{"words": ["figf1a", ",", "Detection", "of", "wild", "-", "type", "(", "+", ")", "and", "Ambra1", "gene", "-", "trap", "transcripts", "(", "gt", ")", "from", "total", "E14", ".", "5", "embryos", "analysed", "by", "northern", "blotting", ".", "Size", "marker", ",", "28S", "ribosomal", "RNA", ".", "b", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "E14", ".", "5embryobrain", "extracts", "using", "antibodies", "against", "Ambra1", "(", "left", "panel", ")", "and", "β", "-", "gal", "(", "right", "panel", ")", ".", "Specific", "bands", "(", "arrowheads", ")", "and", "unspecific", "signals", "(", "asterisk", ")", "are", "indicated", ".", "Molecular", "weights", "are", "measured", "in", "kilodaltons", "(", "kDa", ")", ".", "The", "fusion", "protein", "can", "be", "revealed", "only", "by", "means", "of", "the", "more", "sensitive", "anti", "-", "β", "-", "gal", "antibody", ".", "c", "-", "f", ",", "Expression", "of", "Ambra1", "in", "the", "mouse", "embryonic", "nervous", "system", ".", "β", "-", "gal", "-", "staining", "on", "whole", "-", "mount", "Ambra1", "+", "/", "gt", "mouseembryos", "at", "E8", ".", "5", "(", "c", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "d", ")", "and", "on", "a", "cross", "-", "section", "of", "E11", ".", "5spinal", "cord", "(", "e", ")", "is", "shown", ".", "Fb", ",", "forebrain", ";", "Hb", ",", "hindbrain", ";", "Mb", ",", "midbrain", ".", "f", ",", "Matching", "expression", "of", "the", "endogenous", "gene", "was", "revealed", "by", "whole", "-", "mount", "Ambra1", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "analysis", "in", "E11", ".", "5", "wild", "-", "type", "embryos", ".", "g", "-", "l", ",", "Electron", "scanning", "microscopy", "analysis", "of", "E11", ".", "5", "(", "g", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "h", ")", "Ambra1gt", "/", "gt", "embryos", ".", "Note", "the", "failure", "of", "the", "neural", "tube", "closure", ",", "the", "extensive", "midbrain", "/", "hindbrain", "exencephaly", "(", "Ex", ")", "with", "a", "closed", "telencephalon", "(", "T", ")", ",", "and", "the", "lumbosacral", "spina", "bifida", "(", "Sb", ")", ".", "i", ",", "j", ",", "E14", ".", "5", "wild", "-", "type", "(", "i", ")", "and", "Ambra1gt", "/", "gt", "(", "j", ")", "embryos", "are", "characterized", "by", "prominent", "exencephaly", ".", "k", ",", "l", ",", "Histological", "analysis", "of", "E12", ".", "5", "wild", "-", "type", "(", "k", ")", "and", "Ambra1gt", "/", "gt", "(", "l", ")", "embryos", "on", "cross", "-", "section", ".", "Note", "the", "absence", "of", "a", "normal", "ventricular", "system", ",", "the", "extensive", "overgrowth", "of", "the", "proliferative", "neuroepithelium", "in", "the", "diencephalon", "(", "Di", ")", "and", "spinal", "cord", "(", "Sc", ")", ",", "and", "the", "enlarged", "fifth", "ganglia", "(", "VG", ")", "in", "the", "Ambra1gt", "/", "gt", "embryo", ".", "m", "-", "p", ",", "TUNEL", "(", "TdT", "-", "mediated", "dUTP", "nick", "end", "labelling", ")", "staining", "of", "E10", ".", "5brain", "(", "m", ",", "n", ")", "and", "E9", ".", "5spinal", "cord", "(", "o", ",", "p", ")", "in", "wild", "-", "type", "(", "m", ",", "o", ")", "and", "Ambra1gt", "/", "gt", "(", "n", ",", "p", ")", "embryo", "sections", ".", "q", "-", "t", ",", "Analysis", "of", "cell", "proliferation", "in", "wild", "-", "type", "(", "q", ",", "s", ")", "and", "Ambra1gt", "/", "gt", "(", "r", ",", "t", ")", "embryos", "on", "transverse", "sections", "of", "E8", ".", "5cephalic", "neural", "folds", "in", "prospective", "hindbrain", "region", "(", "mitoses", ",", "arrows", "in", "q", ",", "r", ")", "and", "on", "sagittal", "sections", "of", "E10", ".", "5forebrain", "(", "BrdU", "uptake", ",", "s", ",", "t", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Detection of wild-type (+) and Ambra1 gene-trap transcripts (gt) from total E14.5 embryos analysed by northern blotting. Size marker, 28S ribosomal RNA.b, Immunoblot analysis of E14.5embryobrain extracts using antibodies against Ambra1 (left panel) and β-gal (right panel). Specific bands (arrowheads) and unspecific signals (asterisk) are indicated. Molecular weights are measured in kilodaltons (kDa). The fusion protein can be revealed only by means of the more sensitive anti-β-gal antibody.c-f, Expression of Ambra1 in the mouse embryonic nervous system. β-gal-staining on whole-mount Ambra1+/gt mouseembryos at E8.5 (c), E11.5 (d) and on a cross-section of E11.5spinal cord (e) is shown. Fb, forebrain; Hb, hindbrain; Mb, midbrain. f, Matching expression of the endogenous gene was revealed by whole-mount Ambra1 mRNA in situ hybridization analysis in E11.5 wild-type embryos.g-l, Electron scanning microscopy analysis of E11.5 (g) and E12.5 (h) Ambra1gt/gt embryos. Note the failure of the neural tube closure, the extensive midbrain/hindbrain exencephaly (Ex) with a closed telencephalon (T), and the lumbosacral spina bifida (Sb). i, j, E14.5 wild-type (i) and Ambra1gt/gt (j) embryos are characterized by prominent exencephaly. k, l, Histological analysis of E12.5 wild-type (k) and Ambra1gt/gt (l) embryos on cross-section. Note the absence of a normal ventricular system, the extensive overgrowth of the proliferative neuroepithelium in the diencephalon (Di) and spinal cord (Sc), and the enlarged fifth ganglia (VG) in the Ambra1gt/gt embryo.m-p, TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labelling) staining of E10.5brain (m, n) and E9.5spinal cord (o, p) in wild-type (m, o) and Ambra1gt/gt (n, p) embryo sections. q-t, Analysis of cell proliferation in wild-type (q, s) and Ambra1gt/gt (r, t) embryos on transverse sections of E8.5cephalic neural folds in prospective hindbrain region (mitoses, arrows in q, r) and on sagittal sections of E10.5forebrain (BrdU uptake, s, t)."}
{"words": ["figf2a", ",", "AMBRA1", "-", "BECN1", "interaction", "by", "yeast", "two", "-", "hybrid", "assay", ".", "Yeast", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "and", "plated", "in", "medium", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "histidine", "(", "H", ")", "and", "adenine", "(", "A", ")", ".", "AD", ",", "activation", "domain", ";", "DBD", ",", "DNA", "-", "binding", "domain", ";", "G4", ",", "Gal4", ";", "LAM", ",", "lamin", ".", "b", ",", "AMBRA1", "-", "BECN1", "interaction", "in", "mammalian", "cells", ".", "2FTGH", "cells", "were", "co", "-", "infected", "with", "retroviral", "vectors", "encoding", "BECN1", "and", "the", "indicated", "Myc", "-", "tagged", "AMBRA1", "proteins", ",", "or", "Myc", "-", "tagged", "β", "-", "gal", "as", "a", "negative", "control", ".", "CT", ",", "C", "terminal", ";", "FL", ",", "full", "length", ";", "NT", ",", "N", "terminal", ".", "Protein", "extracts", "were", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "Myc", "-", "tagged", "antibody", "(", "IP", "Myc", ")", ".", "Purified", "complexes", "and", "corresponding", "total", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blot", "using", "anti", "-", "Myc", "(", "WB", "Myc", ",", "upper", "panels", ")", "or", "anti", "-", "BECN1", "(", "WB", "BECN1", ",", "lower", "panels", ")", "antibodies", ".", "When", "multiple", "bands", "are", "present", ",", "the", "upper", "band", "has", "the", "expected", "molecular", "mass", ".", "A", "scheme", "of", "the", "various", "AMBRA1", "mutants", "is", "reported", ".", "c", ",", "AMBRA1", "is", "in", "a", "complex", "that", "includes", "BECN1", "and", "Vps34", ".", "Protein", "extracts", "from", "2FTGH", "cells", "co", "-", "expressing", "BECN1", "and", "the", "Myc", "-", "tagged", "AMBRA1", "full", "-", "length", "protein", "(", "FL", ")", "or", "Myc", "-", "tagged", "β", "-", "gal", "were", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "Myc", "-", "tag", "antibody", "(", "IP", "Myc", ")", ".", "Purified", "complexes", "and", "corresponding", "total", "extracts", "were", "analysed", "using", "anti", "-", "BECN1", "(", "WB", "BECN1", ")", "and", "anti", "-", "Vps34", "(", "WB", "Vps34", ")", "antibodies", ".", "b", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "E14", ".", "5embryobrain", "extracts", "using", "antibodies", "against", "Ambra1", "(", "left", "panel", ")", "and", "β", "-", "gal", "(", "right", "panel", ")", ".", "Specific", "bands", "(", "arrowheads", ")", "and", "unspecific", "signals", "(", "asterisk", ")", "are", "indicated", ".", "Molecular", "weights", "are", "measured", "in", "kilodaltons", "(", "kDa", ")", ".", "The", "fusion", "protein", "can", "be", "revealed", "only", "by", "means", "of", "the", "more", "sensitive", "anti", "-", "β", "-", "gal", "antibody", ".", "e", ",", "BECN1", "and", "AMBRA1", "co", "-", "localize", "in", "mammalian", "cells", ".", "2FTGH", "cells", "co", "-", "expressing", "BECN1", "and", "Myc", "-", "tagged", "AMBRA1", "were", "stained", "for", "Myc", "(", "green", ")", "and", "BECN1", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "8", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, AMBRA1-BECN1 interaction by yeast two-hybrid assay. Yeast cells were co-transfected with the indicated plasmids and plated in medium with (+) or without (-) histidine (H) and adenine (A). AD, activation domain; DBD, DNA-binding domain; G4, Gal4; LAM, lamin.b, AMBRA1-BECN1 interaction in mammalian cells. 2FTGH cells were co-infected with retroviral vectors encoding BECN1 and the indicated Myc-tagged AMBRA1 proteins, or Myc-tagged β-gal as a negative control. CT, C terminal; FL, full length; NT, N terminal. Protein extracts were immunoprecipitated using an anti-Myc-tagged antibody (IP Myc). Purified complexes and corresponding total extracts were analysed by western blot using anti-Myc (WB Myc, upper panels) or anti-BECN1 (WB BECN1, lower panels) antibodies. When multiple bands are present, the upper band has the expected molecular mass. A scheme of the various AMBRA1 mutants is reported.c, AMBRA1 is in a complex that includes BECN1 and Vps34. Protein extracts from 2FTGH cells co-expressing BECN1 and the Myc-tagged AMBRA1 full-length protein (FL) or Myc-tagged β-gal were immunoprecipitated using an anti-Myc-tag antibody (IP Myc). Purified complexes and corresponding total extracts were analysed using anti-BECN1 (WB BECN1) and anti-Vps34 (WB Vps34) antibodies.b, Immunoblot analysis of E14.5embryobrain extracts using antibodies against Ambra1 (left panel) and β-gal (right panel). Specific bands (arrowheads) and unspecific signals (asterisk) are indicated. Molecular weights are measured in kilodaltons (kDa). The fusion protein can be revealed only by means of the more sensitive anti-β-gal antibody.e, BECN1 and AMBRA1 co-localize in mammalian cells. 2FTGH cells co-expressing BECN1 and Myc-tagged AMBRA1 were stained for Myc (green) and BECN1 (red). Scale bars, 8 µm."}
{"words": ["figf3a", ",", "AMBRA1", "downregulation", "in", "2FTGH", "cells", "using", "specific", "short", "interfering", "RNA", "(", "siRNA", ")", "oligoribonucleotides", "(", "1", "and", "2", ")", ".", "AMBRA1", "mRNA", "and", "protein", "levels", "were", "analysed", "by", "quantitative", "polymerase", "chain", "reaction", "(", "PCR", ",", "left", ")", "and", "western", "blotting", "(", "right", ")", ",", "respectively", ".", "An", "unrelated", "oligoribonucleotide", "was", "used", "as", "the", "control", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "the", "protein", "-", "loading", "control", ".", "RL", ",", "relative", "levels", ".", "The", "arrowhead", "indicates", "the", "AMBRA1", "-", "specific", "band", ".", "b", ",", "Rapamycin", "-", "induced", "autophagy", "requires", "AMBRA1", ".", "After", "AMBRA1", "downregulation", ",", "2FTGH", "cells", "were", "treated", "with", "rapamycin", ";", "after", "48", " ", "h", ",", "the", "occurrence", "of", "autophagy", "was", "analysed", "by", "appearance", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "staining", "or", "by", "LC3", "-", "I", "to", "LC3", "-", "II", "conversion", "(", "western", "blot", "in", "inset", ")", ".", "Representative", "results", "are", "accompanied", "by", "a", "graph", "reporting", "data", "from", "three", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "20", " ", "µm", ".", "c", ",", "Nutrient", "-", "starvation", "-", "induced", "autophagy", "requires", "AMBRA1", ".", "After", "AMBRA1", "downregulation", ",", "2FTGH", "cells", "were", "starved", "for", "4", " ", "h", "and", "analysed", "for", "appearance", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "staining", ".", "d", ",", "AMBRA1", "overexpression", "increases", "basal", "and", "rapamycin", "-", "induced", "autophagy", ".", "2FTGH", "cells", "were", "transduced", "with", "full", "-", "length", "AMBRA1", "(", "FL", ")", ",", "AMBRA1", "fragments", "(", "F1", "-", "3", ")", ",", "BECN1", "and", "β", "-", "gal", "(", "negative", "control", ")", "encoding", "retroviruses", ".", "They", "were", "then", "stimulated", "with", "rapamycin", "or", "left", "untreated", ",", "and", "analysed", "by", "appearance", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "staining", ".", "e", ",", "BECN1", "-", "induced", "autophagy", "requires", "AMBRA1", ".", "After", "AMBRA1", "downregulation", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "2FTGH", "cells", "were", "transduced", "with", "a", "BECN1", "-", "encoding", "retrovirus", ".", "Occurrence", "of", "autophagy", "was", "analysed", "48", " ", "h", "later", "by", "appearance", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "staining", ".", "f", ",", "AMBRA1", "downregulation", "reduces", "the", "amount", "of", "Vps34", "associated", "to", "BECN1", "during", "autophagy", ".", "Forty", "-", "eight", "hours", "after", "AMBRA1", "downregulation", "with", "oligo", " ", "2", ",", "2FTGH", "cells", "were", "either", "starved", "or", "cultured", "in", "standard", "medium", "for", "an", "additional", "4", " ", "h", ".", "Protein", "extracts", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "using", "an", "anti", "-", "BECN1", "antibody", ".", "Purified", "complexes", "and", "corresponding", "total", "extracts", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "Vps34", "(", "left", "panels", ")", "and", "anti", "-", "BECN1", "(", "right", "panels", ")", "antibodies", ".", "The", "graph", "indicates", "the", "signal", "intensity", "of", "BECN1", "-", "associated", "Vps34", "as", "determined", "by", "densitometry", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, AMBRA1 downregulation in 2FTGH cells using specific short interfering RNA (siRNA) oligoribonucleotides (1 and 2). AMBRA1 mRNA and protein levels were analysed by quantitative polymerase chain reaction (PCR, left) and western blotting (right), respectively. An unrelated oligoribonucleotide was used as the control. Tubulin was used as the protein-loading control. RL, relative levels. The arrowhead indicates the AMBRA1-specific band.b, Rapamycin-induced autophagy requires AMBRA1. After AMBRA1 downregulation, 2FTGH cells were treated with rapamycin; after 48 h, the occurrence of autophagy was analysed by appearance of GFP-LC3 punctate staining or by LC3-I to LC3-II conversion (western blot in inset). Representative results are accompanied by a graph reporting data from three experiments. Scale bar, 20 µm.c, Nutrient-starvation-induced autophagy requires AMBRA1. After AMBRA1 downregulation, 2FTGH cells were starved for 4 h and analysed for appearance of GFP-LC3 punctate staining.d, AMBRA1 overexpression increases basal and rapamycin-induced autophagy. 2FTGH cells were transduced with full-length AMBRA1 (FL), AMBRA1 fragments (F1-3), BECN1 and β-gal (negative control) encoding retroviruses. They were then stimulated with rapamycin or left untreated, and analysed by appearance of GFP-LC3 punctate staining.e, BECN1-induced autophagy requires AMBRA1. After AMBRA1 downregulation, GFP-LC3-expressing 2FTGH cells were transduced with a BECN1-encoding retrovirus. Occurrence of autophagy was analysed 48 h later by appearance of GFP-LC3 punctate staining.f, AMBRA1 downregulation reduces the amount of Vps34 associated to BECN1 during autophagy. Forty-eight hours after AMBRA1 downregulation with oligo 2, 2FTGH cells were either starved or cultured in standard medium for an additional 4 h. Protein extracts were immunoprecipitated (IP) using an anti-BECN1 antibody. Purified complexes and corresponding total extracts were analysed by western blotting with anti-Vps34 (left panels) and anti-BECN1 (right panels) antibodies. The graph indicates the signal intensity of BECN1-associated Vps34 as determined by densitometry."}
{"words": ["figf4a", ",", "Alteration", "of", "both", "LC3", "conversion", "and", "translocation", "in", "Ambra1gt", "/", "gt", "embryos", ".", "Left", "panel", ":", "immunoblot", "analysis", "of", "LC3", "in", "E14", ".", "5embryos", ".", "LC3", "-", "I", "to", "LC3", "-", "II", "conversion", "is", "reduced", "in", "mutant", "extracts", "(", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", ",", "as", "measured", "by", "densitometry", ",", "from", "left", "to", "right", ":", "5", "%", ",", "9", ".", "8", "%", ",", "2", ".", "5", "%", ",", "4", ".", "6", "%", ")", ".", "B", ",", "body", ";", "H", ",", "head", ".", "Centre", "and", "right", "panels", ":", "sections", "from", "E10", ".", "5Ambra1", "+", "/", "+", ";", "GFP", "-", "LC3", "and", "Ambra1gt", "/", "gt", ";", "GFP", "-", "LC3neuroepithelia", "were", "compared", "to", "evaluate", "GFP", "-", "LC3", "subcellular", "distribution", ".", "Clusters", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "structures", "(", "arrows", ")", "are", "indicated", "in", "wild", "-", "type", "sections", ".", "Images", "were", "optimized", "by", "deconvolution", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", ".", "c", ",", "Rapamycin", "-", "induced", "autophagy", "is", "impaired", "in", "Ambra1gt", "/", "gt", "murine", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", ".", "Cells", "dissected", "from", "embryos", "with", "different", "genotypes", "(", "A", "-", "D", ")", "were", "treated", "with", "rapamycin", ",", "and", "the", "occurrence", "of", "autophagy", "was", "analysed", "48", " ", "h", "later", "by", "the", "appearance", "of", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "staining", ".", "Representative", "results", "are", "shown", "in", "the", "upper", "panels", ",", "whereas", "the", "lower", "panel", "shows", "the", "data", "from", "three", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "20", " ", "µm", ".", "a", ",", "AMBRA1", "-", "BECN1", "interaction", "by", "yeast", "two", "-", "hybrid", "assay", ".", "Yeast", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "and", "plated", "in", "medium", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "histidine", "(", "H", ")", "and", "adenine", "(", "A", ")", ".", "AD", ",", "activation", "domain", ";", "DBD", ",", "DNA", "-", "binding", "domain", ";", "G4", ",", "Gal4", ";", "LAM", ",", "lamin", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Alteration of both LC3 conversion and translocation in Ambra1gt/gt embryos. Left panel: immunoblot analysis of LC3 in E14.5embryos. LC3-I to LC3-II conversion is reduced in mutant extracts (LC3-II/LC3-I ratio, as measured by densitometry, from left to right: 5%, 9.8%, 2.5%, 4.6%). B, body; H, head. Centre and right panels: sections from E10.5Ambra1+/+;GFP-LC3 and Ambra1gt/gt;GFP-LC3neuroepithelia were compared to evaluate GFP-LC3 subcellular distribution. Clusters of GFP-LC3 punctate structures (arrows) are indicated in wild-type sections. Images were optimized by deconvolution. Scale bar, 10 µm.c, Rapamycin-induced autophagy is impaired in Ambra1gt/gt murine embryonic fibroblasts (MEFs). Cells dissected from embryos with different genotypes (A-D) were treated with rapamycin, and the occurrence of autophagy was analysed 48 h later by the appearance of GFP-LC3 punctate staining. Representative results are shown in the upper panels, whereas the lower panel shows the data from three experiments. Scale bar, 20 µm.a, AMBRA1-BECN1 interaction by yeast two-hybrid assay. Yeast cells were co-transfected with the indicated plasmids and plated in medium with (+) or without (-) histidine (H) and adenine (A). AD, activation domain; DBD, DNA-binding domain; G4, Gal4; LAM, lamin."}
{"words": ["Figure", "1Example", "images", "showing", "the", "localization", "of", "SOX2", "-", "SNAP", "and", "OCT4", "-", "HALO", "by", "fluorescence", "microscopy", "of", "SBROS", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "Correlation", "between", "OCT4", "-", "HALO", "and", "total", "OCT4", "levels", "determined", "by", "immunofluorescence", "and", "HALO", "labelling", ".", "R", "is", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", ".", "Distributions", "of", "OCT4", "(", "n", "=", "2682", ")", ",", "SOX2", "(", "n", "=", "1236", ")", "and", "NANOG", "(", "n", "=", "2416", ")", "levels", "in", "WT", "E14", "and", "SBROS", "cell", "lines", "as", "determined", "by", "quantitative", "immunofluorescence", ".", "Dashed", "lines", ":", "mean", "protein", "levels", ";", "Dotted", "lines", ":", "median", "protein", "levels", ".", "Protein", "half", "-", "lives", "of", "OCT4", "-", "HALO", "and", "SOX2", "-", "SNAP", "in", "SBROS", "cells", ".", "Whiskers", ":", "minimum", "and", "maximum", "values", ";", "Box", ":", "lower", "and", "upper", "quartiles", ";", "Solid", "line", ":", "median", ".", "Black", "dots", ":", "outliers", ".", "Cell", "cycle", "duration", "of", "E14", "WT", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "SBROS", "(", "n", "=", "8", ")", "cells", ".", "Error", "bars", ":", "SE", ".", "p", "-", "value", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Example images showing the localization of SOX2-SNAP and OCT4-HALO by fluorescence microscopy of SBROS cells. Scale bar: 50µm.Correlation between OCT4-HALO and total OCT4 levels determined by immunofluorescence and HALO labelling. R is Pearson's correlation coefficient.Distributions of OCT4 (n=2682), SOX2 (n=1236) and NANOG (n=2416) levels in WT E14 and SBROS cell lines as determined by quantitative immunofluorescence. Dashed lines: mean protein levels; Dotted lines: median protein levels.Protein half-lives of OCT4-HALO and SOX2-SNAP in SBROS cells. Whiskers: minimum and maximum values; Box: lower and upper quartiles; Solid line: median. Black dots: outliers.Cell cycle duration of E14 WT (n=6) and SBROS (n=8) cells. Error bars: SE. p-value: two-sided t-test with unequal variance."}
{"words": ["Figure", "2Endogenous", "SOX2", "levels", "in", "single", "cells", "(", "turquoise", ")", "normalized", "to", "the", "value", "at", "t", "=", "0", "in", "SNSF", "cells", "upon", "induction", "of", "SOX2", "-", "SNAP", "(", "n", "=", "37", ",", "left", ")", "or", "a", "truncated", "SOX2", "version", "missing", "the", "DNA", "binding", "domain", "(", "YPET", "-", "SOX2", "-", "delDBD", ",", "n", "=", "47", ",", "right", ")", ".", "Black", "line", ":", "average", "SOX2", "-", "SNAP", "levels", "after", "induction", "normalized", "to", "the", "maximum", "level", "(", "n", "=", "22", ")", ";", "Yellow", "line", ":", "average", "YPET", "-", "SOX2", "-", "delDBD", "levels", "after", "induction", ",", "normalized", "to", "the", "maximum", "level", "(", "n", "=", "20", ")", ".", "Sox2", "and", "Oct4", "mRNA", "levels", "upon", "overexpression", "of", "YPet", "-", "SOX2", "or", "YPET", "-", "SOX2", "-", "delDBD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Changes", "of", "OCT4", "half", "-", "life", "upon", "SOX2", "-", "SNAP", "or", "YPET", "-", "SOX2", "-", "delDBD", "overexpression", "(", "n", "=", "20", "cells", "each", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "SBROS", "cells", "harbouring", "inducible", "SOX2", "-", "SNAP", "or", "YPET", "-", "SOX2", "-", "delDBD", "were", "treated", "with", "0", "or", "500", "ng", "/", "ml", "dox", "for", "6", "-", "8", "hours", "followed", "by", "pulse", "-", "labelling", "of", "OCT4", "-", "HALO", "and", "live", "-", "cell", "imaging", ".", "Sorting", "strategy", "to", "evaluate", "the", "impact", "of", "endogenous", "fluctuations", "of", "SOX2", "and", "OCT4", "on", "OCT4", "and", "SOX2", "protein", "levels", ",", "respectively", ".", "Changes", "of", "SOX2", "and", "OCT4", "levels", "after", "sorting", "for", "high", "and", "low", "SOX2", "levels", "in", "cells", "expressing", "intermediate", "OCT4", "levels", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", ":", "SE", ";", "p", "-", "values", ":", "one", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Changes", "of", "SOX2", "and", "OCT4", "levels", "after", "sorting", "for", "high", "and", "low", "OCT4", "levels", "in", "cells", "expressing", "intermediate", "SOX2", "levels", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "one", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Representative", "traces", "of", "the", "absolute", "number", "of", "SOX2", "-", "NLUC", "molecules", "(", "top", ")", "and", "inferred", "concentration", "in", "nM", "(", "bottom", ")", "in", "in", "-", "silico", "synchronized", "cells", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Single", "cells", "were", "ranked", "according", "to", "their", "SOX2", "expression", "at", "t", "=", "0", "and", "assigned", "a", "color", "code", "for", "their", "initial", "rank", "from", "low", "(", "blue", ")", "to", "high", "(", "red", ")", "levels", ",", "and", "changes", "in", "ranks", "over", "time", "are", "shown", "(", "n", "=", "59", ")", ".", "Rank", "-", "based", "autocorrelation", "function", "of", "the", "SOX2", "ranks", "(", "n", "=", "59", ")", ".", "Error", "bars", ":", "SE", "estimated", "by", "bootstrapping", ".", "Representative", "single", "cell", "traces", "of", "the", "integrated", "intensity", "of", "OCT4", "-", "HALO", "in", "single", "cells", "(", "top", ")", "and", "the", "corresponding", "inferred", "concentration", "(", "bottom", ")", "in", "in", "-", "silico", "synchronized", "cells", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Representation", "of", "the", "ranks", "as", "in", "G", ".", "Rank", "-", "based", "autocorrelation", "function", "as", "in", "I", "(", "n", "=", "47", ")", ".", "Error", "bars", ":", "SE", "estimated", "by", "bootstrapping", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Endogenous SOX2 levels in single cells (turquoise) normalized to the value at t=0 in SNSF cells upon induction of SOX2-SNAP (n=37, left) or a truncated SOX2 version missing the DNA binding domain (YPET-SOX2-delDBD, n=47, right). Black line: average SOX2-SNAP levels after induction normalized to the maximum level (n=22); Yellow line: average YPET-SOX2-delDBD levels after induction, normalized to the maximum level (n=20).Sox2 and Oct4 mRNA levels upon overexpression of YPet-SOX2 or YPET-SOX2-delDBD (n=3). p-values: two-sided t-test with unequal variance.Changes of OCT4 half-life upon SOX2-SNAP or YPET-SOX2-delDBD overexpression (n=20 cells each). p-values: Mann-Whitney U test. SBROS cells harbouring inducible SOX2-SNAP or YPET-SOX2-delDBD were treated with 0 or 500 ng/ml dox for 6-8 hours followed by pulse-labelling of OCT4-HALO and live-cell imaging.Sorting strategy to evaluate the impact of endogenous fluctuations of SOX2 and OCT4 on OCT4 and SOX2 protein levels, respectively.Changes of SOX2 and OCT4 levels after sorting for high and low SOX2 levels in cells expressing intermediate OCT4 levels (n=4). Error bars: SE; p-values: one-sided t-test with unequal variance.Changes of SOX2 and OCT4 levels after sorting for high and low OCT4 levels in cells expressing intermediate SOX2 levels (n=4). p-values: one-sided t-test with unequal variance.Representative traces of the absolute number of SOX2-NLUC molecules (top) and inferred concentration in nM (bottom) in in-silico synchronized cells (n=10). Single cells were ranked according to their SOX2 expression at t=0 and assigned a color code for their initial rank from low (blue) to high (red) levels, and changes in ranks over time are shown (n=59). Rank-based autocorrelation function of the SOX2 ranks (n=59). Error bars: SE estimated by bootstrapping.Representative single cell traces of the integrated intensity of OCT4-HALO in single cells (top) and the corresponding inferred concentration (bottom) in in-silico synchronized cells (n=10). Representation of the ranks as in G. Rank-based autocorrelation function as in I (n=47). Error bars: SE estimated by bootstrapping."}
{"words": ["Figure", "3Snapshot", "from", "luminescence", "movie", "of", "SNSF", "cells", "in", "differentiation", ".", "White", "arrowheads", ":", "cells", "starting", "to", "express", "SOX1", "-", "P2A", "-", "FLUC", ";", "Orange", "arrowheads", ":", "cells", "staying", "SOX1", "-", "negative", "throughout", "the", "experiment", ".", "Red", ":", "SOX2", "-", "NLUC", ",", "turquoise", ":", "Sox1", "-", "P2A", "-", "FLUC", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "Single", "cell", "traces", "of", "SOX2", "levels", "in", "differentiating", "cells", ".", "Turquoise", "traces", ":", "cells", "becoming", "SOX1", "-", "positive", "in", "the", "middle", "cell", "cycle", ",", "population", "average", "is", "shown", "in", "bold", "black", ";", "Red", "traces", ":", "cells", "remaining", "SOX1", "-", "negative", "throughout", "the", "experiment", ",", "population", "average", "is", "shown", "in", "bold", ";", "Green", "line", ":", "population", "average", "FLUC", "signal", "in", "cells", "that", "become", "SOX1", "-", "positive", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "determined", "by", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Strategies", "to", "sort", "SBROS", "cell", "populations", "with", "different", "SOX2", "and", "OCT4", "levels", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "for", "different", "SOX2", "levels", "(", "n", "=", "5", "for", "low", "and", "high", ",", "n", "=", "4", "for", "medium", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "for", "different", "OCT4", "levels", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Differentiation", "outcome", "of", "uninduced", "cells", "or", "cells", "induced", "12", "hours", "for", "OCT4", "-", "SNAP", "overexpression", "before", "sorting", "in", "G1", "phase", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Sorting", "strategy", "for", "SBROS", "cells", "in", "G1", "or", "S", "phase", "and", "into", "the", "four", "following", "subpopulations", ":", "SOX2", "high", "&", "OCT4", "high", "(", "SHOH", ")", ",", "SOX2", "high", "&", "OCT4", "low", "(", "SHOL", ")", ",", "SOX2", "low", "&", "OCT4", "high", "(", "SLOH", ")", "or", "SOX2", "low", "&", "OCT4", "low", "(", "SLOL", ")", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "in", "G1", "phase", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", "(", "SOX1", ")", "and", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "BRA", ")", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "in", "S", "phase", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "SOX1", ")", "and", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", "(", "BRA", ")", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "in", "G1", "phase", "differentiated", "in", "the", "presence", "of", "3μM", "CHIR", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", ".", "Differentiation", "outcome", "for", "cells", "sorted", "in", "G1", "phase", "differentiated", "in", "the", "presence", "of", "1", "μM", "SB431542", "and", "25", "ng", "/", "ml", "bFGF", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "p", "-", "values", ":", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "with", "unequal", "variance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Snapshot from luminescence movie of SNSF cells in differentiation. White arrowheads: cells starting to express SOX1-P2A-FLUC; Orange arrowheads: cells staying SOX1-negative throughout the experiment. Red: SOX2-NLUC, turquoise: Sox1-P2A-FLUC. Scale bar: 50µm.Single cell traces of SOX2 levels in differentiating cells. Turquoise traces: cells becoming SOX1-positive in the middle cell cycle, population average is shown in bold black; Red traces: cells remaining SOX1-negative throughout the experiment, population average is shown in bold; Green line: population average FLUC signal in cells that become SOX1-positive. * p<0.05 determined by two-sided t-test with unequal variance.Strategies to sort SBROS cell populations with different SOX2 and OCT4 levels. Differentiation outcome for cells sorted for different SOX2 levels (n=5 for low and high, n=4 for medium). p-values: two-sided t-test with unequal variance. Differentiation outcome for cells sorted for different OCT4 levels (n=4). p-values: two-sided t-test with unequal variance.Differentiation outcome of uninduced cells or cells induced 12 hours for OCT4-SNAP overexpression before sorting in G1 phase (n=6). p-values: two-sided t-test with unequal variance.Sorting strategy for SBROS cells in G1 or S phase and into the four following subpopulations: SOX2 high & OCT4 high (SHOH), SOX2 high & OCT4 low (SHOL), SOX2 low & OCT4 high (SLOH) or SOX2 low & OCT4 low (SLOL).Differentiation outcome for cells sorted in G1 phase (n=5). p-values: two-sided t-test with unequal variance (SOX1) and Mann-Whitney U test (BRA). Differentiation outcome for cells sorted in S phase (n=5). p-values: Mann-Whitney U test (SOX1) and two-sided t-test with unequal variance (BRA).Differentiation outcome for cells sorted in G1 phase differentiated in the presence of 3μM CHIR (n=7). p-values: two-sided t-test with unequal variance.Differentiation outcome for cells sorted in G1 phase differentiated in the presence of 1 μM SB431542 and 25 ng/ml bFGF (n=7). p-values: two-sided t-test with unequal variance."}
{"words": ["Figure", "4Example", "tracks", "of", "the", "ATAC", "-", "seq", "signal", "in", "SHOH", ",", "SHOL", ",", "SLOH", "and", "SLOL", "populations", "for", "loci", "where", "chromatin", "accessibility", "is", "unaffected", ",", "affected", "by", "OCT4", "levels", ",", "SOX2", "levels", ",", "or", "affected", "by", "both", ".", "Heatmap", "of", "relative", "chromatin", "accessibility", "in", "SHOH", "/", "SHOL", "/", "SLOH", "/", "SLOL", "samples", "for", "all", "loci", "with", "significantly", "altered", "accessibility", ",", "with", "examples", "of", "genes", "close", "to", "affected", "regulatory", "regions", ".", "Groups", "are", "defined", "by", "their", "significance", "(", "OHvsOL", "/", "SHvsSL", "/", "SHOHvsSLOL", ")", "and", "fold", "-", "change", "direction", ".", "Percentage", "of", "regions", "in", "each", "group", "showing", "an", "overlap", "with", "OCT4", ",", "SOX2", "and", "H3K4me3", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Example tracks of the ATAC-seq signal in SHOH, SHOL, SLOH and SLOL populations for loci where chromatin accessibility is unaffected, affected by OCT4 levels, SOX2 levels, or affected by both.Heatmap of relative chromatin accessibility in SHOH/SHOL/SLOH/SLOL samples for all loci with significantly altered accessibility, with examples of genes close to affected regulatory regions. Groups are defined by their significance (OHvsOL/SHvsSL/SHOHvsSLOL) and fold-change direction.Percentage of regions in each group showing an overlap with OCT4, SOX2 and H3K4me3 ChIP-seq peaks."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "MS", "-", "proteomic", "analysis", "of", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Biological", "processes", "and", "cellular", "components", "regulated", "by", "FGF", "signaling", "are", "shown", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "N", "=", "4", "biological", "replicates", "/", "treatment", "were", "analyzed", ".", "p", "-", "value", "was", "calculated", "using", "1D", "annotation", "enrichment", "test", "based", "on", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "FACS", "analysis", "of", "Lysotracker", "(", "B", ")", "dye", "fluorescence", "in", "RCS", "treated", "with", "the", "indicated", "FGF", "ligands", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16h", ".", "Fluorescence", "intensities", "were", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "002", "(", "B", ")", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ".", "FACS", "analysis", "of", "DQ", "-", "BSA", "(", "C", ")", "dye", "fluorescence", "in", "RCS", "treated", "with", "the", "indicated", "FGF", "ligands", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16h", ".", "Concanamycin", "A", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "1h", "to", "inhibit", "lysosomal", "function", ".", "Fluorescence", "intensities", "were", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "=", "0", ".", "005", "(", "C", ")", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ".", "D", ".", "Lamp1", "immunofluorescence", "(", "red", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Insets", "show", "magnification", "of", "the", "boxed", "area", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", "and", "2", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "quantification", "of", "Lamp1", "-", "positive", "vesicles", "/", "cell", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "n", "=", "45", "cells", "were", "analyzed", ".", "Student", "paired", "T", "-", "Test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "E", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "5", "%", "ABS", "(", "vehicle", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "BafA1", "(", "100", "nM", ";", "4", "hours", ")", "was", "used", "to", "inhibit", "lysosome", "activity", ".", "Arrows", "indicate", "lysosomes", ".", "Higher", "magnification", "insets", "showed", "presence", "of", "ER", "membranes", "decorated", "with", "ribosomes", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bar", "500nm", ".", "Quantification", "shows", "average", "number", "of", "ER", "membranes", "and", "mitochondria", "number", "/", "lysosome", "vesicle", "(", "Lys", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "ER", "fragment", "/", "vesicle", "n", "=", "60", "(", "vehicle", ")", "and", "n", "=", "72", "(", "FGF18", ")", "cells", "were", "analyzed", ";", "Mitochondria", "number", "/", "vesicle", ":", "n", "=", "40", "(", "vehicle", ")", "and", "n", "=", "72", "(", "FGF18", ")", "cells", "were", "analyzed", ".", "Student", "paired", "T", "-", "Test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "F", ".", "Representative", "co", "-", "immunofluorescence", "staining", "of", "ER", "(", "ER", "tracker", "BODIPY", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "Lamp1", ",", "red", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Insets", "show", "higher", "magnification", "of", "boxed", "area", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", "and", "2", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "G", ".", "Schematic", "representation", "of", "EATR", "assay", ":", "eGFP", "fluorescence", ",", "but", "not", "mCherry", ",", "is", "lost", "at", "acidic", "pH", ".", "Chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "were", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ";", "12", "hours", ")", "and", "BafA1", "(", "200", "nM", ";", "3", "hours", ")", "where", "indicated", ".", "ER", "acidification", "was", "measured", "by", "FACS", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "H", ".", "FACS", "analysis", "of", "DQ", "-", "BSA", "dye", "fluorescence", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Concanamycin", "A", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "1h", "to", "inhibit", "lysosomal", "degradation", ".", "Fluorescence", "intensities", "were", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", "/", "genotype", ".", "Analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "p", "=", "0", ".", "00279", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", ".", "I", ".", "EATR", "assay", ".", "Chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ";", "16", "hours", ")", "where", "indicated", ".", "ER", "acidification", "was", "measured", "by", "FACS", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "17", "(", "veh", ")", ",", "N", "=", "17", "(", "FGF18", ")", ",", "N", "=", "4", "(", "FGFR3", ";", "4KO", ")", ";", "N", "=", "4", "(", "FGFR3", ";", "4KO", "FGF18", ")", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "J", ".", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "ER", "(", "CLIMP63", ",", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "TMEM192", "-", "HA", ",", "red", ")", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", "for", "16h", ")", ".", "BafA1", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "4", "hours", "to", "inhibit", "lysosomal", "degradation", ".", "Quantification", "of", "relative", "CLIMP63", "fluorescence", "into", "TMEM192", "-", "HA", "positive", "vesicles", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "n", "=", "21", "cells", "were", "analyzed", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Paired", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", "NS", "=", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", "and", "1", ".", "3", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. MS-proteomic analysis of RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Biological processes and cellular components regulated by FGF signaling are shown. FDR <0.05. N=4 biological replicates/treatment were analyzed. p-value was calculated using 1D annotation enrichment test based on Wilcoxon-Mann-Whitney test.FACS analysis of Lysotracker (B) dye fluorescence in RCS treated with the indicated FGF ligands (50 ng/mL) for 16h. Fluorescence intensities were expressed as % relative to vehicle (5% ABS). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.002 (B) Tukey's post hoc test ***p<0.0005.FACS analysis of DQ-BSA (C) dye fluorescence in RCS treated with the indicated FGF ligands (50 ng/mL) for 16h. Concanamycin A was used at 100 nM for 1h to inhibit lysosomal function. Fluorescence intensities were expressed as % relative to vehicle (5% ABS). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment. Analysis of variance one way (ANOVA) =0.005 (C); Tukey's post hoc test ***p<0.0005.D. Lamp1 immunofluorescence (red) in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Insets show magnification of the boxed area. Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar 15 μm and 2 μm (higher magnification boxes) . Bar graph shows quantification of Lamp1-positive vesicles/cell. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment. n=45 cells were analyzed. Student paired T-Test *p<0.05.E. Representative TEM images of RCS chondrocytes treated with 5% ABS (vehicle) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. BafA1 (100 nM; 4 hours) was used to inhibit lysosome activity. Arrows indicate lysosomes. Higher magnification insets showed presence of ER membranes decorated with ribosomes (arrowheads). Scale bar 500nm. Quantification shows average number of ER membranes and mitochondria number/ lysosome vesicle (Lys). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment. ER fragment/vesicle n=60 (vehicle) and n=72 (FGF18) cells were analyzed; Mitochondria number/vesicle: n=40 (vehicle) and n=72 (FGF18) cells were analyzed. Student paired T-Test ***p<0.0005; NS not significant.F. Representative co-immunofluorescence staining of ER (ER tracker BODIPY green) and lysosomes (Lamp1, red) in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Insets show higher magnification of boxed area. Scale bar 15 μm and 2 μm (higher magnification boxes). N=3 biological replicates/treatment.G. Schematic representation of EATR assay: eGFP fluorescence, but not mCherry, is lost at acidic pH. Chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) were treated with FGF18 (50 ng/mL; 12 hours) and BafA1 (200 nM; 3 hours) where indicated. ER acidification was measured by FACS. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; **p<0.005; NS not significant.H. FACS analysis of DQ-BSA dye fluorescence in chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Concanamycin A was used at 100 nM for 1h to inhibit lysosomal degradation. Fluorescence intensities were expressed as % relative to vehicle (5% ABS). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment/genotype. Analysis of variance (ANOVA) p=0.00279; Tukey's post hoc test **p<0.005; *p<0.05; NS not significant.I. EATR assay. Chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with FGF18 (50 ng/mL; 16 hours) where indicated. ER acidification was measured by FACS. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N= 17 (veh), N=17 (FGF18), N=4 (FGFR3;4KO); N=4 (FGFR3;4KO FGF18) biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.J. Representative immunofluorescence staining of ER (CLIMP63, green) and lysosomes (TMEM192-HA, red) in chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with FGF18 (50 ng/mL for 16h). BafA1 was used at 100 nM for 4 hours to inhibit lysosomal degradation. Quantification of relative CLIMP63 fluorescence into TMEM192-HA positive vesicles. N=3 biological replicates; n=21 cells were analyzed. Mean +/- standard error of the mean (sem). Paired Student's T-test NS= not significant. Scale bar 10 μm and 1.3 μm (higher magnification boxes)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "MS", "-", "phospho", "-", "proteomics", "analysis", "of", "RCS", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ",", "showing", "biological", "processes", "regulated", "by", "FGF", "signaling", "(", "in", "blue", ":", "up", "-", "regulated", ",", "in", "green", ":", "down", "-", "regulated", ")", ".", "N", "=", "4", "biological", "replicates", "were", "analyzed", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "Representative", "western", "blot", "analysis", "of", "IRS1", ",", "p", "-", "P70S6K", "(", "T389", ")", ",", "P70S6K", ",", "p", "-", "AKT", "(", "T308", ")", ",", "AKT", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "MG132", "(", "10", "μM", "for", "6h", ")", "to", "inhibit", "proteasome", "(", "C", ")", "activity", ",", "respectively", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Bar", "graphs", "showed", "quantification", "of", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "their", "totals", ".", "IRS1", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", ".", "Representative", "western", "blot", "analysis", "of", "IRS1", ",", "p", "-", "P70S6K", "(", "T389", ")", ",", "P70S6K", ",", "p", "-", "AKT", "(", "T308", ")", ",", "AKT", ",", "p", "-", "cJUN", "(", "s73", ")", "and", "cJUN", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "JNK", "inhibitor", "(", "50", "μM", "for", "12h", ")", "to", "inhibit", "JNK", "(", "D", ")", "activity", ",", "respectively", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Bar", "graphs", "showed", "quantification", "of", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "their", "totals", ".", "IRS1", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", ".", "E", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "of", "p", "-", "IRS1", "S307", "mouse", "(", "green", ")", "and", "p", "-", "S6", "S240", "/", "S242", "(", "red", ")", "ribosomal", "protein", "in", "IRS1", "-", "overexpressing", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "Nuclei", "(", "N", ")", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", ".", "Quantification", "analysis", "of", "p", "-", "S6", "fluorescence", "intensity", "in", "IRS1", "-", "overexpressing", "vs", "non", "expressing", "RCS", "chondrocytes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", "=", "35", "cells", "analyzed", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. MS-phospho-proteomics analysis of RCS with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours, showing biological processes regulated by FGF signaling (in blue: up-regulated, in green: down-regulated). N=4 biological replicates were analyzed. FDR <0.05.Representative western blot analysis of IRS1, p-P70S6K (T389), P70S6K, p-AKT (T308), AKT in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 12h. MG132 (10 μM for 6h) to inhibit proteasome (C) activity, respectively. β-actin was used as loading control. N=3 independent experiments. Bar graphs showed quantification of indicated proteins normalized to their totals. IRS1 was normalized to β-actin. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's paired T-test **p<0.005; *p<0.05; NS not significant.Representative western blot analysis of IRS1, p-P70S6K (T389), P70S6K, p-AKT (T308), AKT, p-cJUN (s73) and cJUN in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 12h. JNK inhibitor (50 μM for 12h) to inhibit JNK (D) activity, respectively. β-actin was used as loading control. N=3 independent experiments. Bar graphs showed quantification of indicated proteins normalized to their totals. IRS1 was normalized to β-actin. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's paired T-test **p<0.005; *p<0.05; NS not significant.E. Co-immunofluorescence of p-IRS1 S307 mouse (green) and p-S6 S240/S242 (red) ribosomal protein in IRS1-overexpressing RCS chondrocytes treated with FGF18 (50 ng/mL) for 12h. Nuclei (N) were stained with DAPI (blue). Scale bar 15 μm. Quantification analysis of p-S6 fluorescence intensity in IRS1-overexpressing vs non expressing RCS chondrocytes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. n=35 cells analyzed. Student's paired T-test *p<0.05."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "EATR", "assay", ".", "Chondrocytes", "were", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ";", "16", "hours", ")", "and", "Actinomycin", "(", "1μg", "/", "mL", ";", "last", "4", "hours", ")", "where", "indicated", ".", "ER", "acidification", "was", "measured", "by", "FACS", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "17", "(", "veh", ")", ",", "N", "=", "17", "(", "FGF18", ")", ",", "N", "=", "5", "(", "actinomycin", ")", ",", "N", "=", "5", "(", "actinomycin", "+", "FGF18", ")", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "B", ".", "FACS", "analysis", "of", "Lysotracker", "dye", "fluorescence", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Actinomycin", "(", "1μg", "/", "mL", ")", "was", "added", "for", "the", "last", "4", "hours", ".", "Fluorescence", "intensities", "were", "calculated", "as", "%", "relative", "to", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "C", ".", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "Lamp1", "(", "red", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", ",", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ";", "16", "hours", ")", "and", "Actinomycin", "(", "1μg", "/", "mL", ";", "4", "hours", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Representative", "images", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "D", ".", "Heat", "-", "map", "of", "lysosomal", "and", "autophagy", "genes", "expression", "in", "RCS", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", ",", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", "were", "analyzed", ".", "In", "green", ":", "down", "-", "regulated", ",", "in", "red", ":", "up", "-", "regulated", "gene", "expression", ".", "E", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ER", "-", "phagy", "receptors", "in", "RCS", "chondrocytes", ".", "Gene", "expression", "was", "analyzed", "after", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "treatment", "for", "16", "hours", ".", "Fold", "change", "values", "were", "relative", "to", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "normalized", "to", "Cyclophilin", "gene", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "(", "top", ")", "Representative", "model", "of", "Fam134b", "∆", "LIR", "protein", ".", "LIR", "=", "LC3", "-", "Interacting", "-", "Region", ".", "(", "bottom", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "Fam134b", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Representative", "images", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Bar", "graph", "showed", "quantification", "of", "Fam134b", "band", "intensity", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "G", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "CLIMP63", "(", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "TMEM192", "-", "HA", ",", "red", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "upon", "FGF18", "treatment", "(", "50", "ng", "/", "mL", "for", "16h", ")", ".", "BafA1", "(", "100", "nM", ";", "4", "hours", ")", "was", "used", "to", "inhibit", "lysosomal", "degradation", ";", "scale", "bar", "20", "μm", ".", "Insets", "show", "magnification", "of", "CLIMP63", "accumulation", "into", "lysosomes", ";", "scale", "bar", "2", "μm", ".", "Quantification", "of", "CLIMP63", "fluorescence", "intensity", "into", "TMEM192", "-", "HA", "decorated", "lysosomes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", "=", "10", "cells", "/", "experiment", "were", "analyzed", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "=", "1", ".", "55e", "-", "7", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "H", ".", "EATR", "assay", "in", "RCS", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "showing", "%", "of", "cells", "with", "acidified", "ER", "by", "FACS", "analysis", ".", "FGF18", "was", "used", "at", "50", "ng", "/", "mL", "for", "16", "hours", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "4", "biological", "replicates", "/", "treatment", "/", "genotype", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. EATR assay. Chondrocytes were treated with FGF18 (50 ng/mL; 16 hours) and Actinomycin (1μg/mL; last 4 hours) where indicated. ER acidification was measured by FACS. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=17 (veh), N=17 (FGF18), N=5 (actinomycin), N=5 (actinomycin + FGF18) biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.B. FACS analysis of Lysotracker dye fluorescence in RCS chondrocytes treated with FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Actinomycin (1μg/mL) was added for the last 4 hours. Fluorescence intensities were calculated as % relative to vehicle (5% ABS). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p=0.0002; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.C. Representative immunofluorescence staining of Lamp1 (red) in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS), FGF18 (50 ng/mL; 16 hours) and Actinomycin (1μg/mL; 4 hours). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar 10 μm. Representative images of N=3 biological replicates. Scale bar 10 μm.D. Heat-map of lysosomal and autophagy genes expression in RCS chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type), treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. FDR <0.05. N=3 biological replicates/treatment were analyzed. In green: down-regulated, in red: up-regulated gene expression.E. qRT-PCR analysis of ER-phagy receptors in RCS chondrocytes. Gene expression was analyzed after FGF18 (50 ng/mL) treatment for 16 hours. Fold change values were relative to vehicle (5% ABS) and normalized to Cyclophilin gene. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment. Student's paired T-test **p<0.005; *p<0.05.F. (top) Representative model of Fam134b∆LIR protein. LIR= LC3-Interacting-Region. (bottom) Western blot analysis of Fam134b in chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Representative images of N=3 biological replicates/treatment. β-actin was used as loading control. Bar graph showed quantification of Fam134b band intensity normalized to β-actin. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's paired T-test, *p<0.05.G. Immunofluorescence staining of CLIMP63 (green) and lysosomes (TMEM192-HA, red) in RCS chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) upon FGF18 treatment (50 ng/mL for 16h). BafA1 (100 nM; 4 hours) was used to inhibit lysosomal degradation; scale bar 20 μm. Insets show magnification of CLIMP63 accumulation into lysosomes; scale bar 2 μm. Quantification of CLIMP63 fluorescence intensity into TMEM192-HA decorated lysosomes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. n=10 cells/experiment were analyzed. Analysis of variance one way (ANOVA) p=1.55e-7; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant. H. EATR assay in RCS with indicated genotypes (ctrl=wild type) showing % of cells with acidified ER by FACS analysis. FGF18 was used at 50 ng/mL for 16 hours. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=4 biological replicates/treatment/genotype. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant. "}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "TFE3", "(", "green", ")", "subcellular", "localization", "in", "RCS", "with", "indicated", "genotypes", "(", "control", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hours", ".", "Torin1", "(", "1", "μM", "for", "2", "hours", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Bar", "graph", "shows", "quantification", "(", "expressed", "as", "%", ")", "of", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "and", "TFEB", "(", "representative", "images", "of", "TFEB", "immunofluorescence", "are", "shown", "in", "EV2E", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "n", "=", "80", "(", "TFE3", ")", "and", "n", "=", "70", "(", "TFEB", ")", "cells", "/", "experiment", "were", "analyzed", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "-", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "=", "3", ".", "23e", "-", "12", "(", "TFEB", ")", ",", "p", "=", "2", ".", "48e", "-", "11", "(", "TFE3", ")", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "TFEB", ",", "and", "phospo", "-", "TFEB", "(", "Serine", "142", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "stably", "expressing", "human", "TFEB", "-", "3XFlag", "protein", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "or", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16h", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "GFP", "immuno", "-", "EM", "staining", "in", "FGFR3", "/", "4KO", "chondrocytes", "infected", "with", "a", "constitutive", "nuclear", "(", "and", "active", ")", "mutant", "TFEB", "fused", "to", "GFP", "tag", "(", "TFEB", "-", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", ")", ".", "GFP", "positive", "gold", "immune", "-", "particles", "showed", "presence", "of", "GFP", "-", "puncta", "into", "the", "nucleus", "(", "N", ",", "stained", "in", "green", "for", "visualization", ")", ".", "Lysosomes", "were", "stained", "in", "blue", "for", "visualization", ".", "Insets", "showed", "magnification", "of", "lysosomes", ".", "Quantification", "of", "lysosome", "diameter", "(", "nm", ")", "in", "control", "(", "wild", "type", ")", "and", "FGFR3", ";", "4KO", "chondrocytes", "infected", "with", "empty", "or", "with", "TFEB", "-", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "vector", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", "=", "40", "(", "veh", ")", "n", "=", "78", "(", "FGFR3", ";", "4KO", ")", "n", "=", "57", "(", "FGFR3", ";", "4KO", "+", "TFEB", "-", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", ")", "cells", "were", "analyzed", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "Kruskal", "Wallis", "test", "p", "=", "1", ".", "43e", "-", "13", ";", "Nemenyi", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "D", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "of", "p", "-", "IRS1", "(", "S307", "mouse", ")", "and", "TFEB", "in", "IRS1", "-", "overexpressing", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "Nuclei", "(", "N", ")", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "delimited", "with", "dashed", "line", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", ".", "Quantification", "of", "TFEB", "nuclear", "localization", "in", "IRS1", "-", "overexpressing", "vs", "non", "-", "expressing", "RCS", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", "=", "124", "cells", "analyzed", ";", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "E", ".", "Subcellular", "localization", "analysis", "of", "TFEB", "(", "red", ")", "and", "TFE3", "(", "green", ")", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "JNK", "inhibitor", "was", "used", "at", "50", "μM", "for", "12h", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Quantification", "analysis", "showed", "%", "of", "cells", "with", "nuclear", "TFEB", "and", "TFE3", "in", "RCS", "chondrocytes", "with", "indicated", "treatments", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", "=", "126", "cells", "(", "control", ")", ",", "126", "cells", "(", "FGF18", ")", ",", "95", "cells", "(", "JNK", "Inhibitor", ")", ",", "163", "cells", "(", "JNK", "Inhibitor", "+", "FGF18", ")", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "phospho", "-", "TFEB", "(", "S142", ")", "and", "IRS1", "in", "RCS", "chondrocytes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "12h", ".", "JNK", "inhibitor", "was", "used", "at", "50", "μM", "for", "12h", "to", "inhibit", "kinase", "activity", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Representative", "images", "of", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Bar", "graphs", "show", "quantification", "of", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. TFE3 (green) subcellular localization in RCS with indicated genotypes (control=wild type) treated with FGF18 (50 ng/mL) for 16 hours. Torin1 (1 μM for 2 hours) was used as positive control. Nuclei were stained with DAPI (blue). Bar graph shows quantification (expressed as %) of cells with nuclear TFE3 and TFEB (representative images of TFEB immunofluorescence are shown in EV2E). Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates; n=80 (TFE3) and n=70 (TFEB) cells/experiment were analyzed. Scale bar 10 μm. Analysis of variance one-way (ANOVA) p=3.23e-12 (TFEB), p=2.48e-11 (TFE3); Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.B. Western blot analysis of TFEB, and phospo-TFEB (Serine 142) in RCS chondrocytes stably expressing human TFEB-3XFlag protein. Cells were treated with vehicle (5% ABS) or FGF18 (50 ng/mL) for 16h. β-actin was used as loading control. Representative of three independent experiments.C. GFP immuno-EM staining in FGFR3/4KO chondrocytes infected with a constitutive nuclear (and active) mutant TFEB fused to GFP tag (TFEB- S142A:S211A-GFP). GFP positive gold immune-particles showed presence of GFP-puncta into the nucleus (N, stained in green for visualization). Lysosomes were stained in blue for visualization. Insets showed magnification of lysosomes. Quantification of lysosome diameter (nm) in control (wild type) and FGFR3;4KO chondrocytes infected with empty or with TFEB- S142A:S211A-GFP vector. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. n=40 (veh) n=78 (FGFR3;4KO) n=57 (FGFR3;4KO +TFEB-S142A:S211A-GFP) cells were analyzed. Scale bar 500 nm. Kruskal Wallis test p=1.43e-13; Nemenyi post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.D. Co-immunofluorescence of p-IRS1 (S307 mouse) and TFEB in IRS1-overexpressing RCS chondrocytes treated with FGF18 (50 ng/mL) for 12h. Nuclei (N) were stained with DAPI (blue) and delimited with dashed line. Scale bar 15 μm. Quantification of TFEB nuclear localization in IRS1-overexpressing vs non-expressing RCS. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. n= 124 cells analyzed; Student's un-paired T-test *p<0.05.E. Subcellular localization analysis of TFEB (red) and TFE3 (green) in RCS chondrocytes treated with FGF18 (50 ng/mL) for 12h. JNK inhibitor was used at 50 μM for 12h. Nuclei were stained with DAPI (blue). Quantification analysis showed % of cells with nuclear TFEB and TFE3 in RCS chondrocytes with indicated treatments. Scale bar 15 μm. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. n= 126 cells (control), 126 cells (FGF18), 95 cells (JNK Inhibitor), 163 cells (JNK Inhibitor + FGF18). Student's paired T-test *p<0.05.F. Western blot analysis of phospho-TFEB (S142) and IRS1 in RCS chondrocytes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) for 12h. JNK inhibitor was used at 50 μM for 12h to inhibit kinase activity. β-actin was used as loading control. Representative images of N=3 independent experiments. Bar graphs show quantification of indicated proteins normalized to β-actin. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's paired T-test *p<0.05; NS not significant."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fam134b", "gene", "expression", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "or", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ";", "16", "hours", ")", ".", "Fold", "change", "values", "were", "relative", "to", "vehicle", "and", "normalized", "to", "Cyclophilin", "gene", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ":", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Fam134b", "protein", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "treated", "with", "vehicle", "(", "5", "%", "ABS", ")", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "overnight", ".", "β", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Representative", "image", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Bar", "graph", "showed", "quantification", "of", "Fam134b", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "NS", "not", "significant", ".", "C", ".", "Co", "-", "staining", "of", "CLIMP63", "(", "green", ")", "and", "TMEM192", "-", "HA", "(", "lysosomes", ",", "red", ")", "in", "control", "and", "TFEB", ";", "3KO", "RCS", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", "for", "16", "hours", ")", ".", "BaFA1", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "3h", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", "and", "2", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "CLIMP63", "fluorescence", "intensity", "into", "TMEM192", "-", "HA", "decorated", "lysosomes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", "/", "genotype", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", ".", "n", "=", "10", "cells", "/", "experiment", "were", "analyzed", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "=", "1", ".", "55e", "-", "7", ";", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "E", ".", "EATR", "assay", "in", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "(", "ctrl", "=", "wild", "type", ")", "showing", "%", "of", "cells", "with", "acidified", "ER", "measured", "by", "FACS", ".", "FGF18", "was", "used", "at", "50", "ng", "/", "mL", "overnight", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ":", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", ".", "F", ",", "G", "Data", "plots", "show", "quantification", "of", "mCherry", "+", "vesicles", "/", "cell", "(", "autolysosomes", ")", "(", "F", ")", "and", "mCherry", "+", "/", "GFP", "+", "vesicles", "/", "cell", "(", "autophagosomes", ")", "(", "G", ")", "in", "wild", "type", "(", "ctrl", ")", "and", "TFEB", ";", "3KO", "cells", "treated", "with", "vehicle", "(", "veh", ")", "or", "FGF18", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "24", "(", "wild", "type", "treated", "with", "5", "%", "ABS", ",", "veh", ")", ",", "N", "=", "30", "(", "wild", "type", "treated", "with", "FGF18", ")", ",", "N", "=", "27", "(", "TFEB", ";", "3KO", "veh", ")", ",", "N", "=", "33", "(", "TFEB", ";", "3KO", "FGF18", ")", "cells", ".", "Student", "un", "-", "paired", "T", "-", "Test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "H", ".", "ChIP", "analysis", "of", "TFEB", "binding", "to", "Fam134b", "DNA", "in", "RCS", "cells", "transfected", "with", "TFEB", "-", "3XFLAG", ".", "Numbers", "in", "the", "CLEAR", "site", "(", "yellow", "box", ")", "refer", "to", "the", "distance", "[", "in", "base", "pairs", "]", "from", "the", "transcriptional", "start", "site", "(", "+", "1", ")", "of", "Fam134b", "-", "2", "gene", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "was", "normalized", "to", "the", "input", "and", "plotted", "as", "relative", "enrichment", "over", "a", "mock", "control", ".", "Bar", "graph", "shows", "fold", "change", "enrichment", ";", "mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Student", "un", "-", "paired", "T", "-", "Test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "I", "-", "J", ".", "Luciferase", "assays", "in", "RCS", "chondrocytes", "using", "as", "promoter", "a", "0", ",", "7kb", "genomic", "Fam134b", "DNA", "fragment", "containing", "a", "wild", "type", "(", "FAM134B", "-", "WT", ")", "or", "a", "deleted", "(", "FAM134B", "-", "mut", ")", "version", "of", "the", "CLEAR", "site", ".", "TFEB", "plasmid", "transfection", "amount", "and", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", "for", "16h", ")", "treatments", "are", "indicated", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Student", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "K", ".", "Luciferase", "activity", "in", "wild", "type", "(", "ctrl", ")", "and", "TFEB", ";", "3KO", "RCS", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "expressing", "the", "indicated", "Fam134b", "luciferase", "report", "plasmids", "and", "treated", "with", "FGF18", "overnight", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "where", "indicated", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ":", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. qRT-PCR analysis of Fam134b gene expression in chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) treated with vehicle (5% ABS) or with FGF18 (50 ng/mL; 16 hours). Fold change values were relative to vehicle and normalized to Cyclophilin gene. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001: Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.B. Western blot analysis of Fam134b protein in chondrocytes with indicated genotypes treated with vehicle (5% ABS) and FGF18 (50 ng/mL) overnight. β actin was used as loading control. Representative image of N=3 biological replicates. Bar graph showed quantification of Fam134b normalized to β-actin. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001; Sidak's multiple comparison test ***p<0.0005; **p<0.005 NS not significant.C. Co-staining of CLIMP63 (green) and TMEM192-HA (lysosomes, red) in control and TFEB;3KO RCS treated with FGF18 (50 ng/mL for 16 hours). BaFA1 was used at 100 nM for 3h. Scale bar 15 μm and 2 μm (higher magnification boxes).D. Quantification of CLIMP63 fluorescence intensity into TMEM192-HA decorated lysosomes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates/treatment/genotype (ctrl=wild type). n=10 cells/experiment were analyzed. Analysis of variance one way (ANOVA) p=1.55e-7; Tukey's post hoc test ***p<0.0005; NS not significant.E. EATR assay in chondrocytes with indicated genotypes (ctrl=wild type) showing % of cells with acidified ER measured by FACS. FGF18 was used at 50 ng/mL overnight. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=4 biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001: Tukey's post hoc test ***p<0.0005; *p<0.05; NS not significant.F,G Data plots show quantification of mCherry+ vesicles/cell (autolysosomes) (F) and mCherry+/GFP+ vesicles/cell (autophagosomes) (G) in wild type (ctrl) and TFEB;3KO cells treated with vehicle (veh) or FGF18. N=3 independent experiments. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=24 (wild type treated with 5%ABS, veh), N=30 (wild type treated with FGF18), N=27 (TFEB;3KO veh), N= 33 (TFEB;3KO FGF18) cells. Student un-paired T-Test ***p<0.0005; **p<0.005.H. ChIP analysis of TFEB binding to Fam134b DNA in RCS cells transfected with TFEB-3XFLAG. Numbers in the CLEAR site (yellow box) refer to the distance [in base pairs] from the transcriptional start site (+1) of Fam134b-2 gene. Immunoprecipitated DNA was normalized to the input and plotted as relative enrichment over a mock control. Bar graph shows fold change enrichment; mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 independent experiments. Student un-paired T-Test **p<0.005.I-J. Luciferase assays in RCS chondrocytes using as promoter a 0,7kb genomic Fam134b DNA fragment containing a wild type (FAM134B-WT) or a deleted (FAM134B-mut) version of the CLEAR site. TFEB plasmid transfection amount and FGF18 (50 ng/mL for 16h) treatments are indicated. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. Student paired T-test *p<0.05; **p<0.005.K. Luciferase activity in wild type (ctrl) and TFEB;3KO RCS chondrocytes with indicated genotypes expressing the indicated Fam134b luciferase report plasmids and treated with FGF18 overnight (50 ng/mL) where indicated. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=5 biological replicates. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.0001: Sidak's multiple comparison test ***p<0.0005; NS not significant."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fam134b", "isoforms", "in", "mock", ",", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "and", "TFE3", "S246A", ":", "S312A", "over", "-", "expressing", "U2OS", "cells", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "Hprt", "gene", "and", "expressed", "as", "fold", "change", "values", "relative", "to", "mock", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "NS", "not", "significant", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Fam134b", "isoforms", "in", "mock", ",", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "and", "TFE3", "S246A", ":", "S312A", "over", "-", "expressing", "U2OS", "cells", "showing", "induction", "of", "FAM134B", "-", "2", ",", "but", "not", "of", "FAM134B", "-", "1", "isoform", "by", "TFEB", "/", "TFE3", ".", "Filamin", "A", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Blot", "is", "representative", "of", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "C", ",", "D", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "staining", "of", "ER", "(", "CLIMP", "-", "63", ",", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "TMEM192", "-", "HA", ",", "red", ")", "in", "control", "and", "Sh", "-", "FAM134B", "U2OS", "cells", "over", "-", "expressing", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "(", "purple", ")", ".", "BaFA1", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "4h", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", "and", "2", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", "(", "C", ")", ".", "In", "(", "D", ")", ",", "Quantification", "of", "CLIMP63", "fluorescence", "in", "TMEM192", "-", "HA", "decorated", "lysosomes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "N", "=", "21", "(", "vehicle", "ctrl", ")", ",", "N", "=", "33", "(", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "ctrl", ")", ",", "N", "=", "21", "(", "vehicle", "shFAM134B", ")", ",", "N", "=", "30", "(", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "shFAM134B", ")", "cells", "were", "analysed", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "E", ",", "F", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "staining", "of", "ER", "(", "CLIMP", "-", "63", ",", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "Lamp1", ",", "red", ")", "in", "WT", "and", "Fam134bKO", "MEF", "cells", "over", "-", "expressing", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "(", "purple", ")", ".", "BaFA1", "was", "used", "at", "100", "nM", "for", "4h", ".", "Scale", "bar", "15", "μm", "and", "2", "μm", "(", "higher", "magnification", "boxes", ")", "(", "E", ")", ".", "In", "(", "F", ")", ",", "Quantification", "of", "CLIMP63", "fluorescence", "in", "Lamp1", "decorated", "lysosomes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "N", "=", "20", "(", "vehicle", "ctrl", ")", ",", "N", "=", "22", "(", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "ctrl", ")", ",", "N", "=", "21", "(", "vehicle", "Fam134bKO", ")", ",", "N", "=", "20", "(", "TFEB", "S142A", ":", "S211A", "-", "GFP", "Fam134bKO", ")", "cells", "were", "analysed", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. qRT-PCR analysis of Fam134b isoforms in mock, TFEB S142A:S211A and TFE3 S246A:S312A over-expressing U2OS cells. Values were normalized to Hprt gene and expressed as fold change values relative to mock. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. Student's un-paired T-test *p<0.05; NS not significant.B. Western blot analysis of Fam134b isoforms in mock, TFEB S142A:S211A and TFE3 S246A:S312A over-expressing U2OS cells showing induction of FAM134B-2, but not of FAM134B-1 isoform by TFEB/TFE3. Filamin A was used as loading control. Blot is representative of N=3 independent experiments.C,D. Co-immunofluorescence staining of ER (CLIMP-63, green) and lysosomes (TMEM192-HA, red) in control and Sh-FAM134B U2OS cells over-expressing TFEB S142A:S211A-GFP (purple). BaFA1 was used at 100 nM for 4h. Scale bar 15 μm and 2 μm (higher magnification boxes) (C). In (D), Quantification of CLIMP63 fluorescence in TMEM192-HA decorated lysosomes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. N= 21 (vehicle ctrl), N=33 (TFEB S142A:S211A-GFP ctrl), N=21 (vehicle shFAM134B), N= 30 (TFEB S142A:S211A-GFP shFAM134B) cells were analysed. Student's un-paired T-test ***p<0.0005; NS not significant.E,F. Co-immunofluorescence staining of ER (CLIMP-63, green) and lysosomes (Lamp1, red) in WT and Fam134bKO MEF cells over-expressing TFEB S142A:S211A-GFP (purple). BaFA1 was used at 100 nM for 4h. Scale bar 15 μm and 2 μm (higher magnification boxes) (E). In (F), Quantification of CLIMP63 fluorescence in Lamp1 decorated lysosomes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=3 biological replicates. N= 20 (vehicle ctrl), N=22 (TFEB S142A:S211A-GFP ctrl), N=21 (vehicle Fam134bKO), N= 20 (TFEB S142A:S211A-GFP Fam134bKO) cells were analysed. Student's un-paired T-test ***p<0.0005; NS not significant."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", ".", "Representative", "images", "of", "alcian", "blue", "(", "cartilage", ")", "and", "Alizarin", "red", "(", "bone", ")", "skeletal", "staining", "showing", "growth", "retardation", "in", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", "compared", "to", "age", "/", "sex", "wild", "type", "littermate", "at", "post", "-", "natal", "day", "30", ".", "B", ".", "Femur", ",", "tibia", "and", "tail", "details", ".", "C", ".", "Haematoxylin", "/", "Eosin", "staining", "of", "femoral", "growth", "plate", "sections", "from", "wild", "type", "and", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", ".", "Higher", "magnification", "insets", "showed", "a", "disorganized", "hypertrophic", "chondrocyte", "layer", ",", "in", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", ".", "Scale", "bar", "60", "μm", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "IRS1", ",", "p", "-", "P70S6K", "(", "T389", ")", ",", "P70S6K", ",", "p", "-", "JNK", "(", "Y185", ")", ",", "JNK1", "/", "2", "proteins", "in", "growth", "plate", "lysates", "of", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "N", "=", "3", "mice", "/", "genotype", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Bar", "graph", "shows", "quantification", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "LC3", "and", "Lamp1", "proteins", "from", "growth", "plate", "lysates", "of", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "N", "=", "3", "mice", "/", "genotype", "were", "analyzed", ".", "Bar", "graph", "shows", "quantification", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fam134b", "-", "2", "expression", "from", "growth", "plate", "of", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "N", "=", "8", "(", "wt", "mice", ")", "and", "N", "=", "9", "(", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", ")", "were", "analyzed", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "Hprt", "gene", "and", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "control", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "G", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Fam134b", "-", "2", "protein", "from", "growth", "plate", "lysates", "of", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "N", "=", "6", "(", "wt", "mice", ")", "and", "N", "=", "4", "(", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", ")", "were", "analyzed", ".", "Bar", "graph", "showed", "quantification", "of", "Fam134b", "-", "2", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "H", ".", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "CLIMP", "-", "63", "of", "femur", "growth", "plate", "sections", "from", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "Insets", "showed", "increased", "CLIMP", "-", "63", "staining", "in", "Fgfr3", "/", "4", "dKO", "mice", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "Hypert", "=", "hypertrophic", "chondrocytes", ";", "pre", "-", "hypert", "=", "pre", "-", "hypertrophic", "chondrocytes", ";", "prolif", "=", "proliferating", "chondrocytes", ".", "I", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "growth", "plate", "chondrocytes", "from", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "Arrows", "indicated", "the", "ER", ".", "N", "=", "nucleus", ".", "Scale", "bar", "1μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A,B. Representative images of alcian blue (cartilage) and Alizarin red (bone) skeletal staining showing growth retardation in Fgfr3/4 dKO mice compared to age/sex wild type littermate at post-natal day 30. B. Femur, tibia and tail details.C. Haematoxylin/Eosin staining of femoral growth plate sections from wild type and Fgfr3/4 dKO mice. Higher magnification insets showed a disorganized hypertrophic chondrocyte layer, in Fgfr3/4 dKO mice. Scale bar 60 μm.D. Western blot analysis of IRS1, p-P70S6K (T389), P70S6K, p-JNK (Y185), JNK1/2 proteins in growth plate lysates of mice with indicated genotypes. N=3 mice/genotype. β-actin was used as loading control. Bar graph shows quantification. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test *p<0.05.E. Western blot analysis of LC3 and Lamp1 proteins from growth plate lysates of mice with indicated genotypes. β-actin was used as loading control. N=3 mice/genotype were analyzed. Bar graph shows quantification. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test *p<0.05.F. qRT-PCR analysis of Fam134b-2 expression from growth plate of mice with indicated genotypes. N=8 (wt mice) and N=9 (Fgfr3/4 dKO mice) were analyzed. Values were normalized to Hprt gene and expressed as fold change relative to control. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test *p<0.05.G. Western blot analysis of Fam134b-2 protein from growth plate lysates of mice with indicated genotypes. β-actin was used as loading control. N=6 (wt mice) and N=4 (Fgfr3/4 dKO mice) were analyzed. Bar graph showed quantification of Fam134b-2 normalized to β-actin. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test *p<0.05.H. Representative immunofluorescence staining of CLIMP-63 of femur growth plate sections from mice with indicated genotypes. Scale bar 10μm. Insets showed increased CLIMP-63 staining in Fgfr3/4 dKO mice. Scale bar 5 μm. Hypert= hypertrophic chondrocytes; pre-hypert= pre-hypertrophic chondrocytes; prolif = proliferating chondrocytes.I. Representative TEM images of growth plate chondrocytes from mice with indicated genotypes. Arrows indicated the ER. N= nucleus. Scale bar 1μm."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Scatter", "plot", "of", "cellular", "compartments", "and", "biological", "processes", "regulated", "by", "FGF18", "in", "a", "Fam134b", "-", "dependent", "manner", ".", "Score", ":", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", "difference", "between", "wild", "type", "and", "Fam134b", "∆", "LIR", "cells", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", "/", "genotype", "were", "analysed", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "B", ".", "Tandem", "mass", "tag", "secretome", "analysis", "of", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "and", "treatments", ".", "Fam134b", "-", "dependent", "secreted", "proteins", "are", "shown", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "/", "treatment", "/", "genotype", "were", "analysed", ".", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "C", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Fam134b", "and", "Lamp1", "from", "medaka", "fish", "embryos", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", ")", "for", "24h", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "Hprt", "gene", "and", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "untreated", "fish", ".", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Paired", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "D", ".", "Co", "-", "immunofluorescence", "staining", "of", "Lamp1", "(", "lysosome", ")", "and", "PDI", "(", "ER", ")", "in", "medaka", "fish", "chondrocytes", "with", "indicated", "genotypes", "treated", "with", "FGF18", "(", "50", "ng", "/", "mL", "for", "24h", ")", ".", "Insets", "showed", "details", "of", "colocalization", "of", "Lamp1", "and", "PDI", ".", "Wheat", "germ", "agglutinin", "(", "WGA", ")", "was", "used", "to", "stain", "cartilage", "matrix", ".", "Representative", "images", "of", "N", "=", "3", "fish", "/", "genotype", "/", "treatment", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", ".", "Boxed", "area", "were", "zoomed", "and", "single", "and", "merged", "channels", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "2", "μm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "PDI", "fluorescence", "intensity", "into", "Lamp1", "positive", "lysosomes", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "N", "=", "10", "cells", "/", "experiment", "were", "analyzed", ".", "Analysis", "of", "variance", "one", "way", "(", "ANOVA", ")", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ";", "NS", "not", "significant", ".", "F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "type", "II", "procollagen", "from", "a", "pool", "of", "medaka", "fish", "embryos", "with", "indicated", "genotypes", ",", "showing", "procollagen", "accumulation", "in", "Fam134bmo", "fish", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Bar", "graph", "shows", "quantification", "of", "type", "II", "procollagen", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "G", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "medaka", "fish", "chondrocytes", ".", "Arrows", "indicated", "the", "ER", ".", "Insets", "show", "ER", "enlargement", "in", "Fam134bmo", "chondrocyte", ".", "N", "=", "3", "fish", "/", "genotype", "were", "analyzed", ".", "Bar", "graph", "shows", "number", "of", "ER", "enlargement", "per", "cell", "in", "medaka", "fish", "with", "indicated", "genotypes", ".", "N", "=", "29", "cells", "(", "Fam134bwt", ")", "and", "N", "=", "37", "cells", "(", "Fam134bmo", ")", "were", "analyzed", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", ".", "Student", "'", "s", "un", "-", "paired", "T", "-", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "N", "=", "nucleus", ",", "ER", "=", "Endoplasmic", "Reticulum", ".", "H", ".", "Lateral", "(", "top", ")", "and", "ventral", "(", "bottom", ")", "projections", "of", "medaka", "fish", "embryos", "with", "indicated", "genotypes", ".", "Scale", "bar", "1mm", ".", "Bar", "graphs", "show", "quantification", "of", "total", "length", "and", "head", "size", "of", "medaka", "fish", "model", "of", "Fam134bmo", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "the", "scramble", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "at", "least", "n", "=", "8", "fish", "/", "genotype", ".", "Student", "un", "-", "paired", "T", "-", "Test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Alcian", "blue", "(", "cartilage", ")", "(", "I", ")", "staining", "of", "scramble", "and", "Fam134bmo", "medaka", "fish", ".", "Graph", "shows", "quantification", "of", "Ethmoid", "plate", "(", "EP", ")", ",", "Palatoquadrate", "(", "PQ", ")", ",", "Ceratohyal", "(", "CH", ")", ",", "Paired", "Prootics", "(", "PO", ")", ",", "Ceretobranchials", "1", "to", "5", "(", "CB1", "to", "CB5", ")", "cartilage", "length", "(", "I", ")", "in", "Fam134bmo", "and", "scramble", "fish", ".", "Values", "were", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "the", "scramble", "(", "100", "%", "red", "dotted", "line", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "n", "=", "9", "fish", "/", "genotype", ".", "Student", "unpaired", "T", "-", "Test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ".", "NS", "not", "significant", ".", "Alizarin", "Red", "(", "bone", ")", "(", "J", ")", "staining", "of", "scramble", "and", "Fam134bmo", "medaka", "fish", ".", "Graph", "shows", "quantification", "of", "Ethmoid", "plate", "(", "EP", ")", ",", "Palatoquadrate", "(", "PQ", ")", ",", "Ceratohyal", "(", "CH", ")", ",", "Paired", "Prootics", "(", "PO", ")", ",", "Ceretobranchials", "1", "to", "5", "(", "CB1", "to", "CB5", ")", "bone", "mineralization", "(", "J", ")", "in", "Fam134bmo", "and", "scramble", "fish", ".", "Values", "were", "expressed", "as", "%", "relative", "to", "the", "scramble", "(", "100", "%", "red", "dotted", "line", ")", ".", "Mean", "+", "/", "-", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "sem", ")", "of", "n", "=", "9", "fish", "/", "genotype", ".", "Student", "unpaired", "T", "-", "Test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ".", "NS", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Scatter plot of cellular compartments and biological processes regulated by FGF18 in a Fam134b-dependent manner. Score: Student's T-test difference between wild type and Fam134b∆LIR cells. N=3 biological replicates/treatment/genotype were analysed. FDR <0.05.B. Tandem mass tag secretome analysis of chondrocytes with indicated genotypes and treatments. Fam134b-dependent secreted proteins are shown N=3 biological replicates/treatment/genotype were analysed. FDR <0.05.C. qRT-PCR analysis of Fam134b and Lamp1 from medaka fish embryos treated with FGF18 (50 ng/mL) for 24h. Values were normalized to Hprt gene and expressed as fold change relative to untreated fish. N= 5 biological replicates. Mean +/- standard error of the mean (sem). Paired Student's T-test **p<0.005; *p<0.05.D. Co-immunofluorescence staining of Lamp1 (lysosome) and PDI (ER) in medaka fish chondrocytes with indicated genotypes treated with FGF18 (50 ng/mL for 24h). Insets showed details of colocalization of Lamp1 and PDI. Wheat germ agglutinin (WGA) was used to stain cartilage matrix. Representative images of N=3 fish/genotype/treatment. Scale bars 10 μm. Boxed area were zoomed and single and merged channels are shown. Scale bars 2 μm.E. Quantification of PDI fluorescence intensity into Lamp1 positive lysosomes. Mean +/- standard error of the mean (sem) of N=10 cells/experiment were analyzed. Analysis of variance one way (ANOVA) p<0.001; Sidak's multiple comparison test ***p<0.0005; NS not significant.F. Western blot analysis of type II procollagen from a pool of medaka fish embryos with indicated genotypes, showing procollagen accumulation in Fam134bmo fish. β-actin was used as loading control. Bar graph shows quantification of type II procollagen normalized to β-actin. N=3 biological replicates. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test *p<0.05.G. Representative TEM images of medaka fish chondrocytes. Arrows indicated the ER. Insets show ER enlargement in Fam134bmo chondrocyte. N=3 fish/genotype were analyzed. Bar graph shows number of ER enlargement per cell in medaka fish with indicated genotypes. N=29 cells (Fam134bwt) and N=37 cells (Fam134bmo) were analyzed. Mean +/- standard error of the mean (sem). Student's un-paired T-test ***p<0.0005. Scale bar 500 nm. N=nucleus, ER= Endoplasmic Reticulum.H. Lateral (top) and ventral (bottom) projections of medaka fish embryos with indicated genotypes. Scale bar 1mm. Bar graphs show quantification of total length and head size of medaka fish model of Fam134bmo expressed as % relative to the scramble. Mean +/- standard error of the mean (sem) of at least n=8 fish/genotype. Student un-paired T-Test *p<0.05.Alcian blue (cartilage) (I) staining of scramble and Fam134bmo medaka fish. Graph shows quantification of Ethmoid plate (EP), Palatoquadrate (PQ), Ceratohyal (CH), Paired Prootics (PO), Ceretobranchials 1 to 5 (CB1 to CB5) cartilage length (I) in Fam134bmo and scramble fish. Values were expressed as % relative to the scramble (100% red dotted line). Mean +/- standard error of the mean (sem) of n=9 fish/genotype. Student unpaired T-Test *p<0.05; **p<0.005; ***p<0.0005. NS not significant.Alizarin Red (bone) (J) staining of scramble and Fam134bmo medaka fish. Graph shows quantification of Ethmoid plate (EP), Palatoquadrate (PQ), Ceratohyal (CH), Paired Prootics (PO), Ceretobranchials 1 to 5 (CB1 to CB5) bone mineralization (J) in Fam134bmo and scramble fish. Values were expressed as % relative to the scramble (100% red dotted line). Mean +/- standard error of the mean (sem) of n=9 fish/genotype. Student unpaired T-Test *p<0.05; **p<0.005; ***p<0.0005. NS not significant."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "ARPI", "(", "CSS", ",", "ENZA", ",", "ODM", "-", "201", ",", "14449", ")", "decreased", ",", "while", "R1881", "increased", ",", "SDHA", "and", "SDHB", "subunit", "protein", "levels", "in", "both", "LNCaP", "and", "LAPC4", "cells", ".", "PSA", "is", "used", "as", "a", "positive", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. ARPI (CSS, ENZA, ODM-201, 14449) decreased, while R1881 increased, SDHA and SDHB subunit protein levels in both LNCaP and LAPC4 cells. PSA is used as a positive control."}
{"words": ["Figure", "2D", ".", "SDH", "repression", "during", "acute", "phase", "of", "ENZA", "stress", "increased", "transcription", "of", "different", "AR", "-", "regulated", "genes", "without", "altering", "AR", "mRNAs", "levels", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "between", "groups", ".", "E", "-", "F", ".", "Overexpression", "of", "SDHA", "and", "SDHB", "subunits", "decreased", "AR", "protein", "levels", "(", "E", ")", "and", "AR", "transactivation", "(", "F", ")", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "between", "groups", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D. SDH repression during acute phase of ENZA stress increased transcription of different AR-regulated genes without altering AR mRNAs levels in LNCaP cells. Data information: ENZA: enzalutamide.Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using two tailed unpaired Student's t-test *, p<0.05 and **, p<0.01 compared between groups.E-F. Overexpression of SDHA and SDHB subunits decreased AR protein levels (E) and AR transactivation (F) in LNCaP cells. Data information: ENZA: enzalutamide.Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey's test *, p<0.05 and **, p<0.01 compared between groups."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "SDH", "-", "repressed", "LNCaP", "cells", "were", "able", "to", "maintain", "higher", "proliferation", "rate", "particularly", "during", "ENZA", "stress", "with", "or", "without", "Hsp27", "silencing", "in", "real", "time", "cell", "proliferation", "assay", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "following", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "panels", "C", "(", "end", "points", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between", "groupsE", ".", "Treatment", "with", "p", "-", "p38", "inhibitors", ":", "SB203580", "(", "10", "µM", ")", "or", "Genistein", "(", "20", "µM", ")", "for", "24", "h", "reduced", "AR", "upregulation", "induced", "by", "SDH", "repression", "in", "LNCaP", "cells", "(", "left", "panel", ")", ".", "Bar", "graph", "in", "the", "right", "panel", "shows", "band", "intensity", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "ENZA", ":", "enzalutamide", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "following", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "panels", "E", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. SDH-repressed LNCaP cells were able to maintain higher proliferation rate particularly during ENZA stress with or without Hsp27 silencing in real time cell proliferation assay. Data information: ENZA: enzalutamide. Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA following Tukey's test for panels C (end points) . *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groupsE. Treatment with p-p38 inhibitors: SB203580 (10 µM) or Genistein (20 µM) for 24 h reduced AR upregulation induced by SDH repression in LNCaP cells (left panel). Bar graph in the right panel shows band intensity normalized to loading control. Data information: ENZA: enzalutamide. Data shown as mean ± SD of three independent experiments. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA following Tukey's test for panels E . *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groups"}
{"words": ["Figure", "4F", ".", ".", "Treatment", "with", "5", "µM", "STO", "-", "609", "for", "24", "h", "in", "LNCaP", "cells", "inhibited", "AR", "upregulation", "induced", "by", "SDHA", "/", "SDHB", "subunit", "silencing", ".", "G", ".", "Thapsigargin", ",", "DMM", ",", "DMS", "and", "ENZA", "treatment", "for", "the", "indicated", "time", "points", "increased", "intracellular", "calcium", "flux", "in", "LNCaP", "cells", "as", "visualized", "with", "calcium", "sensitive", "Fluo4", "-", "AM", "probe", "under", "confocal", "microscope", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4F.. Treatment with 5 µM STO-609 for 24 h in LNCaP cells inhibited AR upregulation induced by SDHA/SDHB subunit silencing.G. Thapsigargin, DMM, DMS and ENZA treatment for the indicated time points increased intracellular calcium flux in LNCaP cells as visualized with calcium sensitive Fluo4-AM probe under confocal microscope."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", ".", "Human", "patient", "samples", "demonstrate", "relative", "differences", "in", "the", "immunoexpression", "of", "AR", ",", "SDHA", ",", "p", "-", "CaMKK2", "/", "p", "-", "AMPK", ",", "p", "-", "p38", ",", "and", "p", "-", "Hsp27", "in", "untreated", "(", "n", "=", "70", ")", ",", "neoadjuvant", "-", "treated", "(", "NHT", ")", "(", "n", "=", "130", ")", "and", "CRPC", "(", "n", "=", "24", ")", "samples", ".", "Representative", "images", "(", "A", ")", ",", "dot", "plots", "(", "B", ")", ",", "compiled", "bar", "graph", "(", "C", ")", "support", "the", "AR", "-", "SDH", "loop", "where", "inhibition", "of", "AR", "axis", "in", "NHT", "samples", "reduced", "SDHA", "levels", "along", "with", "upregulation", "of", "p", "-", "CaMKK2", "/", "p", "-", "AMPK", "/", "p", "-", "p38", "/", "p", "-", "Hsp27", "axis", ".", "AR", "-", "positive", "CRPC", "samples", "restored", "SDHA", "as", "well", "as", "the", "whole", "axis", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ":", "100µm", ".", "All", "the", "TMAs", "were", "constructed", "from", "minimum", "2", "cores", "per", "patient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C. Human patient samples demonstrate relative differences in the immunoexpression of AR, SDHA, p-CaMKK2/p-AMPK, p-p38, and p-Hsp27 in untreated (n=70), neoadjuvant-treated (NHT) (n=130) and CRPC (n=24) samples. Representative images (A), dot plots (B), compiled bar graph (C) support the AR-SDH loop where inhibition of AR axis in NHT samples reduced SDHA levels along with upregulation of p-CaMKK2/p-AMPK/p-p38/p-Hsp27 axis. AR-positive CRPC samples restored SDHA as well as the whole axis. Data information: Data shown as mean ± SEM. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey's test. **, p<0.01; ***, p<0.001 and ****, p<0.0001. Scale bar: 100µm. All the TMAs were constructed from minimum 2 cores per patient. "}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "IVM", "reversed", "the", "cell", "proliferation", "benefit", "mediated", "by", "SDH", "repression", "in", "LNCaP", "cells", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±", "SEM", "In", "vitro", "data", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "for", "the", "last", "data", "point", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "between", "groups", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "E", ".", "LNCaP", "xenografts", "treated", "with", "IVM", "(", "n", "=", "10", ")", "(", "10mg", "/", "kg", ")", "demonstrated", "lower", "serum", "PSA", "values", "(", "upper", "panel", ")", "and", "growth", "of", "tumours", "after", "castration", "(", "lower", "panel", ")", "compared", "to", "vehicle", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "PSA", "was", "measured", "every", "week", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±", "SEMF", ".", "IVM", "treatment", "reduced", "p", "-", "Hsp27", "levels", "and", "therefore", "AR", "protein", "level", ",", "with", "subsequent", "p", "-", "CAMKK2", "axis", "activation", "in", "castrated", "LNCaP", "xenografts", ".", "Bar", "graph", "in", "the", "right", "panel", "shows", "quantification", "of", "data", "from", "western", "blot", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Data", "shown", "as", "means", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. IVM reversed the cell proliferation benefit mediated by SDH repression in LNCaP cells. Data shown as means ± SEM In vitro data represent three independent experiments. Statistical analysis was performed for the last data point *, p<0.05, **, p<0.01 and ***, p<0.001 compared between groups, one-way ANOVA followed by Tukey's test.E. LNCaP xenografts treated with IVM (n=10) (10mg/kg) demonstrated lower serum PSA values (upper panel) and growth of tumours after castration (lower panel) compared to vehicle (n=10). PSA was measured every week. Data shown as means ± SEMF. IVM treatment reduced p-Hsp27 levels and therefore AR protein level, with subsequent p-CAMKK2 axis activation in castrated LNCaP xenografts. Bar graph in the right panel shows quantification of data from western blot normalized to loading control. Data shown as means ± SD"}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Knockdown", "of", "RARα", "in", "NIH3T3", "mouse", "fibroblasts", "was", "conducted", "using", "two", "different", "shRNAs", ",", "sh1", "and", "sh2", ",", "compared", "to", "control", "(", "Ctr", ")", ".", "Left", ",", "representative", "immunoblot", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "loading", "control", "and", "full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "21", ".", "Right", ",", "amounts", "of", "RARα", "in", "control", "and", "knockdown", "cells", "determined", "by", "densitometric", "quantification", "of", "immunoblots", "represented", "by", "the", "one", "shown", "on", "the", "left", ".", "Values", "are", "normalized", "for", "actin", "and", "expressed", "as", "multiples", "of", "control", "(", "None", ")", "values", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "b", ")", "Rates", "of", "degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "in", "control", "and", "RARα", "(", "-", ")", "cells", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", "for", "12", "h", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "proteolysis", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Percentage", "of", "degradation", "due", "to", "lysosomes", "(", "c", ")", "and", "macroautophagy", "(", "d", ")", "in", "cells", "assayed", "as", "in", "b", "but", "treated", "with", "inhibitors", "of", "lysosomal", "proteolysis", "(", "c", ")", "or", "with", "3", "-", "methyladenine", "(", "3MA", ")", "to", "block", "macroautophagy", "(", "d", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "total", "protein", "degradation", "sensitive", "to", "the", "lysosomal", "inhibitors", ";", "n", "=", "3", ".", "In", "all", "panels", ",", "all", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "differences", "with", "control", "are", "significant", "for", "*", "P", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Knockdown of RARα in NIH3T3 mouse fibroblasts was conducted using two different shRNAs, sh1 and sh2, compared to control (Ctr). Left, representative immunoblot. Actin is shown as loading control and full-length blots are shown in Supplementary Figure 21. Right, amounts of RARα in control and knockdown cells determined by densitometric quantification of immunoblots represented by the one shown on the left. Values are normalized for actin and expressed as multiples of control (None) values; n = 3.(b) Rates of degradation of long-lived proteins in control and RARα(-) cells maintained in the presence or absence of serum for 12 h. Values are expressed as percentage of proteolysis; n = 3.(c,d) Percentage of degradation due to lysosomes (c) and macroautophagy (d) in cells assayed as in b but treated with inhibitors of lysosomal proteolysis (c) or with 3-methyladenine (3MA) to block macroautophagy (d). Values are expressed as percentage of total protein degradation sensitive to the lysosomal inhibitors; n = 3. In all panels, all values are mean ± s.e.m., and differences with control are significant for *P 0.05."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Immunoblot", "for", "LC3", "-", "II", "in", "control", "mouse", "fibroblasts", "(", "Ctr", ")", "or", "those", "knocked", "down", "for", "RARα", "(", "RARα", "(", "−", ")", ")", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Where", "indicated", ",", "protease", "inhibitors", "(", "PI", ")", "against", "lysosomal", "proteolysis", "were", "added", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "'", "I", "'", "and", "'", "II", "'", "designate", "different", "forms", "of", "LC3", ",", "as", "described", "in", "the", "text", ".", "(", "b", ")", "Amounts", "of", "LC3", "-", "II", "determined", "by", "densitometric", "quantification", "of", "immunoblots", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "in", "value", "relative", "to", "serum", "-", "supplemented", "control", "cells", ";", "n", "=", "4", ".", "(", "c", ")", "Ratio", "of", "the", "amounts", "of", "LC3", "-", "II", "in", "cells", "treated", "with", "protease", "inhibitors", "compared", "to", "untreated", "cells", "(", "None", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "in", "value", "relative", "to", "untreated", "cells", ";", "n", "=", "4", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Autophagic", "flux", "in", "the", "same", "cells", "as", "in", "c", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "-", "II", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Shown", "in", "d", "are", "representative", "merged", "channel", "images", ";", "scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", "(", "red", ")", ".", "Shown", "in", "e", "are", "the", "quantification", "of", "the", "number", "of", "autophagosomes", "(", "mCherry", "and", "GFP", "positive", ")", "per", "cell", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "mCherry", "positive", "and", "GFP", "negative", ";", "right", ")", "in", ">", "50", "cells", "in", "at", "least", "four", "different", "fields", ".", "AV", ",", "autophagic", "vacuoles", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Autophagic", "flux", "in", "the", "same", "cells", "as", "in", "c", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "-", "II", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Shown", "in", "d", "are", "representative", "merged", "channel", "images", ";", "scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", "(", "red", ")", ".", "Shown", "in", "e", "are", "the", "quantification", "of", "the", "number", "of", "autophagosomes", "(", "mCherry", "and", "GFP", "positive", ")", "per", "cell", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "mCherry", "positive", "and", "GFP", "negative", ";", "right", ")", "in", ">", "50", "cells", "in", "at", "least", "four", "different", "fields", ".", "AV", ",", "autophagic", "vacuoles", ".", "(", "f", ")", "Control", "and", "RARα", "(", "-", ")", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "KFERQ", "-", "mCherry1", "photoactivatable", "reporter", ",", "and", "after", "photoactivation", "they", "were", "maintained", "in", "medium", "with", "or", "without", "serum", ".", "Left", ",", "representative", "images", ".", "Graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "puncta", "per", "cell", "in", ">", "50", "cells", "using", "the", "CMA", "reporter", "in", "at", "least", "four", "different", "fields", ".", "Nuclei", "are", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "In", "b", ",", "c", ",", "e", "and", "f", ",", "all", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Differences", "with", "control", "(", "marked", "with", "asterisk", ")", "or", "with", "serum", "-", "supplemented", "cells", "(", "marked", "with", "§", ")", "are", "significant", "for", "P", "0", ".", "05", ".", "Full", "-", "field", "fluorescence", "images", "and", "full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figures", "2", "and", "21", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Immunoblot for LC3-II in control mouse fibroblasts (Ctr) or those knocked down for RARα (RARα(−)) maintained in the presence or absence of serum for the indicated times. Where indicated, protease inhibitors (PI) against lysosomal proteolysis were added. Actin is shown as a loading control. 'I' and 'II' designate different forms of LC3, as described in the text. (b) Amounts of LC3-II determined by densitometric quantification of immunoblots. Values are expressed as fold change in value relative to serum-supplemented control cells; n = 4. (c) Ratio of the amounts of LC3-II in cells treated with protease inhibitors compared to untreated cells (None). Values are expressed as fold change in value relative to untreated cells; n = 4.(d,e) Autophagic flux in the same cells as in c expressing mCherry-GFP-LC3-II and maintained in the presence or absence of serum. Shown in d are representative merged channel images; scale bars, 2 μm. Arrows indicate autolysosomes (red). Shown in e are the quantification of the number of autophagosomes (mCherry and GFP positive) per cell (left) and percentage of autolysosomes (mCherry positive and GFP negative; right) in >50 cells in at least four different fields. AV, autophagic vacuoles.(d,e) Autophagic flux in the same cells as in c expressing mCherry-GFP-LC3-II and maintained in the presence or absence of serum. Shown in d are representative merged channel images; scale bars, 2 μm. Arrows indicate autolysosomes (red). Shown in e are the quantification of the number of autophagosomes (mCherry and GFP positive) per cell (left) and percentage of autolysosomes (mCherry positive and GFP negative; right) in >50 cells in at least four different fields. AV, autophagic vacuoles.(f) Control and RARα(-) cells were transfected with the KFERQ-mCherry1 photoactivatable reporter, and after photoactivation they were maintained in medium with or without serum. Left, representative images. Graph shows quantification of the number of puncta per cell in >50 cells using the CMA reporter in at least four different fields. Nuclei are labeled with DAPI. Scale bars, 10 μm. In b, c, e and f, all values are mean ± s.e.m. Differences with control (marked with asterisk) or with serum-supplemented cells (marked with §) are significant for P 0.05. Full-field fluorescence images and full-length blots are shown in Supplementary Figures 2 and 21, respectively."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Rates", "of", "degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "in", "mouse", "fibroblasts", "untreated", "(", "None", ")", "or", "treated", "with", "40", "μM", "ATRA", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "proteolysis", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "b", ")", "Percentage", "of", "lysosomal", "degradation", "calculated", "after", "treatment", "with", "inhibitors", "of", "lysosomal", "proteolysis", "for", "12", "h", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "c", ")", "Immunoblot", "for", "LC3", "-", "II", "of", "the", "same", "cells", "as", "in", "a", "and", "b", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", "and", "protease", "inhibitors", "(", "PI", ")", ".", "Top", ",", "representative", "immunoblot", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "Bottom", ",", "ratio", "of", "amount", "of", "LC3", "-", "II", "in", "cells", "treated", "with", "PI", "to", "that", "in", "untreated", "cells", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "in", "value", "relative", "to", "untreated", "cells", ";", "n", "=", "4", ".", "'", "I", "'", "and", "'", "II", "'", "designate", "different", "forms", "of", "LC3", ",", "as", "described", "in", "the", "text", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Autophagic", "flux", "in", "untreated", "and", "ATRA", "-", "treated", "cells", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "-", "II", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Shown", "in", "d", "are", "representative", "merged", "-", "channel", "images", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", ".", "Shown", "in", "e", "are", "the", "number", "of", "autophagosomes", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "right", ")", "after", "quantification", "of", ">", "50", "cells", ".", "AV", ",", "autophagic", "vacuoles", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Autophagic", "flux", "in", "untreated", "and", "ATRA", "-", "treated", "cells", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "-", "II", "and", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Shown", "in", "d", "are", "representative", "merged", "-", "channel", "images", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", ".", "Shown", "in", "e", "are", "the", "number", "of", "autophagosomes", "(", "left", ")", "and", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "right", ")", "after", "quantification", "of", ">", "50", "cells", ".", "AV", ",", "autophagic", "vacuoles", ".", "(", "f", ")", "Mouse", "fibroblasts", "expressing", "the", "KFERQ", "-", "mCherry1", "photoactivatable", "reporter", "with", "or", "without", "ATRA", "and", "after", "photoactivation", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "serum", ".", "Left", ",", "representative", "images", ".", "Nuclei", "are", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "puncta", "per", "cell", "in", ">", "50", "cells", ".", "All", "values", "in", "a", "-", "c", ",", "e", "and", "f", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "differences", "with", "untreated", "(", "marked", "with", "asterisk", ")", "or", "with", "serum", "-", "supplemented", "cells", "(", "marked", "with", "§", ")", "are", "significant", "for", "P", "0", ".", "01", ".", "Full", "-", "field", "fluorescence", "images", "and", "full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figures", "3", "and", "21", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Rates of degradation of long-lived proteins in mouse fibroblasts untreated (None) or treated with 40 μM ATRA and maintained in the presence or absence of serum. Values are expressed as a percentage of proteolysis; n = 3.(b) Percentage of lysosomal degradation calculated after treatment with inhibitors of lysosomal proteolysis for 12 h; n = 3.(c) Immunoblot for LC3-II of the same cells as in a and b maintained in the presence or absence of serum and protease inhibitors (PI). Top, representative immunoblot. Actin is shown as loading control. Bottom, ratio of amount of LC3-II in cells treated with PI to that in untreated cells. Values are expressed as fold change in value relative to untreated cells; n = 4. 'I' and 'II' designate different forms of LC3, as described in the text.(d,e) Autophagic flux in untreated and ATRA-treated cells expressing mCherry-GFP-LC3-II and maintained in the presence or absence of serum. Shown in d are representative merged-channel images. Arrows indicate autolysosomes (red). Scale bar, 2 μm. Shown in e are the number of autophagosomes (left) and percentage of autolysosomes (right) after quantification of >50 cells. AV, autophagic vacuoles.(d,e) Autophagic flux in untreated and ATRA-treated cells expressing mCherry-GFP-LC3-II and maintained in the presence or absence of serum. Shown in d are representative merged-channel images. Arrows indicate autolysosomes (red). Scale bar, 2 μm. Shown in e are the number of autophagosomes (left) and percentage of autolysosomes (right) after quantification of >50 cells. AV, autophagic vacuoles.(f) Mouse fibroblasts expressing the KFERQ-mCherry1 photoactivatable reporter with or without ATRA and after photoactivation maintained in the presence or absence of serum. Left, representative images. Nuclei are labeled with DAPI. Scale bars, 10 μm. Graph shows quantification of the number of puncta per cell in >50 cells. All values in a-c, e and f are mean ± s.e.m., and differences with untreated (marked with asterisk) or with serum-supplemented cells (marked with §) are significant for P 0.01. Full-field fluorescence images and full-length blots are shown in Supplementary Figures 3 and 21, respectively."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Mouse", "fibroblasts", "expressing", "the", "KFERQ", "-", "mCherry1", "photoactivatable", "reporter", "without", "(", "None", ")", "or", "with", "20", "μM", "of", "the", "indicated", "compounds", "imaged", "16", "h", "after", "photoactivation", ".", "Insets", "show", "higher", "-", "magnification", "images", ".", "Nuclei", "are", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "the", "effect", "of", "increasing", "concentrations", "of", "GR1", "on", "the", "same", "cells", ".", "Untreated", "cells", "and", "cells", "treated", "with", "40", "μM", "ATRA", "are", "also", "shown", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "7", ".", "Graph", "shows", "the", "average", "number", "of", "fluorescent", "puncta", "per", "cell", ",", "quantified", "in", ">", "50", "cells", ".", "All", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "c", ")", "Mouse", "fibroblasts", "were", "cotransfected", "with", "the", "human", "RARα", "(", "hRARα", ")", "receptor", ",", "a", "relevant", "reporter", "luciferase", "plasmid", "and", "the", "non", "-", "retinoid", "-", "regulated", "Renilla", "reporter", "to", "control", "for", "transfection", ".", "Values", "show", "relative", "luciferase", "units", "(", "RLU", ")", "detected", "in", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "concentrations", "of", "ATRA", "or", "the", "three", "retinoid", "derivatives", "for", "12h", ".", "(", "d", ")", "Mouse", "fibroblasts", "were", "cotransfected", "with", "the", "human", "RARα", "(", "hRARα", ")", "receptor", ",", "a", "relevant", "reporter", "luciferase", "plasmid", "and", "the", "non", "-", "retinoid", "-", "regulated", "Renilla", "reporter", "to", "control", "for", "transfection", ".", "Cells", "transfected", "as", "in", "c", "were", "treated", "with", "100", "nM", "of", "ATRA", "alone", "or", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "concentrations", "of", "the", "three", "retinoid", "derivatives", "or", "the", "antagonist", "BMS614", "for", "12", "h", ".", "Values", "are", "shown", "as", "RLU", ".", "(", "e", ")", "Mouse", "fibroblasts", "were", "cotransfected", "with", "the", "human", "RXR", "receptor", ",", "a", "relevant", "reporter", "luciferase", "plasmid", "and", "the", "non", "-", "retinoid", "-", "regulated", "Renilla", "reporter", "to", "control", "for", "transfection", ".", "Values", "show", "relative", "luciferase", "units", "detected", "in", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "concentrations", "of", "ATRA", "or", "the", "three", "retinoid", "derivatives", "for", "12", "h", ".", "(", "f", ")", "Mouse", "fibroblasts", "were", "cotransfected", "with", "the", "human", "RXR", "receptor", ",", "a", "relevant", "reporter", "luciferase", "plasmid", "and", "the", "non", "-", "retinoid", "-", "regulated", "Renilla", "reporter", "to", "control", "for", "transfection", ".", "Values", "show", "relative", "luciferase", "units", "detected", "in", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "concentrations", "of", "ATRA", "or", "the", "three", "retinoid", "derivatives", "for", "12", "h", ".", "Cells", "transfected", "as", "in", "e", "were", "treated", "with", "10", "μM", "of", "ATRA", "alone", "or", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "concentrations", "of", "the", "three", "retinoid", "derivatives", "or", "the", "antagonist", "BMS614", "for", "12", "h", ".", "Values", "are", "shown", "as", "RLU", ".", "Values", "in", "c", "-", "f", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "4", "-", "6", ".", "(", "g", ")", "Left", ",", "immunoblot", "for", "LC3", "-", "II", "in", "cells", "treated", "with", "20", "μM", "of", "the", "retinoid", "derivatives", "and", "protease", "inhibitors", "(", "PIs", ")", ",", "as", "labeled", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "loading", "control", ",", "and", "full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "21", ".", "The", "amount", "of", "LC3", "-", "II", "in", "untreated", "cells", ",", "expressed", "as", "fold", "change", "relative", "to", "control", "(", "middle", ")", ",", "and", "the", "increase", "in", "LC3", "-", "II", "after", "PI", "treatment", "(", "LC3", "-", "II", "flux", ",", "right", ")", ",", "expressed", "as", "fold", "change", ",", "were", "calculated", "from", "the", "densitometric", "quantification", "of", "immunoblots", ".", "Values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Mouse fibroblasts expressing the KFERQ-mCherry1 photoactivatable reporter without (None) or with 20 μM of the indicated compounds imaged 16 h after photoactivation. Insets show higher-magnification images. Nuclei are labeled with DAPI. Scale bars, 10 μm. (b) Quantification of the effect of increasing concentrations of GR1 on the same cells. Untreated cells and cells treated with 40 μM ATRA are also shown. Representative images are shown in Supplementary Figure 7. Graph shows the average number of fluorescent puncta per cell, quantified in >50 cells. All values are mean ± s.e.m.(c) Mouse fibroblasts were cotransfected with the human RARα (hRARα) receptor, a relevant reporter luciferase plasmid and the non-retinoid-regulated Renilla reporter to control for transfection. Values show relative luciferase units (RLU) detected in cells subjected to the indicated concentrations of ATRA or the three retinoid derivatives for 12h .(d) Mouse fibroblasts were cotransfected with the human RARα (hRARα) receptor, a relevant reporter luciferase plasmid and the non-retinoid-regulated Renilla reporter to control for transfection.Cells transfected as in c were treated with 100 nM of ATRA alone or in the presence of the indicated concentrations of the three retinoid derivatives or the antagonist BMS614 for 12 h. Values are shown as RLU.(e) Mouse fibroblasts were cotransfected with the human RXR receptor, a relevant reporter luciferase plasmid and the non-retinoid-regulated Renilla reporter to control for transfection. Values show relative luciferase units detected in cells subjected to the indicated concentrations of ATRA or the three retinoid derivatives for 12 h.(f) Mouse fibroblasts were cotransfected with the human RXR receptor, a relevant reporter luciferase plasmid and the non-retinoid-regulated Renilla reporter to control for transfection. Values show relative luciferase units detected in cells subjected to the indicated concentrations of ATRA or the three retinoid derivatives for 12 h. Cells transfected as in e were treated with 10 μM of ATRA alone or in the presence of the indicated concentrations of the three retinoid derivatives or the antagonist BMS614 for 12 h. Values are shown as RLU. Values in c-f are mean ± s.e.m.; n = 4-6.(g) Left, immunoblot for LC3-II in cells treated with 20 μM of the retinoid derivatives and protease inhibitors (PIs), as labeled. Actin is shown as loading control, and full-length blots are shown in Supplementary Figure 21. The amount of LC3-II in untreated cells, expressed as fold change relative to control (middle), and the increase in LC3-II after PI treatment (LC3-II flux, right), expressed as fold change, were calculated from the densitometric quantification of immunoblots. Values are mean ± s.e.m.; n = 3."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Rates", "of", "degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "in", "control", "mouse", "fibroblasts", "or", "RARα", "(", "−", ")", "or", "LAMP", "-", "2A", "(", "−", ")", "(", "L", "-", "2A", "(", "−", ")", ")", "cells", "left", "untreated", "(", "None", ")", "or", "treated", "with", "20", "μM", "of", "the", "indicated", "compounds", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "the", "fold", "change", "in", "proteolytic", "rate", "relative", "to", "the", "rate", "in", "untreated", "cells", "for", "each", "group", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "b", "-", "d", ")", "Control", "mouse", "fibroblasts", "or", "RARα", "(", "−", ")", ",", "LAMP", "-", "2A", "(", "−", ")", "or", "LAMP", "-", "2B", "(", "−", ")", "(", "L", "-", "2B", "(", "−", ")", ")", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "KFERQ", "-", "mCherry1", "photoactivatable", "reporter", "with", "or", "without", "the", "indicated", "compounds", "(", "20", "μM", ")", ".", "In", "b", "are", "shown", "the", "representative", "fields", "and", "high", "-", "magnification", "images", "(", "insets", ")", "for", "GR1", ".", "Nuclei", "are", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Representative", "fields", "for", "GR2", "and", "AR7", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "13", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Average", "number", "of", "fluorescent", "puncta", "per", "cell", "quantified", "in", ">", "50", "cells", "in", "at", "least", "four", "different", "fields", "in", "control", "cells", "and", "RAR", "(", "−", ")", "(", "c", ")", "or", "LAMP", "-", "2B", "(", "−", ")", "(", "d", ")", "cells", ".", "No", "puncta", "were", "detected", "in", "LAMP", "-", "2A", "(", "−", ")", "cells", ".", "(", "e", ")", "Mouse", "fibroblasts", "transfected", "with", "the", "KFERQ", "-", "mCherry1", "photoactivatable", "reporter", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "AR7", "or", "GR1", "or", "with", "both", "compounds", "to", "reach", "the", "same", "final", "concentration", ",", "as", "indicated", ".", "Top", ",", "representative", "fields", "and", "high", "-", "magnification", "images", "(", "insets", ")", ".", "Nuclei", "are", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Bottom", ",", "quantification", "of", "the", "number", "of", "fluorescent", "puncta", "per", "field", "in", "each", "condition", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "In", "a", ",", "c", ",", "d", "and", "e", ",", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "50", "cells", ".", "Differences", "with", "untreated", "samples", "(", "marked", "with", "asterisk", ")", "or", "between", "single", "and", "combined", "treatments", "(", "§", ")", "are", "significant", "for", "P", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Rates of degradation of long-lived proteins in control mouse fibroblasts or RARα(−) or LAMP-2A(−) (L-2A(−)) cells left untreated (None) or treated with 20 μM of the indicated compounds. Values are expressed as the fold change in proteolytic rate relative to the rate in untreated cells for each group; n = 3.(b-d) Control mouse fibroblasts or RARα(−), LAMP-2A(−) or LAMP-2B(−) (L-2B(−)) cells were transfected with the KFERQ-mCherry1 photoactivatable reporter with or without the indicated compounds (20 μM). In b are shown the representative fields and high-magnification images (insets) for GR1. Nuclei are labeled with DAPI. Representative fields for GR2 and AR7 are shown in Supplementary Figure 13. Scale bars, 10 μm. (c,d) Average number of fluorescent puncta per cell quantified in >50 cells in at least four different fields in control cells and RAR(−) (c) or LAMP-2B(−) (d) cells. No puncta were detected in LAMP-2A(−) cells.(e) Mouse fibroblasts transfected with the KFERQ-mCherry1 photoactivatable reporter with the indicated concentrations of AR7 or GR1 or with both compounds to reach the same final concentration, as indicated. Top, representative fields and high-magnification images (insets). Nuclei are labeled with DAPI. Bottom, quantification of the number of fluorescent puncta per field in each condition. Scale bars, 10 μm. In a, c, d and e, values are mean ± s.e.m.; n > 50 cells. Differences with untreated samples (marked with asterisk) or between single and combined treatments (§) are significant for P 0.01."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Immunoblot", "for", "the", "indicated", "proteins", "in", "homogenates", "(", "Hom", ")", "and", "lysosomes", "(", "Lys", ")", "isolated", "from", "cells", "untreated", "(", "None", ")", "or", "treated", "for", "12", "h", "with", "20", "μM", "of", "the", "indicated", "compounds", ".", "(", "b", ")", "mRNA", "levels", "of", "LAMP", "-", "2A", "in", "control", "mouse", "fibroblasts", "(", "left", ")", "or", "RARα", "(", "−", ")", "cells", "(", "right", ")", "treated", "with", "AR7", "or", "paraquat", "(", "PQ", ")", "as", "in", "a", ";", "n", "=", "4", "-", "5", ".", "Values", "are", "presented", "as", "fold", "change", "in", "mRNA", "relative", "to", "untreated", "cells", ".", "(", "c", ")", "Cellular", "viability", "of", "control", "(", "left", ")", "or", "LAMP", "-", "2A", "(", "−", ")", "(", "right", ")", "fibroblasts", "exposed", "to", "2", "mM", "or", "0", ".", "5", "mM", "paraquat", ",", "respectively", ",", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "for", "12", "h", "before", "or", "after", "the", "paraquat", "treatment", ";", "n", "=", "3", ".", "(", "d", ")", "Viability", "of", "mouse", "fibroblasts", "transfected", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "a", "plasmid", "encoding", "α", "-", "synuclein", "and", "left", "untreated", "(", "None", ")", "or", "treated", "with", "1", "mM", "paraquat", "alone", "or", "in", "the", "presence", "of", "20", "μM", "AR7", ";", "n", "=", "3", ".", "In", "b", "-", "d", ",", "all", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Differences", "with", "cells", "that", "are", "untreated", "(", "marked", "with", "asterisk", ")", "or", "those", "treated", "only", "with", "paraquat", "(", "§", ")", "were", "significant", "for", "P", "0", ".", "001", ".", "Full", "-", "length", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "21", ".", "(", "e", ")", "Immunoblot", "for", "α", "-", "synuclein", "(", "α", "-", "syn", ")", "in", "the", "same", "cells", "as", "in", "d", ".", "Top", ",", "higher", "-", "exposure", "blot", "to", "highlight", "oligomeric", "(", "oligo", ")", "species", ".", "Asterisk", "denotes", "nonspecific", "band", ".", "M", ",", "monomer", ";", "MW", ",", "molecular", "weight", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Immunoblot for the indicated proteins in homogenates (Hom) and lysosomes (Lys) isolated from cells untreated (None) or treated for 12 h with 20 μM of the indicated compounds.(b) mRNA levels of LAMP-2A in control mouse fibroblasts (left) or RARα(−) cells (right) treated with AR7 or paraquat (PQ) as in a; n = 4-5. Values are presented as fold change in mRNA relative to untreated cells.(c) Cellular viability of control (left) or LAMP-2A(−) (right) fibroblasts exposed to 2 mM or 0.5 mM paraquat, respectively, and treated with the indicated compounds for 12 h before or after the paraquat treatment; n = 3.(d) Viability of mouse fibroblasts transfected with the indicated concentrations of a plasmid encoding α-synuclein and left untreated (None) or treated with 1 mM paraquat alone or in the presence of 20 μM AR7; n = 3. In b-d, all values are mean ± s.e.m. Differences with cells that are untreated (marked with asterisk) or those treated only with paraquat (§) were significant for P 0.001. Full-length blots are shown in Supplementary Figure 21.(e) Immunoblot for α-synuclein (α-syn) in the same cells as in d. Top, higher-exposure blot to highlight oligomeric (oligo) species. Asterisk denotes nonspecific band. M, monomer; MW, molecular weight."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "The", "Armi", "complex", "immunoisolated", "from", "OSCs", "using", "anti", "-", "Armi", "antibodies", "contains", "Yb", ",", "SoYb", ",", "and", "Vret", ".", "B", ".", "The", "Vret", "complex", "immunoisolated", "from", "OSCs", "using", "anti", "-", "Vret", "antibodies", "contains", "Yb", ",", "Armi", ",", "and", "SoYb", ".", "C", ".", "Silver", "staining", "of", "protein", "components", "in", "the", "Vret", "complex", "The", "lane", "α", "-", "Vret", "(", "left", ")", "contained", "only", "the", "anti", "-", "Vret", "antibodies", "used", "in", "these", "experiments", ".", "D", ".", "Immunoprecipitation", "and", "western", "blotting", "were", "performed", "in", "OSCs", "upon", "RNAi", "treatment", "(", "kd", ")", ".", "Even", "without", "the", "association", "of", "Yb", ",", "Armi", ",", "SoYb", ",", "and", "Vret", "associated", ".", "Yb", "and", "Armi", "remained", "bound", "to", "each", "other", "upon", "SoYb", "or", "Vret", "depletion", ".", "The", "level", "of", "SoYb", "(", "input", ")", "decreased", "upon", "Vret", "depletion", ".", "Likewise", ",", "the", "level", "of", "Vret", "(", "input", ")", "decreased", "upon", "SoYb", "depletion", ".", "E", ".", "Upon", "Armi", "depletion", ",", "SoYb", "and", "Vret", "were", "still", "bound", "to", "each", "other", "but", "this", "heterodimer", "no", "longer", "associated", "with", "Yb", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "analyses", "in", "OSCs", ".", "Yb", "bodies", "disappeared", "upon", "Yb", "depletion", ",", "which", "led", "Armi", ",", "SoYb", "and", "Vret", "to", "be", "localized", "in", "the", "cytosol", ".", "Yb", "bodies", "were", "detected", "in", "OSCs", "upon", "Armi", "depletion", ",", "but", "SoYb", "and", "Vret", "localized", "in", "the", "cytosol", ".", "Armi", "was", "detected", "at", "Yb", "bodies", "upon", "SoYb", "or", "Vret", "depletion", ".", "Yb", "bodies", "are", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. The Armi complex immunoisolated from OSCs using anti-Armi antibodies contains Yb, SoYb, and Vret.B. The Vret complex immunoisolated from OSCs using anti-Vret antibodies contains Yb, Armi, and SoYb.C. Silver staining of protein components in the Vret complex The lane α-Vret (left) contained only the anti-Vret antibodies used in these experiments.D. Immunoprecipitation and western blotting were performed in OSCs upon RNAi treatment (kd). Even without the association of Yb, Armi, SoYb, and Vret associated. Yb and Armi remained bound to each other upon SoYb or Vret depletion. The level of SoYb (input) decreased upon Vret depletion. Likewise, the level of Vret (input) decreased upon SoYb depletion.E. Upon Armi depletion, SoYb and Vret were still bound to each other but this heterodimer no longer associated with Yb.F. Immunofluorescence analyses in OSCs. Yb bodies disappeared upon Yb depletion, which led Armi, SoYb and Vret to be localized in the cytosol. Yb bodies were detected in OSCs upon Armi depletion, but SoYb and Vret localized in the cytosol. Armi was detected at Yb bodies upon SoYb or Vret depletion. Yb bodies are indicated by white arrows. Nuclei are shown in blue. Scale bar: 2 μm."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "In", "Yb", "-", "lacking", "OSCs", "(", "Yb", "kd", ")", ",", "WT", "Yb", "and", "∆", "eTud", "bound", "to", "Armi", "but", "∆", "eTud", "did", "not", ".", "Note", "that", "WT", "Yb", "and", "both", "mutants", "were", "engineered", "to", "be", "RNAi", "-", "resistant", "by", "mutations", ".", "β", "-", "gal", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "C", ".", "In", "normal", "OSCs", ",", "WT", "Yb", "and", "∆", "eTud", "bound", "with", "Yb", "but", "∆", "Hel", "-", "C", "did", "not", ".", "D", ".", "Flag", "-", "Hel", "-", "C", "copurified", "with", "Myc", "-", "Hel", "-", "C", "but", "not", "with", "BSD", "(", "negative", "control", ")", ".", "E", ".", "Subcellular", "localization", "of", "WT", "Yb", "and", "deletion", "mutants", "∆", "Hel", "-", "C", "and", "∆", "eTud", ".", "Myc", "-", "Yb", "is", "shown", "in", "green", ".", "Endogenous", "Armi", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "Western", "blotting", "(", "right", ")", "showing", "WT", "Yb", "and", "deletion", "mutants", "∆", "Hel", "-", "C", "and", "∆", "eTud", "expressed", "in", "Yb", "-", "lacking", "OSCs", ".", "F", ".", "CLIP", "shows", "that", "WT", "Yb", "and", "∆", "Hel", "-", "C", "bind", "RNA", "in", "vivo", "but", "∆", "eTud", "does", "not", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. In Yb-lacking OSCs (Yb kd), WT Yb and ∆eTud bound to Armi but ∆eTud did not. Note that WT Yb and both mutants were engineered to be RNAi-resistant by mutations. β-gal was used as a negative control.C. In normal OSCs, WT Yb and ∆eTud bound with Yb but ∆Hel-C did not.D. Flag-Hel-C copurified with Myc-Hel-C but not with BSD (negative control).E. Subcellular localization of WT Yb and deletion mutants ∆Hel-C and ∆eTud. Myc-Yb is shown in green. Endogenous Armi is shown in red. DAPI shows nuclei (blue). Scale bar: 5 μm. Western blotting (right) showing WT Yb and deletion mutants ∆Hel-C and ∆eTud expressed in Yb-lacking OSCs.F. CLIP shows that WT Yb and ∆Hel-C bind RNA in vivo but ∆eTud does not."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Rescue", "experiments", "showing", "that", "∆", "Hel", "-", "C", "but", "not", "∆", "eTud", "restored", "piRNA", "biogenesis", "attenuated", "by", "endogenous", "Yb", "depletion", ".", "Flag", "-", "Piwi", "was", "expressed", "upon", "endogenous", "Yb", "depletion", ".", "B", ".", "The", "levels", "of", "transposon", "mdg1", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "means", "±", "SEM", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "p", "values", "were", "calculated", "by", "t", "-", "test", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "C", ".", "Mapping", "of", "flam", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", "in", "OSCs", ".", "D", ".", "Mapping", "of", "tj", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", "in", "OSCs", ".", "E", ".", "Scatterplot", "showing", "changes", "in", "the", "abundances", "of", "transposon", "-", "repressing", "piRNAs", "and", "non", "-", "transposon", "-", "repressing", "piRNAs", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "the", "Hel", "-", "C", "domain", ".", "Orange", "and", "blue", "dots", "indicate", "the", "number", "of", "normalized", "piRNA", "reads", "mapped", "uniquely", "to", "transposons", "in", "the", "reverse", "orientation", "and", "coding", "genes", "in", "the", "sense", "orientation", ",", "respectively", ".", "F", ".", "The", "relative", "enrichments", "of", "RNAs", "coimmunopurified", "with", "WT", "Yb", "and", "∆", "Hel", "-", "C", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "means", "±", "SEM", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "In", "addition", "to", "tj", ",", "three", "genic", "piRNA", "sources", "that", "were", "characterized", "in", "previous", "studies", "(", "dm", "/", "Myc", "[", "59", "]", ",", "c", "-", "Fos", "/", "kay", "[", "60", "]", ",", "and", "CG9257", "[", "34", "]", ")", "are", "also", "shown", ".", "rp49", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "p", "value", "was", "calculated", "by", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Rescue experiments showing that ∆Hel-C but not ∆eTud restored piRNA biogenesis attenuated by endogenous Yb depletion. Flag-Piwi was expressed upon endogenous Yb depletion.B. The levels of transposon mdg1 Bars and error bars represent means ± SEM values of three independent experiments. p values were calculated by t-test. *: p < 0.05.C. Mapping of flam-piRNAs produced in the presence and absence of the Hel-C domain in OSCs. D. Mapping of tj-piRNAs produced in the presence and absence of the Hel-C domain in OSCs. E. Scatterplot showing changes in the abundances of transposon-repressing piRNAs and non-transposon-repressing piRNAs in the presence and absence of the Hel-C domain. Orange and blue dots indicate the number of normalized piRNA reads mapped uniquely to transposons in the reverse orientation and coding genes in the sense orientation, respectively.F. The relative enrichments of RNAs coimmunopurified with WT Yb and ∆Hel-C. Bars and error bars represent means ± SEM values of three independent experiments. In addition to tj, three genic piRNA sources that were characterized in previous studies (dm/Myc [59], c-Fos/kay [60], and CG9257 [34]) are also shown. rp49 was used as a negative control. p value was calculated by t-test. ***: p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Yb", "bodies", "(", "Yb", "in", "green", ")", "disappeared", "after", "1", ",", "6", "-", "hexanediol", "treatment", "of", "OSCs", ",", "as", "did", "P", "bodies", "(", "Dcp1", "in", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "B", ".", "Snapshots", "of", "live", "imaging", "of", "GFP", "-", "Yb", "expressed", "in", "OSCs", "Fusion", "-", "and", "fission", "-", "like", "dynamics", "of", "Yb", "bodies", "were", "observed", ".", "Saturated", "pixels", "are", "shown", "in", "red", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "μm", ".", "C", ".", "Yb", "Y23A", "and", "F129A", "mutants", "(", "green", ")", "impaired", "Yb", "body", "formation", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "D", ".", "Yb", "Y23A", "and", "F129A", "mutants", "failed", "to", "produce", "flam", "-", "piRNAs", ".", "miR", "-", "310", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "E", ".", "Mapping", "of", "flam", "-", "and", "tj", "-", "piRNAs", "produced", "in", "the", "flamKG", "mutant", "and", "heterozygote", "ovaries", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Yb bodies (Yb in green) disappeared after 1,6-hexanediol treatment of OSCs, as did P bodies (Dcp1 in red). Nuclei are shown in blue. Scale bar: 5 μm.B. Snapshots of live imaging of GFP-Yb expressed in OSCs Fusion- and fission-like dynamics of Yb bodies were observed. Saturated pixels are shown in red. Scale bar: 0.5 μm.C. Yb Y23A and F129A mutants (green) impaired Yb body formation. Nuclei are shown in blue. Scale bar: 5 μm.D. Yb Y23A and F129A mutants failed to produce flam-piRNAs. miR-310 was used as a loading control.E. Mapping of flam- and tj-piRNAs produced in the flamKG mutant and heterozygote ovaries."}
{"words": ["Figure", "1A", "Phenotypes", "of", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "seedlings", "on", "MS", "medium", "with", "2", "%", "sucrose", ".", "Scale", "bars", "=", "0", ".", "5", "cm", ".", "B", ",", "C", "Phenotypes", "and", "chlorophyll", "fluorescence", "images", "of", "6", "-", "week", "-", "old", "WT", ",", "dja6", "dja5", "and", "complemented", "plants", "(", "B", ")", "on", "MS", "medium", "with", "2", "%", "sucrose", ",", "scale", "bars", "=", "0", ".", "5", "cm", ";", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", "and", "RNAi", "mutants", "(", "C", ")", "grown", "on", "soil", ",", "­", "­", "­", "scale", "bars", "=", "1", "cm", ".", "Fluorescences", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "were", "measured", "with", "the", "FluorCam700MF", "and", "visualized", "using", "a", "pseudocolor", "index", "as", "indicated", "on", "the", "right", ".", "D", "Chlorophyll", "content", "of", "total", "leaves", "in", "6", "-", "week", "-", "old", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "seedlings", ".", "FW", ",", "fresh", "weight", ".", "Data", "are", "the", "means", "±", "SEM", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", ")", ".", "E", "The", "ultrastructure", "of", "plastids", "from", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "mutants", ".", "T", ",", "thylakoids", ".", "Scale", "bars", "=", "0", ".", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Phenotypes of WT, dja6, dja5, dja6 dja5 and RNAi seedlings on MS medium with 2% sucrose. Scale bars = 0.5 cm.B,C Phenotypes and chlorophyll fluorescence images of 6-week-old WT, dja6 dja5 and complemented plants (B) on MS medium with 2% sucrose, scale bars = 0.5 cm; WT, dja6, dja5 and RNAi mutants (C) grown on soil,­­­ scale bars = 1 cm. Fluorescences in (B) and (C) were measured with the FluorCam700MF and visualized using a pseudocolor index as indicated on the right.D Chlorophyll content of total leaves in 6-week-old WT, dja6, dja5, dja6 dja5 and RNAi seedlings. FW, fresh weight. Data are the means ± SEM (n = 7 biological replicates).E The ultrastructure of plastids from WT, dja6, dja5, dja6 dja5 and RNAi mutants. T, thylakoids. Scale bars = 0.2 μm."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Total", "protein", "was", "extracted", "from", "4", "-", "week", "-", "old", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "seedlings", ",", "respectively", ".", "WT", "and", "dja6", "dja5", "used", "in", "(", "A", ")", "were", "grown", "on", "MS", "medium", "with", "2", "%", "sucrose", ",", "while", "WT", ",", "dja6", ",", "dja5", "and", "RNAi", "mutants", "used", "in", "(", "B", ")", "were", "grown", "on", "soil", ".", "10", "μg", "protein", "was", "loaded", ",", "except", "for", "detection", "with", "anti", "-", "SUFE1", "and", "anti", "-", "SUFA", "antiserum", ",", "for", "which", "25", "μg", "were", "loaded", ".", "Specific", "bands", "were", "identified", "by", "immunoblotting", "and", "by", "their", "molecular", "weight", ",", "and", "are", "indicated", "by", "asterisks", ".", "Designations", "of", "photosynthetic", "protein", "complexes", "and", "their", "diagnostic", "components", "are", "labeled", "on", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ".", "The", "Fe", "-", "S", "types", "of", "Fe", "-", "S", "proteins", "are", "shown", "in", "parentheses", ".", "Actin", "served", "as", "controls", "to", "normalize", "protein", "levels", ".", "For", "each", "protein", ",", "three", "independent", "biological", "replicates", "were", "performed", "and", "a", "representative", "one", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B Total protein was extracted from 4-week-old WT, dja6, dja5, dja6 dja5 and RNAi seedlings, respectively. WT and dja6 dja5 used in (A) were grown on MS medium with 2% sucrose, while WT, dja6, dja5 and RNAi mutants used in (B) were grown on soil. 10 μg protein was loaded, except for detection with anti-SUFE1 and anti-SUFA antiserum, for which 25 μg were loaded. Specific bands were identified by immunoblotting and by their molecular weight, and are indicated by asterisks. Designations of photosynthetic protein complexes and their diagnostic components are labeled on the left and right, respectively. The Fe-S types of Fe-S proteins are shown in parentheses. Actin served as controls to normalize protein levels. For each protein, three independent biological replicates were performed and a representative one is shown."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", "Metal", "concentrations", "in", "the", "WT", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "mutants", ".", "Fe", "concentrations", "in", "total", "leaves", "(", "A", "and", "B", ")", "and", "total", "chloroplast", "(", "C", ")", "from", "4", "-", "week", "-", "old", "WT", ",", "dja6", "dja5", "and", "RNAi", "mutants", "were", "quantified", "by", "inductively", "coupled", "plasma", "mass", "spectrometry", ",", "and", "are", "shown", "as", "means", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "of", "μg", "g", "-", "1", "dry", "weight", "(", "DW", ")", ".", "WT", "and", "RNAi", "mutants", "used", "in", "(", "A", "and", "C", ")", "were", "grown", "on", "soil", ",", "while", "WT", "and", "dja6", "dja5", "seedlings", "used", "in", "(", "B", ")", "were", "grown", "on", "MS", "medium", "with", "2", "%", "sucrose", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "additional", "independent", "biological", "experiments", ".", "Asterisks", "indicate", "significant", "differences", "from", "the", "value", "of", "WT", "(", "two", "-", "sample", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", "Volcano", "plot", "of", "the", "result", "from", "quantitative", "transcriptome", "profiling", "in", "WT", "and", "dja6", "dja5", "mutant", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "on", "the", "X", "-", "axis", "represent", "the", "Log2", "-", "ratio", "of", "FC", "(", "fold", "change", ")", "between", "the", "absolute", "abundances", "of", "transcripts", "identified", "from", "dja6", "dja5", "against", "WT", ".", "The", "Y", "-", "axis", "represents", "the", "Log10", "of", "FDR", "(", "false", "discovery", "rate", ")", ".", "All", "DEGs", "(", "differentially", "expressed", "genes", ")", "with", "FDR", "<", "0", ".", "01", "and", "FC", ">", "2", "are", "marked", "in", "grey", ",", "while", "all", "iron", "-", "related", "DEGs", "with", "FDR", "<", "0", ".", "01", "and", "FC", ">", "2", "are", "marked", "in", "red", ".", "The", "iron", "-", "related", "DEGs", "labeled", "with", "red", "dots", "within", "the", "black", "boxes", "are", "referred", "to", "in", "the", "text", ".", "All", "data", "are", "based", "on", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C Metal concentrations in the WT, dja6 dja5 and RNAi mutants. Fe concentrations in total leaves (A and B) and total chloroplast (C) from 4-week-old WT, dja6 dja5 and RNAi mutants were quantified by inductively coupled plasma mass spectrometry, and are shown as means ± SEM (n = 3 biological replicates) of μg g-1 dry weight (DW). WT and RNAi mutants used in (A and C) were grown on soil, while WT and dja6 dja5 seedlings used in (B) were grown on MS medium with 2% sucrose. Similar results were obtained in two additional independent biological experiments. Asterisks indicate significant differences from the value of WT (two-sample Student's t-test; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).D Volcano plot of the result from quantitative transcriptome profiling in WT and dja6 dja5 mutant. Statistical analysis was performed using Student's t-test. Data on the X-axis represent the Log2-ratio of FC (fold change) between the absolute abundances of transcripts identified from dja6 dja5 against WT. The Y-axis represents the Log10 of FDR (false discovery rate). All DEGs (differentially expressed genes) with FDR < 0.01 and FC > 2 are marked in grey, while all iron-related DEGs with FDR < 0.01 and FC > 2 are marked in red. The iron-related DEGs labeled with red dots within the black boxes are referred to in the text. All data are based on three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4D", "DJA6", "can", "bind", "Fe2", "+", "in", "chloroplast", ".", "Arabidopsis", "mesophyll", "protoplasts", "were", "transformed", "with", "plasmids", "that", "express", "the", "indicated", "gene", "constructs", ",", "respectively", ".", "The", "untransformed", "protoplasts", "and", "protoplasts", "transformed", "with", "non", "-", "fused", "EBFP", "proteins", "were", "used", "as", "controls", ".", "The", "protoplasts", "were", "further", "stained", "by", "FeRhoNoxTM", "-", "1", "(", "red", ")", "to", "visualize", "the", "cellular", "distribution", "of", "Fe2", "+", ".", "Green", ",", "EBFP", "fluorescence", "signals", ";", "magenta", ",", "chloroplast", "autofluorescence", "signals", ";", "yellow", ",", "regions", "where", "the", "EBFP", "and", "FeRhoNoxTM", "-", "1", "fluorescence", "signals", "merged", ".", "The", "speckles", "which", "DJA6", "-", "EBFP", "co", "-", "localizes", "with", "FeRhoNoxTM", "-", "1", "are", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D DJA6 can bind Fe2+ in chloroplast. Arabidopsis mesophyll protoplasts were transformed with plasmids that express the indicated gene constructs, respectively. The untransformed protoplasts and protoplasts transformed with non-fused EBFP proteins were used as controls. The protoplasts were further stained by FeRhoNoxTM-1 (red) to visualize the cellular distribution of Fe2+. Green, EBFP fluorescence signals; magenta, chloroplast autofluorescence signals; yellow, regions where the EBFP and FeRhoNoxTM-1 fluorescence signals merged. The speckles which DJA6-EBFP co-localizes with FeRhoNoxTM-1 are indicated by white arrows. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5B", "Co", "-", "IP", "assays", "for", "the", "interactions", "of", "DJA6", "with", "SUFE1", "and", "SUFC", ".", "Total", "protein", "extracts", "of", "protoplasts", "co", "-", "transfected", "with", "designated", "constructs", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "indicated", "on", "the", "right", ".", "Input", "(", "left", "lane", ")", "indicates", "that", "100", "μg", "total", "protein", "was", "loaded", "on", "the", "gel", ".", "G", ",", "H", "BiFC", "analyses", "for", "the", "interactions", "between", "truncated", "forms", "of", "DJA6", "and", "SUFE1", "or", "SUFC", "in", "Arabidopsis", "mesophyll", "protoplasts", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Co-IP assays for the interactions of DJA6 with SUFE1 and SUFC. Total protein extracts of protoplasts co-transfected with designated constructs were subjected to immunoprecipitation, and then analyzed by immunoblotting with antibodies indicated on the right. Input (left lane) indicates that 100 μg total protein was loaded on the gel.G, H BiFC analyses for the interactions between truncated forms of DJA6 and SUFE1 or SUFC in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Scale bars = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "7C", "Phenotypes", "and", "chlorophyll", "fluorescence", "images", "of", "6", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "35Spro", ":", "SynDJA6", "-", "FLAG", "/", "dja6", "dja5", "transgenic", "plants", "grown", "on", "soil", ".", "Scale", "bars", "=", "1", "cm", ".", "D", "Expression", "of", "FLAG", "-", "tagged", "SynDJA6", "in", "35Spro", ":", "SynDJA6", "-", "FLAG", "/", "dja6", "dja5", "transgenic", "plants", ".", "Total", "leaf", "extracts", "(", "100", "μg", "proteins", ")", "from", "WT", "and", "transgenic", "seedlings", "were", "loaded", ".", "FLAG", "-", "tagged", "SynDJA6", "is", "indicated", "by", "asterisk", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C Phenotypes and chlorophyll fluorescence images of 6-week-old WT and 35Spro:SynDJA6-FLAG/dja6 dja5 transgenic plants grown on soil. Scale bars = 1 cm.D Expression of FLAG-tagged SynDJA6 in 35Spro:SynDJA6-FLAG/dja6 dja5 transgenic plants. Total leaf extracts (100 μg proteins) from WT and transgenic seedlings were loaded. FLAG-tagged SynDJA6 is indicated by asterisk."}
{"words": ["Figure", "1Tissue", "microarrays", "(", "TMAs", ")", "from", "primary", "PCa", "(", "n", "=", "132", ")", "and", "CRPC", "(", "n", "=", "148", ")", "were", "stained", "via", "immunohistochemistry", "for", "poly", "(", "ADP", "-", "ribose", ")", "(", "PAR", ")", ",", "and", "scored", "by", "a", "clinical", "pathologist", "(", "T", ".", "Parsons", ")", "for", "intensity", "(", "0", "-", "3", ")", "and", "percentage", "(", "0", "-", "3", ")", "PAR", "score", "was", "generated", "via", "the", "equation", ":", "(", "intensity", "x", "1", ")", "+", "(", "percentage", "x", "2", ")", ".", "PAR", "scores", "were", "compared", "between", "primary", "and", "CRPC", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "value", "<", "0", ".", "0001", "by", "Chi", "-", "square", "testManual", "PAR", "scores", "were", "divided", "in", "to", "quartiles", "and", "then", "were", "compared", "to", "progression", "-", "free", "survival", "in", "the", "CRPC", "TMAs", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", "by", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "Representative", "image", "of", "one", "TMA", "core", "after", "multiplex", "fluorescent", "IHC", "for", "γH2AX", "(", "green", ")", ",", "PAR", "(", "red", ")", ",", "PARP", "-", "1", "(", "purple", ")", ",", "with", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Top", "Right", ":", "Insets", "of", "parent", "image", "at", "left", ".", "Numbers", "above", "inset", "columns", "coincide", "with", "numbers", "on", "image", "at", "left", "that", "were", "chosen", "for", "further", "magnification", "and", "representation", "(", "boxed", "areas", ")", ".", "Bottom", "Left", ":", "Percent", "positive", "staining", "for", "PAR", "for", "the", "entirety", "of", "each", "TMA", "cohort", ".", "Bottom", "Middle", ":", "Percent", "positive", "staining", "for", "PARP", "-", "1", ".", "Bottom", "right", ":", "γH2AX", "for", "the", "entirety", "of", "each", "TMA", "cohort", ".", "Data", "was", "considered", "after", "a", "median", "intensity", "cutoff", ",", "and", "analyzed", "for", "statistical", "significance", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", "for", "PAR", ",", "PARP", "-", "1", ",", "and", "γH2AX", ",", "respectively", ".", "Exact", "p", "values", "are", "indiTwo", "-", "tailed", "Spearman", "correlation", "test", "between", "PAR", "and", "γH2AX", "(", "%", "positive", "with", "a", "median", "intensity", "cut", "-", "off", ")", ".", "Exact", "p", "values", "are", "indicated", "when"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Tissue microarrays (TMAs) from primary PCa (n=132) and CRPC (n=148) were stained via immunohistochemistry for poly(ADP-ribose) (PAR), and scored by a clinical pathologist (T. Parsons) for intensity (0-3) and percentage (0-3) PAR score was generated via the equation: (intensity x 1) + (percentage x 2). PAR scores were compared between primary and CRPC. ****=p value<0.0001 by Chi-square testManual PAR scores were divided in to quartiles and then were compared to progression-free survival in the CRPC TMAs. *=p<0.05, ns=not statistically significant by Log-rank (Mantel-Cox)Representative image of one TMA core after multiplex fluorescent IHC for γH2AX (green), PAR (red), PARP-1 (purple), with DNA (blue). Top Right: Insets of parent image at left. Numbers above inset columns coincide with numbers on image at left that were chosen for further magnification and representation (boxed areas). Bottom Left: Percent positive staining for PAR for the entirety of each TMA cohort. Bottom Middle: Percent positive staining for PARP-1. Bottom right: γH2AX for the entirety of each TMA cohort. Data was considered after a median intensity cutoff, and analyzed for statistical significance using two-tailed Student\"s t-test for PAR, PARP-1, and γH2AX, respectively. Exact p values are indiTwo-tailed Spearman correlation test between PAR and γH2AX (% positive with a median intensity cut-off). Exact p values are indicated when available"}
{"words": ["Figure", "2Top", ",", "left", ":", "Schematic", "representing", "the", "conditions", "utilized", "for", "transcriptomic", "analyses", "(", "n", "=", "2", ")", "of", "HT", "-", "sensitive", "LNCaP", "cells", ".", "Cells", "were", "deprived", "of", "hormones", "for", "72", "hours", ",", "followed", "by", "either", "treatment", "with", "2", ".", "5uM", "veliparib", "(", "PARPi", ")", "or", "vehicle", "control", "(", "DMSO", ")", "for", "1", "hour", ",", "then", "subsequently", "treated", "with", "either", "1nM", "DHT", "or", "vehicle", "control", "(", "EtOH", ")", "for", "16", "hours", ".", "Top", ",", "right", ":", "Immunoblot", "with", "the", "indicated", "antisera", ".", "Bottom", ":", "Volcano", "plots", "of", "transcripts", "found", "to", "be", "differentially", "regulated", "by", "DHT", "v", ".", "EtOH", "(", "left", ")", "or", "DHT", "v", ".", "PARPi", "followed", "by", "DHT", "(", "right", ")", ".", "Red", "dots", "indicate", "transcripts", "that", "were", "both", "statistically", "significantly", "altered", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "more", "than", "1", ".", "5", "-", "fold", "changedTop", ",", "left", ":", "Schematic", "representing", "the", "conditions", "utilized", "for", "transcriptomic", "analyses", "(", "n", "=", "2", ")", "of", "CRPC", "C4", "-", "2", "cells", ".", "Cells", "were", "deprived", "of", "hormones", "for", "72", "hours", ",", "followed", "by", "either", "treatment", "with", "2", ".", "5uM", "veliparib", "(", "PARPi", ")", "or", "vehicle", "control", "(", "DMSO", ")", "for", "for", "16", "hours", ".", "Top", ",", "right", ":", "Immunoblot", "with", "the", "indicated", "antisera", ".", "Bottom", ":", "Volcano", "plots", "of", "transcripts", "found", "to", "be", "differentially", "regulated", "PARPi", "v", ".", "vehicle", "control", ".", "Red", "dots", "indicate", "transcripts", "that", "were", "both", "statistically", "significantly", "altered", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "more", "than", "1", ".", "5", "-", "fold", "changedGenes", "found", "to", "be", "down", "-", "regulated", "by", "PARPi", "as", "described", "above", "(", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "1", ".", "5", "-", "fold", "change", ")", "in", "either", "HT", "-", "sensitive", "cells", "(", "left", ")", "or", "CRPC", "cells", "(", "right", ")", "were", "queried", "against", "the", "expression", "of", "these", "genes", "in", "the", "Grasso", "et", "al", "data", "set", "in", "Oncomine", ".", "Benign", "=", "grey", ",", "primary", "PCa", "=", "blue", ",", "metastases", "=", "orange", ".", "Boxplot", "was", "generated", "using", "the", "mean", "expression", "of", "the", "PARPi", "down", "-", "regulated", "genes", "in", "the", "indicated", "data", "sets", ".", "Statistical", "significance", "determined", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Top, left: Schematic representing the conditions utilized for transcriptomic analyses (n=2) of HT-sensitive LNCaP cells. Cells were deprived of hormones for 72 hours, followed by either treatment with 2.5uM veliparib (PARPi) or vehicle control (DMSO) for 1 hour, then subsequently treated with either 1nM DHT or vehicle control (EtOH) for 16 hours. Top, right: Immunoblot with the indicated antisera. Bottom: Volcano plots of transcripts found to be differentially regulated by DHT v. EtOH (left) or DHT v. PARPi followed by DHT (right). Red dots indicate transcripts that were both statistically significantly altered (p<0.05) and more than 1.5-fold changedTop, left: Schematic representing the conditions utilized for transcriptomic analyses (n=2) of CRPC C4-2 cells. Cells were deprived of hormones for 72 hours, followed by either treatment with 2.5uM veliparib (PARPi) or vehicle control (DMSO) for for 16 hours. Top, right: Immunoblot with the indicated antisera. Bottom: Volcano plots of transcripts found to be differentially regulated PARPi v. vehicle control. Red dots indicate transcripts that were both statistically significantly altered (p<0.05) and more than 1.5-fold changedGenes found to be down-regulated by PARPi as described above (p value < 0.05, 1.5-fold change) in either HT-sensitive cells (left) or CRPC cells (right) were queried against the expression of these genes in the Grasso et al data set in Oncomine. Benign = grey, primary PCa = blue, metastases = orange. Boxplot was generated using the mean expression of the PARPi down-regulated genes in the indicated data sets. Statistical significance determined by two-tailed Student\"s t"}
{"words": ["Figure", "3Indicated", "cell", "lines", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determine", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", "where", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "LNCaP", ":", "E2F1", ",", "p", "=", "0", ".", "0159", ";", "PCNA", ",", "p", "=", "0", ".", "0217", ";", "MCM7", ",", "p", "=", "4", ".", "0936e", "-", "6", ";", "CCNA2", ",", "p", "=", "0", ".", "0005", ".", "C4", "-", "2", ":", "E2F1", ",", "p", "=", "0", ".", "0074", ";", "PCNA", ",", "p", "=", "0", ".", "1258", ";", "MCM7", ",", "p", "=", "3", ".", "7471e", "-", "5", ";", "CCNA2", ",", "p", "=", "0ChIP", "-", "qPCR", "after", "C4", "-", "2", "cells", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "biological", "experimentsAthymic", "nude", "mice", "were", "injected", "with", "C4", "-", "2", "cell", "mixed", "with", "matrigel", ".", "Once", "tumors", "became", "100mm3", ",", "mice", "were", "treated", "with", "either", "vehicle", "control", "or", "veliparib", ".", "72", "hours", "later", ",", "tumors", "were", "harvested", ",", "RNA", "was", "isolated", "and", "used", "for", "qPCR", "quantification", "of", "the", "indicated", "transcripts", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "log2", "absolute", "gene", "regulation", "of", "veliparib", "samples", "compared", "to", "control", "samples", ",", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "xenograft", "tumorsProstatectomy", "tissue", "(", "n", "=", "6", ")", "was", "cultured", "as", "previously", "described", ",", "and", "treated", "with", "either", "vehicle", "control", "or", "veliparib", "for", "six", "days", ".", "RNA", "was", "then", "harvested", "from", "the", "tissues", "and", "used", "for", "qPCR", "quantification", "of", "the", "indicated", "transcripts", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "log2", "absolute", "gene", "regulation", "of", "veliparib", "samples", "compared", "to", "control", "samples", "Each", "individual", "tissue", "is", "depicted", "by", "a", "separate", "bar"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Indicated cell lines were treated as depicted in Figure 2. Data are depicted as mean +/- standard deviation of three independent biological experiments. Statistical significance was determine by two-tailed Student\"s t test where *=p<0.05, **=p<0.01,***=p<0.001, ****=p<0.0001. LNCaP: E2F1, p=0.0159; PCNA, p=0.0217; MCM7, p=4.0936e-6; CCNA2, p=0.0005. C4-2: E2F1, p=0.0074; PCNA, p=0.1258; MCM7, p=3.7471e-5; CCNA2, p=0ChIP-qPCR after C4-2 cells were treated as depicted in Figure 2. Data are depicted as mean +/- standard deviation of three independent biological experimentsAthymic nude mice were injected with C4-2 cell mixed with matrigel. Once tumors became 100mm3, mice were treated with either vehicle control or veliparib. 72 hours later, tumors were harvested, RNA was isolated and used for qPCR quantification of the indicated transcripts. Data are depicted as log2 absolute gene regulation of veliparib samples compared to control samples, +/- standard deviation of three independent xenograft tumorsProstatectomy tissue (n=6) was cultured as previously described, and treated with either vehicle control or veliparib for six days. RNA was then harvested from the tissues and used for qPCR quantification of the indicated transcripts. Data are depicted as log2 absolute gene regulation of veliparib samples compared to control samples Each individual tissue is depicted by a separate bar color"}
{"words": ["Figure", "4Indicated", "cell", "lines", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", ",", "and", "labeled", "with", "bromodeoxyuridine", "(", "BrdU", ")", ",", "harvested", "at", "indicated", "time", "points", "and", "utilized", "for", "FACS"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Indicated cell lines were treated as depicted in Figure 2, and labeled with bromodeoxyuridine (BrdU), harvested at indicated time points and utilized for FACS analyses"}
{"words": ["Figure", "5Left", ":", "Data", "generated", "as", "described", "above", "in", "Figure", "2", "was", "used", "to", "generate", "a", "heatmap", "of", "homologous", "recombination", "(", "HR", ")", "gene", "expression", "after", "the", "indicated", "treatment", "regimens", ".", "Middle", ":", "Selected", "GSEA", "MSigDB", "Oncogenic", "Signature", "pathways", "are", "shown", ".", "Right", ":", "Data", "generated", "as", "described", "above", "in", "Figure", "2", "was", "compared", "to", "a", "previously", "described", "HR", "deficiency", "transcriptional", "profile", "(", "Peng", "et", "al", ".", ",", "Nature", "Communications", ",", "2014", ")", ".", "This", "profile", "was", "derived", "by", "independently", "silencing", "either", "BRCA1", ",", "RAD51", ",", "or", "BRIP1", ",", "followed", "by", "transcriptional", "analyses", ".", "The", "union", "of", "these", "three", "data", "sets", "was", "used", "to", "generate", "the", "signature", ".", "Cut", "-", "offs", "for", "comparison", "were", "a", "p", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "and", "fold", "change", "of", "1", ".", "5", ".", "Venn", "diagrams", "show", "the", "overlapping", "and", "non", "-", "overlapping", "genes", "of", "both", "down", "-", "(", "top", ")", "and", "up", "-", "regulated", "(", "bottom", ")", "genes", "in", "the", "previously", "-", "defined", "HR", "deficiency", "signature", ",", "and", "the", "PARPi", "-", "responsive", "transcriptomeLeft", ":", "C4", "-", "2", "cells", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "mean", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", "where", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "BRCA2", ",", "p", "=", "0", ".", "0046", ";", "RAD51", ",", "p", "=", "0", ".", "0151", ";", "XRCC3", ",", "p", "=", "0", ".", "0341", ";", "TOP3A", ",", "p", "=", "0", ".", "04988", ".", "Right", ":", "C4", "-", "2", "cells", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antisera", ".", "Quantifications", "shown", "below", "eachAthymic", "nude", "mice", "were", "injected", "with", "C4", "-", "2", "cell", "mixed", "with", "matrigel", ".", "Once", "tumors", "became", "100mm3", ",", "mice", "were", "treated", "with", "either", "vehicle", "control", "or", "veliparib", ".", "72", "hours", "later", ",", "tumors", "were", "harvested", ",", "RNA", "was", "isolated", "and", "used", "for", "qPCR", "quantification", "of", "the", "indicated", "transcripts", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "log2", "absolute", "gene", "regulation", "of", "veliparib", "samples", "compared", "to", "control", "samples", ",", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "xenograft", "tumorsProstatectomy", "tissue", "(", "n", "=", "6", ")", "was", "cultured", "as", "previously", "described", ",", "and", "treated", "with", "either", "vehicle", "control", "or", "veliparib", "for", "six", "days", ".", "RNA", "was", "then", "harvested", "from", "the", "tissues", "and", "used", "for", "qPCR", "quantification", "of", "the", "indicated", "transcripts", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "log2", "absolute", "gene", "regulation", "of", "veliparib", "samples", "compared", "to", "control", "samples", ".", "Each", "individual", "tissue", "is", "depicted", "by", "a", "separate", "bar", "color", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "by", "Wilcoxon", "signed", "rank", "testC4", "-", "2", "cells", "were", "treated", "as", "depicted", "in", "Figure", "2", ".", "ChIP", "was", "performed", "using", "the", "indicated", "antisera", ",", "and", "the", "subsequent", "DNA", "was", "isolated", "and", "used", "in", "qPCR", "reaction", "using", "primers", "designed", "to", "amplify", "the", "indicated", "genomic", "loci", ":", "BRCA2", "enhancer", ",", "RAD51", "promoter", ",", "or", "TOP3A", "promoterC4", "-", "2", "cells", "treated", "with", "2", ".", "5uM", "veliparib", "(", "Vel", ".", ")", "or", "vehicle", "control", "(", "Veh", ".", ")", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", ",", "lysed", ",", "and", "differentially", "centrifuged", "as", "described", "in", "the", "material", "and", "methods", "section", ",", "resulting", "in", "a", "soluble", "fraction", "(", "Sol", ".", ")", "(", "GAPDH", "serves", "as", "control", ")", "or", "a", "chromatin", "-", "tethered", "fraction", "(", "Teth", ".", ")", "(", "histone", "H4", "serves", "as", "control", ")", ".", "Immunoblots", "were", "performed", "for", "the", "indicated"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Left: Data generated as described above in Figure 2 was used to generate a heatmap of homologous recombination (HR) gene expression after the indicated treatment regimens. Middle: Selected GSEA MSigDB Oncogenic Signature pathways are shown. Right: Data generated as described above in Figure 2 was compared to a previously described HR deficiency transcriptional profile (Peng et al., Nature Communications, 2014). This profile was derived by independently silencing either BRCA1, RAD51, or BRIP1, followed by transcriptional analyses. The union of these three data sets was used to generate the signature. Cut-offs for comparison were a p value<0.05, and fold change of 1.5. Venn diagrams show the overlapping and non-overlapping genes of both down- (top) and up-regulated (bottom) genes in the previously-defined HR deficiency signature, and the PARPi-responsive transcriptomeLeft: C4-2 cells were treated as depicted in Figure 2. Data are depicted as mean +/- standard deviation of three independent biological experiments. Statistical significance was determined by two-tailed Student\"s t test where *=p<0.05, **=p<0.01. BRCA2, p=0.0046; RAD51, p=0.0151; XRCC3, p=0.0341; TOP3A, p=0.04988. Right: C4-2 cells were treated as depicted in Figure 2 and immunoblotted with the indicated antisera. Quantifications shown below eachAthymic nude mice were injected with C4-2 cell mixed with matrigel. Once tumors became 100mm3, mice were treated with either vehicle control or veliparib. 72 hours later, tumors were harvested, RNA was isolated and used for qPCR quantification of the indicated transcripts. Data are depicted as log2 absolute gene regulation of veliparib samples compared to control samples, +/- standard deviation of three independent xenograft tumorsProstatectomy tissue (n=6) was cultured as previously described, and treated with either vehicle control or veliparib for six days. RNA was then harvested from the tissues and used for qPCR quantification of the indicated transcripts. Data are depicted as log2 absolute gene regulation of veliparib samples compared to control samples. Each individual tissue is depicted by a separate bar color. Statistical analyses were performed by Wilcoxon signed rank testC4-2 cells were treated as depicted in Figure 2. ChIP was performed using the indicated antisera, and the subsequent DNA was isolated and used in qPCR reaction using primers designed to amplify the indicated genomic loci: BRCA2 enhancer, RAD51 promoter, or TOP3A promoterC4-2 cells treated with 2.5uM veliparib (Vel.) or vehicle control (Veh.) for 24 hours. Cells were then harvested, lysed, and differentially centrifuged as described in the material and methods section, resulting in a soluble fraction (Sol.) (GAPDH serves as control) or a chromatin-tethered fraction (Teth.) (histone H4 serves as control). Immunoblots were performed for the indicated proteins"}
{"words": ["Figure", "6Expression", "levels", "of", "indicated", "HR", "pathway", "genes", "in", "primary", "PCa", "vs", "normal", "patient", "samples", ".", "Violin", "plots", "represent", "FPKM", "normalized", "counts", "obtained", "from", "matched", "tumor", "and", "normal", "RNA", "-", "Seq", "data", "from", "TCGA", "(", "n", "=", "52", ")", "with", "p", "-", "values", "generated", "using", "paired", "t", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Expression levels of indicated HR pathway genes in primary PCa vs normal patient samples. Violin plots represent FPKM normalized counts obtained from matched tumor and normal RNA-Seq data from TCGA (n=52) with p-values generated using paired t-tests"}
{"words": ["Figure", "7Indicated", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "indicated", "constructs", ",", "and", "treated", "with", "veliparib", ".", "Cell", "growt", "was", "assessed", "LNCaP", "cell", "growth", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "0220", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "67787", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "4676", ".", "C4", "-", "2", "cell", "growth", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "0354", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "1638", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "2519", ".", "22Rv1", "cell", "growth", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "0039", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "1085", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "2781Indicated", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "indicated", "constructs", ",", "and", "treated", "with", "veliparib", "DDR", "via", "γH2AX", "was", "assessed", "LNCaP", "γH2AX", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "0008", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "9035", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "4685", ".", "C4", "-", "2", "γH2AX", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "0009", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "6362", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "4217", ".", "22Rv1", "γH2AX", ":", "Control", "transfection", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "BRCA1", "transfection", ",", "p", "=", "0", ".", "4698", ";", "BRCA2", "transfection", ",", "p", "=", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Indicated cell lines were transfected with indicated constructs, and treated with veliparib. Cell growt was assessed LNCaP cell growth: Control transfection, p=0.0220; BRCA1 transfection, p=0.67787; BRCA2 transfection, p=0.4676. C4-2 cell growth: Control transfection, p=0.0354; BRCA1 transfection, p=0.1638; BRCA2 transfection, p=0.2519. 22Rv1 cell growth: Control transfection, p=0.0039; BRCA1 transfection, p=0.1085; BRCA2 transfection, p=0.2781Indicated cell lines were transfected with indicated constructs, and treated with veliparib DDR via γH2AX was assessed LNCaP γH2AX: Control transfection, p=0.0008; BRCA1 transfection, p=0.9035; BRCA2 transfection, p=0.4685. C4-2 γH2AX: Control transfection, p=0.0009; BRCA1 transfection, p=0.6362; BRCA2 transfection, p=0.4217. 22Rv1 γH2AX: Control transfection, p<0.0001; BRCA1 transfection, p=0.4698; BRCA2 transfection, p=0.4937"}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", ".", "CHO", "cells", "expressing", "PD", "-", "L1", "alone", "(", "A", ")", "or", "co", "-", "expressing", "CD80", "(", "B", ")", "or", "CD86", "(", "C", ")", "were", "stained", "with", "CD80", "Ig", ",", "PD", "-", "1", "Ig", ",", "CTLA", "-", "4", "Ig", "or", "anti", "-", "PD", "-", "L1", "Ab", "clones", "MIH1", ",", "MIH3", ",", "29E", ".", "2A3", ")", "at", "1µg", "/", "ml", "for", "30", "min", "at", "37", "°", "C", ".", "Representative", "FACS", "plots", "show", "staining", "plotted", "against", "total", "PD", "-", "L1", "mCherry", "levels", ".", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "an", "immunoprecipitation", "by", "anti", "-", "mCherry", "antibody", "(", "PDL1", ")", "from", "indicated", "DG", "-", "75", "cell", "lysates", ",", "with", "and", "without", "the", "BS3", "crosslinker", ",", "and", "probed", "for", "mCherry", "(", "PD", "-", "L1", ")", "or", "GFP", "(", "CD80", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C. CHO cells expressing PD-L1 alone (A) or co-expressing CD80 (B) or CD86 (C) were stained with CD80 Ig, PD-1 Ig, CTLA-4 Ig or anti-PD-L1 Ab clones MIH1, MIH3, 29E.2A3) at 1µg/ml for 30 min at 37°C. Representative FACS plots show staining plotted against total PD-L1 mCherry levels.E. Western blot analysis of an immunoprecipitation by anti-mCherry antibody (PDL1) from indicated DG-75 cell lysates, with and without the BS3 crosslinker, and probed for mCherry (PD-L1) or GFP (CD80)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Transendocytosis", "assays", "were", "carried", "out", "overnight", "using", "CHO", "donor", "cells", "(", "CD80GFP", "alone", "or", "CD80GFP", "with", "PD", "-", "L1mCherry", "co", "-", "expression", ")", "incubated", "with", "CTLA", "-", "4", "recipient", "cells", "at", "a", "ratio", "of", "1", ":", "1", ".", "Recipient", "cells", "either", "lacked", "CTLA", "-", "4", "(", "No", "CTLA", "-", "4", ")", "or", "expressed", "CTLA", "-", "4", ".", "FACS", "plots", "show", "CD80GFP", "ligand", "loss", "from", "donor", "cells", "highlighted", "in", "blue", "quadrants", "in", "the", "presence", "of", "CTLA", "-", "4", "+", "recipients", ".", "C", "-", "F", ".", "Transendocytosis", "assays", "were", "performed", "at", "a", "ratio", "of", "2", "donor", ":", "1", "CTLA", "-", "4", "recipient", "for", "the", "times", "indicated", ".", "(", "C", ")", ",", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "CD80GFP", "levels", "and", "(", "D", ")", "full", "kinetic", "analysis", "of", "CD80", "or", "CD86", "downregulation", "on", "donor", "cells", "quantified", "as", "a", "percentage", "relative", "to", "no", "CTLA", "-", "4", "control", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "3", "independent", "experiments", ",", "ns", "-", "not", "significant", ":", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "PD", "-", "L1mCherry", "level", "at", "time", "points", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Full", "kinetic", "analysis", "of", "PD", "-", "L1mCherry", "level", "on", "donor", "cells", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Transendocytosis assays were carried out overnight using CHO donor cells (CD80GFP alone or CD80GFP with PD-L1mCherry co-expression) incubated with CTLA-4 recipient cells at a ratio of 1:1. Recipient cells either lacked CTLA-4 (No CTLA-4) or expressed CTLA-4. FACS plots show CD80GFP ligand loss from donor cells highlighted in blue quadrants in the presence of CTLA-4+ recipients.C-F. Transendocytosis assays were performed at a ratio of 2 donor:1 CTLA-4 recipient for the times indicated. (C), Representative FACS plots showing CD80GFP levels and (D) full kinetic analysis of CD80 or CD86 downregulation on donor cells quantified as a percentage relative to no CTLA-4 control (mean ± SEM, 3 independent experiments, ns - not significant: two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). (E) Representative FACS plots showing PD-L1mCherry level at time points indicated. (F) Full kinetic analysis of PD-L1mCherry level on donor cells (mean ± SEM, 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Levels", "of", "CD86GFP", "and", "PD", "-", "L1mCherry", "remaining", "on", "donor", "cells", "over", "a", "24h", "transendocytosis", "period", "with", "CTLA", "-", "4", "WT", "or", "Del36", "plotted", "relative", "to", "no", "CTLA", "-", "4", "control", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "6", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "RM", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Levels of CD86GFP and PD-L1mCherry remaining on donor cells over a 24h transendocytosis period with CTLA-4 WT or Del36 plotted relative to no CTLA-4 control (mean ± SEM, 6 independent experiments). ****P≤0.0001, RM one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "B", ".", "APC", "-", "labelled", "PD", "-", "1", "Ig", "(", "0", ".", "75µg", "/", "ml", ")", "was", "used", "to", "detect", "PD", "-", "L1", "in", "DG", "-", "75", "cells", "co", "-", "expressing", "CD80GFP", "(", "A", ")", "or", "CD86GFP", "(", "B", ")", ".", "Staining", "was", "carried", "out", "following", "transendocytosis", "using", "Jurkat", "cells", "expressing", "no", "CTLA", "-", "4", ",", "CTLA", "-", "4", "WT", "or", "CTLA", "-", "4", "Del36", "(", "at", "a", "ratio", "of", "1", ":", "1", ")", "for", "the", "indicated", "durations", ".", "(", "A", ")", "shows", "representative", "FACS", "plots", "of", "CD80GFP", "vs", ".", "PD", "-", "1", "Ig", "at", "the", "time", "points", "indicated", ",", "with", "full", "kinetic", "data", "plotted", "below", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ":", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "As", "for", "(", "A", ")", "except", "using", "CD86", "-", "PD", "-", "L1", "expressing", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-B. APC-labelled PD-1 Ig (0.75µg/ml) was used to detect PD-L1 in DG-75 cells co-expressing CD80GFP (A) or CD86GFP (B). Staining was carried out following transendocytosis using Jurkat cells expressing no CTLA-4, CTLA-4 WT or CTLA-4 Del36 (at a ratio of 1:1) for the indicated durations. (A) shows representative FACS plots of CD80GFP vs. PD-1 Ig at the time points indicated, with full kinetic data plotted below (mean ± SEM, 3 independent experiments, ***P≤0.001, ****P≤0.0001: two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test). (B) As for (A) except using CD86-PD-L1 expressing cells."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Staining", "of", "free", "PD", "-", "L1", "with", "APC", "-", "conjugated", "PD", "-", "1", "Ig", "in", "DG", "-", "75", "cells", "expressing", "only", "PD", "-", "L1mCherry", ",", "using", "cell", "lines", "with", "increasing", "ratios", "of", "CD80GFP", ":", "PD", "-", "L1mCherry", "compared", "to", "CD80GFP", "only", ".", "FACS", "plots", "are", "representative", "of", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Staining of free PD-L1 with APC-conjugated PD-1 Ig in DG-75 cells expressing only PD-L1mCherry, using cell lines with increasing ratios of CD80GFP: PD-L1mCherry compared to CD80GFP only. FACS plots are representative of 4 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "DG", "-", "75", "B", "cells", "expressing", "CD80GFP", "or", "CD86GFP", "(", "green", ")", "and", "PD", "-", "L1mCherry", "(", "red", ")", "were", "incubated", "with", "Jurkat", "cells", "(", "nuclei", "shown", "in", "grey", ")", "expressing", "CTLA", "-", "4", "WT", "or", "mutant", "CTLA", "-", "4", "Del36", "for", "the", "indicated", "durations", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "2", "hours", "prior", "to", "assay", "endpoint", ",", "APC", "-", "labelled", "PD", "-", "1", "Ig", "(", "0", ".", "75µg", "/", "ml", ")", "was", "added", ".", "CD80", "/", "CD86", "and", "PD", "-", "L1", "co", "-", "localisation", "at", "the", "immune", "synapse", "is", "shown", "in", "yellow", "with", "PD", "-", "1", "Ig", "binding", "shown", "in", "purple", ".", "Scale", "bar", ",", "10µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. DG-75 B cells expressing CD80GFP or CD86GFP (green) and PD-L1mCherry (red) were incubated with Jurkat cells (nuclei shown in grey) expressing CTLA-4 WT or mutant CTLA-4 Del36 for the indicated durations and analysed by confocal microscopy. 2 hours prior to assay endpoint, APC-labelled PD-1 Ig (0.75µg/ml) was added. CD80/CD86 and PD-L1 co-localisation at the immune synapse is shown in yellow with PD-1 Ig binding shown in purple. Scale bar, 10µm."}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "Flow", "cytometry", "plots", "of", "CD80GFP", "levels", "on", "DG", "-", "75", "B", "-", "cells", "(", "gated", "on", "CTFR", "+", "cells", ")", "at", "24h", "with", "graphical", "representation", "of", "the", "MFI", "in", "each", "condition", "(", "RH", "graph", ")", ".", "The", "Jreg", "cells", "used", ",", "and", "the", "anti", "-", "PD", "-", "1", "status", "is", "indicated", "above", "the", "plot", ".", "C", ".", "Flow", "cytometry", "plots", "of", "CD28", "levels", "indicating", "contact", "between", "the", "CD80", "+", "APC", "and", "the", "PD", "-", "1", "+", "CD28", "+", "responder", "Jurkat", "T", "-", "cells", ",", "following", "CD80", "transendocytosis", ".", "Graphical", "representation", "of", "the", "CD28", "MFI", "in", "each", "condition", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "D", ".", "Flow", "cytometry", "of", "CD69", "levels", "on", "responder", "Jurkat", "T", "-", "cells", "and", "graphical", "representation", "of", "CD69", "MFI", "in", "each", "condition", ".", "E", ".", "Flow", "cytometry", "of", "CD69", "levels", "on", "CD28KO", "(", "PD", "-", "1", "+", ")", "responder", "Jurkat", "T", "-", "cells", "and", "graphical", "representation", "of", "the", "CD69", "+", "cells", "MFI", "in", "each", "condition", ".", "Cartoons", "on", "the", "left", "of", "B", "-", "E", "illustrate", "the", "cell", "type", "analysed", ".", "Data", "information", ":", "Data", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "showing", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "ns", "-", "not", "significant", ":", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. Flow cytometry plots of CD80GFP levels on DG-75 B-cells (gated on CTFR+ cells) at 24h with graphical representation of the MFI in each condition (RH graph). The Jreg cells used, and the anti-PD-1 status is indicated above the plot. C. Flow cytometry plots of CD28 levels indicating contact between the CD80+ APC and the PD-1+ CD28+ responder Jurkat T-cells, following CD80 transendocytosis. Graphical representation of the CD28 MFI in each condition is shown on the right. D. Flow cytometry of CD69 levels on responder Jurkat T-cells and graphical representation of CD69 MFI in each condition. E. Flow cytometry of CD69 levels on CD28KO (PD-1+) responder Jurkat T-cells and graphical representation of the CD69+ cells MFI in each condition. Cartoons on the left of B-E illustrate the cell type analysed. Data information: Data is representative of 3 independent experiments showing mean ± SEM. *P≤0.05, **P≤0.01, ns - not significant: two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "8B", ".", "Titration", "of", "Abatacept", "staining", "(", "left", "hand", "panel", ")", "and", "EC50", "values", "of", "Abatacept", "(", "right", "hand", "panel", ")", "for", "CD80", "only", "or", "PD", "-", "L1", "/", "CD80", "co", "-", "expressing", "DG", "-", "75", ".", "Data", "information", ":", "Data", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "showing", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "ns", "-", "not", "significant", ":", "paired", "t", "-", "test", "(", "B", ")", "D", ".", "Comparison", "of", "PD", "-", "L1", "detection", "using", "PD", "-", "1", "-", "Ig", "or", "anti", "-", "PD", "-", "L1", "antibodies", "(", "MIH3", "or", "29E", ".", "2A3", "clone", ")", "with", "and", "without", "prior", "incubation", "with", "10µg", "/", "ml", "of", "abatacept", ",", "based", "on", "data", "from", "(", "C", ")", ".", "E", ".", "Graphs", "showing", "PD", "-", "L1", "detection", "under", "conditions", "used", "in", "(", "C", ")", "following", "different", "Abatacept", "incubation", "periods", "(", "30mins", ",", "3h", "or", "6h", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "showing", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "ns", "-", "not", "significant", ":", "RM", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B. Titration of Abatacept staining (left hand panel) and EC50 values of Abatacept (right hand panel) for CD80 only or PD-L1/CD80 co-expressing DG-75. Data information: Data is representative of 3 independent experiments showing mean ± SEM. *P≤0.05, **P≤0.01, ns - not significant: paired t-test (B)D. Comparison of PD-L1 detection using PD-1-Ig or anti-PD-L1 antibodies (MIH3 or 29E.2A3 clone) with and without prior incubation with 10µg/ml of abatacept, based on data from (C). E. Graphs showing PD-L1 detection under conditions used in (C) following different Abatacept incubation periods (30mins, 3h or 6h). Data information: Data is representative of 3 independent experiments showing mean ± SEM. *P≤0.05, **P≤0.01, ns - not significant: RM one-way ANOVA (D)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "the", "D391N", "DIS3L2", "-", "RNA", "complexes", ".", "RNAs", "were", "radioactively", "labeled", "at", "the", "5", "'", "end", "and", "DIS3L2", "-", "bound", "RNAs", "were", "detected", "by", "autoradiography", ".", "The", "negative", "control", "was", "performed", "with", "HEK293T", "-", "Rex", "cells", "(", "Control", ")", "B", ".", "DIS3L2", "CLIP", "reads", "possess", "oligo", "(", "U", ")", "3", "'", "termini", ".", "Histograms", "of", "reads", "with", "3", "'", "-", "terminal", "stretches", "of", "identical", "nucleotides", ".", "Only", "oligo", "(", "U", ")", "tails", "longer", "than", "4", "nucleotides", "are", "observed", ".", "C", ".", "The", "untemplated", "uridylation", "is", "mostly", "found", "in", "the", "proximity", "of", "mature", "3", "'", "RNA", "ends", ".", "The", "heat", "map", "shows", "the", "coverage", "of", "various", "RNA", "types", "by", "uridylated", "reads", ".", "RNA", "class", "and", "number", "of", "uridylated", "genes", "/", "transcripts", "for", "each", "category", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "The", "length", "of", "each", "mature", "RNA", "was", "scaled", "to", "100", "%", ".", "D", ".", "List", "of", "DIS3L2", "-", "bound", "uridylated", "miRNAs", "with", "the", "number", "of", "uridylated", "reads", "identified", "in", "all", "three", "replicate", "CLIPs", ".", "Members", "of", "the", "let", "-", "7", "family", "are", "shown", "in", "bold", ".", "F", ".", "Secondary", "structure", "of", "pre", "-", "hsa", "-", "let", "-", "7i", ",", "with", "both", "5p", "and", "3p", "mature", "products", "highlighted", "in", "bold", ".", "The", "intramolecular", "ligation", "position", "is", "indicated", "in", "dash", "line", "between", "nt", "28", "and", "61", ".", "It", "corresponds", "to", "cleavage", "positions", "of", "RNaseT1", ",", "which", "leaves", "3", "'", "-", "terminal", "guanosine", "residues", ".", "G", ".", "D391N", "DIS3L2", "overexpression", "does", "not", "cause", "abundance", "changes", "of", "CLIPed", "uridylated", "RNAs", ".", "Scatter", "plot", "of", "transcript", "abundances", "estimated", "from", "RNA", "-", "seq", "from", "the", "cell", "line", "overexpressing", "D391N", "DIS3L2", "and", "control", "HEK293T", "-", "Rex", "cells", ".", "CLIPed", "transcripts", "are", "marked", "in", "white", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. SDS-PAGE analysis of the D391N DIS3L2-RNA complexes. RNAs were radioactively labeled at the 5' end and DIS3L2-bound RNAs were detected by autoradiography. The negative control was performed with HEK293T-Rex cells (Control)B. DIS3L2 CLIP reads possess oligo(U) 3' termini. Histograms of reads with 3'-terminal stretches of identical nucleotides. Only oligo(U) tails longer than 4 nucleotides are observed.C. The untemplated uridylation is mostly found in the proximity of mature 3' RNA ends. The heat map shows the coverage of various RNA types by uridylated reads. RNA class and number of uridylated genes/transcripts for each category are indicated on the left. The length of each mature RNA was scaled to 100%.D. List of DIS3L2-bound uridylated miRNAs with the number of uridylated reads identified in all three replicate CLIPs. Members of the let-7 family are shown in bold.F. Secondary structure of pre-hsa-let-7i, with both 5p and 3p mature products highlighted in bold. The intramolecular ligation position is indicated in dash line between nt 28 and 61. It corresponds to cleavage positions of RNaseT1, which leaves 3'-terminal guanosine residues.G. D391N DIS3L2 overexpression does not cause abundance changes of CLIPed uridylated RNAs. Scatter plot of transcript abundances estimated from RNA-seq from the cell line overexpressing D391N DIS3L2 and control HEK293T-Rex cells. CLIPed transcripts are marked in white."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Types", "of", "uridylated", "ncRNAs", "identified", "by", "DIS3L2", "CLIP", "-", "seq", ".", "B", ".", "U", "+", "read", "coverage", "in", "downstream", "regions", "of", "mature", "U12", "snRNA", ",", "Vault1", "and", "7SL", "ncRNAs", ".", "The", "full", "dark", "box", "is", "representing", "mature", "ncRNA", ",", "the", "thin", "line", "indicates", "the", "region", "downstream", "of", "the", "mature", "3", "'", "end", "(", "extension", ")", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "DIS3L2", "D391N", "RIP", "analysis", "of", "U12", "and", "U5D", "snRNAs", "showing", "number", "of", "snRNA", "clones", "with", "mature", "(", "Mat", ")", ",", "extended", "(", "ext", ")", "or", "trimmed", "(", "Trim", ")", "3", "'", "end", ".", "+", "U", "is", "number", "of", "clones", "with", "untemplated", "3", "'", "oligo", "(", "U", ")", "ends", ".", "For", "more", "details", "see", "Figure", "S2", ".", "(", "D", ")", "An", "example", "of", "hybrid", "reads", "(", "produced", "by", "intra", "-", "strand", "ligation", "of", "RNaseT1", "products", "during", "CLIP", "protocol", ")", "for", "RNU5D", "snRNA", ".", "E", ".", "U", "+", "reads", "mapped", "to", "the", "rDNA", "locus", "by", "using", "the", "artificial", "chromosome", "U13369", ".", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Types of uridylated ncRNAs identified by DIS3L2 CLIP-seq.B. U+ read coverage in downstream regions of mature U12 snRNA, Vault1 and 7SL ncRNAs. The full dark box is representing mature ncRNA, the thin line indicates the region downstream of the mature 3' end (extension).C. Quantification of DIS3L2 D391N RIP analysis of U12 and U5D snRNAs showing number of snRNA clones with mature (Mat), extended (ext) or trimmed (Trim) 3' end. +U is number of clones with untemplated 3' oligo(U) ends. For more details see Figure S2. (D) An example of hybrid reads (produced by intra-strand ligation of RNaseT1 products during CLIP protocol) for RNU5D snRNA.E. U+ reads mapped to the rDNA locus by using the artificial chromosome U13369.1."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Uridylated", "tRNA", "reads", "overlap", "mainly", "with", "3", "'", "trailers", ",", "T", "-", "loop", "and", "anticodon", "loop", "regions", ".", "Heat", "map", "showing", "the", "coverage", "of", "uridylated", "reads", "on", "pre", "-", "tRNAs", ".", "The", "pre", "-", "tRNA", "sub", "-", "regions", "(", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", ")", "are", "in", "small", "letters", "on", "the", "x", "-", "axis", ".", "C", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "RNAs", "immunoprecipitated", "with", "Flag", "-", "tagged", "WT", "(", "DIS3L2", ")", "and", "D391N", "(", "MUT", ")", "DIS3L2", ",", "AGO2", "and", "DIS3", ",", "respectively", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "radioactively", "labeled", "probes", "for", "5", "'", "and", "3", "'", "ends", "of", "mature", "tRNAVal", ",", "respectively", ".", "D", ".", "Sequencing", "of", "MUT", "DIS3L2", "-", "bound", "tRNAVal", "and", "tRNALeu", "confirmed", "the", "uridylation", "status", "of", "the", "tRNA", "fragments", "identified", "by", "CLIP", "-", "seq", ".", "Genomic", "sequence", "for", "each", "tRNA", "is", "indicated", "on", "top", "with", "the", "3", "'", "trailer", "region", "separated", "by", "a", "vertical", "line", ".", "Non", "-", "templated", "uridine", "residues", "are", "in", "red", ".", "E", ".", "Identification", "of", "hybrid", "reads", "(", "produced", "by", "intra", "-", "strand", "ligation", "of", "RNaseT1", "products", "during", "CLIP", "protocol", ")", "mapping", "to", "tRNAPhe", "(", "GAA", ")", "and", "tRNAAsn", "(", "GTT", ")", "genes", ".", "To", "the", "right", ":", "the", "schematic", "representation", "of", "selected", "hybrid", "reads", "with", "corresponding", "color", "-", "code", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Uridylated tRNA reads overlap mainly with 3' trailers, T-loop and anticodon loop regions. Heat map showing the coverage of uridylated reads on pre-tRNAs. The pre-tRNA sub-regions (as indicated in (A)) are in small letters on the x-axis.C. Northern blot analysis of RNAs immunoprecipitated with Flag-tagged WT (DIS3L2) and D391N (MUT) DIS3L2, AGO2 and DIS3, respectively. The blots were probed with radioactively labeled probes for 5' and 3' ends of mature tRNAVal, respectively.D. Sequencing of MUT DIS3L2-bound tRNAVal and tRNALeu confirmed the uridylation status of the tRNA fragments identified by CLIP-seq. Genomic sequence for each tRNA is indicated on top with the 3' trailer region separated by a vertical line. Non-templated uridine residues are in red.E. Identification of hybrid reads (produced by intra-strand ligation of RNaseT1 products during CLIP protocol) mapping to tRNAPhe(GAA) and tRNAAsn(GTT) genes. To the right: the schematic representation of selected hybrid reads with corresponding color-code."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "DIS3L2", "-", "bound", "uridylated", "mRNA", "reads", "map", "to", "the", "5", "'", "and", "3", "'", "UTRs", ".", "B", ".", "Most", "3", "'", "UTR", "U", "+", "reads", "match", "the", "stem", "-", "loop", "structure", "of", "histone", "mRNAs", ".", "Heat", "map", "representation", "of", "the", "uridylation", "position", ".", "C", ".", "The", "uridylated", "aberrant", "RNAs", "are", "stabilized", "in", "cells", "with", "nonfunctional", "DIS3L2", ".", "Small", "RNAs", "were", "modified", "with", "3", "'", "end", "linker", ",", "and", "linker", "-", "specific", "primer", "was", "used", "for", "cDNA", "synthesis", ".", "Uridylated", "RNAs", "were", "PCR", "amplified", "in", "a", "semi", "-", "quantitative", "way", "with", "the", "same", "amount", "of", "input", "RNA", "used", "for", "RT", "reaction", ".", "We", "used", "a", "combination", "of", "the", "gene", "-", "and", "linker", "-", "specific", "primers", ",", "-", "RT", "ctrl", "is", "RT", "-", "PCR", "control", ",", "where", "no", "reverse", "transcriptase", "was", "added", ";", "PCR", "control", "is", "a", "reaction", "with", "no", "cDNA", "added", ".", "The", "graph", "on", "the", "right", "summarizes", "the", "percentage", "of", "uridylated", "and", "nonuridylated", "5", "'", "fragments", "of", "OAT", "mRNA", "in", "HEK293T", "-", "Rex", "cells", "(", "Ctrl", ")", "and", "cells", "overexpressing", "mutant", "DIS3L2", "(", "D391N", ")", ".", "D", ".", "DIS3L2", "-", "bound", "uridylated", "RNAs", "are", "degraded", "by", "DIS3L2", "in", "vivo", ".", "RT", "-", "PCR", "amplification", "of", "5", "'", "mRfs", "of", "OAT", "and", "RPL12", "genes", "and", "3", "'", "extended", "forms", "of", "U12", "snRNA", "(", "RNU12", "ext", ")", "from", "HEK293T", "cell", "lines", "with", "modified", "expression", "of", "DIS3L2", "(", "as", "marked", "on", "top", ")", "was", "performed", "as", "described", "in", "C", ".", "Regions", "of", "mature", "5S", "rRNA", "and", "7SL", "RNA", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "DIS3L2", "KO", "is", "a", "DIS3L2", "knock", "-", "out", "cell", "line", ".", "DIS3L2", "rescue", "is", "DIS3L2", "KO", "cells", "with", "stably", "integrated", "mutant", "(", "D391N", ")", "and", "wild", "type", "(", "WT", ")", "DIS3L2", "expressing", "constructs", ",", "respectively", ".", "Bands", "marked", "with", "*", "are", "unspecific", "primer", "-", "dimer", "PCR", "products", ".", "E", ".", "Metagene", "analysis", "of", "the", "position", "of", "DIS3L2", "D391N", "clipped", "U", "+", "reads", "peak", "maximum", "around", "mRNA", "transcription", "start", "sites", "(", "TSS", ")", "and", "of", "the", "ChIP", "-", "seq", "data", "for", "RNAP", "II", ".", "F", ".", "U", "+", "5", "'", "mRfs", "and", "aberrant", "forms", "of", "U12", "snRNA", "are", "highly", "enriched", "in", "the", "cytoplasm", ".", "RT", "-", "PCR", "detection", "of", "5", "'", "mRfs", "of", "the", "OAT", "and", "RPL12", "and", "aberrant", "form", "of", "U12", "snRNA", "was", "performed", "as", "described", "in", "C", "with", "RNA", "isolated", "from", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", ",", "respectively", ".", "The", "RT", "-", "PCR", "amplification", "of", "the", "body", "of", "5S", "rRNA", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "for", "RNA", "isolation", "and", "RT", "reaction", "in", "both", "fractions", ".", "The", "identity", "and", "uridylation", "status", "of", "cytoplasmic", "OAT", "U", "+", "5", "'", "mRfs", "was", "confirmed", "by", "sequencing", "(", "shown", "on", "the", "bottom", ")", ".", "In", "red", "are", "untemplated", "nucleotides", ",", "in", "green", "region", "corresponding", "to", "the", "first", "intron", "of", "OAT", "pre", "-", "mRNA", ".", "The", "efficiency", "of", "the", "subcellular", "fractionation", "was", "monitored", "by", "western", "blot", "(", "right", "panel", ",", "WB", ")", ".", "DDX5", "is", "nucleoplasmic", ",", "ACO2", "is", "mitochondrial", ",", "and", "DIS3L2", "and", "TUBa", "are", "cytoplasmic", "markers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. DIS3L2-bound uridylated mRNA reads map to the 5' and 3' UTRs.B. Most 3' UTR U+ reads match the stem-loop structure of histone mRNAs. Heat map representation of the uridylation position.C. The uridylated aberrant RNAs are stabilized in cells with nonfunctional DIS3L2. Small RNAs were modified with 3' end linker, and linker-specific primer was used for cDNA synthesis. Uridylated RNAs were PCR amplified in a semi-quantitative way with the same amount of input RNA used for RT reaction. We used a combination of the gene- and linker-specific primers, -RT ctrl is RT-PCR control, where no reverse transcriptase was added; PCR control is a reaction with no cDNA added. The graph on the right summarizes the percentage of uridylated and nonuridylated 5' fragments of OAT mRNA in HEK293T-Rex cells (Ctrl) and cells overexpressing mutant DIS3L2 (D391N).D. DIS3L2-bound uridylated RNAs are degraded by DIS3L2 in vivo. RT-PCR amplification of 5'mRfs of OAT and RPL12 genes and 3' extended forms of U12 snRNA (RNU12 ext) from HEK293T cell lines with modified expression of DIS3L2 (as marked on top) was performed as described in C. Regions of mature 5S rRNA and 7SL RNA were used as loading controls. DIS3L2 KO is a DIS3L2 knock-out cell line. DIS3L2 rescue is DIS3L2 KO cells with stably integrated mutant (D391N) and wild type (WT) DIS3L2 expressing constructs, respectively. Bands marked with * are unspecific primer-dimer PCR products.E. Metagene analysis of the position of DIS3L2 D391N clipped U+ reads peak maximum around mRNA transcription start sites (TSS) and of the ChIP-seq data for RNAP II.F. U+5'mRfs and aberrant forms of U12 snRNA are highly enriched in the cytoplasm. RT-PCR detection of 5'mRfs of the OAT and RPL12 and aberrant form of U12 snRNA was performed as described in C with RNA isolated from nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. The RT-PCR amplification of the body of 5S rRNA was used as a positive control for RNA isolation and RT reaction in both fractions. The identity and uridylation status of cytoplasmic OAT U+5'mRfs was confirmed by sequencing (shown on the bottom). In red are untemplated nucleotides, in green region corresponding to the first intron of OAT pre-mRNA. The efficiency of the subcellular fractionation was monitored by western blot (right panel, WB). DDX5 is nucleoplasmic, ACO2 is mitochondrial, and DIS3L2 and TUBa are cytoplasmic markers."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "genomic", "view", "showing", "the", "distribution", "of", "normalized", "22nt", "small", "RNA", "reads", "from", "Caco", "-", "2", "and", "A549", "-", "ACE2", "cells", "at", "24", "and", "48", "hpi", ".", "The", "most", "abundant", "small", "RNAs", "are", "marked", "by", "the", "red", "and", "blue", "boxes", ".", "For", "all", "the", "experiments", "shown", "n", "=", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) SARS-CoV-2 genomic view showing the distribution of normalized 22nt small RNA reads from Caco-2 and A549-ACE2 cells at 24 and 48 hpi. The most abundant small RNAs are marked by the red and blue boxes. For all the experiments shown n=2."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "conservation", "along", "the", "nucleotide", "positions", "in", "the", "ORF7a", "among", "4", ",", "055", ",", "609", "sequenced", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "genomes", ".", "The", "first", "70", "nt", "are", "shown", "in", "red", "and", "shows", "a", "higher", "percentage", "of", "conservation", "compared", "to", "the", "rest", "of", "the", "sequence", "of", "ORF7a", ".", "Boxplot", "shows", "the", "distribution", "of", "conservation", "percentage", "for", "each", "nucleotide", "either", "in", "the", "first", "70", "nt", "or", "71", "-", "366", "nt", "of", "ORF7a", "among", "4", ",", "055", ",", "609", "sequenced", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "genomes", ".", "Box", "plots", "display", "median", "(", "line", ")", ",", "first", "and", "third", "quartiles", "(", "box", ")", ",", "and", "5th", "/", "95th", "percentile", "value", "(", "whiskers", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "outliers", ".", "Two", "-", "tailed", "P", "values", "were", "calculated", "using", "the", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Percentage of conservation along the nucleotide positions in the ORF7a among 4,055,609 sequenced SARS-CoV-2 genomes. The first 70 nt are shown in red and shows a higher percentage of conservation compared to the rest of the sequence of ORF7a. Boxplot shows the distribution of conservation percentage for each nucleotide either in the first 70 nt or 71-366 nt of ORF7a among 4,055,609 sequenced SARS-CoV-2 genomes. Box plots display median (line), first and third quartiles (box), and 5th /95th percentile value (whiskers). Each dot represents the outliers. Two-tailed P values were calculated using the student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Log2", "fold", "changes", "of", "the", "levels", "of", "hsa", "-", "miR", "-", "let", "-", "7a", ",", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", "and", "COV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "in", "DICER1", "knockdown", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "infected", "A549", "-", "ACE2", "cells", "compared", "to", "control", "cells", "analyzed", "by", "stem", "-", "loop", "RT", "-", "qPCR", ".", "Results", "from", "three", "independent", "replicates", "are", "shown", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "kinetics", "of", "DICER1", "mediated", "cleavage", "of", "pre", "-", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", "stem", "-", "loop", "precursor", ",", "pre", "-", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", "with", "mutations", "that", "prevent", "the", "formation", "of", "stem", "-", "loop", "structure", "and", "pre", "-", "hsa", "-", "miR21", ".", "Folded", "conformations", "for", "the", "three", "precursor", "molecules", "are", "shown", ".", "Fold", "change", "in", "the", "production", "of", "mature", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "is", "shown", "in", "presence", "of", "DICER1", "compared", "to", "control", "reaction", "(", "no", "DICER1", ")", "as", "measure", "by", "stem", "-", "loop", "RT", "-", "qPCR", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "the", "average", "and", "standard", "deviation", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Expression", "levels", "of", "the", "virus", "-", "derived", "miRNAs", "as", "a", "percentage", "of", "the", "viral", "genome", ".", "Absolute", "quantification", "of", "virus", "-", "derived", "miRNAs", "and", "viral", "genome", "from", "infected", "A549", "-", "ACE2", "cells", "was", "performed", "using", "two", "spike", "-", "in", "(", "see", "methods", ")", ".", "Line", "represents", "the", "average", "and", "individual", "dots", "represent", "data", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "copy", "number", "per", "cell", "of", "hsa", "-", "miR", "-", "let", "-", "7a", ",", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", "and", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "in", "infected", "A549", "-", "ACE2", "cells", "quantified", "using", "a", "synthetic", "small", "RNA", "spike", "-", "in", "standard", "curve", "by", "stem", "-", "loop", "RT", "-", "qPCR", ".", "Levels", "of", "hsa", "-", "miR", "-", "let", "-", "7a", "were", "normalized", "for", "the", "percentage", "of", "infected", "cells", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "the", "average", "and", "standard", "deviation", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Loading", "of", "hsa", "-", "miR", "-", "let", "-", "7a", ",", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", "and", "COV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "into", "AGOs", "as", "measured", "by", "stem", "-", "loop", "RT", "-", "qPCR", "and", "analyzed", "as", "a", "percentage", "of", "input", "from", "the", "immunoprecipitates", "(", "IPs", ")", "of", "either", "pan", "-", "AGO", "IP", "or", "control", "IgG", "IP", "from", "infected", "A549", "-", "ACE2", "cells", ".", "Levels", "of", "miRNA", "were", "normalized", "for", "the", "percentage", "of", "infected", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Log2 fold changes of the levels of hsa-miR-let-7a, CoV2-miR-O7a.1 and COV2-miR-O7a.2 in DICER1 knockdown SARS-CoV-2-infected A549-ACE2 cells compared to control cells analyzed by stem-loop RT-qPCR. Results from three independent replicates are shown.(B) In vitro kinetics of DICER1 mediated cleavage of pre-CoV2-miR-O7a stem-loop precursor, pre-CoV2-miR-O7a with mutations that prevent the formation of stem-loop structure and pre-hsa-miR21. Folded conformations for the three precursor molecules are shown. Fold change in the production of mature CoV2-miR-O7a.2 is shown in presence of DICER1 compared to control reaction (no DICER1) as measure by stem-loop RT-qPCR. Bars and error bars represent the average and standard deviation from three independent experiments.(C) Expression levels of the virus-derived miRNAs as a percentage of the viral genome. Absolute quantification of virus-derived miRNAs and viral genome from infected A549-ACE2 cells was performed using two spike-in (see methods). Line represents the average and individual dots represent data from two independent experiments.(D) copy number per cell of hsa-miR-let-7a, CoV2-miR-O7a.1 and CoV2-miR-O7a.2 in infected A549-ACE2 cells quantified using a synthetic small RNA spike-in standard curve by stem-loop RT-qPCR. Levels of hsa-miR-let-7a were normalized for the percentage of infected cells. Bars and error bars represent the average and standard deviation from at least three independent experiments.(E) Loading of hsa-miR-let-7a, CoV2-miR-O7a.1 and COV2-miR-O7a.2 into AGOs as measured by stem-loop RT-qPCR and analyzed as a percentage of input from the immunoprecipitates (IPs) of either pan-AGO IP or control IgG IP from infected A549-ACE2 cells. Levels of miRNA were normalized for the percentage of infected cells."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Relative", "firefly", "luciferase", "normalized", "to", "Renilla", "luciferase", "of", "pmirGLO", "Dual", "-", "Luciferase", "miRNA", "Target", "Expression", "Vector", "with", "either", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "target", "site", "or", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "site", "with", "mutations", "in", "seed", "region", "at", "24", "h", "on", "co", "-", "transfection", "with", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "or", "control", "miRNA", "mimics", ".", "Activity", "on", "transfecting", "control", "miRNA", "mimic", "was", "considered", "100", "%", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "represent", "the", "average", "and", "standard", "deviation", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Kinetics", "of", "BATF2", "and", "LAMP3", "mRNA", "levels", "in", "non", "-", "induced", "and", "interferon", "IFN", "-", "α", "-", "induced", "(", "for", "8", ",", "16", ",", "and", "24", "h", ")", "A549", "-", "ACE2", "cells", "transfected", "with", "either", "control", "or", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "mimics", ".", "Normalized", "read", "abundances", "in", "transcript", "per", "million", "(", "TPM", ")", "are", "shown", "for", "two", "individual", "experiments", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "E", ")", "Genomic", "view", "of", "the", "human", "BATF2", "gene", "showing", "normalized", "RNA", "-", "seq", "reads", "from", "non", "-", "induced", "and", "IFN", "-", "α", "-", "induced", "(", "for", "8", "h", ")", "A549", "-", "ACE2", "cells", "transfected", "with", "either", "control", ",", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", "or", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "mimics", ".", "The", "complementary", "site", "of", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", "to", "BATF2", "3", "´", "UTR", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Relative firefly luciferase normalized to Renilla luciferase of pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector with either CoV2-miR-O7a.2 target site or CoV2-miR-O7a.2 site with mutations in seed region at 24 h on co-transfection with CoV2-miR-O7a.2 or control miRNA mimics. Activity on transfecting control miRNA mimic was considered 100 %. Bars and error bars represent the average and standard deviation from three independent experiments.(D) Kinetics of BATF2 and LAMP3 mRNA levels in non-induced and interferon IFN-α-induced (for 8, 16, and 24 h) A549-ACE2 cells transfected with either control or CoV2-miR-O7a.2 mimics. Normalized read abundances in transcript per million (TPM) are shown for two individual experiments (n=2).(E) Genomic view of the human BATF2 gene showing normalized RNA-seq reads from non-induced and IFN-α-induced (for 8 h) A549-ACE2 cells transfected with either control, CoV2-miR-O7a.1 or CoV2-miR-O7a.2 mimics. The complementary site of CoV2-miR-O7a to BATF2 3´UTR is shown."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Volcano", "plots", "showing", "the", "log2", "fold", "change", "and", "corresponding", "significance", "levels", "of", "ISGs", "upon", "8", "hours", "of", "IFN", "-", "α", "treatment", "in", "A549", "-", "ACE2", "cells", "transfected", "with", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", "(", "A", ")", "or", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "(", "B", ")", "compared", "to", "control", "mimic", ".", "Significantly", "downregulated", "genes", "are", "marked", "in", "red", ",", "and", "upregulated", "genes", "in", "blue", ".", "The", "orange", "horizontal", "line", "indicates", "two", "-", "tailed", "P", "=", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "2", ",", "dashed", "lines", "represent", "+", "1", "and", "-", "1", "log2", "fold", "change", ".", "(", "C", ")", "Log2", "fold", "change", "of", "ISGs", "at", "8", ",", "16", ",", "24", "hours", "of", "IFN", "-", "α", "treatment", "and", "categorized", "based", "on", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "target", "sites", "8mer", ",", "7mer", "-", "m8", ",", "7mer", "-", "A1", ",", "and", "no", "seed", "as", "shown", "in", "the", "schematic", ".", "The", "mean", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "shown", ".", "Number", "of", "ISGs", "with", "8mer", "site", "n", "=", "8", ",", "7mer", "-", "m8", "n", "=", "32", ",", "7mer", "-", "A1", "n", "=", "26", "and", "no", "seed", "n", "=", "92", ".", "The", "two", "-", "tailed", "p", "values", "were", "calculated", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Wilcoxon", "test", ".", "ISGs", "were", "calculated", "as", "all", "the", "upregulated", "genes", "(", "≥", "3", "-", "fold", ";", "padj", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "two", "replicates", "of", "IFN", "-", "induced", "versus", "non", "-", "induced", "conditions", "in", "all", "time", "points", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A, B) Volcano plots showing the log2 fold change and corresponding significance levels of ISGs upon 8 hours of IFN-α treatment in A549-ACE2 cells transfected with CoV2-miR-O7a.1 (A) or CoV2-miR-O7a.2 (B) compared to control mimic. Significantly downregulated genes are marked in red, and upregulated genes in blue. The orange horizontal line indicates two-tailed P = 0.05. n=2, dashed lines represent +1 and -1 log2 fold change.(C) Log2 fold change of ISGs at 8, 16, 24 hours of IFN-α treatment and categorized based on CoV2-miR-O7a.2 target sites 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, and no seed as shown in the schematic. The mean and standard error of the mean is shown. Number of ISGs with 8mer site n=8, 7mer-m8 n= 32, 7mer-A1 n=26 and no seed n= 92. The two-tailed p values were calculated using the Mann-Whitney-Wilcoxon test. ISGs were calculated as all the upregulated genes (≥ 3-fold; padj < 0.05) in two replicates of IFN-induced versus non-induced conditions in all time points."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Heat", "map", "showing", "log2", "fold", "change", "of", "expression", "of", "ISGs", "in", "A549", "-", "ACE2", "cells", "across", "8", ",", "16", "and", "24", "h", "time", "points", "upon", "IFN", "-", "α", "treatment", "compared", "to", "non", "-", "treated", "controls", ".", "The", "common", "upregulated", "genes", "(", "≥", "3", "-", "fold", ";", "padj", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "IFN", "-", "induced", "versus", "non", "-", "induced", "conditions", "at", "all", "time", "points", "were", "categorized", "as", "ISGs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Heat map showing log2 fold change of expression of ISGs in A549-ACE2 cells across 8, 16 and 24 h time points upon IFN-α treatment compared to non-treated controls. The common upregulated genes (≥ 3-fold; padj < 0.05) in IFN-induced versus non-induced conditions at all time points were categorized as ISGs."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Expression", "levels", "of", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "1", ",", "CoV2", "-", "miR", "-", "O7a", ".", "2", "and", "a", "22", "nt", "region", "from", "the", "ORF6", "of", "the", "viral", "genome", "that", "does", "not", "produce", "detectable", "levels", "of", "small", "RNAs", "(", "Control", "ORF6", ")", "analyzed", "by", "stem", "-", "loop", "RT", "-", "qPCR", "from", "nasopharyngeal", "swabs", "of", "patients", "tested", "positive", "for", "COVID", "-", "19", "or", "another", "seasonal", "human", "coronavirus", "(", "HCoV", ")", ".", "Relative", "expression", "to", "hsa", "-", "miR", "-", "let", "-", "7a", "is", "shown", ".", "Ct", "values", "in", "parenthesis", "refer", "to", "the", "Ct", "value", "for", "the", "detection", "of", "viral", "genome", "in", "patient", "swab", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Expression levels of CoV2-miR-O7a.1, CoV2-miR-O7a.2 and a 22 nt region from the ORF6 of the viral genome that does not produce detectable levels of small RNAs (Control ORF6) analyzed by stem-loop RT-qPCR from nasopharyngeal swabs of patients tested positive for COVID-19 or another seasonal human coronavirus (HCoV). Relative expression to hsa-miR-let-7a is shown. Ct values in parenthesis refer to the Ct value for the detection of viral genome in patient swab samples."}
{"words": ["Figure", "1Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "Body", "weight", "curve", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "Cumulative", "body", "weight", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "Fasting", "and", "fed", "blood", "glucose", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "Rectal", "temperature", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "Locomotor", "tolerance", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "standard", "diet", "(", "SD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "3", "months", ".", "24", "-", "h", "oxygen", "consumption", ".", "Respiratory", "exchange", "ratio", "(", "RER", ":", "VCO2", "/", "VO2", ")", ".", "Energy", "expenditure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. Body weight curve.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. Cumulative body weight.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. Fasting and fed blood glucose.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. Rectal temperature.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. Locomotor tolerance.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a standard diet (SD) or high-fat diet ( HFD) for 3 months. 24-h oxygen consumption. Respiratory exchange ratio (RER: VCO2/VO2). Energy expenditure."}
{"words": ["Figure", "2Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Blood", "glucose", "levels", "and", "area", "under", "curve", "(", "AUC", ")", "during", "the", "glucose", "tolerance", "test", ".", "Blood", "glucose", "levels", "and", "AUC", "during", "the", "insulin", "tolerance", "test", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Glucose", "infusion", "rates", "(", "GIR", ")", ".", "Glucose", "disposal", "rate", "(", "GDR", ")", ".", "Hepatic", "glucose", "production", "(", "HGP", ")", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Percentage", "of", "suppression", "of", "hepatic", "glucose", "production", "(", "HGP", ")", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "Glucose", "infusion", "rates", "(", "GIR", ")", "during", "lipid", "infusion", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a SD or HFD for 3 months. Blood glucose levels and area under curve (AUC) during the glucose tolerance test. Blood glucose levels and AUC during the insulin tolerance test.Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a SD or HFD for 3 months. Glucose infusion rates (GIR). Glucose disposal rate (GDR). Hepatic glucose production (HGP).Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice were fed a SD or HFD for 3 months. Percentage of suppression of hepatic glucose production (HGP).Eight-week-old male WT and DOCK5-/- mice Glucose infusion rates (GIR) during lipid infusion."}
{"words": ["Figure", "3Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Mice", "were", "treated", "with", "insulin", "(", "1", "U", "/", "kg", ")", "or", "control", "(", "PBS", ")", "by", "intraperitoneal", "injection", "for", "10", "minutes", ";", "animals", "were", "killed", "and", "livers", "were", "collected", ".", "The", "expression", "of", "expression", "of", "phosphoenolpyruvate", "carboxykinase", "(", "PEPCK", ")", "and", "glucose", "-", "6", "-", "phosphatase", "(", "G6Pase", ")", "mRNA", "and", "protein", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Mice", "were", "treated", "with", "insulin", "(", "1", "U", "/", "kg", ")", "or", "control", "(", "PBS", ")", "by", "intraperitoneal", "injection", "for", "10", "minutes", ";", "animals", "were", "killed", "and", "livers", "were", "collected", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "insulin", "receptor", "(", "InsR", ")", ",", "IRS", "-", "1ser1101", "and", "Akt", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", "for", "3", "months", ".", "Mice", "were", "treated", "with", "insulin", "(", "1", "U", "/", "kg", ")", "or", "control", "(", "PBS", ")", "by", "intraperitoneal", "injection", "for", "10", "minutes", ";", "animals", "were", "killed", "and", "livers", "were", "collected", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "mTOR", ",", "S6K1", ",", "and", "the", "levels", "of", "Raptor", "and", "Rictor", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Eight-week-old male WT and DOCK5-/-mice were fed a SD or a HFD for 3 months. Mice were treated with insulin (1 U/kg) or control (PBS) by intraperitoneal injection for 10 minutes; animals were killed and livers were collected. The expression of expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) and glucose-6- phosphatase(G6Pase) mRNA and protein.Eight-week-old male WT and DOCK5-/-mice were fed a SD or a HFD for 3 months. Mice were treated with insulin (1 U/kg) or control (PBS) by intraperitoneal injection for 10 minutes; animals were killed and livers were collected. Total and phosphorylated insulin receptor (InsR), IRS-1ser1101 and Akt.Eight-week-old male WT and DOCK5-/-mice were fed a SD or a HFD for 3 months. Mice were treated with insulin (1 U/kg) or control (PBS) by intraperitoneal injection for 10 minutes; animals were killed and livers were collected. Total and phosphorylated mTOR, S6K1, and the levels of Raptor and Rictor protein."}
{"words": ["Figure", "4Hep1", "-", "6", "cells", "were", "infected", "with", "pCDNA3", ".", "1", "-", "DOCK5", "(", "DOCK5", "+", ")", "or", "pCDNA3", ".", "1", "(", "DOCK5", "-", ")", "for", "48", "h", ".", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "The", "mRNA", "and", "protein", "expression", "of", "PEPCK", "and", "G6Pase", "in", "Hep1", "-", "6", "cells", ".", "Hep1", "-", "6", "cells", "were", "infected", "with", "pCDNA3", ".", "1", "-", "DOCK5", "(", "DOCK5", "+", ")", "or", "pCDNA3", ".", "1", "(", "DOCK5", "-", ")", "for", "48", "h", ".", "-", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "InsR", ",", "IRS", "-", "1Ser1101", "and", "Akt", "in", "Hep1", "-", "6", "cells", ".", "Hep1", "-", "6", "cells", "were", "infected", "with", "pCDNA3", ".", "1", "-", "DOCK5", "(", "DOCK5", "+", ")", "or", "pCDNA3", ".", "1", "(", "DOCK5", "-", ")", "for", "48", "h", ".", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "mTOR", "and", "S6K1", ",", "and", "the", "levels", "of", "Raptor", "and", "Rictor", "protein", "in", "Hep1", "-", "6", "cells", ".", "MPHs", "isolated", "from", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "The", "mRNA", "and", "protein", "expression", "of", "PEPCK", "and", "G6Pase", "in", "MPHs", ".", "MPHs", "isolated", "from", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "InsR", ",", "IRS", "-", "1Ser1101", "and", "Akt", "in", "MPHs", ".", "MPHs", "isolated", "from", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", "were", "incubated", "in", "control", "(", "GlcN", "-", ")", "or", "GlcN", "(", "GlcN", "+", ")", "medium", "for", "indicated", "times", ",", "followed", "with", "(", "Ins", "+", ")", "or", "without", "(", "Ins", "-", ")", "100", "nmol", "/", "L", "insulin", "stimulation", "for", "20", "min", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "mTOR", "and", "S6K1", ",", "and", "the", "levels", "of", "Raptor", "and", "Rictor", "protein", "in", "MPHs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Hep1-6 cells were infected with pCDNA3.1-DOCK5 (DOCK5 +) or pCDNA3.1 (DOCK5-) for 48 h. mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. The mRNA and protein expression of PEPCK and G6Pase in Hep1-6 cells.Hep1-6 cells were infected with pCDNA3.1-DOCK5 (DOCK5 +) or pCDNA3.1 (DOCK5-) for 48 h. - mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. Total and phosphorylated InsR, IRS-1Ser1101 and Akt in Hep1-6 cells.Hep1-6 cells were infected with pCDNA3.1-DOCK5 (DOCK5 +) or pCDNA3.1 (DOCK5-) for 48 h. mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. Total and phosphorylated mTOR and S6K1, and the levels of Raptor and Rictor protein in Hep1-6 cells.MPHs isolated from WT and DOCK5-/- mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. The mRNA and protein expression of PEPCK and G6Pase in MPHs.MPHs isolated from WT and DOCK5-/- mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. Total and phosphorylated InsR, IRS-1Ser1101 and Akt in MPHs.MPHs isolated from WT and DOCK5-/- mice were incubated in control (GlcN-) or GlcN (GlcN+) medium for indicated times, followed with (Ins+) or without (Ins-) 100 nmol/L insulin stimulation for 20 min. Total and phosphorylated mTOR and S6K1, and the levels of Raptor and Rictor protein in MPHs."}
{"words": ["Figure", "5Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "(", "Raptorflox", "/", "flox", "Cre", "+", ")", "were", "fed", "a", "HFD", "for", "12", "weeks", "and", "injected", "with", "AAV8", "-", "shDOCK5", "±", "AAV8", "-", "Cre", "or", "AAV8", "-", "GFP", "(", "at", "a", "dose", "of", "3", "×", "1011", "vg", "/", "200", "μL", "/", "mouse", ")", "via", "the", "tail", "-", "vein", "14", "days", "prior", "to", "the", "in", "vivo", "study", ".", "Fasting", "and", "fed", "blood", "glucose", "14", "days", "post", "-", "infection", ".", "Eight", "-", "week", "-", "old", "male", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "(", "Raptorflox", "/", "flox", "Cre", "+", ")", "were", "fed", "a", "HFD", "for", "12", "weeks", "and", "injected", "with", "AAV8", "-", "shDOCK5", "±", "AAV8", "-", "Cre", "or", "AAV8", "-", "GFP", "(", "at", "a", "dose", "of", "3", "×", "1011", "vg", "/", "200", "μL", "/", "mouse", ")", "via", "the", "tail", "-", "vein", "14", "days", "prior", "to", "the", "in", "vivo", "study", ".", "Blood", "glucose", "levels", "and", "AUC", "during", "glucose", "tolerance", "tests", ".", "Blood", "glucose", "levels", "and", "AUC", "during", "insulin", "tolerance", "tests", ".", "Glucose", "infusion", "rates", "(", "GIR", ")", ".", "Glucose", "disposal", "rate", "(", "GDR", ")", ".", "Hepatic", "glucose", "production", "(", "HGP", ")", ".", "Percentage", "of", "suppression", "of", "hepatic", "glucose", "production", "(", "HGP", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Eight-week-old male Raptor flox/flox mice (Raptorflox/flox Cre+) were fed a HFD for 12 weeks and injected with AAV8-shDOCK5 ± AAV8-Cre or AAV8-GFP (at a dose of 3 × 1011 vg / 200 μL/ mouse) via the tail-vein 14 days prior to the in vivo study. Fasting and fed blood glucose 14 days post-infection.Eight-week-old male Raptor flox/flox mice (Raptorflox/flox Cre+) were fed a HFD for 12 weeks and injected with AAV8-shDOCK5 ± AAV8-Cre or AAV8-GFP (at a dose of 3 × 1011 vg / 200 μL/ mouse) via the tail-vein 14 days prior to the in vivo study. Blood glucose levels and AUC during glucose tolerance tests. Blood glucose levels and AUC during insulin tolerance tests. Glucose infusion rates (GIR). Glucose disposal rate (GDR). Hepatic glucose production (HGP). Percentage of suppression of hepatic glucose production (HGP)."}
{"words": ["Figure", "6Male", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "(", "8", "weeks", ")", "were", "fed", "a", "HFD", "for", "12", "weeks", "and", "injected", "with", "AAV8", "-", "GFP", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "+", "AAV8", "-", "Cre", "via", "the", "tail", "vein", ".", "The", "mRNA", "and", "protein", "expression", "of", "PEPCK", "and", "G6Pase", "in", "the", "liver", ".", "Male", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "(", "8", "weeks", ")", "were", "fed", "a", "HFD", "for", "12", "weeks", "and", "injected", "with", "AAV8", "-", "GFP", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "+", "AAV8", "-", "Cre", "via", "the", "tail", "vein", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "InsR", ",", "IRS", "-", "1Ser1101", "and", "Akt", "in", "the", "liver", ".", "Male", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "(", "8", "weeks", ")", "were", "fed", "a", "HFD", "for", "12", "weeks", "and", "injected", "with", "AAV8", "-", "GFP", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "or", "AAV8", "-", "shDOCK5", "+", "AAV8", "-", "Cre", "via", "the", "tail", "vein", ".", "The", "levels", "of", "DOCK5", "and", "Raptor", "protein", ",", "and", "total", "and", "phosphorylated", "mTOR", "and", "S6K1", "in", "the", "liver", ".", "MPHs", "from", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "were", "infected", "with", "Ad", "-", "GFP", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "+", "Ad", "-", "Cre", ".", "The", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", "or", "β", "-", "actin", ".", "The", "expression", "of", "PEPCK", "and", "G6Pase", "mRNA", "and", "protein", ".", "MPHs", "from", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "were", "infected", "with", "Ad", "-", "GFP", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "+", "Ad", "-", "Cre", ".", "The", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", "or", "β", "-", "actin", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "InsR", ",", "IRS", "-", "1Ser1101", "and", "Akt", ".", "MPHs", "from", "Raptor", "flox", "/", "flox", "mice", "were", "infected", "with", "Ad", "-", "GFP", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "or", "Ad", "-", "shDOCK5", "+", "Ad", "-", "Cre", ".", "The", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", "or", "β", "-", "actin", ".", "The", "levels", "of", "DOCK5", "and", "Raptor", "protein", ",", "and", "total", "and", "phosphorylated", "mTOR", "and", "S6K1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Male Raptor flox/flox mice (8 weeks) were fed a HFD for 12 weeks and injected with AAV8- GFP or AAV8-shDOCK5 or AAV8-shDOCK5 + AAV8-Cre via the tail vein. The mRNA and protein expression of PEPCK and G6Pase in the liver.Male Raptor flox/flox mice (8 weeks) were fed a HFD for 12 weeks and injected with AAV8- GFP or AAV8-shDOCK5 or AAV8-shDOCK5 + AAV8-Cre via the tail vein. Total and phosphorylated InsR, IRS-1Ser1101 and Akt in the liver.Male Raptor flox/flox mice (8 weeks) were fed a HFD for 12 weeks and injected with AAV8- GFP or AAV8-shDOCK5 or AAV8-shDOCK5 + AAV8-Cre via the tail vein. The levels of DOCK5 and Raptor protein, and total and phosphorylated mTOR and S6K1 in the liver.MPHs from Raptor flox/flox mice were infected with Ad-GFP or Ad-shDOCK5 or Ad-shDOCK5 + Ad-Cre. The lysates were immunoblotted with indicated antibodies or β-actin. The expression of PEPCK and G6Pase mRNA and protein.MPHs from Raptor flox/flox mice were infected with Ad-GFP or Ad-shDOCK5 or Ad-shDOCK5 + Ad-Cre. The lysates were immunoblotted with indicated antibodies or β-actin. Total and phosphorylated InsR, IRS-1Ser1101 and Akt.MPHs from Raptor flox/flox mice were infected with Ad-GFP or Ad-shDOCK5 or Ad-shDOCK5 + Ad-Cre. The lysates were immunoblotted with indicated antibodies or β-actin. The levels of DOCK5 and Raptor protein, and total and phosphorylated mTOR and S6K1."}
{"words": ["Figure", "7Rac1", "GEF", "activation", "in", "MPHs", "from", "WT", "and", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", ".", "SEW2871", "treatment", "promotes", "Rac1", "GEF", "activation", "and", "eliminates", "the", "influence", "of", "a", "DOCK5", "deficiency", "on", "Raptor", "/", "S6K1", "signaling", "in", "the", "mouse", "primary", "hepatocytes", "(", "MPHs", ")", "of", "DOCK5", "-", "/", "-", "mice", ".", "Total", "and", "phosphorylated", "mTOR", "and", "S6K1", "and", "the", "level", "of", "Raptor", "protein", "expression", "in", "plasmids", "expressing", "a", "WT", "DOCK5", "or", "mutant", "DOCK5", "treated", "-", "Hep1", "-", "6", "cells", ".", "Coimmunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "analysis", "of", "DOCK5", "and", "Raptor", "expression", "in", "Hepa1", "-", "6", "cells", ".", "After", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", ",", "lysates", "from", "cells", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "DOCK5", "antibody", "or", "normal", "IgG", ",", "and", "then", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "with", "the", "indicated", "antibody", ".", "DOCK5", "binding", "to", "Raptor", "fragments", "(", "445", "-", "887", "aa", ")", "during", "transient", "expression", "in", "Hepa1", "-", "6", "cells", ".", "The", "DOCK5", "and", "Raptor", "binding", "sites", "were", "identified", "using", "mutant", "DOCK5", "(", "DHR", "-", "2V1559A", ")", "and", "Raptor", "fragments", "(", "445", "-", "887", "aa", ")", "based", "on", "a", "Co", "-", "IP", "assay", ".", "VA", ",", "mutant", "DOCK5", "DHR", "-", "2", ";", "His", ",", "His", "-", "DHR", "-", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Rac1 GEF activation in MPHs from WT and DOCK5-/- mice.SEW2871 treatment promotes Rac1 GEF activation and eliminates the influence of a DOCK5 deficiency on Raptor / S6K1 signaling in the mouse primary hepatocytes (MPHs) of DOCK5-/- mice.Total and phosphorylated mTOR and S6K1 and the level of Raptor protein expression in plasmids expressing a WT DOCK5 or mutant DOCK5 treated-Hep1-6 cells.Coimmunoprecipitation (Co-IP) analysis of DOCK5 and Raptor expression in Hepa1-6 cells. After transfected with indicated plasmids, lysates from cells were immunoprecipitated (IP) with anti-DOCK5 antibody or normal IgG, and then immunoblotted (IB) with the indicated antibody.DOCK5 binding to Raptor fragments (445 - 887 aa) during transient expression in Hepa1-6 cells.The DOCK5 and Raptor binding sites were identified using mutant DOCK5 (DHR-2V1559A) and Raptor fragments (445 - 887 aa) based on a Co-IP assay. VA, mutant DOCK5 DHR-2; His, His-DHR-2."}
{"words": ["Figure", "1B", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "fibronectin", "(", "green", ")", "and", "collagen", "(", "red", ")", "fibers", "on", "de", "-", "cellularized", "ECM", "produced", "by", "human", "fibroblasts", ".", "Fibers", "orientation", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "Percentages", "indicate", "oriented", "fibers", "accumulated", "in", "a", "range", "of", "±", "21", "°", "around", "the", "modal", "angle", ".", "Data", "is", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "10", "random", "fields", "from", "2", "independent", "determinations", ")", ".", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "A", "representative", "image", "of", "picrosirius", "red", "staining", "from", "10", "analyzed", "is", "shown", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Immunofluorescence analysis of fibronectin (green) and collagen (red) fibers on de-cellularized ECM produced by human fibroblasts. Fibers orientation was quantified using ImageJ software. Percentages indicate oriented fibers accumulated in a range of ± 21° around the modal angle. Data is represented as mean ± s.d. (n=10 random fields from 2 independent determinations)..Scale bar, 50 µm. A representative image of picrosirius red staining from 10 analyzed is shown for each condition."}
{"words": ["Figure", "2D", ",", "E", "Quantification", "of", "proliferation", "of", "1205Lu", "(", "D", ")", "and", "SKMEL5", "(", "E", ")", "cells", "plated", "for", "48", "h", "on", "plastic", ",", "Coll", "-", "1", "or", "the", "indicated", "fibroblast", "-", "derived", "ECMs", "prior", "a", "96", "h", "treatment", "with", "vehicle", ",", "5", "µM", "BRAFi", "or", "2", "µM", "BRAFi", "plus", "0", ".", "01", "µM", "MEKi", ".", "Cells", "were", "counted", "by", "Hoechst", "-", "labeled", "nuclei", "staining", ".", "Data", "are", "represented", "as", "bar", "plots", "with", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "vehicle", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "015", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0009", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "(", "E", ")", "*", "P", "=", "0", ".", "0204", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "F", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "cell", "cycle", "distribution", "of", "SKMEL5", "cells", "cultured", "on", "plastic", ",", "Coll", "-", "1", "or", "the", "indicated", "fibroblast", "-", "derived", "ECMs", "and", "treated", "with", "vehicle", "or", "2", "µM", "BRAFi", "combined", "with", "0", ".", "01", "µM", "MEKi", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "different", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "is", "indicated", ".", "G", "Immunoblotting", "of", "protein", "extracts", "from", "SKMEL5", "cells", "cultivated", "as", "described", "above", "on", "plastic", ",", "Coll", "-", "1", "or", "the", "indicated", "fibroblast", "-", "derived", "ECMs", "in", "the", "presence", "or", "not", "of", "BRAFi", "or", "BRAFi", "/", "MEKi", "for", "96", "h", ",", "using", "antibodies", "against", "P", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "ERK2", "or", "cell", "cycle", "markers", "(", "P", "-", "Rb", ",", "Rb", ",", "Cyclin", "D1", ",", "p27KIP1", ",", "Survivin", ",", "p53", ")", ".", "HSP60", ",", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D, E Quantification of proliferation of 1205Lu (D) and SKMEL5 (E) cells plated for 48 h on plastic, Coll-1 or the indicated fibroblast-derived ECMs prior a 96 h treatment with vehicle, 5 µM BRAFi or 2 µM BRAFi plus 0.01 µM MEKi. Cells were counted by Hoechst-labeled nuclei staining. Data are represented as bar plots with mean ± SEM normalized to vehicle of 3 independent experiments. (D) **P=0.015, ***P=0.0009, ****P<0.0001 and (E) *P=0.0204, ***P=0.0006, ****P<0.0001. Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons test.F Flow cytometry analysis of cell cycle distribution of SKMEL5 cells cultured on plastic, Coll-1 or the indicated fibroblast-derived ECMs and treated with vehicle or 2 µM BRAFi combined with 0.01 µM MEKi. The percentage of cells in different phases of the cell cycle is indicated.G Immunoblotting of protein extracts from SKMEL5 cells cultivated as described above on plastic, Coll-1 or the indicated fibroblast-derived ECMs in the presence or not of BRAFi or BRAFi/MEKi for 96 h, using antibodies against P-ERK1/2, ERK2 or cell cycle markers (P-Rb, Rb, Cyclin D1, p27KIP1, Survivin, p53). HSP60, loading control."}
{"words": ["Figure", "3B", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "DDR1", "and", "DDR2", "levels", "on", "human", "melanoma", "tissue", "microarrays", ".", "Representative", "IHC", "images", "and", "quantification", "(", "right", "bar", "histograms", ")", "of", "DDR1", "and", "DDR2", "expression", "in", "normal", "skin", ",", "naevus", ",", "primary", "melanoma", "(", "PM", ")", "and", "lymph", "node", "melanoma", "metastases", "(", "MM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "Histological", "scoring", "of", "the", "samples", "was", "performed", "in", "blinded", "fashion", ".", "Samples", "were", "scored", "as", "low", ",", "medium", "or", "high", "for", "DDR1", "or", "DDR2", "expression", "(", "naevus", ",", "n", "=", "12", ";", "PM", ",", "n", "=", "30", ";", "MM", ",", "n", "=", "20", ")", ".", "Immunoblotting", "of", "equal", "amounts", "of", "protein", "extracts", "from", "melanoma", "cell", "lines", "(", "C", ")", "using", "antibodies", "against", "DDR1", ",", "DDR2", "or", "markers", "of", "the", "melanoma", "cell", "differentiation", "AXL", ",", "MITF", "or", "SOX10", ".", "ERK2", ",", "loading", "control", ".", "Immunoblotting", "of", "equal", "amounts", "of", "protein", "extracts", "patient", "-", "derived", "short", "-", "term", "cell", "cultures", "(", "D", ")", "using", "antibodies", "against", "DDR1", ",", "DDR2", "or", "markers", "of", "the", "melanoma", "cell", "differentiation", "AXL", ",", "MITF", "or", "SOX10", ".", "ERK2", ",", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Immunohistochemical analysis of DDR1 and DDR2 levels on human melanoma tissue microarrays. Representative IHC images and quantification (right bar histograms) of DDR1 and DDR2 expression in normal skin, naevus, primary melanoma (PM) and lymph node melanoma metastases (MM). Scale bar, 100 µm. Histological scoring of the samples was performed in blinded fashion. Samples were scored as low, medium or high for DDR1 or DDR2 expression (naevus, n = 12; PM, n = 30; MM, n = 20).Immunoblotting of equal amounts of protein extracts from melanoma cell lines (C) using antibodies against DDR1, DDR2 or markers of the melanoma cell differentiation AXL, MITF or SOX10. ERK2, loading control.Immunoblotting of equal amounts of protein extracts patient-derived short-term cell cultures (D) using antibodies against DDR1, DDR2 or markers of the melanoma cell differentiation AXL, MITF or SOX10. ERK2, loading control."}
{"words": ["Figure", "4B", "Immunoblotting", "of", "protein", "extracts", "from", "SKMEL5", "cells", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "the", "combination", "siDDR1", "#", "2", "/", "siDDR2", "#", "2", "prior", "being", "cultivated", "on", "FRC", "-", "or", "MAF", "-", "derived", "ECMs", "(", "left", "and", "right", "panels", ",", "respectively", ")", "and", "treated", "with", "vehicle", ",", "5", "µM", "BRAFi", "or", "2", "µM", "BRAFi", "plus", "0", ".", "01", "µM", "MEKi", ",", "using", "antibodies", "against", "the", "indicated", "proteins", ".", "HSP60", ",", "loading", "control", ".", "D", "Immunoblotting", "of", "protein", "extracts", "from", "1205Lu", ",", "SKMEL5", "and", "MM099", "cells", "plated", "for", "48", "h", "on", "FRC", "-", "derived", "ECM", "prior", "a", "96", "h", "treatment", "with", "vehicle", "or", "5", "µM", "BRAFi", "in", "the", "presence", "or", "not", "of", "Imatinib", "(", "7", "µM", "for", "1205Lu", ",", "10", "µM", "for", "SKMEL5", "and", "MM099", ")", "or", "DDR1", "-", "IN", "-", "1", "(", "1", "µM", "for", "1205Lu", ",", "5", "µM", "for", "SKMEL5", ",", "3", "µM", "for", "MM099", ")", ",", "using", "antibodies", "against", "the", "indicated", "proteins", ".", "HSP60", ",", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Immunoblotting of protein extracts from SKMEL5 cells transfected with siCTRL or the combination siDDR1#2/siDDR2#2 prior being cultivated on FRC- or MAF-derived ECMs (left and right panels, respectively) and treated with vehicle, 5 µM BRAFi or 2 µM BRAFi plus 0.01 µM MEKi, using antibodies against the indicated proteins. HSP60, loading control.D Immunoblotting of protein extracts from 1205Lu, SKMEL5 and MM099 cells plated for 48 h on FRC-derived ECM prior a 96 h treatment with vehicle or 5 µM BRAFi in the presence or not of Imatinib (7 µM for 1205Lu, 10 µM for SKMEL5 and MM099) or DDR1-IN-1 (1 µM for 1205Lu, 5 µM for SKMEL5, 3 µM for MM099), using antibodies against the indicated proteins. HSP60, loading control."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "images", "of", "1205", "cells", "cultivated", "on", "collagen", "-", "I", "(", "Coll", "-", "I", ")", "or", "FRC", "-", "derived", "ECM", "for", "48", "h", "prior", "treatment", "with", "vehicle", "or", "5", "µM", "BRAFi", "or", "2", "µM", "BRAFi", "plus", "0", ".", "01", "µM", "MEKi", "for", "96", "h", ".", "Immunofluorescence", "for", "Phospho", "-", "DDR1", "(", "P", "(", "Y792", ")", "-", "DDR1", ")", "(", "red", ";", "left", "panels", ")", "and", "Phospho", "-", "DDR1", "/", "2", "(", "P", "(", "Y796", ")", "-", "DDR1", "/", "P", "(", "Y740", ")", "-", "DDR2", ")", "(", "red", ";", "right", "panels", ")", ",", "F", "-", "actin", "(", "green", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", "is", "shown", ".", "Enlarged", "images", "of", "P", "-", "DDR1", "and", "P", "-", "DDR1", "/", "2", "immunostaining", "are", "shown", ".", "White", "arrows", "indicate", "P", "-", "DDR1", "and", "P", "-", "DDR1", "/", "2", "cell", "membrane", "linear", "clustering", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", "(", "enlarged", "images", ":", "scale", "bar", ",", "10", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative images of 1205 cells cultivated on collagen-I (Coll-I) or FRC-derived ECM for 48 h prior treatment with vehicle or 5 µM BRAFi or 2 µM BRAFi plus 0.01 µM MEKi for 96 h. Immunofluorescence for Phospho-DDR1 (P(Y792)-DDR1) (red; left panels) and Phospho-DDR1/2 (P(Y796)-DDR1/P(Y740)-DDR2) (red; right panels), F-actin (green) and nuclei (blue) is shown. Enlarged images of P-DDR1 and P-DDR1/2 immunostaining are shown. White arrows indicate P-DDR1 and P-DDR1/2 cell membrane linear clustering. Scale bar, 25 µm (enlarged images: scale bar, 10 µm)."}
{"words": ["Figure", "6E", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "treated", "with", "vehicle", ",", "Imatinib", ",", "BRAFi", "or", "BRAFi", "plus", "Imatinib", ".", "Median", "time", "to", "progression", "was", "18", ",", "20", ",", "36", "and", "48", "days", ",", "respectively", ".", "Log", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "for", "BRAFi", "vs", "BRAFi", "/", "Imatinib", "mesylate", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "hazard", "ratio", "(", "log", "rank", ")", ":", "0", ".", "2403", "(", "95", "%", "CI", "of", "ratio", ",", "0", ".", "08123", "to", "0", ".", "7106", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E Kaplan-Meier survival curves of mice treated with vehicle, Imatinib, BRAFi or BRAFi plus Imatinib. Median time to progression was 18, 20, 36 and 48 days, respectively. Log rank (Mantel-Cox) for BRAFi vs BRAFi/Imatinib mesylate. ****P<0.0001 and hazard ratio (log rank): 0.2403 (95% CI of ratio, 0.08123 to 0.7106)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Sections", "of", "1205Lu", "xenografts", "from", "Fig", ".", "6B", "were", "stained", "with", "picrosirius", "red", "and", "imaged", "under", "transmission", "light", "(", "upper", "panels", ")", "or", "polarized", "light", "(", "middle", "panels", ")", "(", "scale", "bar", ",", "500", "µm", ")", "or", "imaged", "by", "second", "harmonic", "generation", "(", "SHG", ")", "microscopy", "(", "lower", "panels", ")", "(", "scale", "bar", ",", "50", "µm", ")", "to", "examine", "collagen", "fiber", "network", "upon", "the", "mono", "or", "combined", "regimens", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Sections of 1205Lu xenografts from Fig. 6B were stained with picrosirius red and imaged under transmission light (upper panels) or polarized light (middle panels) (scale bar, 500 µm) or imaged by second harmonic generation (SHG) microscopy (lower panels) (scale bar, 50 µm) to examine collagen fiber network upon the mono or combined regimens."}
{"words": ["Figure", "8A", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "extracts", "from", "siCTRL", "-", "or", "siDDR1", "/", "2", "-", "transfected", "SKMEL5", "cells", "plated", "on", "FRC", "-", "or", "MAF", "-", "derived", "ECMs", "in", "the", "presence", "or", "not", "of", "5", "µM", "BRAFi", ",", "2", "µM", "BRAFi", "plus", "0", ".", "01", "µM", "MEKi", "for", "96", "h", "using", "antibodies", "against", "DDR1", ",", "DDR2", ",", "P", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "ERK2", ",", "RelB", ",", "p100", "/", "p52", "and", "HSP60", "as", "loading", "control", "were", "used", ".", "F", ",", "G", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "extracts", "obtained", "from", "SKMEL5", "(", "F", ")", "or", "MM099", "(", "G", ")", "cells", "plated", "on", "FRC", "-", "or", "MAF", "-", "derived", "ECMs", "and", "treated", "with", "5", "µM", "BRAFi", "in", "combination", "or", "not", "with", "DDR1", "-", "IN", "-", "1", "(", "5", "µM", "for", "SKMEL5", "and", "3", "µM", "for", "MM099", ")", "or", "10", "µM", "NIK", "inhibitor", "(", "NIKi", ")", "for", "96", "h", ".", "Antibodies", "against", "P", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "ERK2", ",", "P", "-", "Rb", ",", "Rb", ",", "Survivin", ",", "Caspase", "3", ",", "cleaved", "Caspase", "3", ",", "RelB", ",", "p100", "/", "p52", "and", "HSP60", "as", "loading", "control", "were", "used", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Immunoblot analysis of protein extracts from siCTRL- or siDDR1/2-transfected SKMEL5 cells plated on FRC- or MAF-derived ECMs in the presence or not of 5 µM BRAFi, 2 µM BRAFi plus 0.01 µM MEKi for 96 h using antibodies against DDR1, DDR2, P-ERK1/2, ERK2, RelB, p100/p52 and HSP60 as loading control were used.F, G Immunoblot analysis of protein extracts obtained from SKMEL5 (F) or MM099 (G) cells plated on FRC- or MAF-derived ECMs and treated with 5 µM BRAFi in combination or not with DDR1-IN-1 (5 µM for SKMEL5 and 3 µM for MM099) or 10 µM NIK inhibitor (NIKi) for 96 h. Antibodies against P-ERK1/2, ERK2, P-Rb, Rb, Survivin, Caspase 3, cleaved Caspase 3, RelB, p100/p52 and HSP60 as loading control were used."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblot", "of", "expression", "levels", "of", "MYC", ",", "TSC1", ",", "TSC2", ",", "and", "β", "-", "actin", "loading", "control", "in", "high", "MYC", "Burkitt", "'", "s", "lymphoma", "(", "BL", ")", "cells", "compared", "to", "low", "MYC", "Hodgkin", "lymphoma", "(", "HL", ")", "cells", ".", "Immunoblots", "showing", "expression", "levels", "of", "MYC", ",", "TSC1", ",", "TSC2", "or", "β", "-", "actin", "loading", "control", "in", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "with", "tetracycline", "for", "72", "hours", "(", "+", "Tet", ")", "or", "in", "untreated", "cells", "(", "-", "Tet", ")", ".", "Relative", "TSC1", "and", "TSC2", "mRNA", "expression", "levels", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "for", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ")", "versus", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ")", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "for", "24", "h", "with", "tetracycline", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "statistical", "relevance", "was", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "TSC1", "mRNA", "levels", "upon", "MYC", "suppression", "for", "24h", "-", "72h", "(", "+", "Tet", ")", ".", "Immunoblots", "for", "24h", "and", "48h", "(", "+", "Tet", ")", "show", "S6K", "and", "phosphorylation", "(", "P", "-", ")", "of", "S6K", "as", "downstream", "mTORC1", "target", ",", "and", "β", "-", "actin", "loading", "control", ".", "For", "72", "h", "(", "+", "Tet", ")", "the", "immunoblots", "show", "expression", "of", "MYC", "and", "phosphorylation", "(", "P", "-", ")", "of", "downstream", "mTORC1", "targets", "S6K", "and", "S6", ",", "and", "α", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", ".", "Upper", "immunoblot", "shows", "the", "reduction", "in", "TSC1", "levels", "upon", "expression", "of", "two", "different", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNAs", "compared", "to", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "in", "P493", "-", "6", "cells", ".", "Other", "blots", "show", "the", "expression", "levels", "of", "TSC2", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", ",", "S6", "/", "P", "-", "S6", "and", "α", "-", "tubulin", "for", "loading", "control", ".", "Immunoblots", "of", "indicated", "proteins", "in", "P493", "-", "6", "cells", "with", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ",", "72", "hours", ")", "or", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ",", "72", "hours", ")", "levels", "either", "treated", "with", "rapamycin", "or", "solvent", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblot of expression levels of MYC, TSC1, TSC2, and β-actin loading control in high MYC Burkitt's lymphoma (BL) cells compared to low MYC Hodgkin lymphoma (HL) cells.Immunoblots showing expression levels of MYC, TSC1, TSC2 or β-actin loading control in P493-6 cells treated with tetracycline for 72 hours (+Tet) or in untreated cells (-Tet).Relative TSC1 and TSC2 mRNA expression levels determined by qRT-PCR for high MYC (-Tet) versus low MYC (+Tet) P493-6 cells treated for 24 h with tetracycline (mean ± st.dev., n=3 technical replicates) *p< 0.05; **p< 0.01; statistical relevance was determined by unpaired t-test (two-tailed).qRT-PCR analysis of TSC1 mRNA levels upon MYC suppression for 24h-72h (+Tet). Immunoblots for 24h and 48h (+Tet) show S6K and phosphorylation (P-) of S6K as downstream mTORC1 target, and β-actin loading control. For 72 h (+Tet) the immunoblots show expression of MYC and phosphorylation (P-) of downstream mTORC1 targets S6K and S6, and α-tubulin as loading control.Upper immunoblot shows the reduction in TSC1 levels upon expression of two different TSC1-specific sh-RNAs compared to scrambled control sh-RNA in P493-6 cells. Other blots show the expression levels of TSC2, S6K/P-S6K, S6/P-S6 and α-tubulin for loading control.Immunoblots of indicated proteins in P493-6 cells with high MYC (-Tet, 72 hours) or low MYC (+Tet, 72 hours) levels either treated with rapamycin or solvent."}
{"words": ["Figure", "2Elevated", "TSC1", "and", "MYC", "expression", "in", "BL", "(", "cohort", "1", ")", ".", "Example", "of", "immune", "staining", "of", "TSC1", ",", "MYC", ",", "the", "B", "-", "cell", "marker", "CD20", ",", "and", "DAPI", "nuclear", "DNA", "-", "staining", "in", "germinal", "centers", "of", "control", "lymph", "nodes", "(", "upper", "rows", ")", "and", "samples", "from", "BL", "patients", "(", "lower", "rows", ")", ".", "Boxplots", "at", "the", "right", "show", "quantification", "of", "TSC1", "or", "MYC", "staining", "from", "control", "germinal", "centers", "and", "BL", "samples", "(", "see", "materials", "and", "methods", ")", "(", "the", "horizontal", "line", "shows", "the", "median", ",", "whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "data", "points", "and", "the", "box", "represents", "the", "first", "to", "the", "third", "quartiles", ",", "n", "=", "56", "fields", "for", "tumor", "samples", "and", "n", "=", "21", "fields", "for", "control", "germinal", "centers", ";", "scale", "bar", "=", "100", "μm", ")", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "analysis", "of", "TSC", "expression", "in", "BL", "(", "cohort", "2", ")", "(", "n", "=", "13", ")", "compared", "to", "healthy", "tonsils", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "reactive", "lymph", "nodes", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ")", "shown", "in", "Fig", "EV2B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Elevated TSC1 and MYC expression in BL (cohort 1). Example of immune staining of TSC1, MYC, the B-cell marker CD20, and DAPI nuclear DNA-staining in germinal centers of control lymph nodes (upper rows) and samples from BL patients (lower rows). Boxplots at the right show quantification of TSC1 or MYC staining from control germinal centers and BL samples (see materials and methods) (the horizontal line shows the median, whiskers show maximum and minimum data points and the box represents the first to the third quartiles, n=56 fields for tumor samples and n=21 fields for control germinal centers; scale bar = 100 μm).Quantification of immunoblot analysis of TSC expression in BL (cohort 2) (n=13) compared to healthy tonsils (n=3) or reactive lymph nodes (n=3) (mean ± st. dev.) shown in Fig EV2B."}
{"words": ["Figure", "3Left", "graph", "shows", "the", "multiplication", "rate", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "a", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "determined", "by", "viable", "cell", "counting", "3", "days", "after", "seeding", "of", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "determined", "by", "Trypan", "blue", "exclusion", ";", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Right", "graph", "shows", "percentage", "of", "apoptotic", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "determined", "by", "FACS", "analysis", "of", "AnnexinV", "/", "7AAD", "stained", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Rapamycin", "treatment", "recovers", "survival", "of", "TSC1", "knockdown", "in", "P493", "-", "6", "cells", ".", "Relative", "viable", "cell", "number", "counts", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "14", "days", "after", "seeding", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "Trypan", "blue", "exclusion", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "30pM", "rapamycin", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "is", "synthetic", "lethal", "with", "MYC", "deregulation", ".", "U2OS", "-", "MYC", "-", "ER", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "were", "treated", "with", "hydroxytamoxifen", "to", "induce", "MYC", "and", "rapamycin", "(", "100", "nM", ")", "where", "indicated", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "was", "determined", "with", "Annexin", "/", "7AAD", "staining", "4", "days", "after", "MYC", "induction", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Survival", "rate", "of", "different", "BL", "cell", "lines", "upon", "TSC1", "knockdown", ".", "Graphs", "show", "numbers", "of", "viable", "cells", "expressing", "either", "a", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "3", "days", "after", "seeding", "of", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "determined", "by", "trypan", "blue", "exclusion", ";", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Immunoblots", "of", "control", "-", "or", "TSC1", "-", "shRNA", "expressing", "BL2", "or", "DG75", "cells", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "Rapamycin", "to", "either", "completely", "inhibit", "mTORC1", "activity", "(", "10nM", ")", "or", "titrate", "the", "activity", "to", "control", "levels", "(", "30", "pM", ")", ",", "and", "survival", "rate", "of", "these", "cells", "over", "7", "days", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ";", "(", "Bl2", "cells", "were", "selected", "for", "stable", "knockdown", "with", "Puromycin", ",", "DG75", "cells", "without", "selection", ")", ".", "Ramos", "cells", "expressing", "either", "a", "TSC1", "-", "specific", "or", "a", "control", "shRNA", "were", "inoculated", "into", "NOD", "/", "SCID", "mice", "and", "tumor", "volume", "was", "measured", "regularly", ".", "The", "immunoblot", "shows", "the", "level", "of", "knockdown", "of", "TSC1", "(", "sh", "-", "TSC1b", ")", "compared", "to", "control", "(", "sh", "-", "contr", ")", ",", "and", "levels", "of", "TSC2", "and", "phosphorylated", "mTORC1", "target", "proteins", "before", "inoculation", ".", "Tumor", "growth", "curves", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "Pictures", "of", "xenotransplanted", "human", "Ramos", "lymphoma", "tumors", "35", "days", "after", "inoculation", ".", "The", "top", "panels", "show", "tumors", "derived", "from", "Ramos", "cells", "stably", "expressing", "control", "sh", "-", "RNA", "(", "sh", "-", "contr", ")", ";", "the", "lower", "panels", "show", "tumors", "derived", "from", "Ramos", "cells", "stably", "expressing", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "(", "sh", "-", "TSC1b", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Left graph shows the multiplication rate of P493-6 (-Tet) cells expressing either a scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA determined by viable cell counting 3 days after seeding of equal number of viable cells (determined by Trypan blue exclusion; mean ± st.dev., n=3 biological replicates). Right graph shows percentage of apoptotic P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or a TSC1-specific sh-RNA determined by FACS analysis of AnnexinV/7AAD stained cells (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Rapamycin treatment recovers survival of TSC1 knockdown in P493-6 cells. Relative viable cell number counts of P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or TSC1-specific sh-RNA 14 days after seeding equal number of viable cells (Trypan blue exclusion), in the presence of 30pM rapamycin where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).TSC1 knockdown is synthetic lethal with MYC deregulation. U2OS-MYC-ER cells expressing either scrambled control sh-RNA or TSC1-specific sh-RNA were treated with hydroxytamoxifen to induce MYC and rapamycin (100 nM) where indicated. Percentage of apoptotic cells was determined with Annexin/7AAD staining 4 days after MYC induction (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Survival rate of different BL cell lines upon TSC1 knockdown. Graphs show numbers of viable cells expressing either a scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA 3 days after seeding of equal number of viable cells (determined by trypan blue exclusion; mean ± st.dev., n=3 biological replicates).Immunoblots of control- or TSC1-shRNA expressing BL2 or DG75 cells treated with different concentrations of Rapamycin to either completely inhibit mTORC1 activity (10nM) or titrate the activity to control levels (30 pM), and survival rate of these cells over 7 days (mean ± st.dev., n=3 biological replicates); (Bl2 cells were selected for stable knockdown with Puromycin, DG75 cells without selection).Ramos cells expressing either a TSC1-specific or a control shRNA were inoculated into NOD/SCID mice and tumor volume was measured regularly. The immunoblot shows the level of knockdown of TSC1 (sh-TSC1b) compared to control (sh-contr), and levels of TSC2 and phosphorylated mTORC1 target proteins before inoculation. Tumor growth curves show mean ± SEM (n=8/group). Pictures of xenotransplanted human Ramos lymphoma tumors 35 days after inoculation. The top panels show tumors derived from Ramos cells stably expressing control sh-RNA (sh-contr); the lower panels show tumors derived from Ramos cells stably expressing TSC1-specific sh-RNA (sh-TSC1b)."}
{"words": ["Figure", "4TSC1", "knockdown", "increases", "respiration", "in", "an", "mTORC1", "and", "MYC", "dependent", "manner", ".", "Rate", "of", "basal", "oxygen", "consumption", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "TSC", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", ",", "or", "tetracycline", "to", "repress", "MYC", "for", "48", "h", "where", "indicatedTSC1", "knockdown", "increases", "respiration", "in", "an", "mTORC1", "and", "MYC", "dependent", "manner", ".", "Rate", "of", "basal", "oxygen", "consumption", "in", "response", "to", "10", "μM", "of", "the", "chemical", "uncoupler", "DNP", "to", "determine", "maximal", "respiration", "or", "10", "μM", "of", "the", "ATP", "synthase", "inhibitor", "oligomycin", "where", "indicated", "(", "B", ")", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", ".", "Ratio", "of", "mitochondrial", "to", "genomic", "DNA", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "expression", "of", "cytochrome", "C", "(", "CYCS", ")", "or", "ATP5G1", "mRNAs", "(", "D", ")", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ",", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "results", "in", "elevated", "ROS", "levels", "in", "a", "MYC", "and", "mTORC1", "dependent", "manner", ".", "FACS", "analysis", "of", "DCF", "-", "DA", "stained", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "to", "evaluate", "ROS", "production", "and", "treated", "with", "20", "nM", "rapamycin", "for", "12", "h", "and", "tetracycline", "for", "48", "h", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "TSC1", "knockdown", "results", "in", "increased", "phosphorylation", "of", "SAPK", "/", "JNK", ".", "Immunoblot", "of", "SAPK", "/", "JNK", "Thr183", "/", "Tyr185", "-", "phosphorylation", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "sh", "-", "RNA", "or", "a", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", ".", "α", "-", "tubulin", "expression", "serves", "as", "loading", "control", ".", "Antioxidant", "treatment", "rescues", "cells", "from", "death", "caused", "by", "TSC1", "knockdown", ".", "Relative", "viable", "cell", "number", "counts", "of", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "expressing", "scrambled", "control", "shRNA", "or", "TSC1", "-", "specific", "sh", "-", "RNA", "3", "days", "after", "seeding", "equal", "number", "of", "viable", "cells", "(", "Trypan", "blue", "exclusion", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "10", "μM", "of", "the", "antioxidant", "BHA", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4TSC1 knockdown increases respiration in an mTORC1 and MYC dependent manner. Rate of basal oxygen consumption in P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or TSC-specific sh-RNA, treated with 20 nM rapamycin for 12 h, or tetracycline to repress MYC for 48 h where indicatedTSC1 knockdown increases respiration in an mTORC1 and MYC dependent manner. Rate of basal oxygen consumption in response to 10 μM of the chemical uncoupler DNP to determine maximal respiration or 10 μM of the ATP synthase inhibitor oligomycin where indicated (B) (mean ± st. dev., n=6 biological replicates).Ratio of mitochondrial to genomic DNA determined by qRT-PCR in P493-6 (-Tet) cells expressing either scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA, and treated with 20 nM rapamycin for 12 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).expression of cytochrome C (CYCS) or ATP5G1 mRNAs (D) determined by qRT-PCR in P493-6 (-Tet) cells expressing either scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA, and treated with 20 nM rapamycin for 12 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).TSC1 knockdown results in elevated ROS levels in a MYC and mTORC1 dependent manner. FACS analysis of DCF-DA stained P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA to evaluate ROS production and treated with 20 nM rapamycin for 12 h and tetracycline for 48 h where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates).TSC1 knockdown results in increased phosphorylation of SAPK/JNK. Immunoblot of SAPK/JNK Thr183/Tyr185-phosphorylation in P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control sh-RNA or a TSC1-specific sh-RNA. α-tubulin expression serves as loading control.Antioxidant treatment rescues cells from death caused by TSC1 knockdown. Relative viable cell number counts of P493-6 (-Tet) cells expressing scrambled control shRNA or TSC1-specific sh-RNA 3 days after seeding equal number of viable cells (Trypan blue exclusion), in the presence of 10 μM of the antioxidant BHA where indicated (mean ± st.dev., n=3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5Accumulation", "of", "EU", "-", "labeled", "(", "Click", "-", "It", ",", "Invitrogen", ")", "TSC1", "-", "mRNA", "over", "3", "h", "in", "high", "MYC", "(", "-", "Tet", ")", "versus", "low", "MYC", "(", "+", "Tet", ")", "P493", "-", "6", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Drawing", "of", "the", "TSC1", "promoter", "and", "luciferase", "-", "reporter", "constructs", "with", "the", "predicted", "E", "-", "box", "(", "CACGTG", ",", "pos", ".", "-", "317", "/", "-", "322", ")", "indicated", ".", "Relative", "luciferase", "units", "(", "RLU", ")", "of", "co", "-", "transfection", "experiments", "using", "the", "indicated", "TSC1", "-", "promoter", "-", "reporters", "with", "MYC", "normalized", "to", "empty", "pcDNA3", "expression", "vector", "in", "HeLa", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunoblot", "shows", "MYC", "overexpression", "and", "α", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", ".", "TSC1", "mRNA", "turnover", "determined", "by", "pulse", "and", "chase", "(", "Click", "-", "It", ",", "Invitrogen", ")", "over", "8", "h", "in", "P493", "-", "6", "cells", ",", "either", "treated", "with", "tetracycline", "to", "repress", "MYC", "or", "left", "untreated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "miR", "-", "15a", "expression", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "cells", "treated", "with", "tetracycline", "for", "3", "days", "(", "+", "Tet", ")", "to", "suppress", "MYC", "expression", "or", "in", "untreated", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Immunoblots", "showing", "expression", "levels", "of", "TSC1", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", "and", "α", "-", "tubulin", "in", "P493", "-", "6", "and", "HEK293T", "cells", "overexpressing", "miR", "-", "15a", "or", "a", "control", "miRNA", ".", "At", "the", "right", "miR", "-", "15a", "overexpression", "was", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "P493", "-", "6", "and", "HEK293T", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Immunoblot", "showing", "TSC1", "expression", ",", "S6K", "/", "P", "-", "S6K", "and", "α", "‑", "tubulin", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "LNA", "modified", "anti", "-", "sense", "miR", "-", "15a", "oligos", "or", "control", "LNAs", ".", "At", "the", "right", ",", "successful", "miR", "-", "15a", "knockdown", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "is", "shown", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "(", "RLU", ")", "derived", "from", "reporter", "constructs", "containing", "TSC1", "-", "3", "´", "UTR", "wild", "type", "sequences", "or", "with", "mutated", "miR", "-", "15a", "seed", "sequence", "binding", "site", "on", "co", "-", "transfection", "with", "miR", "-", "15a", "in", "MCF", "-", "7", "cells", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "drawing", "at", "the", "left", "shows", "the", "TSC1", "-", "3", "'", "UTR", "with", "the", "position", "of", "the", "miR", "-", "15a", "/", "16", "-", "1", "seed", "sequence", "and", "used", "mutation", "indicated", ".", "Rate", "of", "oxygen", "consumption", "in", "P493", "-", "6", "(", "-", "Tet", ")", "cells", "ectopically", "expressing", "miR", "-", "15a", "or", "control", "-", "miRNA", "vector", ",", "under", "basal", "conditions", "and", "in", "response", "to", "10", "μM", "DNP", "or", "10", "μM", "oligomycin", "where", "indicated", "(", "mean", "±", "st", ".", "dev", ".", ",", "n", "=", "8", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Accumulation of EU-labeled (Click-It, Invitrogen) TSC1-mRNA over 3 h in high MYC (-Tet) versus low MYC (+Tet) P493-6 cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Drawing of the TSC1 promoter and luciferase-reporter constructs with the predicted E-box (CACGTG, pos. -317/-322) indicated. Relative luciferase units (RLU) of co-transfection experiments using the indicated TSC1-promoter-reporters with MYC normalized to empty pcDNA3 expression vector in HeLa cells (mean ± st. dev., n=3). Immunoblot shows MYC overexpression and α-tubulin as loading control.TSC1 mRNA turnover determined by pulse and chase (Click-It, Invitrogen) over 8 h in P493-6 cells, either treated with tetracycline to repress MYC or left untreated (mean ± st.dev., n=3 technical replicates).miR-15a expression determined by qRT-PCR in P493-6 cells treated with tetracycline for 3 days (+Tet) to suppress MYC expression or in untreated (-Tet) cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Immunoblots showing expression levels of TSC1, S6K/P-S6K and α-tubulin in P493-6 and HEK293T cells overexpressing miR-15a or a control miRNA. At the right miR-15a overexpression was determined by qRT-PCR in P493-6 and HEK293T cells (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Immunoblot showing TSC1 expression, S6K/P-S6K and α‑tubulin in MCF-7 cells transfected with LNA modified anti-sense miR-15a oligos or control LNAs. At the right, successful miR-15a knockdown determined by qRT-PCR in MCF-7 cells is shown (mean ± st. dev., n=3 technical replicates).Relative luciferase activities (RLU) derived from reporter constructs containing TSC1-3´UTR wild type sequences or with mutated miR-15a seed sequence binding site on co-transfection with miR-15a in MCF-7 cells (mean ± st. dev., n=3 biological replicates). The drawing at the left shows the TSC1-3'UTR with the position of the miR-15a/16-1 seed sequence and used mutation indicated.Rate of oxygen consumption in P493-6 (-Tet) cells ectopically expressing miR-15a or control-miRNA vector, under basal conditions and in response to 10 μM DNP or 10 μM oligomycin where indicated (mean ± st. dev., n=8 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Cell", "viability", "of", "NS", ",", "GBM", ",", "and", "astrocyte", "cell", "lines", "measured", "72", "h", "after", "irradiation", "(", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", ".", "B", ",", "Cell", "viability", "of", "BT308NS", "and", "their", "pseudo", "-", "differentiated", "progeny", "(", "BT308", "diff", ")", "measured", "24", "h", "after", "irradiation", "(", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "C", ",", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "phosphorylated", "histone", "H2AX", "(", "H2AX", ")", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "0", ".", "03", ".", "D", ",", "Neutral", "comet", "assay", "performed", "24", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "Comet", "tail", "'", "s", "length", "is", "proportional", "to", "DSB", "extent", ".", "E", ",", "Western", "blot", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", "(", "pATM", ")", "and", "Chk2", "(", "pChk2", ")", ",", "and", "accumulation", "of", "RAD51", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Total", "ATM", "protein", "is", "also", "shown", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "F", ",", "qPCR", "of", "RAD51", "expression", "measured", "in", "NS", ",", "BT308", "diff", ",", "and", "astrocytes", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Cell viability of NS, GBM, and astrocyte cell lines measured 72 h after irradiation (fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: one-way ANOVA, P=0.0001.B, Cell viability of BT308NS and their pseudo-differentiated progeny (BT308 diff) measured 24 h after irradiation (fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: t-test, P=0.0006.C, Flow cytometry analysis of phosphorylated histone H2AX (H2AX) at the indicated time points after IR (5 Gy, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: one-way ANOVA, P=0.03.D, Neutral comet assay performed 24 h after IR (5 Gy). Ctrl: non-irradiated cells. Comet tail's length is proportional to DSB extent.E, Western blot showing phosphorylation of ATM (pATM) and Chk2 (pChk2), and accumulation of RAD51 after IR (5 Gy). Total ATM protein is also shown. Vinculin was used as loading control.F, qPCR of RAD51 expression measured in NS, BT308 diff, and astrocytes at the indicated time-points after IR (5 Gy, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "PKH", "-", "26", "staining", "in", "irradiated", "BT308NS", ",", "24", "h", "after", "the", "last", "irradiation", ".", "The", "percentage", "of", "PKH", "-", "26pos", "cells", "is", "indicated", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "The", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "was", "as", "follow", ":", "ctrl", ",", "58", ".", "21", ";", "1", ".", "5", "Gy", "×", "4", ",", "69", ".", "35", ";", "2", "Gy", "×", "3", ",", "68", ".", "20", ";", "5", "Gy", ",", "60", ".", "29", ".", "B", ",", "qPCR", "of", "SOX2", "expression", "measured", "in", "NS", "6", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "02", ".", "C", ",", "LDA", "(", "sphere", "forming", ")", "measuring", "the", "enrichment", "of", "GSCs", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", "*", ":", "2", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "E", ",", "Tumor", "incidence", "in", "the", "LDA", "performed", "in", "p3", "mice", ",", "as", "described", "in", "D", ".", "F", ",", "Histogram", "showing", "the", "in", "vivo", "GSC", "frequency", "measured", "by", "LDA", "in", "p3", "tumors", ".", "GSC", "frequency", "(", "95", "%", "CI", ")", "was", "as", "follows", ":", "NS", "-", "ctrl", ",", "1", "/", "258", ".", "2", "(", "97", ".", "67", "-", "683", ".", "9", ")", ";", "NS", "-", "IR", "1", "/", "22", ".", "1", "(", "8", ".", "05", "-", "62", ".", "6", ")", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "1", ".", "6", "×", "10", "-", "4", ".", "G", ",", "LDA", "(", "sphere", "forming", ")", "measuring", "the", "in", "vitro", "frequency", "of", "GSCs", "in", "cells", "derived", "from", "p3", "tumors", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "H", ",", "LDA", "(", "sphere", "forming", ")", "measuring", "the", "in", "vitro", "frequency", "of", "GSCs", "in", "cells", "derived", "from", "intracranial", "tumors", "generated", "by", "BT463NS", ",", "and", "irradiated", "in", "vivo", "(", "2", "Gy", "×", "3", "days", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "tumors", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "2", ".", "04", "×", "10", "-", "11", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "CI", "or", "±", "SEM", "in", "B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Flow cytometry analysis of PKH-26 staining in irradiated BT308NS, 24 h after the last irradiation. The percentage of PKH-26pos cells is indicated. Ctrl: non-irradiated cells. The mean fluorescence intensity (MFI) was as follow: ctrl, 58.21; 1.5 Gy × 4, 69.35; 2 Gy × 3, 68.20; 5 Gy, 60.29.B, qPCR of SOX2 expression measured in NS 6 h after IR (5 Gy, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: t-test, p<0.02.C, LDA (sphere forming) measuring the enrichment of GSCs after IR (5 Gy). Ctrl: non-irradiated cells *: 2 test, p<0.05.E, Tumor incidence in the LDA performed in p3 mice, as described in D.F, Histogram showing the in vivo GSC frequency measured by LDA in p3 tumors. GSC frequency (95% CI) was as follows: NS-ctrl, 1/258.2 (97.67-683.9); NS-IR 1/22.1 (8.05-62.6). *: 2 test, P=1.6×10-4.G, LDA (sphere forming) measuring the in vitro frequency of GSCs in cells derived from p3 tumors. *: 2 test, P=0.0006.H, LDA (sphere forming) measuring the in vitro frequency of GSCs in cells derived from intracranial tumors generated by BT463NS, and irradiated in vivo (2 Gy × 3 days) (n = 3). Ctrl: non-irradiated tumors. *: 2 test, P=2.04×10-11. Data are represented as mean ± CI or ± SEM in B."}
{"words": ["Figure", "3B", ",", "LDA", "(", "sphere", "forming", ")", "measuring", "the", "GSC", "frequency", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", "in", "METhigh", "and", "METneg", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ".", "C", ",", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "MET", "in", "irradiated", "BT308NS", ",", "24", "h", "after", "the", "last", "irradiation", "(", "2", "Gy", "×", "3", "days", "or", "a", "single", "dose", "of", "5", "Gy", ")", ".", "Dotted", "lines", ":", "threshold", "to", "define", "the", "percentage", "of", "MET", "-", "expressing", "cells", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "The", "MFI", "was", "as", "follows", ":", "ctrl", ",", "18", ";", "2", "Gy", "×", "3", ",", "22", ".", "77", ";", "5", "Gy", ",", "19", ".", "49", ".", "D", ",", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "MET", "in", "BT308NS", "weekly", "treated", "with", "IR", "(", "2", "Gy", ")", "for", "6", "weeks", ".", "Dotted", "lines", ":", "threshold", "to", "define", "the", "percentage", "of", "MET", "-", "expressing", "cells", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "E", ",", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "MET", "(", "red", ")", "on", "tumors", "generated", "by", "subcutaneous", "injection", "of", "BT308NS", ",", "irradiated", "(", "2", "Gy", "×", "3", ")", "and", "explanted", "72", "h", "after", "the", "last", "irradiation", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiatedtumors", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "(", "63", "×", "magnification", ")", ".", "F", "left", ",", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "MET", "-", "expressing", "cells", "in", "tumor", "sections", "represented", "in", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "12", "HPF", "/", "group", ")", ".", "HPF", ":", "high", "-", "power", "field", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ".", "F", "right", ",", "Quantification", "of", "MET", "mean", "fluorescence", "intensity", "in", "tumor", "sections", "represented", "in", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "12", "HPF", "/", "group", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "00016", ".", "G", ",", "representative", "METimmunohistochemistry", "staining", "of", "matched", "primary", "and", "recurrent", "tumors", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", "(", "40", "×", "magnification", ")", ".", "H", ",", "Histogram", "representing", "the", "number", "of", "patient", "displaying", "different", "percentages", "of", "MET", "expressing", "cells", "in", "their", "primary", "or", "recurrent", "tumors", ":", "negative", ",", "0", "-", "5", "%", ";", "low", ",", "6", "-", "29", "%", ";", "moderate", ",", "30", "-", "69", "%", ";", "high", ",", "70", "-", "100", "%", "(", "see", "also", "Appendix", "Table", "4", ")", ".", "I", ",", "Dot", "plot", "representing", "the", "MET", "cumulative", "score", "(", "MET", "positive", "cell", "score", "+", "MET", "staining", "intensity", "score", ")", "in", "19", "primary", "and", "recurrent", "tumors", "(", "see", "Appendix", "Table", "4", ")", ".", "Wilcoxon", ",", "p", "<", "0", ".", "02", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "or", "±", "CI", "in", "B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B, LDA (sphere forming) measuring the GSC frequency after IR (5 Gy) in METhigh and METneg subpopulations sorted from BT308NS. *: 2 test, P=0.001.C, Flow cytometry analysis of MET in irradiated BT308NS, 24 h after the last irradiation (2 Gy × 3 days or a single dose of 5 Gy). Dotted lines: threshold to define the percentage of MET-expressing cells. Ctrl: non-irradiated cells. The MFI was as follows: ctrl, 18; 2 Gy × 3, 22.77; 5 Gy, 19.49.D, Flow cytometry analysis of MET in BT308NS weekly treated with IR (2 Gy) for 6 weeks. Dotted lines: threshold to define the percentage of MET-expressing cells. Ctrl: non-irradiated cells.E, Representative immunofluorescence staining of MET (red) on tumors generated by subcutaneous injection of BT308NS, irradiated (2 Gy × 3) and explanted 72 h after the last irradiation. Nuclei are counterstained with DAPI (blue). Ctrl: non-irradiatedtumors. Scale bar, 10 µm (63× magnification). F left, Quantification of the percentage of MET-expressing cells in tumor sections represented in (E) (n = 12 HPF/group). HPF: high-power field. *: t-test, P=0.001. F right, Quantification of MET mean fluorescence intensity in tumor sections represented in (E) (n = 12 HPF/group, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: t-test, P=0.00016.G, representative METimmunohistochemistry staining of matched primary and recurrent tumors. Scale bar, 50 µm (40× magnification). H, Histogram representing the number of patient displaying different percentages of MET expressing cells in their primary or recurrent tumors: negative, 0-5%; low, 6-29%; moderate, 30-69%; high, 70-100% (see also Appendix Table 4). I, Dot plot representing the MET cumulative score (MET positive cell score + MET staining intensity score) in 19 primary and recurrent tumors (see Appendix Table 4). Wilcoxon, p<0.02. Data are represented as mean ± SEM or ± CI in B."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Flow", "-", "cytometry", "analysis", "of", "Annexin", "V", "/", "DAPI", "incorporation", "and", "MET", "expression", "in", "BT308NS", "36", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "Blue", ":", "MET", "-", "negative", "cells", ".", "Red", ":", "MET", "-", "expressing", "cells", ".", "B", ",", "Western", "Blot", "of", "METneg", "and", "METhigh", "subpopulations", "sorted", "from", "BT452NS", ",", "showing", "activation", "of", "PARP", "(", "cleaved", "PARP", ")", "and", "Caspase", "3", "(", "cleaved", "casp", "-", "3", ")", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "C", ",", "Cell", "viability", "of", "METhigh", "and", "METneg", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ",", "measured", "96", "h", "after", "IR", "(", "1", "-", "10", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ",", "Clonogenic", "assay", "with", "METhigh", "and", "METneg", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", "and", "irradiated", "(", "1", "-", "10", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "E", ",", "Neutral", "comet", "assay", "in", "METhigh", "and", "METneg", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ",", "performed", "24", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "Comet", "tail", "'", "s", "length", "is", "proportional", "to", "DSB", "extent", ".", "F", ",", "Western", "Blot", "of", "METneg", "and", "METhigh", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ",", "showing", "constitutive", "(", "ctrl", ")", "and", "/", "or", "IR", "-", "induced", "phosphorylation", "of", "ATM", "(", "pATM", ")", ",", "Chk2", "(", "pChk2", ")", "and", "H2AX", "(", "H2AX", ")", ",", "and", "accumulation", "of", "RAD51", ",", "24", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", ".", "Total", "ATM", "protein", "is", "also", "shown", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "G", ",", "qPCR", "of", "RAD51", "expression", "in", "METhigh", "and", "METneg", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", "24", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "control", "cells", ",", "ctrl", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Flow-cytometry analysis of Annexin V/DAPI incorporation and MET expression in BT308NS 36 h after IR (5 Gy). Ctrl: non-irradiated cells. Blue: MET-negative cells. Red: MET-expressing cells.B, Western Blot of METneg and METhigh subpopulations sorted from BT452NS, showing activation of PARP (cleaved PARP) and Caspase 3 (cleaved casp-3) after IR (5 Gy). Vinculin was used as loading control.C, Cell viability of METhigh and METneg subpopulations sorted from BT308NS, measured 96 h after IR (1-10 Gy, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: t-test, p<0.001.D, Clonogenic assay with METhigh and METneg subpopulations sorted from BT308NS and irradiated (1-10 Gy, fold vs. non-irradiated cells, ctrl). *: t-test, p<0.05.E, Neutral comet assay in METhigh and METneg subpopulations sorted from BT308NS, performed 24 h after IR (5 Gy). Ctrl: non-irradiated cells. Comet tail's length is proportional to DSB extent.F, Western Blot of METneg and METhigh subpopulations sorted from BT308NS, showing constitutive (ctrl) and/or IR-induced phosphorylation of ATM (pATM), Chk2 (pChk2) and H2AX (H2AX), and accumulation of RAD51, 24 h after IR (5 Gy). Total ATM protein is also shown. β-actin was used as loading control.G, qPCR of RAD51 expression in METhigh and METneg subpopulations sorted from BT308NS 24 h after IR (5 Gy, fold vs. non-irradiated control cells, ctrl). *: t-test, P=0.02. Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Cell", "viability", "of", "BT308NS", ",", "measured", "48", "h", "after", "IR", "(", "2", "or", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "mock", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "10", "ng", "/", "ml", "HGF", "(", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "mock", "treated", "cells", ",", "mock", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "*", ":", "t", "-", "test", "(", "5", "Gy", "+", "HGF", ")", "vs", ".", "(", "5", "Gy", ")", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "B", ",", "Flow", "-", "cytometry", "analysis", "of", "Annexin", "V", "/", "DAPI", "incorporation", "in", "BT308NS", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "mock", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "HGF", ".", "Histograms", "show", "the", "percentage", "of", "Annexin", "V", "-", "positive", "cells", "48", "h", "after", "IR", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "C", ",", "Cell", "viability", "of", "BT308NS", ",", "irradiated", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "the", "MET", "inhibitor", "JNJ38877605", "(", "500", "nM", ")", ",", "and", "analyzed", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", "(", "fold", "vs", ".", "vehicle", "-", "treated", "cells", "at", "time", "0", ",", "mock", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ",", "Cell", "viability", "as", "in", "C", ",", "measured", "5", "days", "after", "IR", "(", "1", "-", "10", "Gy", ",", "fold", "vs", ".", "vehicle", "-", "treated", "cells", ",", "mock", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "03", ".", "E", ",", "Flow", "-", "cytometry", "analysis", "of", "Annexin", "V", "/", "DAPI", "incorporation", "in", "BT308NS", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "vehicle", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Histograms", "show", "the", "percentage", "of", "Annexin", "V", "-", "positive", "cells", "36", "h", "after", "IR", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "*", ":", "t", "-", "test", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "vs", ".", "(", "5", "Gy", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "01", ".", "F", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "caspase", "3", "activation", "(", "cleaved", "casp", "-", "3", ")", ",", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "G", ",", "Clonogenic", "assay", "with", "METneg", "and", "METhigh", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ",", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "vehicle", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "MET", "inhibitors", "(", "JNJ38877605", "and", "Crizotinib", ",", "500", "nM", ")", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0004", ".", "H", ",", "LDA", "(", "sphere", "forming", "assay", ")", "with", "METneg", "and", "METhigh", "subpopulations", "sorted", "from", "BT308NS", ",", "measuring", "GSC", "frequency", "after", "irradiation", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", ".", "I", ",", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "phosphorylated", "histone", "H2AX", "(", "H2AX", ")", "in", "the", "whole", "BT308NS", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", "(", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "cells", "at", "time", "0", ",", "mock", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "J", ",", "Neutral", "comet", "assay", "with", "BT308NS", "performed", "24", "h", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "Comet", "tail", "'", "s", "length", "is", "proportional", "to", "DSB", "extent", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "or", "±", "CI", "in", "H", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Cell viability of BT308NS, measured 48 h after IR (2 or 5 Gy) in the absence (mock) or in the presence of 10 ng/ml HGF (fold vs. non-irradiated mock treated cells, mock). Ctrl: non-irradiated cells. *: t-test (5 Gy + HGF) vs. (5 Gy), p<0.0001.B, Flow-cytometry analysis of Annexin V/DAPI incorporation in BT308NS irradiated (5 Gy) in the absence (mock) or in the presence of HGF. Histograms show the percentage of Annexin V-positive cells 48 h after IR. Ctrl: non-irradiated cells.C, Cell viability of BT308NS, irradiated in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of the MET inhibitor JNJ38877605 (500 nM), and analyzed at the indicated time points. Vehicle: non-irradiated cells (fold vs. vehicle-treated cells at time 0, mock). *: t-test, p<0.01.D, Cell viability as in C, measured 5 days after IR (1-10 Gy, fold vs. vehicle-treated cells, mock). *: t-test, p<0.03.E, Flow-cytometry analysis of Annexin V/DAPI incorporation in BT308NS irradiated (5 Gy) in the absence (vehicle) or in the presence (JNJ) of JNJ38877605. Histograms show the percentage of Annexin V-positive cells 36 h after IR. Ctrl: non-irradiated cells. *: t-test (5 Gy + JNJ) vs. (5 Gy), P=0.01.F, Western blot of BT308NS showing caspase 3 activation (cleaved casp-3), at the indicated time points after IR in the absence (-) or in the presence (+) of JNJ38877605. Vinculin was used as loading control.G, Clonogenic assay with METneg and METhigh subpopulations sorted from BT308NS, irradiated (5 Gy) in the absence (vehicle) or in the presence of MET inhibitors (JNJ38877605 and Crizotinib, 500 nM). Ctrl: non-irradiated cells. *: t-test, p<0.0004.H, LDA (sphere forming assay) with METneg and METhigh subpopulations sorted from BT308NS, measuring GSC frequency after irradiation in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605. Vehicle: non-irradiated vehicle-treated cells. *: 2 test, P=0.0002.I, Flow cytometry analysis of phosphorylated histone H2AX (H2AX) in the whole BT308NS at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605 (fold vs. non-irradiated cells at time 0, mock). *: t-test, p<0.05.J, Neutral comet assay with BT308NS performed 24 h after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605. Vehicle: non-irradiated vehicle-treated cells. Comet tail's length is proportional to DSB extent. Data are represented as mean ± SEM or ± CI in H."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "Western", "blot", "of", "BT463NS", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", "(", "pATM", ")", "and", "Chk2", "(", "pChk2", ")", ",", "and", "accumulation", "of", "RAD51", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "HGF", ")", "of", "HGF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Total", "ATM", "is", "also", "shown", ".", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "B", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", "(", "pATM", ")", "and", "Chk2", "(", "pChk2", ")", ",", "and", "accumulation", "of", "RAD51", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "the", "MET", "inhibitor", "JNJ38877605", "(", "500", "nM", ")", ".", "Total", "ATM", "is", "also", "shown", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Veh", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "C", ",", "Densitometric", "analysis", "of", "ATM", "phosphorylation", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", ",", "Chk2", ",", "and", "AKT", "(", "pAKT", ")", ",", "and", "accumulation", "of", "RAD51", "24", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "vehicle", ",", "veh", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "MAPK", "(", "PD98059", ",", "20", "M", ")", ",", "AKT", "(", "Ly294002", ",", "20", "M", ")", ",", "MET", "(", "JNJ38877605", ")", ",", "or", "ATM", "(", "CGK733", ",", "10", "M", ")", "inhibitors", ".", "Total", "ATM", "and", "AKT", "are", "also", "shown", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "E", ",", "Western", "blot", "of", "BT463NS", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", ",", "Chk2", ",", "and", "Aurora", "Kinase", "A", "(", "pAurora", "A", ")", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "Ly", ")", "of", "the", "AKT", "inhibitor", "Ly294002", ".", "Total", "ATM", "and", "Aurora", "Kinase", "A", "are", "also", "shown", ".", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Veh", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "F", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "phosphorylation", "of", "Aurora", "Kinase", "A", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Total", "Aurora", "kinase", "A", "is", "also", "shown", ".", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Veh", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "G", ",", "Western", "blot", "of", "BT463NS", "showing", "phosphorylation", "of", "Aurora", "Kinase", "A", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "HGF", ")", "of", "HGF", ".", "Total", "Aurora", "kinase", "A", "is", "also", "shown", ".", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "the", "same", "control", "applies", "to", "both", "panel", "A", "and", "G", ")", ".", "H", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "phosphorylation", "of", "ATM", "and", "Aurora", "Kinase", "A", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "MLN", ")", "of", "the", "Aurora", "Kinase", "A", "inhibitor", "MLN8237", "(", "20", "M", ")", ".", "Total", "ATM", "and", "Aurora", "kinase", "A", "are", "also", "shown", ".", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Veh", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ".", "I", ",", "Cell", "viability", "of", "BT308NS", ",", "measured", "72", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "vehicle", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "MET", "(", "JNJ38877605", ")", ",", "Aurora", "Kinase", "A", "(", "MLN8237", ")", ",", "or", "AKT", "(", "Ly294002", ")", "inhibitors", "(", "fold", "vs", ".", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "cells", ",", "mock", ")", ".", "*", ":", "t", "-", "test", "(", "5", "Gy", "+", "inhibitor", ")", "vs", ".", "(", "5", "Gy", "+", "vehicle", ")", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, Western blot of BT463NS showing phosphorylation of ATM (pATM) and Chk2 (pChk2), and accumulation of RAD51 at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + HGF) of HGF (10 ng/ml). Total ATM is also shown. H3 was used as loading control.B, Western blot of BT308NS showing phosphorylation of ATM (pATM) and Chk2 (pChk2), and accumulation of RAD51 at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of the MET inhibitor JNJ38877605 (500 nM). Total ATM is also shown. β-actin was used as loading control. Veh: non-irradiated vehicle-treated cells. C, Densitometric analysis of ATM phosphorylation shown in (B). *: t-test, p<0.01.D, Western blot of BT308NS showing phosphorylation of ATM, Chk2, and AKT (pAKT), and accumulation of RAD51 24 h after IR (5 Gy) in the absence (vehicle, veh) or in the presence of MAPK (PD98059, 20 M), AKT (Ly294002, 20 M), MET (JNJ38877605), or ATM (CGK733, 10 M) inhibitors. Total ATM and AKT are also shown. β-actin was used as loading control. Ctrl: non-irradiated cells.E, Western blot of BT463NS showing phosphorylation of ATM, Chk2, and Aurora Kinase A (pAurora A) at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + Ly) of the AKT inhibitor Ly294002. Total ATM and Aurora Kinase A are also shown. H3 was used as loading control. Veh: non-irradiated vehicle-treated cells.F, Western blot of BT308NS showing phosphorylation of Aurora Kinase A at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605. Total Aurora kinase A is also shown. H3 was used as loading control. Veh: non-irradiated vehicle-treated cells.G, Western blot of BT463NS showing phosphorylation of Aurora Kinase A at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + HGF) of HGF. Total Aurora kinase A is also shown. H3 was used as loading control (the same control applies to both panel A and G).H, Western blot of BT308NS showing phosphorylation of ATM and Aurora Kinase A at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + MLN) of the Aurora Kinase A inhibitor MLN8237 (20 M). Total ATM and Aurora kinase A are also shown. H3 was used as loading control. Veh: non-irradiated vehicle-treated cells.I, Cell viability of BT308NS, measured 72 h after IR (5 Gy) in the absence (vehicle) or in the presence of MET (JNJ38877605), Aurora Kinase A (MLN8237), or AKT (Ly294002) inhibitors (fold vs. non-irradiated vehicle-treated cells, mock). *: t-test (5 Gy + inhibitor) vs. (5 Gy + vehicle), p<0.01."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "Western", "blot", "of", "BT371NS", "showing", "p21", "phosphorylation", "(", "pp21Thr145", ")", "in", "cytoplasmic", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "p21", "antibodies", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "HGF", ")", "of", "HGF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ".", "B", ",", "Western", "blot", "of", "BT463NS", "showing", "p21", "phosphorylation", "(", "pp21Thr145", ")", "in", "cytoplasmic", "lysates", "immunoprecipitated", "with", "p21", "antibodies", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "the", "MET", "inhibitor", "JNJ38877605", "(", "500", "nM", ")", ".", "C", ",", "Western", "blot", "of", "BT308NS", "showing", "p21", "localization", "in", "cytoplasmic", "/", "nuclear", "extracts", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Vinculin", "and", "lamin", "B", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "fractions", ",", "respectively", ".", "D", ",", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "p21", "(", "red", ")", "on", "BT308NS", "cells", "3", "h", "after", "IR", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "absence", "(", "vehicle", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Ctrl", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "(", "63", "×", "magnification", ")", ".", "E", ",", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "showing", "p21", "cytoplasmic", "or", "nuclear", "localization", "in", "BT308NS", "represented", "in", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "10", "HPF", "/", "group", ")", ".", "HPF", ":", "high", "-", "power", "field", ".", "*", ":", "t", "-", "test", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "vs", ".", "(", "ctrl", "or", "5", "Gy", ")", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "F", ",", "Cell", "cycle", "analysis", "of", "BT314NS", ",", "performed", "24", "h", "after", "IR", "in", "the", "absence", "(", "5", "Gy", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "5", "Gy", "+", "JNJ", ")", "of", "JNJ38877605", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "cells", ".", "*", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "0", ".", "008", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, Western blot of BT371NS showing p21 phosphorylation (pp21Thr145) in cytoplasmic lysates immunoprecipitated with p21 antibodies at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + HGF) of HGF (10 ng/ml).B, Western blot of BT463NS showing p21 phosphorylation (pp21Thr145) in cytoplasmic lysates immunoprecipitated with p21 antibodies at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of the MET inhibitor JNJ38877605 (500 nM).C, Western blot of BT308NS showing p21 localization in cytoplasmic/nuclear extracts at the indicated time points after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605. Vinculin and lamin B were used as loading controls for cytoplasmic and nuclear fractions, respectively.D, Representative immunofluorescence staining of p21 (red) on BT308NS cells 3 h after IR (5 Gy) in the absence (vehicle) or in the presence (JNJ) of JNJ38877605. Ctrl: non-irradiated cells. Nuclei are counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 µm (63× magnification). E, Quantification of the percentage of cells showing p21 cytoplasmic or nuclear localization in BT308NS represented in (D) (n = 10 HPF/group). HPF: high-power field. *: t-test (5 Gy + JNJ) vs. (ctrl or 5 Gy), p<0.0001.F, Cell cycle analysis of BT314NS, performed 24 h after IR in the absence (5 Gy) or in the presence (5 Gy + JNJ) of JNJ38877605. Vehicle: non-irradiated cells. *: one-way ANOVA, P=0.008."}
{"words": ["Figure", "8B", "right", ",", "Quantification", "of", "epi", "-", "fluorescent", "GFP", "signal", "from", "tumors", "represented", "in", "(", "B", ",", "left", ")", "(", "n", "=", "4", "/", "condition", ")", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "tumors", ".", "*", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "5", ".", "5", "×", "10", "-", "5", ".", "C", ",", "Growth", "curves", "of", "tumors", ",", "generated", "by", "subcutaneous", "injection", "of", "BT308NS", ",", "irradiated", "in", "the", "absence", "(", "2", "Gy", "×", "3", "days", ")", "or", "in", "the", "presence", "(", "combo", ")", "of", "JNJ38877605", ",", "which", "was", "administered", "for", "15", "days", "as", "indicated", "(", "n", "=", "7", "/", "condition", ")", ".", "Vehicle", ":", "non", "-", "irradiated", "vehicle", "-", "treated", "tumors", ".", "*", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "D", ",", "Survival", "analysis", "of", "mice", "bearing", "tumors", "generated", "and", "treated", "as", "in", "C", ".", "Black", "dot", ":", "censored", "mouse", ".", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "(", "combo", ")", "vs", ".", "(", "2", "Gy", "×", "3", "days", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0019", ".", "F", ",", "In", "vitro", "LDA", "(", "sphere", "-", "forming", ")", "measuring", "GSC", "frequencies", "as", "described", "in", "E", "(", "n", "=", "3", "/", "condition", ")", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "p", "<", "10", "-", "5", ".", "G", ",", "Tumor", "incidence", "in", "the", "in", "vivo", "LDA", "performed", "on", "tumors", "generated", "and", "treated", "as", "described", "in", "E", ".", "H", ",", "Histogram", "showing", "GSC", "frequencies", "measured", "by", "in", "vivo", "LDA", ",", "as", "described", "in", "E", ".", "*", ":", "2", "test", ",", "P", "=", "5", ".", "47", "×", "10", "-", "6", ".", "I", ",", "Table", "showing", "GSC", "frequencies", "measured", "by", "in", "vivo", "LDA", ",", "represented", "in", "H", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "or", "±", "CI", "in", "F", ",", "H", ",", "I", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B right, Quantification of epi-fluorescent GFP signal from tumors represented in (B, left) (n = 4/condition). Vehicle: non-irradiated vehicle-treated tumors. *: one-way ANOVA, P=5.5×10-5.C, Growth curves of tumors, generated by subcutaneous injection of BT308NS, irradiated in the absence (2 Gy × 3 days) or in the presence (combo) of JNJ38877605, which was administered for 15 days as indicated (n = 7/condition). Vehicle: non-irradiated vehicle-treated tumors. *: one-way ANOVA, P=0.0006.D, Survival analysis of mice bearing tumors generated and treated as in C. Black dot: censored mouse. Log-rank (Mantel-Cox) test (combo) vs. (2 Gy × 3 days), P=0.0019.F, In vitro LDA (sphere-forming) measuring GSC frequencies as described in E (n = 3/condition). *: 2 test, p<10-5.G, Tumor incidence in the in vivo LDA performed on tumors generated and treated as described in E.H, Histogram showing GSC frequencies measured by in vivo LDA, as described in E. *: 2 test, P=5.47×10-6. I, Table showing GSC frequencies measured by in vivo LDA, represented in H. Data are represented as mean ± SEM or ± CI in F,H,I."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Poly", "(", "I", ":", "C", ")", "treatment", "inhibits", "axonal", "growth", "at", "3", "DIV", "(", "A", ")", "and", "dendritic", "growth", "at", "6", "DIV", "(", "B", ")", "in", "WT", "neurons", ".", "Neurons", "were", "transfected", "with", "GFP", "at", "1", "or", "4", "DIV", ".", "One", "day", "later", ",", "neurons", "were", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", "before", "harvest", ".", "(", "C", ")", "Axon", "and", "dendrite", "morphology", "of", "Tlr3", "-", "/", "-", "neurons", "after", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "treatment", ".", "Data", "in", "A", ",", "B", ",", "C", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "20μm", "in", "A", "and", "B", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Neuronal", "morphology", "in", "saline", "-", "and", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "Tlr3", "+", "/", "+", ";", "Thy1", "-", "Yfp", "(", "D", ")", "and", "Tlr3", "-", "/", "-", ";", "Thy1", "-", "Yfp", "(", "E", ")", "mouse", "brains", ".", "Total", "dendrite", "length", ",", "dendritic", "tip", "number", "and", "Sholl", "analysis", "of", "dendritic", "processes", "were", "used", "to", "examine", "the", "dendrite", "phenotype", ".", "Data", "of", "dendrite", "length", "and", "tip", "number", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "Sholl", "data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "and", "mice", "are", "presented", "in", "each", "column", ".", "Mean", "values", "SEM", "are", "shown", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "in", "D", "and", "E", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Poly(I:C) treatment inhibits axonal growth at 3 DIV (A) and dendritic growth at 6 DIV (B) in WT neurons. Neurons were transfected with GFP at 1 or 4 DIV. One day later, neurons were treated with poly(I:C) for 24 h before harvest. (C) Axon and dendrite morphology of Tlr3-/- neurons after poly(I:C) treatment. Data in A,B,C were analyzed by unpaired t-test. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. ** P < 0.001, *** P < 0.0001. Scale bar, 20μm in A and B.(D, E) Neuronal morphology in saline- and poly(I:C)-treated Tlr3+/+;Thy1-Yfp (D) and Tlr3-/-;Thy1-Yfp (E) mouse brains. Total dendrite length, dendritic tip number and Sholl analysis of dendritic processes were used to examine the dendrite phenotype. Data of dendrite length and tip number were analyzed by unpaired t-test. The Sholl data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. The numbers of analyzed neurons and mice are presented in each column. Mean values SEM are shown. * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001. Scale bar, 50 μm in D and E."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "Quantitation", "of", "dendrite", "morphology", "of", "Trif", "mutant", "neurons", "(", "A", ")", "and", "Myd88", "-", "/", "-", "neurons", "(", "B", ")", "after", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "stimulation", ".", "Trif", "mutant", "or", "Myd88", "-", "/", "-", "neurons", "were", "transfected", "with", "a", "GFP", "construct", "at", "4", "DIV", "and", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "one", "day", "later", ".", "Neuron", "morphology", "was", "analyzed", "at", "6", "DIV", "according", "to", "the", "GFP", "signal", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "MYD88", "but", "not", "TRIF", "expression", "reduces", "dendrite", "outgrowth", ".", "HA", "-", "tagged", "MYD88", "and", "TRIF", "were", "co", "-", "transfected", "with", "a", "GFP", "construct", "into", "cultured", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "neurons", "at", "4", "DIV", ",", "and", "cell", "morphology", "was", "analyzed", "at", "6", "DIV", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "(", "D", ")", "MYD88", "knockdown", ",", "but", "not", "TRIF", "knockdown", ",", "robustly", "increases", "dendritic", "arbors", "and", "loses", "the", "response", "to", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Three", "DIV", "neurons", "were", "transfected", "with", "control", "shRNA", "(", "shCtrl", ")", ",", "MYD88", "shRNA", "(", "shMYD88", ")", "or", "TRIF", "shRNA", "(", "shTRIF", ")", "and", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "was", "applied", "into", "the", "culture", "at", "5", "DIV", "for", "24", "h", "before", "harvest", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) Quantitation of dendrite morphology of Trif mutant neurons (A) and Myd88-/- neurons (B) after poly(I:C) stimulation. Trif mutant or Myd88-/- neurons were transfected with a GFP construct at 4 DIV and treated with poly(I:C) one day later. Neuron morphology was analyzed at 6 DIV according to the GFP signal. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by unpaired t-test.(C) MYD88 but not TRIF expression reduces dendrite outgrowth. HA-tagged MYD88 and TRIF were co-transfected with a GFP construct into cultured wild-type (WT) neurons at 4 DIV, and cell morphology was analyzed at 6 DIV. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by one-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test.(D) MYD88 knockdown, but not TRIF knockdown, robustly increases dendritic arbors and loses the response to poly(I:C). Three DIV neurons were transfected with control shRNA (shCtrl), MYD88 shRNA (shMYD88) or TRIF shRNA (shTRIF) and poly(I:C) was applied into the culture at 5 DIV for 24 h before harvest. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. Scale bar, 20 μm. *** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Coimmunoprecipitation", "of", "TLR3", "and", "MYD88", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ".", "Twenty", "-", "four", "h", "later", ",", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "was", "performed", "using", "HA", "antibody", ".", "The", "precipitates", "were", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "with", "Myc", "and", "HA", "antibodies", "as", "indicated", ".", "EC", ",", "TLR3", "ectodomain", ".", "(", "B", ")", "Poly", "(", "I", ":", "C", ")", "treatment", "increases", "the", "interaction", "between", "TLR3", "and", "MYD88", ".", "One", "day", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "saline", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "30", "min", "before", "harvesting", ".", "(", "C", ")", "Upper", ",", "schematic", "of", "MYD88", "constructs", ".", "DD", ",", "death", "domain", ";", "ID", ",", "intermediate", "domain", ",", "TIR", ",", "TIR", "domain", ".", "Lower", ",", "coimmunoprecipitation", "of", "TLR3", "and", "the", "N", "-", "terminal", "region", "of", "MYD88", ".", "(", "D", ")", "Full", "-", "length", "and", "N", "-", "terminal", "MYD88", "inhibit", "dendrite", "outgrowth", ".", "Myd88", "-", "/", "-", "neurons", "were", "transfected", "with", "control", "vector", "(", "Ctrl", ")", ",", "HA", "-", "tagged", "MYD88", "(", "MYD88", ")", ",", "N", "-", "terminal", "MYD88", "(", "MYD88", "-", "N", ")", ",", "or", "C", "-", "terminal", "MYD88", "(", "MYD88", "-", "C", ")", "with", "a", "GFP", "construct", ".", "Poly", "(", "I", ":", "C", ")", "was", "applied", "into", "the", "culture", "at", "5", "DIV", "and", "neuronal", "morphology", "was", "analyzed", "at", "6", "DIV", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "Expression", "patterns", "of", "full", "-", "length", "and", "truncated", "fragments", "of", "MYD88", "in", "Myd88", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Coimmunoprecipitation of TLR3 and MYD88. HEK293T cells were transfected with the indicated constructs. Twenty-four h later, immunoprecipitation (IP) was performed using HA antibody. The precipitates were immunoblotted (IB) with Myc and HA antibodies as indicated. EC, TLR3 ectodomain.(B) Poly(I:C) treatment increases the interaction between TLR3 and MYD88. One day after transfection, cells were treated with saline or poly(I:C) for 30 min before harvesting.(C) Upper, schematic of MYD88 constructs. DD, death domain; ID, intermediate domain, TIR, TIR domain. Lower, coimmunoprecipitation of TLR3 and the N-terminal region of MYD88.(D) Full-length and N-terminal MYD88 inhibit dendrite outgrowth. Myd88-/- neurons were transfected with control vector (Ctrl), HA-tagged MYD88 (MYD88), N-terminal MYD88 (MYD88-N), or C-terminal MYD88 (MYD88-C) with a GFP construct. Poly(I:C) was applied into the culture at 5 DIV and neuronal morphology was analyzed at 6 DIV. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. Scale bar, 20 μm.(E) Expression patterns of full-length and truncated fragments of MYD88 in Myd88-/- neurons. Representative images are shown."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "qPCR", "analysis", "of", "proinflammatory", "cytokines", "Il", "-", "6", ",", "Tnfα", ",", "Il", "-", "1β", "and", "antiviral", "cytokine", "Ifnβ", "in", "WT", "cultured", "cortical", "and", "hippocampal", "neurons", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Il", "-", "6", "and", "Tnfα", "N", "=", "8", ";", "Ifnβ", "and", "Il", "-", "1β", ",", "N", "=", "6", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Poly", "(", "I", ":", "C", ")", "treatment", "inhibits", "dendrite", "outgrowth", "of", "Il", "-", "6", "-", "/", "-", "neurons", "(", "B", ")", "and", "Tnfα", "-", "/", "-", "neurons", "(", "C", ")", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "Left", ",", "schematic", "of", "experiment", "using", "conditioned", "medium", ".", "Upper", "right", ",", "conditioned", "medium", "applied", "to", "WT", "neurons", ".", "Lower", "right", ",", "conditioned", "medium", "applied", "to", "Tlr3", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Dendrite", "morphology", "was", "analyzed", "one", "day", "after", "adding", "conditioned", "medium", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) qPCR analysis of proinflammatory cytokines Il-6, Tnfα, Il-1β and antiviral cytokine Ifnβ in WT cultured cortical and hippocampal neurons. Data were analyzed by unpaired t-test. Il-6 and Tnfα N=8; Ifnβ and Il-1β, N=6.(B, C) Poly(I:C) treatment inhibits dendrite outgrowth of Il-6-/- neurons (B) and Tnfα-/- neurons (C). Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by unpaired t-test.(D) Left, schematic of experiment using conditioned medium. Upper right, conditioned medium applied to WT neurons. Lower right, conditioned medium applied to Tlr3-/- neurons. Dendrite morphology was analyzed one day after adding conditioned medium. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by unpaired t-test. * P < 0.05, *** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5At", "4", "DIV", ",", "cultured", "cortical", "neurons", "were", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", ".", "Three", "days", "later", ",", "neurons", "were", "treated", "with", "10", "μg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", ".", "Neuronal", "morphology", "was", "monitored", "by", "GFP", "signals", "at", "8", "DIV", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ":", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5At 4 DIV, cultured cortical neurons were transfected with indicated plasmids. Three days later, neurons were treated with 10 μg/ml poly(I:C) for 24 h. Neuronal morphology was monitored by GFP signals at 8 DIV. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. Scale bar, 20 μm. *** P < 0.0001, ns: non-significant."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Expression", "of", "12", "neuropsychiatric", "disorder", "-", "related", "genes", "in", "saline", "-", "and", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "WT", "neurons", ".", "(", "B", ")", "Expression", "of", "9", "neuropsychiatric", "disorder", "-", "related", "genes", "in", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "Tlr3", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Relative", "expression", "levels", "compared", "with", "vehicle", "control", "are", "shown", ".", "In", "(", "B", "-", "D", ")", ",", "dashed", "lines", "indicate", "the", "level", "of", "saline", "control", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Expression", "of", "Auts2", ",", "Disc1", ",", "Fmr1", ",", "Pten", "and", "Ube3a", "in", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "Myd88", "-", "/", "-", "neurons", "(", "C", ")", "and", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "P5", "WT", "mouse", "brains", "(", "D", ")", ".", "In", "(", "B", "-", "D", ")", ",", "dashed", "lines", "indicate", "the", "level", "of", "saline", "control", ".", "(", "E", ")", "DIV", "5", "WT", "neurons", "were", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", ".", "The", "total", "neuronal", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "VCP", "and", "β", "-", "actin", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "The", "protein", "levels", "were", "normalized", "with", "β", "-", "actin", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Numbers", "of", "experimental", "repeats", "(", "N", ")", "are", "shown", "in", "each", "column", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Expression of 12 neuropsychiatric disorder-related genes in saline- and poly(I:C)-treated WT neurons.(B) Expression of 9 neuropsychiatric disorder-related genes in poly(I:C)-treated Tlr3-/- neurons. Relative expression levels compared with vehicle control are shown. In (B-D), dashed lines indicate the level of saline control.(C, D) Expression of Auts2, Disc1, Fmr1, Pten and Ube3a in poly(I:C)-treated Myd88-/- neurons (C) and poly(I:C)-treated P5 WT mouse brains (D). In (B-D), dashed lines indicate the level of saline control.(E) DIV 5 WT neurons were treated with poly(I:C) for 24 h. The total neuronal lysates were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies. VCP and β-actin were used as loading controls. The protein levels were normalized with β-actin. Data were analyzed by unpaired t-test. Numbers of experimental repeats (N) are shown in each column. * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Overexpression", "of", "WT", "DISC1", ",", "but", "not", "the", "DISC1", "L604F", "mutant", ",", "in", "cultured", "neurons", "suppresses", "dendrite", "withdrawal", "induced", "by", "TLR3", "activation", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "in", "the", "representative", "experiments", "are", "indicated", "in", "each", "column", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Overexpression", "of", "DISC1", "in", "cortical", "neurons", "of", "mouse", "brain", "is", "resistant", "to", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "triggered", "reduction", "of", "dendritic", "arborization", ".", "Vector", "control", "(", "Ctrl", ")", "(", "B", ")", "or", "Myc", "-", "DISC1", "(", "C", ")", "was", "co", "-", "expressed", "with", "GFP", "in", "cortical", "layer", "2", "/", "3", "neurons", "in", "mouse", "brain", ".", "After", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "injection", "at", "P4", "and", "P5", ",", "the", "neuronal", "morphology", "was", "analyzed", "at", "P7", "by", "tracing", "the", "GFP", "signals", ".", "The", "data", "of", "dendrite", "length", "and", "tip", "number", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "Sholl", "data", "were", "analyzed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "neurons", "collected", "from", "3", "-", "4", "mice", "of", "each", "group", "are", "indicated", ".", "Mean", "values", "SEM", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Overexpression of WT DISC1, but not the DISC1 L604F mutant, in cultured neurons suppresses dendrite withdrawal induced by TLR3 activation. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. The numbers of analyzed neurons in the representative experiments are indicated in each column. Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. Scale bar, 20 μm. * P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001.(B-C) Overexpression of DISC1 in cortical neurons of mouse brain is resistant to poly(I:C)-triggered reduction of dendritic arborization. Vector control (Ctrl) (B) or Myc-DISC1 (C) was co-expressed with GFP in cortical layer 2/3 neurons in mouse brain. After poly(I:C) injection at P4 and P5, the neuronal morphology was analyzed at P7 by tracing the GFP signals. The data of dendrite length and tip number were analyzed by unpaired t-test. The Sholl data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison test. The numbers of analyzed neurons collected from 3-4 mice of each group are indicated. Mean values SEM are shown. Scale bar, 30 μm. * P < 0.05, *** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Cortical", "and", "hippocampal", "mixed", "neuronal", "cultures", "were", "transfected", "with", "a", "GFP", "construct", "at", "12", "DIV", "and", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "pIC", ")", "at", "17", "DIV", "for", "24", "h", ".", "Spine", "morphology", "was", "examined", "at", "18", "DIV", ".", "Three", "secondary", "dendrites", "of", "each", "neuron", "were", "selected", "to", "analyze", "the", "spine", "density", ",", "the", "width", "of", "the", "spine", "head", "and", "the", "spine", "length", ".", "Mean", "values", "SEM", "of", "representatives", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "For", "the", "saline", "group", ",", "15", "neurons", "/", "45", "dendrites", "were", "examined", ";", "for", "the", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "group", ",", "16", "neurons", "/", "48", "dendrites", "were", "examined", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", "in", "right", "upper", "panel", "and", "5", "µm", "in", "lower", "left", "panel", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Spine", "morphology", "of", "P21", "Thy1", "-", "Yfp", "(", "C", ")", "and", "Tlr3", "-", "/", "-", ";", "Thy1", "-", "Yfp", "mice", "(", "D", ")", "after", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "stimulation", "at", "P4", "and", "P5", ".", "One", "secondary", "dendrite", "of", "an", "apical", "dendrite", "of", "each", "somatosensory", "layer", "5", "cortical", "neuron", "was", "selected", "to", "examine", "the", "spine", "morphology", ".", "Three", "mice", "were", "analyzed", "for", "each", "group", ".", "Saline", "-", "treated", "Thy1", "-", "Yfp", ",", "44", "neurons", ";", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "Thy1", "-", "Yfp", ",", "43", "neurons", ";", "saline", "-", "treated", "Tlr3", "-", "/", "-", ";", "Thy1", "-", "Yfp", ",", "46", "neurons", ";", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "-", "treated", "Tlr3", "-", "/", "-", ";", "Thy1", "-", "Yfp", ",", "50", "neurons", ".", "Mean", "values", "SEM", "are", "shown", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Cortical and hippocampal mixed neuronal cultures were transfected with a GFP construct at 12 DIV and treated with poly(I:C) (pIC) at 17 DIV for 24 h. Spine morphology was examined at 18 DIV. Three secondary dendrites of each neuron were selected to analyze the spine density, the width of the spine head and the spine length. Mean values SEM of representatives of three independent experiments are shown. For the saline group, 15 neurons/45 dendrites were examined; for the poly(I:C) group, 16 neurons/48 dendrites were examined. Data were analyzed by unpaired t-test. Scale bar, 20 μm in right upper panel and 5 µm in lower left panel. *** P < 0.0001.(C, D) Spine morphology of P21 Thy1-Yfp (C) and Tlr3-/-; Thy1-Yfp mice (D) after poly(I:C) stimulation at P4 and P5. One secondary dendrite of an apical dendrite of each somatosensory layer 5 cortical neuron was selected to examine the spine morphology. Three mice were analyzed for each group. Saline-treated Thy1-Yfp, 44 neurons; poly(I:C)-treated Thy1-Yfp, 43 neurons; saline-treated Tlr3-/-;Thy1-Yfp, 46 neurons; poly(I:C)-treated Tlr3-/-;Thy1-Yfp, 50 neurons. Mean values SEM are shown. Data were analyzed by unpaired t-test. Scale bar, 5 μm. *** P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "1The", "reversal", "potential", "of", "currents", "was", "positively", "shifted", "when", "a", "long", "voltage", "ramp", "pulse", "followed", "the", "depolarizing", "steps", ".", "(", "top", "panel", ")", "The", "voltage", "protocol", "used", "for", "the", "experiment", ".", "(", "bottom", "panel", ")", "Representative", "traces", "of", "currents", "elicited", "by", "voltage", "ramp", "pulses", "are", "shown", ".", "(", "top", "panel", ")", ".", "The", "red", "line", "represents", "the", "arithmetical", "difference", "between", "currents", "elicited", "by", "500", "-", "ms", "(", "2", ")", "and", "2", "-", "ms", "pulses", "(", "1", ")", ".", "B", ".", "The", "summary", "bar", "graph", "represents", "the", "mean", "values", "of", "the", "reversal", "potentials", "of", "currents", ".", "(", "9", "cells", "from", "3", "mice", ",", "paired", "Student", "t", "-", "test", ";", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "Tail", "currents", "elicited", "by", "the", "hyperpolarizing", "voltage", "steps", "following", "the", "depolarizing", "steps", "of", "variable", "durations", ".", "Representative", "traces", "of", "currents", "elicited", "by", "the", "voltage", "protocol", "with", "a", "pipette", "solution", "containing", "150", "mM", "Cl", "-", "and", "0", ".", "2", "mM", "EGTA", "(", "top", "panel", ")", ",", "150", "mM", "gluconate", "(", "middle", "panel", ")", ",", "or", "2", "mM", "BAPTA", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "A", "summary", "graph", "of", "averaged", "tail", "current", "amplitudes", "as", "a", "function", "of", "the", "depolarizing", "step", "duration", "(", "the", "numbers", "on", "the", "right", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "A", "bar", "graph", "of", "averaged", "values", "of", "the", "tail", "current", "amplitudes", "summarizing", "the", "results", "of", "(", "c", ")", "at", "500", "ms", ".", "(", "The", "numbers", "inside", "each", "bar", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", "from", "at", "least", "3", "mice", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ";", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1The reversal potential of currents was positively shifted when a long voltage ramp pulse followed the depolarizing steps. (top panel) The voltage protocol used for the experiment. (bottom panel) Representative traces of currents elicited by voltage ramp pulses are shown. (top panel). The red line represents the arithmetical difference between currents elicited by 500-ms (2) and 2-ms pulses (1). B. The summary bar graph represents the mean values of the reversal potentials of currents. (9 cells from 3 mice, paired Student t-test; data are presented as mean values ± s.e.m).Tail currents elicited by the hyperpolarizing voltage steps following the depolarizing steps of variable durations. Representative traces of currents elicited by the voltage protocol with a pipette solution containing 150 mM Cl- and 0.2 mM EGTA (top panel), 150 mM gluconate (middle panel), or 2 mM BAPTA (bottom panel).A summary graph of averaged tail current amplitudes as a function of the depolarizing step duration (the numbers on the right indicate the numbers of recorded cells, data are presented as mean values ± s.e.m.)A bar graph of averaged values of the tail current amplitudes summarizing the results of (c) at 500 ms. (The numbers inside each bar indicate the numbers of recorded cells from at least 3 mice, unpaired Student t-test; data are presented as mean values ± s.e.m.)."}
{"words": ["Figure", "2A", "summary", "bar", "graph", "showing", "the", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "data", "for", "TMEM16A", ",", "TMEM16B", ",", "and", "BEST1", "with", "cDNA", "samples", "prepared", "from", "the", "mHb", "and", "hippocampus", "of", "adult", "mouse", "brains", "(", "N", "=", "3", ",", "n", "=", "3", "each", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "RNAscope", "ISH", "showed", "an", "apparent", "expression", "of", "TMEM16A", "mRNA", "co", "-", "localized", "with", "ChAT", "and", "Tac1", "signals", "in", "the", "mHb", "compared", "to", "the", "ones", "in", "lHb", ".", "Enlarged", "images", "showed", "that", "signals", "of", "TMEM16A", "and", "Tac1", "in", "the", "dorsal", "mHb", "or", "ChAT", "in", "the", "ventral", "mHb", "reside", "together", "at", "the", "single", "cell", "level", ".", "Immunohistochemical", "staining", "of", "40", "-", "µm", "coronal", "brain", "sections", "with", "anti", "-", "TMEM16A", "antibody", ".", "In", "the", "mHb", ",", "TMEM16A", "signals", "colocalize", "with", "the", "cholinergic", "marker", "ChAT", "(", "arrows", ")", ".", "High", "magnifications", "of", "the", "indicated", "areas", "are", "shown", "in", "the", "merged", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A summary bar graph showing the quantitative real-time PCR data for TMEM16A, TMEM16B, and BEST1 with cDNA samples prepared from the mHb and hippocampus of adult mouse brains (N=3, n=3 each, unpaired Student t-test, data are presented as mean values ± s.e.m.).RNAscope ISH showed an apparent expression of TMEM16A mRNA co-localized with ChAT and Tac1 signals in the mHb compared to the ones in lHb. Enlarged images showed that signals of TMEM16A and Tac1 in the dorsal mHb or ChAT in the ventral mHb reside together at the single cell level.Immunohistochemical staining of 40-µm coronal brain sections with anti-TMEM16A antibody. In the mHb, TMEM16A signals colocalize with the cholinergic marker ChAT (arrows). High magnifications of the indicated areas are shown in the merged panel."}
{"words": ["Figure", "3Immunohistochemical", "staining", "of", "40", "-", "µm", "coronal", "brain", "sections", "with", "an", "anti", "-", "TMEM16A", "antibody", ".", "The", "TMEM16A", "signals", "in", "the", "mHb", "of", "TMEM16A", "cKO", "mice", "were", "compared", "to", "the", "ones", "of", "littermate", "controls", ".", "TMEM16A", "colocalized", "with", "the", "cholinergic", "marker", "ChAT", "in", "the", "mHb", ".", "The", "specific", "deletion", "of", "TMEM16A", "in", "the", "mHb", "is", "evident", ".", "Representative", "traces", "demonstrating", "the", "spontaneous", "activity", "of", "the", "mHb", "neurons", "in", "a", "cell", "-", "attached", "mode", "from", "TMEM16A", "cKO", "mice", "compared", "to", "the", "one", "from", "littermate", "controls", ".", "D", ".", "A", "summary", "bar", "graph", "showing", "the", "frequencies", "of", "spontaneous", "firing", "of", "the", "mHb", "neurons", "in", "TMEM16A", "cKO", "(", "4", "mice", ")", "and", "littermate", "controls", "(", "The", "numbers", "inside", "each", "bar", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", "from", "4", "mice", "each", ",", "paired", "Student", "t", "-", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "Representative", "averaged", "traces", "of", "sAPs", "of", "the", "mHb", "neurons", "with", "the", "pipette", "solution", "(", "40", "mM", "Cl", "-", "and", "0", ".", "5", "mM", "EGTA", ")", "from", "TMEM16A", "cKO", "mice", "and", "littermate", "controls", ".", "Summary", "bar", "graphs", "showing", "the", "frequency", ",", "half", "-", "width", ",", "and", "AHP", "slope", "of", "the", "sAPs", "of", "mHb", "neurons", "from", "TMEM16A", "cKO", "mice", "and", "littermate", "controls", "(", "The", "numbers", "inside", "each", "bar", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunohistochemical staining of 40-µm coronal brain sections with an anti-TMEM16A antibody. The TMEM16A signals in the mHb of TMEM16A cKO mice were compared to the ones of littermate controls. TMEM16A colocalized with the cholinergic marker ChAT in the mHb. The specific deletion of TMEM16A in the mHb is evident.Representative traces demonstrating the spontaneous activity of the mHb neurons in a cell-attached mode from TMEM16A cKO mice compared to the one from littermate controls. D. A summary bar graph showing the frequencies of spontaneous firing of the mHb neurons in TMEM16A cKO (4 mice) and littermate controls (The numbers inside each bar indicate the numbers of recorded cells from 4 mice each, paired Student t-test, data are presented as mean values ± s.e.m.).Representative averaged traces of sAPs of the mHb neurons with the pipette solution (40 mM Cl- and 0.5 mM EGTA) from TMEM16A cKO mice and littermate controls.Summary bar graphs showing the frequency, half-width, and AHP slope of the sAPs of mHb neurons from TMEM16A cKO mice and littermate controls (The numbers inside each bar indicate the numbers of recorded cells, unpaired Student t-test, data are presented as mean values ± s.e.m.)."}
{"words": ["Figure", "4Immunohistochemical", "images", "of", "the", "IPN", "region", "from", "control", "and", "TMEM16A", "cKO", "mice", ".", "The", "c", "-", "Fos", "signal", "was", "greatly", "reduced", "in", "TMEM16A", "cKO", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "μm", ".", "A", "summary", "bar", "graph", "showing", "reduced", "c", "-", "Fos", "expression", "in", "the", "IPN", "in", "TMEM16A", "cKO", "mice", ".", "(", "NCTL", "=", "7", "(", "n", "=", "42", ")", ",", "NcKO", "=", "6", "(", "n", "=", "36", ")", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "Representative", "traces", "of", "sEPSCs", "of", "neurons", "in", "the", "medial", "part", "of", "the", "IPN", "showing", "a", "reduced", "frequency", "in", "TMEM16A", "cKO", "mice", "compared", "to", "that", "of", "littermate", "controls", ".", "Summary", "bar", "graphs", "of", "the", "frequency", "and", "amplitude", "of", "the", "sEPSCs", "of", "IPN", "neurons", "in", "TMEM16A", "cKO", "(", "cKO", ")", "mice", "and", "littermate", "controls", "(", "CTL", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "paired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "numbers", "inside", "each", "bar", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunohistochemical images of the IPN region from control and TMEM16A cKO mice. The c-Fos signal was greatly reduced in TMEM16A cKO mice. Scale bar = 200 μm.A summary bar graph showing reduced c-Fos expression in the IPN in TMEM16A cKO mice. (NCTL=7 (n=42), NcKO=6 (n=36), unpaired Student t-test, data are presented as mean values ± s.e.m.).Representative traces of sEPSCs of neurons in the medial part of the IPN showing a reduced frequency in TMEM16A cKO mice compared to that of littermate controls.Summary bar graphs of the frequency and amplitude of the sEPSCs of IPN neurons in TMEM16A cKO (cKO) mice and littermate controls (CTL). Data are presented as mean values ± s.e.m. (paired Student t-test). The numbers inside each bar indicate the numbers of recorded cells."}
{"words": ["Figure", "5In", "the", "EPM", "task", ",", "the", "time", "spent", "in", "the", "open", "arms", "was", "significantly", "decreased", "in", "cKO", "mice", "compared", "to", "that", "in", "the", "control", "(", "CTL", ")", "group", "(", "nCTL", "=", "20", ",", "ncKO", "=", "12", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ".", "In", "the", "LDB", "task", ",", "the", "time", "spent", "in", "the", "light", "zone", "by", "cKO", "mice", "was", "significantly", "decreased", "compared", "to", "that", "spent", "by", "the", "CTL", "mice", "(", "nCTL", "=", "20", ",", "ncKO", "=", "12", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "In", "the", "PA", "task", ",", "the", "entry", "latency", "of", "cKO", "mice", "was", "significantly", "decreased", "compared", "to", "that", "of", "the", "CTL", "mice", "(", "nCTL", "=", "20", ",", "ncKO", "=", "12", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", ".", "D", ".", "Nestlet", "shredding", "behaviors", "of", "the", "cKO", "group", "were", "also", "decreased", "compared", "to", "those", "of", "the", "CTL", "group", ".", "The", "weight", "of", "the", "shredded", "nestlets", "of", "the", "cKO", "group", "was", "significantly", "lower", "than", "that", "of", "the", "CTL", "group", "(", "nCTL", "=", "20", ",", "ncKO", "=", "12", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "In", "the", "3", "-", "chamber", "test", ",", "the", "cKO", "mice", "exhibited", "a", "decreased", "interest", "for", "the", "stranger", "mouse", "(", "S1", ")", "against", "objects", "(", "O", ")", "compared", "to", "the", "CTL", "group", "(", "nCTL", "=", "12", ",", "ncKO", "=", "14", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "When", "cKO", "mice", "were", "exposed", "to", "a", "new", "stranger", "mouse", "(", "S2", ")", "against", "the", "familiar", "S1", "mouse", ",", "they", "also", "showed", "a", "decreased", "interest", "for", "the", "S2", "mouse", "compared", "to", "that", "of", "the", "CTL", "group", ".", "The", "preference", "index", "showed", "the", "decreased", "sociability", "of", "the", "cKO", "group", "in", "both", "sessions", "(", "nCTL", "=", "12", ",", "ncKO", "=", "14", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In the EPM task, the time spent in the open arms was significantly decreased in cKO mice compared to that in the control (CTL) group (nCTL=20, ncKO=12, unpaired Student t-test). B. In the LDB task, the time spent in the light zone by cKO mice was significantly decreased compared to that spent by the CTL mice (nCTL=20, ncKO=12, unpaired Student t-test). C. In the PA task, the entry latency of cKO mice was significantly decreased compared to that of the CTL mice (nCTL=20, ncKO=12, unpaired Student t-test)..D. Nestlet shredding behaviors of the cKO group were also decreased compared to those of the CTL group. The weight of the shredded nestlets of the cKO group was significantly lower than that of the CTL group (nCTL=20, ncKO=12, unpaired Student t-test).In the 3-chamber test, the cKO mice exhibited a decreased interest for the stranger mouse (S1) against objects (O) compared to the CTL group (nCTL=12, ncKO=14, unpaired Student t-test). F. When cKO mice were exposed to a new stranger mouse (S2) against the familiar S1 mouse, they also showed a decreased interest for the S2 mouse compared to that of the CTL group. The preference index showed the decreased sociability of the cKO group in both sessions (nCTL=12, ncKO=14, unpaired Student t-test). Data information: All data are presented as mean values ± s.e.m."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "traces", "showing", "that", "the", "spontaneous", "firing", "of", "mHb", "neurons", "from", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "were", "reduced", "when", "CNO", "(", "10", "μM", ")", "was", "applied", "in", "the", "ACSF", ".", "A", "summary", "bar", "graph", "showing", "the", "reduction", "of", "normalized", "frequencies", "of", "spontaneous", "firing", "of", "the", "mHb", "neurons", "transfected", "with", "AAV", "-", "hM4Di", "-", "mCherry", "before", "and", "during", "CNO", "treatment", "(", "The", "numbers", "inside", "each", "bar", "indicate", "the", "numbers", "of", "recorded", "cells", ")", ".", "In", "the", "EPM", "task", ",", "the", "time", "spent", "in", "the", "open", "arms", "of", "CNO", "-", "treated", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "was", "significantly", "decreased", "compared", "to", "that", "of", "the", "PBS", "-", "treated", "controls", "(", "CTL", ")", ".", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ".", "In", "the", "LDB", "task", ",", "the", "time", "spent", "in", "the", "light", "zone", "by", "CNO", "-", "treated", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "was", "significantly", "decreased", "compared", "to", "that", "spent", "by", "the", "PBS", "-", "treated", "control", "mice", ".", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "In", "the", "PA", "task", ",", "the", "entry", "latency", "of", "CNO", "-", "treated", "mice", "was", "significantly", "decreased", "compared", "to", "that", "of", "the", "CTL", "group", ".", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ".", "Nestlet", "shredding", "behaviors", "of", "the", "CNO", "-", "treated", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "were", "also", "decreased", ".", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ";", ")", ".", "In", "the", "3", "-", "chamber", "test", ",", "the", "subject", "mouse", "of", "the", "PBS", "-", "treated", "mice", "and", "the", "CNO", "-", "treated", "mice", "explored", "freely", "the", "three", "test", "chambers", ".", "The", "time", "spent", "in", "each", "chamber", "during", "two", "sessions", "was", "measured", ".", "The", "CNO", "-", "treated", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "exhibited", "a", "decreased", "interest", "for", "a", "stranger", "mouse", "(", "S1", ")", "against", "objects", "(", "O", ")", "compared", "to", "the", "PBS", "-", "treated", "group", "(", "left", "two", "panels", ")", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "I", ".", "When", "CNO", "-", "treated", "ChAT", "(", "+", ")", "-", "cre", ":", ":", "hM4D", "(", "Gi", ")", "mice", "were", "exposed", "to", "a", "new", "stranger", "mouse", "(", "S2", ")", "against", "the", "familiar", "S1", "mouse", ",", "they", "also", "showed", "a", "decreased", "interest", "for", "the", "S2", "mouse", "compared", "to", "the", "PBS", "-", "treated", "control", "group", "(", "right", "two", "panels", ")", ".", "The", "preference", "index", "showed", "decreased", "sociability", "of", "the", "CNO", "-", "treated", "group", "in", "both", "sessions", "(", "nCTL", "=", "6", ",", "ncKO", "=", "9", ",", "unpaired", "Student", "t", "-", "test", ";", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative traces showing that the spontaneous firing of mHb neurons from ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice were reduced when CNO (10 μM) was applied in the ACSF.A summary bar graph showing the reduction of normalized frequencies of spontaneous firing of the mHb neurons transfected with AAV-hM4Di-mCherry before and during CNO treatment (The numbers inside each bar indicate the numbers of recorded cells).In the EPM task, the time spent in the open arms of CNO-treated ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice was significantly decreased compared to that of the PBS-treated controls (CTL). (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test). E. In the LDB task, the time spent in the light zone by CNO-treated ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice was significantly decreased compared to that spent by the PBS-treated control mice. (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test). F. In the PA task, the entry latency of CNO-treated mice was significantly decreased compared to that of the CTL group. (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test). G. Nestlet shredding behaviors of the CNO-treated ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice were also decreased. (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test;).In the 3-chamber test, the subject mouse of the PBS-treated mice and the CNO-treated mice explored freely the three test chambers. The time spent in each chamber during two sessions was measured. The CNO-treated ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice exhibited a decreased interest for a stranger mouse (S1) against objects (O) compared to the PBS-treated group (left two panels) (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test). I. When CNO-treated ChAT(+)-cre::hM4D(Gi) mice were exposed to a new stranger mouse (S2) against the familiar S1 mouse, they also showed a decreased interest for the S2 mouse compared to the PBS-treated control group (right two panels). The preference index showed decreased sociability of the CNO-treated group in both sessions (nCTL=6, ncKO=9, unpaired Student t-test;)."}
{"words": ["Figure", "1Cell", "surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "control", "vector", "or", "a", "vector", "expressing", "hβ2m", "were", "analyzed", ".", "Cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "expressing", "hβ2m", "were", "compared", "to", "control", "BMDC", ",", "by", "measuring", "IL", "-", "2", "production", "by", "a", "Kb", "-", "SIINFEKL", "specific", "T", "-", "cell", "hybridoma", "(", "B3Z", ")", "cultured", "with", "paraformaldehyde", "fixed", "BMDC", "that", "were", "incubated", "with", "varying", "numbers", "of", "OVA", "-", "coated", "latex", "beads", "for", "6hr", ",", "prior", "to", "fixation", ".", "The", "effect", "of", "hβ2m", "on", "the", "presentation", "of", "peptides", "derived", "from", "endogenous", "antigen", "was", "assessed", "by", "measuring", "IL", "-", "2", "levels", "in", "the", "culture", "supernatant", "of", "the", "B3Z", "hybridoma", "incubated", "with", "fixed", "VV", "-", "OVA", "infected", "WT", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "control", "vector", "or", "hβ2m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Cell surface H2-Kb levels of wild type and TAP1-/- BMDC transduced with control vector or a vector expressing hβ2m were analyzed.Cross-presentation of OVA by wild type and TAP1-/- BMDC expressing hβ2m were compared to control BMDC, by measuring IL-2 production by a Kb-SIINFEKL specific T-cell hybridoma (B3Z) cultured with paraformaldehyde fixed BMDC that were incubated with varying numbers of OVA-coated latex beads for 6hr, prior to fixation.The effect of hβ2m on the presentation of peptides derived from endogenous antigen was assessed by measuring IL-2 levels in the culture supernatant of the B3Z hybridoma incubated with fixed VV-OVA infected WT and TAP1-/- BMDC transduced with control vector or hβ2m."}
{"words": ["Figure", "2Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Surface", "H2", "-", "Kb", "levels", "of", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is", "shownCross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is", "shownCross", "-", "presentation", "of", "OVA", "by", "wild", "-", "type", "and", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "co", "-", "expressing", "Rab", "mutants", "and", "hβ2m", "were", "analyzed", "and", "IL", "-", "2", "release", "is"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Surface H2-Kb levels of wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed by flow cytometry.Cross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shownCross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shownCross-presentation of OVA by wild-type and TAP1-/- BMDC co-expressing Rab mutants and hβ2m were analyzed and IL-2 release is shown"}
{"words": ["Figure", "3TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "transduced", "with", "vector", "control", "(", "A", ")", "or", "hβ2m", "(", "C", ")", "were", "incubated", "with", "varying", "concentrations", "of", "Epoxomicin", "for", "6hr", "in", "absence", "or", "presence", "of", "exogenously", "added", "Kb", "-", "binding", "SIINFEKL", "peptide", "and", "analyzed", "for", "surface", "expression", "of", "Kb", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "plots", "are", "shown", "(", "A", ",", "C", ")", ".", "The", "impact", "of", "Epoxomicin", "on", "cell", "surface", "Kb", "was", "analyzed", "by", "plotting", "Kb", "surface", "expression", "on", "cells", "incubated", "with", "Epoxomicin", ",", "normalized", "to", "that", "on", "cell", "incubated", "without", "Epoxomicin", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "B", ",", "D", ")", ".", "The", "effect", "of", "Epoxomicin", "on", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "-", "coated", "beads", "by", "TAP1", "-", "/", "-", "BMDC", "expressing", "hβ2m", "was", "determined", "by", "incubating", "the", "BMDC", "with", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", "and", "10μM", "gB", "peptide", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3TAP1-/- BMDC transduced with vector control (A) or hβ2m (C) were incubated with varying concentrations of Epoxomicin for 6hr in absence or presence of exogenously added Kb-binding SIINFEKL peptide and analyzed for surface expression of Kb by flow cytometry. Representative plots are shown (A, C). The impact of Epoxomicin on cell surface Kb was analyzed by plotting Kb surface expression on cells incubated with Epoxomicin, normalized to that on cell incubated without Epoxomicin (n=3) (B, D).The effect of Epoxomicin on cross-presentation of OVA-coated beads by TAP1-/- BMDC expressing hβ2m was determined by incubating the BMDC with OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin and 10μM gB peptide. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured"}
{"words": ["Figure", "4293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "co", "-", "expressing", "empty", "vector", "or", "Rab", "mutants", "(", "Rab5ACA", ",", "Rab22ACA", ",", "Rab7ADN", ")", "individually", ",", "with", "either", "LacZ", "as", "a", "control", "or", "US6", "were", "analyzed", "for", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "using", "B3Z", "cells", ".", "The", "effects", "of", "US6", "on", "cross", "-", "presentation", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "mean", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "release", "by", "cells", "co", "-", "expressing", "US6", "(", "A", ")", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", "compared", "to", "cells", "co", "-", "expressing", "LacZ", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", ",", "respectively", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "co", "-", "expressing", "empty", "vector", "or", "Rab", "mutants", "(", "Rab5ACA", ",", "Rab22ACA", ",", "Rab7ADN", ")", "individually", ",", "with", "either", "LacZ", "as", "a", "control", "or", "ICP47", "(", "B", ")", ",", "were", "analyzed", "for", "cross", "-", "presentation", "of", "OVA", "using", "B3Z", "cells", ".", "The", "effects", "of", "ICP47", "on", "cross", "-", "presentation", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "mean", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "release", "by", "cells", "co", "-", "expressing", "ICP47", "(", "B", ")", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", "compared", "to", "cells", "co", "-", "expressing", "LacZ", "with", "control", "vector", "or", "Rab", "mutants", ",", "respectively", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab5ACA", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab22ACA", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", ".", "293T", "-", "FcR", "-", "Kb", "cells", "expressing", "Rab7ADN", "(", "E", ")", "were", "incubated", "with", "opsonized", "OVA", "coated", "latex", "beads", "in", "the", "presence", "of", "varying", "doses", "of", "Epoxomicin", ".", "After", "6hrs", "the", "cells", "were", "fixed", ",", "incubated", "with", "B3Z", "cells", "and", "IL", "-", "2", "production", "was", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4293T-FcR-Kb cells co-expressing empty vector or Rab mutants (Rab5ACA, Rab22ACA, Rab7ADN) individually, with either LacZ as a control or US6 were analyzed for cross-presentation of OVA using B3Z cells. The effects of US6 on cross-presentation were analyzed by plotting the mean percentage of IL-2 release by cells co-expressing US6 (A) with control vector or Rab mutants compared to cells co-expressing LacZ with control vector or Rab mutants, respectively.293T-FcR-Kb cells co-expressing empty vector or Rab mutants (Rab5ACA, Rab22ACA, Rab7ADN) individually, with either LacZ as a control or ICP47 (B), were analyzed for cross-presentation of OVA using B3Z cells. The effects of ICP47 on cross-presentation were analyzed by plotting the mean percentage of IL-2 release by cells co-expressing ICP47 (B) with control vector or Rab mutants compared to cells co-expressing LacZ with control vector or Rab mutants, respectively.293T-FcR-Kb cells expressing Rab5ACA were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured.293T-FcR-Kb cells expressing Rab22ACA were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured.293T-FcR-Kb cells expressing Rab7ADN (E) were incubated with opsonized OVA coated latex beads in the presence of varying doses of Epoxomicin. After 6hrs the cells were fixed, incubated with B3Z cells and IL-2 production was measured."}
{"words": ["Figure", "5EM", "micrographs", "of", "double", "immuno", "-", "gold", "labeling", "using", "antibodies", "against", "immunoproteasome", "subunit", "LMP2", "and", "the", "endolysosomal", "membrane", "marker", "LAMP1", "in", "BMDC", ",", "WT", "MEF", "and", "LMP2", "KO", "MEF", ".", "Large", "gold", "particles", "(", "15", "nm", ",", "black", "arrow", "head", ")", "labels", "LMP2", "and", "small", "gold", "particles", "labels", "LAMP1", "(", "5", "nm", ",", "white", "arrow", "head", ")", "(", "Scale", "bars", "=", "500nm", ")", ".", "The", "insets", "are", "the", "magnification", "of", "region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "(", "Scale", "bars", "=", "100nm", ")", ",", "marked", "by", "the", "black", "rectangle", ".", "The", "distribution", "of", "LMP2", "positive", "signals", "(", "n", "=", "22", "images", ")", "assessed", "by", "plotting", "the", "number", "of", "gold", "particles", "labeling", "LMP2", "within", "the", "LAMP1", "positive", "membrane", "compartment", "versus", "those", "outside", "the", "LAMP1", "positive", "organelles", ".", "Immuno", "-", "gold", "labeling", "with", "antibodies", "against", "constitutive", "proteasome", "subunits", ",", "α5", ",", "β5", "and", "19", "S2", "(", "15", "nm", ",", "black", "arrow", "head", ")", ",", "co", "-", "labeled", "with", "an", "anti", "-", "LAMP1", "antibody", "(", "5", "nm", ",", "white", "arrow", "head", ")", "in", "BMDC", "(", "Scale", "bars", "=", "500nm", ")", ".", "Regions", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuoles", "are", "marked", "by", "the", "black", "rectangles", "and", "magnified", "in", "the", "insets", "(", "Scale", "bars", "=", "100nm", ")", ".", "Immuno", "-", "electron", "microscopy", "images", "(", "n", "=", "23", ")", "were", "analyzed", "by", "plotting", "the", "total", "number", "of", "gold", "particles", "labeling", "proteasome", "subunits", "inside", "and", "outside", "the", "LAMP1", "positive", "membrane", "compartments", "(", "D", ")", ".", "These", "data", "are", "also", "presented", "as", "the", "percentage", "of", "the", "total", "gold", "particles", "that", "are", "within", "the", "LAMP1", "positive", "organelle", "(", "E", ")", ".", "BMDC", "transduced", "with", "genes", "encoding", "GFP", ",", "GFP", "-", "Rab5ACA", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "under", "the", "control", "of", "an", "inducible", "promoter", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "LMP2", "and", "LAMP1", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "24hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "4hr", "after", "Alexa", "647", "-", "OVA", "coated", "bead", "uptake", ".", "A", "single", "optical", "section", "of", "10", "optical", "sections", "of", "a", "representative", "cell", "are", "shown", "(", "Scale", "Bar", "10μm", ")", ".", "Region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "containing", "beads", "coated", "with", "Alexa", "-", "647", "conjugated", "OVA", ",", "marked", "by", "white", "rectangles", ",", "are", "magnified", "as", "inset", "(", "Scale", "bars", "=", "1μm", ")", "BMDC", "transduced", "with", "genes", "encoding", "GFP", ",", "GFP", "-", "Rab5ACA", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "under", "the", "control", "of", "an", "inducible", "promoter", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "LMP2", "and", "LAMP1", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "3D", "-", "rendering", "of", "10", "optical", "sections", "of", "a", "representative", "cell", "are", "shown", "(", "Scale", "Bar", "10μm", ")", ".", "Region", "of", "interest", "containing", "LAMP1", "positive", "vacuole", "containing", "beads", "coated", "with", "Alexa", "-", "647", "conjugated", "OVA", ",", "marked", "by", "white", "rectangles", ",", "are", "magnified", "as", "inset", "(", "Scale", "bars", "=", "1μm", ")", "The", "same", "cells", "were", "analyzed", "for", "LMP2", "fluorescence", "intensity", "within", "the", "phagosomal", "lumen", "as", "defined", "by", "a", "region", "of", "interest", "positive", "for", "Alexa", "647", "-", "OVA", "enclosed", "within", "a", "limiting", "membrane", "positive", "for", "LAMP1", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "LMP2", "within", "the", "phagosomal", "lumen", "normalized", "to", "Alexa647", "-", "OVA", "was", "calculated", "and", "data", "compiled", "from", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", "are", "plotted", "(", "H", ")", ".", "For", "each", "transduced", "cell", "type", ",", "images", "of", "at", "the", "least", "27", "cells", "acquired", "across", "three", "independent", "experiments", "were", "analyzed", "and", "each", "cell", "is", "represented", "as", "a", "data", "point", ".", "BMDC", "co", "-", "expressing", "LMP2", "-", "RFP", "and", "GFP", "-", "Rab5ACA", "were", "live", "imaged", "16hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "30min", "post", "uptake", "of", "Alexa647", "coated", "latex", "beads", "(", "Bar", "10μm", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "every", "3min", "and", "images", "taken", "at", "12min", "interval", "are", "presented", "(", "I", "-", "K", ")", ".", "The", "arrowheads", "in", "panel", "(", "I", "and", "J", ")", "mark", "the", "phagosome", "or", "vacuoles", "containing", "LMP2", ",", "respectively", ".", "BMDC", "co", "-", "expressing", "LMP2", "-", "RFP", "and", "GFP", "-", "Rab22ACA", "(", "J", ",", "K", ")", "were", "live", "imaged", "16hr", "after", "doxycycline", "induction", "and", "30min", "post", "uptake", "of", "Alexa647", "coated", "latex", "beads", "(", "Bar", "10μm", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "every", "3min", "and", "images", "taken", "at", "12min", "interval", "are", "presented", "(", "I", "-", "K", ")", ".", "The", "arrowheads", "in", "panel", "(", "I", "and", "J", ")", "mark", "the", "phagosome", "or", "vacuoles", "containing", "LMP2", ",", "respectively", ".", "The", "boxed", "region", "in", "panel", "(", "J", ")", "marks", "a", "phagosome", "that", "has", "been", "enlarged", "in", "panel", "(", "K", ")", "(", "Bar", "1μm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5EM micrographs of double immuno-gold labeling using antibodies against immunoproteasome subunit LMP2 and the endolysosomal membrane marker LAMP1 in BMDC, WT MEF and LMP2 KO MEF. Large gold particles (15 nm, black arrow head) labels LMP2 and small gold particles labels LAMP1 (5 nm, white arrow head) (Scale bars = 500nm). The insets are the magnification of region of interest containing LAMP1 positive vacuole (Scale bars = 100nm), marked by the black rectangle.The distribution of LMP2 positive signals (n = 22 images) assessed by plotting the number of gold particles labeling LMP2 within the LAMP1 positive membrane compartment versus those outside the LAMP1 positive organelles.Immuno-gold labeling with antibodies against constitutive proteasome subunits, α5, β5 and 19 S2 (15 nm, black arrow head), co-labeled with an anti-LAMP1 antibody (5 nm, white arrow head) in BMDC (Scale bars = 500nm). Regions of interest containing LAMP1 positive vacuoles are marked by the black rectangles and magnified in the insets (Scale bars = 100nm).Immuno-electron microscopy images (n = 23) were analyzed by plotting the total number of gold particles labeling proteasome subunits inside and outside the LAMP1 positive membrane compartments (D). These data are also presented as the percentage of the total gold particles that are within the LAMP1 positive organelle (E).BMDC transduced with genes encoding GFP, GFP-Rab5ACA and GFP-Rab22ACA under the control of an inducible promoter were fixed and stained for LMP2 and LAMP1 and analyzed by confocal microscopy 24hr after doxycycline induction and 4hr after Alexa 647-OVA coated bead uptake. A single optical section of 10 optical sections of a representative cell are shown (Scale Bar 10μm). Region of interest containing LAMP1 positive vacuole containing beads coated with Alexa-647 conjugated OVA, marked by white rectangles, are magnified as inset (Scale bars = 1μm)BMDC transduced with genes encoding GFP, GFP-Rab5ACA and GFP-Rab22ACA under the control of an inducible promoter were fixed and stained for LMP2 and LAMP1 and analyzed by confocal microscopy 3D-rendering of 10 optical sections of a representative cell are shown (Scale Bar 10μm). Region of interest containing LAMP1 positive vacuole containing beads coated with Alexa-647 conjugated OVA, marked by white rectangles, are magnified as inset (Scale bars = 1μm)The same cells were analyzed for LMP2 fluorescence intensity within the phagosomal lumen as defined by a region of interest positive for Alexa 647-OVA enclosed within a limiting membrane positive for LAMP1. The fluorescence intensity of LMP2 within the phagosomal lumen normalized to Alexa647-OVA was calculated and data compiled from independent experiments (n=3) are plotted (H).For each transduced cell type, images of at the least 27 cells acquired across three independent experiments were analyzed and each cell is represented as a data point.BMDC co-expressing LMP2-RFP and GFP-Rab5ACA were live imaged 16hr after doxycycline induction and 30min post uptake of Alexa647 coated latex beads (Bar 10μm). Images were acquired every 3min and images taken at 12min interval are presented (I-K). The arrowheads in panel (I and J) mark the phagosome or vacuoles containing LMP2, respectively.BMDC co-expressing LMP2-RFP and GFP-Rab22ACA (J, K) were live imaged 16hr after doxycycline induction and 30min post uptake of Alexa647 coated latex beads (Bar 10μm). Images were acquired every 3min and images taken at 12min interval are presented (I-K). The arrowheads in panel (I and J) mark the phagosome or vacuoles containing LMP2, respectively. The boxed region in panel (J) marks a phagosome that has been enlarged in panel (K) (Bar 1μm)."}
{"words": ["Figure", "6Activity", "of", "proteasomes", "within", "the", "phagosomes", "was", "determined", "by", "measuring", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "fluorogenic", "proteasome", "substrate", "incubated", "with", "latex", "beads", "from", "detergent", "-", "treated", "phagosomes", "treated", "or", "untreated", "with", "Epoxomicin", ".", "The", "fluorescence", "intensities", "were", "measured", "at", "1hr", "intervals", "and", "values", "plotted", "represent", "the", "ratio", "of", "the", "signals", "in", "the", "absence", "versus", "the", "presence", "of", "EpoxomicinIntraluminal", "proteasome", "dependent", "degradation", "of", "phagocytosed", "antigen", "was", "measured", "by", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "phagocytosed", "latex", "beads", "covalently", "conjugated", "with", "Alexa647", "-", "OVA", ".", "Latex", "beads", "were", "extracted", "by", "mechanical", "disruption", "of", "BMDC", "and", "incubated", "with", "ATP", ",", "lysosomal", "protease", "inhibitor", "cocktail", "and", "varying", "dose", "of", "Epoxomicin", "at", "37oC", "for", "16hrs", ".", "Post", "incubation", "latex", "beads", "were", "treated", "with", "detergent", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "(", "B", ")", ".", "The", "mean", "of", "Alexa647", "fluorescence", "associated", "with", "the", "latex", "beads", "incubated", "with", "Epoxomicin", "were", "normalized", "to", "fluorescence", "of", "untreated", "beads", "from", "independent", "experiments", "were", "plotted", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "C", ")", ".", "Ubiquitination", "of", "phagosomal", "cargo", "within", "the", "phagosomes", "was", "assessed", "by", "measuring", "the", "acquisition", "of", "GFP", "fluorescence", "by", "phagocytosed", "latex", "beads", "conjugated", "with", "OVA", "post", "-", "detergent", "extraction", "from", "BMDC", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "Ub", "(", "D", ")", ".", "The", "mean", "of", "fluorescence", "intensities", "of", "GFP", "on", "the", "beads", "from", "independent", "experiments", "was", "plotted", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Activity of proteasomes within the phagosomes was determined by measuring the fluorescence intensity of fluorogenic proteasome substrate incubated with latex beads from detergent-treated phagosomes treated or untreated with Epoxomicin. The fluorescence intensities were measured at 1hr intervals and values plotted represent the ratio of the signals in the absence versus the presence of EpoxomicinIntraluminal proteasome dependent degradation of phagocytosed antigen was measured by flow cytometric analysis of phagocytosed latex beads covalently conjugated with Alexa647-OVA. Latex beads were extracted by mechanical disruption of BMDC and incubated with ATP, lysosomal protease inhibitor cocktail and varying dose of Epoxomicin at 37oC for 16hrs. Post incubation latex beads were treated with detergent and analyzed by flow cytometry (B). The mean of Alexa647 fluorescence associated with the latex beads incubated with Epoxomicin were normalized to fluorescence of untreated beads from independent experiments were plotted (n=4) (C).Ubiquitination of phagosomal cargo within the phagosomes was assessed by measuring the acquisition of GFP fluorescence by phagocytosed latex beads conjugated with OVA post-detergent extraction from BMDC expressing GFP or GFP-Ub (D). The mean of fluorescence intensities of GFP on the beads from independent experiments was plotted (E)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Colocalization", "of", "LacCer", "and", "LysoTracker", "(", "LyTr", ")", "in", "different", "CTR", "and", "LSD", "patient", "fibroblasts", ".", "Mander", "´", "s", "coefficients", "were", "calculated", "using", "the", "Fiji", "JACoP", "plugin", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "(", "A", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Confocal", "images", "(", "B", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "C", ")", "showing", "colocalization", "of", "LacCer", "and", "LyTr", "in", "human", "CTR", "and", "MLIV", "fibroblasts", ",", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "16h", ")", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Confocal", "images", "(", "D", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "E", ")", "showing", "colocalization", "of", "LacCer", "and", "LyTr", "in", "human", "CTR", "and", "NPC1", "fibroblasts", ",", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "C", ",", "E", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "showing", "LacCer", "/", "LyTr", "colocalization", "in", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "which", "were", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "16h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "G", ",", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Ca2", "+", "chelation", "(", "BAPTA", "-", "AM", ")", "dose", "-", "dependently", "impairs", "LacCer", "trafficking", "in", "CTR", "fibroblasts", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "I", ")", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "Confocal", "images", "(", "J", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "K", ")", "of", "NPC1", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "(", "K", ")", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Colocalization of LacCer and LysoTracker (LyTr) in different CTR and LSD patient fibroblasts. Mander´s coefficients were calculated using the Fiji JACoP plugin. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's (A, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(B-C) Confocal images (B) and statistical analysis (C) showing colocalization of LacCer and LyTr in human CTR and MLIV fibroblasts, treated with TPC2-A1-P (30 µM, 16h). (D-E) Confocal images (D) and statistical analysis (E) showing colocalization of LacCer and LyTr in human CTR and NPC1 fibroblasts, treated with TPC2-A1-P (30 µM, 48h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's C, E, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(F-G) Confocal images and statistical analysis showing LacCer/LyTr colocalization in MLIV patient fibroblasts which were mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 16h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's G, multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(H-I) Ca2+ chelation (BAPTA-AM) dose-dependently impairs LacCer trafficking in CTR fibroblasts. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's I) multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(J-K) Confocal images (J) and statistical analysis (K) of NPC1 patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, Tukey's (K) multiple comparisons test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "Confocal", "images", "(", "A", ")", "and", "statistical", "analysis", "(", "B", ")", "of", "cholesterol", "accumulation", "in", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Cholesterol", "accumulation", "was", "evident", "for", "NPC1", "and", "MLIV", "fibroblasts", ",", "but", "not", "for", "JNCL", "fibroblasts", ".", "The", "images", "show", "filipin", "staining", "to", "visualize", "cholesterol", "accumulation", "and", "TO", "-", "PRO3", "as", "nuclear", "staining", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "B", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "rescued", "NPC1", "and", "MLIV", "cholesterol", "accumulation", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "D", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "(", "E", "-", "F", ")", "of", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "(", "white", "arrow", "heads", ")", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "statistical", "analysis", "(", "G", ")", "of", "MLIV", "patient", "fibroblasts", "mock", "-", "electroporated", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "electroporated", "with", "a", "gain", "-", "of", "-", "function", "hTPC2", "(", "M484L", "/", "G734E", ")", ":", "mCherry", "TOPO", "3", ".", "1", "vector", "(", "white", "arrow", "heads", ")", "and", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "of", "human", "CTR", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "and", "statistical", "analysis", "of", "human", "NPC1", "patient", "fibroblasts", "treated", "with", "50", "nM", "mock", "siRNA", "(", "siSCR", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TPCN2", "(", "siTPC2", ")", "for", "72", "hours", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "K", ")", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Statistics", "(", "L", ")", "of", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Effect", "of", "the", "treatment", "with", "TPC2", "agonist", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "was", "examined", "in", "NPC1", "and", "MLIV", "cells", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "L", ")", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "electron", "microscopy", "images", "(", "M", ")", "of", "human", "CTR", ",", "MLIV", ",", "JNCL", ",", "and", "NPC1", "fibroblasts", ".", "Effect", "of", "the", "treatment", "with", "TPC2", "agonist", "(", "30", "µM", ",", "48h", ")", "was", "examined", "in", "NPC1", "and", "MLIV", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) Confocal images (A) and statistical analysis (B) of cholesterol accumulation in human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Cholesterol accumulation was evident for NPC1 and MLIV fibroblasts, but not for JNCL fibroblasts. The images show filipin staining to visualize cholesterol accumulation and TO-PRO3 as nuclear staining. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test (B, *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.(C-D) TPC2-A1-P (30 µM, 48h) rescued NPC1 and MLIV cholesterol accumulation. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test D, *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images (E-F) of MLIV patient fibroblasts mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector (white arrow heads) and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 48h).statistical analysis (G) of MLIV patient fibroblasts mock-electroporated and treated with DMSO or electroporated with a gain-of-function hTPC2(M484L/G734E):mCherry TOPO 3.1 vector (white arrow heads) and treated with either DMSO or TPC2-A1-P (30 µM, 48h). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images and statistical analysis of human CTR patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells) two-tailed Student's t-test *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images and statistical analysis of human NPC1 patient fibroblasts treated with 50 nM mock siRNA (siSCR) or siRNA targeting TPCN2 (siTPC2) for 72 hours. Cells were then treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM). Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); two-tailed Student's t-test K). *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Statistics (L) of human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Effect of the treatment with TPC2 agonist (30 µM, 48h) was examined in NPC1 and MLIV cells. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells); one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test , L) *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.electron microscopy images (M) of human CTR, MLIV, JNCL, and NPC1 fibroblasts. Effect of the treatment with TPC2 agonist (30 µM, 48h) was examined in NPC1 and MLIV cells."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Images", "show", "LAMP1", "staining", "and", "autofluorescence", "at", "405", "and", "488", "nm", "excitation", "wavelength", ",", "respectively", ",", "corresponding", "to", "the", "lipofuscin", "autofluorescence", "spectrum", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "following", "cell", "cycle", "arrest", "(", "2h", "mitomycin", "C", "treatment", ")", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "showing", "no", "autofluorescence", "signal", "at", "594", "nm", "excitation", "wavelength", "(", "used", "for", "LAMP1", "staining", ")", ".", "(", "C", ")", "Mean", "autofluorescence", "intensity", "in", "LAMP1", "+", "area", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Mean", "intensity", "of", "shigatoxin", "(", "STX", ")", "in", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "after", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Confocal", "images", "of", "Gb3", "accumulation", "stained", "with", "shigatoxin", "(", "STX", ")", "in", "CTR", "and", "JNCL", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "after", "cell", "cycle", "arrest", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Confocal images of CTR and JNCL fibroblasts. Images show LAMP1 staining and autofluorescence at 405 and 488 nm excitation wavelength, respectively, corresponding to the lipofuscin autofluorescence spectrum. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) following cell cycle arrest (2h mitomycin C treatment). (B) Confocal images showing no autofluorescence signal at 594 nm excitation wavelength (used for LAMP1 staining).(C) Mean autofluorescence intensity in LAMP1+ area. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells; one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test. **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Mean intensity of shigatoxin (STX) in CTR and JNCL fibroblasts. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) after cell cycle arrest. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells; one-way ANOVA, post hoc Bonferroni's multiple comparisons test. **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Confocal images of Gb3 accumulation stained with shigatoxin (STX) in CTR and JNCL fibroblasts. Cells were treated with DMSO or TPC2-A1-P (30 µM) after cell cycle arrest."}
{"words": ["Figure", "5Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "cathepsin", "B", "(", "CtsB", ")", "in", "CTR", "and", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", "neurons", "treated", "with", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "or", "DMSO", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "C", ")", ".", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "Cortical", "neurons", "were", "treated", "with", "compounds", "and", "acidic", "compartments", "stained", "with", "LysoTracker", "(", "LyTr", ")", ".", "Endolysosomal", "expansion", "was", "observed", "in", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", ",", "CLN3D416G", "and", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "neurons", ",", "which", "was", "ameliorated", "by", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "treatment", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Cortical", "neurons", "were", "differentiated", "from", "iPSCs", ",", "generating", "lysosomal", "storage", "disease", "neurons", "and", "isogenic", "controls", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Electron", "microscopy", "analysis", "of", "neuronal", "rosettes", "(", "neuronal", "progenitor", "cells", ",", "NPC", ")", "treated", "with", "DMSO", "or", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "treatment", "significantly", "decreased", "the", "number", "of", "inclusion", "bodies", "(", "black", "arrow", "heads", ")", "in", "MCOLN1IVS3", "-", "2A", ">", "G", ".", "CLN3D416G", "and", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "lacked", "an", "appropriate", "assay", "window", "and", "showed", "no", "significant", "accumulation", "of", "inclusion", "bodies", ".", "However", ",", "CLN3ΔEx4", "-", "7", "NPC", "showed", "significantly", "more", "mitochondria", "with", "aberrant", "cristae", "numbers", "(", "white", "arrow", "heads", ")", ",", "a", "phenotype", "which", "was", "rescued", "by", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "treatment", ".", "Statistics", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "technical", "and", "biological", "replicates", "for", "each", "tested", "condition", "(", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "obtained", "from", "at", "least", "three", "distinct", "neuronal", "differentiations", ")", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. (C-D) Western blot analysis of cathepsin B (CtsB) in CTR and MCOLN1IVS3-2A>G neurons treated with TPC2-A1-P (30 µM) or DMSO. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); two-tailed Student's t-test (C). **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. Cortical neurons were treated with compounds and acidic compartments stained with LysoTracker (LyTr). Endolysosomal expansion was observed in MCOLN1IVS3-2A>G, CLN3D416G and CLN3ΔEx4-7 neurons, which was ameliorated by TPC2-A1-P (30 µM) treatment. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); one-way ANOVA, post hoc Tukey's multiple comparisons test **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Cortical neurons were differentiated from iPSCs, generating lysosomal storage disease neurons and isogenic controls. (H-I) Electron microscopy analysis of neuronal rosettes (neuronal progenitor cells, NPC) treated with DMSO or TPC2-A1-P. TPC2-A1-P treatment significantly decreased the number of inclusion bodies (black arrow heads) in MCOLN1IVS3-2A>G. CLN3D416G and CLN3ΔEx4-7 lacked an appropriate assay window and showed no significant accumulation of inclusion bodies. However, CLN3ΔEx4-7 NPC showed significantly more mitochondria with aberrant cristae numbers (white arrow heads), a phenotype which was rescued by TPC2-A1-P (30 µM) treatment. Statistics: Shown are mean values ± SEM. n > 3 technical and biological replicates for each tested condition (each dot represents an imaged frame containing several cells, obtained from at least three distinct neuronal differentiations); one-way ANOVA, post hoc Tukey's multiple comparisons test **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "plasma", "membrane", "(", "PM", ")", "LAMP1", "immunofluorescence", "in", "CTR", "fibroblasts", ".", "LAMP1", "on", "the", "PM", "is", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "relative", "to", "DMSO", "-", "treated", "cells", ".", "(", "B", ")", "Statistical", "analysis", "of", "lysosomal", "exocytosis", "data", "as", "shown", "in", "A", ".", "(", "C", ")", "Lysosomal", "exocytosis", "in", "CTR", ",", "MLIV", ",", "NPC1", "and", "JNCL", "human", "fibroblasts", ".", "PM", "-", "localized", "LAMP1", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ",", "expressed", "as", "%", "of", "CTR", "DMSO", "-", "treated", "cells", ".", "Ionomycin", "in", "A", "-", "C", "(", "4", "µM", ";", "10", "min", "treatment", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "and", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ";", "90", "min", "treatment", "in", "A", "-", "C", ")", ".", "Statistics", "(", "B", "-", "C", ")", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SEM", ".", "n", ">", "3", "for", "each", "tested", "condition", "(", "in", "B", "each", "dot", "represents", "an", "imaged", "frame", "containing", "several", "cells", ",", "in", "C", "each", "dot", "is", "the", "mean", "FITC", "intensity", "value", "expressed", "as", "percentage", "obtained", "from", "at", "least", "1", "*", "104", "events", ")", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "(", "B", ")", "or", "Tukey", "'", "s", "(", "C", ")", "multiple", "comparisons", "test", ",", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "(", "LC3I", "-", "II", ")", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "alone", "or", "with", "BafA1", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patientfibroblasts", ".", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "alone", "or", "with", "BafA1", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patientfibroblasts", ".", "Graphs", "show", "densitometry", "of", "LC3II", "bands", "normalized", "to", "actin", ".", "Statistics", "(", "G", ",", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "(", "LC3I", "-", "II", ")", "following", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "(", "30", "µM", ")", "or", "DMSO", "treatment", ",", "under", "fed", "(", "complete", "Neurobasal", "/", "B27", ")", "or", "starvation", "(", "DMEM", "/", "F12", "free", ")", "conditions", "in", "CTR", "and", "MLIV", "iPSC", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Graphs", "show", "densitometry", "of", "LC3II", "bands", "normalized", "to", "actin", ".", "Statistics", "H", ",", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "SQSTM1", "(", "P62", ")", "upon", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "or", "ML", "-", "SA1", "(", "30", "µM", ",", "each", ")", "treatment", ",", "under", "fed", "(", "complete", "media", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "conditions", "in", "CTR", ",", "MLIV", "and", "NPC1", "patient", "fibroblasts", ".", "Statistics", "J", ")", ":", "Shown", "are", "mean", "values", " ", "±", " ", "SD", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "lysates", "per", "condition", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "-", "value", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Confocal images of plasma membrane (PM) LAMP1 immunofluorescence in CTR fibroblasts. LAMP1 on the PM is expressed as fold-change relative to DMSO-treated cells. (B) Statistical analysis of lysosomal exocytosis data as shown in A. (C) Lysosomal exocytosis in CTR, MLIV, NPC1 and JNCL human fibroblasts. PM-localized LAMP1 was measured by flow cytometry, expressed as % of CTR DMSO-treated cells. Ionomycin in A-C (4 µM; 10 min treatment) was used as positive control. TPC2-A1-P and ML-SA1 (30 µM, each; 90 min treatment in A-C). Statistics (B-C): Shown are mean values ± SEM. n > 3 for each tested condition (in B each dot represents an imaged frame containing several cells, in C each dot is the mean FITC intensity value expressed as percentage obtained from at least 1*104 events); two-way ANOVA, post hoc Dunnett's (B) or Tukey's (C) multiple comparisons test, *p-value < 0.05; ***p-value < 0.001; ****p-value < 0.0001.Immunoblot analysis of endogenous LC3 (LC3I-II) following TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, alone or with BafA1, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patientfibroblasts.analysis of endogenous LC3 following TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, alone or with BafA1, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patientfibroblasts. Graphs show densitometry of LC3II bands normalized to actin. Statistics (G, Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001.(H) Immunoblot analysis of endogenous LC3 (LC3I-II) following TPC2-A1-P (30 µM) or DMSO treatment, under fed (complete Neurobasal/B27) or starvation (DMEM/F12 free) conditions in CTR and MLIV iPSC derived cortical neurons. Graphs show densitometry of LC3II bands normalized to actin. Statistics H, Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001.Immunoblot analysis of endogenous SQSTM1 (P62) upon TPC2-A1-P or ML-SA1 (30 µM, each) treatment, under fed (complete media) or starvation (HBSS) conditions in CTR, MLIV and NPC1 patient fibroblasts. Statistics J): Shown are mean values ± SD. n = 3 lysates per condition pooled from 3 independent experiments; two-tailed Student's t-test. *p-value < 0.05; **p-value < 0.01; ***p-value < 0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "A", "cDNA", "array", "was", "used", "to", "map", "TPC2", "transcripts", "in", "the", "human", "brain", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) A cDNA array was used to map TPC2 transcripts in the human brain."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "injected", "intravenously", ",", "and", "mice", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "time", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "measured", "in", "plasma", "and", "brain", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ".", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "rapidly", "eliminated", ",", "being", "undetectable", "by", "240", "min", ".", "(", "B", ")", "Elimination", "rate", "constants", "were", "determined", "using", "a", "semi", "-", "log", "plot", ".", "A", "two", "-", "phase", "decay", "model", "could", "fit", "the", "obtained", "data", "points", "in", "plasma", ",", "while", "a", "one", "-", "phase", "decay", "model", "fit", "the", "data", "in", "brain", ".", "(", "C", ")", "Brain", "[", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "]", "was", "simulated", "for", "various", "injected", "doses", ".", "20", "mg", "/", "kg", "TPC2", "-", "A1", "-", "P", "was", "chosen", "to", "avoid", "off", "-", "target", "activity", "while", "providing", "a", "therapeutic", "dose", "for", ">", "20", "min", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) TPC2-A1-P was injected intravenously, and mice sacrificed at the indicated time. TPC2-A1-P was measured in plasma and brain by LC-MS/MS. TPC2-A1-P was rapidly eliminated, being undetectable by 240 min.(B) Elimination rate constants were determined using a semi-log plot. A two-phase decay model could fit the obtained data points in plasma, while a one-phase decay model fit the data in brain.(C) Brain [TPC2-A1-P] was simulated for various injected doses. 20 mg/kg TPC2-A1-P was chosen to avoid off-target activity while providing a therapeutic dose for >20 min."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "and", "B", ")", "Tau", "increased", "β", "-", "catenin", "acetylation", "(", "Ace", "-", "β", "-", "cat", ")", "measured", "by", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "or", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "anti", "-", "acetylated", "lysine", "(", "Ace", "-", "lys", ")", "and", "HT7", "(", "probes", "specifically", "human", "total", "Tau", ")", ".", "HEK293", "cells", "transiently", "transfected", "with", "wildtype", "Tau40", "(", "Tau", ")", "or", "the", "empty", "vector", "(", "Vec", ")", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "C", "and", "D", ")", "β", "-", "cat", "mutation", "at", "K49", "(", "K49R", ")", "but", "not", "K19", "(", "K19R", ")", "abolished", "Tau", "-", "induced", "acetylation", ".", "HEK293", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "(", "WT", ",", "or", "K19R", ",", "or", "K49R", ",", "or", "K19R", "/", "K49R", ")", "and", "Tau", "or", "the", "empty", "vector", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "anti", "-", "Ace", "-", "lys", "and", "HT7", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "(", "D", ")", ";", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "plus", "Tau", "(", "D", ")", ";", "&", "&", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "&", "&", "&", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "K19R", "plus", "Tau", "(", "D", ")", ";", "the", "absence", "of", "asterisk", "indicates", "that", "the", "difference", "is", "not", "significant", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "E", "and", "F", ")", "The", "increased", "β", "-", "cat", "(", "K49", ")", "acetylation", "was", "detected", "in", "the", "hippocampal", "extracts", "of", "human", "Tau", "transgenic", "mice", "(", "Tau", "+", ")", "compared", "with", "the", "endogenous", "Tau", "knockout", "mice", "(", "Tau", "-", ")", ",", "measured", "by", "Western", "blotting", "using", "acetylation", "site", "-", "specific", "antibody", "(", "Ace", "-", "β", "-", "cat", "-", "K49", ")", ";", "arrowhead", "in", "panel", "E", "denoted", "nonspecific", "band", "identified", "by", "molecular", "weight", ".", "The", "remarkably", "increased", "levels", "of", "phosphorylated", "Tau", "at", "Ser199", "(", "pS199", ")", "and", "AT8", "epitopes", "were", "detected", "in", "Tau", "+", "mice", "(", "at", "least", "3", "mice", "per", "group", "were", "used", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vs", "Tau", "-", "(", "F", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "G", "and", "H", ")", "K18", "deletion", "of", "Tau", "(", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", ")", "attenuated", "Tau", "-", "induced", "β", "-", "cat", "acetylation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "Vec", ",", "or", "Tau40", "or", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "for", "48", "h", ",", "and", "the", "ace", "-", "β", "-", "cat", "was", "measured", "by", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "β", "-", "cat", "and", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "ace", "-", "lys", ",", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "and", "Tau5", "(", "detecting", "total", "Tau", ";", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "(", "H", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVAThe", "increased", "total", "and", "Ace", "-", "β", "-", "cat", "(", "K49", ")", "levels", "positively", "correlated", "with", "increased", "phosphorylated", "Tau", "pS199", "and", "AT8", "as", "detected", "by", "Western", "blotting", "in", "the", "hippocampal", "extracts", "of", "AD", "patients", "compared", "with", "age", "-", "matched", "controls", "(", "n", "=", "10", "each", "group", ",", "Pearson", "analysis", "was", "used", "for", "correlation", "analysis", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "vs", "Ctrl", "(", "J", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "testThe", "increased", "total", "and", "Ace", "-", "β", "-", "cat", "(", "K49", ")", "levels", "positively", "correlated", "with", "increased", "phosphorylated", "Tau", "pS199", "and", "AT8", "as", "detected", "by", "Western", "blotting", "in", "the", "hippocampal", "extracts", "of", "AD", "patients", "compared", "with", "age", "-", "matched", "controls", "(", "n", "=", "10", "each", "group", "Pearson", "analysis", "was", "used", "for", "correlation", "analysis", "(", "M", "and", "N", ")", "Expressing", "pseudo", "-", "phosphorylated", "Tau", "(", "TauS199E", ")", "further", "increased", "the", "K49", "-", "acetylation", "of", "β", "-", "catenin", ".", "N2a", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "Vec", ",", "Tau40", "or", "TauS199E", "for", "48", "h", ",", "levels", "of", "K49", "-", "acetylated", "β", "-", "cat", ",", "total", "β", "-", "cat", "and", "total", "Tau", "were", "detected", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", ";", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "plus", "vs", "Tau", "(", "N", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "O", "and", "P", ")", "Inhibiting", "acetyltransferases", "CBP", "/", "P300", "by", "TPOP146", "(", "134", "nM", ")", "or", "PCAF", "by", "L", "-", "45", "(", "126", "nM", ")", "for", "24", "h", "did", "not", "significantly", "decrease", "the", "K49", "-", "acetylated", "β", "-", "cat", "level", "in", "Tau", "-", "overexpressing", "N2a", "cells", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A and B) Tau increased β-catenin acetylation (Ace-β-cat) measured by immunoprecipitation using anti-β-cat, or Western blotting using anti-β-cat, anti-acetylated lysine (Ace-lys) and HT7 (probes specifically human total Tau). HEK293 cells transiently transfected with wildtype Tau40 (Tau) or the empty vector (Vec) (n = 3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Vec Data were analyzed by Student's t test(C and D) β-cat mutation at K49 (K49R) but not K19 (K19R) abolished Tau-induced acetylation. HEK293 cells were co-transfected with eGFP-β-cat (WT, or K19R, or K49R, or K19R/K49R) and Tau or the empty vector for 48 h, and then immunoprecipitated using anti-GFP and Western blotting using anti-β-cat, anti-Ace-lys and HT7 (n = 3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs β-cat WT (D) ; #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs β-cat WT plus Tau (D) ; &&, P<0.01, &&&, P<0.001 vs β-cat K19R plus Tau (D); the absence of asterisk indicates that the difference is not significant. Data were analyzed by one-way ANOVA(E and F) The increased β-cat (K49) acetylation was detected in the hippocampal extracts of human Tau transgenic mice (Tau+) compared with the endogenous Tau knockout mice (Tau-), measured by Western blotting using acetylation site-specific antibody (Ace-β-cat-K49); arrowhead in panel E denoted nonspecific band identified by molecular weight. The remarkably increased levels of phosphorylated Tau at Ser199 (pS199) and AT8 epitopes were detected in Tau+ mice (at least 3 mice per group were used). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs vs Tau- (F) Data were analyzed by Student's t test(G and H) K18 deletion of Tau (Tau-k18(-)) attenuated Tau-induced β-cat acetylation. HEK293 cells were transfected with empty Vec, or Tau40 or Tau-k18(-) for 48 h, and the ace-β-cat was measured by immunoprecipitation using anti-β-cat and Western blotting using anti-ace-lys, anti-β-cat, and Tau5 (detecting total Tau; n = 3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Tau (H) Data were analyzed by one-way ANOVAThe increased total and Ace-β-cat (K49) levels positively correlated with increased phosphorylated Tau pS199 and AT8 as detected by Western blotting in the hippocampal extracts of AD patients compared with age-matched controls (n=10 each group, Pearson analysis was used for correlation analysis Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Vec vs Ctrl (J) Data were analyzed by Student's t testThe increased total and Ace-β-cat (K49) levels positively correlated with increased phosphorylated Tau pS199 and AT8 as detected by Western blotting in the hippocampal extracts of AD patients compared with age-matched controls (n=10 each group Pearson analysis was used for correlation analysis(M and N) Expressing pseudo-phosphorylated Tau (TauS199E) further increased the K49-acetylation of β-catenin. N2a cells were transiently transfected with Vec, Tau40 or TauS199E for 48 h, levels of K49-acetylated β-cat, total β-cat and total Tau were detected by Western blotting (n=3 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Vec ; #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs β-cat WT plus vs Tau (N) Data were analyzed by one-way ANOVA(O and P) Inhibiting acetyltransferases CBP/P300 by TPOP146 (134 nM) or PCAF by L-45 (126 nM) for 24 h did not significantly decrease the K49-acetylated β-cat level in Tau-overexpressing N2a cells (n=3 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Vec Data were analyzed by one-way ANOVA"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Tau", "directly", "acetylates", "β", "-", "cat", "in", "test", "-", "tube", ".", "Both", "Tau40", "and", "β", "-", "cat", "were", "purified", "from", "E", ".", "coli", "using", "Ni", "-", "NTA", "resin", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Mutation", "of", "Tau40", "at", "acetyltransferase", "activity", "region", "abolishes", "its", "acetylation", "activity", "on", "β", "-", "cat", ".", "eGFP", "-", "Tau40", ",", "eGFP", "-", "Tau", "-", "2CA", "and", "eGFP", "-", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "were", "purified", "from", "HEK293", "cells", "(", "using", "anti", "-", "GFP", "beads", ")", "and", "GST", "-", "β", "-", "cat", "was", "from", "E", ".", "coli", "(", "B", ")", ",", "or", "both", "Tau40", "and", "β", "-", "cat", "were", "from", "E", ".", "coli", "(", "C", ")", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Mutation", "of", "β", "-", "cat", "K49", "abolishes", "its", "acetylation", "by", "Tau", ".", "Both", "myc", "-", "Tau40", "and", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "were", "purified", "from", "HEK293", "cells", "(", "using", "anti", "-", "GFP", "or", "anti", "-", "Myc", "beads", ")", "(", "D", ")", ",", "or", "both", "from", "E", ".", "coli", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Kinetics", "of", "β", "-", "cat", "acetylation", "by", "Tau", ".", "Tau", "acetylates", "β", "-", "cat", "in", "concentration", "-", "(", "F", ")", "and", "its", "acetyltransferase", "activity", "domain", "-", "dependent", "manner", ".", "Michaelis", "-", "Menten", "parameters", "were", "determined", "using", "Graphpad", "Prism", "6", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Kinetics", "of", "β", "-", "cat", "acetylation", "by", "Tau", ".", "Tau", "acetylates", "β", "-", "cat", "in", "time", "-", "(", "G", ")", "and", "its", "acetyltransferase", "activity", "domain", "-", "dependent", "manner", ".", "Michaelis", "-", "Menten", "parameters", "were", "determined", "using", "Graphpad", "Prism", "6", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Kinetics", "of", "β", "-", "cat", "acetylation", "by", "Tau", ".", "Tau", "acetylates", "β", "-", "cat", "in", "pH", "-", "(", "H", ")", ",", "and", "its", "acetyltransferase", "activity", "domain", "-", "dependent", "manner", ".", "Michaelis", "-", "Menten", "parameters", "were", "determined", "using", "Graphpad", "Prism", "6", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Kinetics", "of", "β", "-", "cat", "acetylation", "by", "Tau", ".", "The", "affinity", "(", "Km", ")", "of", "Tau", "to", "β", "-", "cat", "was", "measured", "by", "the", "initial", "rate", "of", "Tau", "as", "a", "function", "of", "the", "β", "-", "cat", "concentrations", "(", "I", ",", "J", ")", ".", "Michaelis", "-", "Menten", "parameters", "were", "determined", "using", "Graphpad", "Prism", "6", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Tau directly acetylates β-cat in test-tube. Both Tau40 and β-cat were purified from E. coli using Ni-NTA resin (n = 3 from three independent experiments).(B and C) Mutation of Tau40 at acetyltransferase activity region abolishes its acetylation activity on β-cat. eGFP-Tau40, eGFP-Tau-2CA and eGFP-Tau-k18(-) were purified from HEK293 cells (using anti-GFP beads) and GST-β-cat was from E. coli (B), or both Tau40 and β-cat were from E. coli (C) (n = 3 from three independent experiments).(D and E) Mutation of β-cat K49 abolishes its acetylation by Tau. Both myc-Tau40 and eGFP-β-cat were purified from HEK293 cells (using anti-GFP or anti-Myc beads) (D), or both from E. coli (E) (n = 3 from three independent experiments).Kinetics of β-cat acetylation by Tau. Tau acetylates β-cat in concentration- (F) and its acetyltransferase activity domain-dependent manner. Michaelis-Menten parameters were determined using Graphpad Prism 6 (n = 3 from three independent experiments).Kinetics of β-cat acetylation by Tau. Tau acetylates β-cat in time- (G) and its acetyltransferase activity domain-dependent manner. Michaelis-Menten parameters were determined using Graphpad Prism 6 (n = 3 from three independent experiments).Kinetics of β-cat acetylation by Tau. Tau acetylates β-cat in pH- (H), and its acetyltransferase activity domain-dependent manner. Michaelis-Menten parameters were determined using Graphpad Prism 6 (n = 3 from three independent experiments).Kinetics of β-cat acetylation by Tau. The affinity (Km) of Tau to β-cat was measured by the initial rate of Tau as a function of the β-cat concentrations (I, J). Michaelis-Menten parameters were determined using Graphpad Prism 6 (n = 3 from three independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Expressing", "Tau", "inhibited", "β", "-", "cat", "ubiquitination", "in", "HEK293", "cells", ",", "measured", "by", "immunoprecipitation", "using", "antibody", "against", "β", "-", "cat", "and", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "ubiquitination", "(", "anti", "-", "Ub", ")", "and", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "respectively", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "(", "B", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Overexpressing", "Tau", "inhibited", "β", "-", "cat", "ubiquitination", "in", "hippocampi", "of", "Tau", "transgenic", "mice", ",", "measured", "by", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "Ub", "and", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "β", "-", "cat", ",", "respectively", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "-", "(", "D", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "attenuated", "Tau", "-", "induced", "β", "-", "cat", "elevation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "Vec", ",", "or", "Tau", "-", "40", ",", "or", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "were", "treated", "with", "Chx", "for", "12", "h", "or", "24", "h", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", ".", "β", "-", "cat", "protein", "level", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "(", "F", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Two", "-", "way", "repeated", "-", "measures", "ANOVA", "(", "G", "and", "H", ")", "K49", "acetylation", "of", "β", "-", "cat", "inhibited", "its", "ubiquitination", ".", "HEK293", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "ubiquitin", "and", "GFP", "-", "β", "-", "cat", "or", "pseudo", "-", "acetylated", "K49", "-", "β", "-", "catenin", "(", "K49Q", ")", ",", "and", "then", "β", "-", "cat", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "GFP", "and", "blotted", "by", "anti", "-", "Ub", "and", "anti", "-", "β", "-", "cat", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "K49", "acetylation", "of", "β", "-", "cat", "inhibited", "its", "degradation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49Q", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "Chx", ",", "100", "μg", "/", "ml", ")", "for", "12", "h", "or", "24", "h", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "Data", "were", "analyzed", "by", "Two", "-", "way", "repeated", "-", "measures", "ANOVAβ", "-", "cat", "mutation", "at", "K49", "(", "K49R", ")", "restored", "the", "degradation", "of", "β", "-", "catenin", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "or", "co", "-", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "and", "Tau40", ",", "or", "co", "-", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "K49R", "and", "Tau40", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "Chx", ",", "100", "μg", "/", "ml", ")", "for", "12", "h", "or", "24", "h", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "β", "-", "cat", "mutation", "at", "K49", "(", "K49R", ")", "restored", "the", "degradation", "of", "β", "-", "catenin", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "or", "co", "-", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "and", "Tau40", ",", "or", "co", "-", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "K49R", "and", "Tau40", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "Chx", ",", "100", "μg", "/", "ml", ")", "for", "12", "h", "or", "24", "h", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "+", "β", "-", "cat", "WT", "(", "L", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Two", "-", "way", "repeated", "-", "measures", "ANOVA", "(", "M", "and", "N", ")", "K49", "acetylation", "of", "β", "-", "cat", "inhibited", "its", "phosphorylation", "at", "N", "-", "terminal", "domain", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "vec", ",", "or", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "(", "WT", ")", "or", "K49Q", "for", "48", "h", ",", "then", "treated", "with", "wortmannin", "(", "WO", ",", "1", "μM", ")", "plus", "GF109203X", "(", "GFX", ",", "1", "μM", ")", "to", "activate", "GSK", "-", "3β", "for", "1", "h", "followed", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "plus", "WO", "/", "GFX", "(", "N", ")", ".", "data", "in", "(", "N", ")", "was", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Expressing Tau inhibited β-cat ubiquitination in HEK293 cells, measured by immunoprecipitation using antibody against β-cat and Western blotting using anti- ubiquitination (anti-Ub) and anti-β-cat, respectively (n = 3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Vec (B) Data were analyzed by Student's t test.(C and D) Overexpressing Tau inhibited β-cat ubiquitination in hippocampi of Tau transgenic mice, measured by immunoprecipitation using anti-Ub and Western blotting using anti-β-cat, respectively (n = 3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Tau- (D) Data were analyzed by Student's t test.(E and F) Expressing Tau-k18(-) attenuated Tau-induced β-cat elevation. HEK293 cells were transfected with Vec, or Tau-40, or Tau-k18(-) for 24 h, and then were treated with Chx for 12 h or 24 h, followed by Western blotting. β-cat protein level was normalized to β-actin (n=4 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Tau (F) Data were analyzed by Two-way repeated-measures ANOVA(G and H) K49 acetylation of β-cat inhibited its ubiquitination. HEK293 cells were co-transfected with HA-ubiquitin and GFP-β-cat or pseudo-acetylated K49-β-catenin (K49Q), and then β-cat was immunoprecipitated by anti-GFP and blotted by anti-Ub and anti-β-cat (n=3 from three independent experiments). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs β-cat WT Data were analyzed by Student's t test.(I and J) K49 acetylation of β-cat inhibited its degradation. HEK293 cells were transfected with β-cat WT or K49Q for 24 h, and then treated with cycloheximide (Chx, 100 μg/ml) for 12 h or 24 h (n=4 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs β-cat WT Data were analyzed by Two-way repeated-measures ANOVAβ-cat mutation at K49 (K49R) restored the degradation of β-catenin. HEK293 cells were transfected with β-cat WT or co-transfected with β-cat WT and Tau40, or co-transfected with β-cat K49R and Tau40 for 24 h, and then treated with cycloheximide (Chx, 100 μg/ml) for 12 h or 24 h (n=4 biological replicates each group).β-cat mutation at K49 (K49R) restored the degradation of β-catenin. HEK293 cells were transfected with β-cat WT or co-transfected with β-cat WT and Tau40, or co-transfected with β-cat K49R and Tau40 for 24 h, and then treated with cycloheximide (Chx, 100 μg/ml) for 12 h or 24 h (n=4 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs Tau+β-cat WT (L) Data were analyzed by Two-way repeated-measures ANOVA(M and N) K49 acetylation of β-cat inhibited its phosphorylation at N-terminal domain. HEK293 cells were transfected with GFP-vec, or eGFP-β-cat (WT) or K49Q for 48 h, then treated with wortmannin (WO, 1 μM) plus GF109203X (GFX, 1 μM) to activate GSK-3β for 1 h followed by Western blotting (n=3 biological replicates each group). Data information: Data are presented as mean ± SEM; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs β-cat WT plus WO/GFX (N). data in (N) was analyzed by one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "abolished", "its", "effect", "on", "β", "-", "cat", "K49", "-", "acetylation", "and", "c", "-", "cas", "-", "3", "(", "cleaved", "caspase", "-", "3", ")", ".", "N2a", "cells", "were", "transfected", "with", "Vec", ",", "or", "Tau40", ",", "or", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "staurosporine", "(", "STP", ",", "an", "apoptotic", "inducer", ")", "for", "4", "h", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vec", "(", "B", ")", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "plus", "STP", "(", "B", ")", ";", "$", "$", "$", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "plus", "STP", "(", "B", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "or", "Tau", "-", "2CA", "abolished", "its", "anti", "-", "apoptotic", "function", ".", ";", "N2a", "cells", ",", "transfected", "with", "myc", "-", "Vec", ",", "or", "myc", "-", "Tau40", ",", "or", "myc", "-", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", ",", "or", "myc", "-", "Tau", "-", "2CA", "for", "48", "h", ",", "were", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", "followed", "by", "flow", "cytometry", "using", "Annexin", "-", "FITC", "(", "C", ")", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "plus", "STP", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "or", "Tau", "-", "2CA", "abolished", "its", "anti", "-", "apoptotic", "function", ".", "N2a", "cells", ",", "transfected", "with", "eGFP", "-", "Vec", ",", "or", "eGFP", "-", "Tau40", ",", "or", "eGFP", "-", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", ",", "or", "Tau", "-", "2CA", "for", "48", "h", ",", "were", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", "followed", "by", "co", "-", "staining", "with", "c", "-", "cas", "-", "3", "(", "red", ")", "(", "D", "In", "panel", "D", "(", "middle", "row", ")", ",", "the", "Tau", "expression", "(", "white", "arrowheads", ")", "was", "largely", "not", "co", "-", "localized", "with", "c", "-", "casp", "-", "3", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "in", "the", "same", "visual", "field", "(", "n", "=", "4", "~", "8", "biological", "replicates", "each", "group", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ")", ".", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "or", "Tau", "-", "2CA", "abolished", "its", "anti", "-", "apoptotic", "function", ".", "N2a", "cells", ",", "transfected", "with", "eGFP", "-", "Vec", ",", "or", "eGFP", "-", "Tau40", ",", "or", "eGFP", "-", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", ",", "or", "Tau", "-", "2CA", "for", "48", "h", ",", "were", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", "followed", "by", "co", "-", "staining", "with", "c", "-", "cas", "-", "3", "(", "red", ")", "The", "apoptotic", "rate", "(", "E", ")", "was", "presented", "as", "the", "ratio", "of", "yellow", "(", "c", "-", "casp", "-", "3", "and", "GFP", "co", "-", "stained", ")", "to", "green", "(", "the", "total", "GFP", "-", "expressing", "cells", ")", "staining", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "plus", "STP", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "or", "Tau", "-", "2CA", "abolished", "its", "anti", "-", "apoptotic", "function", ".", "N2a", "cells", ",", "transfected", "with", "myc", "-", "Vec", ",", "or", "myc", "-", "Tau40", ",", "or", "myc", "-", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", ",", "or", "myc", "-", "Tau", "-", "2CA", "for", "48", "h", ",", "were", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", "followed", "by", "CCK8", "assay", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "plus", "STP", "♧", "♧", "♧", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vec", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "G", ")", "Non", "-", "acetylation", "modifiable", "mutation", "of", "β", "-", "cat", "at", "K49", "(", "K49R", ")", ",", "not", "K19", "(", "K19R", ")", ",", "abolished", "the", "anti", "-", "apoptotic", "effect", "of", "Tau", ".", "N2a", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Tau40", "and", "β", "-", "cat", "WT", ",", "or", "K49R", ",", "or", "K19R", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", ".", "The", "cell", "viability", "was", "measured", "by", "CCK8", "assay", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "plus", "STP", ";", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vs", "β", "-", "cat", "+", "Vec", "plus", "STP", "(", "G", ")", ";", "$", "$", "$", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "+", "Tau", "plus", "STP", "(", "G", ")", ";", "&", "&", "&", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "K49R", "+", "Tau", "plus", "STP", "(", "G", ")", ".", "♧", "♧", "♧", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vec", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "H", ")", "Expressing", "β", "-", "cat", "K49Q", "most", "significantly", "increased", "cell", "viability", ".", "N2a", "cells", "were", "transfected", "with", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49R", "or", "K49Q", "or", "the", "empty", "Vec", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", ".", "The", "cell", "viability", "was", "measured", "by", "CCK8", "assay", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "plus", "STP", ";", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "plus", "STP", "(", "H", ")", ",", ";", "$", "$", "$", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "K49Q", "plus", "STP", "(", "H", ")", "♧", "♧", "♧", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vec", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "I", ")", "Overexpressing", "Ser199", "-", "phosphorylation", "mimic", "Tau", "(", "TauS199E", ")", "further", "augmented", "cell", "viability", ".", "N2a", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vec", ",", "Tau40", "or", "TauS199E", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "0", ".", "5", "μM", "STP", "for", "4", "h", ".", "The", "cell", "viability", "was", "measured", "by", "CCK8", "assay", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", "plus", "STP", ";", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vs", "Tau", "plus", "STP", "(", "I", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) Expressing Tau-k18(-) abolished its effect on β-cat K49-acetylation and c-cas-3 (cleaved caspase-3). N2a cells were transfected with Vec, or Tau40, or Tau-k18(-) for 48 h, and then treated with 0.5 μM staurosporine (STP, an apoptotic inducer) for 4 h, followed by Western blotting (n=3 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs vec (B) #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs Vec plus STP (B) ; $$$, P<0.001 vs Tau plus STP (B) Data were analyzed by one-way ANOVA.Expressing Tau-k18(-) or Tau-2CA abolished its anti-apoptotic function. ; N2a cells, transfected with myc-Vec, or myc-Tau40, or myc-Tau-k18(-), or myc-Tau-2CA for 48 h, were then treated with 0.5 μM STP for 4 h followed by flow cytometry using Annexin-FITC (C) Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Tau plus STP Data were analyzed by one-way ANOVA.Expressing Tau-k18(-) or Tau-2CA abolished its anti-apoptotic function. N2a cells, transfected with eGFP-Vec, or eGFP-Tau40, or eGFP-Tau-k18(-), or Tau-2CA for 48 h, were then treated with 0.5 μM STP for 4 h followed by co-staining with c-cas-3 (red) (D In panel D (middle row), the Tau expression (white arrowheads) was largely not co-localized with c-casp-3 (yellow arrowheads) in the same visual field (n=4~8 biological replicates each group; scale bar, 10 μm).Expressing Tau-k18(-) or Tau-2CA abolished its anti-apoptotic function. N2a cells, transfected with eGFP-Vec, or eGFP-Tau40, or eGFP-Tau-k18(-), or Tau-2CA for 48 h, were then treated with 0.5 μM STP for 4 h followed by co-staining with c-cas-3 (red) The apoptotic rate (E) was presented as the ratio of yellow (c-casp-3 and GFP co-stained) to green (the total GFP-expressing cells) staining. Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Tau plus STP Data were analyzed by one-way ANOVA.Expressing Tau-k18(-) or Tau-2CA abolished its anti-apoptotic function. N2a cells, transfected with myc-Vec, or myc-Tau40, or myc-Tau-k18(-), or myc-Tau-2CA for 48 h, were then treated with 0.5 μM STP for 4 h followed by CCK8 assay (F). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Tau plus STP ♧♧♧, P<0.001 vs vec Data were analyzed by one-way ANOVA.(G) Non-acetylation modifiable mutation of β-cat at K49 (K49R), not K19 (K19R), abolished the anti-apoptotic effect of Tau. N2a cells were co-transfected with Tau40 and β-cat WT, or K49R, or K19R for 48 h, and then treated with 0.5 μM STP for 4 h. The cell viability was measured by CCK8 assay (n=8 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Vec plus STP ; #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs vs β-cat + Vec plus STP (G) ; $$$, P<0.001 vs β-cat + Tau plus STP (G) ; &&&, P<0.001 vs β-cat K49R+ Tau plus STP (G). ♧♧♧, P<0.001 vs vec Data were analyzed by one-way ANOVA.(H) Expressing β-cat K49Q most significantly increased cell viability. N2a cells were transfected with β-cat WT or K49R or K49Q or the empty Vec for 48 h, and then treated with 0.5 μM STP for 4 h. The cell viability was measured by CCK8 assay (n=8 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Vec plus STP ; #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs β-cat plus STP (H), ; $$$, P<0.001 vs β-cat K49Q plus STP (H) ♧♧♧, P<0.001 vs vec Data were analyzed by one-way ANOVA.(I) Overexpressing Ser199-phosphorylation mimic Tau (TauS199E) further augmented cell viability. N2a cells were transfected with empty vec, Tau40 or TauS199E for 48h and then treated with 0.5 μM STP for 4 h. The cell viability was measured by CCK8 assay (n=8 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Vec plus STP ; #, P<0.05, ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs vs Tau plus STP (I) Data were analyzed by one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Co", "-", "expressing", "myc", "-", "Tau", "and", "eGFP", "-", "β", "-", "catenin", "increased", "nuclear", "translocation", "of", "β", "-", "catenin", ",", "while", "co", "-", "expressing", "myc", "-", "Tau", "and", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "K49R", "abolished", "the", "nuclear", "translocation", "of", "β", "-", "catenin", "in", "HEK293", "cells", ".", "The", "nuclei", "were", "stained", "using", "DAPI", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "scale", "bar", ",", "5", "μm", ")", ".", "Expressing", "β", "-", "cat", "K49Q", "increased", "its", "nuclear", "translocation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49Q", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "β", "-", "cat", "protein", "level", "in", "different", "fractions", "was", "measured", "by", "Western", "blottingExpressing", "β", "-", "cat", "K49Q", "increased", "its", "nuclear", "translocation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49Q", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "β", "-", "cat", "protein", "level", "in", "different", "fractions", "was", "measured", "by", "Western", "blotting", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "(", "C", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "testExpressing", "β", "-", "cat", "K49Q", "increased", "its", "nuclear", "translocation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "eGFP", "-", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49Q", "for", "48", "h", "and", "immunofluorescent", "labeling", "using", "a", "laser", "scanning", "confocal", "microscope", "(", "D", ")", ".", "The", "nuclei", "(", "blue", ")", "was", "stained", "by", "DAPI", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "scale", "bar", ",", "2", "μm", ")", ".", "(", "E", ")", "Expressing", "β", "-", "cat", "K49Q", "further", "increased", "its", "transcription", "activity", "measured", "by", "dual", "Topflash", "/", "Fopflash", "reporter", "luciferase", "assay", "after", "transient", "transfection", "of", "β", "-", "cat", "WT", ",", "or", "K49Q", ",", "or", "Vec", "in", "HEK293", "cells", "for", "48", "h", ",", "and", "the", "luciferase", "activity", "was", "normalized", "by", "β", "-", "cat", "WT", "or", "K49Q", "protein", "level", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", ";", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "β", "-", "cat", "WT", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "F", ")", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "abolished", "Tau", "-", "induced", "upregulation", "of", "mRNA", "levels", "of", "survival", "genes", "(", "bcl2", "and", "survivin", ")", "and", "dkk1", "(", "downstream", "of", "Wnt", "signaling", ")", "in", "N2a", "cells", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "(", "n", "=", "6", "~", "9", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "(", "F", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "G", ")", "Expressing", "Tau", "-", "k18", "(", "-", ")", "or", "Tau", "-", "2CA", "abolished", "Tau", "-", "induced", "Wnt", "/", "β", "-", "catenin", "transcriptional", "activation", "measured", "by", "dual", "reporter", "luciferase", "activity", "assay", "in", "HEK293", "cells", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "vs", "Tau", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "H", ")", "Expressing", "phosphor", "-", "mimic", "TauS199E", "(", "TauS199E", ")", "further", "increased", "the", "transcription", "activity", "of", "Wnt", "/", "TCF", "/", "LEF1", "by", "Tau", "in", "HEK293", "cells", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Vec", ";", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tau", "(", "H", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", ",", "one", "-", "way", "ANOVAThe", "increased", "mRNA", "levels", "of", "bcl2", ",", "survivin", "and", "dkk1", "in", "the", "AD", "brains", "compared", "with", "the", "age", "-", "/", "sex", "-", "matched", "controls", "detected", "by", "Q", "-", "PCR", "(", "n", "=", "7", "each", "group", ")", "Data", "information", ":", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", "(", "I", ")", "Data", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "testThe", "increased", "mRNA", "levels", "of", "bcl2", ",", "survivin", "and", "dkk1", "in", "the", "AD", "brains", "compared", "with", "the", "age", "-", "/", "sex", "-", "matched", "controls", "detected", "by", "Q", "-", "PCR", "(", "n", "=", "7", "each", "group", ")", ",", "and", "the", "positive", "correlations", "with", "the", "increased", "K49", "-", "acetylated", "β", "-", "catenin", "(", "see", "Fig", ".", "1I", ",", "J", ")", "analyzed", "by", "Pearson", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Co-expressing myc-Tau and eGFP-β-catenin increased nuclear translocation of β-catenin, while co-expressing myc-Tau and eGFP-β-cat K49R abolished the nuclear translocation of β-catenin in HEK293 cells. The nuclei were stained using DAPI (n=3 from three independent experiments, scale bar, 5 μm).Expressing β-cat K49Q increased its nuclear translocation. HEK293 cells were transfected with eGFP-β-cat WT or K49Q for 48 h, and then β-cat protein level in different fractions was measured by Western blottingExpressing β-cat K49Q increased its nuclear translocation. HEK293 cells were transfected with eGFP-β-cat WT or K49Q for 48 h, and then β-cat protein level in different fractions was measured by Western blotting Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs β-cat WT (C) Data were analyzed by Student's t testExpressing β-cat K49Q increased its nuclear translocation. HEK293 cells were transfected with eGFP-β-cat WT or K49Q for 48 h and immunofluorescent labeling using a laser scanning confocal microscope (D). The nuclei (blue) was stained by DAPI (n=3 from three independent experiments, scale bar, 2 μm).(E) Expressing β-cat K49Q further increased its transcription activity measured by dual Topflash/Fopflash reporter luciferase assay after transient transfection of β-cat WT, or K49Q, or Vec in HEK293 cells for 48 h, and the luciferase activity was normalized by β-cat WT or K49Q protein level (n=7 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Vec ; ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs β-cat WT Data were analyzed by one-way ANOVA(F) Expressing Tau-k18(-) abolished Tau-induced upregulation of mRNA levels of survival genes (bcl2 and survivin) and dkk1 (downstream of Wnt signaling) in N2a cells measured by Q-PCR (n=6~9 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Tau (F Data were analyzed by one-way ANOVA(G) Expressing Tau-k18(-) or Tau-2CA abolished Tau-induced Wnt/β-catenin transcriptional activation measured by dual reporter luciferase activity assay in HEK293 cells (n=7 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs vs Tau Data were analyzed by one-way ANOVA(H) Expressing phosphor-mimic TauS199E (TauS199E) further increased the transcription activity of Wnt/TCF/LEF1 by Tau in HEK293 cells (n=7 biological replicates each group). Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Vec ; ##, P<0.01, ###, P<0.001 vs Tau (H). Data were analyzed by , one-way ANOVAThe increased mRNA levels of bcl2, survivin and dkk1 in the AD brains compared with the age-/sex-matched controls detected by Q-PCR (n=7 each group) Data information: Data are expressed as mean ± SEM, *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001 vs Ctrl (I) Data were analyzed by Student's t testThe increased mRNA levels of bcl2, survivin and dkk1 in the AD brains compared with the age-/sex-matched controls detected by Q-PCR (n=7 each group), and the positive correlations with the increased K49-acetylated β-catenin (see Fig. 1I, J) analyzed by Pearson analysis."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "H", ",", "I", ")", ".", "Secretory", "vesicles", "of", "primary", "chromaffin", "cells", "were", "examined", "by", "transmission", "electron", "microscopy", "after", "100", "nM", "AngII", "stimulation", ",", "with", "or", "without", "pre", "-", "incubation", "with", "400", "nM", "Compound", "7", ".", "Scale", "bars", ":", "(", "H", ",", "I", ")", ",", "150", "nm", ".", "Red", "arrows", "indicate", "morphologically", "docked", "LDCVs", "and", "green", "arrows", "stands", "for", "undocked", "LDCVs", ".", "PM", "represents", "plasma", "membrane", ".", "(", "J", ")", ".", "Vesicle", "numbers", "according", "to", "different", "distances", "from", "the", "plasma", "membrane", "were", "calculated", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "nM", "AngII", "or", "400", "nM", "Compound", "7", ".", "PM", "represents", "plasma", "membrane", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "#", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ":", "cells", "pre", "-", "incubated", "with", "PTP", "-", "MEG2", "inhibitors", "compared", "with", "control", "vehicles", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "Data", "were", "from", "6", "independent", "experiments", ".", "#", "indicates", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "#", "#", "#", "indicates", "P", "<", "0", ".", "001", "compared", "with", "control", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(H, I). Secretory vesicles of primary chromaffin cells were examined by transmission electron microscopy after 100 nM AngII stimulation, with or without pre-incubation with 400 nM Compound 7. Scale bars: (H, I), 150 nm. Red arrows indicate morphologically docked LDCVs and green arrows stands for undocked LDCVs. PM represents plasma membrane. (J). Vesicle numbers according to different distances from the plasma membrane were calculated in the presence or absence of 100 nM AngII or 400 nM Compound 7. PM represents plasma membrane. Data information: Data were analyzed using one-way ANOVA and displayed as the mean ± s.e.m. #, P<0.05; ##, P<0.01; ###, P<0.001: cells pre-incubated with PTP-MEG2 inhibitors compared with control vehicles. N.S. means no significant difference. Data were from 6 independent experiments. # indicates P<0.05 and ### indicates P<0.001 compared with control group."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", ".", "Phosphorylated", "NSF", "interacted", "with", "PTP", "-", "MEG2", ".", "PC12", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "NSF", ".", "After", "stimulation", "of", "the", "cells", "with", "100nM", "AngII", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100μM", "H2O2", "for", "5", "minutes", "(", "H2O2", "was", "exploited", "to", "increase", "the", "overall", "tyrosine", "phosphorylation", "of", "the", "cellular", "proteins", ")", ",", "the", "potential", "PTP", "-", "MEG2", "substrate", "in", "cell", "lysates", "was", "pulled", "down", "with", "GST", "-", "PTP", "-", "MEG2", "-", "D470A", "or", "GST", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D). Phosphorylated NSF interacted with PTP-MEG2. PC12 cells were transfected with FLAG-NSF. After stimulation of the cells with 100nM AngII in the presence or absence of 100μM H2O2 for 5 minutes (H2O2 was exploited to increase the overall tyrosine phosphorylation of the cellular proteins), the potential PTP-MEG2 substrate in cell lysates was pulled down with GST-PTP-MEG2-D470A or GST control."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", ".", "Relative", "values", "of", "the", "decreased", "phosphatase", "activities", "of", "different", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "towards", "pNPP", "(", "p", "-", "Nitrophenyl", "phosphate", ")", "compared", "with", "wild", "-", "type", "PTP", "-", "MEG2", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ":", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "compared", "with", "the", "control", "group", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "All", "the", "data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "and", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "In", "the", "red", "column", "indicates", "that", "the", "mutation", "sites", "have", "greater", "effects", "on", "the", "enzyme", "activities", "toward", "phospho", "-", "NSF", "segement", "than", "the", "pNPP", ".", "The", "green", "column", "indicates", "that", "the", "mutation", "sites", "only", "have", "significant", "effects", "on", "the", "enzyme", "activity", "toward", "NSF", "phospho", "-", "segement", "but", "not", "pNPP", ".", "The", "white", "column", "stands", "for", "the", "mutants", "that", "have", "similar", "effects", "on", "pNPP", "and", "NSF", "phospho", "-", "segement", ".", "(", "C", ")", ".", "Fold", "-", "change", "decreases", "in", "the", "phosphatase", "activities", "of", "different", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "towards", "the", "NSF", "-", "pY83", "phospho", "-", "segment", "compared", "with", "wild", "-", "type", "PTP", "-", "MEG2", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ":", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "compared", "with", "the", "control", "group", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "All", "the", "data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "and", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "In", "the", "red", "column", "indicates", "that", "the", "mutation", "sites", "have", "greater", "effects", "on", "the", "enzyme", "activities", "toward", "phospho", "-", "NSF", "segement", "than", "the", "pNPP", ".", "The", "green", "column", "indicates", "that", "the", "mutation", "sites", "only", "have", "significant", "effects", "on", "the", "enzyme", "activity", "toward", "NSF", "phospho", "-", "segement", "but", "not", "pNPP", ".", "The", "white", "column", "stands", "for", "the", "mutants", "that", "have", "similar", "effects", "on", "pNPP", "and", "NSF", "phospho", "-", "segement", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B). Relative values of the decreased phosphatase activities of different PTP-MEG2 mutants towards pNPP (p-Nitrophenyl phosphate) compared with wild-type PTP-MEG2. Data information: *** P<0.001: PTP-MEG2 mutants compared with the control group. Data were obtained from 3 independent experiments. N.S. means no significant difference. All the data were analyzed using one-way ANOVA, and displayed as the mean ± s.e.m. In the red column indicates that the mutation sites have greater effects on the enzyme activities toward phospho-NSF segement than the pNPP. The green column indicates that the mutation sites only have significant effects on the enzyme activity toward NSF phospho-segement but not pNPP. The white column stands for the mutants that have similar effects on pNPP and NSF phospho-segement.(C). Fold-change decreases in the phosphatase activities of different PTP-MEG2 mutants towards the NSF-pY83 phospho-segment compared with wild-type PTP-MEG2. Data information: *** P<0.001: PTP-MEG2 mutants compared with the control group. Data were obtained from 3 independent experiments. N.S. means no significant difference. All the data were analyzed using one-way ANOVA, and displayed as the mean ± s.e.m. In the red column indicates that the mutation sites have greater effects on the enzyme activities toward phospho-NSF segement than the pNPP. The green column indicates that the mutation sites only have significant effects on the enzyme activity toward NSF phospho-segement but not pNPP. The white column stands for the mutants that have similar effects on pNPP and NSF phospho-segement."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", ".", "Statistical", "diagram", "of", "the", "quantal", "size", "in", "Fig", ".", "5A", "and", "Appendix", "Figure", "S6A", "-", "D", ".", "The", "secretion", "amount", "of", "each", "group", "was", "standardized", "with", "respect", "to", "the", "control", "group", ".", "Data", "information", ":", "Green", "color", "represents", "the", "amino", "acids", "which", "are", "found", "to", "modulate", "foot", "probability", "based", "on", "structure", "analysis", ",", "and", "red", "color", "means", "amino", "acids", "which", "does", "not", "regulate", "foot", "probability", ".", ",", "*", "indicates", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "overexpression", "group", "compared", "with", "the", "WT", "overexpression", "group", ".", "#", "indicates", "the", "overexpression", "group", "compared", "with", "the", "control", "group", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "#", "#", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "Data", "were", "from", "6", "independent", "experiments", ".", "All", "the", "data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "showed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D). Statistical diagram of the quantal size in Fig. 5A and Appendix Figure S6A-D. The secretion amount of each group was standardized with respect to the control group. Data information: Green color represents the amino acids which are found to modulate foot probability based on structure analysis, and red color means amino acids which does not regulate foot probability. , * indicates PTP-MEG2 mutants overexpression group compared with the WT overexpression group. # indicates the overexpression group compared with the control group. **, P<0.01; *** P<0.001 and #, P<0.05; ##, P<0.01; ### P<0.001. N.S. means no significant difference. Data were from 6 independent experiments. All the data were analyzed using one-way ANOVA and showed as the mean ± s.e.m."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", ".", "The", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "suggested", "that", "PACSIN1", ",", "MUNC18", "-", "1", ",", "VAMP7", ",", "SNAP25", ",", "DYNAMIN1", "and", "DYNAMIN2", "directly", "interact", "with", "PTP", "-", "MEG2", ".", "PC12", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "of", "candidate", "substrates", ",", "including", "SYN1", ",", "MUNC18", "-", "3", ",", "PACSIN1", ",", "SCAMP1", ",", "MUNC18", "-", "1", ",", "PPP3CA", ",", "STX17", ",", "VAMP7", ",", "SYT7", ",", "SYT11", ",", "SNAP25", ",", "DYNAMIN1", ",", "and", "DYNAMIN2", "stimulated", "with", "100", "nM", "AngII", ".", "The", "tyrosine", "phosphorylation", "of", "these", "proteins", "was", "verified", "by", "specific", "anti", "-", "pY", "antibodies", "(", "Appendix", "Figure", "S8A", "-", "E", ")", ".", "The", "potential", "substrates", "of", "PTP", "-", "MEG2", "in", "cell", "lysates", "were", "pulled", "down", "with", "a", "GST", "-", "PTP", "-", "MEG2", "-", "D470A", "trapping", "mutant", "and", "then", "detected", "by", "Western", "blot", ".", "White", "arrow", "stands", "for", "Western", "blot", "band", "consistent", "with", "the", "predicted", "molecular", "weight", "of", "the", "potential", "PTP", "-", "MEG2", "substrate", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C). The GST pull-down assay suggested that PACSIN1, MUNC18-1, VAMP7, SNAP25, DYNAMIN1 and DYNAMIN2 directly interact with PTP-MEG2. PC12 cells were transfected with plasmids of candidate substrates, including SYN1, MUNC18-3, PACSIN1, SCAMP1, MUNC18-1, PPP3CA, STX17, VAMP7, SYT7, SYT11, SNAP25, DYNAMIN1, and DYNAMIN2 stimulated with 100 nM AngII. The tyrosine phosphorylation of these proteins was verified by specific anti-pY antibodies (Appendix Figure S8A-E). The potential substrates of PTP-MEG2 in cell lysates were pulled down with a GST-PTP-MEG2-D470A trapping mutant and then detected by Western blot. White arrow stands for Western blot band consistent with the predicted molecular weight of the potential PTP-MEG2 substrate."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", ".", "Interactions", "of", "the", "PTP", "-", "MEG2", "-", "trapping", "mutants", "with", "the", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145", "mutants", "and", "DYNAMIN2", "-", "Y125", "mutants", ".", "PC12", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145", ",", "FLAG", "-", "DYNAMIN2", "-", "Y125", "and", "different", "mutations", "of", "the", "FLAG", "-", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145A", ",", "Y145H", ",", "Y145E", "or", "Y145F", ",", "FLAG", "-", "DYNAMIN2", "-", "Y125A", ",", "Y125E", ",", "Y125F", ",", "24", "hours", "before", "stimulation", "with", "100", "nM", "AngII", ",", "respectively", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "then", "incubated", "with", "GST", "-", "beads", "-", "PTP", "-", "MEG2", "-", "D470A", "complex", "for", "2", "hours", "with", "constant", "rotation", ".", "The", "potential", "PTP", "-", "MEG2", "substrates", "were", "pulled", "down", "by", "GST", "-", "beads", ",", "and", "their", "levels", "were", "examined", "by", "the", "FLAG", "antibody", "with", "Western", "blot", ".", "(", "H", ")", ".", "The", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145", "mutations", "decreased", "the", "interaction", "between", "MUNC18", "-", "1", "and", "SYNTAXIN1", ".", "PC12", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmid", "encoding", "SYNTAXIN", "-", "1", ".", "The", "proteins", "in", "cell", "lysates", "were", "pulled", "down", "with", "purified", "GST", "-", "beads", "-", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145", "complex", "and", "the", "GST", "-", "MUNC18", "-", "1", "-", "Y145H", "/", "E", "/", "F", ",", "and", "detected", "with", "SYNTAXIN1", "antibody", ".", "The", "right", "histogram", "shows", "the", "quantified", "protein", "levels", ".", "Data", "information", "*", "indicates", "MUNC18", "-", "1", ",", "mutants", "overexpression", "group", "compared", "with", "the", "WT", "overexpression", "group", ".", "#", "indicates", "MUNC18", "-", "1", ",", "overexpression", "group", "compared", "with", "the", "control", "group", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "Data", "were", "from", "3", "(", "H", ")", "independent", "experiments", ".", "All", "the", "data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "and", "showed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D). Interactions of the PTP-MEG2-trapping mutants with the MUNC18-1-Y145 mutants and DYNAMIN2-Y125 mutants. PC12 cells were transfected with FLAG-MUNC18-1-Y145, FLAG-DYNAMIN2-Y125 and different mutations of the FLAG-MUNC18-1-Y145A, Y145H, Y145E or Y145F, FLAG-DYNAMIN2-Y125A, Y125E, Y125F, 24 hours before stimulation with 100 nM AngII, respectively. The cell lysates were then incubated with GST-beads-PTP-MEG2-D470A complex for 2 hours with constant rotation. The potential PTP-MEG2 substrates were pulled down by GST-beads, and their levels were examined by the FLAG antibody with Western blot.(H). The MUNC18-1-Y145 mutations decreased the interaction between MUNC18-1 and SYNTAXIN1. PC12 cells were transfected with plasmid encoding SYNTAXIN-1. The proteins in cell lysates were pulled down with purified GST-beads-MUNC18-1-Y145 complex and the GST-MUNC18-1-Y145H/E/F, and detected with SYNTAXIN1 antibody. The right histogram shows the quantified protein levels. Data information * indicates MUNC18-1, mutants overexpression group compared with the WT overexpression group. # indicates MUNC18-1, overexpression group compared with the control group. *, P<0.05; **, P<0.01; *** P<0.001 N.S. means no significant difference. Data were from 3 (H) independent experiments. All the data were analyzed using one-way ANOVA, and showed as the mean ± s.e.m."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "E", ")", ".", "Relative", "phosphatase", "activities", "of", "different", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "towards", "the", "MUNC18", "-", "1", "-", "pY145", "phospho", "-", "segment", "compared", "with", "wild", "-", "type", "PTP", "-", "MEG2", ".", "(", "F", ")", ".", "Relative", "phosphatase", "activities", "of", "different", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "towards", "the", "DYNAMIN", "2", "-", "pY125", "phospho", "-", "segment", "compared", "with", "wild", "-", "type", "PTP", "-", "MEG2", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", ",", "F", ")", "Residues", "are", "coloured", "according", "to", "Figure", "8B", ".", "(", "E", ",", "F", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ":", "PTP", "-", "MEG2", "mutants", "compared", "with", "the", "control", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "N", ".", "S", ".", "means", "no", "significant", "difference", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "10", "cells", "in", "each", "group", "of", "6", "independent", "experiments", ".", ".", "All", "the", "data", "were", "analyzed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "showed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(E). Relative phosphatase activities of different PTP-MEG2 mutants towards the MUNC18-1-pY145 phospho-segment compared with wild-type PTP-MEG2. (F). Relative phosphatase activities of different PTP-MEG2 mutants towards the DYNAMIN 2-pY125 phospho-segment compared with wild-type PTP-MEG2.Data information: (E, F) Residues are coloured according to Figure 8B. (E, F), * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001: PTP-MEG2 mutants compared with the control. N.S. means no significant difference. Data were obtained from 3 independent experiments. **, P<0.01; *** P<0.001 and ## P<0.01; ### P<0.001. N.S. means no significant difference. Data were obtained from 10 cells in each group of 6 independent experiments. . All the data were analyzed using one-way ANOVA and showed as the mean ± s.e.m."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "results", "showing", "relative", "expression", "levels", "of", "mouse", "Cnot6", "and", "Cnot6l", "in", "oocytes", "(", "GV", "and", "MII", ")", ",", "somatic", "tissues", ",", "ES", "cells", "(", "A", ")", "and", "preimplantation", "embryos", "(", "B", ")", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicatesC", ":", "Cumulative", "numbers", "of", "pups", "per", "female", "showing", "fertility", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "female", "mice", ".", "n", "=", "5", "females", "for", "each", "genotypeD", ":", "Representative", "images", "results", "of", "oocytes", "collected", "from", "oviducts", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", "at", "16", "h", "after", "hCG", "injection", ".", "scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "polar", "body", "-", "1", "(", "PB1", ")", "E", ":", "Confocal", "microscopy", "results", "of", "oocytes", "collected", "from", "oviducts", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", "at", "16", "h", "after", "hCG", "injection", ".", "scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "spindle", "polesF", ":", "Rates", "of", "PB1", "emission", "and", "normal", "spindle", "formation", "in", "oocytes", "ovulated", "by", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "female", "mice", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicated", "(", "n", ")", "G", ":", "Quantification", "of", "preimplantation", "embryos", "derived", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "females", "that", "develop", "to", "the", "indicated", "stages", "after", "hCG", "administration", "and", "mated", "with", "adult", "WT", "males", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "embryos", "are", "indicated", "(", "n", ")", "H", ":", "Representative", "images", "of", "embryos", "collected", "from", "the", "oviducts", "or", "uteri", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "female", "at", "indicated", "time", "points", "after", "hCG", "administration", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B: Quantitative RT-PCR results showing relative expression levels of mouse Cnot6 and Cnot6l in oocytes (GV and MII), somatic tissues, ES cells (A) and preimplantation embryos (B). n = 3 biological replicatesC: Cumulative numbers of pups per female showing fertility of WT and Cnot6l-/- female mice. n = 5 females for each genotypeD: Representative images results of oocytes collected from oviducts of WT and Cnot6l-/- mice at 16 h after hCG injection. scale bar, 100 μm. Arrows indicate polar body-1 (PB1)E: Confocal microscopy results of oocytes collected from oviducts of WT and Cnot6l-/- mice at 16 h after hCG injection. scale bar, 20 μm. Arrows indicate spindle polesF: Rates of PB1 emission and normal spindle formation in oocytes ovulated by WT and Cnot6l-/- female mice. The numbers of analyzed oocytes were indicated (n)G: Quantification of preimplantation embryos derived from WT and Cnot6l-/- females that develop to the indicated stages after hCG administration and mated with adult WT males. The numbers of analyzed embryos are indicated (n)H: Representative images of embryos collected from the oviducts or uteri of WT and Cnot6l-/- female at indicated time points after hCG administration. Scale bar, 100 μm. Data information: Error bars, s.e.m. **P < 0.01; ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-signif"}
{"words": ["Figure", "2A", ":", "Rates", "of", "germinal", "vesicle", "breakdown", "(", "GVBD", ")", "and", "PB1", "emission", "in", "oocytes", "cultured", "in", "vitro", ".", "Fully", "-", "grown", "GV", "oocytes", "were", "collected", "from", "PMSG", "-", "primed", "(", "44", "h", ")", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", ".", "PB1", ":", "polar", "body", "-", "1", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicated", "(", "n", ")", "B", ":", "Representative", "images", "of", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-", "oocytes", "showing", "PB1", "emission", "at", "16", "h", "after", "culture", ".", "Arrows", "indicate", "PB1", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μmC", ":", "Representative", "images", "of", "chromosome", "spreads", "made", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "after", "16", "h", "of", "in", "vitro", "maturation", "culture", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "topoisomerase", "II", "(", "TOP2", ")", "and", "the", "centromere", "antigen", "CREST", "were", "performed", "to", "indicate", "chromosome", "arms", "and", "centromeres", ",", "respectively", ".", "Numbers", "of", "paired", "sister", "chromatids", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μmD", ":", "Percentage", "(", "%", ")", "of", "aneuploidy", "among", "in", "vitro", "cultured", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "that", "have", "released", "PB1s", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-", "significant", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicateE", ":", "Rates", "of", "GVBD", ",", "PB1", "emission", ",", "and", "normal", "spindle", "assembly", "in", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-", "oocytes", "cultured", "in", "vitro", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-", "significant", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicateF", ":", "Confocal", "microscopy", "results", "showing", "spindle", "assembly", "in", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "metaphase", "I", "(", "MI", ")", "and", "metaphase", "II", "(", "MII", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μmG", ":", "Pericentrin", "immunofluorescence", "showing", "MTOCs", "in", "cultured", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "MI", "and", "MII", "stages", ".", "Spindle", "and", "DNA", "were", "labeled", "by", "microtubule", "nucleation", "factor", "(", "TPX2", ")", "and", "DAPI", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "20"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A: Rates of germinal vesicle breakdown (GVBD) and PB1 emission in oocytes cultured in vitro. Fully-grown GV oocytes were collected from PMSG-primed (44 h) WT and Cnot6l-/- mice. PB1: polar body-1. Error bars, s.e.m. The numbers of analyzed oocytes were indicated (n)B: Representative images of WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- oocytes showing PB1 emission at 16 h after culture. Arrows indicate PB1. Scale bar, 100 μmC: Representative images of chromosome spreads made from WT and Cnot6l-/- oocytes after 16 h of in vitro maturation culture. Immunofluorescent staining of topoisomerase II (TOP2) and the centromere antigen CREST were performed to indicate chromosome arms and centromeres, respectively. Numbers of paired sister chromatids are indicated. Scale bar, 5 μmD: Percentage (%) of aneuploidy among in vitro cultured WT and Cnot6l-/- oocytes that have released PB1s. Error bars, s.e.m. *P < 0.05; ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-significant. The numbers of analyzed oocytes were indicateE: Rates of GVBD, PB1 emission, and normal spindle assembly in WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- oocytes cultured in vitro. Error bars, s.e.m. ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-significant. The numbers of analyzed oocytes were indicateF: Confocal microscopy results showing spindle assembly in WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- oocytes at metaphase I (MI) and metaphase II (MII). Scale bar, 20 μmG: Pericentrin immunofluorescence showing MTOCs in cultured WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- oocytes at MI and MII stages. Spindle and DNA were labeled by microtubule nucleation factor (TPX2) and DAPI, respectively. Scale bar, 20 μm"}
{"words": ["Figure", "3A", ":", "Live", "cell", "imaging", "results", "showing", "in", "vitro", "meiotic", "division", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", ".", "Abbreviations", ":", "PM", ",", "prometaphase", ";", "MI", ",", "metaphase", "I", ";", "AI", ",", "anaphase", "I", ";", "TI", ",", "anaphase", "I", "-", "metaphase", "II", "transition", ";", "MII", ",", "metaphase", "II", ";", "PB1", ":", "polar", "body", "-", "1", ".", "Hours", "after", "released", "from", "GV", "arrest", "were", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μmB", ":", "Data", "represent", "the", "mean", "and", "standard", "deviations", "of", "mCherry", "-", "Securin", "fluorescence", "intensity", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "each", "time", "point", ".", "Values", "from", "individual", "oocytes", "are", "normalized", "relative", "to", "that", "at", "0", "h", "after", "released", "from", "GV", "arrest", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicated", "(", "n", ")", "C", ":", "SMC3", "immunofluorescence", "showing", "cohesin", "on", "chromosomes", "of", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "16", "h", "after", "culture", ".", "Centromeres", "and", "DNA", "were", "labeled", "by", "CREST", "and", "DAPI", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μmD", ":", "BUB3", "immunofluorescence", "on", "chromosome", "spreads", "made", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "9", ".", "5", "h", "after", "culture", ".", "More", "than", "8", "oocytes", "were", "observed", "for", "each", "genotype", "with", "similar", "results", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μmE", ":", "PB1", "emission", "rates", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "cultured", "with", "or", "without", "MPS1", "inhibitor", "reversin", "(", "5", "μm", ")", ".", "Reversin", "is", "added", "at", "9", "hours", "after", "culture", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicated", "(", "n", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A: Live cell imaging results showing in vitro meiotic division of WT and Cnot6l-/- oocytes. Abbreviations: PM, prometaphase; MI, metaphase I; AI, anaphase I; TI, anaphase I-metaphase II transition; MII, metaphase II; PB1: polar body-1. Hours after released from GV arrest were indicated. Scale bar, 20 μmB: Data represent the mean and standard deviations of mCherry-Securin fluorescence intensity in WT and Cnot6l-/- oocytes at each time point. Values from individual oocytes are normalized relative to that at 0 h after released from GV arrest. The numbers of analyzed oocytes were indicated (n)C: SMC3 immunofluorescence showing cohesin on chromosomes of WT and Cnot6l-/- oocytes at 16 h after culture. Centromeres and DNA were labeled by CREST and DAPI, respectively. Scale bar, 5 μmD: BUB3 immunofluorescence on chromosome spreads made from WT and Cnot6l-/- oocytes at 9.5 h after culture. More than 8 oocytes were observed for each genotype with similar results. Scale bar, 5 μmE: PB1 emission rates in WT and Cnot6l-/- oocytes cultured with or without MPS1 inhibitor reversin (5 μm). Reversin is added at 9 hours after culture. Error bars, s.e.m. The numbers of analyzed oocytes were indicated (n)"}
{"words": ["Figure", "4A", ":", "Relative", "mRNA", "copy", "number", "dynamics", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "samples", "at", "the", "indicated", "stages", ".", "Error", "bars", "indicate", "values", "of", "the", "two", "biological", "replicatesB", ":", "Box", "plot", "showing", "gene", "expression", "levels", "of", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "the", "MII", "stage", ".", "Genes", "were", "divided", "into", "10", "bins", "according", "to", "their", "expression", "levels", "in", "the", "WT", "MII", "oocytes", ".", "The", "box", "indicates", "upper", "and", "lower", "quantiles", ",", "the", "thick", "line", "in", "the", "box", "indicate", "the", "median", ",", "and", "the", "whiskers", "represent", "2", ".", "5th", "and", "97", ".", "5th", "percentiles", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-", "signifC", ":", "qRT", "-", "PCR", "results", "showing", "the", "relative", "expression", "levels", "of", "Cnot6l", "in", "oocytes", "collected", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", "(", "Cnot6l", "-", "/", "-", "/", "WT", ")", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", "=", "3", "biological", "repliD", ":", "Scatter", "plot", "comparing", "transcripts", "between", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "(", "at", "GV", ",", "MI", "and", "MII", "stages", ")", "and", "zygotes", "derived", "from", "these", "oocytes", ".", "Transcripts", "decreased", "or", "increased", "more", "than", "five", "folds", "in", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocyte", "samples", "were", "high", "-", "lighted", "with", "blue", "or", "red", ",", "respectivelyE", ":", "Heatmap", "showing", "transcripts", "that", "were", "degraded", "during", "meiotic", "maturation", "(", "GV", "/", "Zygote", ">", "10", ")", "in", "WT", "oocytes", ".", "The", "definition", "of", "cluster", "I", "-", "III", "is", "described", "in", "the", "textF", ":", "Relative", "mRNA", "copy", "number", "dynamics", "of", "the", "three", "gene", "clusters", "in", "WT", ",", "Cnot6l", "-", "/", "-", "and", "Btg4", "-", "/", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A: Relative mRNA copy number dynamics in WT and Cnot6l-/- samples at the indicated stages. Error bars indicate values of the two biological replicatesB: Box plot showing gene expression levels of WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- oocytes at the MII stage. Genes were divided into 10 bins according to their expression levels in the WT MII oocytes. The box indicates upper and lower quantiles, the thick line in the box indicate the median, and the whiskers represent 2.5th and 97.5th percentiles. ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-signifC: qRT-PCR results showing the relative expression levels of Cnot6l in oocytes collected from WT and Cnot6l-/- mice (Cnot6l-/-/WT). Error bars, s.e.m. ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n = 3 biological repliD: Scatter plot comparing transcripts between WT and Cnot6l-/- oocytes (at GV, MI and MII stages) and zygotes derived from these oocytes. Transcripts decreased or increased more than five folds in Cnot6l-/- oocyte samples were high-lighted with blue or red, respectivelyE: Heatmap showing transcripts that were degraded during meiotic maturation (GV/Zygote > 10) in WT oocytes. The definition of cluster I-III is described in the textF: Relative mRNA copy number dynamics of the three gene clusters in WT, Cnot6l-/- and Btg4-/- samples"}
{"words": ["Figure", "6Western", "blot", "results", "showing", "the", "levels", "of", "CPEB1", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "meiotic", "resumption", ".", "Total", "proteins", "from", "50", "(", "A", "oocytes", "are", "loaded", "in", "each", "lane", ".", "DDB1", "(", "A", "is", "blotted", "as", "a", "loading", "control", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", "with", "reproducible", "results", ";", "a", "representative", "result", "is", "shownWestern", "blot", "results", "showing", "the", "levels", "of", "CPEB1", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "meiotic", "resumption", ".", "Total", "proteins", "fro", "100", "(", "B", ")", "oocytes", "are", "loaded", "in", "each", "lane", "α", "-", "tubulin", "(", "B", ")", "is", "blotted", "as", "a", "loading", "control", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", "with", "reproducible", "results", ";", "a", "representative", "result", "is", "shownImmunofluorescenc", "of", "L", "-", "homopropargylglycine", "(", "HPG", ")", "showing", "the", "overall", "translation", "levels", "of", "MI", "and", "MII", "oocytes", "collected", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Error", "bars", ",", "standard", "deviations", "(", "n", "=", "6", "oocytes", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001quantification", "(", "D", ")", "of", "L", "-", "homopropargylglycine", "(", "HPG", ")", "showing", "the", "overall", "translation", "levels", "of", "MI", "and", "MII", "oocytes", "collected", "from", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Error", "bars", ",", "standard", "deviations", "(", "n", "=", "6", "oocytes", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001E", ":", "Relative", "mRNA", "copy", "numbers", "of", "polysome", "-", "bound", "transcripts", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "indicated", "stages", ".", "Error", "bars", "indicate", "values", "of", "the", "replicatesF", ":", "Scatter", "plot", "comparing", "polysome", "-", "bound", "transcripts", "between", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "GV", ",", "MI", "and", "MII", "stages", ",", "respectively", ".", "Transcripts", "decreased", "or", "increased", "more", "than", "five", "folds", "in", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocyte", "samples", "were", "high", "-", "lighted", "with", "blue", "or", "red", ",", "respectivelyI", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "results", "showing", "the", "relative", "levels", "of", "indicated", "transcripts", "in", "association", "with", "polysomes", "in", "WT", "and", "Cnot6l", "-", "/", "-", "oocytes", "at", "GV", ",", "MI", "and", "MII", "stages", ".", "Error", "bars", ",", "standard", "deviations", "(", "n", "=", "3", "biologica", "repeats", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blot results showing the levels of CPEB1 in WT and Cnot6l-/- oocytes at the indicated time points after meiotic resumption. Total proteins from 50 (A oocytes are loaded in each lane. DDB1 (A is blotted as a loading control. Experiments were performed three times with reproducible results; a representative result is shownWestern blot results showing the levels of CPEB1 in WT and Cnot6l-/- oocytes at the indicated time points after meiotic resumption. Total proteins fro 100 (B) oocytes are loaded in each lane α-tubulin (B) is blotted as a loading control. Experiments were performed three times with reproducible results; a representative result is shownImmunofluorescenc of L-homopropargylglycine (HPG) showing the overall translation levels of MI and MII oocytes collected from WT and Cnot6l-/- mice. Scale bar, 20 μm. Error bars, standard deviations (n = 6 oocytes for each genotype). **P < 0.01, ***P < 0.001quantification (D) of L-homopropargylglycine (HPG) showing the overall translation levels of MI and MII oocytes collected from WT and Cnot6l-/- mice. Scale bar, 20 μm. Error bars, standard deviations (n = 6 oocytes for each genotype). **P < 0.01, ***P < 0.001E: Relative mRNA copy numbers of polysome-bound transcripts in WT and Cnot6l-/- oocytes at indicated stages. Error bars indicate values of the replicatesF: Scatter plot comparing polysome-bound transcripts between WT and Cnot6l-/- oocytes at GV, MI and MII stages, respectively. Transcripts decreased or increased more than five folds in Cnot6l-/- oocyte samples were high-lighted with blue or red, respectivelyI: Quantitative RT-PCR results showing the relative levels of indicated transcripts in association with polysomes in WT and Cnot6l-/- oocytes at GV, MI and MII stages. Error bars, standard deviations (n = 3 biologica repeats)"}
{"words": ["Figure", "7A", ":", "Presence", "of", "putative", "AREs", "(", "AUUUA", ")", "in", "transcripts", "of", "WT", "oocyte", ".", "Transcripts", "containing", "no", "ARE", "or", "transcripts", "containing", "1", "or", "more", "AREs", "were", "subdivided", "into", "frequency", "groups", "according", "to", "the", "log2", "fold", "change", "(", "MII", "/", "GV", ")", "in", "WT", "oocytesB", ":", "Presence", "of", "putative", "AREs", "in", "oocyte", "transcripts", "stabilized", "by", "Cnot6l", "-", "/", "-", "knockout", ".", "Transcripts", "containing", "no", "ARE", "or", "transcripts", "containing", "1", "or", "more", "AREs", "were", "subdivided", "into", "frequency", "groups", "according", "to", "the", "log2", "fold", "change", "(", "Cnot6l", "-", "/", "-", "/", "WT", ")", "at", "MII", "stageC", ":", "Co", "-", "IP", "results", "showing", "interaction", "of", "ZFP36L2", "with", "CNOT6L", "and", "CNOT7", ".", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "HA", "-", "ZFP36L2", "and", "FLAG", "-", "CNOT6L", "/", "7", "for", "48", "h", "before", "immunoprecipitation", ".", "Experiments", "were", "performed", "three", "times", "with", "reproducible", "results", ";", "a", "representative", "result", "is", "shownD", ":", "RNA", "immunoprecipitation", "results", "showing", "interaction", "of", "CNOT6L", "with", "indicated", "transcripts", ",", "with", "or", "without", "the", "presence", "of", "ZFP36L2", ".", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "FLAG", "-", "ZFP36L2", "and", "HA", "-", "CNOT6L", "for", "48", "h", "before", "immunoprecipitation", "using", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "mRNAs", "recovered", "from", "the", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", ",", "standard", "deviations", "(", "n", "=", "3", "biological", "repeats", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A: Presence of putative AREs (AUUUA) in transcripts of WT oocyte. Transcripts containing no ARE or transcripts containing 1 or more AREs were subdivided into frequency groups according to the log2 fold change (MII/GV) in WT oocytesB: Presence of putative AREs in oocyte transcripts stabilized by Cnot6l-/- knockout. Transcripts containing no ARE or transcripts containing 1 or more AREs were subdivided into frequency groups according to the log2 fold change (Cnot6l-/-/WT) at MII stageC: Co-IP results showing interaction of ZFP36L2 with CNOT6L and CNOT7. HeLa cells were co-transfected with plasmids expressing HA-ZFP36L2 and FLAG-CNOT6L/7 for 48 h before immunoprecipitation. Experiments were performed three times with reproducible results; a representative result is shownD: RNA immunoprecipitation results showing interaction of CNOT6L with indicated transcripts, with or without the presence of ZFP36L2. HeLa cells were co-transfected with plasmids expressing FLAG-ZFP36L2 and HA-CNOT6L for 48 h before immunoprecipitation using an anti-HA antibody. mRNAs recovered from the immunoprecipitates were subjected to qRT-PCR. Error bars, standard deviations (n = 3 biological repeats). ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t"}
{"words": ["Figure", "8fluorescence", "microscopy", "results", "(", "B", ")", "showing", "the", "translation", "activities", "of", "the", "Cnot6l", "3", "\"", "-", "UTR", "(", "WT", "and", "CPE", "mutated", ")", "in", "GV", "-", "(", "maintained", "by", "2", "μM", "milrinone", ")", "or", "MII", "-", "(", "released", "from", "milrinone", ")", "arrested", "oocytes", ".", "GFP", "signal", "indicated", "translational", "activation", "of", "Cnot6l", "3", "\"", "-", "UTR", ".", "An", "in", "vitro", "transcribed", "and", "polyadenylated", "mCherry", "mRNA", "was", "co", "-", "microinjected", "as", "a", "positive", "control", ".", "Scale", "bGFP", "signal", "indicated", "translational", "activation", "of", "Cnot6l", "3", "\"", "-", "UTR", ".", "An", "in", "vitro", "transcribed", "and", "polyadenylated", "mCherry", "mRNA", "was", "co", "-", "microinjected", "as", "a", "positive", "co", "Relative", "intensity", "of", "GFP", "signa", "after", "normalization", "by", "mCherry", "signal", "in", "the", "same", "oocyte", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-", "significant", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicatefluorescence", "microscopy", "results", "(", "E", ")", "showing", "the", "expression", "of", "GFP", "-", "fused", "Cnot6l", "3", "\"", "-", "UTR", "in", "GV", "and", "MII", "oocytes", "with", "or", "without", "U0126", "treatment", "(", "20", "μM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1e", "expression", "of", "GFP", "-", "fused", "Cnot6l", "3", "\"", "-", "UTR", "in", "GV", "and", "MII", "oocytes", "with", "or", "without", "U01", "F", ":", "Relative", "intensity", "of", "GFP", "signa", "after", "normalization", "by", "mCherry", "signal", "in", "the", "same", "oocyte", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were", "indicated", "(", "n", ")", "G", ":", "Rates", "of", "PB2", "emission", "and", "normal", "spindle", "assembly", "in", "oocytes", "cultured", "with", "or", "without", "U0126", ".", "Fully", "grown", "GV", "oocytes", "were", "microinjected", "with", "mRNAs", "encoding", "CNOT6L", ",", "CNOT7", "and", "/", "or", "BTG4", "and", "are", "released", "from", "milrinone", "at", "12", "h", "after", "microinjection", ".", "Then", "the", "oocytes", "were", "further", "culture", "for", "24", "h", "with", "or", "without", "adding", "U0126", "to", "the", "medium", ".", "Error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "\"", "s", "t", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ":", "non", "-", "significant", ".", "The", "numbers", "of", "analyzed", "oocytes", "were"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8fluorescence microscopy results (B) showing the translation activities of the Cnot6l 3\"-UTR (WT and CPE mutated) in GV- (maintained by 2 μM milrinone) or MII- (released from milrinone) arrested oocytes. GFP signal indicated translational activation of Cnot6l 3\"-UTR. An in vitro transcribed and polyadenylated mCherry mRNA was co-microinjected as a positive control. Scale bGFP signal indicated translational activation of Cnot6l 3\"-UTR. An in vitro transcribed and polyadenylated mCherry mRNA was co-microinjected as a positive co Relative intensity of GFP signa after normalization by mCherry signal in the same oocyte. Error bars, s.e.m. *P < 0.05; ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-significant. The numbers of analyzed oocytes were indicatefluorescence microscopy results (E) showing the expression of GFP-fused Cnot6l 3\"-UTR in GV and MII oocytes with or without U0126 treatment (20 μM). Scale bar, 1e expression of GFP-fused Cnot6l 3\"-UTR in GV and MII oocytes with or without U01 F: Relative intensity of GFP signa after normalization by mCherry signal in the same oocyte The numbers of analyzed oocytes were indicated (n)G: Rates of PB2 emission and normal spindle assembly in oocytes cultured with or without U0126. Fully grown GV oocytes were microinjected with mRNAs encoding CNOT6L, CNOT7 and/or BTG4 and are released from milrinone at 12 h after microinjection. Then the oocytes were further culture for 24 h with or without adding U0126 to the medium. Error bars, s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 by two-tailed Student\"s t test. n.s.: non-significant. The numbers of analyzed oocytes were indicate"}
{"words": ["Figure", "1WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "unstimulated", "or", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "Cell", "pellets", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "STm", "infection", "were", "lysed", ",", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "caspase", "-", "1", "(", "E", ",", "F", ")", "(", "E", "Representative", "immunoblots", "showing", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "pro", "-", "casp", ".", "-", "1", ")", "and", "cleaved", "p20", "(", "casp", ".", "-", "1", "p20", ")", "bands", "(", "E", ")", "(", "F", ",", "Quantification", "of", "band", "intensities", "for", "caspase", "-", "1", "p20", "normalized", "to", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "and", "actin", "(", "E", ")", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "as", "fold", "change", "(", "F", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "unstimulated", "or", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "Cell", "pellets", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "STm", "infection", "were", "lysed", ",", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "GSDMD", "or", "LC", "-", "3", "G", ")", ".", "Representative", "immunoblots", "showing", "GSDMD", "full", "length", "(", "GSDMD", "FL", ")", ",", "cleaved", "GSDMD", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "GSDMD", "N", "-", "ter", ")", ",", "LC3", "-", "II", "and", "LC3", "-", "I", "bands", "in", "cell", "lysates", "(", "G", ")", ".", "H", ",", "Quantification", "of", "band", "intensities", "for", "GSDMD", "N", "-", "ter", "normalized", "to", "actin", "(", "G", ")", "and", "LC3", "-", "II", "normalized", "to", "LC3", "-", "I", "and", "actin", "(", "H", ")", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "as", "fold", "change", ",", "H", ")", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1WT or SLC15A4feeble BMDCs unstimulated or infected with flagellin-expressing STm Cell pellets collected at the indicated time points after STm infection were lysed, fractionated by SDS-PAGE and immunoblotted for caspase-1 (E, F) (E Representative immunoblots showing pro-caspase-1 (pro-casp.-1) and cleaved p20 (casp.-1 p20) bands (E) (F, Quantification of band intensities for caspase-1 p20 normalized to pro-caspase-1 and actin (E) from three independent experiments are shown as fold change (F Data information: Data represent mean ± SD. * p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. Two-tailed Student's t-test.WT or SLC15A4feeble BMDCs unstimulated or infected with flagellin-expressing STm Cell pellets collected at the indicated time points after STm infection were lysed, fractionated by SDS-PAGE and immunoblotted for GSDMD or LC-3 G). Representative immunoblots showing GSDMD full length (GSDMD FL), cleaved GSDMD N-terminal fragment (GSDMD N-ter), LC3-II and LC3-I bands in cell lysates (G). H, Quantification of band intensities for GSDMD N-ter normalized to actin (G) and LC3-II normalized to LC3-I and actin (H) from three independent experiments are shown as fold change , H) Data information: Data represent mean ± SD. * p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. Two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3Intestinal", "CD11c", "+", "DCs", "were", "isolated", "from", "colons", "of", "WT", "and", "SLC15A4feeble", "mice", "on", "day", "16", "and", "cultured", "overnight", ".", "B", ".", "Cell", "pellets", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "immunoblotted", "for", "LC3", "and", "actin", ".", "Upper", "panel", ".", "Representative", "immunoblot", ".", "Lower", "panel", ".", "Quantification", "of", "band", "intensities", "for", "LC3", "-", "II", "normalized", "to", "LC3", "-", "I", "and", "actin", "are", "shown", "as", "fold", "induction", "relative", "to", "samples", "from", "untreated", "mice", ".", "Note", "that", "LC3", "-", "I", "signal", "from", "ex", "vivo", "samples", "is", "almost", "undetectable", ".", "Data", "information", ":", "Mean", "is", "indicated", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mann", "-", "Whitney", "non", "-", "parametric", "statistical", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Intestinal CD11c+ DCs were isolated from colons of WT and SLC15A4feeble mice on day 16 and cultured overnight. B. Cell pellets from three independent experiments were immunoblotted for LC3 and actin. Upper panel. Representative immunoblot. Lower panel. Quantification of band intensities for LC3-II normalized to LC3-I and actin are shown as fold induction relative to samples from untreated mice. Note that LC3-I signal from ex vivo samples is almost undetectable. Data information: Mean is indicated. **p<0.01. Mann-Whitney non-parametric statistical test."}
{"words": ["Figure", "4WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "expressing", "ASC", "-", "GFP", "and", "mCherry", "-", "LC3", "(", "A", ",", "B", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "and", "fixed", "A", ".", "Cells", "were", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "showing", "ASC", "speck", "(", "green", ")", "relative", "to", "mCherry", "-", "LC3", "(", "red", ")", "in", "two", "infected", "WT", "and", "SLC15A4feeble", "DCs", "each", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "LC3", "fluorescence", "per", "unit", "area", "in", "a", "radius", "of", "1", "μm", "surrounding", "the", "ASC", "speck", "in", "20", "cells", "per", "cell", "type", "in", "each", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Corresponding", "DIC", "images", "show", "nuclear", "position", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "non", "-", "transduced", "(", "C", ")", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "and", "fixed", "C", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "endogenous", "ASC", "and", "p62", ",", "labeled", "with", "DAPI", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "showing", "ASC", "speck", "(", "red", ")", "relative", "to", "p62", "(", "green", ")", "in", "two", "infected", "WT", "and", "SLC15A4feeble", "DCs", "each", ".", "Note", "p62", "staining", "surrounding", "ASC", "specks", "in", "SLC15A4feeble", "DCs", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "perinuclear", "(", "within", "a", "radius", "of", "3", "μm", "from", "the", "nucleus", ")", "ASC", "specks", "in", "at", "least", "30", "cells", "per", "cell", "type", "in", "each", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Corresponding", "DIC", "images", "show", "nuclear", "position", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "SLC15A4", "-", "GFP", "(", "E", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "and", "fixed", "(", "E", ",", "Cells", "were", "stained", "for", "endogenous", "ASC", ",", "labeled", "with", "DAPI", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "showing", "ASC", "speck", "(", "red", ")", "and", "SLC15A4", "-", "GFP", "(", "green", ")", "in", "SLC15A4feeble", "DCs", "together", "with", "non", "-", "transduced", "SLC15A4feeble", "DCs", ".", "Note", "the", "perinuclear", "positioning", "of", "ASC", "specks", "in", "the", "transduced", "cells", "(", "E", ")", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Dotted", "white", "lines", ",", "cell", "outlines", ".", "Corresponding", "DIC", "images", "show", "nuclear", "position", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "SLC15A4", "-", "GFP", "F", ",", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "and", "fixed", "Quantification", "of", "perinuclear", "(", "within", "a", "radius", "of", "3", "μm", "from", "the", "nucleus", ")", "and", "non", "-", "perinuclear", "ASC", "specks", "in", "at", "least", "30", "cells", "per", "cell", "type", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "SLC15A4", "-", "GFP", "G", ")", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", "and", "lysed", "(", "G", ")", "1", "h", "after", "infection", ".", "G", ".", "Representative", "immunoblots", "showing", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "pro", "-", "casp", ".", "-", "1", ")", "and", "cleaved", "p20", "(", "casp", ".", "-", "1", "p20", ")", ",", "LC3", "-", "II", "and", "LC3", "-", "I", ",", "and", "actin", "bands", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4WT or SLC15A4feeble BMDCs expressing ASC-GFP and mCherry-LC3 (A, B were infected with flagellin-expressing STm and fixed A. Cells were analyzed by fluorescence microscopy. Representative images showing ASC speck (green) relative to mCherry-LC3 (red) in two infected WT and SLC15A4feeble DCs each. B. Quantification of LC3 fluorescence per unit area in a radius of 1 μm surrounding the ASC speck in 20 cells per cell type in each of 3 independent experiments. N, nucleus. Corresponding DIC images show nuclear position. Scale bar, 8 μm. Data information: Data represent mean ± SD. **p<0.01. Two-tailed Student's t-test.WT or SLC15A4feeble BMDCs non-transduced (C) were infected with flagellin-expressing STm and fixed C. Cells were stained for endogenous ASC and p62, labeled with DAPI and analyzed by fluorescence microscopy. Representative images showing ASC speck (red) relative to p62 (green) in two infected WT and SLC15A4feeble DCs each. Note p62 staining surrounding ASC specks in SLC15A4feeble DCs. D. Quantification of perinuclear (within a radius of 3 μm from the nucleus) ASC specks in at least 30 cells per cell type in each of 3 independent experiments. N, nucleus. Corresponding DIC images show nuclear position. Scale bar, 8 μm. Data information: Data represent mean ± SD. **p<0.01. Two-tailed Student's t-test.SLC15A4feeble BMDCs transduced with SLC15A4-GFP (E were infected with flagellin-expressing STm and fixed (E, Cells were stained for endogenous ASC, labeled with DAPI and analyzed by fluorescence microscopy. Representative images showing ASC speck (red) and SLC15A4-GFP (green) in SLC15A4feeble DCs together with non-transduced SLC15A4feeble DCs. Note the perinuclear positioning of ASC specks in the transduced cells (E). N, nucleus. Dotted white lines, cell outlines. Corresponding DIC images show nuclear position. Scale bar, 8 μm.SLC15A4feeble BMDCs transduced with SLC15A4-GFP F, were infected with flagellin-expressing STm and fixed Quantification of perinuclear (within a radius of 3 μm from the nucleus) and non-perinuclear ASC specks in at least 30 cells per cell type in each of three independent experiments (F). Data information: Data represent mean ± SD. **p<0.01. Two-tailed Student's t-test.SLC15A4feeble BMDCs transduced with SLC15A4-GFP G) were infected with flagellin-expressing STm and lysed (G) 1 h after infection. G. Representative immunoblots showing pro-caspase-1 (pro-casp.-1) and cleaved p20 (casp.-1 p20), LC3-II and LC3-I, and actin bands."}
{"words": ["Figure", "5WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "constitutively", "active", "RagB", "(", "RagBQ99L", ")", "or", "metap2", "(", "control", ")", "were", "infected", "with", "flagellin", "-", "expressing", "STm", ".", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "Cell", "pellets", "collected", "1", "h", "after", "STm", "infection", "were", "lysed", ",", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "phospho", "(", "P", ")", "and", "total", "mTOR", ",", "ULK1", "kinase", ",", "p70", "kinase", "and", "S6", ",", "FLAG", "and", "actin", ".", "Representative", "immunoblots", ".", "Non", "-", "specific", "band", "right", "above", "FLAG", "-", "RagBQ99L", "is", "indicated", "with", "an", "asterisk", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "band", "intensities", "for", "P", "-", "mTOR", "normalized", "to", "total", "mTOR", ",", "P", "-", "ULK1", "normalized", "to", "total", "ULK1", ",", "P", "-", "p70", "normalized", "to", "total", "p70", "and", "P", "-", "S6", "normalized", "to", "S6", ",", "in", "transduced", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", "as", "fold", "change", "relative", "to", "WT", "control", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "constitutively", "active", "RagB", "(", "RagBQ99L", ")", "or", "metap2", "(", "control", ")", "(", "E", ",", "Cell", "pellets", "were", "probed", "for", "caspase", "-", "1", ",", "GSDMD", ",", "actin", "(", "E", ",", "Representative", "immunoblots", "showing", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "pro", "-", "casp", ".", "-", "1", ")", "and", "cleaved", "p20", "(", "casp", ".", "-", "1", "p20", ")", ",", "GSDMD", "full", "length", "(", "GSDMD", "FL", ")", "and", "cleaved", "GSDMD", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "GSDMD", "N", "-", "ter", ")", "bands", ".", "WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "non", "-", "target", "control", ",", "ATG5", "or", "ATG7", "shRNAs", "G", ")", "G", ")", ".", "Cell", "pellets", "were", "probed", "for", "caspase", "-", "1", ",", "GSDMD", ",", "actin", ",", "ATG5", "and", "ATG", "7", "(", "G", ")", ".", "Representative", "immunoblots", "showing", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "pro", "-", "casp", ".", "-", "1", ")", "and", "cleaved", "p20", "(", "casp", ".", "-", "1", "p20", ")", ",", "GSDMD", "full", "length", "(", "GSDMD", "FL", ")", "and", "cleaved", "GSDMD", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "GSDMD", "N", "-", "ter", ")", "bands", ".", "WT", "or", "SLC15A4feeble", "BMDCs", "transduced", "with", "constitutively", "active", "RagB", "(", "RagBQ99L", ")", "or", "metap2", "(", "control", ")", "H", ",", "I", ")", "and", "mcherry", "-", "LC3", "(", "H", ",", "I", ")", ",", "(", "H", ",", "I", ")", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "endogenous", "ASC", ",", "labeled", "with", "DAPI", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "showing", "ASC", "speck", "(", "green", ")", "and", "LC3", "(", "red", ")", "in", "SLC15A4feeble", "DCs", "(", "H", ")", ".", "Quantification", "of", "perinuclear", "(", "within", "a", "radius", "of", "3", "μm", "from", "the", "nucleus", ")", "in", "at", "least", "30", "cells", "per", "cell", "type", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "I", ")", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Corresponding", "DIC", "images", "show", "nuclear", "position", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μ", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5WT or SLC15A4feeble BMDCs transduced with constitutively active RagB (RagBQ99L) or metap2 (control) were infected with flagellin-expressing STm. (A, B). Cell pellets collected 1 h after STm infection were lysed, fractionated by SDS-PAGE and immunoblotted for phospho (P) and total mTOR, ULK1 kinase, p70 kinase and S6, FLAG and actin. Representative immunoblots. Non-specific band right above FLAG-RagBQ99L is indicated with an asterisk (A). Quantification of band intensities for P-mTOR normalized to total mTOR, P-ULK1 normalized to total ULK1, P-p70 normalized to total p70 and P-S6 normalized to S6, in transduced cells from 3 independent experiments are shown as fold change relative to WT control (B). Data information: Data represent mean ± SD. **p<0.01; ***p<0.001. Two-tailed Student's t-test.WT or SLC15A4feeble BMDCs transduced with constitutively active RagB (RagBQ99L) or metap2 (control) (E, Cell pellets were probed for caspase-1, GSDMD, actin (E, Representative immunoblots showing pro-caspase-1 (pro-casp.-1) and cleaved p20 (casp.-1 p20), GSDMD full length (GSDMD FL) and cleaved GSDMD N-terminal fragment (GSDMD N-ter) bands.WT or SLC15A4feeble BMDCs transduced with non-target control, ATG5 or ATG7 shRNAs G) G). Cell pellets were probed for caspase-1, GSDMD, actin , ATG5 and ATG 7 (G). Representative immunoblots showing pro-caspase-1 (pro-casp.-1) and cleaved p20 (casp.-1 p20), GSDMD full length (GSDMD FL) and cleaved GSDMD N-terminal fragment (GSDMD N-ter) bands.WT or SLC15A4feeble BMDCs transduced with constitutively active RagB (RagBQ99L) or metap2 (control) H, I) and mcherry-LC3 (H, I), (H, I). Cells were stained for endogenous ASC, labeled with DAPI and analyzed by fluorescence microscopy. Representative images showing ASC speck (green) and LC3 (red) in SLC15A4feeble DCs (H). Quantification of perinuclear (within a radius of 3 μm from the nucleus) in at least 30 cells per cell type in each of three independent experiments (I). N, nucleus. Corresponding DIC images show nuclear position. Scale bar, 8 μ Data information: Data represent mean ± SD. **p<0.01; ***p<0.001. Two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "left", "inset", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "CETN3", "foci", "per", "spermatocyte", "(", "n", "=", "30", ")", "at", "each", "meiotic", "prophase", "substage", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "unseparated", "(", "<", "1", "μm", "apart", ")", ",", "initial", "separation", "(", "1", "-", "5", "μm", "apart", ")", ",", "intermediate", "separation", "(", "5", "-", "11", "μm", "apart", ")", ",", "and", "pole", "separation", "(", ">", "11", "μm", "apart", ")", "of", "centrosomes", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "and", "top", "left", "insets", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", ".", "Centrosome", "separation", "was", "scored", "in", "n", "=", "30", "spermatocytes", "at", "each", "prophase", "substage", "using", "the", "four", "centrosome", "separation", "classifications", "P", "value", "obtained", "from", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "E", ".", "Spermatocytes", "undergoing", "meiosis", "I", "through", "meiosis", "II", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "purple", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "red", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "centrosomes", "below", "each", "panel", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Spermatocytes were immunolabeled against PCNT (red), CETN3 (green), and SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom left inset. Scale bars = 5 μm.B. Quantification of the number of CETN3 foci per spermatocyte (n = 30) at each meiotic prophase substage.C. Representative images of unseparated (< 1 μm apart), initial separation (1-5 μm apart), intermediate separation (5-11 μm apart), and pole separation (>11 μm apart) of centrosomes. Spermatocytes were immunolabeled against PCNT (red), CETN3 (green), and SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom and top left insets. Scale bars = 5 μm.. Centrosome separation was scored in n = 30 spermatocytes at each prophase substage using the four centrosome separation classifications P value obtained from a Kruskal-Wallis one-way ANOVA. **P<0.01.E. Spermatocytes undergoing meiosis I through meiosis II were immunolabeled against PCNT (purple), CETN3 (green), and SYCP3 (red), and stained with DAPI (blue). Zoomed images of centrosomes below each panel. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "5", "-", "micron", "thick", "testis", "sections", "of", "adult", "control", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", ".", "Stars", "indicate", "examples", "of", "spermatocytes", "with", "condensed", "chromosomes", ".", "B", ".", "Percent", "testis", "to", "body", "weight", "ratios", "from", "control", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "Plk1", "cHet", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "and", "Plk1", "cKO", "(", "n", "=", "7", ")", "adult", "mice", ".", "C", ".", "TUNEL", "staining", "of", "paraffin", "embedded", "testis", "sections", "of", "adult", "control", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", ".", "D", ".", "The", "number", "of", "TUNEL", "positive", "cells", "per", "seminiferous", "tubule", "cross", "-", "section", "was", "quantified", "in", "control", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", ".", "Two", "technical", "replicates", "were", "performed", "per", "genotype", ",", "and", "100", "seminiferous", "tubule", "cross", "sections", "were", "analyzed", "per", "replicate", ".", "E", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "5", "-", "micron", "thick", "testis", "sections", "of", "adult", "control", ",", "Aurka", "cHet", ",", "and", "Aurka", "cKO", "mice", ".", "Stars", "indicate", "examples", "of", "spermatocytes", "with", "condensed", "chromosomes", ".", "F", ".", "Percent", "testis", "to", "body", "weight", "ratios", "from", "control", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Aurka", "cHet", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "Aurka", "cKO", "(", "n", "=", "5", ")", "adult", "mice", ".", "G", ".", "TUNEL", "staining", "of", "paraffin", "embedded", "testis", "sections", "of", "adult", "control", ",", "Aurka", "cHet", ",", "and", "Aurka", "cKO", "mice", ".", "H", ".", "The", "number", "of", "TUNEL", "positive", "cells", "per", "seminiferous", "tubule", "cross", "-", "section", "was", "quantified", "in", "control", "Aurka", "cHet", ",", "and", "Aurka", "cKO", "mice", ".", "Two", "technical", "replicates", "were", "performed", "per", "genotype", ",", "and", "100", "seminiferous", "tubule", "cross", "sections", "were", "analyzed", "per", "replicate", ".", "I", ".", "Representative", "images", "of", "spermatocytes", "containing", "monopolar", ",", "bipolar", ",", "and", "multipolar", "spindles", "immunolabeled", "against", "alpha", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "centromere", "(", "green", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", ".", "J", ".", "Spindle", "pole", "number", "per", "primary", "spermatocyte", "was", "quantified", "for", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", ".", "n", "=", "3", "experimental", "replicates", "with", ">", "40", "metaphase", "I", "spermatocytes", "analyzed", "per", "genotype", "in", "each", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Hematoxylin and eosin staining of 5-micron thick testis sections of adult control, Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice. Stars indicate examples of spermatocytes with condensed chromosomes. B. Percent testis to body weight ratios from control (n = 8), Plk1 cHet (n = 4), and Plk1 cKO (n = 7) adult mice.C. TUNEL staining of paraffin embedded testis sections of adult control, Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice. D. The number of TUNEL positive cells per seminiferous tubule cross-section was quantified in control Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice. Two technical replicates were performed per genotype, and 100 seminiferous tubule cross sections were analyzed per replicate.E. Hematoxylin and eosin staining of 5-micron thick testis sections of adult control, Aurka cHet, and Aurka cKO mice. Stars indicate examples of spermatocytes with condensed chromosomes. F. Percent testis to body weight ratios from control (n = 5), Aurka cHet (n = 3), and Aurka cKO (n = 5) adult mice.G. TUNEL staining of paraffin embedded testis sections of adult control, Aurka cHet, and Aurka cKO mice. H. The number of TUNEL positive cells per seminiferous tubule cross-section was quantified in control Aurka cHet, and Aurka cKO mice. Two technical replicates were performed per genotype, and 100 seminiferous tubule cross sections were analyzed per replicate.I. Representative images of spermatocytes containing monopolar, bipolar, and multipolar spindles immunolabeled against alpha-tubulin (red), centromere (green), and stained with DAPI. J. Spindle pole number per primary spermatocyte was quantified for control, Aurka cKO, Plk1 cHet, and Plk1 cKO. n = 3 experimental replicates with > 40 metaphase I spermatocytes analyzed per genotype in each experiment."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "left", "inset", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "CETN3", "foci", "per", "spermatocyte", ".", "n", "=", "30", "for", "each", "meiotic", "prophase", "substage", ".", "C", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "and", "top", "left", "insets", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "CETN3", "foci", "per", "spermatocyte", ".", "n", "=", "30", "for", "each", "meiotic", "prophase", "substage", ".", "E", ".", "Centrosome", "(", "PCNT", ")", "separation", "was", "scored", "per", "spermatocyte", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "analyzed", "with", ">", "30", "metaphase", "I", "spermatocytes", "assessed", "per", "replicate", "using", "the", "four", "centrosome", "separation", "classifications", "P", "values", "obtained", "from", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "the", "percent", "of", "unseparated", "centrosomes", "in", "each", "mouse", "mutant", "to", "control", ".", "n", ".", "s", ".", "(", "not", "significant", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Spermatocytes were immunolabeled against PCNT (red), CETN3 (green), and SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom left inset. Scale bars = 5 μm.B. Quantification of the number of CETN3 foci per spermatocyte. n = 30 for each meiotic prophase substage.C. Spermatocytes were immunolabeled against PCNT (red), CETN3 (green), and SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom and top left insets. Scale bars = 5 μm.D. Quantification of the number of CETN3 foci per spermatocyte. n = 30 for each meiotic prophase substage.E. Centrosome (PCNT) separation was scored per spermatocyte. Three biological replicates were analyzed with > 30 metaphase I spermatocytes assessed per replicate using the four centrosome separation classifications P values obtained from two-tailed Student's t-test comparing the percent of unseparated centrosomes in each mouse mutant to control. n.s. (not significant), ***P<0.001 ."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "CEP164", "(", "red", ")", ",", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "and", "top", "left", "insets", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "B", ".", "The", "percent", "of", "centrioles", "containing", "CEP164", "distal", "appendages", "was", "quantified", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "30", "total", "cells", ")", "in", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "spermatocytes", "at", "the", "pachytene", "-", "stage", "of", "meiotic", "prophase", "and", "metaphase", "I", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "gamma", "-", "tubulin", "positive", "centrosomes", "per", "metaphase", "I", "spermatocyte", ".", "Immunolabeling", "was", "performed", "on", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "≥", "20", "spermatocytes", "quantified", "per", "replicate", ".", "The", "total", "number", "of", "cells", "quantified", "for", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", "were", "137", ",", "169", ",", "198", ",", "and", "198", ",", "respectively", ".", "D", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "gamma", "-", "tubulin", "(", "green", ")", ",", "alpha", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Plk1", "and", "Aurka", "cKO", "spermatocytes", "arrest", "at", "a", "prometaphase", "stage", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "Western", "blots", "of", "gamma", "-", "tubulin", "from", "protein", "extracts", "obtained", "from", "19dpp", "and", "22dpp", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "and", "Plk1", "cKO", "spermatocytes", "(", "E", ")", ".", "Total", "protein", "stained", "with", "2", ",", "2", ",", "2", "-", "Trichloroethanol", "(", "TCE", ")", "display", "protein", "loading", ".", "Western", "blots", "of", "gamma", "-", "tubulin", "from", "Protein", "extracts", "from", "control", "and", "Plk1", "cHet", "spermatocytes", "at", "16", ",", "19", "and", "22", "dpp", "(", "F", ")", ".", "Total", "protein", "stained", "with", "2", ",", "2", ",", "2", "-", "Trichloroethanol", "(", "TCE", ")", "display", "protein", "loading", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Spermatocytes were immunolabeled against CETN3 (green), CEP164 (red), SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom and top left insets. Scale bars = 5 μm.B. The percent of centrioles containing CEP164 distal appendages was quantified from three biological replicates (n = 30 total cells) in control, Aurka cKO, Plk1 cHet, and Plk1 cKO spermatocytes at the pachytene-stage of meiotic prophase and metaphase I.C. Quantification of gamma-tubulin positive centrosomes per metaphase I spermatocyte. Immunolabeling was performed on three biological replicates, with ≥20 spermatocytes quantified per replicate. The total number of cells quantified for control, Aurka cKO, Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice were 137, 169, 198, and 198, respectively.D. Spermatocytes were immunolabeled against gamma-tubulin (green), alpha-tubulin (red), and stained with DAPI (blue). Plk1 and Aurka cKO spermatocytes arrest at a prometaphase stage. Scale bars = 5 μm.Western blots of gamma-tubulin from protein extracts obtained from 19dpp and 22dpp control, Aurka cKO, and Plk1 cKO spermatocytes (E). Total protein stained with 2,2,2-Trichloroethanol (TCE) display protein loading.Western blots of gamma-tubulin from Protein extracts from control and Plk1 cHet spermatocytes at 16, 19 and 22 dpp (F). Total protein stained with 2,2,2-Trichloroethanol (TCE) display protein loading."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "TACC3", "(", "green", ")", ",", "SYCP3", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "magenta", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Zoom", "images", "of", "the", "centrosomes", "are", "presented", "to", "the", "right", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "TACC3", "positive", "centrosomes", "per", "metaphase", "I", "spermatocyte", ".", "Immunolabeling", "was", "performed", "on", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "≥", "20", "spermatocytes", "quantified", "per", "replicate", ".", "The", "total", "number", "of", "cells", "quantified", "for", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", "were", "97", ",", "103", ",", "96", ",", "and", "105", ",", "respectively", ".", "Western", "blots", "of", "TACC3", "from", "protein", "extracts", "obtained", "from", "19dpp", "and", "22dpp", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "and", "Plk1", "cKO", "spermatocytes", "(", "D", ")", ".", "Total", "protein", "stained", "with", "2", ",", "2", ",", "2", "-", "Trichloroethanol", "(", "TCE", ")", "display", "protein", "loading", ".", "Western", "blots", "of", "TACC3", "from", "Protein", "extracts", "from", "control", "and", "Plk1", "cHet", "spermatocytes", "at", "16", ",", "19", "and", "22", "dpp", "(", "C", ")", ".", "Total", "protein", "stained", "with", "2", ",", "2", ",", "2", "-", "Trichloroethanol", "(", "TCE", ")", "display", "protein", "loading", ".", "E", ",", "F", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "beta", "-", "catenin", "(", "green", ")", ",", "SYCP3", "(", "red", ")", ",", "PCNT", "(", "magenta", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Middle", "columns", "emphasize", "beta", "-", "catenin", "signal", "in", "diplonema", "and", "diakinesis", "spermatocytes", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "beta", "-", "catenin", "positive", "centrosomes", "per", "spermatocyte", "at", "diakinesis", ".", "Immunolabeling", "was", "performed", "on", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "≥", "20", "spermatocytes", "quantified", "per", "replicate", ".", "The", "total", "number", "of", "cells", "quantified", "for", "control", ",", "Aurka", "cKO", ",", "Plk1", "cHet", ",", "and", "Plk1", "cKO", "mice", "were", "89", ",", "106", ",", "122", ",", "and", "93", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Spermatocytes were immunolabeled against TACC3 (green), SYCP3 (red), CETN3 (magenta), and stained with DAPI (blue). Zoom images of the centrosomes are presented to the right. Scale bars = 5 μm.B. Quantification of TACC3 positive centrosomes per metaphase I spermatocyte. Immunolabeling was performed on three biological replicates, with ≥20 spermatocytes quantified per replicate. The total number of cells quantified for control, Aurka cKO, Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice were 97, 103, 96, and 105, respectively.Western blots of TACC3 from protein extracts obtained from 19dpp and 22dpp control, Aurka cKO, and Plk1 cKO spermatocytes (D). Total protein stained with 2,2,2-Trichloroethanol (TCE) display protein loading.Western blots of TACC3 from Protein extracts from control and Plk1 cHet spermatocytes at 16, 19 and 22 dpp (C). Total protein stained with 2,2,2-Trichloroethanol (TCE) display protein loading.E, F. Spermatocytes were immunolabeled against beta-catenin (green), SYCP3 (red), PCNT (magenta), and stained with DAPI (blue). Middle columns emphasize beta-catenin signal in diplonema and diakinesis spermatocytes. Scale bars = 5 μm. G. Quantification of beta-catenin positive centrosomes per spermatocyte at diakinesis. Immunolabeling was performed on three biological replicates, with ≥20 spermatocytes quantified per replicate. The total number of cells quantified for control, Aurka cKO, Plk1 cHet, and Plk1 cKO mice were 89, 106, 122, and 93, respectively. "}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Spermatocytes", "were", "immunolabeled", "against", "PCNT", "(", "red", ")", ",", "CETN3", "(", "green", ")", ",", "and", "SYCP3", "(", "blue", ")", ",", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "right", "inset", ")", ".", "Zoomed", "images", "of", "the", "centrosome", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "left", "inset", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "CETN3", "foci", "per", "spermatocyte", "(", "n", "=", "30", ")", "at", "each", "meiotic", "prophase", "substage", ".", "C", ".", "Centrosome", "(", "PCNT", ")", "separation", "was", "assessed", "in", "Aurka", ";", "Plk1", "dKO", "spermatocytes", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "analyzed", "with", ">", "30", "metaphase", "I", "spermatocytes", "assessed", "per", "replicate", "using", "the", "four", "centrosome", "separation"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Spermatocytes were immunolabeled against PCNT (red), CETN3 (green), and SYCP3 (blue), and stained with DAPI (upper right inset). Zoomed images of the centrosome are shown in the bottom left inset. Scale bars = 5 μm.B. Quantification of the number of CETN3 foci per spermatocyte (n = 30) at each meiotic prophase substage.C. Centrosome (PCNT) separation was assessed in Aurka; Plk1 dKO spermatocytes. Three biological replicates were analyzed with > 30 metaphase I spermatocytes assessed per replicate using the four centrosome separation classifications"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "B", "-", "ALL", "progression", "measured", "as", "(", "A", ")", "absolute", "number", "or", "(", "B", ")", "percentage", "of", "OFP", "+", "cells", "in", "peripheral", "blood", "of", "transplanted", "mice", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ",", "CTRL", "=", "6", "mice", ",", "IFNγ", "=", "10", "mice", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ";", "mice", "in", "blue", "and", "yellow", "(", "B", ")", "were", "also", "analyzed", "by", "single", "-", "cell", "RNA", "sequencing", "(", "F", ",", "G", ")", "Percentage", "of", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "cells", "within", "OFP", "-", "BM", "cells", "(", "F", ")", "and", "maturation", "state", "(", "G", ")", "of", "CD8", "+", "lymphocytes", "(", "CD62L", "-", "CD44", "-", "double", "negative", ",", "CD62L", "-", "CD44", "+", "effector", "memory", ",", "CD62L", "+", "CD44", "-", "naive", "and", "CD62L", "+", "CD44", "+", "central", "memory", ")", "in", "the", "BM", "immune", "infiltrate", "at", "12", "-", "and", "17", "-", "days", "after", "B", "-", "ALL", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) B-ALL progression measured as (A) absolute number or (B) percentage of OFP+ cells in peripheral blood of transplanted mice (mean ± SD, each dot represents an individual mouse, CTRL = 6 mice, IFNγ = 10 mice; **** p ≤ 0.001, Two-Way ANOVA; mice in blue and yellow (B) were also analyzed by single-cell RNA sequencing(F, G) Percentage of CD4+ and CD8+ cells within OFP- BM cells (F) and maturation state (G) of CD8+ lymphocytes (CD62L-CD44- double negative, CD62L-CD44+ effector memory, CD62L+CD44- naive and CD62L+CD44+ central memory) in the BM immune infiltrate at 12- and 17-days after B-ALL (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; ** p = 0.005, **** p ≤ 0.001, Two-Way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Engraftment", "of", "CD45", ".", "2", "donor", "cells", "and", "lineage", "composition", "following", "transplantation", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "IFNγ", "receptor", "1", "knock", "out", "(", "KO", ")", "HSPCs", "transduced", "with", "either", "the", "control", "Tie2", ".", "NGFR", "(", "CTRL", ")", "or", "Tie2", ".", "IFNγ", "(", "IFNγ", ")", "LV", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ",", "WT", "CTRL", "=", "7", "mice", ",", "WT", "IFNγ", "=", "7", "mice", ",", "KO", "CTRL", "=", "7", "mice", ",", "KO", "IFNγ", "=", "7", "mice", ")", ".", "(", "C", ")", "B", "-", "ALL", "progression", "measured", "as", "absolute", "number", "of", "OFP", "+", "cells", "in", "the", "peripheral", "blood", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0286", "at", "day", "10", ";", "p", "=", "0", ".", "0174", "at", "day", "12", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ";", "Ordinary", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "OFP", "-", "CD45", "+", "BM", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Engraftment of CD45.2 donor cells and lineage composition following transplantation of wild-type (WT) or IFNγ receptor 1 knock out (KO) HSPCs transduced with either the control Tie2.NGFR (CTRL) or Tie2.IFNγ (IFNγ) LV (mean ± SD, each dot represents an individual mouse, WT CTRL = 7 mice, WT IFNγ = 7 mice, KO CTRL = 7 mice, KO IFNγ = 7 mice).(C) B-ALL progression measured as absolute number of OFP+ cells in the peripheral blood (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; * p = 0.0286 at day 10; p = 0.0174 at day 12; *** p = 0.0002; **** p ≤ 0.0001; Ordinary Two-Way ANOVA).(E) Percentage of CD8+ T lymphocytes within OFP- CD45+ BM cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ",", "C", ")", "Violin", "plots", "show", "the", "distribution", "of", "IFNγ", "(", "B", ")", "and", "MHC", "-", "II", "gene", "(", "C", ")", "signatures", "for", "each", "experimental", "condition", ",", "within", "each", "custom", "cell", "-", "type", ".", "Wilcox", "Rank", "Sum", "Test", "for", "IFNγ", "signature", ",", "condition", "IFNγ", "d12", "vs", ".", "CTR", "d12", ":", "B", "-", "ALL", "p", "=", "2", ".", "68x10", "-", "19", ",", "B", "cells", "p", "=", "0", ".", "5", ",", "plasma", "cells", "p", "=", "0", ".", "78", ";", "Wilcox", "Rank", "Sum", "Test", "for", "MHC", "-", "II", "signature", ",", "condition", "IFNγ", "d12", "vs", ".", "CTRL", "d12", ":", "B", "-", "ALL", "p", "=", "4", ".", "26x10", "-", "46", ",", "B", "cells", "p", "=", "1x10", "-", "9", ",", "plasma", "cells", "p", "=", "0", ".", "32", ".", "(", "F", ")", "Expression", "of", "Mki67", "transcripts", "in", "B", "-", "ALL", "cells", "from", "CTRL", "d12", "and", "IFNγ", "d12", "conditions", ",", "extracted", "from", "the", "scRNAseq", "dataset", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "Welch", "'", "s", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "Loss", "of", "IFNγ", "response", "over", "time", "in", "B", "-", "ALL", "cells", "from", "the", "IFNγ", "group", ",", "potentially", "facilitated", "by", "reduced", "expression", "of", "Ifngr1", ",", "Ifngr2", ",", "Jak1", ",", "Stat1", "and", "Irf1", "(", "data", "extracted", "from", "the", "scRNAseq", "dataset", "statistical", "analysis", "by", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B, C) Violin plots show the distribution of IFNγ (B) and MHC-II gene (C) signatures for each experimental condition, within each custom cell-type. Wilcox Rank Sum Test for IFNγ signature, condition IFNγ d12 vs. CTR d12: B-ALL p= 2.68x10-19, B cells p=0.5, plasma cells p= 0.78; Wilcox Rank Sum Test for MHC-II signature, condition IFNγ d12 vs. CTRL d12: B-ALL p= 4.26x10-46, B cells p=1x10-9, plasma cells p= 0.32.(F) Expression of Mki67 transcripts in B-ALL cells from CTRL d12 and IFNγ d12 conditions, extracted from the scRNAseq dataset (**** p ≤ 0.0001, Welch's test).(I) Loss of IFNγ response over time in B-ALL cells from the IFNγ group, potentially facilitated by reduced expression of Ifngr1, Ifngr2, Jak1, Stat1 and Irf1 (data extracted from the scRNAseq dataset statistical analysis by Two-Way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "6Combination", "gene", "therapy", "with", "IFNα", ",", "TNFα", "and", "IFNγ", ",", "expressed", "from", "the", "Tie2", "vector", "platform", ".", "CTRL", "(", "Tie2", ".", "NGFR", ")", ",", "2", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "9", "mice", ";", "IFNα", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "2", "mice", ";", "IFNα", "/", "IFNγ", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "IFNα", "/", "TNFα", ",", "1", "experiment", ",", "n", "=", "3", "mice", ";", "IFNγ", "/", "TNFα", ",", "2", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "19", "mice", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "MHC", "II", "+", "macrophages", "identified", "by", "F4", "/", "80", "expression", "in", "the", "spleen", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0484", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0049", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "CD45", "positive", "and", "OFP", "negative", "splenic", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0356", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "Combination", "of", "IFNγ", "gene", "therapy", "with", "immuno", "-", "oncology", "drugs", ".", "CTRL", "(", "Tie2", ".", "NGFR", ")", "+", "antibody", "isotype", ",", "n", "=", "6", "mice", ";", "CTRL", "+", "αCTLA4", "antibody", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "CTRL", "+", "αLAG3", "antibody", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "CTRL", "+", "1", "-", "Methyltryptophan", "(", "1", "-", "MT", ")", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "IFNγ", "(", "Tie2", ".", "IFNγ", ")", "+", "antibody", "isotype", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "αCTLA4", "antibody", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "αLAG3", "antibody", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "IFNγ", "+", "1", "-", "MT", ",", "n", "=", "5", "mice", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "MHC", "II", "+", "macrophages", "identified", "by", "F4", "/", "80", "expression", "in", "the", "spleen", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "0001", "as", "compared", "to", "CTRL", "isotype", ",", "ordinary", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "within", "OFP", "negative", "BM", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", ")", ".", "S"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Combination gene therapy with IFNα, TNFα and IFNγ, expressed from the Tie2 vector platform. CTRL (Tie2.NGFR), 2 independent experiments, n = 9 mice; IFNα, 1 experiment, n = 2 mice; IFNα/IFNγ, 1 experiment, n= 4 mice; IFNα/TNFα, 1 experiment, n = 3 mice; IFNγ/TNFα, 2 independent experiments, n = 19 mice. (C) Percentage of MHC II+ macrophages identified by F4/80 expression in the spleen (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; *p = 0.0484, **p = 0.0049, ordinary One-Way ANOVA). (D) Percentage of CD8+ T lymphocytes within CD45 positive and OFP negative splenic cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; *p = 0.0356, ordinary One-Way ANOVA). ( Combination of IFNγ gene therapy with immuno-oncology drugs. CTRL (Tie2.NGFR) + antibody isotype, n = 6 mice; CTRL + αCTLA4 antibody, n= 5 mice; CTRL + αLAG3 antibody, n = 5 mice; CTRL + 1-Methyltryptophan (1-MT), n = 5 mice; IFNγ (Tie2.IFNγ) + antibody isotype, n = 7 mice; IFNγ + αCTLA4 antibody, n = 7 mice; IFNγ + αLAG3 antibody, n = 7 mice; IFNγ +1-MT, n = 5 mice. (F) Percentage of MHC II+ macrophages identified by F4/80 expression in the spleen (mean ± SD, each dot represents an individual mouse; **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001 as compared to CTRL isotype, ordinary One-Way ANOVA). (G) Percentage of CD8+ T lymphocytes within OFP negative BM cells (mean ± SD, each dot represents an individual mouse). S "}
{"words": ["Figure", "1", " ", "(", "B", ")", "Fluorescence", "microscopy", "images", "of", "typical", "mouse", " ", "small", "intestinal", "organoids", "under", "different", "culture", "conditions", ".", "Lgr5", "+", " ", "intestinal", " ", "stem", "cells", "are", "labeled", "with", "GFP", ",", "which", "are", "ubiquitously", "present", ",", "restricted", "to", "the", "bottom", "of", "the", "crypts", "and", "absent", "in", "CV", ",", "ENR", "and", "EN", ",", "respectively", ".", "*", "is", "auto", "-", "fluorescence", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 (B) Fluorescence microscopy images of typical mouse small intestinal organoids under different culture conditions. Lgr5+ intestinal stem cells are labeled with GFP, which are ubiquitously present, restricted to the bottom of the crypts and absent in CV, ENR and EN, respectively. * is auto-fluorescence "}
{"words": ["Figure", "2", " ", "(", "A", ")", "Two", "row", "-", "matched", "heatmaps", "showing", "the", "relative", "change", "in", "mRNA", "expression", "(", "left", ")", "and", "protein", "expression", "(", "right", ")", "of", "significantly", "changing", "proteins", ".", "Known", "markers", "of", "intestinal", "homeostasis", "are", "highlighted", ".", "Relative", "expression", "is", "shown", "as", "log2", "fold", "change", "over", "the", "row", "mean", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (A) Two row-matched heatmaps showing the relative change in mRNA expression (left) and protein expression (right) of significantly changing proteins. Known markers of intestinal homeostasis are highlighted. Relative expression is shown as log2 fold change over the row mean "}
{"words": ["Figure", "4", " ", "(", "B", ")", "Hematoxylin", "and", "(", "Periodic", "acid", "-", "Shiff", ")", "PAS", "staining", "of", "WT", "(", "left", ")", "and", "Hnf4g", "KO", "(", "right", ")", "intestine", ".", "Nuclei", "are", "visualized", "using", "Hematoxylin", "and", "goblet", "cells", "stain", "positive", "for", "PAS", " ", " ", "(", "C", ")", "Alcian", "Blue", "and", "Nuclear", " ", "Fast", "Red", "staining", "of", "WT", "(", "left", ")", "and", "Hnf4g", "KO", "(", "right", ")", "small", "intestinal", "organoids", ".", "Cells", "are", "visualized", "using", "Nuclear", " ", "Fast", "Red", ".", "Intra", "-", "and", "extracellular", " ", "mucus", "that", "is", "produced", "in", "goblet", "cells", "stain", "positive", "for", "Alcian", "Blue", " ", " ", "(", "D", ")", "Strand", "specific", "RNA", "-", "seq", "data", ",", "Hnf4g", " ", "ChIP", "-", "seq", "in", "EN", ",", "and", "promoter", "specific", "histone", "modification", "H3K4me3", "over", "the", "Hnf4a", "locus", "is", "shown", ".", "Data", "from", "different", "organoid", "cultures", "are", "color", "coded", ".", "RNA", "-", "seq", "reads", "mapping", "to", "the", "positive", "strand", "(", "sense", "strand", ")", "are", "plotted", "in", "the", "top", "window", "of", "every", "sample", ",", "while", "RNA", "-", "seq", "reads", "that", "map", "to", "the", "negative", "strand", "are", "mirrored", "and", "shown", "in", "the", "bottom", "window", "of", "every", "sample", ".", "The", "two", "isoforms", "of", "Hnf4a", "that", "are", "expressed", "are", "shown", "in", "the", "bottom", ",", "together", "with", "the", "antisense", "transcript", "Hnf4aos", ".", "The", "\"", "phyloP30way", "\"", "track", "from", "the", "UCSC", "genome", "browser", "is", "plotted", "at", "the", "bottom", "to", "show", "sequence", "conservation", " ", " ", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "amount", "of", "goblet", "cells", "per", "villus", "for", "WT", "and", "Hnf4g", "KO", "intestine", ".", "Dots", "represent", "the", "amount", "of", "goblet", "cells", "counted", "per", "villus", ".", "(", "n", "=", "7", "to", "25", "villi", "from", "11", "WT", "mice", "and", "3", "to", "17", "villi", "from", "14", "Hnf4g", "KO", "mice", ")", ".", "P", "value", "is", "from", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (B) Hematoxylin and (Periodic acid-Shiff) PAS staining of WT (left) and Hnf4g KO (right) intestine. Nuclei are visualized using Hematoxylin and goblet cells stain positive for PAS  (C) Alcian Blue and Nuclear Fast Red staining of WT (left) and Hnf4g KO (right) small intestinal organoids. Cells are visualized using Nuclear Fast Red. Intra- and extracellular mucus that is produced in goblet cells stain positive for Alcian Blue  (D) Strand specific RNA-seq data, Hnf4g ChIP-seq in EN, and promoter specific histone modification H3K4me3 over the Hnf4a locus is shown. Data from different organoid cultures are color coded. RNA-seq reads mapping to the positive strand (sense strand) are plotted in the top window of every sample, while RNA-seq reads that map to the negative strand are mirrored and shown in the bottom window of every sample. The two isoforms of Hnf4a that are expressed are shown in the bottom, together with the antisense transcript Hnf4aos. The \"phyloP30way\" track from the UCSC genome browser is plotted at the bottom to show sequence conservation  (E) Quantification of the amount of goblet cells per villus for WT and Hnf4g KO intestine. Dots represent the amount of goblet cells counted per villus. (n = 7 to 25 villi from 11 WT mice and 3 to 17 villi from 14 Hnf4g KO mice). P value is from two-tailed Mann-Whitney U test "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Adult", "phenotypes", "of", "the", "ash1", "and", "NSD", "mutants", ".", "In", "ash122", "/", "ash121", "mutants", "(", "designated", "as", "ash1", "-", ")", "the", "loss", "of", "Abd", "-", "B", "expression", "results", "in", "partial", "transformation", "of", "abdominal", "segments", "6", "and", "5", "toward", "segments", "5", "and", "4", ",", "which", "is", "visible", "from", "the", "partial", "loss", "of", "pigmentation", "on", "tergites", "5", "and", "6", "(", "t5", "and", "t6", ")", "and", "appearance", "of", "bristles", "on", "sternite", "6", "(", "s6", ",", "marked", "with", "black", "arrows", ")", ".", "The", "loss", "of", "Ubx", "expression", "causes", "transformation", "of", "the", "third", "thoracic", "to", "the", "second", "thoracic", "segment", "visible", "as", "partial", "haltere", "(", "H", ")", "to", "wing", "and", "third", "leg", "(", "3L", ")", "to", "second", "leg", "(", "2L", ")", "transformations", ".", "The", "former", "is", "evident", "from", "the", "change", "in", "the", "haltere", "shape", "and", "the", "appearance", "of", "multiple", "bristles", "(", "black", "arrowheads", ")", ".", "The", "latter", "is", "indicated", "by", "the", "apical", "and", "pre", "-", "apical", "bristles", "(", "red", "arrows", ")", "on", "the", "tibia", "of", "the", "third", "leg", "of", "ash1", "mutants", ".", "These", "are", "normally", "present", "on", "2L", "but", "absent", "on", "3L", "(", "compare", "to", "wild", "-", "type", ")", ".", "Also", "note", "the", "appearance", "of", "additional", "hypopleural", "bristles", "on", "the", "third", "thoracic", "segment", "of", "the", "ash1", "-", "flies", "(", "red", "arrowheads", ")", ",", "which", "indicate", "its", "transformation", "towards", "the", "second", "thoracic", "segment", ".", "Phenotype", "of", "the", "NSDds46", "/", "NSDds46", "(", "NSD", "-", ")", "flies", "is", "indistinguishable", "from", "wild", "-", "type", "and", "the", "phenotype", "of", "the", "double", "ash122", ",", "NSDds46", "/", "ash122", ",", "NSDds46", "(", "ash1", "-", ",", "NSD", "-", ")", "flies", "is", "no", "more", "severe", "than", "that", "of", "the", "single", "ash122", "/", "ash121", "(", "ash1", "-", ")", "mutants", ".", "(", "D", ")", "Ubx", "expression", "in", "the", "haltere", "imaginal", "discs", ".", "The", "expression", "was", "assayed", "by", "immunostaining", "with", "antibodies", "against", "Ubx", "(", "red", ")", "and", "acetylated", "H3K18", "(", "green", ",", "positive", "control", ")", ".", "While", "ash122", "/", "ash121", "(", "ash1", "-", ")", "larvae", "show", "stochastic", "clonal", "loss", "of", "the", "Ubx", "immunostaining", "in", "haltere", "discs", "(", "yellow", "dashed", "lines", ")", ",", "Set2", "-", "larvae", "have", "uniform", "expression", "of", "Ubx", "throughout", "the", "haltere", "disc", ",", "resembling", "that", "in", "the", "wild", "-", "type", "larvae", ".", "Scale", "bars", "indicate", "100μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Adult phenotypes of the ash1 and NSD mutants. In ash122/ash121 mutants (designated as ash1-) the loss of Abd-B expression results in partial transformation of abdominal segments 6 and 5 toward segments 5 and 4, which is visible from the partial loss of pigmentation on tergites 5 and 6 (t5 and t6) and appearance of bristles on sternite 6 (s6, marked with black arrows). The loss of Ubx expression causes transformation of the third thoracic to the second thoracic segment visible as partial haltere (H) to wing and third leg (3L) to second leg (2L) transformations. The former is evident from the change in the haltere shape and the appearance of multiple bristles (black arrowheads). The latter is indicated by the apical and pre-apical bristles (red arrows) on the tibia of the third leg of ash1 mutants. These are normally present on 2L but absent on 3L (compare to wild-type). Also note the appearance of additional hypopleural bristles on the third thoracic segment of the ash1- flies (red arrowheads), which indicate its transformation towards the second thoracic segment. Phenotype of the NSDds46/NSDds46 (NSD-) flies is indistinguishable from wild-type and the phenotype of the double ash122,NSDds46/ ash122,NSDds46 (ash1-,NSD-) flies is no more severe than that of the single ash122/ash121 (ash1-) mutants.(D) Ubx expression in the haltere imaginal discs. The expression was assayed by immunostaining with antibodies against Ubx (red) and acetylated H3K18 (green, positive control). While ash122/ash121 (ash1-) larvae show stochastic clonal loss of the Ubx immunostaining in haltere discs (yellow dashed lines), Set2- larvae have uniform expression of Ubx throughout the haltere disc, resembling that in the wild-type larvae. Scale bars indicate 100μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Adult", "phenotypes", "of", "the", "ash122", "/", "ash19011", "flies", "supplemented", "with", "transgenic", "constructs", "expressing", "either", "the", "full", "-", "length", "Ash1", "(", "Ash1FL", ")", "or", "the", "truncated", "variants", "lacking", "the", "PHD", "(", "Ash1", "∆", "PHD", ")", "or", "the", "SET", "(", "Ash1", "∆", "SET", ")", "domains", ".", "Note", "the", "third", "leg", "(", "L3", ")", "to", "second", "leg", "(", "L2", ")", ",", "haltere", "(", "H", ")", "to", "wing", "(", "black", "arrows", ")", ",", "t5", "to", "t4", "and", "t6", "to", "t5", "transformations", "in", "the", "Ash1", "∆", "PHD", "and", "the", "Ash1", "∆", "SET", "but", "not", "in", "the", "Ash1FL", "flies", ".", "The", "latter", "are", "evident", "from", "the", "partial", "loss", "of", "pigmentation", "in", "t6", "and", "t5", ",", "or", "the", "appearance", "of", "small", "bristles", "(", "trichomas", ")", "on", "t6", "of", "the", "Ash1", "∆", "PHD", "and", "the", "Ash1", "∆", "SET", "flies", "in", "the", "area", "that", "is", "normally", "naked", "(", "Ash1FL", ",", "yellow", "dashed", "line", ")", ".", "(", "B", ")", "Two", "-", "fold", "dilutions", "of", "total", "nuclear", "protein", "extracts", "from", "the", "third", "instar", "larvae", "of", "the", "ash122", "/", "ash19011", "mutants", "supplemented", "with", "various", "transgenic", "constructs", "and", "wild", "type", "flies", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "with", "anti", "-", "Ash1", "antibodies", ".", "Arrowhead", "indicates", "the", "position", "of", "Ash1", "protein", ".", "Note", "that", "transgenic", "proteins", "are", "expressed", "at", "comparable", "level", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "staining", "of", "SDS", "-", "PAGE", "separated", "protein", "extracts", "from", "(", "B", ")", "was", "used", "to", "control", "the", "loading", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Adult phenotypes of the ash122/ash19011 flies supplemented with transgenic constructs expressing either the full-length Ash1 (Ash1FL) or the truncated variants lacking the PHD (Ash1∆PHD) or the SET (Ash1∆SET) domains. Note the third leg (L3) to second leg (L2), haltere (H) to wing (black arrows), t5 to t4 and t6 to t5 transformations in the Ash1∆PHD and the Ash1∆SET but not in the Ash1FL flies. The latter are evident from the partial loss of pigmentation in t6 and t5, or the appearance of small bristles (trichomas) on t6 of the Ash1∆PHD and the Ash1∆SET flies in the area that is normally naked (Ash1FL, yellow dashed line).(B) Two-fold dilutions of total nuclear protein extracts from the third instar larvae of the ash122/ash19011 mutants supplemented with various transgenic constructs and wild type flies were analyzed by western blot with anti-Ash1 antibodies. Arrowhead indicates the position of Ash1 protein. Note that transgenic proteins are expressed at comparable level.(C) Coomassie staining of SDS-PAGE separated protein extracts from (B) was used to control the loading."}
{"words": ["Figure", "3Two", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "the", "total", "protein", "extracts", "from", "the", "wild", "-", "type", ",", "ash122", "/", "ash19011", "(", "ash1", "-", ")", ",", "ash122", ",", "NSDds46", "/", "ash19011", ",", "NSDds46", "(", "ash1", "-", ",", "NSD", "-", ")", "and", "Set21", "(", "Set2", "-", ")", "larval", "brains", ",", "imaginal", "discs", "and", "salivary", "glands", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "with", "antibodies", "against", "H3K36me1", "(", "A", ")", ",", "H3K36me2", "(", "B", ")", "and", "H3K36me3", "(", "C", ")", ".", "Note", "the", "strong", "(", ">", "10", "-", "fold", ")", "reduction", "of", "H3K36me3", "signal", "in", "the", "Set2", "-", "extract", "and", "the", "slight", "(", "~", "2", "-", "fold", ")", "reduction", "of", "H3K36me1", "signal", "in", "the", "ash1", "-", "and", "ash1", "-", ",", "NSD", "-", "extracts", ".", "The", "protein", "extracts", "from", "the", "wild", "-", "type", ",", "double", "ash1", "-", ",", "NSD", "-", "and", "single", "NSD", "-", "and", "Set2", "-", "mutants", "(", "right", "panels", ")", "were", "analyzed", "together", "on", "the", "same", "membrane", ",", "however", "the", "images", "of", "the", "H3K36me1", "and", "H3K36me3", "western", "blots", "were", "modified", "to", "splice", "out", "the", "marker", "lane", "between", "the", "ash1", "-", ",", "NSD", "-", "and", "the", "Set2", "-", "extracts", ".", "Western", "blots", "with", "constitutively", "expressed", "BEAF", "-", "32", "protein", "were", "used", "as", "loading", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Two-fold serial dilutions of the total protein extracts from the wild-type, ash122/ash19011 (ash1-), ash122,NSDds46/ash19011,NSDds46 (ash1-, NSD-) and Set21 (Set2-) larval brains, imaginal discs and salivary glands were analyzed by western blot with antibodies against H3K36me1 (A), H3K36me2 (B) and H3K36me3 (C). Note the strong (>10-fold) reduction of H3K36me3 signal in the Set2- extract and the slight (~2-fold) reduction of H3K36me1 signal in the ash1- and ash1-, NSD- extracts. The protein extracts from the wild-type, double ash1-, NSD- and single NSD- and Set2- mutants (right panels) were analyzed together on the same membrane, however the images of the H3K36me1 and H3K36me3 western blots were modified to splice out the marker lane between the ash1-,NSD- and the Set2- extracts. Western blots with constitutively expressed BEAF-32 protein were used as loading controls."}
{"words": ["Figure", "4Chromatin", "from", "the", "wild", "-", "type", "(", "dark", "blue", "bars", ")", ",", "ash122", "/", "ash19011", "(", "ash1", "-", ",", "red", "bars", ")", "and", "transgenic", "ash122", "/", "ash19011", "(", "Ash1FL", ",", "light", "blue", "bars", ";", "Ash1", "∆", "PHD", ",", "green", "bars", ";", "Ash1", "∆", "SET", ",", "orange", "bars", ")", "larvae", "was", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "the", "antibodies", "against", "H3K36me1", ",", "H3K36me2", "Histograms", "show", "the", "mean", "of", "the", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "2", ")", "with", "dots", "indicating", "individual", "experimental", "results", ".", "An", "intergenic", "region", "on", "chromosome", "3R", "(", "intergenic", ")", "and", "the", "constitutively", "active", "TBP", "-", "associated", "factor", "4", "(", "Taf4", ")", "gene", "serve", "as", "controls", ".", "The", "loss", "of", "Ash1", "ChIP", "signal", "in", "the", "ash1", "-", "larvae", "indicates", "that", "the", "selected", "genes", "are", "the", "genuine", "Ash1", "binding", "sites", ".", "Chromatin", "from", "the", "wild", "-", "type", "(", "dark", "blue", "bars", ")", ",", "ash122", "/", "ash19011", "(", "ash1", "-", ",", "red", "bars", ")", "and", "transgenic", "ash122", "/", "ash19011", "(", "Ash1FL", ",", "light", "blue", "bars", ";", "Ash1", "∆", "PHD", ",", "green", "bars", ";", "Ash1", "∆", "SET", ",", "orange", "bars", ")", "larvae", "was", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "the", "antibodies", "against", "Ash1", "(", "C", ")", ".", "Histograms", "show", "the", "mean", "of", "the", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "2", ")", "with", "dots", "indicating", "individual", "experimental", "results", ".", "An", "intergenic", "region", "on", "chromosome", "3R", "(", "intergenic", ")", "and", "the", "constitutively", "active", "TBP", "-", "associated", "factor", "4", "(", "Taf4", ")", "gene", "serve", "as", "controls", ".", "The", "loss", "of", "Ash1", "ChIP", "signal", "in", "the", "ash1", "-", "larvae", "indicates", "that", "the", "selected", "genes", "are", "the", "genuine", "Ash1", "binding", "sites", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Chromatin from the wild-type (dark blue bars), ash122/ash19011 (ash1-, red bars) and transgenic ash122/ash19011 (Ash1FL, light blue bars; Ash1∆PHD, green bars; Ash1∆SET, orange bars) larvae was subjected to immunoprecipitation with the antibodies against H3K36me1 , H3K36me2 Histograms show the mean of the two independent experiments (n=2) with dots indicating individual experimental results. An intergenic region on chromosome 3R (intergenic) and the constitutively active TBP-associated factor 4 (Taf4) gene serve as controls. The loss of Ash1 ChIP signal in the ash1- larvae indicates that the selected genes are the genuine Ash1 binding sites.Chromatin from the wild-type (dark blue bars), ash122/ash19011 (ash1-, red bars) and transgenic ash122/ash19011 (Ash1FL, light blue bars; Ash1∆PHD, green bars; Ash1∆SET, orange bars) larvae was subjected to immunoprecipitation with the antibodies against Ash1 (C). Histograms show the mean of the two independent experiments (n=2) with dots indicating individual experimental results. An intergenic region on chromosome 3R (intergenic) and the constitutively active TBP-associated factor 4 (Taf4) gene serve as controls. The loss of Ash1 ChIP signal in the ash1- larvae indicates that the selected genes are the genuine Ash1 binding sites."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "The", "∆", "HisC", ";", "12xH3K36R", "and", "control", "∆", "HisC", ";", "12xWT", "flies", "show", "no", "homeotic", "transformations", "and", "are", "indistinguishable", "from", "the", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) The ∆HisC; 12xH3K36R and control ∆HisC; 12xWT flies show no homeotic transformations and are indistinguishable from the wild-type."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "Abd", "-", "B", "expression", "in", "the", "Central", "Nervous", "System", "(", "CNS", ")", "of", "stage", "16", "embryos", "was", "assayed", "by", "immunostaining", "with", "antibodies", "against", "Abd", "-", "B", "(", "red", ")", ".", "In", "the", "ash122", "/", "TM3", ",", "Sb", ",", "e", "Kr", ":", ":", "GFP", "or", "ash19011", "/", "TM3", ",", "Sb", ",", "e", "Kr", ":", ":", "GFP", "embryos", "(", "heterozygous", "control", ")", ",", "Abd", "-", "B", "is", "expressed", "in", "parasegments", "14", "to", "10", "in", "a", "gradient", "that", "recedes", "from", "the", "posterior", "to", "anterior", "parasegment", ".", "In", "the", "ash122", "/", "ash19011", "mutants", "the", "Abd", "-", "B", "gradient", "is", "much", "steeper", ",", "with", "reduced", "staining", "of", "parasegments", "13", "and", "12", "and", "at", "the", "edge", "of", "the", "detection", "in", "parasegments", "11", "-", "10", ".", "Heterozygous", "control", "and", "ash122", "/", "ash19011", "mutant", "embryos", "were", "stained", "together", "and", "separated", "by", "strong", "GFP", "expression", "(", "green", ")", "in", "the", "Bolwig", "'", "s", "organs", "(", "white", "arrows", ")", ".", "Here", "and", "in", "B", "the", "embryos", "are", "oriented", "with", "anterior", "pole", "facing", "the", "top", "and", "scaling", "bars", "correspond", "to", "50μm", ".", "(", "B", ")", "Unlike", "ash1", "mutants", ",", "embryos", "homozygous", "for", "His3", ".", "3A", ",", "His3", ".", "3B", ",", "∆", "HisC", "deletions", "and", "supplemented", "with", "12xH3K36R", "transgene", "(", "His3", ".", "2", "-", ",", "His3", ".", "3", "-", ",", "H3K36R", ")", "display", "the", "wild", "-", "type", "Abd", "-", "B", "immunostaining", "pattern", "(", "red", ")", ",", "the", "same", "as", "the", "control", "embryos", "heterozygous", "for", "His3", ".", "3A", ",", "and", "∆", "HisC", "deletions", ".", "In", "this", "experiment", ",", "immunostaining", "with", "antibodies", "against", "acetylated", "H3K18", "(", "green", ")", "served", "as", "positive", "control", ".", "(", "D", ")", "Reverse", "transcription", "and", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "measurement", "of", "Abd", "-", "B", "expression", "in", "His3", ".", "2", "-", ",", "His3", ".", "3", "-", ",", "H3K36R", "embryos", ".", "Expression", "of", "Abd", "-", "B", "in", "stage", "16", "embryos", ",", "which", "are", "homozygous", "for", "His3", ".", "3A", ",", "His3", ".", "3B", ",", "and", "∆", "HisC", "deletions", "and", "carry", "12xH3K36R", "transgene", "(", "mutant", ")", ",", "is", "not", "reduced", "compared", "to", "their", "wild", "-", "type", "counterparts", "(", "control", "1", ")", "or", "embryos", "heterozygous", "for", "His3", ".", "3A", ",", "and", "∆", "HisC", "deletions", "(", "control", "2", ")", ".", "Histograms", "show", "the", "mean", "of", "the", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "2", ")", "with", "dots", "indicating", "individual", "experimental", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The Abd-B expression in the Central Nervous System (CNS) of stage 16 embryos was assayed by immunostaining with antibodies against Abd-B (red). In the ash122/TM3, Sb, e Kr::GFP or ash19011/TM3, Sb, e Kr::GFP embryos (heterozygous control), Abd-B is expressed in parasegments 14 to 10 in a gradient that recedes from the posterior to anterior parasegment. In the ash122/ash19011 mutants the Abd-B gradient is much steeper, with reduced staining of parasegments 13 and 12 and at the edge of the detection in parasegments 11-10. Heterozygous control and ash122/ash19011 mutant embryos were stained together and separated by strong GFP expression (green) in the Bolwig's organs (white arrows). Here and in B the embryos are oriented with anterior pole facing the top and scaling bars correspond to 50μm.(B) Unlike ash1 mutants, embryos homozygous for His3.3A, His3.3B, ∆HisC deletions and supplemented with 12xH3K36R transgene (His3.2-,His3.3-,H3K36R) display the wild-type Abd-B immunostaining pattern (red), the same as the control embryos heterozygous for His3.3A, and ∆HisC deletions. In this experiment, immunostaining with antibodies against acetylated H3K18 (green) served as positive control.(D) Reverse transcription and quantitative PCR (RT-qPCR) measurement of Abd-B expression in His3.2-,His3.3-,H3K36R embryos. Expression of Abd-B in stage 16 embryos, which are homozygous for His3.3A, His3.3B, and ∆HisC deletions and carry 12xH3K36R transgene (mutant), is not reduced compared to their wild-type counterparts (control 1) or embryos heterozygous for His3.3A, and ∆HisC deletions (control 2). Histograms show the mean of the two independent experiments (n=2) with dots indicating individual experimental results."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ".", "Comparisons", "of", "RNAseq", "and", "ChIPseq", "data", ".", "Wt", "strain", "(", "A", ")", "and", "∆", "rnjA", "(", "B", ")", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "the", "relative", "RNAP", "occupancy", "at", "a", "given", "gene", "(", "normalized", "ChIPseq", "coverage", ")", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "the", "relative", "abundance", "of", "the", "transcript", "(", "normalized", "RNAseq", "coverage", ";", "each", "dot", "is", "one", "gene", ")", ".", "The", "genes", "are", "color", "-", "coded", ",", "ranging", "from", "yellow", "(", "low", "RNA", "abundance", ")", "to", "red", "(", "high", "RNA", "abundance", ")", "in", "wt", ".", "The", "∆", "rnjA", "strain", "has", "higher", "RNAP", "occupancy", "mainly", "among", "the", "genes", "with", "less", "abundant", "transcripts", ".", "The", "color", "coding", "in", "(", "B", ")", "reveals", "no", "dramatic", "overall", "changes", "in", "the", "vertical", "direction", "(", "RNA", "abundance", ")", ".", "If", "anything", ",", "some", "of", "the", "low", "abundance", "transcripts", "decreased", "further", "in", "level", "in", "the", "mutant", "strain", ".", "The", "main", "difference", "(", "mostly", "among", "the", "low", "abundance", "transcripts", ")", "is", "their", "shift", "in", "the", "horizontal", "direction", "to", "the", "right", "(", "towards", "higher", "occupancy", "with", "RNAP", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Relative", "expression", "of", "all", "sigma", "factors", "in", "wt", "(", "LK1371", ")", "versus", "ΔrnjA", "(", "LK1381", ")", ".", "Wt", "levels", "of", "each", "sigma", "factor", "were", "set", "as", "1", "(", "indicated", "with", "the", "horizontal", "line", ")", ".", "D", ".", "Sigma", "-", "dependent", "genes", "and", "correlation", "with", "expression", "of", "sigma", "factors", "(", "significantly", "changed", ")", "in", "ΔrnjA", "(", "LK1381", ")", ".", "The", "most", "down", "-", "regulated", "sigma", "factor", "was", "sigD", "and", "almost", "all", "sigD", "-", "dependent", "genes", "were", "downregulated", ".", "A", "similar", "trend", "is", "visible", "for", "the", "rest", "of", "sigma", "factors", "and", "their", "respective", "dependent", "genes", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "expression", "of", "each", "sigma", "factor", ",", "the", "y", "-", "axis", "shows", "expression", "of", "genes", "for", "each", "sigma", "regulon", ".", "The", "violet", "(", "dark", "blue", ")", "line", ":", "regression", "line", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B. Comparisons of RNAseq and ChIPseq data. Wt strain (A) and ∆rnjA (B). The x-axis shows the relative RNAP occupancy at a given gene (normalized ChIPseq coverage). The y-axis shows the relative abundance of the transcript (normalized RNAseq coverage; each dot is one gene). The genes are color-coded, ranging from yellow (low RNA abundance) to red (high RNA abundance) in wt. The ∆rnjA strain has higher RNAP occupancy mainly among the genes with less abundant transcripts. The color coding in (B) reveals no dramatic overall changes in the vertical direction (RNA abundance). If anything, some of the low abundance transcripts decreased further in level in the mutant strain. The main difference (mostly among the low abundance transcripts) is their shift in the horizontal direction to the right (towards higher occupancy with RNAP). Data represent mean values of three independent experiments.C. Relative expression of all sigma factors in wt (LK1371) versus ΔrnjA (LK1381). Wt levels of each sigma factor were set as 1 (indicated with the horizontal line).D. Sigma-dependent genes and correlation with expression of sigma factors (significantly changed) in ΔrnjA (LK1381). The most down-regulated sigma factor was sigD and almost all sigD-dependent genes were downregulated. A similar trend is visible for the rest of sigma factors and their respective dependent genes. The x-axis shows expression of each sigma factor, the y-axis shows expression of genes for each sigma regulon. The violet (dark blue) line: regression line."}
{"words": ["Figure", "2Average", "gene", "profiles", "of", "normalized", "RNA", "-", "seq", "and", "RNAP", "ChIPseq", "coverages", "from", "wt", "(", "solid", "lines", ")", "and", "∆", "rnjA", "(", "dashed", "lines", ")", "strains", "were", "plotted", "for", "gene", "classes", "I", "-", "IV", "(", "n", "=", "762", ",", "315", ",", "553", "and", "1654", "genes", ",", "respectively", ")", ".", "Open", "reading", "frames", "were", "rescaled", "to", "1", "kb", ",", "upstream", "and", "downstream", "regions", "of", "0", ".", "2", "kb", "were", "also", "included", "in", "the", "plots", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "pie", "-", "chart", "shows", "the", "overall", "distribution", "of", "class", "I", "-", "IV", "and", "other", "genes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Average gene profiles of normalized RNA-seq and RNAP ChIPseq coverages from wt (solid lines) and ∆rnjA (dashed lines) strains were plotted for gene classes I-IV (n = 762, 315, 553 and 1654 genes, respectively). Open reading frames were rescaled to 1 kb, upstream and downstream regions of 0.2 kb were also included in the plots. Data represent mean values of 3 independent experiments. The pie-chart shows the overall distribution of class I-IV and other genes."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "SIM", "of", "exponential", "B", ".", "subtilis", "cells", ".", "RNase", "J1", "was", "fused", "to", "GFP", "(", "green", ")", ",", "RNAP", "to", "mCherry", "(", "red", ")", ".", "The", "graph", "shows", "relative", "fluorescence", "intensities", "at", "the", "cell", "midsection", "(", "along", "the", "long", "axis", ")", ";", "SIM", "of", "the", "cell", "is", "below", ".", "Yellow", "indicates", "colocalization", "of", "the", "two", "proteins", ".", "B", ".", "Pull", "-", "down", "with", "RNase", "J1", "-", "8xHis", "tag", "and", "RNAP", "-", "10xHis", "tag", "and", "detection", "of", "the", "proteins", "with", "antibodies", ".", "Lanes", "1", ",", "2", "-", "RNase", "J1", "-", "8xHis", "was", "used", "to", "pull", "down", "RNAP", ";", "lanes", "3", ",", "4", "-", "RNAP", "-", "10xHis", "was", "used", "to", "pull", "down", "RNase", "J1", ";", "lanes", "5", ",", "6", "-", "purified", "proteins", "were", "used", "as", "markers", ";", "lanes", "7", ",", "8", "-", "strains", "without", "His", "-", "tagged", "proteins", "were", "used", "as", "negative", "controls", "to", "demonstrate", "the", "specificity", "of", "the", "interaction", ".", "M", ",", "molecular", "size", "marker", ";", "EX", ",", "exponential", "phase", ";", "STA", ",", "stationary", "phase", ".", "C", ".", "Pull", "-", "down", "with", "RNase", "J1", "-", "8xHis", "tag", "from", "stationary", "phase", "cells", "The", "samples", "then", "either", "were", "(", "lane", "9", ")", "or", "were", "not", "(", "lane", "10", ")", "treated", "with", "RNase", "A", "to", "detect", "whether", "the", "interaction", "was", "via", "RNA", ".", "Lanes", "11", ",", "12", "-", "purified", "proteins", "were", "used", "as", "markers", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "three", "times", "(", "biological", "replicates", ")", "with", "the", "same", "result", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. SIM of exponential B. subtilis cells. RNase J1 was fused to GFP (green), RNAP to mCherry (red). The graph shows relative fluorescence intensities at the cell midsection (along the long axis); SIM of the cell is below. Yellow indicates colocalization of the two proteins.B. Pull-down with RNase J1-8xHis tag and RNAP-10xHis tag and detection of the proteins with antibodies. Lanes 1, 2 - RNase J1-8xHis was used to pull down RNAP; lanes 3, 4 - RNAP-10xHis was used to pull down RNase J1; lanes 5, 6 - purified proteins were used as markers; lanes 7, 8 - strains without His-tagged proteins were used as negative controls to demonstrate the specificity of the interaction. M, molecular size marker; EX, exponential phase; STA, stationary phase.C. Pull-down with RNase J1-8xHis tag from stationary phase cells The samples then either were (lane 9) or were not (lane 10) treated with RNase A to detect whether the interaction was via RNA. Lanes 11, 12 - purified proteins were used as markers. The experiment was performed three times (biological replicates) with the same result."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Representative", "primary", "data", "-", "polyacrylamide", "gel", "(", "the", "experiment", "was", "performed", "3x", "with", "the", "same", "results", ")", ".", "Lane", "1", ",", "the", "full", "length", "(", "33", "nt", ")", "labeled", "RNA", ";", "lane", "2", ",", "the", "same", "as", "lane", "1", "but", "it", "included", "also", "incubation", "with", "RNase", "J1", "(", "J1", ")", ",", "17", "-", "18", "nt", "long", "fragments", "(", "RNase", "J1", "stopped", "by", "RNAP", ";", "indicated", "with", "asterisks", ")", "and", "<", "5", "nt", "fragments", "(", "RNA", "released", "from", "TC", "into", "buffer", "-", "indicative", "of", "TC", "disassembly", ")", "are", "shown", ";", "lane", "3", ",", "the", "same", "as", "lane", "1", "but", "included", "also", "incubation", "with", "RNase", "R", "(", "R", ")", ";", "lanes", "4", "and", "5", ",", "TCs", "were", "denatured", "by", "heat", "prior", "to", "RNase", "addition", "to", "demonstrate", "the", "activity", "and", "cleavage", "patterns", "of", "both", "enzymes", ";", "lanes", "6", "and", "7", ",", "the", "same", "as", "lanes", "2", "and", "3", "but", "the", "buffer", "was", "washed", "off", "(", "TCs", "were", "retained", "by", "streptavidin", "beads", ")", "to", "demonstrate", "which", "RNA", "fragments", "were", "associated", "with", "TC", ";", "lanes", "8", ",", "9", "(", "M1", ",", "M2", ")", "Mw", "marker", "generated", "by", "treating", "the", "30", "nt", "RNA", "with", "alkali", "and", "formamide", "(", "M1", "-", "4", "min", "treatment", ",", "M2", "-", "7", "min", "treatment", ")", ".", "As", "reported", "in", "(", "Costanzo", "et", "al", ".", ",", "2016", ")", "[", "and", "references", "therein", "]", ",", "the", "cleavage", "by", "alkali", "or", "formamide", "leaves", "the", "phosphate", "group", "of", "the", "attacked", "phosphodiester", "bond", "bound", "at", "3", "'", ",", "initially", "in", "the", "2", "'", ",", "3", "'", "cyclic", "form", "(", "upper", "band", "in", "the", "band", "couples", ")", ".", "This", "successively", "opens", "(", "lower", "band", "in", "the", "band", "couples", ")", "yielding", "a", "double", "-", "banded", "pattern", "for", "short", "oligoribonucleotides", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Representative primary data - polyacrylamide gel (the experiment was performed 3x with the same results). Lane 1, the full length (33 nt) labeled RNA; lane 2, the same as lane 1 but it included also incubation with RNase J1 (J1), 17-18 nt long fragments (RNase J1 stopped by RNAP; indicated with asterisks) and <5 nt fragments (RNA released from TC into buffer - indicative of TC disassembly) are shown; lane 3, the same as lane 1 but included also incubation with RNase R (R); lanes 4 and 5, TCs were denatured by heat prior to RNase addition to demonstrate the activity and cleavage patterns of both enzymes; lanes 6 and 7, the same as lanes 2 and 3 but the buffer was washed off (TCs were retained by streptavidin beads) to demonstrate which RNA fragments were associated with TC; lanes 8, 9 (M1, M2) Mw marker generated by treating the 30 nt RNA with alkali and formamide (M1-4 min treatment, M2-7 min treatment). As reported in (Costanzo et al., 2016) [and references therein], the cleavage by alkali or formamide leaves the phosphate group of the attacked phosphodiester bond bound at 3', initially in the 2',3' cyclic form (upper band in the band couples). This successively opens (lower band in the band couples) yielding a double-banded pattern for short oligoribonucleotides."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Primary", "data", "-", "polyacrylamide", "gel", "-", "a", "representative", "result", ".", "For", "description", "of", "bands", "/", "fragments", "see", "next", "panel", "legend", ".", "Asterisks", "indicate", "STUBS", "(", "16", "-", "19", "nt", ")", ".", "B", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "quantitation", "of", "fragments", ".", "OUTSIDE", "(", "16", "-", "30", "nt", ")", "are", "RNA", "fragments", "that", "originated", "by", "digestion", "of", "the", "full", "length", "RNA", "by", "RNases", "that", "were", "stopped", "either", "before", "reaching", "or", "at", "the", "point", "of", "reaching", "RNAP", ";", "STUBS", "(", "16", "-", "19", "nt", ")", "are", "RNA", "fragments", "that", "originated", "by", "digestion", "of", "the", "full", "length", "RNA", "that", "were", "stopped", "at", "the", "point", "of", "reaching", "RNAP", ";", "INSIDE", "(", "<", "16", "nt", ")", "are", "RNA", "fragments", "(", "oligonucleotides", ")", "that", "could", "be", "only", "generated", "after", "the", "disassembly", "of", "the", "complex", "by", "the", "torpedo", "mechanism", ".", "The", "red", "color", "indicates", "parts", "of", "RNA", "that", "were", "digested", ".", "C", ".", "Quantitation", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "\"", "Full", "length", "\"", "indicates", "the", "remaining", "undigested", "RNA", ".", "\"", "OUTSIDE", "\"", ",", "\"", "INSIDE", "\"", "are", "fragments", "as", "explained", "in", "(", "B", ")", "and", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "bars", "represent", "100", "%", "(", "all", "fragments", ")", ".", "The", "black", "-", "grey", "-", "white", "boxes", "indicate", "the", "percentage", "of", "each", "fragment", "group", "(", "in", "%", ")", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "±", "SEM", "for", "each", "group", "of", "fragments", "calculated", "from", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Primary data - polyacrylamide gel - a representative result. For description of bands/fragments see next panel legend. Asterisks indicate STUBS (16-19 nt). B. A schematic representation of quantitation of fragments. OUTSIDE (16-30 nt) are RNA fragments that originated by digestion of the full length RNA by RNases that were stopped either before reaching or at the point of reaching RNAP; STUBS (16-19 nt) are RNA fragments that originated by digestion of the full length RNA that were stopped at the point of reaching RNAP; INSIDE (< 16 nt) are RNA fragments (oligonucleotides) that could be only generated after the disassembly of the complex by the torpedo mechanism. The red color indicates parts of RNA that were digested. C. Quantitation of three independent experiments. \"Full length\" indicates the remaining undigested RNA. \"OUTSIDE\", \"INSIDE\" are fragments as explained in (B) and indicated in (A). The bars represent 100 % (all fragments). The black-grey-white boxes indicate the percentage of each fragment group (in %). The error bars indicate ± SEM for each group of fragments calculated from three biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "TCs", "were", "assembled", "on", "DNA", "-", "RNA", "scaffolds", "(", "DNA", "was", "biotinylated", "and", "attached", "to", "streptavidin", "coated", "magnetic", "beads", ")", ";", "TCs", "were", "then", "divided", "into", "three", "tubes", "and", "challenged", "with", "buffer", "(", "\"", "-", "\"", ",", "mock", "treatment", ")", "or", "RNase", "J1", "of", "Xrn1", ".", "Dissociation", "of", "RNAP", "from", "DNA", "was", "monitored", "by", "detecting", "RNAP", "with", "anti", "-", "β", "antibody", "in", "two", "fractions", ":", "B", "-", "beads", "(", "RNAP", "still", "bound", "to", "DNA", ")", ",", "R", "-", "released", "(", "free", "in", "buffer", ")", ".", "The", "gel", "strip", "shows", "representative", "primary", "data", "(", "Western", "blot", ")", ".", "The", "graph", "shows", "averages", "(", "the", "bars", ")", "of", "two", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", "and", "the", "error", "bars", "show", "the", "range", ".", "The", "combined", "signal", "for", "B", "+", "R", "for", "each", "treatment", "was", "set", "as", "100", "%", ".", "B", ".", "Primary", "data", "-", "polyacrylamide", "gel", ".", "RNAP", "from", "E", ".", "coli", ".", "Lane", "1", ",", "the", "full", "length", "(", "33", "nt", ")", "labeled", "RNA", ";", "lane", "2", ",", "the", "same", "as", "lane", "1", "but", "it", "included", "also", "incubation", "with", "RNase", "J1", "(", "J1", ")", ",", "lane", "3", ",", "the", "same", "as", "lane", "1", "but", "included", "also", "incubation", "with", "Xrn1", ".", "C", ".", "Quantitation", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "\"", "Full", "length", "\"", "indicates", "the", "remaining", "undigested", "RNA", ".", "\"", "OUTSIDE", "\"", ",", "\"", "INSIDE", "\"", "are", "fragments", "The", "bars", "represent", "100", "%", "(", "all", "fragments", ")", ".", "The", "black", "-", "grey", "-", "white", "boxes", "indicate", "the", "percentage", "of", "each", "fragment", "group", "(", "in", "%", ")", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "±", "SEM", "for", "each", "group", "of"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. TCs were assembled on DNA-RNA scaffolds (DNA was biotinylated and attached to streptavidin coated magnetic beads); TCs were then divided into three tubes and challenged with buffer (\"-\", mock treatment) or RNase J1 of Xrn1. Dissociation of RNAP from DNA was monitored by detecting RNAP with anti-β antibody in two fractions: B - beads (RNAP still bound to DNA), R - released (free in buffer). The gel strip shows representative primary data (Western blot). The graph shows averages (the bars) of two experiments (biological replicates) and the error bars show the range. The combined signal for B+R for each treatment was set as 100 %.B. Primary data - polyacrylamide gel. RNAP from E. coli. Lane 1, the full length (33 nt) labeled RNA; lane 2, the same as lane 1 but it included also incubation with RNase J1 (J1), lane 3, the same as lane 1 but included also incubation with Xrn1. C. Quantitation of three independent experiments. \"Full length\" indicates the remaining undigested RNA. \"OUTSIDE\", \"INSIDE\" are fragments The bars represent 100 % (all fragments). The black-grey-white boxes indicate the percentage of each fragment group (in %). The error bars indicate ± SEM for each group of fragments"}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Exponential", "cells", "of", "indicated", "strains", "(", "below", "the", "bars", ")", "were", "plated", "onto", "LB", "agar", "and", "either", "were", ",", "or", "were", "not", "UV", "-", "irradiated", ".", "After", "overnight", "incubation", ",", "CFU", "were", "counted", ".", "UV", "sensitivity", "of", "the", "mutant", "strains", "(", "KO", ")", "was", "then", "calculated", "as", "the", "ratio", "between", "irradiated", "vs", "non", "-", "irradiated", "cells", "and", "normalized", "to", "this", "ratio", "from", "the", "wt", "strain", "As", "a", "consequence", ",", "the", "wt", "ratio", "is", "1", ".", "The", "experiment", "was", "conducted", "4x", "(", "biological", "replicates", ")", "and", "the", "bars", "show", "the", "geometric", "mean", ".", "The", "p", "-", "values", ",", "shown", "above", "the", "bars", ",", "were", "computed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "for", "logarithms", "of", "the", "ratios", ".", "The", "error", "bars", "show", "±", "SEM", "(", "computed", "on", "the", "log", "scale", ")", ".", "B", ".", "Relative", "expression", "(", "mRNA", ")", "of", "helD", ",", "mfd", ",", "rho", ",", "greA", ",", "nusA", ",", "nusB", ",", "and", "nusG", "in", "the", "∆", "rnjA", "strain", "(", "normalized", "to", "wt", "[", "set", "as", "1", "]", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Exponential cells of indicated strains (below the bars) were plated onto LB agar and either were, or were not UV-irradiated. After overnight incubation, CFU were counted. UV sensitivity of the mutant strains (KO) was then calculated as the ratio between irradiated vs non-irradiated cells and normalized to this ratio from the wt strain As a consequence, the wt ratio is 1. The experiment was conducted 4x (biological replicates) and the bars show the geometric mean. The p-values, shown above the bars, were computed using two-tailed unpaired t-test for logarithms of the ratios. The error bars show ±SEM (computed on the log scale).B. Relative expression (mRNA) of helD, mfd, rho, greA, nusA, nusB, and nusG in the ∆rnjA strain (normalized to wt [set as 1])."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "Listeria", "for", "0", ".", "5", "-", "4", " ", "h", ",", "and", "lysates", "were", "analysed", "by", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "CTR", ")", "or", "infected", "with", "Listeria", "for", "1", "or", "3", " ", "h", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "mTOR", "and", "LAMP2", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "Listeria", "‐", "infected", "cells", "displaying", "mTOR", "localization", "to", "LAMP2", "+", "vesicles", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "and", "*", "*", "P0", ".", "01", "over", "uninfected", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "Listeria", "for", "0", ".", "5", "-", "4", " ", "h", ",", "and", "lysates", "were", "analysed", "by", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "qPCR", "analysis", "of", "ATF3", "induction", "following", "infection", "of", "HeLa", "cells", "with", "Listeria", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", ":", "10", " ", "μm", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) HeLa cells were infected with Listeria for 0.5-4 h, and lysates were analysed by blotting using indicated antibodies.(B) HeLa cells left unstimulated (CTR) or infected with Listeria for 1 or 3 h, analysed by IF using antibodies against mTOR and LAMP2.(C) Percentage of Listeria‐infected cells displaying mTOR localization to LAMP2+ vesicles. Values are means±s.e.m. n=3. ***P0.001 and **P0.01 over uninfected.(D, E) HeLa cells were infected with Listeria for 0.5-4 h, and lysates were analysed by blotting using indicated antibodies.(F) qPCR analysis of ATF3 induction following infection of HeLa cells with Listeria for 1-4 h. Values are means±s.e.m. n=3. Scale bars: 10 μm.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "Listeria", "wild", "‐", "type", "(", "WT", ")", "or", "the", "LLO", "/", "PlcA", "/", "PlcB", "triple", "knockout", "(", "TKO", ")", "mutant", "strain", "for", "0", ".", "5", "-", "4", " ", "h", ",", "and", "lysates", "were", "analysed", "by", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "ATF3", "and", "IL", "‐", "8", "induction", "following", "infection", "of", "HeLa", "cells", "with", "Listeria", "WT", "or", "TKO", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "CTR", ")", "or", "infected", "with", "Listeria", "TKO", "for", "1", " ", "h", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "mTOR", "and", "LAMP2", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "with", "either", "WT", "or", "TKO", "Listeria", "strains", "displaying", "one", "or", "several", "LAMP2", "+", "(", "D", ")", "or", "NDP52", "+", "(", "E", ")", "Listeria", "vesicles", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ".", "Scale", "bars", ":", "10", " ", "μm", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) HeLa cells were infected with Listeria wild‐type (WT) or the LLO/PlcA/PlcB triple knockout (TKO) mutant strain for 0.5-4 h, and lysates were analysed by blotting using indicated antibodies.(B) qPCR analysis of ATF3 and IL‐8 induction following infection of HeLa cells with Listeria WT or TKO for 1-4 h. Values are means±s.e.m. n=3.(C) HeLa cells left unstimulated (CTR) or infected with Listeria TKO for 1 h, analysed by IF using antibodies against mTOR and LAMP2.(D, E) Percentage of cells infected with either WT or TKO Listeria strains displaying one or several LAMP2+ (D) or NDP52+ (E) Listeria vesicles. Values are means±s.e.m. n=3. *P0.05; **P0.01. Scale bars: 10 μm.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "qPCR", "analysis", "of", "ATF3", "induction", "following", "infection", "of", "HeLa", "cells", "with", "WT", ",", "TKO", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "LLO", "−", "Listeria", "strains", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "WT", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "LLO", "−", "Listeria", "strains", "for", "0", ".", "5", "-", "4", " ", "h", ",", "and", "lysates", "were", "analysed", "by", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "CTR", ")", "or", "infected", "with", "WT", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "LLO", "−", "Listeria", "strains", "for", "1", " ", "h", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "mTOR", "and", "LAMP2", ".", "The", "arrow", "shows", "a", "Listeria", "vacuole", "positive", "for", "mTOR", "and", "LAMP2", ",", "and", "arrowheads", "indicate", "mTOR", "‐", "and", "LAMP2", "‐", "positive", "late", "endosomes", "or", "lysosomes", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "with", "WT", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "LLO", "−", "Listeria", "strains", "displaying", "one", "or", "several", "LAMP2", "+", "(", "D", ")", "or", "NDP52", "+", "(", "E", ")", "Listeria", "vesicles", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "with", "WT", "Listeria", ",", "in", "the", "presence", "(", "black", "bars", ")", "or", "absence", "(", "white", "bars", ")", "of", "rapamycin", ",", "displaying", "one", "or", "several", "GFP", "‐", "LC3", "+", "Listeria", "autophagosomes", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "2", ".", "Scale", "bars", ":", "5", " ", "μm", ".", "Source", "data", "for", "this", "figure", "is", "available", "on", "the", "online", "supplementary", "information", "page", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) qPCR analysis of ATF3 induction following infection of HeLa cells with WT, TKO, PlcA/B− or LLO− Listeria strains for 1-4 h. Values are means±s.e.m. n=3.(B) HeLa cells were infected with WT, PlcA/B− or LLO− Listeria strains for 0.5-4 h, and lysates were analysed by blotting using indicated antibodies.(C) HeLa cells left unstimulated (CTR) or infected with WT, PlcA/B− or LLO− Listeria strains for 1 h, analysed by IF using antibodies against mTOR and LAMP2. The arrow shows a Listeria vacuole positive for mTOR and LAMP2, and arrowheads indicate mTOR‐ and LAMP2‐positive late endosomes or lysosomes.(D, E) Percentage of cells infected with WT, PlcA/B− or LLO− Listeria strains displaying one or several LAMP2+ (D) or NDP52+ (E) Listeria vesicles. Values are means±s.e.m. n=3. **P0.01.(F) Percentage of cells infected with WT Listeria, in the presence (black bars) or absence (white bars) of rapamycin, displaying one or several GFP‐LC3+ Listeria autophagosomes. Values are means±s.e.m. n=2. Scale bars: 5 μm.Source data for this figure is available on the online supplementary information page."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "CTR", ")", "or", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ",", "or", "with", "Listeria", "TKO", "for", "4", " ", "h", "and", "with", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "NDP52", ".", "(", "B", ")", "Higher", "magnification", "view", "of", "the", "selected", "area", "from", "(", "A", ")", "showing", "that", "NDP52", "+", "granules", "generally", "form", "at", "the", "vicinity", "of", "cytosolic", "Listeria", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ",", "or", "with", "Listeria", "TKO", "for", "4", " ", "h", ",", "displaying", "one", "or", "several", "NDP52", "+", "granules", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "for", "4", " ", "h", "with", "different", "Listeria", "mutants", "as", "indicated", "displaying", "one", "or", "several", "NDP52", "+", "granules", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "infected", "with", "Listeria", "WT", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "PlcA", "/", "B", "−", "ectopically", "expressing", "PlcA", "for", "3", " ", "h", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "NDP52", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Percentage", "of", "cells", "infected", "for", "3", " ", "h", "with", "Listeria", "WT", ",", "PlcA", "/", "B", "−", "or", "PlcA", "/", "B", "−", "ectopically", "expressing", "PlcA", "displaying", "one", "or", "several", "NDP52", "+", "granules", "(", "F", ")", "or", "bacteria", "entrapped", "in", "NDP52", "+", "autophagosomes", "(", "G", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "2", ".", "Scale", "bars", ":", "5", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cells left unstimulated (CTR) or infected with Listeria WT for 1-4 h, or with Listeria TKO for 4 h and with analysed by IF using an antibody against NDP52.(B) Higher magnification view of the selected area from (A) showing that NDP52+ granules generally form at the vicinity of cytosolic Listeria.(C) Percentage of cells infected with Listeria WT for 1-4 h, or with Listeria TKO for 4 h, displaying one or several NDP52+ granules. Values are means±s.e.m. n=3.(D) Percentage of cells infected for 4 h with different Listeria mutants as indicated displaying one or several NDP52+ granules. Values are means±s.e.m. n=3.(E) HeLa cells infected with Listeria WT, PlcA/B− or PlcA/B− ectopically expressing PlcA for 3 h, analysed by IF using an antibody against NDP52.(F, G) Percentage of cells infected for 3 h with Listeria WT, PlcA/B− or PlcA/B− ectopically expressing PlcA displaying one or several NDP52+ granules (F) or bacteria entrapped in NDP52+ autophagosomes (G). Values are means±s.e.m. n=2. Scale bars: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "‐", "LC3", "and", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "4", " ", "h", "were", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "NDP52", ".", "(", "B", ")", "Murine", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "from", "WT", "or", "ATG16L1", "‐", "deficient", "(", "ATG16L1", "KO", ")", "mice", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "4", "h", "were", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "ubiquitinated", "proteins", "(", "Ubi", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "HeLa", "cells", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "4", " ", "h", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "NDP52", "and", "WIPI", "‐", "2", "(", "C", ")", "or", "Galectin", "‐", "8", "(", "Gal", "‐", "8", ")", "and", "calreticulin", "(", "D", ")", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "4", " ", "h", ",", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Wortmannin", "added", "during", "the", "last", "hour", "of", "infection", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "NDP52", "and", "WIPI", "‐", "2", ".", "Scale", "bars", ":", "5", " ", "μm", "for", "all", "panels", "except", "(", "D", ")", "(", "1", ".", "5", " ", "μm", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HeLa cells transfected with GFP‐LC3 and infected with Listeria WT for 4 h were analysed by IF using an antibody against NDP52.(B) Murine embryonic fibroblasts (MEFs) from WT or ATG16L1‐deficient (ATG16L1 KO) mice infected with Listeria WT for 4 h were analysed by IF using an antibody against ubiquitinated proteins (Ubi).(C, D) HeLa cells infected with Listeria WT for 4 h analysed by IF using antibodies against NDP52 and WIPI‐2 (C) or Galectin‐8 (Gal‐8) and calreticulin (D).(E) HeLa cells infected with Listeria WT for 4 h, in the absence or presence of Wortmannin added during the last hour of infection, analysed by IF using antibodies against NDP52 and WIPI‐2. Scale bars: 5 μm for all panels except (D) (1.5 μm)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "‐", "RFP", "‐", "LC3", "and", "either", "were", "left", "uninfected", "(", "t", "=", "0", ")", "or", "were", "infected", "with", "Listeria", "WT", "or", "PlcA", "/", "B", "−", "for", "1", "-", "4", " ", "h", ".", "GFP", "+", "RFP", "+", "and", "GFP", "−", "RFP", "+", "puncta", "appear", "yellow", "and", "red", ",", "respectively", ".", "Percentage", "of", "cells", "infected", "with", "Listeria", "WT", "or", "PlcA", "/", "B", "−", "for", "1", "-", "4", " ", "h", "displaying", "GFP", "−", "RFP", "+", "red", "puncta", "were", "quantified", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "CTR", ")", "or", "infected", "with", "Listeria", "WT", "or", "PlcA", "/", "B", "−", "for", "4", " ", "h", "were", "lysed", "and", "PI3P", "levels", "measured", "by", "competitive", "ELISA", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "‐", "PKCδ", "and", "infected", "with", "Listeria", "WT", "for", "4", " ", "h", "were", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "NDP52", ".", "The", "arrow", "indicates", "an", "NDP52", "+", "granule", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "infected", "with", "Listeria", "PlcA", "/", "B", "−", "for", "3", " ", "h", ",", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Wortmannin", "added", "during", "the", "last", "10", " ", "min", "of", "infection", ",", "analysed", "by", "IF", "using", "antibodies", "against", "NDP52", "and", "WIPI", "‐", "2", ".", "The", "arrow", "indicates", "an", "NDP52", "+", "granule", ".", "Scale", "bars", ":", "5", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) HeLa cells were transfected with GFP‐RFP‐LC3 and either were left uninfected (t=0) or were infected with Listeria WT or PlcA/B− for 1-4 h. GFP+ RFP+ and GFP− RFP+ puncta appear yellow and red, respectively. Percentage of cells infected with Listeria WT or PlcA/B− for 1-4 h displaying GFP− RFP+ red puncta were quantified. Values are means±s.e.m. n=3. **P0.01; ***P0.001.(B) HeLa cells left unstimulated (CTR) or infected with Listeria WT or PlcA/B− for 4 h were lysed and PI3P levels measured by competitive ELISA.(C) HeLa cells transfected with GFP‐PKCδ and infected with Listeria WT for 4 h were analysed by IF using an antibody against NDP52. The arrow indicates an NDP52+ granule.(D) HeLa cells infected with Listeria PlcA/B− for 3 h, in the absence or presence of Wortmannin added during the last 10 min of infection, analysed by IF using antibodies against NDP52 and WIPI‐2. The arrow indicates an NDP52+ granule. Scale bars: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "HeLa", "cells", "infected", "for", "4", " ", "h", "with", "Listeria", "WT", "expressing", "GFP", "(", "WT", "GFP", ")", ",", "Listeria", "PlcA", "/", "B", "−", "expressing", "mCherry", "(", "PlcA", "/", "B", "−", "mCherry", ")", ",", "or", "both", "Listeria", "strains", "at", "a", "1", ":", "1", "ratio", ",", "were", "analysed", "by", "IF", "using", "an", "antibody", "against", "NDP52", "(", "A", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "displaying", "NDP52", "+", "PlcA", "/", "B", "−", "mCherry", "from", "the", "experiments", "described", "in", "(", "A", ")", ",", "in", "cells", "infected", "with", "either", "PlcA", "/", "B", "−", "mCherry", "alone", "or", "WT", "GFP", "and", "PlcA", "/", "B", "−", "mCherry", "(", "co", "‐", "infection", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Murine", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "from", "WT", "or", "ATG16L1", "‐", "deficient", "(", "ATG16L1", "KO", ")", "mice", "infected", "for", "4", " ", "h", "with", "WT", "GFP", "or", "Listeria", "PlcA", "/", "B", "−", "Listeria", ",", "either", "separately", "(", "Single", ")", "or", "in", "combination", "(", "Mix", ")", "were", "lysed", "and", "colony", "forming", "units", "(", "CFUs", ")", "determined", "on", "agar", "plates", "containing", "appropriate", "selection", "markers", ".", "Each", "point", "represents", "the", "value", "from", "individual", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "P0", ".", "05", ".", "Scale", "bars", ":", "2", ".", "5", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) HeLa cells infected for 4 h with Listeria WT expressing GFP (WT GFP), Listeria PlcA/B− expressing mCherry (PlcA/B− mCherry), or both Listeria strains at a 1:1 ratio, were analysed by IF using an antibody against NDP52 (A). (B) Quantification of the percentage of cells displaying NDP52+ PlcA/B− mCherry from the experiments described in (A), in cells infected with either PlcA/B− mCherry alone or WT GFP and PlcA/B−mCherry (co‐infection). Values are means±s.e.m. n=3. **P0.01.(C) Murine embryonic fibroblasts (MEFs) from WT or ATG16L1‐deficient (ATG16L1 KO) mice infected for 4 h with WT GFP or Listeria PlcA/B− Listeria, either separately (Single) or in combination (Mix) were lysed and colony forming units (CFUs) determined on agar plates containing appropriate selection markers. Each point represents the value from individual independent experiments. **P0.01; *P0.05. Scale bars: 2.5 μm."}
{"words": ["Figure", "1METTL14", "is", "arginine", "methylated", "at", "its", "C", "-", "terminal", "IDR", "in", "cells", ".", "HEK293", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "FL", "or", "C", "-", "terminal", "IDR", "-", "truncated", "(", "1", "-", "400", ")", "METTL14", "were", "lysed", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Arginine", "methylation", "of", "immunoprecipitated", "METTL14", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "two", "different", "antibodies", "that", "recognize", "ADMA", ".", "the", "black", "triangles", "indicate", "arginine", "methylated", "-", "METTL14", ";", "open", "triangles", "indicate", "the", "immunoprecipitated", "METTL14", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1METTL14 is arginine methylated at its C-terminal IDR in cells. HEK293 cells expressing Flag-tagged FL or C-terminal IDR-truncated (1-400) METTL14 were lysed and immunoprecipitated with an anti-Flag antibody. Arginine methylation of immunoprecipitated METTL14 was analyzed by Western blot using two different antibodies that recognize ADMA. the black triangles indicate arginine methylated-METTL14; open triangles indicate the immunoprecipitated METTL14 proteins."}
{"words": ["Figure", "2The", "C", "-", "terminal", "IDR", "of", "METTL14", "is", "essential", "for", "its", "interaction", "with", "PRMT1", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "tagged", "PRMT1", "and", "Flag", "-", "tagged", "FL", "or", "C", "-", "terminal", "IDR", "-", "truncated", "(", "1", "-", "400", ")", "METTL14", ".", "IP", "was", "performed", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ",", "and", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "Knockdown", "of", "PRMT1", "expression", "reduces", "METTL14", "arginine", "methylation", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "and", "the", "siRNA", "targeting", "PRMT1", "(", "siPRMT1", ")", ".", "METTL14", "was", "immunoprecipitated", "from", "these", "cells", ",", "and", "its", "methylation", "level", "was", "detected", "by", "Western", "blot", "analysis", "using", "an", "anti", "-", "ASYM26", "antibody", ".", "*", "indicates", "the", "location", "of", "the", "IgG", "heavy", "chain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The C-terminal IDR of METTL14 is essential for its interaction with PRMT1. HEK293 cells were transfected with GFP-tagged PRMT1 and Flag-tagged FL or C-terminal IDR-truncated (1-400) METTL14. IP was performed using an anti-GFP antibody, and Western blot analysis was performed using anti-GFP and anti-Flag antibodies.Knockdown of PRMT1 expression reduces METTL14 arginine methylation. HEK293 cells were transfected with control siRNA (siCtrl) and the siRNA targeting PRMT1 (siPRMT1). METTL14 was immunoprecipitated from these cells, and its methylation level was detected by Western blot analysis using an anti-ASYM26 antibody. * indicates the location of the IgG heavy chain."}
{"words": ["Figure", "3Arginine", "methylation", "of", "the", "C", "-", "terminal", "IDR", "enhances", "the", "RNA", "methylation", "activity", "of", "the", "METTL14", "/", "METTL3", "complex", "in", "vitro", ".", "In", "vitro", "RNA", "methylation", "assays", "were", "performed", "by", "incubating", "biotin", "-", "labeled", "RNA", "substrates", "with", "METTL3", "/", "METTL14", "methyltransferase", "complexes", "containing", "WT", ",", "hypomethylated", "(", "MS023", ")", ",", "and", "arginine", "methylation", "-", "deficient", "(", "RK", ")", "mutant", "METTL14", "in", "various", "concentrations", "(", "10", "-", "100", "nM", ")", ".", "The", "methylation", "status", "of", "the", "METTL3", "/", "METTL14", "complex", "was", "confirmed", "by", "Western", "blot", "analysis", "using", "an", "anti", "-", "ADMA", "antibody", ".", "Coomassie", "staining", "shows", "the", "purification", "of", "the", "enzyme", "complex", ".", "Enzymatic", "activity", "was", "measured", "in", "counts", "per", "minute", "(", "c", ".", "p", ".", "m", ".", ")", "using", "a", "scintillation", "counter", ".", "Data", "from", "three", "replicates", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Arginine methylation of the C-terminal IDR enhances the RNA methylation activity of the METTL14/METTL3 complex in vitro. In vitro RNA methylation assays were performed by incubating biotin-labeled RNA substrates with METTL3/METTL14 methyltransferase complexes containing WT, hypomethylated (MS023), and arginine methylation-deficient (RK) mutant METTL14 in various concentrations (10-100 nM). The methylation status of the METTL3/METTL14 complex was confirmed by Western blot analysis using an anti-ADMA antibody. Coomassie staining shows the purification of the enzyme complex. Enzymatic activity was measured in counts per minute (c.p.m.) using a scintillation counter. Data from three replicates were analyzed by Student's t-test and shown as mean ± SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ns, not significant."}
{"words": ["Figure", "4Co", "-", "IP", "assays", "were", "performed", "to", "compare", "the", "interactions", "between", "METTL14", "and", "RNAPII", "in", "control", "and", "MS023", "-", "treated", "HEK293", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "either", "DMSO", "or", "MS023", "(", "1", "μM", ")", "for", "48", "h", "before", "they", "were", "lysed", ".", "IP", "was", "performed", "using", "control", "IgG", "and", "METTL14", "antibodies", ",", "respectively", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "using", "anti", "-", "RNAPII", ",", "anti", "-", "ADMA", ",", "anti", "-", "METTL14", ",", "and", "anti", "-", "METTL3", "antibodies", ".", "Co", "-", "IP", "assays", "were", "performed", "to", "examine", "the", "involvement", "of", "RNA", "in", "the", "METTL14", "-", "RNAPII", "interaction", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "either", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "RNase", "A", "to", "remove", "the", "RNA", "component", "before", "IP", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "using", "anti", "-", "RNAPII", ",", "anti", "-", "METTL3", ",", "and", "anti", "-", "METTL14", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Co-IP assays were performed to compare the interactions between METTL14 and RNAPII in control and MS023-treated HEK293 cells. Cells were treated with either DMSO or MS023 (1 μM) for 48 h before they were lysed. IP was performed using control IgG and METTL14 antibodies, respectively. Western blot analysis was performed using anti-RNAPII, anti-ADMA, anti-METTL14, and anti-METTL3 antibodies.   Co-IP assays were performed to examine the involvement of RNA in the METTL14-RNAPII interaction. Total cell lysates were either left untreated or treated with RNase A to remove the RNA component before IP. Western blot analysis was performed using anti-RNAPII, anti-METTL3, and anti-METTL14 antibodies.   "}
{"words": ["Figure", "5m6A", "levels", "are", "reduced", "in", "mESCs", "expressing", "arginine", "methylation", "-", "deficient", "(", "RK", ")", "mutant", "METTL14", ".", "The", "mRNA", "purified", "from", "WT", ",", "Mettl14", "KO", ",", "KO", "+", "WT", ",", "and", "KO", "+", "RK", "mESCs", "was", "subjected", "to", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "to", "quantify", "m6A", "levels", "(", "presented", "as", "the", "m6A", "/", "A", "ratio", ")", ".", "data", "from", "three", "independent", "replicates", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5m6A levels are reduced in mESCs expressing arginine methylation-deficient (RK) mutant METTL14. The mRNA purified from WT, Mettl14 KO, KO+WT, and KO+RK mESCs was subjected to LC-MS/MS analysis to quantify m6A levels (presented as the m6A/A ratio). data from three independent replicates were analyzed by Student's t-test and shown as mean ± SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01, ***, p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6MeRIP", "(", "m6A", "-", "IP", ")", "-", "qPCR", "assays", "were", "performed", "for", "WT", ",", "Mettl14", "KO", ",", "KO", "+", "WT", ",", "and", "KO", "+", "RK", "mESCs", "to", "validate", "the", "MeRIP", "-", "seq", "results", ".", "m6A", "-", "negative", "regions", "of", "the", "transcripts", "(", "blue", ")", "were", "included", "as", "negative", "controls", ".", ":", "In", "(", "B", ")", ",", "data", "from", "three", "independent", "replicates", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "expression", "of", "ICL", "repair", "genes", "is", "reduced", "in", "mESCs", "expressing", "arginine", "methylation", "-", "deficient", "mutant", "(", "RK", ")", "METTL14", ".", "Total", "cell", "lysates", "from", "WT", ",", "Mettl14", "KO", ",", "KO", "+", "WT", ",", "and", "KO", "+", "RK", "mESCs", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "using", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6MeRIP (m6A-IP)-qPCR assays were performed for WT, Mettl14 KO, KO+WT, and KO+RK mESCs to validate the MeRIP-seq results. m6A-negative regions of the transcripts (blue) were included as negative controls. : In (B) , data from three independent replicates were analyzed by Student's t-test and shown as mean ± SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01, ***, p < 0.001.The expression of ICL repair genes is reduced in mESCs expressing arginine methylation-deficient mutant (RK) METTL14. Total cell lysates from WT, Mettl14 KO, KO+WT, and KO+RK mESCs were subjected to Western blot analysis using the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "7mESCs", "expressing", "arginine", "methylation", "-", "deficient", "mutant", "(", "RK", ")", "METTL14", "are", "sensitive", "to", "ICL", "damage", "induced", "by", "MMC", ".", "WT", ",", "Mettl14", "KO", ",", "KO", "+", "WT", ",", "and", "KO", "+", "RK", "mESCs", "were", "treated", "with", "various", "concentrations", "of", "MMC", "for", "4", "days", "before", "cell", "viability", "was", "measured", ".", "Similar", "to", "(", "A", ")", ",", "except", "that", "mESCs", "were", "treated", "with", "cisplatin", ",", "another", "ICL", "-", "inducing", "chemical", ",", "at", "various", "concentrations", ".", "In", "both", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ",", "each", "point", "represents", "the", "average", "of", "three", "independent", "replicates", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7mESCs expressing arginine methylation-deficient mutant (RK) METTL14 are sensitive to ICL damage induced by MMC. WT, Mettl14 KO, KO+WT, and KO+RK mESCs were treated with various concentrations of MMC for 4 days before cell viability was measured.   Similar to (A), except that mESCs were treated with cisplatin, another ICL-inducing chemical, at various concentrations.   In both (A) and (B), each point represents the average of three independent replicates and error bars represent standard deviation (SD). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *, p < 0.05."}
{"words": ["Figure", "1Phenotypic", "analysis", ".", "Wild", "-", "type", ",", "uvr8", ",", "and", "rup1", "rup2", "seedlings", "were", "grown", "in", "1", "/", "2", "MS", "with", "or", "without", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "2", "weeks", ".", "Images", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ";", "scale", "bars", "=", "5", "mm", ".", "Phenotypic", "analysis", ".", "Wild", "-", "type", ",", "uvr8", ",", "and", "rup1", "rup2", "seedlings", "were", "grown", "in", "1", "/", "2", "MS", "with", "or", "without", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "2", "weeks", ".", "The", "lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "B", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "each", "plant", ")", "(", "C", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "measured", ".", "SDs", "(", "n", ">", "8", "independent", "seedlings", ")", "are", "indicated", ".", "Distribution", "of", "lateral", "root", "primordia", "stages", ".", "Seedlings", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "grown", "in", "1", "/", "2", "MS", "treatment", "with", "or", "without", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "2", "weeks", ".", "SDs", "(", "n", ">", "8", ")", "are", "indicated", ".", "GUS", "staining", "of", "seedlings", "expressing", "DR5p", ":", ":", "GUS", "transgene", "in", "the", "WT", ",", "uvr8", "and", "rup1", "rup2", "background", ".", "Seedlings", "were", "grown", "in", "1", "/", "2", "MS", "with", "or", "without", "UV", "-", "B", "for", "2", "weeks", ".", "Images", "of", "lateral", "root", "primordia", "(", "E", ")", "and", "lateral", "roots", "(", "F", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "and", "50", "μm", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Phenotypic analysis. Wild-type, uvr8, and rup1 rup2 seedlings were grown in 1/2 MS with or without UV-B (1 W/m2) for 2 weeks. Images are shown in (A); scale bars = 5 mm.Phenotypic analysis. Wild-type, uvr8, and rup1 rup2 seedlings were grown in 1/2 MS with or without UV-B (1 W/m2) for 2 weeks. The lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (B) and average length of lateral roots (each plant) (C) of the indicated genotypes were measured. SDs (n > 8 independent seedlings) are indicated.Distribution of lateral root primordia stages. Seedlings of the indicated genotypes were grown in 1/2 MS treatment with or without UV-B (1 W/m2) for 2 weeks. SDs (n > 8) are indicated.GUS staining of seedlings expressing DR5p::GUS transgene in the WT, uvr8 and rup1 rup2 background. Seedlings were grown in 1/2 MS with or without UV-B for 2 weeks. Images of lateral root primordia (E) and lateral roots (F) are shown. Scale bars = 100 and 50 μm, respectively."}
{"words": ["Figure", "2Phenotypic", "analysis", ".", "Seedlings", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "grown", "in", "1", "/", "2", "MS", "with", "the", "addition", "of", "a", "series", "of", "concentrations", "of", "NAA", "under", "continuous", "white", "light", "or", "white", "plus", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "light", "for", "2", "weeks", ".", "The", "lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "A", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "B", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "measured", ".", "UV", "-", "B", "inhibits", "the", "response", "of", "Arabidopsis", "seedlings", "to", "exogenously", "added", "NAA", "in", "a", "UVR8", "-", "dependent", "manner", ",", "since", "the", "response", "to", "NAA", "was", "not", "repressed", "in", "uvr8", ".", "Seedlings", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "grown", "in", "LD", "(", "16", "-", "h", "light", "/", "8", "-", "h", "dark", ")", "conditions", "for", "5", "days", ",", "then", "transplanted", "to", "new", "plates", "containing", "0", ".", "4", "μM", "NAA", "and", "kept", "in", "continuous", "white", "light", "or", "white", "light", "plus", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "7", "days", ".", "Images", "are", "shown", "in", "(", "C", ")", ";", "scale", "bars", "=", "2", "mm", ".", "The", "lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "D", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "E", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Phenotypic analysis. Seedlings of the indicated genotypes were grown in 1/2 MS with the addition of a series of concentrations of NAA under continuous white light or white plus UV-B (1 W/m2) light for 2 weeks. The lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (A) and average length of lateral roots (B) of the indicated genotypes were measured.UV-B inhibits the response of Arabidopsis seedlings to exogenously added NAA in a UVR8-dependent manner, since the response to NAA was not repressed in uvr8. Seedlings of the indicated genotypes were grown in LD (16-h light/ 8-h dark) conditions for 5 days, then transplanted to new plates containing 0.4 μM NAA and kept in continuous white light or white light plus UV-B (1 W/m2) for 7 days. Images are shown in (C); scale bars = 2 mm. The lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (D) and average length of lateral roots (E) of the indicated genotypes were measured."}
{"words": ["Figure", "3Phenotypic", "analysis", ".", "WT", ",", "GR", "-", "UVR8R338A", "/", "uvr8", "and", "GR", "-", "UVR8W285F", "/", "uvr8", "seedlings", "were", "grown", "in", "LD", "(", "16", "-", "h", "light", "/", "8", "-", "h", "dark", ")", "for", "5", "days", ",", "then", "transplanted", "to", "new", "medium", "with", "0", ".", "4", "μM", "NAA", "and", "with", "or", "without", "20", "μM", "DEX", "and", "kept", "in", "white", "light", "plus", "UV", "-", "B", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "7", "days", ".", "Images", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ";", "scale", "bars", "=", "2", "mm", ".", "The", "lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "B", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "C", ")", "of", "indicated", "genotypes", "were", "measured", ".", "SDs", "(", "n", ">", "8", ")", "are", "indicated", ".", "UVR8", "inhibited", "auxin", "responses", "under", "UV", "-", "B", "in", "a", "tissue", "-", "autonomous", "way", ".", "WT", "and", "uvr8", "seedlings", "grown", "in", "LD", "for", "5", "days", "were", "used", "for", "reciprocal", "grafting", ".", "Seedlings", "were", "kept", "in", "LD", "for", "7", "days", "after", "grafting", ",", "then", "transplanted", "to", "new", "medium", "containing", "0", ".", "4", "μM", "NAA", "and", "kept", "in", "UV", "-", "B", "light", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "10", "days", ".", "Images", "are", "shown", "in", "(", "D", ")", ";", "scale", "bar", "=", "2", "mm", ".", "The", "lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "E", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "F", ")", "of", "indicated", "genotypes", "were", "measured", ".", "SDs", "(", "n", ">", "8", ")", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Phenotypic analysis. WT, GR-UVR8R338A/uvr8 and GR-UVR8W285F/uvr8 seedlings were grown in LD (16-h light/ 8-h dark) for 5 days, then transplanted to new medium with 0.4 μM NAA and with or without 20 μM DEX and kept in white light plus UV-B (1 W/m2) for 7 days. Images are shown in (A); scale bars = 2 mm. The lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (B) and average length of lateral roots (C) of indicated genotypes were measured. SDs (n > 8) are indicated.UVR8 inhibited auxin responses under UV-B in a tissue-autonomous way. WT and uvr8 seedlings grown in LD for 5 days were used for reciprocal grafting. Seedlings were kept in LD for 7 days after grafting, then transplanted to new medium containing 0.4 μM NAA and kept in UV-B light (1 W/m2) for 10 days. Images are shown in (D); scale bar = 2 mm. The lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (E) and average length of lateral roots (F) of indicated genotypes were measured. SDs (n > 8) are indicated."}
{"words": ["Figure", "4Transcriptome", "analysis", "of", "gene", "expression", "regulated", "by", "auxin", ",", "UV", "-", "B", ",", "and", "UVR8", ".", "(", "A", ")", "Heat", "map", "of", "UV", "-", "B", "-", ",", "UVR8", "-", ",", "and", "auxin", "-", "regulated", "genes", ".", "The", "parameter", "measured", "by", "color", "key", "shows", "the", "Log", "-", "fold", "change", ".", "(", "B", ")", "Auxin", "signaling", "genes", "are", "up", "-", "regulated", "by", "auxin", "treatment", "but", "down", "-", "regulated", "by", "UV", "-", "B", "in", "a", "UVR8", "-", "dependent", "manner", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "analyzed", "and", "final", "Log", "fold", "-", "change", "is", "shown", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "results", "showing", "that", "UV", "-", "B", "represses", "the", "expression", "of", "auxin", "signaling", "genes", ".", "Six", "-", "day", "-", "old", "WT", "seedlings", "grown", "in", "continuous", "white", "light", "were", "transferred", "to", "UV", "-", "B", "light", "(", "2", "W", "/", "m2", ")", "for", "the", "indicated", "period", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "auxin", "signaling", "gene", "expression", "in", "wild", "-", "type", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "uvr8", ",", "and", "rup1", "rup2", "seedlings", ".", "Seedlings", "grown", "in", "continuous", "white", "light", "for", "5", "days", "were", "kept", "in", "white", "light", "(", "D", ")", "or", "transferred", "to", "white", "light", "plus", "UV", "-", "B", "(", "E", ")", "for", "1", "day", "with", "the", "addition", "of", "1", "μM", "IAA", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "qPCR", "analysis", "of", "auxin", "signaling", "gene", "expression", "in", "roots", "of", "WT", ",", "uvr8", ",", "and", "rup1", "rup2", "seedlings", ".", "Seedlings", "grown", "in", "continuous", "white", "light", "for", "12", "days", "were", "kept", "in", "white", "light", "(", "F", ")", "or", "transferred", "to", "white", "light", "plus", "UV", "-", "B", "(", "G", ")", "for", "1", "day", "with", "the", "addition", "of", "0", ".", "4", "μM", "NAA", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Transcriptome analysis of gene expression regulated by auxin, UV-B, and UVR8. (A) Heat map of UV-B-, UVR8-, and auxin-regulated genes. The parameter measured by color key shows the Log-fold change. (B) Auxin signaling genes are up-regulated by auxin treatment but down-regulated by UV-B in a UVR8-dependent manner. Three biological replicates were analyzed and final Log fold-change is shown.Quantitative RT-PCR results showing that UV-B represses the expression of auxin signaling genes. Six-day-old WT seedlings grown in continuous white light were transferred to UV-B light (2 W/m2) for the indicated period. Error bars are SD of three biological replicates.Quantitative RT-PCR analysis of auxin signaling gene expression in wild-type (Col-0), uvr8, and rup1 rup2 seedlings. Seedlings grown in continuous white light for 5 days were kept in white light (D) or transferred to white light plus UV-B (E) for 1 day with the addition of 1 μM IAA. Error bars are SD of three biological replicates.qPCR analysis of auxin signaling gene expression in roots of WT, uvr8, and rup1 rup2 seedlings. Seedlings grown in continuous white light for 12 days were kept in white light (F) or transferred to white light plus UV-B (G) for 1 day with the addition of 0.4 μM NAA. Error bars are SD of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5In", "vitro", "pull", "-", "down", "assay", "showing", "that", "UV", "-", "B", "treatment", "promotes", "the", "interaction", "between", "MYB73", "and", "UVR8", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "eluted", "and", "analyzed", "by", "probing", "immunoblots", "with", "an", "anti", "-", "His", "antibody", ".", "In", "vitro", "pull", "-", "down", "assay", "showing", "that", "UV", "-", "B", "treatment", "promotes", "the", "interaction", "between", "MYB77", "(", "B", ")", "and", "UVR8", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "eluted", "and", "analyzed", "by", "probing", "immunoblots", "with", "an", "anti", "-", "His", "antibody", ".", "BiFC", "assay", "showing", "that", "UVR8", "interacts", "with", "MYB73", "/", "MYB77", "in", "white", "light", "condition", ".", "N", ".", "benthamiana", "was", "co", "-", "transformed", "with", "MYB73", "-", "nYFP", "/", "MYB77", "-", "nYFP", "and", "cCFP", ",", "nYFP", ",", "and", "UVR8", "-", "cCFP", ",", "or", "MYB73", "-", "nYFP", "/", "MYB77", "-", "nYFP", "and", "UVR8", "-", "cCFP", ".", "BF", ",", "bright", "field", ".", "Merge", ",", "overlay", "of", "the", "YFP", "and", "bright", "field", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Co", "-", "IP", "assays", "showing", "that", "MYB73", "interact", "with", "UVR8", "in", "a", "UV", "-", "B", "-", "dependent", "manner", "in", "whole", "seedlings", "and", "roots", "Input", ":", "immunoblots", "showing", "the", "levels", "of", "UVR8", ",", "MYB73", "-", "TAP", "in", "the", "total", "protein", "extract", ".", "UVR8", "IP", ":", "the", "IP", "products", "precipitated", "by", "the", "UVR8", "antibody", ".", "Total", "proteins", "(", "Input", ")", "or", "IP", "product", "were", "probed", ",", "on", "immunoblots", ",", "with", "an", "anti", "-", "UVR8", "or", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "which", "detects", "the", "TAP", "tag", ".", "Co", "-", "IP", "assays", "showing", "that", "MYB77", "interact", "with", "UVR8", "in", "a", "UV", "-", "B", "-", "dependent", "manner", "in", "whole", "seedlings", "and", "roots", "Input", ":", "immunoblots", "showing", "the", "levels", "of", "UVR8", ",", "and", "MYB77", "-", "TAP", "in", "the", "total", "protein", "extract", ".", "UVR8", "IP", ":", "the", "IP", "products", "precipitated", "by", "the", "UVR8", "antibody", ".", "Total", "proteins", "(", "Input", ")", "or", "IP", "product", "were", "probed", ",", "on", "immunoblots", ",", "with", "an", "anti", "-", "UVR8", "or", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "which", "detects", "the", "TAP", "tag", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In vitro pull-down assay showing that UV-B treatment promotes the interaction between MYB73 and UVR8. The bound proteins were eluted and analyzed by probing immunoblots with an anti-His antibody.In vitro pull-down assay showing that UV-B treatment promotes the interaction between MYB77 (B) and UVR8. The bound proteins were eluted and analyzed by probing immunoblots with an anti-His antibody.BiFC assay showing that UVR8 interacts with MYB73/MYB77 in white light condition. N. benthamiana was co-transformed with MYB73-nYFP/MYB77-nYFP and cCFP, nYFP, and UVR8-cCFP, or MYB73-nYFP/MYB77-nYFP and UVR8-cCFP. BF, bright field. Merge, overlay of the YFP and bright field images. Scale bar = 20 μm.Co-IP assays showing that MYB73 interact with UVR8 in a UV-B-dependent manner in whole seedlings and roots Input: immunoblots showing the levels of UVR8, MYB73-TAP in the total protein extract. UVR8 IP: the IP products precipitated by the UVR8 antibody. Total proteins (Input) or IP product were probed, on immunoblots, with an anti-UVR8 or anti-Myc antibody, which detects the TAP tag.Co-IP assays showing that MYB77 interact with UVR8 in a UV-B-dependent manner in whole seedlings and roots Input: immunoblots showing the levels of UVR8 , and MYB77-TAP in the total protein extract. UVR8 IP: the IP products precipitated by the UVR8 antibody. Total proteins (Input) or IP product were probed, on immunoblots, with an anti-UVR8 or anti-Myc antibody, which detects the TAP tag."}
{"words": ["Figure", "6Phenotypic", "analysis", ".", "Seedlings", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "grown", "in", "LD", "conditions", "(", "16", "-", "h", "light", "/", "8", "-", "h", "dark", ")", "for", "5", "days", ",", "and", "then", "transplanted", "to", "new", "medium", "containing", "0", ".", "4", "μM", "NAA", "and", "kept", "in", "continuous", "white", "light", "or", "white", "plus", "UV", "-", "B", "light", "(", "1", "W", "/", "m2", ")", "for", "7", "days", ".", "Images", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ";", "scale", "bars", "=", "2", "mm", ".", "Lateral", "root", "density", "(", "number", "of", "lateral", "roots", "/", "length", "of", "primary", "root", ")", "(", "B", ")", "and", "average", "length", "of", "lateral", "roots", "(", "C", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "measured", ".", "SDs", "(", "n", ">", "8", ")", "are", "indicated", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "auxin", "signaling", "gene", "expression", "in", "roots", "of", "wild", "type", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "uvr8", ",", "myb73", "myb77", ",", "and", "myb73", "myb77", "uvr8", ".", "(", "D", ")", "Results", "under", "white", "light", "and", "(", "E", ")", "under", "white", "plus", "UV", "-", "B", "light", ".", "Seedlings", "grown", "in", "continuous", "white", "light", "for", "12", "days", "were", "kept", "in", "white", "light", "or", "transferred", "to", "white", "light", "plus", "UV", "-", "B", "for", "1", "day", "with", "the", "addition", "of", "0", ".", "4", "μM", "NAA", ",", "and", "roots", "were", "collected", "to", "analyze", "auxin", "signaling", "gene", "expression", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Phenotypic analysis. Seedlings of the indicated genotypes were grown in LD conditions (16-h light/ 8-h dark) for 5 days, and then transplanted to new medium containing 0.4 μM NAA and kept in continuous white light or white plus UV-B light (1 W/m2) for 7 days. Images are shown in (A); scale bars = 2 mm. Lateral root density (number of lateral roots/length of primary root) (B) and average length of lateral roots (C) of the indicated genotypes were measured. SDs (n > 8) are indicated.Quantitative RT-PCR analysis of auxin signaling gene expression in roots of wild type (Col-0), uvr8, myb73 myb77, and myb73 myb77 uvr8. (D) Results under white light and (E) under white plus UV-B light. Seedlings grown in continuous white light for 12 days were kept in white light or transferred to white light plus UV-B for 1 day with the addition of 0.4 μM NAA, and roots were collected to analyze auxin signaling gene expression. Error bars represent SD of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7Electrophoretic", "mobility", "-", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", "showing", "that", "MYB73", "/", "MYB77", "binds", "to", "the", "MBSI", "motif", "in", "vitro", ".", "Cold", "probe", "was", "added", "as", "a", "competitor", ".", "EMSA", "showing", "that", "MYB73", "/", "MYB77", "binds", "to", "the", "promoter", "of", "IAA19", ".", "Cold", "IAA19p", "or", "IAA19mp", "(", "MBSI", "motif", "mutated", ")", "was", "added", "as", "a", "competitor", ".", "EMSA", "results", "showing", "that", "monomeric", "UVR8", "inhibits", "the", "DNA", "-", "binding", "activity", "of", "MYB73", "(", "C", ")", "EMSA", "results", "showing", "that", "monomeric", "UVR8", "inhibits", "the", "DNA", "-", "binding", "activity", "of", "MYB77", "(", "D", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "showed", "that", "UV", "-", "B", "inhibits", "the", "DNA", "-", "binding", "activity", "of", "MYB73", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "assays", "were", "performed", "using", "transgenic", "seedlings", "expressing", "35S", ":", ":", "MYB73", "-", "TAP", ",", "treated", "with", "or", "without", "UV", "-", "B", "for", "5", "h", "before", "harvesting", "samples", ".", "Chromatin", "fragments", "(", "~", "500", "bp", ")", "were", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "Myc", "antibody", ",", "and", "the", "precipitated", "DNA", "was", "analyzed", "by", "qPCR", "using", "the", "primer", "pairs", "indicated", ".", "The", "IP", "/", "Input", "ratios", "are", "shown", "with", "SDs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "that", "UV", "-", "B", "inhibits", "the", "DNA", "-", "binding", "activity", "of", "MYB73", "in", "a", "UVR8", "-", "dependent", "manner", ".", "The", "IP", "/", "Input", "ratios", "are", "shown", "with", "SDs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "that", "UV", "-", "B", "inhibits", "the", "DNA", "-", "binding", "activity", "of", "MYB73", "in", "roots", "(", "G", ")", "in", "a", "UVR8", "-", "dependent", "manner", "(", "H", ")", ".", "The", "IP", "/", "Input", "ratios", "are", "shown", "with", "SDs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "that", "UV", "-", "B", "inhibits", "MYB77", "from", "binding", "to", "the", "indicated", "promoters", "in", "a", "UVR8", "-", "dependent", "manner", ".", "The", "IP", "/", "Input", "ratios", "are", "shown", "with", "SDs", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Electrophoretic mobility-shift assay (EMSA) showing that MYB73/MYB77 binds to the MBSI motif in vitro. Cold probe was added as a competitor.EMSA showing that MYB73/MYB77 binds to the promoter of IAA19. Cold IAA19p or IAA19mp (MBSI motif mutated) was added as a competitor.EMSA results showing that monomeric UVR8 inhibits the DNA-binding activity of MYB73(C)EMSA results showing that monomeric UVR8 inhibits the DNA-binding activity of MYB77(D).ChIP-qPCR analysis showed that UV-B inhibits the DNA-binding activity of MYB73. ChIP-qPCR assays were performed using transgenic seedlings expressing 35S::MYB73-TAP, treated with or without UV-B for 5 h before harvesting samples. Chromatin fragments (~500 bp) were immunoprecipitated by anti-Myc antibody, and the precipitated DNA was analyzed by qPCR using the primer pairs indicated. The IP/Input ratios are shown with SDs (n=3). ChIP-qPCR showing that UV-B inhibits the DNA-binding activity of MYB73 in a UVR8-dependent manner. The IP/Input ratios are shown with SDs (n=3).ChIP-qPCR showing that UV-B inhibits the DNA-binding activity of MYB73 in roots (G) in a UVR8-dependent manner (H). The IP/Input ratios are shown with SDs (n=3).ChIP-qPCR showing that UV-B inhibits MYB77 from binding to the indicated promoters in a UVR8-dependent manner. The IP/Input ratios are shown with SDs (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2Immunoblot", "with", "anti", "-", "HA", "Abs", "of", "lysates", "from", "parental", "(", "Ctrl", ")", "and", "tagged", "lines", "(", "TgCRMPa", "-", "HA3", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", ")", "together", "with", "inducible", "-", "knockdown", "lines", "(", "TgCRMPa", "-", "HA3", "_", "iKD", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "_", "iKD", ")", "treated", "with", "ATc", "for", "0", ",", "24", "or", "48h", ".", "TgROP5", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Two", "close", "bands", "around", "300kDa", "were", "detected", "for", "TgCRMPa", ".", "A", "~", "820kDa", "protein", ",", "corresponding", "to", "the", "predicted", "size", "for", "TgCRMPb", ",", "was", "observed", "together", "with", "a", "~", "130kDa", "band", ".", "Quantification", "of", "microneme", "secretion", "in", "TgCRMPa", "-", "and", "TgCRMPb", "-", "depleted", "tachyzoites", "was", "measured", "by", "detecting", "the", "processed", "form", "(", "arrowhead", ")", "of", "TgMIC2", "(", "arrow", ")", "in", "the", "media", ".", "Control", ",", "TgCRMPa", "_", "iKD", "and", "TgCRMPb", "_", "iKD", "parasites", ",", "ATc", "-", "treated", "(", "+", ")", "and", "untreated", "(", "-", ")", ",", "were", "stimulated", "with", "propranolol", "to", "release", "microneme", "contents", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "anti", "-", "MIC2", "(", "secretion", "of", "micronemes", ")", "and", "anti", "-", "GRA3", "(", "constitutive", "secretion", "of", "dense", "granules", ")", ".", "P", ":", "Parasites", "pellet", ".", "Sup", ":", "Supernatant", "from", "untreated", "parasites", ".", "Sup", "+", "Prop", ":", "Supernatant", "from", "parasites", "treated", "with", "propranolol", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunoblot with anti-HA Abs of lysates from parental (Ctrl) and tagged lines (TgCRMPa-HA3 and TgCRMPb-HA3) together with inducible-knockdown lines (TgCRMPa-HA3_iKD and TgCRMPb-HA3_iKD) treated with ATc for 0, 24 or 48h. TgROP5 was used as loading control. Two close bands around 300kDa were detected for TgCRMPa. A ~820kDa protein, corresponding to the predicted size for TgCRMPb, was observed together with a ~130kDa band.Quantification of microneme secretion in TgCRMPa- and TgCRMPb-depleted tachyzoites was measured by detecting the processed form (arrowhead) of TgMIC2 (arrow) in the media. Control, TgCRMPa_iKD and TgCRMPb_iKD parasites, ATc-treated (+) and untreated (-), were stimulated with propranolol to release microneme contents. Blots were probed with anti-MIC2 (secretion of micronemes) and anti-GRA3 (constitutive secretion of dense granules). P: Parasites pellet. Sup: Supernatant from untreated parasites. Sup+Prop: Supernatant from parasites treated with propranolol. The results are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "TgCRMPa", "and", "TgCRMPb", ".", "Lysates", "from", "parasites", "co", "-", "expressing", "TgCRMPa", "-", "FLAG3", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "were", "split", "and", "incubated", "with", "either", "anti", "-", "FLAG", "(", "left", "panels", ")", "or", "anti", "-", "HA", "beads", "(", "right", "panels", ")", ".", "Eluates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "FLAG", "Abs", ".", "Untagged", ",", "TgCRMPa", "-", "FLAG3", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "parasites", "were", "used", "as", "controls", ".", "TgCRMPs", "robustly", "associate", "with", "each", "other", ".", "Quantification", "of", "microneme", "secretion", "in", "control", "and", "Tg277910", "-", "depleted", "tachyzoites", "was", "measured", "as", "in", "Fig", "2H", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "anti", "-", "MIC2", "(", "secretion", "of", "micronemes", ")", "and", "anti", "-", "GRA3", "(", "constitutive", "secretion", "of", "dense", "granules", ")", ".", "P", ":", "Parasites", "pellet", ".", "Sup", ":", "Supernatant", "from", "untreated", "parasites", ".", "Sup", "+", "Prop", ":", "Supernatant", "from", "parasites", "treated", "with", "propranolol", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Co-immunoprecipitation of TgCRMPa and TgCRMPb. Lysates from parasites co-expressing TgCRMPa-FLAG3 and TgCRMPb-HA3 were split and incubated with either anti-FLAG (left panels) or anti-HA beads (right panels). Eluates were subjected to SDS-PAGE and immunoblotted with anti-HA and anti-FLAG Abs. Untagged, TgCRMPa-FLAG3 and TgCRMPb-HA3 parasites were used as controls. TgCRMPs robustly associate with each other.Quantification of microneme secretion in control and Tg277910-depleted tachyzoites was measured as in Fig 2H. Blots were probed with anti-MIC2 (secretion of micronemes) and anti-GRA3 (constitutive secretion of dense granules). P: Parasites pellet. Sup: Supernatant from untreated parasites. Sup+Prop: Supernatant from parasites treated with propranolol. The results are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5Immunofluorescence", "images", "of", "extracellular", "tachyzoites", "of", "untagged", ",", "TgCRMPa", "-", "HA3", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "parasites", ",", "incubated", "either", "with", "host", "cell", "monolayers", "for", "2min", ",", "or", "with", "ionophore", "A23187", ",", "to", "induce", "natural", "or", "artificial", "conoid", "extrusion", ",", "respectively", ".", "Parasites", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "HA", "Abs", ";", "DNA", "was", "labeled", "by", "Hoechst", ".", "CRMPa", "and", "CRMPb", "consistently", "accumulate", "at", "the", "tip", "of", "extruded", "conoids", "(", "arrows", ")", ".", "The", "apexes", "of", "A23187", "-", "treated", "parasites", "were", "magnified", "on", "the", "right", ",", "and", "increased", "in", "brightness", "and", "contrast", "to", "highlight", "the", "apical", "dots", ".", "DIC", ":", "differential", "interference", "contrast", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "pattern", "upon", "A23187", "treatment", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "parasites", "showing", "(", "dot", ")", "or", "lacking", "(", "no", "dot", ")", "the", "apical", "accumulation", "of", "TgCRMPa", "and", "TgCRMPb", ";", "n", "=", "number", "of", "parasites", "analyzed", "per", "line", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "extracellular", "TgCRMPb", "-", "HA3", "tachyzoites", "in", "presence", "(", "-", "ATc", ")", "or", "absence", "(", "+", "48h", "ATc", ")", "of", "TgCRMPa", "-", "FLAG3", "(", "iKD", "line", ")", ".", "Parasites", "were", "stained", "with", "anti", "-", "HA", "Abs", "to", "visualize", "CRMPb", ".", "TgCRMPb", "localization", "at", "the", "tip", "of", "the", "extruded", "conoid", "(", "arrow", ")", "disappears", "upon", "TgCRMPa", "depletion", ",", "but", "it", "is", "still", "detected", "in", "the", "cytoplasm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "DNA", "is", "labeled", "by", "Hoechst", ".", "Single", "focal", "planes", "are", "shown", ".", "DIC", ":", "differential", "interference", "contrast", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "pattern", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "values", "are", "reported", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "TIR1", "-", "expressing", "parental", "line", "(", "Ctrl", ")", ",", "HA3", "-", "miniAID", "-", "TgCRMPa", "_", "iKD", "(", "N", "-", "term", ")", "and", "TgCRMPa", "-", "miniAID", "-", "HA3", "_", "iKD", "(", "C", "-", "term", ")", "lines", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "HA", "Abs", "to", "visualize", "tagged", "CRMPa", "in", "IAA", "-", "treated", "and", "untreated", "samples", ".", "CRMPa", "was", "undetectable", "upon", "24h", "incubation", "with", "IAA", "when", "C", "-", "terminally", ",", "but", "not", "N", "-", "terminally", ",", "tagged", "with", "the", "miniAID", "-", "HA3", ",", "suggesting", "that", "the", "C", "-", "terminus", "is", "the", "one", "exposed", "towards", "the", "cytosol", ".", "TgMIC2", "was", "used", "as", "loading", "control", "and", "detected", "with", "anti", "-", "MIC2", "Abs", ".", "MW", ":", "molecular", "weight", "standards", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "extracellular", "A23187", "-", "treated", "parasites", "expressing", "either", "N", "-", "or", "C", "-", "terminally", "HA3", "-", "tagged", "TgCRMPa", ",", "and", "immunostained", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "TgCRMPa", "accumulates", "at", "the", "tip", "of", "extruded", "conoids", "(", "arrows", ")", "in", "triton", "-", "permeabilized", "(", "+", ")", "or", "non", "-", "permeabilized", "(", "-", ")", "parasites", ".", "DIC", ":", "differential", "interference", "contrast", ".", "Single", "focal", "planes", "are", "shown", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "pattern", "upon", "natural", "(", "+", "H", "F", "Fibroblasts", ")", "or", "artificial", "(", "+", "A23187", ")", "conoid", "extrusion", "in", "parasites", "expressing", "either", "N", "-", "or", "C", "-", "terminally", "HA3", "-", "tagged", "TgCRMPa", ".", "Values", "are", "reported", "as", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunofluorescence images of extracellular tachyzoites of untagged, TgCRMPa-HA3 and TgCRMPb-HA3 parasites, incubated either with host cell monolayers for 2min, or with ionophore A23187, to induce natural or artificial conoid extrusion, respectively. Parasites were immunostained with anti-HA Abs; DNA was labeled by Hoechst. CRMPa and CRMPb consistently accumulate at the tip of extruded conoids (arrows). The apexes of A23187-treated parasites were magnified on the right, and increased in brightness and contrast to highlight the apical dots. DIC: differential interference contrast. Quantification of the dot pattern upon A23187 treatment shown in (A). Values are expressed as percentage of parasites showing (dot) or lacking (no dot) the apical accumulation of TgCRMPa and TgCRMPb; n= number of parasites analyzed per line.Immunofluorescence images of extracellular TgCRMPb-HA3 tachyzoites in presence (-ATc) or absence (+48h ATc) of TgCRMPa-FLAG3 (iKD line). Parasites were stained with anti-HA Abs to visualize CRMPb. TgCRMPb localization at the tip of the extruded conoid (arrow) disappears upon TgCRMPa depletion, but it is still detected in the cytoplasm (lower panel). DNA is labeled by Hoechst. Single focal planes are shown. DIC: differential interference contrast.   Quantification of the dot pattern shown in (C). The values are reported as in (B).  Whole cell lysates from TIR1-expressing parental line (Ctrl), HA3-miniAID-TgCRMPa_iKD (N-term) and TgCRMPa-miniAID-HA3_iKD (C-term) lines were immunoblotted with anti-HA Abs to visualize tagged CRMPa in IAA-treated and untreated samples. CRMPa was undetectable upon 24h incubation with IAA when C-terminally, but not N-terminally, tagged with the miniAID-HA3, suggesting that the C-terminus is the one exposed towards the cytosol. TgMIC2 was used as loading control and detected with anti-MIC2 Abs. MW: molecular weight standards.Immunofluorescence images of extracellular A23187-treated parasites expressing either N-or C-terminally HA3-tagged TgCRMPa, and immunostained as in (A). TgCRMPa accumulates at the tip of extruded conoids (arrows) in triton-permeabilized (+) or non-permeabilized (-) parasites. DIC: differential interference contrast. Single focal planes are shown.   Quantification of the dot pattern upon natural (+H F Fibroblasts) or artificial (+A23187) conoid extrusion in parasites expressing either N- or C-terminally HA3-tagged TgCRMPa. Values are reported as in (B).  "}
{"words": ["Figure", "6Ultrastructure", "Expansion", "Microscopy", "of", "extracellular", "tachyzoites", ",", "either", "untagged", "or", "co", "-", "expressing", "TgCRMPa", "-", "HA3", "/", "TgCRMPa", "-", "TY2", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "together", "or", "in", "pairwise", "combination", "with", "TgNd6", "-", "TY2", ".", "Parasites", "were", "treated", "with", "A23187", "prior", "to", "fixation", "and", "preparation", "for", "U", "-", "ExM", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "TY", "and", "anti", "-", "α", "/", "β", "tubulin", "Abs", "to", "label", "CRMPs", ",", "Nd6", "/", "CRMPa", "and", "microtubules", ",", "respectively", ".", "Shown", "are", "maximum", "intensity", "projections", "of", "z", "-", "stack", "confocal", "images", ".", "CRMPs", "overlap", "with", "Nd6", "at", "the", "tip", "of", "the", "extruded", "conoid", "(", "yellow", "selection", ")", ".", "A", "magnified", "image", "of", "the", "apical", "tip", "of", "each", "parasite", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Extent", "of", "colocalization", "between", "TgCRMPa", "-", "TY2", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", ",", "and", "TgCRMPs", "-", "HA3", "with", "TgNd6", "-", "TY2", "in", "the", "apical", "dot", "shown", "in", "B", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "was", "measured", "using", "the", "Fiji", "-", "JACoP", "plugin", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "-", "five", "parasites", "per", "line", "were", "analyzed", ".", "Quantification", "of", "the", "dot", "pattern", "for", "TgCRMPa", "-", "HA3", "and", "TgCRMPb", "-", "HA3", "in", "TgNd9", "_", "iKD", "lines", ".", "CRMPs", "accumulation", "at", "the", "apical", "tip", "of", "extracellular", "parasites", "was", "measured", "as", "in", "Fig", "EV4A", ".", "TgCRMPs", "were", "still", "found", "in", "the", "apical", "dot", "in", "absence", "of", "TgNd9", "(", "+", "ATc", ")", ".", "Numbers", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "parasites", "showing", "(", "dot", ")", "or", "lacking", "(", "no", "dot", ")", "the", "tip", "accumulation", "of", "TgCRMPa", "and", "TgCRMPb", ".", "The", "number", "of", "parasites", "(", "n", ")", "analyzed", "for", "each", "line", "is", "reported", "at", "the", "top", "of", "the", "column", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Ultrastructure Expansion Microscopy of extracellular tachyzoites, either untagged or co-expressing TgCRMPa-HA3/TgCRMPa-TY2 and TgCRMPb-HA3 together or in pairwise combination with TgNd6-TY2. Parasites were treated with A23187 prior to fixation and preparation for U-ExM, and stained with anti-HA, anti-TY and anti-α/β tubulin Abs to label CRMPs, Nd6/CRMPa and microtubules, respectively. Shown are maximum intensity projections of z-stack confocal images. CRMPs overlap with Nd6 at the tip of the extruded conoid (yellow selection). A magnified image of the apical tip of each parasite is shown on the right.Extent of colocalization between TgCRMPa-TY2 and TgCRMPb-HA3, and TgCRMPs-HA3 with TgNd6-TY2 in the apical dot shown in B. Pearson's correlation coefficient was measured using the Fiji-JACoP plugin. Values are expressed as mean ± SD. Three-five parasites per line were analyzed. Quantification of the dot pattern for TgCRMPa-HA3 and TgCRMPb-HA3 in TgNd9_iKD lines. CRMPs accumulation at the apical tip of extracellular parasites was measured as in Fig EV4A. TgCRMPs were still found in the apical dot in absence of TgNd9 (+ATc). Numbers are expressed as percentage of parasites showing (dot) or lacking (no dot) the tip accumulation of TgCRMPa and TgCRMPb. The number of parasites (n) analyzed for each line is reported at the top of the column."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "B", ")", "Western", "-", "Blotting", "(", "WB", ")", "of", "p53", "-", "negative", "lung", "cancer", "H1299", "cells", "stably", "expressing", "(", "A", ")", "or", "transiently", "expressing", "(", "B", ")", "the", "indicated", "constructs", ".", "Post", "-", "translationally", "modified", "Δ133p53", "and", "Δ160p53", "isoforms", "are", "indicated", "with", "*", ".", "(", "C", ")", "The", "same", "WB", "membrane", "containing", "lysates", "from", "R273Hp53", "-", "expressing", "A431cells", "was", "incubated", "with", "rabbit", "polyclonal", "CM", "-", "1", "antibody", "and", "mouse", "monoclonal", "1801", "antibody", "against", "the", "N", "-", "terminus", "of", "p53", ".", "Detection", "using", "anti", "-", "rabbit", "IRDye", "680LT", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "mouse", "IRDye", "800CW", "(", "green", ")", "secondary", "antibodies", "confirmed", "that", "the", "Δ160p53", "band", "corresponds", "to", "a", "C", "-", "terminal", "isoform", "of", "p53", ".", "(", "D", ")", "WB", "of", "H1299", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "constructs", ".", "(", "E", ")", "WB", "of", "cell", "lines", "expressing", "wild", "-", "type", "(", "HCT116", ",", "U2OS", ",", "A549", ")", "or", "mutant", "(", "SW480", "[", "R273H", "/", "P309S", "]", ",", "MDAMB231", "[", "R280K", "]", ",", "A431", "[", "R273H", "]", ",", "HT29", "[", "R273H", "]", "and", "SKBR3", "[", "R175H", "]", ")", "p53", ".", "(", "F", ")", "Cell", "lines", "harbouring", "endogenous", "wild", "-", "type", "(", "A549", ")", "or", "R273H", "mutant", "(", "A431", ")", "p53", "were", "treated", "or", "not", "with", "control", "siRNA", "(", "ctl", ")", "or", "siRNA", "targeting", "both", "p53", "transcripts", "(", "ex6", "and", "ex7", ")", ",", "full", "-", "length", "mRNA", "only", "(", "ex2", "/", "3", ")", "or", "Δ133p53", "mRNA", "only", "(", "in4", ")", "before", "lysis", "and", "WB", ".", "(", "G", ")", "WB", "of", "H1299", "cells", "stably", "expressing", "R273Hp53", "and", "treated", "with", "DMSO", ",", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "or", "mRNA", "translation", "inhibitor", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", ".", "Shown", "are", "representative", "data", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "numbers", "in", "parenthesis", "indicate", "the", "amounts", "of", "protein", "for", "the", "indicated", "bands", "according", "to", "WB", "quantifications", "and", "normalization", "against", "α", "-", "tubulin", "or", "GAPDH", "and", "relative", "to", "the", "value", "indicated", "in", "bold", "and", "set", "to", "1", ".", "0", ".", "In", "WBs", "for", "endogenous", "p53", "cell", "lines", "the", "Δ160", "lane", "is", "used", "as", "a", "marker", "lane", "showing", "Δ160p53", "as", "transiently", "expressed", "in", "p53", "-", "null", "H1299", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-B) Western-Blotting (WB) of p53-negative lung cancer H1299 cells stably expressing (A) or transiently expressing (B) the indicated constructs. Post-translationally modified Δ133p53 and Δ160p53 isoforms are indicated with *.(C) The same WB membrane containing lysates from R273Hp53-expressing A431cells was incubated with rabbit polyclonal CM-1 antibody and mouse monoclonal 1801 antibody against the N-terminus of p53. Detection using anti-rabbit IRDye 680LT (red) and anti-mouse IRDye 800CW (green) secondary antibodies confirmed that the Δ160p53 band corresponds to a C-terminal isoform of p53.(D) WB of H1299 cells transiently expressing the indicated constructs.(E) WB of cell lines expressing wild-type (HCT116, U2OS, A549) or mutant (SW480 [R273H/P309S], MDAMB231 [R280K], A431 [R273H], HT29 [R273H] and SKBR3 [R175H]) p53.(F) Cell lines harbouring endogenous wild-type (A549) or R273H mutant (A431) p53 were treated or not with control siRNA (ctl) or siRNA targeting both p53 transcripts (ex6 and ex7), full-length mRNA only (ex2/3) or Δ133p53 mRNA only (in4) before lysis and WB.(G) WB of H1299 cells stably expressing R273Hp53 and treated with DMSO, proteasome inhibitor MG132 or mRNA translation inhibitor cycloheximide (CHX). Shown are representative data of three independent experiments. The numbers in parenthesis indicate the amounts of protein for the indicated bands according to WB quantifications and normalization against α-tubulin or GAPDH and relative to the value indicated in bold and set to 1.0. In WBs for endogenous p53 cell lines the Δ160 lane is used as a marker lane showing Δ160p53 as transiently expressed in p53-null H1299 cells."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Cell", "lines", "endogenously", "expressing", "mutant", "R273Hp53", "(", "A431", "and", "HT29", ")", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "(", "ctl", ")", "or", "siRNA", "targeting", "exon", "7", "of", "p53", ",", "submitted", "to", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "stress", "by", "exposure", "to", "thapsigargin", "(", "Th", ")", "and", "then", "analysed", "for", "apoptosis", "by", "incubation", "with", "propidium", "-", "iodide", "(", "PI", ")", "and", "FACS", "analysis", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "si", "ctl", "condition", ",", "which", "was", "set", "to", "100", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "A549", "(", "B", ")", "lung", "cancer", "cell", "lines", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "were", "counted", "with", "Trypan", "blue", "for", "several", "days", "following", "stress", "stimuli", "(", "over", "-", "confluency", "(", "O", "-", "C", ")", "for", "A549", ")", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "1st", "day", "values", ".", "Δ160p53", "shows", "similar", "pro", "-", "proliferative", "capacities", "as", "mutant", "R273Hp53", ".", "On", "the", "other", "hand", "R273Hp53", "lost", "pro", "-", "proliferative", "functions", "when", "deficient", "for", "Δ160p53", "expression", "(", "M160AR273Hp53", ")", ".", "Also", "shown", "is", "the", "WB", "of", "A549", "cells", "used", "in", "(", "B", ")", "and", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "H1299", "(", "C", ")", "lung", "cancer", "cell", "lines", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "were", "counted", "with", "Trypan", "blue", "for", "several", "days", "following", "stress", "stimuli", "(", "thapsigargin", "(", "Th", ")", "for", "H1299", ")", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "1st", "day", "values", ".", "Δ160p53", "shows", "similar", "pro", "-", "proliferative", "capacities", "as", "mutant", "R273Hp53", ".", "On", "the", "other", "hand", "R273Hp53", "lost", "pro", "-", "proliferative", "functions", "when", "deficient", "for", "Δ160p53", "expression", "(", "M160AR273Hp53", ")", ".", "(", "D", "to", "G", ")", "H1299", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", "were", "submitted", "to", "ER", "stress", "(", "E", "and", "G", ")", "or", "cultured", "under", "regular", "conditions", "(", "D", ")", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "empty", "vector", "(", "E", ")", "or", "p53", "(", "D", ")", "condition", ",", "which", "were", "set", "to", "100", ".", "Cells", "were", "then", "analysed", "for", "apoptosis", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Shown", "are", "representative", "data", "or", "averages", "+", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "and", "^", "P", ">", "0", ".", "05", "compared", "to", "control", "(", "\"", "Th", "+", "si", "ctl", "\"", "or", "\"", "-", "\"", ")", "or", "as", "indicated", ")", ".", "(", "D", "to", "G", ")", "H1299", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", "were", "submitted", "to", "ER", "stress", "(", "E", "and", "G", ")", ",", "DNA", "-", "damage", "by", "36h", "3", "μM", "etoposide", "(", "Eto", ")", "treatment", "(", "F", ")", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "empty", "vector", "(", "E", ")", "or", "p53", "(", "D", ")", "condition", ",", "which", "were", "set", "to", "100", ".", "Cells", "were", "then", "analysed", "for", "apoptosis", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Shown", "are", "representative", "data", "or", "averages", "+", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "and", "^", "P", ">", "0", ".", "05", "compared", "to", "control", "(", "\"", "Th", "+", "si", "ctl", "\"", "or", "\"", "-", "\"", ")", "or", "as", "indicated", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Cell lines endogenously expressing mutant R273Hp53 (A431 and HT29) were treated with control siRNA (ctl) or siRNA targeting exon 7 of p53, submitted to endoplasmic reticulum (ER) stress by exposure to thapsigargin (Th) and then analysed for apoptosis by incubation with propidium-iodide (PI) and FACS analysis. Data was normalized against si ctl condition, which was set to 100.(B and C) A549 (B) lung cancer cell lines stably expressing the indicated constructs were counted with Trypan blue for several days following stress stimuli (over-confluency (O-C) for A549). Data was normalized against 1st day values. Δ160p53 shows similar pro-proliferative capacities as mutant R273Hp53. On the other hand R273Hp53 lost pro-proliferative functions when deficient for Δ160p53 expression (M160AR273Hp53). Also shown is the WB of A549 cells used in (B) and stably expressing the indicated constructs.(B and C) H1299 (C) lung cancer cell lines stably expressing the indicated constructs were counted with Trypan blue for several days following stress stimuli (thapsigargin (Th) for H1299). Data was normalized against 1st day values. Δ160p53 shows similar pro-proliferative capacities as mutant R273Hp53. On the other hand R273Hp53 lost pro-proliferative functions when deficient for Δ160p53 expression (M160AR273Hp53).(D to G) H1299 cells transfected with the indicated constructs were submitted to ER stress (E and G) or cultured under regular conditions (D). Data was normalized against empty vector (E) or p53 (D) condition, which were set to 100. Cells were then analysed for apoptosis as in (A). Shown are representative data or averages + s.d. of three independent experiments (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 and ^P > 0.05 compared to control (\"Th + si ctl\" or \"-\" ) or as indicated).(D to G) H1299 cells transfected with the indicated constructs were submitted to ER stress (E and G), DNA-damage by 36h 3 μM etoposide (Eto) treatment (F). Data was normalized against empty vector (E) or p53 (D) condition, which were set to 100. Cells were then analysed for apoptosis as in (A). Shown are representative data or averages + s.d. of three independent experiments (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 and ^P > 0.05 compared to control (\"Th + si ctl\" or \"-\" ) or as indicated)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Adhesion", "assay", "shows", "that", "MCF10A", "cells", "stably", "expressing", "Δ133p53", ",", "Δ160p53", ",", "R273HΔ160p53", "or", "missense", "mutant", "R273Hp53", "adhere", "more", "strongly", "than", "control", "cells", ".", "Excluding", "Δ160p53", "expression", "from", "the", "mutant", "background", "(", "M160A", "/", "R273Hp53", ")", "rescued", "control", "-", "cell", "phenotype", ".", "Scale", "bar", "represents", "200", "μm", ".", "(", "B", ")", "WB", "of", "MCF10A", "cells", "used", "in", "(", "A", ")", "and", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", ".", "Shown", "are", "representative", "data", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "quantifications", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "MCF10A", "human", "breast", "epithelial", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "were", "cultured", "in", "matrigel", ".", "Control", "-", "and", "Δ133p53", "-", "expressing", "cells", "formed", "regular", "three", "-", "dimensional", "(", "3D", ")", "mammary", "acinar", "structures", "with", "hollow", "lumina", "but", "Δ160p53", "-", ",", "R273HΔ160p53", "and", "to", "a", "smaller", "extent", "mutant", "R273Hp53", "-", "expressing", "cells", "formed", "acini", "with", "filled", "lumen", "and", "long", "invasive", "structures", "(", "n", ">", "30", "acini", "per", "experiment", "per", "condition", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "MCF10A", "human", "breast", "epithelial", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "constructs", "were", "cultured", "in", "matrigel", ".", "Control", "-", "and", "Δ133p53", "-", "expressing", "cells", "formed", "regular", "three", "-", "dimensional", "(", "3D", ")", "mammary", "acinar", "structures", "with", "hollow", "lumina", "but", "Δ160p53", "-", ",", "R273HΔ160p53", "and", "to", "a", "smaller", "extent", "mutant", "R273Hp53", "-", "expressing", "cells", "formed", "acini", "with", "filled", "lumen", "and", "long", "invasive", "structures", "(", "n", ">", "30", "acini", "per", "experiment", "per", "condition", ")", ".", "(", "E", ")", "H1299", "cells", "stably", "expressing", "empty", "vector", "(", "control", ")", "or", "the", "indicated", "constructs", "were", "assessed", "by", "confocal", "microscopy", "for", "invasion", "further", "than", "30", "μm", "through", "a", "Matrigel", "-", "fibronectin", "matrix", "towards", "EGF", "-", "supplemented", "growth", "media", ".", "The", "30", "μm", "plane", "is", "indicated", "and", "scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "Quantifications", "are", "shown", "in", "the", "right", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Adhesion assay shows that MCF10A cells stably expressing Δ133p53, Δ160p53, R273HΔ160p53 or missense mutant R273Hp53 adhere more strongly than control cells. Excluding Δ160p53 expression from the mutant background (M160A/R273Hp53) rescued control-cell phenotype. Scale bar represents 200 μm.(B) WB of MCF10A cells used in (A) and stably expressing the indicated constructs. Shown are representative data of three independent experiments and quantifications.(C and D) MCF10A human breast epithelial cells stably expressing the indicated constructs were cultured in matrigel. Control- and Δ133p53-expressing cells formed regular three-dimensional (3D) mammary acinar structures with hollow lumina but Δ160p53-, R273HΔ160p53 and to a smaller extent mutant R273Hp53-expressing cells formed acini with filled lumen and long invasive structures (n > 30 acini per experiment per condition).(C and D) MCF10A human breast epithelial cells stably expressing the indicated constructs were cultured in matrigel. Control- and Δ133p53-expressing cells formed regular three-dimensional (3D) mammary acinar structures with hollow lumina but Δ160p53-, R273HΔ160p53 and to a smaller extent mutant R273Hp53-expressing cells formed acini with filled lumen and long invasive structures (n > 30 acini per experiment per condition).(E) H1299 cells stably expressing empty vector (control) or the indicated constructs were assessed by confocal microscopy for invasion further than 30 μm through a Matrigel-fibronectin matrix towards EGF-supplemented growth media. The 30 μm plane is indicated and scale bars represent 100 μm. Quantifications are shown in the right panel."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "WB", "of", "H1299", "cells", "stably", "expressing", "Δ133p53", "and", "treated", "with", "control", "morpholino", "oligos", "(", "Ctl", "-", "1", "or", "Ctl", "-", "2", ")", "or", "antisense", "morpholino", "oligo", "targeting", "Δ160p53", "'", "s", "translation", "initiation", "(", "MO", ")", "(", "B", ")", "A431", "and", "HT29", "cells", "expressing", "endogenous", "mutant", "R273Hp53", "were", "treated", "with", "control", "morpholinos", "(", "Ctl", "-", "2", "or", "Ctl", "-", "1", ")", "or", "antisense", "morpholino", "oligo", "targeting", "Δ160p53", "'", "s", "translation", "initiation", "site", "(", "MO", ")", "before", "lysis", "and", "WB", ".", "wtp53", "-", "expressing", "A549", "cells", "were", "used", "as", "reference", "for", "endogenous", "wtp53", "expression", "levels", ".", "Δ160", "lane", "was", "used", "as", "a", "marker", "lane", "showing", "Δ160p53", "as", "transiently", "expressed", "in", "p53", "-", "null", "H1299", "cells", ".", "(", "C", ")", "Shown", "are", "the", "average", "Δ160p53", "protein", "levels", "expressed", "in", "R273Hp53", "versus", "other", "mutant", "p53cell", "lines", "that", "were", "treated", "with", "control", "morpholino", "(", "Ctl", "-", "1", ")", "or", "morpholino", "targeting", "160p53", "'", "s", "translation", "initiation", "site", "(", "MO", ")", ".", "MO", "efficiently", "targets", "160p53", "in", "endogenous", "R273Hp53", "cell", "lines", ".", "See", "also", "figure", "EV3", "for", "the", "raw", "data", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "A431", "(", "D", ")", "and", "HT29", "(", "E", ")", "cells", "endogenously", "expressing", "mutant", "R273Hp53", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "(", "si", "Ctl", ")", "or", "control", "MO", "(", "MO", "Ctl", "-", "2", "or", "MO", "Ctl", "-", "1", ")", "or", "siRNA", "targeting", "exon", "7", "of", "p53", "(", "si", ")", "or", "MO", "targeting", "Δ160p53", "'", "s", "translation", "initiation", "site", "(", "MO", ")", ",", "as", "indicated", ",", "submitted", "to", "endoplasmic", "reticulum", "stress", "by", "exposure", "to", "thapsigargin", "(", "Th", ")", "and", "then", "analysed", "for", "apoptosis", "by", "incubation", "with", "propidium", "-", "iodide", "(", "PI", ")", "and", "FACS", "analysis", ".", "wtp53", "-", "expressing", "A549", "cells", "were", "similarly", "control", "-", "treated", "and", "used", "as", "comparison", ".", "Data", "was", "normalized", "against", "A549", "cell", "condition", ",", "which", "was", "set", "to", "100", ".", "(", "F", ")", "A431", "and", "HT29", "cells", "endogenously", "expressing", "mutant", "R273Hp53", "were", "treated", "with", "control", "morpholino", "Ctl", "-", "1", "or", "morpholino", "targeting", "Δ160p53", "'", "s", "translation", "initiation", "site", "(", "MO", ")", "and", "then", "assessed", "by", "confocal", "microscopy", "for", "invasion", "further", "than", "30", "μm", "through", "a", "Matrigel", "-", "fibronectin", "matrix", "towards", "EGF", "-", "supplemented", "growth", "media", ".", "The", "30", "μm", "plane", "is", "indicated", "and", "scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "Quantifications", "are", "shown", "in", "the", "right", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) WB of H1299 cells stably expressing Δ133p53 and treated with control morpholino oligos (Ctl-1 or Ctl-2) or antisense morpholino oligo targeting Δ160p53's translation initiation (MO)(B) A431 and HT29 cells expressing endogenous mutant R273Hp53 were treated with control morpholinos (Ctl-2 or Ctl-1) or antisense morpholino oligo targeting Δ160p53's translation initiation site (MO) before lysis and WB. wtp53-expressing A549 cells were used as reference for endogenous wtp53 expression levels. Δ160 lane was used as a marker lane showing Δ160p53 as transiently expressed in p53-null H1299 cells.(C) Shown are the average Δ160p53 protein levels expressed in R273Hp53 versus other mutant p53cell lines that were treated with control morpholino (Ctl-1) or morpholino targeting 160p53's translation initiation site (MO). MO efficiently targets 160p53 in endogenous R273Hp53 cell lines. See also figure EV3 for the raw data.(D-E) A431 (D) and HT29 (E) cells endogenously expressing mutant R273Hp53 were treated with control siRNA (si Ctl) or control MO (MO Ctl-2 or MO Ctl-1) or siRNA targeting exon 7 of p53 (si) or MO targeting Δ160p53's translation initiation site (MO), as indicated, submitted to endoplasmic reticulum stress by exposure to thapsigargin (Th) and then analysed for apoptosis by incubation with propidium-iodide (PI) and FACS analysis. wtp53-expressing A549 cells were similarly control-treated and used as comparison. Data was normalized against A549 cell condition, which was set to 100.(F) A431 and HT29 cells endogenously expressing mutant R273Hp53 were treated with control morpholino Ctl-1 or morpholino targeting Δ160p53's translation initiation site (MO) and then assessed by confocal microscopy for invasion further than 30 μm through a Matrigel-fibronectin matrix towards EGF-supplemented growth media. The 30 μm plane is indicated and scale bars represent 100 μm. Quantifications are shown in the right panel."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "reporter", "HslO", "-", "FLAG", "protein", "produced", "with", "a", "custom", "-", "made", "PURExpress", "®", "coupled", "in", "vitro", "transcription", "-", "translation", "system", "supplemented", "with", "the", "indicated", "EF", "-", "G", "proteins", "and", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Blot", "was", "developed", "using", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", ".", "Shown", "is", "a", "representative", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Eco", "EF", "-", "G", ":", "E", ".", "coli", "EF", "-", "G", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Western blot analysis of reporter HslO-FLAG protein produced with a custom-made PURExpress® coupled in vitro transcription-translation system supplemented with the indicated EF-G proteins and incubated for the indicated times. Blot was developed using anti-FLAG antibodies. Shown is a representative from at least two independent experiments. Eco EF-G: E. coli EF-G."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "reporter", "HslO", "-", "FLAG", "protein", "synthesized", "in", "vitro", "using", "a", "custom", "-", "made", "PURExpress", "®", "system", "with", "EF", "-", "G1", ",", "EF", "-", "G2", ",", "and", "two", "engineered", "EF", "-", "G2", "variants", ":", "one", "missing", "the", "26", "-", "amino", "acid", "insert", ",", "EF", "-", "G2", "(", "∆", "514", "-", "539", ")", "and", "one", "missing", "the", "beta", "hairpin", "in", "the", "insert", ",", "EF", "-", "G2", "(", "∆", "516", "-", "527", ")", ".", "Shown", "is", "a", "representative", "experiment", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "co", "-", "sedimentation", "assays", "monitoring", "factor", "(", "EF", "-", "G1", "EF", "-", "G2", "or", "EF", "-", "G2", "variant", "EF", "-", "G2", "(", "∆", "516", "-", "527", ")", "or", "EF", "-", "G2", "(", "∆", "514", "-", "539", ")", ")", "binding", "to", "E", ".", "coli", "70S", "ribosomes", ".", "Binding", "reactions", "were", "centrifuged", "through", "a", "sucrose", "cushion", "to", "recover", "ribosome", "and", "associated", "factor", "in", "the", "pellets", ".", "The", "positions", "of", "EF", "-", "G", "proteins", "and", "ribosomal", "proteins", "and", "molecular", "weight", "markers", "are", "indicated", ".", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "reporter", "HisC", "-", "FLAG", "protein", "synthesized", "in", "vitro", "using", "a", "custom", "-", "made", "PURExpress", "®", "system", "with", "the", "EF", "-", "G1", ",", "EF", "-", "G2", "or", "EF", "-", "G2", "(", "S84H", ")", "proteins", ".", "Shown", "is", "a", "representative", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Western blot analysis of reporter HslO-FLAG protein synthesized in vitro using a custom-made PURExpress® system with EF-G1, EF-G2, and two engineered EF-G2 variants: one missing the 26-amino acid insert, EF-G2 (∆514-539) and one missing the beta hairpin in the insert, EF-G2 (∆516-527). Shown is a representative experiment from at least two independent experiments.D. SDS-PAGE analysis of co-sedimentation assays monitoring factor (EF-G1 EF-G2 or EF-G2 variant EF-G2 (∆516-527) or EF-G2 (∆514-539)) binding to E. coli 70S ribosomes. Binding reactions were centrifuged through a sucrose cushion to recover ribosome and associated factor in the pellets. The positions of EF-G proteins and ribosomal proteins and molecular weight markers are indicated.E. Western blot analysis of reporter HisC-FLAG protein synthesized in vitro using a custom-made PURExpress® system with the EF-G1, EF-G2 or EF-G2(S84H) proteins. Shown is a representative from at least two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6Western", "blot", "analysis", "of", "B", ".", "thetaiotaomicron", "strains", "expressing", "C", "-", "terminally", "FLAG", "-", "tagged", "EF", "-", "G1", "(", "WH405", ")", "(", "A", ")", ",", "or", "EF", "-", "G2", "(", "GT1301", ")", "(", "B", ")", ",", "from", "their", "normal", "promoters", "and", "chromosomal", "locations", ",", "grown", "in", "Tryptone", "Yeast", "Extract", "Glucose", "liquid", "medium", "(", "TYG", ")", "and", "sampled", "at", "the", "indicated", "times", ".", "E", "-", "F", ".", "Western", "blot", "of", "crude", "extracts", "from", "wild", "-", "type", "B", ".", "thetaiotaomicron", "harvested", "from", "the", "ceca", "of", "mice", "(", "representative", "blot", "for", "2", "out", "of", "4", "mice", "tested", ")", "or", "corresponding", "to", "stationary", "phase", "cultures", "harvested", "following", "growth", "in", "TYG", "for", "24", "h", "or", "purified", "EF", "-", "G1", "and", "EF", "-", "G2", "proteins", "at", "the", "indicated", "amounts", "(", "E", ")", ".", "Blots", "were", "developed", "with", "anti", "-", "EF", "-", "G1", "or", "EF", "-", "G2", "polyclonal", "antibodies", ";", "anti", "-", "GroEL", "antibodies", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "Western", "blot", "quantifications", "of", "all", "four", "biological", "replicates", "and", "their", "average", "are", "shown", "in", "(", "F", ")", ",", "where", "EF", "-", "G1", "and", "EF", "-", "G2", "abundances", "were", "estimated", "by", "normalizing", "the", "signal", "of", "bacterial", "sample", "to", "the", "closest", "signal", "of", "known", "amount", "of", "purified", "protein", ",", "and", "the", "derived", "absolute", "amount", "(", "pmol", ")", "was", "normalized", "to", "the", "signal", "of", "GroEL", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blot analysis of B. thetaiotaomicron strains expressing C-terminally FLAG-tagged EF-G1 (WH405) (A), or EF-G2 (GT1301) (B), from their normal promoters and chromosomal locations, grown in Tryptone Yeast Extract Glucose liquid medium (TYG) and sampled at the indicated times.E-F. Western blot of crude extracts from wild-type B. thetaiotaomicron harvested from the ceca of mice (representative blot for 2 out of 4 mice tested) or corresponding to stationary phase cultures harvested following growth in TYG for 24 h or purified EF-G1 and EF-G2 proteins at the indicated amounts (E). Blots were developed with anti-EF-G1 or EF-G2 polyclonal antibodies; anti-GroEL antibodies were used as loading controls. Western blot quantifications of all four biological replicates and their average are shown in (F), where EF-G1 and EF-G2 abundances were estimated by normalizing the signal of bacterial sample to the closest signal of known amount of purified protein, and the derived absolute amount (pmol) was normalized to the signal of GroEL."}
{"words": ["Fig", ".", "1", ":", "Three", "-", "dimensional", "structure", "of", "2019", "-", "nCoV", "Mpro", ",", "in", "two", "different", "views", ".", "One", "protomer", "of", "the", "dimer", "is", "shown", "in", "light", "blue", ",", "the", "other", "one", "in", "orange", ".", "Amino", "-", "acid", "residues", "of", "the", "catalytic", "site", "are", "indicated", "as", "yellow", "and", "blue", "spheres", ",", "for", "Cys145", "and", "His41", ",", "respectively", ".", "Black", "spheres", "indicate", "the", "positions", "of", "Ala285", "of", "each", "of", "the", "two", "domains", "III", "(", "see", "text", ")", ".", "Chain", "termini", "are", "labeled", "N", "and", "C", "for", "molecule", "A", "(", "light", "blue", ")", "and", "N", "*", "and", "C", "*", "for", "molecule", "B", "(", "orange", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig. 1: Three-dimensional structure of 2019-nCoV Mpro, in two different views. One protomer of the dimer is shown in light blue, the other one in orange. Amino-acid residues of the catalytic site are indicated as yellow and blue spheres, for Cys145 and His41, respectively. Black spheres indicate the positions of Ala285 of each of the two domains III (see text). Chain termini are labeled N and C for molecule A (light blue) and N* and C* for molecule B (orange). "}
{"words": ["Fig", ".", "2", ":", "Compound", "13b", "in", "the", "substrate", "-", "binding", "cleft", "located", "between", "domains", "I", "and", "II", "of", "the", "Mpro", ",", "in", "the", "monoclinic", "crystal", "form", "(", "space", "group", "C2", ")", ".", "2Fo", "-", "Fc", "electron", "density", "is", "shown", "for", "the", "inhibitor", "(", "contouring", "level", ":", "1σ", ")", ".", "Carbon", "atoms", "of", "the", "inhibitor", "are", "magenta", ",", "oxygens", "red", ",", "nitrogens", "blue", ",", "and", "sulfur", "yellow", ".", "Note", "the", "interaction", "between", "the", "N", "-", "terminal", "residue", "of", "chain", "B", ",", "S1", "*", ",", "and", "E166", "of", "chain", "A", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig. 2: Compound 13b in the substrate-binding cleft located between domains I and II of the Mpro, in the monoclinic crystal form (space group C2). 2Fo-Fc electron density is shown for the inhibitor (contouring level: 1σ). Carbon atoms of the inhibitor are magenta, oxygens red, nitrogens blue, and sulfur yellow. Note the interaction between the N-terminal residue of chain B, S1*, and E166 of chain A. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "STAT2", "protein", "levels", "in", "mock", "-", ",", "WT", "-", "RCMV", "-", "E", "-", ",", "ΔE27", "-", "RCMV", "-", "E", "-", "or", "UV", "-", "inactivated", "RCMV", "-", "E", "-", "infected", "REF", ".", "24", "h", "p", ".", "i", ".", ",", "cells", "were", "either", "left", "untreated", "or", "treated", "for", "5", ".", "5", "h", "with", "DMSO", ",", "2", ".", "5", "µM", "MLN4924", "for", "blocking", "CRL", "activity", "or", "10", "µM", "MG132", "for", "proteasome", "inhibition", ".", "IE1", "and", "β", "-", "tubulin", "served", "as", "infection", "and", "loading", "controls", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Western blot analysis of STAT2 protein levels in mock-, WT-RCMV-E-, ΔE27-RCMV-E- or UV-inactivated RCMV-E-infected REF. 24 h p.i., cells were either left untreated or treated for 5.5 h with DMSO, 2.5 µM MLN4924 for blocking CRL activity or 10 µM MG132 for proteasome inhibition. IE1 and β-tubulin served as infection and loading controls, respectively."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "GF", "analysis", "of", "in", "vitro", "reconstitutions", "containing", "the", "indicated", "protein", "combinations", ".", "Coomassie", "blue", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "analyses", "of", "fractions", "collected", "during", "the", "GF", "runs", "are", "shown", "next", "to", "the", "chromatograms", ".", "The", "red", "*", "indicates", "a", "contaminant", ",", "which", "we", "identified", "by", "cryo", "-", "EM", "analysis", "as", "E", ".", "coli", "ArnA", ",", "a", "notorious", "contaminant", "in", "E", ".", "coli", "Ni", "-", "NTA", "protein", "purifications", "(", "Andersen", "et", "al", ".", ",", "2013", ")", "(", "Appendix", "Fig", "S2", ",", "S3", ")", ".", "Note", "that", "ArnA", "is", "present", "in", "GF", "fraction", "6", "(", "Ve", "~", "10", ".", "2", "ml", ")", "of", "all", "runs", "containing", "E27", ",", "and", "migrates", "similarly", "to", "E27", "on", "the", "SDS", "-", "PAGE", ".", "*", "-", "additional", "contaminant", "from", "E27", "preparation", ";", "*", "*", "-", "contaminant", "from", "STAT2", "preparation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) GF analysis of in vitro reconstitutions containing the indicated protein combinations. Coomassie blue-stained SDS-PAGE analyses of fractions collected during the GF runs are shown next to the chromatograms. The red * indicates a contaminant, which we identified by cryo-EM analysis as E. coli ArnA, a notorious contaminant in E. coli Ni-NTA protein purifications (Andersen et al., 2013) (Appendix Fig S2, S3). Note that ArnA is present in GF fraction 6 (Ve ~ 10.2 ml) of all runs containing E27, and migrates similarly to E27 on the SDS-PAGE. * - additional contaminant from E27 preparation; ** - contaminant from STAT2 preparation."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Pre", "-", "formed", "DDB1", "/", "DCAF1", "protein", "complex", "was", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "E27", "and", "analysed", "by", "GF", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analyses", "of", "GF", "fractions", "are", "shown", "next", "to", "the", "chromatogram", ".", "The", "red", "*", "indicates", "the", "ArnA", "contaminant", "(", "see", "Fig", "2", ")", ".", "*", "-", "additional", "contaminant", "from", "E27", "preparation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Pre-formed DDB1/DCAF1 protein complex was incubated with indicated amounts of E27 and analysed by GF. SDS-PAGE analyses of GF fractions are shown next to the chromatogram. The red * indicates the ArnA contaminant (see Fig 2). * - additional contaminant from E27 preparation."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "encoding", "E27", "-", "HA", "or", "indicated", "variants", ".", "24", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "E27", "-", "HA", "was", "precipitated", "using", "an", "HA", "-", "specific", "antibody", ".", "Precipitates", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "blotted", ",", "and", "probed", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "plasmids", "encoding", "M27", "-", "FLAG", "or", "the", "indicated", "M27", "-", "FLAG", "variants", ".", "24", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "M27", "-", "FLAG", "was", "precipitated", "using", "a", "FLAG", "-", "specific", "antibody", ".", "Precipitates", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "blotted", "and", "probed", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "Mouse", "fibroblasts", "were", "infected", "with", "MCMV", "or", "the", "indicated", "MCMV", "mutants", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "cells", "were", "lysed", ",", "proteins", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "blotted", ".", "Blots", "were", "probed", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "pIE1", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "infection", "and", "loading", "controls", ".", "(", "G", ")", "NIH3T3", "reporter", "cells", "stably", "expressing", "ISRE", "-", "Luc", "were", "infected", "with", "the", "indicated", "MCMV", "strains", ",", "treated", "with", "IFNβ", "or", "IFNλ", ",", "and", "luciferase", "activity", "was", "measured", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ",", "*", "*", "*", "-", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "H", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "infected", "i", ".", "p", ".", "with", "WT", "-", "MCMV", "and", "indicated", "MCMV", "mutants", ".", "At", "3", "and", "21", "d", "p", ".", "i", ".", ",", "salivary", "glands", "were", "collected", "and", "frozen", ".", "Virus", "titres", "were", "determined", "from", "organ", "homogenates", "by", "plaque", "titration", ".", "Titrations", "were", "performed", "in", "quadruplicates", ".", "Bars", "depict", "the", "geometric", "mean", ",", "dots", "show", "titres", "of", "individual", "mice", "(", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "DL", "-", "detection", "limit", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) 293T cells were transfected with expression plasmids encoding E27-HA or indicated variants. 24 h after transfection, cells were lysed and E27-HA was precipitated using an HA-specific antibody. Precipitates were separated by SDS-PAGE, blotted, and probed using the indicated antibodies.(E) 293T cells were transfected with expression plasmids encoding M27-FLAG or the indicated M27-FLAG variants. 24 h after transfection, cells were lysed and M27-FLAG was precipitated using a FLAG-specific antibody. Precipitates were separated by SDS-PAGE, blotted and probed using the indicated antibodies.(F) Mouse fibroblasts were infected with MCMV or the indicated MCMV mutants. At the indicated time points, cells were lysed, proteins were separated by SDS-PAGE and blotted. Blots were probed using the indicated antibodies. pIE1 and GAPDH were used as infection and loading controls.(G) NIH3T3 reporter cells stably expressing ISRE-Luc were infected with the indicated MCMV strains, treated with IFNβ or IFNλ, and luciferase activity was measured. The error bars represent the standard deviation, N=4 biological replicates, *** - P ≤ 0.001 (ANOVA).(H) BALB/c mice were infected i.p. with WT-MCMV and indicated MCMV mutants. At 3 and 21 d p.i., salivary glands were collected and frozen. Virus titres were determined from organ homogenates by plaque titration. Titrations were performed in quadruplicates. Bars depict the geometric mean, dots show titres of individual mice (N=5 biological replicates). DL - detection limit."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "-", "Vevtor", "(", "VC", ")", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "(", "KO", ")", "cells", "in", "complete", "medium", "(", "CM", ")", "and", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "or", "stimulation", "with", "amino", "acids", "for", "30", "min", ".", "B", "and", "C", ".", "Statistical", "analysis", "of", "phosphorylated", "level", "of", "S6K", "(", "B", ")", "and", "4E", "-", "BP1", "(", "C", ")", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "in", "CM", ",", "under", "nutrient", "starvation", "(", "-", "AA", ")", "and", "in", "response", "to", "stimulation", "with", "amino", "acids", "(", "+", "AA", ")", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "D", ".", "Immunostaining", "of", "endogenous", "mTOR", "and", "LAMP1", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "under", "nutrient", "starvation", "(", "-", "AA", ")", "and", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", "(", "+", "AA", ")", ".", "LAMP1", "was", "immunostained", "as", "a", "lysosome", "marker", ".", "Arrows", "highlight", "the", "co", "-", "localization", "of", "mTOR", "with", "LAMP1", ".", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", "(", "Row", "1", ")", "and", "10", "μm", "(", "Rows", "2", ",", "3", ",", "4", ")", ".", "E", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "of", "mTOR", "and", "LAMP1", "in", "Figure", "1F", "(", "n", "=", "12", "-", "15", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "way", "ANOVA", ".", "F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "stably", "re", "-", "expressing", "exogenous", "GFP", "-", "Aster", "-", "C", "under", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "Aster", "-", "C", "and", "selected", "with", "G418", "for", "2", "weeks", ".", "G", ".", "Immunostaining", "of", "endogenous", "mTOR", "and", "LAMP1", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "under", "cholesterol", "depletion", "by", "treatment", "with", "0", ".", "5", "%", "MCD", "for", "2", "hrs", "(", "-", "CHOL", ")", "or", "cholesterol", "(", "50", "µM", ")", "re", "-", "stimulation", "for", "1", "hr", "(", "+", "CHOL", ")", ".", "Arrows", "highlight", "the", "co", "-", "localization", "of", "mTOR", "with", "LAMP1", ".", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", "(", "Row", "1", ")", "and", "10", "μm", "(", "Rows", "2", ",", "3", ",", "4", ")", ".", "H", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "in", "CM", ",", "under", "starvation", ",", "cholesterol", "depletion", "by", "treatment", "with", "0", ".", "5", "%", "MCD", "for", "2", "hrs", "or", "cholesterol", "(", "50", "µM", ")", "re", "-", "stimulation", "for", "the", "indicated", "time", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12-Vevtor (VC) and Aster-C KO (KO) cells in complete medium (CM) and in response to nutrient starvation or stimulation with amino acids for 30 min. B and C. Statistical analysis of phosphorylated level of S6K (B) and 4E-BP1 (C) in C2C12-Vector and Aster-C KO cells in CM, under nutrient starvation (-AA) and in response to stimulation with amino acids (+AA) using ImageJ software. Data are represented as mean ± SD (n=3 biological replicates). *p < 0.05, **p<0.01 by Student's t test.D. Immunostaining of endogenous mTOR and LAMP1 in C2C12-Vector and Aster-C KO cells under nutrient starvation (-AA) and in response to AA stimulation (+AA). LAMP1 was immunostained as a lysosome marker. Arrows highlight the co-localization of mTOR with LAMP1. Scale bar, 40 μm (Row 1) and 10 μm (Rows 2, 3, 4).E. Statistical analysis of the Pearson's correlation coefficient of mTOR and LAMP1 in Figure 1F (n=12-15 cells per group). Data are represented as mean ± SD. ***p<0.001 by one way ANOVA.F. Western blot analysis of mTORC1 activity in Aster-C KO cells stably re-expressing exogenous GFP-Aster-C under nutrient starvation and AA stimulation. Aster-C KO cells were transfected with GFP-Aster-C and selected with G418 for 2 weeks.G. Immunostaining of endogenous mTOR and LAMP1 in C2C12-Vector and Aster-C KO cells under cholesterol depletion by treatment with 0.5% MCD for 2 hrs (-CHOL) or cholesterol (50 µM) re-stimulation for 1 hr (+CHOL). Arrows highlight the co-localization of mTOR with LAMP1. Scale bar, 40 μm (Row 1) and 10 μm (Rows 2, 3, 4).H. Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12-Vector and Aster-C KO cells in CM, under starvation, cholesterol depletion by treatment with 0.5% MCD for 2 hrs or cholesterol (50 µM) re-stimulation for the indicated time."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Confocal", "image", "analysis", "depicting", "the", "co", "-", "localization", "of", "Aster", "-", "C", "with", "the", "ER", "in", "C2C12", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "Aster", "-", "C", "and", "DsRed", "-", "ER", "under", "starvation", "and", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "B", ".", "Subcellular", "fractionation", "analysis", "of", "mTOR", ",", "GATOR2", "complex", "and", "Aster", "-", "C", "localization", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "FLAG", "-", "Aster", "-", "C", "under", "starvation", "and", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", ".", "LAMP1", ",", "Sec63", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "lysosomal", "(", "Lyso", ")", ",", "rough", "ER", "(", "RER", ")", "and", "cytosol", "(", "Cyto", ")", "protein", "markers", ",", "respectively", ".", "Microsomal", "fraction", "(", "Micro", ")", "was", "also", "used", "in", "the", "blot", ".", "C", ".", "Subcellular", "fractionation", "analysis", "of", "mTOR", "and", "GATOR2", "complex", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "under", "starvation", "and", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", ".", "LAMP1", ",", "Sec63", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "lysosomal", "(", "Lyso", ")", ",", "rough", "ER", "(", "RER", ")", "and", "cytosol", "(", "Cyto", ")", "protein", "markers", ",", "respectively", ".", "D", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "exogenous", "mTOR", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "or", "insulin", "stimulation", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "proteins", ".", "Anti", "-", "Myc", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "E", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "endogenous", "mTOR", "and", "the", "GATOR2", "complex", "using", "FLAG", "-", "Sestrin2", "(", "SESN2", ")", "as", "a", "positive", "control", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "proteins", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "F", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "mTOR", ",", "the", "GATOR2", "complex", ",", "GATOR1", "complex", "and", "the", "Ragulator", "-", "Rag", "complex", "using", "FLAG", "-", "DEPDC5", "as", "a", "positive", "control", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "proteins", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Black", "arrow", "indicates", "the", "RagC", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Confocal image analysis depicting the co-localization of Aster-C with the ER in C2C12 cells transiently expressing GFP-Aster-C and DsRed-ER under starvation and in response to AA stimulation. Scale bar, 5 μm.B. Subcellular fractionation analysis of mTOR, GATOR2 complex and Aster-C localization in HEK293T cells transiently expressing FLAG-Aster-C under starvation and in response to AA stimulation. LAMP1, Sec63 and GAPDH were used as lysosomal (Lyso), rough ER (RER) and cytosol (Cyto) protein markers, respectively. Microsomal fraction (Micro) was also used in the blot.C. Subcellular fractionation analysis of mTOR and GATOR2 complex in C2C12-Vector and Aster-C KO cells under starvation and in response to AA stimulation. LAMP1, Sec63 and GAPDH were used as lysosomal (Lyso), rough ER (RER) and cytosol (Cyto) protein markers, respectively.D. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with exogenous mTOR in response to starvation and AA or insulin stimulation in HEK293T cells transiently expressing the indicated proteins. Anti-Myc antibody was used for immunoprecipitation.E. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with endogenous mTOR and the GATOR2 complex using FLAG-Sestrin2 (SESN2) as a positive control in HEK293T cells transiently expressing the indicated proteins. Anti-FLAG antibody was used for immunoprecipitation.F. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with mTOR, the GATOR2 complex, GATOR1 complex and the Ragulator-Rag complex using FLAG-DEPDC5 as a positive control in HEK293T cells transiently expressing the indicated proteins. Anti-FLAG antibody was used for immunoprecipitation. Black arrow indicates the RagC protein."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "COPA", "and", "COPG", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "stimulation", "using", "FLAG", "-", "DEPDC5", "as", "a", "negative", "control", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "proteins", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Black", "arrow", "indicates", "the", "COPG", "protein", ".", "B", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "COPA", "with", "mTOR", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "COPA", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "Anti", "-", "GFP", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Black", "arrow", "indicates", "the", "COPG", "protein", ".", "C", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "COPA", "with", "mTOR", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "Anti", "-", "COPA", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "D", ".", "Confocal", "imaging", "analysis", "depicting", "the", "co", "-", "localization", "of", "YFP", "-", "mTOR", "(", "yellow", ")", "with", "GFP", "-", "COPA", "(", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "red", ")", "in", "live", "C2C12", "-", "Vector", "and", "Aster", "-", "C", "KO", "cells", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "re", "-", "stimulation", "by", "AA", ".", "Arrows", "highlight", "co", "-", "localization", "of", "mTOR", ",", "COPA", "and", "lysosomes", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "E", "and", "F", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "of", "mTOR", "/", "Lysosome", "(", "E", ")", "and", "COPA", "/", "Lysosome", "(", "F", ")", "in", "Figure", "3D", "(", "n", "=", "10", "-", "12", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with COPA and COPG in response to starvation and AA stimulation using FLAG-DEPDC5 as a negative control in HEK293T cells transiently expressing the indicated proteins. Anti-FLAG antibody was used for immunoprecipitation. Black arrow indicates the COPG protein.B. Co-IP analysis of the interaction of COPA with mTOR in HEK293T cells transiently expressing GFP-COPA in response to starvation and AA stimulation. Anti-GFP antibody was used for immunoprecipitation. Black arrow indicates the COPG protein.C. Co-IP analysis of the interaction of COPA with mTOR in C2C12-Vector and Aster-C KO cells in response to starvation and AA stimulation. Anti-COPA antibody was used for immunoprecipitation.D. Confocal imaging analysis depicting the co-localization of YFP-mTOR (yellow) with GFP-COPA (green) and lysosomes (red) in live C2C12-Vector and Aster-C KO cells in response to nutrient starvation and re-stimulation by AA. Arrows highlight co-localization of mTOR, COPA and lysosomes. Scale bar, 20 μm. E and F. Statistical analysis of the Pearson's correlation coefficient of mTOR/Lysosome (E) and COPA/Lysosome (F) in Figure 3D (n=10-12 cells per group). Data are represented as mean ± SD. ***p<0.001 by one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4Time", "-", "lapse", "confocal", "imaging", "analysis", "of", "the", "co", "-", "localization", "of", "YFP", "-", "mTOR", "(", "red", ")", "with", "GFP", "-", "COPA", "(", "green", ")", "and", "lysosomes", "(", "blue", ")", "in", "live", "C2C12", "cells", "under", "nutrient", "starvation", "(", "0", "min", ")", ",", "and", "in", "response", "to", "AA", "re", "-", "stimulation", "for", "indicated", "time", "(", "0", ".", "5", "min", ",", "2", "min", ",", "6", "min", "and", "8", "min", ")", ".", "Arrows", "highlight", "COPA", "puncta", "that", "were", "co", "-", "localized", "with", "mTOR", "or", "COPA", "puncta", "alone", "prior", "to", "their", "association", "with", "mTOR", "and", "lysosomes", ".", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Time-lapse confocal imaging analysis of the co-localization of YFP-mTOR (red) with GFP-COPA (green) and lysosomes (blue) in live C2C12 cells under nutrient starvation (0 min), and in response to AA re-stimulation for indicated time (0.5 min, 2 min, 6 min and 8 min). Arrows highlight COPA puncta that were co-localized with mTOR or COPA puncta alone prior to their association with mTOR and lysosomes.. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Confocal", "imaging", "analysis", "depicting", "the", "lysosomal", "association", "of", "mTOR", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BFA", "(", "10", "μM", ")", "or", "Exo", "-", "2", "(", "10", "μM", ")", "in", "live", "C2C12", "cells", "transiently", "expressing", "YFP", "-", "mTOR", "and", "stained", "with", "Lysotracker", "Red", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "cells", "in", "CM", ",", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BFA", "(", "10", "μM", ")", "(", "B", ")", "C", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "cells", "in", "CM", ",", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Exo", "-", "2", "(", "10", "μM", ")", "(", "C", ")", ".", "D", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "-", "Vector", "and", "ARF1", "KO", "cells", "in", "CM", ",", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "E", ".", "Confocal", "imaging", "analysis", "depicting", "COPA", "puncta", "(", "green", ")", "formation", "and", "co", "-", "localization", "with", "lysosomes", "(", "red", ")", "in", "live", "C2C12", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "COPA", "and", "stained", "with", "Lysotracker", "Red", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BFA", "(", "10", "μM", ")", "or", "Exo", "-", "2", "(", "10", "μM", ")", ".", "Arrows", "highlight", "co", "-", "localization", "of", "COPA", "with", "lysosomes", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "F", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "of", "COPA", "and", "lysosomes", "in", "Figure", "5E", "(", "n", "=", "10", "-", "15", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Confocal imaging analysis depicting the lysosomal association of mTOR in response to AA stimulation in the presence or absence of BFA (10 μM) or Exo-2 (10 μM) in live C2C12 cells transiently expressing YFP-mTOR and stained with Lysotracker Red. Scale bar, 20 μm.Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12 cells in CM, in response to nutrient starvation and AA stimulation in the presence or absence of BFA (10 μM) (B)C. Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12 cells in CM, in response to nutrient starvation and AA stimulation in the presence or absence of Exo-2 (10 μM) (C).D. Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12-Vector and ARF1 KO cells in CM, in response to nutrient starvation and AA stimulation.E. Confocal imaging analysis depicting COPA puncta (green) formation and co-localization with lysosomes (red) in live C2C12 cells transiently expressing GFP-COPA and stained with Lysotracker Red in response to nutrient starvation and AA stimulation in the presence or absence of BFA (10 μM) or Exo-2 (10 μM). Arrows highlight co-localization of COPA with lysosomes. Scale bar, 5 μm.F. Statistical analysis of the Pearson's correlation coefficient of COPA and lysosomes in Figure 5E (n=10-15 cells per group). Data are represented as mean ± SD. ***p<0.001 by one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "COPA", ",", "MYH10", ",", "WDR24", "and", "Mios", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "the", "indicated", "proteins", "in", "response", "to", "treatment", "with", "brefeldin", "A", "(", "BFA", ",", "10", "μM", ")", "and", "/", "or", "blebbistatin", "(", "BBS", ",", "10", "μM", ")", ",", "inhibitors", "of", "ARFs", "and", "MYH10", ",", "respectively", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "MYH10", "KO", "MEF", "cells", "cultured", "in", "CM", ",", "or", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "C", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "MYH10", "KO", "MEF", "cells", "with", "stably", "re", "-", "expressed", "exogenous", "mCherry", "-", "MYH10", "in", "response", "to", "starvation", "and", "AA", "stimulation", ".", "MYH10", "KO", "MEF", "cells", "were", "transfected", "with", "mCherry", "-", "MYH10", "and", "selected", "with", "G418", "for", "2", "weeks", ".", "D", ".", "Confocal", "imaging", "analysis", "depicting", "COPA", "puncta", "(", "green", ")", "formation", "and", "co", "-", "localization", "with", "mTOR", "(", "red", ")", "in", "live", "C2C12", "cells", "transiently", "expression", "GFP", "-", "COPA", "and", "YFP", "-", "mTOR", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BBS", "(", "10", "µM", ")", ".", "Arrows", "highlight", "the", "co", "-", "localization", "of", "mTOR", "with", "COPA", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "E", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "of", "mTOR", "and", "COPA", "in", "Figure", "6D", "(", "n", "=", "10", "-", "12", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with COPA, MYH10, WDR24 and Mios in HEK293T cells transiently expressing the indicated proteins in response to treatment with brefeldin A (BFA, 10 μM) and/or blebbistatin (BBS, 10 μM), inhibitors of ARFs and MYH10, respectively. Anti-FLAG antibody was used for immunoprecipitation.B. Western blot analysis of mTORC1 activity in wild type (WT) and MYH10 KO MEF cells cultured in CM, or in response to starvation and AA stimulation.C. Western blot analysis of mTORC1 activity in MYH10 KO MEF cells with stably re-expressed exogenous mCherry-MYH10 in response to starvation and AA stimulation. MYH10 KO MEF cells were transfected with mCherry-MYH10 and selected with G418 for 2 weeks.D. Confocal imaging analysis depicting COPA puncta (green) formation and co-localization with mTOR (red) in live C2C12 cells transiently expression GFP-COPA and YFP-mTOR in response to nutrient starvation in the presence or absence of BBS (10 µM). Arrows highlight the co-localization of mTOR with COPA. Scale bar, 20 μm.E. Statistical analysis of the Pearson's correlation coefficient of mTOR and COPA in Figure 6D (n=10-12 cells per group). Data are represented as mean ± SD. ***p<0.001 by student's t test."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Confocal", "imaging", "analysis", "depicting", "mTOR", "puncta", "(", "green", ")", "formation", "on", "actin", "filaments", "(", "red", ")", "in", "COS", "-", "7", "cells", "transiently", "expressing", "YFP", "-", "mTOR", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "latrunculin", "B", "(", "LA", "-", "B", ",", "100", "nM", ")", ".", "Actin", "filaments", "were", "stained", "using", "BODIPY", "™", "558", "/", "568", "-", "Phalloidin", ".", "Arrows", "indicated", "the", "association", "of", "mTOR", "with", "actin", "filaments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "B", ".", "Immunostaining", "of", "endogenous", "mTOR", "and", "LAMP1", "in", "C2C12", "cells", "under", "amino", "acids", "starvation", "(", "-", "AA", ")", ",", "or", "in", "response", "to", "AA", "stimulation", "(", "+", "AA", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "LA", "-", "B", "(", "100", "nM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "C", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mTORC1", "activity", "in", "C2C12", "cells", "in", "CM", ",", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", "and", "AA", "stimulation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "LA", "-", "B", "(", "100", "nM", ")", ".", "D", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "Aster", "-", "C", "with", "COPA", "and", "MYH10", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "LA", "-", "B", "(", "100", "nM", ")", "or", "cytochalasin", "D", "(", "Cyto", "-", "D", ",", "250", "nM", ")", "in", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "FLAG", "-", "Aster", "-", "C", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Confocal imaging analysis depicting mTOR puncta (green) formation on actin filaments (red) in COS-7 cells transiently expressing YFP-mTOR in response to AA stimulation in the presence or absence of latrunculin B (LA-B, 100 nM). Actin filaments were stained using BODIPY™ 558/568-Phalloidin. Arrows indicated the association of mTOR with actin filaments. Scale bar, 5 μm.B. Immunostaining of endogenous mTOR and LAMP1 in C2C12 cells under amino acids starvation (-AA), or in response to AA stimulation (+AA) in the presence or absence of LA-B (100 nM). Scale bar, 20 μm.C. Western blot analysis of mTORC1 activity in C2C12 cells in CM, in response to nutrient starvation and AA stimulation in the presence or absence of LA-B (100 nM).D. Co-IP analysis of the interaction of Aster-C with COPA and MYH10 in the presence or absence of LA-B (100 nM) or cytochalasin D (Cyto-D, 250 nM) in HEK293T cells transiently expressing FLAG-Aster-C. Anti-FLAG antibody was used for immunoprecipitation."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "Distribution", "of", "Casp3", "+", "cells", "in", "rostral", "and", "ventral", "domains", "of", "an", "E11", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryo", ".", "NCx", ",", "neocortex", ";", "OB", ",", "olfactory", "bulb", ";", "Spt", ",", "septum", ".", "B", ",", "C", "-", "Marker", "analysis", "of", "Casp3", "+", "cells", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "E12", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", ".", "Most", "apoptotic", "cells", "are", "Pax6", "+", "RGCs", "(", "solid", "arrowheads", ")", "and", "not", "Tbr1", "+", "neurons", "(", "open", "arrowheads", ")", ".", "N", "=", "3", "replicates", "per", "marker", ".", "D", ",", "E", "-", "Distribution", "and", "abundance", "of", "apoptotic", "cells", "(", "Casp3", "+", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalic", "primordium", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", "at", "the", "indicated", "ages", ".", "Dotted", "line", "indicates", "basal", "surface", ",", "dashed", "line", "apical", "surface", ".", "N", "=", "3", "replicates", "per", "genotype", "and", "age", ".", "F", ",", "G", "-", "Distribution", "and", "abundance", "of", "mitoses", "(", "PH3", "+", ")", "and", "neurons", "(", "Tuj1", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalic", "primordium", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", "at", "the", "indicated", "ages", ".", "Dotted", "line", "indicates", "basal", "surface", ",", "dashed", "line", "apical", "surface", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "replicates", "per", "genotype", "and", "age", ".", "No", "significant", "differences", "were", "found", "between", "control", "and", "mutant", "embryos", "in", "apical", "nor", "basal", "mitoses", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A - Distribution of Casp3+ cells in rostral and ventral domains of an E11.5 Rx-Dicer mutant embryo. NCx, neocortex; OB, olfactory bulb; Spt, septum.B,C - Marker analysis of Casp3+ cells in the rostral telencephalon of E12.5 Rx-Dicer mutant embryos. Most apoptotic cells are Pax6+ RGCs (solid arrowheads) and not Tbr1+ neurons (open arrowheads). N = 3 replicates per marker.D,E - Distribution and abundance of apoptotic cells (Casp3+) in the rostral telencephalic primordium of control and Rx-Dicer mutant embryos at the indicated ages. Dotted line indicates basal surface, dashed line apical surface. N = 3 replicates per genotype and age.F,G - Distribution and abundance of mitoses (PH3+) and neurons (Tuj1) in the rostral telencephalic primordium of control and Rx-Dicer mutant embryos at the indicated ages. Dotted line indicates basal surface, dashed line apical surface. N = 3-4 replicates per genotype and age. No significant differences were found between control and mutant embryos in apical nor basal mitoses."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "DAPI", "stain", "of", "sagittal", "sections", "through", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "E17", ".", "5", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "littermates", "showing", "the", "neocortex", "(", "NCx", ")", "and", "olfactory", "bulb", "(", "OB", ";", "dashed", "line", ")", ".", "B", "-", "Expression", "pattern", "of", "Grm1", "mRNA", "in", "OB", "(", "dotted", "line", ")", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", ".", "C", "-", "Quantification", "of", "OB", "perimeter", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "symbols", "indicate", "values", "for", "individual", "embryos", ")", ";", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "N", "=", "14", "replicates", "per", "genotype", ".", "D", "-", "Immunostains", "of", "E17", ".", "5", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "brains", "showing", "the", "distribution", "of", "progenitor", "cells", "(", "Ki67", ",", "red", ")", "and", "neurons", "(", "Tuj1", ",", "green", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "rosettes", ".", "Sp", ",", "septum", ".", "E", "-", "Detail", "of", "a", "rosette", "from", "an", "E17", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryo", "displaying", "typical", "features", ":", "closed", "apical", "surface", "(", "dotted", "line", ")", "with", "PH3", "+", "apical", "mitoses", "(", "white", "arrowhead", ")", "and", "basal", "mitoses", ",", "surrounded", "by", "Tuj1", "+", "neurons", "(", "green", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "the", "basal", "border", "of", "the", "rosette", ".", "F", "-", "Rostral", "half", "of", "an", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "E17", ".", "5", "brain", "immunostained", "for", "Pax6", ",", "clarified", "and", "segmented", "to", "reveal", "rosettes", "(", "yellow", ")", ".", "C", ",", "caudal", ";", "R", ",", "rostral", ".", "G", ",", "H", "-", "BrdU", "incorporation", "and", "cell", "cycle", "re", "-", "entry", "analysis", "with", "the", "progenitor", "cell", "marker", "Ki67", "at", "E17", ".", "5", ",", "in", "the", "rostral", "cortex", "of", "control", "embryos", "compared", "to", "rostral", "rosettes", "of", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", ".", "Dotted", "lines", "indicate", "apical", "surface", ",", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "border", "of", "VZ", ".", "Arrowheads", "indicate", "double", "-", "positive", "cells", ".", "Data", "in", "histograms", "are", "mean", "±", "SEM", ",", "symbols", "indicate", "values", "for", "individual", "embryos", ";", "n", "≥", "3", "embryos", ";", "X2", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "I", "-", "Apical", "lumen", "of", "rosettes", "immunostained", "against", "apical", "complex", "proteins", "(", "Par3", ",", "β", "-", "Catenin", ")", ",", "primary", "cilia", "(", "Arl13b", ")", ",", "apical", "mitoses", "(", "PhVim", ")", "and", "neurons", "(", "Tuj1", ")", ".", "J", "-", "Coronal", "section", "through", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "an", "E14", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryo", "illustrating", "the", "high", "abundance", "and", "location", "of", "rosettes", "(", "arrows", ")", ",", "as", "revealed", "by", "the", "distribution", "of", "mitoses", "(", "PH3", ")", "and", "neurons", "(", "Tuj1", ")", ".", "K", "-", "S", "-", "Analysis", "of", "the", "regional", "identity", "of", "rosettes", "in", "E14", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", ".", "(", "K", ")", "Schema", "of", "normal", "transcription", "factor", "expression", "patterns", "defining", "telencephalic", "regional", "identity", ".", "Expression", "of", "Ngn2", ",", "Tbr2", "and", "Pax6", "identifies", "rosettes", "in", "the", "rostro", "-", "dorsal", "telencephalon", "as", "having", "dorsal", "identity", "(", "L", "-", "N", ",", "P", ")", ";", "Gsx2", ",", "Dlx2", "and", "Dlx5", "identify", "rosettes", "in", "the", "ventral", "telencephalon", "as", "having", "ventral", "identity", "(", "O", ",", "Q", ")", ";", "Nkx2", ".", "1", "identifies", "MGE", "rosettes", "as", "being", "normotopic", "(", "R", ")", ";", "absence", "of", "Gsx2", "in", "LGE", "rosette", "cells", "identifies", "them", "as", "ectopic", "(", "S", ")", ".", "Tuj1", "labels", "neurons", ".", "In", "(", "L", ",", "M", ")", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "border", "between", "dorsal", "and", "ventral", "territories", ",", "and", "dotted", "line", "indicates", "the", "outer", "border", "of", "the", "telencephalon", ".", "LGE", ",", "lateral", "ganglionic", "eminence", ";", "MGE", ",", "medial", "ganglionic", "eminence", ";", "P", ",", "pallium", ";", "SP", ",", "subpallium", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A - DAPI stain of sagittal sections through the rostral telencephalon of E17.5 control and Rx-Dicer mutant littermates showing the neocortex (NCx) and olfactory bulb (OB; dashed line).B - Expression pattern of Grm1 mRNA in OB (dotted line) of control and Rx-Dicer mutants. C - Quantification of OB perimeter (mean ± SEM; symbols indicate values for individual embryos); t-test, ***P < 0.001. N = 14 replicates per genotype. D - Immunostains of E17.5 control and Rx-Dicer mutant brains showing the distribution of progenitor cells (Ki67, red) and neurons (Tuj1, green). Arrowheads indicate rosettes. Sp, septum.E - Detail of a rosette from an E17.5 Rx-Dicer mutant embryo displaying typical features: closed apical surface (dotted line) with PH3+ apical mitoses (white arrowhead) and basal mitoses, surrounded by Tuj1+ neurons (green). Dashed line indicates the basal border of the rosette.F - Rostral half of an Rx-Dicer mutant E17.5 brain immunostained for Pax6, clarified and segmented to reveal rosettes (yellow). C, caudal; R, rostral.G,H - BrdU incorporation and cell cycle re-entry analysis with the progenitor cell marker Ki67 at E17.5, in the rostral cortex of control embryos compared to rostral rosettes of Rx-Dicer mutants. Dotted lines indicate apical surface, dashed lines indicate basal border of VZ. Arrowheads indicate double-positive cells. Data in histograms are mean ± SEM, symbols indicate values for individual embryos; n ≥ 3 embryos; X2-test, *P < 0.05, ***P < 0.001.I - Apical lumen of rosettes immunostained against apical complex proteins (Par3, β-Catenin), primary cilia (Arl13b), apical mitoses (PhVim) and neurons (Tuj1).J - Coronal section through the rostral telencephalon of an E14.5 Rx-Dicer mutant embryo illustrating the high abundance and location of rosettes (arrows), as revealed by the distribution of mitoses (PH3) and neurons (Tuj1). K-S - Analysis of the regional identity of rosettes in E14.5 Rx-Dicer mutants. (K) Schema of normal transcription factor expression patterns defining telencephalic regional identity. Expression of Ngn2, Tbr2 and Pax6 identifies rosettes in the rostro-dorsal telencephalon as having dorsal identity (L-N,P); Gsx2, Dlx2 and Dlx5 identify rosettes in the ventral telencephalon as having ventral identity (O,Q); Nkx2.1 identifies MGE rosettes as being normotopic (R); absence of Gsx2 in LGE rosette cells identifies them as ectopic (S). Tuj1 labels neurons. In (L,M), arrowheads indicate the border between dorsal and ventral territories, and dotted line indicates the outer border of the telencephalon. LGE, lateral ganglionic eminence; MGE, medial ganglionic eminence; P, pallium; SP, subpallium. "}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "Coronal", "section", "through", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "an", "E14", ".", "5", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryo", "displaying", "the", "three", "types", "of", "rosettes", ".", "B", "-", "High", "magnification", "of", "rosettes", "in", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", "at", "E12", ".", "5", "(", "Type", "1", ")", ",", "E14", ".", "5", "(", "Type", "2", ")", "and", "E17", ".", "5", "(", "Type", "3", ")", ",", "immunostained", "for", "PH3", "and", "Tuj1", ".", "Dashed", "line", "indicates", "ventricular", "surface", ";", "arrowheads", "indicate", "basal", "mitoses", ";", "arrows", "indicate", "a", "stream", "of", "apical", "mitoses", "connecting", "the", "lumen", "of", "the", "rosette", "with", "the", "lumen", "of", "the", "telencephalic", "ventricle", ".", "C", ",", "D", "-", "Abundance", "of", "rosette", "types", "at", "the", "indicated", "ages", "(", "C", ")", ",", "and", "rostro", "-", "caudal", "distribution", "of", "total", "rosette", "abundance", "per", "age", ",", "independent", "of", "type", "(", "D", ")", ".", "n", "≥", "2", "brains", "per", "age", ".", "F", ",", "G", "-", "Distribution", "of", "neurons", "(", "Tuj1", "+", "cells", ")", "and", "apical", "adherens", "junction", "protein", "Par3", "in", "the", "OB", "primordium", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", "at", "the", "indicated", "ages", ".", "Dotted", "lines", "indicate", "basal", "border", ",", "dashed", "lines", "indicate", "apical", "border", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "ectopic", "neurons", "and", "/", "or", "absence", "of", "Par3", ".", "Arrow", "in", "(", "G", ")", "indicates", "accumulation", "of", "Par3", "at", "the", "lumen", "of", "a", "nascent", "rosette", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A - Coronal section through the rostral telencephalon of an E14.5 Rx-Dicer mutant embryo displaying the three types of rosettes.B - High magnification of rosettes in Rx-Dicer mutants at E12.5 (Type 1), E14.5 (Type 2) and E17.5 (Type 3), immunostained for PH3 and Tuj1. Dashed line indicates ventricular surface; arrowheads indicate basal mitoses; arrows indicate a stream of apical mitoses connecting the lumen of the rosette with the lumen of the telencephalic ventricle.C,D - Abundance of rosette types at the indicated ages (C), and rostro-caudal distribution of total rosette abundance per age, independent of type (D). n ≥ 2 brains per age.F,G - Distribution of neurons (Tuj1+ cells) and apical adherens junction protein Par3 in the OB primordium of control and Rx-Dicer mutant embryos at the indicated ages. Dotted lines indicate basal border, dashed lines indicate apical border. White arrowheads indicate ectopic neurons and/or absence of Par3. Arrow in (G) indicates accumulation of Par3 at the lumen of a nascent rosette."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "-", "Changes", "in", "expression", "levels", "of", "miRNAs", "between", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", "at", "E11", ".", "5", "in", "the", "rostral", "telencephalon", ".", "Red", "dots", "indicate", "statistically", "differentially", "expressed", "miRNAs", "according", "to", "FDR", "correction", "of", "P", "values", "based", "on", "the", "Wald", "statistic", "(", "DESeq2", "analysis", ")", "(", "B", ")", ".", "Dashes", "lines", "indicate", "stringency", "limits", "in", "evaluation", "of", "results", ".", "D", ",", "E", "-", "Changes", "in", "mRNA", "expression", "levels", "between", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutants", "at", "E11", ".", "5", "in", "the", "rostral", "telencephalon", ".", "Statistically", "differentially", "expressed", "mRNAs", "according", "to", "FDR", "correction", "of", "P", "values", "based", "on", "the", "Wald", "statistic", "(", "DESeq2", "analysis", ";", "Adj", ".", "P", "<", "0", ".", "1", "and", "FC", ">", "1", ".", "25", ")", "are", "highlighted", "in", "red", ",", "and", "the", "three", "with", "the", "highest", "Adj", ".", "P", "value", "are", "identified", "by", "name", ".", "Blue", "dot", "indicates", "Irs2", ":", "FC", "=", "1", ".", "748", ",", "Adj", ".", "P", "=", "5", ".", "95e", "-", "08", ".", "G", "-", "Heatmaps", "of", "relative", "expression", "levels", "of", "DEGs", "related", "to", "apoptosis", "(", "top", ")", "and", "proliferation", "(", "bottom", ")", ".", "Rows", "correspond", "to", "independent", "biological", "replicates", ".", "Indicated", "are", "some", "example", "genes", ".", "H", "-", "Enrichment", "plots", "from", "GSEA", "for", "MSigDB", "Hallmark", "Neurogenesis", "(", "NES", "=", "2", ".", "98", ";", "p", "=", "0", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "00045", ")", ",", "Regulation", "of", "cell", "proliferation", "(", "NES", "=", "2", ".", "40", ";", "p", "=", "0", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "0033", ")", ",", "Positive", "regulation", "of", "cell", "adhesion", "(", "NES", "=", "2", ".", "06", ";", "p", "=", "0", ".", "0058", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "013", ")", ",", "Regulation", "of", "response", "to", "stress", "(", "NES", "=", "2", ".", "50", ";", "p", "=", "0", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "0023", ")", ",", "Positive", "regulation", "of", "cell", "death", "(", "NES", "=", "1", ".", "84", ";", "p", "=", "0", ".", "0179", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "0326", ")", ",", "Apoptotic", "signaling", "pathway", "(", "NES", "=", "1", ".", "59", ";", "p", "=", "0", ".", "047", ";", "Adj", ".", "P", "=", "0", ".", "084", ")", ".", "I", ",", "J", "-", "ISH", "stains", "of", "Irs2", "mRNA", ",", "and", "qPCR", "for", "Irs2", "mRNA", "and", "let", "-", "7", "-", "5p", "miRNA", ",", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", ".", "Dashed", "line", "indicates", "basal", "border", ",", "dotted", "line", "indicates", "apical", "surface", ".", "Arrowheads", "indicate", "area", "with", "the", "greatest", "increase", "in", "Irs2", "expression", ".", "BG", ",", "basal", "ganglia", ";", "H", ",", "hippocampus", ";", "NCx", ",", "neocortex", ";", "OB", ",", "olfactory", "bulb", ";", "Spt", ",", "septum", ".", "Histograms", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "logarithmic", "scale", ")", ";", "symbols", "in", "plots", "indicate", "values", "for", "individual", "embryos", ";", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "N", "=", "6", "-", "9", "replicates", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A,B - Changes in expression levels of miRNAs between control and Rx-Dicer mutants at E11.5 in the rostral telencephalon. Red dots indicate statistically differentially expressed miRNAs according to FDR correction of P values based on the Wald statistic (DESeq2 analysis) (B). Dashes lines indicate stringency limits in evaluation of results.D,E - Changes in mRNA expression levels between control and Rx-Dicer mutants at E11.5 in the rostral telencephalon. Statistically differentially expressed mRNAs according to FDR correction of P values based on the Wald statistic (DESeq2 analysis; Adj. P < 0.1 and FC > 1.25) are highlighted in red, and the three with the highest Adj. P value are identified by name. Blue dot indicates Irs2: FC=1.748, Adj. P = 5.95e-08.G - Heatmaps of relative expression levels of DEGs related to apoptosis (top) and proliferation (bottom). Rows correspond to independent biological replicates. Indicated are some example genes.H - Enrichment plots from GSEA for MSigDB Hallmark Neurogenesis (NES = 2.98; p = 0; Adj. P = 0.00045), Regulation of cell proliferation (NES = 2.40; p=0; Adj. P = 0.0033), Positive regulation of cell adhesion (NES = 2.06; p = 0.0058; Adj. P = 0.013), Regulation of response to stress (NES = 2.50; p = 0; Adj. P = 0.0023), Positive regulation of cell death (NES = 1.84; p = 0.0179; Adj. P = 0.0326), Apoptotic signaling pathway (NES = 1.59; p= 0.047; Adj. P = 0.084).I,J - ISH stains of Irs2 mRNA, and qPCR for Irs2 mRNA and let-7-5p miRNA, in the rostral telencephalon of control and Rx-Dicer mutant embryos. Dashed line indicates basal border, dotted line indicates apical surface. Arrowheads indicate area with the greatest increase in Irs2 expression. BG, basal ganglia; H, hippocampus; NCx, neocortex; OB, olfactory bulb; Spt, septum. Histograms represent mean ± SEM (logarithmic scale); symbols in plots indicate values for individual embryos; t-test, *P <0.05, **P <0.01. N = 6-9 replicates per group. Scale bar, 100 µm."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "-", "Immunostains", "for", "activated", "p53", "(", "red", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "control", "and", "Rx", "-", "Dicer", "mutant", "embryos", "at", "E12", ".", "5", ",", "and", "quantification", "of", "positive", "cells", "(", "C", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "apical", "side", ",", "dotted", "lines", "indicate", "basal", "side", ".", "N", "=", "4", "replicates", "per", "genotype", ".", "Scale", "bar", ",", "50µm", ".", "D", "-", "L", "-", "Rostral", "telencephalon", "of", "E12", ".", "5", "embryos", "of", "the", "indicated", "genotypes", "immunostained", "for", "the", "detection", "of", "apoptotic", "cells", "(", "Casp3", ")", ",", "neurons", "(", "Tuj1", ")", "and", "the", "apical", "complex", "protein", "Par3", ",", "and", "quantification", "of", "cells", "positive", "for", "Casp3", "(", "H", ")", ".", "N", "=", "4", "-", "7", "replicates", "per", "genotype", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "M", "-", "O", "-", "Sagittal", "sections", "through", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "E17", ".", "5", "embryos", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Note", "the", "rosettes", "and", "general", "disorganization", "in", "Rx", "-", "Dicer", "single", "mutants", ",", "and", "complete", "rescue", "of", "this", "phenotype", "in", "Rx", "-", "Dicer", "-", "p53", "double", "mutants", ".", "NCx", ",", "neocortex", ";", "OB", ",", "olfactory", "bulb", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C - Immunostains for activated p53 (red) in the rostral telencephalon of control and Rx-Dicer mutant embryos at E12.5, and quantification of positive cells (C). Dashed lines indicate apical side, dotted lines indicate basal side. N = 4 replicates per genotype. Scale bar, 50µm.D-L - Rostral telencephalon of E12.5 embryos of the indicated genotypes immunostained for the detection of apoptotic cells (Casp3), neurons (Tuj1) and the apical complex protein Par3, and quantification of cells positive for Casp3 (H). N = 4-7 replicates per genotype. Scale bar, 50 µm.M-O - Sagittal sections through the rostral telencephalon of E17.5 embryos of the indicated genotypes. Note the rosettes and general disorganization in Rx-Dicer single mutants, and complete rescue of this phenotype in Rx-Dicer-p53 double mutants. NCx, neocortex; OB, olfactory bulb. Scale bar, 1 mm."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "Relative", "Irs2", "mRNA", "levels", "in", "HEK", "cells", "upon", "transfection", "with", "Gfp", "-", "or", "Irs2", "-", "encoding", "plasmids", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "N", "=", "6", "replicates", "per", "group", ".", "B", "-", "D", "-", "Distribution", "of", "neurons", "(", "Tuj1", ",", "red", ")", ",", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mitoses", "(", "PH3", ",", "white", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "wild", "-", "type", "E14", ".", "5", "or", "E17", ".", "5", "mouse", "embryos", ",", "as", "indicated", ",", "electroporated", "at", "E12", ".", "5", "with", "the", "indicated", "plasmid", "combinations", ".", "Dashed", "line", "indicates", "the", "apical", "surface", ".", "Insets", "show", "the", "same", "field", "of", "view", ",", "with", "location", "and", "extent", "of", "electroporations", ".", "Note", "the", "overlap", "of", "rosettes", "(", "arrows", ")", "with", "ectopic", "neurons", "at", "the", "apical", "surface", "(", "arrowheads", ")", "and", "increased", "basal", "mitoses", ",", "upon", "overexpression", "of", "Irs2", "(", "C", ")", ".", "Asterisk", "indicates", "absence", "of", "malformation", "in", "nearby", "cortex", ".", "At", "E17", ".", "5", "(", "D", ")", "GFP", "+", "rosettes", "remain", "in", "deep", "cortical", "layers", "(", "arrowheads", ")", ".", "E", "-", "H", "-", "Details", "of", "rosettes", "(", "large", "arrows", "in", "E", ";", "dashed", "lines", "in", "F", "-", "H", ")", "from", "Irs2", "+", "Gfp", "-", "overexpressing", "E14", ".", "5", "embryos", "immunostained", "as", "indicated", ".", "Small", "arrows", "indicate", "apical", "mitoses", ",", "arrowheads", "indicate", "basal", "mitoses", "(", "F", ",", "G", ")", "and", "Par3", "+", "apical", "surface", "at", "the", "centre", "of", "rosettes", "(", "H", ")", ",", "dotted", "lines", "indicate", "apical", "surface", ",", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "side", "of", "rosettes", ".", "Inset", "in", "(", "H", ")", "is", "at", "the", "same", "scale", ".", "I", "-", "M", "-", "Distribution", "of", "neurons", "(", "Tuj1", ",", "red", ")", ",", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mitotic", "(", "PH3", ",", "white", ")", "or", "apoptotic", "(", "Casp3", ",", "white", ")", "cells", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "wild", "-", "type", "E13", ".", "5", "embryos", "electroporated", "at", "E12", ".", "5", "with", "the", "indicated", "plasmids", ",", "and", "quantification", "of", "Casp3", "+", "cells", "(", "M", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "apical", "surface", ",", "dotted", "lines", "indicate", "borders", "of", "the", "cortical", "plate", "(", "CP", ")", ".", "Nascent", "rosettes", "(", "arrows", ")", "are", "next", "to", "ectopic", "ventricular", "neurons", "(", "arrowheads", "in", "K", "'", ")", "and", "basal", "mitoses", ",", "without", "significant", "apoptosis", "in", "VZ", "(", "L", "'", ",", "M", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", "t", "-", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "N", "=", "3", "-", "6", "replicates", "per", "group", ".", "N", "-", "Distribution", "of", "neurons", "(", "Tuj1", ",", "red", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "wild", "-", "type", "E14", ".", "5", "embryos", "electroporated", "at", "E12", ".", "5", "with", "a", "combination", "of", "plasmids", "encoding", "Irs2", ",", "let", "-", "7a", ",", "let", "-", "7b", "and", "let", "-", "7c", ",", "and", "Gfp", ".", "Dashed", "line", "indicates", "apical", "surface", ".", "Formation", "of", "rosettes", "in", "Irs2", "-", "expressing", "embryos", "is", "rescued", "by", "overexpression", "of", "let", "-", "7", ".", "Inset", "shows", "the", "same", "field", "of", "view", ",", "with", "location", "and", "extent", "of", "electroporation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A - Relative Irs2 mRNA levels in HEK cells upon transfection with Gfp- or Irs2-encoding plasmids. Mean ± SEM; t-test, ****P < 0.0001. N = 6 replicates per group.B-D - Distribution of neurons (Tuj1, red), GFP (green) and mitoses (PH3, white) in the rostral telencephalon of wild-type E14.5 or E17.5 mouse embryos, as indicated, electroporated at E12.5 with the indicated plasmid combinations. Dashed line indicates the apical surface. Insets show the same field of view, with location and extent of electroporations. Note the overlap of rosettes (arrows) with ectopic neurons at the apical surface (arrowheads) and increased basal mitoses, upon overexpression of Irs2 (C). Asterisk indicates absence of malformation in nearby cortex. At E17.5 (D) GFP+ rosettes remain in deep cortical layers (arrowheads).E-H - Details of rosettes (large arrows in E; dashed lines in F-H) from Irs2+Gfp-overexpressing E14.5 embryos immunostained as indicated. Small arrows indicate apical mitoses, arrowheads indicate basal mitoses (F,G) and Par3+ apical surface at the centre of rosettes (H), dotted lines indicate apical surface, dashed lines indicate basal side of rosettes. Inset in (H) is at the same scale.I-M - Distribution of neurons (Tuj1, red), GFP (green) and mitotic (PH3, white) or apoptotic (Casp3, white) cells in the rostral telencephalon of wild-type E13.5 embryos electroporated at E12.5 with the indicated plasmids, and quantification of Casp3+ cells (M). Dashed line indicates apical surface, dotted lines indicate borders of the cortical plate (CP). Nascent rosettes (arrows) are next to ectopic ventricular neurons (arrowheads in K') and basal mitoses, without significant apoptosis in VZ (L',M). Mean ± SEM; t-test; ns, not significant, *P < 0.05. N = 3-6 replicates per group. N - Distribution of neurons (Tuj1, red) in the rostral telencephalon of wild-type E14.5 embryos electroporated at E12.5 with a combination of plasmids encoding Irs2, let-7a, let-7b and let-7c, and Gfp. Dashed line indicates apical surface. Formation of rosettes in Irs2-expressing embryos is rescued by overexpression of let-7. Inset shows the same field of view, with location and extent of electroporation. "}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "Frequency", "of", "rosette", "formation", "in", "the", "experimental", "conditions", "indicated", ".", "n", ",", "number", "of", "embryos", "per", "condition", ".", "B", "-", "G", "-", "Distribution", "of", "neurons", "(", "Tuj1", ",", "red", ")", ",", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mitoses", "(", "PH3", ",", "white", ")", "in", "the", "rostral", "telencephalon", "of", "wild", "-", "type", "E14", ".", "5", "mouse", "embryos", "electroporated", "at", "E12", ".", "5", "with", "the", "indicated", "plasmid", "combinations", ".", "Inset", "shows", "the", "same", "field", "of", "view", ",", "with", "location", "and", "extent", "of", "electroporations", ".", "In", "(", "C", ")", "and", "(", "E", ")", ",", "arrows", "indicate", "rosettes", "and", "arrowheads", "indicate", "neuronal", "ventricular", "ectopias", ".", "(", "D", ")", "and", "(", "F", ")", "are", "high", "magnification", "details", "of", "individual", "rosettes", "(", "dashed", "lines", ")", ",", "where", "arrowheads", "indicate", "apical", "and", "basal", "mitoses", ".", "Loss", "of", "endogenous", "let", "-", "7", "drives", "the", "formation", "of", "rosettes", "and", "ventricular", "neuronal", "ectopias", "(", "C", ")", ",", "which", "is", "rescued", "with", "the", "additional", "loss", "of", "Irs2", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A - Frequency of rosette formation in the experimental conditions indicated. n, number of embryos per condition.B-G - Distribution of neurons (Tuj1, red), GFP (green) and mitoses (PH3, white) in the rostral telencephalon of wild-type E14.5 mouse embryos electroporated at E12.5 with the indicated plasmid combinations. Inset shows the same field of view, with location and extent of electroporations. In (C) and (E), arrows indicate rosettes and arrowheads indicate neuronal ventricular ectopias. (D) and (F) are high magnification details of individual rosettes (dashed lines), where arrowheads indicate apical and basal mitoses. Loss of endogenous let-7 drives the formation of rosettes and ventricular neuronal ectopias (C), which is rescued with the additional loss of Irs2 (G)."}
{"words": ["Figure", "8B", "-", "G", "-", "Stains", "and", "quantifications", "of", "human", "cerebral", "organoids", "electroporated", "with", "the", "indicated", "construct", "combinations", ",", "to", "reveal", "the", "frequency", "of", "electroporated", "cells", "remaining", "as", "progenitors", "(", "%", "GFP", "+", "Ki67", "+", "/", "GFP", "+", ")", ".", "Histograms", "represent", "mean", "±", "SEM", ";", "symbols", "in", "plots", "indicate", "values", "for", "individual", "organoids", ";", "X2", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "N", "=", "8", "-", "11", "replicates", "per", "group", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "ventricular", "surface", ",", "solid", "arrowheads", "indicate", "Ki67", "+", "/", "GFP", "+", "cells", ",", "open", "arrowheads", "indicate", "Ki67", "-", "/", "GFP", "+", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B-G - Stains and quantifications of human cerebral organoids electroporated with the indicated construct combinations, to reveal the frequency of electroporated cells remaining as progenitors (%GFP+Ki67+/GFP+). Histograms represent mean ± SEM; symbols in plots indicate values for individual organoids; X2-test, *P < 0.05. N = 8-11 replicates per group. Dashed lines indicate ventricular surface, solid arrowheads indicate Ki67+/GFP+ cells, open arrowheads indicate Ki67-/GFP+ cells. Scale bars, 50 µm."}
{"words": ["Figure", "1q", "-", "RT", "-", "PCR", "reveals", "that", "miR", "-", "181a", "/", "b", "silencing", "leads", "to", "upregulation", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "predicted", "targets", "in", "SH", "-", "SY5Y", "cells", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "miR", "-", "181", "-", "mimic", "transfection", "specifically", "inhibits", "Luciferase", "activity", "of", "constructs", "containing", "WT", "3", "'", "-", "UTR", "predicted", "target", "sequences", ".", "Point", "mutations", "(", "mut", ")", "in", "miR", "-", "181a", "/", "b", "binding", "sites", "abolish", "Luciferase", "repression", "in", "all", "cases", "apart", "from", "PPARGC1A", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "negative", "mimic", "transfection", "(", "dashed", "line", ")", ".", "N", "=", "6", "independent", "experiments", ".", "q", "-", "RT", "-", "PCR", "reveals", "upregulation", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "targets", "in", "the", "eyes", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "vs", ".", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "animals", ".", "n", "≥", "5", "animals", "/", "genotype", ".", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", "show", "increased", "mtDNA", "content", "vs", ".", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "mice", "as", "measured", "by", "q", "-", "PCR", ".", "N", "=", "4", "animals", "/", "genotype", ".", "WB", "analysis", "(", "left", "panel", ")", "reveals", "increased", "levels", "of", "mitochondrial", "proteins", "in", "the", "eyes", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "(", "-", "/", "-", ")", "vs", ".", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "(", "+", "/", "+", ")", "mice", "(", "quantified", "in", "the", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "either", "p115", "or", "Gapdh", ".", "N", "≥", "3", "animals", "/", "genotype", ".", "Please", "note", "that", "all", "compared", "bands", "from", "+", "/", "+", "and", "-", "/", "-", "samples", "are", "from", "the", "same", "blots", "which", "were", "cropped", "and", "shown", "split", "for", "the", "sake", "of", "data", "presentation", "clarity", ".", "WB", "analysis", "on", "mitochondrial", "and", "cytosolic", "fractions", "(", "left", "panel", ")", "show", "increased", "levels", "of", "p62", "and", "Parkin", "in", "mitochondrial", "fraction", "from", "the", "eye", "of", "-", "/", "-", "vs", ".", "+", "/", "+", "mice", "(", "quantified", "in", "the", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "Ndufb8", "or", "Gapdh", "for", "mitochondrial", "and", "cytosolic", "fractions", ",", "respectively", ".", "N", "=", "3", "animals", "/", "genotype", ".", "Cell", "death", "analysis", "shows", "that", "miR", "-", "181a", "/", "b", "silencing", "protects", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "from", "FCCP", "treatment", ".", "N", "≥", "7", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1q-RT-PCR reveals that miR-181a/b silencing leads to upregulation of miR-181a/b predicted targets in SH-SY5Y cells. N=3 independent experiments.miR-181-mimic transfection specifically inhibits Luciferase activity of constructs containing WT 3'-UTR predicted target sequences. Point mutations (mut) in miR-181a/b binding sites abolish Luciferase repression in all cases apart from PPARGC1A. Data are normalized to negative mimic transfection (dashed line). N=6 independent experiments.q-RT-PCR reveals upregulation of miR-181a/b targets in the eyes of miR-181a/b-1-/- vs. miR-181a/b-1+/+ animals. n≥5 animals/genotype.miR-181a/b-1-/- mice show increased mtDNA content vs. miR-181a/b-1+/+ mice as measured by q-PCR. N=4 animals/genotype.WB analysis (left panel) reveals increased levels of mitochondrial proteins in the eyes of miR-181a/b-1-/- (-/-) vs. miR-181a/b-1+/+ (+/+) mice (quantified in the right panel). Data are normalized to either p115 or Gapdh. N≥3 animals/genotype. Please note that all compared bands from +/+ and -/- samples are from the same blots which were cropped and shown split for the sake of data presentation clarity.WB analysis on mitochondrial and cytosolic fractions (left panel) show increased levels of p62 and Parkin in mitochondrial fraction from the eye of -/- vs. +/+ mice (quantified in the right panel). Data are normalized to Ndufb8 or Gapdh for mitochondrial and cytosolic fractions, respectively. N=3 animals/genotype.Cell death analysis shows that miR-181a/b silencing protects SH-SY5Y cells from FCCP treatment. N≥7 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2TUNEL", "assays", "on", "eye", "and", "brain", "sections", "of", "stage", "(", "st", ")", "30", "medakafish", "control", "and", "MO", "-", "injected", "embryos", "reveal", "a", "decrease", "in", "the", "number", "of", "apoptotic", "cells", "in", "both", "hccs", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "and", "cox7b", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "injected", "compared", "to", "hccs", "-", "MO", "-", "and", "cox7b", "-", "MO", "-", "injected", "embryos", ".", "Scale", "bars", "are", "20μm", ".", "TUNEL", "-", "positive", "cells", "/", "eye", ".", "n", "≥", "5", "eyes", "for", "each", "model", ".", "Caspase", "assays", "show", "restored", "levels", "of", "caspase", "-", "3", "and", "caspase", "-", "9", "activities", "in", "hccs", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "and", "cox7b", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "injected", "embryos", "with", "respect", "to", "hccs", "-", "MO", "-", "and", "cox7b", "-", "MO", "-", "injected", "embryos", ".", "n", "≥", "5", "embryos", "for", "each", "model", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TUNEL assays on eye and brain sections of stage (st)30 medakafish control and MO-injected embryos reveal a decrease in the number of apoptotic cells in both hccs-MO/miR-181a/b-MO- and cox7b-MO/miR-181a/b-MO-injected compared to hccs-MO- and cox7b-MO-injected embryos. Scale bars are 20μm.TUNEL-positive cells/eye. n≥5 eyes for each model.Caspase assays show restored levels of caspase-3 and caspase-9 activities in hccs-MO/miR-181a/b-MO- and cox7b-MO/miR-181a/b-MO-injected embryos with respect to hccs-MO- and cox7b-MO-injected embryos. n≥5 embryos for each model."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "images", "of", "st30", "medaka", "embryos", "injected", "with", "hccs", "-", "MO", "(", "B", ")", "alone", "or", "co", "-", "injected", "with", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MOs", "Co", "-", "injection", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MOs", "rescues", "microphthalmia", "and", "microcephaly", "in", "both", "hccs", "-", "MO", "embryos", ".", "hccs", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "b", "-", "MO", "-", "injected", "embryos", "were", "treated", "with", "Baf", "-", "A1", ",", "PD98059", "or", "HA14", "-", "1", ".", "Baf", "-", "A1", "treatment", "counteracts", "the", "protective", "effect", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "downregulation", "in", "hccs", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "embryos", "PD98059", "treatment", "does", "not", "interfere", "with", "the", "modulation", "of", "the", "MLS", "phenotype", "mediated", "by", "miR", "-", "181a", "/", "b", "downregulation", "HA14", "-", "1", "treatment", "counteracts", "the", "effect", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "downregulation", "in", "the", "hccs", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "model", "Scale", "bars", "are", "100μm", ".", "Representative", "images", "of", "st30", "medaka", "embryos", "injected", "with", "cox7b", "-", "MO", "(", "H", ")", "alone", "or", "co", "-", "injected", "with", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MOs", "Co", "-", "injection", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MOs", "rescues", "microphthalmia", "and", "microcephaly", "in", "cox7b", "-", "MO", "embryos", ".", "cox7b", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "-", "injected", "embryos", "were", "treated", "with", "Baf", "-", "A1", ",", "PD98059", "or", "HA14", "-", "1", ".", "Baf", "-", "A1", "treatment", "counteracts", "the", "protective", "effect", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "downregulation", "in", "cox7b", "-", "MO", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "MO", "embryos", "PD98059", "treatment", "does", "not", "interfere", "with", "the", "modulation", "of", "the", "MLS", "phenotype", "mediated", "by", "miR", "-", "181a", "/", "b", "downregulation", "Scale", "bars", "are", "100μm", ".", "Percentage", "of", "embryos", "with", "or", "without", "MLS", "phenotype", "in", "the", "different", "conditions", "in", "hccs", "-", "MO", "embryos", ".", "N", "≥", "300", "embryos", "/", "conditions", ".", "Percentage", "of", "embryos", "with", "or", "without", "MLS", "phenotype", "in", "the", "different", "conditions", "in", "cox7b", "-", "MO", "(", "N", ")", "embryos", ".", "N", "≥", "300", "embryos", "/", "conditions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative images of st30 medaka embryos injected with hccs-MO (B) alone or co-injected with miR-181a/b-MOs Co-injection of miR-181a/b-MOs rescues microphthalmia and microcephaly in both hccs-MO embryos. hccs-MO/miR-181a/b-MO- b-MO-injected embryos were treated with Baf-A1, PD98059 or HA14-1. Baf-A1 treatment counteracts the protective effect of miR-181a/b downregulation in hccs-MO/miR-181a/b-MO embryos PD98059 treatment does not interfere with the modulation of the MLS phenotype mediated by miR-181a/b downregulation HA14-1 treatment counteracts the effect of miR-181a/b downregulation in the hccs-MO/miR-181a/b-MO model Scale bars are 100μm.Representative images of st30 medaka embryos injected with cox7b-MO (H) alone or co-injected with miR-181a/b-MOs Co-injection of miR-181a/b-MOs rescues microphthalmia and microcephaly in cox7b-MO embryos. cox7b-MO/miR-181a/b-MO-injected embryos were treated with Baf-A1, PD98059 or HA14-1. Baf-A1 treatment counteracts the protective effect of miR-181a/b downregulation in cox7b-MO/miR-181a/b-MO embryos PD98059 treatment does not interfere with the modulation of the MLS phenotype mediated by miR-181a/b downregulation Scale bars are 100μm.Percentage of embryos with or without MLS phenotype in the different conditions in hccs-MO embryos. N≥300 embryos/conditions.Percentage of embryos with or without MLS phenotype in the different conditions in cox7b-MO (N) embryos. N≥300 embryos/conditions."}
{"words": ["Figure", "4Immunofluorescence", "analysis", "with", "anti", "-", "NeuN", "antibody", "in", "the", "retina", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "and", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", "intravitreally", "injected", "with", "Rotenone", "or", "DMSO", ".", "RGCs", "are", "preserved", "in", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "rotenone", "-", "injected", "mice", "with", "respect", "to", "controls", "at", "both", "one", "and", "two", "weeks", "after", "injection", ".", "Scale", "bars", "are", "50μm", ".", "Number", "of", "RGCs", "/", "mm", "(", "indicated", "as", "%", ")", "at", "one", "-", "and", "two", "-", "weeks", "post", "-", "injection", ".", "N", "=", "10", ".", "NADH", "dehydrogenase", "histochemical", "reaction", "on", "retinal", "sections", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "and", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", "intravitreally", "injected", "with", "Rotenone", "or", "DMSO", ".", "At", "one", "week", "post", "-", "injection", ",", "NADH", "dehydrogenase", "activity", "is", "lost", "in", "RGCs", "(", "GCL", ",", "areas", "within", "dashed", "lines", ")", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "Rotenone", "-", "injected", "eyes", ",", "while", "it", "is", "preserved", "in", "those", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "Rotenone", "-", "injected", "eyes", ".", "GCL", ",", "Ganglion", "Cells", "Layer", "ONL", ";", "INL", ",", "Inner", "Nuclear", "Layer", ";", "Outer", "Nuclear", "Layer", ".", "Scale", "bars", "are", "50μm", ".", "Immunofluorescence", "analysis", ",", "with", "an", "anti", "-", "CoxIV", "antibody", ",", "in", "the", "retina", "of", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "+", "/", "+", "and", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", ",", "injected", "with", "either", "Rotenone", "or", "DMSO", ",", "showed", "preserved", "mitochondria", "in", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "rotenone", "-", "injected", "eyes", "at", "one", "-", "week", "post", "-", "injection", ".", "Dashed", "boxes", "indicate", "the", "area", "of", "magnifications", "shown", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", "are", "10μm", ".", "Graphical", "representation", "of", "the", "results", "of", "the", "optokinetic", "tracking", "assays", "reported", "as", "fold", "change", "of", "cycles", "/", "degree", ".", "Visual", "acuity", "is", "preserved", "in", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "rotenone", "-", "injected", "mice", "with", "respect", "to", "controls", "at", "both", "one", "and", "two", "weeks", "after", "injection", ".", "N", "=", "10", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunofluorescence analysis with anti-NeuN antibody in the retina of miR-181a/b-1+/+ and miR-181a/b-1-/- mice intravitreally injected with Rotenone or DMSO. RGCs are preserved in miR-181a/b-1-/- rotenone-injected mice with respect to controls at both one and two weeks after injection. Scale bars are 50μm.Number of RGCs/mm (indicated as %) at one- and two-weeks post-injection. N=10.NADH dehydrogenase histochemical reaction on retinal sections of miR-181a/b-1+/+ and miR-181a/b-1-/- mice intravitreally injected with Rotenone or DMSO. At one week post-injection, NADH dehydrogenase activity is lost in RGCs (GCL, areas within dashed lines) of miR-181a/b-1+/+ Rotenone-injected eyes, while it is preserved in those of miR-181a/b-1-/- Rotenone-injected eyes. GCL, Ganglion Cells Layer ONL; INL, Inner Nuclear Layer; Outer Nuclear Layer. Scale bars are 50μm.Immunofluorescence analysis, with an anti-CoxIV antibody, in the retina of miR-181a/b-1+/+ and miR-181a/b-1-/- mice, injected with either Rotenone or DMSO, showed preserved mitochondria in miR-181a/b-1-/- rotenone-injected eyes at one-week post-injection. Dashed boxes indicate the area of magnifications shown in right panels. Scale bars are 10μm.Graphical representation of the results of the optokinetic tracking assays reported as fold change of cycles/degree. Visual acuity is preserved in miR-181a/b-1-/- rotenone-injected mice with respect to controls at both one and two weeks after injection. N=10."}
{"words": ["Figure", "5Immunofluorescence", "analysis", "with", "anti", "-", "NeuN", "antibody", "in", "the", "retina", "of", "WT", ",", "Ndufs4", "-", "/", "-", ",", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "and", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", ".", "RGCs", "are", "preserved", "in", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "with", "respect", "to", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", "are", "50μm", ".", "Number", "of", "RGCs", "/", "mm", "(", "%", ")", ".", "N", "=", "5", ".", "Graphical", "representation", "of", "the", "results", "of", "the", "optokinetic", "tracking", "assays", "reported", "as", "fold", "change", "of", "cycles", "/", "degree", ".", "Visual", "acuity", "is", "preserved", "in", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "with", "respect", "to", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", ".", "N", "≥", "8", ".", "Electroretinographic", "analysis", "reveals", "amelioration", "of", "b", "-", "wave", "patterns", "in", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "with", "respect", "to", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", ".", "N", "≥", "5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunofluorescence analysis with anti-NeuN antibody in the retina of WT, Ndufs4-/-, Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- and miR-181a/b-1-/- mice. RGCs are preserved in Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- with respect to Ndufs4-/- mice. Scale bars are 50μm.Number of RGCs/mm (%). N=5.Graphical representation of the results of the optokinetic tracking assays reported as fold change of cycles/degree. Visual acuity is preserved in Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- with respect to Ndufs4-/- mice. N≥8.Electroretinographic analysis reveals amelioration of b-wave patterns in Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- with respect to Ndufs4-/-mice. N≥5."}
{"words": ["Figure", "6Electron", "microscopy", "analysis", "shows", "amelioration", "of", "mitochondria", "morphology", "and", "increase", "of", "mitochondrial", "number", "in", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "vs", ".", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", "are", "1μm", ".", "The", "quantitative", "increase", "of", "mitochondria", "is", "reported", "in", "C", "as", "number", "of", "mitochondria", "/", "RGC", ",", "at", "p30", "and", "p55", ".", "N", "≥", "2", "animals", "/", "genotype", ".", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", "show", "increased", "mtDNA", "content", "vs", ".", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", "as", "measured", "by", "q", "-", "PCR", ".", "N", "≥", "4", "animals", "/", "genotype", ".", "Biochemical", "activity", "of", "MRC", "complexes", "I", ",", "II", "and", "IV", "normalized", "by", "the", "percentage", "of", "citrate", "synthase", "(", "CS", ")", "activity", "in", "Ndufs4", "-", "/", "-", "/", "miR", "-", "181a", "/", "b", "-", "1", "-", "/", "-", "vs", ".", "Ndufs4", "-", "/", "-", "mice", ".", "N", "≥", "3", "animals", "/", "genotype", ".", "p", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "two", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "Error", "bars", "are", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Electron microscopy analysis shows amelioration of mitochondria morphology and increase of mitochondrial number in Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- vs. Ndufs4-/- mice. Scale bars are 1μm. The quantitative increase of mitochondria is reported in C as number of mitochondria/RGC, at p30 and p55. N≥2 animals/genotype.Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- mice show increased mtDNA content vs. Ndufs4-/- mice as measured by q-PCR. N≥4 animals/genotype.Biochemical activity of MRC complexes I, II and IV normalized by the percentage of citrate synthase (CS) activity in Ndufs4-/-/miR-181a/b-1-/- vs. Ndufs4-/- mice. N≥3 animals/genotype. p‐values were calculated by two tailed Student's t-test; Error bars are SEM."}
{"words": ["Figure", "2Tap", "-", "1", "is", "required", "for", "the", "secretion", "of", "TseL", ".", "Pellet", "(", "P", ")", "and", "supernatant", "(", "S", ")", "of", "bacterial", "cultures", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "result", "of", "immunoblotting", "with", "antisera", "against", "TseL", "and", "Hcp", "and", "purified", "antibodies", "against", "DnaK", "is", "shown", ".", "The", "asterisk", "marks", "an", "unspecific", "band", ",", "detected", "by", "the", "antiserum", "against", "TseL", ",", "present", "in", "the", "pre", "-", "immunized", "serum", ".", "One", "representative", "experiment", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Tap", "-", "1", "is", "required", "for", "TseL", "-", "mediated", "killing", ".", "Wild", "-", "type", "C6706", "or", "C6706", "lacking", "tsiV1", "were", "exposed", "to", "the", "indicated", "V52", "mutants", "in", "a", "killing", "assay", ".", "The", "y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "surviving", "C6706", ".", "Tap", "-", "1", "is", "required", "for", "TseL", "function", ".", "Killing", "assays", "in", "which", "V52Δtap", "-", "1", "was", "mixed", "with", "wild", "-", "type", "C6706", "or", "mutants", "lacking", "tsiV1", ",", "tsiV2", ",", "or", "tsiV3", ".", "The", "y", "-", "axis", "indicates", "surviving", "C6706", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Tap-1 is required for the secretion of TseL. Pellet (P) and supernatant (S) of bacterial cultures were analyzed by SDS-PAGE. The result of immunoblotting with antisera against TseL and Hcp and purified antibodies against DnaK is shown. The asterisk marks an unspecific band, detected by the antiserum against TseL, present in the pre-immunized serum. One representative experiment of three independent experiments is shown.Tap-1 is required for TseL-mediated killing. Wild-type C6706 or C6706 lacking tsiV1 were exposed to the indicated V52 mutants in a killing assay. The y-axis indicates the number of surviving C6706.Tap-1 is required for TseL function. Killing assays in which V52Δtap-1 was mixed with wild-type C6706 or mutants lacking tsiV1, tsiV2, or tsiV3. The y-axis indicates surviving C6706."}
{"words": ["Figure", "3TseL", "secretion", "depends", "on", "VgrG", "-", "1", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "pellet", "(", "P", ")", "and", "supernatant", "(", "S", ")", "samples", "of", "the", "indicated", "strains", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "with", "antisera", "against", "TseL", "and", "Hcp", "and", "purified", "antibodies", "against", "DnaK", ".", "The", "unspecific", "band", "detected", "by", "rabbit", "serum", "is", "marked", "with", "an", "asterisk", ".", "One", "representative", "of", "three", "experiments", "is", "shown", ".", "VgrG", "-", "1", "is", "required", "for", "TseL", "-", "mediated", "killing", ".", "Killing", "assay", "with", "wild", "-", "type", "V52", "or", "indicated", "mutants", "and", "wild", "-", "type", "C6706", "or", "a", "mutant", "lacking", "the", "immunity", "gene", "tsiV1", ".", "The", "y", "-", "axis", "indicates", "surviving", "C6706", ".", "VasX", "-", "and", "VgrG", "-", "3", "-", "mediated", "killing", "but", "not", "TseL", "-", "mediated", "killing", "occurs", "in", "the", "absence", "of", "VgrG", "-", "1", ".", "V52ΔvgrG", "-", "1", "was", "mixed", "in", "a", "killing", "assay", "with", "wild", "-", "type", "C6706", "or", "mutants", "lacking", "immunity", "genes", "tsiV1", ",", "tsiV2", ",", "or", "tsiV3", "(", "specific", "for", "TseL", ",", "VasX", ",", "and", "VgrG", "-", "3", ",", "respectively", ")", ".", "The", "y", "-", "axis", "indicates", "surviving", "C6706", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3TseL secretion depends on VgrG-1. Western blot analysis of pellet (P) and supernatant (S) samples of the indicated strains. Samples were immunoblotted with antisera against TseL and Hcp and purified antibodies against DnaK. The unspecific band detected by rabbit serum is marked with an asterisk. One representative of three experiments is shown.VgrG-1 is required for TseL-mediated killing. Killing assay with wild-type V52 or indicated mutants and wild-type C6706 or a mutant lacking the immunity gene tsiV1. The y-axis indicates surviving C6706.VasX- and VgrG-3-mediated killing but not TseL-mediated killing occurs in the absence of VgrG-1. V52ΔvgrG-1 was mixed in a killing assay with wild-type C6706 or mutants lacking immunity genes tsiV1, tsiV2, or tsiV3 (specific for TseL, VasX, and VgrG-3, respectively). The y-axis indicates surviving C6706."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Interactions", "between", "Tap", "-", "1", "and", "TseL", "(", "A", ")", "or", "VgrG", "-", "1", "(", "B", ")", ".", "Shown", "are", "immunoblots", "of", "lysates", "(", "total", ")", "and", "immunoprecipitates", "with", "anti", "-", "FLAG", "affinity", "beads", "(", "IP", ":", "FLAG", ")", "of", "V52Δtap", "-", "1", "(", "A", ")", "or", "V52", "vgrG", "-", "1", ":", ":", "myc", "(", "B", ")", "transformed", "with", "empty", "vector", "or", "a", "plasmid", "encoding", "His", "-", "tagged", "or", "FLAG", "-", "tagged", "Tap", "-", "1", ".", "C", "Interaction", "between", "TseL", "and", "VgrG", "-", "1", ".", "Shown", "are", "immunoblots", "of", "lysates", "(", "total", ")", "and", "immunoprecipitates", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "affinity", "beads", "(", "IP", ":", "FLAG", ")", "of", "V52", "or", "V52Δtap", "-", "1", "transformed", "with", "empty", "vector", "or", "a", "plasmid", "encoding", "HIS", "-", "tagged", "or", "FLAG", "-", "tagged", "VgrG", "-", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B Interactions between Tap-1 and TseL (A) or VgrG-1 (B). Shown are immunoblots of lysates (total) and immunoprecipitates with anti-FLAG affinity beads (IP:FLAG) of V52Δtap-1 (A) or V52 vgrG-1::myc (B) transformed with empty vector or a plasmid encoding His-tagged or FLAG-tagged Tap-1.C Interaction between TseL and VgrG-1. Shown are immunoblots of lysates (total) and immunoprecipitates with an anti-FLAG affinity beads (IP:FLAG) of V52 or V52Δtap-1 transformed with empty vector or a plasmid encoding HIS-tagged or FLAG-tagged VgrG-1."}
{"words": ["Figure", "5Specificity", "of", "the", "C", "-", "terminal", "Tap", "-", "1", "segment", ".", "Killing", "assay", "in", "which", "the", "lack", "of", "tap", "-", "1", "in", "V52", "is", "complemented", "by", "empty", "vector", "(", "control", ")", "or", "one", "of", "two", "different", "alleles", "of", "tap", "-", "1", ".", "The", "ability", "to", "kill", "in", "a", "TseL", "-", "dependent", "manner", "is", "indicated", "by", "the", "logarithm", "of", "surviving", "C6706ΔtsiV1", ".", "Specificity", "of", "N", "-", "terminal", "segment", "of", "Tap", "-", "1", ".", "Killing", "assay", "in", "which", "the", "lack", "of", "tap", "-", "1", "in", "1587", "is", "complemented", "by", "empty", "vector", "(", "control", ")", "or", "one", "of", "two", "different", "alleles", "of", "tap", "-", "1", ".", "The", "ability", "to", "facilitate", "killing", "by", "the", "effector", "A55", "_", "1502", "is", "indicated", "by", "the", "logarithm", "of", "surviving", "1587ΔA55", "_", "1501", "-", "03", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Specificity of the C-terminal Tap-1 segment. Killing assay in which the lack of tap-1 in V52 is complemented by empty vector (control) or one of two different alleles of tap-1. The ability to kill in a TseL-dependent manner is indicated by the logarithm of surviving C6706ΔtsiV1.Specificity of N-terminal segment of Tap-1. Killing assay in which the lack of tap-1 in 1587 is complemented by empty vector (control) or one of two different alleles of tap-1. The ability to facilitate killing by the effector A55_1502 is indicated by the logarithm of surviving 1587ΔA55_1501-03."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "The", "time", "courses", "of", "normalized", "FRET", "ratio", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "of", "calcium", "biosensor", "before", "and", "after", "shockwave", "stimulation", "in", "HBSS", "Ca2", "+", "medium", "with", "(", "yellow", "line", ",", "n", "=", "6", ",", "N", "=", "3", ")", "or", "without", "the", "Piezo1", "expression", "(", "black", "line", ",", "n", "=", "6", ",", "N", "=", "3", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "representative", "FRET", "/", "ECFP", "ratio", "images", "of", "calcium", "biosensor", "in", "Piezo1", "-", "expressed", "HEK", "cells", "before", "(", "top", "left", ")", "and", "after", "(", "top", "right", ")", "LIS", "stimulation", ".", "Phase", "image", "with", "laser", "initiating", "point", "(", "left", ")", "and", "fluorescent", "image", "indicating", "Piezo1", "expression", "(", "right", ")", "were", "also", "shown", "on", "the", "bottom", "panels", "(", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "in", "the", "figures", "are", "to", "show", "the", "FRET", "/", "ECFP", "ratios", ",", "with", "cold", "and", "hot", "colors", "representing", "low", "and", "high", "ratios", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "The", "time", "course", "of", "normalized", "FRET", "ratio", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "of", "calcium", "biosensor", "in", "the", "Piezo1", "-", "expressing", "HEK", "cells", "before", "and", "after", "multiple", "shockwave", "stimulations", "in", "HBSS", "Ca2", "+", "medium", "(", "n", "=", "6", ",", "N", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) The time courses of normalized FRET ratio (Mean ± SEM) of calcium biosensor before and after shockwave stimulation in HBSS Ca2+ medium with (yellow line, n = 6, N = 3) or without the Piezo1 expression (black line, n = 6, N = 3). (B) The representative FRET/ECFP ratio images of calcium biosensor in Piezo1-expressed HEK cells before (top left) and after (top right) LIS stimulation. Phase image with laser initiating point (left) and fluorescent image indicating Piezo1 expression (right) were also shown on the bottom panels (Scale bar, 40 μm). Color scale bars in the figures are to show the FRET/ECFP ratios, with cold and hot colors representing low and high ratios, respectively. (C) The time course of normalized FRET ratio (Mean ± SEM) of calcium biosensor in the Piezo1-expressing HEK cells before and after multiple shockwave stimulations in HBSS Ca2+ medium (n = 6, N = 3)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "The", "representative", "ECFP", "/", "FRET", "ratio", "images", "of", "FAK", "biosensor", "in", "Piezo1", "overexpressed", "HEK", "cells", "before", "(", "left", ")", "and", "after", "(", "right", ")", "shockwave", "stimulation", "(", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "in", "the", "figures", "are", "to", "show", "the", "ECFP", "/", "FRET", "ratios", ",", "with", "cold", "and", "hot", "colors", "representing", "low", "and", "high", "ratios", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "The", "time", "courses", "of", "normalized", "ECFP", "/", "FRET", "ratio", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "of", "FAK", "FRET", "biosensor", "before", "and", "after", "shockwave", "stimulation", "in", "HBSS", "Ca2", "+", "media", "with", "(", "green", "line", ",", "n", "=", "16", ",", "N", "=", "3", ")", "or", "without", "Piezo1", "(", "black", "line", ",", "n", "=", "10", ",", "N", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "percentage", "change", "of", "FRET", "ratio", "of", "the", "FAK", "FRET", "biosensor", "in", "HEK", "cells", "with", "or", "without", "Piezo1", "after", "shockwave", "stimulation", "in", "HBSS", "Ca2", "+", "medium", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "from", "student", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) The representative ECFP/FRET ratio images of FAK biosensor in Piezo1 overexpressed HEK cells before (left) and after (right) shockwave stimulation (Scale bar, 40 μm). Color scale bars in the figures are to show the ECFP/FRET ratios, with cold and hot colors representing low and high ratios, respectively. (B) The time courses of normalized ECFP/FRET ratio (Mean ± SEM) of FAK FRET biosensor before and after shockwave stimulation in HBSS Ca2+ media with (green line, n = 16, N = 3) or without Piezo1 (black line, n = 10, N = 3). (C) The percentage change of FRET ratio of the FAK FRET biosensor in HEK cells with or without Piezo1 after shockwave stimulation in HBSS Ca2+ medium. *P < 0.05 from student two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "representative", "ECFP", "/", "FRET", "ratio", "images", "of", "FAK", "biosensor", "in", "Piezo1", "expressing", "HEK", "cells", "before", "and", "after", "25", "μM", "Yoda1", "stimulation", "(", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "in", "the", "figures", "indicate", "ECFP", "/", "FRET", "ratios", ",", "with", "cold", "and", "hot", "colors", "representing", "low", "and", "high", "ratios", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "The", "time", "courses", "of", "normalized", "FRET", "ratio", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "of", "FAK", "FRET", "biosensor", "before", "and", "after", "Yoda1", "stimulation", "with", "(", "pink", "line", ",", "n", "=", "10", ",", "N", "=", "3", ")", "or", "without", "Piezo1", "(", "black", "line", ",", "n", "=", "11", ",", "N", "=", "3", ")", ".", "The", "grey", "line", "represents", "the", "DMSO", "control", "group", "(", "n", "=", "8", ",", "N", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "representative", "FRET", "/", "ECFP", "ratio", "images", "of", "the", "calcium", "biosensor", "in", "the", "Piezo1", "-", "expressing", "HEK", "cells", "before", "and", "after", "25", "μM", "Yoda1", "stimulation", "(", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "in", "the", "figures", "indicate", "FRET", "/", "ECFP", "ratios", ",", "with", "cold", "and", "hot", "colors", "representing", "low", "and", "high", "ratios", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "The", "time", "courses", "of", "normalized", "FRET", "ratio", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "of", "calcium", "biosensor", "in", "the", "Piezo1", "-", "expressing", "HEK", "cells", "(", "purple", "line", ",", "n", "=", "9", ",", "N", "=", "3", ")", "before", "and", "after", "25", "μM", "Yoda1", "stimulation", "in", "culture", "medium", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The representative ECFP/FRET ratio images of FAK biosensor in Piezo1 expressing HEK cells before and after 25 μM Yoda1 stimulation (Scale bar, 10 μm). Color scale bars in the figures indicate ECFP/FRET ratios, with cold and hot colors representing low and high ratios, respectively. (B) The time courses of normalized FRET ratio (Mean ± SEM) of FAK FRET biosensor before and after Yoda1 stimulation with (pink line, n = 10, N = 3) or without Piezo1 (black line, n = 11, N = 3). The grey line represents the DMSO control group (n = 8, N = 3).(C) The representative FRET/ECFP ratio images of the calcium biosensor in the Piezo1-expressing HEK cells before and after 25 μM Yoda1 stimulation (Scale bar, 10 μm). Color scale bars in the figures indicate FRET/ECFP ratios, with cold and hot colors representing low and high ratios, respectively. (D) The time courses of normalized FRET ratio (Mean ± SEM) of calcium biosensor in the Piezo1-expressing HEK cells (purple line, n = 9, N = 3) before and after 25 μM Yoda1 stimulation in culture medium."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "&", "(", "B", ")", ",", "The", "time", "courses", "(", "Mean", "±", "SEM", ")", "(", "A", ")", "and", "representative", "images", "(", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ")", "of", "FRET", "ratio", "of", "SHP2", "biosensor", "(", "Y542F", ")", "before", "and", "after", "25", "μM", "or", "0", ".", "5", "μM", "Yoda1", "stimulation", "in", "cells", "with", "or", "without", "Piezo1", "overexpression", "(", "red", "bar", ",", "n", "=", "5", ",", "N", "=", "3", ";", "blue", "bar", ",", "n", "=", "5", ",", "N", "=", "3", ";", "purple", "bar", ",", "n", "=", "11", ",", "N", "=", "3", ";", "green", "bar", ",", "n", "=", "5", ",", "N", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A)&(B), The time courses (Mean ± SEM) (A) and representative images (Scale bar, 10 μm) of FRET ratio of SHP2 biosensor (Y542F) before and after 25 μM or 0.5 μM Yoda1 stimulation in cells with or without Piezo1 overexpression (red bar, n = 5, N=3; blue bar, n = 5, N=3; purple bar, n = 11, N=3; green bar, n = 5, N=3)."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Expression", "of", "the", "21U", "sensor", "(", "left", ")", "and", "DAPI", "staining", "(", "right", ")", "of", "gonad", "arms", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", ".", "Gonads", "are", "outlined", "by", "a", "dashed", "line", ".", "The", "mCherry", "signal", "is", "represented", "in", "pseudo", "-", "colours", "[", "LUT", "fire", "(", "ImageJ", ")", "]", "to", "reflect", "differences", "in", "the", "intensity", "of", "the", "signal", ".", "Number", "of", "animals", "analysed", "and", "with", "indicated", "phenotype", "are", "given", "in", "the", "panel", ".", "Animals", "not", "showing", "the", "activation", "of", "the", "21U", "sensor", "(", "+", ")", "were", "still", "silenced", ",", "and", "animals", "that", "did", "not", "show", "the", "silenced", "21U", "sensor", "(", "RNAe", ")", "state", "were", "expressing", "weakly", ",", "comparable", "to", "the", "21U", "sensor", "(", "+", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "C", ")", "Tc1", "reversion", "assay", "in", "different", "genetic", "backgrounds", ".", "All", "the", "strains", "tested", "carried", "the", "unc", "-", "22", ":", ":", "Tc1", "(", "st136", ")", "allele", ".", "Tc1", "excision", "can", "result", "in", "restoration", "of", "unc", "-", "22", "function", ",", "which", "can", "be", "scored", "visually", ".", "Negative", "control", "=", "unc", "-", "22", ":", ":", "Tc1", "(", "st136", ")", "in", "a", "wild", "type", "background", ";", "positive", "control", "=", "wago", "-", "1", "/", "-", "2", "/", "-", "3", ".", "Two", "independent", "experiments", "per", "strain", "are", "represented", ".", "D", ")", "Crossing", "scheme", "to", "address", "the", "re", "-", "initiation", "of", "silencing", "of", "the", "21U", "sensor", ".", "A", "mut", "-", "7", "mutant", "male", "expressing", "the", "21U", "sensor", "is", "crossed", "with", "either", "a", "wild", "type", "(", "left", ")", ",", "prg", "-", "1", "(", "middle", ")", "or", "pid", "-", "2", "(", "right", ")", "mutant", "hermaphrodite", ".", "Their", "F1", "offspring", "was", "scored", "for", "expression", "of", "the", "21U", "sensor", "by", "microscopy", ".", "Three", "states", "of", "expression", "were", "scored", ",", "and", "represented", "in", "a", "pie", "chart", ".", "The", "three", "expression", "states", "are", "exemplified", "by", "representative", "images", "at", "the", "bottom", ":", "OFF", "(", "left", ")", ",", "FAINT", "(", "right", ")", "or", "ON", "(", "middle", ")", ".", "DIC", "images", "are", "shown", "above", "the", "fluorescence", "panels", ".", "Gonads", "are", "outlined", "by", "a", "dashed", "line", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "E", ")", "Crossing", "scheme", "to", "address", "if", "maternal", "21U", "RNAs", "are", "sufficient", "to", "re", "-", "initiate", "the", "silencing", "of", "the", "21U", "sensor", ".", "A", "pid", "-", "1", "mutant", "male", "expressing", "the", "21U", "sensor", "is", "crossed", "with", "a", "hermaphrodite", ",", "heterozygous", "for", "the", "same", "mutation", ".", "All", "their", "F1", "offspring", "inherit", "a", "pool", "of", "21U", "RNAs", "from", "the", "hermaphrodite", ",", "but", "in", "50", "%", "of", "the", "F1", ",", "which", "is", "pid", "-", "1", "homozygous", "mutant", ",", "no", "zygotic", "PID", "-", "1", "is", "present", ",", "hence", "no", "zygotic", "21U", "RNAs", "can", "be", "made", ".", "The", "silencing", "or", "expression", "of", "the", "21U", "sensor", "in", "the", "pid", "-", "1", "homozygous", "mutant", "F1", "has", "been", "scored", "by", "microscopy", ",", "and", "depicted", "in", "a", "pie", "chart", ".", "At", "the", "bottom", ",", "a", "representative", "image", "of", "an", "animal", "carrying", "a", "silenced", "21U", "sensor", "(", "lower", ":", "mCherry", "signal", ";", "upper", ":", "DAPI", "staining", ")", "in", "pid", "-", "1", "mutant", "offspring", ".", "Gonads", "are", "outlined", "by", "a", "dashed", "line", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "F", ")", "Crossing", "scheme", "to", "test", "the", "role", "of", "PID", "-", "2", "in", "re", "-", "initiating", "the", "silencing", "of", "the", "21U", "sensor", ",", "mediated", "by", "maternally", "provided", "21U", "RNAs", "only", ".", "The", "expression", "of", "the", "21U", "sensor", "in", "the", "F1", "has", "been", "scored", "by", "microscopy", ",", "and", "depicted", "in", "a", "pie", "chart", ".", "White", "arrow", "heads", "indicate", "the", "many", "arrayed", "oocytes", ",", "typical", "of", "a", "feminized", "germline", ".", "DIC", "and", "fluorescence", "image", "of", "a", "representative", "animal", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "Gonads", "are", "outlined", "by", "a", "dashed", "line", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Expression of the 21U sensor (left) and DAPI staining (right) of gonad arms in the indicated genetic backgrounds. Gonads are outlined by a dashed line. The mCherry signal is represented in pseudo-colours [LUT fire (ImageJ)] to reflect differences in the intensity of the signal. Number of animals analysed and with indicated phenotype are given in the panel. Animals not showing the activation of the 21U sensor(+) were still silenced, and animals that did not show the silenced 21U sensor(RNAe) state were expressing weakly, comparable to the 21U sensor(+). Scale bar: 25 μm.C) Tc1 reversion assay in different genetic backgrounds. All the strains tested carried the unc-22::Tc1(st136) allele. Tc1 excision can result in restoration of unc-22 function, which can be scored visually. Negative control = unc-22::Tc1(st136) in a wild type background; positive control = wago-1/-2/-3. Two independent experiments per strain are represented.D) Crossing scheme to address the re-initiation of silencing of the 21U sensor. A mut-7 mutant male expressing the 21U sensor is crossed with either a wild type (left), prg-1 (middle) or pid-2 (right) mutant hermaphrodite. Their F1 offspring was scored for expression of the 21U sensor by microscopy. Three states of expression were scored, and represented in a pie chart. The three expression states are exemplified by representative images at the bottom: OFF (left), FAINT (right) or ON (middle). DIC images are shown above the fluorescence panels. Gonads are outlined by a dashed line. Scale bar: 25 µm.E) Crossing scheme to address if maternal 21U RNAs are sufficient to re-initiate the silencing of the 21U sensor. A pid-1 mutant male expressing the 21U sensor is crossed with a hermaphrodite, heterozygous for the same mutation. All their F1 offspring inherit a pool of 21U RNAs from the hermaphrodite, but in 50% of the F1, which is pid-1 homozygous mutant, no zygotic PID-1 is present, hence no zygotic 21U RNAs can be made. The silencing or expression of the 21U sensor in the pid-1 homozygous mutant F1 has been scored by microscopy, and depicted in a pie chart. At the bottom, a representative image of an animal carrying a silenced 21U sensor (lower: mCherry signal; upper: DAPI staining) in pid-1 mutant offspring. Gonads are outlined by a dashed line. Scale bar: 25 μm.F) Crossing scheme to test the role of PID-2 in re-initiating the silencing of the 21U sensor, mediated by maternally provided 21U RNAs only. The expression of the 21U sensor in the F1 has been scored by microscopy, and depicted in a pie chart. White arrow heads indicate the many arrayed oocytes, typical of a feminized germline. DIC and fluorescence image of a representative animal are shown at the bottom. Gonads are outlined by a dashed line. Scale bar: 25 μm."}
{"words": ["Figure", "2The", "22G", "RNAs", "mapping", "to", "the", "21U", "sensor", "transgene", "were", "identified", "from", "small", "RNA", "sequencing", "data", ",", "and", "read", "density", "was", "plotted", "over", "the", "transgene", ",", "which", "is", "schematically", "depicted", "at", "the", "bottom", ".", "The", "aggregated", "results", "of", "three", "replicates", "is", "shown", "for", "each", "indicated", "genotype", "in", "the", "different", "panels", ".", "The", "shading", ",", "in", "grey", ",", "represents", "the", "standard", "deviation", "of", "the", "read", "density", "from", "the", "three", "replicates", ".", "(", "+", ")", "means", "that", "the", "sensor", "was", "detectably", "expressed", ".", "(", "RNAe", ")", "means", "that", "the", "sensor", "was", "crossed", "into", "the", "respective", "mutant", "background", "in", "an", "RNAe", "state", "(", "i", ".", "e", ".", "its", "silencing", "was", "PRG", "-", "1", "-", "independent", ")", ",", "and", "its", "expression", "remained", "undetectable", "by", "microscopy", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The 22G RNAs mapping to the 21U sensor transgene were identified from small RNA sequencing data, and read density was plotted over the transgene, which is schematically depicted at the bottom. The aggregated results of three replicates is shown for each indicated genotype in the different panels. The shading, in grey, represents the standard deviation of the read density from the three replicates. (+) means that the sensor was detectably expressed. (RNAe) means that the sensor was crossed into the respective mutant background in an RNAe state (i.e. its silencing was PRG-1-independent), and its expression remained undetectable by microscopy."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "MA", "-", "plot", "of", "log2", "fold", "changes", "(", "Y", "-", "axis", ")", "versus", "the", "mean", "of", "normalized", "counts", "of", "22G", "RNAs", "(", "X", "-", "axis", ")", "for", "pid", "-", "2", "(", "xf23", ")", "mutants", ",", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Red", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", ">", "2", ".", "Blue", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", "<", "-", "2", ".", "B", ")", "Heatmap", "displaying", "overlap", "significance", "between", "different", "gene", "sets", "and", "genes", "that", "either", "up", "-", "or", "down", "-", "regulated", "in", "pid", "-", "2", "(", "xf23", ")", "mutants", ".", "Significance", "was", "tested", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "and", "p", "-", "values", "adjusted", "with", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "Procedure", ".", "Colour", "scheme", "represents", "the", "odds", "ratio", "of", "overlaps", "representing", "the", "strength", "of", "association", ".", "N", ".", "S", ".", ":", "not", "significant", ".", "C", "-", "D", ")", "Cumulative", "22G", "coverage", "along", "the", "gene", "body", "of", "Mutator", "and", "CSR", "-", "1", "targets", ".", "Values", "represent", "22G", "coverage", "normalized", "to", "the", "total", "coverage", "of", "each", "gene", ",", "for", "wild", "type", "(", "N2", ")", "and", "pid", "-", "2", "(", "xf23", ")", "mutants", ".", "The", "lines", "represent", "the", "average", "of", "biological", "replicates", ",", "whereas", "the", "shading", "represents", "the", "standard", "deviation", "of", "biological", "replicates", ".", "a", ".", "u", ".", ":", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) MA-plot of log2 fold changes (Y-axis) versus the mean of normalized counts of 22G RNAs (X-axis) for pid-2(xf23) mutants, compared to wild type. Red dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change > 2. Blue dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change < -2.B) Heatmap displaying overlap significance between different gene sets and genes that either up- or down-regulated in pid-2(xf23) mutants. Significance was tested with Fisher's exact test and p-values adjusted with the Benjamini-Hochberg Procedure. Colour scheme represents the odds ratio of overlaps representing the strength of association. N.S.: not significant.C-D) Cumulative 22G coverage along the gene body of Mutator and CSR-1 targets. Values represent 22G coverage normalized to the total coverage of each gene, for wild type (N2) and pid-2(xf23) mutants. The lines represent the average of biological replicates, whereas the shading represents the standard deviation of biological replicates. a.u.: arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Volcano", "plot", "representing", "the", "enrichment", "of", "proteins", "interacting", "with", "PID", "-", "2", ",", "isolated", "by", "immunoprecipitation", "of", "eGFP", ":", ":", "PID", "-", "2", "protein", ",", "followed", "by", "quantitative", "label", "-", "free", "mass", "spectrometry", ".", "As", "control", ",", "eGFP", "IPs", "were", "performed", "on", "protein", "extracts", "from", "wild", "-", "type", ",", "non", "-", "transgenic", "animals", ".", "For", "each", "IP", "-", "MS", "experiment", ",", "quadruplicates", "were", "measured", "and", "analysed", ".", "The", "dashed", "line", "reflects", "a", "significance", "threshold", "of", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "at", "two", "-", "fold", "enrichment", ".", "Volcano", "plot", "representing", "the", "enrichment", "of", "proteins", "interacting", "with", "PID", "-", "2", ",", "isolated", "by", "immunoprecipitation", "of", "eGFP", ":", ":", "PID", "-", "2", "protein", ",", "followed", "by", "quantitative", "label", "-", "free", "mass", "spectrometry", ".", "In", "this", "experiment", ",", "the", "endogenous", "PID", "-", "2", "protein", "was", "immunoprecipitated", ",", "and", "pid", "-", "2", "(", "xf23", ")", "mutant", "protein", "extracts", "were", "used", "as", "control", ".", "Volcano", "plot", ",", "representing", "the", "enrichment", "of", "proteins", "interacting", "with", "PID", "-", "4", ",", "by", "immunoprecipitating", "endogenously", "tagged", "PID", "-", "4", "protein", ".", "IPs", "from", "protein", "extracts", "from", "wild", "-", "type", ",", "non", "-", "tagged", "animals", "were", "used", "as", "control", ".", "Volcano", "plot", ",", "representing", "the", "enrichment", "of", "proteins", "interacting", "with", "PID", "-", "5", ",", "by", "immunoprecipitating", "endogenously", "tagged", "PID", "-", "5", "protein", ".", "IPs", "from", "protein", "extracts", "from", "wild", "-", "type", ",", "non", "-", "tagged", "animals", "were", "used", "as", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Volcano plot representing the enrichment of proteins interacting with PID-2, isolated by immunoprecipitation of eGFP::PID-2 protein, followed by quantitative label-free mass spectrometry. As control, eGFP IPs were performed on protein extracts from wild-type, non-transgenic animals. For each IP-MS experiment, quadruplicates were measured and analysed. The dashed line reflects a significance threshold of p-value < 0.05 at two-fold enrichment.Volcano plot representing the enrichment of proteins interacting with PID-2, isolated by immunoprecipitation of eGFP::PID-2 protein, followed by quantitative label-free mass spectrometry. In this experiment, the endogenous PID-2 protein was immunoprecipitated, and pid-2(xf23) mutant protein extracts were used as control.Volcano plot , representing the enrichment of proteins interacting with PID-4, by immunoprecipitating endogenously tagged PID-4 protein. IPs from protein extracts from wild-type, non-tagged animals were used as control.Volcano plot, representing the enrichment of proteins interacting with PID-5, by immunoprecipitating endogenously tagged PID-5 protein. IPs from protein extracts from wild-type, non-tagged animals were used as control."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Expression", "of", "the", "21U", "sensor", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", ".", "Gonads", "are", "outlined", "by", "a", "dashed", "line", ".", "The", "mCherry", "signal", "is", "represented", "in", "pseudo", "-", "colours", "[", "LUT", "fire", "(", "ImageJ", ")", "]", "to", "reflect", "differences", "in", "the", "intensity", "of", "the", "signal", ".", "The", "panels", "on", "the", "right", "are", "DIC", "images", "of", "the", "respective", "animals", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "B", ")", "22G", "RNA", "coverage", "of", "the", "21U", "sensor", "(", "RNAe", ")", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", ".", "C", ")", "MA", "-", "plot", "of", "log2", "fold", "changes", "(", "on", "the", "Y", "-", "axis", ")", "versus", "the", "mean", "of", "normalized", "counts", "of", "22G", "RNAs", "(", "on", "the", "X", "-", "axis", ")", "for", "pid", "-", "4", "mutants", ",", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Red", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", ">", "2", ".", "Blue", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", "<", "-", "2", ".", "D", ")", "Heatmap", "displaying", "overlap", "significance", "between", "different", "gene", "sets", "and", "genes", "that", "either", "up", "-", "or", "down", "-", "regulated", "in", "pid", "-", "4", "mutants", ".", "Colour", "scheme", "represents", "the", "odds", "ratio", "of", "overlaps", "representing", "the", "strength", "of", "association", ".", "MA", "-", "plot", "of", "log2", "fold", "changes", "(", "on", "the", "Y", "-", "axis", ")", "versus", "the", "mean", "of", "normalized", "counts", "of", "22G", "RNAs", "(", "on", "the", "X", "-", "axis", ")", ",", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Red", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", ">", "2", ".", "Blue", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", "<", "-", "2", ".", "E", ")", "for", "pid", "-", "5", "mutantHeatmap", "displaying", "overlap", "significance", "between", "different", "gene", "sets", "and", "genes", "that", "either", "up", "-", "or", "down", "-", "regulated", "in", "F", ")", "pid", "-", "5", "mutantMA", "-", "plot", "of", "log2", "fold", "changes", "(", "on", "the", "Y", "-", "axis", ")", "versus", "the", "mean", "of", "normalized", "counts", "of", "22G", "RNAs", "(", "on", "the", "X", "-", "axis", ")", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Red", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", ">", "2", ".", "Blue", "dots", ":", "genes", "with", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "fold", "-", "change", "<", "-", "2", ".", "G", ")", "for", "pid", "-", "4", ";", "pid", "-", "5", "double", "mutantHeatmap", "displaying", "overlap", "significance", "between", "different", "gene", "sets", "and", "genes", "that", "either", "up", "-", "or", "down", "-", "regulated", "in", "H", ")", "pid", "-", "4", ";", "pid", "-", "5", "double", "mutantI", ",", "J", ")", "Line", "plots", "representing", "fertility", "over", "generations", "for", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", "at", "25oC", ".", "Six", "L2", "-", "L3", "larvae", "for", "each", "of", "the", "indicated", "backgrounds", "were", "hand", "-", "picked", "to", "a", "fresh", "plate", "every", "four", "or", "six", "days", ",", "counting", "as", "two", "or", "three", "generations", ",", "respectively", ",", "until", "no", "larvae", "were", "present", "on", "the", "plate", "to", "be", "picked", ".", "*", ":", "two", "plates", "of", "N2", "were", "contaminated", "and", "were", "excluded", "from", "the", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Expression of the 21U sensor in the indicated genetic backgrounds. Gonads are outlined by a dashed line. The mCherry signal is represented in pseudo-colours [LUT fire (ImageJ)] to reflect differences in the intensity of the signal. The panels on the right are DIC images of the respective animals. Scale bar: 25 μm.B) 22G RNA coverage of the 21U sensor(RNAe) in the indicated genetic backgrounds.C) MA-plot of log2 fold changes (on the Y-axis) versus the mean of normalized counts of 22G RNAs (on the X-axis) for pid-4 mutants, compared to wild type. Red dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change > 2. Blue dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change < -2.D) Heatmap displaying overlap significance between different gene sets and genes that either up- or down-regulated in pid-4 mutants. Colour scheme represents the odds ratio of overlaps representing the strength of association.MA-plot of log2 fold changes (on the Y-axis) versus the mean of normalized counts of 22G RNAs (on the X-axis) , compared to wild type. Red dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change > 2. Blue dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change < -2. E) for pid-5 mutantHeatmap displaying overlap significance between different gene sets and genes that either up- or down-regulated in F) pid-5 mutantMA-plot of log2 fold changes (on the Y-axis) versus the mean of normalized counts of 22G RNAs (on the X-axis) compared to wild type. Red dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change > 2. Blue dots: genes with adjusted p-value < 0.05 and fold-change < -2. G) for pid-4;pid-5 double mutantHeatmap displaying overlap significance between different gene sets and genes that either up- or down-regulated in H) pid-4;pid-5 double mutantI, J) Line plots representing fertility over generations for the indicated genetic backgrounds at 25oC. Six L2-L3 larvae for each of the indicated backgrounds were hand-picked to a fresh plate every four or six days, counting as two or three generations, respectively, until no larvae were present on the plate to be picked. *: two plates of N2 were contaminated and were excluded from the assay."}
{"words": ["Figure", "6Expression", "of", "PID", "-", "2", ":", ":", "eGFP", "(", "xfSi145", ")", "(", "A", ")", "in", "perinuclear", "granules", "in", "the", "germline", ".", "PGL", "-", "1", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "A", ")", "mark", "P", "granules", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Expression", "of", ",", "PID", "-", "4", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "B", ")", "in", "perinuclear", "granules", "in", "the", "germline", ".", "DEPS", "-", "1", ":", ":", "GFP", "(", "B", "mark", "P", "granules", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "5", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "C", ")", "in", "perinuclear", "granules", "in", "the", "germline", ".", "DEPS", "-", "1", ":", ":", "GFP", "mark", "P", "granules", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "4", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "D", ")", "together", "with", "3xFLAG", ":", ":", "GFP", ":", ":", "ZNFX", "-", "1", ",", "a", "Z", "granule", "marker", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "5", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "E", ")", "together", "with", "3xFLAG", ":", ":", "GFP", ":", ":", "ZNFX", "-", "1", ",", "a", "Z", "granule", "marker", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "F", ")", "Box", "-", "plots", "representing", "the", "distance", "(", "µm", ")", "between", "the", "centres", "of", "two", "fluorescent", "signals", "from", "the", "indicated", "fusion", "proteins", "The", "distance", "between", "each", "pair", "of", "fluorescent", "proteins", "is", "represented", "by", "a", "dot", ".", "Between", "4", "-", "10", "different", "gonads", "were", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "2", ":", ":", "eGFP", "(", "xfSi145", ")", "together", "with", "PID", "-", "4", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "G", ")", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "µExpression", "of", "PID", "-", "2", ":", ":", "eGFP", "(", "xfSi145", ")", "together", "with", "PID", "-", "5", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "H", ")", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Note", "that", "most", "of", "the", "L4", "gonad", "is", "in", "pachytene", "stage", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Expression of PID-2::eGFP(xfSi145) (A) in perinuclear granules in the germline. PGL-1::mTagRFP-T (A) mark P granules. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm.Expression of , PID-4::mTagRFP-T (B) in perinuclear granules in the germline. DEPS-1::GFP (B mark P granules. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm.Expression of PID-5::mTagRFP-T (C) in perinuclear granules in the germline. DEPS-1::GFP mark P granules. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm.Expression of PID-4::mTagRFP-T (D) together with 3xFLAG::GFP::ZNFX-1, a Z granule marker. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm.Expression of PID-5::mTagRFP-T (E) together with 3xFLAG::GFP::ZNFX-1, a Z granule marker. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm.F) Box-plots representing the distance (µm) between the centres of two fluorescent signals from the indicated fusion proteins The distance between each pair of fluorescent proteins is represented by a dot. Between 4-10 different gonads were analyzed for each condition.Expression of PID-2::eGFP (xfSi145) together with PID-4::mTagRFP-T (G) The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar = 25 µExpression of PID-2::eGFP (xfSi145) together with PID-5::mTagRFP-T (H). The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Note that most of the L4 gonad is in pachytene stage. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar = 25 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "E", ")", "Expression", "of", "3xFLAG", ":", ":", "GFP", ":", ":", "ZNFX", "-", "1", "and", "PGL", "-", "1", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "in", "a", "wild", "type", "(", "A", ")", ",", "pid", "-", "2", "(", "B", ")", ",", "pid", "-", "4", ";", "pid", "-", "5", "(", "C", ")", ",", "pid", "-", "4", "(", "D", ")", ",", "and", "pid", "-", "5", "(", "E", ")", "mutant", "backgrounds", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "individual", "condensates", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "ratio", "Z", "/", "P", "granules", "in", "wild", "type", ",", "pid", "-", "2", ",", "pid", "-", "4", "/", "-", "5", ",", "pid", "-", "4", "and", "pid", "-", "5", "mutant", "backgrounds", ".", "The", "number", "of", "granules", "is", "indicated", "in", "brackets", ",", "next", "to", "the", "genotype", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "4", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "(", "G", ")", "together", "with", "3xFLAG", ":", ":", "GFP", ":", ":", "ZNFX", "-", "1", ",", "a", "Z", "granule", "marker", ",", "in", "a", "pid", "-", "2", "mutant", "background", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "Expression", "of", "PID", "-", "4", ":", ":", "mTagRFP", "-", "T", "H", ")", "together", "with", "3xFLAG", ":", ":", "GFP", ":", ":", "ZNFX", "-", "1", ",", "a", "Z", "granule", "marker", ",", "in", "a", "pid", "-", "2", "mutant", "background", ".", "The", "indicated", "dashed", "boxes", "reflect", "zoom", "-", "ins", "on", "specific", "nuclei", "to", "better", "visualize", "the", "granules", ",", "and", "their", "overlaps", ".", "One", "L4", "gonad", "is", "shown", "for", "each", "animal", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ".", "I", ")", "Box", "-", "plots", "representing", "the", "distance", "(", "µm", ")", "between", "the", "centres", "of", "two", "fluorescent", "signals", "from", "the", "indicated", "fusion", "proteins", "The", "distance", "between", "each", "pair", "of", "fluorescent", "proteins", "is", "represented", "by", "a", "dot", ".", "Between", "4", "-", "10", "different", "gonads", "were", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "The", "median", "is", "represented", "by", "a", "line", ".", "The", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "25th", "to", "75th", "percentile", ",", "is", "represented", "by", "the", "upper", "and", "lower", "lines", ",", "respectively", ",", "and", "whiskers", "represent", "the", "first", "quartile", "(", "down", "to", "-", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "or", "the", "third", "quartile", "(", "up", "to", "+", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-E) Expression of 3xFLAG::GFP::ZNFX-1 and PGL-1::mTagRFP-T in a wild type (A), pid-2 (B), pid-4;pid-5 (C), pid-4 (D), and pid-5 (E) mutant backgrounds. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown. Arrow heads indicate individual condensates. Scale bar: 25 µm. F) Quantification of the ratio Z / P granules in wild type, pid-2, pid-4/-5, pid-4 and pid-5 mutant backgrounds. The number of granules is indicated in brackets, next to the genotype. Expression of PID-4::mTagRFP-T (G) together with 3xFLAG::GFP::ZNFX-1, a Z granule marker, in a pid-2 mutant background. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Scale bar: 25 µm.Expression of PID-4::mTagRFP-T H) together with 3xFLAG::GFP::ZNFX-1, a Z granule marker, in a pid-2 mutant background. The indicated dashed boxes reflect zoom-ins on specific nuclei to better visualize the granules, and their overlaps. One L4 gonad is shown for each animal. Scale bar: 25 µm.I) Box-plots representing the distance (µm) between the centres of two fluorescent signals from the indicated fusion proteins The distance between each pair of fluorescent proteins is represented by a dot. Between 4-10 different gonads were analyzed for each condition. The median is represented by a line. The interquartile range (IQR), 25th to 75th percentile, is represented by the upper and lower lines, respectively, and whiskers represent the first quartile (down to -1.5*IQR) or the third quartile (up to +1.5*IQR). P-values were calculated using a t-test (two-tailed)."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "HEK293", "cells", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", "as", "indicated", ",", "endogenous", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "and", "an", "autophosphorylation", "assay", "was", "performed", ".", "Proteins", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualized", "with", "autoradiography", "(", "top", ")", "or", "western", "blotting", "(", "WB", ";", "bottom", ")", ".", "(", "b", ")", "Cells", "were", "incubated", "in", "glucose", "-", "free", "medium", "(", "4", "h", ")", "as", "indicated", "and", "lysed", ".", "Lysates", "were", "incubated", "with", "lambda", "phosphatase", "(", "λ", "PPase", ")", "as", "indicated", ".", "Endogenous", "Ulk1", "mobility", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "c", ")", "HA", "-", "Ulk1", "was", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "together", "with", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "AMPKα1", "or", "a", "kinase", "-", "dead", "(", "DN", ")", "mutant", ".", "Cells", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ";", "Glu", ")", "or", "amino", "acids", "(", "-", "A", ".", "A", ")", "and", "treated", "with", "compound", "C", "(", "20", "μM", ",", "C", ".", "C", ")", "as", "indicated", ".", "Ulk1", "mobility", "as", "well", "as", "phosphorylation", "levels", "of", "ACC", "and", "S6K", "were", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "d", ")", "HA", "-", "Ulk1", "proteins", "were", "immunopurified", "from", "transfected", "HEK293", "cells", ",", "which", "had", "undergone", "glucose", "starvation", "(", "4", "h", ")", "as", "indicated", ".", "The", "HA", "-", "Ulk1", "proteins", "were", "treated", "with", "λ", "PPase", ",", "and", "in", "vitro", "kinase", "assays", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "GST", "-", "ATG13", ".", "Proteins", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", ";", "phosphorylated", "proteins", "were", "visualized", "with", "autoradiography", ",", "HA", "-", "Ulk1", "by", "western", "blotting", "and", "GST", "-", "Atg13", "by", "Coomassie", "staining", ".", "(", "e", ")", "HA", "-", "Ulk1", "was", "immunopurified", "from", "transfected", "HEK293", "cells", "under", "glucose", "-", "rich", "media", "and", "treated", "with", "AMPK", "in", "the", "presence", "of", "cold", "ATP", "for", "15", "min", ",", "followed", "by", "kinase", "assays", "as", "described", "in", "d", ".", "In", "vitro", "kinase", "assays", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "GST", "-", "ATG13", ".", "Proteins", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", ";", "phosphorylated", "proteins", "were", "visualized", "with", "autoradiography", ",", "HA", "-", "Ulk1", "by", "western", "blotting", "and", "GST", "-", "Atg13", "by", "Coomassie", "staining", ".", "(", "f", ")", "AMPK", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "α1", "/", "α2", "double", "knockout", "(", "DKO", ")", "MEFs", "were", "incubated", "with", "or", "without", "glucose", "(", "4", "h", ")", ".", "Endogenous", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "and", "autophosphorylation", "was", "measured", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Autophosphorylation", "activity", "was", "normalized", "to", "Ulk1", "protein", "level", ";", "relative", "activity", "is", "calculated", "by", "normalization", "to", "Ulk1", "activity", "from", "AMPK", "wild", "-", "type", "MEFs", "in", "glucose", "-", "rich", "conditions", ".", "(", "g", ")", "HA", "-", "Ulk1", "was", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "together", "with", "vector", "(", "Vec", ")", "or", "an", "AMPKα1", "kinase", "-", "dead", "mutant", "(", "DN", ")", ".", "The", "cells", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "-", "Glu", ")", "or", "amino", "acids", "(", "-", "A", ".", "A", ")", ",", "or", "treated", "with", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "for", "3", "h", "before", "lysis", ".", "Left", ":", "autophosphorylation", "activity", "was", "assessed", "and", "normalized", "as", "in", "f", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Right", ":", "fold", "induction", "in", "Ulk1", "autophosphorylation", ",", "compared", "with", "Ulk1", "autophosphorylation", "from", "cells", "under", "nutrient", "-", "rich", "conditions", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) HEK293 cells were starved of glucose (4 h) as indicated, endogenous Ulk1 was immunoprecipitated and an autophosphorylation assay was performed. Proteins were resolved by SDS-PAGE and visualized with autoradiography (top) or western blotting (WB; bottom).(b) Cells were incubated in glucose-free medium (4 h) as indicated and lysed. Lysates were incubated with lambda phosphatase (λ PPase) as indicated. Endogenous Ulk1 mobility was examined by western blotting.(c) HA-Ulk1 was transfected into HEK293 cells together with wild-type (WT) AMPKα1 or a kinase-dead (DN) mutant. Cells were starved of glucose (4 h; Glu) or amino acids (-A.A) and treated with compound C (20 μM, C.C) as indicated. Ulk1 mobility as well as phosphorylation levels of ACC and S6K were determined by western blotting.(d) HA-Ulk1 proteins were immunopurified from transfected HEK293 cells, which had undergone glucose starvation (4 h) as indicated. The HA-Ulk1 proteins were treated with λ PPase, and in vitro kinase assays were performed in the presence of GST-ATG13. Proteins were resolved by SDS-PAGE; phosphorylated proteins were visualized with autoradiography , HA-Ulk1 by western blotting and GST-Atg13 by Coomassie staining.(e) HA-Ulk1 was immunopurified from transfected HEK293 cells under glucose-rich media and treated with AMPK in the presence of cold ATP for 15 min, followed by kinase assays as described in d. In vitro kinase assays were performed in the presence of GST-ATG13. Proteins were resolved by SDS-PAGE; phosphorylated proteins were visualized with autoradiography, HA-Ulk1 by western blotting and GST-Atg13 by Coomassie staining.(f) AMPK wild-type (WT) and α1/α2 double knockout (DKO) MEFs were incubated with or without glucose (4 h). Endogenous Ulk1 was immunoprecipitated and autophosphorylation was measured (mean ± s.d., n = 3). Autophosphorylation activity was normalized to Ulk1 protein level; relative activity is calculated by normalization to Ulk1 activity from AMPK wild-type MEFs in glucose-rich conditions.(g) HA-Ulk1 was transfected into HEK293 cells together with vector (Vec) or an AMPKα1 kinase-dead mutant (DN). The cells were starved of glucose (-Glu) or amino acids (-A.A), or treated with 50 nM rapamycin (Rapa) for 3 h before lysis. Left: autophosphorylation activity was assessed and normalized as in f (mean ± s.d., n = 3). Right: fold induction in Ulk1 autophosphorylation, compared with Ulk1 autophosphorylation from cells under nutrient-rich conditions. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "AMPK", "phosphorylates", "the", "Ulk1", "S", "/", "T", "domain", "in", "vitro", ".", "Top", ":", "schematic", "representation", "of", "Ulk1", "domain", "structure", "and", "deletion", "constructs", "used", "to", "map", "phosphorylation", "sites", ".", "The", "mouse", "Ulk1", "protein", "consists", "of", "an", "N", "-", "terminal", "kinase", "domain", "(", "KD", ";", "1", "-", "278", ")", ",", "serine", "/", "threonine", "-", "rich", "domain", "(", "S", "/", "T", "domain", ",", "279", "-", "828", ")", ",", "and", "C", "-", "terminal", "domain", "(", "CTD", ",", "829", "-", "1051", ")", ".", "Bottom", ":", "the", "indicated", "Flag", "-", "Ulk1", "deletion", "mutants", "were", "immunopurified", "from", "transfected", "HEK293", "cells", "and", "were", "used", "for", "in", "vitro", "AMPK", "assay", "as", "a", "substrate", ".", "Phosphorylation", "was", "examined", "by", "32P", "-", "autoradiogram", "and", "protein", "level", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "b", ")", "Determination", "of", "AMPK", "phosphorylation", "sites", "in", "Ulk1", ".", "The", "indicated", "recombinant", "GST", "-", "Ulk1", "mutants", "were", "expressed", "and", "purified", "from", "Escherichia", "coli", ",", "and", "used", "as", "substrates", "for", "in", "vitro", "phosphorylation", "by", "AMPK", ".", "Deletion", "analyses", "indicated", "that", "two", "Ulk1", "fragments", "in", "the", "S", "/", "T", "domain", ",", "279", "-", "425", "and", "769", "-", "782", ",", "were", "highly", "phosphorylated", "by", "AMPK", "in", "vitro", ".", "Mutation", "of", "Ser", "317", "abolished", "the", "majority", "of", "phosphorylation", "in", "the", "Ulk1", "fragment", "279", "-", "425", ".", "Within", "the", "fragment", "769", "-", "782", ",", "mutations", "of", "five", "serine", "residues", "(", "Ser", "774", ",", "Ser", "777", ",", "Ser", "778", ",", "Ser", "779", "and", "Ser", "780", ")", "to", "alanine", ",", "denoted", "as", "(", "769", "-", "782", ")", "5SA", ",", "completely", "abolished", "the", "phosphorylation", "by", "AMPK", ".", "Reconstitution", "of", "Ser", "777", "in", "this", "mutation", "background", ",", "(", "769", "-", "782", ")", "4SA", "-", "S777", ",", "but", "not", "any", "of", "the", "other", "four", "residues", ",", "restored", "the", "phosphorylation", "by", "AMPK", ".", "GST", "and", "GST", "-", "TSC2F", "(", "TSC2", "fragment", "1300", "-", "1367", "containing", "AMPK", "phosphorylation", "site", "at", "Ser", "1345", ")", "were", "used", "as", "negative", "and", "positive", "controls", "for", "AMPK", "reaction", ",", "respectively", ".", "Phosphorylation", "was", "determined", "by", "32P", "-", "autoradiograph", "and", "the", "protein", "levels", "were", "detected", "by", "Coomassie", "staining", ".", "(", "c", ")", "Ser", "317", "/", "Ser", "777", "are", "required", "for", "glucose", "-", "starvation", "induced", "Ulk1", "phosphorylation", "in", "vivo", ".", "HA", "-", "Ulk1", "and", "mutants", "were", "transfected", "into", "HEK293", "cells", ".", "Cells", "were", "starved", "for", "glucose", "for", "4", "h", "as", "indicated", ".", "HA", "-", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "and", "examined", "by", "western", "blot", "for", "mobility", ".", "(", "d", ")", "Phosphorylation", "of", "Ulk1", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "are", "induced", "by", "AMPK", ".", "Wild", "-", "type", "HA", "-", "Ulk1", "or", "S317", "/", "777A", "mutant", "were", "co", "-", "transfected", "with", "AMPK", "into", "HEK293", "cells", "as", "indicated", ".", "HA", "-", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "and", "phosphorylation", "of", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "were", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) AMPK phosphorylates the Ulk1 S/T domain in vitro. Top: schematic representation of Ulk1 domain structure and deletion constructs used to map phosphorylation sites. The mouse Ulk1 protein consists of an N-terminal kinase domain (KD; 1-278), serine/threonine-rich domain (S/T domain, 279-828), and C-terminal domain (CTD, 829-1051). Bottom: the indicated Flag-Ulk1 deletion mutants were immunopurified from transfected HEK293 cells and were used for in vitro AMPK assay as a substrate. Phosphorylation was examined by 32P-autoradiogram and protein level was determined by western blot.(b) Determination of AMPK phosphorylation sites in Ulk1. The indicated recombinant GST-Ulk1 mutants were expressed and purified from Escherichia coli, and used as substrates for in vitro phosphorylation by AMPK. Deletion analyses indicated that two Ulk1 fragments in the S/T domain, 279-425 and 769-782, were highly phosphorylated by AMPK in vitro. Mutation of Ser 317 abolished the majority of phosphorylation in the Ulk1 fragment 279-425. Within the fragment 769-782, mutations of five serine residues (Ser 774, Ser 777, Ser 778, Ser 779 and Ser 780) to alanine, denoted as (769-782) 5SA, completely abolished the phosphorylation by AMPK. Reconstitution of Ser 777 in this mutation background, (769-782) 4SA-S777, but not any of the other four residues, restored the phosphorylation by AMPK. GST and GST-TSC2F (TSC2 fragment 1300-1367 containing AMPK phosphorylation site at Ser 1345) were used as negative and positive controls for AMPK reaction, respectively. Phosphorylation was determined by 32P-autoradiograph and the protein levels were detected by Coomassie staining.(c) Ser 317/Ser 777 are required for glucose-starvation induced Ulk1 phosphorylation in vivo. HA-Ulk1 and mutants were transfected into HEK293 cells. Cells were starved for glucose for 4 h as indicated. HA-Ulk1 was immunoprecipitated and examined by western blot for mobility.(d) Phosphorylation of Ulk1 Ser 317 and Ser 777 are induced by AMPK. Wild-type HA-Ulk1 or S317/777A mutant were co-transfected with AMPK into HEK293 cells as indicated. HA-Ulk1 was immunoprecipitated (IP) and phosphorylation of Ser 317 and Ser 777 were determined by western blotting. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "AMPK", "wild", "-", "type", "or", "DKO", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", "as", "indicated", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "probed", "for", "Ulk1", "protein", "and", "phosphorylation", ".", "(", "b", ")", "Time", "course", "of", "Ulk1", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "phosphorylation", "in", "response", "to", "glucose", "starvation", "/", "re", "-", "addition", ".", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "-", "Glu", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "After", "3", "h", "starvation", ",", "the", "culture", "was", "switched", "to", "glucose", "-", "containing", "(", "25", "mM", ")", "medium", "and", "samples", "were", "harvested", "(", "Re", "-", "Glu", ")", ".", "In", "parallel", ",", "cells", "were", "treated", "with", "amino", "-", "acid", "-", "free", "(", "-", "A", ".", "A", ")", "medium", "or", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "for", "3", "h", ".", "(", "c", ")", "Phosphorylation", "of", "Ulk1", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "correlates", "with", "AMPK", "activity", ".", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", "as", "indicated", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "20", "μM", "compound", "C", "(", "C", ".", "C", ")", ".", "In", "parallel", ",", "cells", "were", "treated", "with", "2", "mM", "Metformin", "(", "Met", ",", "2", "h", ")", "in", "glucose", "-", "rich", "medium", ".", "Phosphorylation", "of", "ACC", "S79", "was", "tested", "as", "a", "positive", "control", "for", "AMPK", "activation", ".", "(", "d", ")", "Ulk1", "is", "highly", "phosphorylated", "at", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "by", "glucose", "starvation", "in", "vivo", ".", "To", "determine", "the", "Ulk1", "phosphorylation", "level", "in", "vivo", ",", "immunopurified", "HA", "-", "Ulk1", "protein", "was", "phosphorylated", "by", "AMPK", "in", "vitro", "(", "100", "%", "represents", "full", "phosphorylation", "of", "Ulk1", "by", "AMPK", ")", ".", "In", "vitro", "phosphorylated", "HA", "-", "Ulk1", "was", "diluted", "as", "indicated", ",", "and", "was", "immunoblotted", "along", "with", "the", "immunoprecipitated", "HA", "-", "Ulk1", "from", "cells", "grown", "in", "either", "glucose", "-", "rich", "(", "+", "Glu", ")", "or", "glucose", "-", "free", "(", "-", "Glu", ",", "4", "h", ")", "medium", ".", "The", "density", "of", "the", "bands", "was", "then", "quantified", ".", "By", "this", "measurement", ",", "approximately", "50", "%", "of", "Ulk1", "isolated", "from", "glucose", "-", "starved", "cells", "was", "phosphorylated", "on", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", ".", "(", "e", ")", "The", "indicated", "HA", "-", "Ulk1", "proteins", "were", "immunopurified", "from", "transfected", "HEK293", "cells", "grown", "in", "high", "-", "glucose", "medium", ",", "and", "then", "incubated", "with", "AMPK", "in", "the", "presence", "of", "cold", "ATP", "for", "15", "minin", "vitro", ".", "After", "the", "reaction", ",", "AMPK", "was", "removed", "by", "extensive", "washing", ",", "the", "resulting", "Ulk1", "immuno", "-", "complexes", "were", "assayed", "for", "kinase", "activity", "in", "the", "presence", "of", "32P", "-", "ATP", ".", "(", "f", ")", "HA", "-", "Ulk1", "proteins", "(", "wild", "type", "or", "S317", "/", "777A", "mutant", ")", "were", "immunoprecipitated", "from", "the", "transfected", "HEK293", "cells", ",", "which", "were", "incubated", "with", "or", "without", "glucose", "(", "4", "h", ")", "before", "lysis", ".", "An", "in", "vitro", "kinase", "reaction", "was", "performed", "in", "the", "presence", "of", "GST", "-", "ATG13", "and", "FIP200", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) AMPK wild-type or DKO MEFs were starved of glucose (4 h) as indicated. Total cell lysates were probed for Ulk1 protein and phosphorylation.(b) Time course of Ulk1 Ser 317 and Ser 777 phosphorylation in response to glucose starvation/re-addition. MEFs were starved of glucose (-Glu) for the indicated times. After 3 h starvation, the culture was switched to glucose-containing (25 mM) medium and samples were harvested (Re-Glu). In parallel, cells were treated with amino-acid-free (-A.A) medium or 50 nM rapamycin (Rapa) for 3 h.(c) Phosphorylation of Ulk1 Ser 317 and Ser 777 correlates with AMPK activity. MEFs were starved of glucose (4 h) as indicated in the presence or absence of 20 μM compound C (C.C). In parallel, cells were treated with 2 mM Metformin (Met, 2 h) in glucose-rich medium. Phosphorylation of ACC S79 was tested as a positive control for AMPK activation.(d) Ulk1 is highly phosphorylated at Ser 317 and Ser 777 by glucose starvation in vivo. To determine the Ulk1 phosphorylation level in vivo, immunopurified HA-Ulk1 protein was phosphorylated by AMPK in vitro (100% represents full phosphorylation of Ulk1 by AMPK). In vitro phosphorylated HA-Ulk1 was diluted as indicated, and was immunoblotted along with the immunoprecipitated HA-Ulk1 from cells grown in either glucose-rich (+ Glu) or glucose-free (- Glu, 4 h) medium. The density of the bands was then quantified. By this measurement, approximately 50% of Ulk1 isolated from glucose-starved cells was phosphorylated on Ser 317 and Ser 777.(e) The indicated HA-Ulk1 proteins were immunopurified from transfected HEK293 cells grown in high-glucose medium, and then incubated with AMPK in the presence of cold ATP for 15 minin vitro. After the reaction, AMPK was removed by extensive washing, the resulting Ulk1 immuno-complexes were assayed for kinase activity in the presence of 32P-ATP.(f) HA-Ulk1 proteins (wild type or S317/777A mutant) were immunoprecipitated from the transfected HEK293 cells, which were incubated with or without glucose (4 h) before lysis. An in vitro kinase reaction was performed in the presence of GST-ATG13 and FIP200. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "AMPK", "interacts", "with", "Ulk1", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "various", "Flag", "-", "Ulk1", "deletion", "mutants", "together", "with", "AMPK", "α", "/", "β", "/", "γ", ",", "Atg13", "and", "FIP200", ".", "Flag", "-", "Ulk1", "protein", "(", "indicated", "by", "white", "arrows", ")", "was", "immunoprecipitated", "and", "co", "-", "immunoprecipitation", "of", "AMPK", "α", "/", "β", "/", "γ", ",", "Atg13", "and", "FIP200", "were", "examined", "by", "western", "blots", ".", "(", "b", ")", "Deletion", "analysis", "of", "Ulk1", "regions", "responsible", "for", "AMPK", "interaction", ".", "The", "indicated", "Flag", "-", "Ulk1", "truncation", "mutants", "were", "immunoprecipitated", "from", "transfected", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "AMPK", "complex", "(", "α", "/", "β", "/", "γ", ")", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "AMPK", "subunits", "was", "determined", "by", "western", "blots", ".", "(", "c", ")", "Rheb", "inhibits", "the", "Ulk1", "-", "AMPK", "interaction", ".", "HA", "-", "AMPKα", ",", "Flag", "-", "Ulk1", "and", "Myc", "-", "Rheb", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "rapamycin", "(", "50", "nM", "Rapa", ")", "for", "1", "h", "before", "lysis", ".", "Flag", "-", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "and", "co", "-", "immunoprecipitates", "of", "AMPKα", "were", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "d", ")", "Rapamycin", "treatment", "enhances", "the", "interaction", "of", "endogenous", "Ulk1", "and", "AMPK", ".", "Endogenous", "Ulk1", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "from", "either", "Ulk1", "or", "AMPK", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "(", "single", "-", "knockout", ";", "KO", "or", "double", "-", "knockout", ";", "DKO", ")", "MEFs", ".", "Treatment", "with", "50", "nM", "rapamycin", "for", "1", "h", "is", "indicated", "(", "Rapa", ")", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "endogenous", "AMPKα", "protein", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "The", "arrow", "indicates", "AMPKα", "protein", ".", "(", "e", ")", "Phosphorylation", "by", "mTORC1", "inhibits", "the", "ability", "of", "Ulk1", "to", "bind", "AMPK", "in", "vitro", ".", "CBP", "/", "SBP", "-", "Ulk1", "was", "purified", "from", "transfected", "HEK293", "cells", "by", "streptavidin", "beads", "and", "the", "Ulk1", "-", "bead", "complex", "was", "incubated", "with", "mTORC1", ",", "which", "was", "prepared", "by", "Raptor", "immunoprecipitation", ",", "in", "the", "presence", "of", "cold", "ATP", ",", "as", "indicated", ".", "The", "resulting", "Ulk1", "complex", "was", "incubated", "with", "the", "cell", "lysates", "containing", "AMPK", ",", "then", "extensively", "washed", ".", "The", "Ulk1", "and", "associated", "AMPKα", "were", "detected", "by", "western", "blot", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) AMPK interacts with Ulk1. HEK293 cells were transfected with the various Flag-Ulk1 deletion mutants together with AMPK α/β/γ, Atg13 and FIP200. Flag-Ulk1 protein (indicated by white arrows) was immunoprecipitated and co-immunoprecipitation of AMPK α/β/γ, Atg13 and FIP200 were examined by western blots.(b) Deletion analysis of Ulk1 regions responsible for AMPK interaction. The indicated Flag-Ulk1 truncation mutants were immunoprecipitated from transfected HEK293 cells co-expressing AMPK complex (α/β/γ). Co-immunoprecipitation of AMPK subunits was determined by western blots.(c) Rheb inhibits the Ulk1-AMPK interaction. HA-AMPKα, Flag-Ulk1 and Myc-Rheb were co-transfected into HEK293 cells as indicated. Cells were treated with or without rapamycin (50 nM Rapa) for 1 h before lysis. Flag-Ulk1 was immunoprecipitated and co-immunoprecipitates of AMPKα were determined by western blot.(d) Rapamycin treatment enhances the interaction of endogenous Ulk1 and AMPK. Endogenous Ulk1 proteins were immunoprecipitated from either Ulk1 or AMPK wild-type and knockout (single-knockout; KO or double-knockout; DKO) MEFs. Treatment with 50 nM rapamycin for 1 h is indicated (Rapa). Co-immunoprecipitation of endogenous AMPKα protein was determined by western blot. The arrow indicates AMPKα protein.(e) Phosphorylation by mTORC1 inhibits the ability of Ulk1 to bind AMPK in vitro. CBP/SBP-Ulk1 was purified from transfected HEK293 cells by streptavidin beads and the Ulk1-bead complex was incubated with mTORC1, which was prepared by Raptor immunoprecipitation, in the presence of cold ATP, as indicated. The resulting Ulk1 complex was incubated with the cell lysates containing AMPK, then extensively washed. The Ulk1 and associated AMPKα were detected by western blot. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "mTORC1", "phosphorylates", "the", "Ulk1", "S", "/", "T", "domain", ".", "Ulk1", "deletion", "mutants", "were", "prepared", "from", "the", "transfected", "HEK293", "cells", "and", "used", "for", "in", "vitro", "mTORC1", "assay", ".", "Phosphorylation", "was", "examined", "by", "32P", "-", "autoradiogram", "(", "top", ")", "and", "protein", "level", "was", "determined", "by", "western", "blot", "(", "bottom", ")", ".", "(", "b", ")", "Ser", "757", "is", "phosphorylated", "by", "mTORC1", ".", "Left", ":", "the", "indicated", "recombinant", "GST", "-", "mUlk1", "mutants", "were", "purified", "from", "E", ".", "coli", "and", "used", "for", "in", "vitro", "mTORC1", "assay", "as", "substrates", ".", "Deletion", "analyses", "isolated", "the", "fragment", "(", "753", "-", "771", ")", "as", "a", "target", "for", "mTORC1", ".", "The", "Ulk1", "(", "753", "-", "771", ")", "fragment", "contains", "five", "conserved", "serine", "/", "threonine", "residues", ",", "Thr", "754", ",", "Ser", "757", ",", "Ser", "760", ",", "Thr", "763", "and", "Thr", "770", ".", "Right", ":", "mutation", "of", "Ser", "757", "abolished", "Ulk1", "phosphorylation", "by", "mTORC1", "in", "vitro", ".", "GST", "was", "used", "as", "negative", "control", "for", "mTORC1", "phosphorylation", "reaction", ".", "Phosphorylation", "was", "determined", "by", "32P", "-", "autoradiograph", "(", "top", ")", ",", "whereas", "protein", "levels", "were", "detected", "by", "Coomassie", "staining", "(", "bottom", ")", ".", "(", "c", ")", "Rheb", "increases", "Ulk1", "Ser", "757", "phosphorylation", ".", "HA", "-", "Ulk1", "wild", "type", "and", "the", "S757A", "mutant", "were", "immunoprecipitated", "from", "transfected", "HEK293", "cells", ".", "Co", "-", "transfection", "with", "Rheb", "and", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "treatment", "are", "indicated", ".", "Ulk1", "Ser", "757", "phosphorylation", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "d", ")", "Rheb", "induces", "a", "mobility", "shift", "in", "wild", "-", "type", "Ulk1", ",", "but", "not", "the", "Ulk1S757A", "mutant", ".", "HA", "-", "Ulk1", "was", "transfected", "with", "or", "without", "Rheb", "into", "HEK293", "cells", ".", "HA", "-", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "from", "the", "cells", "under", "nutrient", "-", "rich", "medium", "and", "Ulk1", "mobility", "was", "examined", "by", "western", "blot", ".", "(", "e", ")", "Endogenous", "Ulk1", "Ser", "757", "phosphorylation", "is", "elevated", "in", "Tsc1", "−", "/", "−", "Tsc1", ".", "Tsc1", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", "and", "Tsc1", "−", "/", "−", "(", "KO", ")", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", ",", "or", "treated", "with", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ",", "1", "h", ")", ".", "Ser", "757", "phosphorylation", "of", "endogenous", "Ulk1", "was", "detected", "by", "a", "phospho", "-", "Ulk1", "Ser", "757", "antibody", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) mTORC1 phosphorylates the Ulk1 S/T domain. Ulk1 deletion mutants were prepared from the transfected HEK293 cells and used for in vitro mTORC1 assay. Phosphorylation was examined by 32P-autoradiogram (top) and protein level was determined by western blot (bottom).(b) Ser 757 is phosphorylated by mTORC1. Left: the indicated recombinant GST-mUlk1 mutants were purified from E. coli and used for in vitro mTORC1 assay as substrates. Deletion analyses isolated the fragment (753-771) as a target for mTORC1. The Ulk1 (753-771) fragment contains five conserved serine/threonine residues, Thr 754, Ser 757, Ser 760, Thr 763 and Thr 770. Right: mutation of Ser 757 abolished Ulk1 phosphorylation by mTORC1 in vitro. GST was used as negative control for mTORC1 phosphorylation reaction. Phosphorylation was determined by 32P-autoradiograph (top), whereas protein levels were detected by Coomassie staining (bottom).(c) Rheb increases Ulk1 Ser 757 phosphorylation. HA-Ulk1 wild type and the S757A mutant were immunoprecipitated from transfected HEK293 cells. Co-transfection with Rheb and rapamycin (Rapa) treatment are indicated. Ulk1 Ser 757 phosphorylation was determined by western blot.(d) Rheb induces a mobility shift in wild-type Ulk1, but not the Ulk1S757A mutant. HA-Ulk1 was transfected with or without Rheb into HEK293 cells. HA-Ulk1 was immunoprecipitated from the cells under nutrient-rich medium and Ulk1 mobility was examined by western blot.(e) Endogenous Ulk1 Ser 757 phosphorylation is elevated in Tsc1−/− Tsc1. Tsc1+/+ (WT) and Tsc1−/− (KO) MEFs were starved of glucose (4 h), or treated with 50 nM rapamycin (Rapa, 1 h). Ser 757 phosphorylation of endogenous Ulk1 was detected by a phospho-Ulk1 Ser 757 antibody. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Ulk1", "Ser", "757", "is", "required", "for", "mTORC1", "to", "regulate", "the", "interaction", "of", "Ulk1", "with", "AMPK", "in", "vivo", ".", "CBP", "/", "SBP", "tagged", "Ulk1", "(", "wild", "type", "or", "S757C", ")", "was", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "AMPKα", "and", "Rheb", "into", "HEK293", "cells", "as", "indicated", ".", "Ulk1", "was", "purified", "by", "streptavidin", "beads", "and", "the", "co", "-", "precipitatedHA", "-", "AMPKα", "was", "examined", "by", "western", "blot", "(", "Rapa", ",", "50", "nM", "rapamycin", "treatment", "for", "1", "h", "before", "cell", "lysis", ")", ".", "(", "b", ")", "Ulk1", "Ser", "757", "is", "required", "for", "rapamycin", "to", "enhance", "the", "Ulk1", "-", "AMPK", "interaction", "in", "vitro", ".", "CBP", "/", "SBP", "Ulk1", "proteins", "(", "wild", "type", "or", "S757C", ")", "were", "prepared", "from", "transfected", "HEK293", "cells", ",", "which", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ",", "1h", ")", "as", "indicated", ".", "The", "Ulk1", "proteins", "were", "purified", "by", "streptavidin", "beads", "and", "the", "resulting", "Ulk1", "-", "bead", "was", "incubated", "with", "the", "bacterial", "purified", "AMPKα", "/", "β", "/", "γ", "complex", ".", "AMPKα", "protein", "levels", "in", "the", "in", "vitro", "pulldown", "assays", "were", "examined", "by", "western", "blot", "using", "AMPKα", "antibody", ".", "L", ".", "E", ".", ";", "long", "exposure", ".", "(", "c", ")", "Phosphorylation", "of", "AMPK", "sites", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "in", "Ulk1", "are", "decreased", "in", "Tsc1", "−", "/", "−", "Tsc1", ".", "Tsc1", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", "and", "Tsc1", "−", "/", "−", "(", "KO", ")", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", ",", "or", "treated", "with", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ",", "1", "h", ")", ".", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "phosphorylation", "of", "endogenous", "Ulk1", "was", "examined", "by", "western", "blotting", "with", "antibodies", "against", "Ulk1", "phosphorylated", "at", "Ser", "317", "or", "Ser", "777", ".", "(", "d", ")", "Rheb", "suppresses", "Ulk1", "Ser", "317", "and", "Ser", "777", "phosphorylation", "in", "a", "manner", "dependent", "on", "mTORC1", ".", "HA", "-", "Ulk1", ",", "AMPKα", "kinase", "-", "dead", "mutant", "(", "DN", ")", ",", "and", "Myc", "-", "Rheb", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HEK293", "cells", "as", "indicated", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "with", "glucose", "-", "free", "medium", "(", "-", "Glu", ",", "glucose", ")", ",", "in", "which", "either", "20", "μM", "compound", "C", "(", "C", ".", "C", ".", ")", "or", "50", "nM", "Rapamycin", "(", "Rapa", ")", "was", "added", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "Ulk1", "phosphorylated", "at", "Ser", "317", ",", "Ser", "777", ",", "Ser", "757", ",", "and", "HA", ",", "as", "indicated", ".", "(", "e", ")", "Rheb", "inhibits", "glucose", "starvation", "-", "induced", "Ulk1", "activation", ".", "HA", "-", "Ulk1", "and", "Myc", "-", "Rheb", "was", "transfected", "into", "HEK293", "cells", ",", "which", "were", "incubated", "with", "glucose", "-", "free", "(", "-", "Glu", ")", ",", "amino", "-", "acid", "-", "free", "(", "-", "A", ".", "A", ")", "medium", ",", "or", "50", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "for", "4", "h", "before", "lysis", ".", "HA", "-", "Ulk1", "was", "immunoprecipitated", "and", "kinase", "assays", "were", "performed", ".", "Ulk1", "activity", "was", "measured", "by", "32P", "-", "autoradiogram", "and", "the", "protein", "level", "of", "HA", "-", "Ulk1", "and", "GST", "-", "Atg13", "used", "in", "the", "assay", "was", "determined", "by", "western", "blot", "and", "by", "Coomassie", "staining", ",", "respectively", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Ulk1 Ser 757 is required for mTORC1 to regulate the interaction of Ulk1 with AMPK in vivo. CBP/SBP tagged Ulk1 (wild type or S757C) was co-transfected with HA-AMPKα and Rheb into HEK293 cells as indicated. Ulk1 was purified by streptavidin beads and the co-precipitatedHA- AMPKα was examined by western blot (Rapa, 50 nM rapamycin treatment for 1 h before cell lysis).(b) Ulk1 Ser 757 is required for rapamycin to enhance the Ulk1-AMPK interaction in vitro. CBP/SBP Ulk1 proteins (wild type or S757C) were prepared from transfected HEK293 cells, which were pre-incubated with 50 nM rapamycin (Rapa, 1h) as indicated. The Ulk1 proteins were purified by streptavidin beads and the resulting Ulk1-bead was incubated with the bacterial purified AMPKα/β/γ complex. AMPKα protein levels in the in vitro pulldown assays were examined by western blot using AMPKα antibody. L.E.; long exposure.(c) Phosphorylation of AMPK sites Ser 317 and Ser 777 in Ulk1 are decreased in Tsc1−/− Tsc1. Tsc1+/+ (WT) and Tsc1−/− (KO) MEFs were starved of glucose (4 h), or treated with 50 nM rapamycin (Rapa, 1 h). Ser 317 and Ser 777 phosphorylation of endogenous Ulk1 was examined by western blotting with antibodies against Ulk1 phosphorylated at Ser 317 or Ser 777.(d) Rheb suppresses Ulk1 Ser 317 and Ser 777 phosphorylation in a manner dependent on mTORC1. HA-Ulk1, AMPKα kinase-dead mutant (DN), and Myc-Rheb were co-transfected into HEK293 cells as indicated. The cells were incubated with glucose-free medium (-Glu, glucose), in which either 20 μM compound C (C.C.) or 50 nM Rapamycin (Rapa) was added. Total cell lysates were probed with antibodies against Ulk1 phosphorylated at Ser 317, Ser 777, Ser 757, and HA, as indicated.(e) Rheb inhibits glucose starvation-induced Ulk1 activation. HA-Ulk1 and Myc-Rheb was transfected into HEK293 cells, which were incubated with glucose-free (-Glu), amino-acid-free (-A.A) medium, or 50 nM rapamycin (Rapa) for 4 h before lysis. HA-Ulk1 was immunoprecipitated and kinase assays were performed. Ulk1 activity was measured by 32P-autoradiogram and the protein level of HA-Ulk1 and GST-Atg13 used in the assay was determined by western blot and by Coomassie staining, respectively. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S5."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Ser", "317", "/", "Ser", "777", "is", "required", "for", "Ulk1", "to", "protect", "cells", "from", "glucose", "starvation", ".", "Viability", "(", "24", "h", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "4", ";", "top", ")", "and", "PARP", "cleavage", "(", "8", "h", ";", "western", "blot", ",", "middle", ";", "quantification", ",", "n", "=", "2", ",", "bottom", ")", "was", "examined", "in", "Ulk1", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", ",", "Ulk1", "−", "/", "−", "(", "KO", ")", ",", "Ulk1", "−", "/", "−", "re", "-", "expressing", "wild", "-", "type", "Ulk1", "(", "KO", "-", "WT", ")", ",", "and", "Ulk1", "−", "/", "−", "re", "-", "expressing", "Ulk1", "S317", "/", "777A", "mutant", "(", "KO", "-", "S317", "/", "777A", ")", "MEFs", ".", "Arrows", "in", "western", "blots", "indicate", "non", "-", "cleaved", "and", "cleaved", "PARP", ".", "(", "b", ")", "The", "Ulk1", "S317", "/", "777A", "mutant", "is", "compromised", "in", "LC3", "lipidation", "in", "response", "to", "glucose", "starvation", ".", "ULK1MEFs", "were", "cultured", "in", "MEFs", "-", "free", "medium", "for", "the", "indicated", "times", ".", "LC3", "-", "II", "level", "was", "determined", "by", "western", "blotting", "and", "the", "LC3", "-", "II", "accumulation", "was", "normalized", "by", "α", "-", "tubulin", "and", "quantified", "(", "bottom", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "A", "representative", "western", "blot", "was", "shown", ".", "The", "LC3", "antibody", "used", "in", "this", "experiment", "seemed", "to", "preferentially", "recognise", "the", "lipid", "-", "modified", "form", "of", "LC3", "-", "II", ",", "which", "migrated", "faster", "on", "the", "gel", ".", "(", "c", ")", "The", "Ulk1", "S317", "/", "777A", "mutant", "is", "defective", "in", "autophagosome", "formation", ".", "The", "indicated", "MEFs", "were", "starved", "of", "glucose", "(", "4", "h", ")", "and", "the", "formation", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "autophagosomes", "was", "examined", "by", "confocal", "microscopy", ".", "GFP", "-", "LC3", ";", "green", "and", "DAPI", ";", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "d", ")", "Autophagy", "vacuole", "analysis", "by", "electron", "microscopy", ".", "Low", "-", "magnification", "images", "of", "Ulk1", "−", "/", "−", "(", "KO", ",", "upper", "left", "panel", ")", ",", "Ulk1", "−", "/", "−", "reconstituted", "with", "wild", "-", "type", "Ulk1", "(", "KO", "-", "WT", ",", "two", "middle", "panels", "with", "accompanying", "higher", "magnification", "images", ")", ",", "and", "Ulk1", "−", "/", "−", "reconstituted", "with", "Ulk1", "S317", "/", "777A", "(", "KO", "-", "S317", "/", "777A", ",", "lower", "left", "panel", ")", "are", "shown", ".", "High", "-", "magnification", "images", "of", "autophagosomes", "from", "KO", "-", "WT", "are", "shown", "in", "upper", "right", "and", "lower", "right", "panels", ".", "Autophagosome", "/", "autolysosome", "-", "like", "structures", "indicated", "by", "arrowheads", "on", "the", "lower", "-", "magnification", "images", "and", "arrows", "in", "higher", "-", "magnification", "images", ".", "Scale", "bars", ";", "lower", "-", "magnification", ",", "1", "μm", ";", "higher", "-", "magnification", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Ser 317/Ser 777 is required for Ulk1 to protect cells from glucose starvation. Viability (24 h, mean ± s.d., n = 4; top) and PARP cleavage (8 h; western blot, middle; quantification, n = 2, bottom) was examined in Ulk1+/+ (WT), Ulk1−/− (KO), Ulk1−/− re-expressing wild-type Ulk1 (KO-WT), and Ulk1−/− re-expressing Ulk1 S317/777A mutant (KO-S317/777A) MEFs. Arrows in western blots indicate non-cleaved and cleaved PARP.(b) The Ulk1 S317/777A mutant is compromised in LC3 lipidation in response to glucose starvation. ULK1MEFs were cultured in MEFs-free medium for the indicated times. LC3-II level was determined by western blotting and the LC3-II accumulation was normalized by α-tubulin and quantified (bottom, n = 3, mean ± s.d.). A representative western blot was shown. The LC3 antibody used in this experiment seemed to preferentially recognise the lipid-modified form of LC3-II, which migrated faster on the gel.(c) The Ulk1 S317/777A mutant is defective in autophagosome formation. The indicated MEFs were starved of glucose (4 h) and the formation of GFP-LC3-positive autophagosomes was examined by confocal microscopy. GFP-LC3; green and DAPI; blue. Scale bar, 20 μm.(d) Autophagy vacuole analysis by electron microscopy. Low-magnification images of Ulk1−/− (KO, upper left panel), Ulk1−/− reconstituted with wild-type Ulk1 (KO-WT, two middle panels with accompanying higher magnification images), and Ulk1−/− reconstituted with Ulk1 S317/777A (KO-S317/777A, lower left panel) are shown. High-magnification images of autophagosomes from KO-WT are shown in upper right and lower right panels. Autophagosome/autolysosome-like structures indicated by arrowheads on the lower-magnification images and arrows in higher-magnification images. Scale bars; lower-magnification, 1 μm; higher-magnification, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "1A", "cdc14", "‐", "3", "temperature", "‐", "sensitive", "cells", "reconstituted", "with", "CDC14", "or", "CDC14", "‐", "NLS", "were", "released", "from", "a", "G1", "arrest", "at", "the", "restrictive", "temperature", "and", "stained", "for", "Cdc14", "and", "the", "spindle", "(", "Tub1", ")", "once", "cells", "had", "reached", "late", "anaphase", ".", "B", "Wild", "‐", "type", ",", "cdc14", "‐", "3", ",", "+", "CDC14", "and", "+", "CDC14", "‐", "NLS", "cells", "were", "released", "from", "an", "α", "‐", "factor", "‐", "induced", "G1", "arrest", "and", "re", "‐", "arrested", "in", "the", "next", "G1", ".", "Samples", "were", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "stained", "with", "DAPI", "and", "for", "the", "nucleolar", "protein", "Nop1", "(", "n", ">", "100", ")", ".", "Photographs", "of", "examples", "of", "cells", "without", "(", "top", ")", "and", "with", "(", "bottom", ")", "rDNA", "segregation", "defects", "at", "80", "min", "after", "release", "are", "shown", "together", "with", "quantification", "over", "time", ".", "C", "Cells", "from", "the", "experiment", "in", "(", "B", ")", "were", "stained", "for", "the", "spindle", "(", "n", ">", "100", ")", ".", "Cells", "without", "(", "top", ")", "and", "with", "(", "bottom", ")", "anaphase", "spindles", "at", "100", "min", "after", "release", "are", "shown", "together", "with", "their", "quantification", "over", "time", ".", "D", "FACS", "analysis", "of", "DNA", "content", "and", "Western", "blot", "analysis", "of", "cell", "cycle", "markers", "of", "the", "samples", "from", "(", "B", ")", ".", "Tub1", "served", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A cdc14‐3 temperature‐sensitive cells reconstituted with CDC14 or CDC14‐NLS were released from a G1 arrest at the restrictive temperature and stained for Cdc14 and the spindle (Tub1) once cells had reached late anaphase.B Wild‐type, cdc14‐3, +CDC14 and +CDC14‐NLS cells were released from an α‐factor‐induced G1 arrest and re‐arrested in the next G1. Samples were harvested at the indicated time points and stained with DAPI and for the nucleolar protein Nop1 (n > 100). Photographs of examples of cells without (top) and with (bottom) rDNA segregation defects at 80 min after release are shown together with quantification over time.C Cells from the experiment in (B) were stained for the spindle (n > 100). Cells without (top) and with (bottom) anaphase spindles at 100 min after release are shown together with their quantification over time.D FACS analysis of DNA content and Western blot analysis of cell cycle markers of the samples from (B). Tub1 served as a loading control."}
{"words": ["Figure", "2A", "+", "CDC14", "and", "+", "CDC14", "‐", "NLS", "cells", "were", "grown", "at", "35", ".", "5", "°", "C", "for", "5", "h", "and", "sonicated", ",", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "images", "were", "acquired", ".", "B", "Cells", "from", "a", "synchronous", "culture", "(", "as", "in", "Fig", "B", ")", "were", "treated", "with", "zymolyase", "to", "remove", "the", "cell", "wall", ".", "The", "fraction", "of", "remaining", "budded", "cells", "is", "shown", "over", "time", "(", "n", "=", "100", ")", ".", "C", "Cells", "expressing", "the", "plasma", "membrane", "marker", "GFP", "‐", "Spo2051", "-", "91", ",", "exemplifying", "the", "indicated", "bud", "neck", "phenotypes", "and", "stages", "of", "cytokinesis", ".", "D", "Bud", "neck", "phenotypes", "of", "synchronized", "GFP", "‐", "Spo2051", "-", "91", "‐", "expressing", "+", "CDC14", "or", "+", "CDC14", "‐", "NLS", "cells", "during", "the", "progression", "of", "a", "cell", "cycle", "(", "n", ">", "75", ")", ".", "E", "+", "CDC14", "or", "+", "CDC14", "‐", "NLS", "cells", "expressing", "Spc42", "‐", "YFP", "and", "GFP", "fusions", "with", "the", "indicated", "cytokinetic", "protein", "were", "synchronized", "in", "G1", "using", "α", "‐", "factor", ".", "Upon", "release", "at", "35", ".", "5", "°", "C", ",", "cells", "were", "imaged", "every", "2", "min", "and", "the", "time", "from", "anaphase", "onset", "to", "the", "indicated", "events", "was", "recorded", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ";", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "applied", "to", "analyze", "differences", "between", "the", "indicated", "conditions", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "For", "representative", "image", "sequences", ",", "see", "Supplementary", "Fig", "S2C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A +CDC14 and +CDC14‐NLS cells were grown at 35.5°C for 5 h and sonicated, and differential interference contrast (DIC) images were acquired.B Cells from a synchronous culture (as in Fig B) were treated with zymolyase to remove the cell wall. The fraction of remaining budded cells is shown over time (n = 100).C Cells expressing the plasma membrane marker GFP‐Spo2051-91, exemplifying the indicated bud neck phenotypes and stages of cytokinesis.D Bud neck phenotypes of synchronized GFP‐Spo2051-91‐expressing +CDC14 or +CDC14‐NLS cells during the progression of a cell cycle (n > 75).E +CDC14 or +CDC14‐NLS cells expressing Spc42‐YFP and GFP fusions with the indicated cytokinetic protein were synchronized in G1 using α‐factor. Upon release at 35.5°C, cells were imaged every 2 min and the time from anaphase onset to the indicated events was recorded. Error bars represent SD; Student's t‐test was applied to analyze differences between the indicated conditions; **P ≤ 0.01; ****P ≤ 0.0001. For representative image sequences, see Supplementary Fig S2C."}
{"words": ["Figure", "3A", "MET3pr", "‐", "CDC20cdc15", "‐", "as1", "cells", "were", "arrested", "in", "metaphase", "by", "Cdc20", "depletion", "and", "subsequently", "treated", "with", "1NM", "‐", "PP1", "to", "inhibit", "Cdc15", "‐", "as1", ".", "Cells", "were", "released", "from", "the", "metaphase", "arrest", "by", "Cdc20", "re", "‐", "induction", "(", "left", "graph", ")", ",", "or", "Cdc14", "and", "/", "or", "Sic1", "expression", "were", "induced", "from", "the", "GAL1", "promoter", "while", "cells", "remained", "arrested", "(", "right", "graph", ")", ".", "The", "fraction", "of", "large", "‐", "budded", "cells", "after", "spheroplastation", "(", "n", "=", "100", ")", "was", "quantified", ".", "Representative", "photographs", "120", "min", "after", "galactose", "addition", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", "As", "(", "A", ")", ",", "the", "plasma", "membrane", "marker", "GFP", "‐", "Spo2051", "-", "91", "was", "visualized", "following", "Cdc14", "induction", "(", "n", "=", "100", ")", ".", "C", "Samples", "from", "the", "experiment", "in", "(", "B", ")", "were", "processed", "for", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "indicated", "cell", "cycle", "proteins", ".", "Arrowheads", "indicate", "endogenous", "and", "exogenous", "forms", "of", "Cdc14", ".", "Tub1", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "A", "schematic", "of", "downstream", "processing", "for", "the", "phosphoproteome", "analysis", "is", "shown", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A MET3pr‐CDC20cdc15‐as1 cells were arrested in metaphase by Cdc20 depletion and subsequently treated with 1NM‐PP1 to inhibit Cdc15‐as1. Cells were released from the metaphase arrest by Cdc20 re‐induction (left graph), or Cdc14 and/or Sic1 expression were induced from the GAL1 promoter while cells remained arrested (right graph). The fraction of large‐budded cells after spheroplastation (n = 100) was quantified. Representative photographs 120 min after galactose addition are shown. Scale bar, 10 μm.B As (A), the plasma membrane marker GFP‐Spo2051-91 was visualized following Cdc14 induction (n = 100).C Samples from the experiment in (B) were processed for Western blot analysis of the indicated cell cycle proteins. Arrowheads indicate endogenous and exogenous forms of Cdc14. Tub1 served as a loading control. A schematic of downstream processing for the phosphoproteome analysis is shown on the right."}
{"words": ["Figure", "4A", "Phospho", "‐", "peptide", "abundance", "during", "Cdc14", "‐", "induced", "mitotic", "exit", ".", "Examples", "of", "phospho", "‐", "peptides", "that", "disappear", "with", "early", "(", "red", ")", ",", "intermediate", "(", "orange", ")", "and", "late", "(", "green", ")", "timing", "or", "that", "remain", "stable", "(", "black", ")", "are", "shown", ".", "This", "color", "coding", "is", "used", "throughout", "all", "panels", "of", "this", "figure", ".", "B", "Numbers", "of", "unique", "peptides", "and", "corresponding", "proteins", "that", "do", "or", "do", "not", "contain", "a", "minimal", "Cdk", "consensus", "motif", "are", "shown", ",", "categorized", "according", "to", "timing", "of", "disappearance", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "C", "Protein", "stability", "data", "for", "proteins", "corresponding", "to", "disappearing", "phospho", "‐", "peptides", "(", "blue", ")", "and", "for", "all", "other", "proteins", "(", "black", ")", ".", "D", "The", "fractions", "of", "peptides", "that", "contain", "a", "minimal", "Cdk", "consensus", "motif", "(", "[", "S", "/", "T", "]", "‐", "P", ")", "within", "the", "timing", "categories", "shown", "in", "(", "B", ")", "were", "calculated", ".", "The", "ratio", "and", "P", "‐", "value", "of", "enrichment", "of", "each", "category", "relative", "to", "the", "combined", "stable", "/", "rest", "category", "(", "gray", ")", "are", "shown", ".", "E", "Similar", "to", "(", "D", ")", ",", "the", "enrichment", "for", "reported", "physical", "Cdc14", "interactors", "is", "assessed", "within", "[", "S", "/", "T", "]", "‐", "P", "‐", "containing", "phospho", "‐", "peptides", ".", "F", "Peptides", "that", "contain", "the", "indicated", "Cdk", "consensus", "sequence", "motifs", "and", "that", "have", "disappeared", "over", "time", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "all", "phospho", "‐", "peptides", "containing", "that", "motif", ".", "G", "Unique", "phospho", "‐", "peptides", "of", "Spa2", ",", "as", "an", "example", ",", "are", "categorized", "based", "on", "their", "dephosphorylation", "timing", "(", "graph", ")", ".", "Enrichment", "of", "clustered", "timing", "for", "all", "proteins", "covered", "by", "phospho", "‐", "peptides", "was", "compared", "to", "random", "for", "Cdk", "or", "non", "‐", "Cdk", "consensus", "site", "‐", "containing", "peptides", "(", "table", ")", ".", "Fisher", "'", "s", "exact", "tests", "were", "used", "to", "determine", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Phospho‐peptide abundance during Cdc14‐induced mitotic exit. Examples of phospho‐peptides that disappear with early (red), intermediate (orange) and late (green) timing or that remain stable (black) are shown. This color coding is used throughout all panels of this figure.B Numbers of unique peptides and corresponding proteins that do or do not contain a minimal Cdk consensus motif are shown, categorized according to timing of disappearance as described in (A).C Protein stability data for proteins corresponding to disappearing phospho‐peptides (blue) and for all other proteins (black).D The fractions of peptides that contain a minimal Cdk consensus motif ([S/T]‐P) within the timing categories shown in (B) were calculated. The ratio and P‐value of enrichment of each category relative to the combined stable/rest category (gray) are shown.E Similar to (D), the enrichment for reported physical Cdc14 interactors is assessed within [S/T]‐P‐containing phospho‐peptides.F Peptides that contain the indicated Cdk consensus sequence motifs and that have disappeared over time are represented as a fraction of all phospho‐peptides containing that motif.G Unique phospho‐peptides of Spa2, as an example, are categorized based on their dephosphorylation timing (graph). Enrichment of clustered timing for all proteins covered by phospho‐peptides was compared to random for Cdk or non‐Cdk consensus site‐containing peptides (table). Fisher's exact tests were used to determine significance."}
{"words": ["Figure", "5B", "Western", "blot", "analysis", "of", "cells", "expressing", "conditional", "Clb2m", "(", "+", ")", "or", "Clb2mΔCdk", "(", "Δ", ")", "fusions", "to", "the", "indicated", "proteins", ",", "before", "(", "−", ")", "and", "5", "h", "after", "(", "+", ")", "β", "‐", "estradiol", "treatment", ".", "Tub1", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "c", ",", "control", "cells", ".", "C", "FACS", "analysis", "of", "DNA", "content", "after", "conditional", "Clb2m", "or", "Clb2mΔCdk", "fusion", "to", "the", "indicated", "proteins", ".", "Quantification", "of", "the", "fraction", "of", "cells", "with", ">", "2C", "DNA", "content", "is", "shown", "in", "the", "bar", "graph", "for", "two", "independent", "biological", "replicates", ",", "with", "red", "dots", "representing", "individual", "and", "bars", "representing", "average", "values", ".", "Bnr1", "fusions", "were", "included", "as", "controls", "for", "cytokinetic", "defects", ".", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "applied", "to", "compare", "matched", "Clb2m", "versus", "Clb2mΔCdk", "fusion", "strains", ".", "‐", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "D", "Serial", "dilutions", "of", "cells", "from", "(", "C", ")", "were", "plated", "6", "h", "following", "β", "‐", "estradiol", "treatment", "and", "grown", "for", "1", "day", "at", "36", "°", "C", ".", "E", "The", "length", "of", "cell", "chains", "containing", "a", "common", "cytoplasm", "was", "scored", "6", "h", "after", "β", "‐", "estradiol", "treatment", "using", "the", "GFP", "‐", "Spo2051", "-", "91", "plasma", "membrane", "marker", "(", "n", ">", "150", ")", ".", "c", ",", "control", "cells", ";", "scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Western blot analysis of cells expressing conditional Clb2m (+) or Clb2mΔCdk (Δ) fusions to the indicated proteins, before (−) and 5 h after (+) β‐estradiol treatment. Tub1 served as a loading control. c, control cells.C FACS analysis of DNA content after conditional Clb2m or Clb2mΔCdk fusion to the indicated proteins. Quantification of the fraction of cells with > 2C DNA content is shown in the bar graph for two independent biological replicates, with red dots representing individual and bars representing average values. Bnr1 fusions were included as controls for cytokinetic defects. Student's t‐test was applied to compare matched Clb2m versus Clb2mΔCdk fusion strains. ‐P > 0.05; *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001.D Serial dilutions of cells from (C) were plated 6 h following β‐estradiol treatment and grown for 1 day at 36°C.E The length of cell chains containing a common cytoplasm was scored 6 h after β‐estradiol treatment using the GFP‐Spo2051-91 plasma membrane marker (n > 150). c, control cells; scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", "Genes", "corresponding", "to", "the", "indicated", "proteins", "were", "replaced", "by", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", "or", "Cdk", "phospho", "‐", "site", "mutant", "(", "xA", ")", "sequences", "and", "then", "conditionally", "fused", "to", "Clb2m", "or", "Clb2mΔCdk", ".", "Cytokinetic", "defects", "were", "scored", "by", "FACS", "analysis", "of", "DNA", "content", "as", "in", "Fig", "C", ".", "The", "individual", "values", "from", "two", "independent", "clones", "(", "red", "dots", ")", "as", "well", "as", "their", "average", "(", "bars", ")", "are", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "applied", "to", "compare", "matched", "wt", "and", "xA", "strains", ".", "c", ",", "control", "cells", ".", "B", "Cell", "chain", "formation", "in", "the", "samples", "from", "(", "A", ")", ".", "The", "fraction", "of", "cells", "with", ">", "2", "cell", "bodies", "for", "each", "clone", "are", "represented", "with", "red", "dots", "and", "their", "averages", "by", "the", "black", "bar", "(", "n", ">", "150", ")", ".", "Significance", "is", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "‐", "tests", "for", "the", "indicated", "conditions", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "C", "The", "indicated", "strains", "were", "spotted", "in", "serial", "dilutions", "onto", "auxin", "‐", "containing", "plates", "and", "grown", "for", "2", "days", ".", "D", "Auxin", "was", "added", "to", "cultures", "of", "the", "indicated", "strains", ",", "and", "after", "6", "h", ",", "cells", "were", "sonicated", "and", "the", "number", "of", "attached", "cell", "bodies", "was", "counted", "(", "n", ">", "200", ")", ".", "Significance", "was", "calculated", "using", "a", "Wilcoxon", "rank", "‐", "sum", "test", ".", "E", "The", "fraction", "of", "cells", "in", "asynchronously", "proliferating", "cultures", "of", "the", "indicated", "strains", "with", "a", "DNA", "content", "of", ">", "2C", "was", "determined", "by", "FACS", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Genes corresponding to the indicated proteins were replaced by wild‐type (wt) or Cdk phospho‐site mutant (xA) sequences and then conditionally fused to Clb2m or Clb2mΔCdk. Cytokinetic defects were scored by FACS analysis of DNA content as in Fig C. The individual values from two independent clones (red dots) as well as their average (bars) are shown. Student's t‐test was applied to compare matched wt and xA strains. c, control cells.B Cell chain formation in the samples from (A). The fraction of cells with > 2 cell bodies for each clone are represented with red dots and their averages by the black bar (n > 150). Significance is determined by Student's t‐tests for the indicated conditions. Scale bars, 5 μm.C The indicated strains were spotted in serial dilutions onto auxin‐containing plates and grown for 2 days.D Auxin was added to cultures of the indicated strains, and after 6 h, cells were sonicated and the number of attached cell bodies was counted (n > 200). Significance was calculated using a Wilcoxon rank‐sum test.E The fraction of cells in asynchronously proliferating cultures of the indicated strains with a DNA content of > 2C was determined by FACS analysis (n = 3). Error bars represent SD."}
{"words": ["Figure", "7A", "Cyk3", "‐", "GFP", "signal", "intensity", "at", "the", "GFP", "relative", "to", "the", "onset", "of", "actomyosin", "ring", "contraction", "(", "t", "=", "0", ")", ".", "The", "mean", "and", "SEM", "from", "at", "least", "20", "cells", "are", "shown", ".", "B", "Inn1", "‐", "Clb2m", ",", "Inn1", "‐", "Clb2mΔCdk", "and", "control", "cells", "before", "Clb2m", "fusion", "were", "arrested", "in", "G1", "using", "α", "‐", "factor", ",", "released", "and", "harvested", "90", "-", "100", "min", "later", "at", "the", "time", "of", "cytokinesis", ".", "Indirect", "immunofluorescence", "microscopy", "was", "used", "to", "determine", "Inn1bud", "neck", "staining", "and", "the", "spindle", "status", ".", "Representative", "images", "of", "full", "spindles", "and", "partially", "and", "fully", "disassembled", "spindles", "are", "shown", ".", "nr", ",", "non", "‐", "recombined", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "C", "The", "time", "from", "anaphase", "onset", "until", "the", "GFP", "appearance", "of", "Inn1", "was", "determined", "by", "filming", "synchronized", "Inn1", "‐", "Clb2m", "‐", "GFP", "and", "Inn1", "‐", "Clb2mΔCdk", "‐", "GFP", "cells", "containing", "Spc42", "‐", "YFP", "‐", "labeled", "spindle", "pole", "bodies", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "D", "As", "in", "(", "C", ")", ",", "now", "the", "persistence", "of", "a", "full", "actomyosin", "ring", "was", "measured", "in", "cells", "expressing", "Inn1", "‐", "Clb2m", ",", "Inn1", "‐", "Clb2mΔCdk", "or", "their", "respective", "non", "‐", "phosphorylatable", "mutants", "together", "with", "Myo1", "‐", "GFP", "and", "Spc42", "‐", "YFP", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "E", "Montage", "of", "medial", "view", "projections", "of", "actomyosin", "rings", "in", "Inn1", "‐", "Clb2m", "and", "Inn1", "‐", "Clb2mΔCdk", "cells", ".", "Frames", "are", "shown", "in", "2", "‐", "min", "intervals", ".", "F", "Actomyosin", "ring", "contraction", "phenotypes", "from", "at", "least", "21", "cells", "filmed", "as", "in", "(", "E", ")", "were", "blindly", "scored", "as", "having", "a", "normal", "(", "\"", "constriction", "\"", ")", "or", "aberrant", "(", "\"", "disintegration", "\"", ")", "cytokinetic", "phenotype", ".", "G", "Cytokinetic", "defect", "and", "cell", "viability", "of", "Inn1", "‐", "Clb2m", "or", "Inn1", "‐", "Clb2mΔCdk", "cells", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Chs2V377I", ".", "In", "the", "bar", "graph", ",", "red", "dots", "represent", "values", "of", "duplicate", "biological", "replicates", "with", "bars", "representing", "the", "average", ".", "Significance", "is", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "10", "‐", "fold", "spot", "dilution", "assays", "are", "represented", ",", "together", "with", "the", "Western", "blotting", "analysis", "for", "Inn1", "before", "and", "after", "its", "fusion", "to", "Clb2m", ".", "Tub1", "served", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Cyk3‐GFP signal intensity at the GFP relative to the onset of actomyosin ring contraction (t = 0). The mean and SEM from at least 20 cells are shown.B Inn1‐Clb2m, Inn1‐Clb2mΔCdk and control cells before Clb2m fusion were arrested in G1 using α‐factor, released and harvested 90-100 min later at the time of cytokinesis. Indirect immunofluorescence microscopy was used to determine Inn1bud neck staining and the spindle status. Representative images of full spindles and partially and fully disassembled spindles are shown. nr, non‐recombined cells. Scale bars, 5 μm.C The time from anaphase onset until the GFP appearance of Inn1 was determined by filming synchronized Inn1‐Clb2m‐GFP and Inn1‐Clb2mΔCdk‐GFP cells containing Spc42‐YFP‐labeled spindle pole bodies. Error bars represent SD.D As in (C), now the persistence of a full actomyosin ring was measured in cells expressing Inn1‐Clb2m, Inn1‐Clb2mΔCdk or their respective non‐phosphorylatable mutants together with Myo1‐GFP and Spc42‐YFP. Error bars represent SD.E Montage of medial view projections of actomyosin rings in Inn1‐Clb2m and Inn1‐Clb2mΔCdk cells. Frames are shown in 2‐min intervals.F Actomyosin ring contraction phenotypes from at least 21 cells filmed as in (E) were blindly scored as having a normal (\"constriction\") or aberrant (\"disintegration\") cytokinetic phenotype.G Cytokinetic defect and cell viability of Inn1‐Clb2m or Inn1‐Clb2mΔCdk cells in the absence or presence of Chs2V377I. In the bar graph, red dots represent values of duplicate biological replicates with bars representing the average. Significance is calculated using Student's t‐test. 10‐fold spot dilution assays are represented, together with the Western blotting analysis for Inn1 before and after its fusion to Clb2m. Tub1 served as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Typical", "examples", "of", "stage", "1", "(", "day", "0", ")", ",", "stage", "2", "(", "day", "7", ")", "and", "stage", "3", "(", "day", "12", ")", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "/", "neurons", "immunostained", "for", "γ", "-", "Tubulin", "and", "Centrin", ",", "marked", "by", "arrows", ".", "Cells", "were", "co", "-", "immunostained", "with", "Ki67", "and", "DAPI", "(", "day", "0", ")", "or", "Trim46", "and", "MAP2", "(", "day", "7", "and", "12", ")", "to", "define", "their", "neuronal", "stages", ".", "Arrowheads", "mark", "the", "AIS", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "zooms", ".", "D", ".", "3D", "STED", "imaging", "of", "αTubulin", "in", "stage", "1", "(", "day", "0", ")", ",", "stage", "2", "(", "day", "7", ")", "and", "stage", "3", "(", "day", "13", ")", "hiPSC", "-", "derived", "neurons", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", "in", "overview", ",", "1µm", "in", "zoom", ".", "F", ".", "Typical", "examples", "of", "centrosomes", "of", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "(", "day", "0", ")", "with", "STED", "imaging", "of", "Trim46", "and", "Centrin", "immunostaining", ",", "and", "confocal", "imaging", "of", "γ", "-", "Tubulin", "immunostaining", ".", "Scale", "bar", "=", "1µm", ".", "G", ".", "Typical", "examples", "of", "stage", "2", "and", "stage", "3", "human", "iPSC", "-", "derived", "neurons", "immunostained", "for", "Trim46", "and", "MAP2", ".", "Inserts", "represent", "centrosomes", ".", "Zooms", "on", "the", "right", "represent", "a", "non", "-", "polarized", "neurite", "or", "a", "developing", "axon", "in", "stage", "2", "or", "stage", "3", "neurons", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", "in", "overview", ",", "1µm", "in", "insert", ",", "10µm", "in", "zoom", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Typical examples of stage 1 (day 0), stage 2 (day 7) and stage 3 (day 12) human iPSC-derived NSCs/neurons immunostained for γ-Tubulin and Centrin, marked by arrows. Cells were co-immunostained with Ki67 and DAPI (day 0) or Trim46 and MAP2 (day 7 and 12) to define their neuronal stages. Arrowheads mark the AIS. Scale bar = 10µm in overview, 2µm in zooms.D. 3D STED imaging of αTubulin in stage 1 (day 0), stage 2 (day 7) and stage 3 (day 13) hiPSC-derived neurons. Scale bar = 5µm in overview, 1µm in zoom.F. Typical examples of centrosomes of human iPSC-derived NSCs (day 0) with STED imaging of Trim46 and Centrin immunostaining, and confocal imaging of γ-Tubulin immunostaining. Scale bar = 1µm.G. Typical examples of stage 2 and stage 3 human iPSC-derived neurons immunostained for Trim46 and MAP2. Inserts represent centrosomes. Zooms on the right represent a non-polarized neurite or a developing axon in stage 2 or stage 3 neurons, respectively. Scale bar = 20µm in overview, 1µm in insert, 10µm in zoom."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Typical", "examples", "of", "Centrinone", "-", "B", "treated", "or", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "NSCs", "immunostained", "for", "Pericentrin", "and", "Centrin", ".", "Inserts", "represent", "centriole", "(", "s", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "inserts", ".", "B", ".", "Quantifications", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "0", ",", "1", "or", "2", "centrioles", "per", "cell", "after", "0", "(", "control", ")", ",", "2", "or", "5", "days", "Centrinone", "-", "B", "treatment", "and", "prior", "to", "neuronal", "induction", ".", "n", "=", "48", "-", "51", "cells", "in", "2", "independent", "experiments", ".", "C", "Data", "information", ":", "Data", "represents", "mean", "±", "SEM", ".", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Bonferroni", "correction", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", ">", "0", ".", "05C", ".", "Typical", "examples", "of", "Centrinone", "-", "B", "treated", "or", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "neurons", "(", "12", "-", "15", "days", ")", "immunostained", "for", "AnkG", ",", "Trim46", ",", "MAP2", "and", "Centrin", ".", "Arrowheads", "mark", "AIS", "structures", ",", "arrows", "mark", "centrosomes", ".", "Inserts", "represent", "centrosomes", ",", "zooms", "on", "the", "right", "represent", "AIS", "structures", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", "in", "overview", ",", "2µm", "in", "insert", ",", "10µm", "in", "zooms", ".", "M", ".", "AP", "threshold", ",", "amplitude", "and", "after", "-", "hyperpolarization", "recorded", "in", "Centrinone", "-", "B", "treated", "(", "n", "=", "43", "cells", "in", "3", "independent", "experiments", ")", "and", "control", "human", "iPSC", "-", "derived", "neuron", "cultures", "(", "n", "=", "59", "cells", "in", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represents", "mean", "±", "SEM", ".", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Mann", "Whitney", "test", "after", "-", "hyperpolarization", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "M", ":", "threshold", ",", "AP", "amplitude", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", ">", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Typical examples of Centrinone-B treated or control human iPSC-derived NSCs immunostained for Pericentrin and Centrin. Inserts represent centriole(s). Scale bar = 5µm in overview, 2µm in inserts. B. Quantifications of the percentage of cells with 0, 1 or 2 centrioles per cell after 0 (control), 2 or 5 days Centrinone-B treatment and prior to neuronal induction. n = 48-51 cells in 2 independent experiments. C Data information: Data represents mean ± SEM. Chi-square-test including post-hoc analysis with Bonferroni correction *** p<0.001, ** p<0.01, * p < 0.05, ns p>0.05C. Typical examples of Centrinone-B treated or control human iPSC-derived neurons (12-15 days) immunostained for AnkG, Trim46, MAP2 and Centrin. Arrowheads mark AIS structures, arrows mark centrosomes. Inserts represent centrosomes, zooms on the right represent AIS structures. Scale bar = 20µm in overview, 2µm in insert, 10µm in zooms.M. AP threshold, amplitude and after-hyperpolarization recorded in Centrinone-B treated (n = 43 cells in 3 independent experiments) and control human iPSC-derived neuron cultures (n = 59 cells in 4 independent experiments). Data information: Data represents mean ± SEM. Chi-square-test including post-hoc analysis with Mann Whitney test after-hyperpolarization Student's t test (M: threshold, AP amplitude). *** p<0.001, ** p<0.01, * p < 0.05, ns p>0.05"}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Representative", "images", "of", "fan", "-", "like", "growth", "cones", "at", "day", "5", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", ".", "Growth", "cone", "visualized", "by", "immunostaining", "for", "phalloidin", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "E", ".", "Quantifications", "of", "the", "average", "area", "(", "µm²", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "n", "=", "25", "-", "83", "growth", "cones", "in", "3", "independent", "experiments", ".", "F", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "including", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "analysis", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", "≥", "0", ".", "05F", ".", "Representative", "images", "of", "different", "growth", "cone", "morphological", "categories", ":", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", "and", "bulb", "-", "like", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "G", ".", "Quantifications", "of", "the", "ratios", "of", "different", "subtypes", "(", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", ",", "bulb", "-", "like", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "H", ".", "Quantifications", "of", "the", "average", "area", "(", "µm²", ")", "of", "different", "subtypes", "(", "fan", "-", "like", ",", "torpedo", "-", "like", ",", "bulb", "-", "like", ")", "of", "growth", "cones", "of", "control", "and", "Centrinone", "-", "B", "treated", "neurons", "in", "untreated", ",", "or", "nocodazole", "-", "treated", "conditions", "at", "different", "time", "points", ".", "n", "=", "5", "-", "55", "growth", "cones", "in", "3", "independent", "experiments", ".", "Da", "Data", "information", ":", "Chi", "-", "square", "-", "test", "including", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Bonferroni", "correction", "(", "G", ")", ",", "One", "-", "way", "ANOVA", "including", "Sidak", "'", "s", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "H", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "p", "≥", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Representative images of fan-like growth cones at day 5 of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions. Growth cone visualized by immunostaining for phalloidin. Scale bar = 5µm. E. Quantifications of the average area (µm²) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. n = 25-83 growth cones in 3 independent experiments. F Data information: Data represent mean ± SEM. One-way ANOVA including Tukey's post-hoc analysis *** p<0.001, ** p<0.005, * p < 0.05, ns p≥0.05F. Representative images of different growth cone morphological categories: fan-like, torpedo-like and bulb-like. Scale bar = 5µm. G. Quantifications of the ratios of different subtypes (fan-like, torpedo-like, bulb-like) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. H. Quantifications of the average area (µm²) of different subtypes (fan-like, torpedo-like, bulb-like) of growth cones of control and Centrinone-B treated neurons in untreated, or nocodazole-treated conditions at different time points. n = 5-55 growth cones in 3 independent experiments. Da Data information: Chi-square-test including post-hoc analysis with Bonferroni correction (G), One-way ANOVA including Sidak's post-hoc analysis (H). *** p<0.001, ** p<0.005, * p < 0.05, ns p≥0.05"}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Example", "stills", "from", "a", "spinning", "-", "disk", "time", "-", "lapse", "recording", "of", "a", "neurite", "transfected", "with", "mRFP", "and", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", ".", "The", "top", "panel", "is", "a", "still", "of", "a", "neurite", "in", "mRFP", ",", "showing", "neurite", "morphology", ".", "The", "other", "panels", "show", "moving", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", "comets", "pointing", "in", "either", "an", "anterograde", "direction", "(", "green", "arrowheads", ")", "or", "retrograde", "direction", "(", "blue", "arrowheads", ")", ".", "P", "indicates", "the", "proximal", "direction", "and", "D", "the", "distal", "direction", "of", "the", "neurite", ".", "Timestamp", "in", "minutes", ":", "seconds", "given", "on", "bottom", "right", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "B", ".", "Kymographs", "and", "schematic", "representations", "of", "time", "-", "lapse", "recordings", "of", "the", "distal", "axon", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "for", "different", "time", "points", "(", "day", "7", ";", "day", "13", ")", "and", "conditions", "(", "control", ";", "Centrinone", "-", "B", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "C", "J", ".", "Example", "stills", "from", "a", "spinning", "-", "disk", "time", "-", "lapse", "recording", "of", "a", "neurite", "transfected", "with", "mRFP", "and", "GFP", "-", "MT", "+", "TIP", ".", "Red", "line", "denotes", "the", "location", "of", "LS", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "K", ".", "Kymographs", "and", "schematic", "representations", "of", "time", "-", "lapse", "recordings", "of", "the", "distal", "axon", "as", "shown", "in", "(", "J", ")", "following", "LS", ",", "for", "different", "time", "points", "(", "day", "7", ";", "day", "13", ")", "and", "conditions", "(", "control", ";", "Centrinone", "-", "B", ")", ".", "Red", "line", "and", "red", "arrowhead", "denote", "location", "and", "time", "of", "LS", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "L"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Example stills from a spinning-disk time-lapse recording of a neurite transfected with mRFP and GFP-MT+TIP. The top panel is a still of a neurite in mRFP, showing neurite morphology. The other panels show moving GFP-MT+TIP comets pointing in either an anterograde direction (green arrowheads) or retrograde direction (blue arrowheads). P indicates the proximal direction and D the distal direction of the neurite. Timestamp in minutes:seconds given on bottom right. Scale bar = 5 µm. B. Kymographs and schematic representations of time-lapse recordings of the distal axon as shown in (A), for different time points (day 7; day 13) and conditions (control; Centrinone-B). Scale bar = 5 µm. C J. Example stills from a spinning-disk time-lapse recording of a neurite transfected with mRFP and GFP-MT+TIP. Red line denotes the location of LS. Scale bar = 5 µm. K. Kymographs and schematic representations of time-lapse recordings of the distal axon as shown in (J) following LS, for different time points (day 7; day 13) and conditions (control; Centrinone-B). Red line and red arrowhead denote location and time of LS. Scale bar = 5 µm. L "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Period", "length", "decreases", "with", "continual", "differentiation", "of", "PSCs", "into", "HIOs", ".", "Maturation", "of", "HIOs", "into", "kcHIEs", "leads", "to", "24", "-", "hour", "rhythms", "with", "greater", "reproducibility", ".", "(", "D", ")", "The", "amplitude", "of", "oscillations", "are", "significantly", "higher", "in", "kcHIEs", "/", "bHIEs", "compared", "to", "HIOs", ".", "Bmal1", "-", "luc", "traces", "in", "B", "were", "generated", "by", "plotting", "the", "standard", "deviation", "of", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Period length decreases with continual differentiation of PSCs into HIOs. Maturation of HIOs into kcHIEs leads to 24-hour rhythms with greater reproducibility. (D) The amplitude of oscillations are significantly higher in kcHIEs/bHIEs compared to HIOs. Bmal1-luc traces in B were generated by plotting the standard deviation of n≥3 biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "mRNA", "expression", "of", "Bmal1", "(", "black", ")", ",", "Rev", "-", "erbα", "(", "grey", ")", "and", "Per2", "(", "red", ")", "in", "HIOs", "(", "A", ")", ",", "kcHIEs", "(", "B", ")", "and", "bHIEs", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) mRNA expression of Bmal1 (black), Rev-erbα (grey) and Per2 (red) in HIOs (A), kcHIEs (B) and bHIEs (C)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "necrotic", "cell", "death", "(", "SYTOX", "orange", "-", "red", "fluorescence", ")", "at", "2", "-", ",", "24", "-", "and", "48", "-", "hours", "post", "exposure", "to", "10ng", "/", "mL", "TcdB", "in", "control", "Bmal1f", "/", "f", "-", "EsrCRE", "enteroids", ".", "Scale", "bar", "=", "250μm", ".", "(", "B", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "fluorescent", "intensity", "from", "SYTOX", "orange", "in", "control", "Bmal1f", "/", "f", "-", "EsrCRE", "enteroids", "without", "tamoxifen", "treatment", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "necrotic", "cell", "death", "(", "SYTOX", "orange", ")", "at", "2", "-", ",", "24", "-", "and", "48", "-", "hours", "post", "exposure", "to", "10ng", "/", "mL", "TcdB", "in", "tamoxifen", "-", "treated", "circadian", "arrhythmic", "Bmal1f", "/", "f", "-", "EsrCRE", "enteroids", ".", "Scale", "bar", "=", "250μm", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "fluorescent", "intensity", "from", "SYTOX", "orange", "in", "tamoxifen", "-", "treated", "circadian", "arrhythmic", "Bmal1f", "/", "f", "-", "EsrCRE", "enteroids", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative images of necrotic cell death (SYTOX orange - red fluorescence) at 2-, 24- and 48-hours post exposure to 10ng/mL TcdB in control Bmal1f/f-EsrCRE enteroids. Scale bar = 250μm. (B) Quantitative analysis of fluorescent intensity from SYTOX orange in control Bmal1f/f-EsrCRE enteroids without tamoxifen treatment. (C) Representative images of necrotic cell death (SYTOX orange) at 2-, 24- and 48-hours post exposure to 10ng/mL TcdB in tamoxifen-treated circadian arrhythmic Bmal1f/f-EsrCRE enteroids. Scale bar = 250μm. (D) Quantitative analysis of fluorescent intensity from SYTOX orange in tamoxifen-treated circadian arrhythmic Bmal1f/f-EsrCRE enteroids. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "necrotic", "cell", "death", "(", "SYTOX", "orange", ")", "at", "2", "-", ",", "24", "-", "and", "48", "-", "hours", "post", "exposure", "to", "0", ".", "1μg", "/", "mL", "TcdB", "in", "HIOs", ".", "Scale", "bar", "=", "250μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "necrotic", "cell", "death", "in", "HIOs", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "necrotic", "cell", "death", "(", "SYTOX", "orange", ")", "at", "2", "-", ",", "24", "-", "and", "48", "-", "hours", "post", "exposure", "to", "0", ".", "5μg", "/", "mL", "TcdB", "in", "kcHIEs", ".", "Scale", "bar", "=", "250μm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "necrotic", "cell", "death", "in", "kcHIEs", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "necrotic", "cell", "death", "(", "SYTOX", "orange", ")", "at", "2", "-", ",", "24", "-", "and", "48", "-", "hours", "post", "exposure", "to", "0", ".", "5μg", "/", "mL", "TcdB", "in", "bHIEs", ".", "Scale", "bar", "=", "250μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "necrotic", "cell", "death", "in", "bHIEs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images of necrotic cell death (SYTOX orange) at 2-, 24- and 48-hours post exposure to 0.1μg/mL TcdB in HIOs. Scale bar = 250μm. (B) Quantification of necrotic cell death in HIOs. (C) Representative images of necrotic cell death (SYTOX orange) at 2-, 24- and 48-hours post exposure to 0.5μg/mL TcdB in kcHIEs. Scale bar = 250μm. (D) Quantification of necrotic cell death in kcHIEs. (E) Representative images of necrotic cell death (SYTOX orange) at 2-, 24- and 48-hours post exposure to 0.5μg/mL TcdB in bHIEs. Scale bar = 250μm. (F) Quantification of necrotic cell death in bHIEs. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Heatmap", "of", "circadian", "transcripts", "over", "48", "hours", "in", "mouse", "and", "human", "enteroids", ".", "(", "B", ")", "Spearman", "'", "s", "rho", "for", "circadian", "clock", "and", "clock", "-", "associated", "genes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Heatmap of circadian transcripts over 48 hours in mouse and human enteroids.(B) Spearman's rho for circadian clock and clock-associated genes."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Validation", "of", "anti", "-", "phasic", "Rac1", "expression", "in", "mouse", "(", "mRac1", ",", "red", ")", "and", "human", "enteroids", "(", "hRac1", ",", "black", ")", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "(", "B", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "fluorescent", "intensity", "from", "SYTOX", "orange", "in", "Rac1", "-", "KD", "bHIEs", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "fluorescent", "intensity", "from", "SYTOX", "orange", "in", "control", "Rac1", "f", "/", "f", ";", "CAGGCre", "-", "ERTM", "without", "tamoxifen", "(", "C", ")", "or", "Rac1", "f", "/", "f", ";", "CAGGCre", "-", "ERTM", "with", "tamoxifen", "-", "treated", "(", "D", ")", "enteroids", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Validation of anti-phasic Rac1 expression in mouse (mRac1, red) and human enteroids (hRac1, black) by qRT-PCR. (B) Quantitative analysis of fluorescent intensity from SYTOX orange in Rac1-KD bHIEs. (C-D) Quantitative analysis of fluorescent intensity from SYTOX orange in control Rac1 f/f;CAGGCre-ERTM without tamoxifen (C) or Rac1 f/f;CAGGCre-ERTM with tamoxifen-treated (D) enteroids."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "FPKM", "of", "the", "7", "LncRNAs", "identified", "in", "the", "RNA", "-", "seq", "with", "high", "expression", "in", "PGCs", ".", "The", "solid", "lines", "at", "each", "end", "of", "the", "box", "plot", "represent", "the", "maximum", "and", "minimum", "values", ",", "respectively", ".", "The", "three", "dotted", "lines", "in", "the", "middle", "of", "the", "violin", "diagram", "represent", "the", "75", "%", "percentile", ",", "the", "mean", ",", "and", "the", "25", "%", "percentile", "in", "turn", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. FPKM of the 7 LncRNAs identified in the RNA-seq with high expression in PGCs. The solid lines at each end of the box plot represent the maximum and minimum values, respectively. The three dotted lines in the middle of the violin diagram represent the 75% percentile, the mean, and the 25% percentile in turn."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Up", ":", "The", "schematic", "diagram", "of", "PGCs", "induced", "from", "chicken", "ESCs", "in", "vitro", ".", "Down", ":", "Morphological", "observation", "of", "the", "number", "of", "embryoid", "bodies", "in", "the", "in", "vitro", "PGCs", "induction", "model", "after", "LncBMP4overexpression", "and", "interference", ";", "oeLncBMP4", "indicates", "the", "overexpression", "of", "LncBMP4", ";", "shLncBMP4", "indicates", "the", "interference", "of", "LncBMP4", ";", "BMP4", "induction", "was", "regarded", "as", "the", "control", ".", "Scale", "bar", ":", "60", "µm", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "B", ".", "The", "expression", "of", "reproductive", "marker", "genes", "(", "Cvh", "and", "C", "-", "kit", ")", ",", "LncBMP4", ",", "and", "BMP4", "were", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "after", "LncBMP4", "overexpression", "and", "interference", ",", "in", "vitro", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Up: The schematic diagram of PGCs induced from chicken ESCs in vitro. Down: Morphological observation of the number of embryoid bodies in the in vitro PGCs induction model after LncBMP4overexpression and interference; oeLncBMP4 indicates the overexpression of LncBMP4; shLncBMP4 indicates the interference of LncBMP4; BMP4 induction was regarded as the control. Scale bar: 60 µm (n = 3 independent experiments).B. The expression of reproductive marker genes (Cvh and C-kit), LncBMP4, and BMP4 were detected by qRT-PCR after LncBMP4 overexpression and interference, in vitro (Data are shown as mean ± SEM, n = 3 independent experiments, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, one-way ANOVA) ."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "The", "results", "of", "IHC", "examining", "using", "anti", "-", "DDX4", "antibody", "shows", "that", "the", "overexpression", "of", "LncBMP4", "increases", "the", "number", "of", "PGCs", "in", "the", "genital", "ridge", ",", "and", "interference", "with", "LncBMP4", "reduces", "the", "number", "of", "PGCs", "in", "the", "genital", "ridge", ".", "The", "number", "of", "PGCs", "was", "counted", "through", "the", "Segmentation", "module", "of", "Image", "J", "software", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", "(", "top", "row", ")", ",", "40", "μm", "(", "bottom", "row", ")", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "B", ".", "The", "number", "of", "PGCs", "in", "the", "genital", "ridge", ",", "following", "the", "overexpression", "or", "interference", "of", "LncBMP4", ",", "as", "determined", "by", "flow", "cytometry", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "C", ".", "The", "number", "of", "PGCs", "labeled", "with", "PkH26", "(", "red", ")", "that", "migrated", "to", "the", "genital", "ridge", "in", "a", "frozen", "section", ",", "the", "number", "of", "PGCs", "labeled", "with", "PkH26", "(", "red", ")", "was", "counted", "using", "Image", "J", "software", ".", "Scale", "bar", ":", "70", "µm", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", " ", "6", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. The results of IHC examining using anti-DDX4 antibody shows that the overexpression of LncBMP4 increases the number of PGCs in the genital ridge, and interference with LncBMP4 reduces the number of PGCs in the genital ridge. The number of PGCs was counted through the Segmentation module of Image J software. Scale bars:200 μm (top row),40 μm (bottom row) (Data are shown as mean ± SEM, n = 3 independent experiments, * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).B. The number of PGCs in the genital ridge, following the overexpression or interference of LncBMP4, as determined by flow cytometry (Data are shown as mean ± SEM, n = 3 independent experiments, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).C. The number of PGCs labeled with PkH26 (red) that migrated to the genital ridge in a frozen section, the number of PGCs labeled with PkH26 (red) was counted using Image J software. Scale bar: 70 µm (Data are shown as mean ± SEM, n = 6 independent experiments, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, one-way ANOVA.)."}
{"words": ["Figure", "4D", ".", "The", "expression", "of", "reproductive", "marker", "genes", "(", "Cvh", "and", "C", "-", "kit", ")", ",", "LncBMP4", ",", "and", "BMP4", "were", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "the", "genital", "ridge", "after", "gga", "-", "mir", "-", "12211", "overexpression", "and", "interference", "in", "vitro", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "E", ".", "The", "efficiency", "of", "PGC", "differentiation", "was", "detected", "by", "IF", ",", "4", "d", "after", "induction", ",", "using", "C", "-", "KIT", "and", "CVH", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ":", "60", "µm", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D. The expression of reproductive marker genes (Cvh and C-kit), LncBMP4, and BMP4 were detected by qRT-PCR in the genital ridge after gga-mir-12211 overexpression and interference in vitro (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).E. The efficiency of PGC differentiation was detected by IF, 4 d after induction, using C-KIT and CVH antibodies. Scale bar: 60 µm (n = 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "A", "luciferase", "reporting", "system", "was", "used", "to", "detect", "the", "regulatory", "effects", "of", "gga", "-", "mir", "-", "12211", "on", "the", "activity", "of", "BMP4", "-", "3", "'", "UTR", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "B", ".", "qRT", "-", "PCR", "was", "used", "to", "detect", "the", "regulatory", "effects", "of", "gga", "-", "mir", "-", "12211", "on", "LncBMP4", "expression", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "Enrichment", "levels", "of", "m6A", "in", "LncBMP4", "were", "detected", "by", "RIP", "-", "qPCR", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "H", "and", "I", ".", "The", "effects", "of", "m6A", "modifications", "of", "LncBMP4", "on", "the", "ceRNA", "system", "were", "detected", "by", "the", "luciferase", "reporting", "system", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. A luciferase reporting system was used to detect the regulatory effects of gga-mir-12211 on the activity of BMP4-3'UTR (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, * p < 0.05, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).B. qRT-PCR was used to detect the regulatory effects of gga-mir-12211 on LncBMP4 expression (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).Enrichment levels of m6A in LncBMP4 were detected by RIP-qPCR (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).H and I. The effects of m6A modifications of LncBMP4 on the ceRNA system were detected by the luciferase reporting system (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, * p < 0.05, **** p < 0.0001, one-way ANOVA.)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "The", "influence", "of", "m6A", "on", "the", "stability", "of", "LncBMP4", "was", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "D", ".", "The", "enrichment", "level", "of", "m6A", ",", "for", "LncBMP4", "variants", "with", "the", "progressive", "accumulation", "of", "RRACH", "site", "mutations", ",", "was", "detected", "by", "RIP", "-", "qPCR", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "E", ".", "The", "ability", "of", "LncBMP4", ",", "modified", "with", "different", "levels", "of", "m6A", ",", "to", "bind", "gga", "-", "mir", "-", "12211", "was", "detected", "by", "the", "luciferase", "reporting", "system", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. The influence of m6A on the stability of LncBMP4 was detected by qRT-PCR (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).D. The enrichment level of m6A, for LncBMP4 variants with the progressive accumulation of RRACH site mutations, was detected by RIP-qPCR (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, * p < 0.05, ** p < 0.01, one-way ANOVA).E. The ability of LncBMP4, modified with different levels of m6A, to bind gga-mir-12211 was detected by the luciferase reporting system (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, ** p < 0.01, **** p < 0.0001, one-way ANOVA.)."}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "qRT", "-", "PCR", "was", "used", "to", "detect", "the", "expression", "of", "related", "genes", "in", "each", "group", ",", "during", "induction", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "D", ".", "The", "number", "of", "CVH", "-", "positive", "cells", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. qRT-PCR was used to detect the expression of related genes in each group, during induction (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, one-way ANOVA).D. The number of CVH-positive cells was determined by flow cytometry (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, ** p < 0.01, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, one-way ANOVA.)."}
{"words": ["Figure", "8C", ".", "Effects", "of", "m6A", "on", "small", "peptide", "expression", ",", "assessed", "by", "western", "blot", "(", "Up", ")", ",", "Image", "J", "software", "was", "used", "for", "gray", "level", "analysis", "(", "Down", ")", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "D", "and", "E", ".", "Western", "blot", "(", "Up", ")", "was", "used", "to", "detect", "gga", "-", "mir", "-", "12211", "and", "m6A", "affect", "the", "ability", "of", "LncBMP4", "to", "translate", "EPC5", ".", "Image", "J", "software", "was", "used", "for", "gray", "level", "analysis", "(", "Down", ")", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SEM", ",", "n", " ", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C. Effects of m6A on small peptide expression, assessed by western blot (Up), Image J software was used for gray level analysis(Down) (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, **** p < 0.0001, one-way ANOVA).D and E. Western blot(Up) was used to detect gga-mir-12211 and m6A affect the ability of LncBMP4 to translate EPC5. Image J software was used for gray level analysis(Down) (Data are shown as mean ± SEM, n =3 independent experiments, *** p < 0.001,**** p < 0.0001, one-way ANOVA.)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Cardiac", "GATA4", "protein", "abundance", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "GAPDH", "was", "the", "loading", "control", ".", "+", "denotes", "positive", "control", "for", "GATA4", "from", "cardiomyocytes", "infected", "with", "a", "GATA4", "overexpressing", "adenovirus", ".", "(", "B", ")", "Densitometric", "quantification", "of", "the", "immunoblot", "shown", "under", "(", "A", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0003", "for", "P1", "vs", ".", "P7", "and", "P1", "vs", ".", "P21", ";", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "P1", "vs", ".", "P60", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "of", "cardiac", "GATA4", "abundance", "in", "control", "(", "Con", ")", "and", "cardiomyocyte", "specific", "Gata4", "knock", "-", "out", "mice", "(", "CM", "-", "G4", "-", "KO", ")", "at", "postnatal", "day", "(", "P", ")", "1", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "immunoblot", "shown", "in", "(", "C", ")", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "018", ".", "(", "E", ")", "Cardiac", "immunofluorescence", "staining", "and", "its", "quantification", "from", "Con", "and", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "mice", "at", "P1", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "µm", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "Transversal", "sections", "of", "mouse", "hearts", "7", "days", "after", "cryoinjury", "as", "indicated", ",", "stained", "with", "Sirius", "-", "Red", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "The", "quantification", "of", "the", "left", "ventricular", "(", "LV", ")", "scar", "area", "(", "red", ",", "arrows", ")", "7", "days", "after", "injury", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0027", ".", "(", "G", ")", "The", "quantification", "of", "the", "LV", "scar", "area", "of", "the", "indicated", "mice", "21", "days", "after", "cryoinjury", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0261", ".", "(", "H", ")", "The", "quantification", "of", "the", "LV", "scar", "area", "of", "the", "indicated", "mice", "60", "days", "after", "cryoinjury", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "I", ")", "Echocardiography", "analysis", "of", "left", "ventricular", "systolic", "function", "(", "measured", "as", "fractional", "area", "change", ")", "in", "the", "indicated", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "033", "between", "Con", "mice", "after", "sham", "or", "cryoinjury", "and", "p", "=", "0", ".", "04", "between", "Con", "and", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "mice", "after", "cryoinjury", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Cardiac GATA4 protein abundance analyzed by immunoblotting. GAPDH was the loading control. + denotes positive control for GATA4 from cardiomyocytes infected with a GATA4 overexpressing adenovirus.(B) Densitometric quantification of the immunoblot shown under (A); ***p=0.0003 for P1 vs. P7 and P1 vs. P21; p<0.0001 for P1 vs. P60. The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group.(C) Immunoblot of cardiac GATA4 abundance in control (Con) and cardiomyocyte specific Gata4 knock-out mice (CM-G4-KO) at postnatal day (P) 1.(D) Quantification of the immunoblot shown in (C); *p=0.018.(E) Cardiac immunofluorescence staining and its quantification from Con and CM-G4-KO mice at P1. Scale bar: 25 µm; ****p<0.0001.(F) Transversal sections of mouse hearts 7 days after cryoinjury as indicated, stained with Sirius-Red . Scale bar: 500 µm. The quantification of the left ventricular (LV) scar area (red, arrows) 7 days after injury is shown on the right; **p=0.0027.(G) The quantification of the LV scar area of the indicated mice 21 days after cryoinjury; *p=0.0261.(H) The quantification of the LV scar area of the indicated mice 60 days after cryoinjury; ****p<0.0001.(I) Echocardiography analysis of left ventricular systolic function (measured as fractional area change) in the indicated mice 7 days after cryoinjury; *p=0.033 between Con mice after sham or cryoinjury and p=0.04 between Con and CM-G4-KO mice after cryoinjury."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "pictures", "of", "TUNEL", ",", "WGA", "(", "wheat", "germ", "agglutinin", "to", "mark", "cardiomyocyte", "membranes", ")", "and", "DAPI", "immunofluorescence", "staining", "of", "mouse", "hearts", "as", "indicated", ".", "The", "white", "dashed", "line", "encircles", "the", "infarcted", "area", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200µm", ".", "The", "quantification", "of", "the", "area", "of", "TUNEL", "positive", "cells", "3", "hours", "after", "cryoinjury", "is", "shown", "on", "the", "right", "(", "A", "´", ")", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "(", "B", ")", "Representative", "merged", "and", "single", "channel", "pictures", "of", "cardiac", "CD31", ",", "DAPI", "and", "WGA", "immunostaining", "in", "mouse", "hearts", "as", "indicated", ".", "The", "quantification", "of", "the", "myocardial", "capillary", "density", "as", "capillaries", "/", "cardiomyocyte", "(", "CM", ")", "ratio", ",", "7", "days", "(", "d", ")", "after", "cryoinjury", "or", "sham", "surgery", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "B", "´", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0039", ".", "(", "C", ")", "Representative", "pictures", "of", "myocardial", "immunofluorescence", "staining", "for", "the", "mitosis", "marker", "phospho", "-", "histone", "H3", "(", "pH3", ")", ",", "troponin", "T", "and", "DAPI", "in", "mice", "as", "indicated", ".", "Enlarged", "pH3", "positive", "cardiomyocyte", "nuclei", "are", "shown", "separately", ".", "The", "arrows", "indicate", "pH3", "positive", "cardiomyocyte", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ":", "25µm", ".", "The", "quantification", "of", "pH3", "positive", "(", "+", ")", "cardiomyocytes", "per", "microscopic", "field", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "C", "´", ")", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "046", ".", "(", "D", ")", "Representative", "myocardial", "immunostaining", "for", "aurora", "B", ",", "DAPI", "and", "troponin", "T", "(", "TropT", ")", ".", "The", "arrow", "points", "towards", "a", "cardiomyocyte", "cell", "division", ",", "in", "which", "aurora", "B", "localizes", "at", "the", "midbody", "in", "cytokinesis", ".", "Scale", "bar", ":", "25µm", ".", "The", "quantification", "of", "dividing", "cardiomyocytes", "per", "microscopic", "field", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "D", "´", ")", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0104", ".", "(", "E", ")", "Determination", "of", "cardiac", "gene", "-", "expression", "by", "qPCR", "7", "days", "after", "sham", "or", "cryoinjury", "for", "the", "indicated", "genes", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "039", "for", "Il13", "and", "p", "=", "0", ".", "049", "for", "Vegfa", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0043", "for", "Ccne1", ",", "p", "=", "0", ".", "0027", "for", "Cdk4", ",", "p", "=", "0", ".", "0096", "for", "Cenpa", ",", "p", "=", "0", ".", "0015", "for", "Zfp191", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0009", "for", "Ccna2", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", "for", "Cenpa", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative pictures of TUNEL, WGA (wheat germ agglutinin to mark cardiomyocyte membranes) and DAPI immunofluorescence staining of mouse hearts as indicated. The white dashed line encircles the infarcted area (arrows). Scale bar: 200µm. The quantification of the area of TUNEL positive cells 3 hours after cryoinjury is shown on the right (A´). The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group.(B) Representative merged and single channel pictures of cardiac CD31, DAPI and WGA immunostaining in mouse hearts as indicated. The quantification of the myocardial capillary density as capillaries/cardiomyocyte (CM) ratio, 7 days (d) after cryoinjury or sham surgery is shown as bar graph (B´). Scale bar: 20µm. **p=0.0039.(C) Representative pictures of myocardial immunofluorescence staining for the mitosis marker phospho-histone H3 (pH3), troponin T and DAPI in mice as indicated. Enlarged pH3 positive cardiomyocyte nuclei are shown separately. The arrows indicate pH3 positive cardiomyocyte nuclei. Scale bar: 25µm. The quantification of pH3 positive (+) cardiomyocytes per microscopic field is shown as bar graph (C´); *p=0.046.(D) Representative myocardial immunostaining for aurora B, DAPI and troponin T (TropT). The arrow points towards a cardiomyocyte cell division, in which aurora B localizes at the midbody in cytokinesis. Scale bar: 25µm. The quantification of dividing cardiomyocytes per microscopic field is shown as bar graph (D´); *p=0.0104.(E) Determination of cardiac gene-expression by qPCR 7 days after sham or cryoinjury for the indicated genes; *p=0.039 for Il13 and p=0.049 for Vegfa; **p=0.0043 for Ccne1, p=0.0027 for Cdk4, p=0.0096 for Cenpa, p=0.0015 for Zfp191; ***p=0.0009 for Ccna2, p=0.0002 for Cenpa."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "for", "GATA4", "and", "GAPDH", "(", "as", "loading", "control", ")", "of", "fetal", "cardiomyocytes", "treated", "with", "adenoviruses", "(", "Ad", ")", "expressing", "control", "shRNA", "(", "shCon", ")", "or", "shRNA", "against", "Gata4", "(", "shGATA4", ")", "for", "48", "hours", ".", "(", "B", ")", "Number", "of", "cardiomyocytes", "(", "CM", ")", "in", "a", "defined", "low", "magnification", "(", "50x", ")", "microscopic", "field", "before", "the", "adenoviral", "infection", "and", "48h", "later", ".", "The", "number", "in", "the", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "cell", "culture", "plates", "analyzed", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Representative", "pictures", "and", "quantification", "of", "BrdU", "incorporation", "in", "fetal", "cardiomyocytes", "48", "hours", "after", "application", "of", "the", "adenoviruses", "as", "indicated", "and", "immunostained", "for", "BrdU", ",", "troponin", "I", "(", "Trop", "I", ")", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ";", "p", "=", "0", ".", "0169", ".", "(", "D", ")", "Representative", "pictures", "and", "quantification", "of", "cardiomyocytes", "positive", "for", "phospho", "-", "histone", "H3", "(", "pH3", ")", "in", "fetal", "cardiomyocytes", "48", "hours", "after", "application", "of", "the", "adenoviruses", "as", "indicated", "and", "immunostained", "for", "pH3", ",", "troponin", "I", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0145", ".", "(", "E", ")", "Representative", "picture", "and", "quantification", "of", "cardiomyocyte", "cell", "division", "in", "fetal", "cardiomyocytes", "48", "hours", "after", "application", "of", "the", "adenoviruses", "as", "indicated", "and", "immunostained", "for", "aurora", "B", "(", "Auro", "B", ")", ",", "troponin", "I", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "(", "F", ")", "Representative", "pictures", ",", "single", "channel", "enlargements", "and", "quantification", "of", "cardiomyocyte", "apoptosis", "in", "fetal", "cardiomyocytes", "48", "hours", "after", "application", "of", "the", "adenoviruses", "and", "after", "immunostaining", "for", "cleaved", "caspase", "3", ",", "troponin", "I", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "100µm", ".", "(", "G", ")", "Representative", "pictures", "of", "cardiac", "explants", "of", "the", "indicated", "mice", "embedded", "in", "Matrigel", "shortly", "after", "cryoinjury", "and", "immunostained", "for", "troponin", "I", "7", "days", "later", ".", "Quantification", "of", "outgrowing", "cardiomyocytes", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0037", ".", "(", "H", ")", "Representative", "pictures", "of", "cardiac", "explants", "like", "in", "(", "G", ")", ",", "stained", "for", "pH3", "in", "addition", ".", "The", "quantification", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0215", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative immunoblots for GATA4 and GAPDH (as loading control) of fetal cardiomyocytes treated with adenoviruses (Ad) expressing control shRNA (shCon) or shRNA against Gata4 (shGATA4) for 48 hours.(B) Number of cardiomyocytes (CM) in a defined low magnification (50x) microscopic field before the adenoviral infection and 48h later. The number in the bars indicates the number of cell culture plates analyzed. ****p<0.0001.(C) Representative pictures and quantification of BrdU incorporation in fetal cardiomyocytes 48 hours after application of the adenoviruses as indicated and immunostained for BrdU, troponin I (Trop I) and DAPI. Scale bar: 50µm; p=0.0169.(D) Representative pictures and quantification of cardiomyocytes positive for phospho-histone H3 (pH3) in fetal cardiomyocytes 48 hours after application of the adenoviruses as indicated and immunostained for pH3, troponin I and DAPI. Scale bar: 50µm; *p=0.0145.(E) Representative picture and quantification of cardiomyocyte cell division in fetal cardiomyocytes 48 hours after application of the adenoviruses as indicated and immunostained for aurora B (Auro B), troponin I and DAPI. Scale bar: 50µm.(F) Representative pictures, single channel enlargements and quantification of cardiomyocyte apoptosis in fetal cardiomyocytes 48 hours after application of the adenoviruses and after immunostaining for cleaved caspase 3, troponin I and DAPI. Scale bar: 100µm.(G) Representative pictures of cardiac explants of the indicated mice embedded in Matrigel shortly after cryoinjury and immunostained for troponin I 7 days later. Quantification of outgrowing cardiomyocytes is shown on the right. The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group. Scale bar: 50µm. **p=0.0037.(H) Representative pictures of cardiac explants like in (G), stained for pH3 in addition. The quantification is shown on the right. Scale bar: 50µm. *p=0.0215."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblot", "for", "GATA4", "and", "actin", "from", "neonatal", "cardiomyocytes", "treated", "with", "control", "(", "Ad", ".", "Con", ")", "or", "GATA4", "expressing", "adenovirus", "(", "Ad", ".", "GATA4", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "BrdU", "incorporation", ",", "pH3", "labelling", "and", "cytokinesis", "in", "neonatal", "cardiomyocytes", "treated", "as", "shown", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0272", "for", "BrdU", "incorporation", ",", "p", "=", "0", ".", "0329", "for", "pH3", "labelling", ",", "p", "=", "0", ".", "0217", "for", "cytokinesis", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "for", "GATA4", "and", "GAPDH", "of", "mouse", "hearts", "treated", "as", "shown", "in", "the", "experimental", "time", "scale", "above", ".", "(", "D", ")", "A", "quantification", "of", "the", "immunoblot", "from", "(", "C", ")", "is", "shown", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0062", ".", "(", "E", ")", "Representative", "pictures", "of", "myocardial", "sections", "immunostained", "for", "the", "indicated", "proteins", "from", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", "and", "treatment", "with", "Ad", ".", "Con", "or", "Ad", ".", "GATA4", ".", "The", "quantification", "of", "cardiomyocytes", "(", "CM", ")", "staining", "positive", "for", "GATA4", "vs", ".", "total", "cardiomyocytes", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "E", "´", ")", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "E", ")", "Representative", "pictures", "of", "myocardial", "sections", "immunostained", "for", "the", "indicated", "proteins", "from", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", "and", "treatment", "with", "Ad", ".", "Con", "or", "Ad", ".", "GATA4", ".", "The", "quantification", "of", "cardiomyocytes", "(", "CM", ")", "staining", "positive", "for", "GATA4", "vs", ".", "total", "cardiomyocytes", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "E", "´", ")", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "Representative", "Sirius", "-", "Red", "stained", "heart", "sections", "of", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", "(", "performed", "at", "P7", ")", "and", "treated", "with", "adenoviruses", "as", "indicated", ".", "The", "scar", "is", "displayed", "in", "red", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "The", "quantification", "of", "left", "ventricular", "(", "LV", ")", "scar", "area", "of", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", "is", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "F", "´", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0135", ".", "(", "G", ")", "Representative", "picture", "of", "a", "myocardial", "section", "immunostained", "for", "the", "indicated", "proteins", "7", "days", "after", "cryoinjury", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cardiomyocytes", "in", "these", "mice", "(", "G", "´", ")", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0023", ".", "(", "G", ")", "Representative", "picture", "of", "a", "myocardial", "section", "immunostained", "for", "the", "indicated", "proteins", "7", "days", "after", "cryoinjury", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cardiomyocytes", "in", "these", "mice", "(", "G", "´", ")", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0023", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "pH3", "positive", "cardiomyocytes", "and", "cardiomyocyte", "(", "CM", ")", "cytokinesis", "in", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0264", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0006", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "capillary", "/", "cardiomyocyte", "ratio", "in", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", ".", "*", "*", "*", "p", "=", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative immunoblot for GATA4 and actin from neonatal cardiomyocytes treated with control (Ad.Con) or GATA4 expressing adenovirus (Ad.GATA4).(B) Quantification of BrdU incorporation, pH3 labelling and cytokinesis in neonatal cardiomyocytes treated as shown. *p=0.0272 for BrdU incorporation, p=0.0329 for pH3 labelling, p=0.0217 for cytokinesis.(C) Immunoblot for GATA4 and GAPDH of mouse hearts treated as shown in the experimental time scale above.(D) A quantification of the immunoblot from (C) is shown; **p=0.0062.(E) Representative pictures of myocardial sections immunostained for the indicated proteins from mice 7 days after cryoinjury and treatment with Ad.Con or Ad.GATA4. The quantification of cardiomyocytes (CM) staining positive for GATA4 vs. total cardiomyocytes is shown as bar graph (E´). The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group. Scale bar: 20µm. ****p<0.0001.(E) Representative pictures of myocardial sections immunostained for the indicated proteins from mice 7 days after cryoinjury and treatment with Ad.Con or Ad.GATA4. The quantification of cardiomyocytes (CM) staining positive for GATA4 vs. total cardiomyocytes is shown as bar graph (E´). The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group. Scale bar: 20µm. ****p<0.0001.(F) Representative Sirius-Red stained heart sections of mice 7 days after cryoinjury (performed at P7) and treated with adenoviruses as indicated. The scar is displayed in red (arrows). Scale bar: 500 µm. The quantification of left ventricular (LV) scar area of mice 7 days after cryoinjury is shown as bar graph (F´). *p=0.0135.(G) Representative picture of a myocardial section immunostained for the indicated proteins 7 days after cryoinjury. Scale bar: 10 µm. Quantification of Ki67 positive cardiomyocytes in these mice (G´). **p=0.0023.(G) Representative picture of a myocardial section immunostained for the indicated proteins 7 days after cryoinjury. Scale bar: 10 µm. Quantification of Ki67 positive cardiomyocytes in these mice (G´). **p=0.0023.(H) Quantification of pH3 positive cardiomyocytes and cardiomyocyte (CM) cytokinesis in mice 7 days after cryoinjury; *p=0.0264, ***p=0.0006.(I) Quantification of the capillary/cardiomyocyte ratio in mice 7 days after cryoinjury. ***p=0.0002"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "left", "ventricular", "(", "LV", ")", "scar", "area", "of", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", "and", "treated", "as", "indicated", ".", "The", "number", "within", "bars", "indicates", "the", "number", "of", "mice", "analyzed", "in", "that", "particular", "group", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0017", "between", "Con", "and", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "after", "PBS", "treatment", "and", "p", "=", "0", ".", "0078", "between", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "mice", "with", "PBS", "or", "IL", "-", "13", "treatment", ".", "(", "C", ")", "Echocardiography", "analysis", "of", "left", "ventricular", "systolic", "function", "in", "the", "indicated", "mice", "7", "days", "after", "cryoinjury", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0218", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Ki67", "or", "pH3", "positive", "cardiomyocytes", "in", "mice", "treated", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0106", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0052", "between", "Con", "and", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "after", "PBS", "treatment", "and", "*", "p", "=", "0", ".", "0439", "or", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0023", "between", "CM", "-", "G4", "-", "KO", "mice", "with", "PBS", "or", "IL", "-", "13", "treatment", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "capillary", "density", "as", "capillary", "/", "cardiomyocyte", "(", "CM", ")", "ratio", "in", "mice", "treated", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0365", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0031", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "α", "-", "SMA", "positive", "small", "conductance", "vessel", "(", "~", "20", "-", "50µM", "in", "diameter", ")", "in", "myocardial", "sections", "of", "the", "mice", "treated", "as", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunoblots", "for", "STAT6", "and", "GAPDH", "from", "neonatal", "mouse", "hearts", "(", "KO", "=", "CM", "-", "G4", "-", "KO", ")", "treated", "as", "indicated", ".", "The", "quantification", "of", "the", "blots", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0114", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Quantification of left ventricular (LV) scar area of mice 7 days after cryoinjury and treated as indicated. The number within bars indicates the number of mice analyzed in that particular group. **p=0.0017 between Con and CM-G4-KO after PBS treatment and p=0.0078 between CM-G4-KO mice with PBS or IL-13 treatment.(C) Echocardiography analysis of left ventricular systolic function in the indicated mice 7 days after cryoinjury; *p=0.0218(D) Quantification of Ki67 or pH3 positive cardiomyocytes in mice treated as described in (A); *p=0.0106 and **p=0.0052 between Con and CM-G4-KO after PBS treatment and *p=0.0439 or **p=0.0023 between CM-G4-KO mice with PBS or IL-13 treatment.(E) Quantification of capillary density as capillary/cardiomyocyte (CM) ratio in mice treated as described in (A). *p=0.0365, **p=0.0031.(F) Quantification of α-SMA positive small conductance vessel (~20-50µM in diameter) in myocardial sections of the mice treated as indicated.(G) Representative immunoblots for STAT6 and GAPDH from neonatal mouse hearts (KO = CM-G4-KO) treated as indicated. The quantification of the blots is shown on the right. *p=0.0114."}
{"words": ["Fig", "1HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "B", ")", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "(", "grey", "bars", ")", ",", "48", "(", "pink", "bars", ")", ",", "or", "72", "(", "yellow", "bars", ")", "hours", "and", "cell", "proliferation", "was", "assessed", ".", "HCT", "-", "116", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "D", ",", "F", ")", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaB", "for", "24", "h", ".", "C", ".", "D", ".", "The", "percentage", "of", "apoptotic", "cells", "in", "HCT", "-", "116", "(", "C", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "D", ")", "cells", "was", "quantified", "in", "three", "independent", "experiments", "using", "an", "annexinV", "/", "PI", "assay", "(", "annexinV", "+", "/", "PI", "-", ")", "by", "flow", "cytometry", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "to", "compare", "between", "the", "control", "cells", "and", "NaB", "treatments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "control", ".", "E", ".", "F", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "full", "-", "length", "and", "cleaved", "PARP", "products", "in", "HCT", "-", "116", "(", "E", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "F", ")", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1HCT-116 (A) and HT-29 (B) cells were treated with the indicated concentrations of sodium butyrate (NaB) for 24 (grey bars), 48 (pink bars), or 72 (yellow bars) hours and cell proliferation was assessed. HCT-116(C, E) and HT-29 (D, F) cells were treated with the indicated concentrations of NaB for 24 h. C.D. The percentage of apoptotic cells in HCT-116 (C) and HT-29 (D) cells was quantified in three independent experiments using an annexinV/PI assay (annexinV+/PI-) by flow cytometry and expressed as mean ± SD. One-way ANOVA was used to compare between the control cells and NaB treatments. *p<0.05, ** p<0.01 compared to control. E.F. Representative Western blots of full-length and cleaved PARP products in HCT-116 (E) and HT-29 (F) cells."}
{"words": ["Fig", "2HCT", "-", "116", "(", "A", ",", "C", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "B", ",", "D", ")", "cells", "were", "treated", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", "and", "then", "stained", "with", "acridine", "orange", "(", "AO", ";", "A", "-", "B", ")", "or", "monodansylcadaverine", "(", "MDC", ";", "C", "-", "D", ")", ".", "Flow", "cytometry", "measured", "the", "percentage", "of", "AO", "+", "cells", "and", "the", "results", "of", "three", "independent", "AO", "fluorescence", "experiments", "for", "HTC", "-", "116", "(", "E", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "F", ")", "cells", "were", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "to", "compare", "control", "cells", "and", "NaB", "treatments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 2HCT-116 (A, C) and HT-29 (B, D) cells were treated with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h and then stained with acridine orange (AO; A-B) or monodansylcadaverine (MDC; C-D).Flow cytometry measured the percentage of AO+ cells and the results of three independent AO fluorescence experiments for HTC-116 (E) and HT-29 (F) cells were expressed as mean ± SD. One-way ANOVA was used to compare control cells and NaB treatments. *p<0.05, ** p<0.01 when compared to control."}
{"words": ["Fig", "3HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "or", "HT", "-", "29", "(", "B", ")", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "blots", "showed", "expression", "of", "Beclin1", ",", "ATG3", ",", "and", "LC3", "as", "well", "as", "GAPDH", ",", "the", "loading", "control", ".", "C", ".", "Electron", "microscopy", "images", "of", "control", "and", "NaB", "(", "2mM", ")", "treated", "HCT", "-", "116", "cells", ".", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", ";", "Mt", ",", "mitochondrion", ";", "AL", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 3HCT-116 (A) or HT-29 (B) cells were treated with the indicated concentrations of sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative blots showed expression of Beclin1, ATG3, and LC3 as well as GAPDH, the loading control.C. Electron microscopy images of control and NaB (2mM) treated HCT-116 cells. ER, endoplasmic reticulum; Mt, mitochondrion; AL."}
{"words": ["Fig", "4HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "5mM", "3", "-", "MA", "or", "5μM", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "expression", "were", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "is", "indicated", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", ".", "(", "A", ")", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "3", "-", "MA", "and", "NaB", ";", "HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "5mM", "3", "-", "MA", "or", "5μM", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "expression", "were", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "is", "indicated", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", ".", "(", "B", ")", "HT", "-", "29", "cells", "treated", "with", "3", "-", "MA", "and", "NaBHCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "5mM", "3", "-", "MA", "or", "5μM", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "null", "and", "LC3", "-", "II", "expression", "were", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "is", "indicated", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", ".", "(", "C", ")", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "CQ", "and", "NaB", ";", "HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "5mM", "3", "-", "MA", "or", "5μM", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "expression", "were", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "is", "indicated", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", ".", "(", "D", ")", "HT", "-", "20", "cells", "treated", "with", "CQ", "and", "NaB", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4HCT-116 or HT-29 cells were treated with 5mM 3-MA or 5μM chloroquine (CQ) for 30 min, and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of LC3-I and LC3-II expression were quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3:GAPDH). The fold change from control is indicated as the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis. ** p<0.01, compared to the respective control group. (A) HCT-116 cells treated with 3-MA and NaB;HCT-116 or HT-29 cells were treated with 5mM 3-MA or 5μM chloroquine (CQ) for 30 min, and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of LC3-I and LC3-II expression were quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3:GAPDH). The fold change from control is indicated as the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis. ** p<0.01, compared to the respective control group. (B) HT-29 cells treated with 3-MA and NaBHCT-116 or HT-29 cells were treated with 5mM 3-MA or 5μM chloroquine (CQ) for 30 min, and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of null and LC3-II expression were quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3:GAPDH). The fold change from control is indicated as the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis. ** p<0.01, compared to the respective control group. (C) HCT-116 cells treated with CQ and NaB;HCT-116 or HT-29 cells were treated with 5mM 3-MA or 5μM chloroquine (CQ) for 30 min, and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of LC3-I and LC3-II expression were quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3:GAPDH). The fold change from control is indicated as the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis. ** p<0.01, compared to the respective control group.(D) HT-20 cells treated with CQ and NaB."}
{"words": ["Fig", "5", "HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "B", ")", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "show", "the", "expression", "of", "IRE", "-", "1a", ",", "BIP", ",", "PDI", ",", "and", "CHOP", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5  HCT-116 (A) and HT-29 (B) cells were treated with the indicated concentrations of sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots show the expression of IRE-1a, BIP, PDI, and CHOP. GAPDH was used as the loading control. "}
{"words": ["Fig", "6", "HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "for", "30", "min", "followed", "by", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "showed", "the", "expression", "of", "IRE", "-", "1a", ",", "BIP", ",", "PDI", ",", "and", "GADPH", "(", "loading", "control", ")", "in", "HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "or", "HT", "-", "29", "(", "C", ")", "cells", ".", "Protein", "expression", "was", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "protein", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "for", "each", "protein", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "HCT", "-", "116", "(", "B", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "D", ")", "cells", ".", "are", "shown", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6  HCT-116 or HT-29 cells were treated with 10 μg/mL cycloheximide for 30 min followed by sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots showed the expression of IRE-1a, BIP, PDI, and GADPH (loading control) in HCT-116 (A) or HT-29 (C) cells. Protein expression was quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of protein:GAPDH). The fold change from control for each protein is expressed as mean ± SD of three independent experiments for HCT-116 (B) and HT-29 (D) cells. are shown. One-way ANOVA was used for statistical analysis. * P<0.05, ** p<0.01, compared to the respective control group. "}
{"words": ["Fig", "7", "HCT", "-", "116", "(", "A", ",", "B", ")", "or", "HT", "-", "29", "(", "C", ",", "D", ")", "cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "1μM", "mithramycin", "for", "30", "min", "followed", "by", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "showing", "the", "expression", "of", "IRE", "-", "1a", ",", "BIP", ",", "and", "PDI", "in", "HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "or", "HT", "-", "29", "(", "C", ")", "cells", "are", "shown", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Protein", "expression", "(", "IRE", "-", "1a", ",", "BIP", ",", "and", "PDI", ")", "was", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "protein", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "for", "each", "protein", "is", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "HCT", "-", "116", "(", "B", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "D", ")", "cells", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 7  HCT-116 (A, B) or HT-29 (C,D) cells were treated with 0.1μM mithramycin for 30 min followed by sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots showing the expression of IRE-1a, BIP, and PDI in HCT-116 (A) or HT-29 (C) cells are shown. GAPDH was used as loading control. Protein expression (IRE-1a, BIP, and PDI) was quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of protein:GAPDH). The fold change from control for each protein is expressed as mean ± SD of three independent experiments for HCT-116 (B) and HT-29 (D) cells. One-way ANOVA was used for statistical analysis. * P<0.05, ** p<0.01, compared to the respective control group. "}
{"words": ["Fig", "8HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "or", "0", ".", "1μM", "mithramycin", "for", "30", "min", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "the", "expression", "of", "LC3", "-", "II", "are", "shown", ".", "The", "level", "of", "LC3", "-", "II", "expression", "was", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", "-", "II", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "cells", "is", "shown", ".", "Means", "and", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "control", "group", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "cyclohexamide", ";", "(", "E", "-", "F", ")", "HT", "-", "29", "cells", "treated", "with", "cyclohexamide", ";", "HCT", "-", "116", "or", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "or", "0", ".", "1μM", "mithramycin", "for", "30", "min", "and", "then", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "Western", "blots", "of", "the", "expression", "of", "LC3", "-", "II", "are", "shown", ".", "The", "level", "of", "LC3", "-", "II", "expression", "was", "quantified", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "LC3", "-", "II", ":", "GAPDH", ")", ".", "The", "fold", "change", "from", "control", "cells", "is", "shown", ".", "Means", "and", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "control", "group", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "mithramycin", ";", "(", "G", "-", "H", ")", "HT", "-", "29", "cells", "treated", "with", "mithramycin", ".", "cancel"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 8HCT-116 or HT-29 cells were treated with 10 μg/mL cycloheximide or 0.1μM mithramycin for 30 min and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of the expression of LC3-II are shown. The level of LC3-II expression was quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3-II:GAPDH). The fold change from control cells is shown. Means and standard deviation (SD) of three independent experiments are shown. One-way ANOVA was used for statistical analysis. * P<0.05, ** p<0.01, compared to the control group. (A-B) HCT-116 cells treated with cyclohexamide; (E-F) HT-29 cells treated with cyclohexamide;HCT-116 or HT-29 cells were treated with 10 μg/mL cycloheximide or 0.1μM mithramycin for 30 min and then with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Representative Western blots of the expression of LC3-II are shown. The level of LC3-II expression was quantified by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of LC3-II:GAPDH). The fold change from control cells is shown. Means and standard deviation (SD) of three independent experiments are shown. One-way ANOVA was used for statistical analysis. * P<0.05, ** p<0.01, compared to the control group. (C-D) HCT-116 cells treated with mithramycin;  (G-H) HT-29 cells treated with mithramycin. cancel "}
{"words": ["Fig", "9", "HCT", "-", "116", "cells", "were", "transfected", "with", "BIP", "or", "CHOP", "specific", "siRNAs", "for", "48", "h", "and", "then", "treated", "with", "or", "without", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "Negative", "control", "(", "NC", ")", "scramble", "siRNA", "was", "used", "the", "negative", "control", "for", "the", "transfection", ".", "Representative", "Western", "blots", "are", "shown", "for", "BIP", "siRNA", "(", "A", ")", "and", "CHOP", "siRNA", "(", "C", ")", ".", "The", "expression", "level", "of", "each", "protein", "was", "determined", "by", "densitometry", "and", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "ratio", "of", "protein", ":", "GAPDH", ")", ".", "(", "B", ")", "Normalized", "expression", "levels", "of", "BIP", "and", "LC3", "-", "II", "in", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "BIP", "specific", "siRNA", ".", "(", "C", ")", "Normalized", "expression", "levels", "of", "CHOP", "and", "LC3", "-", "II", "in", "HCT", "-", "116", "cells", "treated", "with", "CHOP", "specific", "siRNA", ".", "Means", "and", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "respective", "control", "group", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 9  HCT-116 cells were transfected with BIP or CHOP specific siRNAs for 48 h and then treated with or without 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. Negative control (NC) scramble siRNA was used the negative control for the transfection. Representative Western blots are shown for BIP siRNA (A) and CHOP siRNA (C). The expression level of each protein was determined by densitometry and normalized to GAPDH (ratio of protein:GAPDH). (B) Normalized expression levels of BIP and LC3-II in HCT-116 cells treated with BIP specific siRNA. (C) Normalized expression levels of CHOP and LC3-II in HCT-116 cells treated with CHOP specific siRNA. Means and standard deviation (SD) of three independent experiments are shown. One-way ANOVA was used for statistical analysis. * P<0.05, ** p<0.01, compared to the respective control group.  "}
{"words": ["Fig", "10", " ", " ", "HCT", "-", "116", "(", "A", ")", "and", "HT", "-", "29", "(", "B", ")", "cells", "were", "exposed", "to", "5mM", "3", "-", "MA", "or", "5μM", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "for", "30", "min", "and", "then", "treated", "with", "2mM", "sodium", "butyrate", "(", "NaB", ")", "for", "24", "h", ".", "The", "percentage", "of", "apoptotic", "cells", "(", "annexinV", "+", "/", "PI", "-", ")", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "an", "annexinV", "/", "PI", "assay", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "to", "compare", "control", "cells", "and", "NaB", "treatments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "control", ".", "(", "C", ".", "D", ".", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "described", "above", "and", "the", "proteins", "were", "harvested", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Expression", "of", "full", "-", "length", "and", "cleaved", "PARP", "in", "HCT", "-", "116", "(", "C", ")", "or", "HT", "-", "29", "(", "D", ")", "cells", "was", "compared", "to", "GAPDH", ",", "the", "loading", "control", ".", "The", "ratio", "of", "cleaved", "PARP", "to", "total", "PARP", "was", "calculated", "and", "the", "fold", "change", "in", "normalized", "PARP", "expression", "relative", "to", "cells", "treated", "with", "2mM", "NaB", "is", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "the", "2mM", "NaB", "group", ".", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 10  HCT-116 (A) and HT-29 (B) cells were exposed to 5mM 3-MA or 5μM chloroquine (CQ) for 30 min and then treated with 2mM sodium butyrate (NaB) for 24 h. The percentage of apoptotic cells (annexinV+/PI-) was quantified by flow cytometry using an annexinV/PI assay and expressed as mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis to compare control cells and NaB treatments. *p<0.05, ** p<0.01 compared to control. (C.D.) Cells were treated as described above and the proteins were harvested for Western blot analysis. Expression of full-length and cleaved PARP in HCT-116 (C) or HT-29 (D) cells was compared to GAPDH, the loading control. The ratio of cleaved PARP to total PARP was calculated and the fold change in normalized PARP expression relative to cells treated with 2mM NaB is shown as the mean ± SD of three independent experiments. One-way ANOVA was used for statistical analysis. *P<0.05, ** p<0.01, compared to the 2mM NaB group. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Heatmap", "of", "differentially", "enriched", "metabolites", "in", "heart", ",", "liver", ",", "skeletal", "muscle", "and", "serum", "of", "young", "(", "Y", ")", "and", "aged", "(", "A", ")", "killifish", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Ageing", "leads", "to", "significant", "cardiac", "-", "specific", "accumulation", "of", "sphinganine", ".", "(", "D", ")", "Targeted", "lipidomics", "confirm", "age", "-", "dependent", "accumulation", "of", "sphinganine", "in", "killifish", "(", "n", "=", "4", ";", "per", "condition", ")", ",", "zebrafish", "(", "n", "=", "4", ",", "per", "condition", ")", ",", "mouse", "(", "n", "=", "4", "for", "young", "and", "n", "=", "6", "for", "aged", "samples", ")", "and", "human", "hearts", "(", "n", "=", "1", "for", "young", "and", "2", "for", "aged", ")", ".", "In", "the", "case", "of", "human", "heart", "tissue", ",", "statistical", "significance", "was", "computed", "from", "technical", "replicates", ".", "(", "E", ")", "Heatmap", "of", "differentially", "expressed", "transcripts", "(", "Log2", "fold", "change", "+", "/", "-", "1", ",", "adjusted", "p", "-", "value", "cut", "off", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "young", "and", "aged", "killifish", "hearts", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significantly", "enriched", "relevant", "GO", "categories", "depicted", "as", "bar", "graph", ".", "(", "F", ")", "Transcriptional", "drift", "variance", "of", "genes", "involved", "in", "genome", "integrity", ",", "epigenetic", "regulation", "and", "sphingolipid", "metabolism", ".", "(", "G", ")", "γH2A", ".", "X", "staining", "of", "young", ",", "mid", "-", "aged", "and", "aged", "killifish", "hearts", "show", "signs", "of", "DNA", "damage", ",", "increasing", "with", "age", "(", "n", "=", "4", ",", "#", "of", "sections", "per", "animal", "=", "10", "alternate", "sections", ",", "10", "µm", "thickness", ")", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "cardiomyocyte", "nuclei", ".", "(", "I", ")", "The", "aged", "killifish", "heart", "shows", "significant", "signs", "of", "genome", "instability", "shown", "here", "by", "neutral", "comet", "assays", ".", "Representative", "images", "of", "single", "nuclei", "from", "young", "and", "old", "hearts", "along", "with", "comet", "length", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "J", ")", "γH2A", ".", "X", "staining", "of", "young", "and", "aged", "human", "ventricles", "show", "signs", "of", "DNA", "damage", "accumulating", "with", "age", "(", "n", "=", "2", ",", "#", "of", "sections", "per", "sample", "=", "5", "alternate", "sections", ",", "10", "µm", "thickness", ")", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "cardiomyocyte", "nuclei", "is", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Heatmap of differentially enriched metabolites in heart, liver, skeletal muscle and serum of young (Y) and aged (A) killifish (n = 4).(B-C) Ageing leads to significant cardiac-specific accumulation of sphinganine.(D) Targeted lipidomics confirm age-dependent accumulation of sphinganine in killifish (n = 4; per condition), zebrafish (n = 4, per condition), mouse (n = 4 for young and n=6 for aged samples) and human hearts (n = 1 for young and 2 for aged). In the case of human heart tissue, statistical significance was computed from technical replicates.(E) Heatmap of differentially expressed transcripts (Log2 fold change +/- 1, adjusted p-value cut off <0.05) between young and aged killifish hearts (n = 3). Significantly enriched relevant GO categories depicted as bar graph.(F) Transcriptional drift variance of genes involved in genome integrity, epigenetic regulation and sphingolipid metabolism.(G) γH2A.X staining of young, mid-aged and aged killifish hearts show signs of DNA damage, increasing with age (n = 4, # of sections per animal = 10 alternate sections, 10 µm thickness).(H) Quantification of γH2A.X+ cardiomyocyte nuclei.(I) The aged killifish heart shows significant signs of genome instability shown here by neutral comet assays. Representative images of single nuclei from young and old hearts along with comet length on the right (n = 4).(J) γH2A.X staining of young and aged human ventricles show signs of DNA damage accumulating with age (n = 2, # of sections per sample = 5 alternate sections, 10 µm thickness).(K) Quantification of γH2A.X+ cardiomyocyte nuclei is on the right. Scale bar = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "2Sphinganine", "induces", "DNA", "damage", "in", "human", "cardiomyocytes", "depicted", "here", "(", "A", "-", "C", ")", "by", "γH2A", ".", "X", "+", "nuclei", "in", "cardiac", "-", "specific", "ACTN2", "+", "cells", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "#", "of", "cells", "quantified", "=", "147", "per", "condition", ")", "Sphinganine", "induces", "DNA", "damage", "in", "human", "cardiomyocytes", "depicted", "here", "(", "D", ")", "by", "neutral", "comet", "assay", "of", "DHS", "treated", "hCMs", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "comet", "length", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "Elevated", "DHS", "levels", "lead", "to", "ageing", "signatures", "in", "hCMs", "shown", "here", "by", "(", "F", "-", "G", ")", "SA", "-", "β", "-", "GAL", "activity", ",", "Respective", "graphs", "depict", "the", "quantification", "of", "each", "of", "the", "ageing", "signatures", "are", "on", "the", "right", ".", "Elevated", "DHS", "levels", "lead", "to", "ageing", "signatures", "in", "hCMs", "shown", "here", "by", "(", "H", ")", "p21", "activation", "(", "#", "cells", "quantified", "per", "replicate", "=", "150", "-", "200", ")", ",", "(", "I", ")", "HP1", "-", "α", "+", "nuclear", "foci", "(", "#", "of", "cells", "quantified", "per", "replicate", "=", "120", "-", "200", ")", "and", "(", "J", ")", "disruption", "of", "the", "nuclear", "envelope", "marked", "by", "Lamin", "B1", "along", "with", "an", "increase", "in", "H4K16ac", "staining", "(", "#", "of", "cells", "quantified", "per", "replicate", "=", "100", "-", "150", "per", "condition", ")", ".", "Respective", "graphs", "depict", "the", "quantification", "of", "each", "of", "the", "ageing", "signatures", "are", "on", "the", "right", ".", "High", "sphinganine", "levels", "cause", "significant", "increase", "in", "H3K27ac", "and", "H3K56ac", "marks", "in", "hCMs", "(", "L", ")", "and", "(", "M", ")", "in", "aged", "human", "hearts", ".", "(", "N", ")", "Violin", "plot", "depicting", "the", "distributions", "of", "the", "grey", "-", "scale", "nuclear", "intensity", "of", "the", "indicated", "markers", ".", "(", "When", "not", "specified", ",", "the", "experiments", "were", "conducted", "in", "at", "least", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Sphinganine induces DNA damage in human cardiomyocytes depicted here (A-C) by γH2A.X+ nuclei in cardiac-specific ACTN2+ cells (n = 3 biological replicates; # of cells quantified = 147 per condition)Sphinganine induces DNA damage in human cardiomyocytes depicted here (D) by neutral comet assay of DHS treated hCMs. (E) Quantification of comet length in the indicated conditions.Elevated DHS levels lead to ageing signatures in hCMs shown here by (F-G) SA-β-GAL activity, Respective graphs depict the quantification of each of the ageing signatures are on the right.Elevated DHS levels lead to ageing signatures in hCMs shown here by (H) p21 activation (# cells quantified per replicate = 150-200), (I) HP1-α+ nuclear foci (# of cells quantified per replicate = 120-200) and (J) disruption of the nuclear envelope marked by Lamin B1 along with an increase in H4K16ac staining (# of cells quantified per replicate = 100-150 per condition). Respective graphs depict the quantification of each of the ageing signatures are on the right.High sphinganine levels cause significant increase in H3K27ac and H3K56ac marks in hCMs (L) and (M) in aged human hearts. (N) Violin plot depicting the distributions of the grey-scale nuclear intensity of the indicated markers. (When not specified, the experiments were conducted in at least 3 biological replicates). Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Pharmacological", "inhibition", "of", "HDAC1", "using", "romidepsin", ",", "MS", "-", "275", "and", "pyroxamide", "in", "human", "cardiomyocytes", "cause", "extensive", "DNA", "damage", ",", "shown", "here", "by", "γH2A", ".", "X", "staining", ".", "(", "B", ")", "Bar", "-", "graphs", "depict", "quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "hCM", "nuclei", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "E", ")", "Sphinganine", "and", "its", "derivative", "DHS1P", "inhibits", "class", "1", "HDACs", "in", "the", "human", "cardiomyocytes", "as", "inferred", "from", "the", "in", "cellulo", "HDAC", "-", "activity", "assay", ",", "shown", "here", "as", "bar", "graph", ".", "(", "F", ")", "In", "vitro", "HDAC", "activity", "assay", "revealed", "inhibition", "of", "nuclear", "HDAC", "'", "s", "and", "purified", "HDAC1", "activity", "by", "DHS1P", "and", "S1P", ",", "shown", "here", "as", "bar", "graphs", ".", "Assessment", "of", "transcription", "levels", "measured", "by", "EU", "labeling", "assay", "upon", "treatment", "with", "DHS", "on", "hCMsAssessment", "of", "transcription", "levels", "measured", "by", "EU", "labeling", "assay", "upon", "treatment", "with", "DHS", "on", "hCMs", "and", "respective", "quantifications", ".", "(", "I", ")", "Representative", "micrographs", "of", "hCMs", "indicating", "the", "rescue", "of", "the", "DHS", "induced", "DNA", "damage", "by", "co", "-", "incubation", "with", "RNA", "Pol", "II", "inhibitor", ",", "triptolide", "and", "(", "J", ")", "the", "respective", "quantifications", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "CM", "nuclei", "represented", "as", "bar", "graph", ".", "Scale", "bars", "for", "A", ",", "I", "=", "10", "µm", "and", "G", "=", "50", "µm", ".", "(", "When", "not", "specified", ",", "the", "experiments", "were", "conducted", "in", "at", "least", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Pharmacological inhibition of HDAC1 using romidepsin, MS-275 and pyroxamide in human cardiomyocytes cause extensive DNA damage, shown here by γH2A.X staining.(B) Bar-graphs depict quantification of γH2A.X+ hCM nuclei in the indicated conditions.(E) Sphinganine and its derivative DHS1P inhibits class 1 HDACs in the human cardiomyocytes as inferred from the in cellulo HDAC-activity assay, shown here as bar graph.(F) In vitro HDAC activity assay revealed inhibition of nuclear HDAC's and purified HDAC1 activity by DHS1P and S1P, shown here as bar graphs.Assessment of transcription levels measured by EU labeling assay upon treatment with DHS on hCMsAssessment of transcription levels measured by EU labeling assay upon treatment with DHS on hCMs and respective quantifications.(I) Representative micrographs of hCMs indicating the rescue of the DHS induced DNA damage by co-incubation with RNA Pol II inhibitor, triptolide and (J) the respective quantifications of γH2A.X+ CM nuclei represented as bar graph. Scale bars for A,I=10 µm and G = 50 µm. (When not specified, the experiments were conducted in at least 3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "B", ")", "SPHK2", "inhibition", "using", "ABC294640", "and", "SLM6031434", "prevents", "DHS", "-", "induced", "DNA", "damage", "as", "shown", "here", "by", "staining", "for", "γH2A", ".", "X", "(", "green", ")", "in", "hCMs", ".", "(", "C", ")", "Bar", "graphs", "representing", "the", "percentage", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "hCMs", "in", "the", "indicated", "conditions", "(", "#", "cells", "quantified", "per", "replicate", "~", "200", ")", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Treatment", "of", "hCMs", "with", "ABC294640", ",", "a", "specific", "SPHK2", "inhibitor", "prevents", "DHS", "-", "induced", "epigenetic", "aberrations", "in", "hCMs", "visualized", "here", "by", "H3K56ac", "and", "H3K27ac", "staining", "(", "~", "100", "cells", "quantified", "/", "condition", ")", ".", "(", "F", ")", "Violin", "plots", "depicting", "the", "distributions", "of", "the", "grey", "-", "scale", "nuclear", "intensity", "of", "the", "indicated", "markers", ".", "(", "G", ")", "HAT", "inhibition", "by", "curcumin", "prevents", "the", "aberrant", "increase", "in", "H3K56ac", "and", "H3K27ac", "levels", ".", "(", "H", ")", "Violin", "plots", "depicting", "the", "distributions", "of", "the", "grey", "-", "scale", "nuclear", "intensity", "of", "the", "indicated", "markers", ".", "(", "I", ")", "HAT", "inhibition", "prevents", "DHS", "-", "induced", "DNA", "damage", "as", "shown", "here", "by", "staining", "for", "γH2A", ".", "X", "(", "green", ")", "on", "human", "cardiomyocytes", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "hCMs", "nuclei", "represented", "as", "percentage", "bar", "graph", ".", "(", "K", ")", "Curcumin", "-", "mediated", "HAT", "inhibition", "lead", "to", "inactivation", "of", "p21", "in", "hCMs", ".", "(", "L", ")", "Violin", "plots", "depicting", "the", "distributions", "of", "the", "grey", "-", "scale", "nuclear", "intensity", "of", "p21", "stained", "nuclei", ".", "(", "When", "not", "specified", ",", "the", "experiments", "were", "conducted", "in", "at", "least", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-B) SPHK2 inhibition using ABC294640 and SLM6031434 prevents DHS-induced DNA damage as shown here by staining for γH2A.X (green) in hCMs.(C) Bar graphs representing the percentage of γH2A.X+ hCMs in the indicated conditions (# cells quantified per replicate ~200).(D-E) Treatment of hCMs with ABC294640, a specific SPHK2 inhibitor prevents DHS-induced epigenetic aberrations in hCMs visualized here by H3K56ac and H3K27ac staining (~100 cells quantified/ condition).(F) Violin plots depicting the distributions of the grey-scale nuclear intensity of the indicated markers.(G) HAT inhibition by curcumin prevents the aberrant increase in H3K56ac and H3K27ac levels.(H) Violin plots depicting the distributions of the grey-scale nuclear intensity of the indicated markers.(I) HAT inhibition prevents DHS-induced DNA damage as shown here by staining for γH2A.X (green) on human cardiomyocytes.(J) Quantification of γH2A.X+ hCMs nuclei represented as percentage bar graph.(K) Curcumin-mediated HAT inhibition lead to inactivation of p21 in hCMs.(L) Violin plots depicting the distributions of the grey-scale nuclear intensity of p21 stained nuclei. (When not specified, the experiments were conducted in at least 3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "Heatmap", "depicting", "the", "expression", "profile", "of", "the", "markers", "of", "DNA", "damage", "response", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "treatment", "of", "curcumin", "activates", "DNA", "repair", "pathways", "as", "depicted", "here", "by", "heatmaps", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) Heatmap depicting the expression profile of the markers of DNA damage response in the indicated conditions.(E) Co-treatment of curcumin activates DNA repair pathways as depicted here by heatmaps."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "micrographs", "depicting", "(", "B", ")", "γH2A", ".", "X", "staining", "on", "the", "ventricle", "sections", "for", "the", "indicated", "cohorts", ".", "Representative", "micrographs", "depicting", "(", "C", ")", "H3K27ac", "staining", "on", "the", "ventricle", "sections", "for", "the", "indicated", "cohorts", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "γH2A", ".", "X", "+", "CMs", "nuclei", "represented", "as", "percentage", "bar", "graph", ".", "(", "E", ")", "Box", "-", "plot", "depicting", "the", "distributions", "of", "the", "corrected", "total", "nuclear", "fluorescence", "of", "the", "indicated", "cohorts", ".", "(", "F", ")", "Representative", "micrographs", "depicting", "ventricular", "view", "from", "the", "echocardiography", "of", "the", "indicated", "cohorts", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Quantification", "of", "fractional", "shortening", "and", "ejection", "fraction", "of", "the", "indicated", "groups", "represented", "as", "bean", "plot", "and", "percentage", "bar", "graph", "respectively", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "condition", ")", ".", "Scale", "bars", "for", "B", ",", "C", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative micrographs depicting (B) γH2A.X staining on the ventricle sections for the indicated cohorts.Representative micrographs depicting (C) H3K27ac staining on the ventricle sections for the indicated cohorts.(D) Quantification of γH2A.X+ CMs nuclei represented as percentage bar graph.(E) Box-plot depicting the distributions of the corrected total nuclear fluorescence of the indicated cohorts.(F) Representative micrographs depicting ventricular view from the echocardiography of the indicated cohorts.(G-H) Quantification of fractional shortening and ejection fraction of the indicated groups represented as bean plot and percentage bar graph respectively (n=6 animals per condition). Scale bars for B,C = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", "qRT", "-", "PCR", "detection", "of", "mRNA", "levels", "of", "IL", "-", "1β", ",", "TNFα", "and", "IL", "-", "6", "mRNA", "levels", "in", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "primed", "with", "LPS", "and", "then", "treated", "with", "ATP", "and", "Nigericin", "(", "A", ")", ",", "or", "infected", "with", "Listeria", "monocytogenes", "at", "a", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "of", "10", "and", "Salmonella", "typhimurium", "(", "MOI", "of", "10", ")", "for", "6", "h", "(", "B", ")", "or", "MSU", "(", "40", "μg", "/", "ml", ")", "and", "SiO2", "(", "40", "μg", "/", "ml", ")", "for", "6", "h", "(", "C", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "L", ".", "m", ",", "Listeria", "monocytogene", ";", "S", ".", "t", ",", "Salmonella", "typhimurium", ";", "MSU", ",", "Monosodium", "urate", ";", "mRNA", "results", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "relative", "to", "untreated", "wild", "-", "type", "cells", "Data", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", "and", "shown", "as", "mean", "with", "SEM", "(", "A", "-", "C", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "D", "Enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assays", "(", "ELISA", ")", "of", "IL", "-", "1β", "production", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "as", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "(", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "L", ".", "m", ",", "Listeria", "monocytogene", ";", "S", ".", "t", ",", "Salmonella", "typhimurium", ";", "MSU", ",", "Monosodium", "urate", ";", ";", "data", "are", "representative", "of", "two", "biological", "replicates", "(", "D", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "-", "G", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "The", "cells", "were", "collected", "for", "immunoblot", "analysis", "of", "pro", "-", "caspase", "-", "1", ",", "and", "the", "supernatants", "were", "subjected", "to", "cleaved", "caspase", "-", "1", "and", "IL", "-", "1β", "analysis", ".", "The", "expression", "levels", "of", "cleaved", "-", "caspase", "-", "1", "and", "cleaved", "-", "IL", "-", "1β", "were", "quantitated", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "information", ":", "L", ".", "m", ",", "Listeria", "monocytogene", ";", "S", ".", "t", ",", "Salmonella", "typhimurium", ";", "MSU", ",", "Monosodium", "urate", ";", "Casp1", ",", "caspase", "-", "1", ";", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C qRT-PCR detection of mRNA levels of IL-1β, TNFα and IL-6 mRNA levels in CCDC50-WT and CCDC50-KO THP-1 cells primed with LPS and then treated with ATP and Nigericin (A), or infected with Listeria monocytogenes at a multiplicity of infection (MOI) of 10 and Salmonella typhimurium (MOI of 10) for 6 h (B) or MSU (40 μg/ml ) and SiO2 (40 μg/ml) for 6 h (C) (n = 3 biological replicates). Data information: L.m, Listeria monocytogene; S.t, Salmonella typhimurium; MSU, Monosodium urate; mRNA results are normalized to GAPDH and relative to untreated wild-type cells Data are representative of three biological replicates and shown as mean with SEM (A-C); **P < 0.01, ***P < 0.001; two-tailed unpaired Student's t-test.D Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) of IL-1β production in supernatants of THP-1 cells treated as in (A-C) (n = 2 biological replicates). Data information: L.m, Listeria monocytogene; S.t, Salmonella typhimurium; MSU, Monosodium urate; ; data are representative of two biological replicates (D). **P < 0.01, ***P < 0.001; two-tailed unpaired Student's t-test.E-G CCDC50-WT and CCDC50-KO THP-1 cells were stimulated as in (A-C). The cells were collected for immunoblot analysis of pro-caspase-1, and the supernatants were subjected to cleaved caspase-1 and IL-1β analysis. The expression levels of cleaved-caspase-1 and cleaved-IL-1β were quantitated using ImageJ software. Data information: L.m, Listeria monocytogene; S.t, Salmonella typhimurium; MSU, Monosodium urate; Casp1, caspase-1; actin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "3C", "qRT", "-", "PCR", "detection", "of", "Il6", ",", "IL", "-", "1β", "and", "Tnfα", "mRNA", "levels", "in", "Ccdc50", "+", "/", "+", "and", "Ccdc50", "-", "/", "-", "BMDMs", "primed", "with", "LPS", "for", "3", "h", "and", "then", "induced", "with", "ATP", "and", "Nigericin", "(", "A", ")", ",", "L", ".", "m", "and", "S", ".", "t", "(", "B", ")", ",", "or", "MSU", "and", "SiO2", "(", "C", ")", "for", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "D", "-", "F", "Ccdc50", "+", "/", "+", "and", "Ccdc50", "-", "/", "-", "BMDCs", "treated", "as", "BMDMs", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "mRNA", "data", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "relative", "to", "untreated", "wild", "-", "type", "cells", ";", "Data", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", "and", "are", "shown", "as", "the", "mean", "with", "SEM", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", "ELISA", "analysis", "of", "the", "protein", "level", "of", "secreted", "IL", "-", "1β", "in", "supernatants", "of", "Ccdc50", "+", "/", "+", "and", "Ccdc50", "-", "/", "-", "BMDMs", "(", "top", "panel", ")", "and", "BMDCs", "(", "bottom", "panel", ")", "treated", "as", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", "and", "are", "shown", "as", "the", "mean", "with", "SEM", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", ",", "I", "Ccdc50", "+", "/", "+", "and", "Ccdc50", "-", "/", "-", "BMDMs", "(", "H", ")", "and", "BMDCs", "(", "I", ")", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "for", "western", "blotting", "analysis", "of", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "and", "the", "supernatant", "was", "collected", "for", "immunoblots", "of", "cleaved", "-", "caspase", "-", "1", ".", "The", "expression", "levels", "of", "cleaved", "-", "caspase", "-", "1", "were", "quantitated", "using", "ImageJ", "software", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C qRT-PCR detection of Il6, IL-1β and Tnfα mRNA levels in Ccdc50+/+ and Ccdc50-/- BMDMs primed with LPS for 3 h and then induced with ATP and Nigericin (A), L.m and S.t (B), or MSU and SiO2 (C) for indicated time points (n = 3 biological replicates). D-F Ccdc50+/+ and Ccdc50-/- BMDCs treated as BMDMs were collected and subjected to qRT-PCR analysis (n = 3 biological replicates). Data information: mRNA data are normalized to GAPDH and relative to untreated wild-type cells; Data are representative of three biological replicates and are shown as the mean with SEM *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; two-tailed unpaired Student's t-test.G ELISA analysis of the protein level of secreted IL-1β in supernatants of Ccdc50+/+ and Ccdc50-/- BMDMs (top panel) and BMDCs (bottom panel) treated as in (A-C) (n = 3 biological replicates). Data information: Data are representative of three biological replicates and are shown as the mean with SEM *P <0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; two-tailed unpaired Student's t-test.H,I Ccdc50+/+ and Ccdc50-/- BMDMs (H) and BMDCs (I) were treated as in (A-C). The cells were lysed for western blotting analysis of pro-caspase-1 and the supernatant was collected for immunoblots of cleaved-caspase-1. The expression levels of cleaved-caspase-1 were quantitated using ImageJ software."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Co", "-", "Immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "with", "anti", "-", "HA", "(", "A", ")", "or", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ")", "was", "performed", "for", "the", "analysis", "of", "the", "association", "between", "HA", "-", "CCDC50", "and", "Flag", "-", "AIM2", ",", "-", "NLRP3", ",", "and", "-", "ASC", "in", "cotransfected", "HEK293", "cells", ".", "Data", "information", ":", "L", ".", "C", ",", "light", "-", "chain", ";", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "C", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "analysis", "of", "the", "interaction", "of", "NLRP3", "with", "endogenous", "CCDC50", "and", "ASC", "in", "THP", "-", "1", "cells", "activated", "by", "LPS", "plus", "ATP", ".", "IgG", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "D", "Representative", "endogenous", "colocalization", "analysis", "of", "CCDC50", "and", "NLRP3", "in", "PMA", "-", "induced", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "LPS", "and", "ATP", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "E", "Representative", "confocal", "microscopy", "image", "of", "HCT116", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "CCDC50", "and", "stimulated", "with", "LPS", "as", "well", "as", "ATP", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "F", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysates", "from", "HEK293", "cells", "cotransfected", "with", "Flag", "-", "AIM2", ",", "-", "NLRP3", ",", "-", "ASC", "and", "HA", "-", "CCDC50", "or", "empty", "control", "vector", ".", "The", "expression", "levels", "of", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "and", "Actin", "were", "quantitated", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "G", "Immunoblot", "analysis", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "NLRP3", "and", "an", "increasing", "amount", "of", "HA", "-", "CCDC50", "plasmids", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "H", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysates", "from", "CCDC50", "-", "KO", "and", "CCDC50", "-", "WT", "THP", "-", "1", "cells", "induced", "with", "LPS", "plus", "ATP", "and", "then", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "indicated", "time", "points", ".", "The", "expression", "levels", "of", "NLRP3", "and", "Actin", "were", "quantitated", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "I", "HEK293", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "NLRP3", "and", "HA", "-", "CCDC50", "or", "empty", "control", "vector", "for", "24", "h", "and", "then", "treated", "with", "MG132", ",", "NH4Cl", ",", "3", "-", "MA", ",", "CQ", "or", "DMSO", "for", "another", "6", "h", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "J", "Immunoblot", "analysis", "of", "NLRP3", "in", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "stimulated", "with", "LPS", "in", "combination", "with", "ATP", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "K", "Western", "blotting", "analysis", "of", "ATG5", "wild", "-", "type", "or", "knockout", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "NLRP3", "and", "HA", "-", "CCDC50", "or", "empty", "control", "vector", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", ".", "L", "Immunoblot", "analyses", "of", "NLRP3", "in", "HEK293", "cells", "in", "the", "presence", "of", "CCDC50", "or", "its", "mutant", "CCDC50", "with", "the", "deletion", "of", "MIUs", ".", "Data", "information", ":", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "the", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "once", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A,B Co-Immunoprecipitation (Co-IP) with anti-HA (A) or anti-Flag (B) was performed for the analysis of the association between HA-CCDC50 and Flag-AIM2, -NLRP3, and -ASC in cotransfected HEK293 cells. Data information: L.C, light-chain; actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.C Immunoprecipitation (IP) analysis of the interaction of NLRP3 with endogenous CCDC50 and ASC in THP-1 cells activated by LPS plus ATP. IgG was used as a negative control. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.D Representative endogenous colocalization analysis of CCDC50 and NLRP3 in PMA-induced THP-1 cells treated with LPS and ATP. Scale bar, 10 μm.E Representative confocal microscopy image of HCT116 cells overexpressing GFP-CCDC50 and stimulated with LPS as well as ATP. Scale bar, 10 μm.F Immunoblot analysis of lysates from HEK293 cells cotransfected with Flag- AIM2, -NLRP3, -ASC and HA-CCDC50 or empty control vector. The expression levels of Flag-tagged proteins and Actin were quantitated using ImageJ software. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.G Immunoblot analysis of HEK293 cells transfected with FLAG-NLRP3 and an increasing amount of HA-CCDC50 plasmids. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.H Immunoblot analysis of lysates from CCDC50-KO and CCDC50-WT THP-1 cells induced with LPS plus ATP and then treated with cycloheximide (CHX) for indicated time points. The expression levels of NLRP3 and Actin were quantitated using ImageJ software. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.I HEK293 cells were co-transfected with Flag-NLRP3 and HA-CCDC50 or empty control vector for 24 h and then treated with MG132, NH4Cl, 3-MA, CQ or DMSO for another 6 h. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.J Immunoblot analysis of NLRP3 in CCDC50-WT and CCDC50-KO THP-1 cells stimulated with LPS in combination with ATP. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.K Western blotting analysis of ATG5 wild-type or knockout HEK293T cells co-transfected with Flag-NLRP3 and HA-CCDC50 or empty control vector for 24 h. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once.L Immunoblot analyses of NLRP3 in HEK293 cells in the presence of CCDC50 or its mutant CCDC50 with the deletion of MIUs. Data information: actin was used as a loading control. All the experiments were repeated at least once."}
{"words": ["Figure", "5A", "Denature", "-", "IP", "(", "with", "anti", "-", "Flag", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "polyubiquitinated", "NLRP3", "in", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "NLRP3", ",", "HA", "-", "Ub", "(", "ubiquitin", ")", "as", "well", "as", "HA", "-", "CCDC50", "or", "empty", "vector", "for", "24", "h", ".", "B", "Denature", "-", "IP", "analysis", "(", "with", "anti", "-", "Flag", ")", "of", "K63", "-", "linked", "polyubiquitination", "of", "NLRP3", "in", "cotransfected", "HEK293", "cells", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "CQ", "for", "6", "h", ".", "C", "The", "colocalization", "analysis", "of", "K63", "-", "Ub", "(", "Red", ")", ",", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "Purple", ")", "and", "GFP", "-", "CCDC50", "in", "HeLa", "cells", ";", "scale", "bars", ",", "5", "μM", ".", "D", ",", "E", "Images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "CCDC50", "(", "red", ")", "(", "D", ")", "or", "K63", "-", "Ub", "(", "red", ")", "(", "E", ")", "and", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "Purple", ")", "and", "GFP", "-", "LC3B", "for", "24", "h", "and", "then", "induced", "with", "LPS", "plus", "ATP", ";", "scale", "bars", ",", "5", "μM", ".", "F", "The", "colocalization", "analysis", "of", "NLRP3", "and", "LC3B", "in", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "HeLa", "cells", "stimulated", "with", "LPS", "plus", "ATP", ";", "scale", "bars", ",", "5", "μM", ".", "Data", "information", ":", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ";", "data", "are", "representative", "of", "three", "individual", "experiments", ".", "G", "The", "oligomerization", "analysis", "of", "NLRP3", "in", "CCDC50", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "THP", "-", "1", "cells", "stimulated", "with", "LPS", "as", "well", "as", "ATP", ".", "LPS", "-", "primed", "(", "1", "μg", "/", "ml", ",", "3", "h", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "stimulated", "with", "ATP", "(", "5", "mM", ")", "for", "another", "30", "min", "and", "then", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "centrifuged", "and", "separated", "into", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", ".", "The", "soluble", "fraction", "was", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "insoluble", "fraction", "was", "analyzed", "by", "native", "-", "PAGE", ".", "H", "The", "oligomerization", "analysis", "of", "NLRP3", "in", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "Flag", "-", "NLRP3", ",", "HA", "-", "CCDC50", "or", "empty", "vector", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "DMSO", "or", "CQ", "for", "6", "h", ".", "After", "treatment", ",", "the", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "centrifuged", "and", "separated", "into", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", ".", "The", "soluble", "fraction", "was", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "insoluble", "fraction", "was", "analyzed", "by", "native", "-", "PAGE", ".", "I", "Co", "-", "IP", "(", "with", "anti", "-", "HA", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "NLRP3", "and", "ASC", "in", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ",", "and", "treated", "with", "or", "without", "CQ", "for", "6", "h", ".", "J", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "colocalization", "between", "NLRP3", "and", "ASC", "in", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "HeLa", "cells", "stimulated", "with", "LPS", "plus", "ATP", ";", "scale", "bars", ",", "5", "μM", ".", "Data", "information", ":", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ";", "data", "are", "representative", "of", "three", "individual", "experiments", ".", "K", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "ASC", "speck", "formation", "in", "CCDC50", "-", "WT", "and", "CCDC50", "-", "KO", "HeLa", "cells", "stimulated", "with", "LPS", "plus", "ATP", ";", "scale", "bars", ",", "5", "μM", ".", "Data", "information", ":", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ";", "data", "are", "representative", "of", "three", "individual", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Denature-IP (with anti-Flag) and immunoblot analysis of polyubiquitinated NLRP3 in HEK293 cells transfected with Flag-NLRP3, HA-Ub (ubiquitin) as well as HA- CCDC50 or empty vector for 24 h.B Denature-IP analysis (with anti-Flag) of K63-linked polyubiquitination of NLRP3 in cotransfected HEK293 cells left untreated or treated with CQ for 6 h.C The colocalization analysis of K63-Ub (Red), Flag-NLRP3 (Purple) and GFP- CCDC50 in HeLa cells; scale bars, 5 μM.D,E Images of HeLa cells transfected with CCDC50 (red) (D) or K63-Ub (red) (E) and Flag-NLRP3 (Purple) and GFP-LC3B for 24 h and then induced with LPS plus ATP; scale bars, 5 μM.F The colocalization analysis of NLRP3 and LC3B in CCDC50-WT and CCDC50- KO HeLa cells stimulated with LPS plus ATP; scale bars, 5 μM. Data information: The nuclei were stained with DAPI; data are representative of three individual experiments.G The oligomerization analysis of NLRP3 in CCDC50 wild-type and knockout THP-1 cells stimulated with LPS as well as ATP. LPS-primed (1 μg/ml, 3 h) THP-1 cells were stimulated with ATP (5 mM) for another 30 min and then were collected and lysed. The cell lysates were centrifuged and separated into soluble and insoluble fractions. The soluble fraction was analyzed by SDS-PAGE. The insoluble fraction was analyzed by native-PAGE.H The oligomerization analysis of NLRP3 in HEK293 cells transfected with plasmids expressing Flag-NLRP3, HA-CCDC50 or empty vector for 24 h, and then treated with DMSO or CQ for 6 h. After treatment, the cells were collected and lysed. The cell lysates were centrifuged and separated into soluble and insoluble fractions. The soluble fraction was analyzed by SDS-PAGE. The insoluble fraction was analyzed by native-PAGE.I Co-IP (with anti-HA) and immunoblot analysis of the interaction between NLRP3 and ASC in HEK293 cells transfected with indicated plasmids for 24 h, and treated with or without CQ for 6 h.J Confocal microscopy analysis of colocalization between NLRP3 and ASC in CCDC50-WT and CCDC50-KO HeLa cells stimulated with LPS plus ATP; scale bars, 5 μM. Data information: The nuclei were stained with DAPI; data are representative of three individual experiments.K Confocal microscopy analysis of ASC speck formation in CCDC50-WT and CCDC50-KO HeLa cells stimulated with LPS plus ATP; scale bars, 5 μM. Data information: The nuclei were stained with DAPI; data are representative of three individual experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Expression", "patterns", "of", "Hoxa5", "and", "Hoxc8", "in", "MNs", "(", "demarcated", "by", "white", "dashed", "lines", ")", "along", "the", "rostrocaudal", "axis", "of", "the", "spinal", "cord", "(", "cervical", "C4", "to", "thoracic", "T1", ")", "from", "mouse", "embryos", "from", "E9", ".", "5", "to", "E12", ".", "5", ".", "Pink", "scale", "bars", ":", "12", ".", "5", "μm", "for", "E9", ".", "5", ";", "12", ".", "5", "μm", "for", "E10", ".", "5", ";", "25", "μm", "for", "E11", ".", "5", ";", "and", "50", "μm", "for", "E12", ".", "5", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Expression patterns of Hoxa5 and Hoxc8 in MNs (demarcated by white dashed lines) along the rostrocaudal axis of the spinal cord (cervical C4 to thoracic T1) from mouse embryos from E9.5 to E12.5. Pink scale bars: 12.5 μm for E9.5; 12.5 μm for E10.5; 25 μm for E11.5; and 50 μm for E12.5."}
{"words": ["Figure", "3Expression", "patterns", "of", "Hoxa5", "and", "Hoxc8", "mRNAs", ",", "as", "revealed", "by", "in", "situ", "hybridization", ",", "aligned", "with", "corresponding", "sections", "showing", "Hoxa5", "and", "Hoxc8", "immunostainings", "in", "MNs", "(", "demarcated", "with", "pink", "/", "white", "dashed", "lines", ")", "along", "the", "cervical", "spinal", "cord", "(", "cervical", "C5", "to", "C7", ")", "in", "mouse", "embryos", "at", "E12", ".", "5", ".", "Pink", "scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "White", "and", "pink", "dash", "lines", "demarcate", "the", "postmitotic", "MN", "region", ".", "Dot", "-", "plots", "showing", "expression", "of", "genes", "(", "rows", ")", "that", "distinguish", "MN", "subtypes", "(", "columns", ")", ".", "The", "height", "of", "each", "colored", "shape", "is", "proportional", "to", "the", "percentage", "of", "cells", "expressing", "the", "marker", "(", "≥", "1", "UMI", ")", ",", "and", "its", "width", "reflects", "the", "average", "transcript", "count", "within", "expressing", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Expression patterns of Hoxa5 and Hoxc8 mRNAs, as revealed by in situ hybridization, aligned with corresponding sections showing Hoxa5 and Hoxc8 immunostainings in MNs (demarcated with pink/white dashed lines) along the cervical spinal cord (cervical C5 to C7) in mouse embryos at E12.5. Pink scale bar, 50 μm. White and pink dash lines demarcate the postmitotic MN region.Dot-plots showing expression of genes (rows) that distinguish MN subtypes (columns). The height of each colored shape is proportional to the percentage of cells expressing the marker (≥1 UMI), and its width reflects the average transcript count within expressing cells."}
{"words": ["Figure", "6Immunostaining", "(", "C", ")", "of", "EBs", "96", "h", "after", "ESC", "differentiation", ",", "and", "quantification", "(", "D", ")", "of", "Hoxa5on", "in", "MNs", "(", "Hb9on", ")", ".", "Hoxa5", "expression", "upon", "miR", "-", "27", "knockdown", ",", "with", "exposure", "to", "RAhi", "for", "72", "h", ",", "or", "with", "exposure", "to", "RAhi", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "switching", "to", "RAlow", "plus", "RAR", "inhibitor", "(", "1", "µM", ")", "for", "a", "further", "24", "h", ",", "or", "with", "exposure", "to", "RAmed", "for", "72", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immunostaining (C) of EBs 96 h after ESC differentiation, and quantification (D) of Hoxa5on in MNs (Hb9on).Hoxa5 expression upon miR-27 knockdown, with exposure to RAhi for 72 h, or with exposure to RAhi for 48 h, and then switching to RAlow plus RAR inhibitor (1 µM) for a further 24 h, or with exposure to RAmed for 72 h."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ")", "Immunostaining", "at", "cervical", "spinal", "cord", "sections", "reveals", "Hoxa5", "expansion", "into", "the", "MNs", "of", "cervical", "C6", "/", "7", "segments", "of", "miR", "-", "23", "~", "27", "~", "24", "double", "KO", "(", "DKO", ")", "mice", ".", "miR", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", "+", "/", "-", ";", "miR", "-", "23b", "~", "27b", "~", "24", "-", "1", "-", "/", "-", "mice", "were", "used", "as", "a", "control", "(", "ctrl", ")", ".", "(", "E", ")", "Conversely", ",", "Hoxc8", "is", "shifted", "into", "the", "MNs", "of", "cervical", "C5", "segments", "of", "both", "miR", "-", "196a2", "/", "b", "DKO", "and", "miR", "-", "196a1", "/", "a2", "/", "b", "triple", "knockout", "(", "TKO", ")", "embryos", ".", "Age", "-", "matched", "wild", "type", "embryos", "were", "used", "as", "controls", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "White", "dash", "lines", "demarcate", "the", "postmitotoic", "MN", "domain", "(", "D", ",", "F", ")", "Quantifications", "of", "Hoxa5on", ",", "Hoxc8on", ",", "and", "Hoxa5on", "Hoxc8on", "cells", "in", "the", "cervical", "spinal", "cord", "of", "control", "and", "knockout", "embryos", "(", "mean", "±", "SD", ",", "N", "=", "3", "embryos", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C) Immunostaining at cervical spinal cord sections reveals Hoxa5 expansion into the MNs of cervical C6/7 segments of miR-23~27~24 double KO (DKO) mice. miR-23a~27a~24-2+/-;miR-23b~27b~24-1-/- mice were used as a control (ctrl). (E) Conversely, Hoxc8 is shifted into the MNs of cervical C5 segments of both miR-196a2/b DKO and miR-196a1/a2/b triple knockout (TKO) embryos. Age-matched wild type embryos were used as controls. Scale bar represents 50 μm. White dash lines demarcate the postmitotoic MN domain (D, F) Quantifications of Hoxa5on, Hoxc8on, and Hoxa5on Hoxc8on cells in the cervical spinal cord of control and knockout embryos (mean ± SD, N=3 embryos, *p < 0.01, Student's t-tests )."}
{"words": ["Figure", "1a", ",", "Ultrasonic", "vocalizations", "(", "USV", ")", "in", "isolated", "miR379", "-", "410", "ko", "mouse", "pups", "emitted", "on", "postnatal", "day", "P3", ",", "P6", ",", "P9", "and", "P12", ".", "Left", "panel", ":", "total", "number", "of", "ultrasonic", "vocalizations", "(", "USV", ")", "in", "isolated", "miR379", "-", "410", "wt", "and", "ko", "mouse", "pups", "emitted", "on", "average", "(", "P", "3", ",", "6", ",", "9", "and", "12", ")", "when", "isolated", "from", "the", "mother", ",", "wt", "n", "=", "13", "(", "male", "n", "=", "9", ",", "female", "n", "=", "4", ")", ",", "ko", "n", "=", "20", "(", "male", "n", "=", "11", ",", "female", "n", "=", "9", ")", ",", "t31", "=", "2", ".", "274", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0301", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "developmental", "course", "for", "total", "number", "of", "USV", ",", "wt", "n", "=", "13", "(", "male", "n", "=", "9", ",", "female", "n", "=", "4", ")", ",", "ko", "n", "=", "20", "(", "male", "n", "=", "11", ",", "female", "n", "=", "9", ")", ",", "(", "development", ":", "F3", ",", "87", "=", "25", ".", "463", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "genotype", ":", "F1", ",", "29", "=", "4", ".", "979", ",", "p", "=", "0", ".", "03", ";", "development", "x", "genotype", ":", "F3", ",", "87", "=", "1", ".", "403", ",", "p", "=", "0", ".", "22", ",", "rm", "-", "ANOVA", ")", ";", "P", "9", ":", "t31", "=", "2", ".", "096", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "044", ";", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "b", ",", "Reciprocal", "social", "interaction", "in", "juvenile", "miR379", "-", "410", "wt", "-", "and", "ko", "mice", "pairs", "(", "P23", ")", ".", "Aberrant", "time", "spending", "in", "social", "interaction", "activity", "in", "miR379", "-", "410", "ko", "-", "pairs", "compared", "to", "their", "control", "wt", "littermate", "pairs", ".", "Left", "panel", ":", "wt", "-", "pairs", "male", "n", "=", "13", ",", "ko", "-", "pairs", "male", "n", "=", "10", ",", "t21", "=", "2", ".", "433", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0240", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Middle", "panel", ":", "wt", "-", "pairs", "female", "n", "=", "15", ",", "ko", "-", "pairs", "female", "n", "=", "13", ",", "t26", "=", "1", ".", "873", ",", "ns", "p", "=", "0", ".", "0723", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "pooled", "data", "of", "wt", "-", "pairs", "n", "=", "28", "(", "male", "n", "=", "13", ",", "female", "n", "=", "15", ")", ",", "ko", "-", "pairs", "n", "=", "23", "(", "male", "n", "=", "10", ",", "female", "n", "=", "13", ")", ",", "t49", "=", "2", ".", "969", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "005", ";", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "c", ",", "Emitted", "USVs", "during", "social", "interaction", "activity", "in", "genotype", "-", "matched", "pairs", "in", "juvenile", "mice", "(", "P23", ")", ".", "Left", "panel", ":", "wt", "-", "pairs", "male", "n", "=", "13", ",", "ko", "-", "pairs", "male", "n", "=", "15", ",", "t21", "=", "2", ".", "704", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0133", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Middle", "panel", ":", "wt", "-", "pairs", "female", "n", "=", "15", ",", "ko", "-", "pairs", "female", "n", "=", "13", ",", "t26", "=", "2", ".", "869", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0081", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "pooled", "data", "of", "wt", "-", "pairs", "n", "=", "28", "(", "male", "n", "=", "13", ",", "female", "n", "=", "15", ")", ",", "ko", "-", "pairs", "n", "=", "23", "(", "male", "n", "=", "10", ",", "female", "n", "=", "13", ")", ",", "t49", "=", "3", ".", "992", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "d", ",", "Social", "preference", "index", "in", "adolescent", "mice", "-", "defined", "as", "the", "ratio", "of", "time", "sniffing", "a", "stranger", "mouse", "vs", ".", "an", "object", "-", "is", "shown", ".", "Left", "panel", ":", "wt", "male", "n", "=", "26", ",", "ko", "male", "n", "=", "26", ",", "t50", "=", "1", ".", "075", ",", "ns", "p", "=", "0", ".", "2876", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Middle", "panel", ":", "wt", "female", "n", "=", "27", ",", "ko", "female", "n", "=", "30", ",", "t55", "=", "2", ".", "017", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0486", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "pooled", "data", "of", "wt", "n", "=", "53", "(", "male", "n", "=", "26", ",", "female", "n", "=", "27", ")", ",", "ko", "n", "=", "56", "(", "male", "n", "=", "26", ",", "female", "n", "=", "30", ")", ",", "t107", "=", "2", ".", "283", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0244", ";", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1a, Ultrasonic vocalizations (USV) in isolated miR379-410 ko mouse pups emitted on postnatal day P3, P6, P9 and P12. Left panel: total number of ultrasonic vocalizations (USV) in isolated miR379-410 wt and ko mouse pups emitted on average (P 3, 6, 9 and 12) when isolated from the mother, wt n=13 (male n=9, female n=4), ko n=20 (male n=11, female n=9), t31=2.274, *p=0.0301, unpaired Student's t-test. Right panel: developmental course for total number of USV, wt n=13 (male n=9, female n=4), ko n=20 (male n=11, female n=9), (development: F3,87=25.463, p<0.001; genotype: F1,29=4.979, p=0.03; development x genotype: F3,87=1.403, p= 0.22, rm-ANOVA); P 9: t31=2.096, *p=0.044; unpaired Student`s t-test.b, Reciprocal social interaction in juvenile miR379-410 wt- and ko mice pairs (P23). Aberrant time spending in social interaction activity in miR379-410 ko-pairs compared to their control wt littermate pairs. Left panel: wt-pairs male n=13, ko-pairs male n=10, t21=2.433, *p=0.0240, unpaired Student's t-test. Middle panel: wt-pairs female n=15, ko-pairs female n=13, t26=1.873, ns p=0.0723, unpaired Student's t-test. Right panel: pooled data of wt-pairs n=28 (male n=13, female n=15), ko-pairs n=23 (male n=10, female n=13), t49=2.969, **p=0.005; unpaired Student`s t-test.c, Emitted USVs during social interaction activity in genotype-matched pairs in juvenile mice (P23). Left panel: wt-pairs male n=13, ko-pairs male n=15, t21=2.704, *p=0.0133, unpaired Student's t-test. Middle panel: wt-pairs female n=15, ko-pairs female n=13, t26=2.869, **p=0.0081, unpaired Student's t-test. Right panel: pooled data of wt-pairs n=28 (male n=13, female n=15), ko-pairs n=23 (male n=10, female n=13), t49=3.992, ***p<0.001; unpaired Student`s t-test.d, Social preference index in adolescent mice - defined as the ratio of time sniffing a stranger mouse vs. an object - is shown. Left panel: wt male n=26, ko male n=26, t50=1.075, ns p=0.2876, unpaired Student's t-test. Middle panel: wt female n=27, ko female n=30, t55=2.017, *p=0.0486, unpaired Student's t-test. Right panel: pooled data of wt n=53 (male n=26, female n=27), ko n=56 (male n=26, female n=30), t107=2.283, *p=0.0244; unpaired Student`s t-test."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Single", "-", "molecule", "FISH", "(", "smFISH", ")", "on", "mouse", "hippocampal", "neurons", ".", "(", "A", ")", "Representative", "pictures", "of", "smFISH", "on", "BDNF", "-", "treated", "WT", "(", "top", ")", "and", "KO", "(", "bottom", ")", "mouse", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV6", ")", "using", "a", "probe", "directed", "against", "the", "Mirg", "transcript", "(", "green", ")", ".", "(", "Middle", ")", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "(", "Right", ")", "MAP2", "immunostaining", "(", "red", ")", ".", "Pictures", "show", "a", "zoom", "-", "in", "on", "the", "cell", "body", ",", "since", "the", "signal", "detected", "in", "WT", "neurons", "was", "restricted", "to", "the", "nuclei", "(", "scale", "bar", ":", "5μm", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "pictures", "of", "smFISH", "on", "mouse", "wild", "type", "hippocampal", "neuron", "cultures", "(", "DIV6", ";", "basal", ")", "using", "a", "probe", "specific", "for", "the", "Mirg", "transcript", "(", "green", ")", ".", "(", "Middle", ")", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "(", "Right", ")", "MAP2", "immunostaining", "(", "red", ")", ".", "Top", ":", "overview", ",", "scale", "bar", ":", "10μm", ";", "bottom", ":", "zoom", "-", "in", ",", "scale", "bar", ":", "5μm", ".", "C", ",", "D", ",", "Patch", "-", "clamp", "electrophysiological", "recordings", "in", "cultured", "mouse", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV", "8", "-", "10", ")", "isolated", "from", "wt", "or", "miR379", "-", "410", "ko", "animals", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ".", "(", "C", ")", "Cumulative", "distribution", "(", "left", "panel", ",", "D", "=", "0", ".", "25", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "KS", "-", "test", ")", "and", "mean", "(", "right", "panel", ",", "t16", "=", "2", ".", "736", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0146", ",", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ")", "of", "mEPSC", "inter", "-", "event", "intervals", ";", "wt", "n", "=", "9", ",", "ko", "n", "=", "9", "cells", "analyzed", ".", "(", "D", ")", "Cumulative", "distribution", "(", "left", "panel", ",", "D", "=", "0", ".", "34741", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "KS", "-", "test", ")", "and", "mean", "(", "right", "panel", ",", "t18", "=", "2", ".", "357", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0299", ",", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ")", "of", "mEPSC", "amplitudes", ";", "wt", "n", "=", "10", ",", "ko", "n", "=", "10", "cells", "analyzed", ".", "e", ",", "Representative", "confocal", "images", "of", "CA1", "pyramidal", "neuron", "apical", "dendrites", "from", "adult", "Thy1", "-", "GFP", "/", "miR379", "-", "410", "wt", "and", "Thy1", "-", "GFP", "/", "miR379", "-", "410", "ko", "mouse", "tissue", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "f", ",", "Spine", "density", "in", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "adult", "male", "Thy1", "-", "GFP", "/", "miR379", "-", "410", "wt", "and", "ko", "mice", ";", "wt", "n", "=", "5", ",", "ko", "n", "=", "6", "animals", ".", "Mean", "of", "basal", "and", "apical", "neurons", "per", "mouse", "are", "shown", ",", "t9", "=", "3", ".", "662", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0052", ",", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "g", ",", "Spine", "volume", "in", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "adult", "Thy1", "-", "GFP", "/", "miR379", "-", "410", "wt", "and", "ko", "mice", ";", "wt", "n", "=", "5", ",", "ko", "n", "=", "6", "animals", ".", "Mean", "of", "basal", "and", "apical", "neurons", "per", "mouse", "are", "shown", ",", "t9", "=", "2", ".", "265", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0497", ",", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B Single-molecule FISH (smFISH) on mouse hippocampal neurons. (A) Representative pictures of smFISH on BDNF-treated WT (top) and KO (bottom) mouse hippocampal neurons (DIV6) using a probe directed against the Mirg transcript (green). (Middle) Hoechst (blue). (Right) MAP2 immunostaining (red). Pictures show a zoom-in on the cell body, since the signal detected in WT neurons was restricted to the nuclei (scale bar: 5μm). (B) Representative pictures of smFISH on mouse wild type hippocampal neuron cultures (DIV6; basal) using a probe specific for the Mirg transcript (green). (Middle) Hoechst (blue). (Right) MAP2 immunostaining (red). Top: overview, scale bar: 10μm; bottom: zoom-in, scale bar: 5μm.C, D, Patch-clamp electrophysiological recordings in cultured mouse hippocampal neurons (DIV 8-10) isolated from wt or miR379-410 ko animals (n=3 per group). (C) Cumulative distribution (left panel, D=0.25, p<0.0001, KS-test) and mean (right panel, t16=2.736, *p=0.0146, unpaired Student`s t-test) of mEPSC inter-event intervals; wt n=9, ko n=9 cells analyzed. (D) Cumulative distribution (left panel, D=0.34741, p<0.0001, KS-test) and mean (right panel, t18=2.357, *p=0.0299, unpaired Student`s t-test) of mEPSC amplitudes; wt n=10, ko n=10 cells analyzed.e, Representative confocal images of CA1 pyramidal neuron apical dendrites from adult Thy1-GFP/miR379-410 wt and Thy1-GFP/miR379-410 ko mouse tissue. Scale bar: 10 µm. f, Spine density in CA1 pyramidal neurons of adult male Thy1-GFP/miR379-410 wt and ko mice; wt n=5, ko n=6 animals. Mean of basal and apical neurons per mouse are shown, t9=3.662, **p=0.0052, unpaired Student`s t-test. g, Spine volume in CA1 pyramidal neurons of adult Thy1-GFP/miR379-410 wt and ko mice; wt n=5, ko n=6 animals. Mean of basal and apical neurons per mouse are shown, t9=2.265, *p=0.0497, unpaired Student`s t-test. "}
{"words": ["Figure", "4b", ",", "qPCR", "validation", "of", "predicted", "direct", "miR379", "-", "410", "targets", "using", "RNA", "from", "hippocampi", "of", "juvenile", "(", "P", "22", "-", "24", ")", "mice", ",", "except", "of", "Shank", "3", "where", "adult", "miR", "-", "379", "-", "410", "wt", "and", "ko", "animals", "were", "measured", ".", "If", "not", "indicated", ",", "both", ",", "male", "and", "female", "samples", "were", "used", ".", "Cnih2", "(", "wt", "n", "=", "12", ",", "ko", "n", "=", "9", ",", "t19", "=", "2", ".", "344", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0301", ")", ",", "Dlgap3", "(", "wt", "n", "=", "12", ",", "ko", "n", "=", "9", ",", "t19", "=", "2", ".", "128", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0467", ")", ",", "Prr7", "(", "male", "wt", "n", "=", "7", ",", "ko", "n", "=", "4", ",", "t9", "=", "2", ".", "719", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0236", ")", ",", "Src", "(", "wt", "n", "=", "12", ",", "ko", "n", "=", "9", ",", "t19", "=", "2", ".", "410", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0263", ")", ",", "Lzts2", "(", "male", "wt", "n", "=", "7", ",", "ko", "n", "=", "4", ",", "t9", "=", "2", ".", "554", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0310", ")", ",", "Mpp2", "(", "male", "wt", "n", "=", "7", ",", "ko", "n", "=", "4", ",", "t9", "=", "2", ".", "369", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0420", ")", ",", "Prr12", "(", "wt", "n", "=", "6", ",", "ko", "n", "=", "4", ",", "t8", "=", "2", ".", "375", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0449", ")", ",", "Shank1", "(", "wt", "n", "=", "11", ",", "ko", "n", "=", "9", ",", "t18", "=", "2", ".", "310", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0329", ")", ",", "Shb", "(", "male", "wt", "n", "=", "6", ",", "ko", "n", "=", "4", ",", "t8", "=", "3", ".", "451", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0087", ")", "and", "Shank3", "(", "adult", "male", "wt", "n", "=", "3", ",", "ko", "n", "=", "5", ",", "t6", "=", "2", ".", "538", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0442", ")", ";", "unpaired", "Student", "`", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "c", ",", "d", ",", "Cnih2", ",", "Prr7", "and", "Src", "are", "direct", "miR", "-", "379", "-", "410", "target", "mRNAs", ".", "(", "C", ")", "3", "'", "-", "UTR", "luciferase", "reporter", "gene", "assays", "in", "cultured", "rat", "cortical", "neurons", "using", "the", "indicated", "3", "'", "UTR", "reporter", "genes", "(", "wt", "or", "seed", "mutant", ")", "together", "with", "miRNA", "mimics", ".", "Cnih2", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "wt", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0020", ",", "mut", ":", "p", "=", "0", ".", "9267", ";", "mimic", ":", "F1", ",", "8", "=", "19", ".", "92", ",", "p", "=", "0", ".", "0021", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "4", ".", "760", ",", "p", "=", "0", ".", "0607", ";", "mimic", "x", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "12", ".", "99", ",", "p", "=", "0", ".", "0069", ")", ",", "Prr7", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "wt", ":", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "mut", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0103", ";", "wt", "vs", ".", "mut", "mimic", "miR329", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0014", ";", "mimic", ":", "F1", ",", "8", "=", "153", ".", "1", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "5", ".", "631", ",", "p", "=", "0", ".", "0450", ";", "mimic", "x", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "38", ".", "54", ",", "p", "=", "0", ".", "0003", ")", ";", "Src", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "wt", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0110", ",", "mut", ":", "p", "=", "0", ".", "4724", ";", "mimic", ":", "F1", ",", "8", "=", "16", ".", "99", ",", "p", "=", "0", ".", "0033", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "0", ".", "6809", ",", "p", "=", "0", ".", "4332", ";", "mimic", "vs", ".", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "8", "=", "3", ".", "920", ",", "p", "=", "0", ".", "0831", ")", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "D", ")", "Same", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "but", "in", "the", "presence", "of", "antimiRs", "(", "pLNAs", ")", "in", "hippocampal", "neurons", "after", "48h", "of", "PTX", "stimulation", ".", "Cnih2", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ";", "wt", ":", "p", "=", "0", ".", "2688", ";", "mut", ":", "p", "=", "0", ".", "8668", ";", "wt", "ctr", "vs", ".", "mut", "ctr", ":", "p", "=", "0", ".", "6463", ";", "anti", "-", "miRNA", ":", "F1", ",", "12", "=", "3", ".", "629", ",", "p", "=", "0", ".", "0810", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "0", ".", "7407", ",", "p", "=", "0", ".", "4063", ";", "anti", "-", "miRNA", "x", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "0", ".", "6679", ",", "p", "=", "0", ".", "4297", ")", ",", "Prr7", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ";", "wt", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0123", ";", "mut", ":", "p", "=", "0", ".", "9917", ";", "wt", "ctr", "vs", ".", "mut", "ctr", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0152", ";", "anti", "-", "miRNA", ":", "F1", ",", "12", "=", "6", ".", "082", ",", "p", "=", "0", ".", "0297", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "5", ".", "271", ";", "p", "=", "0", ".", "0405", ";", "anti", "-", "miRNA", "x", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "8", ".", "212", ",", "p", "=", "0", ".", "0142", ")", ";", "Src", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "wt", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0370", ";", "mut", ":", "p", "=", "0", ".", "3540", ";", "wt", "ctr", "vs", ".", "mut", "ctr", ":", "p", "=", "0", ".", "9906", ";", "anti", "-", "miRNA", ":", "F1", ",", "12", "=", "13", ".", "43", ",", "p", "=", "0", ".", "0064", ";", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "0", ".", "5672", ",", "p", "=", "0", ".", "4730", ";", "anti", "-", "miRNA", "x", "utr", "-", "construct", ":", "F1", ",", "12", "=", "1", ".", "362", ",", "p", "=", "0", ".", "2768", ")", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4b, qPCR validation of predicted direct miR379-410 targets using RNA from hippocampi of juvenile (P 22-24) mice, except of Shank 3 where adult miR-379-410 wt and ko animals were measured. If not indicated, both, male and female samples were used. Cnih2 (wt n=12, ko n=9, t19=2.344, *p=0.0301), Dlgap3 (wt n=12, ko n=9, t19=2.128, *p=0.0467), Prr7 (male wt n=7, ko n=4, t9=2.719, *p=0.0236), Src (wt n=12, ko n=9, t19=2.410, *p=0.0263), Lzts2 (male wt n=7, ko n=4, t9=2.554, *p=0.0310), Mpp2 (male wt n=7, ko n=4, t9=2.369, *p=0.0420), Prr12 (wt n=6, ko n=4, t8=2.375, *p=0.0449), Shank1 (wt n=11, ko n=9, t18=2.310, *p=0.0329), Shb (male wt n=6, ko n=4, t8=3.451, **p=0.0087) and Shank3 (adult male wt n=3, ko n=5, t6=2.538, *p=0.0442); unpaired Student`s t-test. Data are presented as mean ± s.e.m.c, d, Cnih2, Prr7 and Src are direct miR-379-410 target mRNAs. (C) 3'-UTR luciferase reporter gene assays in cultured rat cortical neurons using the indicated 3'UTR reporter genes (wt or seed mutant) together with miRNA mimics. Cnih2 (n=3 per group; wt: **p=0.0020, mut: p=0.9267; mimic: F1,8=19.92, p=0.0021; utr-construct: F1,8=4.760, p=0.0607; mimic x utr-construct: F1,8=12.99, p=0.0069), Prr7 (n=3 per group; wt: ****p<0.0001, mut: *p=0.0103; wt vs. mut mimic miR329: **p=0.0014; mimic: F1,8=153.1, p<0.0001; utr-construct: F1,8=5.631, p=0.0450; mimic x utr-construct: F1,8=38.54, p=0.0003); Src (n=3 per group; wt: *p=0.0110, mut: p=0.4724; mimic: F1,8=16.99, p=0.0033; utr-construct: F1,8=0.6809, p=0.4332; mimic vs. utr-construct: F1,8=3.920, p=0.0831); two-way ANOVA. (D) Same as in (C), but in the presence of antimiRs (pLNAs) in hippocampal neurons after 48h of PTX stimulation. Cnih2 (n=4 per group; wt: p=0.2688; mut: p=0.8668; wt ctr vs. mut ctr: p=0.6463; anti-miRNA: F1,12=3.629, p=0.0810; utr-construct: F1,12=0.7407, p=0.4063; anti-miRNA x utr-construct: F1,12=0.6679, p=0.4297), Prr7 (n=4 per group; wt: *p=0.0123; mut: p=0.9917; wt ctr vs. mut ctr: *p=0.0152; anti-miRNA: F1,12=6.082, p=0.0297; utr-construct: F1,12=5.271; p=0.0405; anti-miRNA x utr-construct: F1,12=8.212, p=0.0142); Src (n=3 per group; wt: *p=0.0370; mut: p=0.3540; wt ctr vs. mut ctr: p=0.9906; anti-miRNA: F1,12=13.43, p=0.0064; utr-construct: F1,12=0.5672, p=0.4730; anti-miRNA x utr-construct: F1,12=1.362, p=0.2768); two-way ANOVA. Data are presented as mean ± s.d."}
{"words": ["Figure", "1Expression", "of", "USP28", "(", "left", ")", "and", "TP63", "(", "right", ")", "in", "human", "lung", "squamous", "cell", "carcinomas", "(", "SCC", ",", "n", "=", "498", ")", ",", "adenocarcinomas", "(", "ADC", ",", "n", "=", "513", ")", "and", "normal", "non", "-", "transformed", "tissue", "(", "normal", "SCC", "=", "338", ",", "normal", "ADC", "=", "348", ")", ".", "Xena", "UCSC", "software", ".", "In", "box", "plots", ",", "the", "centre", "line", "reflects", "the", "median", ",", "the", "cross", "represents", "the", "mean", "and", "the", "upper", "and", "lower", "box", "limits", "indicates", "the", "first", "and", "third", "quartile", ".", "Whiskers", "extend", "1", ".", "5x", "the", "IQR", "and", "outliers", "are", "marked", "as", "dots", ".", "Correlation", "of", "mRNA", "expression", "of", "USP28", "and", "TP63", "in", "lung", "SCC", "(", "left", ",", "n", "=", "498", ")", ",", "ADC", "(", "right", ",", "n", "=", "513", ")", "and", "normal", ",", "non", "-", "transformed", "tissue", "(", "normal", "SCC", "=", "338", ",", "normal", "ADC", "=", "348", ")", ".", "R", ":", "Spearmans", "correlation", "coefficient", ";", "m", "=", "Slope", ".", "Xena", "UCSC", "software", ".", "IHC", "analysis", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "protein", "abundance", "in", "lung", "cancer", "and", "non", "-", "transformed", "human", "samples", "(", "n", "=", "300", ")", ".", "The", "staining", "intensity", "was", "quantified", "in", "arbitrary", "units", "from", "0", "up", "to", "3", "by", "three", "independent", "pathologists", ".", "In", "box", "plots", ",", "the", "centre", "line", "reflects", "the", "median", ",", "the", "cross", "represents", "the", "mean", "and", "the", "upper", "and", "lower", "box", "limits", "indicates", "the", "first", "and", "third", "quartile", ".", "Whiskers", "extend", "1", ".", "5x", "the", "IQR", "and", "outliers", "are", "marked", "as", "dots", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "estimator", "of", "NSCLC", "patients", "stratified", "by", "USP28", "(", "left", ",", "n", "=", "1145", ")", "and", "TP63", "(", "right", ",", "n", "=", "1926", ")", "expression", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "log", "-", "rank", "test", ".", "HR", ":", "hazard", "ratio", ".", "Kmplot", "software", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "estimator", "of", "lung", "SCC", "patients", "stratified", "by", "USP28", "expression", "(", "n", "=", "271", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "was", "calculated", "using", "a", "logrank", "test", ".", "HR", ":", "hazard", "ratio", ".", "Kmplot", "software", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Expression of USP28 (left) and TP63 (right) in human lung squamous cell carcinomas (SCC, n=498), adenocarcinomas (ADC, n=513) and normal non-transformed tissue (normal SCC=338, normal ADC=348). Xena UCSC software. In box plots, the centre line reflects the median, the cross represents the mean and the upper and lower box limits indicates the first and third quartile. Whiskers extend 1.5x the IQR and outliers are marked as dots.Correlation of mRNA expression of USP28 and TP63 in lung SCC (left, n=498), ADC (right, n=513) and normal, non-transformed tissue (normal SCC=338, normal ADC=348). R: Spearmans correlation coefficient; m=Slope. Xena UCSC software.IHC analysis of USP28 and ∆Np63 protein abundance in lung cancer and non-transformed human samples (n=300). The staining intensity was quantified in arbitrary units from 0 up to 3 by three independent pathologists. In box plots, the centre line reflects the median, the cross represents the mean and the upper and lower box limits indicates the first and third quartile. Whiskers extend 1.5x the IQR and outliers are marked as dots. p-values were calculated using two-tailed t-test.Kaplan-Meier estimator of NSCLC patients stratified by USP28 (left, n=1145) and TP63 (right, n=1926) expression. p-values were calculated using log-rank test. HR: hazard ratio. Kmplot software.Kaplan-Meier estimator of lung SCC patients stratified by USP28 expression (n=271). The p-value was calculated using a logrank test. HR: hazard ratio. Kmplot software."}
{"words": ["Figure", "2Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "exogenous", "HA", "-", "USP28", "and", "FLAG", "-", "ΔNp63", "in", "HEK293", "cells", ".", "Either", "HA", "-", "USP28", "or", "FLAG", "-", "ΔNp63", "were", "precipitated", "and", "blotted", "against", "FLAG", "-", "ΔNp63", "or", "HA", "-", "USP28", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "IP", "(", "ACTIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Ni", "-", "NTA", "His", "-", "ubiquitin", "pulldown", "in", "control", "transfected", "or", "HA", "-", "USP28", "overexpressing", "HEK293", "cells", ",", "followed", "by", "immunoblot", "against", "exogenous", "ΔNp63", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "pull", "down", ".", "Relative", "ubiquitination", "of", "the", "representative", "immunoblot", "was", "calculated", "using", "undefined", "for", "normalization", ".", "Ni", "-", "NTA", "His", "-", "ubiquitin", "pulldown", "K48", "or", "K63", "in", "control", "and", "HA", "-", "USP28", "overexpressing", "HEK293", "cells", ",", "followed", "by", "immunoblot", "against", "exogenous", "ΔNp63", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "pulldown", ".", "Relative", "ubiquitination", "of", "the", "representative", "immunoblot", "was", "calculated", "using", "VINCULIN", "for", "normalization", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "exogenous", "FLAG", "-", "USP28", "C171A", "and", "FLAG", "-", "ΔNp63", "in", "HEK293", "cells", ".", "ΔNp63", "was", "precipitated", "and", "blotted", "against", "FLAG", "-", "USP28", "or", "ΔNp63", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "IP", "(", "ACTIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Ni", "-", "NTA", "His", "-", "ubiquitin", "pulldown", "in", "control", ",", "FLAG", "-", "USP28", "or", "FLAG", "-", "USP28", "C171A", "transfected", "HEK293", "cells", ",", "followed", "by", "immunoblot", "against", "exogenous", "ΔNp63", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "pulldown", ".", "Relative", "ubiquitination", "of", "the", "representative", "immunoblot", "was", "calculated", "using", "ACTIN", "for", "normalization", ".", "CHX", "chase", "assay", "(", "100ug", "/", "ml", ")", "of", "control", ",", "FLAG", "-", "USP28", "or", "FLAG", "-", "USP28", "C171A", "transfected", "HEK293", "cells", "for", "indicated", "time", "points", ".", "Representative", "immunoblot", "analysis", "of", "FLAG", "(", "USP28", ")", "and", "∆", "Np63", "as", "well", "quantification", "of", "relative", "protein", "abundance", "(", "ACTIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Immunoblot", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "in", "transfected", "HEK293", "cells", "upon", "treatment", "with", "either", "DMSO", "or", "indicated", "concentrations", "of", "PR", "-", "619", "for", "24", "hours", ".", "Relative", "protein", "abundance", "was", "calculated", "ACTIN", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Co-immunoprecipitation of exogenous HA-USP28 and FLAG-ΔNp63 in HEK293 cells. Either HA-USP28 or FLAG-ΔNp63 were precipitated and blotted against FLAG-ΔNp63 or HA-USP28. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the IP (ACTIN as loading control).Ni-NTA His-ubiquitin pulldown in control transfected or HA-USP28 overexpressing HEK293 cells, followed by immunoblot against exogenous ΔNp63. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the pull down. Relative ubiquitination of the representative immunoblot was calculated using undefined for normalization.Ni-NTA His-ubiquitin pulldown K48 or K63 in control and HA-USP28 overexpressing HEK293 cells, followed by immunoblot against exogenous ΔNp63. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the pulldown. Relative ubiquitination of the representative immunoblot was calculated using VINCULIN for normalization.Co-immunoprecipitation of exogenous FLAG-USP28 C171A and FLAG-ΔNp63 in HEK293 cells. ΔNp63 was precipitated and blotted against FLAG-USP28 or ΔNp63. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the IP (ACTIN as loading control).Ni-NTA His-ubiquitin pulldown in control, FLAG-USP28 or FLAG-USP28 C171A transfected HEK293 cells, followed by immunoblot against exogenous ΔNp63. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the pulldown. Relative ubiquitination of the representative immunoblot was calculated using ACTIN for normalization.CHX chase assay (100ug/ml) of control, FLAG-USP28 or FLAG-USP28 C171A transfected HEK293 cells for indicated time points. Representative immunoblot analysis of FLAG (USP28) and ∆Np63 as well quantification of relative protein abundance (ACTIN as loading control).Immunoblot of USP28 and ∆Np63 in transfected HEK293 cells upon treatment with either DMSO or indicated concentrations of PR-619 for 24 hours. Relative protein abundance was calculated ACTIN as loading control."}
{"words": ["Figure", "3Immunoblot", "of", "endogenous", "USP25", ",", "USP28", "and", "∆", "Np63", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "A", "-", "431", "cells", "and", "co", "-", "precipitated", "∆", "Np63", "or", "USP28", ".", "Beads", "were", "coupled", "to", "specific", "USP25", ",", "USP28", "and", "∆", "Np63", "antibodies", "or", "non", "-", "specific", "rabbit", "IgG", "as", "control", ".", "The", "input", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "protein", "amount", "used", "for", "the", "IP", "(", "TUBULIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Inducible", "depletion", "of", "USP28", "in", "A", "-", "431", "upon", "treatment", "with", "doxycycline", "(", "1µg", "/", "ml", ")", "for", "96h", ",", "western", "blot", "(", "left", ",", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", "and", "qPCR", "analysis", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "expression", "relative", "to", "ACTIN", "(", "right", ")", "was", "performed", ".", "Tandem", "ubiquitin", "binding", "entity", "(", "TUBE", ")", "pulldown", "of", "endogenous", "ubiquitylated", "∆", "Np63", "in", "A", "-", "431", "cells", "upon", "DOX", "depletion", "of", "USP28", ".", "Relative", "ubiquitination", "of", "the", "representative", "immunoblot", "was", "calculated", "using", "ACTIN", "for", "normalization", ".", "Cycloheximide", "(", "CHX", ")", "chase", "assay", "(", "100µg", "/", "ml", ")", "of", "control", "or", "inducible", "sh", "-", "USP28", "A", "-", "431", "cell", "line", "(", "EtOH", "or", "1µg", "/", "ml", "dox", ")", "for", "indicated", "time", "points", ".", "Representative", "immunoblot", "(", "left", ",", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "and", "quantification", "of", "relative", "protein", "abundance", "(", "right", ")", ".", "Doxycycline", "induced", "murine", "USP28", "overexpression", "(", "EtOH", "or", "1ug", "/", "ml", "dox", "for", "96", "hours", ")", "in", "A", "-", "431", "cells", "followed", "by", "immunoblot", "(", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", "and", "qPCR", "analysis", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", ".", "For", "qPCR", ",", "human", "USP28", "and", "murine", "USP28", "(", "mUSP28", ")", "primers", "were", "used", ".", "Relative", "mRNA", "was", "calculated", "using", "∆", "∆", "Ct", "analysis", "for", "human", "USP28", "and", "∆", "Ct", "for", "mUSP28", "(", "ACTIN", "as", "housekeeping", ")", ".", "TUBE", "pulldown", "of", "endogenous", "ubiquitylated", "∆", "Np63", "in", "A", "-", "431", "cells", "upon", "overexpression", "of", "mUSP28", "for", "96", "hours", "(", "EtOH", "or", "1µg", "/", "ml", "dox", ")", ".", "Relative", "ubiquitination", "of", "the", "representative", "immunoblot", "was", "calculated", "using", "ACTIN", "for", "normalization", ".", "CHX", "chase", "assay", "(", "100µg", "/", "ml", ")", "of", "control", "or", "inducible", "mUSP28", "overexpressing", "A", "-", "431", "cell", "line", "(", "EtOH", "or", "1µg", "/", "ml", "dox", ")", "for", "indicated", "time", "points", ".", "Representative", "immunoblot", "analysis", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "as", "well", "quantification", "of", "relative", "protein", "abundance", "(", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Immunoblot", "of", "control", "(", "sh", "-", "NTC", ")", "and", "two", "independent", "shRNA", "targeting", "USP28", "(", "sh", "-", "USP28", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "for", "∆", "Np63", "and", "USP28", "protein", "abundance", "in", "LUDLU", "-", "1adh", "(", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", ",", "followed", "by", "qPCR", "analysis", "of", "USP28", "and", "∆", "Np63", "expression", "relative", "to", "ACTIN", ".", "Doxycycline", "induced", "mUSP28", "overexpression", "(", "EtOH", "or", "1µg", "/", "ml", "dox", "for", "96", "hours", ")", "in", "LUDLU", "-", "1adh", "cells", "followed", "by", "immunoblot", "(", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", "and", "qPCR", "analysis", "of", "USP28", ",", "mUSP28", "and", "∆", "Np63", ".", "Relative", "mRNA", "was", "calculated", "using", "∆", "∆", "Ct", "analysis", "for", "human", "USP28", "and", "∆", "Ct", "for", "mUSP28", "(", "ACTIN", "as", "housekeeping", "for", "the", "analysis", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblot of endogenous USP25, USP28 and ∆Np63 immunoprecipitated (IP) from A-431 cells and co-precipitated ∆Np63 or USP28. Beads were coupled to specific USP25, USP28 and ∆Np63 antibodies or non-specific rabbit IgG as control. The input corresponds to 10% of the total protein amount used for the IP (TUBULIN as loading control).Inducible depletion of USP28 in A-431 upon treatment with doxycycline (1µg/ml) for 96h, western blot (left, VINCULIN as loading control) and qPCR analysis of USP28 and ∆Np63 expression relative to ACTIN (right) was performed.Tandem ubiquitin binding entity (TUBE) pulldown of endogenous ubiquitylated ∆Np63 in A-431 cells upon DOX depletion of USP28. Relative ubiquitination of the representative immunoblot was calculated using ACTIN for normalization.Cycloheximide (CHX) chase assay (100µg/ml) of control or inducible sh-USP28 A-431 cell line (EtOH or 1µg/ml dox) for indicated time points. Representative immunoblot (left, VINCULIN as loading control) of USP28 and ∆Np63 and quantification of relative protein abundance (right).Doxycycline induced murine USP28 overexpression (EtOH or 1ug/ml dox for 96 hours) in A-431 cells followed by immunoblot (VINCULIN as loading control) and qPCR analysis of USP28 and ∆Np63. For qPCR, human USP28 and murine USP28 (mUSP28) primers were used. Relative mRNA was calculated using ∆∆Ct analysis for human USP28 and ∆Ct for mUSP28 (ACTIN as housekeeping).TUBE pulldown of endogenous ubiquitylated ∆Np63 in A-431 cells upon overexpression of mUSP28 for 96 hours (EtOH or 1µg/ml dox). Relative ubiquitination of the representative immunoblot was calculated using ACTIN for normalization.CHX chase assay (100µg/ml) of control or inducible mUSP28 overexpressing A-431 cell line (EtOH or 1µg/ml dox) for indicated time points. Representative immunoblot analysis of USP28 and ∆Np63 as well quantification of relative protein abundance (VINCULIN as loading control).Immunoblot of control (sh-NTC) and two independent shRNA targeting USP28 (sh-USP28#1 and #2) for ∆Np63 and USP28 protein abundance in LUDLU-1adh (VINCULIN as loading control), followed by qPCR analysis of USP28 and ∆Np63 expression relative to ACTIN.Doxycycline induced mUSP28 overexpression (EtOH or 1µg/ml dox for 96 hours) in LUDLU-1adh cells followed by immunoblot (VINCULIN as loading control) and qPCR analysis of USP28, mUSP28 and ∆Np63. Relative mRNA was calculated using ∆∆Ct analysis for human USP28 and ∆Ct for mUSP28 (ACTIN as housekeeping for the analysis)."}
{"words": ["Figure", "4Correlation", "of", "gene", "expression", "changes", "upon", "constitutive", "transduction", "of", "A", "-", "431", "cells", "with", "either", "shRNA", "targeting", "USP28", "(", "sh", "-", "USP28", "#", "1", ")", "or", "∆", "Np63", "(", "sh", "-", "∆", "Np63", "#", "2", ")", "relative", "to", "non", "-", "targeting", "control", "(", "sh", "-", "NTC", ")", ".", "The", "diagonal", "line", "reflects", "a", "regression", "build", "on", "a", "linear", "model", ".", "R", ":", "Pearsons", "correlation", "coefficient", ",", "m", ":", "slope", "of", "the", "linear", "regression", "modelGene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "of", "a", "gene", "set", "of", "significantly", "down", "-", "regulated", "genes", "in", "sh", "-", "∆", "Np63", "#", "2", "transfected", "A", "-", "431", "cells", "(", "\"", "Down", "-", "regulated", "sh", "-", "∆", "NP63", "\"", ",", "Appendix", "Table", "S1", ")", ".", "The", "gene", "set", "was", "analysed", "in", "sh", "-", "∆", "Np63", "#", "2", "(", "left", ")", "and", "sh", "-", "USP28", "#", "1", "-", "depleted", "(", "right", ")", "A", "-", "431", "cells", ".", "(", "N", ")", "ES", ":", "(", "normalised", ")", "enrichment", "scoreGene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "of", "a", "gene", "set", "of", "significantly", "down", "-", "regulated", "genes", "in", "sh", "-", "USP28", "#", "1", "transfected", "A", "-", "431", "cells", "(", "\"", "Down", "-", "regulated", "sh", "-", "USP28", "\"", ",", "Appendix", "Table", "S1", ")", ".", "The", "gene", "set", "was", "analysed", "in", "shUSP28", "#", "1", "(", "left", ")", "and", "sh", "-", "∆", "Np63", "#", "-", "depleted", "(", "right", ")", "A", "-", "431", "cells", ".", "(", "N", ")", "ES", ":", "(", "normalised", ")", "enrichment", "scoreImmunoblot", "of", "endogenous", "ΔNp63", "and", "USP28", "in", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "constitutive", "shRNA", "-", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", "or", "against", "USP28", "and", "transiently", "transfected", "with", "exogenous", "ΔNp63", ".", "ACTIN", "served", "as", "loading", "control", ".", "Representative", "western", "blot", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cell", "growth", "of", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "constitutive", "shRNA", "-", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", "or", "against", "USP28", "and", "transiently", "transfected", "with", "exogenous", "ΔNp63", ".", "Total", "cell", "number", "was", "measured", "and", "assessed", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Quantitative", "graph", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "statistical", "analysis", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01Relative", "expression", "of", "SCC", "marker", "genes", "KRT5", ",", "14", "and", "19", "in", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "constitutive", "shRNA", "-", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", ",", "two", "independent", "shRNA", "-", "ΔNp63", ",", "two", "independent", "shRNA", "-", "USP28", "or", "ΔNp63", "in", "shRNA", "-", "USP28", "#", "1", ",", "normalised", "to", "ACTIN", ".", "Quantitative", "graph", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "epithelial", "marker", "genes", "KRT10", "and", "GPCR5A", "in", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "constitutive", "shRNA", "-", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", ",", "two", "independent", "shRNA", "-", "ΔNp63", "and", "shRNA", "-", "USP28", "#", "1", ",", "normalised", "to", "ACTIN", ".", "Quantitative", "graph", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Genomic", "signature", "of", "primary", "human", "lung", "SCC", "samples", "comprising", "USP28", ",", "∆", "Np63", ",", "KRT5", ",", "KRT14", ",", "KRT19", ",", "DSG3", ",", "MKI67", ",", "PCNA", "and", "GPRC5A", ".", "Samples", "were", "sorted", "dependent", "on", "relative", "USP28", "expression", "(", "high", "to", "low", ")", ".", "n", "=", "553", ".", "Xena", "UCSC", "software", ".", "GSEA", "of", "consensus", "squamous", "cancer", "marker", "genes", "(", "se", "Appendix", "Table", "S2", ")", "in", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "sh", "-", "∆", "Np63", "#", "2", "or", "sh", "-", "NTC", ".", "(", "N", ")", "ES", ":", "(", "normalised", ")", "enrichment", "score", "GSEA", "of", "consensus", "squamous", "cancer", "marker", "genes", "in", "A", "-", "431", "cells", "stably", "transduced", "with", "sh", "-", "USP28", "#", "1", "or", "sh", "-", "NTC", ".", "(", "N", ")", "ES", ":", "(", "normalised", ")", "enrichment", "scoreCorrelation", "of", "mRNA", "expression", "of", "consensus", "squamous", "cancer", "marker", "genes", "and", "TP63", "in", "lung", "SCC", "and", "non", "-", "transformed", "lung", "tissue", "(", "Normal", ")", ".", "R", ":", "Spearmans", "correlation", "coefficient", ".", "n", "=", "836", ".", "Gepia", "software", ".", "Correlation", "of", "mRNA", "expression", "of", "consensus", "squamous", "cancer", "marker", "genes", "and", "USP28", "in", "lung", "SCC", "and", "non", "-", "transformed", "lung", "tissue", "(", "Normal", ")", ".", "R", ":", "Spearmans", "correlation", "coefficient", ".", "N", "=", "836", ".", "Gepia", "software", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Correlation of gene expression changes upon constitutive transduction of A-431 cells with either shRNA targeting USP28 (sh-USP28#1) or ∆Np63 (sh-∆Np63#2) relative to non-targeting control (sh-NTC). The diagonal line reflects a regression build on a linear model. R: Pearsons correlation coefficient, m: slope of the linear regression modelGene set enrichment analysis (GSEA) of a gene set of significantly down-regulated genes in sh-∆Np63#2 transfected A-431 cells (\"Down-regulated sh-∆NP63\", Appendix Table S1). The gene set was analysed in sh-∆Np63#2 (left) and sh-USP28#1-depleted (right) A-431 cells. (N)ES: (normalised) enrichment scoreGene set enrichment analysis (GSEA) of a gene set of significantly down-regulated genes in sh-USP28#1 transfected A-431 cells (\"Down-regulated sh-USP28\", Appendix Table S1). The gene set was analysed in shUSP28#1 (left) and sh-∆Np63#-depleted (right) A-431 cells. (N)ES: (normalised) enrichment scoreImmunoblot of endogenous ΔNp63 and USP28 in A-431 cells stably transduced with constitutive shRNA-non-targeting control (NTC) or against USP28 and transiently transfected with exogenous ΔNp63. ACTIN served as loading control. Representative western blot from three independent experiments.Cell growth of A-431 cells stably transduced with constitutive shRNA-non-targeting control (NTC) or against USP28 and transiently transfected with exogenous ΔNp63. Total cell number was measured and assessed at indicated time points. Quantitative graph is represented as mean ± SD of three experiments (n=3). p-values were calculated using two-tailed t-test statistical analysis. *p-value < 0.05, **p-value < 0.01Relative expression of SCC marker genes KRT5, 14 and 19 in A-431 cells stably transduced with constitutive shRNA-non-targeting control (NTC), two independent shRNA-ΔNp63, two independent shRNA-USP28 or ΔNp63 in shRNA-USP28#1, normalised to ACTIN. Quantitative graph is represented as mean ± SD of three experiments (n=3).Relative expression of epithelial marker genes KRT10 and GPCR5A in A-431 cells stably transduced with constitutive shRNA-non-targeting control (NTC), two independent shRNA-ΔNp63 and shRNA-USP28#1, normalised to ACTIN. Quantitative graph is represented as mean ± SD of three experiments (n=3).Genomic signature of primary human lung SCC samples comprising USP28, ∆Np63, KRT5, KRT14, KRT19, DSG3, MKI67, PCNA and GPRC5A. Samples were sorted dependent on relative USP28 expression (high to low). n=553. Xena UCSC software.GSEA of consensus squamous cancer marker genes (se Appendix Table S2) in A-431 cells stably transduced with sh-∆Np63#2 or sh-NTC. (N)ES: (normalised) enrichment score GSEA of consensus squamous cancer marker genes in A-431 cells stably transduced with sh-USP28#1 or sh-NTC. (N)ES: (normalised) enrichment scoreCorrelation of mRNA expression of consensus squamous cancer marker genes and TP63 in lung SCC and non-transformed lung tissue (Normal). R: Spearmans correlation coefficient. n=836. Gepia software. Correlation of mRNA expression of consensus squamous cancer marker genes and USP28 in lung SCC and non-transformed lung tissue (Normal). R: Spearmans correlation coefficient. N=836. Gepia software."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "of", "tumour", "bearing", "animals", "12", "weeks", "post", "intratracheal", "infection", ".", "Boxes", "indicate", "highlighted", "tumour", "areas", "in", "(", "C", ")", "(", "a", ",", "b", ",", "a", "'", "and", "b", "'", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "2000µm", ";", "nKPL", "=", "6", "and", "nKPLU", "=", "5", ".", "H", "=", "heart", ".", "Representative", "IHC", "staining", "for", "ADC", "(", "TTF", "-", "1", ")", "and", "SCC", "(", "KRT5", "and", "∆", "Np63", ")", "marker", "expression", "as", "well", "as", "Usp28", "abundance", "in", "KPL", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "KPLU", "(", "n", "=", "5", ")", "lung", "tumours", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "Quantification", "of", "%", "tumour", "area", "(", "normalised", "to", "total", "lung", "area", ")", "in", "KPL", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "KPLU", "(", "n", "=", "5", ")", "animals", ".", "Quantification", "of", "lung", "tumour", "numbers", "in", "KPL", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "KPLU", "(", "n", "=", "5", ")", "animals", ".", "Immunoblot", "of", "endogenous", "LKB1", ",", "USP28", "and", "∆", "Np63", "in", "KPL", "and", "KPLU", "tumours", ".", "(", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Western", "blot", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "endogenous", "NOTCH1", ",", "c", "-", "MYC", "and", "c", "-", "JUN", "in", "KPL", "and", "KPLU", "(", "ACTIN", "as", "a", "control", ")", ".", "n", "=", "3Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "comparing", "KPL", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "KPLU", "(", "n", "=", "5", ")", "animals", "upon", "AAV", "intratracheal", "infection", ".", "The", "p", "-", "value", "was", "calculated", "using", "a", "log", "-", "rank", "test", ".", "Representative", "qPCR", "of", "SCC", "and", "ADC", "marker", "expression", "in", "two", "independent", "KP", "lung", "tumour", "clones", ",", "resulting", "in", "KPADC", "and", "KPSCC", ";", "(", "ACTIN", "served", "as", "loading", "control", ")", ".", "Quantitative", "graph", "is", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunoblot", "against", "endogenous", "USP28", "in", "the", "murine", "KPSCC", "cell", "line", "upon", "targeting", "with", "two", "independent", "shRNA", "sequences", ".", "ACTIN", "served", "as", "loading", "control", ".", "Representative", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "images", "of", "tumour", "bearing", "animals", "8", "weeks", "post", "intratracheal", "transplantation", "of", "2", "×", "105", "cells", "/", "animal", ".", "KPSCC", "sh", "-", "NTC", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "KPSCC", "sh", "-", "USP28", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "Scale", "bar", "=", "5000µmQuantification", "of", "%", "tumour", "area", "(", "top", ",", "normalised", "to", "total", "lung", "area", ")", "and", "lung", "tumour", "numbers", "(", "bottom", ")", "on", "KPSCC", "sh", "-", "NTC", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "KPSCC", "sh", "-", "USP28", "(", "n", "=", "6", ")", "animals", ".", "Representative", "IHC", "staining", "for", "ADC", "(", "TTF", "-", "1", ")", "and", "SCC", "(", "KRT5", "and", "∆", "Np63", ")", "marker", "expression", "as", "well", "as", "Usp28", "and", "GFP", "abundance", "in", "KPSCC", "sh", "-", "NTC", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "KPSCC", "sh", "-", "USP28", "(", "n", "=", "3", ")", "lung", "tumours", ".", "Scale", "bar", "=", "50"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative haematoxylin and eosin (H&E) staining of tumour bearing animals 12 weeks post intratracheal infection. Boxes indicate highlighted tumour areas in (C) (a, b, a' and b'). Scale bar = 2000µm; nKPL= 6 and nKPLU = 5. H=heart.Representative IHC staining for ADC (TTF-1) and SCC (KRT5 and ∆Np63) marker expression as well as Usp28 abundance in KPL (n=6) and KPLU (n=5) lung tumours. Scale bar: 20µm.Quantification of % tumour area (normalised to total lung area) in KPL (n=6) and KPLU (n=5) animals. Quantification of lung tumour numbers in KPL (n=6) and KPLU (n=5) animals.Immunoblot of endogenous LKB1, USP28 and ∆Np63 in KPL and KPLU tumours. (VINCULIN as loading control). Western blot shown are representative of three independent experiments (n=3). Representative immunoblot of endogenous NOTCH1, c-MYC and c-JUN in KPL and KPLU (ACTIN as a control). n=3Kaplan-Meier survival curves comparing KPL (n=6) and KPLU (n=5) animals upon AAV intratracheal infection. The p-value was calculated using a log-rank test.Representative qPCR of SCC and ADC marker expression in two independent KP lung tumour clones, resulting in KPADC and KPSCC; (ACTIN served as loading control). Quantitative graph is represented as mean ± SD of three experiments (n=3).Immunoblot against endogenous USP28 in the murine KPSCC cell line upon targeting with two independent shRNA sequences. ACTIN served as loading control.Representative haematoxylin and eosin (H&E) images of tumour bearing animals 8 weeks post intratracheal transplantation of 2 × 105 cells/animal. KPSCC sh-NTC (n=3); KPSCC sh-USP28 (n=3), Scale bar = 5000µmQuantification of % tumour area (top, normalised to total lung area) and lung tumour numbers (bottom) on KPSCC sh-NTC (n=6) and KPSCC sh-USP28 (n=6) animals.Representative IHC staining for ADC (TTF-1) and SCC (KRT5 and ∆Np63) marker expression as well as Usp28 and GFP abundance in KPSCC sh-NTC (n=3) and KPSCC sh-USP28 (n=3) lung tumours. Scale bar =50 µm"}
{"words": ["Figure", "6Analysis", "of", "occurring", "TP63", "genetic", "alterations", "in", "lung", "squamous", "(", "LUSC", ")", ",", "cervical", "(", "CESC", ")", ",", "oesophagus", "(", "ESCA", ")", ",", "head", "and", "neck", "(", "HNSC", ")", "and", "pancreatic", "(", "PAAD", ")", "tumours", ".", "Cbioportal", ".", "Expression", "of", "TP63", "(", "left", ")", "and", "USP28", "(", "right", ")", "in", "human", "Lung", "(", "n", "=", "498", ")", ",", "Cervix", "(", "n", "=", "254", ")", ",", "Oesophagus", "(", "n", "=", "96", ")", "and", "HNSC", "(", "n", "=", "522", ")", "SCC", "tumours", "and", "normal", "non", "-", "transformed", "tissue", "(", "nLung", "=", "338", "nCervix", "=", "3", ",", "nOesophagus", "=", "11", "and", "nHNSC", "=", "44", ")", ".", "In", "box", "plots", ",", "the", "centre", "line", "reflects", "the", "median", ",", "the", "cross", "represents", "the", "mean", "and", "the", "upper", "and", "lower", "box", "limits", "indicates", "the", "first", "and", "third", "quartile", ".", "Whiskers", "extend", "1", ".", "5x", "the", "IQR", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "statistical", "analysis", ".", "Xena", "UCSC", "software", ".", "Correlation", "of", "mRNA", "expression", "of", "KRT14", "/", "KRT7", "and", "TP63", "in", "ADC", "and", "SCC", "tumours", "for", "Lung", "(", "nADC", "=", "513", "and", "nSCC", "=", "498", ")", ",", "Cervix", "(", "nADC", "=", "47", "and", "nSCC", "=", "254", ")", "and", "Oesophagus", "(", "nADC", "=", "89", "and", "nSCC", "=", "96", ")", ".", "Blue", "dots", ":", "ADC", ";", "Red", "dots", ":", "SCC", ";", "R", "=", "Spearmans", "correlation", "coefficient", ";", "m", ":", "Slope", ".", "Xena", "UCSC", ".", "Immunoblot", "of", "control", "(", "sh", "-", "NTC", ")", "and", "two", "independent", "shRNA", "targeting", "USP28", "(", "sh", "-", "USP28", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "for", "∆", "Np63", ",", "KRT14", "and", "USP28", "protein", "abundance", "in", "H1299", ",", "LUDLU", "-", "1adh", ",", "HELA", ",", "SiHa", ",", "Ca", "Ski", ",", "PANC", "-", "1", "and", "BXPC", "-", "3", "(", "ACTIN", "as", "loading", "control", ")", ".", "Cells", "were", "seeded", "at", "equal", "cell", "density", "and", "counted", "after", "five", "days", ",", "Brigth", "field", "images", "of", "control", "or", "sh", "-", "USP28", "#", "2", "infected", "H1299", ",", "LUDLU", "-", "1adh", ",", "Hela", ",", "CaSKI", ",", "PANC", "-", "1", "and", "BXPC", "-", "3", "cells", "before", "quantification", ".", "Scale", "bar", "=", "30µm", "Relative", "number", "of", "H1299", ",", "LUDLU", "-", "1adh", ",", "Hela", ",", "CaSKI", ",", "SiHa", ",", "PANC", "-", "1", "and", "BXPC", "-", "3", "sh", "-", "USP28", "#", "2", "cells", "compared", "with", "sh", "-", "NTC", "control", "cells", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "statistical", "analysis", ".", "SiHa", "*", "=", "Notably", ",", "the", "human", "SCC", "cell", "line", "SiHa", "was", "negative", "for", "ΔNp63", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Analysis of occurring TP63 genetic alterations in lung squamous (LUSC), cervical (CESC), oesophagus (ESCA), head and neck (HNSC) and pancreatic (PAAD) tumours. Cbioportal.Expression of TP63 (left) and USP28 (right) in human Lung (n=498), Cervix (n=254), Oesophagus (n=96) and HNSC (n=522) SCC tumours and normal non-transformed tissue (nLung=338 nCervix=3, nOesophagus=11 and nHNSC=44). In box plots, the centre line reflects the median, the cross represents the mean and the upper and lower box limits indicates the first and third quartile. Whiskers extend 1.5x the IQR. p-values were calculated using two-tailed t-test statistical analysis. Xena UCSC software.Correlation of mRNA expression of KRT14 / KRT7 and TP63 in ADC and SCC tumours for Lung (nADC=513 and nSCC=498), Cervix (nADC=47 and nSCC=254) and Oesophagus (nADC=89 and nSCC=96). Blue dots: ADC; Red dots: SCC; R= Spearmans correlation coefficient; m: Slope. Xena UCSC.Immunoblot of control (sh-NTC) and two independent shRNA targeting USP28 (sh-USP28#1 and #2) for ∆Np63, KRT14 and USP28 protein abundance in H1299, LUDLU-1adh, HELA, SiHa, Ca Ski, PANC-1 and BXPC-3 (ACTIN as loading control).Cells were seeded at equal cell density and counted after five days, Brigth field images of control or sh-USP28#2 infected H1299, LUDLU-1adh, Hela, CaSKI, PANC-1 and BXPC-3 cells before quantification. Scale bar = 30µm Relative number of H1299, LUDLU-1adh, Hela, CaSKI, SiHa, PANC-1 and BXPC-3 sh-USP28#2 cells compared with sh-NTC control cells. p-values were calculated using two-tailed t-test statistical analysis. SiHa* = Notably, the human SCC cell line SiHa was negative for ΔNp63."}
{"words": ["Figure", "7Immunoblot", "of", "endogenous", "USP28", "in", "A", "-", "431", "cells", "upon", "treatment", "with", "warheads", "(", "WH", ")", "and", "either", "DMSO", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", "(", "USP28", "Inh", ".", ")", "for", "24", "hours", ".", "USP28", "Upper", "band", ":", "Active", "USP28", ";", "USP28", "lower", "band", ":", "Inactive", "USP28", ",", "VINCULIN", "as", "loading", "control", ".", "Immunoblot", "of", "endogenous", "USP28", ",", "∆", "Np63", "and", "KRT14", "in", "A", "-", "431", "cells", "treated", "for", "24", "hours", "with", "either", "DMSO", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", ".", "VINCULIN", "served", "as", "loading", "control", ".", "TP63", "and", "USP28", "half", "maximal", "inhibitory", "protein", "abundance", "(", "IC50", ")", "was", "calculated", ".", "Graphs", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "TUBE", "pulldown", "of", "endogenous", "ubiquitylated", "∆", "Np63", "in", "A", "-", "431", "cells", "upon", "treatment", "with", "either", "DMSO", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", "for", "24", "hours", ".", "VINCULIN", "served", "as", "loading", "control", "for", "relative", "Ubiquitination", ".", "Immunoblot", "of", "endogenous", "USP28", ",", "∆", "Np63", "and", "KRT14", "in", "A", "-", "431", "cells", "treated", "for", "18", "hours", "with", "either", "DMSO", "or", "15µM", "AZ1", "followed", "by", "6", "hours", "of", "treatment", "with", "20µM", "proteasomal", "inhibitor", "MG", "-", "132", "(", "20µM", ")", "or", "DMSO", ".", "VINCULIN", "served", "as", "loading", "control", ".", "A", "-", "431", "cells", "were", "seeded", "at", "equal", "cell", "density", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "either", "DMSO", ",", "1µM", ",", "10µM", "or", "30µM", "AZ1", "for", "48h", ".", "Cells", "were", "quantified", "with", "the", "Operetta", "imaging", "system", "using", "Hoechst", "staining", ".", "50", "%", "growth", "inhibition", "(", "GI50", ")", "was", "calculated", ".", "Scale", "bar", "=", "250µm", ".", "n", "=", "30", "fields", "analysedImmunoblot", "of", "endogenous", "USP28", ",", "∆", "Np63", "and", "KRT14", "in", "LUDLU", "-", "1adh", ",", "H1299", ",", "Ca", "Ski", ",", "Hela", "and", "SiHa", "cells", "treated", "for", "24", "hours", "with", "either", "DMSO", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", ".", "VINCULIN", "served", "as", "loading", "controlLUDLU", "-", "1ADH", ",", "H1299", ",", "Ca", "Ski", ",", "Hela", "and", "SiHa", "cells", "were", "seeded", "at", "equal", "cell", "density", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "either", "DMSO", ",", "1µM", ",", "10µM", "or", "30µM", "AZ1", "for", "48h", ".", "Scale", "bar", "for", "LUDLU", "-", "1adh", "and", "H1299", "=", "500µm", ".", "Scale", "bar", "for", "Ca", "Ski", ",", "Hela", "and", "SiHa", "=", "250µm", ".", "SiHa", "*", "=", "Notably", ",", "the", "human", "SCC", "cell", "line", "SiHa", "was", "negative", "for", "ΔNp63", ".", "Number", "of", "cells", "were", "quantified", "with", "the", "Operetta", "imaging", "system", "using", "Hoechst", "staining", ".", "50", "%", "growth", "inhibition", "(", "GI50", ")", "was", "calculated", ".", "n", "=", "30", "fields"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Immunoblot of endogenous USP28 in A-431 cells upon treatment with warheads (WH) and either DMSO or indicated concentrations of AZ1 (USP28 Inh.) for 24 hours. USP28 Upper band: Active USP28; USP28 lower band: Inactive USP28, VINCULIN as loading control.Immunoblot of endogenous USP28, ∆Np63 and KRT14 in A-431 cells treated for 24 hours with either DMSO or indicated concentrations of AZ1. VINCULIN served as loading control. TP63 and USP28 half maximal inhibitory protein abundance (IC50) was calculated. Graphs are represented as mean ± SD (n=3).TUBE pulldown of endogenous ubiquitylated ∆Np63 in A-431 cells upon treatment with either DMSO or indicated concentrations of AZ1 for 24 hours. VINCULIN served as loading control for relative Ubiquitination.Immunoblot of endogenous USP28, ∆Np63 and KRT14 in A-431 cells treated for 18 hours with either DMSO or 15µM AZ1 followed by 6 hours of treatment with 20µM proteasomal inhibitor MG-132 (20µM) or DMSO. VINCULIN served as loading control.A-431 cells were seeded at equal cell density and cultured in the presence of either DMSO, 1µM, 10µM or 30µM AZ1 for 48h. Cells were quantified with the Operetta imaging system using Hoechst staining. 50% growth inhibition (GI50) was calculated. Scale bar = 250µm. n= 30 fields analysedImmunoblot of endogenous USP28, ∆Np63 and KRT14 in LUDLU-1adh, H1299, Ca Ski, Hela and SiHa cells treated for 24 hours with either DMSO or indicated concentrations of AZ1. VINCULIN served as loading controlLUDLU-1ADH, H1299, Ca Ski, Hela and SiHa cells were seeded at equal cell density and cultured in the presence of either DMSO, 1µM, 10µM or 30µM AZ1 for 48h. Scale bar for LUDLU-1adh and H1299 = 500µm. Scale bar for Ca Ski, Hela and SiHa = 250µm. SiHa* = Notably, the human SCC cell line SiHa was negative for ΔNp63. Number of cells were quantified with the Operetta imaging system using Hoechst staining. 50% growth inhibition (GI50) was calculated. n=30 fields analysed"}
{"words": ["Figure", "8Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "against", "endogenous", "∆", "Np63", "in", "KP", "and", "KPL", "cell", "lines", "(", "blue", ":", "DAPI", "[", "staining", "of", "nuclei", "]", "and", "red", "/", "magenta", ":", "∆", "Np63", ")", ",", "Scale", "bar", "=", "32µm", ".", "GFP", "Fluorescent", "images", "of", "lungs", "treated", "with", "either", "PBS", "/", "DMSO", "/", "0", ",", "1", "%", "Tween80", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", ".", "Tumour", "cells", "are", "positive", "for", "GFP", "(", "green", "arrows", ")", ".", "n", "=", "3", "Quantification", "of", "%", "tumour", "area", "(", "normalised", "to", "total", "lung", "area", ")", "in", "control", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "125", "mg", "/", "kg", "AZ1", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "375", "mg", "/", "kg", "AZ1", "(", "n", "=", "4", ")", "treated", "animals", ".", "Representative", "staining", "of", "H", "&", "E", "and", "IHC", "for", "USP28", "and", "∆", "Np63", "of", "SCC", "tumours", "from", "mice", "treated", "with", "PBS", "/", "DMSO", "/", "0", ",", "1", "%", "Tween80", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", ".", "Boxes", "indicate", "highlighted", "tumour", "areas", ".", "First", "line", "Scale", "bars", "=", "500µm", ";", "Lower", "scale", "bars", "=", "20µm", ".", "n", "=", "3", "∆", "Np63", "staining", "intensity", "of", "lung", "tumours", "treated", "with", "PBS", "/", "DMSO", "/", "0", ",", "1", "%", "Tween80", "or", "indicated", "concentrations", "of", "AZ1", ".", "nControl", "=", "33712", "cells", ";", "nAZ1", "125mg", "/", "kg", "=", "7382", "cells", ";", "nAZ1", "375mg", "/", "kg", "=", "4967", "cells", ".", "Cells", "were", "analysed", "from", "three", "independent", "animals", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Immunofluorescence (IF) staining against endogenous ∆Np63 in KP and KPL cell lines (blue: DAPI [staining of nuclei] and red/magenta: ∆Np63), Scale bar = 32µm.GFP Fluorescent images of lungs treated with either PBS/DMSO/0,1% Tween80 or indicated concentrations of AZ1. Tumour cells are positive for GFP (green arrows). n=3 Quantification of % tumour area (normalised to total lung area) in control (n=5), 125 mg/kg AZ1 (n=4) and 375 mg/kg AZ1 (n=4) treated animals.Representative staining of H&E and IHC for USP28 and ∆Np63 of SCC tumours from mice treated with PBS/DMSO/0,1% Tween80 or indicated concentrations of AZ1. Boxes indicate highlighted tumour areas. First line Scale bars = 500µm; Lower scale bars = 20µm. n=3   ∆Np63 staining intensity of lung tumours treated with PBS/DMSO/0,1%Tween80 or indicated concentrations of AZ1. nControl = 33712 cells ; nAZ1 125mg/kg = 7382 cells; nAZ1 375mg/kg = 4967 cells. Cells were analysed from three independent animals.   "}
{"words": ["Figure", "1A", "Western", "blot", "analysis", "STAT", "expression", "and", "phosphorylation", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "/", "+", "(", "WT", "/", "YF", ")", "or", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "or", "5", "ng", "/", "mL", "of", "IFNγ", "for", "0", ".", "5", ",", "6", ",", "12", "and", "24", "h", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "collected", "and", "tested", "in", "western", "blot", "for", "levels", "of", "phosphorylation", "of", "STAT1", "(", "Y701", ")", "and", "STAT2", "(", "Y689", ")", "and", "total", "level", "of", "STAT1", "and", "STAT2", ".", "The", "blots", "are", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", ".", "B", "Effect", "of", "STAT1Y701Fheterozygosity", "on", "the", "expression", "of", "type", "I", "IFN", "-", "induced", "genes", "(", "ISG", ")", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "/", "+", "(", "WT", "/", "YF", ")", "or", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "4", "and", "48", "h", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "Gapdh", "and", "to", "the", "expression", "levels", "in", "untreated", "wild", "type", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "mean", "values", "with", "the", "standard", "deviations", "(", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "Effect", "of", "STAT1Y701Fheterozygosity", "on", "the", "expression", "of", "IFNγ", "-", "induced", "genes", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "/", "+", "(", "WT", "/", "YF", ")", "or", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "treated", "with", "5", "ng", "/", "mL", "of", "IFNγ", "for", "4", "and", "48", "h", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "Gapdh", "and", "to", "the", "expression", "levels", "in", "untreated", "wild", "type", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "mean", "values", "with", "the", "standard", "deviations", "(", "SD", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Western blot analysis STAT expression and phosphorylation. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F/+ (WT/YF) or Stat1-/- (S1) mice were treated with 250 IU/mL of IFNβ or 5 ng/mL of IFNγ for 0.5, 6, 12 and 24 h. Whole cell extracts were collected and tested in western blot for levels of phosphorylation of STAT1 (Y701) and STAT2 (Y689) and total level of STAT1 and STAT2. The blots are representative of more than 3 independent experiments.B Effect of STAT1Y701Fheterozygosity on the expression of type I IFN-induced genes (ISG). BMDMs of wild type (WT), Stat1Y701F/+ (WT/YF) or Stat1-/- (S1) mice were treated with 250 IU/mL of IFNβ for 4 and 48 h. Gene expression was measured by Q-PCR and normalized to Gapdh and to the expression levels in untreated wild type cells. The bars represent mean values with the standard deviations (SD) of three independent experiments.C Effect of STAT1Y701Fheterozygosity on the expression of IFNγ-induced genes. BMDMs of wild type (WT), Stat1Y701F/+ (WT/YF) or Stat1-/- (S1) mice were treated with 5 ng/mL of IFNγ for 4 and 48 h. Gene expression was measured by Q-PCR and normalized to Gapdh and to the expression levels in untreated wild type cells. The bars represent mean values with the standard deviations (SD) of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2A", "Effect", "of", "STAT1Y701F", "homozygosity", "on", "STAT1", "expression", "in", "mouse", "cells", "and", "organs", ".", "Spleens", ",", "livers", "or", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "were", "isolated", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "collected", "and", "tested", "for", "levels", "of", "total", "Stat1", "in", "western", "blot", ".", "The", "blots", "are", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", ".", "B", "Effect", "of", "STAT1Y701F", "homozygosity", "on", "STAT1", "phosphorylation", "at", "Y701", ".", "BMDMs", "were", "isolated", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "and", "stimulated", "for", "30", "min", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "or", "5", "ng", "/", "mL", "of", "IFNγ", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "collected", "and", "tested", "for", "levels", "of", "STAT1", "phosphorylation", "on", "Y701", "in", "western", "blot", ".", "The", "blots", "are", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", ".", "C", "Effect", "of", "STAT1Y701Fhomozygosity", "on", "the", "expression", "of", "IFNβ", "-", "induced", "genes", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "treated", "with", "5", "ng", "/", "mL", "of", "IFNγ", "for", "4", "or", "48", "h", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "Gapdh", "and", "to", "the", "expression", "levels", "in", "untreated", "wild", "type", "cells", ".", "Bars", "represent", "a", "mean", "value", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "asterisks", "denote", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ";", "the", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "ratio", "t", "-", "test", ".", "D", "Effect", "of", "STAT1Y701Fhomozygosity", "on", "the", "expression", "of", "type", "I", "IFN", "-", "induced", "genes", "(", "ISG", ")", ".", "BMDMs", "were", "isolated", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", ",", "Stat1", "-", "/", "-", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "and", "IRF9", "-", "/", "-", "mice", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "4", ",", "8", ",", "12", ",", "24", "or", "48", "h", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "Gapdh", "and", "to", "the", "expression", "levels", "in", "untreated", "wild", "type", "cells", ".", "Bars", "represent", "a", "mean", "value", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "asterisks", "denote", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", ";", "the", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "ratio", "t", "-", "test", ".", "E", "STAT1", "and", "STAT2", "phosphorylation", "in", "Stat1", "-", "/", "-", ",", "Stat1Y701F", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "and", "Irf9", "-", "/", "-", "macrophages", ".", "BMDMs", "were", "isolated", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "(", "S2", ")", "and", "IRF9", "-", "/", "-", "(", "IRF9", ")", "mice", "and", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "30", "min", "or", "6", ",", "12", "or", "24", "h", ".", "The", "whole", "cell", "extracts", "were", "collected", "and", "tested", "in", "western", "blot", "for", "levels", "of", "phosphorylation", "of", "STAT1", "on", "Y701", "and", "of", "STAT2", "on", "Y689", ".", "The", "same", "cell", "extracts", "were", "tested", "for", "total", "levels", "of", "STAT1", "and", "STAT2", ".", "The", "blots", "are", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Effect of STAT1Y701F homozygosity on STAT1 expression in mouse cells and organs. Spleens, livers or bone marrow derived macrophages (BMDMs) were isolated from wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice. Whole cell extracts were collected and tested for levels of total Stat1 in western blot. The blots are representative of more than 3 independent experiments.B Effect of STAT1Y701F homozygosity on STAT1 phosphorylation at Y701. BMDMs were isolated from wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice and stimulated for 30 min with 250 IU/mL of IFNβ or 5 ng/mL of IFNγ. Whole cell extracts were collected and tested for levels of STAT1 phosphorylation on Y701 in western blot. The blots are representative of more than 3 independent experiments.C Effect of STAT1Y701Fhomozygosity on the expression of IFNβ-induced genes. BMDMs of wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice were treated with 5 ng/mL of IFNγ for 4 or 48 h. Gene expression was measured by Q-PCR and normalized to Gapdh and to the expression levels in untreated wild type cells. Bars represent a mean value of 3 independent experiments. Error bars represent standard error of the mean (SEM); asterisks denote the level of statistical significance (ns, p>0.05); the p-values were calculated using paired ratio t-test.D Effect of STAT1Y701Fhomozygosity on the expression of type I IFN-induced genes (ISG). BMDMs were isolated from wild type (WT), Stat1Y701F, Stat1-/-, Stat2-/- and IRF9-/- mice treated with 250 IU/mL of IFNβ for 4, 8, 12, 24 or 48 h. Gene expression was measured by Q-PCR and normalized to Gapdh and to the expression levels in untreated wild type cells. Bars represent a mean value of 3 independent experiments. Error bars represent standard error of the mean (SEM); asterisks denote the level of statistical significance (ns, p>0.05; *, p≤ 0.05; **, p≤ 0.01); the p-values were calculated using paired ratio t-test.E STAT1 and STAT2 phosphorylation in Stat1-/-, Stat1Y701F, Stat2-/- and Irf9-/- macrophages. BMDMs were isolated from wild type (WT), Stat1Y701F (YF), Stat1-/- (S1), Stat2-/- (S2) and IRF9-/- (IRF9) mice and treated with 250 IU/mL of IFNβ for 30 min or 6, 12 or 24 h. The whole cell extracts were collected and tested in western blot for levels of phosphorylation of STAT1 on Y701 and of STAT2 on Y689. The same cell extracts were tested for total levels of STAT1 and STAT2. The blots are representative of more than 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", "IFNβ", "-", "stimulated", "binding", "of", "STAT2", "to", "ISRE", "sequences", "of", "Mx2", "and", "IRF7", "promoters", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "(", "S2", ")", "and", "IRF9", "-", "/", "-", "(", "IRF9", ")", "mice", "were", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "2", "or", "24", "h", ".", "Cells", "were", "crosslinked", ",", "sonicated", "and", "immunoprecipitated", "with", "STAT2", "-", "specific", "antibody", ".", "The", "amount", "of", "precipitated", "DNA", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Bars", "represent", "a", "mean", "value", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "asterisks", "denote", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", ";", "the", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "ratio", "t", "-", "test", ".", "B", "Impact", "of", "STAT2", "deficiency", "on", "IFNβ", "-", "stimulated", "STAT1", "association", "with", "the", "Mx2", "ISRE", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "and", "Stat2", "-", "/", "-", "(", "S2", ")", "mice", "were", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "2", "or", "24", "h", ".", "Cells", "were", "crosslinked", ",", "sonicated", "and", "immunoprecipitated", "with", "STAT1", "-", "specific", "antibody", ".", "The", "amount", "of", "precipitated", "DNA", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "C", "Simultaneous", "association", "of", "STAT1", "and", "STAT2", "with", "the", "Mx2", "ISRE", "analyzed", "by", "ChIP", "-", "reChIP", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "mice", "were", "treated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "2", "or", "24", "h", ".", "Cells", "were", "crosslinked", ",", "sonicated", "and", "immunoprecipitated", "with", "either", "STAT1", "-", "specific", "antibody", "and", "re", "-", "immunoprecipitated", "with", "STAT2", "-", "specific", "antibody", "or", "vice", "versa", ".", "The", "amount", "of", "precipitated", "DNA", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "D", "Impact", "of", "STAT1Y701F", "on", "delayed", ",", "STAT2", "-", "mediated", "expression", "of", "IFN", "-", "induced", "genes", ".", "Stat1", "-", "/", "-", "fibroblasts", "were", "transfected", "with", "plasmids", "driving", "expression", "of", "the", "indicated", "proteins", ".", "24", "h", "after", "transfection", ",", "250", "IU", "/", "ml", "of", "IFNβ", "was", "added", "to", "the", "transfected", "cells", "and", "ISG", "expression", "was", "determined", "by", "Q", "-", "PCR", "after", "48h", "of", "cytokine", "treatment", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "Q", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "Gapdh", ".", "Bars", "represent", "a", "mean", "value", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "and", "asterisks", "denote", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ")", ";", "the", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "ratio", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A IFNβ-stimulated binding of STAT2 to ISRE sequences of Mx2 and IRF7 promoters. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F (YF), Stat1-/- (S1), Stat2-/- (S2) and IRF9-/- (IRF9) mice were treated with 250 IU/mL of IFNβ for 2 or 24 h. Cells were crosslinked, sonicated and immunoprecipitated with STAT2-specific antibody. The amount of precipitated DNA was measured by Q-PCR. Bars represent a mean value of 3 independent experiments. Error bars represent standard error of the mean (SEM); asterisks denote the level of statistical significance (**, p≤ 0.01); the p-values were calculated using paired ratio t-test.B Impact of STAT2 deficiency on IFNβ -stimulated STAT1 association with the Mx2 ISRE. BMDMs of wild type (WT), Stat1-/- (S1) and Stat2-/- (S2) mice were treated with 250 IU/mL of IFNβ for 2 or 24 h. Cells were crosslinked, sonicated and immunoprecipitated with STAT1-specific antibody. The amount of precipitated DNA was measured by Q-PCR. Bars represent mean values of three independent experiments; error bars represent standard error of mean (SEM).C Simultaneous association of STAT1 and STAT2 with the Mx2 ISRE analyzed by ChIP-reChIP. BMDMs of wild type (WT) mice were treated with 250 IU/mL of IFNβ for 2 or 24 h. Cells were crosslinked, sonicated and immunoprecipitated with either STAT1-specific antibody and re-immunoprecipitated with STAT2-specific antibody or vice versa. The amount of precipitated DNA was measured by Q-PCR. Bars represent mean values of three independent experiments; error bars represent standard deviation (SD).D Impact of STAT1Y701F on delayed, STAT2-mediated expression of IFN-induced genes. Stat1-/- fibroblasts were transfected with plasmids driving expression of the indicated proteins. 24 h after transfection, 250 IU/ml of IFNβ was added to the transfected cells and ISG expression was determined by Q-PCR after 48h of cytokine treatment. Gene expression was measured by Q-PCR and normalized to Gapdh. Bars represent a mean value of 3 independent experiments. Error bars represent standard error of the mean (SEM) and asterisks denote the level of statistical significance (*, p≤ 0.05); the p-values were calculated using paired ratio t-test."}
{"words": ["Figure", "4A", "Analysis", "of", "STAT2", "nuclear", "translocation", "by", "immunofluorescence", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "(", "S2", ")", "and", "IRF9", "-", "/", "-", "(", "IRF9", ")", "mice", "were", "seeded", "on", "cover", "slips", "and", "stimulated", "with", "250", "IU", "/", "mL", "of", "IFNβ", "for", "30", "min", "or", "24", "h", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "STAT2", "specific", "antibody", "followed", "by", "Alexafluor", "®", "488", "conjugated", "secondary", "antibody", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Studies", "are", "representative", "of", "more", "than", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "µm", ".", "B", "Quantitative", "evaluation", "of", "STAT2nuclear", "translocation", ".", "The", "intensity", "of", "STAT2", "-", "dependent", "immunofluorescence", "over", "DNA", "staining", "(", "DAPI", ")", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", "in", "20", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Bars", "represent", "a", "mean", "with", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "and", "asterisks", "denote", "the", "level", "of", "statistical", "significance", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ";", "p", "-", "value", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Analysis of STAT2 nuclear translocation by immunofluorescence. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F (YF), Stat1-/- (S1), Stat2-/- (S2) and IRF9-/- (IRF9) mice were seeded on cover slips and stimulated with 250 IU/mL of IFNβ for 30 min or 24 h. The cells were fixed and stained for STAT2 specific antibody followed by Alexafluor® 488 conjugated secondary antibody (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Studies are representative of more than three independent experiments. The scale bars represent 10 µm.B Quantitative evaluation of STAT2nuclear translocation. The intensity of STAT2-dependent immunofluorescence over DNA staining (DAPI) was quantified using ImageJ software in 20 cells from two independent experiments. Bars represent a mean with standard deviation (SD) and asterisks denote the level of statistical significance (***, p≤ 0.001); p-value was calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "5A", "Legionella", "pneumophila", "growth", "in", "unstimulated", "macrophages", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "mice", "were", "seeded", "on", "in", "the", "24", "-", "well", "plates", "and", "infected", "with", "L", ".", "pneumophila", "(", "JR32", "Fla", "-", ",", "MOI", "0", ".", "25", ")", ".", "The", "numbers", "of", "colony", "forming", "units", "(", "CFUs", ")", "were", "determined", "24", "h", ",", "48", "h", "and", "72", "h", "after", "infection", "on", "charcoal", "yeast", "extract", "plates", "(", "CYE", ")", ".", "The", "0", "time", "point", "was", "collected", "1", ".", "5", "h", "after", "the", "infection", ".", "B", "Legionella", "pneumophila", "growth", "in", "IFNβ", "-", "treated", "macrophages", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", ",", "Stat1", "-", "/", "-", "mice", "were", "seeded", "in", "24", "-", "well", "plates", ",", "treated", "with", "500", "U", "/", "mL", "of", "IFNβ", "and", "then", "infected", "with", "L", ".", "pneumophila", "(", "JR32", "Fla", "-", ",", "MOI", "0", ".", "25", ")", ".", "The", "numbers", "of", "colony", "forming", "units", "(", "CFUs", ")", "were", "determined", "24", "h", ",", "48", "h", "and", "72", "h", "after", "infection", "on", "charcoal", "yeast", "extract", "plates", "(", "CYE", ")", ".", "The", "0", "time", "point", "was", "collected", "1", ".", "5", "h", "after", "the", "infection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Legionella pneumophila growth in unstimulated macrophages. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F, Stat1-/- mice were seeded on in the 24-well plates and infected with L. pneumophila (JR32 Fla-, MOI 0.25). The numbers of colony forming units (CFUs) were determined 24 h, 48 h and 72 h after infection on charcoal yeast extract plates (CYE). The 0 time point was collected 1.5 h after the infection.B Legionella pneumophila growth in IFNβ-treated macrophages. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F, Stat1-/- mice were seeded in 24-well plates, treated with 500 U/mL of IFNβ and then infected with L. pneumophila (JR32 Fla-, MOI 0.25). The numbers of colony forming units (CFUs) were determined 24 h, 48 h and 72 h after infection on charcoal yeast extract plates (CYE). The 0 time point was collected 1.5 h after the infection."}
{"words": ["Figure", "6A", "Western", "blot", "analysis", "of", "STAT1", "tyrosine", "phosphorylation", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "(", "LO28", ",", "MOI", "10", ")", "for", "5", "or", "6", "h", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "collected", "and", "tested", "in", "western", "blot", "for", "levels", "of", "total", "STAT1", "and", "phosphorylation", "of", "STAT1", "on", "tyrosine", "(", "Y701", ")", ".", "The", "blots", "are", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", ".", "B", "Impact", "of", "Stat1Y701F", "mutation", ",", "or", "of", "deletion", "of", "ISGF3", "subunits", "on", "the", "expression", "of", "the", "IFNβ", "gene", ".", "BMDMs", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", ",", "Stat1", "-", "/", "-", ",", "Stat2", "-", "/", "-", "and", "IRF9", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "(", "LO28", ",", "MOI", "10", ")", "for", "4", ",", "8", ",", "12", ",", "24", "or", "48", "h", ".", "Levels", "of", "Ifnβ", "gene", "expression", "were", "determined", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Western blot analysis of STAT1 tyrosine phosphorylation. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice were infected with L. monocytogenes (LO28, MOI 10) for 5 or 6 h. Whole cell extracts were collected and tested in western blot for levels of total STAT1 and phosphorylation of STAT1 on tyrosine (Y701). The blots are representative of more than 3 independent experiments.B Impact of Stat1Y701F mutation, or of deletion of ISGF3 subunits on the expression of the IFNβ gene. BMDMs of wild type (WT), Stat1Y701F, Stat1-/-, Stat2-/- and IRF9-/- mice were infected with L. monocytogenes (LO28, MOI 10) for 4, 8, 12, 24 or 48 h. Levels of Ifnβ gene expression were determined by Q-PCR. Bars represent mean values of three independent experiments. Error bars represent standard error of mean (SEM)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Impact", "of", "Stat1", "deficiency", "or", "of", "STAT1Y701F", "mutation", "on", "the", "growth", "of", "Listeria", "monocytogenes", "in", "macrophages", ".", "Bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "(", "LO28", ",", "MOI", "10", ")", ".", "Colony", "forming", "unit", "(", "CFU", ")", "numbers", "were", "determined", "1", ",", "2", ",", "4", ",", "6", "or", "8", "h", "after", "infection", "by", "plating", "on", "brain", "-", "heart", "-", "infusion", "(", "BHI", ")", "agar", "plates", ".", "The", "graph", "represents", "biological", "triplicates", "and", "the", "data", "are", "represented", "as", "mean", "values", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "and", "asterisks", "denote", "statistically", "significant", "differences", "(", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ";", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "B", "Survival", "of", "mice", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", ".", "10", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "mice", "per", "group", "were", "infected", "by", "intraperitoneal", "injection", "of", "1x", "102", "viable", "L", ".", "monocytogenes", ".", "Survival", "was", "monitored", "over", "10", "days", ".", "The", "study", "is", "representative", "of", "more", "than", "3", "independent", "experiments", ".", "C", "Organ", "pathogen", "burdens", "of", "mice", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "infected", "by", "intraperitoneal", "injection", "of", "1x", "102", "viable", "L", ".", "monocytogenes", ".", "Number", "of", "colony", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "in", "organs", "was", "determined", "at", "48", "h", ",", "72", "h", "or", "at", "the", "terminal", "stage", "of", "infection", "by", "plating", "homogenates", "on", "brain", "-", "heart", "-", "infusion", "(", "BHI", ")", "agar", "plates", "or", "Oxford", "agar", "plates", "(", "for", "lungs", ")", ".", "Dots", "represent", "pooled", "data", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Lines", "represent", "the", "median", "and", "asterisks", "denote", "statistically", "significant", "differences", "(", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ";", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Impact of Stat1 deficiency or of STAT1Y701F mutation on the growth of Listeria monocytogenes in macrophages. Bone marrow derived macrophages (BMDMs) of wild type (WT), Stat1Y701F and Stat1-/- mice were infected with L. monocytogenes (LO28, MOI 10). Colony forming unit (CFU) numbers were determined 1, 2, 4, 6 or 8 h after infection by plating on brain-heart-infusion (BHI) agar plates. The graph represents biological triplicates and the data are represented as mean values. Error bars represent standard deviation (SD) and asterisks denote statistically significant differences (ns, p>0.05; **, p≤0.01; ***, p≤ 0.001); p-values were calculated using unpaired t-test.B Survival of mice infected with L. monocytogenes. 10 wild type (WT), Stat1Y701F and Stat1-/- mice per group were infected by intraperitoneal injection of 1x 102 viable L. monocytogenes. Survival was monitored over 10 days. The study is representative of more than 3 independent experiments.C Organ pathogen burdens of mice infected with L. monocytogenes. Wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice were infected by intraperitoneal injection of 1x 102 viable L. monocytogenes. Number of colony forming units (CFU) in organs was determined at 48 h, 72 h or at the terminal stage of infection by plating homogenates on brain-heart-infusion (BHI) agar plates or Oxford agar plates (for lungs). Dots represent pooled data of 3 independent experiments. Lines represent the median and asterisks denote statistically significant differences (ns, p>0.05; *, p≤ 0.05; **, p≤ 0.01; ***, p≤ 0.001; ****, p≤ 0.0001); p-values were calculated using Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "8A", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "infection", "and", "inflammatory", "infiltrates", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "mice", "were", "infected", "by", "intraperitoneal", "injection", "of", "1x102", "viable", "L", ".", "monocytogenes", "for", "48", "h", ".", "Liver", "sections", "were", "examined", "by", "immunohistochemistry", "with", "L", ".", "monocytogenes", "or", "Ly6C", "/", "Ly6G", "specific", "antibody", ".", "The", "scale", "bars", "on", "20x", "magnification", "images", "represent", "100", "µm", "and", "50", "µm", "on", "the", "63x", "magnification", "images", ".", "B", "Quantitative", "evaluation", "of", "inflammatory", "infiltrates", ".", "Infiltrates", "representing", "the", "entire", "surface", "of", "sections", "from", "five", "animals", "per", "genotype", "were", "counted", "and", "categorized", "according", "to", "their", "size", ".", "C", "Liver", "pathology", "in", "infected", "mice", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Stat1Y701F", "(", "YF", ")", "and", "Stat1", "-", "/", "-", "(", "S1", ")", "mice", "were", "infected", "by", "intraperitoneal", "injection", "of", "1x105", "viable", "L", ".", "monocytogenes", "for", "72", "h", ".", "Serum", "was", "collected", "and", "tested", "for", "ALT", "activity", ".", "Lines", "represent", "the", "median", "and", "asterisks", "denote", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ";", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Immunohistochemical analysis of infection and inflammatory infiltrates. Wild type (WT), Stat1Y701F and Stat1-/- mice were infected by intraperitoneal injection of 1x102 viable L. monocytogenes for 48 h. Liver sections were examined by immunohistochemistry with L. monocytogenes or Ly6C/Ly6G specific antibody. The scale bars on 20x magnification images represent 100 µm and 50 µm on the 63x magnification images.B Quantitative evaluation of inflammatory infiltrates. Infiltrates representing the entire surface of sections from five animals per genotype were counted and categorized according to their size.C Liver pathology in infected mice. Wild type (WT), Stat1Y701F (YF) and Stat1-/- (S1) mice were infected by intraperitoneal injection of 1x105 viable L. monocytogenes for 72 h. Serum was collected and tested for ALT activity. Lines represent the median and asterisks denote statistically significant differences (*, p≤ 0.05; ***, p≤ 0.001); p-values were calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Downstream", "polarization", "of", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "in", "endothelial", "cells", "in", "the", "thoracic", "aorta", ".", "Blood", "flow", ":", "left", "to", "right", ".", "VE", "-", "cadherin", ",", "green", ".", "(", "C", ")", "Higher", "magnification", "views", "of", "a", "region", "similar", "to", "B", ",", "showing", "variability", "of", "VE", "-", "PTP", "polarization", "ranging", "from", "conspicuous", "(", "upper", ")", "to", "subtle", "(", "lower", ")", ".", "Nuclei", ",", "blue", "(", "lamin", "A", "/", "C", ")", ".", "(", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "of", "proportions", "of", "VE", "-", "PTP", "staining", "in", "upstream", "and", "downstream", "halves", "of", "endothelial", "cells", "in", "thoracic", "aorta", "of", "wild", "-", "type", "mouse", ".", "Each", "dot", "is", "one", "endothelial", "cell", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "15", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Downstream polarization of VE-PTP (red) in endothelial cells in the thoracic aorta. Blood flow: left to right. VE-cadherin, green. (C) Higher magnification views of a region similar to B, showing variability of VE-PTP polarization ranging from conspicuous (upper) to subtle (lower). Nuclei, blue (lamin A/C). ((D) Dot plot of proportions of VE-PTP staining in upstream and downstream halves of endothelial cells in thoracic aorta of wild-type mouse. Each dot is one endothelial cell. Mean ± SEM, n = 15 cells."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "VE", "-", "PTP", "internalization", "in", "HUVEC", "into", "EEA1", "endosomes", "(", "arrowheads", ")", "under", "static", "conditions", "and", "laminar", "flow", "of", "15", "dyn", "/", "cm2", "of", "shear", "force", "for", "5", ",", "10", ",", "and", "30", "min", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "VE", "-", "PTP", "staining", "signals", "of", "images", "shown", "in", "C", ",", "which", "co", "-", "localize", "with", "EEA1", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "10", "pooled", "in", "3", "independent", "experiments", "(", "(", "E", ")", "HUVEC", "exposed", "to", "same", "conditions", "as", "in", "C", ",", "followed", "by", "fixation", "with", "(", "upper", "row", ")", "or", "without", "(", "lower", "row", ")", "permeabilization", "with", "0", ".", "3", "%", "Triton", "X", "-", "100", ",", "and", "staining", "for", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ",", "Hoechst", "33342", ")", ".", "(", "F", ")", "VE", "-", "PTP", "on", "cell", "surface", "measured", "by", "cell", "-", "based", "ELISA", "assay", "of", "HUVEC", "after", "exposure", "as", "in", "C", "and", "D", ".", "Red", "and", "black", "lines", "show", "measurements", "with", "anti", "-", "VE", "-", "PTP", "antibody", "and", "isotype", "control", "antibody", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "independent", "experiments", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) VE-PTP internalization in HUVEC into EEA1 endosomes (arrowheads) under static conditions and laminar flow of 15 dyn/cm2 of shear force for 5, 10, and 30 min. (D) Quantification of VE-PTP staining signals of images shown in C, which co-localize with EEA1. Mean ± SEM, n= 10 pooled in 3 independent experiments ((E) HUVEC exposed to same conditions as in C, followed by fixation with (upper row) or without (lower row) permeabilization with 0.3% Triton X-100, and staining for VE-PTP (red) and nuclei (blue, Hoechst 33342). (F) VE-PTP on cell surface measured by cell-based ELISA assay of HUVEC after exposure as in C and D. Red and black lines show measurements with anti-VE-PTP antibody and isotype control antibody. Mean ± SEM, n = 6 independent experiments/group. D"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", "-", "D", ")", "Strong", "Tie2", "-", "pY992", "(", "green", ")", "staining", "at", "cell", "borders", "and", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ")", "downstream", "polarization", "in", "outer", "curvature", "in", "C", "in", "contrast", "to", "weak", ",", "dispersed", "staining", "for", "Tie2", "-", "pY992", "and", "VE", "-", "PTP", "in", "inner", "curvature", "in", "D", "of", "aortic", "arch", "of", "wild", "-", "type", "mouse", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Tie2", "-", "pY992", "(", "green", ")", "at", "endothelial", "junctions", "marked", "by", "VE", "-", "cadherin", "(", "red", ")", ".", "(", "E", ")", "Contrasting", "patterns", "and", "intensity", "of", "Tie2", "-", "pY992", "in", "outer", "and", "inner", "curvatures", ".", "(", "F", ")", "Tie2", "-", "pY992", "mean", "fluorescence", "intensity", "at", "junctions", "(", "normalized", "to", "outer", "curvature", "=", "1", ".", "0", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C-D) Strong Tie2-pY992 (green) staining at cell borders and VE-PTP (red) downstream polarization in outer curvature in C in contrast to weak, dispersed staining for Tie2-pY992 and VE-PTP in inner curvature in D of aortic arch of wild-type mouse.(E-F) Tie2-pY992 (green) at endothelial junctions marked by VE-cadherin (red). (E) Contrasting patterns and intensity of Tie2-pY992 in outer and inner curvatures. (F) Tie2-pY992 mean fluorescence intensity at junctions (normalized to outer curvature = 1.0). Mean ± SEM, n = 6 mice/group."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Comparison", "of", "distribution", "of", "fluorescence", "intensities", "of", "extravasated", "antibody", "showing", "significantly", "stronger", "fluorescence", "due", "to", "greater", "leakage", "in", "inner", "curvature", ".", "(", "F", ")", "Mean", "fluorescence", "intensity", "value", "for", "each", "mouse", "in", "the", "two", "groups", "shown", "in", "E", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "7", "mice", "/", "group", ".", "(", "(", "G", ")", "Localized", "distribution", "of", "intense", "leakage", "(", "red", ")", "around", "ostium", "of", "an", "intercostal", "artery", "(", "arrow", ")", ".", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ".", "(", "H", ")", "Opposite", "distributions", "of", "extravasation", "and", "VE", "-", "PTP", "polarization", "in", "endothelial", "cells", "in", "thoracic", "aorta", ".", "Left", "and", "right", "panels", "are", "the", "same", "image", "with", "colors", "switched", "to", "highlight", "leakage", "(", "red", ")", "and", "polarized", "VE", "-", "PTP", "(", "green", ",", "arrowheads", ")", "on", "the", "left", ",", "and", "polarized", "VE", "-", "PTP", "(", "red", ",", "arrowheads", ")", ",", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ",", "and", "leakage", "(", "blue", ")", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Comparison of distribution of fluorescence intensities of extravasated antibody showing significantly stronger fluorescence due to greater leakage in inner curvature. (F) Mean fluorescence intensity value for each mouse in the two groups shown in E. Mean ± SEM, n = 7 mice/group. ((G) Localized distribution of intense leakage (red) around ostium of an intercostal artery (arrow). VE-cadherin (green). (H) Opposite distributions of extravasation and VE-PTP polarization in endothelial cells in thoracic aorta. Left and right panels are the same image with colors switched to highlight leakage (red) and polarized VE-PTP (green, arrowheads) on the left, and polarized VE-PTP (red, arrowheads), VE-cadherin (green), and leakage (blue) on the right. D"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Measurements", "of", "Tie2", "-", "pY992", "staining", "intensity", "at", "intercellular", "junctions", "in", "aortic", "arch", "endothelial", "cells", "showing", "lower", "values", "in", "the", "inner", "curvature", "than", "in", "the", "upper", "curvature", "of", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "but", "equally", "high", "values", "in", "both", "regions", "of", "VE", "-", "PTPiECKO", "mice", ".", "Normalized", "to", "mean", "value", "for", "outer", "curvature", "of", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "scaled", "to", "1", ".", "0", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ".", "(", "C", ")", "HUVEC", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "VE", "-", "PTP", "siRNA", "and", "exposed", "to", "static", "or", "laminar", "shear", "force", "at", "15", "dyn", "/", "cm2", "for", "30", "min", ",", "followed", "by", "immunoprecipitation", "of", "Tie2", ".", "Left", ".", "Blot", "showing", "immunoprecipitates", "(", "top", ")", "or", "cell", "lysates", "(", "bottom", ")", "immunoblotted", "for", "pan", "-", "phosphotyrosine", "(", "antibody", "4G10", ")", ",", "Tie2", ",", "or", "VE", "-", "PTP", ".", "Ratio", "of", "staining", "for", "phosphorylated", "Tie2", "and", "total", "Tie2", "(", "Tie2", "-", "pY", "to", "Tie2", ",", "n", "=", "4", "experiments", ")", ".", "Right", ".", "Relative", "Tie2", "-", "pY", "levels", "in", "HUVEC", "after", "control", "siRNA", "or", "VE", "-", "PTP", "siRNA", ".", "Normalized", "to", "static", "control", "=", "1", ".", "(", "D", ")", "Effect", "of", "shear", "stress", "on", "the", "phosphorylation", "levels", "of", "Tie2", "Y992", "at", "cellular", "junctions", ".", "HUVECs", "treated", "with", "either", "control", "siRNA", "(", "left", ")", "or", "Tie2", "siRNA", "(", "right", ")", ",", "were", "exposed", "to", "15", "dyn", "/", "cm2", "shear", "stress", "for", "5", "min", ".", "The", "resulting", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "Tie2", "-", "pY992", "(", "red", ")", "and", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Measurements of Tie2-pY992 staining intensity at intercellular junctions in aortic arch endothelial cells showing lower values in the inner curvature than in the upper curvature of VE-PTPfl/fl mice but equally high values in both regions of VE-PTPiECKO mice. Normalized to mean value for outer curvature of VE-PTPfl/fl mice scaled to 1.0. Mean ± SEM, n = 6 mice/group.(C) HUVEC transfected with control siRNA or VE-PTP siRNA and exposed to static or laminar shear force at 15 dyn/cm2 for 30 min, followed by immunoprecipitation of Tie2. Left. Blot showing immunoprecipitates (top) or cell lysates (bottom) immunoblotted for pan-phosphotyrosine (antibody 4G10), Tie2, or VE-PTP. Ratio of staining for phosphorylated Tie2 and total Tie2 (Tie2-pY to Tie2, n = 4 experiments). Right. Relative Tie2-pY levels in HUVEC after control siRNA or VE-PTP siRNA. Normalized to static control = 1.(D) Effect of shear stress on the phosphorylation levels of Tie2 Y992 at cellular junctions. HUVECs treated with either control siRNA (left) or Tie2 siRNA (right), were exposed to 15 dyn/cm2 shear stress for 5 min. The resulting cells were fixed and stained for Tie2-pY992 (red) and VE-cadherin (green)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "HUVECs", "cultured", "on", "biotinylated", "gelatin", "were", "treated", "either", "with", "control", "siRNA", ",", "VE", "-", "PTP", "siRNA", ",", "Tie2", "siRNA", "or", "VE", "-", "cadherin", "siRNA", ",", "then", "exposed", "to", "15", "dyn", "/", "cm2", "shear", "stress", "for", "30", "minutes", "followed", "by", "3", "min", "incubation", "with", "Streptavidin", "-", "Alexa647", "(", "red", ")", ",", "washing", ",", "fixation", "and", "staining", "for", "VE", "-", "cadherin", "(", "green", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Quantification", "of", "Streptavidin", "leakage", "area", "per", "image", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "19", "pooled", "in", "ten", "independent", "experiments", "(", "F", ")", ",", "and", "n", "=", "6", "pooled", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) HUVECs cultured on biotinylated gelatin were treated either with control siRNA, VE-PTP siRNA, Tie2 siRNA or VE-cadherin siRNA, then exposed to 15 dyn/cm2 shear stress for 30 minutes followed by 3 min incubation with Streptavidin-Alexa647 (red), washing, fixation and staining for VE-cadherin (green). (F and G) Quantification of Streptavidin leakage area per image. Mean ± SEM, n = 19 pooled in ten independent experiments (F), and n = 6 pooled in three independent experiments (G). D"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Fractional", "area", "occupied", "by", "Oil", "Red", "O", "-", "stained", "atheromas", "in", "aortic", "arch", ",", "brachiocephalic", "artery", ",", "at", "intercostal", "artery", "ostia", ",", "and", "away", "from", "ostia", ".", "Each", "dot", "is", "value", "for", "one", "mouse", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "13", "-", "18", "mice", "/", "group", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Fluorescence", "intensity", "distributions", "in", "D", "and", "mean", "intensities", "in", "E", "of", "extravasated", "anti", "-", "fibrinogen", "antibody", "in", "inner", "curvature", "of", "ApoE", "-", "/", "-", "/", "VE", "-", "PTPfl", "/", "fl", "mice", "and", "ApoE", "-", "/", "-", "/", "VE", "-", "PTPiECKO", "mice", "on", "high", "-", "fat", "diet", "for", "7", "wk", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "7", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Fractional area occupied by Oil Red O-stained atheromas in aortic arch, brachiocephalic artery, at intercostal artery ostia, and away from ostia. Each dot is value for one mouse. Mean ± SEM, n = 13-18 mice/group.(D-E) Fluorescence intensity distributions in D and mean intensities in E of extravasated anti-fibrinogen antibody in inner curvature of ApoE-/-/VE-PTPfl/fl mice and ApoE-/-/VE-PTPiECKO mice on high-fat diet for 7 wk. Mean ± SEM, n = 7 mice/group."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ")", "Measurements", "of", "Tie2", "-", "pY992", "intensity", "at", "intercellular", "junctions", "in", "aortic", "arch", "of", "mice", "shown", "in", "B", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", "mice", "/", "group", ".", "(", "E", ")", "Fractional", "area", "occupied", "by", "Oil", "Red", "O", "-", "stained", "atheromas", "in", "aortic", "arch", ",", "brachiocephalic", "artery", ",", "at", "intercostal", "artery", "ostia", ",", "and", "away", "from", "ostia", ".", "Each", "dot", "is", "value", "for", "one", "mouse", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "17", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C) Measurements of Tie2-pY992 intensity at intercellular junctions in aortic arch of mice shown in B. Mean ± SEM, n = 8 mice/group.(E) Fractional area occupied by Oil Red O-stained atheromas in aortic arch, brachiocephalic artery, at intercostal artery ostia, and away from ostia. Each dot is value for one mouse. Mean ± SEM, n = 17 mice/group."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Coronal", "section", "of", "a", "P3", "spheroid", "embedded", "with", "paraffin", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "LDHA", "(", "green", ")", ",", "and", "LDHB", "(", "red", ")", ".", "Magnification", "boxes", "show", "different", "areas", "as", "depicted", "in", "the", "main", "image", ".", "Quantification", "of", "LDHA", "and", "LDHB", "staining", "was", "performed", "on", "the", "spheroid", "areas", "as", "indicated", "in", "the", "graphs", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "5", "-", "8", "fields", "per", "area", "of", "interest", ",", "one", "representative", "spheroid", "of", "3", "independent", "invading", "spheroids", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Coronal section of a P3 spheroid embedded with paraffin and stained with DAPI (blue), LDHA (green), and LDHB (red). Magnification boxes show different areas as depicted in the main image. Quantification of LDHA and LDHB staining was performed on the spheroid areas as indicated in the graphs. Scale bar: 100 µm. Data are represented as mean ± s.d. (5-8 fields per area of interest, one representative spheroid of 3 independent invading spheroids)"}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "LDHA", "and", "LDHB", "from", "P3", "cells", "upon", "exposure", "to", "21", "%", "or", "0", ".", "1", "%", "O2", "for", "6", ",", "24", ",", "48", ",", "and", "72", "h", ".", "The", "graphs", "represent", "densitometry", "quantification", "of", "immunoblots", "normalized", "to", "tubulin", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "analyzed", "using", "One", "-", "Way", "ANOVA", "following", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ".", "LDHA", ":", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "6h", ",", "P", ">", "0", ".", "99", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "24h", ",", "P", "=", "0", ".", "15", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "48h", ",", "P", "=", "0", ".", "0009", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "72h", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "LDHB", ":", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "6h", ",", "P", ">", "0", ".", "99", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "24h", ",", "P", ">", "0", ".", "99", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "48h", ",", "P", "=", "0", ".", "97", ";", "O2", "21", "%", "vs", "O2", "0", ".", "1", "%", "72h", ",", "P", "=", "0", ".", "88", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Western blot analysis of LDHA and LDHB from P3 cells upon exposure to 21% or 0.1% O2 for 6, 24, 48, and 72 h. The graphs represent densitometry quantification of immunoblots normalized to tubulin (n = 4 independent experiments). Data are represented as mean ± s.d. and analyzed using One-Way ANOVA following Dunnett's multiple comparisons tests. LDHA: O2 21% vs O2 0.1% 6h, P>0.99; O2 21% vs O2 0.1% 24h, P=0.15; O2 21% vs O2 0.1% 48h, P=0.0009; O2 21% vs O2 0.1% 72h, P<0.0001. LDHB: O2 21% vs O2 0.1% 6h, P>0.99; O2 21% vs O2 0.1% 24h, P>0.99; O2 21% vs O2 0.1% 48h, P=0.97; O2 21% vs O2 0.1% 72h, P=0.88."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "LDHA", "and", "LDHB", "expression", "in", "P3", "cells", "transduced", "with", "CRISPR", "-", "Cas9", "lentiviral", "vectors", "with", "scramble", "sequence", "(", "sgControl", ")", "or", "against", "LDHA", "(", "sgLDHA", ")", ",", "LDHB", "(", "sgLDHB", ")", "or", "both", "(", "sgLDHA", "/", "B", ")", ".", "Knockout", "(", "KO", ")", "cells", "were", "exposed", "to", "21", "%", "or", "1", "%", "O2", "for", "48", "h", ".", "D", ".", "Left", ":", "P3", "spheroid", "growth", "recorded", "over", "one", "week", "at", "1", "%", "O2", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "one", "experiment", "including", "16", "spheroids", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "analyzed", "using", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Spheroid", "growth", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", ",", "P", "=", "0", ".", "0003", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHB", ",", "P", "=", "0", ".", "78", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Dead", "area", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", ",", "P", "=", "0", ".", "19", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHB", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Right", ":", "Viability", "of", "spheroids", "at", "one", "week", ",", "incubated", "with", "calcein", "(", "green", ")", "or", "ethidium", "homodimer", "-", "1", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "E", ".", "P3", "spheroid", "invasion", "in", "collagen", "I", "gel", ",", "incubated", "24", "h", "at", "21", "%", "or", "0", ".", "1", "%", "O2", ".", "Invasion", "rate", "is", "expressed", "as", "fold", "change", "from", "controls", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ",", "one", "experiment", "including", "6", "-", "8", "spheroids", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "analyzed", "using", "Two", "-", "way", "ANOVA", "following", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "sgCont", "21", "%", "vs", "sgLDHA", "21", "%", ",", "P", "=", "0", ".", "003", ";", "sgCont", "0", ".", "1", "%", "vs", "sgLDHA", "0", ".", "1", "%", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "sgCont", "21", "%", "vs", "sgLDHB", "21", "%", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "sgCont", "0", ".", "1", "%", "vs", "sgLDHB", "0", ".", "1", "%", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "sgCont", "21", "%", "vs", "sgLDHA", "/", "B", "21", "%", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "sgCont", "0", ".", "1", "%", "vs", "sgLDHA", "/", "B", "0", ".", "1", "%", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Images", "of", "representative", "of", "control", "or", "LDHA", "/", "B", "KO", "spheroids", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "F", "-", "G", ".", "A", "first", "cohort", "of", "mice", "was", "sacrificed", "when", "one", "mouse", "reached", "a", "limit", "point", ",", "brains", "was", "extract", ",", "snap", "frozen", "in", "liquid", "nitrogen", ",", "sliced", "and", "stained", ".", "For", "the", "second", "cohort", ",", "each", "mouse", "was", "sacrificed", "when", "it", "reached", "a", "limit", "point", "allowing", "the", "draw", "of", "survival", "curves", ".", "Left", ":", "Immunofluorescence", "staining", "of", "Nestin", "(", "top", "and", "middle", ")", "and", "CD31", "(", "bottom", ")", "of", "control", "and", "LDHA", "/", "B", "KO", "P3", "tumor", "section", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "mm", "(", "top", ")", ",", "250", "µm", "(", "middle", ")", "and", "100", "µm", "(", "bottom", ")", ".", "Right", ":", "Graphs", "represent", "tumor", "core", "and", "invasion", "area", "of", "control", "and", "LDHA", "/", "B", "KO", "P3", "tumors", "in", "mm2", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "average", "of", "5", "-", "6", "sections", "per", "tumor", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", ".", "For", "F", ",", "data", "are", "analyzed", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "following", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Core", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", ",", "P", "=", "0", ".", "48", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHB", ",", "P", "=", "0", ".", "99", ".", "Invasion", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", ",", "P", "=", "0", ".", "40", ";", "sgCont", "vs", "sgLDHB", ",", "P", "=", "0", ".", "81", ".", "For", "G", ",", "data", "are", "analyzed", "using", "unpaired", "t", "test", ".", "Core", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "=", "0", ".", "005", ".", "Invasion", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "=", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Western blot analysis of LDHA and LDHB expression in P3 cells transduced with CRISPR-Cas9 lentiviral vectors with scramble sequence (sgControl) or against LDHA (sgLDHA), LDHB (sgLDHB) or both (sgLDHA/B). Knockout (KO) cells were exposed to 21% or 1% O2 for 48 h.D. Left: P3 spheroid growth recorded over one week at 1% O2 (n = 3 independent experiments, one experiment including 16 spheroids per condition). Data are represented as mean and analyzed using Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparisons test. Spheroid growth: sgCont vs sgLDHA, P=0.0003; sgCont vs sgLDHB, P=0.78; sgCont vs sgLDHA/B, P<0.0001. Dead area: sgCont vs sgLDHA, P=0.19; sgCont vs sgLDHB, P<0.0001; sgCont vs sgLDHA/B, P<0.0001. Right: Viability of spheroids at one week, incubated with calcein (green) or ethidium homodimer-1 (red). Scale bar: 200 µm.E. P3 spheroid invasion in collagen I gel, incubated 24 h at 21% or 0.1% O2. Invasion rate is expressed as fold change from controls (n = 4 independent experiments, one experiment including 6-8 spheroids per condition). Data are represented as mean and analyzed using Two-way ANOVA following by Tukey's multiple comparisons test: sgCont 21% vs sgLDHA 21%, P=0.003; sgCont 0.1% vs sgLDHA 0.1%, P<0.0001; sgCont 21% vs sgLDHB 21%, P<0.0001; sgCont 0.1% vs sgLDHB 0.1%, P<0.0001; sgCont 21% vs sgLDHA/B 21%, P<0.0001; sgCont 0.1% vs sgLDHA/B 0.1%, P<0.0001. Images of representative of control or LDHA/B KO spheroids. Scale bar: 100 µm.F-G. A first cohort of mice was sacrificed when one mouse reached a limit point, brains was extract, snap frozen in liquid nitrogen, sliced and stained. For the second cohort, each mouse was sacrificed when it reached a limit point allowing the draw of survival curves. Left: Immunofluorescence staining of Nestin (top and middle) and CD31 (bottom) of control and LDHA/B KO P3 tumor section. Scale bars: 2 mm (top), 250 µm (middle) and 100 µm (bottom). Right: Graphs represent tumor core and invasion area of control and LDHA/B KO P3 tumors in mm2 (n = 5 mice per group, average of 5-6 sections per tumor). Data are represented as mean. For F, data are analyzed using One-way ANOVA following by Dunnett's multiple comparisons test. Core: sgCont vs sgLDHA, P=0.48; sgCont vs sgLDHB, P=0.99. Invasion: sgCont vs sgLDHA, P=0.40; sgCont vs sgLDHB, P=0.81. For G, data are analyzed using unpaired t test. Core: sgCont vs sgLDHA/B, P=0.005. Invasion: sgCont vs sgLDHA/B, P=0.01."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "respiratory", "chain", "subunits", "from", "LDH", "KO", "P3", "cells", "upon", "exposure", "to", "21", "%", "or", "0", ".", "1", "%", "O2", ".", "Roman", "numbers", "indicate", "the", "respiratory", "complex", "number", ".", "The", "diagram", "below", "represents", "densitometry", "quantification", "of", "the", "immunoblots", "normalized", "to", "vinculin", "and", "expressed", "as", "log2", "foldchange", "to", "control", "cells", "in", "21", "%", "and", "0", ".", "1", "%", "O2", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "B", ".", "Epifluorescence", "(", "top", ")", "and", "quantitative", "image", "analysis", "(", "bottom", ")", "of", "immune", "stained", "mitochondria", "(", "TOM20", ",", "green", ")", "from", "LDH", "KO", "P3", "cells", "(", "Phalloidin", ",", "red", ";", "DAPI", ",", "blue", ")", "upon", "exposure", "to", "0", ".", "1", "%", "O2", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ",", "28", "-", "32", "cells", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "analyzed", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "following", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Mitochondrial", "mass", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "=", "0", ".", "005", ";", "sgLDHA", "/", "sgLDHB", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "p", "=", "0", ".", "006", ".", "Network", "aspect", "ratio", ":", "sgCont", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "=", "0", ".", "03", ";", "sgLDHA", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ";", "sgLDHB", "vs", "sgLDHA", "/", "B", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ".", "Mitochondrial", "mass", "corresponds", "to", "the", "area", "covered", "by", "the", "mitochondria", "relative", "to", "the", "entire", "cell", "area", ".", "Network", "aspect", "ratio", "is", "the", "ratio", "of", "the", "major", "axis", "to", "minor", "axis", "of", "the", "mitochondrial", "network", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "E", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "xenotransplanted", "mice", "with", "LDHA", "/", "B", "KO", "(", "red", ")", "or", "control", "(", "blue", ")", "P3", "cells", ",", "treated", "with", "phenformin", "or", "irradiated", "with", "10", "Gy", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ":", "sgCont", "Vehicle", "vs", "sgCont", "Phenformin", ",", "P", "=", "0", ".", "019", ";", "sgCont", "Vehicle", "vs", "sgCont", "Irradiation", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", ";", "sgCont", "Irradiation", "vs", "sgLDHA", "/", "B", "Irradiation", ",", "P", "=", "0", ".", "024", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Western blot analysis of mitochondrial respiratory chain subunits from LDH KO P3 cells upon exposure to 21% or 0.1% O2. Roman numbers indicate the respiratory complex number. The diagram below represents densitometry quantification of the immunoblots normalized to vinculin and expressed as log2 foldchange to control cells in 21% and 0.1% O2 (n = 3 independent experiments).B. Epifluorescence (top) and quantitative image analysis (bottom) of immune stained mitochondria (TOM20, green) from LDH KO P3 cells (Phalloidin, red; DAPI, blue) upon exposure to 0.1% O2 (n = 2 independent experiments, 28-32 cells per group). Data are represented as mean and analyzed using One-way ANOVA following by Tukey's multiple comparisons test. Mitochondrial mass: sgCont vs sgLDHA/B, P=0.005; sgLDHA/sgLDHB vs sgLDHA/B, p=0.006. Network aspect ratio: sgCont vs sgLDHA/B, P=0.03; sgLDHA vs sgLDHA/B, P=0.02; sgLDHB vs sgLDHA/B, p=0.04. Mitochondrial mass corresponds to the area covered by the mitochondria relative to the entire cell area. Network aspect ratio is the ratio of the major axis to minor axis of the mitochondrial network. Scale bar: 10 µm.E. Kaplan-Meier survival curves of xenotransplanted mice with LDHA/B KO (red) or control (blue) P3 cells, treated with phenformin or irradiated with 10 Gy (n = 6-8 mice per group). Data are analyzed using Log-rank (Mantel-Cox) test: sgCont Vehicle vs sgCont Phenformin, P=0.019; sgCont Vehicle vs sgCont Irradiation, P=0.0002; sgCont Irradiation vs sgLDHA/B Irradiation, P=0.024."}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "Left", ":", "P3", "spheroid", "growth", "recorded", "over", "72", "h", "during", "incubation", "with", "stiripentol", "at", "0", ".", "1", "%", "O2", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "one", "experiment", "including", "8", "spheroids", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "growth", "at", "72", "h", "are", "analyzed", "using", "unpaired", "t", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Right", ":", "Viability", "of", "spheroids", "at", "72", "h", ",", "incubated", "with", "calcein", "(", "green", ")", "or", "ethidium", "homodimer", "-", "1", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "E", ".", "Left", ":", "P3", "spheroid", "invasion", "in", "collagen", "I", "gel", ",", "incubated", "24", "h", "with", "500", "µM", "stiripentol", "at", "0", ".", "1", "%", "O2", ".", "Invasion", "rate", "is", "expressed", "as", "fold", "change", "from", "control", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "one", "experiment", "including", "8", "spheroids", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "analyzed", "using", "unpaired", "t", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Right", ":", "Representative", "images", "of", "invasive", "spheroids", "for", "each", "condition", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "F", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "xenotransplanted", "mice", "with", "P3", "cells", ".", "Mice", "were", "treated", "either", "with", "vehicle", "(", "blue", ")", "or", "stiripentol", "(", "red", ")", "(", "n", "=", "15", "-", "16", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "using", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ":", "P", "=", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. Left: P3 spheroid growth recorded over 72 h during incubation with stiripentol at 0.1% O2 (n = 3 independent experiments, one experiment including 8 spheroids per condition). Data are represented as mean ± s.d. and growth at 72 h are analyzed using unpaired t test: P<0.0001. Right: Viability of spheroids at 72 h, incubated with calcein (green) or ethidium homodimer-1 (red). Scale bar: 100 µm. E. Left: P3 spheroid invasion in collagen I gel, incubated 24 h with 500 µM stiripentol at 0.1% O2. Invasion rate is expressed as fold change from control (n = 3 independent experiments, one experiment including 8 spheroids per condition). Data are represented as mean and analyzed using unpaired t test: P<0.0001. Right: Representative images of invasive spheroids for each condition. Scale bar: 100 µm.F. Kaplan-Meier survival curves of xenotransplanted mice with P3 cells. Mice were treated either with vehicle (blue) or stiripentol (red) (n = 15-16 mice per group). Data are analyzed using Log-rank (Mantel-Cox) test: P=0.002"}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "Gp96", "IP", "fractions", "(", "IP", "Gp96", ")", "of", "HeLa", "cells", ":", "(", "A", ")", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "LLO", "for", "15", "min", ".", "(", "A", ",", "C", ")", "Quantifications", "of", "NMHCIIA", "in", "IP", "Gp96", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "a", ".", "u", ".", "-", "arbitrary", "units", ")", ".", "(", "A", "-", "C", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "Gp96", "IP", "fractions", "(", "IP", "Gp96", ")", "of", "HeLa", "cells", ":", "(", "B", ")", "left", "uninfected", "(", "U", ")", "or", "infected", "with", "wt", "or", "Δhly", "Lm", "for", "1", "h", ".", "(", "A", ",", "C", ")", "Quantifications", "of", "NMHCIIA", "in", "IP", "Gp96", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "a", ".", "u", ".", "-", "arbitrary", "units", ")", ".", "(", "A", "-", "C", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "Gp96", "IP", "fractions", "(", "IP", "Gp96", ")", "of", "HeLa", "cells", ":", "(", "C", ")", "infected", "with", "wt", "Lm", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "A", ",", "C", ")", "Quantifications", "of", "NMHCIIA", "in", "IP", "Gp96", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "a", ".", "u", ".", "-", "arbitrary", "units", ")", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", ":", "(", "D", ")", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", ",", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", ",", "Gp96", "(", "red", ")", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "various", "NMHCIIA", "-", "Gp96", "positive", "cortical", "bundles", "in", "different", "cell", ".", "Insets", "show", "high", "magnification", "image", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "PCC", ")", "within", ":", "uninfected", "cells", "(", "U", ")", ",", "LLO", "-", "treated", "cells", ",", "cortical", "NMHCIIA", "bundles", "or", "equivalent", "size", "control", "cellular", "ROI", ".", "(", "Ctrl", "ROI", ")", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ";", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "F", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "infected", "with", "wt", "or", "Δhly", "Lm", "for", "6", "h", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", ",", "Gp96", "(", "red", ")", "Lm", "(", "blue", ")", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "Arrows", "indicate", "NMHCIIA", "-", "Gp96", "cortical", "bundles", "at", "cortical", "sites", "close", "to", "wt", "Lm", ".", "(", "D", "and", "F", ")", "Scale", "bar", "-", "10", "μm", ".", "See", "also", "Figs", "EV1", "and", "EV2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from whole cell lysates (WCL) and Gp96 IP fractions (IP Gp96) of HeLa cells: (A) left untreated or treated with increasing concentrations of LLO for 15 min. (A, C) Quantifications of NMHCIIA in IP Gp96 are the mean±SEM (n≥3) (a.u. - arbitrary units).(A-C) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from whole cell lysates (WCL) and Gp96 IP fractions (IP Gp96) of HeLa cells: (B) left uninfected (U) or infected with wt or Δhly Lm for 1 h. (A, C) Quantifications of NMHCIIA in IP Gp96 are the mean±SEM (n≥3) (a.u. - arbitrary units).(A-C) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from whole cell lysates (WCL) and Gp96 IP fractions (IP Gp96) of HeLa cells: (C) infected with wt Lm for the indicated time points. (A, C) Quantifications of NMHCIIA in IP Gp96 are the mean±SEM (n≥3) (a.u. - arbitrary units).(D) Confocal microscopy images of HeLa cells: (D) left untreated or treated with LLO (0.5 nM, 15 min), immunolabelled for NMHCIIA (green), Gp96 (red) and stained with DAPI (blue). Arrows point to various NMHCIIA-Gp96 positive cortical bundles in different cell. Insets show high magnification image (E) Quantification of Pearson's correlation coefficient (PCC) within: uninfected cells (U), LLO-treated cells, cortical NMHCIIA bundles or equivalent size control cellular ROI. (Ctrl ROI) Data are mean±SEM (n=6); p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(F) Confocal microscopy images of HeLa cells infected with wt or Δhly Lm for 6 h immunolabelled for NMHCIIA (green), Gp96 (red) Lm (blue) and stained with DAPI (white). Arrows indicate NMHCIIA-Gp96 cortical bundles at cortical sites close to wt Lm. (D and F) Scale bar - 10 μm. See also Figs EV1 and EV2."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "Sequential", "frames", "of", "time", "-", "lapse", "confocal", "microscopy", "sequence", "of", "LLO", "-", "treated", "HeLa", "cells", "expressing", "(", "A", ")", "GFP", "-", "NMHCIIA", ".", "LLO", "was", "added", "to", "culture", "medium", "10", "seconds", "before", "t0", ".", "DIC", "-", "differential", "interference", "contrast", ".", "(", "A", ")", "Arrows", "indicate", "NMHCIIA", "bundles", "at", "PM", "blebbing", "sites", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Sequential", "frames", "of", "time", "-", "lapse", "confocal", "microscopy", "sequence", "of", "LLO", "-", "treated", "HeLa", "cells", "expressing", "(", "B", ")", "simultaneously", "GFP", "-", "NMHCIIA", "and", "mcherry", "-", "KDEL", ".", "LLO", "was", "added", "to", "culture", "medium", "10", "seconds", "before", "t0", ".", "DIC", "-", "differential", "interference", "contrast", ".", "(", "B", ")", "Highlights", "depicting", "ER", "structures", "within", "NMHCIIA", "bundles", "and", "PM", "blebs", ".", "Arrows", "indicate", "cortical", "ER", "surrounding", "NMHCIIA", "accumulations", ",", "arrowheads", "indicate", "contact", "points", "between", "ER", "vesicles", "and", "NMHCIIA", "cables", "and", "asterisks", "point", "to", "ER", "vacuoles", "within", "PM", "blebs", "(", "C", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "Control", ")", "or", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", "15", "min", ")", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "FITC", "-", "WGA", "(", "Plasma", "membrane", ",", "PM", "-", "red", ")", "and", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", ".", "Insets", "show", "PM", "blebs", "and", "arrows", "indicate", "recruitment", "of", "NMHCIIA", "bundles", "to", "PM", "blebs", "associated", "(", "1", ")", "or", "detached", "(", "2", ")", "from", "the", "cell", "body", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", ":", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", "(", "LLO", ")", "and", "(", "D", ")", "LLO", "pre", "-", "incubated", "with", "cholesterol", "(", "LLOCHT", ")", "(", "D", "-", "F", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", ":", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", "(", "LLO", ")", "and", "(", "E", ")", "LLO", "in", "medium", "supplemented", "with", "140", "mM", "K", "+", "(", "HighK", "+", ")", "and", "LLO", "in", "Ca2", "+", "-", "free", "medium", "Ca2", "+", "(", "Ca2", "+", "free", ")", "(", "D", "-", "F", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "NMHCIIA", "levels", "from", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", ":", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", "(", "LLO", ")", "and", "(", "F", ")", "LLO", "in", "the", "presence", "of", "25", "μM", "blebbistatin", "(", "BB", ")", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "as", "indicated", "and", "immunolabelled", "for", "ER", "-", "KDEL", "(", "blue", ")", ",", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "and", "Gp96", "(", "red", ")", ".", "(", "H", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "aerolysin", "and", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "and", "Gp96", "(", "red", ")", ".", "Insets", "show", "NMHCIIA", "bundles", "and", "arrows", "indicate", "association", "between", "Gp96", "and", "NMHCIIA", ".", "(", "I", ")", "Immunoblots", "of", "NMHCIIA", "and", "Gp96", "levels", "from", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", ",", "SLO", "(", "1", ".", "5", "μg", "/", "ml", ",", "30", "min", ")", "(", "SLO", ")", "or", "aerolysin", "(", "0", ".", "2", "nM", ",", "40", "min", ")", "(", "AL", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) Sequential frames of time-lapse confocal microscopy sequence of LLO-treated HeLa cells expressing (A) GFP-NMHCIIA . LLO was added to culture medium 10 seconds before t0. DIC - differential interference contrast. (A) Arrows indicate NMHCIIA bundles at PM blebbing sites.(A-B) Sequential frames of time-lapse confocal microscopy sequence of LLO-treated HeLa cells expressing (B) simultaneously GFP-NMHCIIA and mcherry-KDEL. LLO was added to culture medium 10 seconds before t0. DIC - differential interference contrast. (B) Highlights depicting ER structures within NMHCIIA bundles and PM blebs. Arrows indicate cortical ER surrounding NMHCIIA accumulations, arrowheads indicate contact points between ER vesicles and NMHCIIA cables and asterisks point to ER vacuoles within PM blebs(C) Confocal microscopy images of HeLa cells left untreated (Control) or treated with LLO (0.5 nM 15 min). Cells were stained with FITC-WGA (Plasma membrane, PM-red) and immunolabelled for NMHCIIA (green). Insets show PM blebs and arrows indicate recruitment of NMHCIIA bundles to PM blebs associated (1) or detached (2) from the cell body.(D-F) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with: LLO (0.5 nM, 15 min) (LLO) and (D) LLO pre-incubated with cholesterol (LLOCHT)(D-F) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with: LLO (0.5 nM, 15 min) (LLO) and (E) LLO in medium supplemented with 140 mM K+(HighK+) and LLO in Ca2+-free medium Ca2+ (Ca2+free)(D-F) Immunoblots of Gp96 and NMHCIIA levels from Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with: LLO (0.5 nM, 15 min) (LLO) and (F) LLO in the presence of 25 μM blebbistatin (BB).(G) Confocal microscopy images of HeLa cells treated as indicated and immunolabelled for ER-KDEL (blue), NMHCIIA (green) and Gp96 (red).(H) Confocal microscopy images of HeLa cells treated with aerolysin and immunolabelled for NMHCIIA (green) and Gp96 (red). Insets show NMHCIIA bundles and arrows indicate association between Gp96 and NMHCIIA.(I) Immunoblots of NMHCIIA and Gp96 levels from Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with LLO (0.5 nM, 15 min), SLO (1.5 μg/ml, 30 min) (SLO) or aerolysin (0.2 nM, 40 min) (AL)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "shCtrl", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", "and", "immunolabelled", "for", "KDEL", "-", "proteins", "(", "blue", ")", ",", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "and", "Gp96", "(", "red", ")", ".", "Insets", "show", "compact", "NMHCIIA", "bundles", "in", "shCtrl", "cells", "and", "dispersed", "NMHCIIA", "bundles", "in", "shGp96", "cells", ".", "Scale", "bar", "-", "10", "μm", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "%", "of", "cells", "harbouring", "NMHCIIA", "bundles", "after", "incubation", "with", "(", "B", ")", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", ",", "(", "C", ")", "aerolysin", "(", "0", ".", "2", "nM", ",", "40", "min", ")", "or", "(", "D", ")", "with", "wt", "Lm", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", ",", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "(", "B", "-", "C", ")", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Dunnett", "post", "hoc", "analyses", "and", "(", "D", ")", "two", "-", "tailed", "un", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "For", "shNMHCIIA", ",", "bundles", "were", "detected", "following", "actin", "staining", "(", "Fig", "EV3C", ")", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Number", "of", "(", "E", ")", "blebs", "per", "cell", "or", "(", "F", ")", "retracting", "blebs", "per", "cell", "evaluated", "by", "time", "-", "lapse", "microscopy", "analysis", "of", "LLO", "-", "treated", "shCtrl", "or", "shGp96", "cells", ".", "shCtrl", "n", "=", "32", "cells", "and", "shGp96", "n", "=", "40", "cells", ",", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "un", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ".", "(", "G", ")", "Sequential", "frames", "of", "time", "-", "lapse", "microscopy", "analysis", "of", "LLO", "-", "treated", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "NMHCIIA", "(", "shCtrl", ",", "shGp96", "and", "shCtrl", "with", "25", "μM", "Blebbistatin", "-", "shCtrl", "-", "BB", ")", ".", "LLO", "was", "added", "to", "culture", "medium", "10", "seconds", "before", "t0", ".", "(", "H", ")", "Immunoblots", "of", "Ser19", "-", "phosphorylated", "MRLC", "(", "pMRLC", ")", ",", "MRLC", "and", "actin", "levels", "from", "shCtrl", "or", "shGp96", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", "0", ".", "1", "nM", "LLO", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Quantification", "of", "pMRLC", "levels", "corresponds", "to", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", ",", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "See", "also", "Appendix", "Fig", "S2", "and", "Fig", "EV3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Confocal microscopy images of shCtrl, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells treated with LLO (0.5 nM, 15 min) and immunolabelled for KDEL-proteins (blue), NMHCIIA (green) and Gp96 (red). Insets show compact NMHCIIA bundles in shCtrl cells and dispersed NMHCIIA bundles in shGp96 cells. Scale bar - 10 μm. (B-D) Quantification of the % of cells harbouring NMHCIIA bundles after incubation with (B) LLO (0.5 nM, 15 min), (C) aerolysin (0.2 nM, 40 min) or (D) with wt Lm. Values are the mean ±SEM (n≥3), p-values were calculated using (B-C) one-way-ANOVA with Dunnett post hoc analyses and (D) two-tailed un-paired Student's t-test, *p<0.5, ***p<0.001. For shNMHCIIA, bundles were detected following actin staining (Fig EV3C).(E-F) Number of (E) blebs per cell or (F) retracting blebs per cell evaluated by time-lapse microscopy analysis of LLO-treated shCtrl or shGp96 cells. shCtrl n=32 cells and shGp96 n=40 cells, p-values were calculated using two-tailed un-paired Student's t-test *p<0.5. (G) Sequential frames of time-lapse microscopy analysis of LLO-treated HeLa cells expressing GFP-NMHCIIA (shCtrl, shGp96 and shCtrl with 25 μM Blebbistatin - shCtrl-BB). LLO was added to culture medium 10 seconds before t0.(H) Immunoblots of Ser19-phosphorylated MRLC (pMRLC), MRLC and actin levels from shCtrl or shGp96 cells left untreated (U) or treated with 0.1 nM LLO for the indicated time points. Quantification of pMRLC levels corresponds to the mean ± SEM (n≥3), p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses **p<0.01, ***p<0.001. See also Appendix Fig S2 and Fig EV3."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "Ai", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "LLO", "-", "treated", "HeLa", "cells", "immunolabelled", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Insets", "show", "colocalization", "between", "NMHCIIA", "and", "WRAMP", "components", "at", "cortical", "bundles", ".", "(", "Aii", ")", "Quantification", "of", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "PCC", ")", "between", "NMHCIIA", "and", "the", "indicated", "proteins", "within", "entire", "LLO", "-", "treated", "cells", ",", "cortical", "bundles", "or", "equivalent", "size", "control", "cellular", "ROI", "(", "Ctrl", "ROI", ")", ".", "For", "Calpain", "2", "cortical", "bundles", "were", "defined", "by", "actin", "staining", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "experiment", "repeated", "3", "independent", "times", "with", "similar", "results", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "-", "non", "significant", "(", "B", ")", "Immunoblots", "of", "NMHCIIA", ",", "Gp96", "and", "Filamin", "A", "levels", "from", "WCL", "and", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", "(", "LLO", ")", ".", "(", "C", ")", "Immunoblots", "of", "NMHCIIA", "and", "Gp96", "levels", "from", "WCL", "and", "Gp96", "IP", "of", "HeLa", "cells", "left", "untreated", "(", "U", ")", "or", "treated", "with", "25", "μg", "/", "ml", "of", "Wnt5a", "for", "the", "indicated", "time", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "untreated", "(", "Mock", ")", "or", "treated", "with", "25", "μg", "/", "ml", "of", "Wnt5a", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "immunolabelled", "for", "ER", "-", "KDEL", "(", "blue", ")", ",", "Gp96", "(", "red", ")", "and", "NMHCIIA", "(", "green", ")", ".", "Arrows", "indicate", "polarised", "localization", "of", "NMHCIIA", ",", "ER", "-", "KDEL", "and", "Gp96", "in", "Wnt5a", "-", "treated", "cells", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", "stained", "for", "actin", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "immunolabelled", "for", "(", "E", ")", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "or", "(", "F", ")", "focal", "adhesion", "kinase", "(", "FAK", ")", "(", "green", ")", ".", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", "Scale", "bar", "-", "10", "μm", ".", "Insets", "show", "sites", "with", "focal", "adhesion", "points", "and", "arrows", "indicate", "stress", "fibers", "or", "distinct", "focal", "adhesion", "points", ".", "Quantification", "of", "the", "%", "of", "cells", "with", "(", "G", ")", "stress", "fibers", "or", "(", "H", ")", "focal", "adhesion", "points", "labelled", "by", "FAK", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "Wound", "closure", "assay", ".", "(", "I", ")", "Sequential", "frames", "of", "time", "-", "lapse", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "grown", "to", "confluence", "separated", "by", "a", "stopper", ".", "Stopper", "was", "removed", "at", "t0", "and", "cellular", "migration", "was", "imaged", "for", "the", "indicated", "times", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "%", "of", "wound", "area", "occupied", "by", "migrating", "cells", "over", "time", "stopper", "removal", "(", "upper", "panel", ")", "and", "respective", "rate", "of", "closure", "(", "lower", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(Ai) Confocal microscopy images of LLO-treated HeLa cells immunolabelled for the indicated proteins. Insets show colocalization between NMHCIIA and WRAMP components at cortical bundles. (Aii) Quantification of Pearson's correlation coefficient (PCC) between NMHCIIA and the indicated proteins within entire LLO-treated cells, cortical bundles or equivalent size control cellular ROI (Ctrl ROI). For Calpain 2 cortical bundles were defined by actin staining. Data are representative of one experiment repeated 3 independent times with similar results. p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses ** p<0.01; *** p<0.001, ns - non significant(B) Immunoblots of NMHCIIA, Gp96 and Filamin A levels from WCL and Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with LLO (0.5 nM, 15 min) (LLO).(C) Immunoblots of NMHCIIA and Gp96 levels from WCL and Gp96 IP of HeLa cells left untreated (U) or treated with 25 μg/ml of Wnt5a for the indicated time.(D) Confocal microscopy images of HeLa cells untreated (Mock) or treated with 25 μg/ml of Wnt5a for 30 min. Cells were immunolabelled for ER-KDEL (blue), Gp96 (red) and NMHCIIA (green). Arrows indicate polarised localization of NMHCIIA, ER-KDEL and Gp96 in Wnt5a-treated cells.(E-F) Confocal microscopy images of shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells stained for actin (red) and DAPI (blue) and immunolabelled for (E) NMHCIIA (green) or (F) focal adhesion kinase (FAK) (green). (A, D-F) Scale bar - 10 μm. Insets show sites with focal adhesion points and arrows indicate stress fibers or distinct focal adhesion points. Quantification of the % of cells with (G) stress fibers or (H) focal adhesion points labelled by FAK.(I-J) Wound closure assay. (I) Sequential frames of time-lapse microscopy of HeLa cells grown to confluence separated by a stopper. Stopper was removed at t0 and cellular migration was imaged for the indicated times. (J) Quantification of the % of wound area occupied by migrating cells over time stopper removal (upper panel) and respective rate of closure (lower panel)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Epifluorescence", "microscopy", "images", "of", "supernatants", "from", "LLO", "-", "treated", "(", "0", ".", "5", "nM", "15", "min", ")", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", "collected", "into", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "cover", "slips", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "FITC", "-", "WGA", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Insets", "show", "PM", "blebs", "of", "variable", "sizes", "and", "DAPI", "staining", "confirms", "the", "absence", "of", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "-", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "released", "PM", "blebs", "(", "total", "FITCWGA", "/", "field", ")", ".", "Values", "are", "the", "means", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "the", "%", "of", "PI", "-", "positive", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "(", "C", ")", "0", ".", "5", "nM", "LLO", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Levels", "of", "PI", "incorporation", "by", "untreated", "cells", "were", "subtracted", "from", "all", "LLO", "-", "treated", "samples", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "4", ")", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "the", "%", "of", "PI", "-", "positive", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "(", "D", ")", "1", ".", "5", "or", "3", "nM", "LLO", "for", "15", "min", ";", "or", "(", "E", ")", "0", ".", "1", "nM", "LLO", "for", "10", "min", "followed", "by", "LLO", "washed", "out", "and", "recovery", "for", "indicated", "times", ".", "Levels", "of", "PI", "incorporation", "by", "untreated", "cells", "were", "subtracted", "from", "all", "LLO", "-", "treated", "samples", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "4", ")", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "the", "%", "of", "PI", "-", "positive", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "(", "E", ")", "0", ".", "1", "nM", "LLO", "for", "10", "min", "followed", "by", "LLO", "washed", "out", "and", "recovery", "for", "indicated", "times", ".", "Levels", "of", "PI", "incorporation", "by", "untreated", "cells", "were", "subtracted", "from", "all", "LLO", "-", "treated", "samples", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "4", ")", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Epifluorescence microscopy images of supernatants from LLO-treated (0.5 nM 15 min) shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells collected into poly-lysine-coated cover slips, fixed and stained with FITC-WGA (green) and DAPI (blue). Insets show PM blebs of variable sizes and DAPI staining confirms the absence of cell nuclei. Scale bar - 10 μm. (B) Quantification of released PM blebs (total FITCWGA/field). Values are the means ± SEM (n≥3). ***p<0.001.(C-E) Flow cytometry analysis of the % of PI-positive shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells. Cells were treated with (C) 0.5 nM LLO for the indicated times. Levels of PI incorporation by untreated cells were subtracted from all LLO-treated samples. Values are the mean ± SEM (n≥4) and p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.5, **p<0.01, ***p<0.001.(C-E) Flow cytometry analysis of the % of PI-positive shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells. Cells were treated with (D) 1.5 or 3 nM LLO for 15 min; or (E) 0.1 nM LLO for 10 min followed by LLO washed out and recovery for indicated times. Levels of PI incorporation by untreated cells were subtracted from all LLO-treated samples. Values are the mean ± SEM (n≥4) and p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.5, **p<0.01, ***p<0.001.(C-E) Flow cytometry analysis of the % of PI-positive shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa cells. Cells were treated with (E) 0.1 nM LLO for 10 min followed by LLO washed out and recovery for indicated times. Levels of PI incorporation by untreated cells were subtracted from all LLO-treated samples. Values are the mean ± SEM (n≥4) and p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.5, **p<0.01, ***p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Epifluorecence", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "(", "A", ")", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "LLO", "(", "0", ".", "5", "nM", ",", "15", "min", ")", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "exofacial", "-", "PS", "probe", "(", "Alexa", "-", "568", "annexin", "A5", ")", "(", "red", ")", "30", "min", "prior", "fixation", ",", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Insets", "show", "PM", "damage", "marked", "by", "exofacial", "-", "PS", "sites", ".", "Arrows", "indicate", "exofacial", "-", "PS", "associated", "with", "intracellular", "bacteria", "and", "in", "shCtrl", "cells", "with", "NMHCIIA", "bundles", ";", "arrowheads", "indicate", "NMHCIIA", "bundles", "associated", "with", "exofacial", "-", "PS", "sites", "without", "detectable", "bacteria", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Epifluorecence", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "(", "B", ")", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "wt", "Lm", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "exofacial", "-", "PS", "probe", "(", "Alexa", "-", "568", "annexin", "A5", ")", "(", "red", ")", "30", "min", "prior", "fixation", ",", "immunolabelled", "for", "NMHCIIA", "(", "green", ")", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Insets", "show", "PM", "damage", "marked", "by", "exofacial", "-", "PS", "sites", ".", "Arrows", "indicate", "exofacial", "-", "PS", "associated", "with", "intracellular", "bacteria", "and", "in", "shCtrl", "cells", "with", "NMHCIIA", "bundles", ";", "arrowheads", "indicate", "NMHCIIA", "bundles", "associated", "with", "exofacial", "-", "PS", "sites", "without", "detectable", "bacteria", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "%", "of", "infected", "cells", "with", "exofacial", "-", "PS", "sites", "in", "HeLa", "cells", "infected", "with", "wt", "Lm", "for", "6", "h", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "the", "%", "of", "PI", "-", "positive", "shCtlr", ",", "shGp96", "or", "shNMHCIIA", "HeLa", "and", "RAW264", ".", "7", "cells", ",", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "wt", "or", "Δhly", "Lm", "for", "6", "h", ".", "The", "levels", "of", "PI", "incorporation", "by", "uninfected", "cells", "were", "subtracted", "from", "infected", "samples", ".", "Values", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "4", ")", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "p", "<", "0", ".", "5", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "PM", "permeability", "was", "assessed", "in", "cells", "harbouring", "equivalent", "numbers", "of", "intracellular", "bacteria", "(", "Fig", "Appendix", "Fig", "S3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Epifluorecence microscopy images of HeLa cells (A) left untreated or treated with LLO (0.5 nM, 15 min). Cells were incubated with exofacial-PS probe (Alexa-568 annexin A5) (red) 30 min prior fixation, immunolabelled for NMHCIIA (green) and stained with DAPI (blue). Insets show PM damage marked by exofacial-PS sites. Arrows indicate exofacial-PS associated with intracellular bacteria and in shCtrl cells with NMHCIIA bundles; arrowheads indicate NMHCIIA bundles associated with exofacial-PS sites without detectable bacteria.(A-B) Epifluorecence microscopy images of HeLa cells (B) infected with GFP-expressing wt Lm for 6 h. Cells were incubated with exofacial-PS probe (Alexa-568 annexin A5) (red) 30 min prior fixation, immunolabelled for NMHCIIA (green) and stained with DAPI (blue). Insets show PM damage marked by exofacial-PS sites. Arrows indicate exofacial-PS associated with intracellular bacteria and in shCtrl cells with NMHCIIA bundles; arrowheads indicate NMHCIIA bundles associated with exofacial-PS sites without detectable bacteria.(C) Quantification of the % of infected cells with exofacial-PS sites in HeLa cells infected with wt Lm for 6 h. Data are the mean ±SEM (n=3) and p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.5.(D-E) Flow cytometry analysis of the % of PI-positive shCtlr, shGp96 or shNMHCIIA HeLa and RAW264.7 cells, infected with GFP-expressing wt or Δhly Lm for 6 h. The levels of PI incorporation by uninfected cells were subtracted from infected samples. Values are the mean ± SEM (n≥4) and p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses *p<0.5, **p<0.01, ***p<0.001. PM permeability was assessed in cells harbouring equivalent numbers of intracellular bacteria (Fig Appendix Fig S3)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunoblots", "of", "NMHCIIA", "and", "Gp96", "levels", "from", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "IP", "fractions", "(", "IP", "Gp96", ")", "of", "extracts", "of", "zebrafish", "larvae", "3", "dpf", "uninfected", "(", "U", ")", "or", "infected", "with", "wt", "or", "∆", "hly", "Lm", "(", "low", "dose", "200", "-", "1500", "CFU", ")", "for", "24h", ".", "(", "B", ")", "Immunoblots", "of", "Gp96", "and", "tubulin", "levels", "from", "zebrafish", "3", "dpf", "larvae", "injected", "with", "control", "(", "Ctrl", "-", "mo", ")", "or", "Gp96", "morpholino", "oligonucleotides", "(", "Gp96", "mo", ")", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "zebrafish", "larvae", "(", "Ctrl", "mo", "or", "Gp96", "mo", ")", "infected", "(", "low", "dose", ")", "in", "the", "tail", "muscle", ",", "with", "the", "GFP", "-", "expressing", "wt", "or", "Δhly", "Lm", "for", "24", "h", ",", "immunolabelled", "for", "KDEL", "-", "proteins", "(", "green", ")", ",", "and", "stained", "with", "phalloidin", "(", "actin", ",", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "Images", "show", "actin", "rich", "structures", "at", "the", "cell", "cortex", "(", "arrows", ")", "and", "ER", "-", "KDEL", "puncta", "(", "arrowheads", ")", "in", "larvae", "infected", "with", "wt", "strain", ".", "(", "D", ")", "CFU", "counts", "per", "zebrafish", "larvae", "(", "Ctrl", "or", "Gp96", "mo", ")", "infected", "with", "wt", "(", "low", "dose", ")", "or", "Δhly", "(", "high", "dose", ">", "10", ",", "000", "CFU", ")", "Lm", "and", "analysed", "at", "0", ",", "24", ",", "48", "hpi", ".", "Results", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "horizontal", "bars", ")", "and", "each", "circle", "represents", "1", "larvae", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "analyses", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", ")", "Survival", "curves", "of", "zebrafish", "larvae", "(", "Ctrl", "-", "mo", "or", "Gp96", "-", "mo", ")", "infected", "with", "a", "wt", "(", "low", "dose", ")", "or", "Δhly", "(", "high", "dose", ">", "10", ",", "000", "CFU", ")", "Lm", ".", "Results", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "wt", "infection", "of", "Ctrl", "and", "Gp96", "mo", ",", "n", "=", "28", "larvae", ";", "Δhly", "infection", "of", "Gp96", "mo", "n", "=", "13", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "Log", "Rank", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "CFU", "counts", "per", "zebrafish", "larvae", "infected", "with", "a", "high", "dose", "of", "∆", "hly", "Lm", "at", "different", "times", "post", "-", "infection", ".", "Results", "are", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "horizontal", "bars", ")", ";", "each", "point", "represents", "1", "larvae", ".", "See", "also", "Fig", "EV5", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunoblots of NMHCIIA and Gp96 levels from whole cell lysates (WCL) and IP fractions (IP Gp96) of extracts of zebrafish larvae 3 dpf uninfected (U) or infected with wt or ∆hly Lm (low dose 200-1500 CFU) for 24h.(B) Immunoblots of Gp96 and tubulin levels from zebrafish 3 dpf larvae injected with control (Ctrl-mo) or Gp96 morpholino oligonucleotides (Gp96 mo).(C) Confocal microscopy images of zebrafish larvae (Ctrl mo or Gp96 mo) infected (low dose) in the tail muscle, with the GFP-expressing wt or Δhly Lm for 24 h, immunolabelled for KDEL-proteins (green), and stained with phalloidin (actin, red) and DAPI (white). Images show actin rich structures at the cell cortex (arrows) and ER-KDEL puncta (arrowheads) in larvae infected with wt strain.(D) CFU counts per zebrafish larvae (Ctrl or Gp96 mo) infected with wt (low dose) or Δhly (high dose > 10,000 CFU) Lm and analysed at 0, 24, 48 hpi. Results are mean ± SEM (n≥3) (horizontal bars) and each circle represents 1 larvae. p-values were calculated using one-way-ANOVA with Tukey post hoc analyses **p<0.01.(E) Survival curves of zebrafish larvae (Ctrl-mo or Gp96-mo) infected with a wt (low dose) or Δhly (high dose > 10,000 CFU) Lm. Results are the mean ± SEM (n≥3). wt infection of Ctrl and Gp96 mo, n=28 larvae; Δhly infection of Gp96 mo n=13. p-values were calculated using Log Rank test, **p<0.01.(F) CFU counts per zebrafish larvae infected with a high dose of ∆hly Lm at different times post-infection. Results are mean ± SEM (n≥3) (horizontal bars); each point represents 1 larvae. See also Fig EV5."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "F", ")", "Examples", "of", "expression", "levels", "of", "Treg", "signature", "genes", "Foxp3", ",", "Il10ra", ",", "Nrp1", ",", "Ikzf4", "and", "Ccr6", ";", "and", "examples", "of", "expression", "levels", "of", "genes", "upregulated", "in", "Tet2", "/", "3", "DKO", "Treg", "cells", "Eomes", ",", "Ccl4", ",", "Chek1", "and", "Fn1", ".", "The", "Y", "-", "axis", "shows", "FPKM", "(", "Fragment", "Per", "Kilobase", "per", "Million", "reads", ")", ",", "the", "X", "-", "axis", "shows", "the", "different", "cell", "types", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", "from", "two", "(", "CD4", "+", "naïve", "T", "cells", ")", "or", "four", "(", "WT", "and", "Tet2", "/", "3", "DKO", "Treg", ")", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(F) Examples of expression levels of Treg signature genes Foxp3, Il10ra, Nrp1, Ikzf4 and Ccr6; and examples of expression levels of genes upregulated in Tet2/3 DKO Treg cells Eomes, Ccl4, Chek1 and Fn1. The Y-axis shows FPKM (Fragment Per Kilobase per Million reads), the X-axis shows the different cell types. Error bars show mean ± S.D. from two (CD4+ naïve T cells) or four (WT and Tet2/3 DKO Treg) biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Genome", "browser", "view", "of", "CMS", "-", "IP", "data", "showing", "CMS", "(", "5hmC", ")", "distribution", "at", "Il2ra", "and", "Foxp3", "locus", "for", "CD4", "+", "naïve", "T", "cells", "and", "WT", "Treg", "cells", ".", "Hydroxymethylated", "regions", "(", "hmRs", ")", "and", "DhmRs", "are", "shown", "on", "the", "top", ";", "conservation", "(", "cons", ")", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Genome browser view of CMS-IP data showing CMS (5hmC) distribution at Il2ra and Foxp3 locus for CD4+ naïve T cells and WT Treg cells. Hydroxymethylated regions (hmRs) and DhmRs are shown on the top; conservation (cons) is shown at the bottom."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "E", ")", "Genome", "browser", "view", "of", "DNA", "methylation", "patterns", "of", "Hopx", "and", "Il10", "loci", "for", "CD4", "+", "naïve", "T", "cells", ",", "WT", "Treg", "cells", "and", "Tet2", "/", "3", "DKO", "Treg", "cells", ".", "Differentially", "hydroxymethylated", "regions", "(", "DhmRs", ")", "and", "differentially", "methylated", "CpGs", "(", "DM", "-", "CpGs", ")", "are", "shown", "on", "top", "of", "the", "tracks", ".", "Conservation", "track", "(", "Cons", ")", "and", "denotation", "of", "all", "CpGs", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "WGBS", "data", "are", "from", "two", "biological", "replicate", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(E) Genome browser view of DNA methylation patterns of Hopx and Il10 loci for CD4+ naïve T cells, WT Treg cells and Tet2/3 DKO Treg cells. Differentially hydroxymethylated regions (DhmRs) and differentially methylated CpGs (DM-CpGs) are shown on top of the tracks. Conservation track (Cons) and denotation of all CpGs are shown at the bottom. WGBS data are from two biological replicate samples."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Genome", "browser", "view", "of", "chromatin", "accessibilities", "at", "Hopx", "and", "Il10", "loci", "for", "CD4", "+", "naïve", "T", "cells", ",", "WT", "Treg", "cells", "and", "Tet2", "/", "3", "DKO", "Treg", "cells", ".", "DhmRs", ",", "DM", "-", "CpGs", "and", "DARs", "(", "shaded", ")", "are", "shown", "on", "top", "of", "the", "tracks", ".", "Conservation", "track", "(", "Cons", ")", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Genome browser view of chromatin accessibilities at Hopx and Il10 loci for CD4+ naïve T cells, WT Treg cells and Tet2/3 DKO Treg cells. DhmRs, DM-CpGs and DARs (shaded) are shown on top of the tracks. Conservation track (Cons) is shown at the bottom."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "H", "-", "J", ")", "Box", "-", "and", "-", "whisker", "plots", "of", "DNA", "methylation", "levels", "for", "DM", "-", "CpGs", "less", "methylated", "in", "TGFβ", "+", "RA", "+", "VitC", "iTregs", "vs", "TGFβ", "iTregs", "(", "H", ")", ",", "DM", "-", "CpGs", "less", "methylated", "in", "WT", "Treg", "cells", "vs", "CD4", "+", "naïve", "T", "cells", "(", "I", ")", "and", "DM", "-", "CpGs", "less", "methylated", "in", "WT", "Treg", "cells", "vs", "Tet2", "/", "3", "DKO", "Treg", "cells", "(", "J", ")", ".", "DM", "-", "CpGs", "denotes", "the", "CpGs", "in", "the", "respective", "cell", "types", "used", "for", "the", "comparison", ".", "Boxplots", "show", "the", "median", "and", "quartiles", "with", "the", "whiskers", "extending", "to", "the", "most", "extreme", "data", "point", "within", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", ".", "P", "-", "values", "are", "shown", "above", "relevant", "comparisons", "and", "are", "calculated", "using", "an", "analysis", "of", "variances", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "Data", "are", "from", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(H-J) Box-and-whisker plots of DNA methylation levels for DM-CpGs less methylated in TGFβ + RA + VitC iTregs vs TGFβ iTregs (H), DM-CpGs less methylated in WT Treg cells vs CD4+ naïve T cells (I) and DM-CpGs less methylated in WT Treg cells vs Tet2/3 DKO Treg cells (J). DM-CpGs denotes the CpGs in the respective cell types used for the comparison. Boxplots show the median and quartiles with the whiskers extending to the most extreme data point within 1.5 times the interquartile range. P-values are shown above relevant comparisons and are calculated using an analysis of variances with Tukey's post-hoc test. Data are from two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "Graphs", "depicting", "the", "percentage", "of", "viable", "cells", "for", "TGFβ", "iTregs", "(", "left", ")", "and", "TGFβ", "+", "RA", "+", "VitC", "iTregs", "(", "right", ")", "differentiated", "with", "0", "U", "/", "ml", ",", "1", "U", "/", "ml", ",", "5", "U", "/", "ml", "and", "10", "U", "/", "ml", "IL", "-", "2", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", "from", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) Graphs depicting the percentage of viable cells for TGFβ iTregs (left) and TGFβ+RA+VitC iTregs (right) differentiated with 0 U/ml, 1 U/ml, 5 U/ml and 10 U/ml IL-2. Error bars show mean ± S.D. from three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "STAT5", "occupancy", "at", "Foxp3", "CNS2", "and", "IL2Rα", "IN1b", "regions", "in", "TGFβ", "and", "TGFβ", "+", "RA", "+", "VitC", "iTregs", "without", "or", "with", "3", "U", "/", "ml", "IL", "-", "2", "restimulation", ".", "GMPR", "is", "a", "negative", "control", "region", ".", "Data", "are", "from", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C) ChIP-qPCR showing STAT5 occupancy at Foxp3 CNS2 and IL2Rα IN1b regions in TGFβ and TGFβ + RA + VitC iTregs without or with 3 U/ml IL-2 restimulation. GMPR is a negative control region. Data are from two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ",", "E", ")", "Imaging", "of", "luciferase", "activity", "in", "the", "liver", "of", "HIF1aAlbKO", "(", "D", ")", "and", "HIF2aAlbKO", "(", "E", ")", "mice", "after", "a", "hydrodynamic", "tail", "vein", "injection", "with", "a", "HRE", "-", "luc", "reporter", "plasmid", "or", "control", "(", "PBS", ")", "according", "to", "body", "weight", "followed", "by", "6h", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Bioluminescent", "photon", "counts", "normalized", "to", "the", "PBS", "control", "group", "in", "liver", "of", "(", "F", ")", "HIF1aAlbKO", "and", "(", "G", ")", "HIF2aALbKO", "mice", "and", "their", "wild", "-", "type", "littermates", "6h", "after", "normoxia", "of", "hypoxia", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Each", "individual", "data", "point", "represent", "individual", "mice", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "N", "=", "normoxia", ",", "H", "=", "hypoxia", ".", "Signal", "around", "the", "perimeter", "of", "the", "Petri", "dishes", "represent", "aspecific", "luciferase", "signal", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D, E) Imaging of luciferase activity in the liver of HIF1aAlbKO (D) and HIF2aAlbKO (E) mice after a hydrodynamic tail vein injection with a HRE-luc reporter plasmid or control (PBS) according to body weight followed by 6h normoxia or hypoxia. (F, G) Bioluminescent photon counts normalized to the PBS control group in liver of (F) HIF1aAlbKO and (G) HIF2aALbKO mice and their wild-type littermates 6h after normoxia of hypoxia. Data information: All bars represent mean ± SEM. Each individual data point represent individual mice. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. *** P<0.001; ** P≤ 0.01; * P≤ 0.05. N = normoxia, H = hypoxia. Signal around the perimeter of the Petri dishes represent aspecific luciferase signal. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "E", ")", "Scatter", "plot", "showing", "log", "fold", "change", "(", "LFC", ")", "of", "all", "DEX", "-", "upregulated", "genes", "(", "LFC", ">", "1", "and", "P", "≤", "0", ".", "05", ")", "and", "DEX", "-", "downregulated", "genes", "(", "LFC", "<", "-", "1", "and", "P", "≤", "0", ".", "05", ")", "in", "normoxia", "vs", "hypoxia", "after", "24h", ".", "The", "black", "line", "represents", "the", "diagonal", ",", "and", "the", "red", "line", "represents", "the", "real", "slope", "±", "standard", "error", "of", "the", "data", "as", "analysed", "by", "linear", "regression", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Examples", "of", "GR", "-", "responsive", "genes", "based", "on", "the", "RNA", "-", "seq", "data", "6h", "(", "F", ")", "and", "24h", "(", "G", ")", "after", "normoxia", "or", "hypoxia", "and", "DEX", "stimulation", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "N", "=", "3", "per", "group", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "H", "ChIP", "-", "seq", "on", "liver", "derived", "from", "mice", "which", "were", "subjected", "to", "hypoxia", "(", "6h", "and", "24h", ")", ",", "followed", "by", "DEX", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "injection", "and", "2h", "later", "sacrificed", "for", "liver", "isolation", ".", "(", "H", ")", "Box", "plots", "showing", "the", "LFC", "of", "genes", "responsive", "to", "DEX", "in", "both", "normoxia", "or", "hypoxia", "(", "6h", "and", "24h", ")", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", ".", "The", "box", "ranges", "from", "the", "first", "quartile", "(", "Q1", ")", "to", "the", "third", "quartile", "(", "Q3", ")", "which", "represents", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", "=", "Q3", "-", "Q1", ")", "and", "covers", "the", "central", "50", "%", "of", "the", "data", ".", "The", "whiskers", "illustrate", "the", "minimum", "(", "Q1", "-", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "and", "maximum", "(", "Q3", "+", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "of", "the", "data", ".", "Outliers", "are", "shown", "as", "dots", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(E) Scatter plot showing log fold change (LFC) of all DEX-upregulated genes (LFC > 1 and P ≤ 0.05) and DEX-downregulated genes (LFC < -1 and P ≤ 0.05) in normoxia vs hypoxia after 24h. The black line represents the diagonal, and the red line represents the real slope ± standard error of the data as analysed by linear regression.(F, G) Examples of GR-responsive genes based on the RNA-seq data 6h (F) and 24h (G) after normoxia or hypoxia and DEX stimulation. Data information: All bars represent mean ± SEM. N=3 per group. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ***P<0.001, **P<0.01.(H ChIP-seq on liver derived from mice which were subjected to hypoxia (6h and 24h), followed by DEX (10 mg/kg) injection and 2h later sacrificed for liver isolation. (H) Box plots showing the LFC of genes responsive to DEX in both normoxia or hypoxia (6h and 24h). The central band represents the median. The box ranges from the first quartile (Q1) to the third quartile (Q3) which represents the interquartile range (IQR = Q3 - Q1) and covers the central 50% of the data. The whiskers illustrate the minimum (Q1 - 1.5*IQR) and maximum (Q3 + 1.5*IQR) of the data. Outliers are shown as dots. N=3 biological replicates per condition."}
{"words": ["Figure", "3Female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "put", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", "for", "6h", "or", "24h", ",", "injected", "i", ".", "p", ".", "with", "PBS", "or", "DEX", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "and", "livers", "were", "isolated", "for", "genome", "-", "wide", "transcriptomics", "via", "RNA", "-", "seq", ".", "N", "=", "3", "per", "group", "for", "a", "single", "RNA", "-", "seq", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Examples", "of", "DEX", "-", "responsive", "genes", "in", "hypoxia", "6h", "(", "A", ")", "and", "24h", "(", "B", ")", "which", "were", "not", "induced", "by", "DEX", "in", "normoxia", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "ChIP", "-", "seq", "on", "liver", "derived", "from", "mice", "which", "were", "subjected", "to", "hypoxia", "(", "6h", "and", "24h", ")", ",", "followed", "by", "DEX", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "injection", "and", "2h", "later", "sacrificed", "for", "liver", "isolation", ".", "(", "E", ")", "Examples", "of", "specific", "GR", "DNA", "-", "binding", "peaks", ",", "associated", "with", "the", "DEX", "-", "induced", "gene", "Slc22a5", "in", "hypoxia", "(", "6h", "and", "24h", ")", ".", "(", "F", ")", "HIF1aHIF2afl", "/", "fl", "and", "HIF1aHIF2aAlbKO", "mice", "were", "put", "in", "hypoxia", "for", "6h", "and", "stimulated", "with", "DEX", ".", "Slc25a30", "expression", "was", "measured", "in", "the", "liver", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "N", "=", "3", "per", "group", ",", "one", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Female C57BL/6J mice were put in normoxia or hypoxia for 6h or 24h, injected i.p. with PBS or DEX (10 mg/kg) and livers were isolated for genome-wide transcriptomics via RNA-seq. N=3 per group for a single RNA-seq. (A, B) Examples of DEX-responsive genes in hypoxia 6h (A) and 24h (B) which were not induced by DEX in normoxia. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.ChIP-seq on liver derived from mice which were subjected to hypoxia (6h and 24h), followed by DEX (10 mg/kg) injection and 2h later sacrificed for liver isolation. (E) Examples of specific GR DNA-binding peaks, associated with the DEX-induced gene Slc22a5 in hypoxia (6h and 24h).(F) HIF1aHIF2afl/fl and HIF1aHIF2aAlbKO mice were put in hypoxia for 6h and stimulated with DEX. Slc25a30 expression was measured in the liver via RT-qPCR. N=3 per group, one experiment. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Heatmap", "representing", "log2", "values", "of", "shared", "stress", "GRE", "genes", "(", "counts", ")", "induced", "by", "hypoxia", "6h", "and", "24h", "and", "induced", "by", "DEX", "in", "normoxia", "(", "LFC", ">", "1", "and", "P", "≤", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "Female", "C57BL", "/", "6J", "and", "ADX", "mice", "were", "put", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", "for", "6h", "or", "24h", ",", "n", "=", "6", "/", "group", ",", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Confirmation", "of", "RNA", "-", "seq", "data", "via", "RT", "-", "qPCR", "[", "6h", "(", "D", ")", "or", "24h", "(", "E", ")", "]", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Plasma", "GC", "concentration", "[", "6h", "(", "F", ")", "or", "24h", "(", "G", ")", "]", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "M", ")", "HIF1aHIF2afl", "/", "fl", "and", "HIF1aHIF2aAlbKO", "mice", "were", "put", "in", "hypoxia", "for", "6h", ".", "Stress", "GRE", "genes", "were", "measured", "in", "the", "liver", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "N", "=", "4", "per", "group", ",", "one", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "N", ")", "Expression", "levels", "of", "DEX", "responsive", "genes", "in", "normoxia", "and", "unique", "DEX", "responsive", "genes", "induced", "by", "hypoxia", "were", "measured", "in", "the", "liver", "of", "ADX", "mice", "after", "DEX", "stimulation", "during", "hypoxia", "(", "24h", ")", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ",", "one", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Heatmap representing log2 values of shared stress GRE genes (counts) induced by hypoxia 6h and 24h and induced by DEX in normoxia (LFC > 1 and P ≤ 0.05).(D-G) Female C57BL/6J and ADX mice were put in normoxia or hypoxia for 6h or 24h, n=6/group, two independent experiments. (D, E) Confirmation of RNA-seq data via RT-qPCR [6h (D) or 24h (E)]. (F, G) Plasma GC concentration [6h (F) or 24h (G)]. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.(M) HIF1aHIF2afl/fl and HIF1aHIF2aAlbKO mice were put in hypoxia for 6h. Stress GRE genes were measured in the liver via RT-qPCR. N=4 per group, one experiment. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.(N) Expression levels of DEX responsive genes in normoxia and unique DEX responsive genes induced by hypoxia were measured in the liver of ADX mice after DEX stimulation during hypoxia (24h) via RT-qPCR. N=3-4 per group, one experiment. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "HIF1α", "and", "HIF2α", "protein", "levels", "were", "analysed", "via", "western", "blot", "using", "VINCULIN", "as", "a", "loading", "control", ".", "HIF1α", "and", "HIF2α", "protein", "levels", "were", "quantified", "using", "FIJI", "and", "normalized", "to", "VINCULIN", "levels", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "N", "=", "5", "biological", "replicates", "per", "group", ".", "N", "=", "normoxia", ",", "H", "=", "hypoxia", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) HIF1α and HIF2α protein levels were analysed via western blot using VINCULIN as a loading control. HIF1α and HIF2α protein levels were quantified using FIJI and normalized to VINCULIN levels. P-values were calculated using Mann-Whitney test. N=5 biological replicates per group. N = normoxia, H = hypoxia. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, **P<0.01, *P≤0.05."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Female", "C57BL", "/", "6J", "and", "ADX", "mice", "were", "put", "in", "normoxia", "and", "hypoxia", "for", "6h", "and", "24h", ".", "Plasma", "was", "isolated", "for", "metabolomics", "analysis", ".", "The", "heatmap", "represents", "log10", "of", "metabolites", "which", "are", "significantly", "increased", "of", "the", "plasma", "of", "C57BL", "/", "6J", "mice", "(", "C57BL", "/", "6J", "P", "≤", "0", ".", "05", "and", "ADX", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "LFC", ">", "1", ")", ",", "significantly", "increased", "in", "the", "plasma", "of", "C57BL", "/", "6J", "and", "ADX", "mice", "(", "C57BL", "/", "6J", "P", "≤", "0", ".", "05", "and", "ADX", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "LFC", ">", "1", ")", ",", "and", "significantly", "increased", "in", "the", "plasma", "of", "ADX", "mice", "only", "(", "C57BL", "/", "6J", "P", ">", "0", ".", "05", "and", "ADX", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "LFC", ">", "1", ")", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "FFA", "levels", "and", "stress", "GRE", "genes", "were", "determined", "in", "the", "plasma", "and", "iWAT", "of", "female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "injected", "with", "5", "mg", "RU486", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "(", "D", ",", "F", ")", ",", "and", "in", "GRdim", "/", "dim", "mice", "and", "their", "wild", "-", "type", "littermates", "(", "E", ",", "G", ")", "after", "6h", "of", "normoxia", "and", "hypoxia", ".", "N", "=", "4", "-", "9", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "H", "-", "J", ")", "Blood", "ketone", "body", "levels", "6h", "after", "normoxia", "and", "hypoxia", "in", "female", "C57BL", "/", "6J", "and", "ADX", "mice", "(", "H", ")", ",", "in", "female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "injected", "with", "5", "mg", "RU486", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "(", "I", ")", ",", "and", "in", "GRdim", "/", "dim", "mice", "and", "their", "wild", "-", "type", "littermates", "(", "J", ")", ".", "N", "=", "5", "-", "9", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Female C57BL/6J and ADX mice were put in normoxia and hypoxia for 6h and 24h. Plasma was isolated for metabolomics analysis. The heatmap represents log10 of metabolites which are significantly increased of the plasma of C57BL/6J mice (C57BL/6J P ≤ 0.05 and ADX P > 0.05, LFC > 1), significantly increased in the plasma of C57BL/6J and ADX mice (C57BL/6J P ≤ 0.05 and ADX P ≤ 0.05, LFC > 1), and significantly increased in the plasma of ADX mice only (C57BL/6J P > 0.05 and ADX P ≤ 0.05, LFC > 1).(D-G) FFA levels and stress GRE genes were determined in the plasma and iWAT of female C57BL/6J mice injected with 5 mg RU486 or vehicle (DMSO) (D, F), and in GRdim/dim mice and their wild-type littermates (E, G) after 6h of normoxia and hypoxia. N=4-9 per group. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.(H-J) Blood ketone body levels 6h after normoxia and hypoxia in female C57BL/6J and ADX mice (H), in female C57BL/6J mice injected with 5 mg RU486 or vehicle (DMSO) (I), and in GRdim/dim mice and their wild-type littermates (J). N=5-9 per group. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "put", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", "for", "24h", ",", "injected", "with", "PBS", "or", "DEX", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "and", "2h", "later", ",", "indicated", "organs", "were", "isolated", "and", "gene", "expression", "was", "measured", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "Survival", "curves", "were", "analysed", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "LPS", "LD100", "dose", "-", "response", "in", "female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "injected", "with", "indicated", "LPS", "doses", "after", "24h", "hypoxia", ".", "During", "the", "follow", "-", "up", "of", "lethality", ",", "mice", "remained", "under", "hypoxic", "conditions", ".", "N", "-", "values", "are", "indicated", "in", "the", "legend", ".", "(", "E", ")", "Female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "14", ".", "5", "mg", "/", "kg", "LPS", "(", "normoxia", ")", "or", "5", "mg", "/", "kg", "LPS", "(", "hypoxia", ")", "after", "24h", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "Liver", "was", "isolated", "6h", "after", "injected", "and", "typical", "GRE", "genes", "were", "measured", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "N", "=", "4", "-", "5", "per", "group", ".", "(", "F", ")", "Female", "ADX", "mice", "were", "put", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", "for", "24h", ",", "injected", "i", ".", "p", ".", "with", "PBS", "or", "DEX", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "and", "2h", "later", ",", "liver", "was", "isolated", "for", "RT", "-", "qPCR", "analyses", "of", "typical", "GRE", "genes", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "during", "the", "pairwise", "multiple", "comparisons", ",", "except", "if", "otherwise", "stated", ".", "Survival", "curves", "were", "analysed", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "G", ")", "Female", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "14", ".", "5", "mg", "/", "kg", "LPS", "(", "normoxia", ")", "or", "5", "mg", "/", "kg", "LPS", "(", "hypoxia", ")", "after", "24h", "normoxia", "or", "hypoxia", ",", "with", "or", "without", "pre", "-", "treatment", "with", "10", "mg", "/", "kg", "DEX", "1h", "before", "LPS", "injection", ".", "During", "the", "follow", "-", "up", "of", "lethality", ",", "mice", "remained", "under", "normoxic", "or", "hypoxic", "conditions", ".", "Mice", "in", "normoxia", ":", "black", "circles", "(", "LPS", ")", ",", "black", "squares", "(", "DEX", "-", "LPS", ")", ";", "mice", "in", "hypoxia", ":", "white", "circles", "(", "LPS", ")", ",", "white", "squares", "(", "DEX", "-", "LPS", ")", ".", "(", "H", ")", "Female", "ADX", "mice", "were", "injected", "with", "0", ".", "05", "mg", "/", "kg", "LPS", "after", "24h", "normoxia", "or", "hypoxia", ",", ",", "with", "or", "without", "10", "mg", "/", "kg", "DEX", "pre", "-", "treatment", "1h", "before", "LPS", "injection", ".", "During", "the", "follow", "-", "up", "of", "lethality", ",", "mice", "remained", "under", "normoxic", "or", "hypoxic", "conditions", ".", "ADX", "mice", "in", "normoxia", ":", "black", "circles", "(", "LPS", ")", ",", "black", "squares", "(", "DEX", "-", "LPS", ")", ";", "ADX", "mice", "in", "hypoxia", ":", "white", "circles", "(", "LPS", ")", ",", "white", "squares", "(", "DEX", "-", "LPS", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Female C57BL/6J mice (n=3 per group) were put in normoxia or hypoxia for 24h, injected with PBS or DEX (10 mg/kg) and 2h later, indicated organs were isolated and gene expression was measured via RT-qPCR. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. Survival curves were analysed with Fisher's exact test. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.(B) LPS LD100 dose-response in female C57BL/6J mice injected with indicated LPS doses after 24h hypoxia. During the follow-up of lethality, mice remained under hypoxic conditions. N-values are indicated in the legend.(E) Female C57BL/6J mice were injected with 14.5 mg/kg LPS (normoxia) or 5 mg/kg LPS (hypoxia) after 24h normoxia or hypoxia. Liver was isolated 6h after injected and typical GRE genes were measured via RT-qPCR. N=4-5 per group. (F) Female ADX mice were put in normoxia or hypoxia for 24h, injected i.p. with PBS or DEX (10 mg/kg) and 2h later, liver was isolated for RT-qPCR analyses of typical GRE genes. N=3-4 per group. Data information: All bars represent mean ± SEM. P-values were calculated using two-way ANOVA followed by post-hoc Šídák's multiple comparisons test to correct for multiple testing during the pairwise multiple comparisons, except if otherwise stated. Survival curves were analysed with Fisher's exact test. ****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P≤0.05.(G) Female C57BL/6J mice were injected with 14.5 mg/kg LPS (normoxia) or 5 mg/kg LPS (hypoxia) after 24h normoxia or hypoxia, with or without pre-treatment with 10 mg/kg DEX 1h before LPS injection. During the follow-up of lethality, mice remained under normoxic or hypoxic conditions. Mice in normoxia: black circles (LPS), black squares (DEX-LPS); mice in hypoxia: white circles (LPS), white squares (DEX-LPS).(H) Female ADX mice were injected with 0.05 mg/kg LPS after 24h normoxia or hypoxia, , with or without 10 mg/kg DEX pre-treatment 1h before LPS injection. During the follow-up of lethality, mice remained under normoxic or hypoxic conditions. ADX mice in normoxia: black circles (LPS), black squares (DEX-LPS); ADX mice in hypoxia: white circles (LPS), white squares (DEX-LPS)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "The", "Western", "blot", "analysis", "of", "GFP", ",", "Spd2", "and", "αTub", "(", "loading", "control", ")", "in", "the", "brain", "extracts", "from", "wild", "type", "(", "Oregon", "R", ",", "OR", ")", ",", "Spd2WT", "-", "OE", "and", "Spd2DK", "-", "OE", "third", "instar", "larva", ".", "Representative", "immune", "blot", "images", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "The", "signal", "intensities", "of", "Spd2", "bands", "were", "quantified", "and", "normalised", "against", "αTub", "values", ".", "The", "values", "relative", "to", "control", "of", "each", "biological", "replicate", "(", "n", "=", "2", ")", "and", "their", "means", "are", "shown", "as", "dots", "and", "bars", ",", "respectively", ",", "in", "a", "scatted", "dot", "plot", "on", "the", "right", ".", "The", "numbers", "above", "the", "bars", "indicate", "means", "±", "Range", ".", "GFP", "-", "Spd2DK", "proteins", "in", "Spd2DK", "-", "OE", "larval", "brain", "extracts", "showed", "approximately", "2", ".", "04", "-", "fold", "higher", "accumulation", "than", "GFP", "-", "Spd2WT", "proteins", "in", "Spd2WT", "-", "OE", "brain", "extracts", ".", "(", "C", ")", "The", "Western", "blot", "analysis", "of", "Spd2", ",", "CycB", "and", "αTub", "in", "OR", ",", "fzrRNAi", ",", "Spd2WT", "-", "RES", "and", "Spd2DK", "-", "RES", "brain", "extracts", ".", "The", "signal", "intensities", "of", "Spd2", "bands", "were", "quantified", "and", "normalised", "against", "αTub", "values", ".", "The", "values", "relative", "to", "control", "and", "their", "means", "are", "presented", "in", "a", "scatted", "dot", "plot", "on", "the", "right", "(", "biological", "replicate", "n", "=", "2", ")", ".", "Means", "±", "Range", "are", "shown", "above", "the", "bars", ".", "RFP", "-", "Spd2DK", "proteins", "in", "Spd2DK", "-", "RES", "larval", "brain", "extracts", "showed", "approximately", "2", ".", "08", "-", "fold", "higher", "accumulation", "than", "RFP", "-", "Spd2WT", "proteins", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "brain", "extracts", ".", "(", "D", ")", "Larval", "brains", "of", "OR", ",", "Spd2WT", "-", "RES", ",", "fzrRNAi", "and", "Spd2WT", "-", "OE", "flies", "were", "stained", "by", "an", "anti", "-", "Spd2", "antibody", ".", "Representative", "images", "of", "NBs", "are", "shown", "on", "the", "top", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "The", "local", "signal", "intensities", "of", "Spd2", "immunofluorescence", "at", "the", "centrosomes", "and", "in", "the", "cytoplasm", "of", "individual", "NBs", "in", "each", "brain", "were", "measured", ",", "and", "the", "normalised", "Spd2", "signal", "intensities", "in", "individual", "NBs", "were", "presented", "as", "scattered", "dot", "plots", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", "for", "detail", ")", ".", "The", "lines", "indicate", "means", "±", "SD", ".", "The", "numbers", "of", "NBs", "(", "n", ")", "and", "the", "numbers", "of", "brains", "analysed", "(", "N", ")", "are", "control", ":", "n", "=", "29", "(", "N", "=", "6", ")", ",", "Spd2WT", "-", "RES", ":", "n", "=", "30", "(", "N", "=", "4", ")", ",", "fzrRNA", ":", "n", "=", "30", "(", "N", "=", "6", ")", ",", "and", "Spd2WT", "-", "OE", ":", "n", "=", "27", "(", "N", "=", "10", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "non", "-", "parametric", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "Based", "on", "these", "results", ",", "the", "relative", "centrosomal", "Spd2", "protein", "levels", "in", "NBs", "can", "be", "estimated", "as", "wildtype", "(", "or", "control", ")", ":", "Spd2WT", "-", "RES", ":", "fzrRNAi", ":", "Spd2DK", "-", "RES", ":", "Spd2WT", "-", "OE", ":", "Spd2DK", "-", "OE", "­", "=", "1", ":", "1", ".", "00", "~", "1", ".", "18", ":", "1", ".", "06", "~", "1", ".", "29", ":", "2", ".", "08", "~", "2", ".", "45", "(", "=", "1", ".", "00", "~", "1", ".", "18", "x", "2", ".", "08", ")", ":", "1", ".", "93", "~", "3", ".", "62", ":", "3", ".", "94", "~", "7", ".", "38", "(", "=", "1", ".", "93", "~", "3", ".", "62", "x", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) The Western blot analysis of GFP, Spd2 and αTub (loading control) in the brain extracts from wild type (Oregon R, OR), Spd2WT-OE and Spd2DK-OE third instar larva. Representative immune blot images are shown on the left. The signal intensities of Spd2 bands were quantified and normalised against αTub values. The values relative to control of each biological replicate (n = 2) and their means are shown as dots and bars, respectively, in a scatted dot plot on the right. The numbers above the bars indicate means ± Range. GFP-Spd2DK proteins in Spd2DK-OE larval brain extracts showed approximately 2.04-fold higher accumulation than GFP-Spd2WT proteins in Spd2WT-OE brain extracts. (C) The Western blot analysis of Spd2, CycB and αTub in OR, fzrRNAi, Spd2WT-RES and Spd2DK-RES brain extracts. The signal intensities of Spd2 bands were quantified and normalised against αTub values. The values relative to control and their means are presented in a scatted dot plot on the right (biological replicate n = 2). Means ± Range are shown above the bars. RFP-Spd2DK proteins in Spd2DK-RES larval brain extracts showed approximately 2.08-fold higher accumulation than RFP-Spd2WT proteins in Spd2WT-RES brain extracts.(D) Larval brains of OR, Spd2WT-RES, fzrRNAi and Spd2WT-OE flies were stained by an anti-Spd2 antibody. Representative images of NBs are shown on the top. Scale bar: 10 µm. The local signal intensities of Spd2 immunofluorescence at the centrosomes and in the cytoplasm of individual NBs in each brain were measured, and the normalised Spd2 signal intensities in individual NBs were presented as scattered dot plots (see Materials and Methods for detail). The lines indicate means ± SD. The numbers of NBs (n) and the numbers of brains analysed (N) are control: n= 29 (N = 6), Spd2WT-RES: n = 30 (N = 4), fzrRNA: n = 30 (N = 6), and Spd2WT-OE: n = 27 (N = 10). P values were calculated using non-parametric two-tailed Mann-Whitney tests. Based on these results, the relative centrosomal Spd2 protein levels in NBs can be estimated as wildtype (or control) : Spd2WT-RES: fzrRNAi: Spd2DK-RES: Spd2WT-OE: Spd2DK-OE ­= 1: 1.00~1.18: 1.06~1.29: 2.08~2.45 (= 1.00~1.18 x 2.08): 1.93~3.62: 3.94 ~ 7.38 (= 1.93~3.62 x 2.04"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "In", "time", "lapse", "movies", ",", "NBs", "that", "showed", "an", "active", "centrosome", "that", "was", "attached", "to", "the", "cortex", "(", "\"", "Attached", "\"", ")", "and", "NBs", "with", "both", "two", "centrosomes", "being", "inactivated", "and", "detached", "from", "the", "cortex", "(", "\"", "Detached", "\"", ")", "in", "interphase", "were", "counted", "in", "third", "instar", "larval", "brains", "of", "the", "indicated", "fly", "lines", "and", "their", "proportions", "are", "presented", "in", "bar", "graphs", ".", "The", "numbers", "of", "NBs", "analysed", "from", "at", "least", "four", "brains", "(", "n", ")", "are", "Control", ":", "29", ",", "fzrRNAi", ":", "80", ",", "Spd2WT", "-", "RES", ":", "45", ",", "Spd2DK", "-", "RES", ":", "52", ",", "Spd2WT", "-", "OE", ":", "43", ",", "Spd2DK", "-", "OE", ":", "40", ",", "Spd2WT", "-", "OE", "+", "fzrRNAi", ":", "72", ".", "p", "-", "values", "are", "fzrRNAi", ":", "0", ".", "0069", ",", "Spd2WT", "-", "RES", ":", "0", ".", "2479", ",", "Spd2DK", "-", "RES", ":", "0", ".", "0116", ",", "Spd2WT", "-", "OE", ":", "<", "0", ".", "0001", ",", "Spd2DK", "-", "OE", ":", "<", "0", ".", "0001", ",", "Spd2WT", "-", "OE", "+", "fzrRNAi", ":", "0", ".", "0008", "(", "Pearson", "'", "s", "chi", "-", "squared", "tests", "were", "performed", "between", "control", "and", "each", "condition", ")", ".", "(", "E", ")", "The", "signal", "intensities", "of", "the", "indicated", "centriolar", "and", "PCM", "proteins", "at", "two", "centrosomes", "were", "quantified", "in", "individual", "interphase", "NBs", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "and", "Spd2DK", "-", "RES", "larval", "brains", ",", "and", "their", "asymmetric", "distributions", "of", "their", "centrosomal", "signals", "between", "the", "two", "centrosomes", "are", "presented", "as", "Asymmetric", "Indexes", "(", "see", "Materials", "and", "Method", ")", "in", "a", "scatted", "dot", "plot", ".", "Red", "bars", "represent", "means", "±", "SD", ".", "The", "numbers", "of", "NBs", "analysed", "from", "at", "least", "3", "different", "brains", "of", "Spd2WT", "-", "RES", "and", "Spd2DK", "-", "RES", "(", "n", ")", "were", "40", "and", "40", "for", "Asl", ",", "40", "and", "41", "for", "RFP", "-", "Spd2", ",", "42", "and", "37", "for", "Cnn", ",", "40", "and", "41", "for", "γTub", ",", "and", "40", "and", "40", "for", "AurA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) In time lapse movies, NBs that showed an active centrosome that was attached to the cortex (\"Attached\") and NBs with both two centrosomes being inactivated and detached from the cortex (\"Detached\") in interphase were counted in third instar larval brains of the indicated fly lines and their proportions are presented in bar graphs. The numbers of NBs analysed from at least four brains (n) are Control: 29, fzrRNAi: 80, Spd2WT-RES: 45, Spd2DK-RES: 52, Spd2WT-OE: 43, Spd2DK-OE: 40, Spd2WT-OE + fzrRNAi: 72. p-values are fzrRNAi: 0.0069, Spd2WT-RES: 0.2479, Spd2DK-RES: 0.0116, Spd2WT-OE: <0.0001, Spd2DK-OE: <0.0001, Spd2WT-OE + fzrRNAi: 0.0008 (Pearson's chi-squared tests were performed between control and each condition).(E) The signal intensities of the indicated centriolar and PCM proteins at two centrosomes were quantified in individual interphase NBs in Spd2WT-RES and Spd2DK-RES larval brains, and their asymmetric distributions of their centrosomal signals between the two centrosomes are presented as Asymmetric Indexes (see Materials and Method) in a scatted dot plot. Red bars represent means ± SD. The numbers of NBs analysed from at least 3 different brains of Spd2WT-RES and Spd2DK-RES (n) were 40 and 40 for Asl, 40 and 41 for RFP-Spd2, 42 and 37 for Cnn, 40 and 41 for γTub, and 40 and 40 for AurA."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "Division", "axis", "deviations", "were", "separately", "analysed", "in", "NBs", "with", "apically", "attached", "interphase", "centrosomes", "(", "\"", "attached", "\"", ")", "and", "those", "with", "centrosomes", "being", "detached", "from", "the", "cortex", "(", "\"", "detached", "\"", ")", "for", "each", "line", ",", "using", "the", "same", "dataset", "as", "in", "Fig", ".", "3C", ".", "The", "same", "control", "data", "as", "in", "Fig", ".", "3C", "is", "shown", "for", "reference", ".", "fzrRNA", "detached", "(", "mean", "±", "SD", ":", "34", ".", "62", "°", "±", "23", ".", "39", ")", ",", "Spd2DK", "-", "OE", "detached", "(", "64", ".", "01", "°", "±", "33", ".", "93", ")", ",", "and", "Spd2WT", "-", "OE", "+", "fzrRNAi", "attached", "(", "39", ".", "55", "°", "±", "27", ".", "08", ")", "and", "detached", "(", "59", ".", "08", "°", "±", "34", ".", "88", ")", "brains", "showed", "statistically", "significant", "differences", "from", "control", ",", "while", "NBs", "with", "cortically", "attached", "centrosomes", "in", "any", "of", "the", "lines", "did", "not", "show", "significant", "differences", ".", "n", ":", "the", "number", "of", "NB", "divisions", "analysed", "from", "at", "least", "four", "brains", "for", "each", "line", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "tests", "comparing", "with", "control", "and", "are", "shown", "above", "the", "dots", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) Division axis deviations were separately analysed in NBs with apically attached interphase centrosomes (\"attached\") and those with centrosomes being detached from the cortex (\"detached\") for each line, using the same dataset as in Fig. 3C. The same control data as in Fig. 3C is shown for reference. fzrRNA detached (mean ± SD: 34.62° ± 23.39), Spd2DK-OE detached (64.01° ± 33.93), and Spd2WT-OE+fzrRNAi attached (39.55° ± 27.08) and detached (59.08° ± 34.88) brains showed statistically significant differences from control, while NBs with cortically attached centrosomes in any of the lines did not show significant differences. n: the number of NB divisions analysed from at least four brains for each line. p-values were calculated using Mann-Whitney U tests comparing with control and are shown above the dots."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Selected", "images", "from", "time", "-", "lapse", "microscopy", "of", "NBs", "in", "control", "(", "wor", ">", "mCh", "-", "Tub", ",", "pUbq", "-", "GFP", "-", "Fzr", ",", "top", "panels", ")", "and", "Spd2DK", "-", "OE", "(", "lower", "panels", ")", "larval", "brains", "(", "Movies", "EV1", ",", "EV10", ")", ".", "In", "the", "control", "NB", ",", "the", "daughter", "centrosomes", "(", "blue", "arrowheads", ")", "first", "matured", "(", "-", "5", ".", "0", "min", ")", "and", "was", "segregated", "into", "the", "daughter", "NB", "(", "12", ".", "0", "min", ")", ",", "while", "the", "mother", "centrosome", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "matured", "a", "little", "later", "(", "0", ".", "0", "min", ")", "and", "segregated", "into", "the", "GMC", ".", "In", "contrast", ",", "in", "the", "Spd2DK", "-", "OE", "NB", ",", "both", "centrosomes", "lost", "microtubule", "nucleation", "activity", "in", "interphase", "(", "red", "arrowheads", ")", ".", "The", "centrosome", "that", "matured", "earlier", "(", "blue", "arrowheads", ",", "-", "6", ".", "0", "min", ")", "was", "incorrectly", "segregated", "into", "the", "GMC", "(", "12", ".", "0", "min", ")", "while", "the", "centrosome", "that", "matured", "later", "(", "yellow", "arrowheads", ",", "0", ".", "0", "min", ")", "was", "segregated", "into", "the", "NB", "(", "12", ".", "0", "min", ")", ".", "Dotted", "white", "lines", "outline", "the", "dividing", "NBs", "and", "the", "newly", "formed", "GMC", ",", "which", "are", "also", "marked", "by", "asterisks", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Selected images from time-lapse microscopy of NBs in control (wor>mCh-Tub, pUbq-GFP-Fzr, top panels) and Spd2DK-OE (lower panels) larval brains (Movies EV1, EV10). In the control NB, the daughter centrosomes (blue arrowheads) first matured (-5.0 min) and was segregated into the daughter NB (12.0 min), while the mother centrosome (yellow arrowheads) matured a little later (0.0 min) and segregated into the GMC. In contrast, in the Spd2DK-OE NB, both centrosomes lost microtubule nucleation activity in interphase (red arrowheads). The centrosome that matured earlier (blue arrowheads, -6.0 min) was incorrectly segregated into the GMC (12.0 min) while the centrosome that matured later (yellow arrowheads, 0.0 min) was segregated into the NB (12.0 min). Dotted white lines outline the dividing NBs and the newly formed GMC, which are also marked by asterisks."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ",", "D", ")", "Representative", "images", "of", "interphase", "NBs", "in", "fixed", "wor", ">", "lacZ", "(", "control", ",", "top", "panels", ")", "and", "HA", "-", "Spd2WT", "-", "OE", "larval", "brains", "expressing", "Polo", "-", "GFP", "from", "the", "native", "promoter", "and", "stained", "for", "DAPI", "and", "Spd2", "(", "C", ")", ".", "Asymmetric", "indexes", "of", "Polo", "-", "GFP", "in", "interphase", "NBs", "wor", ">", "lacZ", "(", "control", ",", "top", "panels", ")", "and", "HA", "-", "Spd2WT", "-", "OE", "larval", "brains", "(", "D", ")", ".", "38", "and", "39", "NBs", "(", "n", ")", "from", "at", "least", "three", "brains", "were", "analysed", "in", "each", "line", ".", "The", "asymmetric", "distribution", "of", "Polo", "-", "GFP", "at", "interphase", "centrosomes", "was", "unaffected", "by", "HA", "-", "Spd2WT", "overexpression", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "interphase", "NBs", "in", "fixed", "mCh", "-", "Spd2WT", "-", "RES", "(", "top", "panels", ")", "and", "mCH", "-", "Spd2DK", "-", "RES", "larval", "brains", "and", "stained", "for", "DAPI", ",", "γTub", "and", "Cnn", ".", "Both", "multichannel", "and", "single", "-", "channel", "images", "of", "mCh", "-", "Spd2", ",", "γTub", "and", "Cnn", "are", "shown", ".", "Dotted", "yellow", "squares", "highlight", "centrosomes", "and", "their", "magnified", "images", "are", "shown", "in", "insets", ".", "Similar", "to", "Spd2DK", "-", "RES", "NBs", ",", "in", "mCh", "-", "Spd2CONS", "-", "RES", "NBs", ",", "Spd2", "and", "γTub", "were", "more", "symmetrically", "accumulated", "at", "the", "two", "centrosomes", "than", "in", "mCh", "-", "Spd2WT", "-", "RES", "NBs", ",", "but", "Cnn", "was", "still", "asymmetrically", "distributed", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "FRAP", "analyses", "of", "the", "centrosomal", "Spd2", "fluorescent", "signals", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "and", "Spd2DK", "-", "OE", "NBs", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "from", "time", "-", "lapse", "movies", "(", "Movies", "EV13", ",", "EV14", ")", "of", "Spd2", "fluorescent", "signals", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "NBs", "(", "top", "panels", ")", "and", "Spd2DK", "-", "OE", "NBs", "(", "lower", "panels", ")", "upon", "photobleaching", ".", "(", "H", ")", "The", "recoveries", "of", "the", "fluorescent", "intensities", "of", "centrosomal", "Spd2", "signals", "after", "photobleaching", "were", "measured", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "Spd2DK", "-", "OE", "NBs", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Means", "±", "SEM", "of", "the", "normalised", "fluorescent", "intensities", "are", "shown", "in", "a", "line", "graph", ".", "Centrosomal", "Spd2", "signals", "recovered", "more", "fully", "after", "photobleaching", "in", "Spd2DK", "-", "OE", "NBs", "than", "in", "Spd2WT", "-", "RES", "NBs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C, D) Representative images of interphase NBs in fixed wor>lacZ (control, top panels) and HA-Spd2WT-OE larval brains expressing Polo-GFP from the native promoter and stained for DAPI and Spd2 (C). Asymmetric indexes of Polo-GFP in interphase NBs wor>lacZ (control, top panels) and HA-Spd2WT-OE larval brains (D). 38 and 39 NBs (n) from at least three brains were analysed in each line. The asymmetric distribution of Polo-GFP at interphase centrosomes was unaffected by HA-Spd2WT overexpression.(E) Representative images of interphase NBs in fixed mCh-Spd2WT-RES (top panels) and mCH-Spd2DK-RES larval brains and stained for DAPI, γTub and Cnn. Both multichannel and single-channel images of mCh-Spd2, γTub and Cnn are shown. Dotted yellow squares highlight centrosomes and their magnified images are shown in insets. Similar to Spd2DK-RES NBs, in mCh-Spd2CONS-RES NBs, Spd2 and γTub were more symmetrically accumulated at the two centrosomes than in mCh-Spd2WT-RES NBs, but Cnn was still asymmetrically distributed.(G, H) FRAP analyses of the centrosomal Spd2 fluorescent signals in Spd2WT-RES and Spd2DK-OE NBs. (G) Representative images from time-lapse movies (Movies EV13, EV14) of Spd2 fluorescent signals in Spd2WT-RES NBs (top panels) and Spd2DK-OE NBs (lower panels) upon photobleaching. (H) The recoveries of the fluorescent intensities of centrosomal Spd2 signals after photobleaching were measured in Spd2WT-RES (n = 7) and Spd2DK-OE NBs (n = 5). Means ± SEM of the normalised fluorescent intensities are shown in a line graph. Centrosomal Spd2 signals recovered more fully after photobleaching in Spd2DK-OE NBs than in Spd2WT-RES NBs."}
{"words": ["Figure", "1H", ".", "Endogenous", "levels", "of", "Stim1", "in", "testes", "from", "C57BL", "/", "6", "wt", "and", "splice", "deficient", "10A", "mice", ",", "using", "an", "antibody", "detecting", "the", "N", "-", "term", "of", "STIM1", ",", "detecting", "STIM1A", "(", "A", ",", "red", "arrow", ")", ",", "STIM1", "and", "its", "glycosylated", "(", "wt", ")", "and", "unglycosylated", "(", "wt", "gl", ".", ")", "form", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1H. Endogenous levels of Stim1 in testes from C57BL/6 wt and splice deficient 10A mice, using an antibody detecting the N-term of STIM1, detecting STIM1A (A, red arrow), STIM1 and its glycosylated (wt) and unglycosylated (wt gl.) form."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Traces", "showing", "average", "changes", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "intracellular", "Ca2", "+", "(", "Fura2", "ratio", ")", "over", "time", "in", "response", "to", "perfusion", "of", "different", "[", "Ca2", "+", "]", "o", "as", "indicated", "in", "the", "upper", "bar", "in", "MEF", "Stim1", "/", "Stim2", "-", "/", "-", "cells", "transfected", "with", "Stim1", "-", "(", "black", "trace", ",", "n", "=", "111", ")", ",", "Stim1A", "(", "red", "trace", ",", "n", "=", "116", ")", ",", "the", "combination", "Stim1", "with", "Stim1A", "(", "blue", "trace", ",", "n", "=", "86", ")", "or", "with", "vector", "only", "(", "grey", "trace", ",", "n", "=", "79", ")", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "changes", "in", "ratio", "of", "resting", ",", "influx", "rate", "(", "Δratio", "/", "time", ")", ",", "Δpeak", "and", "Δplateau", "measured", "in", "A", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", ".", "C", ".", "Traces", "showing", "average", "changes", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "intracellular", "Ca2", "+", "(", "Fura", "2", "ratio", ")", "in", "HEK293", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Orai1", "and", "either", "Stim1", "-", "(", "black", "trace", ",", "n", "=", "119", ")", "or", "Stim1A", "IRES", "-", "mCherry", "(", "red", "trace", ",", "n", "=", "118", ")", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "changes", "in", "ratio", "of", "resting", ",", "influx", "rate", "(", "Δratio", "/", "time", ")", ",", "Δpeak", "and", "Δplateau", "measured", "in", "C", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "E", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "e", ".", "g", ".", "transfections", ")", "with", "each", "three", "measured", "dishes", "(", "technical", "replicates", ")", "with", "multiple", "cells", "each", "(", "yielding", "a", "total", "number", "n", ")", "and", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "I", ".", "Traces", "showing", "average", "changes", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "intracellular", "Ca2", "+", "(", "Fura", "2", "ratio", ")", "in", "primary", "astrocytes", "from", "C57BL", "/", "6", "wt", "(", "CTRL", ",", "black", "trace", ",", "n", "=", "49", ")", "and", "splice", "deficient", "C57BL", "/", "6", "10ACon", "mice", "(", "10ACon", ",", "red", "trace", ",", "n", "=", "82", ")", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "parameters", "determined", "in", "[", "I", "]", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Data", "information", ":", "D", "were", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "e", ".", "g", ".", "transfections", ")", "with", "each", "three", "measured", "dishes", "(", "technical", "replicates", ")", "with", "multiple", "cells", "each", "(", "yielding", "a", "total", "number", "n", ")", "and", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Traces showing average changes (mean±s.e.m.) in intracellular Ca2+ (Fura2 ratio) over time in response to perfusion of different [Ca2+]o as indicated in the upper bar in MEF Stim1/Stim2-/- cells transfected with Stim1- (black trace, n=111), Stim1A (red trace, n=116), the combination Stim1 with Stim1A (blue trace, n=86) or with vector only (grey trace, n=79). B. Quantification of changes in ratio of resting, influx rate (Δratio/time), Δpeak and Δplateau measured in A. *** p<0.001, Kruskal-Wallis Anova. C. Traces showing average changes (mean±s.e.m.) in intracellular Ca2+ (Fura 2 ratio) in HEK293 cells co-transfected with Orai1 and either Stim1- (black trace, n=119) or Stim1A IRES-mCherry (red trace, n=118). D. Quantification of changes in ratio of resting, influx rate (Δratio/time), Δpeak and Δplateau measured in C. ** p<0.01 *** p<0.001 Mann-Whitney test. E. Data information: Data were obtained from three biological replicates (e.g. transfections) with each three measured dishes (technical replicates) with multiple cells each (yielding a total number n) and is shown as mean±s.e.m.I. Traces showing average changes (mean±s.e.m.) in intracellular Ca2+ (Fura 2 ratio) in primary astrocytes from C57BL/6 wt (CTRL,black trace, n=49) and splice deficient C57BL/6 10ACon mice (10ACon, red trace, n=82). J. Quantification of parameters determined in [I]. *** p<0.001 Mann-Whitney test. Data information: D were obtained from three biological replicates (e.g. transfections) with each three measured dishes (technical replicates) with multiple cells each (yielding a total number n) and is shown as mean±s.e.m."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Images", "showing", "representative", "HEK293", "cells", "expressing", "Orai1", "-", "GFP", "(", "green", "=", "donor", "molecule", ")", "or", "either", "STIM1", "-", "mCherry", "(", "upper", "panel", "=", "acceptor", "molecule", ")", "or", "STIM1A", "-", "mCherry", "(", "lower", "panel", "=", "acceptor", "molecule", ")", "after", "stimulation", "with", "TG", ".", "Also", "shown", "is", "the", "overlay", "of", "the", "two", "channels", ",", "as", "well", "as", "the", "FRET", "signal", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Images showing representative HEK293 cells expressing Orai1-GFP (green = donor molecule) or either STIM1-mCherry (upper panel = acceptor molecule) or STIM1A-mCherry (lower panel = acceptor molecule) after stimulation with TG. Also shown is the overlay of the two channels, as well as the FRET signal."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Traces", "showing", "average", "changes", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "intracellular", "Ca2", "+", "(", "Fura2", "ratio", ")", "over", "time", "in", "response", "to", "perfusion", "of", "different", "[", "Ca2", "+", "]", "o", "as", "indicated", "in", "the", "upper", "bar", "with", "constructs", "as", "indicated", "expressed", "in", "HEKO1", ".", "STIM1", "(", "black", ",", "n", "=", "145", ")", ",", "STIM1A", "(", "red", ",", "n", "=", "157", ")", "and", "STIM1A", "_", "D503A", "(", "n", "=", "185", ")", ".", "C", ".", "Relative", "fluorescence", "intensities", "of", "mCherry", "-", "tagged", "constructs", "measured", "in", "(", "B", ")", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "changes", "in", "resting", "ratio", ",", "TG", "peak", "(", "∆", "ratio", ")", "and", "SOCE", "parameters", "measured", "in", "B", ".", "E", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Data", "points", "(", "total", "n", ")", "were", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "with", "each", "three", "technical", "replicates", "(", "each", "multiple", "cells", ")", "and", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "for", "traces", "and", "as", "scatter", "plots", "with", "the", "underlying", "boxes", "showing", "the", "means", "for", "individual", "parameters", ".", "E", ".", "Average", "traces", "showing", "whole", "-", "cell", "current", "density", "(", "CD", ")", "over", "time", "extracted", "at", "-", "80", "mV", "in", "HEKO1", "cells", "transfected", "with", "STIM1", "(", "black", ")", ",", "STIM1A", "(", "red", ")", "or", "STIM1A", "_", "D503A", "(", "blue", ")", ".", "F", ".", "Average", "maximum", "CDs", "recorded", "from", "cells", "measured", "in", "E", "(", "n", "within", "bars", ")", ".", "G", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Data", "points", "(", "total", "n", ")", "were", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "with", "each", "three", "technical", "replicates", "(", "each", "multiple", "cells", ")", "and", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "for", "traces", "and", "as", "scatter", "plots", "with", "the", "underlying", "boxes", "showing", "the", "means", "for", "individual", "parameters", ".", "G", ".", "Average", "current", "-", "voltage", "(", "I", "-", "V", ")", "relationship", "of", "all", "cells", "recorded", "in", "E", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Traces showing average changes (mean±s.e.m.) in intracellular Ca2+ (Fura2 ratio) over time in response to perfusion of different [Ca2+]o as indicated in the upper bar with constructs as indicated expressed in HEKO1. STIM1 (black, n=145), STIM1A (red, n=157) and STIM1A_D503A (n=185). C. Relative fluorescence intensities of mCherry-tagged constructs measured in (B). D. Quantification of changes in resting ratio, TG peak (∆ ratio) and SOCE parameters measured in B. E. Data information: *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001 Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparisons test. Data points (total n) were obtained from three biological replicates with each three technical replicates (each multiple cells) and shown as mean±s.e.m for traces and as scatter plots with the underlying boxes showing the means for individual parameters.E. Average traces showing whole-cell current density (CD) over time extracted at -80 mV in HEKO1 cells transfected with STIM1 (black), STIM1A (red) or STIM1A_D503A (blue). F. Average maximum CDs recorded from cells measured in E (n within bars). G Data information: *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001 Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparisons test. Data points (total n) were obtained from three biological replicates with each three technical replicates (each multiple cells) and shown as mean±s.e.m for traces and as scatter plots with the underlying boxes showing the means for individual parameters.G. Average current-voltage (I- V) relationship of all cells recorded in E."}
{"words": ["Figure", "5F", ".", "Traces", "showing", "average", "changes", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "intracellular", "Ca2", "+", "(", "Fura2", "ratio", ")", "over", "time", "in", "response", "to", "perfusion", "of", "different", "[", "Ca2", "+", "]", "o", "as", "indicated", "in", "the", "upper", "bar", "with", "constructs", "as", "indicated", "expressed", "in", "HEKS1", "/", "S2", "-", "/", "-", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "reduction", "of", "ratio", "/", "time", "or", "ratio", "for", "cells", "(", "135", "H", "Data", "information", ":", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "Data", "points", "(", "total", "n", ")", "were", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "with", "each", "three", "technical", "replicates", "(", "with", "multiple", "cells", ")", "and", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "for", "traces", "(", "F", ")", "and", "as", "scatter", "plots", "with", "the", "underlying", "boxes", "showing", "the", "means", "for", "individual", "parameters", "(", "G", ")", ".", "H", ",", "I", ".", "Average", "traces", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "showing", "whole", "-", "cell", "current", "density", "(", "CD", ")", "over", "time", "extracted", "at", "-", "80", "mV", "in", "in", "HEKS1", "/", "S2", "-", "/", "-", "cells", "co", "-", "transfected", "either", "with", "STIM1", "(", "black", ")", "or", "STIM1A", "(", "red", ")", "and", "ORAI1", "(", "H", ")", "or", "with", "ORAI1", "R77E", "(", "I", ")", "and", "recorded", "using", "extracellular", "solution", "containing", "2", "mM", "Ca2", "+", ".", "J", ".", "Average", "maximum", "CDs", "recorded", "from", "cells", "measured", "in", "[", "H", ",", "I", "]", "(", "n", "within", "bars", ")", ".", "Data", "information", ":", "I", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "T", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "For", "patch", "-", "clamp", "experiments", ",", "number", "in", "bars", "indicate", "measured", "cells", ",", "which", "were", "from", "three", "independent", "transfections", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5F. Traces showing average changes (mean±s.e.m.) in intracellular Ca2+ (Fura2 ratio) over time in response to perfusion of different [Ca2+]o as indicated in the upper bar with constructs as indicated expressed in HEKS1/S2-/-. G. Quantification of the relative reduction of ratio/time or ratio for cells (135 H Data information: , ***P<0.001, Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparisons test Data points (total n) were obtained from three biological replicates with each three technical replicates (with multiple cells) and shown as mean±s.e.m for traces (F) and as scatter plots with the underlying boxes showing the means for individual parameters (G).H,I. Average traces (mean±s.e.m.) showing whole- cell current density (CD) over time extracted at -80 mV in in HEKS1/S2-/- cells co-transfected either with STIM1 (black) or STIM1A (red) and ORAI1 (H) or with ORAI1 R77E (I) and recorded using extracellular solution containing 2 mM Ca2+. J. Average maximum CDs recorded from cells measured in [H,I] (n within bars). Data information: I , *P<0.05, **P<0.01, unpaired T test with Welch's correction. For patch-clamp experiments, number in bars indicate measured cells, which were from three independent transfections."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Hits", "from", "(", "A", ")", "tested", "for", "interaction", "with", "commercially", "available", "constructs", "quantified", "with", "bimolecular", "fluorescence", "complementation", "(", "BiFC", ")", "via", "flow", "cytometry", ".", "HEKS1", "/", "S2", "-", "/", "-", "were", "transfected", "with", "STIM1", "-", "YFPC", "(", "black", ")", "or", "STIM1A", "-", "YFPC", "(", "red", ")", "in", "combination", "with", "POI", "-", "YFPN", "and", "screened", "for", "YFP", "+", "cells", "via", "FACS", ",", "results", "(", "mean", "±", "SD", ")", "from", "three", "transfections", "with", "each", "10", ".", "000", "sorted", "cells", ".", "D", ".", "Ratio", "nuclear", "NFAT", "-", "GFP", "vs", ".", "cytosolic", "GFP", "intensity", "normalized", "to", "t", "=", "0", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "after", "transfection", "of", "SH", "-", "SY5Y", "S1", "-", "/", "-", "cells", "with", "STIM", "(", "n", "=", "42", ")", ",", "STIM1A", "(", "n", "=", "82", ")", ",", "STIM1A", "_", "D503A", "(", "n", "=", "49", ")", "or", "vector", "only", "(", "ØSTIM", ",", "n", "=", "15", ")", "IRES", "mCherry", "and", "induction", "of", "SOCE", "after", "stimulation", "with", "1", "µM", "TG", ".", "Data", "(", "total", "n", "as", "indicated", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "transfections", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Hits from (A) tested for interaction with commercially available constructs quantified with bimolecular fluorescence complementation (BiFC) via flow cytometry. HEKS1/S2-/- were transfected with STIM1-YFPC (black) or STIM1A-YFPC (red) in combination with POI-YFPN and screened for YFP+ cells via FACS, results (mean ± SD) from three transfections with each 10.000 sorted cells.D. Ratio nuclear NFAT-GFP vs. cytosolic GFP intensity normalized to t=0 (mean±s.e.m.) after transfection of SH-SY5Y S1-/- cells with STIM (n=42), STIM1A (n=82), STIM1A_D503A (n=49) or vector only (ØSTIM, n=15) IRES mCherry and induction of SOCE after stimulation with 1 µM TG. Data (total n as indicated) from at least three independent transfections."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Time", "course", "of", "translocation", "(", "Nuclear", "NFAT", "-", "GFP", "signal", "/", "cytosolic", "signal", "normalized", "to", "TG", "addition", "at", "t", "=", "0", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ",", "for", "each", "time", "point", ")", "after", "transfection", "of", "indicated", "constructs", "and", "preincubation", "with", "1", "µM", "PF", "-", "04957325", "(", "analyzed", "cells", ":", "STIM1", "+", "PF", "n", "=", "75", ",", "STIM1A", "+", "PF", "n", "=", "50", ",", "ØSTIM", "+", "PF", "n", "=", "9", ")", "Data", "(", "total", "n", "as", "indicated", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "transfections", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "B", ".", "PF", "-", "04957325", "induced", "difference", "of", "the", "nuclear", "NFAT", "-", "GFP", "signal", "vs", ".", "cytosolic", "signal", "from", "(", "A", ")", "to", "mean", "of", "control", "without", "the", "blocker", "(", "see", "Fig", ".", "6D", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "of", "differences", ".", ".", "C", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "2way", "Anova", "Data", "(", "total", "number", "of", "cells", ",", "n", ")", "were", "obtained", "from", "at", "least", "three", "independent", "transfections", "with", "several", "technical", "replicates", "each", ".", "C", ".", "Endpoint", "value", "with", "addition", "of", "PF", "or", "indicated", "cAMP", "analoga", "loaded", "for", "30", "min", "as", "AM", "esters", "before", "the", "experiment", ",", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ",", "ØSTIM", "+", "6Bnz", "-", "cAMP", "/", "8", "-", "pCPT", "-", "cAMP", "n", "=", "15", "/", "14", "cells", ";", "STIM1", "+", "6Bnz", "-", "cAMP", "/", "8", "-", "pCPT", "-", "cAMP", ":", "n", "=", "87", "/", "66", ",", "STIM1A", "+", "6Bnz", "-", "cAMP", ":", "n", "=", "78", "/", "67", ";", "from", "three", "independent", "transfections", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "Data", "(", "total", "number", "of", "cells", ",", "n", ")", "were", "obtained", "from", "at", "least", "three", "independent", "transfections", "with", "several", "technical", "replicates", "each", ".", "G", ".", "Normalized", "fluorescence", "signal", "change", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", "of", "R", "-", "FlincA", ",", "SH", "-", "SY5Y", "S1", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "STIM1", "(", "n", "=", "20", ")", "or", "STIM1A", "(", "n", "=", "22", ")", "IRES", "GFP", "variants", "and", "the", "indicator", "were", "stimulated", "by", "TG", "(", "1", "μM", ")", ".", "To", "avoid", "photobleaching", ",", "values", "were", "only", "recorded", "after", "5", "and", "30", "min", ",", "respectively", "The", "mutant", "R", "-", "Flinc", "(", "n", "=", "15", ")", "was", "measured", "in", "SH", "-", "SY5Y", "wt", "cells", "after", "TG", "stimulation", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "Anova", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "Data", "(", "total", "number", "of", "cells", ",", "n", ")", "were", "obtained", "from", "at", "least", "three", "independent", "transfections", "with", "several", "technical", "replicates", "each", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Time course of translocation (Nuclear NFAT-GFP signal/cytosolic signal normalized to TG addition at t=0, mean±s.e.m, for each time point) after transfection of indicated constructs and preincubation with 1 µM PF-04957325 (analyzed cells: STIM1 + PF n = 75, STIM1A + PF n = 50, ØSTIM + PF n = 9) Data (total n as indicated) from at least three independent transfections. * p< 0.05, **p<0.01, ***p<0.001, Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparisons test. B. PF-04957325 induced difference of the nuclear NFAT-GFP signal vs. cytosolic signal from (A) to mean of control without the blocker (see Fig. 6D). * p< 0.05, **p<0.01, ***p<0.001,Mann-Whitney test of differences.. C Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, 2way Anova Data (total number of cells, n) were obtained from at least three independent transfections with several technical replicates each.C. Endpoint value with addition of PF or indicated cAMP analoga loaded for 30 min as AM esters before the experiment, shown as mean±s.e.m , ØSTIM + 6Bnz-cAMP/8-pCPT-cAMP n = 15/14 cells; STIM1 + 6Bnz-cAMP/8-pCPT-cAMP: n = 87/66, STIM1A + 6Bnz-cAMP : n = 78/67; from three independent transfections. Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, , Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparison test Data (total number of cells, n) were obtained from at least three independent transfections with several technical replicates each.G. Normalized fluorescence signal change (mean±s.e.m) of R-FlincA, SH-SY5Y S1-/- cells expressing STIM1 (n=20) or STIM1A (n=22) IRES GFP variants and the indicator were stimulated by TG (1 μM). To avoid photobleaching, values were only recorded after 5 and 30 min, respectively The mutant R-Flinc (n=15) was measured in SH-SY5Y wt cells after TG stimulation. Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, Kruskal-Wallis Anova with Dunn's multiple comparison test Data (total number of cells, n) were obtained from at least three independent transfections with several technical replicates each."}
{"words": ["Figure", "2Relative", "expression", "and", "co", "-", "localization", "of", "IL6", "mRNA", "and", "IL", "-", "6", "Signaling", "Scoring", "in", "integrated", "skin", "cells", "by", "blended", "UMAPs", ".", "Quantification", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "analysis", "of", "Il6", "mRNA", "in", "the", "skin", "of", "naïve", "and", "irradiated", "(", "15Gy", ")", "WT", "mice", "at", "indicated", "times", ",", "(", "n", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "B", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnet", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "B", ")", ",", "five", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "of", "ventral", "hair", "loss", "area", "21", "days", "post", "-", "IR", "(", "15Gy", ")", "in", "WT", "and", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", "mice", ",", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "Photographic", "images", "showing", "hair", "loss", "(", "area", "demarked", "by", "yellow", "dashed", "line", ")", "21", "days", "post", "-", "IR", "(", "15", "Gy", ")", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", "mice", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "C", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "C", ",", ";", "five", "independent", "experiments", ".", "Histochemical", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "(", "red", ")", "showing", "skin", "morphology", ",", "and", "T", "cell", "(", "CD3", "+", ")", "and", "neutrophil", "(", "Ly6b", "+", ")", "infiltration", "in", "WT", "or", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", "mice", "before", "(", "naïve", ")", ",", "and", "14", "days", "(", "H", "&", "E", ",", "Ly6b", "+", ")", ",", "or", "21", "days", "(", "CD3", "+", ")", "post", "-", "IR", ".", "Infiltrating", "CD3", "+", "T", "cells", "(", "yellow", "arrows", ")", "within", "degenerating", "hair", "follicles", "(", "HF", ";", "dashed", "lines", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", "(", "n", "=", "5", "-", "8", ")", ".", "Kinetics", "of", "neutrophil", "(", "Ly6b", "+", ")", "(", "n", "=", "3", "-", "9", ")", "and", "T", "cell", "(", "CD3", "+", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "infiltration", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "F", ",", "mean", "±", "SD", "(", "G", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "F", ",", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "posthoc", "multiple", "comparisons", "test", "(", "G", ")", ";", "five", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "analysis", "of", "Tnfa", ",", "Ccl3", ",", "and", "Ifng", "mRNAs", "in", "whole", "skin", "of", "WT", "and", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", "mice", "at", "indicated", "times", "post", "-", "IR", "(", "15Gy", ")", ",", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "H", ")", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "H", ")", ",", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Relative expression and co-localization of IL6 mRNA and IL-6 Signaling Scoring in integrated skin cells by blended UMAPs.Quantification by real-time qPCR analysis of Il6 mRNA in the skin of naïve and irradiated (15Gy) WT mice at indicated times, (n=3-6). Data information: Data represent mean ± SD (B, *P<0.05, **P<0.01, **P<0.01, ****P<0.001 by one-way ANOVA with Dunnet's multiple comparisons test (B), five independent experiments.Quantification of ventral hair loss area 21 days post-IR (15Gy) in WT and IL-6-/- mice, (n=11). Photographic images showing hair loss (area demarked by yellow dashed line) 21 days post-IR (15 Gy) in wild type (WT) and IL-6-/- mice. Data information: Data represent mean ± SD C, *P<0.05, **P<0.01, **P<0.01, ****P<0.001 by , two-tailed Mann-Whitney test (C, ; five independent experiments.Histochemical (H&E) and immunostaining (red) showing skin morphology, and T cell (CD3+) and neutrophil (Ly6b+) infiltration in WT or IL-6-/- mice before (naïve), and 14 days (H&E, Ly6b+), or 21 days (CD3+) post-IR. Infiltrating CD3+ T cells (yellow arrows) within degenerating hair follicles (HF; dashed lines) are indicated. Scale bars, 100 μm. Quantification of epidermal thickness at 14 days post-IR (n = 5-8). Kinetics of neutrophil (Ly6b+) (n = 3-9) and T cell (CD3+) (n = 3) infiltration. Data information: Data represent mean ± SD F, mean ± SD (G). *P<0.05, **P<0.01, **P<0.01, ****P<0.001 by two-tailed Mann-Whitney test F, or two-way ANOVA with Bonferroni's posthoc multiple comparisons test (G); five independent experiments.Quantification by real-time qPCR analysis of Tnfa, Ccl3, and Ifng mRNAs in whole skin of WT and IL-6-/- mice at indicated times post-IR (15Gy), (n = 5-7). Data information: Data represent mean ± SD H) *P<0.05, **P<0.01, **P<0.01, ****P<0.001 by , two-tailed Mann-Whitney test H), five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "shows", "phosphorylated", "STAT3", "(", "p", "-", "Stat3", ")", ",", "Akt", "(", "p", "-", "Akt", ")", ")", ",", "Erk1", "and", "Erk2", "(", "p", "-", "Erk1", "/", "2", ")", ")", ",", "and", "β", "-", "Actin", "in", "the", "skin", "of", "WT", ",", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", ",", "and", "IL", "-", "1R", "-", "/", "-", "mice", "at", "indicated", "times", "(", "days", ")", "post", "-", "IR", "(", "15Gy", ")", ".", "Histochemical", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "(", "red", ")", "staining", "of", "T", "cells", "(", "CD3", "+", ")", ",", "neutrophils", "(", "Ly6b", "+", ")", "and", "phosphorylated", "Stat3", "(", "p", "-", "Stat3", ")", "(", "red", "nuclear", "staining", ",", "black", "arrows", ")", "in", "skin", "thin", "sections", "prepared", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", "from", "mice", "treated", "by", "daily", "topical", "application", "of", "acquosum", "(", "control", ")", ",", "ruxolitinib", "or", "tofacitinib", "following", "irradiation", "(", "15", "Gy", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "CD3", "and", "Ly6b", "immunostaining", "images", "from", "Tofacitinib", "treated", "mice", "represent", "seperate", "analyses", "performed", "on", "serial", "thin", "sections", ".", ")", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ",", "T", "cells", "(", "CD3", "+", ")", "and", "neutrophils", "(", "Ly6b", "+", ")", ",", "and", "p", "-", "STAT3", "+", "cells", "in", "(", "B", ")", ",", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ";", "two", "independent", "experiments", ".", "Photographic", "images", "showing", "hair", "loss", "in", "mice", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", "(", "15", "Gy", ")", "following", "treatment", "by", "daily", "topical", "application", "of", "acquosum", "(", "carrier", "control", ")", "or", "JAK", "inhibitors", ",", "ruxolitinib", "or", "tofacitinib", ".", "Chest", "and", "neck", "hairs", "of", "mice", "in", "all", "groups", "were", "clipped", "prior", "to", "irradiation", "to", "enhance", "drug", "absorption", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "of", "ventral", "hair", "loss", "(", "in", "pixels", ")", "in", "mice", "in", "(", "D", ")", ",", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ";", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis shows phosphorylated STAT3 (p-Stat3), Akt (p-Akt)), Erk1 and Erk2 (p-Erk1/2)), and β-Actin in the skin of WT, IL-6-/-, and IL-1R-/- mice at indicated times (days) post-IR (15Gy).Histochemical (H&E) and immunostaining (red) staining of T cells (CD3+), neutrophils (Ly6b+) and phosphorylated Stat3 (p-Stat3) (red nuclear staining, black arrows) in skin thin sections prepared at 14 days post-IR from mice treated by daily topical application of acquosum (control), ruxolitinib or tofacitinib following irradiation (15 Gy). Scale bar, 100 μm. (CD3 and Ly6b immunostaining images from Tofacitinib treated mice represent seperate analyses performed on serial thin sections.) Quantification of epidermal thickness, T cells (CD3+) and neutrophils (Ly6b+), and p-STAT3+ cells in (B), (n = 4). Data information: Data represent mean ± SD. *P<0.05, **P<0.01, by two-tailed Student's t test; two independent experiments.Photographic images showing hair loss in mice at 14 days post-IR (15 Gy) following treatment by daily topical application of acquosum (carrier control) or JAK inhibitors, ruxolitinib or tofacitinib. Chest and neck hairs of mice in all groups were clipped prior to irradiation to enhance drug absorption. Quantification of the area of ventral hair loss (in pixels) in mice in (D), (n = 4). Data information: Data represent mean ± SD. *P<0.05, **P<0.01, by two-tailed Student's t test; two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4UMAP", "plots", "depicting", "relative", "expression", "and", "localization", "of", "Il1a", "and", "Il1b", "mRNAs", "in", "irradiated", "and", "naïve", "skin", "-", "derived", "cell", "clusters", ".", "Photographic", "images", "showing", "hair", "loss", "14", "days", "post", "-", "IR", "(", "15", "Gy", ")", "in", "WT", "and", "IL", "-", "1R", "-", "/", "-", "mice", ".", "Quantification", "of", "ventral", "hair", "loss", "area", "14", "days", "post", "-", "IR", "(", "15Gy", ")", "in", "WT", "and", "IL", "-", "1R", "-", "/", "-", "mice", ",", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "C", ")", "five", "independent", "experiments", ".", "Histochemical", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "(", "red", ")", "showing", "morphology", "and", "neutrophil", "(", "Ly6b", ")", "infiltration", "in", "the", "skin", "of", "mice", "in", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ",", "neutrophils", "(", "Ly6b", ")", "and", "T", "cells", "(", "CD3", "+", ")", "in", "specimens", "in", "(", "D", ")", ",", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "E", ")", ";", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4UMAP plots depicting relative expression and localization of Il1a and Il1b mRNAs in irradiated and naïve skin-derived cell clusters.Photographic images showing hair loss 14 days post-IR (15 Gy) in WT and IL-1R-/- mice. Quantification of ventral hair loss area 14 days post-IR (15Gy) in WT and IL-1R-/- mice, (n = 4). Data information: Data represent mean ± SD. *P<0.05, by two-tailed Mann-Whitney test (C) five independent experiments.Histochemical (H&E) and immunostaining (red) showing morphology and neutrophil (Ly6b) infiltration in the skin of mice in (B). Scale bar, 50 μm. Quantification of epidermal thickness, neutrophils (Ly6b) and T cells (CD3+) in specimens in (D), (n = 4). Data information: Data represent mean ± SD. *P<0.05, by Student's t test (E); five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5UMAP", "plots", "depicting", "relative", "expression", "and", "localization", "of", "Ccr6", "and", "Ccl20", "mRNAs", "in", "irradiated", "and", "naïve", "skin", "-", "derived", "cell", "clusters", ".", "Quantification", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "analysis", "of", "Ccr6", "and", "Ccl20", "mRNAs", "in", "whole", "skin", "of", "naïve", "and", "irradiated", "(", "15Gy", ")", "WT", "and", "IL", "-", "6", "-", "/", "-", "mice", "at", "indicated", "times", "post", "-", "IR", ",", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "Two", "independent", "experiments", ".", "Photographic", "images", "showing", "the", "development", "of", "radiodermatitis", "and", "alopecia", "in", "irradiated", "(", "15", "Gy", ")", "WT", "and", "CCR6", "-", "/", "-", "mice", "at", "indicated", "times", "post", "-", "IR", ".", "Escalating", "radiodermatitis", ",", "which", "manifests", "on", "day", "7", "-", "10", "as", "serous", "exudates", "on", "the", "chin", "and", "neck", ",", "is", "visible", "in", "both", "strains", "and", "progresses", "in", "WT", "mice", "to", "alopecia", "by", "day", "14", "post", "-", "IR", "but", "resolves", "spontaneously", "in", "the", "CCR6", "-", "/", "-", "mice", ".", "Quantification", "(", "lower", "right", ")", "of", "the", "area", "of", "hair", "loss", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", ",", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "Two", "independent", "experiments", ".", "Histochemical", "staining", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "(", "red", ")", "show", "morphology", "and", "infiltration", "of", "neutrophils", "(", "Ly6b", "+", ")", "and", "T", "cells", "(", "CD3", "+", ")", "(", "red", "arrows", ")", "to", "the", "skin", "and", "to", "the", "hair", "follicle", "(", "HF", ")", "(", "dashed", "lines", ")", "in", "WT", "or", "CCR6", "-", "/", "-", "mice", "14", "days", "post", "-", "IR", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "(", "black", ")", "and", "25", "μm", "(", "red", ")", ".", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ",", "neutrophils", "(", "Ly6b", "+", ")", ",", "total", "T", "cell", "(", "CD3", "+", ")", "infiltration", "to", "the", "skin", ",", "and", "(", "F", ")", "CD3", "+", "cells", "infiltration", "to", "the", "hair", "follicle", "in", "(", "D", ")", ",", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "E", "-", "Ly6b", ",", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "Two", "independent", "experiments", ".", "MHC", "class", "I", "immunostaining", "(", "red", ")", "of", "skin", "thin", "sections", "prepared", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", "from", "mice", "in", "(", "C", ")", ",", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "MHC", "I", "positive", "hair", "follicles", ",", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "Two", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "analysis", "of", "Il6", ",", "Il17a", ",", "Ccl20", ",", "and", "Ccl3", "mRNAs", "in", "the", "skin", "of", "naïve", "WT", "and", "irradiated", "(", "15Gy", ")", "WT", "and", "CCR6", "-", "/", "-", "mice", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", ",", "(", "n", "=", "3", "-", "5", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "Two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5UMAP plots depicting relative expression and localization of Ccr6 and Ccl20 mRNAs in irradiated and naïve skin-derived cell clusters. Quantification by real-time qPCR analysis of Ccr6 and Ccl20 mRNAs in whole skin of naïve and irradiated (15Gy) WT and IL-6-/- mice at indicated times post-IR, (n=5-7). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by Mann-Whitney test Two independent experiments.Photographic images showing the development of radiodermatitis and alopecia in irradiated (15 Gy) WT and CCR6-/- mice at indicated times post-IR. Escalating radiodermatitis, which manifests on day 7-10 as serous exudates on the chin and neck, is visible in both strains and progresses in WT mice to alopecia by day 14 post-IR but resolves spontaneously in the CCR6-/- mice. Quantification (lower right) of the area of hair loss at 14 days post-IR, (n = 6). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by Mann-Whitney test Two independent experiments.Histochemical staining (H&E) and immunostaining (red) show morphology and infiltration of neutrophils (Ly6b+) and T cells (CD3+) (red arrows) to the skin and to the hair follicle (HF) (dashed lines) in WT or CCR6-/- mice 14 days post-IR. Scale bars, 50 μm (black) and 25 μm (red). Quantification of epidermal thickness, neutrophils (Ly6b+), total T cell (CD3+) infiltration to the skin, and (F) CD3+ cells infiltration to the hair follicle in (D), (n = 5-6). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Student's t test (E-Ly6b, by Mann-Whitney test Two independent experiments.MHC class I immunostaining (red) of skin thin sections prepared at 14 days post-IR from mice in (C), and quantification (right) of MHC I positive hair follicles, (n = 4-5). Scale bar, 50 μm. Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by Mann-Whitney test Two independent experiments.Quantification by real-time qPCR analysis of Il6, Il17a, Ccl20, and Ccl3 mRNAs in the skin of naïve WT and irradiated (15Gy) WT and CCR6-/- mice at 14 days post-IR, (n = 3-5). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by Mann-Whitney test Two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6Photographic", "images", "showing", "hair", "loss", "in", "control", "(", "PBS", ")", "and", "cyclosporine", "(", "CsA", ")", "treated", "WT", "mice", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", "(", "15", "Gy", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "of", "ventral", "hair", "loss", "in", "mice", "in", "(", "A", ")", ",", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "two", "independent", "experiments", ".", "Histochemical", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "immunostaining", "(", "red", ")", "show", "T", "cell", "(", "CD3", "+", ")", "and", "neutrophil", "(", "Ly6b", "+", ")", "infiltration", "in", "the", "skin", "of", "mice", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "Images", "of", "CD3", "and", "Ly6b", "immunostaining", "from", "CsA", "treated", "mice", "represent", "seperate", "analyses", "performed", "on", "serial", "thin", "sections", ".", ")", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ",", "and", "T", "cell", "(", "CD3", "+", ")", "and", "neutrophil", "(", "Ly6b", "+", ")", "infiltration", "(", "red", "staining", ")", "in", "skin", "thin", "sections", "from", "(", "C", ")", ",", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "two", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "analysis", "of", "Il6", ",", "Il17a", ",", "II22", ",", "Ccl3", ",", "Ccr6", ",", "and", "Ccl20", "mRNAs", "in", "whole", "skin", "of", "naïve", "and", "irradiated", "(", "15Gy", ")", "control", "(", "PBS", ")", "and", "CSA", "treated", "WT", "mice", "at", "14", "days", "post", "-", "IR", ",", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Photographic images showing hair loss in control (PBS) and cyclosporine (CsA) treated WT mice at 14 days post-IR (15 Gy). Quantification of the area of ventral hair loss in mice in (A), (n = 6). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Mann-Whitney test; two independent experiments.Histochemical (H&E) and immunostaining (red) show T cell (CD3+) and neutrophil (Ly6b+) infiltration in the skin of mice in (A). Scale bar, 100 μm. (Images of CD3 and Ly6b immunostaining from CsA treated mice represent seperate analyses performed on serial thin sections.) Quantification of epidermal thickness, and T cell (CD3+) and neutrophil (Ly6b+) infiltration (red staining) in skin thin sections from (C), (n = 6). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Mann-Whitney test; two independent experiments.Quantification by real-time qPCR analysis of Il6, Il17a, II22, Ccl3, Ccr6, and Ccl20 mRNAs in whole skin of naïve and irradiated (15Gy) control (PBS) and CSA treated WT mice at 14 days post-IR, (n = 5). Data information: Data represent mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 by two-tailed Mann-Whitney test; two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "B", ")", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "analysis", "of", "IκBα", "in", "sections", "from", "murine", "small", "intestine", "of", "2", "month", "-", "old", "WT", "(", "A", ")", "and", "Lgr5", "-", "GFP", "reporter", "mice", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "50μm", ".", "IF", "analysis", "of", "P", "-", "IκBα", "in", "the", "intestine", "of", "2", "month", "-", "old", "WT", "(", "C", ")", "and", "quantification", "of", "P", "-", "IκBα", "positivity", "Scale", "bars", "in", "C", ",", "25", "μmIF", "analysis", "of", "P", "-", "IκBα", "in", "the", "intestine", "of", "2", "month", "-", "old", "Lgr5", "-", "GFP", "reporter", "mice", "(", "D", ")", ",", "and", "quantification", "of", "P", "-", "IκBα", "positivity", "inside", "the", "Lgr5", "-", "GFP", "population", ".", "A", "minimum", "of", "30", "crypts", "was", "counted", "in", "3", "Lgr5", "-", "GFP", "mice", ".", "Scale", "bars", "in", "D", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Distribution", "of", "P", "-", "IκBα", "positive", "cells", "according", "to", "their", "position", "in", "the", "intestinal", "crypt", "from", "200", "crypts", "counted", ".", "(", "F", ")", "Double", "IF", "analysis", "of", "2", "month", "-", "old", "murine", "small", "intestine", "sections", "with", "the", "indicated", "antibodies", "and", "quantification", "of", "P", "-", "IκBα", "positivity", "inside", "the", "EphB2", "+", "population", ".", "70", "crypts", "were", "counted", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Double", "IF", "analysis", "of", "murine", "small", "intestine", "sections", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "H", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "cytoplasmic", "(", "CYT", ")", "and", "nuclear", "(", "NUC", ")", "extracts", "from", "isolated", "intestinal", "crypt", "cells", ".", "(", "I", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "crypt", "nuclear", "extracts", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "SUMO2", "/", "3", "antibody", ".", "(", "J", ")", "IF", "analysis", "of", "developing", "intestines", "from", "E12", ".", "5", "to", "E17", ".", "5", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "(", "K", ")", "Representation", "of", "IκBα", "distribution", "in", "the", "indicated", "genomic", "regions", "obtained", "from", "ChIP", "-", "sequencing", "analysis", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-B) Immunofluorescence (IF) analysis of IκBα in sections from murine small intestine of 2 month-old WT (A) and Lgr5-GFP reporter mice (B). Scale bars, 50μm.IF analysis of P-IκBα in the intestine of 2 month-old WT (C) and quantification of P-IκBα positivity Scale bars in C, 25 μmIF analysis of P-IκBα in the intestine of 2 month-old Lgr5-GFP reporter mice (D), and quantification of P-IκBα positivity inside the Lgr5-GFP population. A minimum of 30 crypts was counted in 3 Lgr5-GFP mice. Scale bars in D, 50 μm.(E) Distribution of P-IκBα positive cells according to their position in the intestinal crypt from 200 crypts counted.(F) Double IF analysis of 2 month-old murine small intestine sections with the indicated antibodies and quantification of P-IκBα positivity inside the EphB2+ population. 70 crypts were counted. Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m). Scale bars, 50 μm.(G) Double IF analysis of murine small intestine sections with the indicated antibodies. Scale bars, 50 μm.(H) Western blot analysis of cytoplasmic (CYT) and nuclear (NUC) extracts from isolated intestinal crypt cells.(I) Western blot analysis of crypt nuclear extracts immunoprecipitated with anti-SUMO2/3 antibody.(J) IF analysis of developing intestines from E12.5 to E17.5 with the indicated antibodies. Scale bars, 25 μm.(K) Representation of IκBα distribution in the indicated genomic regions obtained from ChIP-sequencing analysis (n=4)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "P4", "and", "P6", "mice", "of", "the", "indicated", "IκBα", "genotypes", ".", "Quantification", "of", "the", "animal", "weight", "(", "B", ")", "from", "50", "WT", "/", "HET", "and", "15", "KO", "mice", "analyzed", ".", "Data", "information", ":", "bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", ".", "Quantification", "of", "the", "intestinal", "length", "(", "C", ")", "from", "50", "WT", "/", "HET", "and", "15", "KO", "mice", "analyzed", ".", "Data", "information", ":", "bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", ".", "D", "-", "G", "(", "D", ")", "Immunohistochemical", "(", "IHC", ")", ",", "IF", "­", "and", "Alcian", "Blue", "staining", "with", "quantification", "of", "P6", "IκBα", "WT", "and", "KO", "intestines", "(", "D", ")", ",", "2", "month", "-", "old", "IκBβ", ";", "IκBε", "KO", "(", "E", ")", "and", "2", "month", "-", "old", "IκBαNES", "mice", "(", "F", "and", "G", ")", ".", "A", "minimum", "of", "50", "crypts", "/", "villus", "was", "counted", "per", "genotype", "(", "3", "mice", ")", ".", "Data", "information", ":", "bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", ".", "Scale", "bars", "in", "D", ",", "E", ",", "F", "and", "G", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of P4 and P6 mice of the indicated IκBα genotypes.Quantification of the animal weight (B) from 50 WT/HET and 15 KO mice analyzed. Data information: bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, * p-value<0.05, n.s. no significant.Quantification of the intestinal length (C) from 50 WT/HET and 15 KO mice analyzed. Data information: bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, * p-value<0.05, n.s. no significant.D-G (D) Immunohistochemical (IHC), IF ­and Alcian Blue staining with quantification of P6 IκBα WT and KO intestines (D), 2 month-old IκBβ;IκBε KO (E) and 2 month-old IκBαNES mice (F and G). A minimum of 50 crypts/villus was counted per genotype (3 mice). Data information: bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, * p-value<0.05, n.s. no significant. Scale bars in D, E, F and G, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "image", "of", "the", "intestinal", "populations", "purified", "in", "the", "cell", "sorting", "experiments", ".", "(", "B", ")", "IF", "analysis", "of", "EphB2", "in", "P6", "WT", "and", "IκBα", "KO", "intestine", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "(", "C", ")", "P", "-", "IκBα", "IF", "of", "EphB2", "-", "high", "or", "negative", "sorted", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "(", "D", ")", "Clustering", "analysis", "of", "the", "indicated", "cell", "populations", "based", "on", "their", "transcriptional", "profiles", "obtained", "in", "RNA", "-", "seq", ".", "3", "mice", "per", "genotype", "were", "initially", "processed", "although", "1", "EphB2neg", "KO", "replicate", "was", "excluded", "from", "the", "analysis", "due", "to", "insufficient", "number", "of", "reads", "in", "the", "RNA", "seq", ".", "(", "E", ")", "Correlation", "plot", "of", "the", "indicated", "differentially", "expressed", "gene", "(", "DEG", ")", "sets", ".", "Values", "for", "DEG", "in", "fetal", "and", "adult", "ISC", "was", "obtained", "from", "Nusse", "et", "al", ",", "2012", ".", "(", "F", ")", "Table", "indicating", "the", "top", "15", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "the", "IκBα", "KO", "EphB2", "-", "high", "signature", "including", "11", "genes", "in", "the", "fetal", "ISC", "signature", "(", "in", "orange", ")", ".", "(", "G", ")", "GSEA", "of", "EphB2", "-", "high", "cells", "indicating", "the", "enrichment", "of", "relevant", "ISC", "-", "related", "pathways", ".", "(", "H", ")", "Representative", "image", "of", "the", "Lgr5", "+", "population", "purified", "in", "the", "cell", "sorting", "experiments", ".", "(", "I", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "genes", "in", "purified", "Lgr5", "+", "cells", "from", "the", "different", "IκBα", "backgrounds", ".", "4", "WT", "and", "1", "KO", "mice", "were", "analyzed", "with", "at", "least", "three", "technical", "replicates", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative image of the intestinal populations purified in the cell sorting experiments.(B) IF analysis of EphB2 in P6 WT and IκBα KO intestine. Data information: Scale bars , 25 μm.(C) P-IκBα IF of EphB2-high or negative sorted cells. Data information: Scale bars , 25 μm.(D) Clustering analysis of the indicated cell populations based on their transcriptional profiles obtained in RNA-seq. 3 mice per genotype were initially processed although 1 EphB2neg KO replicate was excluded from the analysis due to insufficient number of reads in the RNA seq.(E) Correlation plot of the indicated differentially expressed gene (DEG) sets. Values for DEG in fetal and adult ISC was obtained from Nusse et al, 2012.(F) Table indicating the top 15 up-regulated genes in the IκBα KO EphB2-high signature including 11 genes in the fetal ISC signature (in orange).(G) GSEA of EphB2-high cells indicating the enrichment of relevant ISC-related pathways.(H) Representative image of the Lgr5+ population purified in the cell sorting experiments.(I) qPCR analysis of the indicated genes in purified Lgr5+ cells from the different IκBα backgrounds. 4 WT and 1 KO mice were analyzed with at least three technical replicates. Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m). p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, **p-value<0.005, *p-value<0.05, n.s. no significant."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "IF", "analysis", "of", "c", "-", "Rel", "and", "RelA", "/", "p65", "in", "P6", "WT", "and", "IκBα", "KO", "intestines", ".", "Scale", "bars", "in", "25", "μm", ".", "(", "B", ")", "Number", "of", "peaks", "from", "p65", "ChIP", "-", "sequencing", "analysis", "associated", "with", "the", "different", "genomic", "localizations", "was", "obtained", "merging", "two", "biological", "replicates", "per", "condition", "(", "n", "=", "2", "P6", "WT", "and", "n", "=", "2", "P6", "IκBα", "KO", "intestinal", "crypt", "cells", ")", ".", "Data", "from", "individual", "experiments", "have", "been", "deposited", "at", "GSE131187", ".", "IF", "analysis", "of", "active", "Notch1", "(", "ICN1", ")", "(", "C", ")", "in", "the", "indicated", "IκBα", "backgrounds", "at", "P6", "intestines", ".", "Scale", "bars", "in", "25", "μm", ".", "IF", "analysis", "of", "β", "-", "catenin", "(", "D", ")", "in", "the", "indicated", "IκBα", "backgrounds", "at", "P6", "intestines", ".", "Scale", "bars", "25", "μm", ".", "(", "E", ")", "IF", "analysis", "of", "the", "PRC2", "protein", "EZH2", "and", "quantification", "of", "the", "EZH2", "positive", "cells", "per", "crypt", "in", "n", "=", "3", "P6", "animals", "per", "genotype", "were", "analyzed", "(", "a", "minimum", "of", "15", "crypts", "was", "counted", "per", "genotype", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bars", "25", "μm", ".", "(", "F", ")", "Table", "indicating", "the", "methylation", "-", "related", "genes", "(", "PRC2", "members", "and", "KDM6", "demethylase", ")", "differentially", "express", "between", "IκBα", "WT", "and", "KO", "EphB2", "-", "high", "sorted", "cells", "(", "RNA", "-", "seq", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "IκBα", "IP", "from", "crypt", "nuclear", "extracts", ".", "(", "I", ")", "Representation", "of", "H3K27me3", "distribution", "at", "embryonic", "E14", ".", "5", "(", "n", "=", "2", "WT", "and", "n", "=", "2", "KO", "mice", ")", "and", "postnatal", "P6", "(", "n", "=", "2", "WT", "and", "n", "=", "2", "KO", "mice", ")", "(", "from", "ChIP", "-", "sequencing", ")", "and", "expression", "levels", "(", "from", "RNA", "-", "sequencing", ")", "in", "the", "genomic", "region", "of", "the", "indicated", "fetal", "ISC", "genes", ".", "(", "J", ")", "Representation", "of", "IκBα", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "H3K27me3", "(", "n", "=", "2", ")", "distribution", "(", "from", "ChIP", "-", "sequencing", ")", "and", "expression", "levels", "(", "from", "RNA", "-", "sequencing", ")", "in", "the", "genomic", "region", "of", "Litaf", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) IF analysis of c-Rel and RelA/p65 in P6 WT and IκBα KO intestines. Scale bars in 25 μm.(B) Number of peaks from p65 ChIP-sequencing analysis associated with the different genomic localizations was obtained merging two biological replicates per condition (n=2 P6 WT and n=2 P6 IκBα KO intestinal crypt cells). Data from individual experiments have been deposited at GSE131187.IF analysis of active Notch1 (ICN1) (C) in the indicated IκBα backgrounds at P6 intestines. Scale bars in 25 μm.IF analysis of β-catenin (D) in the indicated IκBα backgrounds at P6 intestines. Scale bars 25 μm.(E) IF analysis of the PRC2 protein EZH2 and quantification of the EZH2 positive cells per crypt in n=3 P6 animals per genotype were analyzed (a minimum of 15 crypts was counted per genotype). Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001. Scale bars 25 μm.(F) Table indicating the methylation-related genes (PRC2 members and KDM6 demethylase) differentially express between IκBα WT and KO EphB2-high sorted cells (RNA-seq).(G) Western blot analysis of IκBα IP from crypt nuclear extracts.(I) Representation of H3K27me3 distribution at embryonic E14.5 (n=2 WT and n=2 KO mice) and postnatal P6 (n=2 WT and n=2 KO mice) (from ChIP-sequencing) and expression levels (from RNA-sequencing) in the genomic region of the indicated fetal ISC genes.(J) Representation of IκBα (n=4) and H3K27me3 (n=2) distribution (from ChIP-sequencing) and expression levels (from RNA-sequencing) in the genomic region of Litaf."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "stereoscopic", "image", "of", "P6", "WT", "and", "IκBα", "KO", "-", "derived", "intestinal", "organoids", ".", "Scale", "bars", "in", "A", ",", "100", "μm", "(", "B", ")", "IHC", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", "and", "Alcian", "Blue", "staining", "of", "WT", "and", "IκBα", "KO", "-", "derived", "organoids", ".", "Scale", "bars", "in", "B", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "ISC", "genes", "in", "WT", "and", "IκBα", "KO", "-", "derived", "organoids", ".", "Data", "information", ":", "3", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "genotype", "were", "analyzed", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "Correlation", "plots", "of", "the", "indicated", "differentially", "expressed", "gene", "(", "DEG", ")", "sets", "obtained", "in", "expression", "microarray", "(", "5", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "genotype", "were", "analyzed", ")", ".", "Values", "for", "DEG", "in", "fetal", "and", "adult", "organoids", "were", "obtained", "from", "Mustata", "et", "al", ",", "2013", ".", "(", "E", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "fetal", "genes", "in", "WT", "and", "IκBα", "KO", "-", "derived", "organoids", ".", "Data", "information", ":", "3", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "genotype", "were", "analyzed", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "control", "and", "IκBα", "-", "deleted", "organoids", "using", "CRISPR", "-", "Cas9", "technology", ".", "(", "G", ")", "Representative", "stereoscopic", "image", "of", "WT", "and", "IκBα", "-", "deleted", "organoids", ".", "Scale", "bars", "in", "G", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative stereoscopic image of P6 WT and IκBα KO-derived intestinal organoids. Scale bars in A, 100 μm(B) IHC analysis with the indicated antibodies and Alcian Blue staining of WT and IκBα KO-derived organoids. Scale bars in B 50 μm.(C) qPCR analysis of the indicated ISC genes in WT and IκBα KO-derived organoids. Data information: 3 technical replicates of a minimum of two organoids per genotype were analyzed Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m). p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, **p-value<0.005, * p-value<0.05.(D) Correlation plots of the indicated differentially expressed gene (DEG) sets obtained in expression microarray (5 technical replicates of a minimum of two organoids per genotype were analyzed). Values for DEG in fetal and adult organoids were obtained from Mustata et al, 2013.(E) qPCR analysis of the indicated fetal genes in WT and IκBα KO-derived organoids. Data information: 3 technical replicates of a minimum of two organoids per genotype were analyzed Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m). p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, **p-value<0.005, * p-value<0.05.(F) Western blot analysis of control and IκBα-deleted organoids using CRISPR-Cas9 technology.(G) Representative stereoscopic image of WT and IκBα-deleted organoids. Scale bars in G, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "stereoscopic", "images", "and", "Western", "blot", "analysis", "of", "IκBα", "KO", "organoids", "infected", "with", "the", "indicated", "sh", "-", "RNA", "for", "NF", "-", "κB", "elements", ".", "Data", "information", "Scale", "bars", "in", "A", ",", "100", "μm", ",", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "ISC", "and", "differentiation", "genes", "in", "the", "different", "sh", "-", "RNA", "treated", "organoids", ".", "The", "canonical", "NF", "-", "κB", "target", "gene", "Cxcl10", "is", "shown", "as", "positive", "control", "of", "the", "experiment", ".", "Data", "information", "3", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "condition", "were", "analyzed", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", ".", "(", "C", ")", "Representative", "stereoscopic", "images", "of", "IκBα", "KO", "organoids", "untreated", "or", "treated", "with", "the", "PRC2", "inhibitor", "EPZ", "-", "6438", ".", "Data", "information", "Scale", "bars", "in", "50", "μm", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "adult", "and", "fetal", "ISC", "genes", "(", "D", ")", "and", "elements", "of", "the", "Notch", "and", "IFN", "pathway", "(", "E", ")", "(", "differentially", "expressed", "in", "IκBα", "KO", "organoids", ")", "in", "IκBα", "KO", "organoids", "untreated", "or", "treated", "with", "the", "PRC2", "inhibitor", "EPZ", "-", "6438", ".", "Data", "information", ":", "3", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "condition", "were", "analyzed", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", ".", "(", "F", ")", "Representative", "stereoscopic", "images", "of", "IκBα", "KO", "organoids", "treated", "with", "dexamethasone", "as", "IFN", "inhibitor", "and", "DAPT", "as", "Notch", "inhibitor", ".", "Data", "information", "Scale", "bars", "in", "F", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "qPCR", "analysis", "of", "IκBα", "KO", "organoids", "untreated", "or", "treated", "with", "dexamethasone", "and", "DAPT", ".", "Data", "information", ":", "3", "technical", "replicates", "of", "a", "minimum", "of", "two", "organoids", "per", "condition", "were", "analyzed", ".", "Bars", "represent", "mean", "values", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ";", "p", "values", "were", "derived", "from", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative stereoscopic images and Western blot analysis of IκBα KO organoids infected with the indicated sh-RNA for NF-κB elements. Data information Scale bars in A, 100 μm,(B) qPCR analysis of the indicated ISC and differentiation genes in the different sh-RNA treated organoids. The canonical NF-κB target gene Cxcl10 is shown as positive control of the experiment. Data information 3 technical replicates of a minimum of two organoids per condition were analyzed. Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, **p-value<0.005, * p-value<0.05, n.s. no significant.(C) Representative stereoscopic images of IκBα KO organoids untreated or treated with the PRC2 inhibitor EPZ-6438. Data information Scale bars in 50 μm.(D-E) qPCR analysis of the indicated adult and fetal ISC genes (D) and elements of the Notch and IFN pathway (E) (differentially expressed in IκBα KO organoids) in IκBα KO organoids untreated or treated with the PRC2 inhibitor EPZ-6438. Data information: 3 technical replicates of a minimum of two organoids per condition were analyzed. Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, **p-value<0.005, * p-value<0.05, n.s. no significant.(F) Representative stereoscopic images of IκBα KO organoids treated with dexamethasone as IFN inhibitor and DAPT as Notch inhibitor. Data information Scale bars in F, 50 μm.(G) qPCR analysis of IκBα KO organoids untreated or treated with dexamethasone and DAPT. Data information: 3 technical replicates of a minimum of two organoids per condition were analyzed. Bars represent mean values ± standard error of the mean (s.e.m); p values were derived from an unpaired t-test, two-tailed, ****p-value<0.0001, ***p-value<0.0005, **p-value<0.005, * p-value<0.05, n.s. no significant."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "IF", "analysis", "of", "colonic", "tissue", "from", "control", "and", "DSS", "-", "treated", "animals", "including", "acute", "damaged", "(", "AD", ")", "areas", "and", "recovery", "(", "R", ")", "areas", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "100", "μmIF", "analysis", "of", "P", "-", "IκBα", "and", "the", "indicated", "markers", "in", "the", "areas", "of", "acute", "damage", "and", "recovery", "(", "B", ")", "Asterisks", "indicate", "the", "presence", "of", "rare", "cells", "with", "nuclear", "P", "-", "IκBα", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "50", "μm", ".", "IF", "analysis", "of", "P", "-", "IκBα", "and", "colocalization", "of", "P", "-", "IκBα", "with", "the", "ISC", "marker", "Olfm4", "in", "acute", "damaged", "areas", "(", "C", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "presence", "of", "rare", "cells", "with", "nuclear", "P", "-", "IκBα", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "50", "μm", ".", "(", "D", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "genes", "in", "WT", "and", "IκBα", "KO", "organoids", "treated", "with", "TNFα", "and", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ".", "3", "technical", "replicates", "of", "organoids", "from", "each", "genotype", "were", "analyzed", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Representative", "images", "of", "the", "colonic", "tissue", "from", "2", "months", "-", "old", "DSS", "-", "treated", "WT", "and", "IκBα", "KO", "mice", "are", "shown", ".", "Alcian", "Blue", "staining", "was", "used", "to", "identify", "the", "mucus", "-", "secreting", "goblet", "cells", "in", "the", "colonic", "glands", "and", "Ki67", "as", "proliferation", "marker", ".", "Nuclear", "counterstain", "is", "Fast", "Red", ".", "The", "table", "shows", "number", "of", "ulcerations", "present", "in", "the", "intestines", "of", "mice", "analysed", "(", "3", "WT", ",", "2", "IκBα", "KO", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "in", "E", "and", "F", ",", "100"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) IF analysis of colonic tissue from control and DSS-treated animals including acute damaged (AD) areas and recovery (R) areas. Data information: Scale bars 100 μmIF analysis of P-IκBα and the indicated markers in the areas of acute damage and recovery (B) Asterisks indicate the presence of rare cells with nuclear P-IκBα. Data information: Scale bars 50 μm.IF analysis of P-IκBα and colocalization of P-IκBα with the ISC marker Olfm4 in acute damaged areas (C). Asterisks indicate the presence of rare cells with nuclear P-IκBα. Data information: Scale bars 50 μm.(D) qPCR analysis of the indicated genes in WT and IκBα KO organoids treated with TNFα and collected at the indicated time-points. 3 technical replicates of organoids from each genotype were analyzed.(E-F) Representative images of the colonic tissue from 2 months-old DSS-treated WT and IκBα KO mice are shown. Alcian Blue staining was used to identify the mucus-secreting goblet cells in the colonic glands and Ki67 as proliferation marker. Nuclear counterstain is Fast Red. The table shows number of ulcerations present in the intestines of mice analysed (3 WT, 2 IκBα KO). Data information: Scale bars in E and F, 100 μm"}
{"words": ["Figure", "1A", "and", "B", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "showing", "mitochondrial", "fragmentation", "in", "HBV", "-", "and", "HBx", "-", "expressing", "cells", ",", "respectively", ".", "Huh7", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "HBV", "(", "A", ")", "or", "the", "HBx", "-", "flag", "construct", "(", "B", ")", ".", "At", "2", "days", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "prestained", "with", "MitoTracker", "(", "Mito", ",", "white", ")", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "HBsAg", "(", "A", ",", "green", ")", "and", "anti", "-", "flag", "(", "B", ",", "green", ")", "antibodies", ",", "respectively", ".", "In", "the", "zoomed", "images", ",", "typical", "tubular", "mitochondria", "in", "untransfected", "cells", "and", "fragmented", "mitochondria", "in", "transfected", "cells", "are", "shown", ".", "C", ")", "Whole", "cell", "lysates", "extracted", "from", "Huh7", "cells", "with", "empty", "vector", "(", "Mock", ")", "and", "those", "with", "HBV", "construct", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "against", "the", "indicated", "proteins", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "an", "internal", "loading", "control", ".", "Mitochondrial", "fraction", "(", "bottom", "panel", ")", "isolated", "from", "HepAD38", "cells", "(", "see", "the", "purity", "in", "Figure", "2B", ")", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "phospho", "-", "Drp1", "(", "Ser616", ")", "antibody", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Confocal", "immunofluorescence", "showing", "mitochondrial", "translocation", "of", "Drp1", "in", "HBV", "-", "and", "HBx", "-", "expressing", "cells", ",", "respectively", ".", "Huh7", "cells", "transfected", "with", "HBV", "(", "D", "and", "E", ")", "or", "HBx", "-", "flag", "construct", "(", "F", ")", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "specific", "to", "TOM20", "(", "red", ")", ",", "Drp1", "(", "D", ",", "green", ")", ",", "and", "phospho", "-", "Drp1", "(", "Ser616", ")", "(", "E", "and", "F", ",", "green", ")", ",", "respectively", ".", "HBV", "and", "HBx", "gene", "expression", "(", "white", ")", "was", "verified", "using", "anti", "-", "HBsAg", "(", "D", "and", "E", ")", "and", "anti", "-", "flag", "(", "F", ")", "antibodies", ",", "respectively", ".", "In", "the", "zoomed", "images", ",", "the", "yellow", "color", "indicates", "the", "merge", "of", "Drp1", "or", "phospho", "-", "Drp1", "(", "Ser616", ")", "with", "mitochondria", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "E", ",", "and", "F", ")", "Transfected", "(", "+", ")", "and", "untransfected", "(", "−", ")", "cells", "are", "marked", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A and B) Confocal microscopy images showing mitochondrial fragmentation in HBV- and HBx-expressing cells, respectively. Huh7 cells were transiently transfected with HBV (A) or the HBx-flag construct (B). At 2 days post-transfection, cells prestained with MitoTracker (Mito, white) were immunostained with anti-HBsAg (A, green) and anti-flag (B, green) antibodies, respectively. In the zoomed images, typical tubular mitochondria in untransfected cells and fragmented mitochondria in transfected cells are shown.C) Whole cell lysates extracted from Huh7 cells with empty vector (Mock) and those with HBV construct were analyzed by Western blotting with antibodies against the indicated proteins. β-actin was used as an internal loading control. Mitochondrial fraction (bottom panel) isolated from HepAD38 cells (see the purity in Figure 2B) was analyzed by Western blotting with phospho-Drp1 (Ser616) antibody.(D-F) Confocal immunofluorescence showing mitochondrial translocation of Drp1 in HBV- and HBx-expressing cells, respectively. Huh7 cells transfected with HBV (D and E) or HBx-flag construct (F) were immunostained with antibodies specific to TOM20 (red), Drp1 (D, green), and phospho-Drp1 (Ser616) (E and F, green), respectively. HBV and HBx gene expression (white) was verified using anti-HBsAg (D and E) and anti-flag (F) antibodies, respectively. In the zoomed images, the yellow color indicates the merge of Drp1 or phospho-Drp1 (Ser616) with mitochondria. (A, B, D, E, and F) Transfected (+) and untransfected (−) cells are marked. Nuclei were stained with DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Huh7", "cells", "transfected", "with", "HBV", "construct", "were", "prestained", "with", "MitoTracker", "(", "Mito", ",", "red", ")", "and", "subsequently", ",", "immunostained", "with", "anti", "-", "Parkin", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "HBsAg", "(", "white", ")", "antibodies", ".", "Nuclei", "are", "demarcated", "with", "white", "dots", ".", "Transfected", "(", "+", ")", "and", "untransfected", "(", "−", ")", "cells", "are", "marked", ".", "In", "the", "zoomed", "images", ",", "yellow", "color", "indicates", "the", "accumulation", "of", "endogenous", "Parkin", "recruited", "to", "the", "mitochondria", ".", "Quantification", "of", "fluorescence", "intensity", "of", "Parkin", "aggregates", "on", "the", "mitochondria", "in", "HBV", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "B", ")", "The", "cytosolic", "(", "Cyto", ")", "and", "mitochondrial", "(", "Mito", ")", "fractions", "were", "isolated", "from", "HepAD38", "cells", "grown", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "tetracycline", "for", "48", "h", ".", "Cellular", "fractions", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "specific", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Fractions", ":", "WCL", ",", "whole", "cell", "lysates", ";", "Cyto", ",", "purified", "cytoplasm", ";", "Mito", ",", "purified", "mitochondria", ".", "Organelle", "markers", ":", "VDAC1", ",", "mitochondria", ";", "GAPDH", ",", "cytoplasm", ".", "(", "C", ")", "Parkin", "protein", "in", "whole", "cell", "lysates", "of", "HBV", "-", "expressing", "cells", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "Parkin", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "antibody", ".", "Normal", "rabbit", "IgG", "was", "used", "as", "a", "control", "for", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "for", "β", "-", "actin", "indicates", "equivalent", "amount", "of", "cell", "lysates", "for", "IP", "(", "C", "and", "D", ")", ".", "(", "D", ")", "Mfn2", "protein", "in", "whole", "cell", "lysates", "extracted", "from", "HepAD38", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "and", "Parkin", "(", "P", ")", "siRNA", ",", "respectively", ",", "for", "48", "h", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "Mfn2", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "antibody", ".", "Normal", "mouse", "IgG", "was", "used", "as", "a", "control", "for", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "The", "protein", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "specific", "to", "Mfn2", ",", "Parkin", ",", "and", "β", "-", "actin", "proteins", ".", "(", "(", "E", ")", "Intracellular", "mRNA", "levels", "of", "Parkin", ",", "PINK1", ",", "and", "LC3B", "were", "analyzed", "by", "real", "-", "time", "qRT", "-", "PCR", ".", "GAPDH", "was", "used", "to", "normalize", "changes", "in", "Parkin", ",", "PINK1", ",", "and", "LC3B", "gene", "expression", ".", "(", "F", ")", "The", "protein", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "specific", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "cont", "(", "F", ")", "The", "protein", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "specific", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "(", "F", "and", "G", ")", ".", "The", "relative", "intensity", "of", "ATF4", ",", "Parkin", ",", "PINK1", ",", "and", "LC3B", "protein", "expression", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "was", "analyzed", "by", "ImageJ", "software", ".", ".", "(", "G", ")", "Whole", "cell", "lysates", "extracted", "from", "Huh7", "cells", "with", "empty", "vector", "(", "Mock", ")", "and", "those", "with", "HBV", "construct", "for", "48", "h", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "specific", "to", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Huh7 cells transfected with HBV construct were prestained with MitoTracker (Mito, red) and subsequently, immunostained with anti-Parkin (green) and anti-HBsAg (white) antibodies. Nuclei are demarcated with white dots. Transfected (+) and untransfected (−) cells are marked. In the zoomed images, yellow color indicates the accumulation of endogenous Parkin recruited to the mitochondria. Quantification of fluorescence intensity of Parkin aggregates on the mitochondria in HBV-expressing cells.(B) The cytosolic (Cyto) and mitochondrial (Mito) fractions were isolated from HepAD38 cells grown in the absence or presence of tetracycline for 48 h. Cellular fractions were analyzed by Western blotting with antibodies specific for the indicated proteins. Fractions: WCL, whole cell lysates; Cyto, purified cytoplasm; Mito, purified mitochondria. Organelle markers: VDAC1, mitochondria; GAPDH, cytoplasm.(C) Parkin protein in whole cell lysates of HBV-expressing cells was immunoprecipitated by anti-Parkin antibody, followed by immunoblotting (IB) with anti-ubiquitin (Ub) antibody. Normal rabbit IgG was used as a control for immunoprecipitation (IP). Western blot analysis for β-actin indicates equivalent amount of cell lysates for IP (C and D).(D) Mfn2 protein in whole cell lysates extracted from HepAD38 cells transfected with non-targeting (NT) and Parkin (P) siRNA, respectively, for 48 h was immunoprecipitated by anti-Mfn2 antibody, followed by immunoblotting (IB) with anti-ubiquitin (Ub) antibody. Normal mouse IgG was used as a control for immunoprecipitation (IP). The protein expression was analyzed by Western blotting with antibodies specific to Mfn2, Parkin, and β-actin proteins. ((E) Intracellular mRNA levels of Parkin, PINK1, and LC3B were analyzed by real-time qRT-PCR. GAPDH was used to normalize changes in Parkin, PINK1, and LC3B gene expression.(F) The protein expression was analyzed by Western blotting with antibodies specific for the indicated proteins. β-actin was used as a loading cont(F) The protein expression was analyzed by Western blotting with antibodies specific for the indicated proteins. β-actin was used as a loading control (F and G). The relative intensity of ATF4, Parkin, PINK1, and LC3B protein expression normalized to β-actin was analyzed by ImageJ software.. (G) Whole cell lysates extracted from Huh7 cells with empty vector (Mock) and those with HBV construct for 48 h were analyzed by Western blotting with antibodies specific to the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Huh7", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "protein", "were", "transfected", "with", "HBV", "construct", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "3", "-", "MA", "(", "10", "mM", ")", "and", "BafA1", "(", "100", "nM", ")", ",", "respectively", ",", "for", "8", "h", "before", "fixation", ".", "At", "2", "days", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "HBsAg", "(", "white", ")", ",", "TOM20", "(", "blue", ")", ",", "and", "Parkin", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "demarcated", "with", "white", "dots", ".", "Transfected", "(", "+", ")", "and", "untransfected", "(", "−", ")", "cells", "are", "marked", ".", "In", "the", "zoomed", "images", ",", "the", "arrows", "(", "white", "puncta", ")", "indicate", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "green", ")", "colocalized", "with", "TOM20", "and", "Parkin", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "total", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "B", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "colocalized", "with", "TOM20", "(", "C", ")", "in", "the", "panel", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "area", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "white", ")", "representing", "merge", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", ",", "TOM20", ",", "and", "Parkin", "in", "the", "panel", "(", "A", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Huh7 cells transiently expressing GFP-LC3 protein were transfected with HBV construct in the absence or presence of 3-MA (10 mM) and BafA1 (100 nM), respectively, for 8 h before fixation. At 2 days post-transfection, cells were immunostained with antibodies against HBsAg (white), TOM20 (blue), and Parkin (red). Nuclei are demarcated with white dots. Transfected (+) and untransfected (−) cells are marked. In the zoomed images, the arrows (white puncta) indicate GFP-LC3 puncta (green) colocalized with TOM20 and Parkin.(B and C) Quantification of the number of total GFP-LC3 puncta (B) and GFP-LC3 puncta colocalized with TOM20 (C) in the panel (A). (D) Quantitative analysis of the area of GFP-LC3 puncta (white) representing merge of GFP-LC3 puncta, TOM20, and Parkin in the panel (A)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Huh7", "cells", "transiently", "expressing", "Mito", "-", "mRFP", "-", "EGFP", "were", "transfected", "with", "HBV", ",", "HBx", "-", "flag", ",", "and", "HBV", "-", "ΔX", "constructs", ",", "respectively", ",", "for", "48", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "specific", "to", "HBsAg", "and", "flag", "(", "white", ")", ",", "respectively", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Transfected", "(", "+", ")", "and", "untransfected", "(", "−", ")", "cells", "are", "marked", ".", "In", "the", "zoomed", "images", ",", "fluorescence", "signals", "indicate", "the", "expression", "of", "Mito", "-", "mRFP", "-", "EGFP", "targeting", "mitochondria", ":", "yellow", "color", ",", "no", "mitophagy", ";", "red", "color", ",", "mitophagy", ".", "(", "C", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "fluorescence", "signal", "targeted", "to", "mitochondria", "in", "the", "panel", "(", "B", ")", ".", "(", "D", ")", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "Huh7", "cells", "were", "transfected", "with", "HBV", "construct", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "3", "-", "MA", "(", "10", "mM", ")", "and", "BafA1", "(", "100", "nM", ")", ",", "respectively", ",", "for", "8", "h", "before", "fixation", ".", "At", "2", "days", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "prestained", "with", "LysoTracker", "(", "Lyso", ",", "red", ")", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "HBsAg", "(", "white", ")", "and", "TOM20", "(", "blue", ")", ".", "Nuclei", "are", "demarcated", "with", "white", "dot", "circles", ".", "Transfected", "(", "+", ")", "and", "untransfected", "(", "−", ")", "cells", "are", "marked", ".", "In", "the", "zoom", "images", ",", "the", "arrows", "denoting", "white", "puncta", "indicate", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "green", ")", "colocalized", "with", "TOM20", "and", "lysosome", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "containing", "lysosome", "with", "mitochondria", "in", "the", "panel", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Huh7 cells transiently expressing Mito-mRFP-EGFP were transfected with HBV, HBx-flag, and HBV-ΔX constructs, respectively, for 48 h. Cells were immunostained with antibodies specific to HBsAg and flag (white), respectively. Nuclei were stained with DAPI (blue). Transfected (+) and untransfected (−) cells are marked. In the zoomed images, fluorescence signals indicate the expression of Mito-mRFP-EGFP targeting mitochondria: yellow color, no mitophagy; red color, mitophagy.(C) Quantitative analysis of the fluorescence signal targeted to mitochondria in the panel (B).(D) GFP-LC3-expressing Huh7 cells were transfected with HBV construct in the absence or presence of 3-MA (10 mM) and BafA1 (100 nM), respectively, for 8 h before fixation. At 2 days post-transfection, cells prestained with LysoTracker (Lyso, red) were immunostained with antibodies against HBsAg (white) and TOM20 (blue). Nuclei are demarcated with white dot circles. Transfected (+) and untransfected (−) cells are marked. In the zoom images, the arrows denoting white puncta indicate GFP-LC3 puncta (green) colocalized with TOM20 and lysosome. (E) Quantification of the colocalization of GFP-LC3 puncta containing lysosome with mitochondria in the panel (D)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Parkin", "silencing", "accelerates", "HBV", "-", "induced", "mitochondrial", "apoptotic", "signaling", ".", "HepG2", "and", "HepAD38", "cells", "grown", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "tetracycline", "were", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "and", "Parkin", "siRNA", ",", "respectively", ",", "for", "72", "h", ".", "Cells", "were", "used", "for", "Western", "blot", "analysis", "using", "antibodies", "specific", "to", "the", "indicated", "proteins", "(", "A", ")", ",", "caspase", "-", "3", "/", "7", "activity", "assay", "(", "B", ")", ",", "and", "TUNEL", "assay", "(", "C", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Parkin silencing accelerates HBV-induced mitochondrial apoptotic signaling. HepG2 and HepAD38 cells grown in the absence or presence of tetracycline were transfected with non-targeting (NT) and Parkin siRNA, respectively, for 72 h. Cells were used for Western blot analysis using antibodies specific to the indicated proteins (A), caspase-3/7 activity assay (B), and TUNEL assay (C)"}
{"words": ["figf1", "(", "a", "-", "c", ")", "HeLa", "cells", "were", "either", "left", "untreated", ",", "amino", "-", "acid", "(", "aa", ")", "/", "FBS", "starved", "for", "5", " ", "h", ",", "or", "starved", "and", "then", "recovered", "in", "amino", "-", "acid", "/", "FBS", "-", "containing", "medium", ",", "then", "immunostained", ",", "or", "immunoblotted", "using", "antibodies", "as", "shown", ".", "Co", "-", "localization", "panels", "show", "an", "overlap", "between", "mTOR", "and", "LAMP1", "signals", ".", "Note", "that", "changes", "in", "the", "positioning", "of", "lysosomal", "mTOR", "(", "quantified", "as", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "predominantly", "peripheral", "localization", "of", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", ";", "a", ",", "c", ")", "correlate", "with", "mTORC1", "activity", "(", "levels", "of", "phosphorylated", "S6K", "relative", "to", "the", "total", "S6K", ";", "b", ")", ".", "(", "d", ")", "Visualization", "of", "Akt", "activated", "in", "response", "to", "recovery", "after", "serum", "starvation", ".", "After", "nutrient", "recovery", ",", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "localize", "to", "peripheral", "regions", "with", "higher", "concentrations", "of", "phospho", "-", "Akt", ".", "DAPI", ",", "4", ",", "6", "−", "diamidino", "−", "2", "−", "phenylindole", ".", "For", "all", "panels", ",", "values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "other", "comparisons", "are", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "Representative", "maximum", "-", "intensity", "projections", "of", "serial", "confocal", "optical", "sections", "are", "shown", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a-c) HeLa cells were either left untreated, amino-acid (aa)/FBS starved for 5 h, or starved and then recovered in amino-acid/FBS-containing medium, then immunostained, or immunoblotted using antibodies as shown. Co-localization panels show an overlap between mTOR and LAMP1 signals. Note that changes in the positioning of lysosomal mTOR (quantified as the percentage of cells with predominantly peripheral localization of LAMP1-positive vesicles; a,c) correlate with mTORC1 activity (levels of phosphorylated S6K relative to the total S6K; b).(d) Visualization of Akt activated in response to recovery after serum starvation. After nutrient recovery, LAMP1-positive vesicles localize to peripheral regions with higher concentrations of phospho-Akt. DAPI, 4,6−diamidino−2−phenylindole. For all panels, values are means ± s.e.m. of three independent experiments carried out in triplicate. *P0.05, **P0.01, ***P0.005 Student's t-test; other comparisons are not significant (n.s.). Representative maximum-intensity projections of serial confocal optical sections are shown. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S7."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ",", "b", ")", "Nocodazole", "flattens", "the", "differences", "in", "lysosomal", "mTOR", "localization", "and", "dampens", "mTORC1", "signalling", "in", "response", "to", "changes", "in", "nutrient", "availability", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "Fig", ".", "1a", "followed", "by", "incubation", "with", "dimethylsulphoxide", "(", "vehicle", ")", "or", "with", "nocodazole", "during", "the", "last", "2", " ", "h", "before", "fixation", "/", "lysis", ".", "Samples", "were", "analysed", "by", "immunofluorescence", "(", "a", ")", "or", "immunoblotting", "(", "b", ")", ".", "Quantification", "of", "phopho", "-", "S6K", "levels", "is", "shown", "in", "(", "b", ")", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Changes", "in", "lysosomal", "positioning", "induced", "by", "kinesin", "-", "or", "small", "GTPase", "-", "family", "members", "(", "c", ",", "d", ")", "correlate", "with", "changes", "in", "mTORC1", "activity", "(", "e", ")", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "overexpression", "constructs", "(", "OE", ")", "or", "with", "siRNA", "as", "shown", ",", "followed", "by", "immunofluorescence", "(", "c", ",", "d", ")", "or", "by", "immunoblotting", "(", "e", ")", "analyses", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "All", "comparisons", "are", "with", "the", "control", "within", "each", "treatment", "condition", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a,b) Nocodazole flattens the differences in lysosomal mTOR localization and dampens mTORC1 signalling in response to changes in nutrient availability. Cells were treated as in Fig. 1a followed by incubation with dimethylsulphoxide (vehicle) or with nocodazole during the last 2 h before fixation/lysis. Samples were analysed by immunofluorescence (a) or immunoblotting (b). Quantification of phopho-S6K levels is shown in (b).(c-e) Changes in lysosomal positioning induced by kinesin- or small GTPase-family members (c,d) correlate with changes in mTORC1 activity (e). HeLa cells were transfected with overexpression constructs (OE) or with siRNA as shown, followed by immunofluorescence (c,d) or by immunoblotting (e) analyses. Values are means ± s.e.m. of three independent experiments carried out in triplicate. All comparisons are with the control within each treatment condition, *P0.05, ***P0.005 Student's t-test; n.s. not significant. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S7."}
{"words": ["figf3", "(", "a", "-", "c", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "ARL8B", "or", "KIF2", "siRNA", ",", "or", "with", "ARL8B", "overexpression", "construct", "(", "non", "-", "targeting", "siRNA", "and", "empty", "pcDNA", "vector", "used", "as", "transfection", "controls", ")", ",", "were", "either", "left", "untreated", ",", "serum", "/", "amino", "-", "acid", "starved", "for", "5", " ", "h", ",", "or", "starved", "and", "then", "recovered", "in", "amino", "-", "acid", "-", "and", "FBS", "-", "containing", "medium", "for", "30", " ", "min", ".", "Cells", "were", "immunostained", "using", "LAMP1", "antibody", "(", "a", ")", "and", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "predominantly", "peripheral", "localization", "of", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "(", "b", ")", "or", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "c", ")", "using", "antibodies", "as", "shown", ".", "Quantification", "of", "phospho", "-", "S6K", "levels", "relative", "to", "the", "total", "S6K", "is", "shown", "in", "(", "c", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "All", "comparisons", "are", "with", "the", "control", "within", "each", "treatment", "condition", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a-c) HeLa cells transfected with ARL8B or KIF2 siRNA, or with ARL8B overexpression construct (non-targeting siRNA and empty pcDNA vector used as transfection controls), were either left untreated, serum/amino-acid starved for 5 h, or starved and then recovered in amino-acid- and FBS-containing medium for 30 min. Cells were immunostained using LAMP1 antibody (a) and the percentage of cells with predominantly peripheral localization of LAMP1-positive vesicles was quantified (b) or subjected to immunoblotting (c) using antibodies as shown. Quantification of phospho-S6K levels relative to the total S6K is shown in (c). Values are means ± s.e.m. of three independent experiments carried out in triplicate. All comparisons are with the control within each treatment condition, *P0.05, **P0.01, ***P0.005 Student's t-test; n.s. not significant. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S7."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Starvation", "increases", "pHi", "in", "HeLa", "cells", "allowed", "to", "starve", "using", "three", "different", "protocols", "(", "see", "Methods", ")", "with", "or", "without", "subsequent", "recovery", ".", "(", "b", "-", "d", ")", "Changing", "pHi", "from", "7", ".", "1", "to", "7", ".", "7", "is", "sufficient", "to", "affect", "localization", "of", "lysosomes", "and", "mTORC1", "activity", ".", "pHi", "was", "titrated", "in", "full", "tissue", "-", "culture", "medium", "containing", "nigericin", ",", "which", "enables", "changes", "in", "pHi", "to", "be", "forced", "by", "altering", "pH", "in", "the", "medium", ",", "followed", "by", "immunostaining", "(", "b", ",", "c", ")", "or", "western", "blotting", "(", "d", ")", "using", "antibodies", "as", "shown", ".", "(", "e", ")", "Changes", "in", "lysosomal", "localization", "have", "no", "effect", "on", "pHi", ".", "ARL8B", "and", "KIF2", "were", "overexpressed", "or", "knocked", "down", "in", "HeLa", "cells", "followed", "by", "pHi", "measurement", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Nutrients", "and", "pHi", "affect", "levels", "of", "ARL8", "and", "KIF2", "in", "lysosomal", "fractions", ".", "Protein", "levels", "and", "their", "quantification", "in", "total", "cellular", "lysates", "or", "in", "isolated", "lysosomal", "fractions", "from", "HeLa", "cells", "subjected", "to", "1", " ", "h", "nutrient", "deprivation", "-", "recovery", "(", "f", ")", "or", "to", "1", " ", "h", "changes", "of", "pHi", "in", "full", "tissue", "-", "culture", "medium", "containing", "nigericin", "(", "g", ")", "are", "shown", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "Effect", "of", "nutrients", "and", "pHi", "on", "binding", "of", "ARL8", "and", "KIF2", "to", "polymerized", "microtubules", ".", "HeLa", "cells", "treated", "as", "in", "(", "f", ")", "and", "(", "g", ")", ",", "followed", "by", "isolation", "of", "polymerized", "microtubule", "fraction", "and", "western", "blotting", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "For", "all", "panels", "values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "All", "comparisons", "are", "with", "the", "control", "within", "each", "treatment", "condition", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "n", ".", "s", ".", "not", "significant", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Starvation increases pHi in HeLa cells allowed to starve using three different protocols (see Methods) with or without subsequent recovery.(b-d) Changing pHi from 7.1 to 7.7 is sufficient to affect localization of lysosomes and mTORC1 activity. pHi was titrated in full tissue-culture medium containing nigericin, which enables changes in pHi to be forced by altering pH in the medium, followed by immunostaining (b,c) or western blotting (d) using antibodies as shown.(e) Changes in lysosomal localization have no effect on pHi. ARL8B and KIF2 were overexpressed or knocked down in HeLa cells followed by pHi measurement.(f,g) Nutrients and pHi affect levels of ARL8 and KIF2 in lysosomal fractions. Protein levels and their quantification in total cellular lysates or in isolated lysosomal fractions from HeLa cells subjected to 1 h nutrient deprivation-recovery (f) or to 1 h changes of pHi in full tissue-culture medium containing nigericin (g) are shown.(h,i) Effect of nutrients and pHi on binding of ARL8 and KIF2 to polymerized microtubules. HeLa cells treated as in (f) and (g), followed by isolation of polymerized microtubule fraction and western blotting. The asterisk indicates a nonspecific band. For all panels values are means ± s.e.m. of three independent experiments carried out in triplicate. All comparisons are with the control within each treatment condition, *P0.05, **P0.01, ***P0.005 Student's t-test; n.s. not significant. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S7."}
{"words": ["figf5", "(", "b", ")", "Serum", "and", "amino", "-", "acid", "starvation", "of", "HeLa", "cells", "for", "5", " ", "h", "reduces", "LC3", "-", "II", "levels", "(", "above", ")", ",", "but", "increases", "autolysosome", "numbers", "detected", "using", "tfLC3", "(", "below", ")", ".", "With", "tfLC3", ",", "GFP", "-", "and", "RFP", "-", "positive", "puncta", "represent", "autophagosomes", "before", "lysosomal", "fusion", ",", "whereas", "RFP", "-", "positive", "/", "GFP", "-", "negative", "puncta", "represent", "autolysosomes", "-", "GFP", "is", "more", "rapidly", "quenched", "by", "low", "lysosomal", "pH", "(", "see", "Methods", ")", ".", "Increased", "autolysosomes", "indicate", "enhanced", "starvation", "-", "induced", "flux", "of", "LC3", "to", "lysosomes", ".", "(", "c", ")", "ARL8B", "knockdown", "increases", "autophagosomal", "synthesis", ".", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "for", "48", " ", "h", ",", "then", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "bafilomycin", "A1", ".", "LC3", "-", "II", "levels", "versus", "actin", "were", "quantified", "(", "bottom", "graphs", ")", ".", "Asterisk", ":", "nonspecific", "band", ".", "(", "d", ")", "ARL8B", "overexpression", "inhibits", "autophagosome", "synthesis", "and", "degradation", ".", "HeLa", "cells", "overexpressing", "ARL8B", "or", "empty", "vector", "were", "analysed", "as", "in", "(", "c", ")", ".", "(", "e", ")", "HeLa", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "either", "ARL8B", "overexpression", "construct", "or", "siRNA", "(", "non", "-", "targeting", "siRNA", "and", "empty", "peGFP", "vector", "were", "transfection", "controls", ")", "together", "with", "mCherry", "-", "LC3", "for", "48", " ", "h", ".", "After", "fixation", ",", "cells", "were", "stained", "for", "endogenous", "LAMP1", "and", "DNA", "(", "DAPI", ")", ".", "Representative", "maximum", "-", "intensity", "projections", "of", "serial", "confocal", "optical", "sections", "are", "shown", ".", "Co", "-", "localization", "panels", "show", "overlapping", "mCherry", "-", "LC3", "and", "LAMP1", "signals", ".", "(", "f", "-", "h", ")", "Quantification", "of", "autophagosome", "-", "lysosome", "fusion", "in", "HeLa", "cells", ".", "Percentages", "of", "autolysosomes", "(", "positive", "for", "both", "mCherry", "-", "LC3", "and", "LAMP1", ")", "to", "autophagosomes", "(", "positive", "for", "mCherry", "-", "LC3", "and", "negative", "for", "LAMP1", ")", "were", "quantified", ".", "In", "(", "h", ")", ",", "we", "analysed", "cells", "treated", "for", "2", " ", "h", "with", "nocodazole", "before", "fixation", ",", "which", "dispersed", "the", "perinuclear", "lysosomal", "cluster", "(", "see", "Fig", ".", "2a", ")", ".", "(", "i", ")", "Autophagosomal", "and", "autolysosomal", "numbers", "in", "tfLC3", "-", "expressing", "cells", "after", "ARL8B", "overexpression", "and", "knockdown", "(", "Supplementary", "Fig", ".", "S5o", "shows", "representative", "cells", ".", ")", ".", "In", "(", "f", "-", "i", ")", "we", "analysed", "20", "cells", "per", "group", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "other", "comparisons", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(b) Serum and amino-acid starvation of HeLa cells for 5 h reduces LC3-II levels (above), but increases autolysosome numbers detected using tfLC3 (below). With tfLC3, GFP- and RFP-positive puncta represent autophagosomes before lysosomal fusion, whereas RFP-positive/GFP-negative puncta represent autolysosomes-GFP is more rapidly quenched by low lysosomal pH (see Methods). Increased autolysosomes indicate enhanced starvation-induced flux of LC3 to lysosomes.(c) ARL8B knockdown increases autophagosomal synthesis. siRNA-transfected HeLa cells were incubated for 48 h, then left untreated or incubated with bafilomycin A1. LC3-II levels versus actin were quantified (bottom graphs). Asterisk: nonspecific band.(d) ARL8B overexpression inhibits autophagosome synthesis and degradation. HeLa cells overexpressing ARL8B or empty vector were analysed as in (c).(e) HeLa cells were co-transfected with either ARL8B overexpression construct or siRNA (non-targeting siRNA and empty peGFP vector were transfection controls) together with mCherry-LC3 for 48 h. After fixation, cells were stained for endogenous LAMP1 and DNA (DAPI). Representative maximum-intensity projections of serial confocal optical sections are shown. Co-localization panels show overlapping mCherry-LC3 and LAMP1 signals. (f-h) Quantification of autophagosome-lysosome fusion in HeLa cells. Percentages of autolysosomes (positive for both mCherry-LC3 and LAMP1) to autophagosomes (positive for mCherry-LC3 and negative for LAMP1) were quantified. In (h), we analysed cells treated for 2 h with nocodazole before fixation, which dispersed the perinuclear lysosomal cluster (see Fig. 2a). (i) Autophagosomal and autolysosomal numbers in tfLC3-expressing cells after ARL8B overexpression and knockdown (Supplementary Fig. S5o shows representative cells.). In (f-i) we analysed 20 cells per group in three independent experiments. Values are means ± s.e.m of three independent experiments carried out in triplicate. *P0.05, **P0.01, ***P0.005 Student's t-test; other comparisons not significant (n.s.). Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S7."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "ELISA", "of", "supernatant", "IL", "-", "1β", "for", "unprimed", "THP", "-", "1", "cells", "(", "UT", ")", "or", "LPS", "-", "primed", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "THP", "-", "1", "cells", "then", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "Uninfected", "cells", "serves", "as", "mock", "control", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "supernatant", "(", "Sup", ")", "and", "cell", "extracts", "(", "Lys", ")", "of", "THP", "-", "1", "cells", ",", "left", "untreated", "or", "primed", "by", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", ",", "after", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "C", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatants", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "NLRP3", "knockout", "(", "KO", ")", "#", "1", "or", "AIM2", "KO", "#", "1", "THP", "-", "1", "cells", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ",", "or", "pretreated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "followed", "by", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", "stimulation", ",", "or", "stimulated", "with", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", "(", "1mg", "/", "ml", ",", "6", "hrs", ")", ",", "or", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ",", "36", "hrs", ")", ".", "(", "D", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatants", "of", "two", "clones", "of", "NLRP3", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "with", "or", "without", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "E", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatants", "of", "PBMCs", "from", "two", "donors", "transfected", "with", "control", "(", "ctrl", ")", "siRNA", "or", "NLRP3", "siRNA", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "F", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatant", "of", "WT", ",", "NLRP3", "KO", "or", "AIM2", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "with", "ZIKV", "(", "MR766", "or", "GZ01", ")", "(", "MOI", "=", "1", ")", "or", "DENV", "-", "2", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "for", "36", "hrs", ".", "(", "G", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "pre", "-", "infected", "with", "ZIKV", "for", "24", "hrs", "or", "mock", "control", ".", "The", "cells", "were", "then", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "followed", "by", "ATP", "(", "5", "mM", ")", "treatment", "for", "6", "hrs", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "supernatant", "(", "Sup", ")", "and", "cell", "extracts", "(", "Lys", ")", "of", "THP", "-", "1", "cells", "pre", "-", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "or", "mock", "control", "for", "24", "hrs", ".", "The", "cells", "were", "then", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "followed", "by", "ATP", "(", "5", "mM", ")", "stimulation", "for", "6", "hrs", ".", "(", "I", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "supernatants", "and", "cell", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "NLRP3", ",", "ASC", ",", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "and", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "together", "with", "NS1", ".", "(", "J", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "extracts", "of", "Flag", "-", "tagged", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "increasing", "doses", "of", "doxycycline", "(", "Dox", ")", "for", "24", "hrs", ".", "(", "K", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatants", "of", "Flag", "-", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "left", "unprimed", "then", "treated", "with", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "2", "mg", "/", "ml", ",", "6", "hrs", ")", ",", "or", "pre", "-", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "followed", "by", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "2", "mg", "/", "ml", ",", "6", "hrs", ")", "stimulation", ".", "(", "L", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "supernatants", "(", "Sup", ")", "and", "cell", "extracts", "(", "Lys", ")", "of", "Flag", "-", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "followed", "by", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "2", "mg", "/", "ml", ",", "6", "hrs", ")", "stimulation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) ELISA of supernatant IL-1β for unprimed THP-1 cells (UT) or LPS-primed (500 ng/ml, 3 hrs) THP-1 cells then infected with ZIKV (MOI=1) for 36 hrs. Uninfected cells serves as mock control.(B) Immunoblot analysis of supernatant (Sup) and cell extracts (Lys) of THP-1 cells, left untreated or primed by LPS (500 ng/ml, 3 hrs), after ZIKV infection (MOI=1) for 36 hrs.(C) ELISA of IL-1β in the supernatants of wild type (WT), NLRP3 knockout (KO) #1 or AIM2 KO#1 THP-1 cells left untreated (UT), or pretreated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) followed by ATP (5 mM, 6 hrs) stimulation, or stimulated with poly (dA:dT) (1mg/ml, 6 hrs), or infected with ZIKV (MOI=1, 36 hrs).(D) ELISA of IL-1β in the supernatants of two clones of NLRP3 KO THP-1 cells with or without ZIKV infection (MOI=1) at the indicated time points.(E) ELISA of IL-1β in the supernatants of PBMCs from two donors transfected with control (ctrl) siRNA or NLRP3 siRNA followed by ZIKV infection (MOI=1) for 36 hrs.(F) ELISA of IL-1β in the supernatant of WT, NLRP3 KO or AIM2 KO THP-1 cells with ZIKV (MR766 or GZ01) (MOI=1) or DENV-2 (MOI=1) infection for 36 hrs.(G) ELISA of IL-1β in the supernatants of THP-1 cells pre-infected with ZIKV for 24 hrs or mock control. The cells were then treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) followed by ATP (5 mM) treatment for 6 hrs.(H) Immunoblot analysis of supernatant (Sup) and cell extracts (Lys) of THP-1 cells pre-infected with ZIKV (MOI=1) or mock control for 24 hrs. The cells were then treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) followed by ATP (5 mM) stimulation for 6 hrs.(I) Immunoblot analysis of supernatants and cell extracts of 293T cells transfected with plasmids expressing NLRP3, ASC, pro-caspase-1 and pro-IL-1β together with NS1.(J) Immunoblot analysis of protein extracts of Flag-tagged NS1-inducible THP-1 cells treated with increasing doses of doxycycline (Dox) for 24 hrs.(K) ELISA of IL-1β in the supernatants of Flag-NS1-inducible THP-1 cells left unprimed then treated with ATP (5 mM, 6 hrs) or poly (I:C) (2 mg/ml, 6 hrs), or pre-treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) followed by ATP (5 mM, 6 hrs) or poly (I:C) (2 mg/ml, 6 hrs) stimulation.(L) Immunoblot analysis of supernatants (Sup) and cell extracts (Lys) of Flag-NS1-inducible THP-1 cells pre-treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) followed by ATP (5 mM, 6 hrs) or poly (I:C) (2 mg/ml, 6 hrs) stimulation."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "THP", "-", "1", "cells", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "and", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", ",", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "NLRP3", "knockout", "(", "KO", ")", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "by", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "E", ")", "Plaque", "titration", "of", "ZIKV", "in", "supernatants", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "WT", "or", "caspase", "-", "1", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "by", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "G", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "WT", "or", "caspase", "-", "1", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "H", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "NS", "-", "1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "doxycycline", "(", "Dox", ")", ",", "then", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "Ac", "-", "YVAD", "-", "cmk", "(", "20", "μΜ", ")", "for", "3", "hrs", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "I", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "NLRP3", "knockdown", "efficiency", "in", "PBMCs", "from", "two", "donors", ".", "(", "J", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "NLRP3", "siRNA", "then", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "K", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "in", "PBMCs", "treated", "with", "DMSO", "or", "Ac", "-", "YVAD", "-", "cmk", "(", "20μM", ")", "for", "3hrs", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in THP-1 cells left untreated or treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) and ATP (5 mM, 6 hrs), followed by ZIKV infection (MOI=1) for the indicated time points.(B) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in wild type (WT) or NLRP3 knockout (KO) THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(C) Immunoblot analysis of extracts of WT or Nlrp3-/- BMDMs by the indicated antibodies.(D) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in WT or Nlrp3-/- BMDMs infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(E) Plaque titration of ZIKV in supernatants of WT or Nlrp3-/- BMDMs infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(F) Immunoblot analysis of extracts of WT or caspase-1 KO THP-1 cells by the indicated antibodies.(G) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in WT or caspase-1 KO THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(H) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in NS-1-inducible THP-1 cells treated with or without doxycycline (Dox), then left untreated or treated with Ac-YVAD-cmk (20 μΜ) for 3 hrs followed by ZIKV infection (MOI=1) for the indicated time points.(I) Relative qRT-PCR analysis of NLRP3 knockdown efficiency in PBMCs from two donors.(J) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in PBMCs transfected with control siRNA or NLRP3 siRNA then infected with ZIKV (MOI=1) for 36 hrs.(K) qRT-PCR analysis of ZIKV RNA in PBMCs treated with DMSO or Ac-YVAD-cmk (20μM) for 3hrs followed by ZIKV infection (MOI=1) for 36 hrs."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "NS1", "together", "with", "Flag", "-", "NLRP3", ",", "Flag", "-", "ASC", ",", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "and", "Flag", "-", "IL", "-", "1β", ".", "WCL", ",", "whole", "cell", "lysates", ".", "(", "B", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", ",", "which", "expressed", "Flag", "-", "tagged", "NS1", ",", "treated", "with", "or", "without", "doxycycline", "(", "Dox", ")", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "and", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", "followed", "by", "increasing", "doses", "of", "Dox", "treatment", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "increasing", "amount", "of", "HA", "-", "NS1", ".", "Below", ",", "caspase", "-", "1", "mRNA", "RT", "-", "PCR", ";", "RPL13A", "mRNA", "RT", "-", "PCR", "serves", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "increasing", "amount", "of", "HA", "-", "DENV", "-", "2", "-", "NS1", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "NS1", "followed", "by", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "treatment", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "NS1", "then", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "mM", ")", ",", "Lactacystin", "(", "5", "μM", ")", ",", "Carfilzomib", "(", "100", "mM", ")", "or", "CQ", "(", "50", "mM", ")", "for", "6", "hrs", ".", "(", "H", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "Flag", "-", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "Dox", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "(", "I", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "and", "indicated", "HA", "-", "tagged", "WT", "ubiquitin", "or", "mutants", "(", "K6", "-", ",", "K11", "-", ",", "K27", "-", ",", "K29", "-", ",", "K33", "-", ",", "K48", "-", "and", "K63", "-", "Only", ")", ",", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "NS1", ",", "followed", "by", "MG132", "(", "10", "mM", ")", "treatment", "for", "6", "hrs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with HA-NS1 together with Flag-NLRP3, Flag-ASC, Flag-caspase-1 and Flag-IL-1β. WCL, whole cell lysates.(B) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of NS1-inducible THP-1 cells, which expressed Flag-tagged NS1, treated with or without doxycycline (Dox) (100 ng/ml).(C) Immunoblot analysis of extracts of THP-1 cells treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) and ATP (5 mM, 6 hrs) followed by increasing doses of Dox treatment.(D) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 together with increasing amount of HA-NS1. Below, caspase-1 mRNA RT-PCR; RPL13A mRNA RT-PCR serves as a loading control.(E) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 together with increasing amount of HA-DENV-2-NS1.(F) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 together with empty vector or HA-NS1 followed by cycloheximide (CHX) treatment (100 μg/ml) for the indicated time points.(G) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 together with empty vector or HA-NS1 then treated with MG132 (10 mM), Lactacystin (5 μM), Carfilzomib (100 mM) or CQ (50 mM) for 6 hrs.(H) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of Flag-NS1-inducible THP-1 cells treated with or without Dox (100 ng/ml).(I) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with plasmids expressing Flag-caspase-1 and indicated HA-tagged WT ubiquitin or mutants (K6-, K11-, K27-, K29-, K33-, K48- and K63-Only), together with empty vector or Myc-NS1, followed by MG132 (10 mM) treatment for 6 hrs."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "USP8", "knockout", "(", "KO", ")", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "NS1", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "USP8", "then", "treated", "with", "or", "without", "MG132", "(", "10", "mM", ")", "for", "6", "hrs", ".", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "Flag", "-", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "Dox", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "then", "transfected", "with", "or", "without", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "2", "mg", "/", "ml", ",", "6", "hrs", ")", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "and", "Myc", "-", "USP8", "together", "with", "HA", "-", "NS1", "followed", "by", "MG132", "treatment", "(", "10", "mM", ")", "for", "6", "hrs", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "hrs", ".", "(", "F", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "WT", "and", "USP8", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "hrs", ".", "(", "G", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "and", "indicated", "HA", "-", "tagged", "WT", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "or", "mutants", "(", "K6", "-", ",", "K11", "-", ",", "K27", "-", ",", "K29", "-", ",", "K33", "-", ",", "K48", "-", "and", "K63", "-", "Only", ")", ",", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "USP8", ",", "followed", "by", "MG132", "(", "10", "mM", ")", "treatment", "for", "6", "hrs", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "WT", "or", "USP8", "KO", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", ",", "HA", "-", "K11", "-", "Ub", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "NS1", ",", "followed", "by", "two", "-", "step", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Flag", "beads", "and", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", ".", "(", "I", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "USP8", "KO", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "and", "HA", "-", "K11", "-", "Ub", "together", "with", "WT", "or", "inactive", "mutant", "C786A", "of", "USP8", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Immunoblot analysis of extracts of wild type (WT) and USP8 knockout (KO) 293T cells transfected with Flag-caspase-1 together with empty vector or Myc-NS1.(B) Immunoblot analysis of extracts of transfected with Flag-caspase-1 together with empty vector or Myc-USP8 then treated with or without MG132 (10 mM) for 6 hrs.(C) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of Flag-NS1-inducible THP-1 cells treated with or without Dox (100 ng/ml) then transfected with or without poly (I:C) (2 mg/ml, 6 hrs).(D) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 and Myc-USP8 together with HA-NS1 followed by MG132 treatment (10 mM) for 6 hrs.(E) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for 24 hrs.(F) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of WT and USP8 KO THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for 24 hrs.(G) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with plasmids expressing Flag-caspase-1 and indicated HA-tagged WT ubiquitin (Ub) or mutants (K6-, K11-, K27-, K29-, K33-, K48- and K63-Only), together with empty vector or Myc-USP8, followed by MG132 (10 mM) treatment for 6 hrs.(H) Immunoblot analysis of extracts of WT or USP8 KO 293T cells transfected with Flag-caspase-1, HA-K11-Ub together with empty vector or Myc-NS1, followed by two-step immunoprecipitation with anti-Flag beads and immunoblot analysis with anti-HA.(I) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of USP8 KO 293T cells transfected with Flag-caspase-1 and HA-K11-Ub together with WT or inactive mutant C786A of USP8."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "NS1", "together", "with", "Flag", "-", "caspae", "-", "1", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "mutants", "(", "K37R", ",", "K44R", "or", "K134R", ")", ".", "Lower", "panel", "shows", "the", "intensity", "analysis", "of", "the", "bands", "from", "the", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "K11", "-", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "together", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "(", "WT", ",", "K37R", ",", "K44R", ",", "K134R", ")", ".", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "(", "WT", "or", "K134R", ")", "and", "HA", "-", "K11", "-", "Ub", ",", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "NS1", ".", "Lower", "panel", "shows", "the", "intensity", "analysis", "of", "the", "bands", "from", "the", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", "(", "WT", "or", "K134R", ")", "and", "HA", "-", "K11", "-", "Ub", ",", "together", "with", "empty", "vector", "or", "Myc", "-", "USP8", ".", "Lower", "panel", "shows", "the", "intensity", "analysis", "of", "the", "bands", "from", "the", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with empty vector or HA-NS1 together with Flag-caspae-1 wild type (WT) and mutants (K37R, K44R or K134R). Lower panel shows the intensity analysis of the bands from the three independent experiments.(B) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with HA-K11-ubiquitin (Ub) together with Flag-caspase-1 (WT, K37R, K44R, K134R).(C) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 (WT or K134R) and HA-K11-Ub, together with empty vector or Myc-NS1. Lower panel shows the intensity analysis of the bands from the three independent experiments.(D) Co-immunoprecipitation and immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Flag-caspase-1 (WT or K134R) and HA-K11-Ub, together with empty vector or Myc-USP8. Lower panel shows the intensity analysis of the bands from the three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", ",", "IFIT2", "and", "IFIT1", "mRNA", "levels", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "caspase", "-", "1", "knockout", "(", "KO", ")", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", "mRNA", "levels", "in", "THP", "-", "1", "cells", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "LPS", "(", "500", "ng", "/", "ml", ",", "3", "hrs", ")", "and", "ATP", "(", "5", "mM", ",", "6", "hrs", ")", ",", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", "mRNA", "levels", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "NLRP3", "knockout", "(", "KO", ")", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "D", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", ",", "IFIT2", "and", "IFIT1", "mRNA", "levels", "in", "Flag", "-", "NS1", "-", "inducible", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "Dox", "then", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "YVAD", "(", "20", "μM", ")", "for", "3", "hrs", ",", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "E", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", "mRNA", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "NLRP3", "siRNA", "then", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "F", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", "mRNA", "in", "PBMCs", "treated", "with", "DMSO", "or", "Ac", "-", "YVAD", "-", "cmk", "(", "20μM", ")", "for", "3hrs", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "G", ")", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "in", "the", "supernatants", "of", "PBMCs", "treated", "with", "DMSO", "or", "Ac", "-", "YVAD", "-", "cmk", "(", "20μM", ")", "for", "3hrs", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "H", ")", "ELISA", "of", "IL", "-", "1β", "production", "in", "brain", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "1", "-", "day", "-", "old", "neonatal", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "intracerebrally", "injected", "with", "1", "×", "105", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "of", "ZIKV", "for", "5", "days", ".", "(", "I", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNB", "mRNA", "levels", "in", "brain", "tissues", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "neonatal", "mice", "with", "or", "without", "ZIKV", "infection", "(", "J", ")", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "production", "in", "brains", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "neonatal", "mice", "(", "K", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "levels", "in", "brain", "tissues", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "neonatal", "mice", "with", "or", "without", "ZIKV", "infection", "(", "L", ")", "Plaque", "titration", "of", "ZIKV", "in", "brain", "tissues", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "neonatal", "mice", "(", "M", ")", "Body", "weight", "gain", "of", "WT", "and", "Nlrp3", "-", "/", "-", "neonatal", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", "inoculated", "with", "ZIKV", "(", "1", "×", "105", "PFUs", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Relative qRT-PCR analysis of IFNB, IFIT2 and IFIT1 mRNA levels in wild type (WT) or caspase-1 knockout (KO) THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(B) Relative qRT-PCR analysis of IFNB mRNA levels in THP-1 cells left untreated or treated with LPS (500 ng/ml, 3 hrs) and ATP (5 mM, 6 hrs), followed by ZIKV infection (MOI=1) for the indicated time points.(C) Relative qRT-PCR analysis of IFNB mRNA levels in wild type (WT) or NLRP3 knockout (KO) THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(D) Relative qRT-PCR analysis of IFNB , IFIT2 and IFIT1 mRNA levels in Flag-NS1-inducible THP-1 cells treated with or without Dox then left untreated or treated with YVAD (20 μM) for 3 hrs, followed by ZIKV infection (MOI=1) for the indicated time points.(E) Relative qRT-PCR analysis of IFNB mRNA in PBMCs transfected with control siRNA or NLRP3 siRNA then infected with ZIKV (MOI=1) for 36 hrs.(F) Relative qRT-PCR analysis of IFNB mRNA in PBMCs treated with DMSO or Ac-YVAD-cmk (20μM) for 3hrs followed by ZIKV infection (MOI=1) for 36 hrs.(G) ELISA of IFN-β in the supernatants of PBMCs treated with DMSO or Ac-YVAD-cmk (20μM) for 3hrs followed by ZIKV infection (MOI=1) for 36 hrs.(H) ELISA of IL-1β production in brain of WT or Nlrp3-/- 1-day-old neonatal mice (n=3 per group) intracerebrally injected with 1×105 plaque-forming units (PFU) of ZIKV for 5 days.(I) Relative qRT-PCR analysis of IFNB mRNA levels in brain tissues of WT or Nlrp3-/- neonatal mice with or without ZIKV infection(J) ELISA of IFN-β production in brains of WT or Nlrp3-/- neonatal mice(K) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA levels in brain tissues of WT or Nlrp3-/- neonatal mice with or without ZIKV infection(L) Plaque titration of ZIKV in brain tissues of WT or Nlrp3-/- neonatal mice(M) Body weight gain of WT and Nlrp3-/- neonatal mice (n=4 per group) inoculated with ZIKV (1×105 PFUs)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "levels", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "cGAS", "knockout", "(", "KO", ")", "THP", "-", "1", "cells", "after", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IFNΒ", ",", "IFIT2", "and", "IFIT1", "mRNA", "levels", "in", "WT", "or", "cGAS", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "after", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "indicated", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "and", "IFNB", "mRNA", "levels", "in", "PBMCs", "transduced", "with", "Cas9", "and", "small", "guide", "RNA", "targeting", "GFP", ",", "cGAS", "or", "NLRP3", "and", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "36", "hrs", ".", "(", "D", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "and", "IFNΒ", "mRNA", "levels", "in", "WT", "or", "cGAS", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "YVAD", "(", "20", "μM", ")", ",", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "indicated", "times", "points", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "Flag", "-", "cGAS", "-", "overexpressed", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "or", "without", "YVAD", "(", "20", "μM", ")", "then", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "5", ")", "for", "24", "hrs", "or", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "hrs", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "WT", ",", "NLRP3", "KO", "(", "F", ")", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "WT", ",", "caspase", "-", "1", "KO", "(", "G", ")", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "WT", "or", "Nlrp3", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "with", "ZIKV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "I", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "PBMCs", "from", "Donor", "#", "1", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "NLRP3", "siRNA", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "J", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "extracts", "of", "293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "cGAS", "(", "tagged", "on", "C", "-", "terminal", ")", ",", "GFP", "-", "ASC", ",", "Flag", "-", "caspase", "-", "1", ",", "together", "with", "empty", "vector", "or", "HA", "-", "NS1", ".", "(", "K", ")", "Relative", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "ZIKV", "RNA", "and", "IFNB", "mRNA", "levels", "in", "WT", ",", "cGAS", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "as", "well", "as", "cGAS", "KO", "THP", "-", "1", "cells", "reconstituted", "with", "WT", "or", "D140A", "/", "D157A", "mutant", "of", "cGAS", ",", "followed", "by", "ZIKV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "24", "hrs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA levels in wild type (WT) or cGAS knockout (KO) THP-1 cells after ZIKV infection (MOI=1) for indicated time points.(B) Relative qRT-PCR analysis of IFNΒ, IFIT2 and IFIT1 mRNA levels in WT or cGAS KO THP-1 cells after ZIKV infection (MOI=1) for indicated time points.(C) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA and IFNB mRNA levels in PBMCs transduced with Cas9 and small guide RNA targeting GFP, cGAS or NLRP3 and infected with ZIKV (MOI=1) for 36 hrs.(D) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA and IFNΒ mRNA levels in WT or cGAS KO THP-1 cells treated with or without YVAD (20 μM), followed by ZIKV infection (MOI=1) for indicated times points.(E) Immunoblot analysis of extracts of Flag-cGAS-overexpressed THP-1 cells treated with or without YVAD (20 μM) then infected with ZIKV (MOI=5) for 24 hrs or infected with HSV-1 (MOI=1) for 24 hrs.Immunoblot analysis of WT, NLRP3 KO (F) THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.Immunoblot analysis of WT, caspase-1 KO (G) THP-1 cells infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(H) Immunoblot analysis of extracts of WT or Nlrp3-/- BMDMs infected with ZIKV (MOI=1) for the indicated time points.(I) Immunoblot analysis of PBMCs from Donor#1 transfected with control siRNA or NLRP3 siRNA followed by ZIKV infection (MOI=1) for the indicated time points.(J) Immunoblot analysis of extracts of 293T cells transfected with Myc-cGAS (tagged on C-terminal), GFP-ASC, Flag-caspase-1, together with empty vector or HA-NS1.(K) Relative qRT-PCR analysis of ZIKV RNA and IFNB mRNA levels in WT, cGAS KO THP-1 cells as well as cGAS KO THP-1 cells reconstituted with WT or D140A/D157A mutant of cGAS, followed by ZIKV infection (MOI=1) for 24 hrs."}
{"words": ["Figure", "1Western", "blot", "analysis", "showing", "increased", "RNF8", "protein", "level", "in", "HeLa", "cells", "after", "siRNA", "-", "mediated", "p97", "depletion", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "A", ")", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "showing", "increased", "RNF8", "protein", "level", "in", "HeLa", "cells", "after", "p97", "chemical", "inhibition", "(", "CB5083", ",", "10µM", "for", "6h", ")", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "C", ")", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "showing", "increased", "RNF8", "protein", "level", "in", "HEK293", "cells", "after", "doxycycline", "-", "induced", "mild", "expression", "of", "the", "p97EQ", "variant", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "E", ")", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "4", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "kinetics", "showing", "reduced", "RNF8", "degradation", "rate", "in", "HEK293", "cells", "after", "siRNA", "-", "mediated", "p97", "depletion", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "H", ")", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", "and", "Western", "blot", "for", "efficacy", "of", "siRNA", "depletion", "of", "p97", "(", "right", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "RNF8", "denaturing", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "K48", "-", "linked", "hyper", "-", "ubiquitination", "of", "RNF8", "after", "siRNA", "-", "mediated", "p97", "depletion", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Strep", "-", "p97", "Co", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "increased", "RNF8", "interaction", "with", "p97EQ", "variant", "as", "compared", "to", "p97WT", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "K", ")", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Western blot analysis showing increased RNF8 protein level in HeLa cells after siRNA-mediated p97 depletion under physiological conditions and after IR (10 Gy).   Graph represents the quantifications of (A) (***P<0.001; unpaired t-test, n=3, mean +SEM).   Western blot analysis showing increased RNF8 protein level in HeLa cells after p97 chemical inhibition (CB5083, 10µM for 6h) under physiological conditions and after IR (10 Gy).   Graph represents the quantifications of (C) (*P<0.05, ****P<0.0001; unpaired t-test, n=3, mean +SEM).   Western blot analysis showing increased RNF8 protein level in HEK293 cells after doxycycline-induced mild expression of the p97EQ variant under physiological conditions and after IR (10 Gy).   Graph represents the quantifications of (E) (**P<0.01, ****P<0.0001; unpaired t-test, n=4, mean +SEM).   Western blot analysis of CHX chase kinetics showing reduced RNF8 degradation rate in HEK293 cells after siRNA-mediated p97 depletion.   Graph represents the quantifications of (H) (***P<0.001, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean +SEM) and Western blot for efficacy of siRNA depletion of p97 (right).   Western blot analysis of Flag-RNF8 denaturing-IP in HEK293 cells showing K48-linked hyper-ubiquitination of RNF8 after siRNA-mediated p97 depletion.Western blot analysis of Strep-p97 Co-IP in HEK293 cells showing increased RNF8 interaction with p97EQ variant as compared to p97WT under physiological conditions and after IR (10 Gy).   Graph represents the quantifications of (K) (*P<0.05; unpaired t-test, n=2, mean +SEM).   "}
{"words": ["Figure", "2Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "RNF8", "denaturing", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "the", "ubiquitination", "pattern", "of", "RNF8", "-", "WT", "and", "RNF8", "-", "RING", "*", "variant", ",", "under", "siRNA", "-", "mediated", "luciferase", "(", "siLuc", ")", "or", "p97", "-", "depleted", "conditions", "(", "sip97", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "kinetics", "in", "HeLa", "cells", "showing", "the", "degradation", "kinetics", "of", "RNF8", "and", "inhibition", "of", "RNF8", "degradation", "by", "simultaneous", "proteasome", "inhibition", "(", "MG132", ",", "10µM", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "B", ")", "(", "ns", ";", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "RNF8", "denaturing", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "hyper", "-", "ubiquitination", "of", "RNF8", "after", "proteasome", "inhibition", "(", "MG132", ",", "10µM", "for", "6h", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "kinetics", "in", "U2OS", "cells", ",", "comparing", "the", "degradation", "rate", "of", "Flag", "-", "RNF8", "-", "WT", "and", "Flag", "-", "RNF8", "-", "RING", "*", ".", "Endogenous", "RNF8", "was", "depleted", "by", "shRNF8", "targeting", "only", "endogenous", "RNF8", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "E", ")", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blot analysis of Flag-RNF8 denaturing-IP in HEK293 cells showing the ubiquitination pattern of RNF8-WT and RNF8-RING* variant, under siRNA-mediated luciferase (siLuc) or p97-depleted conditions (sip97).Western blot analysis of CHX chase kinetics in HeLa cells showing the degradation kinetics of RNF8 and inhibition of RNF8 degradation by simultaneous proteasome inhibition (MG132, 10µM).   Graph represents the quantifications of (B) (ns; not significant, P>0.05, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM).   Western blot analysis of Flag-RNF8 denaturing-IP in HEK293 cells showing hyper-ubiquitination of RNF8 after proteasome inhibition (MG132, 10µM for 6h).Western blot analysis of CHX chase kinetics in U2OS cells, comparing the degradation rate of Flag-RNF8-WT and Flag-RNF8-RING*. Endogenous RNF8 was depleted by shRNF8 targeting only endogenous RNF8.   Graph represents the quantifications of (E) (ns P>0.05, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean +SEM).   "}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "of", "Strep", "-", "p97", "Co", "-", "IP", "in", "nuclear", "fraction", "of", "HEK293", "cells", "showing", "interaction", "of", "p97", "with", "ATX3", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "ATX3", "Co", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "interaction", "of", "ATX3", "with", "p97", ",", "RNF8", "and", "PSα6", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "ATX3", "WT", "or", "Flag", "-", "ATX3", "VBM", "*", "Co", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "interaction", "of", "ATX3", "with", "p97", ",", "RNF8", "and", "p97", "core", "co", "-", "factors", "Npl4", "-", "Ufd1", ".", "(", "*", "represents", "unspecific", "bands", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Strep", "-", "p97EQ", "Co", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", ",", "in", "presence", "or", "absence", "(", "CRISPR", "knockout", ";", "∆", "ATX3", ")", "of", "ATX3", ",", "showing", "increased", "interaction", "of", "RNF8", "with", "p97", "in", "absence", "of", "ATX3", ",", "under", "physiological", "conditions", "and", "after", "IR", "(", "10", "Gy", ")", ".", "Graph", "represents", "quantifications", "of", "(", "F", ")", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis of Strep-p97 Co-IP in nuclear fraction of HEK293 cells showing interaction of p97 with ATX3 under physiological conditions and after IR (10 Gy).Western blot analysis of Flag-ATX3 Co-IP in HEK293 cells showing interaction of ATX3 with p97, RNF8 and PSα6 under physiological conditions and after IR (10 Gy).Western blot analysis of Flag-ATX3 WT or Flag-ATX3 VBM* Co-IP in HEK293 cells showing interaction of ATX3 with p97, RNF8 and p97 core co-factors Npl4-Ufd1. (* represents unspecific bands).Western blot analysis of Strep-p97EQ Co-IP in HEK293 cells, in presence or absence (CRISPR knockout; ∆ATX3) of ATX3, showing increased interaction of RNF8 with p97 in absence of ATX3, under physiological conditions and after IR (10 Gy).   Graph represents quantifications of (F) (*P<0.05, **P<0.01; unpaired t-test, n=3, mean +SEM).   "}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "kinetics", "in", "HeLa", "cells", "showing", "accelerated", "endogenous", "RNF8", "degradation", "in", "the", "soluble", "fraction", "(", "Cytosol", "and", "Nucleosol", ")", "of", "∆", "ATX3", "cell", "extract", ".", "Arrow", "represents", "the", "main", "RNF8", "band", "and", "asterisks", "represents", "unspecific", "bands", ".", "Graphs", "represent", "the", "quantifications", "of", "(", "A", ")", ".", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", "was", "shown", "without", "equalisation", "(", "left", ")", ".", "In", "order", "to", "nullify", "the", "difference", "in", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", ",", "we", "equalised", "RNF8", "level", "to", "100", "%", "and", "then", "compared", "the", "degradation", "rate", "(", "right", ")", ".", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "showing", "the", "kinetics", "of", "endogenous", "RNF8", "degradation", "in", "the", "soluble", "fraction", "(", "Cytosol", "and", "Nucleosol", ")", "of", "ATX3", "knockdown", "HeLa", "cells", ".", "The", "degradation", "was", "completely", "blocked", "after", "simultaneous", "inhibition", "of", "proteasome", "(", "MG132", ",", "10µM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "RNF8", "denaturing", "-", "IP", "in", "HEK293", "cells", "showing", "RNF8", "hyper", "-", "ubiquitination", "in", "siRNA", "-", "mediated", "p97", "or", "ATX3", "-", "depleted", "conditions", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "RNF8", "denaturing", "-", "IP", "in", "HeLa", "cells", "showing", "RNF8", "hyper", "-", "ubiquitination", "in", "∆", "ATX3", "condition", ".", "RNF8", "hyper", "-", "ubiquitination", "was", "suppressed", "by", "reintroduction", "of", "GFP", "-", "ATX3", "-", "WT", "but", "not", "with", "GFP", "-", "ATX3", "-", "C14A", "or", "GFP", "-", "ATX3", "-", "UIM", "*", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis of CHX chase kinetics in HeLa cells showing accelerated endogenous RNF8 degradation in the soluble fraction (Cytosol and Nucleosol) of ∆ATX3 cell extract. Arrow represents the main RNF8 band and asterisks represents unspecific bands.   Graphs represent the quantifications of (A). RNF8 level at starting point (0h) was shown without equalisation (left). In order to nullify the difference in RNF8 level at starting point (0h), we equalised RNF8 level to 100% and then compared the degradation rate (right). (**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM).   Western blot analysis of CHX chase showing the kinetics of endogenous RNF8 degradation in the soluble fraction (Cytosol and Nucleosol) of ATX3 knockdown HeLa cells. The degradation was completely blocked after simultaneous inhibition of proteasome (MG132, 10µM).Western blot analysis of Flag-RNF8 denaturing-IP in HEK293 cells showing RNF8 hyper-ubiquitination in siRNA-mediated p97 or ATX3-depleted conditions.Western blot analysis of Flag-RNF8 denaturing-IP in HeLa cells showing RNF8 hyper-ubiquitination in ∆ATX3 condition. RNF8 hyper-ubiquitination was suppressed by reintroduction of GFP-ATX3-WT but not with GFP-ATX3-C14A or GFP-ATX3-UIM*."}
{"words": ["Figure", "5Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "showing", "accelerated", "degradation", "of", "RNF8", "in", "soluble", "fraction", "(", "cytoplasm", "+", "nucleoplasm", ")", "of", "HeLa", "cells", ",", "expressing", "DOX", "-", "inducible", "GFP", "-", "ATX3", "-", "C14A", "variant", "as", "compared", "to", "GFP", "-", "ATX3", "-", "WT", ".", "Endogenous", "ATX3", "was", "depleted", "with", "siRNA", "targeting", "3", "'", "UTR", "region", "of", "ATXN3", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "A", ")", ".", "In", "order", "to", "nullify", "the", "difference", "in", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", ",", "we", "equalised", "RNF8", "level", "to", "100", "%", "and", "then", "compared", "the", "degradation", "rate", ".", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", "was", "also", "shown", "without", "equalisation", ".", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CHX", "chase", "showing", "accelerated", "degradation", "of", "RNF8", "in", "soluble", "fraction", "(", "cytoplasm", "+", "nucleoplasm", ")", "of", "HeLa", "cells", ",", "expressing", "DOX", "-", "inducible", "ATX3", "-", "UIM", "*", "variant", "as", "compared", "to", "ATX3", "-", "WT", ".", "Endogenous", "ATX3", "was", "depleted", "with", "siRNA", "ATX3", "_", "3", "'", "UTR", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "of", "(", "C", ")", ".", "In", "order", "to", "nullify", "the", "difference", "in", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", ",", "we", "equalised", "RNF8", "level", "to", "100", "%", "and", "then", "compared", "the", "degradation", "rate", ".", "RNF8", "level", "at", "starting", "point", "(", "0h", ")", "was", "also", "shown", "without", "equalisation", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "showing", "endogenous", "RNF8", "protein", "level", "in", "soluble", "fraction", "(", "Cytosol", "and", "Nucleosol", ")", "of", "HeLa", "cells", "under", "indicated", "conditions", ".", "RNF8", "level", "was", "significantly", "reduced", "after", "siRNA", "mediated", "ATX3", "depletion", "and", "then", "was", "significantly", "rescued", "by", "DOX", "-", "inducible", "expression", "of", "GFP", "-", "ATX3", "-", "WT", "but", "not", "with", "GFP", "-", "ATX3", "-", "VBM", ".", "Graphs", "represent", "the", "quantifications", "of", "(", "E", ")", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Representative", "IF", "images", "showing", "γH2AX", "-", "positive", "micronuclei", "(", "white", "arrows", ")", "under", "physiological", "conditions", "with", "indicated", "siRNA", "mediated", "depletion", ".", "(", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ")", "Graph", "represents", "quantification", "of", "(", "G", ")", ",", "showing", "percentage", "of", "cells", "with", "γH2AX", "-", "positive", "micronuclei", "in", "U2OS", "cells", ".", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "200", "randomly", "selected", "nuclei", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Western blot analysis of CHX chase showing accelerated degradation of RNF8 in soluble fraction (cytoplasm+nucleoplasm) of HeLa cells, expressing DOX-inducible GFP-ATX3-C14A variant as compared to GFP-ATX3-WT. Endogenous ATX3 was depleted with siRNA targeting 3'UTR region of ATXN3.   Graph represents the quantifications of (A). In order to nullify the difference in RNF8 level at starting point (0h), we equalised RNF8 level to 100% and then compared the degradation rate. RNF8 level at starting point (0h) was also shown without equalisation. (*P<0.05, **P<0.01; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM).   Western blot analysis of CHX chase showing accelerated degradation of RNF8 in soluble fraction (cytoplasm + nucleoplasm) of HeLa cells, expressing DOX-inducible ATX3-UIM* variant as compared to ATX3-WT. Endogenous ATX3 was depleted with siRNA ATX3_3'UTR.   Graph represents the quantifications of (C). In order to nullify the difference in RNF8 level at starting point (0h), we equalised RNF8 level to 100% and then compared the degradation rate. RNF8 level at starting point (0h) was also shown without equalisation. (ns P>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM).   Western blot analysis showing endogenous RNF8 protein level in soluble fraction (Cytosol and Nucleosol) of HeLa cells under indicated conditions. RNF8 level was significantly reduced after siRNA mediated ATX3 depletion and then was significantly rescued by DOX-inducible expression of GFP-ATX3-WT but not with GFP-ATX3-VBM.   Graphs represent the quantifications of (E). (ns P>0.05, * P<0.05, **P<0.01; unpaired t-test, n=3, mean +SEM).   Representative IF images showing γH2AX-positive micronuclei (white arrows) under physiological conditions with indicated siRNA mediated depletion. (Scale bar represents 10 µm)   Graph represents quantification of (G), showing percentage of cells with γH2AX-positive micronuclei in U2OS cells. (* P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; unpaired t-test, n=3, mean +SEM, at least 200 randomly selected nuclei were counted per condition per experiment).   "}
{"words": ["Figure", "6Quantifications", "of", "neutral", "comet", "assay", "showing", "the", "level", "of", "DSBs", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", ",", "before", "and", "after", "IR", "(", "4", "Gy", ")", ".", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "Colony", "forming", "assay", "(", "CFA", ")", "showing", "the", "IR", "sensitivity", "of", "HeLa", "cells", "under", "siRNA", "-", "mediated", "p97", "or", "ATX3", "-", "depleted", "conditions", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "IR", "sensitivity", "of", "HeLa", "-", "WT", "cells", "compared", "to", "HeLa", "∆", "ATX3", "cells", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "rescue", "of", "cell", "survival", "in", "IR", "treated", ",", "ATX3", "-", "depleted", "(", "siRNA", ")", ",", "HeLa", "cells", ",", "after", "DOX", "-", "inducible", "expression", "of", "ATX3", "-", "WT", "but", "not", "with", "ATX3", "-", "C14A", "or", "ATX3", "-", "UIM", "*", "variant", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "rescue", "of", "cell", "survival", "in", "IR", "treated", ",", "ATX3", "-", "depleted", "(", "siRNA", ")", ",", "HeLa", "cells", ",", "after", "DOX", "-", "inducible", "expression", "of", "ATX3", "-", "WT", "but", "not", "with", "ATX3", "-", "VBM", "variant", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ")", ".", "Representative", "IF", "micrographs", "in", "U2OS", "cells", "showing", "IRIF", "formation", "of", "GFP", "-", "RNF8", "-", "WT", ",", "53BP1", "and", "γH2AX", "(", "first", "panel", ")", "and", "GFP", "-", "RNF8", "-", "∆", "RING", ",", "53BP1", "and", "γH2AX", "(", "second", "panel", ")", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "or", "p97", "-", "inhibited", "(", "CB5083", ")", "conditions", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Quantification", "of", "(", "F", ")", "for", "GFP", "-", "RNF8", "-", "WT", ".", "Graph", "represents", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "increased", "GFP", "-", "RNF8", "-", "WT", "foci", "(", "white", "bars", ")", "or", "percentage", "of", "cells", "with", ">", "5", "53BP1", "foci", "(", "grey", "bars", ")", ".", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "100", "nuclei", "per", "condition", "and", "experiment", ")", ".", "Quantification", "of", "(", "F", ")", "for", "GFP", "-", "RNF8", "-", "∆", "RING", ".", "Graph", "represents", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "increased", "GFP", "-", "RNF8", "-", "∆", "RING", "foci", "(", "white", "bars", ")", "or", "percentage", "of", "cells", "with", ">", "5", "53BP1", "foci", "(", "grey", "bars", ")", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "100", "nuclei", "per", "condition", "and", "experiment", ")", ".", "Representative", "IF", "images", "and", "quantification", "showing", "endogenous", "K63", "-", "Ub", "and", "γ", "-", "H2AX", "at", "UV", "-", "A", "micro", "-", "laser", "-", "induced", "DNA", "damage", "tracks", "in", "U2OS", "cells", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Quantification", "of", "(", "I", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "average", "intensity", "of", "the", "K63", "-", "Ub", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "more", "than", "50", "nuclei", "were", "analysed", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Quantifications of neutral comet assay showing the level of DSBs under indicated siRNA-depleted conditions, before and after IR (4 Gy). (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean +SEM).Colony forming assay (CFA) showing the IR sensitivity of HeLa cells under siRNA-mediated p97 or ATX3-depleted conditions. (n=3, mean ±SD).   CFA showing the IR sensitivity of HeLa-WT cells compared to HeLa∆ATX3 cells. (n=3, mean ±SD).   CFA showing the rescue of cell survival in IR treated, ATX3-depleted (siRNA), HeLa cells, after DOX-inducible expression of ATX3-WT but not with ATX3-C14A or ATX3-UIM* variant. (ns P>0.05, **P<0.01, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean ±SD).   CFA showing the rescue of cell survival in IR treated, ATX3-depleted (siRNA), HeLa cells, after DOX-inducible expression of ATX3-WT but not with ATX3-VBM variant. (ns P>0.05, *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean ±SD).   Representative IF micrographs in U2OS cells showing IRIF formation of GFP-RNF8-WT, 53BP1 and γH2AX (first panel) and GFP-RNF8-∆RING, 53BP1 and γH2AX (second panel) under indicated siRNA-depleted or p97-inhibited (CB5083) conditions. (Scale bar; 10µm).   Quantification of (F) for GFP-RNF8-WT. Graph represents the percentage of cells with increased GFP-RNF8-WT foci (white bars) or percentage of cells with >5 53BP1 foci (grey bars). (***P<0.001, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM, at least 100 nuclei per condition and experiment).   Quantification of (F) for GFP-RNF8-∆RING. Graph represents the percentage of cells with increased GFP-RNF8-∆RING foci (white bars) or percentage of cells with >5 53BP1 foci (grey bars). (ns P>0.05, *P<0.01, **P<0.01, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=2, mean +SEM, at least 100 nuclei per condition and experiment).   Representative IF images and quantification showing endogenous K63-Ub and γ-H2AX at UV-A micro-laser-induced DNA damage tracks in U2OS cells under indicated siRNA-depleted conditions. (Scale bar; 10µm).   Quantification of (I). Graph represents the average intensity of the K63-Ub (ns P>0.05, **P<0.01, ***P<0.001; unpaired t-test, n=2, mean +SEM, more than 50 nuclei were analysed).   "}
{"words": ["Figure", "7Representative", "IF", "images", "showing", "the", "average", "intensity", "of", "endogenous", "RNF168", "at", "UV", "-", "A", "micro", "-", "laser", "-", "induced", "DNA", "damage", "tracks", "in", "U2OS", "cells", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "more", "than", "50", "nuclei", "were", "analysed", ")", ".", "Representative", "IF", "images", "showing", "the", "average", "intensity", "of", "endogenous", "53BP1", "at", "UV", "-", "A", "micro", "-", "laser", "-", "induced", "DNA", "damage", "tracks", "in", "U2OS", "cells", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantification", "of", "(", "C", ")", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "80", "nuclei", "per", "condition", "and", "experiment", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "histone", "H1", "denaturing", "-", "IP", ",", "showing", "ubiquitination", "pattern", "of", "histone", "H1", "after", "30", "min", "of", "IR", "(", "10", "Gy", ")", "treatment", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", ".", "Representative", "IF", "images", "showing", "the", "average", "intensity", "of", "endogenous", "BRCA1", "at", "UV", "-", "A", "micro", "-", "laser", "-", "induced", "DNA", "damage", "tracks", "in", "U2OS", "cells", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantification", "of", "(", "F", ")", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "100", "nuclei", "per", "condition", "and", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative IF images showing the average intensity of endogenous RNF168 at UV-A micro-laser-induced DNA damage tracks in U2OS cells. (Scale bar; 10µm).   Graph represents the quantification of (A). (***P<0.001; unpaired t-test, n=3, mean +SEM, more than 50 nuclei were analysed).   Representative IF images showing the average intensity of endogenous 53BP1 at UV-A micro-laser-induced DNA damage tracks in U2OS cells. (Scale bar; 10µm).   Graph represents the quantification of (C). (ns P>0.05, ***P<0.001; unpaired t-test, n=2, mean +SEM, at least 80 nuclei per condition and experiment).   Western blot analysis of Flag-histone H1 denaturing-IP, showing ubiquitination pattern of histone H1 after 30 min of IR (10 Gy) treatment under indicated siRNA-depleted conditions.Representative IF images showing the average intensity of endogenous BRCA1 at UV-A micro-laser-induced DNA damage tracks in U2OS cells. (Scale bar; 10µm).   Graph represents the quantification of (F). (ns P>0.05, ***P<0.001; unpaired t-test, n=2, mean +SEM, at least 100 nuclei per condition and experiment).   "}
{"words": ["Figure", "8GFP", "based", "reporter", "assay", "showing", "the", "efficiency", "of", "NHEJ", "repair", "pathway", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", "in", "HEK293", "cells", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "GFP", "based", "reporter", "assay", "showing", "the", "efficiency", "of", "HR", "repair", "pathway", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", "in", "HEK293", "cells", ".", "Graph", "represents", "the", "quantifications", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "+", "SEM", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "IR", "sensitivity", "of", "53BP1", "-", "proficient", "and", "deficient", "MCF7", "cells", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", ".", "Data", "was", "collected", "from", "two", "individual", "experiments", "with", "triplicates", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "IR", "sensitivity", "of", "BRCA2", "-", "proficient", "and", "deficient", "DLD1", "cells", "under", "indicated", "siRNA", "-", "depleted", "conditions", ".", "Data", "was", "collected", "from", "two", "individual", "experiments", "with", "triplicates", ".", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Representative", "IF", "-", "images", "showing", "Rad51", "foci", "in", "S", "-", "phase", "(", "Edu", "positive", ")", "U2OS", "nucleus", "after", "5h", "of", "IR", "(", "2Gy", ")", "exposure", ".", "(", "Scale", "bar", ";", "10µm", ")", ".", "Graph", "represents", "the", "quantification", "of", "(", "E", ")", "showing", "average", "number", "of", "Rad51", "foci", "per", "S", "-", "phase", "(", "Edu", "positive", ")", "nucleus", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "2", ",", "mean", "+", "SEM", ",", "at", "least", "50", "nuclei", "per", "condition", "and", "experiment", ")", ".", "CFA", "showing", "the", "rescue", "of", "cell", "survival", "in", "IR", "treated", ",", "ATX3", "-", "depleted", "(", "siRNA", ")", ",", "HeLa", "cells", ",", "after", "co", "-", "depletion", "(", "siRNA", ")", "of", "RNF8", ".", "(", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8GFP based reporter assay showing the efficiency of NHEJ repair pathway under indicated siRNA-depleted conditions in HEK293 cells. Graph represents the quantifications from three independent experiments (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; one-way ANOVA, n=3, mean +SEM).GFP based reporter assay showing the efficiency of HR repair pathway under indicated siRNA-depleted conditions in HEK293 cells. Graph represents the quantifications from three independent experiments (ns P>0.05, **P<0.01; one-way ANOVA, n=3, mean +SEM).CFA showing the IR sensitivity of 53BP1-proficient and deficient MCF7 cells under indicated siRNA-depleted conditions. Data was collected from two individual experiments with triplicates. (ns P>0.05; two-way ANOVA, n=2, mean ±SEM).CFA showing the IR sensitivity of BRCA2-proficient and deficient DLD1 cells under indicated siRNA-depleted conditions. Data was collected from two individual experiments with triplicates. (**P<0.01, ***P<0.001; two-way ANOVA, n=2, mean ±SEM).Representative IF-images showing Rad51 foci in S-phase (Edu positive) U2OS nucleus after 5h of IR (2Gy) exposure. (Scale bar; 10µm).   Graph represents the quantification of (E) showing average number of Rad51 foci per S-phase (Edu positive) nucleus. (ns P>0.05, ****P<0.0001; unpaired t-test, n=2, mean +SEM, at least 50 nuclei per condition and experiment).   CFA showing the rescue of cell survival in IR treated, ATX3-depleted (siRNA), HeLa cells, after co-depletion (siRNA) of RNF8. (ns P>0.05, *P<0.05, ****P<0.0001; two-way ANOVA, n=3, mean ±SEM)."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "Immunoblot", "of", "9", "-", "mo", "-", "old", "quadricepsmuscle", "lysates", "from", "control", "(", "cont", ")", "or", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "RH9", ",", "or", "-", "RH12", "mutant", "transgenic", "lines", "with", "p62", "(", "A", ")", "or", "LC3", "(", "B", ")", "antibodies", ".", "Note", "the", "increase", "in", "p62", "and", "LC3II", "isoforms", "in", "mutant", "animals", ".", "Densitometric", "quantification", "is", "from", "more", "than", "six", "9", "-", "mo", "-", "old", "animals", "/", "group", ".", "LC3", "and", "p62", "levels", "are", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "(", "C", ")", "p62", "immunostaining", "of", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "or", "quadriceps", "(", "Quad", ")", "muscle", "from", "9", "-", "mo", "-", "old", "control", ",", "VCP", "-", "WT", ",", "or", "one", "of", "two", "VCP", "-", "RH", "transgenic", "lines", "(", "RH9", "or", "RH12", ")", ".", "Note", "accumulations", "of", "p62", "in", "the", "middle", "of", "myofibers", "or", "along", "subsarcolemmal", "regions", ".", "(", "D", ")", "Histochemistry", "and", "immunohistochemistry", "of", "quadriceps", "muscle", "from", "VCP", "-", "RH", "-", "expressing", "transgenic", "mice", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "staining", "of", "a", "15", "-", "mo", "-", "old", "animal", "with", "an", "RV", ",", "p62", "immunostaining", "of", "an", "RV", "from", "a", "12", "-", "mo", "-", "old", "animal", ",", "LC3", "immunostaining", "of", "an", "RV", ",", "and", "subsarcolemmal", "accumulations", "of", "LC3", "from", "a", "12", "-", "mo", "-", "old", "animal", ".", "The", "bracket", "highlights", "one", "LC3", "-", "positive", "myofiber", ".", "A", "single", "muscle", "fiber", "is", "outlined", "in", "white", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Arrows", "denote", "vacuoles", "or", "accumulations", "of", "p62", "or", "LC3", ".", "Bars", ",", "30", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.(A and B) Immunoblot of 9-mo-old quadricepsmuscle lysates from control (cont) or VCP-WT, -RH9, or -RH12 mutant transgenic lines with p62 (A) or LC3 (B) antibodies. Note the increase in p62 and LC3II isoforms in mutant animals. Densitometric quantification is from more than six 9-mo-old animals/group. LC3 and p62 levels are normalized to loading control. Error bars represent the standard error from six independent experiments. **, P < 0.001. AU, arbitrary unit.(C) p62 immunostaining of tibialis anterior (TA) or quadriceps (Quad) muscle from 9-mo-old control, VCP-WT, or one of two VCP-RH transgenic lines (RH9 or RH12). Note accumulations of p62 in the middle of myofibers or along subsarcolemmal regions.(D) Histochemistry and immunohistochemistry of quadriceps muscle from VCP-RH-expressing transgenic mice. Hematoxylin and eosin (H&amp;amp;E) staining of a 15-mo-old animal with an RV, p62 immunostaining of an RV from a 12-mo-old animal, LC3 immunostaining of an RV, and subsarcolemmal accumulations of LC3 from a 12-mo-old animal. The bracket highlights one LC3-positive myofiber. A single muscle fiber is outlined in white. (C and D) Arrows denote vacuoles or accumulations of p62 or LC3. Bars, 30 µm."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "(", "A", ")", "Lysates", "from", "scrambled", "siRNA", "or", "VCP", "-", "targeted", "siRNA", "-", "treated", "U20S", "cells", "immunoblotted", "with", "antibodies", "to", "VCP", ",", "LC3", ",", "p62", ",", "or", "α", "-", "tubulin", ".", "Densitometric", "analysis", "is", "graphically", "represented", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "LC3", "and", "p62", "levels", "are", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "Fluorescent", "microscopy", "images", "of", "siRNA", "scrambled", "control", "(", "Scr", ")", "or", "VCP", "-", "targeted", "siRNA", "KD", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", ".", "Basal", "numbers", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "/", "cell", "were", "counted", ".", "(", "C", ")", "Lysates", "from", "control", "or", "myc", "-", "tagged", "VCP", "-", "WT", ",", "ATPase", "-", "inactive", "VCP", "-", "EQ", ",", "or", "one", "of", "two", "IBMPFD", "mutants", ",", "VCP", "-", "RH", "or", "-", "AE", ",", "expressed", "for", "16", "h", "from", "stably", "transfected", "tetracycline", "-", "inducible", "U20S", "cells", "and", "immunoblotted", "with", "antibodies", "to", "myc", ",", "LC3", ",", "p62", ",", "or", "α", "-", "tubulin", ".", "Densitometric", "analysis", "is", "graphically", "represented", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "LC3", "and", "p62", "levels", "are", "normalized", "to", "loading", "control", ".", "Note", "the", "increase", "in", "LC3II", "and", "p62", "in", "VCP", "siRNA", "KD", "and", "mutant", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "D", ")", "Fluorescent", "microscopy", "images", "of", "tetracycline", "-", "inducible", "U20S", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "treated", "with", "and", "without", "Baf", "for", "4", "h", "(", "DMSO", "control", "[", "left", "]", "or", "Baf", "+", "[", "right", "]", ")", ".", "Cells", "are", "control", "U20S", "cells", "and", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "RH", ",", "-", "AE", ",", "and", "-", "EQ", ".", "(", "E", ")", "The", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "/", "cell", "was", "counted", "for", "control", "U20S", "and", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "EQ", ",", "-", "RH", ",", "and", "-", "AE", "with", "and", "without", "Baf", "for", "4", "h", "(", "DMSO", "or", "Baf", ")", ".", "Note", "the", "increase", "in", "basal", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "in", "mutant", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "A", "-", "C", "and", "E", ")", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", ",", "25", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.(A) Lysates from scrambled siRNA or VCP-targeted siRNA-treated U20S cells immunoblotted with antibodies to VCP, LC3, p62, or α-tubulin. Densitometric analysis is graphically represented from four independent experiments. LC3 and p62 levels are normalized to loading control.(B) Fluorescent microscopy images of siRNA scrambled control (Scr) or VCP-targeted siRNA KD cells expressing GFP-LC3. Basal numbers of GFP-LC3 puncta/cell were counted.(C) Lysates from control or myc-tagged VCP-WT, ATPase-inactive VCP-EQ, or one of two IBMPFD mutants, VCP-RH or -AE, expressed for 16 h from stably transfected tetracycline-inducible U20S cells and immunoblotted with antibodies to myc, LC3, p62, or α-tubulin. Densitometric analysis is graphically represented from four independent experiments. LC3 and p62 levels are normalized to loading control. Note the increase in LC3II and p62 in VCP siRNA KD and mutant-expressing cells.(D) Fluorescent microscopy images of tetracycline-inducible U20S cells expressing GFP-LC3 treated with and without Baf for 4 h (DMSO control [left] or Baf+ [right]). Cells are control U20S cells and VCP-WT, -RH, -AE, and -EQ. (E) The number of GFP-LC3 puncta/cell was counted for control U20S and VCP-WT, -EQ, -RH, and -AE with and without Baf for 4 h (DMSO or Baf). Note the increase in basal GFP-LC3 puncta in mutant-expressing cells. (A-C and E) Error bars represent the standard error from four independent experiments. *, P < 0.01; and **, P < 0.001. Bars, 25 µm."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "(", "A", ")", "Epifluorescent", "images", "for", "GFP", "and", "mRFP", "in", "U20S", "or", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "VCP", "-", "AE", "-", ",", "or", "VCP", "-", "EQ", "-", "expressing", "cells", "transfected", "with", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", "(", "tfLC3", ")", "and", "treated", "with", "rapamycin", "for", "2", "h", "to", "induce", "autolysosome", "formation", ".", "(", "B", ")", "siRNA", "control", "(", "Scr", ")", "or", "VCP", "-", "KD", "-", "or", "Baf", "-", "treated", "control", "U20S", "cells", "transfected", "with", "tfLC3", "and", "treated", "with", "rapamycin", "for", "2", "h", "to", "induce", "autolysosome", "formation", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "Open", "arrows", "denote", "autophagosomes", "(", "both", "GFP", "and", "mRFP", "fluorescence", ")", ",", "whereas", "closed", "arrows", "highlight", "autolysosomes", "(", "mRFP", "only", "fluorescence", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "graph", "represents", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "GFP", "and", "mRFP", "colocalization", "from", "10", "independent", "fields", "of", "cells", "in", "two", "different", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "from", "20", "fields", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "Lysates", "from", "U20S", "or", "tetracycline", "-", "inducible", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "RH", ",", "or", "-", "AE", "cells", "treated", "with", "vehicle", "or", "Baf", "for", "4", "h", "and", "immunoblotted", "for", "LC3", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "Note", "that", "Baf", "treatment", "does", "not", "increase", "the", "LC3II", "levels", "in", "IBMPFD", "mutant", "(", "RH", "and", "AE", ")", "-", "expressing", "cells", ".", "Bars", ",", "15", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.(A) Epifluorescent images for GFP and mRFP in U20S or VCP-WT-, VCP-RH-, VCP-AE-, or VCP-EQ-expressing cells transfected with mRFP-GFP-LC3 (tfLC3) and treated with rapamycin for 2 h to induce autolysosome formation. (B) siRNA control (Scr) or VCP-KD- or Baf-treated control U20S cells transfected with tfLC3 and treated with rapamycin for 2 h to induce autolysosome formation. (A and B) Open arrows denote autophagosomes (both GFP and mRFP fluorescence), whereas closed arrows highlight autolysosomes (mRFP only fluorescence). (C) The graph represents Pearson's coefficient of GFP and mRFP colocalization from 10 independent fields of cells in two different experiments. Error bars represent the standard error from 20 fields in two independent experiments. *, P < 0.001.(D) Lysates from U20S or tetracycline-inducible VCP-WT, -RH, or -AE cells treated with vehicle or Baf for 4 h and immunoblotted for LC3 and α-tubulin. Note that Baf treatment does not increase the LC3II levels in IBMPFD mutant (RH and AE)-expressing cells. Bars, 15 µm."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "(", "A", ")", "Lysates", "from", "siRNA", "-", "treated", "U20S", "cells", "(", "scramble", "control", "[", "Scr", "]", "or", "VCP", "siRNA", "KD", ")", "after", "autophagic", "induction", "via", "nutrient", "deprivation", "for", "0", ",", "2", ",", "or", "4", "h", "and", "immunoblotting", "for", "LC3", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "LC3II", "degrades", "over", "time", "in", "control", "but", "not", "in", "KD", "cells", ".", "One", "of", "two", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "Lysates", "from", "U20S", "or", "tetracycline", "-", "inducible", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "EQ", ",", "-", "RH", ",", "or", "-", "AE", "cells", "after", "autophagic", "induction", "via", "nutrient", "deprivation", "for", "0", ",", "2", ",", "4", ",", "or", "6", "h", "and", "immunoblotting", "for", "LC3", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "LC3II", "degrades", "in", "control", "and", "VCP", "-", "WT", "but", "degrades", "less", "efficiently", "in", "mutant", "(", "EQ", ",", "RH", ",", "or", "AE", ")", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "C", ")", "Graphical", "representation", "of", "densitometric", "evaluation", "of", "LC3II", "and", "α", "-", "tubulin", "at", "each", "time", "point", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.(A) Lysates from siRNA-treated U20S cells (scramble control [Scr] or VCP siRNA KD) after autophagic induction via nutrient deprivation for 0, 2, or 4 h and immunoblotting for LC3 and α-tubulin. LC3II degrades over time in control but not in KD cells. One of two experiments is shown.(B) Lysates from U20S or tetracycline-inducible VCP-WT, -EQ, -RH, or -AE cells after autophagic induction via nutrient deprivation for 0, 2, 4, or 6 h and immunoblotting for LC3 and α-tubulin. LC3II degrades in control and VCP-WT but degrades less efficiently in mutant (EQ, RH, or AE)-expressing cells. (C) Graphical representation of densitometric evaluation of LC3II and α-tubulin at each time point from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "(", "A", ")", "Epifluorescent", "images", "for", "GFP", "-", "LC3", "(", "LC3", ")", "and", "LTR", "of", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "VCP", "-", "AE", "-", ",", "or", "VCP", "-", "EQ", "-", "expressing", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "treated", "with", "rapamycin", "for", "2", "h", "to", "induce", "autolysosome", "formation", ".", "Open", "arrows", "highlight", "autolysosomes", "(", "GFP", "and", "LTR", "colocalized", ")", ",", "and", "closed", "arrows", "show", "autophagosomes", "(", "GFP", "only", ")", ".", "(", "B", ")", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "GFP", "and", "LTR", "colocalization", "from", "10", "independent", "fields", "of", "cells", "in", "two", "different", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Epifluorescent", "images", "for", "GFP", "-", "LC3", "and", "endogenous", "Lamp1", "immunohistochemistry", "of", "U20S", ",", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "VCP", "-", "AE", "-", ",", "or", "VCP", "-", "EQ", "-", "expressing", "cells", "or", "U20S", "cells", "cotreated", "with", "Baf", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "treated", "with", "rapamycin", "for", "2", "h", "to", "induce", "autolysosome", "formation", ".", "Arrows", "highlight", "autolysosomes", "(", "GFP", "and", "Lamp1", "colocalized", ")", ".", "(", "A", "and", "C", ")", "The", "boxed", "regions", "in", "the", "merge", "field", "are", "enlarged", "in", "the", "adjacent", "panels", ".", "(", "D", ")", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "GFP", "and", "Lamp1", "colocalization", "from", "10", "independent", "fields", "of", "cells", "in", "two", "different", "experiments", ".", "(", "B", "and", "D", ")", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "from", "20", "fields", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Electron", "microscopy", "of", "tetracycline", "-", "inducible", "control", "or", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "or", "VCP", "-", "AE", "-", "expressing", "U20S", "cells", "induced", "for", "16", "h", "and", "then", "treated", "with", "rapamycin", "for", "2", "h", ".", "Note", "the", "accumulation", "of", "autophagic", "structures", "in", "the", "mutant", "-", "expressing", "cell", "lines", ".", "Arrows", "denote", "autophagic", "structures", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.(A) Epifluorescent images for GFP-LC3 (LC3) and LTR of VCP-WT-, VCP-RH-, VCP-AE-, or VCP-EQ-expressing cells transfected with GFP-LC3 and treated with rapamycin for 2 h to induce autolysosome formation. Open arrows highlight autolysosomes (GFP and LTR colocalized), and closed arrows show autophagosomes (GFP only). (B) Pearson's coefficient of GFP and LTR colocalization from 10 independent fields of cells in two different experiments.(C) Epifluorescent images for GFP-LC3 and endogenous Lamp1 immunohistochemistry of U20S, VCP-WT-, VCP-RH-, VCP-AE-, or VCP-EQ-expressing cells or U20S cells cotreated with Baf transfected with GFP-LC3 and treated with rapamycin for 2 h to induce autolysosome formation. Arrows highlight autolysosomes (GFP and Lamp1 colocalized). (A and C) The boxed regions in the merge field are enlarged in the adjacent panels. (D) Pearson's coefficient of GFP and Lamp1 colocalization from 10 independent fields of cells in two different experiments. (B and D) Error bars represent the standard error from 20 fields in two independent experiments. *, P < 0.001.(E) Electron microscopy of tetracycline-inducible control or VCP-WT-, VCP-RH-, or VCP-AE-expressing U20S cells induced for 16 h and then treated with rapamycin for 2 h. Note the accumulation of autophagic structures in the mutant-expressing cell lines. Arrows denote autophagic structures."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "images", "of", "quadriceps", "muscle", "using", "p62", "and", "Lamp1", "or", "-", "2", "antibodies", ".", "Quadriceps", "section", "from", "a", "9", "-", "mo", "-", "oldVCP", "-", "WT", "mouse", ",", "age", "-", "matched", "VCP", "-", "RH", "transgenic", ",", "12", "-", "mo", "-", "oldVCP", "-", "RH", "transgenic", ",", "and", "IBMPFD", "patientmuscle", "biopsy", "are", "shown", ".", "Open", "arrows", "highlight", "p62", "and", "Lamp1", "/", "2", "colocalization", ",", "and", "closed", "arrows", "show", "regions", "of", "only", "p62immunofluorescence", ".", "Single", "myofibers", "containing", "RVs", "are", "outlined", "in", "the", "merge", "panels", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "of", "tibialis", "anterior", "muscle", "from", "one", "of", "two", "independent", "lines", "(", "B", "shows", "RH12", ",", "and", "C", "shows", "RH9", "lines", ")", "of", "12", "-", "mo", "-", "old", "VCP", "-", "RH", "-", "expressing", "transgenic", "mice", ".", "Note", "the", "large", "vacuolated", "structures", "that", "are", "perinuclear", "or", "subsarcolemmal", ".", "Bars", ":", "(", "A", ")", "30", "µm", ";", "(", "B", "and", "C", ")", "500", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.(A) Immunofluorescence images of quadriceps muscle using p62 and Lamp1 or -2 antibodies. Quadriceps section from a 9-mo-oldVCP-WT mouse, age-matched VCP-RH transgenic, 12-mo-oldVCP-RH transgenic, and IBMPFD patientmuscle biopsy are shown. Open arrows highlight p62 and Lamp1/2 colocalization, and closed arrows show regions of only p62immunofluorescence. Single myofibers containing RVs are outlined in the merge panels.(B and C) Transmission electron microscopy of tibialis anterior muscle from one of two independent lines (B shows RH12, and C shows RH9 lines) of 12-mo-old VCP-RH-expressing transgenic mice. Note the large vacuolated structures that are perinuclear or subsarcolemmal. Bars: (A) 30 µm; (B and C) 500 nm."}
{"words": ["Figure", "7", ".", "(", "A", ")", "Representative", "images", "using", "in", "vivo", "bioluminescence", "of", "control", "or", "IBMPFD", "mutant", "RH", "-", "expressing", "mice", "(", "RH12", ")", "2", "d", "after", "electroporation", "(", "baseline", ")", "or", "after", "24", "h", "of", "nutrient", "deprivation", "(", "starvation", ")", "of", "polyQ80", "(", "Q80", ")", "-", "or", "polyQ19", "-", "luciferase", "(", "Q19", ")", "in", "the", "right", "and", "left", "tibialis", "anterior", ",", "respectively", ".", "The", "ratio", "of", "polyQ80", "-", "luciferase", "/", "polyQ19", "-", "luciferase", "is", "indicated", "below", "each", "image", "set", ".", "Values", "are", "in", "×", "104", "photons", "per", "second", "per", "square", "centimeter", "per", "steradian", ".", "(", "B", ")", "Box", "and", "whisker", "plot", "of", "the", "change", "(", "Δ", ")", "in", "the", "ratio", "of", "polyQ80", "-", "luciferase", "/", "polyQ19", "-", "luciferase", "activity", "in", "the", "left", "and", "right", "tibialis", "anterior", "muscle", "of", "control", ",", "VCP", "-", "WT", ",", "or", "one", "of", "two", "VCP", "-", "RH", "(", "RH12", "or", "RH9", ")", "transgenic", "mouse", "lines", "after", "24", "h", "of", "starvation", ".", "The", "graph", "is", "representative", "of", "three", "animals", "per", "group", ".", "The", "p", "-", "value", "for", "RH12", "was", "0", ".", "05", "and", "0", ".", "06", "when", "compared", "with", "control", "animals", "or", "VCP", "-", "WT", "transgenic", ".", "The", "p", "-", "value", "for", "RH9", "was", "0", ".", "03", "when", "compared", "with", "either", "control", "or", "VCP", "-", "WT", "transgenic", ".", "The", "p", "-", "value", "was", "0", ".", "01", "and", "0", ".", "02", "when", "combined", "RH12", "and", "RH9", "animals", "were", "compared", "with", "control", "or", "VCP", "-", "WT", "groups", ",", "respectively", ".", "There", "was", "no", "statistical", "difference", "between", "control", "or", "VCP", "-", "WT", "groups", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7.(A) Representative images using in vivo bioluminescence of control or IBMPFD mutant RH-expressing mice (RH12) 2 d after electroporation (baseline) or after 24 h of nutrient deprivation (starvation) of polyQ80 (Q80)- or polyQ19-luciferase (Q19) in the right and left tibialis anterior, respectively. The ratio of polyQ80-luciferase/polyQ19-luciferase is indicated below each image set. Values are in ×104 photons per second per square centimeter per steradian. (B) Box and whisker plot of the change (Δ) in the ratio of polyQ80-luciferase/polyQ19-luciferase activity in the left and right tibialis anterior muscle of control, VCP-WT, or one of two VCP-RH (RH12 or RH9) transgenic mouse lines after 24 h of starvation. The graph is representative of three animals per group. The p-value for RH12 was 0.05 and 0.06 when compared with control animals or VCP-WT transgenic. The p-value for RH9 was 0.03 when compared with either control or VCP-WT transgenic. The p-value was 0.01 and 0.02 when combined RH12 and RH9 animals were compared with control or VCP-WT groups, respectively. There was no statistical difference between control or VCP-WT groups."}
{"words": ["Figure", "8", ".", "(", "A", ")", "Quantitation", "of", "mCherry", "-", "TDP", "-", "43", "distribution", "(", "nuclear", "only", "or", "cytoplasmic", ")", "in", "control", "U20S", ",", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "VCP", "-", "AE", "-", ",", "or", "VCP", "-", "EQ", "-", "expressing", "cells", ",", "or", "control", "U20S", "cells", "treated", "with", "10", "µM", "Baf", "or", "50", "µM", "chloroquine", "(", "Chlq", ")", "for", "4", "h", "from", "10", "different", "fields", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "from", "20", "fields", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "02", "when", "compared", "with", "VCP", "-", "WT", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "B", ")", "Epifluorescent", "images", "for", "mCherry", "-", "TDP", "-", "43", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "control", "U20S", ",", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "or", "VCP", "-", "AE", "-", "expressing", "cells", ",", "or", "control", "U20S", "cells", "treated", "with", "Baf", "or", "chloroquine", "for", "4", "h", ".", "Arrows", "denote", "cytosolic", "TDP", "-", "43", "and", "perinuclear", "TDP", "-", "43", "inclusions", ".", "(", "C", ",", "top", ")", "Immunoblot", "for", "TDP", "-", "43", ",", "lamin", "A", "/", "C", ",", "and", "actin", "from", "nuclear", "or", "cytosolic", "lysate", "fractions", "of", "mCherry", "-", "TDP", "-", "43", "-", "transfected", "VCP", "-", "WT", "-", ",", "VCP", "-", "RH", "-", ",", "VCP", "-", "AE", "-", ",", "or", "VCP", "-", "EQ", "-", "expressing", "cells", ".", "Note", "the", "increase", "in", "cytosolic", "TDP", "-", "43", "from", "IBMPFD", "mutant", "-", "and", "EQ", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "bottom", ")", "Immunoblot", "for", "TDP", "-", "43", ",", "lamin", "A", "/", "C", ",", "and", "actin", "from", "nuclear", "or", "cytosolic", "lysate", "fractions", "of", "untreated", "U20S", "cells", "transfected", "with", "mCherry", "-", "TDP", "-", "43", "or", "similarly", "transfected", "cells", "treated", "with", "30", "µg", "/", "ml", "(", "cq1", ")", "or", "120", "µg", "/", "ml", "(", "cq2", ")", "chloroquine", "diphosphate", "or", "200", "ng", "/", "ml", "Baf", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Bar", ",", "15", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8.(A) Quantitation of mCherry-TDP-43 distribution (nuclear only or cytoplasmic) in control U20S, VCP-WT-, VCP-RH-, VCP-AE-, or VCP-EQ-expressing cells, or control U20S cells treated with 10 µM Baf or 50 µM chloroquine (Chlq) for 4 h from 10 different fields from two independent experiments. Error bars represent the standard error from 20 fields in two independent experiments. *, P < 0.02 when compared with VCP-WT-expressing cells. (B) Epifluorescent images for mCherry-TDP-43 (red) and DAPI (blue) in control U20S, VCP-WT-, VCP-RH-, or VCP-AE-expressing cells, or control U20S cells treated with Baf or chloroquine for 4 h. Arrows denote cytosolic TDP-43 and perinuclear TDP-43 inclusions.(C, top) Immunoblot for TDP-43, lamin A/C, and actin from nuclear or cytosolic lysate fractions of mCherry-TDP-43-transfected VCP-WT-, VCP-RH-, VCP-AE-, or VCP-EQ-expressing cells. Note the increase in cytosolic TDP-43 from IBMPFD mutant- and EQ-expressing cells. (bottom) Immunoblot for TDP-43, lamin A/C, and actin from nuclear or cytosolic lysate fractions of untreated U20S cells transfected with mCherry-TDP-43 or similarly transfected cells treated with 30 µg/ml (cq1) or 120 µg/ml (cq2) chloroquine diphosphate or 200 ng/ml Baf. Data are representative of three independent experiments. Bar, 15 µm."}
{"words": ["Figure", "9", ".", "(", "A", ")", "TDP", "-", "43", "immunostaining", "of", "quadriceps", "skeletal", "muscle", "from", "15", "-", "mo", "-", "old", "control", "(", "Cont", ")", "or", "VCP", "-", "WT", ",", "-", "RH9", ",", "or", "-", "RH12", "transgenic", "mice", ".", "A", "single", "myofiber", "is", "outlined", "in", "white", ".", "(", "B", ")", "TDP", "-", "43", "immunostaining", "of", "quadriceps", "skeletal", "muscle", "from", "3", "-", "mo", "-", "old", "mice", "treated", "with", "saline", "or", "50", "mg", "/", "kg", "/", "d", "intraperitoneal", "chloroquine", "(", "Chlq", ")", "for", "4", "wk", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "Insets", "show", "one", "myonuclei", "from", "each", "field", ".", "Bars", ",", "30", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9.(A) TDP-43 immunostaining of quadriceps skeletal muscle from 15-mo-old control (Cont) or VCP-WT, -RH9, or -RH12 transgenic mice. A single myofiber is outlined in white.(B) TDP-43 immunostaining of quadriceps skeletal muscle from 3-mo-old mice treated with saline or 50 mg/kg/d intraperitoneal chloroquine (Chlq) for 4 wk. (A and B) Insets show one myonuclei from each field. Bars, 30 µm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Muscular", "exophers", "contain", "organelles", "and", "large", "protein", "complexes", ".", "Arrows", ":", "white", "-", "exopher", ",", "blue", "-", "muscle", "cell", ",", "green", "-", "mitochondria", ",", "red", "-", "proteasome", "foci", ".", "MOM", "-", "mitochondrial", "outer", "membrane", ".", "(", "B", ")", "BMW", "actively", "releases", "significant", "amounts", "of", "exopher", ".", "The", "image", "shows", "the", "middle", "part", "of", "the", "worm", "'", "s", "body", "with", "muscles", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "Arrows", "indicate", "representative", "exophers", ",", "and", "the", "asterisk", "indicates", "the", "position", "of", "the", "vulva", ".", "(", "H", ")", "Knockdown", "of", "two", "autophagy", "genes", ",", "atg", "-", "7", "and", "lgg", "-", "1", "significantly", "reduce", "the", "number", "of", "generated", "exophers", ".", "n", "=", "91", "-", "103", ";", "N", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Muscular exophers contain organelles and large protein complexes. Arrows: white - exopher, blue - muscle cell, green - mitochondria, red - proteasome foci. MOM - mitochondrial outer membrane. (B) BMW actively releases significant amounts of exopher. The image shows the middle part of the worm's body with muscles marked with dashed lines. Arrows indicate representative exophers, and the asterisk indicates the position of the vulva.(H) Knockdown of two autophagy genes, atg-7 and lgg-1 significantly reduce the number of generated exophers. n = 91-103; N = 3."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "The", "highest", "number", "of", "exophers", "is", "produced", "during", "the", "hermaphrodite", "reproductive", "period", "and", "in", "aging", "animals", ".", "Males", "do", "not", "produce", "exophers", "during", "the", "first", "days", "of", "adulthood", "and", "begin", "to", "generate", "a", "small", "number", "of", "exophers", "later", "in", "life", ".", "Starting", "n", "=", "90", "hermaphrodites", "and", "150", "males", ";", "N", "=", "3", ".", "(", "B", ")", "Feminized", "hermaphrodites", "of", "thermosensitive", "a", "fem", "-", "1", "mutant", "strain", "do", "not", "produce", "exophers", "regardless", "of", "growth", "temperature", ".", "This", "phenotype", "can", "be", "partially", "rescued", "by", "mating", "fem", "-", "1", "mutants", "with", "males", ".", "n", "=", "10", "-", "26", ";", "N", "=", "2", ".", "(", "D", ")", "Hermaphrodites", "sterilized", "via", "FUdR", "treatment", "produce", "no", "exophers", "or", "only", "a", "few", "per", "animal", ".", "n", "=", "118", "and", "112", "animals", ";", "N", "=", "3", ".", "(", "E", ")", "Males", "and", "sterile", "hermaphrodites", "(", "via", "FUdR", "treatment", ")", "show", "the", "formation", "of", "spherical", "structures", "in", "the", "BWM", "that", "resemble", "mature", "exophers", ".", "MOM", "-", "mitochondrial", "outer", "membrane", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) The highest number of exophers is produced during the hermaphrodite reproductive period and in aging animals. Males do not produce exophers during the first days of adulthood and begin to generate a small number of exophers later in life. Starting n = 90 hermaphrodites and 150 males; N = 3.(B) Feminized hermaphrodites of thermosensitive a fem-1 mutant strain do not produce exophers regardless of growth temperature. This phenotype can be partially rescued by mating fem-1 mutants with males. n = 10-26; N = 2.(D) Hermaphrodites sterilized via FUdR treatment produce no exophers or only a few per animal. n = 118 and 112 animals; N = 3.(E) Males and sterile hermaphrodites (via FUdR treatment) show the formation of spherical structures in the BWM that resemble mature exophers. MOM - mitochondrial outer membrane."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "RNAi", "knockdown", "of", "genes", "regulating", "the", "egg", "laying", "rate", "and", "their", "presence", "in", "the", "uterus", "influences", "exopher", "production", ".", "n", "=", "50", "-", "60", ";", "N", "=", "2", ".", "(", "F", ")", "Increased", "eggshell", "permeability", "caused", "by", "emb", "-", "27", "knockdown", "elevates", "exopher", "production", ".", "n", "=", "103", "and", "89", ";", "N", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) RNAi knockdown of genes regulating the egg laying rate and their presence in the uterus influences exopher production. n = 50-60; N = 2.(F) Increased eggshell permeability caused by emb-27 knockdown elevates exopher production. n = 103 and 89; N = 3."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ",", "D", ")", "Animals", "with", "overactive", "exopheresis", "have", "reduced", "exploratory", "behaviour", "presented", "as", "a", "reduction", "in", "straight", "line", "distance", "travelled", "(", "C", ")", "and", "by", "representative", "worms", "traces", "on", "the", "plate", "(", "D", ")", ".", "n", "=", "11", "-", "34", ";", "N", "=", "3", ".", "(", "E", ")", "RNAi", "knockdown", "of", "the", "egg", "yolk", "precursor", "protein", "VIT", "-", "1", "increases", "the", "number", "of", "muscular", "exophers", ".", "n", "=", "20", ";", "N", "=", "2", ".", "(", "F", ")", "Embryos", "from", "hermaphrodite", "mothers", "that", "produce", "a", "high", "number", "of", "exophers", "contain", "more", "egg", "yolk", "precursor", "protein", "VIT", "-", "2", ".", "Representative", "images", "of", "embryos", "with", "endogenous", "VIT", "-", "2", ":", ":", "GFP", "levels", "from", "mothers", "with", "different", "exopheresis", "activity", "are", "shown", "above", "the", "graph", ".", "n", "=", "15", "and", "14", ",", "N", "=", "5", "and", "6", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "(", "G", ")", "RNAi", "knockdown", "of", "RME", "-", "2", "yolk", "receptor", "abolish", "exopher", "production", ".", "n", "=", "110", "-", "123", ";", "N", "=", "3", ".", "(", "H", ")", "Muscle", "-", "produced", "VIT", "-", "2", "is", "released", "from", "muscles", "via", "exophers", ".", "The", "image", "shows", "the", "midbody", "of", "worms", "expressing", "the", "proteasome", "subunit", "RPN", "-", "5", "tagged", "with", "RFP", "in", "BWM", "and", "VIT", "-", "2", ":", ":", "GFP", "endogenous", "expression", ".", "Arrows", ":", "white", "-", "exopher", ",", "blue", "-", "muscle", "cell", ".", "Dashed", "lines", "mark", "embryos", "present", "in", "the", "uterus", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C, D) Animals with overactive exopheresis have reduced exploratory behaviour presented as a reduction in straight line distance travelled (C) and by representative worms traces on the plate (D). n = 11-34; N = 3.(E) RNAi knockdown of the egg yolk precursor protein VIT-1 increases the number of muscular exophers. n = 20; N = 2.(F) Embryos from hermaphrodite mothers that produce a high number of exophers contain more egg yolk precursor protein VIT-2. Representative images of embryos with endogenous VIT-2::GFP levels from mothers with different exopheresis activity are shown above the graph. n = 15 and 14, N = 5 and 6. Scale bar is 10 µm.(G) RNAi knockdown of RME-2 yolk receptor abolish exopher production. n = 110-123; N = 3.(H) Muscle-produced VIT-2 is released from muscles via exophers. The image shows the midbody of worms expressing the proteasome subunit RPN-5 tagged with RFP in BWM and VIT-2::GFP endogenous expression. Arrows: white - exopher, blue - muscle cell. Dashed lines mark embryos present in the uterus. Scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "G", ")", "Tumour", "growth", "(", "in", "mm3", ")", "of", "FBXW7", "+", "/", "+", "and", "FBXW7", "-", "/", "-", "xenografts", "in", "nude", "mice", "(", "n", "=", "10", "animals", "per", "group", ")", ".", "Treatment", "with", "either", "vehicle", ",", "paclitaxel", "(", "1", ",", "5mg", "/", "kg", ")", "or", "tigecycline", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "started", "at", "day", "6", "post", "-", "tumour", "-", "injection", ",", "and", "was", "administered", "three", "times", "per", "week", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "the", "xenografts", "defined", "in", "(", "G", ")", "at", "day", "15", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(G) Tumour growth (in mm3) of FBXW7+/+ and FBXW7-/- xenografts in nude mice (n=10 animals per group). Treatment with either vehicle, paclitaxel (1,5mg/kg) or tigecycline (50mg/kg) started at day 6 post-tumour-injection, and was administered three times per week. Error bars indicate SEM. (H) Representative images of the xenografts defined in (G) at day 15."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "WB", "illustrating", "the", "levels", "of", "ATF4", "in", "DLD", "-", "1", "cells", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "GAPDH", "levels", "are", "shown", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) WB illustrating the levels of ATF4 in DLD-1 cells treated as in (C). GAPDH levels are shown as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Localization", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "PE", "synthesizing", "enzyme", "(", "Psd", ")", "targeted", "to", "the", "indicated", "organelles", "in", "choppΔ", "cells", ",", "grown", "in", "SD", "medium", "supplemented", "with", "10", "mM", "choline", ".", "Images", "shown", "are", "either", "a", "single", "Z", "-", "slice", "(", "ER", "construct", ")", "or", "a", "maximum", "intensity", "projection", "of", "several", "Z", "-", "sections", "(", "other", "constructs", ")", ";", "LD", ",", "lipid", "droplets", ";", "MM", ",", "mitochondrial", "matrix", ".", "A", "scheme", "depicting", "each", "chimeric", "Psd", "construct", "is", "shown", "under", "the", "corresponding", "microscopy", "image", ".", "C", ")", "Localization", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "PC", "synthesizing", "enzyme", "(", "Pmt", ")", "targeted", "to", "the", "indicated", "organelles", "in", "choppΔ", "cells", ",", "grown", "in", "SD", "medium", "supplemented", "with", "10", "mM", "ethanolamine", ".", "Images", "shown", "are", "either", "a", "single", "Z", "-", "slice", "(", "ER", "construct", ")", "or", "a", "maximum", "intensity", "projection", "of", "several", "Z", "-", "sections", "(", "other", "constructs", ")", ".", "A", "schematic", "depicting", "each", "chimeric", "Pmt", "construct", "is", "shown", "under", "the", "corresponding", "microscopy", "image", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Localization of the GFP-tagged PE synthesizing enzyme (Psd) targeted to the indicated organelles in choppΔ cells, grown in SD medium supplemented with 10 mM choline. Images shown are either a single Z-slice (ER construct) or a maximum intensity projection of several Z-sections (other constructs); LD, lipid droplets; MM, mitochondrial matrix. A scheme depicting each chimeric Psd construct is shown under the corresponding microscopy image. C) Localization of the GFP-tagged PC synthesizing enzyme (Pmt) targeted to the indicated organelles in choppΔ cells, grown in SD medium supplemented with 10 mM ethanolamine. Images shown are either a single Z-slice (ER construct) or a maximum intensity projection of several Z-sections (other constructs). A schematic depicting each chimeric Pmt construct is shown under the corresponding microscopy image."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Five", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "strains", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "wt", "cells", "and", "choppΔ", "cells", "harboring", "empty", "vectors", "or", "choppΔ", "cells", "expressing", "chimeric", "Psd", "and", "Pmt", "enzymes", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "on", "SD", "-", "HIS", "-", "LEU", "(", "-", "HL", ")", "medium", "(", "KennedyOFF", ")", "or", "SD", "-", "HL", "containing", "ethanolamine", "and", "choline", "(", "KennedyON", ")", ".", "C", ")", "Thin", "layer", "chromatography", "(", "TLC", ")", "analysis", "of", "steady", "-", "state", "phospholipid", "profiles", "of", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Where", "Psd", "and", "/", "or", "Pmt", "are", "missing", "(", "-", ")", ",", "choppΔ", "cells", "were", "grown", "in", "the", "presence", "of", "ethanolamine", "and", "/", "or", "choline", ".", "Bands", "corresponding", "to", "the", "phospholipids", "PA", ",", "PS", ",", "PE", ",", "PI", "and", "PC", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Five-fold serial dilutions of strains of the indicated genotypes (wt cells and choppΔ cells harboring empty vectors or choppΔ cells expressing chimeric Psd and Pmt enzymes). Cells were grown on SD-HIS-LEU (-HL) medium (KennedyOFF) or SD-HL containing ethanolamine and choline (KennedyON).C) Thin layer chromatography (TLC) analysis of steady-state phospholipid profiles of cells of the indicated genotypes. Where Psd and/or Pmt are missing (-), choppΔ cells were grown in the presence of ethanolamine and/or choline. Bands corresponding to the phospholipids PA, PS, PE, PI and PC are indicated."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "VPS13", "is", "required", "in", "KennedyOFF", "conditions", "when", "chimeric", "enzymes", "are", "targeted", "to", "mitochondria", "or", "endosomes", ".", "Volcano", "plots", "show", "the", "fold", "change", "of", "number", "of", "transposon", "insertions", "per", "gene", "of", "libraries", "grown", "in", "KennedyOFF", "versus", "ON", "conditions", ".", "This", "comparison", "included", "all", "six", "libraries", "where", "the", "enzymes", "are", "targeted", "to", "endosomes", "and", "/", "or", "mitochondria", "(", "top", "left", "panel", ")", "or", "six", "libraries", "with", "enzymes", "targeted", "to", "other", "organelles", "(", "bottom", "left", "panel", ")", ".", "Data", "-", "points", "for", "VPS13", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "Schematic", "illustrating", "Vps13", "-", "mediated", "lipid", "transport", "at", "endosomes", "and", "mitochondria", "contact", "sites", "(", "right", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) VPS13 is required in KennedyOFF conditions when chimeric enzymes are targeted to mitochondria or endosomes. Volcano plots show the fold change of number of transposon insertions per gene of libraries grown in KennedyOFF versus ON conditions. This comparison included all six libraries where the enzymes are targeted to endosomes and/or mitochondria (top left panel) or six libraries with enzymes targeted to other organelles (bottom left panel). Data-points for VPS13 are highlighted in red. Schematic illustrating Vps13-mediated lipid transport at endosomes and mitochondria contact sites (right panel)."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Volcano", "plot", "comparing", "the", "number", "of", "transposon", "insertions", "per", "gene", "of", "all", "12", "libraries", "in", "KennedyON", "and", "OFF", "conditions", ".", "Genes", "significantly", "required", "in", "KennedyOFF", "conditions", "are", "highlighted", "in", "red", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "log2", "(", "fold", "change", ")", "<", "-", "0", ".", "5", ")", ".", "Genes", "highlighted", "in", "the", "clusterogram", "in", "A", "(", "top", "inset", ")", "are", "indicated", "with", "blue", "arrows", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Volcano plot comparing the number of transposon insertions per gene of all 12 libraries in KennedyON and OFF conditions. Genes significantly required in KennedyOFF conditions are highlighted in red (p-value < 0.05, log2(fold change) < -0.5). Genes highlighted in the clusterogram in A (top inset) are indicated with blue arrows."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "Requirement", "for", "mitochondrial", "lipid", "transport", "and", "biosynthesis", "genes", "in", "rewired", "libraries", ".", "Left", "panel", ",", "schematic", "depicting", "PE", "and", "cardiolipin", "(", "CL", ")", "synthesis", "in", "mitochondria", ".", "The", "inner", "mitochondrial", "putative", "lipid", "transporter", "Mdm31", "is", "depicted", "in", "yellow", ".", "Grey", "arrows", "indicate", "the", "need", "for", "lipid", "transport", "from", "the", "ER", "or", "other", "organelles", "to", "mitochondria", "and", "transport", "between", "the", "MOM", "and", "MIM", ".", "Right", "panel", ",", "transposon", "numbers", "(", "normalized", "to", "wt", "libraries", ")", "for", "the", "indicated", "(", "set", "of", ")", "libraries", "for", "MDM31", ",", "PGS1", ",", "and", "CRD1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) Requirement for mitochondrial lipid transport and biosynthesis genes in rewired libraries. Left panel, schematic depicting PE and cardiolipin (CL) synthesis in mitochondria. The inner mitochondrial putative lipid transporter Mdm31 is depicted in yellow. Grey arrows indicate the need for lipid transport from the ER or other organelles to mitochondria and transport between the MOM and MIM. Right panel, transposon numbers (normalized to wt libraries) for the indicated (set of) libraries for MDM31, PGS1, and CRD1."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Five", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "strains", "of", "the", "indicated", "genotypes", "grown", "at", "30", "°", "C", "on", "SD", "medium", "supplemented", "with", "10", "mM", "ethanolamine", "and", "/", "or", "10", "mM", "choline", ".", "Growth", "assays", "are", "representative", "images", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Five-fold serial dilutions of strains of the indicated genotypes grown at 30°C on SD medium supplemented with 10 mM ethanolamine and/or 10 mM choline. Growth assays are representative images of biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Top", ":", "Co", "-", "localization", "of", "Csf1", "-", "GFP", "cells", "in", "log", "phase", "with", "genomically", "integrated", "Pex10", "-", "mCherry", "(", "peroxisome", "marker", ")", "and", "mtBFP", "plasmid", "(", "mito", "marker", ")", ".", "Bottom", ":", "Co", "-", "localization", "of", "log", "growing", "Csf1", "-", "GFP", "cells", "with", "mCherry", "-", "Ubc6", "(", "tail", "-", "anchor", ")", "(", "ER", "marker", ")", "and", "mtBFP", "plasmid", "(", "mito", "marker", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "µm", ".", "C", ")", "Five", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "strains", "of", "the", "indicated", "genotypes", "grown", "at", "indicated", "temperatures", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "ethanolamine", "(", "etn", ")", ".", "E", ")", "Bar", "graphs", "depicting", "the", "fraction", "of", "more", "saturated", "species", "(", "defined", "as", "fatty", "acid", "chains", "with", "one", "double", "bond", "for", "≤", "30", "carbon", "chains", "or", "with", "two", "double", "bonds", "for", "≥", "32", ")", ",", "and", "less", "unsaturated", "species", "(", "defined", "as", "fatty", "acid", "chains", "with", "zero", "double", "bond", "for", "≤", "30", "carbon", "chains", "or", "with", "one", "double", "bond", "for", "≥", "32", ")", "for", "each", "phospholipid", "class", "with", "different", "head", "groups", ".", "Bars", "represent", "the", "means", "of", "two", "or", "three", "biological", "replicates", "(", "individual", "measurements", "are", "shown", "as", "points", "and", "triangles", ")", ".", "p", "-", "values", "are", "calculated", "with", "a", "two", "-", "sample", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Top: Co-localization of Csf1-GFP cells in log phase with genomically integrated Pex10-mCherry (peroxisome marker) and mtBFP plasmid (mito marker). Bottom: Co-localization of log growing Csf1-GFP cells with mCherry-Ubc6 (tail-anchor) (ER marker) and mtBFP plasmid (mito marker). Scale bar, 2 µm.C) Five-fold serial dilutions of strains of the indicated genotypes grown at indicated temperatures, in the presence or absence of 10 mM ethanolamine (etn).E) Bar graphs depicting the fraction of more saturated species (defined as fatty acid chains with one double bond for ≤30 carbon chains or with two double bonds for ≥32), and less unsaturated species (defined as fatty acid chains with zero double bond for ≤30 carbon chains or with one double bond for ≥32) for each phospholipid class with different head groups. Bars represent the means of two or three biological replicates (individual measurements are shown as points and triangles). p-values are calculated with a two-sample t-test."}
{"words": ["Figure", "1Figure", "1", ".", "Cytoplasmic", "conical", "structures", "in", "Thermococcus", "kodakaraensis", ".", "(", "A", ")", "A", "tomographic", "slice", "shows", "a", "side", "view", "of", "a", "conical", "structure", "(", "c", ")", "in", "the", "cytoplasm", ",", "rotated", "and", "enlarged", "in", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ")", "A", "tomographic", "slice", "shows", "a", "side", "view", "of", "the", "cone", "in", "another", "cell", ",", "highlighting", "the", "subunit", "texture", "along", "the", "edge", "of", "the", "cone", "(", "arrowheads", ")", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Top", "views", "of", "a", "cone", "at", "different", "heights", "show", "the", "inner", "ring", "(", "r", ";", "enlarged", "in", "inset", "to", "highlight", "19", "-", "subunit", "structure", ")", "and", "outer", "cone", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Sequential", "slices", "through", "a", "side", "view", "of", "a", "cone", "in", "a", "lysed", "cell", "show", "the", "relative", "location", "of", "the", "ring", "in", "the", "cone", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Different", "views", "of", "a", "3D", "segmentation", "of", "the", "cone", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "embedded", "in", "a", "tomographic", "slice", ".", "s", ",", "S", "-", "layer", ";", "m", ",", "membrane", ";", "a", ",", "archaella", ";", "rib", ",", "ribosomes", ";", "rez", ",", "ribosome", "-", "excluding", "zone", ".", "Scale", "bars", "100", "nm", ";", "scale", "bar", "in", "(", "D", ")", "applies", "to", "(", "D", ",", "E", ")", ";", "scale", "bar", "in", "(", "F", ")", "applies", "to", "(", "F", "-", "H", ")", ";", "segmentation", "not", "to", "scale", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Figure 1. Cytoplasmic conical structures in Thermococcus kodakaraensis. (A) A tomographic slice shows a side view of a conical structure (c) in the cytoplasm, rotated and enlarged in (B). (C) A tomographic slice shows a side view of the cone in another cell, highlighting the subunit texture along the edge of the cone (arrowheads). (D, E) Top views of a cone at different heights show the inner ring (r; enlarged in inset to highlight 19-subunit structure) and outer cone. (F-H) Sequential slices through a side view of a cone in a lysed cell show the relative location of the ring in the cone. (I, J) Different views of a 3D segmentation of the cone shown in (A), embedded in a tomographic slice. s, S-layer; m, membrane; a, archaella; rib, ribosomes; rez, ribosome-excluding zone. Scale bars 100 nm; scale bar in (D) applies to (D, E); scale bar in (F) applies to (F-H); segmentation not to scale."}
{"words": ["Figure", "2Figure", "2", ".", "Cones", "are", "associated", "with", "chemosensory", "arrays", ",", "ribosome", "-", "excluding", "zones", "and", "filament", "bundles", ".", "Tomographic", "slices", "show", "side", "(", "A", ")", "and", "top", "(", "B", ",", "C", ")", "views", "of", "cones", "(", "c", ")", "in", "three", "cells", ",", "highlighting", "associated", "chemosensory", "arrays", "(", "ca", ")", ",", "ribosome", "-", "excluding", "zones", "(", "rez", ")", "and", "filament", "bundles", "(", "f", ")", ".", "For", "a", "slice", "-", "by", "-", "slice", "view", "through", "the", "tomogram", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "see", "Movie", "S1", ".", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", "show", "different", "views", "of", "a", "3D", "segmentation", "of", "the", "structures", "shown", "in", "(", "C", ")", ",", "with", "the", "conical", "structure", "in", "blue", "and", "the", "filament", "bundle", "in", "red", ".", "s", ",", "S", "-", "layer", ";", "m", ",", "membrane", ";", "a", ",", "archaellum", ";", "o", ",", "other", "filaments", ".", "Scale", "bar", "100", "nm", "(", "applies", "to", "A", "-", "C", ")", ";", "segmentation", "not", "to", "scale", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Figure 2. Cones are associated with chemosensory arrays, ribosome-excluding zones and filament bundles. Tomographic slices show side (A) and top (B, C) views of cones (c) in three cells, highlighting associated chemosensory arrays (ca), ribosome-excluding zones (rez) and filament bundles (f). For a slice-by-slice view through the tomogram shown in (A), see Movie S1. (D) and (E) show different views of a 3D segmentation of the structures shown in (C), with the conical structure in blue and the filament bundle in red. s, S-layer; m, membrane; a, archaellum; o, other filaments. Scale bar 100 nm (applies to A-C); segmentation not to scale."}
{"words": ["Figure", "3Figure", "3", ".", "Archaellum", "orientation", "with", "respect", "to", "the", "cell", "envelope", ".", "(", "A", "-", "D", ")", "show", "tomographic", "slices", "through", "side", "views", "of", "cones", ".", "In", "the", "bottom", "row", ",", "white", "lines", "show", "the", "angle", "of", "the", "archaellum", "with", "respect", "to", "the", "surface", "layer", ",", "and", "red", "dashed", "lines", "show", "the", "conserved", "distance", "from", "the", "archaellum", "at", "the", "membrane", "to", "the", "cone", ".", "Scale", "bar", "100", "nm", "(", "applies", "to", "A", "-", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Figure 3. Archaellum orientation with respect to the cell envelope. (A-D) show tomographic slices through side views of cones. In the bottom row, white lines show the angle of the archaellum with respect to the surface layer, and red dashed lines show the conserved distance from the archaellum at the membrane to the cone. Scale bar 100 nm (applies to A-D)."}
{"words": ["Figure", "4Figure", "4", ".", "Structure", "of", "the", "T", ".", "kodakaraensis", "archaellum", ".", "(", "A", ")", "A", "sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "archaellum", "reveals", "structural", "features", ",", "including", "four", "layers", "of", "density", "in", "the", "cytoplasm", "(", "L1", "-", "L3", ",", "cone", ")", ".", "CM", ",", "cytoplasmic", "membrane", ".", "The", "speculated", "identity", "of", "densities", "in", "the", "archaellum", "is", "proposed", ":", "archaellum", "fiber", "=", "FlaA", "/", "B", "flagellins", ";", "integral", "membrane", "density", "=", "FlaJ", ";", "L1", "=", "FlaI", ";", "L2", "/", "L3", "/", "cone", "=", "FlaH", "/", "FlaC", "/", "D", "/", "E", ".", "Scale", "bar", "10", "nm", "(", "applies", "to", "A", ",", "B", ")", ".", "Figure", "4", ".", "Structure", "of", "the", "T", ".", "kodakaraensis", "archaellum", ".", "(", "B", ")", "For", "comparison", ",", "a", "subtomogram", "average", "of", "the", "type", "IVa", "pilus", "machine", "from", "Myxococcus", "xanthus", "is", "shown", "(", "adapted", "with", "permission", "from", "[", "8", "]", ")", ".", "Arrows", "indicate", "components", "with", "recognized", "homology", ".", "OM", ",", "outer", "membrane", ";", "IM", ",", "inner", "membrane", ".", "Scale", "bar", "10", "nm", "(", "applies", "to", "A", ",", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Figure 4. Structure of the T. kodakaraensis archaellum. (A) A sub-tomogram average of the archaellum reveals structural features, including four layers of density in the cytoplasm (L1-L3, cone). CM, cytoplasmic membrane. The speculated identity of densities in the archaellum is proposed: archaellum fiber = FlaA/B flagellins; integral membrane density = FlaJ; L1 = FlaI; L2/L3/cone = FlaH/FlaC/D/E.Scale bar 10 nm (applies to A, B).Figure 4. Structure of the T. kodakaraensis archaellum.(B) For comparison, a subtomogram average of the type IVa pilus machine from Myxococcus xanthus is shown (adapted with permission from [8]). Arrows indicate components with recognized homology. OM, outer membrane; IM, inner membrane. Scale bar 10 nm (applies to A, B)."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Growth", "of", "DiCre", "-", "3D7", "transgenic", "lines", "following", "LDH1", ",", "HAD4", ",", "and", "Lipin", "depletion", "with", "100", "nM", "rapamycin", "and", "2", ".", "5", "mM", "glucosamine", "was", "assessed", "relative", "to", "uninduced", "parasite", "cultures", ".", "The", "untransfected", "DiCre", "-", "3D7", "parasite", "line", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "from", "three", "independent", "replicates", ".", "C", ".", "Untargeted", "LC", "-", "MS", "analysis", "of", "LDH1", "depletion", "(", "one", "cycle", "of", "rapamycin", "and", "glucosamine", "treatment", ")", "indicated", "minimal", "but", "selective", "metabolic", "changes", ".", "m", "/", "z", "feature", "intensities", "are", "plotted", "as", "the", "log2", "ratio", "of", "treated", "/", "untreated", "and", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "corrected", "P", "values", "across", "six", "biological", "replicates", "plotted", "as", "-", "log10", "(", "P", ")", ".", "Below", ",", "LDH1", "substrate", "and", "product", "(", "pyruvate", "and", "lactate", "respectively", ")", "abundance", "plotted", "as", "the", "ratio", "of", "treated", "/", "untreated", "from", "biological", "replicates", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "and", "the", "parental", "DiCre", "line", "presented", "as", "the", "negative", "control", ".", "D", ".", "Loss", "of", "Lipin", "(", "PF3D7", "_", "0303200", ")", "leads", "to", "accumulation", "of", "various", "lipid", "species", "(", "three", "cycles", "of", "rapamycin", "and", "glucosamine", "treatment", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "log2", "fold", "change", "Lipin", "depleted", "(", "treated", ")", "enriched", "trophozoite", "-", "stage", "iRBCs", "to", "untreated", "controls", "from", "three", "to", "six", "biological", "replicates", "(", "±", "SD", ")", ".", "The", "schematic", "depicts", "the", "proposed", "lipid", "phosphatase", "activity", "of", "Lipin", ".", "E", ".", "Loss", "of", "HAD4", "leads", "to", "increases", "in", "intracellular", "levels", "of", "several", "nucleotides", "and", "intermediates", "in", "lower", "glycolysis", ".", "Data", "are", "represented", "as", "the", "mean", "log2", "fold", "change", "of", "enriched", "trophozoite", "-", "stage", "iRBCs", "treated", "for", "three", "cycles", "compared", "to", "untreated", "controls", "from", "three", "/", "four", "biological", "replicates", ".", "Three", "nucleotide", "-", "nucleoside", "pairs", "are", "depicted", "in", "the", "top", "inset", "panels", ",", "HAD4", "disruption", "leads", "to", "accumulation", "of", "the", "nucleotide", "-", "monophosphate", "and", "depletion", "of", "the", "nucleoside", ".", "The", "schematic", "depicts", "lower", "glycolysis", "and", "triose", "-", "phosphate", "interconversion", ",", "with", "the", "corresponding", "metabolite", "levels", "following", "HAD4", "disruption", "depicted", "in", "the", "lower", "right", "inset", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Growth of DiCre-3D7 transgenic lines following LDH1, HAD4, and Lipin depletion with 100 nM rapamycin and 2.5 mM glucosamine was assessed relative to uninduced parasite cultures. The untransfected DiCre-3D7 parasite line was used as a negative control. Data are presented as the mean ± standard error of the mean (SEM) from three independent replicates.C. Untargeted LC-MS analysis of LDH1 depletion (one cycle of rapamycin and glucosamine treatment) indicated minimal but selective metabolic changes. m/z feature intensities are plotted as the log2 ratio of treated/untreated and the Benjamini-Hochberg corrected P values across six biological replicates plotted as -log10(P). Below, LDH1 substrate and product (pyruvate and lactate respectively) abundance plotted as the ratio of treated/untreated from biological replicates (mean±SEM) and the parental DiCre line presented as the negative control.D. Loss of Lipin (PF3D7_0303200) leads to accumulation of various lipid species (three cycles of rapamycin and glucosamine treatment). Data are presented as the mean log2 fold change Lipin depleted (treated) enriched trophozoite-stage iRBCs to untreated controls from three to six biological replicates (± SD). The schematic depicts the proposed lipid phosphatase activity of Lipin.E. Loss of HAD4 leads to increases in intracellular levels of several nucleotides and intermediates in lower glycolysis. Data are represented as the mean log2 fold change of enriched trophozoite-stage iRBCs treated for three cycles compared to untreated controls from three/four biological replicates. Three nucleotide-nucleoside pairs are depicted in the top inset panels, HAD4 disruption leads to accumulation of the nucleotide-monophosphate and depletion of the nucleoside. The schematic depicts lower glycolysis and triose-phosphate interconversion, with the corresponding metabolite levels following HAD4 disruption depicted in the lower right inset."}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Relative", "parasitemia", "was", "assessed", "for", "the", "untransfected", "DiCre", "3D7", "parental", "line", "and", "transfectant", "parasite", "lines", "with", "AMR1", "under", "inducible", "disruption", ".", "Rapamycin", "/", "glucosamine", "treatment", "began", "on", "cycle", "zero", "and", "parasitemia", "determined", "by", "flow", "cytometry", "and", "compared", "to", "identical", "lines", "that", "were", "left", "untreated", ".", "Data", "represents", "the", "mean", "relative", "parasitemia", "±", "SEM", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "y", "-", "axis", ")", "across", "seven", "replication", "cycles", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "C", ".", "Metabolite", "profile", "following", "three", "cycles", "of", "rapamycin", "and", "glucosamine", "treatment", ".", "The", "abundance", "of", "isoprenoid", "biosynthestic", "intermediates", "(", "1", "-", "deoxy", "-", "xylulose", "-", "5", "-", "P", "(", "DOXP", ")", ",", "methyl", "-", "erithritol", "-", "4", "-", "P", "(", "MEP", ")", ",", "methyl", "-", "erithritol", "-", "cyclo", "-", "2", ",", "4", "-", "PP", "(", "MEcPP", ")", ",", "and", "isopentyl", "-", "PP", ")", ",", "and", "hemoglobin", "-", "like", "peptides", "are", "presented", "as", "the", "mean", "log2", "fold", "change", "from", "four", "biological", "replicates", "(", "±", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Relative parasitemia was assessed for the untransfected DiCre 3D7 parental line and transfectant parasite lines with AMR1 under inducible disruption. Rapamycin/glucosamine treatment began on cycle zero and parasitemia determined by flow cytometry and compared to identical lines that were left untreated. Data represents the mean relative parasitemia ± SEM from three biological replicates (y-axis) across seven replication cycles (x-axis).C. Metabolite profile following three cycles of rapamycin and glucosamine treatment. The abundance of isoprenoid biosynthestic intermediates (1-deoxy-xylulose-5-P (DOXP), methyl-erithritol-4-P (MEP), methyl-erithritol-cyclo-2,4-PP (MEcPP), and isopentyl-PP), and hemoglobin-like peptides are presented as the mean log2 fold change from four biological replicates (±SD)."}
{"words": ["Figure", "6C", ".", "HA", "-", "tagged", "SHMT", "-", "M", "detection", "via", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "DAPI", "was", "used", "to", "visualise", "the", "nucleus", ",", "and", "MitoTracker", "CMXros", "used", "to", "illuminate", "the", "mitochondrion", ".", "Anti", "-", "HA", "signal", "partially", "colocalises", "with", "the", "mitochondrion", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C. HA-tagged SHMT-M detection via immunofluorescence microscopy. DAPI was used to visualise the nucleus, and MitoTracker CMXros used to illuminate the mitochondrion. Anti-HA signal partially colocalises with the mitochondrion."}
{"words": ["Figure", "7D", ".", "Pyrimidine", "biosynthetic", "intermediates", "accumulate", "when", "SHMT", "-", "M", "is", "disrupted", "compared", "to", "the", "DiCre", "parental", "line", "(", "C", ")", "following", "rapamycin", "/", "glucosamine", "treatment", "(", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Pyrimidine", "biosynthetic", "disruption", "islinked", "to", "dihydroorotate", "dehydrogenase", "(", "DHODH", ")", "inhibition", "and", "blockage", "of", "the", "mitochondrial", "electron", "transport", "chain", "(", "mETC", ")", ".", "Ubiquinone", "(", "Q", ")", "is", "the", "necessary", "electron", "carrier", "for", "the", "mETC", ".", "E", ".", "Asexual", "growth", "when", "SHMT", "-", "M", "is", "depleted", ".", "Parasitemia", "was", "determined", "across", "seven", "replication", "cycles", "(", "x", "-", "axis", ")", "via", "flow", "cytometry", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Decylubiquinone", "(", "Dub", ")", "was", "added", "at", "10", "µM", "to", "determine", "if", "the", "growth", "defect", "observed", "was", "due", "to", "impaired", "ubiquinone", "synthesis", "or", "recycling", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D. Pyrimidine biosynthetic intermediates accumulate when SHMT-M is disrupted compared to the DiCre parental line (C) following rapamycin/glucosamine treatment (mean ±SEM). Pyrimidine biosynthetic disruption islinked to dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) inhibition and blockage of the mitochondrial electron transport chain (mETC). Ubiquinone (Q) is the necessary electron carrier for the mETC.E. Asexual growth when SHMT-M is depleted. Parasitemia was determined across seven replication cycles (x-axis) via flow cytometry and presented as the mean ± SEM from three independent experiments. Decylubiquinone (Dub) was added at 10 µM to determine if the growth defect observed was due to impaired ubiquinone synthesis or recycling."}
{"words": ["Figure", "1IES", "retention", "PCR", "(", "cropped", "inverted", "images", ")", ".", "Four", "maternally", "-", "controlled", "IES", "and", "four", "non", "-", "maternally", "controlled", "IESs", "are", "shown", ".", "The", "IES", "+", "band", "represents", "retained", "IES", ";", "the", "IES", "-", "band", "represents", "an", "excised", "IES", ";", "additional", "bands", "are", "likely", "PCR", "artefacts", ".", "IRS", "is", "IES", "retention", "Score", "for", "the", "IESs", "calculated", "after", "whole", "genome", "sequencing", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IES retention PCR (cropped inverted images). Four maternally-controlled IES and four non-maternally controlled IESs are shown. The IES+ band represents retained IES; the IES- band represents an excised IES; additional bands are likely PCR artefacts. IRS is IES retention Score for the IESs calculated after whole genome sequencing."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Schematic", "drawing", "of", "the", "life", "cycle", "stages", "of", "Paramecium", "tetraurelia", ".", "MIC", "and", "parental", "MAC", "are", "represented", "in", "red", ",", "representing", "the", "DAPI", "signal", ",", "and", "developing", "MAC", "(", "dm", ")", "is", "represented", "in", "green", "until", "fully", "developed", ",", "representing", "the", "GFP", "signal", ".", "(", "B", ")", "ISWI1", "-", "tagged", "C", "-", "terminally", "with", "GFP", "localizes", "in", "the", "developing", "MAC", "as", "soon", "as", "developing", "new", "MACs", "(", "panel", "Early", "Development", ")", "become", "visible", "and", "remain", "there", "throughout", "late", "MAC", "development", "(", "panel", "Late", "Development", ")", ".", "Red", ":", "DAPI", ",", "Green", ":", "ISWI1", "-", "GFP", ".", "Blue", "arrows", "identify", "developing", "MAC", ";", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", "after", "coimmunoprecipitation", "of", "ISWI1", "-", "3XFlagHA", "fusion", "protein", ".", "Non", "-", "transformed", "cells", "(", "WT", ")", "of", "the", "same", "strain", "were", "used", "as", "the", "negative", "control", ".", "1", "%", "of", "the", "total", "lysate", "was", "loaded", "as", "Input", "and", "20", "%", "of", "co", "-", "immunoprecipitated", "samples", "were", "loaded", "on", "12", "%", "SDS", "gel", ".", "(", "D", ")", "Volcano", "plot", "illustrating", "the", "distribution", "of", "proteins", "identified", "in", "label", "-", "free", "MS", "in", "WT", "Vs", "ISWI1", "-", "3XFlagHA", ".", "Significantly", "abundant", "proteins", "(", "fold", "change", "≥", "4", ")", "are", "highlighted", "in", "orange", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", "after", "coimmunoprecipitation", "of", "Ptiwi01", "-", "3XFlagHA", "fusion", "protein", "co", "-", "transformed", "with", "ISWI1", "-", "GFP", ".", "Non", "-", "transformed", "cells", "(", "WT", ")", "of", "the", "same", "strain", "and", "ISWI1", "-", "GFP", "fusion", "protein", "transformation", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "1", "%", "of", "the", "total", "lysate", "was", "loaded", "as", "Input", "and", "20", "%", "of", "co", "-", "immunoprecipitated", "samples", "were", "loaded", "on", "10", "%", "SDS", "gel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Schematic drawing of the life cycle stages of Paramecium tetraurelia. MIC and parental MAC are represented in red, representing the DAPI signal, and developing MAC (dm) is represented in green until fully developed, representing the GFP signal. (B) ISWI1-tagged C-terminally with GFP localizes in the developing MAC as soon as developing new MACs (panel Early Development) become visible and remain there throughout late MAC development (panel Late Development). Red: DAPI, Green: ISWI1-GFP. Blue arrows identify developing MAC;(C) Western blot analysis using anti-HA antibody after coimmunoprecipitation of ISWI1-3XFlagHA fusion protein. Non-transformed cells (WT) of the same strain were used as the negative control. 1% of the total lysate was loaded as Input and 20% of co-immunoprecipitated samples were loaded on 12% SDS gel.(D) Volcano plot illustrating the distribution of proteins identified in label-free MS in WT Vs ISWI1-3XFlagHA. Significantly abundant proteins (fold change ≥ 4) are highlighted in orange.(E) Western blot analysis using anti-HA and anti-GFP antibodies after coimmunoprecipitation of Ptiwi01-3XFlagHA fusion protein co-transformed with ISWI1-GFP. Non-transformed cells (WT) of the same strain and ISWI1-GFP fusion protein transformation were used as negative controls. 1% of the total lysate was loaded as Input and 20% of co-immunoprecipitated samples were loaded on 10%SDS gel."}
{"words": ["figf1", "(", "b", ")", "A53T", "α", "-", "synuclein", "(", "α", "-", "syn", ")", "expression", "was", "induced", "in", "stable", "PC12", "cells", "for", "48", "h", ",", "then", "switched", "off", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "or", "with", "0", ".", "94", "μM", ",", "4", ".", "7", "μM", "or", "47", "μM", "of", "SMER10", ";", "0", ".", "86", "μM", ",", "4", ".", "3", "μM", "or", "43", "μM", "of", "SMER18", ";", "or", "0", ".", "9", "μM", ",", "4", ".", "7", "μM", "or", "47", "μM", "of", "SMER28", "added", "in", "the", "switch", "-", "off", "period", ".", "A53T", "α", "-", "syn", "levels", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "antibody", "against", "HA", "(", "left", ")", "and", "densitometry", "analysis", "relative", "to", "actin", "(", "right", ")", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "=", "0", ".", "0917", ",", "P", "=", "0", ".", "009", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", "(", "for", "increasing", "concentrations", "of", "SMER10", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0068", ",", "P", "=", "0", ".", "0023", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", "(", "for", "increasing", "concentrations", "of", "SMER18", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0016", ",", "P", "0", ".", "0001", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "for", "increasing", "concentrations", "of", "SMER28", ")", ".", "(", "c", ")", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "construct", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "(", "Rap", ")", ",", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", "for", "48", "h", ",", "and", "we", "assessed", "the", "proportions", "of", "apoptotic", "or", "aggregate", "-", "containing", "transfected", "cells", ".", "Error", "bars", ":", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "P", "0", ".", "0001", "(", "Rap", "and", "SMER28", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "013", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "019", "(", "SMER18", ")", "(", "aggregation", ")", ";", "P", "0", ".", "0001", "(", "Rap", ",", "SMER18", "and", "SMER28", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "004", "(", "SMER10", ")", "(", "cell", "death", ")", ".", "(", "d", ")", "Wild", "-", "type", "(", "Atg5", "+", "/", "+", ")", "and", "knockout", "(", "Atg5", "−", "/", "−", ")", "Atg5", "MEFs", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", "for", "24", "h", ",", "and", "we", "assessed", "the", "percentages", "of", "aggregate", "-", "containing", "transfected", "cells", ".", "The", "control", "(", "DMSO", "-", "treated", ")", "values", "were", "fixed", "at", "1", "for", "both", "cell", "lines", ".", "Error", "bars", ":", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "P", "=", "0", ".", "039", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "and", "SMER28", ")", "(", "in", "Atg5", "+", "/", "+", "cells", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "092", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "271", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "358", "(", "SMER28", ")", "(", "in", "Atg5", "−", "/", "−", "cells", ")", ".", "Note", "that", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregation", "was", "higher", "in", "Atg5", "−", "/", "−", "than", "in", "Atg5", "+", "/", "+", "cells", "(", "Supplementary", "Fig", ".", "3a", ")", ".", "e", ")", "The", "percentages", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "as", "in", "c", ",", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "10", "μM", "lactacystin", "(", "proteasome", "inhibitor", ")", "or", "both", "10", "μM", "lactacystin", "along", "with", "either", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", "for", "48", "h", ",", "expressed", "as", "odds", "ratios", ".", "Error", "bars", ":", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "P", "0", ".", "0001", "(", "control", "versus", "Lact", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "014", "(", "SMER10", "versus", "Lact", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "versus", "Lact", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "001", "(", "SMER28", "versus", "Lact", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(b) A53T α-synuclein (α-syn) expression was induced in stable PC12 cells for 48 h, then switched off for 24 h. Cells were treated with DMSO (control), or with 0.94 μM, 4.7 μM or 47 μM of SMER10; 0.86 μM, 4.3 μM or 43 μM of SMER18; or 0.9 μM, 4.7 μM or 47 μM of SMER28 added in the switch-off period. A53T α-syn levels were analyzed by immunoblotting with antibody against HA (left) and densitometry analysis relative to actin (right). Error bars denote s.e.m. P = 0.0917, P = 0.009, P = 0.0001 (for increasing concentrations of SMER10); P = 0.0068, P = 0.0023, P = 0.0002 (for increasing concentrations of SMER18); P = 0.0016, P 0.0001, P 0.0001 (for increasing concentrations of SMER28).(c) COS-7 cells transfected with EGFP-HDQ74 construct were treated with DMSO (control), 0.2 μM rapamycin (Rap), 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28 for 48 h, and we assessed the proportions of apoptotic or aggregate-containing transfected cells. Error bars: 95% confidence interval. P 0.0001 (Rap and SMER28), P = 0.013 (SMER10), P = 0.019 (SMER18) (aggregation); P 0.0001 (Rap, SMER18 and SMER28), P = 0.004 (SMER10) (cell death).(d) Wild-type (Atg5+/+) and knockout (Atg5−/−) Atg5 MEFs were transfected with EGFP-HDQ74 and treated with DMSO (control), 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28 for 24 h, and we assessed the percentages of aggregate-containing transfected cells. The control (DMSO-treated) values were fixed at 1 for both cell lines. Error bars: 95% confidence interval. P = 0.039 (SMER10), P 0.0001 (SMER18 and SMER28) (in Atg5+/+ cells); P = 0.092 (SMER10), P = 0.271 (SMER18), P = 0.358 (SMER28) (in Atg5−/− cells). Note that EGFP-HDQ74 aggregation was higher in Atg5−/− than in Atg5+/+ cells (Supplementary Fig. 3a).e) The percentages of EGFP-positive COS-7 cells with EGFP-HDQ74 aggregates as in c, treated with DMSO (control), 10 μM lactacystin (proteasome inhibitor) or both 10 μM lactacystin along with either 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28 for 48 h, expressed as odds ratios. Error bars: 95% confidence interval. P 0.0001 (control versus Lact), P = 0.014 (SMER10 versus Lact), P 0.0001 (SMER18 versus Lact), P = 0.001 (SMER28 versus Lact). ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "LC3", "construct", "for", "4", "h", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "(", "positive", "control", ")", ",", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", "for", "16", "h", ",", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "The", "effects", "of", "treatment", "on", "the", "percentage", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", ">", "5", "EGFP", "-", "LC3", "vesicles", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "0", ".", "0001", "(", "all", "SMERs", ")", ".", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "LC3", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", "for", "24", "h", ".", "Confocal", "sections", "show", "cells", "containing", "EGFP", "-", "positive", "autophagic", "vesicles", ".", "Nuclei", "are", "stained", "with", "DAPI", ".", "Bar", ",", "20", "μM", ".", "(", "c", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "LC3", "were", "treated", "for", "4", "h", "with", "DMSO", "(", "control", ")", "or", "200", "nM", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ")", ",", "or", "with", "200", "nM", "bafilomycin", "A1", "and", "47", "μM", "SMER10", ",", "43", "μM", "SMER18", "or", "47", "μM", "SMER28", ".", "Cells", "were", "left", "untreated", "or", "pretreated", "with", "SMERs", "for", "24", "h", "before", "adding", "bafilomycin", "A1", ".", "Levels", "of", "EGFP", "-", "LC3", "-", "II", "were", "determined", "by", "immunoblotting", "with", "antibody", "against", "EGFP", "(", "above", ")", "and", "densitometry", "analysis", "relative", "to", "actin", "(", "below", ")", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "=", "0", ".", "0259", "(", "baf", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0003", "(", "SMER18", "and", "SMER28", ")", "versus", "control", ";", "P", "=", "0", ".", "0025", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0218", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0195", "(", "SMER28", ")", "versus", "bafilomycin", "A1", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) COS-7 cells transfected with EGFP-LC3 construct for 4 h were treated with DMSO (control), 0.2 μM rapamycin (positive control), 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28 for 16 h, and analyzed by fluorescence microscopy. The effects of treatment on the percentage of EGFP-positive cells with >5 EGFP-LC3 vesicles are shown. Error bars denote s.e.m. P 0.0001 (all SMERs).(b) HeLa cells stably expressing EGFP-LC3 were treated with DMSO (control), 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28 for 24 h. Confocal sections show cells containing EGFP-positive autophagic vesicles. Nuclei are stained with DAPI. Bar, 20 μM.(c) HeLa cells stably expressing EGFP-LC3 were treated for 4 h with DMSO (control) or 200 nM bafilomycin A1 (Baf), or with 200 nM bafilomycin A1 and 47 μM SMER10, 43 μM SMER18 or 47 μM SMER28. Cells were left untreated or pretreated with SMERs for 24 h before adding bafilomycin A1. Levels of EGFP-LC3-II were determined by immunoblotting with antibody against EGFP (above) and densitometry analysis relative to actin (below). Error bars denote s.e.m. P = 0.0259 (baf), P 0.0001 (SMER10), P = 0.0003 (SMER18 and SMER28) versus control; P = 0.0025 (SMER10), P = 0.0218 (SMER18), P = 0.0195 (SMER28) versus bafilomycin A1. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05."}
{"words": ["figf3", "(", "a", "-", "c", ")", "Flies", "treated", "with", "100", "μM", "SMER10", "(", "a", ")", ",", "200", "μM", "SMER18", "(", "b", ")", "or", "100", "μM", "SMER28", "(", "c", ")", "show", "a", "shift", "in", "the", "distribution", "of", "the", "number", "of", "rhabdomeres", "compared", "with", "flies", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", "alone", "(", "2", "d", "after", "eclosion", ")", ".", "Rhabdomere", "counts", "from", "all", "three", "independent", "experiments", "are", "included", ".", "n", "=", "600", "ommatidia", "(", "SMER10", ")", ",", "n", "=", "1", ",", "500", "ommatidia", "(", "SMER18", ")", "and", "n", "=", "600", "ommatidia", "(", "SMER28", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "values", "P", "0", ".", "0001", "(", "all", "SMERs", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "1", "-", "tailed", ")", "P", "=", "0", ".", "005", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "004", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "03", "(", "SMER28", ")", "comparing", "means", "of", "distributions", "from", "independent", "experiments", ".", "These", "SMER", "concentrations", "cause", "no", "overt", "toxicity", "to", "flies", "(", "see", "Supplementary", "Methods", ")", ".", "Distributions", "of", "DMSO", "-", "treated", "flies", "may", "vary", "when", "SMERs", "are", "treated", "in", "different", "experiments", "at", "different", "times", ".", "For", "instance", ",", "an", "individual", "experiment", "may", "have", "lasted", "slightly", "longer", "or", "shorter", "and", "photoreceptor", "degeneration", "is", "progressive", "and", "time", "-", "dependent", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a-c) Flies treated with 100 μM SMER10 (a), 200 μM SMER18 (b) or 100 μM SMER28 (c) show a shift in the distribution of the number of rhabdomeres compared with flies treated with DMSO (control) alone (2 d after eclosion). Rhabdomere counts from all three independent experiments are included. n = 600 ommatidia (SMER10), n = 1,500 ommatidia (SMER18) and n = 600 ommatidia (SMER28). Mann-Whitney test values P 0.0001 (all SMERs). Student's t-test (1-tailed) P = 0.005 (SMER10), P = 0.004 (SMER18), P = 0.03 (SMER28) comparing means of distributions from independent experiments. These SMER concentrations cause no overt toxicity to flies (see Supplementary Methods). Distributions of DMSO-treated flies may vary when SMERs are treated in different experiments at different times. For instance, an individual experiment may have lasted slightly longer or shorter and photoreceptor degeneration is progressive and time-dependent."}
{"words": ["figf4", "(", "a", "-", "c", ")", "Clearance", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1b", "-", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "or", "with", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "alone", ",", "SMER", "alone", "(", "140", "μM", "SMER10", "(", "a", ")", ",", "43", "μM", "SMER18", "(", "b", ")", "or", "47", "μM", "SMER28", "(", "c", ")", ")", "or", "both", "for", "the", "8", "h", "switch", "-", "off", "period", "-", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "antibody", "against", "HA", "(", "above", ")", "and", "densitometry", "analysis", "relative", "to", "actin", "(", "below", ")", ".", "The", "concentration", "of", "rapamycin", "is", "saturating", "for", "its", "effect", "on", "the", "clearance", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "=", "0", ".", "0025", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0018", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER10", "+", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "Rap", "or", "SMER10", "versus", "SMER10", "+", "Rap", ")", "(", "a", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0069", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0498", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0038", "(", "Rap", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0007", "(", "SMER18", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", "(", "b", ")", ";", "P", "0", ".", "0001", "(", "Rap", ",", "SMER28", ",", "Rap", "versus", "SMER28", "+", "Rap", ",", "SMER28", "versus", "SMER28", "+", "Rap", ")", "(", "c", ")", ".", "(", "d", "-", "f", ")", "The", "percentage", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "(", "above", ")", "and", "cell", "death", "(", "below", ")", "in", "COS", "-", "7", "cells", ",", "as", "in", "Figure", "1c", "-", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "or", "with", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "alone", ",", "SMER", "alone", "(", "140", "μM", "SMER10", "(", "d", ")", ",", "43", "μM", "SMER18", "(", "e", ")", "or", "47", "μM", "SMER28", "(", "f", ")", ")", "or", "both", "for", "24", "h", "-", "were", "expressed", "as", "odds", "ratios", ".", "Error", "bars", ":", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "Aggregation", "(", "top", "panels", ")", ":", "P", "=", "0", ".", "248", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "217", "(", "SMER10", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER10", "+", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "001", "(", "Rap", "or", "SMER10", "versus", "SMER10", "+", "Rap", ")", "(", "d", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "248", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "543", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "008", "(", "Rap", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "SMER18", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", "(", "e", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "248", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "SMER28", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER28", "+", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "Rap", "versus", "SMER28", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "012", "(", "SMER28", "versus", "SMER28", "+", "Rap", ")", "(", "f", ")", ".", "Cell", "death", "(", "bottom", "panels", ")", ":", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER10", ",", "SMER10", "+", "Rap", ",", "Rap", "or", "SMER10", "versus", "SMER10", "+", "Rap", ")", "(", "d", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "948", "(", "SMER18", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "015", "(", "Rap", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", "versus", "SMER18", "+", "Rap", ")", "(", "e", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "Rap", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER28", ",", "SMER28", "+", "Rap", ",", "Rap", "or", "SMER28", "versus", "SMER28", "+", "Rap", ")", "(", "f", ")", ".", "Note", "that", "we", "have", "treated", "cells", "for", "a", "shorter", "time", "in", "this", "experiment", "(", "24", "h", ")", ",", "compared", "with", "Figure", "1c", "(", "48", "h", ")", ".", "This", "probably", "accounts", "for", "the", "failure", "of", "the", "protective", "trends", "of", "rapamycin", "and", "some", "of", "the", "SMERs", "to", "reach", "significance", "for", "aggregation", "on", "their", "own", "in", "some", "of", "the", "experiments", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a-c) Clearance of A53T α-synuclein in stable PC12 cells as in Figure 1b-treated with DMSO (control), or with 0.2 μM rapamycin alone, SMER alone (140 μM SMER10 (a), 43 μM SMER18 (b) or 47 μM SMER28 (c)) or both for the 8 h switch-off period-was analyzed by immunoblotting with antibody against HA (above) and densitometry analysis relative to actin (below). The concentration of rapamycin is saturating for its effect on the clearance of A53T α-synuclein. Error bars denote s.e.m. P = 0.0025 (Rap), P = 0.0018 (SMER10), P 0.0001 (SMER10 + Rap), P 0.0001 (Rap or SMER10 versus SMER10 + Rap) (a); P = 0.0069 (Rap), P = 0.0498 (SMER18), P 0.0001 (SMER18 + Rap), P = 0.0038 (Rap versus SMER18 + Rap), P = 0.0007 (SMER18 versus SMER18 + Rap) (b); P 0.0001 (Rap, SMER28, Rap versus SMER28 + Rap, SMER28 versus SMER28 + Rap) (c).(d-f) The percentage of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates (above) and cell death (below) in COS-7 cells, as in Figure 1c-treated with DMSO (control), or with 0.2 μM rapamycin alone, SMER alone (140 μM SMER10 (d), 43 μM SMER18 (e) or 47 μM SMER28 (f)) or both for 24 h-were expressed as odds ratios. Error bars: 95% confidence interval. Aggregation (top panels): P = 0.248 (Rap), P = 0.217 (SMER10), P 0.0001 (SMER10 + Rap), P 0.001 (Rap or SMER10 versus SMER10 + Rap) (d); P = 0.248 (Rap), P = 0.543 (SMER18), P 0.0001 (SMER18 + Rap), P = 0.008 (Rap versus SMER18 + Rap), P = 0.002 (SMER18 versus SMER18 + Rap) (e); P = 0.248 (Rap), P = 0.002 (SMER28), P 0.0001 (SMER28 + Rap), P 0.0001 (Rap versus SMER28 + Rap), P = 0.012 (SMER28 versus SMER28 + Rap) (f). Cell death (bottom panels): P = 0.002 (Rap), P 0.0001 (SMER10, SMER10 + Rap, Rap or SMER10 versus SMER10 + Rap) (d); P = 0.002 (Rap), P = 0.948 (SMER18), P 0.0001 (SMER18 + Rap), P = 0.015 (Rap versus SMER18 + Rap), P 0.0001 (SMER18 versus SMER18 + Rap) (e); P = 0.002 (Rap), P 0.0001 (SMER28, SMER28 + Rap, Rap or SMER28 versus SMER28 + Rap) (f). Note that we have treated cells for a shorter time in this experiment (24 h), compared with Figure 1c (48 h). This probably accounts for the failure of the protective trends of rapamycin and some of the SMERs to reach significance for aggregation on their own in some of the experiments. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf5", "(", "a", "-", "c", ")", "Clearance", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1b", "-", "treated", "for", "24", "h", "with", "either", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "or", "with", "47", "μM", "SMER10", "and", "its", "analogs", "(", "SMER10a", "-", "c", ")", "(", "a", ")", ",", "43", "μM", "SMER18", "and", "its", "analogs", "(", "SMER18a", "-", "l", ")", "(", "b", ")", ",", "or", "47", "μM", "SMER28", "and", "its", "analogs", "(", "SMER28a", "-", "k", ")", "(", "c", ")", "-", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "(", "above", ")", "and", "densitometry", "analysis", "relative", "to", "actin", "(", "below", ")", ".", "All", "the", "analogs", "were", "used", "in", "the", "cell", "culture", "medium", "at", "1", ":", "400", "dilution", "of", "5", "mg", "ml", "−", "1", "stock", "solution", "(", "in", "DMSO", ")", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "P", "=", "0", ".", "0058", "(", "SMER10a", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "6736", "(", "SMER10b", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "9507", "(", "SMER10c", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0481", "(", "SMER10", ")", "(", "a", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0006", "(", "SMER18a", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0249", "(", "SMER18b", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0167", "(", "SMER18c", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0117", "(", "SMER18d", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0269", "(", "SMER18e", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0165", "(", "SMER18f", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0148", "(", "SMER18g", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0011", "(", "SMER18h", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "7369", "(", "SMER18i", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0012", "(", "SMER18j", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "1531", "(", "SMER18k", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", "(", "SMER18l", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", "(", "SMER18", ")", "(", "b", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0014", "(", "SMER28a", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", "(", "SMER28b", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", "(", "SMER28d", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0048", "(", "SMER28h", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", "(", "SMER28i", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0162", "(", "SMER28j", ")", ",", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER28c", ",", "SMER28e", "-", "g", ",", "SMER28k", ",", "SMER28", ")", "(", "c", ")", ".", "(", "d", "-", "f", ")", "The", "percentage", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "in", "COS", "-", "7", "cells", "as", "in", "Figure", "1c", "-", "treated", "for", "48", "h", "with", "either", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "or", "with", "47", "μM", "SMER10", "and", "its", "analog", "(", "SMER10a", ")", "(", "d", ")", ",", "43", "μM", "SMER18", "and", "its", "analogs", "(", "SMER18a", ",", "SMER18c", "-", "h", ",", "SMER18j", ",", "SMER18l", ")", "(", "e", ")", ",", "or", "47", "μM", "SMER28", "and", "its", "analogs", "(", "SMER28a", "-", "k", ")", "(", "f", ")", "-", "were", "expressed", "as", "odds", "ratios", ".", "All", "the", "analogs", "were", "used", "in", "the", "cell", "culture", "medium", "at", "1", ":", "400", "dilution", "of", "5", "mg", "ml", "−", "1", "stock", "solution", "(", "in", "DMSO", ")", ".", "Error", "bars", ":", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "P", "=", "0", ".", "003", "(", "SMER10a", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "004", "(", "SMER10", ")", "(", "d", ")", ";", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER18a", ",", "SMER18c", ",", "SMER18d", ",", "SMER18f", ",", "SMER18h", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "009", "(", "SMER18e", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "001", "(", "SMER18g", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "382", "(", "SMER18j", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "067", "(", "SMER18l", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "031", "(", "SMER18", ")", "(", "e", ")", ";", "P", "0", ".", "0001", "(", "SMER28a", ",", "SMER28c", ",", "SMER28e", "-", "g", ",", "SMER28i", "-", "k", ",", "SMER28", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "574", "(", "SMER28b", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "041", "(", "SMER28d", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "SMER28h", ")", "(", "f", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a-c) Clearance of A53T α-synuclein in stable PC12 cells as in Figure 1b-treated for 24 h with either DMSO (control), or with 47 μM SMER10 and its analogs (SMER10a-c) (a), 43 μM SMER18 and its analogs (SMER18a-l) (b), or 47 μM SMER28 and its analogs (SMER28a-k) (c)-was analyzed by immunoblotting with anti-HA antibody (above) and densitometry analysis relative to actin (below). All the analogs were used in the cell culture medium at 1:400 dilution of 5 mg ml−1 stock solution (in DMSO). Error bars denote s.e.m. P = 0.0058 (SMER10a), P = 0.6736 (SMER10b), P = 0.9507 (SMER10c), P = 0.0481 (SMER10) (a); P = 0.0006 (SMER18a), P = 0.0249 (SMER18b), P = 0.0167 (SMER18c), P = 0.0117 (SMER18d), P = 0.0269 (SMER18e), P = 0.0165 (SMER18f), P = 0.0148 (SMER18g), P = 0.0011 (SMER18h), P = 0.7369 (SMER18i), P = 0.0012 (SMER18j), P = 0.1531 (SMER18k), P = 0.0006 (SMER18l), P = 0.0001 (SMER18) (b); P = 0.0014 (SMER28a), P = 0.0002 (SMER28b), P = 0.0001 (SMER28d), P = 0.0048 (SMER28h), P = 0.0002 (SMER28i), P = 0.0162 (SMER28j), P 0.0001 (SMER28c, SMER28e-g, SMER28k, SMER28) (c).(d-f) The percentage of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates in COS-7 cells as in Figure 1c-treated for 48 h with either DMSO (control), or with 47 μM SMER10 and its analog (SMER10a) (d), 43 μM SMER18 and its analogs (SMER18a, SMER18c-h, SMER18j, SMER18l) (e), or 47 μM SMER28 and its analogs (SMER28a-k) (f)-were expressed as odds ratios. All the analogs were used in the cell culture medium at 1:400 dilution of 5 mg ml−1 stock solution (in DMSO). Error bars: 95% confidence interval. P = 0.003 (SMER10a), P = 0.004 (SMER10) (d); P 0.0001 (SMER18a, SMER18c, SMER18d, SMER18f, SMER18h), P = 0.009 (SMER18e), P = 0.001 (SMER18g), P = 0.382 (SMER18j), P = 0.067 (SMER18l), P = 0.031 (SMER18) (e); P 0.0001 (SMER28a, SMER28c, SMER28e-g, SMER28i-k, SMER28), P = 0.574 (SMER28b), P = 0.041 (SMER28d), P = 0.002 (SMER28h) (f). ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "validation", "of", "mintbody", "specificity", ".", "Mouse", "MC12", "cells", ",", "which", "stably", "express", "H3K27me3", "-", "mintbody", "(", "sfGFP", ")", ",", "are", "labelled", "with", "antibodies", "specific", "for", "H3K27me3", "(", "Cy5", ")", "and", "H3K9me3", "(", "Cy3", ")", ".", "DNA", "is", "stained", "with", "Hoechst33342", ".", "Single", "confocal", "sections", "are", "shown", ".", "Arrows", "mark", "Xi", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Immunofluorescence (IF) validation of mintbody specificity. Mouse MC12 cells, which stably express H3K27me3-mintbody (sfGFP), are labelled with antibodies specific for H3K27me3 (Cy5) and H3K9me3 (Cy3). DNA is stained with Hoechst33342. Single confocal sections are shown. Arrows mark Xi. Scale bar = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "ESCs", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "engineered", "to", "express", "H3K27me3", "-", "mintbody", "(", "SNAP", "/", "JF646", ")", "and", "H4K20me1", "-", "mintbody", "(", "mCherry", ")", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "the", "absence", "of", "LIF", "for", "2", "days", ".", "Time", "-", "lapse", "images", "for", "12", "z", "-", "plane", "confocal", "stack", "were", "acquired", "every", "1", "h", ".", "Maximum", "intensity", "projection", "images", "are", "shown", "with", "elapse", "time", "(", "hh", ":", "mm", ")", ".", "Arrowheads", "mark", "Xi", ".", "Scale", "bar", "=", "10"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) ESCs as in (B) were engineered to express H3K27me3-mintbody (SNAP/JF646) and H4K20me1-mintbody (mCherry). Cells were cultured in the absence of LIF for 2 days. Time-lapse images for 12 z-plane confocal stack were acquired every 1 h. Maximum intensity projection images are shown with elapse time (hh:mm). Arrowheads mark Xi. Scale bar = 10 μm"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "H4K20me1", "(", "blue", ")", "and", "H3K27me3", "(", "red", ")", "accumulation", "across", "the", "Xi", "after", "12", "h", "of", "DOX", "treatment", ".", "The", "black", "line", "is", "a", "locally", "estimated", "scatterplot", "smoothing", "(", "LOESS", ")", "regression", "on", "all", "10", "-", "kb", "windows", "(", "dots", ")", ".", "Below", "each", "plot", "shown", "is", "the", "Xist", "locus", "(", "green", "bar", ")", "and", "Xist", "entry", "sites", "(", "black", "bars", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) H4K20me1 (blue) and H3K27me3 (red) accumulation across the Xi after 12 h of DOX treatment. The black line is a locally estimated scatterplot smoothing (LOESS) regression on all 10-kb windows (dots). Below each plot shown is the Xist locus (green bar) and Xist entry sites (black bars)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Genome", "browser", "tracks", "showing", "H3K27me3", "(", "top", ")", "and", "H4K20me1", "(", "bottom", ")", "accumulation", "at", "a", "gene", "silenced", "rapidly", "(", "Rnf12", ")", "or", "more", "slowly", "(", "Pgk1", ")", ".", "Allele", "-", "specific", "tracks", "were", "overlaid", "(", "B6", "in", "red", "and", "Cast", "in", "blue", ")", ".", "Note", "strong", "H4K20me1", "bi", "-", "allelic", "pre", "-", "marking", "at", "gene", "bodies", ".", "(", "B", ")", "Average", "H3K27me3", "(", "top", ")", "and", "H4K20me1", "(", "bottom", ")", "enrichment", "at", "the", "B6", "allele", "over", "initially", "active", "or", "inactive", "genes", "±", "30kb", "at", "the", "X", "chromosome", ".", "Shown", "is", "data", "for", "all", "time", "points", ".", "Data", "information", ":", "TSS", ":", "transcription", "start", "site", ";", "TES", ":", "transcript", "end", "site", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Genome browser tracks showing H3K27me3 (top) and H4K20me1 (bottom) accumulation at a gene silenced rapidly (Rnf12) or more slowly (Pgk1). Allele-specific tracks were overlaid (B6 in red and Cast in blue). Note strong H4K20me1 bi-allelic pre-marking at gene bodies.(B) Average H3K27me3 (top) and H4K20me1 (bottom) enrichment at the B6 allele over initially active or inactive genes ± 30kb at the X chromosome. Shown is data for all time points. Data information: TSS : transcription start site ; TES : transcript end site."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Representative", "image", "of", "IF", "/", "RNA", "FISH", "for", "Xist", "RNA", "and", "H4K20me1", "in", "cells", "expressing", "XistFL", "or", "XistΔBC", ".", "Arrowheads", "point", "to", "the", "Xist", "RNA", "domains", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Graph", "represents", "the", "mean", "%", "+", "/", "-", "StDev", "of", "Xist", "RNA", "domains", "enriched", "for", "H4K20me1", "(", "left", ")", "or", "H3K27me3", "(", "right", ")", "in", "cells", "expressing", "XistWT", "or", "XistΔBC", ".", "Shown", "are", "averages", "from", "at", "least", "2", "independent", "experiments", ";", "minimum", "of", "50", "Xist", "RNA", "domains", "were", "counted", "per", "experiment", ";", "only", "P", "-", "values", "corresponding", "to", "significant", "differences", "from", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "mutants", "to", "Xist", "FL", "are", "indicated", "as", "*", "(", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "for", "H3K27me3", "was", "extracted", "from", "published", "data", "(", "Bousard", "et", "al", ".", ",", "2019", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Representative image of IF/RNA FISH for Xist RNA and H4K20me1 in cells expressing XistFL or XistΔBC. Arrowheads point to the Xist RNA domains. Scale bar = 5 μm.(C) Graph represents the mean % +/- StDev of Xist RNA domains enriched for H4K20me1 (left) or H3K27me3 (right) in cells expressing XistWT or XistΔBC. Shown are averages from at least 2 independent experiments; minimum of 50 Xist RNA domains were counted per experiment; only P-values corresponding to significant differences from unpaired Student's t-test comparing mutants to Xist FL are indicated as * (P-value < 0.05). Data for H3K27me3 was extracted from published data (Bousard et al., 2019)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "mkk1", "mkk2", "and", "summ3", "-", "1", "mkk1", "mkk2", "plants", ".", "Photos", "were", "taken", "on", "three", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", ".", "(", "B", ")", "Trypan", "Blue", "staining", "of", "cell", "death", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "C", ")", "DAB", "staining", "of", "H2O2", "accumulation", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Expression", "of", "PR1", "(", "D", ")", "and", "PR2", "(", "E", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", "as", "determined", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "expression", "levels", "of", "ACTIN1", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "and", "Tukey", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Morphological phenotypes of Wild type (WT), mkk1 mkk2 and summ3-1 mkk1 mkk2 plants. Photos were taken on three-week-old soil-grown plants.(B) Trypan Blue staining of cell death in the indicated genotypes.(C) DAB staining of H2O2 accumulation in the indicated genotypes.(D-E) Expression of PR1 (D) and PR2 (E) in the indicated genotypes as determined by quantitative RT-PCR. Values were normalized to the expression levels of ACTIN1. The data are shown as mean ± SD (n=3) with one-way ANOVA analysis and Tukey test (P < 0.01). Different letters indicate significant differences. The experiments were repeated three times with similar results."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "WT", ",", "summ3", "-", "17", ",", "mekk1", "-", "1", "and", "summ3", "-", "17", "mekk1", "-", "1", "plants", "grown", "on", "soil", "for", "three", "weeks", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Expression", "levels", "of", "PR1", "(", "B", ")", "and", "PR2", "(", "C", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", "as", "determined", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "expression", "levels", "of", "ACTIN1", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "and", "Tukey", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "Two", "-", "week", "-", "old", "seedlings", "grown", "on", "half", "MS", "plates", "were", "used", "for", "assays", "in", "(", "B", ")", "-", "(", "C", ")", ".", "(", "D", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "WT", ",", "mpk4", "-", "3", ",", "summ3", "-", "1", "mpk4", "-", "3", "and", "summ3", "-", "2", "mpk4", "-", "3", "plants", ".", "Photos", "were", "taken", "on", "three", "-", "week", "-", "old", "soil", "grown", "plants", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Expression", "levels", "of", "PR1", "(", "E", ")", "and", "PR2", "(", "F", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", "as", "determined", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "expression", "levels", "of", "ACTIN1", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "and", "Tukey", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "Two", "-", "week", "-", "old", "seedlings", "grown", "on", "half", "MS", "plates", "were", "used", "for", "assays", "in", "(", "E", ")", "-", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Morphological phenotypes of WT, summ3-17, mekk1-1 and summ3-17 mekk1-1 plants grown on soil for three weeks.(B-C) Expression levels of PR1 (B) and PR2 (C) in the indicated genotypes as determined by quantitative RT-PCR. Values were normalized to the expression levels of ACTIN1. The data are shown as mean ± SD (n=3) with one-way ANOVA analysis and Tukey test (P < 0.01). Different letters indicate significant differences. The experiments were repeated three times with similar results. Two-week-old seedlings grown on half MS plates were used for assays in (B)-(C).(D) Morphological phenotypes of WT, mpk4-3, summ3-1 mpk4-3 and summ3-2 mpk4-3 plants. Photos were taken on three-week-old soil grown plants.(E-F) Expression levels of PR1 (E) and PR2 (F) in the indicated genotypes as determined by quantitative RT-PCR. Values were normalized to the expression levels of ACTIN1. The data are shown as mean ± SD (n=3) with one-way ANOVA analysis and Tukey test (P < 0.01). Different letters indicate significant differences. The experiments were repeated three times with similar results. Two-week-old seedlings grown on half MS plates were used for assays in (E)-(F)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "transgenic", "plants", "over", "-", "expressing", "MEKK2", "-", "FLAG", "protein", "in", "WT", "and", "summ3", "-", "17", "background", ".", "Line", "1", "and", "2", "express", "MEKK2", "-", "FLAG", "in", "WT", "background", ".", "Line", "3", "-", "5", "express", "MEKK2", "-", "FLAG", "in", "the", "summ3", "-", "17", "mutant", "background", ".", "The", "photograph", "shows", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "grown", "plants", ".", "Expression", "of", "MEKK2", "-", "FLAG", "was", "detected", "by", "western", "blot", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Trypan", "Blue", "staining", "of", "cell", "death", "(", "B", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "DAB", "staining", "of", "H2O2", "accumulation", "(", "C", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Expression", "levels", "of", "PR1", "(", "D", ")", "and", "PR2", "(", "E", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", "as", "determined", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "expression", "levels", "of", "ACTIN1", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "and", "Tukey", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Morphological phenotypes of transgenic plants over-expressing MEKK2-FLAG protein in WT and summ3-17 background. Line 1 and 2 express MEKK2-FLAG in WT background. Line 3-5 express MEKK2-FLAG in the summ3-17 mutant background. The photograph shows four-week-old soil grown plants. Expression of MEKK2-FLAG was detected by western blot using an anti-FLAG antibody.(B-C) Trypan Blue staining of cell death (B) in the indicated genotypes.(B-C) DAB staining of H2O2 accumulation (C) in the indicated genotypes.(D-E) Expression levels of PR1 (D) and PR2 (E) in the indicated genotypes as determined by quantitative RT-PCR. Values were normalized to the expression levels of ACTIN1. The data are shown as mean ± SD (n=3) with one-way ANOVA analysis and Tukey test (P < 0.01). Different letters indicate significant differences. The experiments were repeated three times with similar results."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "luciferase", "activity", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "expressing", "CRCK3NLuc", "and", "MPK4CLuc", "or", "MPK6CLuc", ".", "Data", "were", "collected", "three", "days", "after", "infiltration", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "8", ")", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "and", "Tukey", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", ".", "(", "B", ")", "Phosphorylation", "of", "CRCK3G390R", "by", "MPK4", ".", "MPK4", "was", "immunoprecipitated", "from", "wild", "type", "or", "MPK4", ":", ":", "MPK4", "-", "FLAG", ".", "After", "incubation", "with", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "and", "the", "immunoprecipitated", "MPK4", "-", "FLAG", "protein", "in", "protein", "kinase", "buffer", ",", "CRCK3G390R", "was", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "autoradiograph", "of", "the", "gel", "is", "shown", "in", "the", "top", "panel", ",", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "MPK4", "-", "FLAG", "levels", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "Myelin", "basic", "protein", "(", "MBP", ")", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "This", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "CRCK3", "-", "FLAG", "proteins", "in", "wild", "type", "and", "mpk4", "-", "3", ".", "Total", "protein", "was", "extracted", "from", "two", "-", "week", "-", "old", "CRCK3", "-", "FLAG", "transgenic", "plants", "in", "WT", "and", "mpk4", "background", "grown", "on", "½", "MS", "medium", "plates", ".", "The", "protein", "extracts", "were", "treated", "with", "or", "without", "λ", "-", "PMPase", "phosphatase", ".", "The", "proteins", "were", "separated", "by", "Phos", "-", "tagTM", "acrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "CRCK", "-", "FLAG", "proteins", "were", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "pCRCK3", ",", "phosphorylated", "CRCK3", "-", "FLAG", "protein", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "CRCK3", "-", "FLAG", "and", "CRCK35S", "-", "5A", "-", "FLAG", "proteins", "in", "transgenic", "plants", "of", "wild", "type", "background", ".", "Total", "protein", "was", "extracted", "from", "two", "-", "week", "-", "old", "plants", "grown", "on", "½", "MS", "medium", "plates", ".", "The", "protein", "extracts", "were", "treated", "with", "or", "without", "λ", "-", "PMPase", "phosphatase", ".", "The", "proteins", "were", "separated", "by", "Phos", "-", "tagTM", "acrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "the", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "were", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "5S", "-", "5A", "stands", "for", "a", "change", "in", "five", "amino", "acids", "(", "S172A", ",", "S181A", ",", "S188A", ",", "S195A", ",", "S202A", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Quantification of luciferase activity in N. benthamiana leaves expressing CRCK3NLuc and MPK4CLuc or MPK6CLuc. Data were collected three days after infiltration. The data are shown as mean ± SD (n=8) with one-way ANOVA analysis and Tukey test (P < 0.01). Different letters indicate significant differences. The experiments were repeated twice with similar results.(B) Phosphorylation of CRCK3G390R by MPK4. MPK4 was immunoprecipitated from wild type or MPK4::MPK4-FLAG. After incubation with [γ-32P] ATP and the immunoprecipitated MPK4-FLAG protein in protein kinase buffer, CRCK3G390R was separated by SDS-PAGE. The autoradiograph of the gel is shown in the top panel, and immunoblot analysis of MPK4-FLAG levels is shown in the bottom panel. Myelin basic protein (MBP) was used as a positive control. This experiment was repeated three times with similar results.(C) Western blot analysis of CRCK3-FLAG proteins in wild type and mpk4-3. Total protein was extracted from two-week-old CRCK3-FLAG transgenic plants in WT and mpk4 background grown on ½ MS medium plates. The protein extracts were treated with or without λ-PMPase phosphatase. The proteins were separated by Phos-tagTM acrylamide gel electrophoresis and CRCK-FLAG proteins were detected by western blot analysis using an anti-FLAG antibody. Similar results were obtained in two independent experiments. pCRCK3, phosphorylated CRCK3-FLAG protein.(D) Western blot analysis of CRCK3-FLAG and CRCK35S-5A-FLAG proteins in transgenic plants of wild type background. Total protein was extracted from two-week-old plants grown on ½ MS medium plates. The protein extracts were treated with or without λ-PMPase phosphatase. The proteins were separated by Phos-tagTM acrylamide gel electrophoresis and the FLAG-tagged proteins were detected by western blot analysis using an anti-FLAG antibody. Similar results were obtained in two independent experiments. 5S-5A stands for a change in five amino acids (S172A, S181A, S188A, S195A, S202A)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "In", "vivo", "pull", "-", "down", "of", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "by", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", ".", "FLAG", "-", "tagged", "full", "-", "length", "or", "truncated", "CRCK3", "and", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "proteins", "were", "transiently", "expressed", "in", "N", ".", "bethamiana", "by", "agro", "-", "infiltration", ".", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "conjugated", "beads", "(", "Sigma", ")", "and", "detected", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "protein", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", "was", "detected", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "In", "vivo", "pull", "-", "down", "of", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "by", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", "kinase", "domain", ".", "KD", "represents", "a", "truncation", "of", "SUMM3", "with", "only", "the", "kinase", "domain", "(", "amino", "acid", "201", "-", "510", ")", ".", "FLAG", "-", "tagged", "full", "-", "length", "or", "truncated", "CRCK3", "and", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "proteins", "were", "transiently", "expressed", "in", "N", ".", "bethamiana", "by", "agro", "-", "infiltration", ".", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "conjugated", "beads", "(", "Sigma", ")", "and", "detected", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "HA", "-", "tagged", "SUMM2", "protein", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "FLAG", "-", "tagged", "CRCK3", "was", "detected", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) In vivo pull-down of HA-tagged SUMM2 by FLAG-tagged CRCK3.FLAG-tagged full-length or truncated CRCK3 and HA-tagged SUMM2 proteins were transiently expressed in N. bethamiana by agro-infiltration. FLAG-tagged CRCK3 proteins were immunoprecipitated with anti-FLAG conjugated beads (Sigma) and detected by Western blot using anti-FLAG antibody. HA-tagged SUMM2 protein co-immunoprecipitated with FLAG-tagged CRCK3 was detected by Western blot using anti-HA antibody. Similar results were obtained in two independent experiments.(B) In vivo pull-down of HA-tagged SUMM2 by FLAG-tagged CRCK3 kinase domain. KD represents a truncation of SUMM3 with only the kinase domain (amino acid 201-510).FLAG-tagged full-length or truncated CRCK3 and HA-tagged SUMM2 proteins were transiently expressed in N. bethamiana by agro-infiltration. FLAG-tagged CRCK3 proteins were immunoprecipitated with anti-FLAG conjugated beads (Sigma) and detected by Western blot using anti-FLAG antibody. HA-tagged SUMM2 protein co-immunoprecipitated with FLAG-tagged CRCK3 was detected by Western blot using anti-HA antibody. Similar results were obtained in two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "transcripts", "following", "1", "μM", "T0901317", "stimulation", "of", "LXR", "+", "/", "+", "and", "LXR", "−", "/", "−", "primary", "BMMs", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "LXR", "+", "/", "+", "0", "h", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "8", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", "at", "8", "h", "and", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "00004", "at", "16", "h", "versus", "LXR", "−", "/", "−", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", "at", "0", "h", "versus", "LXR", "+", "/", "+", ")", ";", "bottom", ",", "proposed", "model", "explaining", "the", "ligand", "‐", "dependent", "induction", "of", "Abca1", ".", "Following", "ligand", "stimulation", ",", "LXR", "-", "corepressor", "complexes", "are", "exchanged", "for", "LXR", "-", "coactivator", "complexes", ",", "which", "promote", "gene", "expression", ".", "The", "LXR", "-", "cofactor", "interactions", "responsible", "for", "the", "attenuation", "of", "expression", "beginning", "after", "16", "h", "remain", "unknown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1RT-qPCR of Abca1 transcripts following 1 μM T0901317 stimulation of LXR+/+ and LXR−/− primary BMMs. Fold changes are shown relative to LXR+/+ 0 h. Error bars represent ± SEM for n = 4-8 (**P = 0.001 at 8 h and **P = 0.00004 at 16 h versus LXR−/−; **P = 0.0003 at 0 h versus LXR+/+); bottom, proposed model explaining the ligand‐dependent induction of Abca1. Following ligand stimulation, LXR-corepressor complexes are exchanged for LXR-coactivator complexes, which promote gene expression. The LXR-cofactor interactions responsible for the attenuation of expression beginning after 16 h remain unknown."}
{"words": ["Figure", "2Luciferase", "reporter", "assays", "from", "RAW", "264", ".", "7", "macrophages", "expressing", "reporter", "alone", ",", "or", "together", "with", "full", "‐", "length", "SND1", ",", "SART1", ",", "or", "HMBOX1", ".", "LXR", "ligand", "stimulations", "with", "1", "μM", "T0901317", "were", "performed", "for", "18", "h", ".", "A", "diagram", "of", "the", "reporter", "construct", "is", "shown", "above", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "vehicle", "‐", "stimulated", "reporter", "alone", "(", "first", "lane", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "9", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "011", "for", "SND1", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "046", "for", "SART1", ")", ".", "Luciferase", "reporter", "assays", "from", "RAW", "264", ".", "7", "macrophages", "expressing", "reporter", "alone", ",", "or", "together", "with", "full", "‐", "length", "NCOA5", "or", "an", "NCOA5", "mutant", "lacking", "the", "NH2", "‐", "terminus", ".", "LXR", "ligand", "stimulations", "with", "1", "μM", "T0901317", "were", "performed", "for", "18", "h", ".", "Diagrams", "of", "the", "reporter", "constructs", "are", "shown", "above", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "vehicle", "‐", "stimulated", "reporter", "alone", "(", "first", "lane", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "6", "-", "12", "(", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "035", ")", ".", "RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "transcripts", "following", "infection", "of", "primary", "BMMs", "with", "Ncoa5", "or", "control", "retrovirus", ".", "LXR", "ligand", "stimulations", "were", "performed", "with", "1", "μM", "T0901317", "for", "18", "h", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "vehicle", "‐", "stimulated", "control", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "029", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Luciferase reporter assays from RAW 264.7 macrophages expressing reporter alone, or together with full‐length SND1, SART1, or HMBOX1. LXR ligand stimulations with 1 μM T0901317 were performed for 18 h. A diagram of the reporter construct is shown above. Fold changes are shown relative to vehicle‐stimulated reporter alone (first lane). Error bars represent ± SEM for n = 9 (**P = 0.001, *P = 0.011 for SND1, *P = 0.046 for SART1).Luciferase reporter assays from RAW 264.7 macrophages expressing reporter alone, or together with full‐length NCOA5 or an NCOA5 mutant lacking the NH2‐terminus. LXR ligand stimulations with 1 μM T0901317 were performed for 18 h. Diagrams of the reporter constructs are shown above. Fold changes are shown relative to vehicle‐stimulated reporter alone (first lane). Error bars represent ± SEM for n = 6-12 (**P 0.001, *P = 0.035).RT-qPCR of Abca1 transcripts following infection of primary BMMs with Ncoa5 or control retrovirus. LXR ligand stimulations were performed with 1 μM T0901317 for 18 h. Fold changes are shown relative to vehicle‐stimulated control. Error bars represent ± SEM for n = 4 (*P = 0.029)."}
{"words": ["Figure", "3In", "vitro", "pulldown", "assays", "using", "recombinant", "GST", "‐", "LXRα", "to", "isolate", "the", "indicated", "in", "vitro", "translated", "NCOA5", "constructs", ".", "Assays", "were", "performed", "for", "2", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "2", "μM", "T0901317", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "as", "indicated", ".", "Note", "the", "requirement", "of", "the", "NCOA5", "NH2", "‐", "terminus", "for", "interacting", "with", "LXRα", ".", "Immunoprecipitation", "of", "Protein", "C", "‐", "tagged", "LXRα", "from", "stable", "RAW", "264", ".", "7macrophagenuclear", "extracts", "stimulated", "with", "1", "μM", "T0901317", "or", "vehicle", "control", "for", "18", "h", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "for", "endogenous", "NCOA5", "or", "over", "‐", "expressed", "LXRα", ".", "Protein", "immunoblots", "of", "nuclear", "extracts", "are", "shown", "below", ".", "NCOA5", "ChIP", "time", "course", "from", "primary", "BMMs", "stimulated", "with", "1", "μM", "T0901317", "or", "vehicle", "control", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "proximal", "LXRE", ".", "Note", "the", "ligand", "‐", "stimulated", "association", "of", "NCOA5", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "9", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "02", ")", ".", "NCOA5", "ChIP", "assays", "from", "LXR", "−", "/", "−", "BMMs", "stimulated", "with", "1", "μM", "T0901317", "or", "vehicle", "control", "for", "18", "h", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "proximal", "LXRE", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "5", "-", "6", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", "for", "vehicle", "and", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "002", "for", "T0901317", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3In vitro pulldown assays using recombinant GST‐LXRα to isolate the indicated in vitro translated NCOA5 constructs. Assays were performed for 2 h in the presence or absence of 2 μM T0901317. Samples were immunoblotted as indicated. Note the requirement of the NCOA5 NH2‐terminus for interacting with LXRα.Immunoprecipitation of Protein C‐tagged LXRα from stable RAW 264.7macrophagenuclear extracts stimulated with 1 μM T0901317 or vehicle control for 18 h, followed by immunoblotting for endogenous NCOA5 or over‐expressed LXRα. Protein immunoblots of nuclear extracts are shown below.NCOA5 ChIP time course from primary BMMs stimulated with 1 μM T0901317 or vehicle control. qPCR was performed for the Abca1 proximal LXRE. Note the ligand‐stimulated association of NCOA5. Error bars represent ± SEM for n = 4-9 (*P = 0.02).NCOA5 ChIP assays from LXR−/− BMMs stimulated with 1 μM T0901317 or vehicle control for 18 h. qPCR was performed for the Abca1 proximal LXRE. Error bars represent ± SEM for n = 5-6 (**P = 0.0003 for vehicle and **P = 0.002 for T0901317)."}
{"words": ["Figure", "4RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "expression", "following", "1", "μM", "T0901317", "treatment", "in", "primary", "BMMs", "infected", "with", "a", "non", "‐", "silencing", "or", "Ncoa5", "‐", "specific", "shRNA", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "shControl", "0", "h", ".", "Note", "the", "elevated", "Abca1", "expression", "at", "24", "-", "30", "h", "following", "loss", "of", "NCOA5", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", "at", "24", "h", "and", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "004", "at", "30", "h", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "02", ")", ".", "Quantification", "of", "ABCA1", "immunoblots", "from", "primary", "BMMs", "infected", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S7E", ".", "LXR", "ligand", "stimulation", "with", "1", "μM", "T0901317", "or", "vehicle", "control", "was", "performed", "for", "8", "h", "or", "30", "h", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "2", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "007", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4RT-qPCR of Abca1 expression following 1 μM T0901317 treatment in primary BMMs infected with a non‐silencing or Ncoa5‐specific shRNA. Fold changes are shown relative to shControl 0 h. Note the elevated Abca1 expression at 24-30 h following loss of NCOA5. Error bars represent ± SEM for n = 4-6 (**P = 0.0007 at 24 h and **P = 0.004 at 30 h, *P = 0.02).Quantification of ABCA1 immunoblots from primary BMMs infected as in (A). Representative immunoblot is shown in Supplementary Fig S7E. LXR ligand stimulation with 1 μM T0901317 or vehicle control was performed for 8 h or 30 h. Error bars represent ± SEM for n = 2 (**P = 0.007)."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "expression", "from", "primary", "BMMs", "infected", "with", "non", "‐", "silencing", "or", "Ncoa5", "‐", "specific", "shRNAs", ".", "Ligand", "stimulations", "were", "performed", "for", "4", "h", "with", "vehicle", "control", ",", "1", "μM", "T0901317", "alone", "or", "together", "with", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", "(", "A", ")", "or", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "(", "B", ")", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "vehicle", "‐", "stimulated", "shControl", ".", "Note", "only", "the", "loss", "of", "TLR3", "‐", "mediated", "repression", "following", "Ncoa5", "silencing", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "10", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", "for", "A", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", "for", "shControl", "in", "B", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", "for", "shNcoa5", "in", "B", "versus", "T0901317", ")", ".", "C", ",", "D", "RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "expression", "from", "primary", "BMMs", "infected", "with", "non", "‐", "silencing", "or", "Ncoa5", "‐", "specific", "shRNAs", ".", "Ligand", "stimulations", "were", "performed", "for", "4", "h", "unstimulated", ",", "or", "with", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", "(", "C", ")", "or", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "(", "D", ")", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "unstimulated", "shControl", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", "for", "C", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "00000001", "for", "shControl", "in", "D", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000001", "for", "shNcoa5", "in", "D", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "013", "versus", "T0901317", ")", ".", "E", "NCOA5", "ChIP", "assays", "from", "primary", "BMMs", "stimulated", "for", "3", "h", "with", "1", "μM", "T0901317", ",", "1", "μM", "T0901317", "+", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", ",", "or", "vehicle", "control", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "proximal", "LXRE", ".", "Note", "the", "increased", "occupancy", "only", "in", "the", "presence", "of", "both", "lipid", "and", "inflammatory", "ligands", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "8", "-", "12", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", "versus", "T0901317", ")", ".", "F", "NCOA5", "ChIP", "assays", "from", "primary", "BMMs", "stimulated", "for", "3", "h", "with", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", "or", "left", "unstimulated", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "proximal", "LXRE", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "5", "-", "6", ".", "G", "Cholesterol", "efflux", "assays", "to", "APOA1", "from", "primary", "BMMs", "infected", "with", "non", "‐", "silencing", "or", "Ncoa5", "‐", "specific", "shRNAs", ".", "Agonist", "stimulations", "were", "performed", "for", "6", "h", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "3", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "02", "versus", "T0901317", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B RT-qPCR of Abca1 expression from primary BMMs infected with non‐silencing or Ncoa5‐specific shRNAs. Ligand stimulations were performed for 4 h with vehicle control, 1 μM T0901317 alone or together with 6 μg/ml PolyIC (A) or 10 ng/ml LPS (B). Fold changes are shown relative to vehicle‐stimulated shControl. Note only the loss of TLR3‐mediated repression following Ncoa5 silencing. Error bars represent ± SEM for n = 4-10 (**P = 0.0003 for A, **P = 0.0004 for shControl in B, **P = 0.0002 for shNcoa5 in B versus T0901317).C, D RT-qPCR of Abca1 expression from primary BMMs infected with non‐silencing or Ncoa5‐specific shRNAs. Ligand stimulations were performed for 4 h unstimulated, or with 6 μg/ml PolyIC (C) or 10 ng/ml LPS (D). Fold changes are shown relative to unstimulated shControl. Error bars represent ± SEM for n = 4-6 (**P = 0.0006 for C, **P = 0.00000001 for shControl in D, **P = 0.000001 for shNcoa5 in D, *P = 0.013 versus T0901317).E NCOA5 ChIP assays from primary BMMs stimulated for 3 h with 1 μM T0901317, 1 μM T0901317 + 6 μg/ml PolyIC, or vehicle control. qPCR was performed for the Abca1 proximal LXRE. Note the increased occupancy only in the presence of both lipid and inflammatory ligands. Error bars represent ± SEM for n = 8-12 (**P = 0.0007 versus T0901317).F NCOA5 ChIP assays from primary BMMs stimulated for 3 h with 6 μg/ml PolyIC or left unstimulated. qPCR was performed for the Abca1 proximal LXRE. Error bars represent ± SEM for n = 5-6.G Cholesterol efflux assays to APOA1 from primary BMMs infected with non‐silencing or Ncoa5‐specific shRNAs. Agonist stimulations were performed for 6 h. Error bars represent ± SEM for n = 3 (*P = 0.02 versus T0901317)."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "Unmodified", "/", "pSer5", "RNAPII", "(", "A", ")", "or", "RNAPII", "pSer2", "(", "B", ")", "ChIP", "assays", "from", "primary", "BMMs", "stimulated", "for", "4", "h", "with", "1", "μM", "T0901317", ",", "1", "μM", "T0901317", "+", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", ",", "or", "vehicle", "control", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "TSS", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "6", "-", "9", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", "in", "A", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "002", "in", "B", "versus", "T0901317", ")", ".", "C", ",", "D", "RNAPII", "ChIP", "assays", "as", "in", "(", "A", ",", "B", ")", "but", "performed", "from", "LXR", "−", "/", "−", "BMMs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "5", "-", "9", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000000001", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "02", "versus", "T0901317", ")", ".", "E", "RT", "-", "qPCR", "of", "Abca1", "expression", "from", "LXR", "+", "/", "+", "versus", "LXR", "−", "/", "−", "BMMs", ".", "Ligand", "stimulations", "were", "performed", "for", "4", "h", "with", "vehicle", "control", ",", "1", "μM", "T0901317", ",", "or", "1", "μM", "T0901317", "together", "with", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", ".", "Fold", "changes", "are", "shown", "relative", "to", "vehicle", "‐", "stimulated", "LXR", "+", "/", "+", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "004", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "012", "versus", "T0901317", ")", ".", "F", "RNAPII", "pSer2", "ChIP", "assays", "from", "primary", "BMMs", "infected", "with", "non", "‐", "silencing", "or", "Ncoa5", "‐", "specific", "shRNAs", ".", "Ligand", "stimulations", "were", "performed", "for", "4", "h", "with", "vehicle", "control", ",", "1", "μM", "T0901317", ",", "or", "1", "μM", "T0901317", "+", "6", "μg", "/", "ml", "PolyIC", ".", "qPCR", "was", "performed", "for", "the", "Abca1", "TSS", ".", "Note", "RNAPII", "pSer2", "returns", "to", "baseline", "occupancy", "following", "TLR3", "stimulation", "in", "shControl", "but", "not", "shNcoa5", "BMMs", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "004", "versus", "baseline", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "SEM", "for", "n", "=", "3", "from", "11", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B Unmodified/pSer5 RNAPII (A) or RNAPII pSer2 (B) ChIP assays from primary BMMs stimulated for 4 h with 1 μM T0901317, 1 μM T0901317 + 6 μg/ml PolyIC, or vehicle control. qPCR was performed for the Abca1 TSS. Error bars represent ± SEM for n = 6-9 (**P = 0.0001 in A, **P = 0.002 in B versus T0901317).C, D RNAPII ChIP assays as in (A, B) but performed from LXR−/− BMMs. Error bars represent ± SEM for n = 5-9 (**P = 0.000000001, *P = 0.02 versus T0901317).E RT-qPCR of Abca1 expression from LXR+/+ versus LXR−/− BMMs. Ligand stimulations were performed for 4 h with vehicle control, 1 μM T0901317, or 1 μM T0901317 together with 6 μg/ml PolyIC. Fold changes are shown relative to vehicle‐stimulated LXR+/+. Error bars represent ± SEM for n = 4 (**P = 0.004, *P = 0.012 versus T0901317).F RNAPII pSer2 ChIP assays from primary BMMs infected with non‐silencing or Ncoa5‐specific shRNAs. Ligand stimulations were performed for 4 h with vehicle control, 1 μM T0901317, or 1 μM T0901317 + 6 μg/ml PolyIC. qPCR was performed for the Abca1 TSS. Note RNAPII pSer2 returns to baseline occupancy following TLR3 stimulation in shControl but not shNcoa5 BMMs (**P = 0.004 versus baseline). Error bars represent ± SEM for n = 3 from 11 mice."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Schematic", "of", "experimental", "setup", "depicting", "MECs", "grown", "as", "monolayers", "on", "a", "rigid", "rBM", "(", "two", "-", "dimensional", "culture", "model", ",", "2D", ";", "top", "left", ")", "or", "within", "a", "compliant", "rBM", "to", "generate", "multicellular", "spheroid", "structures", "with", "apical", "-", "basal", "polarity", "(", "three", "-", "dimensional", "culture", "model", ",", "3D", ")", "top", "right", ")", ".", "Heatmap", "of", "microarray", "analysis", "of", "gene", "expression", "in", "HMT", "-", "3522", "S", "-", "1", "MECs", "cultured", "either", "as", "a", "2D", "monolayer", "or", "as", "spheroids", "(", "Bottom", ")", ".", "Expression", "of", "the", "top", "200", "differentially", "expressed", "genes", "between", "the", "two", "experimental", "conditions", "(", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ";", "R", "=", "replicate", ")", ".", "(", "C", ")", "Samples", "were", "stained", "with", "antibodies", "for", "β4", "-", "integrin", "or", "laminin", "(", "green", ";", "yellow", "arrows", ")", ".", "The", "actin", "and", "nucleus", "were", "counterstained", "with", "phalloidin", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "HMT", "-", "3522", "S", "-", "1", "MECs", "plated", "as", "monolayers", "on", "a", "rigid", "rBM", "(", "2D", ")", "or", "as", "spheroids", "within", "rBM", "(", "3D", ")", "were", "treated", "with", "increasing", "doses", "of", "Paclitaxel", "(", "Pac", ")", ",", "TRAIL", ",", "Doxorubicin", "(", "Doxo", ")", "and", "irradiation", "(", "IR", ")", ".", "Percent", "cell", "death", "was", "quantified", "by", "immunofluorescence", "as", "percentage", "of", "cells", "stained", "positive", "for", "cleaved", "caspase", "-", "3", "at", "48h", "post", "-", "treatment", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "MCF10A", "MECs", "plated", "in", "the", "indicated", "conditions", "for", "18h", "and", "stained", "with", "phalloidin", "to", "reveal", "F", "-", "actin", "organization", ".", "Cells", "were", "plated", "as", "single", "cells", "on", "rigid", "glass", "coverslips", "(", "2D", "glass", ";", "top", "left", ")", "or", "fully", "embedded", "within", "rBM", "(", "3D", "fully", "embedded", ";", "bottom", "left", ")", ".", "Cell", "spreading", "was", "inhibited", "by", "plating", "cells", "on", "either", "laminin", "-", "111", "conjugated", ",", "10", "-", "μm", "micropatterned", "glass", "(", "2D", "/", "micropatterned", ",", "rigid", "substrate", ";", "top", "middle", ")", "or", "on", "compliant", "75", "Pa", "rBM", "-", "laminated", "polyacrylamide", "(", "PA", ")", "gels", "(", "2D", "/", "PA", ",", "soft", "substrate", ";", "top", "right", ")", ".", "The", "single", "2D", "cells", "were", "overlaid", "with", "either", "purified", "laminin", "-", "111", "(", "bottom", "middle", ")", "or", "rBM", "(", "bottom", "right", ")", "to", "create", "a", "3D", "ECM", "microenvironment", ".", "Images", "show", "maximum", "intensity", "z", "-", "projections", "of", "confocal", "stacks", "for", "F", "-", "actin", "phalloidin", "staining", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μ", "(", "G", ")", "Representative", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "MCF10A", "MECs", "stably", "expressing", "recombinant", "mCherry", "-", "tagged", "golgi", "marker", "(", "mCherry", "-", "GalT", ";", "red", ";", "yellow", "arrows", ")", "ligated", "with", "rBM", "in", "either", "2D", "or", "3D", "for", "18h", ".", "The", "actin", "cortex", "and", "nucleus", "were", "counterstained", "with", "phalloidin", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "respectively", ".", "Images", "show", "the", "cross", "-", "sectional", "view", "of", "each", "cell", "compartment", "(", "dashed", "lines", ";", "xy", "plane", ")", "and", "side", "view", "of", "confocal", "stacks", "(", "xz", "plane", ")", "in", "individual", "MCF10A", "MECs", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "H", ")", "Golgi", "staining", "was", "assessed", "within", "non", "-", "spread", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "for", "18h", "and", "values", "were", "plotted", "as", "a", "function", "of", "subcellular", "localization", "(", "2D", ",", "n", "=", "8", ";", "3D", ",", "n", "=", "9", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "I", ")", "Heatmap", "of", "RNA", "-", "seq", "experiment", "from", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "12h", "post", "-", "plating", ".", "Data", "show", "the", "expression", "of", "the", "top", "200", "genes", "that", "are", "differentially", "expressed", "between", "the", "2D", "and", "3D", "rBM", "conditions", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Schematic of experimental setup depicting MECs grown as monolayers on a rigid rBM (two-dimensional culture model, 2D; top left) or within a compliant rBM to generate multicellular spheroid structures with apical-basal polarity (three-dimensional culture model, 3D) top right). Heatmap of microarray analysis of gene expression in HMT-3522 S-1 MECs cultured either as a 2D monolayer or as spheroids (Bottom). Expression of the top 200 differentially expressed genes between the two experimental conditions (n=3 independent biological replicates; R=replicate).(C) Samples were stained with antibodies for β4-integrin or laminin (green; yellow arrows). The actin and nucleus were counterstained with phalloidin (red) and DAPI (blue), respectively. Scale bar, 10 μm.(D) HMT-3522 S-1 MECs plated as monolayers on a rigid rBM (2D) or as spheroids within rBM (3D) were treated with increasing doses of Paclitaxel (Pac), TRAIL, Doxorubicin (Doxo) and irradiation (IR). Percent cell death was quantified by immunofluorescence as percentage of cells stained positive for cleaved caspase-3 at 48h post-treatment (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). ****P < 0.0001 (Student's t test).(F) Representative immunofluorescence microscopy images of MCF10A MECs plated in the indicated conditions for 18h and stained with phalloidin to reveal F-actin organization. Cells were plated as single cells on rigid glass coverslips (2D glass; top left) or fully embedded within rBM (3D fully embedded; bottom left). Cell spreading was inhibited by plating cells on either laminin-111 conjugated, 10-μm micropatterned glass (2D/micropatterned, rigid substrate; top middle) or on compliant 75 Pa rBM-laminated polyacrylamide (PA) gels (2D/PA, soft substrate; top right). The single 2D cells were overlaid with either purified laminin-111 (bottom middle) or rBM (bottom right) to create a 3D ECM microenvironment. Images show maximum intensity z-projections of confocal stacks for F-actin phalloidin staining. Scale bar, 10 μ(G) Representative immunofluorescence microscopy images of MCF10A MECs stably expressing recombinant mCherry-tagged golgi marker (mCherry-GalT; red; yellow arrows) ligated with rBM in either 2D or 3D for 18h. The actin cortex and nucleus were counterstained with phalloidin (green) and DAPI (blue), respectively. Images show the cross-sectional view of each cell compartment (dashed lines; xy plane) and side view of confocal stacks (xz plane) in individual MCF10A MECs. Scale bar, 10 μm. (H) Golgi staining was assessed within non-spread MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D for 18h and values were plotted as a function of subcellular localization (2D, n=8; 3D, n=9 cells from two independent experiments).(I) Heatmap of RNA-seq experiment from MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D 12h post-plating. Data show the expression of the top 200 genes that are differentially expressed between the 2D and 3D rBM conditions. (n=3 independent biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Bar", "graph", "showing", "qPCR", "quantification", "of", "SEC61B", "level", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "12h", "post", "-", "plating", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ",", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0022", ".", "(", "B", ")", "MCF10A", "MECs", "expressing", "VSVGts045", "-", "EGFP", "were", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "and", "incubated", "at", "40", "°", "C", "for", "16h", "to", "trap", "VSVGts045", "-", "EGFP", "protein", "in", "the", "ER", ".", "Cells", "were", "shifted", "to", "32", "°", "C", "for", "2h", "to", "release", "VSVGts045", "-", "EGFP", "into", "the", "secretory", "pathway", ".", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "MECs", "expressing", "VSVGts045", "-", "EGFP", "2h", "post", "incubation", "at", "32", "°", "C", ".", "Scale", "bar", "(", "whole", "cell", ")", ",", "10", "μm", ";", "Scale", "bar", "(", "magnified", ")", ",", "2", "μm", ".", "(", "C", ")", "Scatter", "plot", "of", "the", "secretory", "trafficking", "efficiency", "of", "VSVGts045", "-", "EGFP", "based", "on", "the", "fluorescence", "of", "VSVGts045", "at", "the", "plasma", "membrane", "versus", "total", "fluorescence", "measured", "in", "cells", "from", "Panel", "B", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "45", ";", "3D", ",", "n", "=", "49", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "line", "graph", "showing", "the", "changes", "in", "cytosolic", "[", "Ca2", "+", "]", "levels", "of", "MCF10A", "MECs", "under", "different", "treatment", ".", "Fura", "-", "2", "-", "loaded", "MECs", "ligated", "to", "2D", "(", "blue", ")", "or", "3D", "rBM", "(", "red", ")", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "EGTA", "to", "chelate", "extracellular", "Ca2", "+", "in", "the", "bath", "solution", ",", "challenged", "with", "2μM", "thapsigargin", "to", "induce", "ER", "Ca2", "+", "release", ",", "and", "replenished", "with", "4", "mM", "Ca2", "+", "in", "bath", "solution", "at", "the", "indicated", "time", ".", "F340", "/", "F380", "values", "for", "each", "cell", "were", "quantified", "over", "the", "course", "of", "imaging", "(", "mean", "±", "SD", ";", "2D", ",", "n", "=", "7", ";", "3D", ",", "n", "=", "7", "cells", "from", "one", "experiment", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "amplitude", "of", "the", "Ca2", "+", "response", "induced", "by", "thapsigargin", "(", "∆", "F", "=", "F", "-", "F0", ")", ",", "where", "F0", "is", "the", "basal", "fluorescence", "before", "thapsigargin", "treatment", "(", "mean", "±", "SEM", "(", "2D", ",", "n", "=", "20", ";", "3D", ",", "n", "=", "21", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0007", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Bar", "graph", "showing", "qPCR", "of", "the", "relative", "level", "of", "ATF3", "mRNA", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "12h", "post", "-", "plating", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ",", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0037", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "and", "corresponding", "quantification", "data", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "6", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0049", ".", "(", "H", ")", "Bar", "graph", "of", "qPCR", "data", "measuring", "the", "relative", "levels", "of", "CRACR2B", "mRNA", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "12h", "post", "-", "plating", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0371", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "the", "ER", "-", "plasma", "membrane", "contact", "site", "reporter", "GFP", "-", "MAPPER", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "18h", "post", "plating", ".", "Scale", "bar", "(", "whole", "cell", ")", ",", "10", "μm", ";", "Scale", "bar", "(", "magnified", ")", ",", "1", "μm", ".", "(", "J", ")", "Graph", "of", "the", "levels", "of", "GFP", "-", "MAPPER", "at", "the", "plasma", "membrane", "relative", "total", "cellular", "GFP", "-", "MAPPER", "fluorescence", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "in", "Panel", "I", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "52", ";", "3D", ",", "n", "=", "57", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0032", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Bar graph showing qPCR quantification of SEC61B level in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D 12h post-plating (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD, **P = 0.0022.(B) MCF10A MECs expressing VSVGts045-EGFP were ligated to rBM in 2D or 3D and incubated at 40°C for 16h to trap VSVGts045-EGFP protein in the ER. Cells were shifted to 32°C for 2h to release VSVGts045-EGFP into the secretory pathway. Representative fluorescence microscopy images of MECs expressing VSVGts045-EGFP 2h post incubation at 32°C. Scale bar (whole cell), 10 μm; Scale bar (magnified), 2 μm. (C) Scatter plot of the secretory trafficking efficiency of VSVGts045-EGFP based on the fluorescence of VSVGts045 at the plasma membrane versus total fluorescence measured in cells from Panel B (mean ± SEM; 2D, n=45; 3D, n=49 cells from three independent experiments). ****P < 0.0001 (Student's t test).(D) Representative line graph showing the changes in cytosolic [Ca2+] levels of MCF10A MECs under different treatment. Fura-2-loaded MECs ligated to 2D (blue) or 3D rBM (red) were pre-incubated with EGTA to chelate extracellular Ca2+ in the bath solution, challenged with 2μM thapsigargin to induce ER Ca2+ release, and replenished with 4 mM Ca2+ in bath solution at the indicated time. F340/F380 values for each cell were quantified over the course of imaging (mean ± SD; 2D, n=7; 3D, n=7 cells from one experiment). (E) Quantification of the amplitude of the Ca2+ response induced by thapsigargin (∆F=F-F0), where F0 is the basal fluorescence before thapsigargin treatment (mean ± SEM (2D, n=20; 3D, n=21 cells from three independent experiments). ***P = 0.0007 (Student's t test).(F) Bar graph showing qPCR of the relative level of ATF3 mRNA in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D 12h post-plating (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD, **P = 0.0037.(G) Representative immunoblots of phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MECs ligated to a rBM in 2D or 3D and corresponding quantification data (mean ± SEM; n=6 independent biological replicates). Statistical analysis by Student's t test, **P = 0.0049.(H) Bar graph of qPCR data measuring the relative levels of CRACR2B mRNA in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D 12h post-plating (mean ± SEM; n=4 independent biological replicates). *P = 0.0371 (Student's t test).(I) Representative fluorescence microscopy images of the ER-plasma membrane contact site reporter GFP-MAPPER in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D or 3D 18h post plating. Scale bar (whole cell), 10 μm; Scale bar (magnified), 1 μm. (J) Graph of the levels of GFP-MAPPER at the plasma membrane relative total cellular GFP-MAPPER fluorescence in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D or 3D in Panel I (mean ± SEM; 2D, n=52; 3D, n=57 cells from three independent experiments). **P = 0.0032 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "either", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "for", "18h", "and", "stained", "with", "antibody", "targeting", "filamin", "(", "green", ")", ".", "F", "-", "actin", "was", "counterstained", "with", "phalloidin", "(", "red", ")", ".", "Images", "show", "maximum", "intensity", "z", "-", "projections", "of", "xy", "confocal", "stacks", "(", "left", ")", "and", "middle", "focal", "plane", "of", "confocal", "stacks", "from", "MECs", "(", "right", ")", ".", "Yellow", "arrows", "indicate", "filamin", "aggregates", "in", "individual", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", ".", "Yellow", "blunt", "-", "end", "lines", "highlight", "the", "extent", "of", "filamin", "distribution", "away", "from", "the", "cell", "edge", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "expression", "level", "of", "filamin", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "for", "18h", "was", "assessed", "via", "immunoblot", "and", "quantified", "relative", "to", "actin", "loading", "control", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0008", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "MCF10A", "MECs", "co", "-", "expressing", "the", "ER", "-", "plasma", "membrane", "contact", "site", "reporter", "GFP", "-", "MAPPER", "and", "shRNA", "targeting", "filamin", "(", "FLMN", ")", "or", "luciferase", "(", "Luc", ")", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "for", "18h", ".", "Scale", "bar", "(", "whole", "cell", ")", ",", "10", "μm", ";", "Scale", "bar", "(", "magnified", ")", ",", "2", "μm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "GFP", "-", "MAPPER", "at", "the", "plasma", "membrane", "versus", "total", "cellular", "fluorescence", "in", "MCF10A", "MECs", "stably", "expressing", "an", "shRNA", "targeting", "filamin", "(", "FLMN", ")", "or", "luciferase", "(", "Luc", ")", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", "+", "shLuc", ",", "n", "=", "38", ";", "2D", "+", "shFLMN", ",", "n", "=", "39", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0021", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "filamin", ",", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MECs", "that", "express", "shRNA", "targeting", "filamin", "(", "shFLMN", ")", "or", "luciferase", "(", "shLuc", ")", "and", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "for", "18h", "and", "corresponding", "quantification", "data", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "2D", "-", "shLuc", "versus", "3D", "-", "shLuc", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0003", ".", "2D", "-", "shLuc", "versus", "2D", "-", "shFLMN", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0004", ".", "(", "F", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "relative", "levels", "of", "ATF3", "mRNA", "as", "measured", "by", "qPCR", "in", "MCF10A", "MECs", "expressing", "shRNA", "targeting", "filamin", "(", "shFLMN", ")", "or", "luciferase", "(", "shLuc", ")", "and", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "for", "18h", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "2D", "-", "shLuc", "versus", "3D", "-", "shLuc", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0005", ".", "2D", "-", "shLuc", "versus", "2D", "-", "shFLMN", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0359", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "filamin", ",", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "3D", "and", "treated", "with", "ethanol", "(", "mock", ")", "or", "doxycycline", "(", "FLMN", ")", "for", "18h", "to", "induce", "filamin", "expression", "and", "corresponding", "quantification", "data", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0018", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative immunofluorescence microscopy images of MCF10A MECs ligated with either a rBM in 2D or 3D for 18h and stained with antibody targeting filamin (green). F-actin was counterstained with phalloidin (red). Images show maximum intensity z-projections of xy confocal stacks (left) and middle focal plane of confocal stacks from MECs (right). Yellow arrows indicate filamin aggregates in individual MECs ligated to rBM in 2D. Yellow blunt-end lines highlight the extent of filamin distribution away from the cell edge. Scale bar, 10 μm.(B) The expression level of filamin in MCF10A MECs ligated to rBM in 2D and 3D for 18h was assessed via immunoblot and quantified relative to actin loading control (mean ± SEM; n=5 independent biological replicates). ***P = 0.0008 (Student's t test).(C) Representative fluorescence microscopy images of MCF10A MECs co-expressing the ER-plasma membrane contact site reporter GFP-MAPPER and shRNA targeting filamin (FLMN) or luciferase (Luc) ligated to rBM in 2D for 18h. Scale bar (whole cell), 10 μm; Scale bar (magnified), 2 μm.(D) Quantification of the levels of GFP-MAPPER at the plasma membrane versus total cellular fluorescence in MCF10A MECs stably expressing an shRNA targeting filamin (FLMN) or luciferase (Luc) ligated to rBM in 2D (mean ± SEM; 2D + shLuc, n=38; 2D + shFLMN , n=39 cells from three independent experiments). **P < 0.0021 (Student's t test).(E) Representative immunoblots of filamin, phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MECs that express shRNA targeting filamin (shFLMN) or luciferase (shLuc) and ligated to a rBM in 2D or 3D for 18h and corresponding quantification data (mean ± SEM; n=4 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. 2D-shLuc versus 3D-shLuc, ***P = 0.0003. 2D-shLuc versus 2D-shFLMN, ***P = 0.0004.(F) Bar graph of the relative levels of ATF3 mRNA as measured by qPCR in MCF10A MECs expressing shRNA targeting filamin (shFLMN) or luciferase (shLuc) and ligated with rBM in 2D or 3D for 18h (mean ± SEM; n=4 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. 2D-shLuc versus 3D-shLuc, ***P = 0.0005. 2D-shLuc versus 2D-shFLMN, *P = 0.0359.(G) Representative immunoblots of filamin, phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MECs ligated to rBM in 3D and treated with ethanol (mock) or doxycycline (FLMN) for 18h to induce filamin expression and corresponding quantification data (mean ± SEM; n=5 independent biological replicates). **P = 0.0018 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Schematic", "showing", "the", "principles", "behind", "Atomic", "Force", "Microscopy", "(", "AFM", ")", "(", "left", ")", ".", "A", "cantilever", "at", "the", "end", "of", "the", "microscope", "probe", "is", "deflected", "when", "it", "is", "in", "contact", "with", "the", "cell", "surface", ".", "Cell", "cortex", "-", "mediated", "resistance", "to", "indentation", "alters", "the", "path", "of", "the", "laser", "beam", "focused", "on", "the", "cantilever", "that", "is", "then", "reflected", "onto", "a", "photodetector", "to", "enable", "measurement", "of", "cellular", "cortical", "actin", "tension", ".", "AFM", "was", "used", "to", "measure", "the", "cortical", "actin", "tension", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "a", "laminin", "-", "111", "substrate", "in", "2D", "or", "3D", "(", "right", ")", "and", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "to", "reduce", "cortical", "actin", "tension", ",", "induced", "to", "overexpress", "filamin", "expression", "(", "FLMN", ")", ",", "or", "activated", "ROCK", "(", "ROCK", ")", "to", "increase", "cortical", "actin", "tension", ".", "MECs", "were", "indented", "using", "a", "2", "-", "µm", "beaded", "tip", "on", "the", "AFM", "cantilever", "and", "the", "Hertz", "model", "was", "used", "to", "fit", "each", "indentation", "curve", "to", "extract", "the", "Young", "'", "s", "modulus", "of", "the", "cell", "cortex", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "123", ";", "3D", ",", "n", "=", "184", ";", "3D", "+", "FLMN", ",", "n", "=", "83", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "66", ";", "3D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "65", ";", "3D", "+", "ROCK", ",", "n", "=", "212", ";", "n", "=", "AFM", "indentation", "from", ">", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "2D", "versus", "3D", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "3D", "versus", "3D", "+", "FLMN", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "3D", "versus", "3D", "+", "ROCK", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "2D", "versus", "2D", "+", "Bleb", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ".", "(", "B", ")", "Schematic", "of", "the", "principles", "behind", "traction", "force", "microscopy", "(", "left", ")", ".", "MECs", "are", "plated", "on", "compliant", "polyacrylamide", "gels", "containing", "100", "nm", "fluorescent", "beads", "(", "close", "to", "the", "cell", "-", "polyacrylamide", "gel", "interface", ")", ".", "Traction", "stresses", "are", "calculated", "based", "on", "the", "bead", "displacement", "induced", "by", "substrate", "deformation", "and", "relaxation", ".", "Quantification", "of", "the", "traction", "stresses", "in", "individual", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "for", "18h", "(", "right", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "139", ";", "3D", ",", "n", "=", "124", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "42", ";", "3D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "43", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "The", "background", "bead", "displacement", "was", "measured", "from", "gel", "areas", "that", "lacked", "ligated", "cells", "(", "n", "=", "8", "fields", "from", "one", "experiment", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Schematic", "of", "the", "principle", "of", "active", "microrheology", "(", "left", ")", ".", "MCF10A", "MECs", "endocytosed", "0", ".", "5", "μm", "polystyrene", "particles", ",", "which", "were", "trapped", "and", "oscillated", "using", "laser", "optical", "tweezers", "to", "measure", "the", "cytoplasmic", "modulus", ".", "The", "cytoplasmic", "modulus", "was", "measured", "for", "MECs", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "to", "reduce", "cortical", "actin", "tension", "(", "right", ")", ";", "individual", "modulus", "values", "were", "calculated", "based", "on", "the", "slope", "in", "the", "linear", "range", "of", "the", "normalized", "force", "-", "displacement", "curve", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "66", ";", "3D", ",", "n", "=", "69", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "46", ";", "3D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "60", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "2D", "versus", "3D", ",", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0028", ".", "2D", "versus", "2D", "+", "Bleb", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0182", ".", "(", "D", ")", "Schematic", "depicting", "strategy", "used", "to", "measure", "cortical", "tension", "using", "laser", "ablation", ".", "(", "Top", ")", "Cells", "with", "high", "cortical", "tension", "exhibit", "plasma", "membrane", "blebbing", "when", "cortical", "actin", "is", "severed", "by", "a", "pulsed", "laser", ",", "whereas", "cells", "with", "lower", "cortical", "tension", "do", "not", ".", "(", "Bottom", "left", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "laser", "ablation", "response", "of", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "(", "mean", "±", "SD", ";", "2D", ",", "n", "=", "35", ";", "3D", ",", "n", "=", "40", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "Bottom", "right", ")", "Bar", "graph", "showing", "the", "laser", "ablation", "response", "of", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", "and", "3D", "+", "Bleb", ")", "or", "expressing", "constitutively", "active", "ROCK", "(", "3D", "+", "ROCK", ")", "(", "mean", ";", "2D", ",", "n", "=", "14", ";", "3D", ",", "n", "=", "15", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "17", ";", "3D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "14", ";", "3D", "+", "ROCK", ",", "n", "=", "10", "cells", "from", "one", "experiment", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "fluorescence", "and", "brightfield", "images", "of", "bleb", "formation", "induced", "by", "laser", "ablation", "in", "MECs", "stably", "expressing", "LifeAct", "-", "RFP", ".", "Arrowhead", ":", "the", "site", "of", "laser", "ablation", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Schematic showing the principles behind Atomic Force Microscopy (AFM) (left). A cantilever at the end of the microscope probe is deflected when it is in contact with the cell surface. Cell cortex-mediated resistance to indentation alters the path of the laser beam focused on the cantilever that is then reflected onto a photodetector to enable measurement of cellular cortical actin tension. AFM was used to measure the cortical actin tension in MCF10A MECs ligated to a laminin-111 substrate in 2D or 3D (right) and treated with blebbistatin (Bleb) to reduce cortical actin tension, induced to overexpress filamin expression (FLMN), or activated ROCK (ROCK) to increase cortical actin tension. MECs were indented using a 2-µm beaded tip on the AFM cantilever and the Hertz model was used to fit each indentation curve to extract the Young's modulus of the cell cortex (mean ± SEM; 2D, n=123; 3D, n=184; 3D+FLMN, n=83; 2D+Bleb, n=66; 3D + Bleb, n= 65; 3D+ROCK, n=212; n=AFM indentation from >30 cells from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. 2D versus 3D, ****P < 0.0001; 3D versus 3D + FLMN, ****P < 0.0001; 3D versus 3D + ROCK, ****P < 0.0001; 2D versus 2D + Bleb, ***P=0.0004.(B) Schematic of the principles behind traction force microscopy (left). MECs are plated on compliant polyacrylamide gels containing 100 nm fluorescent beads (close to the cell-polyacrylamide gel interface). Traction stresses are calculated based on the bead displacement induced by substrate deformation and relaxation. Quantification of the traction stresses in individual MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and 3D and treated in the absence and presence of blebbistatin (Bleb) for 18h (right; mean ± SEM; 2D, n=139; 3D, n=124; 2D+Bleb, n=42; 3D + Bleb, n= 43 cells from three independent experiments). The background bead displacement was measured from gel areas that lacked ligated cells (n=8 fields from one experiment). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. ****P < 0.0001.(C) Schematic of the principle of active microrheology (left). MCF10A MECs endocytosed 0.5 μm polystyrene particles, which were trapped and oscillated using laser optical tweezers to measure the cytoplasmic modulus. The cytoplasmic modulus was measured for MECs ligated to a rBM in 2D or 3D and treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb) to reduce cortical actin tension (right); individual modulus values were calculated based on the slope in the linear range of the normalized force-displacement curve (mean ± SEM; 2D, n= 66; 3D, n=69; 2D+Bleb, n=46; 3D+Bleb, n=60 cells from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. 2D versus 3D, **P = 0.0028. 2D versus 2D + Bleb, *P = 0.0182.(D) Schematic depicting strategy used to measure cortical tension using laser ablation. (Top) Cells with high cortical tension exhibit plasma membrane blebbing when cortical actin is severed by a pulsed laser, whereas cells with lower cortical tension do not. (Bottom left) Bar graph of the laser ablation response of MCF10A MECs ligated to a rBM in 2D or 3D (mean ± SD; 2D, n= 35; 3D, n=40 cells from three independent experiments). (Bottom right) Bar graph showing the laser ablation response of MCF10A MECs ligated to a rBM in 2D or 3D and treated in the absence or presence of blebbistatin (2D+Bleb and 3D+Bleb) or expressing constitutively active ROCK (3D+ROCK) (mean; 2D, n= 14; 3D, n=15; 2D+Bleb, n=17; 3D+Bleb, n=14; 3D+ ROCK, n=10 cells from one experiment).(E) Representative fluorescence and brightfield images of bleb formation induced by laser ablation in MECs stably expressing LifeAct-RFP. Arrowhead: the site of laser ablation. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "line", "graph", "showing", "the", "changes", "in", "cytosolic", "[", "Ca2", "+", "]", "levels", "of", "MCF10A", "MECs", "in", "response", "to", "treatment", ".", "Fura", "-", "2", "-", "loaded", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "2D", ";", "blue", ")", "or", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ";", "red", ")", "and", "preincubated", "with", "EGTA", "to", "chelate", "extracellular", "Ca2", "+", "in", "the", "bath", "solution", ",", "challenged", "with", "2", "μM", "thapsigargin", "to", "induce", "ER", "Ca2", "+", "release", ",", "and", "replenished", "with", "4", "mM", "Ca2", "+", "in", "bath", "solution", "at", "the", "indicated", "times", ".", "F340", "/", "F380", "values", "for", "each", "cell", "were", "quantified", "over", "the", "course", "of", "imaging", "and", "plotted", "(", "mean", "±", "SD", ";", "2D", ",", "n", "=", "7", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "7", "cells", "from", "one", "experiment", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "amplitude", "of", "the", "Ca2", "+", "response", "(", "∆", "F", "=", "F", "-", "F0", ")", "induced", "by", "thapsigargin", ",", "where", "F0", "is", "the", "basal", "fluorescence", "before", "thapsigargin", "treatment", ".", "The", "data", "shown", "indicated", "mean", "±", "SEM", "(", "2D", ",", "n", "=", "13", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "12", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", ".", "Corresponding", "quantification", "data", "are", "shown", "at", "bottom", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "2D", "versus", "3D", ",", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0022", ".", "2D", "versus", "2D", "+", "Bleb", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0248", ".", "(", "D", ")", "Bar", "graph", "of", "qPCR", "data", "measuring", "the", "relative", "levels", "of", "ATF3", "mRNA", "in", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0158", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Graph", "of", "the", "levels", "of", "GFP", "-", "MAPPER", "at", "the", "plasma", "membrane", "relative", "total", "cellular", "GFP", "-", "MAPPER", "fluorescence", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "39", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "39", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0002", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Scatter", "plot", "of", "the", "number", "of", "proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "puncta", "within", "individual", "cells", "expressing", "myc", "-", "PERK", "that", "were", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", ",", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "for", "25h", "and", "stained", "with", "PLA", "antibody", "probes", "specific", "for", "endogenous", "filamin", "and", "myc", "-", "PERK", ".", "Representative", "images", "of", "PLA", "staining", "from", "these", "experiments", "can", "be", "found", "in", "Panel", "H", ".", "Background", "PLA", "signal", "was", "measured", "from", "cells", "stained", "in", "the", "absence", "of", "primary", "antibodies", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "47", ";", "3D", ",", "n", "=", "32", "cells", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "39", ";", "background", ",", "n", "=", "14", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "H", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "cells", "expressing", "myc", "-", "PERK", "that", "were", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", ",", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "for", "25h", "and", "stained", "with", "PLA", "antibody", "probes", "specific", "for", "endogenous", "filamin", "and", "myc", "-", "PERK", "(", "red", "puncta", ")", ".", "F", "-", "actin", "was", "stained", "with", "phalloidin", "(", "I", ")", "Representative", "line", "graph", "showing", "the", "changes", "in", "cytosolic", "[", "Ca2", "+", "]", "levels", "of", "MCF10A", "MECs", "in", "response", "to", "treatment", ".", "Fura", "-", "2", "-", "loaded", "MCF10A", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "expressing", "filamin", "repeats", "21", "-", "23", "(", "2D", "+", "FLMNIg21", "-", "Ig23", ")", "or", "vector", "control", "(", "2D", ")", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "EGTA", "to", "chelate", "extracellular", "Ca2", "+", "in", "the", "bath", "solution", ",", "challenged", "with", "2", "μM", "thapsigargin", "to", "induce", "ER", "Ca2", "+", "release", ",", "and", "replenished", "with", "4", "mM", "Ca2", "+", "in", "bath", "solution", "at", "the", "indicated", "time", ".", "F340", "/", "F380", "values", "of", "individual", "cells", "were", "quantified", "over", "the", "course", "of", "imaging", "(", "mean", "±", "SD", "(", "2D", ",", "n", "=", "8", ";", "2D", "+", "FLMNIg21", "-", "Ig23", ",", "n", "=", "7", "cells", "from", "one", "experiment", ")", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "amplitude", "of", "the", "Ca2", "+", "response", "(", "∆", "F", "=", "F", "-", "F0", ")", "induced", "by", "thapsigargin", ",", "where", "F0", "is", "the", "basal", "fluorescence", "before", "thapsigargin", "treatment", ".", "The", "data", "shown", "indicated", "mean", "±", "SEM", "(", "2D", ",", "n", "=", "21", ";", "2D", "+", "FLMNIg21", "-", "Ig23", ",", "n", "=", "19", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", "0", ".", "0001", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "K", ")", "Bar", "graph", "of", "qPCR", "data", "measuring", "the", "relative", "levels", "of", "ATF3", "mRNA", "in", "MCF10A", "MECs", "expressing", "luciferase", "control", "or", "filamin", "repeats", "21", "-", "23", "(", "FLMNIg21", "-", "Ig23", ")", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "for", "18h", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "032", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "L", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MECs", "expressing", "luciferase", "(", "control", ")", "or", "filamin", "repeats", "21", "-", "23", "(", "FLMNIg21", "-", "Ig23", "-", "myc", ")", "that", "were", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", ".", "Corresponding", "quantification", "data", "are", "shown", "at", "bottom", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0112", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative line graph showing the changes in cytosolic [Ca2+] levels of MCF10A MECs in response to treatment. Fura-2-loaded MECs ligated with rBM in 2D were treated with DMSO (2D; blue) or with blebbistatin (2D+Bleb; red) and preincubated with EGTA to chelate extracellular Ca2+ in the bath solution, challenged with 2 μM thapsigargin to induce ER Ca2+ release, and replenished with 4 mM Ca2+ in bath solution at the indicated times. F340/F380 values for each cell were quantified over the course of imaging and plotted (mean ± SD; 2D, n=7; 2D + Bleb, n=7 cells from one experiment). (B) Quantification of the amplitude of the Ca2+ response (∆F=F-F0) induced by thapsigargin, where F0 is the basal fluorescence before thapsigargin treatment. The data shown indicated mean ± SEM (2D, n=13; 2D + Bleb, n=12 cells from two independent experiments). ****P < 0.0001 (Student's t test).(C) Representative immunoblots of phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MECs ligated to a rBM in 2D or 3D and treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb). Corresponding quantification data are shown at bottom (mean ± SEM; n=4 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. 2D versus 3D, **P = 0.0022. 2D versus 2D + Bleb, *P = 0.0248.(D) Bar graph of qPCR data measuring the relative levels of ATF3 mRNA in MECs ligated with rBM in 2D and treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb) (mean ± SEM; n=4 independent biological replicates). *P = 0.0158 (Student's t test).(E) Graph of the levels of GFP-MAPPER at the plasma membrane relative total cellular GFP-MAPPER fluorescence in MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb) (mean ± SEM; 2D, n=39; 2D + Bleb, n=39 cells from three independent experiments). ***P = 0.0002 (Student's t test).(G) Scatter plot of the number of proximity ligation assay (PLA) puncta within individual cells expressing myc-PERK that were ligated to rBM in 2D or 3D, treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb) for 25h and stained with PLA antibody probes specific for endogenous filamin and myc-PERK. Representative images of PLA staining from these experiments can be found in Panel H. Background PLA signal was measured from cells stained in the absence of primary antibodies (mean ± SEM; 2D, n=47; 3D, n=32 cells; 2D + Bleb, n=39; background, n=14 cells from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. ****P < 0.0001.(H) Representative fluorescence microscopy images of cells expressing myc-PERK that were ligated to rBM in 2D or 3D, treated in the absence or presence of blebbistatin (Bleb) for 25h and stained with PLA antibody probes specific for endogenous filamin and myc-PERK (red puncta). F-actin was stained with phalloidin(I) Representative line graph showing the changes in cytosolic [Ca2+] levels of MCF10A MECs in response to treatment. Fura-2-loaded MCF10A MECs ligated with rBM in 2D and expressing filamin repeats 21-23 (2D+FLMNIg21-Ig23) or vector control (2D) were pre-incubated with EGTA to chelate extracellular Ca2+ in the bath solution, challenged with 2 μM thapsigargin to induce ER Ca2+ release, and replenished with 4 mM Ca2+ in bath solution at the indicated time. F340/F380 values of individual cells were quantified over the course of imaging (mean ± SD (2D, n=8; 2D + FLMNIg21-Ig23, n=7 cells from one experiment). (J) Quantification of the amplitude of the Ca2+ response (∆F=F-F0) induced by thapsigargin, where F0 is the basal fluorescence before thapsigargin treatment. The data shown indicated mean ± SEM (2D, n=21; 2D + FLMNIg21-Ig23, n=19 cells from three independent experiments). ****P < 0.0001 (Student's t test).(K) Bar graph of qPCR data measuring the relative levels of ATF3 mRNA in MCF10A MECs expressing luciferase control or filamin repeats 21-23 (FLMNIg21-Ig23) ligated with rBM in 2D for 18h (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). *P = 0.032 (Student's t test).(L) Representative immunoblots of phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MECs expressing luciferase (control) or filamin repeats 21-23 (FLMNIg21-Ig23-myc) that were ligated with rBM in 2D. Corresponding quantification data are shown at bottom (mean ± SEM; n=5 independent biological replicates). *P = 0.0112 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Bar", "graph", "of", "qPCR", "data", "measuring", "the", "levels", "of", "SEC61B", "mRNA", "in", "MECs", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "and", "treated", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0046", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "Change", "in", "the", "Helmholtz", "free", "energy", "of", "membrane", "protrusion", "assembly", "(", "∆", "F", ")", "as", "a", "function", "of", "cell", "membrane", "excess", "area", "(", "A", "/", "Ap", ")", ",", "which", "is", "the", "variable", "conjugate", "to", "the", "cortical", "actin", "tension", ".", "(", "D", ")", "Representative", "time", "-", "lapse", "confocal", "microscopy", "images", "of", "MECs", "stably", "expressing", "LifeAct", "-", "RFP", "that", "were", "ligated", "to", "a", "rBM", "in", "2D", "(", "2D", ")", "or", "3D", "(", "3D", ")", ".", "Time", "in", "seconds", "(", "s", ")", "is", "indicated", "in", "each", "inset", ";", "scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "Bar", "graph", "of", "protrusion", "length", "measurements", "in", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", ",", "3D", ",", "or", "in", "2D", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "139", ";", "3D", ",", "n", "=", "106", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "88", "protrusions", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "Bar", "graph", "of", "protrusion", "residence", "time", "measurements", "in", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "(", "2D", ")", ",", "3D", "(", "3D", ")", ",", "or", "in", "2D", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "30", ";", "3D", ",", "n", "=", "30", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "38", "protrusions", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "30", "-", "nm", "thick", "slice", "through", "a", "cellular", "tomogram", "focusing", "on", "protrusions", "emanating", "from", "a", "vitrified", "no", "-", "spread", "MECs", "cultured", "on", "a", "rBM", "in", "the", "absence", "(", "left", ",", "2D", ")", "or", "in", "the", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "right", ",", "2D", "+", "Bleb", ")", ".", "The", "position", "of", "the", "cell", "body", "is", "towards", "the", "upper", "right", "-", "hand", "corner", "(", "marked", "with", "white", "asterisk", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "nm", ".", "Note", ":", "under", "conditions", "of", "low", "cortical", "actin", "tension", "(", "blebbistatin", "treatment", ")", "the", "protrusions", "visualized", "in", "these", "MECs", "appeared", "to", "be", "highly", "interdigitated", "with", "sharp", "kinks", ",", "consistent", "with", "a", "compliant", "phenotype", ".", "By", "contrast", ",", "the", "protrusions", "observed", "in", "the", "2D", "samples", "(", "higher", "cortical", "actin", "tension", ")", "were", "predominantly", "straight", "and", "outwardly", "projected", ",", "suggesting", "they", "were", "stiffer", "than", "the", "protrusions", "formed", "in", "the", "MECs", "with", "lower", "cortical", "actin", "tension", "(", "e", ".", "g", ".", "blebbistatin", "treated", ")", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "membrane", "protrusion", "width", "in", "tomograms", "from", "non", "-", "spread", "MECs", "interacting", "with", "rBM", "treated", "with", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", "and", "without", "blebbistatin", "(", "2D", ")", ".", "n", ">", "2000", "protrusions", ".", "Statistical", "significance", "of", "differences", "between", "the", "distributions", "was", "assessed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "rank", "tests", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Bar graph of qPCR data measuring the levels of SEC61B mRNA in MECs ligated with rBM in 2D and treated in the absence and presence of blebbistatin (Bleb) (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). **P = 0.0046 (Student's t test).(B) Change in the Helmholtz free energy of membrane protrusion assembly (∆F) as a function of cell membrane excess area (A/Ap), which is the variable conjugate to the cortical actin tension.(D) Representative time-lapse confocal microscopy images of MECs stably expressing LifeAct-RFP that were ligated to a rBM in 2D (2D) or 3D (3D). Time in seconds (s) is indicated in each inset; scale bar, 10 μm.(E) Bar graph of protrusion length measurements in MECs ligated to rBM in 2D, 3D, or in 2D treated with blebbistatin (2D + Bleb) (mean ± SEM; 2D, n= 139; 3D, n=106; 2D + Bleb, n=88 protrusions from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. ****P < 0.0001. (F) Bar graph of protrusion residence time measurements in MECs ligated to rBM in 2D (2D), 3D (3D), or in 2D treated with blebbistatin (2D+ Bleb) (mean ± SEM; 2D, n= 30; 3D, n=30; 2D + Bleb, n=38 protrusions from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. ****P < 0.0001.(G) 30-nm thick slice through a cellular tomogram focusing on protrusions emanating from a vitrified no-spread MECs cultured on a rBM in the absence (left, 2D) or in the presence of blebbistatin (right, 2D+ Bleb). The position of the cell body is towards the upper right-hand corner (marked with white asterisk). Scale bars, 200 nm. Note: under conditions of low cortical actin tension (blebbistatin treatment) the protrusions visualized in these MECs appeared to be highly interdigitated with sharp kinks, consistent with a compliant phenotype. By contrast, the protrusions observed in the 2D samples (higher cortical actin tension) were predominantly straight and outwardly projected, suggesting they were stiffer than the protrusions formed in the MECs with lower cortical actin tension (e.g. blebbistatin treated). (H) Quantification of membrane protrusion width in tomograms from non-spread MECs interacting with rBM treated with (2D+Bleb) and without blebbistatin (2D). n > 2000 protrusions. Statistical significance of differences between the distributions was assessed using Mann-Whitney rank tests. ****P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "C", ")", "(", "Top", ")", "Model", "of", "how", "exocyst", "components", "(", "including", "Exo70", ")", "tether", "vesicles", "during", "exocytosis", ".", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "MECs", "stably", "co", "-", "expressing", "EGFP", "-", "Exo70", "(", "Exo70", ")", "and", "the", "plasma", "membrane", "reporter", "farnesylated", "mCherry", "(", "PM", ")", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", ",", "3D", ",", "and", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", ".", "Fluorescent", "images", "of", "whole", "cells", "are", "shown", "(", "left", ")", "and", "cell", "-", "edge", "protrusions", "are", "magnified", "within", "inset", "(", "right", ")", ".", "Colocalization", "of", "Exo70", "and", "membrane", "protrusions", "are", "highlighted", "with", "yellow", "arrows", ".", "Scale", "bar", "(", "whole", "cell", ")", ",", "5", "μm", ";", "Scale", "bar", "(", "magnified", "inset", ")", ",", "1", "μm", ".", "(", "D", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "relative", "level", "of", "EGFP", "-", "Exo70", "at", "the", "plasma", "membrane", "versus", "cytoplasm", "in", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "blebbistatin", "(", "Bleb", ")", ".", "Membrane", "localization", "of", "EGFP", "-", "Exo70", "was", "quantified", "as", "a", "ratio", "of", "plasma", "membrane", "to", "cytoplasmic", "fluorescence", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "59", ";", "3D", ",", "n", "=", "60", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "57", ";", "3D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "54", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "E", ")", "30", "-", "nm", "thick", "slices", "through", "a", "cellular", "tomogram", "focusing", "on", "subplasmalemmal", "regions", "enriched", "with", "membrane", "-", "encased", "compartments", "of", "vitrified", "MECs", "cultured", "on", "rBM", "treated", "with", "(", "2D", ",", "right", "panel", ")", "or", "without", "(", "2D", "+", "Bleb", ",", "left", "panel", ")", "blebbistatin", ".", "The", "position", "of", "the", "cell", "body", "is", "towards", "the", "upper", "right", "-", "hand", "corners", "(", "marked", "with", "white", "asterisk", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "nm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "membrane", "-", "enclosed", "compartments", "(", "vesicles", ")", "proximal", "to", "the", "plasma", "membrane", "that", "were", "classified", "as", "either", "'", "filled", "'", "(", "black", ")", "or", "'", "empty", "'", "(", "white", ")", ",", "based", "on", "the", "absence", "or", "presence", "of", "encapsulated", "macromolecules", ".", "Membrane", "-", "enclosed", "compartments", "were", "independently", "classified", "by", "three", "cryo", "-", "EM", "experts", "using", "28", "tomograms", "per", "condition", ".", "The", "resulting", "standard", "deviation", "for", "assigning", "'", "empty", "'", "versus", "'", "filled", "'", "was", "10", ".", "3", "%", "(", "n", "=", "3", "independent", "expert", "classifications", ")", ".", "Statistical", "significance", "of", "differences", "between", "the", "distributions", "was", "assessed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "rank", "tests", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "H", ")", "Volcano", "plot", "showing", "differentially", "associated", "proteins", "in", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ";", "blue", ";", "log", "2", ">", "0", ".", "5", ";", "high", "cortical", "actin", "tension", ")", "versus", "blebbistatin", "(", "Bleb", ";", "red", ";", "log", "2", ">", "0", ".", "5", ";", "low", "cortical", "actin", "tension", ")", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "with", "an", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "1", "and", "log2", "(", "fold", "change", ")", ">", "0", ".", "5", "are", "shown", "(", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "J", ")", "Representative", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", ",", "3D", ",", "or", "2D", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", "and", "immunostained", "with", "antibodies", "targeting", "ANXA2", "or", "S100A14", "(", "green", ")", ".", "Cellular", "F", "-", "actin", "was", "counterstained", "using", "phalloidin", "(", "red", ")", "and", "actin", "-", "rich", "protrusions", "are", "highlighted", "with", "yellow", "arrows", ".", "Fluorescent", "images", "of", "whole", "cells", "(", "left", ")", "and", "actin", "-", "rich", "protrusions", "containing", "ANXA2", "or", "S100A14", "are", "magnified", "in", "the", "inset", "(", "right", ")", ".", "The", "edge", "of", "the", "actin", "cortex", "in", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "was", "marked", "with", "a", "yellow", "dashed", "line", ".", "Scale", "bar", "(", "whole", "cell", ")", ",", "5", "μm", ";", "Scale", "bar", "(", "magnified", "insets", ")", ",", "1", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(C) (Top) Model of how exocyst components (including Exo70) tether vesicles during exocytosis. Representative fluorescence microscopy images of MECs stably co-expressing EGFP-Exo70 (Exo70) and the plasma membrane reporter farnesylated mCherry (PM) ligated to rBM in 2D, 3D, and treated with blebbistatin (2D+Bleb). Fluorescent images of whole cells are shown (left) and cell-edge protrusions are magnified within inset (right). Colocalization of Exo70 and membrane protrusions are highlighted with yellow arrows. Scale bar (whole cell), 5 μm; Scale bar (magnified inset), 1 μm.(D) Bar graph of the relative level of EGFP-Exo70 at the plasma membrane versus cytoplasm in MECs ligated to rBM in 2D or 3D in the absence and presence of blebbistatin (Bleb). Membrane localization of EGFP-Exo70 was quantified as a ratio of plasma membrane to cytoplasmic fluorescence (mean ± SEM; 2D, n= 59; 3D, n=60; 2D + Bleb, n=57; 3D + Bleb, n=54 cells from three independent experiments). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. ****P < 0.0001.(E) 30-nm thick slices through a cellular tomogram focusing on subplasmalemmal regions enriched with membrane-encased compartments of vitrified MECs cultured on rBM treated with (2D, right panel) or without (2D+Bleb, left panel) blebbistatin. The position of the cell body is towards the upper right-hand corners (marked with white asterisk). Scale bars, 200 nm.(F) Quantification of the number of membrane-enclosed compartments (vesicles) proximal to the plasma membrane that were classified as either 'filled' (black) or 'empty' (white), based on the absence or presence of encapsulated macromolecules. Membrane-enclosed compartments were independently classified by three cryo-EM experts using 28 tomograms per condition. The resulting standard deviation for assigning 'empty' versus 'filled' was 10.3% (n=3 independent expert classifications). Statistical significance of differences between the distributions was assessed using Mann-Whitney rank tests. ****P < 0.0001.(H) Volcano plot showing differentially associated proteins in MECs ligated to rBM in 2D treated with vehicle (DMSO; blue; log 2> 0.5; high cortical actin tension) versus blebbistatin (Bleb; red; log 2> 0.5; low cortical actin tension). Differentially expressed genes with an adjusted p-value<0.1 and log2 (fold change) > 0.5 are shown (n=2 biological replicates).(J) Representative immunofluorescence microscopy images of MECs ligated to rBM in 2D, 3D, or 2D treated with blebbistatin (2D+ Bleb) and immunostained with antibodies targeting ANXA2 or S100A14 (green). Cellular F-actin was counterstained using phalloidin (red) and actin-rich protrusions are highlighted with yellow arrows. Fluorescent images of whole cells (left) and actin-rich protrusions containing ANXA2 or S100A14 are magnified in the inset (right). The edge of the actin cortex in MECs ligated to rBM in 2D was marked with a yellow dashed line. Scale bar (whole cell), 5 μm; Scale bar (magnified insets), 1 μm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Graph", "of", "the", "percent", "cell", "death", "measured", "in", "MCF10A", "MECs", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", "and", "3D", "(", "left", ")", "and", "in", "2D", "treated", "with", "blebbistatin", "(", "2D", "+", "Bleb", ")", "48h", "post", "-", "plating", "(", "right", ")", "that", "was", "quantified", "using", "calcein", "AM", "and", "ethidium", "homodimer", "staining", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "2D", ",", "n", "=", "3", ";", "3D", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "2D", "+", "DMSO", ",", "n", "=", "5", ";", "2D", "+", "Bleb", ",", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ")", ".", "2D", "versus", "3D", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0010", ",", "2D", "versus", "2D", "+", "Bleb", ",", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0248", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "percent", "cell", "death", "measured", "in", "MCF10A", "MECs", "stably", "expressing", "shRNAs", "targeting", "Luciferase", "(", "Luc", ")", ",", "filamin", "(", "FLMN", ")", "or", "actinin", "(", "ACTN", ")", "and", "ligated", "to", "rBM", "in", "2D", ".", "Cell", "death", "was", "assessed", "at", "48h", "post", "-", "plating", "via", "calcein", "AM", "and", "ethidium", "homodimer", "staining", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0034", ";", "ns", "=", "not", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "percent", "cell", "death", "in", "MCF10A", "MECs", "expressing", "luciferase", "control", "or", "filamin", "repeats", "21", "-", "23", "(", "FLMNIg21", "-", "Ig23", ")", "that", "were", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", ".", "Cell", "death", "was", "assessed", "at", "48h", "post", "-", "plating", "via", "calcein", "AM", "and", "ethidium", "homodimer", "staining", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0489", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "levels", "of", "endogenous", "Exo70", "in", "MECs", "stably", "expressing", "shRNA", "against", "Exo70", "or", "luciferase", "(", "Luc", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0086", ".", "(", "E", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "percent", "cell", "death", "measured", "in", "MECs", "expressing", "shRNA", "targeting", "Exo70", "(", "shExo70", ")", "or", "luciferase", "(", "control", ")", "and", "ligated", "with", "rBM", "in", "2D", "or", "3D", ".", "Cell", "death", "was", "assessed", "at", "48h", "post", "-", "plating", "via", "calcein", "AM", "and", "ethidium", "homodimer", "staining", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "Statistical", "analysis", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Uncorrected", "Fisher", "'", "s", "LSD", ".", "2D", "versus", "3D", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0004", ".", "3D", "+", "shLuc", "versus", "3D", "+", "shExo70", ",", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0091", ".", "(", "F", ")", "Spheroids", "were", "induced", "to", "express", "constitutively", "active", "ROCK", "or", "left", "uninduced", "(", "control", ")", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "for", "laminin", "or", "S100A14", "(", "green", ")", ",", "phalloidin", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "phosphorylated", "EIF2a", "(", "pEIF2a", ")", ",", "total", "EIF2a", "and", "alpha", "-", "tubulin", "in", "cell", "lysate", "from", "MCF10A", "MEC", "spheroids", "induced", "to", "express", "constitutively", "active", "ROCK", "or", "left", "uninduced", "(", "control", ")", ".", "Corresponding", "quantification", "data", "are", "plotted", "at", "bottom", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "P", " ", "=", "0", ".", "0442", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "H", ")", "Spheroids", "were", "induced", "to", "express", "constitutively", "active", "ROCK", "or", "left", "uninduced", "(", "control", ")", ",", "treated", "with", "Paclitaxel", "(", "2nM", ")", ",", "lysed", "and", "immunoblotted", "for", "cleaved", "caspase", "-", "3", "and", "alpha", "-", "tubulin", "(", "top", ")", ".", "In", "parallel", ",", "spheroids", "were", "stained", "with", "antibody", "and", "phalloidin", "to", "evaluate", "the", "levels", "of", "caspase", "-", "3", "(", "green", ")", "and", "actin", "organization", "(", "red", ")", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "I", ")", "Bar", "graph", "of", "the", "relative", "mRNA", "levels", "of", "ER", "stress", "response", "genes", "including", "ATF3", ",", "STC2", ",", "PPP1R15A", ",", "and", "PMAIP1", "in", "microarray", "analyses", "of", "TRAIL", "treated", "HMT", "-", "3522", "S", "-", "1", "MECs", "plated", "as", "monolayers", "on", "a", "rigid", "rBM", "(", "2D", ")", "or", "as", "spheroids", "(", "3D", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "ATF3", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0006", ";", "STC2", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0353", ";", "PPP1R15A", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0254", ";", "PMAIP1", ",", "*", "P", " ", "=", " ", "0", ".", "0127", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Graph of the percent cell death measured in MCF10A MECs ligated to rBM in 2D and 3D (left) and in 2D treated with blebbistatin (2D+Bleb) 48h post-plating (right) that was quantified using calcein AM and ethidium homodimer staining (mean ± SEM; 2D, n= 3; 3D, n=3 independent experiments; 2D + DMSO, n = 5; 2D + Bleb, n=5 independent experiments). 2D versus 3D, ***P = 0.0010, 2D versus 2D + Bleb, **P = 0.0248 (Student's t test).(B) Bar graph of the percent cell death measured in MCF10A MECs stably expressing shRNAs targeting Luciferase (Luc), filamin (FLMN) or actinin (ACTN) and ligated to rBM in 2D. Cell death was assessed at 48h post-plating via calcein AM and ethidium homodimer staining (mean ± SEM; n =3 independent biological replicates). **P = 0.0034; ns= not significant (Student's t test).(C) Bar graph of the percent cell death in MCF10A MECs expressing luciferase control or filamin repeats 21-23 (FLMNIg21-Ig23) that were ligated with rBM in 2D. Cell death was assessed at 48h post-plating via calcein AM and ethidium homodimer staining (mean ± SEM; n =3 independent biological replicates). *P = 0.0489 (Student's t test).(D) Bar graph of the levels of endogenous Exo70 in MECs stably expressing shRNA against Exo70 or luciferase (Luc) (mean ± SEM; n =3 independent biological replicates). ** p = 0.0086.(E) Bar graph of the percent cell death measured in MECs expressing shRNA targeting Exo70 (shExo70) or luciferase (control) and ligated with rBM in 2D or 3D. Cell death was assessed at 48h post-plating via calcein AM and ethidium homodimer staining (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). Statistical analysis by one-way ANOVA followed by Uncorrected Fisher's LSD. 2D versus 3D, ***P = 0.0004. 3D + shLuc versus 3D + shExo70, **P = 0.0091.(F) Spheroids were induced to express constitutively active ROCK or left uninduced (control) and co-stained with antibodies for laminin or S100A14 (green), phalloidin (red) and DAPI (blue). Scale bar, 10 μm.(G) Representative immunoblots of phosphorylated EIF2a (pEIF2a), total EIF2a and alpha-tubulin in cell lysate from MCF10A MEC spheroids induced to express constitutively active ROCK or left uninduced (control). Corresponding quantification data are plotted at bottom (mean ± SEM; n=3 independent biological replicates). *P = 0.0442 (Student's t test).(H) Spheroids were induced to express constitutively active ROCK or left uninduced (control), treated with Paclitaxel (2nM), lysed and immunoblotted for cleaved caspase-3 and alpha-tubulin (top). In parallel, spheroids were stained with antibody and phalloidin to evaluate the levels of caspase-3 (green) and actin organization (red), respectively. Scale bar, 10 μm.(I) Bar graph of the relative mRNA levels of ER stress response genes including ATF3, STC2, PPP1R15A, and PMAIP1 in microarray analyses of TRAIL treated HMT-3522 S-1 MECs plated as monolayers on a rigid rBM (2D) or as spheroids (3D) (mean ± SEM; n=3 independent experiments). ATF3, ***P = 0.0006; STC2, *P = 0.0353; PPP1R15A, *P = 0.0254; PMAIP1, *P = 0.0127 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "D", "Heat", "maps", "of", "the", "occurrence", "frequency", "of", "effective", "variants", "within", "each", "genotype", "in", "DENV1", "(", "A", ")", ",", "DENV2", "(", "B", ")", ",", "DENV3", "(", "C", ")", ",", "and", "DENV4", "(", "D", ")", ".", "Residues", "with", "the", "occurrence", "frequency", "<", "20", "%", "before", "1995", "were", "shown", "in", "the", "heat", "maps", ".", "Red", "square", "frames", "represent", "ten", "stable", "substitutions", ",", "including", "171T", "in", "DENV1", "-", "I", "(", "A", ")", ",", "131Q", ",", "170T", ",", "340T", ",", "and", "380V", "in", "DENV2", "-", "Asian", "American", "(", "B", ")", ",", "226K", "and", "228E", "in", "DENV2", "-", "Asian", "I", "(", "B", ")", ",", "301S", "and", "377I", "in", "DENV3", "-", "I", "(", "C", ")", ",", "and", "265A", "in", "DENV4", "-", "I", "(", "D", ")", ".", "Gray", "boxes", "represent", "the", "data", "that", "were", "not", "available", ".", "E", "-", "H", "Growth", "kinetics", "and", "plaque", "morphology", "DENV2", "-", "Asian", "I", "16681", "strain", "(", "16681", ",", "U87411", ")", "(", "E", ")", ",", "DENV2", "-", "Asian", "American", "DENV2", "/", "US", "/", "BID", "-", "V1164", "/", "1986", "strain", "(", "BID", ",", "EU482568", ")", "(", "F", ")", ",", "DENV3", "-", "I", "PF89", "/", "27643", "strain", "(", "PF89", ",", "AY744677", ")", "(", "G", ")", ",", "and", "DENV4", "-", "I", "H241", "strain", "(", "H241", ",", "AY947539", ")", "(", "H", ")", ".", "Vero", "cells", "were", "infected", "with", "each", "mutant", "at", "a", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "of", "0", ".", "01", ",", "and", "the", "cell", "supernatant", "was", "collected", "at", "Days", "1", ",", "3", ",", "5", ",", "7", ",", "and", "9", "for", "the", "plaque", "assay", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "E", "-", "H", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-D Heat maps of the occurrence frequency of effective variants within each genotype in DENV1 (A), DENV2 (B), DENV3 (C), and DENV4 (D). Residues with the occurrence frequency <20% before 1995 were shown in the heat maps. Red square frames represent ten stable substitutions, including 171T in DENV1-I (A), 131Q, 170T, 340T, and 380V in DENV2-Asian American (B), 226K and 228E in DENV2-Asian I (B), 301S and 377I in DENV3-I (C), and 265A in DENV4-I (D). Gray boxes represent the data that were not available.E-H Growth kinetics and plaque morphology DENV2-Asian I 16681 strain (16681, U87411) (E), DENV2-Asian American DENV2/US/BID-V1164/1986 strain (BID, EU482568) (F), DENV3-I PF89/27643 strain (PF89, AY744677) (G), and DENV4-I H241 strain (H241, AY947539) (H). Vero cells were infected with each mutant at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01, and the cell supernatant was collected at Days 1, 3, 5, 7, and 9 for the plaque assay. Data information: In (E-H), data are presented as mean ± SEM of n = 4 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2One", "-", "week", "-", "old", "mosquitoes", "were", "thoracically", "infected", "with", "DENV2", "-", "Asian", "I", "(", "A", ")", ",", "DENV2", "-", "Asian", "American", "(", "B", ")", ",", "DENV3", "-", "I", "mutants", ",", "respectively", ".", "A", ".", "aegypti", "mosquitoes", "were", "infected", "intrathoracically", "with", "10", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "DENV", ".", "The", "DENV", "viral", "loads", "were", "assessed", "at", "3", "days", "postinfection", "via", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "A", ".", "aegypti", "actin", ".", "Data", "information", ":", "one", "dot", "represents", "one", "mosquito", ",", "and", "the", "horizontal", "lines", "represent", "the", "median", "of", "the", "results", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "One", "-", "week", "-", "old", "mosquitoes", "were", "thoracically", "infected", "with", "DENV4", "-", "I", "(", "D", ")", "mutants", ",", "respectively", ".", "A", ".", "aegypti", "mosquitoes", "were", "infected", "intrathoracically", "with", "10", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "DENV", ".", "The", "DENV", "viral", "loads", "were", "assessed", "at", "3", "days", "postinfection", "via", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "A", ".", "aegypti", "actin", ".", "Data", "information", ":", "one", "dot", "represents", "one", "mosquito", ",", "and", "the", "horizontal", "lines", "represent", "the", "median", "of", "the", "results", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "DENV", "(", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "by", "footpad", "inoculation", ".", "Blood", "samples", "were", "collected", "for", "DENV", "viremia", "detection", "from", "Day", "1", "to", "Day", "7", ".", "The", "viral", "loads", "from", "AG6", "mice", "infected", "with", "DENV2", "-", "Asian", "I", "(", "E", ")", ",", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "mouse", "GAPDH", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "DENV", "(", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "by", "footpad", "inoculation", ".", "Blood", "samples", "were", "collected", "for", "DENV", "viremia", "detection", "from", "Day", "1", "to", "Day", "7", ".", "The", "viral", "loads", "from", "AG6", "mice", "infected", "with", "DENV2", "-", "Asian", "American", "(", "F", ")", ",", "DENV3", "-", "I", "(", "G", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "mouse", "GAPDH", ".", "Data", "information", ":", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "In", "(", "F", ")", ",", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "DENV", "(", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "by", "footpad", "inoculation", ".", "Blood", "samples", "were", "collected", "for", "DENV", "viremia", "detection", "from", "Day", "1", "to", "Day", "7", ".", "The", "viral", "loads", "from", "AG6", "mice", "infected", "with", "DENV4", "-", "I", "(", "H", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "mouse", "GAPDH", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "I", ",", "J", "Infection", "of", "DENV2", "-", "Asian", "I", "mutants", "on", "hu", "-", "moDC", "(", "I", ")", "and", "hu", "-", "moMØ", "(", "J", ")", ".", "The", "cells", "were", "infected", "with", "0", ".", "01", "MOI", "of", "the", "indicated", "viruses", ".", "The", "infected", "cells", "were", "detected", "at", "48", "h", "postinfection", "by", "qRT", "-", "PCR", ",", "and", "DENV", "viral", "loads", "were", "normalized", "against", "human", "GAPDH", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "I", ",", "J", ")", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "corresponding", "WT", "within", "genotypes", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2One-week-old mosquitoes were thoracically infected with DENV2-Asian I (A), DENV2-Asian American (B), DENV3-I mutants, respectively. A. aegypti mosquitoes were infected intrathoracically with 10 p.f.u. of DENV. The DENV viral loads were assessed at 3 days postinfection via qRT-PCR and were normalized against A. aegypti actin. Data information: one dot represents one mosquito, and the horizontal lines represent the median of the results. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05).One-week-old mosquitoes were thoracically infected with DENV4-I (D) mutants, respectively. A. aegypti mosquitoes were infected intrathoracically with 10 p.f.u. of DENV. The DENV viral loads were assessed at 3 days postinfection via qRT-PCR and were normalized against A. aegypti actin. Data information: one dot represents one mosquito, and the horizontal lines represent the median of the results. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with DENV (2,500 p.f.u.) by footpad inoculation. Blood samples were collected for DENV viremia detection from Day 1 to Day 7. The viral loads from AG6 mice infected with DENV2-Asian I (E), were measured by qRT-PCR and were normalized against mouse GAPDH. Data information: n = 6 biological replicates. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with DENV (2,500 p.f.u.) by footpad inoculation. Blood samples were collected for DENV viremia detection from Day 1 to Day 7. The viral loads from AG6 mice infected with DENV2-Asian American (F), DENV3-I (G) were measured by qRT-PCR and were normalized against mouse GAPDH. Data information: , n = 6 biological replicates. In (F), n = 5 biological replicates. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with DENV (2,500 p.f.u.) by footpad inoculation. Blood samples were collected for DENV viremia detection from Day 1 to Day 7. The viral loads from AG6 mice infected with DENV4-I (H) were measured by qRT-PCR and were normalized against mouse GAPDH. Data information: n = 6 biological replicates. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05).I, J Infection of DENV2-Asian I mutants on hu-moDC (I) and hu-moMØ (J). The cells were infected with 0.01 MOI of the indicated viruses. The infected cells were detected at 48 h postinfection by qRT-PCR, and DENV viral loads were normalized against human GAPDH. Data information: n = 6 biological replicates. data are presented as mean ± SEM. The data were analyzed statistically using the unpaired t-test (I, J). The P value represents a comparison between the mutants and corresponding WT within genotypes. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s., not significant (p > 0.05)."}
{"words": ["Figure", "3A", "The", "five", "-", "year", "occurrence", "frequency", "of", "residues", "in", "226th", "and", "228th", "sites", "from", "<", "1995", "to", "2016", "-", "2020", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", "by", "footpad", "inoculation", ".", "The", "viremia", "of", "infected", "AG6", "mice", "from", "Day", "1", "to", "Day", "7", "was", "measured", "using", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", ",", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", "by", "footpad", "inoculation", ".", "Two", "days", "postinfection", ",", "infected", "mice", "were", "euthanized", ",", "and", "the", "viral", "loads", "in", "the", "bone", "marrow", "(", "C", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", "by", "footpad", "inoculation", ".", "Two", "days", "postinfection", ",", "infected", "mice", "were", "euthanized", ",", "and", "the", "viral", "loads", "in", "the", "spleen", "(", "D", ")", ",", "and", "footpad", "(", "E", ")", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mice", "were", "infected", "with", "2", ",", "500", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", "by", "footpad", "inoculation", ".", "The", "survival", "rates", "of", "mice", "(", "F", ")", "were", "recorded", "daily", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "F", ")", ",", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ".", "In", "(", "F", ")", ",", "the", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Mosquito", "infectivity", "was", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "at", "8", "days", "after", "the", "blood", "meal", ".", "The", "number", "at", "the", "top", "of", "each", "column", "represents", "the", "infected", "number", "/", "total", "number", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "H", "one", "dot", "represents", "one", "mosquito", ",", "and", "the", "horizontal", "lines", "represent", "the", "median", "of", "the", "results", ".", "In", "(", "H", ",", "the", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05Mosquitoes", "were", "thoracically", "infected", "with", "10", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", ".", "Ten", "days", "postinfection", ",", "five", "infected", "mosquitoes", "were", "allowed", "to", "bite", "one", "four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mouse", ".", "From", "Day", "1", "to", "Day", "8", ",", "infected", "mice", "were", "subjected", "to", "daily", "biting", "by", "naive", "A", ".", "aegypti", ",", "and", "blood", "samples", "were", "collected", "for", "DENV2", "viremia", "detection", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "J", ")", ",", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "In", "J", ")", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "J", ")", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Mosquitoes", "were", "thoracically", "infected", "with", "10", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", ".", "Ten", "days", "postinfection", ",", "five", "infected", "mosquitoes", "were", "allowed", "to", "bite", "one", "four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mouse", ".", "From", "Day", "1", "to", "Day", "8", ",", "infected", "mice", "were", "subjected", "to", "daily", "biting", "by", "naive", "A", ".", "aegypti", ",", "and", "Mosquitoes", "were", "collected", "at", "8", "days", "after", "the", "blood", "meal", "for", "qRT", "-", "PCR", "to", "compare", "the", "infection", "rate", "of", "DENV2", "(", "K", "Data", "information", ":", "In", "K", ",", "the", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Mosquitoes", "were", "thoracically", "infected", "with", "10", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "of", "viruses", ".", "Ten", "days", "postinfection", ",", "five", "infected", "mosquitoes", "were", "allowed", "to", "bite", "one", "four", "-", "week", "-", "old", "AG6", "mouse", ".", "From", "Day", "1", "to", "Day", "8", ",", "infected", "mice", "were", "subjected", "to", "daily", "biting", "by", "naive", "A", ".", "aegypti", ",", "and", "Mosquitoes", "were", "collected", "at", "8", "days", "after", "the", "blood", "meal", "for", "qRT", "-", "PCR", "to", "compare", "the", "infection", "rate", "of", "DENV2", "L", ")", ".", "The", "number", "at", "the", "top", "of", "each", "column", "represents", "the", "infected", "number", "/", "total", "number", "(", "L", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "L", ")", ",", "one", "dot", "represents", "one", "mosquito", ",", "and", "the", "horizontal", "lines", "represent", "the", "median", "of", "the", "results", ".", "In", ",", "L", ")", ",", "the", "data", "were", "analyzed", "statistically", "using", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A The five-year occurrence frequency of residues in 226th and 228th sites from <1995 to 2016-2020.Four-week-old AG6 mice were infected with 2,500 p.f.u. of viruses by footpad inoculation. The viremia of infected AG6 mice from Day 1 to Day 7 was measured using qRT-PCR. Data information: , n = 5 biological replicates. the data are presented as means ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with 2,500 p.f.u. of viruses by footpad inoculation. Two days postinfection, infected mice were euthanized, and the viral loads in the bone marrow (C) were measured by qRT-PCR. Data information: n = 5 biological replicates. the data are presented as means ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with 2,500 p.f.u. of viruses by footpad inoculation. Two days postinfection, infected mice were euthanized, and the viral loads in the spleen (D), and footpad (E) were measured by qRT-PCR. Data information: n = 5 biological replicates. the data are presented as means ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Four-week-old AG6 mice were infected with 2,500 p.f.u. of viruses by footpad inoculation. The survival rates of mice (F) were recorded daily. Data information: In (F), n = 10 biological replicates. In (F), the data were analyzed statistically using the log-rank (Mantel-Cox) test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Mosquito infectivity was determined by qRT-PCR at 8 days after the blood meal. The number at the top of each column represents the infected number/total number (H). Data information: In (H one dot represents one mosquito, and the horizontal lines represent the median of the results. In (H, the data were analyzed statistically using the Fisher's exact test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05Mosquitoes were thoracically infected with 10 p.f.u. of viruses. Ten days postinfection, five infected mosquitoes were allowed to bite one four-week-old AG6 mouse. From Day 1 to Day 8, infected mice were subjected to daily biting by naive A. aegypti, and blood samples were collected for DENV2 viremia detection by qRT-PCR (J). Data information: In (J), n = 4 biological replicates. In J), the data are presented as means ± SEM. The data were analyzed statistically using the Mann-Whitney test J). The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Mosquitoes were thoracically infected with 10 p.f.u. of viruses. Ten days postinfection, five infected mosquitoes were allowed to bite one four-week-old AG6 mouse. From Day 1 to Day 8, infected mice were subjected to daily biting by naive A. aegypti, and Mosquitoes were collected at 8 days after the blood meal for qRT-PCR to compare the infection rate of DENV2 (K Data information: In K, the data were analyzed statistically using the Fisher's exact test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05).Mosquitoes were thoracically infected with 10 p.f.u. of viruses. Ten days postinfection, five infected mosquitoes were allowed to bite one four-week-old AG6 mouse. From Day 1 to Day 8, infected mice were subjected to daily biting by naive A. aegypti, and Mosquitoes were collected at 8 days after the blood meal for qRT-PCR to compare the infection rate of DENV2 L). The number at the top of each column represents the infected number/total number (L). Data information: In L), one dot represents one mosquito, and the horizontal lines represent the median of the results. In , L), the data were analyzed statistically using the Fisher's exact test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05)."}
{"words": ["Figure", "4B", "The", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "pcDNA3", ".", "1", "recombinant", "plasmid", "with", "a", "human", "DC", "-", "SIGN", "gene", ".", "The", "cells", "transfected", "by", "an", "empty", "pcDNA3", ".", "1", "plasmid", "served", "as", "negative", "controls", ".", "Thirty", "-", "six", "hours", "after", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "infected", "with", "DENV2", "(", "0", ".", "01", "MOI", ")", ".", "The", "DENV2", "viral", "loads", "were", "assessed", "at", "48", "h", "postinfection", "via", "qRT", "-", "PCR", "and", "were", "normalized", "against", "human", "GAPDH", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", ")", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "In", "(", "B", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", "and", "were", "analyzed", "statistically", "using", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "C", "hu", "-", "moDCs", "were", "infected", "with", "0", ".", "01", "MOI", "of", "DENV2", ".", "The", "infected", "cells", "were", "detected", "at", "48", "h", "postinfection", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "C", ")", ",", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "In", "C", ")", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", "and", "were", "analyzed", "statistically", "using", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "P", "value", "represents", "a", "comparison", "between", "the", "mutants", "and", "the", "16681", "WT", "strain", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "D", "The", "binding", "affinity", "between", "DC", "-", "SIGN", "and", "purified", "DENV2", "virions", "measured", "by", "SPR", ".", "E", "The", "binding", "affinity", "between", "DC", "-", "SIGN", "(", "R309A", "/", "R312A", ")", "and", "purified", "DENV2", "virions", "measured", "by", "SPR", ".", "G", "The", "binding", "affinity", "between", "mosGCTL", "-", "AAEL011408", "and", "purified", "DENV2", "virions", "measured", "by", "SPR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B The 293T cells were transfected with a pcDNA3.1 recombinant plasmid with a human DC-SIGN gene. The cells transfected by an empty pcDNA3.1 plasmid served as negative controls. Thirty-six hours after transfection, the cells were infected with DENV2 (0.01 MOI). The DENV2 viral loads were assessed at 48 h postinfection via qRT-PCR and were normalized against human GAPDH. Data information: In (B), n = 6 biological replicates. In (B, the data are presented as means ± SEM and were analyzed statistically using an unpaired t-test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05). C hu-moDCs were infected with 0.01 MOI of DENV2. The infected cells were detected at 48 h postinfection by qRT-PCR. Data information: In (C), n = 5 biological replicates. In C), the data are presented as means ± SEM and were analyzed statistically using an unpaired t-test. The P value represents a comparison between the mutants and the 16681 WT strain. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n.s., not significant (p > 0.05). D The binding affinity between DC-SIGN and purified DENV2 virions measured by SPR. E The binding affinity between DC-SIGN (R309A/R312A) and purified DENV2 virions measured by SPR.G The binding affinity between mosGCTL-AAEL011408 and purified DENV2 virions measured by SPR."}
{"words": ["Figure", "5B", "The", "AOF", "prediction", "of", "the", "T226K", "substitution", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "G228E", "substitution", "(", "right", "panel", ")", "in", "the", "DENV2", "Asian", "I", "genotype", ".", "C", "The", "AOF", "prediction", "of", "the", "T226K", "substitution", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "G228E", "substitution", "(", "right", "panel", ")", "in", "the", "DENV2", "Cosmopolitan", "genotype", ".", "The", "performance", "of", "the", "GPR", "-", "2", "in", "modeling", "the", "prevalence", "of", "the", "DENV2", "Asian", "I", "genotype", ".", "E", "The", "prevalence", "of", "the", "DENV2", "Cosmopolitan", "genotype", "predicted", "by", "the", "GPR", "-", "2", "model", "(", "orange", "dashed", "line", "+", "squares", ")", ".", "The", "orange", "shadow", "denotes", "the", "predicted", "prevalence", "range", "of", "the", "DENV2", "Cosmopolitan", "genotype", ",", "with", "the", "AOF", "of", "T226K", "/", "G228E", "substitutions", "predicted", "by", "the", "numerical", "kinetics", ",", "GPR", "-", "1", ",", "and", "support", "vector", "machine", "(", "SVR", ")", "models", "serving", "as", "the", "GPR", "-", "2", "input", "data", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B The AOF prediction of the T226K substitution (left panel) and the G228E substitution (right panel) in the DENV2 Asian I genotype.C The AOF prediction of the T226K substitution (left panel) and the G228E substitution (right panel) in the DENV2 Cosmopolitan genotype.The performance of the GPR-2 in modeling the prevalence of the DENV2 Asian I genotype.E The prevalence of the DENV2 Cosmopolitan genotype predicted by the GPR-2 model (orange dashed line + squares). The orange shadow denotes the predicted prevalence range of the DENV2 Cosmopolitan genotype, with the AOF of T226K/G228E substitutions predicted by the numerical kinetics, GPR-1, and support vector machine (SVR) models serving as the GPR-2 input data."}
{"words": ["Figure", "1Schematic", "of", "single", "‐", "plane", "acquisition", "FRAP", "on", "endogenously", "tagged", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Representative", "still", "images", "of", "a", "FRAP", "experiment", "are", "shown", ".", "See", "also", "Movie", "EV1", ".", "Green", "sphere", ":", "yeast", "nucleus", "containing", "Swi6", "‐", "EGFP", ";", "green", "dots", ":", "heterochromatic", "Swi6", "‐", "EGFP", ";", "red", "circle", ":", "bleached", "area", ".", "Normalized", "average", "intensities", "(", "black", "dots", ")", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", "(", "n", "=", "31", ")", "fitted", "to", "a", "one", "‐", "component", "model", "(", "blue", "line", ")", ".", "The", "dashed", "lines", "indicate", "the", "final", "relative", "intensity", "that", "is", "set", "to", "1", "and", "the", "fluorescence", "half", "‐", "recovery", "time", "(", "t", "1", "/", "2", ")", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", ".", "The", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", ".", "Normalized", "fluorescence", "recovery", "values", "of", "FRAP", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "loci", ".", "The", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", ".", "FLIP", "experiment", "showing", "a", "bleached", "(", "FRAP", ",", "red", "circle", ")", "and", "unbleached", ",", "adjacent", "locus", "(", "FLIP", ",", "blue", "circle", ")", "in", "the", "same", "nucleus", ".", "The", "graph", "displays", "average", "relative", "fluorescence", "of", "FLIP", "(", "blue", ")", ",", "FRAP", "(", "red", ")", ",", "and", "control", "loci", "(", "no", "bleach", ",", "green", ")", "in", "other", "non", "‐", "bleached", "cells", ".", "Schematic", "of", "a", "line", "‐", "scan", "FRAP", "experiment", ".", "Fluorescence", "intensities", "are", "measured", "along", "a", "line", "of", "a", "non", "‐", "bleached", "nucleus", "(", "Ctrl", "nucleus", ")", "and", "a", "bleached", "nucleus", "(", "FRAP", "nucleus", ")", "in", "Swi6", "‐", "EGFP", "clr4", "∆", "cells", ".", "Red", "box", ":", "bleached", "region", ".", "Right", ":", "raw", "data", "example", ".", "Average", "relative", "intensities", "of", "a", "line", "‐", "scan", "FRAP", "experiment", "on", "Swi6", "‐", "EGFP", "in", "heterochromatin", "(", "blue", "line", ")", ",", "euchromatin", "(", "green", "line", ")", ",", "and", "clr4", "∆", "(", "red", "line", ")", ".", "The", "curves", "have", "a", "gliding", "average", "of", "40", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Schematic of single‐plane acquisition FRAP on endogenously tagged Swi6‐EGFP. Representative still images of a FRAP experiment are shown. See also Movie EV1. Green sphere: yeast nucleus containing Swi6‐EGFP; green dots: heterochromatic Swi6‐EGFP; red circle: bleached area.Normalized average intensities (black dots) of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci (n = 31) fitted to a one‐component model (blue line). The dashed lines indicate the final relative intensity that is set to 1 and the fluorescence half‐recovery time (t 1/2).Fluorescence t 1/2 values of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci. The box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box.Normalized fluorescence recovery values of FRAP on Swi6‐EGFP heterochromatic loci. The box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box.FLIP experiment showing a bleached (FRAP, red circle) and unbleached, adjacent locus (FLIP, blue circle) in the same nucleus. The graph displays average relative fluorescence of FLIP (blue), FRAP (red), and control loci (no bleach, green) in other non‐bleached cells.Schematic of a line‐scan FRAP experiment. Fluorescence intensities are measured along a line of a non‐bleached nucleus (Ctrl nucleus) and a bleached nucleus (FRAP nucleus) in Swi6‐EGFP clr4∆ cells. Red box: bleached region. Right: raw data example.Average relative intensities of a line‐scan FRAP experiment on Swi6‐EGFP in heterochromatin (blue line), euchromatin (green line), and clr4∆ (red line). The curves have a gliding average of 40."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "BAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "blue", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", ")", ".", "C", ",", "DAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "wild", "‐", "type", "(", "brown", ")", "or", "cid14", "∆", "(", "dark", "green", ")", "cells", "expressing", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "E", ",", "FAverage", "relative", "intensities", "over", "time", "and", "corresponding", "fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "heterochromatic", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "wild", "‐", "type", "cells", "expressing", "heterochromatic", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "blue", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", ")", ",", "or", "cid14", "∆", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "green", ")", "or", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "yellow", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", ")", ",", "(", "D", ")", "and", "(", "F", ")", ",", "the", "box", "bounds", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "divided", "by", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", "beyond", "the", "box", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, BAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (blue) or NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (red).C, DAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with wild‐type (brown) or cid14∆ (dark green) cells expressing Swi6‐EGFP.E, FAverage relative intensities over time and corresponding fluorescence t 1/2 values of heterochromatic Swi6 obtained from FRAP experiments performed with wild‐type cells expressing heterochromatic NLS‐Swi6‐EGFP (blue) or NLS‐Swi6 KR25A‐EGFP (red), or cid14∆ cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (green) or NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (yellow).Data information: In (B), (D) and (F), the box bounds the interquartile range (IQR) divided by the median, and whiskers extend to a maximum of 1.5 × IQR beyond the box."}
{"words": ["Figure", "3Schematic", "of", "a", "chromosome", "indicating", "Swi6", "‐", "EGFP", "heterochromatic", "domains", "(", "green", ")", ".", "Cnp1", "‐", "mCherry", "and", "Taz1", "‐", "mCherry", "(", "red", ")", "mark", "centromeres", "and", "telomeres", ",", "respectively", ".", "Representative", "images", "demonstrating", "Swi6", "‐", "EGFP", "co", "‐", "localization", "with", "centromeres", "(", "Cnp1", "‐", "mCherry", ")", "and", "telomeres", "(", "Taz1", "‐", "mCherry", ")", "are", "shown", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "Swi6", "‐", "EGFP", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "after", "release", "of", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "(", "black", "dots", ")", "or", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "(", "red", "dots", ")", "from", "G1", "/", "S", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "FRAP", "experiment", "at", "the", "respective", "time", "after", "release", "from", "cell", "cycle", "arrest", ".", "Swi6", "is", "dispersed", "in", "M", "phase", "due", "to", "H3S10", "phosphorylation", ",", "and", "M", "phase", "was", "therefore", "not", "included", "in", "the", "FRAP", "analysis", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "on", "centromeric", "Swi6", ".", "A", "total", "of", "40", ",", "66", ",", "and", "104", "individual", "cells", "residing", "in", "the", "G1", ",", "S", ",", "and", "G2", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "were", "analyzed", ",", "respectively", ".", "Representative", "bright", "‐", "field", "images", "of", "cells", "in", "G1", ",", "S", ",", "or", "G2", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "=", "2", "μm", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "on", "centromeric", "Swi6", "of", "cells", "expressing", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "EGFP", "and", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "that", "reside", "in", "the", "G2", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "Fluorescence", "t", "1", "/", "2", "values", "of", "centromeric", "or", "telomeric", "Swi6", "obtained", "from", "FRAP", "experiments", "performed", "with", "cells", "expressing", "the", "RNA", "‐", "binding", "mutant", "NLS", "‐", "Swi6", "‐", "KR25A", "‐", "EGFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Schematic of a chromosome indicating Swi6‐EGFP heterochromatic domains (green). Cnp1‐mCherry and Taz1‐mCherry (red) mark centromeres and telomeres, respectively. Representative images demonstrating Swi6‐EGFP co‐localization with centromeres (Cnp1‐mCherry) and telomeres (Taz1‐mCherry) are shown.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing Swi6‐EGFP.Fluorescence t 1/2 values of centromeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed after release of cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP (black dots) or the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP (red dots) from G1/S cell cycle arrest. Each dot represents one FRAP experiment at the respective time after release from cell cycle arrest. Swi6 is dispersed in M phase due to H3S10 phosphorylation, and M phase was therefore not included in the FRAP analysis.Fluorescence t 1/2 values obtained from FRAP experiments performed on centromeric Swi6. A total of 40, 66, and 104 individual cells residing in the G1, S, and G2 phases of the cell cycle were analyzed, respectively. Representative bright‐field images of cells in G1, S, or G2 are shown. Scale bars = 2 μm.Fluorescence t 1/2 values obtained from FRAP experiments performed on centromeric Swi6 of cells expressing NLS‐Swi6‐EGFP and NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP that reside in the G2 of the cell cycle.Fluorescence t 1/2 values of centromeric or telomeric Swi6 obtained from FRAP experiments performed with cells expressing the RNA‐binding mutant NLS‐Swi6‐KR25A‐EGFP."}
{"words": ["Figure", "4H3K9me2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichment", "profiles", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "on", "centromere", "1", ".", "Centromeric", "repeat", "elements", "(", "dg", "/", "dh", ")", "are", "indicated", ".", "Inverted", "repeats", "(", "IRC1", ")", "constitute", "heterochromatin", "boundaries", "in", "wild", "‐", "type", "cells", "(", "Cam", "et", "al", ",", "2005", ")", ".", "The", "y", "‐", "axes", "represent", "log2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichments", "in", "200", "‐", "bp", "genomically", "tiled", "windows", "calculated", "over", "clr4Δ", "cells", ".", "Two", "independent", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", "were", "performed", "(", "replicates", "1", "and", "2", ")", ".", "Positions", "of", "genomic", "elements", "on", "the", "plus", "and", "minus", "strands", "are", "indicated", ".", "Blue", ",", "protein", "‐", "coding", "genes", ";", "white", ",", "repeats", ";", "green", ",", "long", "terminal", "repeat", "(", "LTR", ")", ".", "H3K9me2", "ChIP", "‐", "seq", "enrichment", "profiles", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "on", "the", "telomere", "of", "the", "right", "arm", "of", "chromosome", "1", ".", "Two", "independent", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", "were", "performed", "(", "replicates", "1", "and", "2", ")", ".", "Differential", "expression", "of", "transcripts", "coming", "from", "centromere", "1", "assessed", "by", "tiling", "microarray", "gene", "expression", "analysis", ".", "Expression", "data", "for", "swi6", "+", "and", "swi6", "∆", "cells", "were", "taken", "from", "a", "previous", "publication", "(", "Woolcock", "et", "al", ",", "2012", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4H3K9me2 ChIP‐seq enrichment profiles for swi6+ and swi6∆ cells on centromere 1. Centromeric repeat elements (dg/dh) are indicated. Inverted repeats (IRC1) constitute heterochromatin boundaries in wild‐type cells (Cam et al, 2005). The y‐axes represent log2 ChIP‐seq enrichments in 200‐bp genomically tiled windows calculated over clr4Δ cells. Two independent biological replicates for each genotype were performed (replicates 1 and 2). Positions of genomic elements on the plus and minus strands are indicated. Blue, protein‐coding genes; white, repeats; green, long terminal repeat (LTR).H3K9me2 ChIP‐seq enrichment profiles for swi6+ and swi6∆ cells on the telomere of the right arm of chromosome 1. Two independent biological replicates for each genotype were performed (replicates 1 and 2).Differential expression of transcripts coming from centromere 1 assessed by tiling microarray gene expression analysis. Expression data for swi6+ and swi6∆ cells were taken from a previous publication (Woolcock et al, 2012)."}
{"words": ["Figure", "5C", "-", "EH3K9me2", "levels", "on", "heterochromatin", "‐", "adjacent", "genes", "assessed", "by", "ChIP", "-", "PCR", "in", "swi6", "+", ",", "swi6", "∆", ",", "and", "swi6", "‐", "L315E", "(", "CSD", "dimerization", "mutant", ")", "(", "C", ")", ",", "swi6", "‐", "W104A", "(", "H3K9me2", "binding", "mutant", ")", "(", "D", ")", ",", "and", "epe1", "∆", "(", "E", ")", "cells", ".", "Enrichments", "over", "clr4", "∆", "are", "normalized", "to", "adh1", "+", ".", "Average", "fold", "enrichment", "with", "s", ".", "d", ".", "is", "shown", "for", "three", "(", "C", "and", "E", ")", "or", "four", "(", "D", ")", "independent", "experiments", ".", "P", "‐", "values", "were", "generated", "by", "the", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "two", "‐", "tailed", "distribution", ",", "two", "‐", "sample", ",", "unequal", "variance", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C-EH3K9me2 levels on heterochromatin‐adjacent genes assessed by ChIP-PCR in swi6+, swi6∆, and swi6‐L315E (CSD dimerization mutant) (C), swi6‐W104A (H3K9me2 binding mutant) (D), and epe1∆ (E) cells. Enrichments over clr4∆ are normalized to adh1+. Average fold enrichment with s.d. is shown for three (C and E) or four (D) independent experiments. P‐values were generated by the Student's t‐test (two‐tailed distribution, two‐sample, unequal variance)."}
{"words": ["Figure", "6sRNA", "reads", "mapping", "to", "centromere", "1", "in", "swi6", "+", "(", "green", ")", "and", "swi6", "∆", "(", "blue", ")", "cells", ".", "The", "dashed", "red", "box", "highlights", "the", "loss", "of", "brdrRNAs", "at", "the", "IRC1R", "in", "the", "absence", "of", "Swi6", ".", "Centromeric", "repeat", "elements", "and", "the", "central", "core", "are", "indicated", ".", "Counts", "were", "normalized", "to", "the", "library", "size", ".", "Asterisks", "denote", "tRNA", "fragments", ".", "Note", "that", "tRNA", "genes", "flank", "IRC3", "(", "Fig", "EV4", ")", "but", "not", "IRC1R", ".", "H3K9me2", "levels", "on", "heterochromatin", "‐", "adjacent", "genes", "assessed", "by", "ChIP", "-", "PCR", "in", "swi6", "+", ",", "swi6", "∆", ",", "tas3", "L479E", ",", "and", "tas3", "L479E", "swi6", "∆", "cells", ".", "Enrichments", "over", "clr4", "∆", "are", "normalized", "to", "adh1", "+", ".", "Average", "fold", "enrichment", "with", "s", ".", "d", ".", "is", "shown", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "P", "‐", "values", "were", "generated", "by", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "two", "‐", "tailed", "distribution", ",", "two", "‐", "sample", ",", "unequal", "variance", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6sRNA reads mapping to centromere 1 in swi6+ (green) and swi6∆ (blue) cells. The dashed red box highlights the loss of brdrRNAs at the IRC1R in the absence of Swi6. Centromeric repeat elements and the central core are indicated. Counts were normalized to the library size. Asterisks denote tRNA fragments. Note that tRNA genes flank IRC3 (Fig EV4) but not IRC1R.H3K9me2 levels on heterochromatin‐adjacent genes assessed by ChIP-PCR in swi6+, swi6∆, tas3 L479E, and tas3 L479E swi6∆ cells. Enrichments over clr4∆ are normalized to adh1+. Average fold enrichment with s.d. is shown for three independent experiments. P‐values were generated by Student's t‐test (two‐tailed distribution, two‐sample, unequal variance)."}
{"words": ["figf1a", ",", "Northern", "blot", "analysis", "of", "lamp", "-", "2", "expression", ".", "Total", "RNA", "was", "hybridized", "using", "a", "lamp", "-", "2", "cDNA2", "probe", "and", "a", "murine", "glyceraldehyde", "-", "3", "-", "phosphate", "dehydrogenase", "probe", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "LAMP", "-", "2", "expression", ".", "In", "control", "liver", "and", "kidney", "extracts", "the", "glycosylated", "LAMP", "-", "2", "molecules", "were", "detected", ".", "In", "LAMP", "-", "2", "-", "/", "-", "tissues", "no", "LAMP", "-", "2", "product", "was", "found", ".", "c", ",", "Increased", "mortality", "in", "LAMP", "-", "2", "deficient", "outbred", "(", "C57B6", "/", "Jx129SV", ")", "mice", ".", "Forty", "-", "two", "control", "(", "closed", "circles", ")", "and", "LAMP", "-", "2", "-", "deficient", "mice", "(", "open", "circles", ")", "were", "monitored", "over", "300", "days", ".", "d", ",", "Loss", "of", "weight", "in", "early", "dying", "(", "n", "=", "7", "males", ")", "and", "surviving", "LAMP", "-", "2", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "11", "males", ")", "in", "comparison", "with", "control", "mice", "(", "n", "=", "12", "males", ")", "monitored", "for", "60", "days", "after", "birth", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Northern blot analysis of lamp-2 expression. Total RNA was hybridized using a lamp-2 cDNA2 probe and a murine glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase probe.b, Western blot analysis of LAMP-2 expression. In control liver and kidney extracts the glycosylated LAMP-2 molecules were detected. In LAMP-2-/- tissues no LAMP-2 product was found.c, Increased mortality in LAMP-2 deficient outbred (C57B6/Jx129SV) mice. Forty-two control (closed circles) and LAMP-2-deficient mice (open circles) were monitored over 300 days.d, Loss of weight in early dying (n = 7 males) and surviving LAMP-2-deficient mice (n = 11 males) in comparison with control mice ( n = 12 males) monitored for 60 days after birth."}
{"words": ["figf2a", ",", "Ultrastructure", "of", "autophagic", "vacuoles", "(", "arrowheads", ")", "in", "pancreatic", "acinar", "gland", "cells", "from", "a", "6", ".", "5", "-", "month", "-", "old", "LAMP", "-", "2", "-", "deficient", "mouse", ".", "b", ",", "Autophagic", "vacuoles", "containing", "glycogen", "(", "g", ")", ",", "cytosol", "and", "cellular", "constituents", "in", "a", "hepatocyte", "of", "an", "8", "-", "day", "-", "old", "LAMP", "-", "2", "-", "/", "-", "mouse", ".", "m", ",", "mitochrondria", ";", "bc", ",", "bile", "canaliculus", ".", "c", ",", "Accumulation", "of", "numerous", "early", "autophagic", "vacuoles", "in", "cultured", "LAMP", "-", "2", "-", "/", "-", "hepatocytes", ".", "Arrow", ",", "large", "late", "autophagic", "vacuole", "containing", "partially", "degraded", "material", ".", "Insert", ",", "magnification", "of", "the", "region", "indicated", "by", "an", "asterisk", "with", "typical", "early", "autophagic", "vacuoles", "containing", "undigested", "cellular", "constituents", ".", "Scale", "bars", ":", "a", ",", "3", ".", "5", "µm", ";", "b", ",", "0", ".", "2", "µm", ";", "c", ",", "1", ".", "3", "µm", ";", "insert", ",", "0", ".", "9", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Ultrastructure of autophagic vacuoles (arrowheads) in pancreatic acinar gland cells from a 6.5-month-old LAMP-2-deficient mouse.b, Autophagic vacuoles containing glycogen (g), cytosol and cellular constituents in a hepatocyte of an 8-day-old LAMP-2-/- mouse. m, mitochrondria; bc, bile canaliculus. c, Accumulation of numerous early autophagic vacuoles in cultured LAMP-2-/- hepatocytes. Arrow, large late autophagic vacuole containing partially degraded material. Insert, magnification of the region indicated by an asterisk with typical early autophagic vacuoles containing undigested cellular constituents. Scale bars: a, 3.5 µm; b, 0.2 µm; c, 1.3 µm; insert, 0.9 µm."}
{"words": ["figf3a", ",", "Vacuole", "in", "a", "fibre", "of", "the", "soleus", "muscle", ".", "b", ",", "Ultrastructure", "of", "a", "vacuole", "in", "a", "cardiomyocyte", ".", "Scale", "bars", ":", "a", ",", "1", " ", "µm", ";", "b", ",", "1", ".", "5", " ", "µm", ".", "c", ",", "Typical", "original", "twitch", "recordings", "of", "developed", "force", "of", "heart", "muscles", "from", "control", "(", "thin", "line", ")", "and", "LAMP", "-", "2", "-", "deficient", "(", "thick", "line", ")", "mice", ".", "d", ",", "Average", "values", "of", "developed", "force", ".", "Preparations", "of", "LAMP", "-", "2", "deficient", "mice", "had", "a", "significantly", "lower", "baseline", "developed", "force", "at", "a", "stimulation", "frequency", "of", "4", " ", "Hz", "and", "10", " ", "Hz", ";", "P", " ", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Vacuole in a fibre of the soleus muscle. b, Ultrastructure of a vacuole in a cardiomyocyte. Scale bars: a, 1 µm; b, 1.5 µm.c, Typical original twitch recordings of developed force of heart muscles from control (thin line) and LAMP-2-deficient (thick line) mice. d, Average values of developed force. Preparations of LAMP-2 deficient mice had a significantly lower baseline developed force at a stimulation frequency of 4 Hz and 10 Hz; P  0.01."}
{"words": ["figf4a", ",", "Volume", "density", "of", "early", "(", "Avi", ")", "and", "late", "(", "Avd", ")", "autophagic", "vacuoles", "from", "four", "independent", "cultures", ".", "Examples", "of", "Avi", "and", "Avd", "are", "shown", "in", "b", "and", "c", ",", "respectively", ".", "Bars", "represent", "0", ".", "4", " ", "µm", ".", "d", ",", "Labelling", "density", "of", "cathepsin", "-", "D", "as", "estimated", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "e", ",", "Labelling", "density", "of", "LAMP", "-", "1", ".", "f", ",", "Degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "followed", "over", "24", " ", "h", "in", "amino", "acid", "and", "fetal", "-", "calf", "-", "serum", "-", "containing", "medium", ".", "g", ",", "Effect", "of", "amino", "-", "acid", "(", "AA", ")", "deprivation", "and", "3", "-", "methyladenine", "(", "MA", ")", "on", "protein", "degradation", "during", "4", " ", "h", "of", "chase", ".", "The", "error", "bars", "in", "a", ",", "d", ",", "e", "and", "g", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Volume density of early (Avi) and late (Avd) autophagic vacuoles from four independent cultures. Examples of Avi and Avd are shown in b and c, respectively. Bars represent 0.4 µm.d, Labelling density of cathepsin-D as estimated in two independent experiments. e, Labelling density of LAMP-1.f, Degradation of long-lived proteins followed over 24 h in amino acid and fetal-calf-serum-containing medium. g, Effect of amino-acid (AA) deprivation and 3-methyladenine (MA) on protein degradation during 4 h of chase. The error bars in a, d, e and g represent s.e.m."}
{"words": ["Figure", "1Localization", "of", "R", "-", "LPS", "(", "green", ")", "and", "S", "-", "LPS", "(", "red", ")", "in", "exponential", "phase", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Distribution", "of", "R", "-", "LPS", "and", "S", "-", "LPS", "in", "exponential", "phase", "culture", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "(", "one", "representative", "example", "among", "3", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "20", ",", "000", "events", ")", ".", "Numbers", "in", "each", "corner", "corresponds", "to", "%", "of", "relative", "frequencies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Localization of R-LPS (green) and S-LPS (red) in exponential phase bacteria. Scale bars: 2 μm. Distribution of R-LPS and S-LPS in exponential phase culture analyzed by flow cytometry (one representative example among 3 biological replicates, n = 20,000 events). Numbers in each corner corresponds to % of relative frequencies."}
{"words": ["Figure", "2Roughness", "measurements", "on", "R", "-", "LPS", "labeled", "(", "green", ")", "WT", "and", "Δgmd", "cells", ".", "AFM", "images", "of", "whole", "bacteria", "and", "of", "the", "separated", "areas", "(", "coloured", "squares", "in", "first", "images", ",", "0", ".", "4", "x", "0", ".", "4", "μm2", ")", "are", "shown", ".", "The", "arithmetic", "roughness", "Ra", "is", "indicated", "below", "each", "area", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "μm", ".", "Quantitative", "roughness", "measurement", "of", "R", "-", "LPS", "labeled", "WT", "and", "Δgmd", "cells", ".", "The", "areas", "with", "the", "lower", "roughness", "(", "more", "regular", "surfaces", ")", "of", "Δgmd", "cells", "were", "assigned", "as", "areas", "1", ".", "mAb", ":", "monoclonal", "antibody", ".", "Ab", ":", "antibody", ".", "nWT", "=", "13", "bacteria", ".", "nΔgmd", "=", "7", "bacteria", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "ns", ":", "not", "significant", ".", "Detection", "of", "forces", "between", "AFM", "tip", "functionalized", "with", "mAb", "against", "R", "-", "LPS", "and", "unlabeled", "WT", "cells", ".", "Height", "image", "and", "the", "corresponding", "adhesion", "image", "are", "shown", "on", "top", "and", "zooms", "of", "depicted", "areas", "(", "black", "squares", ",", "0", ".", "4", "x", "0", ".", "4", "μm2", ")", "below", ".", "The", "arithmetic", "roughness", "Ra", "and", "percentage", "of", "adhesion", "Padh", "are", "indicated", "below", "each", "area", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "μm", ".", "Correlation", "between", "roughness", "and", "detection", "of", "R", "-", "LPS", "on", "unlabeled", "WT", "cells", ".", "The", "areas", "with", "the", "lower", "roughness", "(", "more", "regular", "surfaces", ")", "were", "assigned", "as", "areas", "1", ".", "The", "boxplot", "represents", "the", "mean", "values", "(", "squares", ")", ",", "the", "median", "(", "horizontal", "line", ")", ",", "the", "25", "%", "and", "75", "%", "quartiles", "(", "box", "limits", ")", "and", "the", "standard", "deviations", "(", "whiskers", ")", ".", "n", "=", "9", "bacteria", ".", "Error", "bars", ":", "s", ".", "d", ".", "Statistical", "differences", "were", "analyzed", "by", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Roughness measurements on R-LPS labeled (green) WT and Δgmd cells. AFM images of whole bacteria and of the separated areas (coloured squares in first images, 0.4 x 0.4 μm2) are shown. The arithmetic roughness Ra is indicated below each area. Scale bars: 1 μm. Quantitative roughness measurement of R-LPS labeled WT and Δgmd cells. The areas with the lower roughness (more regular surfaces) of Δgmd cells were assigned as areas 1. mAb: monoclonal antibody. Ab: antibody. nWT = 13 bacteria. nΔgmd = 7 bacteria. Differences were statistically analyzed by t-test. **P < 0.01. ns: not significant.Detection of forces between AFM tip functionalized with mAb against R-LPS and unlabeled WT cells. Height image and the corresponding adhesion image are shown on top and zooms of depicted areas (black squares, 0.4 x 0.4 μm2) below. The arithmetic roughness Ra and percentage of adhesion Padh are indicated below each area. Scale bar: 1 μm. Correlation between roughness and detection of R-LPS on unlabeled WT cells. The areas with the lower roughness (more regular surfaces) were assigned as areas 1. The boxplot represents the mean values (squares), the median (horizontal line), the 25% and 75% quartiles (box limits) and the standard deviations (whiskers). n = 9 bacteria. Error bars: s.d. Statistical differences were analyzed by t-test. **P < 0.01. *P < 0.05."}
{"words": ["Figure", "3Co", "-", "localization", "of", "Omp2b", "(", "red", ")", "and", "R", "-", "LPS", "(", "green", ")", "in", "exponential", "phase", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Co", "-", "detection", "of", "Omp2b", "(", "red", ")", "and", "R", "-", "LPS", "by", "AFM", ".", "R", "-", "LPS", "was", "detected", "using", "AFM", "tips", "functionalized", "with", "mAb", "against", "R", "-", "LPS", ".", "AFM", "images", "of", "whole", "bacteria", "and", "of", "the", "separated", "areas", "(", "red", "squares", "in", "first", "images", ",", "0", ".", "4", "x", "0", ".", "4", "μm2", ")", "are", "shown", ".", "The", "percentages", "of", "adhesion", "Padh", "are", "indicated", "below", "each", "area", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "μm", ".", "Adhesion", "ratio", "between", "the", "Omp2b", "positive", "area", "compared", "to", "the", "Omp2b", "negative", "area", ".", "Grey", "dashed", "line", "shows", "ratio", "=", "1", "corresponding", "to", "homogeneity", "in", "surface", "structure", ".", "nWT", "=", "13", "bacteria", ",", "nΔgmd", "=", "13", "bacteria", ".", "Statistical", "analysis", "with", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "showed", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Co-localization of Omp2b (red) and R-LPS (green) in exponential phase bacteria. Scale bars: 2 μm.Co-detection of Omp2b (red) and R-LPS by AFM. R-LPS was detected using AFM tips functionalized with mAb against R-LPS. AFM images of whole bacteria and of the separated areas (red squares in first images, 0.4 x 0.4 μm2) are shown. The percentages of adhesion Padh are indicated below each area. Scale bars: 1 μm.Adhesion ratio between the Omp2b positive area compared to the Omp2b negative area. Grey dashed line shows ratio = 1 corresponding to homogeneity in surface structure. nWT = 13 bacteria, nΔgmd = 13 bacteria. Statistical analysis with Mann-Whitney U test showed **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4Localization", "of", "initially", "labeled", "Omp25", "(", "green", ")", "on", "TRSE", "-", "labeled", "(", "red", ")", "bacteria", "before", "(", "0", "h", ")", "and", "after", "2", "h", "of", "growth", "in", "the", "absence", "of", "both", "labelings", "(", "2", "h", ")", ".", "As", "a", "control", ",", "Omp25", "localization", "after", "pulse", "-", "chase", "labeling", "with", "TRSE", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "panel", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Localization", "of", "initially", "labeled", "Omp2b", "(", "green", ")", "on", "TRSE", "-", "labeled", "(", "red", ")", "bacteria", "before", "(", "0", "h", ")", "and", "after", "2", "h", "of", "growth", "in", "the", "absence", "of", "both", "labelings", "(", "2", "h", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Co", "-", "localization", "of", "Omp25", "and", "Omp2b", "positive", "pixels", "with", "TRSE", "positive", "or", "negative", "pixels", ",", "respectively", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "s", ".", "d", ".", "from", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "nOmp25", "=", "279", "bacteria", ",", "85666", "pixels", "(", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "nOmp2b", "=", "252", "bacteria", ",", "74630", "pixels", "(", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Localization of initially labeled Omp25 (green) on TRSE-labeled (red) bacteria before (0 h) and after 2 h of growth in the absence of both labelings (2 h). As a control, Omp25 localization after pulse-chase labeling with TRSE is shown at the bottom panel. Scale bars: 2 μm.Localization of initially labeled Omp2b (green) on TRSE-labeled (red) bacteria before (0 h) and after 2 h of growth in the absence of both labelings (2 h). Scale bars: 2 μm.Co-localization of Omp25 and Omp2b positive pixels with TRSE positive or negative pixels, respectively. Error bars correspond to s.d. from independent experiments. Differences were statistically analyzed by t-test. ***P < 0.001. nOmp25 = 279 bacteria, 85666 pixels (5 biological replicates). nOmp2b = 252 bacteria, 74630 pixels (3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5Short", "pulse", "labeling", "of", "exponential", "phase", "bacteria", "with", "the", "fluorescent", "D", "-", "amino", "acid", "HADA", ".", "Merge", "is", "showing", "old", "pole", "marker", "PdhS", "-", "mCherry", "(", "red", ")", "and", "PG", "insertion", "sites", "(", "white", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Demographic", "representation", "of", "HADA", "labeling", ".", "Bacteria", "were", "sorted", "according", "to", "their", "cell", "length", "and", "oriented", "with", "the", "old", "pole", "at", "the", "bottom", "of", "the", "demograph", "by", "PdhS", "-", "mCherry", "fluorescence", "signal", ".", "NFI", ":", "normalized", "fluorescence", "intensity", ".", "n", "=", "393", "bacteria", "(", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Short pulse labeling of exponential phase bacteria with the fluorescent D-amino acid HADA. Merge is showing old pole marker PdhS-mCherry (red) and PG insertion sites (white). Scale bars: 2 μm.Demographic representation of HADA labeling. Bacteria were sorted according to their cell length and oriented with the old pole at the bottom of the demograph by PdhS-mCherry fluorescence signal. NFI: normalized fluorescence intensity. n = 393 bacteria (3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "6Localization", "of", "S", "-", "LPS", "(", "green", ")", "in", "the", "eFluor", "-", "labeled", "(", "magenta", ")", "inducible", "rough", "strain", "Δgmd", "plac", "-", "gmd", "possessing", "the", "old", "pole", "marker", "PdhS", "-", "mCherry", "(", "red", ")", ".", "The", "strains", "Δgmd", "and", "Δgmd", "plac", "-", "gmd", "-", "IPTG", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Demograph", "represents", "fluorescence", "profile", "of", "S", "-", "LPS", "labeling", "from", "(", "A", ")", ".", "Cells", "were", "oriented", "with", "the", "old", "pole", "at", "the", "bottom", "of", "the", "graph", "by", "PdhS", "-", "mCherry", "and", "sorted", "by", "cell", "length", ".", "NFI", ":", "normalized", "fluorescence", "intensity", ".", "n", "=", "468", "bacteria", "(", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Short", "pulse", "labeling", "of", "LPS", "(", "2", "h", ")", "by", "Kdo", "-", "N3", "(", "green", ")", "on", "eFluor", "-", "labeled", "(", "magenta", ")", "bacteria", "expressing", "the", "old", "pole", "marker", "PdhS", "-", "mCherry", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Demographs", "represent", "fluorescence", "intensities", "of", "eFluor", "(", "OM", ",", "left", ")", "and", "Kdo", "-", "N3", "(", "LPS", ",", "right", ")", "labeling", ".", "Cells", "were", "sorted", "by", "cell", "length", "and", "aligned", "with", "the", "old", "pole", "at", "the", "bottom", "of", "the", "graph", "by", "PdhS", "-", "mCherry", "localization", ".", "NFI", ":", "normalized", "fluorescence", "intensity", ".", "n", "=", "566", "bacteria", "(", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Localization of S-LPS (green) in the eFluor-labeled (magenta) inducible rough strain Δgmd plac-gmd possessing the old pole marker PdhS-mCherry (red). The strains Δgmd and Δgmd plac-gmd -IPTG were used as negative controls. Scale bars: 2 μm.Demograph represents fluorescence profile of S-LPS labeling from (A). Cells were oriented with the old pole at the bottom of the graph by PdhS-mCherry and sorted by cell length. NFI: normalized fluorescence intensity. n = 468 bacteria (3 biological replicates).Short pulse labeling of LPS (2 h) by Kdo-N3 (green) on eFluor-labeled (magenta) bacteria expressing the old pole marker PdhS-mCherry (red). Scale bars: 2 μm.Demographs represent fluorescence intensities of eFluor (OM, left) and Kdo-N3 (LPS, right) labeling. Cells were sorted by cell length and aligned with the old pole at the bottom of the graph by PdhS-mCherry localization. NFI: normalized fluorescence intensity. n = 566 bacteria (3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "7Distribution", "of", "R", "-", "LPS", "and", "S", "-", "LPS", "in", "Δgmd", "plac", "-", "gmd", "after", "3", ",", "6", ",", "9", "and", "24", "h", "post", "-", "induction", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "(", "one", "representative", "example", "among", "3", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "20", ",", "000", "events", ")", ".", "Quantification", "of", "S", "-", "LPS", "labeling", "from", "(", "A", ")", "as", "relative", "frequencies", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "s", ".", "d", ".", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "n0h", "=", "77", "bacteria", ",", "n3h", "=", "254", "bacteria", ",", "n6h", "=", "616", "bacteria", ",", "n9h", "=", "937", "bacteria", ",", "n24h", "=", "1059", "bacteria", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Distribution of R-LPS and S-LPS in Δgmd plac-gmd after 3, 6, 9 and 24 h post-induction analyzed by flow cytometry (one representative example among 3 biological replicates, n = 20,000 events).Quantification of S-LPS labeling from (A) as relative frequencies. Error bars correspond to s.d. from 3 independent experiments. n0h = 77 bacteria, n3h = 254 bacteria, n6h = 616 bacteria, n9h = 937 bacteria, n24h = 1059 bacteria."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Binding", "assay", "for", "Hsc70", "binding", "in", "the", "presence", "of", "WT", "DNAJB1", ":", "control", "of", "DNAJB1", "/", "Hsc70", ",", "αSyn", "fibres", "+", "DNAJB1", "/", "Hsc70", ",", "αSyn", "fibres", "+", "DNAJB1", "/", "Hsc70", "/", "Apg2", ",", "control", "of", "DNAJB1", "/", "Hsc70", "/", "Apg2", ".", "The", "'", "*", "'", "highlights", "the", "condition", "where", "an", "increase", "of", "Hsc70", "in", "the", "bound", "fraction", "is", "observed", ".", "P", ",", "pellet", ";", "S", ",", "supernatant", ".", "The", "amount", "of", "Hsc70", "recruited", "to", "the", "fibres", "is", "shown", "in", "the", "pellet", "fractions", ".", "(", "B", ")", "Binding", "assay", "for", "Hsc70", "binding", "in", "the", "presence", "of", "the", "truncated", "ΔJ", "-", "DNAJB1", ",", "lacking", "the", "J", "domain", ".", "The", "gel", "layout", "is", "similar", "to", "the", "previous", "one", "with", "ΔJ", "-", "DNAJB1", "replacing", "WT", "DNAJB1", ".", "Both", "Apg2", "and", "J", "domain", "are", "required", "for", "enhancement", "of", "Hsc70", "binding", ".", "(", "C", ")", "Histogram", "of", "Hsc70", "bound", "fraction", "in", "each", "sample", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "WT", ":", "WT", "DNAJB1", ",", "ΔJ", ":", "ΔJ", "-", "DNAJB1", "mutant", ",", "-", "Apg2", ":", "condition", "with", "fibres", "+", "DNAJB1", "/", "Hsc70", ",", "+", "Apg2", ":", "condition", "with", "fibres", "+", "DNAJB1", "/", "Hsc70", "/", "Apg2", ")", ".", "A", "2", "-", "way", "ANOVA", "was", "performed", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "*", "*", ":", "P", "=", "0", ".", "003", ";", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Mean", "Hsc70", "binding", "values", "with", "SD", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "TIRF", "microscopy", "images", "of", "the", "labelled", "αSyn", "fibres", "and", "Hsc70", "in", "the", "absence", "or", "in", "the", "presence", "of", "Apg2", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Quantitation", "of", "fluorescence", "intensity", "of", "Hsc70", "(", "E", ")", "and", "αSyn", "(", "F", ")", "in", "the", "two", "conditions", "(", "+", "/", "-", "Apg2", ",", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "65", "fibres", ")", ".", "Mean", "Hsc70", "and", "αSyn", "fluorescence", "intensities", "with", "SD", "are", "shown", ".", "(", "G", ")", "Quantitation", "of", "differences", "in", "Hsc70", "binding", "between", "the", "two", "ends", "of", "the", "fibres", ",", "normalised", "to", "the", "local", "αSyn", "intensity", ",", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "Apg2", "(", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "54", "fibres", ")", ".", "Mean", "Hsc70", "fluorescence", "intensities", "with", "SD", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", "-", "G", ")", "For", "each", "plot", ",", "data", "were", "tested", "for", "normality", "by", "performing", "a", "Shapiro", "-", "Wilk", "test", ".", "As", "the", "data", "did", "not", "display", "a", "normal", "distribution", ",", "they", "were", "analysed", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Binding assay for Hsc70 binding in the presence of WT DNAJB1: control of DNAJB1/Hsc70, αSyn fibres + DNAJB1/Hsc70, αSyn fibres + DNAJB1/Hsc70/Apg2, control of DNAJB1/Hsc70/Apg2. The '*' highlights the condition where an increase of Hsc70 in the bound fraction is observed. P, pellet; S, supernatant. The amount of Hsc70 recruited to the fibres is shown in the pellet fractions. (B) Binding assay for Hsc70 binding in the presence of the truncated ΔJ-DNAJB1, lacking the J domain. The gel layout is similar to the previous one with ΔJ-DNAJB1 replacing WT DNAJB1. Both Apg2 and J domain are required for enhancement of Hsc70 binding. (C) Histogram of Hsc70 bound fraction in each sample (N = 3 independent experiments, WT: WT DNAJB1, ΔJ: ΔJ-DNAJB1 mutant, -Apg2: condition with fibres + DNAJB1/Hsc70, +Apg2: condition with fibres + DNAJB1/Hsc70/Apg2). A 2-way ANOVA was performed with Tukey's multiple comparisons test (**: P=0.003; ****: P<0.0001). Mean Hsc70 binding values with SD are shown.(D) TIRF microscopy images of the labelled αSyn fibres and Hsc70 in the absence or in the presence of Apg2. Scale bar, 1 µm. (E, F) Quantitation of fluorescence intensity of Hsc70 (E) and αSyn (F) in the two conditions (+/- Apg2, N = 3 independent experiments, n = 65 fibres). Mean Hsc70 and αSyn fluorescence intensities with SD are shown. (G) Quantitation of differences in Hsc70 binding between the two ends of the fibres, normalised to the local αSyn intensity, in the absence and presence of Apg2 (N = 3 independent experiments, n = 54 fibres). Mean Hsc70 fluorescence intensities with SD are shown. Data information: (E-G) For each plot, data were tested for normality by performing a Shapiro-Wilk test. As the data did not display a normal distribution, they were analysed using a two-tailed Mann-Whitney test (****: P<0.0001, ns: not significant)."}
{"words": ["Figure", "5Binding", "assay", "with", "different", "dilutions", "of", "Apg2", "incubated", "with", "DNAJB1", "/", "Hsc70", "and", "(", "A", ")", "with", "αSyn", "fibres", "or", "(", "B", ")", "without", "αSyn", "fibres", "(", "control", ")", ".", "5", "mM", "ATP", "was", "present", "in", "the", "buffer", "throughout", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Binding assay with different dilutions of Apg2 incubated with DNAJB1/Hsc70 and (A) with αSyn fibres or (B) without αSyn fibres (control). 5 mM ATP was present in the buffer throughout."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "L", ")", "Serum", "starved", "HUVECs", "were", "stimulated", "with", "designed", "scaffolds", "normalized", "to", "18", "nM", "of", "F", "-", "domains", "for", "15", "minutes", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "for", "pAKT", "(", "S473", ")", ",", "pERK1", "/", "2", "(", "T202", "/", "Y204", ")", ",", "and", "pFAK", "(", "Y397", ")", "phosphorylation", ".", "A", ",", "E", ",", "I", ")", "pAKT", ",", "B", ",", "F", ",", "J", ")", "pERK1", "/", "2", ",", "and", "C", ",", "G", ",", "K", ")", "pFAK", "phosphorylation", "levels", "are", "quantified", "and", "normalized", "to", "Icos", "-", "cage", "signaling", "levels", ".", "Appendix", "Figure", "S1B", "shows", "the", "detection", "of", "two", "bands", "expected", "for", "pERK1", "/", "2", ".", "Representative", "immunoblot", "gels", "of", "cells", "stimulated", "with", "or", "without", "scaffolds", "at", "18", "nM", "of", "F", "-", "domain", ":", "D", ")", "helical", "bundles", ",", "H", ")", "trimeric", "and", "tetrameric", "homo", "-", "oligomers", "and", "tetrahedral", "nanocages", ",", "L", ")", "Icosahedral", "nanocages", "and", "trimeric", "subunit", ".", "M", "-", "P", ")", "Dose", "-", "response", "curves", ",", "EC50", ",", "and", "EMAX", "for", "pAKT", "and", "pERK1", "/", "2", "activation", ".", "The", "curves", ",", "EC50", "and", "EMAX", "values", "are", "calculated", "using", "Prism", ",", "GraphPad", ".", "N", ",", "P", ")", "Darker", "red", "color", "indicate", "lower", "EC50", "and", "higher", "EMAX", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-L) Serum starved HUVECs were stimulated with designed scaffolds normalized to 18 nM of F-domains for 15 minutes and analyzed by immunoblotting for pAKT (S473), pERK1/2 (T202/Y204), and pFAK (Y397) phosphorylation. A, E, I) pAKT, B, F, J) pERK1/2, and C, G, K) pFAK phosphorylation levels are quantified and normalized to Icos-cage signaling levels. Appendix Figure S1B shows the detection of two bands expected for pERK1/2. Representative immunoblot gels of cells stimulated with or without scaffolds at 18 nM of F-domain: D) helical bundles, H) trimeric and tetrameric homo-oligomers and tetrahedral nanocages, L) Icosahedral nanocages and trimeric subunit.M-P) Dose-response curves, EC50, and EMAX for pAKT and pERK1/2 activation. The curves, EC50 and EMAX values are calculated using Prism, GraphPad. N, P) Darker red color indicate lower EC50 and higher EMAX values."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Comparison", "of", "cell", "migration", "induced", "by", "Ang1", ",", "Ang2", ",", "and", "designed", "F", "-", "domain", "scaffolds", "after", "12", "hours", "of", "treatment", ".", "The", "change", "in", "wound", "area", "is", "normalized", "to", "vehicle", "control", ".", "All", "experiments", "have", "at", "least", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "*", ")", "is", "the", "comparison", "between", "F", "-", "domain", "scaffolds", "vs", "Ang1", ",", "and", "(", "#", ")", "is", "the", "comparison", "between", "F", "-", "domain", "scaffolds", "vs", "Vehicle", ".", "E", ")", "Representative", "increase", "in", "vascular", "stability", "by", "Icos1", ".", "The", "number", "of", "nodes", "(", "blue", ")", ",", "meshes", "(", "red", ")", ",", "and", "tubes", "(", "green", ")", "were", "quantified", "using", "angiogenesis", "analyzer", "plugin", "in", "ImageJ", ".", "Scale", "bar", "is100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Comparison of cell migration induced by Ang1, Ang2, and designed F-domain scaffolds after 12 hours of treatment. The change in wound area is normalized to vehicle control. All experiments have at least 3 biological replicates. (*) is the comparison between F-domain scaffolds vs Ang1, and (#) is the comparison between F-domain scaffolds vs Vehicle.E) Representative increase in vascular stability by Icos1. The number of nodes (blue), meshes (red), and tubes (green) were quantified using angiogenesis analyzer plugin in ImageJ. Scale bar is100 µm."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", ")", "Representative", "images", "of", "FOXO1", "localization", "upon", "scaffolds", "administration", ".", "Scale", "bars", "are", "10", "µm", "D", ")", "Quantifications", "of", "nuclear", "FOXO1", "shown", "as", "percent", "of", "cells", "with", "nuclear", "FOXO1", "stain", ",", "100", "cells", "were", "counted", "per", "sample", ".", "E", ")", "Cells", "were", "stimulated", "with", "scaffolds", "or", "angiopoietins", "and", "stained", "with", "Tie2", "antibodies", "for", "analyzing", "plasma", "membrane", "Tie2", "clusters", ".", "Dark", "gray", "bars", ":", "Quantification", "shows", "the", "percent", "%", "of", "total", "cells", "that", "exhibit", "large", "Tie2", "clusters", "on", "the", "plasma", "membrane", ".", "K", ",", "L", ")", "Representatives", "immunoblot", "gel", "(", "K", ")", "and", "quantifications", "(", "L", ")", "for", "α5", "integrin", "knockdown", "experiments", "using", "20", "nM", "of", "siRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C) Representative images of FOXO1 localization upon scaffolds administration. Scale bars are 10 µm D) Quantifications of nuclear FOXO1 shown as percent of cells with nuclear FOXO1 stain, 100 cells were counted per sample. E) Cells were stimulated with scaffolds or angiopoietins and stained with Tie2 antibodies for analyzing plasma membrane Tie2 clusters. Dark gray bars: Quantification shows the percent % of total cells that exhibit large Tie2 clusters on the plasma membrane.K, L) Representatives immunoblot gel (K) and quantifications (L) for α5 integrin knockdown experiments using 20 nM of siRNA."}
{"words": ["Figure", "5C", ",", "D", ")", "CCI", "-", "TBI", "brain", "sections", "were", "stained", "for", "reactive", "astrocytes", "(", "GFAP", ",", "blue", ")", ",", "microglia", "(", "Iba1", ",", "green", ")", "and", "serum", "albumin", "(", "magenta", ")", "to", "highlight", "tissue", "margins", "(", "dotted", "white", "line", ")", "and", "quantify", "secondary", "damage", "as", "a", "function", "of", "lesion", "area", "(", "E", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "4", ",", "the", "mean", "±", "SEM", "is", "plotted", ")", ".", "Bar", ",", "1", "mm", ".", "E", ")", "Cumulative", "blood", "extravasation", "into", "brain", "tissue", "(", "white", "outline", ")", "was", "imaged", "by", "albumin", "immunofluorescence", "to", "establish", "an", "unbiased", "intensity", "-", "threshold", "mask", "(", "red", ")", "and", "quantify", "the", "area", "of", "blood", "serum", "extravasation", "(", "mm2", ")", "in", "Icos1ø", "vs", ".", "Icos1", "treated", "animals", "(", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "4", ",", "the", "mean", "±", "SEM", "is", "plotted", ")", ".", "Scale", "bar", "is", "500", "µm", ".", "F", "-", "H", ")", "Brain", "tissues", "stained", "by", "GFAP", "-", "(", "magenta", ")", "and", "CD31", "-", "immunofluorescence", "(", "green", ")", "were", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", "to", "measure", "angiogenesis", "as", "a", "function", "of", "vessel", "diameter", "(", "G", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "003", ",", "n", "=", "4", ",", "the", "boxes", "show", "25th", "to", "75th", "percentiles", "and", "whiskers", "represent", "the", "min", "and", "max", "values", ".", ")", "and", "quantify", "the", "number", "of", "CD31", "-", "vessels", "(", "H", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "007", ",", "n", "=", "4", ",", "the", "mean", "±", "SEM", "is", "plotted", ")", "at", "the", "site", "of", "injury", "in", "Icos1ø", "and", "Icos1", "treated", "animals", "4", "days", "post", "-", "injury", ".", "Scale", "bars", "in", "G", "and", "H", "is", "100", "µm", ".", "I", ")", "Activation", "of", "pAKT", "(", "Magenta", ")", "was", "examined", "in", "Icos1ø", "and", "Icos1", "treated", "-", "animals", "within", "or", "around", "vascular", "(", "CD31", "+", ",", "green", ")", "and", "pericytes", "(", "NG2", "+", "cells", ",", "yellow", ")", "of", "the", "BBB", ".", "High", "-", "resolution", "confocal", "images", "(", "insets", ")", "reveal", "the", "prevalence", "of", "activated", "pAKT", "(", "magenta", ")", "co", "-", "stain", "(", "cyan", "arrows", ")", "in", "pericytes", "(", "yellow", ")", "of", "the", "BBB", "along", "vasculature", "(", "green", ",", "or", "dotted", "outline", ")", "versus", "reactive", "neuroglia", "(", "NG2", "+", "pAKT", "-", ")", "in", "the", "parenchyma", "(", "red", "arrows", ")", "in", "Icos1ø", "vs", ".", "Icos1", "treated", "animals", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C, D) CCI-TBI brain sections were stained for reactive astrocytes (GFAP, blue), microglia (Iba1, green) and serum albumin (magenta) to highlight tissue margins (dotted white line) and quantify secondary damage as a function of lesion area (E; *p = 0.04, n = 4, the mean ± SEM is plotted ). Bar, 1 mm. E) Cumulative blood extravasation into brain tissue (white outline) was imaged by albumin immunofluorescence to establish an unbiased intensity-threshold mask (red) and quantify the area of blood serum extravasation (mm2) in Icos1ø vs. Icos1 treated animals (**p = 0.01, n = 4, the mean ± SEM is plotted). Scale bar is 500 µm. F-H) Brain tissues stained by GFAP- (magenta) and CD31-immunofluorescence (green) were imaged by confocal microscopy to measure angiogenesis as a function of vessel diameter (G; **p = 0.003, n = 4, the boxes show 25th to 75th percentiles and whiskers represent the min and max values.) and quantify the number of CD31-vessels (H; **p = 0.007, n = 4, the mean ± SEM is plotted) at the site of injury in Icos1ø and Icos1 treated animals 4 days post-injury. Scale bars in G and H is 100 µm.I) Activation of pAKT (Magenta) was examined in Icos1ø and Icos1 treated-animals within or around vascular (CD31+, green) and pericytes (NG2+ cells, yellow) of the BBB. High-resolution confocal images (insets) reveal the prevalence of activated pAKT (magenta) co-stain (cyan arrows) in pericytes (yellow) of the BBB along vasculature (green, or dotted outline) versus reactive neuroglia (NG2+pAKT-) in the parenchyma (red arrows) in Icos1ø vs. Icos1 treated animals. Scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", "Age", ",", "gender", "and", "BMI", "information", "of", "the", "Ashkenazi", "Jewish", "Centenarian", "cohort", ".", "Table", "showing", "the", "age", ",", "gender", "and", "BMI", "information", "in", "control", "and", "centenarian", "groups", ".", "Pie", "chart", "showing", "the", "percentage", "of", "male", "/", "female", "individuals", "in", "control", "and", "centenarian", "groups", ".", "Right", "panel", "showing", "the", "age", "and", "BMI", "distribution", "of", "all", "individuals", "recruited", "in", "targeted", "capture", "-", "seq", ".", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "and", "SD", ",", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "B", ",", "C", "Histograms", "of", "normalized", "allele", "counts", "in", "individuals", "75", "+", "years", "old", "compared", "to", "all", "age", "groups", "(", "N", "=", "125", ",", "748", ")", "across", "(", "B", ")", "all", "chromosome", "19", "SNPs", "and", "small", "insertions", "/", "deletions", ",", "and", "(", "C", ")", "missense", "SNPs", "and", "indels", "only", ".", "Dotted", "vertical", "lines", "show", "centSIRT6", ".", "E", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetic", "parameters", "as", "calculated", "by", "saturation", "curves", "using", "differential", "concentrations", "of", "myristoylated", "peptide", "or", "NAD", "+", ".", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "(", "TR", ")", ";", "error", "bars", "=", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Age, gender and BMI information of the Ashkenazi Jewish Centenarian cohort. Table showing the age, gender and BMI information in control and centenarian groups. Pie chart showing the percentage of male/female individuals in control and centenarian groups. Right panel showing the age and BMI distribution of all individuals recruited in targeted capture-seq. Data were presented as mean and SD, Students t-test, two tailed, *** p<0.001.B, C Histograms of normalized allele counts in individuals 75+ years old compared to all age groups (N=125,748) across (B) all chromosome 19 SNPs and small insertions/deletions, and (C) missense SNPs and indels only. Dotted vertical lines show centSIRT6.E Michaelis-Menten kinetic parameters as calculated by saturation curves using differential concentrations of myristoylated peptide or NAD+. n=3 technical replicates (TR); error bars=SD."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Deacetylase", "activity", "on", "H3K9", "(", "A", ")", "and", "H3K18", "(", "B", ")", "residues", "shows", "reduced", "activity", "in", "centSIRT6", "allele", ".", "Designer", "histones", "were", "incubated", "with", "purified", "SIRT6", "and", "5", "mM", "NAD", "+", ",", "then", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "acetyl", "-", "specific", "histone", "antibodies", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Asterisks", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "WT", ",", "color", "corresponds", "to", "allele", ".", "H3K9ac", ",", "H3K18ac", "and", "H3", "are", "blots", ",", "SIRT6", "loading", "Coomassie", "stain", "HeLa", "histone", "preps", "were", "also", "probedC", "Quantitative", "mass", "spec", "of", "histone", "H3", "peptide", "purified", "from", "human", "cells", "expressing", "different", "SIRT6", "alleles", "did", "not", "reveal", "a", "difference", "in", "acetylation", "levels", ".", "Relative", "fraction", "represents", "the", "portion", "of", "the", "peptide", "encompassing", "H3K9", "-", "17", "compared", "to", "the", "summed", "total", "of", "all", "of", "the", "peptide", "quantitation", "values", "for", "the", "same", "region", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "BR", ")", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailedD", "Whole", "cell", "histone", "H3", "acetylation", "levels", "in", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "human", "fibroblasts", ",", "assessed", "by", "Western", "blot", ".", "Cu", ",", "cumate", ";", "PQ", ",", "paraquat", ".", "Cumate", "dosage", "required", "for", "equivalent", "SIRT6", "protein", "abundance", "was", "determined", "by", "Western", "blot", ",", "and", "administered", "accordingly", "to", "respective", "cell", "lines", "Cells", "were", "incubated", "with", "appropriate", "cumate", "dose", "for", "48hrs", "prior", "to", "harvest", ",", "with", "PQ", "-", "treated", "cells", "receiving", "PQ", "24hrs", "after", "initial", "cumate", "induction", ".", "E", "-", "H", "Relative", "abundance", "of", "H3K9ac", "at", "SIRT6", "-", "dependent", "NF", "-", "κB", "target", "genes", ".", "Anti", "-", "H3K9ac", "antibodies", "were", "used", "to", "perform", "ChIP", "in", "the", "absence", "(", "-", "Cu", ")", "or", "presence", "of", "(", "+", "Cu", ")", "cumate", "-", "induced", "SIRT6", "expression", ".", "Samples", "were", "normalized", "using", "10", "%", "input", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Black", "asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "-", "Cu", "condition", ".", "Red", "asterisk", "indicated", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "+", "Cu", "WT", ".", "I", ",", "J", "Relative", "abundance", "of", "H3K18ac", "at", "satellite", "repeats", "associated", "with", "SIRT6", "deacetylase", "activity", ".", "Anti", "-", "H3K18ac", "antibodies", "were", "used", "to", "perform", "ChIP", "in", "the", "absence", "(", "-", "Cu", ")", "or", "presence", "of", "(", "+", "Cu", ")", "cumate", "-", "induced", "SIRT6", "expression", ".", "Samples", "were", "normalized", "using", "10", "%", "input", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Black", "asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "-", "Cu", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B Deacetylase activity on H3K9 (A) and H3K18 (B) residues shows reduced activity in centSIRT6 allele. Designer histones were incubated with purified SIRT6 and 5 mM NAD+, then resolved by SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with acetyl-specific histone antibodies. n=3 TR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Asterisks indicate p<0.05 compared to WT, color corresponds to allele. H3K9ac, H3K18ac and H3 are blots, SIRT6 loading Coomassie stain HeLa histone preps were also probedC Quantitative mass spec of histone H3 peptide purified from human cells expressing different SIRT6 alleles did not reveal a difference in acetylation levels. Relative fraction represents the portion of the peptide encompassing H3K9-17 compared to the summed total of all of the peptide quantitation values for the same region. n=3 biological replicates (BR); error bars=SD. Students t-test, two tailedD Whole cell histone H3 acetylation levels in cumate-inducible SIRT6 human fibroblasts, assessed by Western blot. Cu, cumate; PQ, paraquat. Cumate dosage required for equivalent SIRT6 protein abundance was determined by Western blot, and administered accordingly to respective cell lines Cells were incubated with appropriate cumate dose for 48hrs prior to harvest, with PQ-treated cells receiving PQ 24hrs after initial cumate induction.E-H Relative abundance of H3K9ac at SIRT6-dependent NF-κB target genes. Anti-H3K9ac antibodies were used to perform ChIP in the absence (-Cu) or presence of (+Cu) cumate-induced SIRT6 expression. Samples were normalized using 10% input. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Black asterisk indicate p<0.05 compared to -Cu condition. Red asterisk indicated p<0.05 compared to +Cu WT.I, J Relative abundance of H3K18ac at satellite repeats associated with SIRT6 deacetylase activity. Anti-H3K18ac antibodies were used to perform ChIP in the absence (-Cu) or presence of (+Cu) cumate-induced SIRT6 expression. Samples were normalized using 10% input. n=3 TR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Black asterisk indicate p<0.05 compared to -Cu condition."}
{"words": ["Figure", "3A", "Self", "-", "ribosylation", "of", "SIRT6", "using", "biotin", "-", "labeled", "NAD", "+", ".", "Recombinant", "SIRT6", "was", "incubated", "with", "NAD", "+", "conjugated", "with", "a", "biotin", "residue", "and", "then", "run", "on", "an", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Each", "allele", "was", "assessed", "relative", "to", "its", "0", "hr", "time", "point", "and", "normalized", "to", "SIRT6", "total", "protein", "loading", "controls", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Black", "asterisks", "indicate", "significance", "over", "0", "hr", "control", ".", "Red", "asterisks", "indicated", "significance", "over", "time", "-", "matched", "WT", "SIRT6", ".", "B", "Self", "-", "ribosylation", "of", "SIRT6", "with", "titration", "of", "NAD", "+", ".", "mADPr", "-", "specific", "antibody", "was", "used", "to", "detect", "ribosylated", "wild", "type", "SIRT6", "and", "centSIRT6", "proteins", ".", "Plot", "was", "fit", "the", "Michaelis", "-", "Menten", "best", "-", "fit", "with", "GraphPad", "software", ".", "Km", "NAD", "was", "142", "+", "29", "for", "centSIRT6", "and", "106", "+", "45", "for", "wild", "type", "SIRT6", "and", "maximal", "signal", "was", "~", "2x", "greater", "for", "centSIRT6", "compared", "to", "the", "wild", "type", "SIRT6", ".", "Two", "separate", "batches", "of", "recombinant", "protein", "of", "each", "SIRT6", "allele", "were", "prepared", "and", "assayed", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "C", "Activation", "of", "PARP1", "by", "SIRT6", "variants", ".", "SIRT6", "protein", "was", "incubated", "with", "human", "PARP1", "protein", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "poly", "-", "ADPr", "antibody", ".", "Poly", "-", "ADPr", "activity", "of", "PARP1", "results", "in", "a", "wide", "range", "of", "product", "size", ".", "Activity", "was", "assessed", "by", "quantifying", "poly", "-", "ADPr", "signal", "in", "whole", "lanes", "for", "each", "sample", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Black", "asterisks", "indicate", "significance", "over", "HPRT", "control", ".", "Red", "asterisks", "indicated", "significance", "over", "wild", "type", "SIRT6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Self-ribosylation of SIRT6 using biotin-labeled NAD+. Recombinant SIRT6 was incubated with NAD+ conjugated with a biotin residue and then run on an SDS-PAGE. Each allele was assessed relative to its 0 hr time point and normalized to SIRT6 total protein loading controls. n=3 TR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Asterisk indicate p<0.05. Black asterisks indicate significance over 0 hr control. Red asterisks indicated significance over time-matched WT SIRT6.B Self-ribosylation of SIRT6 with titration of NAD+. mADPr-specific antibody was used to detect ribosylated wild type SIRT6 and centSIRT6 proteins. Plot was fit the Michaelis-Menten best-fit with GraphPad software. Km NAD was 142+29 for centSIRT6 and 106+45 for wild type SIRT6 and maximal signal was ~2x greater for centSIRT6 compared to the wild type SIRT6. Two separate batches of recombinant protein of each SIRT6 allele were prepared and assayed. n=3 TR; error bars=SD.C Activation of PARP1 by SIRT6 variants. SIRT6 protein was incubated with human PARP1 protein and then analyzed by immunoblotting with poly-ADPr antibody. Poly-ADPr activity of PARP1 results in a wide range of product size. Activity was assessed by quantifying poly-ADPr signal in whole lanes for each sample. n=3 TR; error bars=SD. Two-way ANOVA. Asterisk indicate p<0.05. Black asterisks indicate significance over HPRT control. Red asterisks indicated significance over wild type SIRT6."}
{"words": ["Figure", "4A", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "LINE1", "expression", "in", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", ".", "Primers", "assessed", "both", "5", "'", "(", "ORF1", ")", "and", "3", "'", "(", "ORF2", ")", "LINE1", "sequences", "from", "the", "L1HS", "family", "of", "evolutionarily", "active", "LINE1", "retrotransposons", ".", "Assessment", "of", "both", "regions", "was", "conducted", "to", "mitigate", "contributions", "from", "partial", "insertion", "sequences", "in", "coding", "genes", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "TR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "B", "LINE1", "EGFP", "retrotransposition", "assay", ".", "Three", "independent", "transfections", "with", "LINE1", "EGFP", "reporter", "plasmid", "were", "conducted", "and", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Red", "asterisk", "indicated", "significance", "over", "SIRT6", "KO", "control", ".", "Black", "asterisk", "indicate", "significance", "over", "WT", "SIRT6", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ".", "C", "In", "vitro", "KAP1", "ribosylation", "by", "SIRT6", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Red", "asterisk", "indicate", "significance", "over", "0", "hr", ",", "black", "asterisk", "indicate", "significance", "over", "compared", "to", "WT", "SIRT6", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "D", ",", "E", "Stimulation", "of", "NHEJ", "and", "HR", "by", "SIRT6", "variants", ".", "Reporter", "cell", "lines", "were", "co", "-", "transfected", "with", "SIRT6", "-", "expressing", "plasmid", ",", "I", "-", "Sce1", "plasmid", ",", "and", "DsRed", "transfection", "control", ".", "After", "72", "hr", "recovery", ",", "reactivation", "of", "the", "GFP", "reporter", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Stimulation", "of", "NHEJ", "or", "HR", "was", "calculated", "as", "radio", "of", "GFP", "+", "/", "DsRed", "+", "positive", "cells", ".", "Blots", "demonstrate", "equivalent", "SIRT6", "abundance", "in", "transfected", "cells", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", "Black", "asterisk", "indicate", "significance", "over", "control", ",", "red", "asterisk", "indicate", "significance", "over", "WT", "SIRT6", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Two", "-", "way", "ANOVAF", "Basal", "γH2AX", "foci", "in", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", ".", "Foci", "were", "scored", "in", "at", "least", "80", "cells", "per", "condition", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "G", "DNA", "repair", "kinetics", "in", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "grown", "on", "slides", "and", "irradiated", "with", "2", "Gy", "gamma", "radiation", ",", "followed", "by", "immunostaining", "for", "γH2AX", ".", "Irradiation", "was", "conducted", "when", "the", "cells", "were", "at", "75", "%", "confluency", "on", "slides", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "foci", "scored", "at", "t", "=", "0", ".", "5", "hr", ",", "2", "hr", ",", "4", "hr", ",", "6", "hr", ",", "and", "24", "hr", "post", "-", "irradiation", ".", "Foci", "were", "scored", "in", "at", "least", "80", "cells", "per", "genotype", "per", "time", "point", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "over", "WT", "SIRT6", ".", "Color", "of", "the", "asterisk", "corresponds", "to", "the", "SIRT6", "allele", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "H", ",", "I", "Oxidative", "stress", "resistance", ".", "Cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", "were", "induced", "for", "SIRT6", "expression", "and", "exposed", "to", "paraquat", "for", "24", "hours", ".", "Resistance", "was", "determined", "by", "apoptosis", "staining", "48", "hours", "after", "exposure", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "over", "WT", "SIRT6", ".", "Color", "of", "the", "asterisk", "corresponds", "to", "the", "SIRT6", "allele", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A qRT-PCR analysis of LINE1 expression in cumate-inducible SIRT6 fibroblasts. Primers assessed both 5' (ORF1) and 3' (ORF2) LINE1 sequences from the L1HS family of evolutionarily active LINE1 retrotransposons. Assessment of both regions was conducted to mitigate contributions from partial insertion sequences in coding genes. Asterisk indicate p<0.05. n=3 TR; error bars=SD. Students t-test, two tailed.B LINE1 EGFP retrotransposition assay. Three independent transfections with LINE1 EGFP reporter plasmid were conducted and quantified by flow cytometry. Asterisk indicate p<0.05. Red asterisk indicated significance over SIRT6 KO control. Black asterisk indicate significance over WT SIRT6. n=3 BR; error bars=SD. Two-way ANOVA.C In vitro KAP1 ribosylation by SIRT6. Asterisk indicate p<0.05. Red asterisk indicate significance over 0 hr, black asterisk indicate significance over compared to WT SIRT6. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed.D, E Stimulation of NHEJ and HR by SIRT6 variants. Reporter cell lines were co-transfected with SIRT6-expressing plasmid, I-Sce1 plasmid, and DsRed transfection control. After 72 hr recovery, reactivation of the GFP reporter was measured by flow cytometry. Stimulation of NHEJ or HR was calculated as radio of GFP+/DsRed+ positive cells. Blots demonstrate equivalent SIRT6 abundance in transfected cells. Asterisk indicate p<0.05 Black asterisk indicate significance over control, red asterisk indicate significance over WT SIRT6. n=3 BR; error bars=SD. Two-way ANOVAF Basal γH2AX foci in cumate-inducible SIRT6 fibroblasts. Foci were scored in at least 80 cells per condition. Asterisk indicate p<0.05. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed.G DNA repair kinetics in cumate-inducible SIRT6 fibroblasts. Cells were grown on slides and irradiated with 2 Gy gamma radiation, followed by immunostaining for γH2AX. Irradiation was conducted when the cells were at 75% confluency on slides. Cells were fixed and foci scored at t=0.5 hr, 2 hr, 4 hr, 6 hr, and 24 hr post-irradiation. Foci were scored in at least 80 cells per genotype per time point. Asterisk indicate p<0.05. Asterisks indicate significance over WT SIRT6. Color of the asterisk corresponds to the SIRT6 allele. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed.H, I Oxidative stress resistance. Cumate-inducible SIRT6 fibroblasts were induced for SIRT6 expression and exposed to paraquat for 24 hours. Resistance was determined by apoptosis staining 48 hours after exposure. Asterisk indicate p<0.05. Asterisks indicate significance over WT SIRT6. Color of the asterisk corresponds to the SIRT6 allele. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed."}
{"words": ["Figure", "5A", "Number", "of", "adherent", "cells", "after", "transfection", "with", "SIRT6", "variants", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "SIRT6", "plasmids", "encoding", "different", "SIRT6", "alleles", "and", "cell", "numbers", "were", "counted", "after", "72", "hours", ".", "HCA2", "are", "normal", "human", "foreskin", "fibroblasts", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "B", ",", "C", "Apoptosis", "staining", "of", "cancer", "cell", "lines", "48", "hours", "after", "transfection", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V", "/", "PI", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Red", "asterisk", "indicates", "significance", "over", "control", ",", "black", "asterisk", "indicates", "significance", "over", "WT", "SIRT6", ".", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Number of adherent cells after transfection with SIRT6 variants. Cells were transfected with SIRT6 plasmids encoding different SIRT6 alleles and cell numbers were counted after 72 hours. HCA2 are normal human foreskin fibroblasts. Asterisk indicate p<0.05. n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed.B, C Apoptosis staining of cancer cell lines 48 hours after transfection. Cells were stained with Annexin V/PI and analyzed by flow cytometry. Asterisk indicate p<0.05. Red asterisk indicates significance over control, black asterisk indicates significance over WT SIRT6. n=3 BR; error bars=SD. Two-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "6B", "IP", "experiments", "on", "lysates", "from", "cumate", "-", "induced", "fibroblasts", "expressing", "wild", "type", "or", "centSIRT6", "alleles", "with", "antibodies", "to", "SIRT6", ",", "LMNA", ",", "and", "mADPr", ".", "SIRT6", "expression", "was", "induced", "48", "hours", "prior", "to", "IP", ".", "n", "=", "3", "BR", ".", "One", "representative", "set", "of", "IPs", "is", "shown", ".", "C", "CentSIRT6", "shows", "stronger", "interaction", "with", "LMNA", "compared", "to", "the", "wild", "type", "SIRT6", ".", "Quantification", "of", "the", "IP", "experiment", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "SIRT6", "IP", "followed", "by", "Western", "blot", "with", "antibodies", "to", "LMNA", ".", "D", "LMNA", "shows", "enhanced", "interaction", "with", "centSIRT6", "compared", "to", "the", "wild", "type", ".", "Quantification", "of", "the", "IP", "experiment", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "LMNA", "IP", "from", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", "followed", "by", "Western", "blot", "with", "antibodies", "to", "SIRT6", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05E", "centSIRT6", "shows", "enhanced", "mADPr", ".", "Quantification", "of", "the", "IP", "experiment", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "SIRT6", "IP", "from", "cumate", "-", "inducible", "SIRT6", "fibroblasts", "followed", "by", "Western", "blot", "with", "antibody", "to", "mADPr", "residues", "F", "LMNA", "shows", "enhanced", "mADPr", "signal", "in", "cells", "expressing", "centSIRT6", ".", "Quantification", "of", "the", "IP", "experiment", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "IP", "with", "mADPr", "antibody", "using", "extract", "from", "cumate", "-", "induced", "SIRT6", "fibroblasts", ",", "followed", "by", "Western", "blot", "with", "antibodies", "to", "LMNA", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "3", "BR", ";", "error", "bars", "=", "SD", ".", "Students", "t", "-", "test", ",", "two", "tailed", ".", "Asterisk", "indicate", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B IP experiments on lysates from cumate-induced fibroblasts expressing wild type or centSIRT6 alleles with antibodies to SIRT6, LMNA, and mADPr. SIRT6 expression was induced 48 hours prior to IP. n=3 BR. One representative set of IPs is shown.C CentSIRT6 shows stronger interaction with LMNA compared to the wild type SIRT6. Quantification of the IP experiment shown in (B). SIRT6 IP followed by Western blot with antibodies to LMNA. D LMNA shows enhanced interaction with centSIRT6 compared to the wild type. Quantification of the IP experiment shown in (B). LMNA IP from cumate-inducible SIRT6 fibroblasts followed by Western blot with antibodies to SIRT6. Data information: n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Asterisk indicate p<0.05E centSIRT6 shows enhanced mADPr. Quantification of the IP experiment shown in (B). SIRT6 IP from cumate-inducible SIRT6 fibroblasts followed by Western blot with antibody to mADPr residues F LMNA shows enhanced mADPr signal in cells expressing centSIRT6. Quantification of the IP experiment shown in (B). IP with mADPr antibody using extract from cumate-induced SIRT6 fibroblasts, followed by Western blot with antibodies to LMNA. Data information: n=3 BR; error bars=SD. Students t-test, two tailed. Asterisk indicate p<0.05"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "H", ")", "-", "(", "J", ")", "mRNA", "expression", "of", "(", "H", ")", "U2AF1", ",", "(", "I", ")", "SMN2", "-", "FL", ",", "or", "(", "J", ")", "SMN2", "∆", "7", "in", "SMA", "patient", "-", "derived", "fibroblasts", "(", "red", "bars", ")", "72", "hours", "post", "-", "transfection", "with", "SMN2", "SSO", ",", "scrambled", "siRNA", ",", "or", "U2AF1", "siRNA", "at", "the", "indicated", "dose", ".", "Unaffected", ",", "SMA", "carrier", "fibroblasts", "(", "blue", "bars", ")", "treated", "with", "scrambled", "siRNA", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "empirical", "p", "-", "values", "are", "determined", "by", "a", "simulation", "and", "sampling", "method", "The", "error", "bars", "show", "the", "Standard", "Error", "of", "Mean", "(", "SEM", ")", ".", "Data", "represent", "3", "biological", "replicates", ".", "Three", "technical", "replicates", "were", "performed", "during", "qPCR", "for", "each", "biological", "replicate", "and", "averaged", ".", "Scrambled", "siRNA", "condition", "for", "each", "experiment", "was", "set", "to", "1", ".", "(", "K", ")", "Representative", "Western", "blot", ".", "(", "L", ")", "-", "(", "M", ")", "Quantification", "of", "protein", "expression", "of", "(", "L", ")", "U2AF1", "or", "(", "M", ")", "SMN", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "empirical", "p", "-", "values", "are", "determined", "by", "a", "simulation", "and", "sampling", "method", "The", "error", "bars", "show", "the", "Standard", "Error", "of", "Mean", "(", "SEM", ")", ".", "Data", "represent", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(H)-(J) mRNA expression of (H) U2AF1, (I) SMN2-FL, or (J) SMN2∆7 in SMA patient-derived fibroblasts (red bars) 72 hours post-transfection with SMN2 SSO, scrambled siRNA, or U2AF1 siRNA at the indicated dose. Unaffected, SMA carrier fibroblasts (blue bars) treated with scrambled siRNA. Data information: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; empirical p-values are determined by a simulation and sampling method The error bars show the Standard Error of Mean (SEM). Data represent 3 biological replicates. Three technical replicates were performed during qPCR for each biological replicate and averaged. Scrambled siRNA condition for each experiment was set to 1.(K) Representative Western blot. (L)-(M) Quantification of protein expression of (L) U2AF1 or (M) SMN normalized to GAPDH (n=3). Data information: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; empirical p-values are determined by a simulation and sampling method The error bars show the Standard Error of Mean (SEM). Data represent 3 biological replicates."}
{"words": ["figf1a", ",", "Mice", "were", "infected", "for", "21", "days", "and", "liver", "granulomas", "analysed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", ".", "Shown", "are", "spacious", "vacuoles", "(", "SLAPs", ")", "containing", "multiple", "bacteria", ".", "Magnification", ",", "×", "5", ",", "200", ".", "Region", "1", "and", "2", "(", "white", "boxes", ")", "are", "enlarged", "in", "the", "lower", "panels", ".", "b", ",", "SCID", "mice", "were", "infected", "as", "in", "a", "and", "liver", "sections", "stained", "for", "LAMP1", "(", "green", ")", ",", "bacteria", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Shown", "is", "a", "LAMP1", "+", "SLAP", ".", "c", ",", "The", "percentage", "of", "bacteria", "in", "LAMP1", "+", "compartments", "was", "quantified", "and", "characterized", "as", "either", "spacious", "or", "tight", "-", "fitting", ".", "Mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", " ", "mice", "examined", ".", "The", "image", "in", "a", "(", "from", "ref", ".", "2", ")", "and", "the", "tissue", "sections", "were", "provided", "by", "E", ".", "Unanue", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Mice were infected for 21 days and liver granulomas analysed by transmission electron microscopy (TEM). Shown are spacious vacuoles (SLAPs) containing multiple bacteria. Magnification, ×5,200. Region 1 and 2 (white boxes) are enlarged in the lower panels.b, SCID mice were infected as in a and liver sections stained for LAMP1 (green), bacteria (red) and DNA (blue). Shown is a LAMP1+ SLAP.c, The percentage of bacteria in LAMP1+ compartments was quantified and characterized as either spacious or tight-fitting. Mean ± s.e.m. for three mice examined. The image in a (from ref. 2) and the tissue sections were provided by E. Unanue."}
{"words": ["figf2a", ",", "RAW", "264", ".", "7macrophages", "infected", "for", "4", "or", "8", "h", "were", "analysed", "by", "TEM", ".", "Shown", "are", "spacious", "vacuoles", "(", "SLAPs", ")", "containing", "multiple", "bacteria", ".", "The", "arrow", "indicates", "septum", "of", "dividing", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ",", "0", ".", "5", "µm", ".", "b", ",", "The", "arrow", "indicates", "a", "LAMP1", "+", "SLAP", "colocalizing", "with", "green", "fluorescent", "protein", "(", "GFP", ")", "-", "LC3", "in", "cells", "infected", "for", "4", " ", "h", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "+", "(", "c", ")", "d", ",", "The", "arrowhead", "indicates", "a", "LAMP1", "+", "SLAP", "devoid", "of", "cathepsin", "D", "in", "cells", "infected", "for", "4", " ", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "µm", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "+", "(", "c", ")", "or", "cathepsin", "D", "+", "(", "e", ")", "f", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "transfected", "macrophages", "were", "infected", "with", "wild", "-", "type", "or", "D", "actA", "bacteria", ".", "Where", "indicated", ",", "chloramphenicol", "(", "CM", ")", "was", "added", "to", "the", "media", "at", "3", " ", "h", "post", "infection", ".", "The", "number", "of", "bacteria", "per", "SLAP", "was", "quantified", ".", "Brackets", "indicate", "significant", "differences", ",", "and", "corresponding", "P", "values", "are", "shown", ".", "g", ",", "Macrophages", "were", "infected", "with", "wild", "-", "type", "bacteria", "for", "7", " ", "h", ",", "pulsed", "with", "BrdU", "for", "1", " ", "h", ",", "and", "stained", "for", "LAMP1", "(", "red", ")", ",", "bacteria", "(", "blue", ")", "and", "BrdU", "(", "green", ")", ".", "Magnified", "images", "and", "the", "arrow", "indicate", "SLAPs", "containing", "actively", "replicating", "bacteria", "(", "BrdU", "+", ")", ".", "h", ",", "The", "percentage", "of", "BrdU", "+", "bacteria", "in", "SLAPs", ",", "compared", "to", "bacteria", "and", "PFA", "-", "killed", "bacteria", ",", "was", "quantified", "as", "in", "c", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, RAW 264.7macrophages infected for 4 or 8 h were analysed by TEM. Shown are spacious vacuoles (SLAPs) containing multiple bacteria. The arrow indicates septum of dividing bacteria. Scale bars, 0.5 µm.b, The arrow indicates a LAMP1+ SLAP colocalizing with green fluorescent protein (GFP)-LC3 in cells infected for 4 h.The percentage of GFP-LC3+ (c)d, The arrowhead indicates a LAMP1+ SLAP devoid of cathepsin D in cells infected for 4 h. Scale bars, 5 µm.The percentage of GFP-LC3+ (c) or cathepsin D+ (e)f, GFP-LC3-transfected macrophages were infected with wild-type or D actA bacteria. Where indicated, chloramphenicol (CM) was added to the media at 3 h post infection. The number of bacteria per SLAP was quantified. Brackets indicate significant differences, and corresponding P values are shown.g, Macrophages were infected with wild-type bacteria for 7 h, pulsed with BrdU for 1 h, and stained for LAMP1 (red), bacteria (blue) and BrdU (green). Magnified images and the arrow indicate SLAPs containing actively replicating bacteria (BrdU+). h, The percentage of BrdU+ bacteria in SLAPs, compared to bacteria and PFA-killed bacteria, was quantified as in c."}
{"words": ["figf3a", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "transfected", "macrophages", "were", "infected", "for", "4", "h", ",", "and", "the", "percentage", "of", "infected", "cells", "exhibiting", "SLAPs", "was", "quantified", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "P", "values", "for", "strains", "with", "significant", "differences", "from", "wild", "-", "type", "levels", "are", "shown", ".", "b", ",", "The", "arrow", "indicates", "a", "GFP", "-", "LC3", "+", "SLAP", "with", "internal", "LLO", "expression", "in", "cells", "infected", "for", "4", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "c", ",", "Arrowheads", "indicate", "GFP", "-", "LC3", "+", "SLAPs", "devoid", "of", "Lysotracker", "Red", "in", "cells", "infected", "for", "4", "h", ".", "e", ",", "The", "arrow", "indicates", "a", "LAMP1", "+", "SLAP", "colocalizing", "with", "v", "-", "ATPase", "staining", "in", "cells", "infected", "for", "4", " ", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "µm", ".", "f", ",", "The", "percentage", "of", "v", "-", "ATPase", "+", "SLAPs", "was", "quantified", "as", "in", "Fig", ".", "2c", ".", "Mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "P", "values", "for", "conditions", "significantly", "different", "from", "PFA", "-", "killed", "bacteria", "are", "shown", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, GFP-LC3-transfected macrophages were infected for 4 h, and the percentage of infected cells exhibiting SLAPs was quantified. Mean ± s.e.m. for three independent experiments. P values for strains with significant differences from wild-type levels are shown.b, The arrow indicates a GFP-LC3+ SLAP with internal LLO expression in cells infected for 4 h. Scale bar, 5 µm.c, Arrowheads indicate GFP-LC3+ SLAPs devoid of Lysotracker Red in cells infected for 4 h.e, The arrow indicates a LAMP1+ SLAP colocalizing with v-ATPase staining in cells infected for 4 h. Scale bar, 5 µm. f, The percentage of v-ATPase+ SLAPs was quantified as in Fig. 2c. Mean ± s.e.m. for three independent experiments. P values for conditions significantly different from PFA-killed bacteria are shown."}
{"words": ["figf4a", ",", "Arrows", "indicate", "LAMP1", "-", "wild", "-", "type", "bacteria", "with", "actin", "'", "comet", "tails", "'", "in", "cells", "infected", "for", "6", " ", "h", ".", "The", "boxed", "region", "is", "magnified", "in", "the", "bottom", "left", "panels", ".", "The", "merged", "image", "for", "this", "region", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "µm", ".", "b", ",", "Macrophages", "were", "infected", "with", "IPTG", "-", "induced", "iLLO", "bacteria", ".", "Arrowheads", "indicate", "actin", "-", "iLLO", "bacteria", "within", "LAMP1", "+", "vacuoles", ".", "c", ",", "Macrophages", "were", "infected", "with", "wild", "-", "type", "(", "triangles", ")", "or", "IPTG", "-", "induced", "iLLO", "(", "circles", ")", "bacteria", ",", "and", "the", "percentage", "of", "LAMP1", "+", "bacteria", "was", "quantified", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "d", ",", "Macrophages", "were", "infected", "as", "in", "c", "with", "or", "without", "IPTG", "induction", ".", "Intracellular", "bacterial", "replication", "was", "determined", "using", "a", "gentamicin", "-", "protection", "assay", ".", "Shown", "is", "fold", "replication", "compared", "to", "2", "h", "post", "infection", ".", "Clear", "triangles", ",", "wild", "type", ";", "filled", "triangles", ",", "wild", "type", "+", "IPTG", ";", "clear", "circles", ",", "iLLO", ";", "filled", "circles", ",", "iLLO", "+", "IPTG", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "or", "range", "for", "three", "(", "wild", "type", ",", "wild", "type", "+", "IPTG", ",", "iLLO", "+", "IPTG", ")", "or", "two", "(", "iLLO", "-", "IPTG", ")", "independent", "experiments", ",", "respectively", ".", "e", ",", "Wild", "-", "type", "or", "Atg5", "-", "/", "-", "MEFs", "were", "infected", "with", "iLLO", "bacteria", ",", "and", "intracellular", "bacterial", "replication", "was", "determined", "as", "in", "d", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Clear", "circles", ",", "wild", "-", "type", "MEFs", ";", "filled", "circles", ",", "wild", "-", "type", "MEFs", "+", "IPTG", ";", "clear", "squares", ",", "Atg5", "-", "/", "-", "MEFs", ";", "filled", "squares", ",", "Atg5", "-", "/", "-", "MEFs", "+", "IPTG", ".", "f", ",", "Wild", "-", "type", "(", "circles", ")", "or", "Atg5", "-", "/", "-", "(", "squares", ")", "MEFs", "were", "infected", "as", "in", "e", "with", "IPTG", "induction", ".", "The", "percentage", "of", "LAMP1", "+", "bacteria", "was", "quantified", "as", "in", "c", ".", "Mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Arrows indicate LAMP1- wild-type bacteria with actin 'comet tails' in cells infected for 6 h. The boxed region is magnified in the bottom left panels. The merged image for this region is shown at the bottom right. Scale bar, 5 µm.b, Macrophages were infected with IPTG-induced iLLO bacteria. Arrowheads indicate actin- iLLO bacteria within LAMP1+ vacuoles.c, Macrophages were infected with wild-type (triangles) or IPTG-induced iLLO (circles) bacteria, and the percentage of LAMP1+ bacteria was quantified. Mean ± s.e.m. for three independent experiments.d, Macrophages were infected as in c with or without IPTG induction. Intracellular bacterial replication was determined using a gentamicin-protection assay. Shown is fold replication compared to 2 h post infection. Clear triangles, wild type; filled triangles, wild type + IPTG; clear circles, iLLO; filled circles, iLLO + IPTG. Mean ± s.e.m. or range for three (wild type, wild type + IPTG, iLLO + IPTG) or two (iLLO-IPTG) independent experiments, respectively.e, Wild-type or Atg5-/- MEFs were infected with iLLO bacteria, and intracellular bacterial replication was determined as in d. Mean ± s.e.m. for three independent experiments. Clear circles, wild-type MEFs; filled circles, wild-type MEFs + IPTG; clear squares, Atg5-/- MEFs; filled squares, Atg5-/- MEFs + IPTG.f, Wild-type (circles) or Atg5-/- (squares) MEFs were infected as in e with IPTG induction. The percentage of LAMP1+ bacteria was quantified as in c. Mean ± s.e.m. for three independent experiments. g"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Isolation", "of", "FTCD", "from", "rat", "liver", "extract", ".", "The", "p47", "(", "1", "-", "170", ")", "fragment", ",", "which", "does", "not", "contain", "the", "p97", "-", "binding", "site", ",", "was", "immobilized", "on", "beads", "and", "incubated", "with", "rat", "liver", "extract", ".", "Bound", "proteins", "were", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "stained", "with", "CBB", ".", "(", "B", ")", "FTCD", "binds", "directly", "to", "p47", ".", "GST", "-", "tagged", "p47", "(", "0", ".", "54", "μg", ")", "or", "GST", "-", "tagged", "p37", "(", "0", ".", "45", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "0", ".", "80", "μg", ")", ",", "and", "then", "isolated", "on", "glutathione", "beads", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "GST", ".", "(", "C", ")", "FTCD", "and", "p47", "form", "a", "complex", "in", "cells", ".", "HepG2", "cells", "were", "solubilized", "and", "incubated", "with", "anti", "-", "p47", "antibodies", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "to", "p47", "and", "FTCD", ".", "(", "D", ")", "FTCD", ",", "p47", "and", "p97", "form", "a", "complex", "in", "cells", ".", "HepG2", "cells", "were", "solubilized", "and", "incubated", "with", "anti", "-", "FTCD", "antibodies", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "to", "FTCD", ",", "VCIP135", ",", "p97", ",", "p47", "and", "syntaxin5", ".", "(", "E", ")", "p47", "binds", "to", "the", "CD", "domain", "of", "FTCD", ".", "GST", "-", "tagged", "p47", "(", "0", ".", "50", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "either", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "1", "-", "326", ")", "(", "FT", ",", "0", ".", "88", "μg", ")", "or", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "327", "-", "541", ")", "(", "CD", ",", "0", ".", "63", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "His", "-", "tag", "and", "GST", ".", "(", "F", ")", "p47", "(", "E86K", ",", "E88K", ")", "does", "not", "bind", "to", "FTCD", ".", "GST", "-", "tagged", "p47wt", "/", "mutant", "(", "0", ".", "50", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "His", "-", "tagged", "proteins", "(", "p97", ",", "1", ".", "0", "μg", ";", "FTCD", ",", "0", ".", "75", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "p97", ",", "FTCD", "and", "GST", ".", "(", "G", ")", "FTCD", "(", "R382A", ")", ",", "which", "lacks", "binding", "ability", "to", "polyglutamates", ",", "does", "not", "bind", "to", "p47", ".", "GST", "-", "tagged", "p47", "(", "0", ".", "35", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "His", "-", "tagged", "FTCDwt", "/", "mutant", "(", "0", ".", "53", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "His", "-", "tag", "and", "GST", ".", "(", "H", ")", "p47", "binds", "to", "FTCD", "in", "Golgi", "membranes", ".", "Salt", "-", "washed", "Golgi", "membranes", "were", "first", "incubated", "with", "either", "GST", "-", "tagged", "p47wt", ",", "p47", "(", "E86K", ",", "E88K", ")", "or", "p47", "(", "F253S", ")", ".", "The", "isolated", "membranes", "were", "solubilized", ",", "and", "then", "GST", "-", "tagged", "p47wt", "/", "mutants", "and", "their", "binding", "proteins", "were", "recovered", "with", "glutathione", "-", "beads", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "assayed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "GST", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Isolation of FTCD from rat liver extract. The p47(1-170) fragment, which does not contain the p97-binding site, was immobilized on beads and incubated with rat liver extract. Bound proteins were fractionated by SDS-PAGE, and stained with CBB.(B) FTCD binds directly to p47. GST-tagged p47 (0.54 μg) or GST-tagged p37 (0.45 μg) was incubated with His-tagged FTCD (0.80 μg), and then isolated on glutathione beads. The blots were probed with antibodies to FTCD and GST.(C) FTCD and p47 form a complex in cells. HepG2 cells were solubilized and incubated with anti-p47 antibodies. The immunoprecipitates were fractionated by SDS-PAGE, followed by Western blotting with antibodies to p47 and FTCD.(D) FTCD, p47 and p97 form a complex in cells. HepG2 cells were solubilized and incubated with anti-FTCD antibodies. The immunoprecipitates were fractionated by SDS-PAGE, followed by Western blotting with antibodies to FTCD, VCIP135, p97, p47 and syntaxin5.(E) p47 binds to the CD domain of FTCD. GST-tagged p47 (0.50 μg) was incubated with either His-tagged FTCD(1-326) (FT, 0.88 μg) or His-tagged FTCD(327-541) (CD, 0.63 μg). The blots were probed with antibodies to His-tag and GST.(F) p47(E86K, E88K) does not bind to FTCD. GST-tagged p47wt/mutant (0.50 μg) was incubated with the indicated His-tagged proteins (p97, 1.0 μg; FTCD, 0.75 μg). The blots were probed with antibodies to p97, FTCD and GST.(G) FTCD(R382A), which lacks binding ability to polyglutamates, does not bind to p47. GST-tagged p47 (0.35 μg) was incubated with His-tagged FTCDwt/mutant (0.53 μg). The blots were probed with antibodies to His-tag and GST.(H) p47 binds to FTCD in Golgi membranes. Salt-washed Golgi membranes were first incubated with either GST-tagged p47wt, p47(E86K, E88K) or p47(F253S). The isolated membranes were solubilized, and then GST-tagged p47wt/mutants and their binding proteins were recovered with glutathione-beads. The bound proteins were assayed by Western blotting with antibodies to FTCD and GST."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "FTCD", "directly", "binds", "to", "p97", ".", "GST", "-", "tagged", "p97", "(", "2", ".", "1", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "0", ".", "80", "μg", ")", ",", "and", "then", "isolated", "on", "glutathione", "beads", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "GST", ".", "(", "B", ")", "Nucleotide", "dependency", "of", "the", "binding", "of", "FTCD", "with", "p97", ".", "FTCD", "(", "0", ".", "80", "μg", ")", "and", "GST", "-", "tagged", "p97", "(", "2", ".", "1", "μg", ")", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "nucleotide", "(", "1", "mM", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "GST", ".", "(", "C", ")", "FTCD", "binds", "to", "the", "C", "-", "terminal", "region", "of", "p97", ".", "GST", "-", "tagged", "p97", "fragments", "were", "incubated", "with", "either", "FTCD", "or", "p47", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "p47", ".", "(", "D", ")", "p97", "also", "binds", "to", "the", "CD", "domain", "of", "FTCD", ".", "GST", "-", "tagged", "p97", "(", "2", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "either", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "1", "-", "326", ")", "(", "FT", ",", "0", ".", "88", "μg", ")", "or", "His", "-", "tagged", "FTCD", "(", "327", "-", "541", ")", "(", "CD", ",", "0", ".", "62", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "His", "-", "tag", "and", "GST", ".", "(", "E", ")", "p97", "(", "V722K", ",", "E724K", ")", "shows", "very", "low", "binding", "affinity", "to", "FTCD", ".", "GST", "-", "tagged", "p97wt", "/", "mutant", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "His", "-", "tagged", "proteins", "(", "FTCD", ",", "2", ".", "0", "μg", ";", "p47", ",", "0", ".", "5", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "p47", ",", "FTCD", "and", "GST", ".", "(", "F", ")", "FTCD", "(", "R382A", ")", ",", "which", "lacks", "binding", "ability", "to", "polyglutamates", ",", "shows", "a", "very", "low", "binding", "affinity", "to", "p97", ".", "GST", "-", "tagged", "p97", "(", "1", ".", "4", "μg", ")", "was", "incubated", "with", "His", "-", "tagged", "FTCDwt", "/", "mutant", "(", "0", ".", "53", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "His", "-", "tag", "and", "GST", ".", "(", "G", ")", "p97", "binds", "to", "FTCD", "in", "Golgi", "membranes", ".", "Salt", "-", "washed", "Golgi", "membranes", "were", "incubated", "with", "either", "GST", "-", "tagged", "p97wt", "or", "p97", "(", "V722k", ",", "E724K", ")", ".", "The", "isolated", "membranes", "were", "solubilized", ",", "and", "then", "GST", "-", "tagged", "p97wt", "/", "mutants", "and", "their", "binding", "proteins", "were", "recovered", "with", "glutathione", "-", "beads", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "assayed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "GST", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) FTCD directly binds to p97. GST-tagged p97 (2.1 μg) was incubated with His-tagged FTCD (0.80 μg), and then isolated on glutathione beads. The blots were probed with antibodies to FTCD and GST.(B) Nucleotide dependency of the binding of FTCD with p97. FTCD (0.80 μg) and GST-tagged p97 (2.1 μg) were incubated in the presence of the indicated nucleotide (1 mM). The blots were probed with antibodies to FTCD and GST.(C) FTCD binds to the C-terminal region of p97. GST-tagged p97 fragments were incubated with either FTCD or p47. The blots were probed with antibodies to FTCD and p47.(D) p97 also binds to the CD domain of FTCD. GST-tagged p97 (2 μg) was incubated with either His-tagged FTCD(1-326) (FT, 0.88 μg) or His-tagged FTCD(327-541) (CD, 0.62 μg). The blots were probed with antibodies to His-tag and GST.(E) p97(V722K, E724K) shows very low binding affinity to FTCD. GST-tagged p97wt/mutant ( 2.0 μg) was incubated with the indicated His-tagged proteins (FTCD, 2.0 μg; p47, 0.5 μg). The blots were probed with antibodies to p47, FTCD and GST.(F) FTCD(R382A), which lacks binding ability to polyglutamates, shows a very low binding affinity to p97. GST-tagged p97 (1.4 μg) was incubated with His-tagged FTCDwt/mutant (0.53 μg). The blots were probed with antibodies to His-tag and GST.(G) p97 binds to FTCD in Golgi membranes. Salt-washed Golgi membranes were incubated with either GST-tagged p97wt or p97(V722k, E724K). The isolated membranes were solubilized, and then GST-tagged p97wt/mutants and their binding proteins were recovered with glutathione-beads. The bound proteins were assayed by Western blotting with antibodies to FTCD and GST."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "FTCD", "and", "GM130", ",", "a", "Golgi", "marker", ".", "HepG2", "cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", ",", "stained", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "FTCD", ",", "a", "polyclonal", "antibody", "to", "GM130", "and", "DAPI", ",", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Depletion", "of", "FTCD", "by", "FTCD", "siRNA", "duplexes", ".", "HepG2", "cells", "were", "either", "mock", "transfected", "with", "water", "or", "transfected", "with", "two", "distinct", "siRNA", "duplexes", "specific", "to", "FTCD", ".", "After", "incubation", "for", "48", "hrs", ",", "the", "cells", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "antibodies", "to", "FTCD", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "(", "C", ")", "The", "Golgi", "in", "cells", "which", "were", "depleted", "of", "either", "FTCD", "or", "p47", ".", "HepG2", "cells", ",", "which", "were", "treated", "with", "either", "FTCD", "siRNAs", ",", "p47", "siRNA", "or", "mock", "for", "48", "hrs", ",", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "GM130", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "C", ")", ".", "The", "values", "are", "from", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "of", "each", "set", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "mock", "-", "treated", "cells", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "EM", "images", "of", "the", "Golgi", "in", "HepG2", "cells", "treated", "with", "either", "mock", "or", "FTCD", "siRNAs", "for", "42", "hrs", ".", "Scale", "bar", "=", "0", ".", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "E", ")", ".", "Golgi", "membranes", "in", "HepG2", "cells", "were", "classified", "into", "cisternae", ",", "vesicles", "and", "tubules", ",", "and", "counted", "as", "previously", "described", "(", "Shorter", "&", "Warren", ",", "1999", ")", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "15", "-", "20", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "compared", "with", "the", "mock", "-", "treated", "cells", "in", "each", "category", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunofluorescence staining of FTCD and GM130, a Golgi marker. HepG2 cells were fixed, permeabilized, stained with a monoclonal antibody to FTCD, a polyclonal antibody to GM130 and DAPI, and observed by confocal microscopy. Scale bar = 10 μm.(B) Depletion of FTCD by FTCD siRNA duplexes. HepG2 cells were either mock transfected with water or transfected with two distinct siRNA duplexes specific to FTCD. After incubation for 48 hrs, the cells were analyzed by Western blotting with antibodies to FTCD and α-tubulin.(C) The Golgi in cells which were depleted of either FTCD or p47. HepG2 cells, which were treated with either FTCD siRNAs, p47 siRNA or mock for 48 hrs, were fixed and stained with a monoclonal antibody to GM130. Scale bar = 10 μm. (D) The results of quantification of (C). The values are from five sets of independent experiments. Results are expressed as the mean±SD (n=5), with 100 cells counted in each group of each set. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the mock-treated cells (Bonferroni method). (E) Representative EM images of the Golgi in HepG2 cells treated with either mock or FTCD siRNAs for 42 hrs. Scale bar = 0.5 μm. (F) The results of quantification of (E). Golgi membranes in HepG2 cells were classified into cisternae, vesicles and tubules, and counted as previously described (Shorter & Warren, 1999). The results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 15-20 cells counted in each group in each independent experiment. An asterisk indicates a significant difference (P<0.05) compared with the mock-treated cells in each category (Bonferroni method). "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "localization", "of", "FTCD", "in", "mitotic", "cells", ".", "Mitotic", "HepG2", "cells", "were", "collected", "by", "flushing", "and", "cultured", "on", "coated", "coverslips", "for", "10", "-", "40", "mins", ".", "The", "cells", "were", "fixed", ",", "stained", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "FTCD", "and", "polyclonal", "antibodies", "to", "GM130", "and", "α", "-", "tubulin", ",", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Panels", "d", ",", "h", ",", "and", "l", "indicate", "the", "images", "of", "α", "-", "tubulin", "and", "the", "other", "panels", "show", "the", "distribution", "of", "FTCD", "or", "/", "and", "GM130", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "colocalization", "of", "FTCD", "and", "GM130", ".", "(", "B", ")", "The", "effects", "of", "FTCD", "siRNA", "treatment", "on", "Golgi", "reassembly", "at", "the", "end", "of", "mitosis", ".", "HepG2", "cells", "were", "treated", "with", "either", "FTCD", "siRNA", "(", "FTCD", "siRNA", "2", "duplex", ")", "or", "mock", "for", "48", "hrs", "before", "the", "collection", "of", "mitotic", "cells", ".", "The", "collected", "mitotic", "cells", "were", "cultured", "for", "35", "mins", "and", "then", "fixed", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "a", "polyclonal", "antibody", "to", "GM130", "and", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "α", "-", "tubulin", ",", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Panels", "a", "-", "p", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Rescue", "experiments", "in", "FTCD", "siRNA", "-", "treated", "HepG2", "cells", ".", "The", "indicated", "HA", "-", "tagged", "FTCDs", ",", "which", "were", "insensitive", "to", "FTCD", "siRNA", ",", "were", "expressed", "25", "hrs", "after", "the", "treatment", "of", "cells", "with", "FTCD", "siRNA2", ".", "The", "cells", "were", "further", "cultured", "for", "23", "hrs", "and", "then", "used", "for", "the", "collection", "of", "mitotic", "cells", ".", "The", "collected", "mitotic", "cells", "were", "cultured", "for", "35", "mins", "and", "fixed", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "α", "-", "tubulin", "(", "panels", "g", "and", "h", ")", "and", "polyclonal", "antibodies", "to", "GM130", "and", "HA", "(", "panels", "a", "-", "f", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "The", "cells", "at", "cytokinesis", "in", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "were", "analyzed", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "compared", "with", "the", "mock", "-", "treated", "cells", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The localization of FTCD in mitotic cells. Mitotic HepG2 cells were collected by flushing and cultured on coated coverslips for 10-40 mins. The cells were fixed, stained with a monoclonal antibody to FTCD and polyclonal antibodies to GM130 and α-tubulin, and observed by confocal microscopy. Panels d, h, and l indicate the images of α-tubulin and the other panels show the distribution of FTCD or/and GM130. Scale bar = 10 μm. Arrowheads indicate the colocalization of FTCD and GM130.(B) The effects of FTCD siRNA treatment on Golgi reassembly at the end of mitosis. HepG2 cells were treated with either FTCD siRNA (FTCD siRNA 2 duplex) or mock for 48 hrs before the collection of mitotic cells. The collected mitotic cells were cultured for 35 mins and then fixed. The cells were stained with a polyclonal antibody to GM130 and a monoclonal antibody to α-tubulin, and observed by confocal microscopy. Panels a-p display representative images. Scale bar = 10 μm.(C) Rescue experiments in FTCD siRNA-treated HepG2 cells. The indicated HA-tagged FTCDs, which were insensitive to FTCD siRNA, were expressed 25 hrs after the treatment of cells with FTCD siRNA2. The cells were further cultured for 23 hrs and then used for the collection of mitotic cells. The collected mitotic cells were cultured for 35 mins and fixed. The cells were stained with a monoclonal antibody to α-tubulin (panels g and h) and polyclonal antibodies to GM130 and HA (panels a-f). Scale bar = 10 μm.(D) The cells at cytokinesis in (B) and (C) were analyzed. The results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiment. Asterisks indicate a significant difference (P<0.01) compared with the mock-treated cells (Bonferroni method)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "p47", "requires", "its", "association", "with", "FTCD", "for", "its", "localization", "to", "the", "Golgi", "at", "the", "end", "of", "mitosis", ".", "HepG2", "cells", "were", "treated", "with", "FTCD", "siRNA", "and", "then", "the", "indicated", "HA", "-", "tagged", "FTCDs", "were", "expressed", "as", "described", "in", "Figure", "4C", ".", "The", "mitotic", "cells", "were", "collected", ",", "cultured", "for", "35", "mins", ",", "and", "then", "fixed", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "polyclonal", "antibodies", "to", "p47", "and", "HA", "and", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "GM130", ",", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Panels", "a", "-", "l", "show", "the", "distribution", "of", "p47", "or", "/", "and", "GM130", "and", "panels", "m", "-", "o", "show", "HA", "-", "FTCD", "expression", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Insets", "in", "(", "A", ")", ".", "p47", "(", "red", ")", "and", "the", "GM130", "(", "a", "Golgi", "marker", ",", "green", ")", "were", "visualized", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "mock", "-", "treated", "cells", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "D", ")", "p97", "requires", "its", "association", "with", "FTCD", "for", "its", "localization", "to", "the", "Golgi", "at", "the", "end", "of", "mitosis", ".", "The", "cells", "were", "treated", "in", "the", "same", "way", "as", "(", "A", ")", "and", "stained", "with", "polyclonal", "antibodies", "to", "p97", "and", "HA", "and", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "GM130", ".", "Panels", "a", "-", "l", "show", "the", "distribution", "of", "p97", "or", "/", "and", "GM130", "and", "panels", "m", "-", "o", "show", "HA", "-", "FTCD", "expression", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "Insets", "in", "(", "D", ")", ".", "p97", "(", "red", ")", "and", "the", "GM130", "(", "a", "Golgi", "marker", ",", "green", ")", "were", "visualized", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "D", ")", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "mock", "-", "treated", "cells", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) p47 requires its association with FTCD for its localization to the Golgi at the end of mitosis. HepG2 cells were treated with FTCD siRNA and then the indicated HA-tagged FTCDs were expressed as described in Figure 4C. The mitotic cells were collected, cultured for 35 mins, and then fixed. The cells were stained with polyclonal antibodies to p47 and HA and a monoclonal antibody to GM130, and observed by confocal microscopy. Panels a-l show the distribution of p47 or/and GM130 and panels m-o show HA-FTCD expression. Scale bar = 10 μm. (B) Insets in (A). p47 (red) and the GM130 (a Golgi marker, green) were visualized. Scale bar = 5 μm. (C) The results of quantification of (A). The results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiments. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the mock-treated cells (Bonferroni method). (D) p97 requires its association with FTCD for its localization to the Golgi at the end of mitosis. The cells were treated in the same way as (A) and stained with polyclonal antibodies to p97 and HA and a monoclonal antibody to GM130. Panels a-l show the distribution of p97 or/and GM130 and panels m-o show HA-FTCD expression. Scale bar = 10 μm. (E) Insets in (D). p97 (red) and the GM130 (a Golgi marker, green) were visualized. Scale bar = 5 μm. (F) The results of quantification of (D). The results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiments. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the mock-treated cells (Bonferroni method). "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Anti", "-", "FTCD", "antibodies", "inhibit", "p97", "/", "p47", "-", "mediated", "Golgi", "membrane", "fusion", ".", "Golgi", "fragments", "were", "mixed", "with", "the", "indicated", "components", "(", "p97", ",", "60", "μg", "/", "ml", ";", "p47", ",", "30", "μg", "/", "ml", ";", "p37", ",", "24", "μg", "/", "ml", ";", "p115", ",", "40", "μg", "/", "ml", ")", "together", "with", "either", "anti", "-", "FTCD", "or", "anti", "-", "p115", "antibodies", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ";", "0", "%", "and", "100", "%", "represent", "the", "buffer", "only", "(", "25", ".", "9", "%", "in", "cisternal", "membranes", ")", "and", "p97", "/", "p47", "with", "no", "antibodies", "(", "'", "+", "none", "'", ",", "48", ".", "8", "%", ")", ",", "respectively", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "no", "antibody", "groups", "(", "'", "+", "none", "'", ")", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "B", ")", "p47", "(", "E86K", ",", "E88K", ")", ",", "which", "lacks", "binding", "affinity", "to", "FTCD", ",", "does", "not", "function", "in", "p97", "/", "p47", "-", "mediated", "Golgi", "membrane", "fusion", ".", "Golgi", "fragments", "were", "incubated", "with", "p97", "(", "60", "μg", "/", "ml", ")", "and", "p47wt", "/", "mutant", "(", "30", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "+", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ";", "0", "%", "and", "100", "%", "represent", "the", "buffer", "only", "(", "27", ".", "3", "%", "in", "cisternal", "membranes", ")", "and", "p97", "+", "p47wt", "(", "'", "+", "p47wt", "'", ",", "50", ".", "9", "%", ")", ",", "respectively", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "group", "in", "which", "p47wt", "as", "well", "as", "p97", "were", "added", "(", "'", "+", "p47wt", "'", ")", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "C", ")", "p97", "(", "V722K", ",", "E724K", ")", ",", "which", "lacks", "binding", "affinity", "to", "FTCD", ",", "does", "not", "function", "in", "p97", "/", "p47", "-", "mediated", "Golgi", "membrane", "fusion", ".", "Golgi", "fragments", "were", "incubated", "with", "the", "following", "components", ":", "p97wt", "/", "mutant", ",", "60", "μg", "/", "ml", ";", "p47", ",", "30", "μg", "/", "ml", ";", "p37", ",", "24", "μg", "/", "ml", ";", "p115", ",", "40", "μg", "/", "ml", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "+", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ";", "0", "%", "and", "100", "%", "represent", "the", "buffer", "only", "(", "29", ".", "5", "%", "in", "cisternal", "membranes", ")", ",", "and", "p47", "+", "p97wt", "(", "'", "+", "p97wt", "'", ".", "57", ".", "5", "%", ")", ",", "respectively", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "group", "in", "which", "p97wt", "as", "well", "as", "p47", "were", "added", "(", "'", "+", "p97wt", "'", ")", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "D", ")", "Panels", "a", "-", "e", "show", "representative", "EM", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "0", ".", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Anti-FTCD antibodies inhibit p97/p47-mediated Golgi membrane fusion. Golgi fragments were mixed with the indicated components (p97, 60 μg/ml; p47, 30 μg/ml; p37, 24 μg/ml; p115, 40 μg/ml) together with either anti-FTCD or anti-p115 antibodies. Results are expressed as mean+SD of five sets of independent experiments; 0% and 100% represent the buffer only (25.9% in cisternal membranes) and p97/p47 with no antibodies ('+ none', 48.8%), respectively. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the no antibody groups ('+none') (Bonferroni method).(B) p47(E86K, E88K), which lacks binding affinity to FTCD, does not function in p97/p47-mediated Golgi membrane fusion. Golgi fragments were incubated with p97 (60 μg/ml) and p47wt/mutant (30 μg/ml). Data are shown as the mean+SD of five sets of independent experiments; 0% and 100% represent the buffer only (27.3% in cisternal membranes) and p97+p47wt ('+p47wt', 50.9%), respectively. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the group in which p47wt as well as p97 were added ('+p47wt') (Bonferroni method).(C) p97(V722K,E724K), which lacks binding affinity to FTCD, does not function in p97/p47-mediated Golgi membrane fusion. Golgi fragments were incubated with the following components: p97wt/mutant, 60 μg/ml; p47, 30 μg/ml; p37, 24 μg/ml; p115, 40 μg/ml. Data are shown as the mean+SD of five sets of independent experiments; 0% and 100% represent the buffer only (29.5% in cisternal membranes), and p47+p97wt ('+p97wt'. 57.5%), respectively. An asterisk indicates a significant difference at P<0.01 compared with the group in which p97wt as well as p47 were added ('+p97wt') (Bonferroni method).(D) Panels a-e show representative EM images. Scale bar = 0.5 μm."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Two", "sets", "of", "FTCD", "molecules", "and", "a", "p97", "/", "p47", "complex", "form", "a", "quaternary", "complex", ".", "His", "-", "tagged", "FTCD", "was", "biotinylated", "and", "immobilized", "on", "streptavidin", "beads", "(", "His", "-", "FTCD", "-", "beads", ")", ".", "The", "beads", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", "were", "incubated", "with", "Flag", "-", "tagged", "FTCD", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "p47", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", "and", "p97", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "HRP", "-", "conjugated", "avidin", "and", "antibodies", "to", "Flag", "-", "tag", ",", "p97", "and", "p47", ".", "(", "B", ")", "Formation", "of", "the", "quaternary", "complex", "in", "the", "presence", "of", "nucleotides", ".", "His", "-", "FTCD", "-", "beads", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", "were", "incubated", "with", "Flag", "-", "tagged", "FTCD", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", ",", "p97", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", "and", "p47", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", "in", "the", "presence", "of", "nucleotides", "(", "1", "mM", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "C", ")", "Mutants", "that", "lack", "binding", "affinity", "disrupt", "the", "formation", "of", "the", "quaternary", "complex", ".", "His", "-", "FTCD", "-", "beads", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", "and", "Flag", "-", "tagged", "FTCD", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "AMP", "-", "PNP", "together", "with", "p97wt", "/", "mutant", "(", "2", ".", "0", "μg", ")", "and", "p47wt", "/", "mutant", "(", "1", ".", "0", "μg", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "Negative", "stain", "electron", "microscopy", "of", "the", "quaternary", "complex", ".", "The", "panels", "show", "class", "averages", "of", "centered", "and", "aligned", "negative", "stain", "particles", "for", "the", "different", "populations", "present", "within", "the", "dataset", ",", "i", ".", "e", ".", ",", "the", "full", "quaternary", "complex", "FTCD", "-", "p97", "/", "p47", "-", "FTCD", "(", "left", "panel", ")", ",", "and", "its", "partial", "complexes", "(", "two", "variations", ",", "middle", "two", "panels", ")", ".", "Class", "averages", "contain", "approximately", "20", "images", "per", "class", ".", "A", "class", "average", "showing", "a", "p97", "/", "p47", "side", "view", "from", "cryo", "-", "EM", "data", "and", "a", "projection", "generated", "from", "FTCD", "structure", "(", "PDB", "code", "1TT9", ")", "have", "been", "included", "for", "comparisons", ".", "Brackets", "and", "arrow", "heads", "indicate", "the", "p97", "hexamer", "and", "the", "FTCD", "octamer", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "=", "15", "nm", ".", "(", "E", ")", "FTCDwt", "-", "beads", "are", "aggregated", "in", "the", "presence", "of", "both", "p97", "and", "p47", ".", "Biotinylated", "FTCDwt", "and", "FTCD", "(", "R382A", ")", "were", "immobilized", "on", "streptavidin", "magnetic", "beads", "to", "form", "FTCDwt", "-", "beads", "and", "FTCD", "(", "R382A", ")", "-", "beads", ",", "respectively", ".", "The", "beads", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "proteins", "(", "p97", ",", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ";", "p47", ",", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ";", "p37", ",", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ")", "in", "the", "presence", "of", "AMP", "-", "PNP", "(", "1", "mM", ")", ",", "and", "observed", "under", "a", "bright", "-", "field", "microscope", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "E", ")", ".", "The", "percentages", "of", "beads", "in", "the", "aggregates", "were", "calculated", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "+", "SD", "of", "ten", "sets", "of", "independent", "experiments", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "others", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "G", ")", "p97", "/", "p47", "-", "mediated", "aggregation", "of", "FTCDwt", "-", "beads", "is", "nucleotide", "-", "dependent", ".", "FTCDwt", "-", "beads", "were", "incubated", "together", "with", "p97", "(", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ")", "and", "p47", "(", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ")", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "nucleotides", "(", "1mM", ")", ".", "The", "representative", "images", "are", "presented", "in", "Figure", "EV1E", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "+", "SD", "of", "nine", "sets", "of", "independent", "experiments", ".", "An", "asterisk", "and", "hash", "tags", "indicate", "significant", "differences", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "others", "and", "the", "negative", "control", "(", "'", "none", "'", ")", ",", "respectively", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "H", ")", "p47", "and", "p97", "mutants", "that", "lack", "binding", "affinity", "inhibit", "p97", "/", "p47", "-", "mediated", "aggregation", "of", "FTCDwt", "-", "beads", ".", "FTCDwt", "-", "beads", "were", "incubated", "with", "p97wt", "/", "mutant", "(", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ")", "and", "p47wt", "/", "mutants", "(", "0", ".", "1", "μg", "/", "μl", ")", "in", "the", "presence", "of", "AMP", "-", "PNP", ".", "The", "representative", "images", "are", "presented", "in", "Figure", "EV1F", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "+", "SD", "of", "nine", "sets", "of", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "positive", "control", "(", "'", "p97wt", "+", "p47wt", "'", ")", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Two sets of FTCD molecules and a p97/p47 complex form a quaternary complex. His-tagged FTCD was biotinylated and immobilized on streptavidin beads (His-FTCD-beads). The beads (1.0 μg) were incubated with Flag-tagged FTCD (2.0 μg) in the absence or presence of p47 (1.0 μg) and p97 (2.0 μg). The blots were probed with HRP-conjugated avidin and antibodies to Flag-tag, p97 and p47.(B) Formation of the quaternary complex in the presence of nucleotides. His-FTCD-beads (1.0 μg) were incubated with Flag-tagged FTCD (2.0 μg), p97 (2.0 μg) and p47 (1.0 μg) in the presence of nucleotides (1 mM). The blots were probed as described in (A).(C) Mutants that lack binding affinity disrupt the formation of the quaternary complex. His-FTCD-beads (1.0 μg) and Flag-tagged FTCD (2.0 μg) were incubated in the presence of AMP-PNP together with p97wt/mutant (2.0 μg) and p47wt/mutant (1.0 μg). The blots were probed as described in (A).(D) Negative stain electron microscopy of the quaternary complex. The panels show class averages of centered and aligned negative stain particles for the different populations present within the dataset, i.e., the full quaternary complex FTCD-p97/p47-FTCD (left panel), and its partial complexes (two variations, middle two panels). Class averages contain approximately 20 images per class. A class average showing a p97/p47 side view from cryo-EM data and a projection generated from FTCD structure (PDB code 1TT9) have been included for comparisons. Brackets and arrow heads indicate the p97 hexamer and the FTCD octamer, respectively. Scale bar = 15 nm.(E) FTCDwt-beads are aggregated in the presence of both p97 and p47. Biotinylated FTCDwt and FTCD(R382A) were immobilized on streptavidin magnetic beads to form FTCDwt-beads and FTCD(R382A)-beads, respectively. The beads were incubated with the indicated proteins (p97, 0.1 μg/μl; p47, 0.1 μg/μl; p37, 0.1 μg/μl) in the presence of AMP-PNP (1 mM), and observed under a bright-field microscope. Scale bar = 50 μm. (F) The results of quantification of (E). The percentages of beads in the aggregates were calculated. Results are expressed as the mean+SD of ten sets of independent experiments. An asterisk indicates a significant difference at P<0.01 compared with the others (Bonferroni method). (G) p97/p47-mediated aggregation of FTCDwt-beads is nucleotide-dependent. FTCDwt-beads were incubated together with p97 (0.1 μg/μl) and p47 (0.1 μg/μl) in the presence of the indicated nucleotides (1mM). The representative images are presented in Figure EV1E. Data are shown as the mean+SD of nine sets of independent experiments. An asterisk and hash tags indicate significant differences at P<0.01 compared with the others and the negative control ('none'), respectively (Bonferroni method).(H) p47 and p97 mutants that lack binding affinity inhibit p97/p47-mediated aggregation of FTCDwt-beads. FTCDwt-beads were incubated with p97wt/mutant (0.1 μg/μl) and p47wt/mutants (0.1 μg/μl) in the presence of AMP-PNP. The representative images are presented in Figure EV1F. Data are shown as the mean+SD of nine sets of independent experiments. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the positive control ('p97wt+p47wt') (Bonferroni method)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "The", "expression", "of", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "causes", "the", "aggregation", "of", "mitochondria", ".", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "either", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "or", "FTCD", "(", "R382A", ")", "-", "HA", "-", "MAO", "were", "cultured", "in", "DOX", "-", "free", "medium", "for", "48", "hrs", ".", "Cells", "which", "were", "cultured", "in", "the", "DOX", "-", "containing", "medium", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "mitochondria", "and", "a", "polyclonal", "antibody", "to", "HA", ",", "followed", "by", "observation", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Panels", "a", "-", "j", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "others", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "EM", "images", "of", "a", "cell", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ".", "The", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "were", "cultured", "for", "48", "hrs", "in", "the", "absence", "of", "DOX", ",", "and", "used", "for", "EM", "observation", ".", "Panel", "b", "displays", "the", "inset", "in", "panel", "a", ".", "Arrowheads", "show", "narrow", "gaps", "between", "mitochondria", ".", "Scale", "bar", "=", "0", ".", "2", "μm", ".", "The", "low", "magnification", "image", "is", "presented", "in", "Figure", "EV2C", ".", "(", "D", ")", "Endogenous", "p47", "and", "p97", "are", "necessary", "for", "mitochondria", "aggregation", "mediated", "by", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ".", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "were", "transfected", "with", "either", "mock", ",", "p47", "siRNA", "or", "p97", "siRNA", "duplexes", "and", "cultured", "for", "24", "hrs", ".", "The", "cells", "were", "further", "cultured", "in", "DOX", "-", "free", "medium", "for", "48", "hrs", "for", "the", "induction", "of", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ",", "and", "then", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Panels", "a", "-", "l", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "D", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "others", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "F", ")", "Binding", "between", "FTCD", "and", "p47", "and", "between", "p47", "and", "p97", "is", "necessary", "for", "mitochondria", "aggregation", "mediated", "by", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ".", "The", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "were", "transfected", "with", "mammalian", "expression", "constructs", "of", "siRNA", "-", "insensitive", "Flag", "-", "tagged", "p47wt", "/", "mutants", "at", "the", "same", "time", "as", "the", "treatment", "of", "p47", "siRNA", ",", "and", "cultured", "for", "24", "hrs", ".", "The", "cells", "were", "further", "cultured", "in", "DOX", "-", "free", "medium", "for", "48", "hrs", "for", "the", "induction", "of", "FTCD", "-", "HA", "-", "MAO", ".", "After", "fixation", ",", "the", "cells", "were", "visualized", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "mitochondria", "and", "polyclonal", "antibodies", "to", "HA", "and", "Flag", ".", "Panels", "a", "-", "l", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Binding", "between", "FTCD", "and", "p97", "is", "necessary", "for", "mitochondria", "aggregation", "mediated", "by", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ".", "The", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "were", "transfected", "with", "the", "mammalian", "expression", "construct", "of", "siRNA", "-", "insensitive", "Flag", "-", "tagged", "p97wt", "/", "mutant", "at", "the", "same", "time", "as", "treatment", "with", "p97", "siRNA", ".", "The", "following", "procedures", "were", "the", "same", "as", "in", "(", "F", ")", ".", "Panels", "a", "-", "i", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "H", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "F", ")", "and", "(", "G", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "five", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "siRNA", "treatment", "alone", "(", "'", "none", "'", ")", "and", "compared", "with", "mutant", "expression", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) The expression of FTCDwt-HA-MAO causes the aggregation of mitochondria. HeLa Tet-off cells inducibly expressing either FTCDwt-HA-MAO or FTCD(R382A)-HA-MAO were cultured in DOX-free medium for 48 hrs. Cells which were cultured in the DOX-containing medium were used as a control. The cells were fixed and stained with a monoclonal antibody to mitochondria and a polyclonal antibody to HA, followed by observation by confocal microscopy. Panels a-j display representative images. Scale bar = 10 μm. (B) The results of quantification of (A). Results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiment. An asterisk indicates a significant difference at P<0.01 compared with the others (Bonferroni method). (C) Representative EM images of a cell expressing FTCDwt-HA-MAO. The HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO were cultured for 48 hrs in the absence of DOX, and used for EM observation. Panel b displays the inset in panel a. Arrowheads show narrow gaps between mitochondria. Scale bar = 0.2 μm. The low magnification image is presented in Figure EV2C.(D) Endogenous p47 and p97 are necessary for mitochondria aggregation mediated by FTCDwt-HA-MAO. HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO were transfected with either mock, p47 siRNA or p97 siRNA duplexes and cultured for 24 hrs. The cells were further cultured in DOX-free medium for 48 hrs for the induction of FTCDwt-HA-MAO, and then analyzed as in (A). Panels a-l display representative images. Scale bar = 10 μm. (E) The results of quantification of (D). Results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiment. An asterisk indicates a significant difference at P<0.01 compared with the others (Bonferroni method). (F) Binding between FTCD and p47 and between p47 and p97 is necessary for mitochondria aggregation mediated by FTCDwt-HA-MAO. The HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO were transfected with mammalian expression constructs of siRNA-insensitive Flag-tagged p47wt/mutants at the same time as the treatment of p47 siRNA, and cultured for 24 hrs. The cells were further cultured in DOX-free medium for 48 hrs for the induction of FTCD-HA-MAO. After fixation, the cells were visualized with a monoclonal antibody to mitochondria and polyclonal antibodies to HA and Flag. Panels a-l display representative images. Scale bar = 10 μm. (G) Binding between FTCD and p97 is necessary for mitochondria aggregation mediated by FTCDwt-HA-MAO. The HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO were transfected with the mammalian expression construct of siRNA-insensitive Flag-tagged p97wt/mutant at the same time as treatment with p97 siRNA. The following procedures were the same as in (F). Panels a-i display representative images. Scale bar = 10 μm. (H) The results of quantification of (F) and (G). Results are shown as the mean±SD of five sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiment. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with siRNA treatment alone ('none') and compared with mutant expression (Bonferroni method). "}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "FTCD", "located", "in", "mitochondria", "causes", "mitochondria", "aggregation", "during", "mitosis", ".", "Mitotic", "cells", "were", "collected", "by", "flushing", "from", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "in", "which", "either", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "or", "FTCD", "(", "R382A", ")", "-", "HA", "-", "MAO", "had", "been", "induced", "for", "24", "hrs", ".", "The", "mitotic", "cells", "were", "further", "cultured", "for", "4", "hrs", "to", "enable", "complete", "cytokinesis", ".", "Cells", "in", "which", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "was", "induced", "for", "28", "hrs", "without", "synchronization", "were", "used", "as", "the", "asynchronous", "control", "group", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "visualized", "with", "a", "monoclonal", "antibody", "to", "mitochondria", "and", "a", "polyclonal", "antibody", "to", "HA", ".", "Panels", "a", "-", "f", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "seven", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "100", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "others", "(", "Bonferroni", "method", ")", ".", "(", "C", ")", "A", "single", "living", "cell", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "was", "tracked", "during", "mitosis", ".", "Mitotic", "cells", "were", "collected", "by", "flushing", "from", "the", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", ",", "and", "cultured", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "DOX", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "MitoTracker", "at", "the", "22", "hr", "time", "point", "and", "confocal", "images", "of", "30", "-", "40", "cells", "were", "randomly", "taken", "at", "the", "23", "hr", "time", "point", ".", "From", "the", "23", "hr", "to", "27", "hr", "time", "point", ",", "cells", "were", "tracked", "in", "the", "bright", "field", "every", "30", "mins", ".", "At", "the", "27", "hr", "time", "point", ",", "confocal", "images", "were", "taken", "of", "the", "21", "-", "38", "cells", "that", "were", "successfully", "tracked", ".", "Panels", "a", "-", "j", "display", "representative", "images", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "tracked", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "C", ")", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "five", "times", "and", "each", "line", "shows", "the", "average", "percentage", "of", "an", "independent", "experiment", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "that", "underwent", "mitosis", "are", "as", "follows", ":", "41", ".", "5", "%", "in", "the", "DOX", "(", "-", ")", "group", "and", "54", ".", "7", "%", "in", "the", "DOX", "(", "+", ")", "group", ".", "(", "E", ")", "FTCD", "located", "in", "mitochondria", "causes", "mitochondria", "aggregation", "at", "the", "end", "of", "mitosis", ".", "Mitotic", "cells", "were", "collected", "from", "the", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "inducibly", "expressing", "FTCDwt", "-", "HA", "-", "MAO", "and", "cultured", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "DOX", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "MitoTracker", "at", "the", "23hr", "time", "point", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", "from", "the", "24", "hr", "to", "26", "hr", "time", "point", ".", "Panels", "a", "-", "t", "display", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "F", ")", "The", "results", "of", "quantification", "of", "(", "E", ")", ".", "Cells", "were", "classified", "by", "their", "cell", "cycle", "phases", "into", "the", "following", "three", "categories", ":", "prometaphase", "/", "metaphase", ",", "anaphase", "/", "telophase", "and", "cytokinesis", ".", "Results", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "sets", "of", "independent", "experiments", ",", "with", "10", "-", "14", "cells", "counted", "in", "each", "group", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P", "<", "0", ".", "01", "compared", "with", "the", "DOX", "(", "+", ")", "group", "and", "with", "the", "prometaphase", "/", "metaphase", "category", "(", "Bonferroni", "method", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) FTCD located in mitochondria causes mitochondria aggregation during mitosis. Mitotic cells were collected by flushing from HeLa Tet-off cells in which either FTCDwt-HA-MAO or FTCD(R382A)-HA-MAO had been induced for 24 hrs. The mitotic cells were further cultured for 4 hrs to enable complete cytokinesis. Cells in which FTCDwt-HA-MAO was induced for 28 hrs without synchronization were used as the asynchronous control group. Cells were fixed and visualized with a monoclonal antibody to mitochondria and a polyclonal antibody to HA. Panels a-f display representative images. Scale bar = 10 μm. (B) The results of quantification of (A). Results are shown as the mean±SD of seven sets of independent experiments, with 100 cells counted in each group in each independent experiment. An asterisk indicates a significant difference at P<0.01 compared with the others (Bonferroni method). (C) A single living cell expressing FTCDwt-HA-MAO was tracked during mitosis. Mitotic cells were collected by flushing from the HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO, and cultured in the absence or presence of DOX. The cells were stained with MitoTracker at the 22 hr time point and confocal images of 30-40 cells were randomly taken at the 23 hr time point. From the 23 hr to 27 hr time point, cells were tracked in the bright field every 30 mins. At the 27 hr time point, confocal images were taken of the 21-38 cells that were successfully tracked. Panels a-j display representative images. Asterisks indicate the tracked cells. Scale bar = 10 μm. (D) The results of quantification of (C). The experiment was repeated five times and each line shows the average percentage of an independent experiment. The percentages of cells that underwent mitosis are as follows: 41.5 % in the DOX(-) group and 54.7 % in the DOX(+) group. (E) FTCD located in mitochondria causes mitochondria aggregation at the end of mitosis. Mitotic cells were collected from the HeLa Tet-off cells inducibly expressing FTCDwt-HA-MAO and cultured in the absence or presence of DOX as in (C). Cells were stained with MitoTracker at the 23hr time point and observed by confocal microscopy from the 24 hr to 26 hr time point. Panels a-t display representative images. Scale bar = 10 μm.(F) The results of quantification of (E). Cells were classified by their cell cycle phases into the following three categories: prometaphase/metaphase, anaphase/telophase and cytokinesis. Results are shown as the mean±SD of three sets of independent experiments, with 10-14 cells counted in each group in each independent experiment. Asterisks indicate a significant difference at P<0.01 compared with the DOX(+) group and with the prometaphase/metaphase category (Bonferroni method)."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Heat", "map", "of", "all", "reported", "cancer", "blood", "metabolites", "(", "each", "dark", "blue", "mark", "denotes", "that", "the", "metabolite", "was", "reported", "to", "be", "increased", "or", "decreased", ")", "in", "various", "cancer", "types", ",", "illustrating", "that", "most", "individual", "studies", "report", "only", "a", "small", "subset", "of", "all", "previously", "measured", "metabolites", ".", "It", "is", "typically", "not", "described", "whether", "the", "metabolites", "that", "were", "not", "reported", "(", "white", "\"", "empty", "\"", "space", ")", "were", "not", "measured", ",", "or", "measured", "but", "not", "reported", ".", "Labelings", ":", "X", "-", "axis", "(", "top", ")", ":", "ribbon", "colour", "code", ",", "denoting", "the", "cancer", "type", "(", "right", ";", "indicated", "by", "red", "arrow", ")", ";", "X", "-", "axis", "(", "bottom", ")", ":", "cohorts", ",", "arranged", "from", "1", "to", "71", ";", "Y", "-", "axis", "(", "right", ")", ":", "all", "1", ",", "206", "metabolites", "reported", "in", "at", "least", "one", "of", "the", "studies", ";", "Y", "-", "axis", "(", "left", ")", ":", "ribbon", "colour", "code", ",", "denoting", "the", "metabolite", "class", "(", "amino", "acids", ",", "carbohydrates", ",", "etc", ";", "\"", "other", "\"", "refers", "to", "all", "other", "metabolites", "than", "the", "listed", "classes", ")", ".", "B", ",", "Vote", "counting", "of", "cancer", "blood", "metabolites", "(", "reported", "in", "at", "least", "six", "cohorts", ")", "showed", "consistently", "deregulated", "metabolites", ".", "Blue", "bars", ":", "decreased", "metabolites", ";", "red", "bars", ":", "increased", "metabolites", ".", "*", "(", "asterisk", ")", "in", "front", "of", "the", "name", "of", "the", "metabolite", "indicates", "a", "statistical", "trend", "(", "p", "<", "0", ".", "1", ")", ";", "red", "arrowheads", "denote", "metabolites", "mentioned", "in", "the", "main", "text", ".", "C", ",", "D", ",", "Volcano", "plot", "of", "bloodmetabolites", "(", "C", ")", "and", "tissuemetabolites", "(", "D", ")", ",", "reported", "in", "at", "least", "six", "cancer", "studies", ",", "with", "the", "vote", "counting", "score", "on", "the", "X", "-", "axis", "and", "the", "-", "log10", "adjusted", "p", "-", "value", "on", "the", "Y", "-", "axis", ".", "Cyan", "indicates", "deregulated", "metabolites", "that", "show", "a", "trend", "(", "p", "<", "0", ".", "1", ";", "for", "blood", ",", "corresponding", "to", "metabolites", "marked", "with", "*", "in", "panel", "2B", ";", "for", "tissue", ",", "corresponding", "to", "metabolites", "marked", "with", "*", "in", "Figure", "3", ")", "or", "statistical", "significance", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "above", "black", "dashed", "horizontal", "line", ")", ";", "red", "indicates", "metabolites", "with", "a", "p", "-", "value", ">", "0", ".", "1", ".", "A", "subset", "of", "metabolites", "is", "annotated", "(", "see", "Table", "EV4", "(", "blood", ")", "and", "EV5", "(", "tissue", ")", "for", "full", "annotation", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Heat map of all reported cancer blood metabolites (each dark blue mark denotes that the metabolite was reported to be increased or decreased) in various cancer types, illustrating that most individual studies report only a small subset of all previously measured metabolites. It is typically not described whether the metabolites that were not reported (white \"empty\" space) were not measured, or measured but not reported. Labelings: X-axis (top): ribbon colour code, denoting the cancer type (right; indicated by red arrow); X-axis (bottom): cohorts, arranged from 1 to 71; Y-axis (right): all 1,206 metabolites reported in at least one of the studies; Y-axis (left): ribbon colour code, denoting the metabolite class (amino acids, carbohydrates, etc; \"other\" refers to all other metabolites than the listed classes).B, Vote counting of cancer blood metabolites (reported in at least six cohorts) showed consistently deregulated metabolites. Blue bars: decreased metabolites; red bars: increased metabolites. * (asterisk) in front of the name of the metabolite indicates a statistical trend (p < 0.1); red arrowheads denote metabolites mentioned in the main text.C,D, Volcano plot of bloodmetabolites (C) and tissuemetabolites (D), reported in at least six cancer studies, with the vote counting score on the X-axis and the -log10 adjusted p-value on the Y-axis. Cyan indicates deregulated metabolites that show a trend (p < 0.1; for blood, corresponding to metabolites marked with * in panel 2B; for tissue, corresponding to metabolites marked with * in Figure 3) or statistical significance (p < 0.05; above black dashed horizontal line); red indicates metabolites with a p-value > 0.1. A subset of metabolites is annotated (see Table EV4 (blood) and EV5 (tissue) for full annotation)."}
{"words": ["Figure", "3Vote", "counting", "of", "cancer", "tissue", "metabolites", "(", "reported", "in", "at", "least", "six", "cohorts", ")", "showed", "consistently", "deregulated", "metabolites", ".", "Blue", "bars", ":", "decreased", "metabolites", ";", "red", "bars", ":", "increased", "metabolites", ".", "*", "(", "asterisk", ")", "in", "front", "of", "the", "name", "of", "the", "metabolite", "indicates", "a", "statistical", "trend", "(", "p", "<", "0", ".", "1", ")", ";", "red", "arrows", "denote", "key", "metabolites", "mentioned", "in", "the", "main", "text", "(", "see", "Table", "EV5", "for", "full", "annotation", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Vote counting of cancer tissue metabolites (reported in at least six cohorts) showed consistently deregulated metabolites. Blue bars: decreased metabolites; red bars: increased metabolites. * (asterisk) in front of the name of the metabolite indicates a statistical trend (p < 0.1); red arrows denote key metabolites mentioned in the main text (see Table EV5 for full annotation)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "nuclear", "fluorescence", "of", "H676", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "for", "24h", "at", "1", "μM", ".", "Scale", "bars", ",", "5μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "images", "(", "top", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "bottom", ")", "of", "h676", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "for", "24h", "at", "1", "μM", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "(", "PLKi", ",", "HSP90i", "and", "RTKi", ")", "and", "n", "=", "4", "(", "AuroraI", ",", "mTOR", ",", "CDKi", ",", "Docetaxel", ",", "Gemcitabine", ",", "ERKi", ",", "MEKi", ")", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative images (top) and quantification (bottom) of TRF1 nuclear fluorescence of H676 cells treated with the indicated compounds for 24h at 1 μM. Scale bars, 5μm. Data are representative of n=3 biological replicates. (C) Western blot images (top) and TRF1 protein levels (bottom) of h676 cells treated with the indicated compounds for 24h at 1 μM. Data are representative of n=3 (PLKi, HSP90i and RTKi) and n=4 (AuroraI, mTOR, CDKi, Docetaxel, Gemcitabine, ERKi, MEKi) biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "percentage", "(", "right", ")", "of", "cells", "presenting", "1", "or", "more", "γH2AX", "and", "RAP1", "colocalizing", "foci", "(", "TIFs", ")", "upon", "treatment", "of", "CHA9", "-", "3", "lung", "cancer", "cells", "with", "the", "indicated", "compounds", ".", "White", "arrowheads", "point", "to", "colocalization", "of", "γH2AX", "and", "RAP1", ".", "Scale", "bars", ",", "5μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "(", "DMSO", ")", "and", "n", "=", "3", "(", "mTORi", ",", "PI3Ki", ",", "RTKi", ",", "MEKi", ",", "ERKi", ",", "HSPO90i", ",", "CDKi", ",", "Docetaxel", ")", "biological", "replicatesRepresentative", "images", "(", "left", ")", "and", "percentage", "(", "right", ")", "of", "γH2AX", "-", "positive", "cells", "per", "field", "in", "DMSO", "or", "compound", "treated", "patient", "-", "derived", "h676", "GSCs", ".", "Scale", "bars", ",", "50μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "6", "(", "DMSO", ")", "and", "3", "(", "mTORi", ",", "Docetaxel", ",", "ERKi", ",", "MEKi", ",", "RTKi", ",", "HSP90i", ",", "Gemcitabine", ",", "CDKi", ")", "biological", "replicatesQuantification", "of", "multitelomeric", "signals", "(", "MTS", ")", "in", "h676", "GSC", "metaphases", "upon", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", ".", "Representative", "images", "of", "the", "qFISH", "in", "the", "metaphases", "(", "left", ")", ".", "Multitelomeric", "signals", "are", "indicated", "by", "arrowheads", ".", "Scale", "bars", ",", "1μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "31", "(", "DMSO", ")", ",", "n", "=", "18", "(", "mTORi", ")", ",", "n", "=", "11", "(", "MEKi", ")", "and", "n", "=", "24", "(", "RTKi", ")", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Significant", "differences", "using", "unpaired", "t", "‐", "test", "are", "indicated", "by", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative images (left) and percentage (right) of cells presenting 1 or more γH2AX and RAP1 colocalizing foci (TIFs) upon treatment of CHA9-3 lung cancer cells with the indicated compounds. White arrowheads point to colocalization of γH2AX and RAP1. Scale bars, 5μm. Data are representative of n=6 (DMSO) and n=3 (mTORi, PI3Ki, RTKi, MEKi, ERKi, HSPO90i, CDKi, Docetaxel) biological replicatesRepresentative images (left) and percentage (right) of γH2AX-positive cells per field in DMSO or compound treated patient-derived h676 GSCs. Scale bars, 50μm. Data are representative of 6 (DMSO) and 3 (mTORi, Docetaxel, ERKi, MEKi, RTKi, HSP90i, Gemcitabine, CDKi) biological replicatesQuantification of multitelomeric signals (MTS) in h676 GSC metaphases upon treatment with the indicated compounds. Representative images of the qFISH in the metaphases (left). Multitelomeric signals are indicated by arrowheads. Scale bars, 1μm. Data are representative of n=31 (DMSO), n=18 (mTORi), n=11 (MEKi) and n=24 (RTKi) biological replicates. Data are represented as mean ± SEM. Significant differences using unpaired t‐test are indicated by *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", ".", "Dose", "response", "curves", "of", "h543", "and", "h676", "GSCs", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "at", "several", "concentrations", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "normalized", "to", "DMSO", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO.Dose response curves of h543 and h676 GSCs treated with the indicated compounds at several concentrations. Data are representative of n=2 biological replicates. Data are represented as mean ± SEM normalized to DMSO."}
{"words": ["Figure", "41", "or", "2", "μM", "of", "GST", "or", "GST", "-", "TRF1", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "mouse", "ERK2", "kinase", "in", "the", "presence", "of", "5μCi", "[", "γ", "-", "32", "-", "P", "]", "ATP", ".", "The", "mixture", "was", "resolve", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "autoradiography", ".", "1", "or", "2", "μM", "of", "GST", "or", "GST", "-", "TRF1", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "human", "b", "-", "Raf", "kinase", "(", "WT", "or", "V600E", ")", "in", "the", "presence", "of", "5μCi", "[", "γ", "-", "32", "-", "P", "]", "ATP", ".", "The", "mixture", "was", "resolve", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "autoradiography", ".", "1", "or", "2", "μM", "of", "GST", "or", "GST", "-", "TRF1", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "mouse", "MEK1", "kinase", "in", "the", "presence", "of", "5μCi", "[", "γ", "-", "32", "-", "P", "]", "ATP", ".", "The", "mixture", "was", "resolve", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "autoradiography", ".", "1", "μM", "of", "GST", "-", "TRF1", "and", "0", ".", "2", "μM", "of", "mouse", "ERK2", "kinase", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "ERK", "and", "MEK", "inhibitors", ".", "2", "μM", "of", "GST", "-", "TRF1", "and", "0", ".", "1", "μM", "of", "human", "b", "-", "Raf", "kinase", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "the", "bRaf", "inhibitors", "dabrafenib", "and", "vemurafenib", ".", "1", "or", "2", "μM", "of", "GST", "or", "GST", "-", "TRF1", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "human", "mTOR", "kinase1", "or", "2", "μM", "of", "GST", "or", "GST", "-", "TRF1", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "human", "mTOR", "kinase", "in", "the", "presence", "of", "the", "mTOR", "inhibitors", "rapamycin", "and", "Ku0063794Phosphopeptide", "peak", "intensity", "normalized", "to", "total", "TRF1", "signal", "in", "samples", "containing", "only", "TRF1", "or", "TRF1", "plus", "ERK2Phosphopeptide", "peak", "intensity", "normalized", "to", "total", "TRF1", "signal", "in", "samples", "containing", "only", "TRF1", "plus", "bRAFWT", "or", "bRAFV600EPhosphopeptide", "peak", "intensity", "normalized", "to", "total", "TRF1", "signal", "in", "samples", "containing", "only", "TRF1", "plus", "mTORRepresentative", "image", "(", "down", ")", "and", "quantification", "(", "up", ")", "of", "in", "vitro", "phosphorylation", "assays", "with", "the", "indicated", "GST", "-", "TRF1", "wild", "-", "type", "or", "mutated", "forms", "in", "the", "presence", "of", "mouse", "ERK2", "kinase", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 41 or 2 μM of GST or GST-TRF1 were incubated with the indicated concentrations of mouse ERK2 kinase in the presence of 5μCi [γ-32-P]ATP. The mixture was resolve by SDS-PAGE followed by autoradiography.1 or 2 μM of GST or GST-TRF1 were incubated with the indicated concentrations of human b-Raf kinase (WT or V600E) in the presence of 5μCi [γ-32-P]ATP. The mixture was resolve by SDS-PAGE followed by autoradiography.1 or 2 μM of GST or GST-TRF1 were incubated with the indicated concentrations of mouse MEK1 kinase in the presence of 5μCi [γ-32-P]ATP. The mixture was resolve by SDS-PAGE followed by autoradiography.1 μM of GST-TRF1 and 0.2 μM of mouse ERK2 kinase were incubated in the presence of ERK and MEK inhibitors.2 μM of GST-TRF1 and 0.1 μM of human b-Raf kinase were incubated in the presence of the bRaf inhibitors dabrafenib and vemurafenib.1 or 2 μM of GST or GST-TRF1 were incubated with the indicated concentrations of human mTOR kinase1 or 2 μM of GST or GST-TRF1 were incubated with the indicated concentrations of human mTOR kinase in the presence of the mTOR inhibitors rapamycin and Ku0063794Phosphopeptide peak intensity normalized to total TRF1 signal in samples containing only TRF1 or TRF1 plus ERK2Phosphopeptide peak intensity normalized to total TRF1 signal in samples containing only TRF1 plus bRAFWT or bRAFV600EPhosphopeptide peak intensity normalized to total TRF1 signal in samples containing only TRF1 plus mTORRepresentative image (down) and quantification (up) of in vitro phosphorylation assays with the indicated GST-TRF1 wild-type or mutated forms in the presence of mouse ERK2 kinase."}
{"words": ["Figure", "5Western", "blot", "images", "of", "Trf1lox", "/", "lox", "MEFS", "with", "or", "without", "overexpression", "of", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "followed", "by", "Cre", "recombinase", "transduction", ".", "Quantification", "of", "eGFP", "-", "TRF1", "inhibition", "in", "Trf1Δ", "/", "Δ", "MEFs", "transduced", "with", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "15", "biological", "replicatesGrowth", "curves", "of", "Trf1Δ", "/", "Δ", "MEFs", "transduced", "with", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "5", "biological", "replicatesWestern", "blot", "images", "of", "Trf1lox", "/", "lox", "MEFS", "with", "or", "without", "overexpression", "of", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "followed", "by", "Cre", "recombinase", "transduction", ".", "Quantification", "of", "eGFP", "-", "TRF1", "inhibition", "in", "Trf1Δ", "/", "Δ", "MEFs", "transduced", "with", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "5", "biological", "replicatesWestern", "blot", "images", "of", "p53", "-", "/", "-", "MEFS", "with", "or", "without", "overexpression", "of", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "or", "mutant", "alleles", "followed", "treatment", "with", "ERKi", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "biological", "replicatesRepresentative", "images", "(", "above", ")", "and", "percentage", "(", "bottom", ")", "of", "Telomeric", "and", "53BP1", "colocalizing", "foci", "(", "TIFs", ")", "per", "cells", "of", "p53", "-", "/", "-", "MEFS", "with", "or", "without", "overexpression", "of", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "and", "the", "indicated", "mutants", "upon", "treatment", "with", "the", "ERKi", ".", "White", "arrowheads", ":", "colocalization", "of", "telomeric", "and", "53BP1", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Western blot images of Trf1lox/lox MEFS with or without overexpression of eGFP-Trf1 WT or mutant alleles followed by Cre recombinase transduction.Quantification of eGFP-TRF1 inhibition in Trf1Δ/Δ MEFs transduced with eGFP-Trf1 WT or mutant alleles as indicated. Data are representative of n=15 biological replicatesGrowth curves of Trf1Δ/Δ MEFs transduced with eGFP-Trf1 WT or mutant alleles as indicated. Data are representative of n=5 biological replicatesWestern blot images of Trf1lox/lox MEFS with or without overexpression of eGFP-Trf1 WT or mutant alleles followed by Cre recombinase transduction. Quantification of eGFP-TRF1 inhibition in Trf1Δ/Δ MEFs transduced with eGFP-Trf1 WT or mutant alleles as indicated. Data are representative of n=5 biological replicatesWestern blot images of p53-/- MEFS with or without overexpression of eGFP-Trf1 WT or mutant alleles followed treatment with ERKi. Data are representative of n=2 biological replicatesRepresentative images (above) and percentage (bottom) of Telomeric and 53BP1 colocalizing foci (TIFs) per cells of p53-/- MEFS with or without overexpression of eGFP-Trf1 WT and the indicated mutants upon treatment with the ERKi. White arrowheads: colocalization of telomeric and 53BP1. Scale bars, 10μm."}
{"words": ["Figure", "6Western", "blot", "image", "(", "above", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "protein", "levels", "upon", "genetic", "depletion", "of", "ERK1", "/", "2", "in", "p53", "-", "/", "-", "MEF", "line", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Representative", "images", "(", "above", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "telomeric", "foci", "in", "ERK1", "/", "2", "RNA", "interfered", "p53", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Scale", "bars", ",", "5μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "Western", "blot", "image", "of", "eGFP", "-", "tagged", "and", "endogenous", "TRF1", "protein", "levels", "upon", "genetic", "depletion", "of", "ERK1", "/", "2", "in", "p53", "-", "/", "-", "MEF", "line", ".", "Representative", "images", "(", "above", ")", "and", "percentage", "(", "bottom", ")", "of", "telomeric", "and", "53BP1", "colocalizing", "foci", "(", "TIFs", ")", "per", "cell", "in", "p53", "-", "/", "-", "MEF", "with", "or", "without", "overexpression", "of", "eGFP", "-", "Trf1", "WT", "and", "indicated", "mutants", "upon", "genetic", "depletion", "of", "ERK1", "/", "2", ".", "White", "arrowheads", ":", "colocalization", "of", "telomeric", "and", "53BP1", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blot image (above) and quantification (bottom) of TRF1 protein levels upon genetic depletion of ERK1/2 in p53-/- MEF line. Data are representative of n=3 independent experiments.Representative images (above) and quantification (bottom) of TRF1 telomeric foci in ERK1/2 RNA interfered p53-/- MEFs. Scale bars, 5μm. Data are representative of n=2 independent experiments.Western blot image of eGFP-tagged and endogenous TRF1 protein levels upon genetic depletion of ERK1/2 in p53-/- MEF line.Representative images (above) and percentage (bottom) of telomeric and 53BP1 colocalizing foci (TIFs) per cell in p53-/- MEF with or without overexpression of eGFP-Trf1 WT and indicated mutants upon genetic depletion of ERK1/2. White arrowheads: colocalization of telomeric and 53BP1.Scale bars, 10μm."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "number", "of", "spheres", "formed", "by", "h676", "GSCs", "7", "days", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "Western", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "(", "RTKi", "in", "G", "(", "DMSO", "in", "GWestern", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "(", "DMSO", "in", "and", "ERKi", "in", "H", ")", "Western", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "(", "DMSO", "in", "(", "PI3Ki", "inWestern", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "(", "DMSO", "in", "(", "PI3Ki", "inWestern", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "(", "DMSOWestern", "blot", "images", "(", "left", ")", "and", "TRF1", "protein", "levels", "(", "right", ")", "measured", "in", "h676", "GSCs", "24h", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Data", "are", "representative", "of", "Docetaxel", "("], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Representative images (left) and quantification (right) of number of spheres formed by h676 GSCs 7 days after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 100μm. Data are representative of n=6 biological replicates.Western blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of n=3 (RTKi in G (DMSO in GWestern blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of (DMSO in and ERKi in H)Western blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of (DMSO in (PI3Ki inWestern blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of (DMSO in (PI3Ki inWestern blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of (DMSOWestern blot images (left) and TRF1 protein levels (right) measured in h676 GSCs 24h after treatment with the indicated compounds as single agents or in combination. Data are representative of Docetaxel (DMSO"}
{"words": ["Figure", "8Longitudinal", "tumor", "growth", "follow", "-", "up", "in", "mice", "injected", "with", "h676", "GSCs", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "in", "single", "agents", "or", "combination", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ",", "in", "A", ":", "vehicle", "n", "=", "16", ",", "PI3Ki", "n", "=", "8", ",", "ERKi", "n", "=", "16", ",", "Combination", "n", "=", "8", "Pvalues", "represent", "the", "mean", "of", "all", "the", "time", "pointsLongitudinal", "tumor", "growth", "follow", "-", "up", "in", "mice", "injected", "with", "h676", "GSCs", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "in", "single", "agents", "or", "combination", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ",", "in", "B", ":", "Vehicle", "n", "=", "16", ",", "PI3Ki", "n", "=", "16", ",", "MEKi", "n", "=", "8", ",", "Combination", "n", "=", "8", "Pvalues", "represent", "the", "mean", "of", "all", "the", "time", "pointsLongitudinal", "tumor", "growth", "follow", "-", "up", "in", "mice", "injected", "with", "h676", "GSCs", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "in", "single", "agents", "or", "combination", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ",", "in", "C", ":", "Vehicle", "n", "=", "8", ",", "PI3Ki", "n", "=", "16", ",", "Docetaxel", "n", "=", "16", ",", "Combination", "n", "=", "8", "Pvalues", "represent", "the", "mean", "of", "all", "the", "time", "pointsLongitudinal", "tumor", "growth", "follow", "-", "up", "in", "mice", "injected", "with", "h676", "GSCs", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "in", "single", "agents", "or", "combination", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ",", "in", "D", ":", "Vehicle", "n", "=", "16", ",", "PI3K", "n", "=", "16", ",", "Gemcitabine", "n", "=", "4", ",", "Combination", "n", "=", "4", ".", "Pvalues", "represent", "the", "mean", "of", "all", "the", "time", "pointsRepresentative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "nuclear", "fluorescence", "in", "tumors", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ":", "in", "E", ":", "vehicle", "n", "=", "15", ",", "PI3Ki", "n", "=", "10", ",", "ERKi", "n", "=", "8", ",", "Combination", "n", "=", "2Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "nuclear", "fluorescence", "in", "tumors", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", "in", "F", ":", "Vehicle", "n", "=", "15", ",", "PI3Ki", "n", "=", "10", ",", "MEKi", "n", "=", "8", ",", "Combination", "n", "=", "6Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "nuclear", "fluorescence", "in", "tumors", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ";", "in", "G", ":", "Vehicle", "n", "=", "15", ",", "PI3Ki", "n", "=", "10", ",", "Docetaxel", "n", "=", "8", ",", "Combination", "n", "=", "4Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "TRF1", "nuclear", "fluorescence", "in", "tumors", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "as", "single", "agents", "or", "in", "combination", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "represents", "number", "of", "tumors", ";", "in", "H", ":", "Vehicle", "n", "=", "15", ",", "PI3K", "n", "=", "10", ",", "Gemcitabine", "n", "=", "8", ",", "Combination", "n", "=", "6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Longitudinal tumor growth follow-up in mice injected with h676 GSCs and treated with the indicated compounds in single agents or combination. n represents number of tumors, in A: vehicle n=16, PI3Ki n=8, ERKi n=16, Combination n=8 Pvalues represent the mean of all the time pointsLongitudinal tumor growth follow-up in mice injected with h676 GSCs and treated with the indicated compounds in single agents or combination. n represents number of tumors, in B: Vehicle n=16, PI3Ki n=16, MEKi n=8, Combination n=8 Pvalues represent the mean of all the time pointsLongitudinal tumor growth follow-up in mice injected with h676 GSCs and treated with the indicated compounds in single agents or combination. n represents number of tumors, in C: Vehicle n=8, PI3Ki n=16, Docetaxel n=16, Combination n=8 Pvalues represent the mean of all the time pointsLongitudinal tumor growth follow-up in mice injected with h676 GSCs and treated with the indicated compounds in single agents or combination. n represents number of tumors, in D: Vehicle n=16, PI3K n=16, Gemcitabine n=4, Combination n=4. Pvalues represent the mean of all the time pointsRepresentative images (top) and quantification (bottom) of TRF1 nuclear fluorescence in tumors treated with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 10 μm. Data are represented as mean ± SEM. n represents number of tumors: in E: vehicle n=15, PI3Ki n=10, ERKi n=8, Combination n=2Representative images (top) and quantification (bottom) of TRF1 nuclear fluorescence in tumors treated with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 10 μm. Data are represented as mean ± SEM. n represents number of tumors in F: Vehicle n=15, PI3Ki n=10, MEKi n=8, Combination n=6Representative images (top) and quantification (bottom) of TRF1 nuclear fluorescence in tumors treated with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 10 μm. Data are represented as mean ± SEM. n represents number of tumors ; in G: Vehicle n=15, PI3Ki n=10, Docetaxel n=8, Combination n=4Representative images (top) and quantification (bottom) of TRF1 nuclear fluorescence in tumors treated with the indicated compounds as single agents or in combination. Scale bars, 10 μm. Data are represented as mean ± SEM. n represents number of tumors ; in H: Vehicle n=15, PI3K n=10, Gemcitabine n=8, Combination n=6."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Analysis", "of", "puromycin", "incorporation", "in", "MelJuSo", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "puromycin", ",", "and", "GAPDH", "as", "loading", "control", ".", "C", ")", "Representative", "images", "of", "MelJuSo", "cells", "expressing", "Ub", "-", "YFP", ",", "which", "were", "either", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Analysis of puromycin incorporation in MelJuSo cells that were left untreated (- HS), exposed to 43°C for 30 minutes (+ HS), and followed for 4 hours after heat shock (HS + 4h Rec.). The blots were probed with antibodies against puromycin, and GAPDH as loading control.C) Representative images of MelJuSo cells expressing Ub-YFP, which were either left untreated (- HS), exposed to 43 °C for 30 minutes (+ HS), and followed for 4 hours after heat shock (HS + 4h Rec.)."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "and", "B", ")", "Representative", "images", "of", "stress", "granule", "proficient", "(", "siControl", ")", "and", "deficient", "(", "siG3BP1", "/", "2", ")", "MelJuSo", "cells", "expressing", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "(", "A", ")", "and", "the", "cytoplasmic", "UPS", "reporter", "NES", "-", "GFP", "-", "CL1", "(", "B", ")", ".", "The", "cells", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "(", "HS", ")", ",", "or", "exposed", "to", "43", "°", "C", "for", "30", "minutes", "and", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "4h", "Rec", ".", ")", ".", "Nucleolar", "accumulation", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "during", "the", "recovery", "is", "indicated", "by", "arrows", "in", "A", ")", ".", "C", ")", "and", "D", ")", "Quantifications", "of", "the", "mean", "cellular", "GFP", "fluorescence", "intensities", "of", "A", ")", "and", "B", ")", "normalized", "to", "untreated", "control", "cells", "(", "siControl", "-", "HS", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "relative", "fluorescence", "intensities", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "1000", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "in", "control", "(", "siControl", ",", "left", "panel", ")", "and", "G3BP1", "/", "2", "-", "depleted", "(", "siGRBP1", "/", "2", ",", "right", "panel", ")", "MelJuSo", "cells", "exposed", "to", "a", "30", "min", "43", "°", "C", "heat", "shock", ",", "followed", "by", "4", "hours", "at", "37", "°", "C", "(", "Recovery", ")", ".", "Nucleolar", "accumulation", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratios", "of", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", "intensities", "in", "images", "of", "experiment", "shown", "in", "E", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "100", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) and B) Representative images of stress granule proficient (siControl) and deficient (siG3BP1/2) MelJuSo cells expressing the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1 (A) and the cytoplasmic UPS reporter NES-GFP-CL1 (B). The cells were left untreated (- HS), exposed to 43°C for 30 minutes (HS), or exposed to 43°C for 30 minutes and followed by 4 hours recovery (HS + 4h Rec.). Nucleolar accumulation of NLS-GFP-CL1 during the recovery is indicated by arrows in A). C) and D) Quantifications of the mean cellular GFP fluorescence intensities of A) and B) normalized to untreated control cells (siControl - HS). The frequency and distribution of the relative fluorescence intensities per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits. (n=3 independent experiments, >1000 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01, ns: not significant).E) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1 in control (siControl, left panel) and G3BP1/2-depleted (siGRBP1/2, right panel) MelJuSo cells exposed to a 30 min 43°C heat shock, followed by 4 hours at 37°C (Recovery). Nucleolar accumulation of NLS-GFP-CL1 is indicated by arrows. F) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratios of NLS-GFP-CL1 intensities in images of experiment shown in E). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits. (n=3 independent experiments, 100 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01)."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "stress", "granule", "marker", "TIA1", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleus", "/", "cytoplasm", "ratios", "of", "puromycin", "intensities", "in", "images", "from", "A", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "stress", "granule", "marker", "TIA1", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "control", "(", "siControl", ")", "and", "Hsp70", "-", "depleted", "(", "siHsp70", ")", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "puromycin", "positive", "TIA", "dots", "per", "cell", "in", "images", "from", "E", ")", ".", "The", "numbers", "of", "positive", "foci", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "G", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "puromycin", "-", "labelled", "proteins", "in", "control", "(", "siControl", ")", "and", "Hsp70", "-", "depleted", "(", "siHsp70", ")", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "43", "°", "C", "heat", "shock", ".", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratio", "of", "puromycin", "intensities", "in", "images", "from", "G", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the stress granule marker TIA1 and puromycin-labelled proteins in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock. B) Quantification of the nucleus/cytoplasm ratios of puromycin intensities in images from A). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).E) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the stress granule marker TIA1 and puromycin-labelled proteins in control (siControl) and Hsp70-depleted (siHsp70) U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock F) Quantification of the numbers of puromycin positive TIA dots per cell in images from E). The numbers of positive foci per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).G) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and puromycin-labelled proteins in control (siControl) and Hsp70-depleted (siHsp70) G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to 43°C heat shock. H) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratio of puromycin intensities in images from G). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01)."}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "HSF1", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "directly", "after", "heat", "shock", "(", "+", "HS", ")", "and", "2", "hours", "after", "2", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "2h", "Recovery", ")", ".", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "HSF1", "foci", "per", "cell", "in", "images", "from", "B", ")", ",", "shown", "as", "box", "plot", "with", "median", "and", "5", "-", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "300", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "heat", "shocked", "(", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "1", ",", "2", ",", "and", "4", "hours", "after", "heat", "shock", "(", "Rec", ")", ".", "The", "blots", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "HSF1", "and", "GAPDH", "(", "*", "indicated", "phosphorylated", "HSF1", ",", "and", "*", "*", "indicates", "unphosphorylated", "HSF1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) Representative confocal images of immunofluorescent staining of HSF1 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells directly after heat shock (+ HS) and 2 hours after 2 hours recovery (HS + 2h Recovery). C) Quantification of the number of HSF1 foci per cell in images from B), shown as box plot with median and 5-95 percentiles (n=3 independent experiments, >300 cells analyzed per condition, Kruskal-Wallis test, ** P<0.01).D) Western blot analysis of parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (- HS), heat shocked (HS), and followed for 1, 2, and 4 hours after heat shock (Rec). The blots were probed with antibodies against HSF1 and GAPDH (* indicated phosphorylated HSF1, and ** indicates unphosphorylated HSF1)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "and", "SUMO2", "/", "3", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "a", "heat", "shock", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "nucleolus", "/", "nucleoplasm", "ratio", "of", "SUMO2", "/", "3", "intensities", "in", "images", "from", "A", ")", ".", "The", "frequency", "and", "distribution", "of", "the", "ratio", "per", "cell", "are", "shown", "as", "violin", "plots", ".", "The", "solid", "lines", "in", "each", "distribution", "represent", "the", "median", ",", "and", "dash", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "interquartile", "range", "limits", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "C", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "PML", "bodies", "(", "PML", ")", "and", "SUMO2", "/", "3", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "heat", "shocked", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "Arrows", "indicate", "dots", "positive", "for", "PML", "and", "SUMO2", "/", "3", "staining", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "SUMO2", "/", "3", "positive", "PML", "puncta", "in", "images", "from", "C", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "E", ")", "Analysis", "of", "SUMO2", "/", "3", "conjugates", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "a", "heat", "shock", "(", "+", "HS", ")", ",", "and", "followed", "for", "2", "hours", "(", "2h", "Rec", ".", ")", "with", "or", "without", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of the nucleolar marker nucleolin and SUMO2/3 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to a heat shock followed by 2 hours recovery. B) Quantification of the nucleolus/nucleoplasm ratio of SUMO2/3 intensities in images from A). The frequency and distribution of the ratio per cell are shown as violin plots. The solid lines in each distribution represent the median, and dash lines represent the upper and lower interquartile range limits (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).C) Representative confocal images of immunofluorescent staining of PML bodies (PML) and SUMO2/3 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were heat shocked followed by 2 hours recovery. Arrows indicate dots positive for PML and SUMO2/3 staining. D) Quantification of SUMO2/3 positive PML puncta in images from C). Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).E) Analysis of SUMO2/3 conjugates in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (- HS), exposed to a heat shock (+ HS), and followed for 2 hours (2h Rec.) with or without 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX)."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "SUMO2", "/", "3", "and", "TDP43", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "a", "heat", "shocked", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", ".", "Arrows", "indicate", "dots", "positive", "for", "TDP", "-", "43", "and", "SUMO2", "/", "3", "staining", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "SUMO2", "/", "3", "positive", "TDP43", "puncta", "in", "images", "from", "experiment", "shown", "in", "A", ")", ".", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", ">", "50", "cells", "analyzed", "per", "condition", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "D", ")", "Analysis", "of", "detergent", "SDS", "and", "NP40", "soluble", "fractions", "of", "TDP43", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", "that", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "(", "+", "HS", ")", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", "(", "2h", "Rec", ".", ")", "in", "absence", "or", "presence", "of", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "TDP43", "band", "densities", "in", "the", "SDS", "-", "soluble", "fraction", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of SUMO2/3 and TDP43 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were exposed to a heat shocked followed by 2 hours recovery. Arrows indicate dots positive for TDP-43 and SUMO2/3 staining. B) Quantification of the percentage of SUMO2/3 positive TDP43 puncta in images from experiment shown in A)..Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, >50 cells analyzed per condition, Mann-Whitney test, ** P<0.01).D) Analysis of detergent SDS and NP40 soluble fractions of TDP43 in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells that were left untreated (-HS), exposed to 43°C (+HS) followed by 2 hours recovery (2h Rec.) in absence or presence of 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). E) Quantification of the TDP43 band densities in the SDS-soluble fraction. Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, Student's unpaired t-test, * P<0.05)."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Analysis", "of", "SUMO2", "/", "3", "conjugates", "in", "control", "(", "siControl", ")", "or", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siRNF4", ")", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "left", "untreated", "(", "-", "HS", ")", ",", "exposed", "to", "43", "°", "C", "(", "+", "HS", ")", ",", "followed", "by", "2", "hours", "recovery", "(", "HS", "+", "2h", "Rec", ".", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "100", "nM", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "total", "SUMO2", "/", "3", "band", "densities", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "control", "(", "siControl", ")", ",", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siRNF4", ")", ",", "G3BP1", "/", "2", "-", "depleted", "(", "siG3BP1", "/", "2", ")", "and", "G3BP1", "/", "2", "+", "RNF4", "-", "depleted", "(", "siG3BP1", "/", "2", "+", "siRNF4", ")", "MelJuSo", "cells", "expressing", "the", "nuclear", "UPS", "reporter", "NLS", "-", "GFP", "-", "CL1", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "heat", "shock", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "the", "proteasome", "inhibitor", "epoxomicin", "(", "EPX", ")", ".", "The", "nucleolar", "marker", "nucleolin", "was", "stained", "by", "immunofluorescence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Analysis of SUMO2/3 conjugates in control (siControl) or RNF4-depleted (siRNF4) G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were left untreated (-HS), exposed to 43°C (+ HS), followed by 2 hours recovery (HS + 2h Rec.) in the absence or presence of 100 nM proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). B) Quantification of the total SUMO2/3 band densities. Data represent the mean ± SD (n=3 independent experiments, *P<0.05).E) Representative confocal images of control (siControl), RNF4-depleted (siRNF4), G3BP1/2-depleted (siG3BP1/2) and G3BP1/2+RNF4-depleted (siG3BP1/2 + siRNF4) MelJuSo cells expressing the nuclear UPS reporter NLS-GFP-CL1. Cells were exposed to heat shock followed by 4 hours recovery in the absence or presence of the proteasome inhibitor epoxomicin (EPX). The nucleolar marker nucleolin was stained by immunofluorescence."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "FLAG", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "FLAG", "-", "Ub", ")", "and", "mutant", "ataxin1", "(", "ATX1", ")", "in", "parental", "and", "G3BP1", "/", "2", "knock", "-", "out", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "heat", "shock", "followed", "by", "4", "hours", "recovery", ".", "B", ")", "Frequency", "distribution", "of", "ataxin", "-", "1", "inclusions", "per", "cell", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) Representative confocal images of immunofluorescent staining of FLAG-tagged ubiquitin (FLAG-Ub) and mutant ataxin1 (ATX1) in parental and G3BP1/2 knock-out U2OS cells. Cells were subjected to heat shock followed by 4 hours recovery. B) Frequency distribution of ataxin-1 inclusions per cell from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", "WT", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "were", "treated", "with", "0", ".", "4", "mM", "H2O2", "as", "indicated", ",", "extracts", "prepared", "and", "immunoprecipitated", "with", "antibody", "recognizing", "the", "active", "conformation", "of", "Bax", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "and", "probed", "for", "total", "Bax", "or", "cyclin", "C", ".", "Whole", "cell", "extracts", "(", "WCE", ")", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "as", "indicated", "to", "control", "for", "protein", "concentrations", "in", "the", "extracts", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "B", "Cyclin", "C", "and", "Bax", "directly", "interact", ".", "Recombinant", "Bax", "and", "SUMO", "-", "His6", "-", "cyclin", "C", "were", "either", "incubated", "together", "or", "separately", "at", "room", "temperature", "then", "passed", "over", "Co", "+", "+", "resin", ".", "The", "elutions", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "probing", "for", "Bax", "and", "cyclin", "C", "(", "lanes", "4", "-", "6", ")", ".", "Input", "controls", "for", "each", "sample", "(", "1", "/", "10", ")", "are", "included", "in", "lanes", "1", "-", "3", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "C", "Mitochondrial", "relocalization", "of", "cyclin", "C", "is", "required", "for", "Bax", "activation", ".", "The", "experiment", "described", "in", "(", "A", ")", "was", "repeated", "except", "that", "H2O2", "treated", "cells", "were", "treated", "with", "1", "µM", "pifithrin", "-", "µ", "(", "PFT", ")", "for", "24", "h", "as", "indicated", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "D", "Cyclin", "C", "is", "required", "for", "efficient", "Bax", "-", "Bcl", "-", "XL", "disassociation", ".", "Extracts", "prepared", "from", "MEF", "cells", "with", "the", "indicated", "genotypes", "following", "treatment", "with", "H2O2", "(", "0", ".", "4", "mM", ",", "4", "h", ")", "were", "immunoprecipitated", "with", "active", "conformation", "Bax", "antibodies", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "probing", "with", "Bcl", "-", "XL", "antibodies", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "WCE", "was", "performed", "as", "input", "concentration", "controls", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "E", "The", "mitochondrial", "fission", "complex", "is", "required", "for", "cyclin", "C", "-", "dependent", "Bax", "activation", ".", "Extracts", "were", "prepared", "MEF", "cultures", "with", "the", "indicated", "genotypes", "treated", "with", "H2O2", "(", "0", ".", "4", "mM", ",", "4", "h", ")", ".", "The", "extracts", "were", "treated", "as", "in", "A", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "F", "Drp1", "is", "required", "for", "cyclin", "C", "-", "Bax", "interaction", ".", "Extracts", "were", "prepared", "from", "wild", "type", "or", "Drp1", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "treated", "or", "not", "with", "H2O2", "and", "analyzed", "for", "the", "presence", "of", "Bax", "and", "cyclin", "C", "as", "described", "in", "A", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A WT and Ccnc-/- MEF cultures were treated with 0.4 mM H2O2 as indicated, extracts prepared and immunoprecipitated with antibody recognizing the active conformation of Bax. The immunoprecipitates were subjected to Western blot analysis and probed for total Bax or cyclin C. Whole cell extracts (WCE) were subjected to Western blot analysis as indicated to control for protein concentrations in the extracts. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.B Cyclin C and Bax directly interact. Recombinant Bax and SUMO-His6-cyclin C were either incubated together or separately at room temperature then passed over Co++ resin. The elutions were subjected to Western blot analysis probing for Bax and cyclin C (lanes 4-6). Input controls for each sample (1/10) are included in lanes 1-3. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.C Mitochondrial relocalization of cyclin C is required for Bax activation. The experiment described in (A) was repeated except that H2O2 treated cells were treated with 1 µM pifithrin-µ (PFT) for 24 h as indicated. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.D Cyclin C is required for efficient Bax-Bcl-XL disassociation. Extracts prepared from MEF cells with the indicated genotypes following treatment with H2O2 (0.4 mM, 4 h) were immunoprecipitated with active conformation Bax antibodies. The immunoprecipitates were subjected to Western blot analysis probing with Bcl-XL antibodies. Western blot analysis of WCE was performed as input concentration controls. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.E The mitochondrial fission complex is required for cyclin C-dependent Bax activation. Extracts were prepared MEF cultures with the indicated genotypes treated with H2O2 (0.4 mM, 4 h). The extracts were treated as in A. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.F Drp1 is required for cyclin C-Bax interaction. Extracts were prepared from wild type or Drp1-/- MEF cultures treated or not with H2O2 and analyzed for the presence of Bax and cyclin C as described in A. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left."}
{"words": ["Figure", "2A", "Wild", "type", "MEF", "cells", "were", "fixed", "before", "(", "control", ")", "and", "following", "S", "-", "HAD", "treatment", "(", "10", "µM", ",", "4", "h", ")", "then", "nuclei", "(", "DAPI", ")", ",", "cyclin", "C", "(", "indirect", "immunofluorescence", ")", "and", "mitochondria", "(", "MitoTracker", "Red", ")", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Merge", "panels", "present", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "only", ".", "Zoom", "panels", "(", "4X", ")", "are", "indicated", "by", "the", "boxes", "in", "the", "merge", "panels", ".", "Green", "arrows", "indicate", "cyclin", "C", "and", "mitochondrial", "co", "-", "localization", ".", "Bar", "indicates", "10", "µM", ".", "B", "Timecourse", "experiment", "with", "wild", "type", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "times", "indicated", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Asterisks", "indicate", "p", "values", "<", "0", ".", "05", "from", "pretreatment", "control", "(", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ")", ".", "MEF", "cells", "were", "fixed", "before", "(", "control", ")", "and", "following", "S", "-", "HAD", "treatment", "(", "10", "µM", ",", "4", "h", ")", "then", "nuclei", "(", "DAPI", ")", ",", "cyclin", "C", "(", "indirect", "immunofluorescence", ")", "and", "mitochondria", "(", "MitoTracker", "Red", ")", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Merge", "panels", "present", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "only", ".", "S", "-", "HAD", "peptide", "activity", "requires", "cyclin", "C", ".", "The", "experiment", "described", "in", "A", "was", "repeated", "with", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", ".", "D", "S", "-", "HAD", "treatment", "increases", "Bax", "mitochondrial", "localization", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "nuclear", "and", "mitochondrial", "fractions", "before", "and", "following", "S", "-", "HAD", "treatment", "(", "10", "µM", ",", "4", "h", ")", ".", "Atp5A", "and", "fibrillarin", "levels", "controlled", "for", "mitochondrial", "and", "nuclear", "loadings", ",", "respectively", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "E", "Bax", "activation", "was", "monitored", "in", "wild", "-", "type", "MEF", "cultures", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "times", "indicated", ".", "The", "anti", "-", "oxidant", "N", "-", "acetyl", "cysteine", "(", "NAC", ")", "was", "added", "(", "1", "mM", ")", "2", "h", "prior", "to", "S", "-", "HAD", "treatment", ".", "Active", "Bax", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "for", "Bax", "and", "cyclin", "C", "as", "indicated", ".", "Bax", ",", "cyclin", "C", "and", "ß", "-", "actin", "levels", "were", "monitored", "in", "extract", "preparations", "as", "input", "controls", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Wild type MEF cells were fixed before (control) and following S-HAD treatment (10 µM, 4 h) then nuclei (DAPI), cyclin C (indirect immunofluorescence) and mitochondria (MitoTracker Red) were visualized by fluorescence microscopy. Merge panels present DAPI staining (blue) only. Zoom panels (4X) are indicated by the boxes in the merge panels. Green arrows indicate cyclin C and mitochondrial co-localization. Bar indicates 10 µM.B Timecourse experiment with wild type and Ccnc-/- MEF cells treated with S-HAD (10 µM) for the times indicated (n=3). Error bars indicate SD. Asterisks indicate p values <0.05 from pretreatment control (Student's T-Test).MEF cells were fixed before (control) and following S-HAD treatment (10 µM, 4 h) then nuclei (DAPI), cyclin C (indirect immunofluorescence) and mitochondria (MitoTracker Red) were visualized by fluorescence microscopy. Merge panels present DAPI staining (blue) only. S-HAD peptide activity requires cyclin C. The experiment described in A was repeated with Ccnc-/- MEF cultures.D S-HAD treatment increases Bax mitochondrial localization. Western blot analysis of the indicated proteins in nuclear and mitochondrial fractions before and following S-HAD treatment (10 µM, 4 h). Atp5A and fibrillarin levels controlled for mitochondrial and nuclear loadings, respectively. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.E Bax activation was monitored in wild-type MEF cultures treated with S-HAD (10 µM) for the times indicated. The anti-oxidant N-acetyl cysteine (NAC) was added (1 mM) 2 h prior to S-HAD treatment. Active Bax immunoprecipitates were subjected to Western blot analysis for Bax and cyclin C as indicated. Bax, cyclin C and ß-actin levels were monitored in extract preparations as input controls. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left."}
{"words": ["Figure", "3A", "Caspase", "activation", "was", "measured", "by", "fluorescent", "cell", "analysis", "in", "wild", "-", "type", "MEF", "cells", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ",", "24", "h", ")", "or", "cisplatin", "(", "CP", ",", "30", "µM", ",", "16", "h", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", "with", "*", "and", "*", "*", "indicate", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "respectively", "using", "Student", "'", "s", "T", "test", ".", "B", "PARP", "cleavage", "was", "not", "induced", "by", "S", "-", "HAD", "treatment", ".", "PARP", "cleavage", "was", "monitored", "by", "Western", "blot", "analysis", "in", "Hela", "cells", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "or", "cisplatin", "(", "CP", ")", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "blot", "was", "stripped", "and", "reprobed", "with", "ß", "-", "actin", "antibodies", "as", "a", "loading", "control", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "C", "Wild", "type", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "were", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "and", "cisplatin", "(", "CP", ")", "as", "just", "described", ".", "Cells", "were", "imaged", "and", "examined", "for", "a", "\"", "rounding", "up", "\"", "phenotype", "diagnostic", "for", "death", ".", "D", "Cyclin", "C", "is", "required", "for", "normal", "Bax", "oligomerization", "in", "response", "to", "cisplatin", ".", "Whole", "cell", "extracts", "prepared", "from", "DSP", "crosslinked", "wild", "type", "and", "CCNC", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "exposed", "to", "cisplatin", "(", "30", "µM", ",", "16", "h", ")", "were", "probed", "for", "total", "Bax", ".", "Bax", "multimers", "are", "indicated", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "E", "S", "-", "HAD", "does", "not", "induce", "Bax", "oligomerization", ".", "Experiments", "described", "in", "D", "were", "repeated", "with", "cultures", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ",", "24", "h", ")", ".", "Bax", "multimers", "are", "indicated", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "F", "S", "-", "HAD", "treatment", "sensitizes", "Hela", "cells", "to", "cisplatin", ".", "Hela", "cultures", "were", "treated", "with", "cisplatin", "(", "30", "µM", ")", ",", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ")", "and", "N", "-", "acetyl", "cysteine", "(", "NAC", ",", "1", "mM", ")", "as", "indicated", ".", "Fluorescent", "cell", "analysis", "was", "used", "to", "quantitate", "the", "apoptotic", "(", "Annexin", "V", "positive", ")", "and", "necrotic", "(", "PI", "positive", ")", "population", "percentages", ",", "respectively", ".", "n", "=", "3", "independent", "cultures", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Asterisk", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Caspase activation was measured by fluorescent cell analysis in wild-type MEF cells treated with S-HAD (10 µM, 24 h) or cisplatin (CP, 30 µM, 16 h). n = 3. Error bars indicate SD with * and ** indicate p <0.05 and p<0.01, respectively using Student's T test.B PARP cleavage was not induced by S-HAD treatment. PARP cleavage was monitored by Western blot analysis in Hela cells treated with S-HAD or cisplatin (CP) as described in (A). The blot was stripped and reprobed with ß-actin antibodies as a loading control. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.C Wild type and Ccnc-/- MEF cultures were treated with S-HAD and cisplatin (CP) as just described. Cells were imaged and examined for a \"rounding up\" phenotype diagnostic for death.D Cyclin C is required for normal Bax oligomerization in response to cisplatin. Whole cell extracts prepared from DSP crosslinked wild type and CCNC-/- MEF cells exposed to cisplatin (30 µM, 16 h) were probed for total Bax. Bax multimers are indicated. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.E S-HAD does not induce Bax oligomerization. Experiments described in D were repeated with cultures treated with S-HAD (10 µM, 24 h). Bax multimers are indicated. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.F S-HAD treatment sensitizes Hela cells to cisplatin. Hela cultures were treated with cisplatin (30 µM), S-HAD (10 µM) and N-acetyl cysteine (NAC, 1 mM) as indicated. Fluorescent cell analysis was used to quantitate the apoptotic (Annexin V positive) and necrotic (PI positive) population percentages, respectively. n = 3 independent cultures. Error bars indicate SD. Asterisk indicates p <0.05 (Student's T-test)."}
{"words": ["Figure", "4A", "S", "-", "HAD", "treatment", "induces", "mitochondrial", "ROS", ".", "Wild", "type", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "were", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ",", "24", "h", ")", ",", "rotenone", "or", "vehicle", "control", "as", "indicated", ".", "Mitochondrial", "ROS", "was", "measured", "by", "MitoSox", "staining", "(", "4", "µM", ",", "15", "min", ")", "and", "quantitative", "confocal", "imaging", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "n", "=", "3", ",", "asterisk", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "T", "-", "test", ")", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significantly", "different", ".", "B", "Quenching", "mitochondrial", "ROS", "reduces", "cyclin", "C", "-", "Bax", "interaction", ".", "Wild", "type", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "were", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ",", "16", "h", ")", "and", "100", "nM", "mitochondrial", "-", "specific", "reactive", "oxygen", "scavenger", "MitoTempol", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "conducted", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "C", "Insulin", "treatment", "stimulates", "S", "-", "HAD", "induced", "Bax", "activation", ".", "Wild", "type", "and", "Ccnc", "-", "/", "-", "MEF", "cultures", "were", "grown", "with", "or", "without", "insulin", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", "then", "treated", "with", "S", "-", "HAD", "(", "10", "µM", ",", "2", "h", ")", ".", "Mitochondrial", "and", "cytosolic", "fractions", "were", "prepared", "and", "probed", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Atp5A", "and", "ß", "-", "actin", "levels", "control", "for", "mitochondrial", "and", "cytosolic", "loading", ",", "respectively", ".", "The", "two", "blots", "were", "prepared", ",", "processed", "and", "developed", "identically", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A S-HAD treatment induces mitochondrial ROS. Wild type and Ccnc-/- MEF cultures were treated with S-HAD (10 µM, 24 h), rotenone or vehicle control as indicated. Mitochondrial ROS was measured by MitoSox staining (4 µM, 15 min) and quantitative confocal imaging. Error bars indicate SD. n=3, asterisk indicates p<0.05 (Student's T-test), n.s., not significantly different.B Quenching mitochondrial ROS reduces cyclin C-Bax interaction. Wild type and Ccnc-/- MEF cultures were treated with S-HAD (10 µM, 16 h) and 100 nM mitochondrial-specific reactive oxygen scavenger MitoTempol. Western blot analysis was conducted as described in Fig. 1. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left.C Insulin treatment stimulates S-HAD induced Bax activation. Wild type and Ccnc-/- MEF cultures were grown with or without insulin (10 µg/ml) then treated with S-HAD (10 µM, 2 h). Mitochondrial and cytosolic fractions were prepared and probed for the indicated proteins. Atp5A and ß-actin levels control for mitochondrial and cytosolic loading, respectively. The two blots were prepared, processed and developed identically. Molecular weight markers (kDa) are indicated on the left."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "1", "×", "105", "B16F10", "melanoma", "cells", "were", "intravenously", "injected", "into", "C57BL", "/", "6", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "mice", ",", "and", "the", "number", "of", "lung", "metastases", "was", "determined", "after", "14", "days", ".", "The", "photographs", "(", "A", ")", "show", "two", "representative", "results", ".", "The", "graph", "(", "B", ")", "shows", "the", "mean", "±", "SD", "number", "of", "pulmonary", "metastases", "in", "15", "WT", "and", "14", "Asm", "-", "deficient", "animals", ".", "C", ",", "D", "B16F10", "melanoma", "grow", "as", "fast", "or", "slightly", "faster", "in", "Asm", "-", "deficient", "mice", "than", "in", "wild", "-", "type", "mice", "after", "subcutaneous", "injection", "at", "the", "flank", "(", "C", ")", "or", "transcutaneous", "direct", "intrapulmonary", "injection", "(", "D", ")", ",", "excluding", "a", "general", "growth", "defect", "of", "the", "tumor", "in", "Asm", "-", "deficient", "mice", ".", "The", "size", "of", "tumors", "was", "determined", "14", "days", "after", "local", "injection", "at", "the", "flank", "or", "10", "days", "after", "injection", "into", "the", "lung", ".", "E", "The", "number", "of", "lung", "metastases", "25", "days", "after", "intravenous", "injection", "does", "not", "differ", "from", "the", "number", "observed", "after", "14", "days", "in", "(", "B", ")", ".", "F", "5", "×", "108platelets", "isolated", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "mice", "were", "injected", "intravenously", "into", "Asm", "-", "deficient", "or", "wild", "-", "type", "mice", ",", "respectively", ".", "After", "120", "min", "1", "×", "105", ",", "B16F10tumor", "cells", "were", "intravenously", "injected", ".", "The", "number", "of", "lungmetastases", "was", "determined", "after", "14", "days", ".", "Displayed", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "the", "number", "of", "pulmonary", "metastases", ",", "n", "=", "3", "in", "WT", "platelets", "in", "WT", "mice", ",", "n", "=", "5", "in", "WT", "platelets", "in", "Asm", "−", "/", "−", "mice", ",", "and", "n", "=", "4", "in", "Asm", "−", "/", "−", "platelets", "in", "Asm", "−", "/", "−", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B 1 × 105 B16F10 melanoma cells were intravenously injected into C57BL/6 wild-type (WT) or Asm-deficient (Asm−/−) mice, and the number of lung metastases was determined after 14 days. The photographs (A) show two representative results. The graph (B) shows the mean ± SD number of pulmonary metastases in 15 WT and 14 Asm-deficient animals.C, D B16F10 melanoma grow as fast or slightly faster in Asm-deficient mice than in wild-type mice after subcutaneous injection at the flank (C) or transcutaneous direct intrapulmonary injection (D), excluding a general growth defect of the tumor in Asm-deficient mice. The size of tumors was determined 14 days after local injection at the flank or 10 days after injection into the lung.E The number of lung metastases 25 days after intravenous injection does not differ from the number observed after 14 days in (B).F 5 × 108platelets isolated from wild-type (WT) or Asm-deficient (Asm−/−) mice were injected intravenously into Asm-deficient or wild-type mice, respectively. After 120 min 1 × 105, B16F10tumor cells were intravenously injected. The number of lungmetastases was determined after 14 days. Displayed are the mean ± SD of the number of pulmonary metastases, n = 3 in WT platelets in WT mice, n = 5 in WT platelets in Asm−/−mice, and n = 4 in Asm−/−platelets in Asm−/−mice."}
{"words": ["Figure", "2A", "Platelets", "were", "isolated", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "mice", "by", "density", "-", "gradient", "centrifugation", ",", "and", "1", "×", "107", "platelets", "were", "incubated", "with", "1", "×", "105", "B16F10", "cells", ".", "The", "samples", "were", "lysed", ",", "and", "Asm", "activity", "was", "determined", ".", "In", "unstimulated", "samples", "(", "time", "point", "of", "co", "-", "incubation", "0", "s", ")", ",", "tumor", "cells", "and", "platelets", "were", "admixed", "after", "lysis", ".", "B", "The", "formation", "of", "ceramide", "was", "determined", "by", "a", "diacylglycerol", "(", "DAG", ")", "kinase", "assay", "(", "upper", "panel", ")", "and", "mass", "spectrometry", "(", "lower", "panel", ")", ".", "In", "unstimulated", "samples", "(", "time", "point", "of", "co", "-", "incubation", "0", "s", ")", ",", "tumor", "cells", "and", "platelets", "were", "admixed", "after", "lysis", ".", "C", ",", "D", "For", "determination", "of", "the", "secretion", "of", "Asm", "by", "platelets", "into", "the", "supernatants", "(", "C", ")", ",", "tumor", "cells", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "platelets", "were", "co", "-", "incubated", "for", "20", "s", ",", "the", "samples", "were", "pelleted", ",", "the", "supernatants", "were", "removed", "and", "acidified", ",", "and", "the", "Asm", "activity", "was", "measured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Zn2", "+", ".", "For", "measurement", "of", "surface", "Asm", "and", "ceramide", ",", "samples", "were", "co", "-", "incubated", "as", "indicated", "(", "C", ",", "D", ")", "and", "pelleted", ";", "the", "supernatants", "were", "discarded", ",", "incubated", "with", "anti", "-", "Asm", "antibodies", ",", "washed", ",", "and", "lysed", ";", "and", "Asm", "immunocomplexes", "were", "immobilized", "and", "subjected", "to", "immunocomplex", "enzyme", "assays", ".", "Surface", "ceramide", "was", "measured", "by", "incubation", "of", "intact", "cells", "with", "DAG", "kinase", "in", "the", "presence", "of", "[", "32P", "]", "γATP", "followed", "by", "extraction", "and", "measurement", "of", "[", "32P", "]", "-", "ceramide", ".", "Omission", "of", "one", "cell", "type", "indicated", "by", "\"", "−", "\"", "here", "and", "thereafter", ".", "E", "Treatment", "of", "B16F10tumor", "cells", "for", "2", "min", "with", "1", "U", "/", "ml", "ASM", "or", "10", "μM", "C16ceramide", "restores", "in", "vivo", "metastasis", "in", "Asm", "-", "deficient", "mice", ".", "After", "treatment", ",", "the", "cells", "were", "injected", "intravenously", "into", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "mice", ".", "Controls", "were", "left", "untreated", "prior", "to", "injection", ".", "The", "number", "of", "metastases", "was", "determined", "14", "days", "after", "tumor", "cell", "injection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Platelets were isolated from wild-type (WT) or Asm-deficient (Asm−/−) mice by density-gradient centrifugation, and 1 × 107 platelets were incubated with 1 × 105 B16F10 cells. The samples were lysed, and Asm activity was determined. In unstimulated samples (time point of co-incubation 0 s), tumor cells and platelets were admixed after lysis.B The formation of ceramide was determined by a diacylglycerol (DAG) kinase assay (upper panel) and mass spectrometry (lower panel). In unstimulated samples (time point of co-incubation 0 s), tumor cells and platelets were admixed after lysis.C, D For determination of the secretion of Asm by platelets into the supernatants (C), tumor cells and wild-type (WT) or Asm-deficient (Asm−/−) platelets were co-incubated for 20 s, the samples were pelleted, the supernatants were removed and acidified, and the Asm activity was measured in the presence or absence of Zn2+. For measurement of surface Asm and ceramide, samples were co-incubated as indicated (C, D) and pelleted; the supernatants were discarded, incubated with anti-Asm antibodies, washed, and lysed; and Asm immunocomplexes were immobilized and subjected to immunocomplex enzyme assays. Surface ceramide was measured by incubation of intact cells with DAG kinase in the presence of [32P]γATP followed by extraction and measurement of [32P]-ceramide. Omission of one cell type indicated by \"−\" here and thereafter.E Treatment of B16F10tumor cells for 2 min with 1 U/ml ASM or 10 μM C16ceramide restores in vivo metastasis in Asm-deficient mice. After treatment, the cells were injected intravenously into Asm-deficient (Asm−/−) mice. Controls were left untreated prior to injection. The number of metastases was determined 14 days after tumor cell injection."}
{"words": ["Figure", "3Incubation", "of", "human", "melanoma", "(", "HM", ")", "cells", "with", "human", "platelets", "results", "in", "the", "release", "of", "Zn2", "+", "-", "dependent", "ASM", "into", "the", "supernatant", ",", "Zn2", "+", "-", "dependent", "activity", "of", "ASM", "on", "cell", "surfaces", ",", "and", "the", "formation", "of", "ceramide", ".", "The", "assay", "buffer", "contained", "100", "μM", "Zn2", "+", ".", "Addition", "of", "human", "or", "mouse", "recombinant", "ASM", "to", "human", "melanoma", "or", "B16F10", "cells", ",", "respectively", ",", "results", "in", "binding", "of", "ASM", "to", "the", "tumorcell", "surfaces", "as", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Cytochalasin", "B", "was", "added", "to", "control", "for", "internalization", "of", "added", "ASM", ".", "Suppression", "of", "Asm", "in", "B16F10", "tumor", "cells", "using", "siRNA", "technology", "reduces", "Asm", "activity", "in", "B16F10", "cells", "(", "right", "panel", ")", ",", "but", "does", "not", "alter", "release", "or", "surface", "activity", "of", "the", "Asm", "after", "co", "-", "incubation", "with", "wild", "-", "type", "platelets", "(", "left", "panels", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Incubation of human melanoma (HM) cells with human platelets results in the release of Zn2+-dependent ASM into the supernatant, Zn2+-dependent activity of ASM on cell surfaces, and the formation of ceramide. The assay buffer contained 100 μM Zn2+.Addition of human or mouse recombinant ASM to human melanoma or B16F10 cells, respectively, results in binding of ASM to the tumorcell surfaces as determined by flow cytometry. Cytochalasin B was added to control for internalization of added ASM.Suppression of Asm in B16F10 tumor cells using siRNA technology reduces Asm activity in B16F10 cells (right panel), but does not alter release or surface activity of the Asm after co-incubation with wild-type platelets (left panels)."}
{"words": ["Figure", "4Platelets", "were", "isolated", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "mice", "by", "density", "-", "gradient", "centrifugation", ",", "and", "1", "×", "107platelets", "were", "incubated", "with", "1", "×", "105B16F10", "cells", "or", "left", "untreated", ".", "Co", "-", "incubation", "of", "washed", "platelets", "with", "B16F10", "melanoma", "cells", "resulted", "in", "upregulation", "of", "GPIIb", "/", "IIIa", "and", "CD62P", "on", "both", "wild", "-", "type", "and", "Asm", "-", "deficient", "platelets", "in", "FACS", "analyses", ".", "Platelets", "were", "gated", "in", "FCS", "/", "SSC", ".", "Aggregation", "properties", "of", "platelets", "after", "co", "-", "incubation", "with", "collagen", "or", "ADP", "are", "independent", "of", "Asm", "as", "determined", "by", "aggregometry", "measurements", ".", "Incubation", "of", "tumor", "cells", "with", "platelets", "resulted", "in", "marked", "change", "of", "platelet", "shape", "and", "degranulation", "as", "determined", "by", "FACS", "analysis", "using", "forward", "versus", "side", "scatter", "analysis", "indicating", "global", "activation", "of", "platelets", ".", "4", "×", "104B16F10tumor", "cells", "were", "incubated", "with", "2", "×", "107", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "platelets", "(", "Plts", ")", "or", "a", "45", ":", "55", "of", "WT", ":", "Asm", "−", "/", "−", "platelet", "mixture", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50", "ng", "/", "ml", "PGE1", ".", "Controls", "were", "stimulated", "with", "Mn2", "+", ".", "Tumor", "cells", "were", "then", "incubated", "for", "60", "s", "on", "fibronectin", "-", "coated", "cover", "slips", ",", "washed", ",", "and", "fixed", ",", "and", "adhesion", "of", "the", "tumor", "cells", "was", "determined", ".", "The", "graph", "displays", "the", "mean", "±", "SD", "of", "tumor", "cells", "adhering", "to", "fibronectin", "-", "coated", "cover", "slips", ",", "n", "=", "7", "for", "WT", "-", "platelets", ",", "n", "=", "9", "for", "Asm", "-", "deficient", "-", "platelets", ",", "n", "=", "4", "for", "45", ":", "55", "WT", ":", "Asm", "−", "/", "−", "platelets", ",", "and", "all", "others", "n", "=", "3", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Platelets were isolated from wild-type (WT) or Asm-deficient (Asm−/−) mice by density-gradient centrifugation, and 1 × 107platelets were incubated with 1 × 105B16F10 cells or left untreated. Co-incubation of washed platelets with B16F10 melanoma cells resulted in upregulation of GPIIb/IIIa and CD62P on both wild-type and Asm-deficient platelets in FACS analyses. Platelets were gated in FCS/SSC.Aggregation properties of platelets after co-incubation with collagen or ADP are independent of Asm as determined by aggregometry measurements.Incubation of tumor cells with platelets resulted in marked change of platelet shape and degranulation as determined by FACS analysis using forward versus side scatter analysis indicating global activation of platelets.4 × 104B16F10tumor cells were incubated with 2 × 107 wild-type (WT), Asm-deficient (Asm−/−) platelets (Plts) or a 45:55 of WT:Asm−/−platelet mixture in the presence or absence of 50 ng/ml PGE1. Controls were stimulated with Mn2+. Tumor cells were then incubated for 60 s on fibronectin-coated cover slips, washed, and fixed, and adhesion of the tumor cells was determined. The graph displays the mean ± SD of tumor cells adhering to fibronectin-coated cover slips, n = 7 for WT-platelets, n = 9 for Asm-deficient-platelets, n = 4 for 45:55 WT:Asm−/−platelets, and all others n = 3. Statistical significance was determined by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's multiple comparisons test. P-values are indicated."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "1", "×", "105", "B16F10", "cells", "were", "incubated", "with", "(", "A", ")", "1", "U", "/", "ml", "purified", "acid", "sphingomyelinase", "(", "ASM", ")", "or", "(", "B", ")", "5", "×", "107", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "Asm", "-", "deficient", "(", "Asm", "−", "/", "−", ")", "platelets", "(", "Plts", ")", ",", "or", "a", "mixture", "of", "45", ":", "55", "wild", "-", "type", ":", "Asm", "-", "deficient", "platelets", ".", "Cells", "were", "fixed", "with", "2", "%", "paraformaldehyde", "for", "15", "min", "and", "stained", "with", "fluorescein", "isothiocyanate", "(", "FITC", ")", "-", "coupled", "anti", "-", "α5", "integrin", ",", "Cy3", "-", "labeled", "anti", "-", "β1", "integrin", ",", "and", "Cy5", "-", "labeled", "anti", "-", "ceramide", "antibodies", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Shown", "are", "representative", "examples", "from", "four", "independent", "experiments", "(", "A", ",", "B", ")", "or", "the", "quantitative", "analysis", "of", "cells", "positive", "for", "ceramide", "/", "β1", "integrin", "clusters", "from", "at", "least", "100", "cells", "/", "sample", "(", "C", ")", ".", "Given", "is", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ",", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "D", "ASM", "-", "induced", "B16F10", "tumorcell", "adhesion", "to", "fibronectin", "-", "coated", "cover", "slips", "is", "abrogated", "by", "the", "inhibition", "of", "integrins", "with", "RGD", "peptides", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SD", "of", "the", "number", "of", "cells", "adherent", "to", "the", "cover", "slip", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "E", "Intravenous", "injection", "of", "CFSE", "-", "labeled", "B16F10", "cells", "into", "wild", "-", "type", "mice", "results", "in", "formation", "of", "ceramide", "-", "enriched", "domains", "that", "contain", "β1", "integrin", "clusters", "on", "tumor", "cells", "in", "vivo", ",", "while", "injection", "of", "tumor", "cells", "into", "Asm", "-", "deficient", "mice", "does", "not", "result", "in", "ceramide", "and", "integrin", "clustering", ".", "Please", "note", "that", "the", "cell", "in", "the", "lower", "panel", "still", "binds", "a", "platelet", ".", "Shown", "are", "representative", "results", "from", "four", "independent", "experiments", "each", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C 1 × 105 B16F10 cells were incubated with (A) 1 U/ml purified acid sphingomyelinase (ASM) or (B) 5 × 107 wild-type (WT), Asm-deficient (Asm−/−) platelets (Plts), or a mixture of 45:55 wild-type:Asm-deficient platelets. Cells were fixed with 2% paraformaldehyde for 15 min and stained with fluorescein isothiocyanate (FITC)-coupled anti-α5 integrin, Cy3-labeled anti-β1 integrin, and Cy5-labeled anti-ceramide antibodies. Samples were analyzed by confocal microscopy. Shown are representative examples from four independent experiments (A, B) or the quantitative analysis of cells positive for ceramide/β1 integrin clusters from at least 100 cells/sample (C). Given is the mean ± SD, n = 4, ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. P-values are indicated.D ASM-induced B16F10 tumorcell adhesion to fibronectin-coated cover slips is abrogated by the inhibition of integrins with RGD peptides. Shown is the mean ± SD of the number of cells adherent to the cover slip. Statistical significance was determined by ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. P-values are indicated.E Intravenous injection of CFSE-labeled B16F10 cells into wild-type mice results in formation of ceramide-enriched domains that contain β1 integrin clusters on tumor cells in vivo, while injection of tumor cells into Asm-deficient mice does not result in ceramide and integrin clustering. Please note that the cell in the lower panel still binds a platelet. Shown are representative results from four independent experiments each."}
{"words": ["Figure", "6Human", "melanoma", "cells", "were", "stimulated", "for", "10", "min", "with", "1", "U", "/", "ml", "purified", "ASM", "or", "10", "μM", "C16", "ceramide", "(", "C16", "-", "Cer", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "500", "ng", "ceramidase", "(", "CDase", ")", "or", "1", "μg", "/", "ml", "neutralizing", "anti", "-", "ceramide", "antibodies", "(", "anti", "-", "Cer", ")", ",", "and", "lysed", "and", "active", "β1", "integrin", "was", "immunoprecipitated", "using", "the", "HUTS", "-", "4", "antibody", ".", "Octylglucopyranoside", "(", "OGP", ",", "final", "concentration", "0", ".", "01", "%", ")", "served", "to", "resuspend", "C16", "ceramide", ".", "Internalization", "was", "excluded", "by", "addition", "of", "cytochalasin", "B", "(", "CTB", ")", "as", "indicated", ".", "Samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "blotted", "with", "an", "activation", "-", "independent", "anti", "-", "β1", "Integrin", "antibody", "to", "detect", "the", "amount", "of", "immunoprecipitated", ",", "that", "is", "active", "β1", "integrin", ".", "Control", "immunoprecipitates", "(", "control", "Ipt", ")", "were", "performed", "with", "an", "irrelevant", "isotype", "control", "antibody", ".", "Activation", "of", "β1", "integrin", "in", "human", "melanoma", "cells", "by", "incubation", "with", "Asm", "or", "C16", "ceramide", "was", "confirmed", "by", "FACS", "analysis", "upon", "staining", "with", "FITC", "-", "labeled", "HUTS", "-", "4", "antibodies", ".", "Incubation", "of", "human", "melanoma", "with", "human", "platelets", "or", "ASM", "for", "5", "min", "triggers", "co", "-", "clustering", "of", "ceramide", "and", "activated", "β1", "integrin", "on", "the", "surface", "of", "the", "tumor", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "FITC", "-", "coupled", "anti", "-", "active", "β1", "integrin", "(", "HUTS", "-", "4", ")", "antibodies", "and", "Cy3", "-", "coupled", "anti", "-", "ceramide", "antibodies", ".", "Shown", "are", "representative", "stainings", "from", "each", "four", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Human melanoma cells were stimulated for 10 min with 1 U/ml purified ASM or 10 μM C16 ceramide (C16-Cer) in the presence or absence of 500 ng ceramidase (CDase) or 1 μg/ml neutralizing anti-ceramide antibodies (anti-Cer), and lysed and active β1 integrin was immunoprecipitated using the HUTS-4 antibody. Octylglucopyranoside (OGP, final concentration 0.01%) served to resuspend C16 ceramide. Internalization was excluded by addition of cytochalasin B (CTB) as indicated. Samples were separated by SDS-PAGE and blotted with an activation-independent anti-β1 Integrin antibody to detect the amount of immunoprecipitated, that is active β1 integrin. Control immunoprecipitates (control Ipt) were performed with an irrelevant isotype control antibody. Activation of β1 integrin in human melanoma cells by incubation with Asm or C16 ceramide was confirmed by FACS analysis upon staining with FITC-labeled HUTS-4 antibodies.Incubation of human melanoma with human platelets or ASM for 5 min triggers co-clustering of ceramide and activated β1 integrin on the surface of the tumor cells. Cells were stained with FITC-coupled anti-active β1 integrin (HUTS-4) antibodies and Cy3-coupled anti-ceramide antibodies. Shown are representative stainings from each four independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7B16F10tumor", "cells", "or", "B16F10", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Asm", "expression", "or", "with", "scrambled", "control", "siRNA", "were", "labeled", "with", "[", "3H", "]", "thymidine", ",", "washed", ",", "and", "treated", "(", "+", ")", "for", "10", "min", "with", "1", "U", "/", "ml", "ASM", ",", "10", "μM", "C16ceramide", ",", "10", "μM", "S1P", ",", "10", "μM", "PDMP", ",", "20", "μM", "sphingosine", "kinase", "inhibitor", "SKI", "II", ",", "and", "10", "μM", "myriocin", ",", "or", "left", "untreated", "(", "−", ")", ".", "The", "cells", "were", "then", "injected", "intravenously", "into", "wild", "-", "type", "or", "Asm", "-", "deficient", "mice", "as", "indicated", ".", "If", "indicated", ",", "10", "μg", "of", "arginine", "-", "glycine", "-", "aspartic", "acid", "(", "RGD", ")", "peptide", "or", "10", "μg", "/", "ml", "neutralizing", "anti", "-", "β1", "integrin", "antibodies", "were", "added", "to", "B16F10tumor", "cells", "together", "with", "ASM", "for", "15", "min", "prior", "injection", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "30", "min", "after", "tumorcell", "injection", ",", "the", "lungs", "carefully", "flushed", "via", "the", "right", "heart", ",", "and", "the", "radioactivity", "in", "the", "lung", "as", "a", "measurement", "for", "adherent", "tumor", "cells", "was", "determined", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SD", "of", "the", "counts", "per", "minute", "(", "cpm", ")", "in", "the", "lung", "lysates", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparison", "to", "determine", "P", "-", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B16F10tumor cells or B16F10 transfected with siRNA targeting Asm expression or with scrambled control siRNA were labeled with [3H]thymidine, washed, and treated (+) for 10 min with 1 U/ml ASM, 10 μM C16ceramide, 10 μM S1P, 10 μM PDMP, 20 μM sphingosine kinase inhibitor SKI II, and 10 μM myriocin, or left untreated (−). The cells were then injected intravenously into wild-type or Asm-deficient mice as indicated. If indicated, 10 μg of arginine-glycine-aspartic acid (RGD) peptide or 10 μg/ml neutralizing anti-β1 integrin antibodies were added to B16F10tumor cells together with ASM for 15 min prior injection. Mice were sacrificed 30 min after tumorcell injection, the lungs carefully flushed via the right heart, and the radioactivity in the lung as a measurement for adherent tumor cells was determined. Shown is the mean ± SD of the counts per minute (cpm) in the lung lysates from three independent experiments. Statistical significance was determined by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's test for multiple comparison to determine P-values."}
{"words": ["Figure", "8A", "Amitriptyline", "(", "2", "mg", "/", "kg", ",", "Ami", ")", "was", "intraperitoneally", "injected", "into", "C57BL", "/", "6mice", "for", "five", "times", "every", "12", "h", ".", "Sixty", "minutes", "after", "the", "last", "injection", ",", "1", "×", "105B16F10tumor", "cells", "were", "intravenously", "injected", ".", "Control", "experiments", "confirmed", "that", "amitriptyline", "inhibited", "Asm", "activity", "in", "the", "blood", "by", "approximately", "85", "%", ".", "Asm", "heterozygous", "mice", "were", "injected", "with", "1", "×", "105B16F10tumor", "cells", ".", "The", "number", "of", "lungmetastases", "was", "determined", "after", "14", "days", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SD", "from", "six", "mice", "each", ",", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "for", "multiple", "comparison", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "B", ",", "C", "MT", "/", "ret", "cells", "(", "105", ")", "suspended", "in", "200", "μl", "Matrigel", "/", "PBS", "(", "1", ":", "1", ")", "were", "injected", "s", ".", "c", ".", "in", "the", "left", "and", "right", "flanks", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "Asm", "-", "deficient", "mice", "or", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "day", "20", "after", "injection", ",", "and", "spleens", "were", "inspected", "for", "the", "presence", "of", "metastases", ".", "The", "representative", "photographs", "(", "B", ")", "show", "the", "results", "from", "one", "of", "four", "experiments", ",", "and", "the", "quantitative", "analysis", "is", "displayed", "in", "(", "C", ")", ".", "B", ",", "C", "MT", "/", "ret", "cells", "(", "105", ")", "suspended", "in", "200", "μl", "Matrigel", "/", "PBS", "(", "1", ":", "1", ")", "were", "injected", "s", ".", "c", ".", "in", "the", "left", "and", "right", "flanks", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "Asm", "-", "deficient", "mice", "or", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "day", "20", "after", "injection", ",", "and", "spleens", "were", "inspected", "for", "the", "presence", "of", "metastases", ".", "The", "representative", "photographs", "(", "B", ")", "show", "the", "results", "from", "one", "of", "four", "experiments", ",", "and", "the", "quantitative", "analysis", "is", "displayed", "in", "(", "C", ")", ".", "D", "Platelets", "were", "isolated", "from", "wild", "-", "type", "or", "Asm", "-", "deficient", "mice", "by", "density", "-", "gradient", "centrifugation", ",", "and", "1", "×", "107", "platelets", "were", "incubated", "with", "1", "×", "105", "MT", "/", "ret", "melanoma", "cells", ".", "The", "samples", "were", "lysed", ",", "and", "Asm", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "determined", ".", "In", "unstimulated", "samples", "(", "time", "point", "0", "of", "co", "-", "incubation", ")", ",", "tumorcell", "and", "platelet", "lysates", "were", "admixed", "after", "lysis", ".", "E", "To", "measure", "secretion", "of", "Asm", "by", "platelets", ",", "tumor", "cells", "and", "platelets", "were", "co", "-", "incubated", "for", "30", "s", ",", "the", "samples", "were", "pelleted", ",", "the", "supernatants", "were", "acidified", ",", "and", "the", "Asm", "activity", "was", "measured", ".", "All", "Asm", "activity", "measurements", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "100", "μM", "Zn2", "+", ".", "F", "Local", "tumor", "growth", "in", "wild", "-", "type", "or", "Asm", "-", "deficient", "mice", "at", "the", "flank", "was", "measured", "at", "day", "20", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Amitriptyline (2 mg/kg, Ami) was intraperitoneally injected into C57BL/6mice for five times every 12 h. Sixty minutes after the last injection, 1 × 105B16F10tumor cells were intravenously injected. Control experiments confirmed that amitriptyline inhibited Asm activity in the blood by approximately 85%. Asm heterozygous mice were injected with 1 × 105B16F10tumor cells. The number of lungmetastases was determined after 14 days. Shown is the mean ± SD from six mice each, ANOVA followed by Tukey's test for multiple comparison. P-values are indicated.B, C MT/ret cells (105) suspended in 200 μl Matrigel/PBS (1:1) were injected s.c. in the left and right flanks of 8-week-old Asm-deficient mice or wild-type mice. Mice were sacrificed at day 20 after injection, and spleens were inspected for the presence of metastases. The representative photographs (B) show the results from one of four experiments, and the quantitative analysis is displayed in (C).B, C MT/ret cells (105) suspended in 200 μl Matrigel/PBS (1:1) were injected s.c. in the left and right flanks of 8-week-old Asm-deficient mice or wild-type mice. Mice were sacrificed at day 20 after injection, and spleens were inspected for the presence of metastases. The representative photographs (B) show the results from one of four experiments, and the quantitative analysis is displayed in (C).D Platelets were isolated from wild-type or Asm-deficient mice by density-gradient centrifugation, and 1 × 107 platelets were incubated with 1 × 105 MT/ret melanoma cells. The samples were lysed, and Asm activity in cell lysates was determined. In unstimulated samples (time point 0 of co-incubation), tumorcell and platelet lysates were admixed after lysis.E To measure secretion of Asm by platelets, tumor cells and platelets were co-incubated for 30 s, the samples were pelleted, the supernatants were acidified, and the Asm activity was measured. All Asm activity measurements were performed in the presence of 100 μM Zn2+.F Local tumor growth in wild-type or Asm-deficient mice at the flank was measured at day 20."}
{"words": ["Figure", "1SAGA", "is", "epistatic", "to", "the", "TORC1", "and", "TORC2", "pathways", "in", "the", "regulation", "of", "differentiation", "in", "response", "to", "nutrient", "availability", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "E", ")", "Expression", "of", "ste11", "+", "(", "A", ",", "D", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "nutrient", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "shifted", "for", "4", "hours", "to", "starvation", "medium", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "tsc2Η", ",", "gcn5Η", "tsc2Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", "-", "a", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "rhb1", "mutant", "[", "34", "]", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "tor2", "-", "L1310P", "-", "a", "CA", "tor2", "mutant", "[", "33", "]", ",", "gcn5Η", "tor2", "-", "L1310P", ",", "tor1Η", ",", "gcn5Η", "tor1Η", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "standard", "error", "(", "SE", ")", "bars", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", "for", "A", ",", "B", ")", "SAGA", "is", "epistatic", "to", "the", "TORC1", "and", "TORC2", "pathways", "in", "the", "regulation", "of", "differentiation", "in", "response", "to", "nutrient", "availability", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "E", ")", "Expression", "of", "mei2", "+", "(", "B", ",", "E", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "nutrient", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "shifted", "for", "4", "hours", "to", "starvation", "medium", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "tsc2Η", ",", "gcn5Η", "tsc2Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", "-", "a", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "rhb1", "mutant", "[", "34", "]", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "tor2", "-", "L1310P", "-", "a", "CA", "tor2", "mutant", "[", "33", "]", ",", "gcn5Η", "tor2", "-", "L1310P", ",", "tor1Η", ",", "gcn5Η", "tor1Η", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "standard", "error", "(", "SE", ")", "bars", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", "for", "A", ",", "B", ")", "(", "C", ",", "F", ")", "Cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "either", "in", "rich", "medium", "or", "shifted", "for", "8", "hours", "to", "starvation", "medium", ".", "Zygotes", "and", "tetrads", ",", "which", "correspond", "to", "differentiated", "cells", ",", "were", "counted", "under", "a", "light", "microscope", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "WT", "isogenic", "controls", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "Each", "value", "represents", "the", "mean", "percentage", "and", "SE", "of", "differentiating", "cells", "to", "the", "total", "number", "of", "cells", ",", "averaged", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "zygotes", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "SAGA", "is", "epistatic", "to", "the", "TORC1", "and", "TORC2", "pathways", "in", "the", "regulation", "of", "differentiation", "in", "response", "to", "nutrient", "availability", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "E", ")", "Expression", "of", "ste11", "+", "(", "A", ",", "D", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "nutrient", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "shifted", "for", "4", "hours", "to", "starvation", "medium", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "tsc2Η", ",", "gcn5Η", "tsc2Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", "-", "a", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "rhb1", "mutant", "[", "34", "]", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "tor2", "-", "L1310P", "-", "a", "CA", "tor2", "mutant", "[", "33", "]", ",", "gcn5Η", "tor2", "-", "L1310P", ",", "tor1Η", ",", "gcn5Η", "tor1Η", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "3", "(", "D", ",", "E", ")", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "standard", "error", "(", "SE", ")", "bars", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "3", "for", "D", ",", "E", ")", ".", "SAGA", "is", "epistatic", "to", "the", "TORC1", "and", "TORC2", "pathways", "in", "the", "regulation", "of", "differentiation", "in", "response", "to", "nutrient", "availability", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "E", ")", "Expression", "of", "mei2", "+", "(", "B", ",", "E", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "nutrient", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "shifted", "for", "4", "hours", "to", "starvation", "medium", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "tsc2Η", ",", "gcn5Η", "tsc2Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", "-", "a", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "rhb1", "mutant", "[", "34", "]", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "tor2", "-", "L1310P", "-", "a", "CA", "tor2", "mutant", "[", "33", "]", ",", "gcn5Η", "tor2", "-", "L1310P", ",", "tor1Η", ",", "gcn5Η", "tor1Η", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "3", "(", "D", ",", "E", ")", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "standard", "error", "(", "SE", ")", "bars", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "3", "for", "D", ",", "E", ")", ".", "(", "C", ",", "F", ")", "Cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "either", "in", "rich", "medium", "or", "shifted", "for", "8", "hours", "to", "starvation", "medium", ".", "Zygotes", "and", "tetrads", ",", "which", "correspond", "to", "differentiated", "cells", ",", "were", "counted", "under", "a", "light", "microscope", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "WT", "isogenic", "controls", ",", "gcn5Η", ",", "tsc1Η", ",", "gcn5Η", "tsc1Η", ",", "rhb1", "-", "DA4", ",", "gcn5Η", "rhb1", "-", "DA4", ",", "gad8Η", ",", "and", "gcn5Η", "gad8Η", ".", "Each", "value", "represents", "the", "mean", "percentage", "and", "SE", "of", "differentiating", "cells", "to", "the", "total", "number", "of", "cells", ",", "averaged", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "zygotes", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1SAGA is epistatic to the TORC1 and TORC2 pathways in the regulation of differentiation in response to nutrient availability. (A,B,D,E) Expression of ste11+ (A,D) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in nutrient rich medium (dark gray) or shifted for 4 hours to starvation medium (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, tsc2Η, gcn5Η tsc2Η, rhb1-DA4 - a constitutively active (CA) rhb1 mutant [34], gcn5Η rhb1-DA4, tor2-L1310P - a CA tor2 mutant [33], gcn5Η tor2-L1310P, tor1Η, gcn5Η tor1Η, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 (A,B)independent experiments, overlaid with individual data points and standard error (SE) bars. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4 for A,B)SAGA is epistatic to the TORC1 and TORC2 pathways in the regulation of differentiation in response to nutrient availability. (A,B,D,E) Expression of mei2+ (B,E) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in nutrient rich medium (dark gray) or shifted for 4 hours to starvation medium (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, tsc2Η, gcn5Η tsc2Η, rhb1-DA4 - a constitutively active (CA) rhb1 mutant [34], gcn5Η rhb1-DA4, tor2-L1310P - a CA tor2 mutant [33], gcn5Η tor2-L1310P, tor1Η, gcn5Η tor1Η, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 (A,B) independent experiments, overlaid with individual data points and standard error (SE) bars. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4 for A,B)(C,F) Cells were grown to mid-log phase either in rich medium or shifted for 8 hours to starvation medium. Zygotes and tetrads, which correspond to differentiated cells, were counted under a light microscope. Cells of the following genotypes were analyzed: WT isogenic controls, gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, rhb1-DA4, gcn5Η rhb1-DA4, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. Each value represents the mean percentage and SE of differentiating cells to the total number of cells, averaged from 4 independent experiments. At least 200 cells from the indicated genotypes were counted in each experiment. White arrowheads indicate zygotes. Scale bar, 10 μm.SAGA is epistatic to the TORC1 and TORC2 pathways in the regulation of differentiation in response to nutrient availability. (A,B,D,E) Expression of ste11+ (A,D) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in nutrient rich medium (dark gray) or shifted for 4 hours to starvation medium (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, tsc2Η, gcn5Η tsc2Η, rhb1-DA4 - a constitutively active (CA) rhb1 mutant [34], gcn5Η rhb1-DA4, tor2-L1310P - a CA tor2 mutant [33], gcn5Η tor2-L1310P, tor1Η, gcn5Η tor1Η, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 3 (D,E) independent experiments, overlaid with individual data points and standard error (SE) bars. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 3 for D,E).SAGA is epistatic to the TORC1 and TORC2 pathways in the regulation of differentiation in response to nutrient availability. (A,B,D,E) Expression of mei2+ (B,E) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in nutrient rich medium (dark gray) or shifted for 4 hours to starvation medium (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, tsc2Η, gcn5Η tsc2Η, rhb1-DA4 - a constitutively active (CA) rhb1 mutant [34], gcn5Η rhb1-DA4, tor2-L1310P - a CA tor2 mutant [33], gcn5Η tor2-L1310P, tor1Η, gcn5Η tor1Η, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 3 (D,E) independent experiments, overlaid with individual data points and standard error (SE) bars. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 3 for D,E).(C,F) Cells were grown to mid-log phase either in rich medium or shifted for 8 hours to starvation medium. Zygotes and tetrads, which correspond to differentiated cells, were counted under a light microscope. Cells of the following genotypes were analyzed: WT isogenic controls, gcn5Η, tsc1Η, gcn5Η tsc1Η, rhb1-DA4, gcn5Η rhb1-DA4, gad8Η, and gcn5Η gad8Η. Each value represents the mean percentage and SE of differentiating cells to the total number of cells, averaged from 4 independent experiments. At least 200 cells from the indicated genotypes were counted in each experiment. White arrowheads indicate zygotes. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2SAGA", "is", "phosphorylated", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "4", "-", "20", "%", "gradient", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "analysis", "of", "SAGA", "purified", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "SAGA", "was", "purified", "using", "endogenously", "TAP", "-", "tagged", "Ada1", ".", "A", "fraction", "of", "each", "eluate", "was", "loaded", "and", "either", "stained", "with", "silver", ",", "to", "detect", "all", "proteins", "(", "A", ")", ",", ".", "A", "strain", "without", "any", "TAP", "tag", "is", "shown", "as", "a", "negative", "control", "for", "the", "purification", ".", "The", "graph", "on", "the", "left", "of", "the", "gel", "in", "B", "shows", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "phospho", "-", "specific", "stain", ",", "which", "was", "quantified", "along", "the", "left", "lane", "in", "blue", "(", "rich", ")", "and", "the", "middle", "lane", "in", "red", "(", "starved", ")", ",", "using", "ImageJ", ".", "The", "area", "of", "one", "peak", ",", "which", "corresponds", "to", "the", "bands", "marked", "with", "arrowheads", "and", "was", "coined", "p55", ",", "is", "1", ".", "8", "-", "fold", "larger", "in", "SAGA", "purified", "from", "starved", "cells", ",", "as", "compared", "to", "rich", "conditions", ".", "Below", "is", "an", "anti", "-", "HA", "immuno", "-", "blot", "(", "IB", ")", "of", "each", "eluate", ",", "to", "reveal", "the", "amount", "of", "Ada1", "-", "HA", "bait", "recovered", ".", "Shown", "are", "gels", "that", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "A", ".", "U", ".", ",", "arbitrary", "units", ".", "SAGA", "is", "phosphorylated", "in", "response", "to", "nutrient", "starvation", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "4", "-", "20", "%", "gradient", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "analysis", "of", "SAGA", "purified", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "SAGA", "was", "purified", "using", "endogenously", "TAP", "-", "tagged", "Ada1", ".", "A", "fraction", "of", "each", "eluate", "was", "loaded", "and", "either", "stained", "with", "Pro", "-", "Q", "®", "Diamond", ",", "which", "stains", "phosphorylated", "proteins", "(", "B", ")", ".", "A", "strain", "without", "any", "TAP", "tag", "is", "shown", "as", "a", "negative", "control", "for", "the", "purification", ".", "The", "graph", "on", "the", "left", "of", "the", "gel", "in", "B", "shows", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "phospho", "-", "specific", "stain", ",", "which", "was", "quantified", "along", "the", "left", "lane", "in", "blue", "(", "rich", ")", "and", "the", "middle", "lane", "in", "red", "(", "starved", ")", ",", "using", "ImageJ", ".", "The", "area", "of", "one", "peak", ",", "which", "corresponds", "to", "the", "bands", "marked", "with", "arrowheads", "and", "was", "coined", "p55", ",", "is", "1", ".", "8", "-", "fold", "larger", "in", "SAGA", "purified", "from", "starved", "cells", ",", "as", "compared", "to", "rich", "conditions", ".", "Below", "is", "an", "anti", "-", "HA", "immuno", "-", "blot", "(", "IB", ")", "of", "each", "eluate", ",", "to", "reveal", "the", "amount", "of", "Ada1", "-", "HA", "bait", "recovered", ".", "Shown", "are", "gels", "that", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "A", ".", "U", ".", ",", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2SAGA is phosphorylated in response to nutrient starvation. (A,B) 4-20% gradient SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of SAGA purified from cells grown either in rich medium (R) or starved for 45 minutes (S). SAGA was purified using endogenously TAP-tagged Ada1. A fraction of each eluate was loaded and either stained with silver, to detect all proteins (A),. A strain without any TAP tag is shown as a negative control for the purification. The graph on the left of the gel in B shows the fluorescence intensity of the phospho-specific stain, which was quantified along the left lane in blue (rich) and the middle lane in red (starved), using ImageJ. The area of one peak, which corresponds to the bands marked with arrowheads and was coined p55, is 1.8-fold larger in SAGA purified from starved cells, as compared to rich conditions. Below is an anti-HA immuno-blot (IB) of each eluate, to reveal the amount of Ada1-HA bait recovered. Shown are gels that are representative of 3 independent experiments. A.U., arbitrary units.SAGA is phosphorylated in response to nutrient starvation. (A,B) 4-20% gradient SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of SAGA purified from cells grown either in rich medium (R) or starved for 45 minutes (S). SAGA was purified using endogenously TAP-tagged Ada1. A fraction of each eluate was loaded and either stained with Pro-Q® Diamond, which stains phosphorylated proteins (B). A strain without any TAP tag is shown as a negative control for the purification. The graph on the left of the gel in B shows the fluorescence intensity of the phospho-specific stain, which was quantified along the left lane in blue (rich) and the middle lane in red (starved), using ImageJ. The area of one peak, which corresponds to the bands marked with arrowheads and was coined p55, is 1.8-fold larger in SAGA purified from starved cells, as compared to rich conditions. Below is an anti-HA immuno-blot (IB) of each eluate, to reveal the amount of Ada1-HA bait recovered. Shown are gels that are representative of 3 independent experiments. A.U., arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "FLAG", "-", "tagged", "Taf12", "was", "purified", "from", "cells", "grown", "in", "rich", "medium", "(", "R", ")", "or", "shifted", "for", "45", "minutes", "to", "starvation", "medium", "(", "S", ")", ".", "Anti", "-", "FLAG", "immuno", "-", "precipitations", "(", "IP", ")", "were", "incubated", "with", "and", "without", "λ", "-", "phosphatase", "or", "its", "inhibitor", "and", "immuno", "-", "blotted", "(", "IB", ")", ",", "together", "with", "1", "%", "of", "whole", "cell", "extracts", "(", "WCE", ")", ",", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "(", "E", ")", "Phospho", "-", "Taf12", "(", "P", "-", "Taf12", ")", ",", "total", "Taf12", ",", "and", "tubulin", "levels", "were", "quantified", "from", "cells", "grown", "in", "rich", "medium", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "P", "-", "Taf12", "levels", "were", "normalized", "to", "those", "of", "total", "Taf12", ",", "while", "total", "Taf12", "levels", "were", "normalized", "to", "those", "of", "tubulin", ".", "Data", "points", "were", "individually", "plotted", "on", "the", "graph", "and", "overlaid", "with", "the", "mean", "and", "SE", ".", "Signal", "intensities", "were", "quantified", "from", "IBs", "of", "7", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "t", "-", "test", "(", "n", "=", "7", ",", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", ")", ".", "(", "F", ")", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "followed", "in", "WT", ",", "taf12", "-", "T283A", "and", "taf12", "-", "5A", "mutants", ",", "grown", "in", "rich", "medium", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "SAGA", "and", "TFIID", "were", "tandem", "affinity", "-", "purified", "using", "endogenously", "TAP", "-", "tagged", "Spt7", "(", "G", ")", "from", "strains", "containing", "FLAG", "-", "tagged", "Taf12", ",", "grown", "in", "rich", "medium", "or", "starved", "for", "45", "minutes", ".", "TAP", "-", "tagged", "Spt7", "and", "Taf4", "were", "eluted", "using", "the", "TEV", "protease", ",", "releasing", "a", "shorter", "form", "of", "each", "bait", "(", "Spt7", "-", "CBP", "or", "Taf4", "-", "CBP", ")", ".", "Eluates", "were", "loaded", "and", "immuno", "-", "blotted", "(", "IB", ")", "using", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "CBP", "antibodies", ",", "together", "with", "1", "%", "of", "either", "whole", "cell", "extracts", "(", "WCE", ")", "or", "IgG", "-", "sepharose", "flow", "-", "through", "(", "FT", ")", ".", "Shown", "are", "IBs", "that", "are", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "SAGA", "and", "TFIID", "were", "tandem", "affinity", "-", "purified", "using", "endogenously", "TAP", "-", "tagged", "Taf4", "(", "H", ")", ",", "from", "strains", "containing", "FLAG", "-", "tagged", "Taf12", ",", "grown", "in", "rich", "medium", "or", "starved", "for", "45", "minutes", ".", "TAP", "-", "tagged", "Spt7", "and", "Taf4", "were", "eluted", "using", "the", "TEV", "protease", ",", "releasing", "a", "shorter", "form", "of", "each", "bait", "(", "Spt7", "-", "CBP", "or", "Taf4", "-", "CBP", ")", ".", "Eluates", "were", "loaded", "and", "immuno", "-", "blotted", "(", "IB", ")", "using", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "CBP", "antibodies", ",", "together", "with", "1", "%", "of", "either", "whole", "cell", "extracts", "(", "WCE", ")", "or", "IgG", "-", "sepharose", "flow", "-", "through", "(", "FT", ")", ".", "Shown", "are", "IBs", "that", "are", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "P", "-", "Taf12", ",", "total", "Taf12", ",", "and", "Ser546", "-", "phosphorylated", "Gad8AKT", "were", "followed", "in", "WT", "cells", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "or", "over", "a", "time", "-", "course", "after", "a", "shift", "to", "starvation", "medium", ".", "Gad8AKT", "phosphorylation", "at", "Ser546", "is", "a", "proxy", "of", "TORC2", "activity", "in", "S", ".", "pombe", ".", "(", "J", ")", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "followed", "in", "WT", "cells", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "or", "shifted", "to", "different", "starvation", "media", "for", "30", "minutes", ".", "These", "include", "both", "the", "removal", "of", "the", "nitrogen", "source", ",", "ammonium", "chloride", "(", "NH4Cl", ")", ",", "and", "the", "reduction", "of", "the", "carbon", "source", ",", "glucose", ",", "from", "a", "concentration", "of", "2", "%", "to", "0", ".", "5", "%", ".", "Alternatively", ",", "cells", "were", "either", "only", "deprived", "of", "NH4Cl", "or", "only", "exposed", "to", "reduced", "glucose", "levels", "(", "2", "%", "to", "0", ".", "5", "%", ")", ".", "(", "K", ")", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "followed", "in", "WT", "cells", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "or", "deprived", "of", "NH4Cl", "for", "one", "hour", ".", "Then", ",", "NH4Cl", "was", "added", "back", "to", "the", "medium", "for", "30", "or", "60", "minutes", ".", "Both", "short", "and", "long", "exposures", "of", "the", "FLAG", "IBs", "are", "shown", "to", "detect", "total", "Taf12", "and", "P", "-", "Taf12", ",", "respectively", ",", "within", "the", "linear", "range", "of", "the", "chemi", "-", "luminescence", "signal", ".", "Anti", "-", "tubulin", "IBs", "are", "shown", "as", "controls", "for", "loading", "between", "samples", ".", "Shown", "are", "star", "that", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "number", "sign", "(", "#", ")", "symbol", "identifies", "antibody", "heavy", "chains", "and", "the", "star", "(", "*", ")", "symbol", "labels", "an", "unspecific", "band", "detected", "by", "the", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "in", "S", ".", "pombe", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) FLAG-tagged Taf12 was purified from cells grown in rich medium (R) or shifted for 45 minutes to starvation medium (S). Anti-FLAG immuno-precipitations (IP) were incubated with and without λ-phosphatase or its inhibitor and immuno-blotted (IB), together with 1% of whole cell extracts (WCE), using an anti-FLAG antibody.(E) Phospho-Taf12 (P-Taf12), total Taf12, and tubulin levels were quantified from cells grown in rich medium (R) or starved for 45 minutes (S). P-Taf12 levels were normalized to those of total Taf12, while total Taf12 levels were normalized to those of tubulin. Data points were individually plotted on the graph and overlaid with the mean and SE. Signal intensities were quantified from IBs of 7 independent experiments. Statistical significance was determined using a t-test (n = 7, unpaired, two-tailed).(F) P-Taf12 and total Taf12 were followed in WT, taf12-T283A and taf12-5A mutants, grown in rich medium (R) or starved for 45 minutes (S).(G,H) SAGA and TFIID were tandem affinity-purified using endogenously TAP-tagged Spt7 (G) from strains containing FLAG-tagged Taf12, grown in rich medium or starved for 45 minutes. TAP-tagged Spt7 and Taf4 were eluted using the TEV protease, releasing a shorter form of each bait (Spt7-CBP or Taf4-CBP). Eluates were loaded and immuno-blotted (IB) using anti-FLAG or anti-CBP antibodies, together with 1% of either whole cell extracts (WCE) or IgG-sepharose flow-through (FT). Shown are IBs that are representative of 2 independent experiments.(G,H) SAGA and TFIID were tandem affinity-purified using endogenously TAP-tagged Taf4 (H), from strains containing FLAG-tagged Taf12, grown in rich medium or starved for 45 minutes. TAP-tagged Spt7 and Taf4 were eluted using the TEV protease, releasing a shorter form of each bait (Spt7-CBP or Taf4-CBP). Eluates were loaded and immuno-blotted (IB) using anti-FLAG or anti-CBP antibodies, together with 1% of either whole cell extracts (WCE) or IgG-sepharose flow-through (FT). Shown are IBs that are representative of 2 independent experiments.(I) P-Taf12, total Taf12, and Ser546-phosphorylated Gad8AKT were followed in WT cells, grown in rich conditions or over a time-course after a shift to starvation medium. Gad8AKT phosphorylation at Ser546 is a proxy of TORC2 activity in S. pombe.(J) P-Taf12 and total Taf12 were followed in WT cells, grown in rich conditions or shifted to different starvation media for 30 minutes. These include both the removal of the nitrogen source, ammonium chloride (NH4Cl), and the reduction of the carbon source, glucose, from a concentration of 2% to 0.5%. Alternatively, cells were either only deprived of NH4Cl or only exposed to reduced glucose levels (2% to 0.5%).(K) P-Taf12 and total Taf12 were followed in WT cells, grown in rich conditions or deprived of NH4Cl for one hour. Then, NH4Cl was added back to the medium for 30 or 60 minutes. Both short and long exposures of the FLAG IBs are shown to detect total Taf12 and P-Taf12, respectively, within the linear range of the chemi-luminescence signal. Anti-tubulin IBs are shown as controls for loading between samples. Shown are star that are representative of at least 3 independent experiments. The number sign (#) symbol identifies antibody heavy chains and the star (*) symbol labels an unspecific band detected by the anti-FLAG antibody in S. pombe."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Expression", "of", "ste11", "+", "(", "A", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "4", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "ppa2Η", ",", "par1Η", ",", "pab1Η", ",", "tsc1Η", ",", "and", "pab1Η", "tsc1Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Expression", "of", "mei2", "+", "(", "B", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "4", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "ppa2Η", ",", "par1Η", ",", "pab1Η", ",", "tsc1Η", ",", "and", "pab1Η", "tsc1Η", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "C", ")", "Cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "either", "in", "rich", "medium", "or", "starved", "for", "8", "hours", ".", "Zygotes", "and", "tetrads", ",", "which", "correspond", "to", "differentiated", "cells", ",", "were", "counted", "under", "a", "light", "microscope", ".", "Each", "value", "represents", "the", "mean", "percentage", "and", "SE", "of", "differentiating", "cells", "to", "the", "total", "number", "of", "cells", ",", "averaged", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "zygotes", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", "and", "pab1Η", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "An", "anti", "-", "Rpb1", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "The", "signal", "intensities", "of", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "quantified", "in", "each", "strain", "and", "condition", ".", "Ratios", "of", "P", "-", "Taf12", "to", "total", "Taf12", "were", "calculated", "from", "6", "independent", "experiments", "and", "individually", "plotted", "in", "a", "graph", "below", "the", "IBs", ",", "together", "with", "the", "mean", "and", "SE", ".", "Averaged", "values", "from", "all", "WT", "controls", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "strains", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "6", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "A", "short", "and", "a", "long", "exposure", "of", "the", "FLAG", "IB", "are", "shown", "to", "detect", "total", "Taf12", "and", "P", "-", "Taf12", ",", "respectively", ",", "within", "the", "linear", "range", "of", "the", "chemi", "-", "luminescence", "signal", ".", "(", "E", ")", "FLAG", "-", "tagged", "Taf12", "and", "TAP", "-", "tagged", "Pab1", "were", "affinity", "purified", "separately", "from", "cells", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "upper", "panels", ")", ".", "TAP", "-", "tagged", "Pab1", "was", "cleaved", "off", "from", "beads", "using", "the", "Tobacco", "Etch", "Virus", "(", "TEV", ")", "protease", ",", "releasing", "a", "shorter", "form", "of", "Pab1", "(", "CBP", "-", "Pab1", ")", "in", "the", "eluate", "(", "E", ")", ".", "CBP", "-", "Pab1", "was", "then", "mixed", "with", "beads", "containing", "FLAG", "-", "Taf12", "IPs", "and", "incubated", "in", "a", "phosphatase", "buffer", ",", "with", "and", "without", "0", ".", "5", "µM", "microcystin", ".", "Each", "reaction", "was", "then", "analyzed", "by", "IB", "and", "simultaneously", "probed", "with", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "CBP", "antibodies", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "F", ")", "Exponentially", "growing", "cells", "were", "treated", "for", "1", "hour", "with", "Torin1", ",", "which", "was", "added", "at", "increasing", "concentrations", ",", "7", "and", "21", "µM", ",", "to", "rich", "medium", ".", "Dimethylsulphoxide", "(", "DMSO", ")", "was", "used", "as", "the", "vehicle", "and", "added", "as", "a", "negative", "control", ".", "(", "G", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", "and", "tor2", "-", "ts10", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "at", "25", "°", "C", "or", "shifted", "to", "30", "°", "C", "for", "4", "and", "6", "hours", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Anti", "-", "tubulin", "IBs", "are", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", "between", "samples", ".", "Shown", "are", "IBs", "that", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "star", "(", "*", ")", "symbol", "labels", "unspecific", "bands", "detected", "by", "the", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "CBP", "antibodies", "in", "S", ".", "pombe", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A,B) Expression of ste11+ (A) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 4 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), ppa2Η, par1Η, pab1Η, tsc1Η, and pab1Η tsc1Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4).(A,B) Expression of mei2+ (B) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 4 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), ppa2Η, par1Η, pab1Η, tsc1Η, and pab1Η tsc1Η. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4).(C) Cells were grown to mid-log phase either in rich medium or starved for 8 hours. Zygotes and tetrads, which correspond to differentiated cells, were counted under a light microscope. Each value represents the mean percentage and SE of differentiating cells to the total number of cells, averaged from 4 independent experiments. At least 200 cells from the indicated genotypes were counted in each experiment. White arrowheads indicate zygotes. Scale bar, 10 μm.(D) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from WT and pab1Η strains, grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). An anti-Rpb1 IB is shown as a control for loading. The signal intensities of P-Taf12 and total Taf12 were quantified in each strain and condition. Ratios of P-Taf12 to total Taf12 were calculated from 6 independent experiments and individually plotted in a graph below the IBs, together with the mean and SE. Averaged values from all WT controls grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and strains. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 6; *p < 0.01; #p < 0.05). A short and a long exposure of the FLAG IB are shown to detect total Taf12 and P-Taf12, respectively, within the linear range of the chemi-luminescence signal.(E) FLAG-tagged Taf12 and TAP-tagged Pab1 were affinity purified separately from cells grown in rich conditions (upper panels). TAP-tagged Pab1 was cleaved off from beads using the Tobacco Etch Virus (TEV) protease, releasing a shorter form of Pab1 (CBP-Pab1) in the eluate (E). CBP-Pab1 was then mixed with beads containing FLAG-Taf12 IPs and incubated in a phosphatase buffer, with and without 0.5 µM microcystin. Each reaction was then analyzed by IB and simultaneously probed with anti-FLAG or anti-CBP antibodies (lower panel).(F) Exponentially growing cells were treated for 1 hour with Torin1, which was added at increasing concentrations, 7 and 21 µM, to rich medium. Dimethylsulphoxide (DMSO) was used as the vehicle and added as a negative control.(G) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from WT and tor2-ts10 strains, grown in rich conditions at 25°C or shifted to 30°C for 4 and 6 hours. (F,G) Anti-tubulin IBs are shown as a control for loading between samples. Shown are IBs that are representative of 3 independent experiments. The star (*) symbol labels unspecific bands detected by the anti-FLAG or anti-CBP antibodies in S. pombe."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Igo1", "phosphorylation", "(", "P", "-", "Igo1", ")", "was", "followed", "by", "anti", "-", "MYC", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", ",", "ppk18Η", ",", "and", "igo1", "-", "S64A", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "Igo1", "migration", "was", "analyzed", "by", "electrophoresis", "of", "both", "a", "12", "%", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "containing", "the", "Phos", "-", "tag", "™", "molecule", "(", "right", "panel", ")", "and", "a", "standard", "10", "%", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "(", "left", "panel", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "various", "phosphorylated", "isoforms", "of", "Igo1", "-", "MYC", "in", "each", "strain", "and", "condition", ".", "Shown", "is", "an", "IB", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Expression", "of", "ste11", "+", "(", "C", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "4", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "pab1Η", ",", "gcn5Η", "ppk18Η", ",", "pab1Η", ",", "pab1Η", "ppk18Η", ",", "igo1Η", ",", "igo1", "-", "S64A", ",", "gcn5Η", "igo1", "-", "S64A", "and", "pab1Η", "igo1", "-", "S64A", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Expression", "of", "mei2", "+", "(", "D", ")", "using", "igo1", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "4", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "gcn5Η", ",", "ppk18Η", ",", "gcn5Η", "ppk18Η", ",", "pab1Η", ",", "pab1Η", "ppk18Η", ",", "igo1Η", ",", "igo1", "-", "S64A", ",", "gcn5Η", "igo1", "-", "S64A", "and", "pab1Η", "igo1", "-", "S64A", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "4", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "D", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", ",", "S", ".", "pombeΗ", ",", "and", "igo1Η", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "An", "anti", "-", "MYC", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "The", "signal", "intensities", "of", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "quantified", "in", "each", "strain", "and", "condition", ".", "Shown", "below", "each", "blot", "are", "average", "measurements", "of", "3", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "A", "short", "and", "a", "long", "exposure", "of", "the", "FLAG", "IB", "are", "shown", "to", "detect", "total", "Taf12", "and", "P", "-", "Taf12", ",", "respectively", ",", "within", "the", "linear", "range", "of", "the", "chemi", "-", "luminescence", "signal", ".", "The", "star", "(", "*", ")", "symbol", "labels", "an", "unspecific", "band", "detected", "by", "the", "FLAG", "antibody", "in", "S", ".", "pombe", ".", "(", "E", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "in", "WT", ",", "igoS64A", ",", "pab1Η", ",", "and", "pab1Η", "igoS64A", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "An", "anti", "-", "Rpb1", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "The", "signal", "intensities", "of", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "quantified", "in", "each", "strain", "and", "condition", ".", "Shown", "below", "each", "blot", "are", "average", "measurements", "of", "3", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "A", "short", "and", "a", "long", "exposure", "of", "the", "FLAG", "IB", "are", "shown", "to", "detect", "total", "Taf12", "and", "P", "-", "Taf12", ",", "respectively", ",", "within", "the", "linear", "range", "of", "the", "chemi", "-", "luminescence", "signal", ".", "The", "star", "(", "*", ")", "symbol", "labels", "an", "unspecific", "band", "detected", "by", "the", "S", ".", "pombe", "antibody", "in", "S", ".", "pombe", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Igo1 phosphorylation (P-Igo1) was followed by anti-MYC IB of protein extracts from WT, ppk18Η, and igo1-S64A strains, grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). Igo1 migration was analyzed by electrophoresis of both a 12% SDS-polyacrylamide gel containing the Phos-tag™ molecule (right panel) and a standard 10% SDS-polyacrylamide gel (left panel). Arrowheads indicate the various phosphorylated isoforms of Igo1-MYC in each strain and condition. Shown is an IB representative of 2 independent experiments.(B,C) Expression of ste11+ (C) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 4 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, pab1Η, gcn5Η ppk18Η, pab1Η, pab1Η ppk18Η, igo1Η, igo1-S64A, gcn5Η igo1-S64A and pab1Η igo1-S64A. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4).(B,C) Expression of mei2+ (D) using igo1 of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 4 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), gcn5Η, ppk18Η, gcn5Η ppk18Η, pab1Η, pab1Η ppk18Η, igo1Η, igo1-S64A, gcn5Η igo1-S64A and pab1Η igo1-S64A. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 4 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 4).(D) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from WT, S. pombeΗ, and igo1Η strains, grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). An anti-MYC IB is shown as a control for loading. (D,E) The signal intensities of P-Taf12 and total Taf12 were quantified in each strain and condition. Shown below each blot are average measurements of 3 independent experiments (n = 3). A short and a long exposure of the FLAG IB are shown to detect total Taf12 and P-Taf12, respectively, within the linear range of the chemi-luminescence signal. The star (*) symbol labels an unspecific band detected by the FLAG antibody in S. pombe.(E) P-Taf12 was followed in WT, igoS64A, pab1Η, and pab1Η igoS64A strains, grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). An anti-Rpb1 IB is shown as a control for loading. (D,E) The signal intensities of P-Taf12 and total Taf12 were quantified in each strain and condition. Shown below each blot are average measurements of 3 independent experiments (n = 3). A short and a long exposure of the FLAG IB are shown to detect total Taf12 and P-Taf12, respectively, within the linear range of the chemi-luminescence signal. The star (*) symbol labels an unspecific band detected by the S. pombe antibody in S. pombe."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", ",", "tor1Η", ",", "and", "gad8Η", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "An", "anti", "-", "tubulin", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "The", "signal", "intensities", "of", "P", "-", "Taf12", "and", "total", "Taf12", "were", "quantified", "in", "each", "strain", "and", "condition", ".", "P", "-", "Taf12", "to", "Taf2", "ratios", "were", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "and", "individually", "plotted", "in", "a", "graph", "below", "the", "IBs", ",", "together", "with", "the", "mean", "and", "SE", ".", "Averaged", "values", "from", "all", "WT", "controls", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "B", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "sty1Η", "cells", "(", "left", "panel", ")", "or", "ssp2Η", "cells", "(", "right", "panel", ")", ",", "grown", "in", "rich", "conditions", "(", "R", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "S", ")", ".", "An", "anti", "-", "tubulin", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "The", "star", "(", "*", ")", "symbols", "label", "an", "unspecific", "band", "detected", "by", "the", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "in", "S", ".", "pombe", ".", "Shown", "are", "IBs", "that", "are", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "TAP", "-", "tagged", "Gad8", "was", "immuno", "-", "precipitated", "using", "IgG", "-", "sepharose", "beads", "(", "IP", ")", "from", "strains", "containing", "FLAG", "-", "tagged", "Taf12", ",", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "left", "panels", ")", "or", "starved", "for", "45", "minutes", "(", "right", "panels", ")", ".", "TAP", "-", "tagged", "Gad8", "was", "eluted", "from", "beads", "using", "the", "TEV", "protease", ",", "releasing", "a", "shorter", "form", "of", "Gad8", "(", "CBP", "-", "Gad8", ")", ".", "Eluates", "were", "loaded", "and", "immuno", "-", "blotted", "(", "IB", ")", "using", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "CBP", "antibodies", ",", "together", "with", "1", "%", "of", "whole", "cell", "extracts", "(", "WCE", ")", ",", "to", "detect", "Taf12", "co", "-", "precipitation", "with", "Gad8", ".", "A", "strain", "which", "does", "not", "contain", "any", "TAP", "tag", "is", "shown", "as", "a", "negative", "control", "for", "the", "IP", ".", "Shown", "is", "an", "IB", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "A", ",", "C", ")", "The", "star", "(", "*", ")", "symbols", "label", "unspecific", "bands", "detected", "by", "the", "FLAG", "or", "the", "CBP", "antibodies", "in", "S", ".", "pombe", ".", "(", "D", ")", "Endogenous", "Gad8", "-", "HA", "was", "affinity", "purified", "from", "starved", "cells", ",", "in", "order", "to", "activate", "its", "kinase", "activity", "(", "left", "and", "middle", "panels", ")", ",", "and", "mixed", "with", "recombinant", ",", "purified", "GST", "-", "Taf12", ",", "GST", "-", "Taf12", "-", "5A", ",", "or", "GST", "-", "Fkh2", "proteins", "(", "right", "panels", ")", "in", "a", "kinase", "assay", "buffer", ".", "Each", "assay", "was", "then", "analyzed", "by", "IB", "and", "probed", "with", "an", "anti", "-", "phospho", "-", "AKT", "substrate", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from WT, tor1Η, and gad8Η strains, grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). An anti-tubulin IB is shown as a control for loading. The signal intensities of P-Taf12 and total Taf12 were quantified in each strain and condition. P-Taf12 to Taf2 ratios were calculated from 3 independent experiments and individually plotted in a graph below the IBs, together with the mean and SE. Averaged values from all WT controls grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 3).(B) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from sty1Η cells (left panel) or ssp2Η cells (right panel), grown in rich conditions (R) or starved for 45 minutes (S). An anti-tubulin IB is shown as a control for loading. The star (*) symbols label an unspecific band detected by the anti-FLAG antibody in S. pombe. Shown are IBs that are representative of 2 independent experiments.(C) TAP-tagged Gad8 was immuno-precipitated using IgG-sepharose beads (IP) from strains containing FLAG-tagged Taf12, grown either in rich medium (left panels) or starved for 45 minutes (right panels). TAP-tagged Gad8 was eluted from beads using the TEV protease, releasing a shorter form of Gad8 (CBP-Gad8). Eluates were loaded and immuno-blotted (IB) using anti-FLAG or anti-CBP antibodies, together with 1% of whole cell extracts (WCE), to detect Taf12 co-precipitation with Gad8. A strain which does not contain any TAP tag is shown as a negative control for the IP. Shown is an IB representative of two independent experiments. (A,C) The star (*) symbols label unspecific bands detected by the FLAG or the CBP antibodies in S. pombe.(D) Endogenous Gad8-HA was affinity purified from starved cells, in order to activate its kinase activity (left and middle panels), and mixed with recombinant, purified GST-Taf12, GST-Taf12-5A, or GST-Fkh2 proteins (right panels) in a kinase assay buffer. Each assay was then analyzed by IB and probed with an anti-phospho-AKT substrate antibody."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "Expression", "of", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "+", "(", "A", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "2", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", "and", "taf12", "-", "5A", "mutants", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "6", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "mei2", "+", "(", "B", ")", "using", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "RNA", "extracted", "from", "cells", "grown", "either", "in", "rich", "medium", "(", "dark", "gray", ")", "or", "starved", "for", "2", "hours", "(", "light", "grey", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", "and", "taf12", "-", "5A", "mutants", ".", "act1", "+", "served", "as", "a", "control", "for", "normalization", "across", "samples", ".", "Values", "from", "a", "WT", "strain", "grown", "in", "rich", "medium", "were", "set", "at", "1", "to", "allow", "comparisons", "across", "culture", "conditions", "and", "mutant", "strains", ".", "Each", "column", "represents", "the", "mean", "value", "of", "6", "independent", "experiments", ",", "overlaid", "with", "individual", "data", "points", "and", "SE", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "C", ",", "E", ")", "Zygotes", "and", "tetrads", ",", "which", "correspond", "to", "differentiated", "cells", ",", "were", "counted", "from", "cultures", "of", "homothallic", "cells", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "rich", "medium", "(", "t0", ")", "and", "shifted", "to", "starvation", "medium", "for", "up", "to", "24", "hours", "(", "C", ")", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "taf12", "-", "5A", ",", "taf12", "-", "5DE", ",", "tor1", "-", "1972A", ",", "and", "taf12", "-", "5A", "tor1", "-", "1972A", ".", "Each", "value", "represents", "the", "mean", "percentage", "and", "SE", "of", "differentiating", "cells", "to", "the", "total", "number", "of", "cells", ",", "averaged", "from", "6", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "D", ")", "P", "-", "Taf12", "was", "followed", "by", "anti", "-", "FLAG", "IB", "of", "protein", "extracts", "from", "WT", "and", "tor1", "-", "1972A", "strains", ",", "grown", "in", "rich", "medium", "and", "shifted", "to", "starved", "conditions", "for", "60", "minutes", ".", "An", "anti", "-", "Tubulin", "IB", "is", "shown", "as", "a", "control", "for", "loading", ".", "Shown", "is", "an", "IB", "which", "is", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ",", "E", ")", "taf12", "and", "tetrads", ",", "which", "correspond", "to", "differentiated", "cells", ",", "were", "counted", "from", "heterothallic", "cells", "mixed", "and", "incubated", "for", "2", "days", "on", "mating", "medium", "(", "E", ")", ".", "Cells", "of", "the", "following", "genotypes", "were", "analyzed", ":", "wild", "-", "type", "isogenic", "controls", "(", "WT", ")", ",", "taf12", "-", "5A", ",", "taf12", "-", "5DE", ",", "tor1", "-", "1972A", ",", "and", "taf12", "-", "5A", "tor1", "-", "1972A", ".", "Each", "value", "represents", "the", "mean", "percentage", "and", "SE", "of", "differentiating", "cells", "to", "the", "total", "number", "of", "cells", ",", "averaged", "from", "6", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "from", "the", "indicated", "genotypes", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "2", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A,B) Expression of quantitative RT-PCR+ (A) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 2 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT) and taf12-5A mutants. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 6 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 6).mei2+ (B) using quantitative RT-PCR of RNA extracted from cells grown either in rich medium (dark gray) or starved for 2 hours (light grey). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT) and taf12-5A mutants. act1+ served as a control for normalization across samples. Values from a WT strain grown in rich medium were set at 1 to allow comparisons across culture conditions and mutant strains. Each column represents the mean value of 6 independent experiments, overlaid with individual data points and SE. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison tests (n = 6).(C,E) Zygotes and tetrads, which correspond to differentiated cells, were counted from cultures of homothallic cells grown to mid-log phase in rich medium (t0) and shifted to starvation medium for up to 24 hours (C) Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), taf12-5A, taf12-5DE, tor1-1972A, and taf12-5A tor1-1972A. Each value represents the mean percentage and SE of differentiating cells to the total number of cells, averaged from 6 independent experiments. At least 200 cells from the indicated genotypes were counted in each experiment. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison tests (n = 6).(D) P-Taf12 was followed by anti-FLAG IB of protein extracts from WT and tor1-1972A strains, grown in rich medium and shifted to starved conditions for 60 minutes. An anti-Tubulin IB is shown as a control for loading. Shown is an IB which is representative of 2 independent experiments.(C,E) taf12 and tetrads, which correspond to differentiated cells, were counted from heterothallic cells mixed and incubated for 2 days on mating medium (E). Cells of the following genotypes were analyzed: wild-type isogenic controls (WT), taf12-5A, taf12-5DE, tor1-1972A, and taf12-5A tor1-1972A. Each value represents the mean percentage and SE of differentiating cells to the total number of cells, averaged from 6 independent experiments. At least 200 cells from the indicated genotypes were counted in each experiment. Statistical significance was determined by 2-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison tests (n = 6)."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "IL", "-", "8", "production", "after", "6", "h", "of", "treatment", "with", "digitonin", "and", "βHBP", "at", "indicated", "concentrations", "or", "digitonin", "and", "wt", "S", ".", "flexneri", "lysate", "in", "HeLa", "cells", "(", "Hoechst", "in", "blue", ",", "IL", "-", "8", "in", "red", ")", "after", "6", "h", "of", "treatment", "with", "digitonin", "and", "βHBP", "at", "indicated", "concentrations", "or", "digitonin", "and", "wt", "S", ".", "flexneri", "lysate", "in", "HeLa", "cell", "B", ")", "Quantification", "of", "IL", "-", "8", "awith", "digitonin", "and", "βHBP", "at", "indicated", "concentrations", "or", "digitonin", "and", "wt", "S", ".", "flexneri", "lysat", "C", ")", "TIFA", "oligomerization", "at", "6", "h", "in", "TIFA", "-", "GFP", "-", "expressing", "HeLa", "cells", "treatewith", "digitonin", "and", "βHBP", "at", "indicated", "concentrations", "or", "digitonin", "and", "wt", "S", ".", "flexneri", "lysat", "at", "6", "h", "in", "TIFA", "-", "GFP", "-", "expressing", "HeLa", "cells", "treate", "D", ")", "Quantification", "of", "TIFA", "oligomerizatiowith", "digitonin", "and", "βHBP", "at", "indicated", "concentrations", "or", "digitonin", "and", "wt", "S", ".", "flexneri", "lysat", "E", ")", "TIFA", "oligomerization", "at", "30", "min", "in", "cells", "treateF", ")", "Kinetics", "of", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "upon", "treatment", "with", "digitonin", "alone", "or", "in", "combination", "with", "βHBP", "or", "S", ".", "flexneri"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) IL-8 production after 6 h of treatment with digitonin and βHBP at indicated concentrations or digitonin and wt S. flexneri lysate in HeLa cells (Hoechst in blue, IL-8 in red)after 6 h of treatment with digitonin and βHBP at indicated concentrations or digitonin and wt S. flexneri lysate in HeLa cell B) Quantification of IL-8 awith digitonin and βHBP at indicated concentrations or digitonin and wt S. flexneri lysat C) TIFA oligomerization at 6 h in TIFA-GFP-expressing HeLa cells treatewith digitonin and βHBP at indicated concentrations or digitonin and wt S. flexneri lysat at 6 h in TIFA-GFP-expressing HeLa cells treate D) Quantification of TIFA oligomerizatiowith digitonin and βHBP at indicated concentrations or digitonin and wt S. flexneri lysat E) TIFA oligomerization at 30 min in cells treateF) Kinetics of TIFA-GFP oligomerization upon treatment with digitonin alone or in combination with βHBP or S. flexneri lysate"}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "at", "30", "min", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "digitonin", "(", "mock", ")", "or", "digitonin", "and", "a", "lysate", "from", "indicated", "S", ".", "flexneri", "strains", "(", "pHldA", "/", "C", "means", "plasmid", "-", "encoded", "HldA", "and", "HldC", ")", "with", "digitonin", "(", "mock", ")", "or", "digitonin", "and", "a", "lysate", "from", "indicated", "S", ".", "flexneri", "strain", "(", "pHldA", "/", "C", "means", "plasmid", "-", "encoded", "HldA", "and", "HldC", ")", "C", ")", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "at", "6", "h", "in", "cells", "treatewith", "digitonin", "(", "mock", ")", "or", "digitonin", "and", "a", "lysate", "from", "indicated", "S", ".", "flexneri", "strains", "(", "pHldA", "/", "C", "means", "plasmid", "-", "encoded", "HldA", "and", "HldC", ")", "D", ")", "IL", "-", "8", "production", "at", "6", "h", "in", "cells", "were", "treateE", ")", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "in", "cells", "treated", "for", "30", "min", "with", "digitonin", "alone", ",", "digitonin", "and", "wild", "-", "type", "S", ".", "flexneri", "lysate", "or", "digitonin", "and", "ADP", "-", "L", "-", "β", "-", "d", "-", "heptose", "at", "indicated", "concentrationswith", "digitonin", "alone", ",", "digitonin", "and", "wild", "-", "type", "S", ".", "flexneri", "lysate", "or", "digitonin", "and", "ADP", "-", "L", "-", "β", "-", "d", "-", "heptose", "at", "indicated", "concentrations", ".", "F", ")", "IL", "-", "8", "production", "after", "6", "h", "in", "cells"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) TIFA-GFP oligomerization at 30 min in HeLa cells treated with digitonin (mock) or digitonin and a lysate from indicated S. flexneri strains (pHldA/C means plasmid-encoded HldA and HldC)with digitonin (mock) or digitonin and a lysate from indicated S. flexneri strain (pHldA/C means plasmid-encoded HldA and HldC) C) TIFA-GFP oligomerization at 6 h in cells treatewith digitonin (mock) or digitonin and a lysate from indicated S. flexneri strains (pHldA/C means plasmid-encoded HldA and HldC) D) IL-8 production at 6 h in cells were treateE) TIFA-GFP oligomerization in cells treated for 30 min with digitonin alone, digitonin and wild-type S. flexneri lysate or digitonin and ADP-L-β-d-heptose at indicated concentrationswith digitonin alone, digitonin and wild-type S. flexneri lysate or digitonin and ADP-L-β-d-heptose at indicated concentrations. F) IL-8 production after 6 h in cells treate"}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Representative", "images", "of", "the", "formation", "of", "TIFA", "oligomers", "in", "HeLa", "cells", "infected", "for", "30", "min", "with", "dsRed", "-", "expressing", "wt", "or", "indicated", "mutants", "of", "S", ".", "flexneri", "(", "MOI", "50", ")", ".", "pHldA", "/", "C", "means", "plasmid", "-", "encoded", "HldA", "and", "HldC", ".", "Fluorescence", "intensity", "was", "adjusted", "between", "strains", "to", "optimize", "visualization", "of", "bacteria", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μmB", ")", "Infectivity", "of", "indicated", "S", ".", "flexneri", "strainsC", ")", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "after", "30", "min", "of", "infection", "with", "selected", "mutants", "of", "the", "LPS", "biosynthesis", "pathway", "(", "MOI", "10", ")", "of", "the", "LPS", "biosynthesis", "pathway", "(", "MOI", "10", ")", ".", "D", ")", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "after", "4", "h", "of", "infection", "with", "the", "S", ".", "flexneri", "mutantE", ")", "IL", "-", "8", "production", "4", "h", "post", "infection", "(", "MOI", "5", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Representative images of the formation of TIFA oligomers in HeLa cells infected for 30 min with dsRed-expressing wt or indicated mutants of S. flexneri (MOI 50). pHldA/C means plasmid-encoded HldA and HldC. Fluorescence intensity was adjusted between strains to optimize visualization of bacteria. Scale bar, 20 μmB) Infectivity of indicated S. flexneri strainsC) TIFA-GFP oligomerization after 30 min of infection with selected mutants of the LPS biosynthesis pathway (MOI 10)of the LPS biosynthesis pathway (MOI 10). D) TIFA-GFP oligomerization after 4 h of infection with the S. flexneri mutantE) IL-8 production 4 h post infection (MOI 5)"}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "ADP", "-", "heptose", "-", "induced", "TIFA", "-", "GFP", "oligomerization", "depends", "on", "ALPK1", ".", "After", "siRNA", "transfection", ",", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "pCMV", "or", "pCMV", "-", "ALPK1", "as", "indicated", ".", "They", "were", "then", "infected", "with", "wt", "S", ".", "flexneri", "(", "MOI", "10", ")", "or", "treated", "with", "digitonin", "and", "ADP", "-", "heptose", "(", "10", "-", "5", "M", ")", "for", "30", "min", ".", "As", "control", ",", "cells", "were", "left", "untreated", "(", "mock", ")", "or", "treated", "with", "digitoninADP", "-", "heptose", "-", "induced", "cytokine", "secretion", "is", "ALPK1", "-", "dependent", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "ALPK1", "-", "targeting", "siRNAs", "and", "infected", "with", "wt", "S", ".", "flexneri", "(", "MOI", "2", ")", "or", "treated", "with", "ADP", "-", "heptose", "(", "10", "-", "5", "M", ")", ".", "As", "control", ",", "cells", "were", "left", "untreated", "(", "mock", ")", "or", "treated", "with", "digitonin", ".", "Cytokines", "were", "measured", "in", "cell", "culture", "supernatants", "after", "8"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) ADP-heptose-induced TIFA-GFP oligomerization depends on ALPK1. After siRNA transfection, HeLa cells were transfected with empty pCMV or pCMV-ALPK1 as indicated. They were then infected with wt S. flexneri (MOI 10) or treated with digitonin and ADP-heptose (10-5 M) for 30 min. As control, cells were left untreated (mock) or treated with digitoninADP-heptose-induced cytokine secretion is ALPK1-dependent. HeLa cells were transfected with control or ALPK1-targeting siRNAs and infected with wt S. flexneri (MOI 2) or treated with ADP-heptose (10-5 M). As control, cells were left untreated (mock) or treated with digitonin. Cytokines were measured in cell culture supernatants after 8 h"}
{"words": ["Figure", "1Representative", "flow", "cytometry", "data", "showing", "surface", "phenotypes", "of", "DCs", "sorted", "from", "spleens", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "and", "treated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "48", "hours", ".", "ELISA", "of", "cytokines", "in", "culture", "supernatants", "of", "DCs", "treatedThe", "intracellular", "production", "of", "IFN", "-", "γ", "and", "IL", "-", "17", "by", "CD4", "+", "T", "cells", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "treatedcytokines", "in", "culture", "supernatants", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "treatedthymidine", "incorporation", "proliferation", "assay", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "treatedCFSE", "proliferation", "assay", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative flow cytometry data showing surface phenotypes of DCs sorted from spleens of wild type (WT) or Nlrc3-/- mice and treated with LPS (100 ng/ml) for 48 hours.ELISA of cytokines in culture supernatants of DCs treatedThe intracellular production of IFN-γ and IL-17 by CD4+ T cells among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treatedcytokines in culture supernatants among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treatedthymidine incorporation proliferation assay among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treatedCFSE proliferation assay among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treated"}
{"words": ["Figure", "2WT", "and", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Mean", "clinical", "scores", "of", "EAE", "in", "immunized", "WT", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "data", "showing", "intracellular", "production", "of", "IFN", "-", "γ", "and", "IL", "-", "17A", "by", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "the", "spinal", "cord", "and", "brain", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", "after", "restimulation", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", ".", "Pooled", "data", "are", "presented", "in", "the", "right", "panel", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "data", "showing", "surface", "phenotypes", "of", "DCs", "from", "spleens", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ".", "Expression", "of", "Nlrc3", ",", "Il12", ",", "Il6", ",", "Il23", "and", "Il27", "mRNA", "in", "DCs", "sorted", "from", "WT", "and", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ",", "presented", "relative", "to", "that", "of", "Gapdh", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2WT and Nlrc3-/- mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Mean clinical scores of EAE in immunized WT (n= 10) and Nlrc3-/- mice (n= 10).Representative flow cytometry data showing intracellular production of IFN-γ and IL-17A by CD4+ T cells from the spinal cord and brain of WT or Nlrc3-/- mice 26 d after EAE induction after restimulation with MOG(35-55) peptide. Pooled data are presented in the right panel.Representative flow cytometry data showing surface phenotypes of DCs from spleens of WT or Nlrc3-/- mice 26 d after EAE induction.Expression of Nlrc3, Il12, Il6, Il23 and Il27 mRNA in DCs sorted from WT and Nlrc3-/- mice 26 d after EAE induction, presented relative to that of Gapdh."}
{"words": ["Figure", "3DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Mean", "clinical", "scores", "of", "EAE", "in", "immunized", "DC", "(", "WT", ")", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "data", "showing", "intracellular", "production", "of", "IFN", "-", "γ", "and", "IL", "-", "17A", "by", "CD4", "+", "T", "cells", "in", "the", "spinal", "cord", "and", "brain", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", "after", "restimulation", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", ".", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Recall", "response", "to", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "by", "splenocytes", "isolated", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ".", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Expression", "of", "Il12", ",", "Il6", ",", "Il23", "and", "Il27", "mRNA", "in", "DCs", "sorted", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ",", "presented", "relative", "to", "that", "of", "Gapdh", ".", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "CFSE", "proliferation", "assay", "of", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "sorted", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ".", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "cytokine", "secretion", "of", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "sorted", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Mean clinical scores of EAE in immunized DC(WT) (n= 5) and DC(NLRC3-KO) mice (n= 5).DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Representative flow cytometry data showing intracellular production of IFN-γ and IL-17A by CD4+ T cells in the spinal cord and brain from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction after restimulation with MOG(35-55) peptide.DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Recall response to MOG(35-55) by splenocytes isolated from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction.DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Expression of Il12, Il6, Il23 and Il27 mRNA in DCs sorted from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction, presented relative to that of Gapdh.DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. CFSE proliferation assay of naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs sorted from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction.DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. cytokine secretion of naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs sorted from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction."}
{"words": ["Figure", "4DCs", "were", "sorted", "from", "spleens", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", ".", "Purified", "DCs", "were", "treated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "specified", "time", ".", "DC", "lysates", "were", "probed", "for", "phosphorylated", "p65", "(", "p", "-", "p65", ")", ",", "total", "p65", ",", "p", "-", "AKT", ",", "AKT", ",", "p", "-", "p38", ",", "p38", ",", "p", "-", "ERK", ",", "ERK", ",", "p", "-", "JNK", ",", "JNK", "and", "GAPDH", ".", "DCs", "were", "sorted", "from", "spleens", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", ".", "Purified", "DCs", "were", "treated", "for", "48", "hours", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "p38", "inhibitor", "SB203580", "(", "10", "μM", "or", "indicated", "concentrations", ")", ".", "Concentrations", "of", "IL", "-", "12", ",", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "23", "and", "IL", "-", "27", "in", "supernatants", "were", "detected", "by", "ELISA", ".", "DCs", "were", "sorted", "from", "spleens", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", ".", "Purified", "DCs", "were", "treated", "for", "48", "hours", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "p38", "inhibitor", "SB203580", "(", "10", "μM", "or", "indicated", "concentrations", ")", ".", "Cytokines", "in", "culture", "supernatants", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", ".", "NC", ":", "negative", "control", ".", "DCs", "were", "sorted", "from", "spleens", "of", "WT", "or", "Nlrc3", "-", "/", "-", "mice", ".", "Purified", "DCs", "were", "treated", "for", "48", "hours", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "p38", "inhibitor", "SB203580", "(", "10", "μM", "or", "indicated", "concentrations", ")", ".", "CFSE", "proliferation", "assay", "(", "D", ")", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", ".", "NC", ":", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4DCs were sorted from spleens of WT or Nlrc3-/- mice. Purified DCs were treated with LPS (100 ng/ml) for specified time. DC lysates were probed for phosphorylated p65 (p-p65), total p65, p-AKT, AKT, p-p38, p38, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK and GAPDH.DCs were sorted from spleens of WT or Nlrc3-/- mice. Purified DCs were treated for 48 hours with LPS (100 ng/ml) in the presence or absence of the p38 inhibitor SB203580 (10 μM or indicated concentrations). Concentrations of IL-12, IL-6, IL-23 and IL-27 in supernatants were detected by ELISA.DCs were sorted from spleens of WT or Nlrc3-/- mice. Purified DCs were treated for 48 hours with LPS (100 ng/ml) in the presence or absence of the p38 inhibitor SB203580 (10 μM or indicated concentrations). Cytokines in culture supernatants among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs. NC: negative control.DCs were sorted from spleens of WT or Nlrc3-/- mice. Purified DCs were treated for 48 hours with LPS (100 ng/ml) in the presence or absence of the p38 inhibitor SB203580 (10 μM or indicated concentrations). CFSE proliferation assay (D) among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs. NC: negative control."}
{"words": ["Figure", "5Activity", "phosphorylation", "of", "p38", "were", "detected", "in", "DCs", "in", "the", "spleens", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ".", "Pooled", "data", "are", "presented", "in", "the", "right", "panel", ".", "DC", "(", "p38", "-", "KO", ")", "and", "DC", "(", "p38", "+", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Mean", "clinical", "scores", "of", "EAE", "in", "immunized", "DC", "(", "WT", ")", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "DC", "(", "p38", "-", "KO", ")", "and", "DC", "(", "p38", "+", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Frequencies", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "that", "express", "IFN", "-", "γ", "and", "IL", "-", "17A", "in", "the", "spinal", "cord", "and", "brain", "from", "DC", "(", "WT", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", "after", "restimulation", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", ".", "Pooled", "data", "are", "presented", "in", "the", "right", "panel", ".", "DC", "(", "p38", "-", "KO", ")", "and", "DC", "(", "p38", "+", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "were", "immunized", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "peptide", "in", "CFA", "adjuvant", "and", "pertussis", "toxin", "to", "induce", "EAE", ".", "Expression", "of", "Il12", ",", "Il6", "and", "Il23", "mRNA", "in", "DCs", "sorted", "from", "spleens", "of", "DC", "(", "WT", ")", ",", "DC", "(", "NLRC3", "-", "KO", ")", ",", "DC", "(", "p38", "-", "KO", ")", "and", "DC", "(", "p38", "+", "NLRC3", "-", "KO", ")", "mice", "26", "d", "after", "EAE", "induction", ",", "presented", "relative", "to", "that", "of", "Gapdh", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Activity phosphorylation of p38 were detected in DCs in the spleens from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction. Pooled data are presented in the right panel.DC(p38-KO) and DC(p38+NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Mean clinical scores of EAE in immunized DC(WT) (n= 5) and DC(NLRC3-KO) mice (n= 5).DC(p38-KO) and DC(p38+NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Frequencies of CD4+ T cells that express IFN-γ and IL-17A in the spinal cord and brain from DC(WT) and DC(NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction after restimulation with MOG(35-55) peptide. Pooled data are presented in the right panel.DC(p38-KO) and DC(p38+NLRC3-KO) mice were immunized with MOG(35-55) peptide in CFA adjuvant and pertussis toxin to induce EAE. Expression of Il12, Il6 and Il23 mRNA in DCs sorted from spleens of DC(WT), DC(NLRC3-KO), DC(p38-KO) and DC(p38+NLRC3-KO) mice 26 d after EAE induction, presented relative to that of Gapdh."}
{"words": ["Figure", "6DC", "(", "Ctrl", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "OE", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "specified", "time", ".", "DC", "lysates", "were", "probed", "for", "p", "-", "p38", ",", "p38", ",", "NLRC3", "and", "GAPDH", ".", "Densitometry", "quantification", "of", "band", "intensity", "were", "presented", "in", "the", "right", "panel", ".", "DC", "(", "Ctrl", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "OE", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "specified", "time", ".", "Enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "of", "cytokines", "in", "culture", "supernatants", "of", "DCs", "treated", "with", "LPS", "for", "48", "hours", ".", "DC", "(", "Ctrl", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "OE", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "specified", "time", ".", "Cytokines", "in", "culture", "supernatants", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "treated", "with", "LPS", "for", "48", "hours", ".", "DC", "(", "Ctrl", ")", "and", "DC", "(", "NLRC3", "-", "OE", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "specified", "time", ".", "CFSE", "proliferation", "assay", "(", "D", ")", "among", "naive", "2D2", "CD4", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "plus", "DCs", "treated", "with", "LPS", "for", "48", "hours", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6DC(Ctrl) and DC(NLRC3-OE) were stimulated with LPS (100 ng/ml) for specified time. DC lysates were probed for p-p38, p38, NLRC3 and GAPDH. Densitometry quantification of band intensity were presented in the right panel.DC(Ctrl) and DC(NLRC3-OE) were stimulated with LPS (100 ng/ml) for specified time. Enzyme-linked immunosorbent assay of cytokines in culture supernatants of DCs treated with LPS for 48 hours.DC(Ctrl) and DC(NLRC3-OE) were stimulated with LPS (100 ng/ml) for specified time. Cytokines in culture supernatants among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treated with LPS for 48 hours.DC(Ctrl) and DC(NLRC3-OE) were stimulated with LPS (100 ng/ml) for specified time. CFSE proliferation assay (D) among naive 2D2 CD4+ T cells stimulated with MOG(35-55) plus DCs treated with LPS for 48 hours."}
{"words": ["Figure", "7EAE", "was", "induced", "by", "immunization", "of", "naive", "B6", "mice", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", ",", "and", "the", "mice", "were", "randomly", "divided", "into", "five", "groups", ".", "BMDCs", "transduced", "with", "either", "lentiviral", "vector", "encoding", "GFP", "and", "NLRC3", "(", "LV", "-", "NLRC3", ")", "or", "only", "GFP", "(", "LV", "-", "Ctrl", ")", "were", "administered", "i", ".", "v", ".", "4", "times", ",", "once", "every", "4", "days", ",", "starting", "at", "day", "10", "after", "EAE", "induction", ".", "Mean", "clinical", "scores", "of", "EAE", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "Arrows", "indicate", "DC", "vaccine", "administration", ".", "EAE", "was", "induced", "by", "immunization", "of", "naive", "B6", "mice", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", ",", "and", "the", "mice", "were", "randomly", "divided", "into", "five", "groups", ".", "BMDCs", "transduced", "with", "either", "lentiviral", "vector", "encoding", "GFP", "and", "NLRC3", "(", "LV", "-", "NLRC3", ")", "or", "only", "GFP", "(", "LV", "-", "Ctrl", ")", "were", "administered", "i", ".", "v", ".", "4", "times", ",", "once", "every", "4", "days", ",", "starting", "at", "day", "10", "after", "EAE", "induction", ".", "Recall", "proliferative", "to", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "in", "splenocytes", "taken", "from", "DCs", "-", "treated", "mice", "26", "days", "after", "EAE", "induction", ".", "EAE", "was", "induced", "by", "immunization", "of", "naive", "B6", "mice", "with", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", ",", "and", "the", "mice", "were", "randomly", "divided", "into", "five", "groups", ".", "BMDCs", "transduced", "with", "either", "lentiviral", "vector", "encoding", "GFP", "and", "NLRC3", "(", "LV", "-", "NLRC3", ")", "or", "only", "GFP", "(", "LV", "-", "Ctrl", ")", "were", "administered", "i", ".", "v", ".", "4", "times", ",", "once", "every", "4", "days", ",", "starting", "at", "day", "10", "after", "EAE", "induction", ".", "cytokine", "response", "(", "D", ")", "to", "MOG", "(", "35", "-", "55", ")", "in", "splenocytes", "taken", "from", "DCs", "-", "treated", "mice", "26", "days", "after", "EAE", "induction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7EAE was induced by immunization of naive B6 mice with MOG (35-55), and the mice were randomly divided into five groups. BMDCs transduced with either lentiviral vector encoding GFP and NLRC3 (LV-NLRC3) or only GFP (LV-Ctrl) were administered i.v. 4 times, once every 4 days, starting at day 10 after EAE induction. Mean clinical scores of EAE (n= 5 mice per group ). Arrows indicate DC vaccine administration.EAE was induced by immunization of naive B6 mice with MOG (35-55), and the mice were randomly divided into five groups. BMDCs transduced with either lentiviral vector encoding GFP and NLRC3 (LV-NLRC3) or only GFP (LV-Ctrl) were administered i.v. 4 times, once every 4 days, starting at day 10 after EAE induction. Recall proliferative to MOG (35-55) in splenocytes taken from DCs-treated mice 26 days after EAE induction.EAE was induced by immunization of naive B6 mice with MOG (35-55), and the mice were randomly divided into five groups. BMDCs transduced with either lentiviral vector encoding GFP and NLRC3 (LV-NLRC3) or only GFP (LV-Ctrl) were administered i.v. 4 times, once every 4 days, starting at day 10 after EAE induction. cytokine response (D) to MOG (35-55) in splenocytes taken from DCs-treated mice 26 days after EAE induction."}
{"words": ["Figure", "2Starvation", "triggers", "accumulation", "of", "nucleosides", ",", "bases", "and", "S7P", ".", "Wild", "‐", "type", "S", ".", "cerevisiae", "cells", "growing", "in", "minimal", "media", "were", "switched", "to", "minimal", "media", "containing", "no", "carbon", ",", "no", "nitrogen", "or", "no", "phosphate", ".", "After", "the", "indicated", "duration", "of", "starvation", ",", "the", "metabolome", "was", "quantified", "by", "LC", "‐", "MS", ".", "For", "media", "composition", ",", "see", "Supplementary", "Table", "S2", ".", "For", "the", "list", "of", "absolute", "concentration", "of", "metabolties", ",", "see", "Supplementary", "Table", "S3", ".", "Data", "are", "shown", "in", "heat", "map", "format", ",", "with", "each", "line", "reflecting", "the", "dynamics", "of", "a", "particular", "compound", "in", "a", "particular", "culture", "condition", ".", "Metabolite", "levels", "of", "biological", "duplicates", "were", "averaged", ",", "normalized", "to", "cells", "growing", "steadily", "in", "glucose", "(", "time", "zero", ")", ",", "and", "the", "resulting", "fold", "changes", "log2", "transformed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Starvation triggers accumulation of nucleosides, bases and S7P. Wild‐type S. cerevisiae cells growing in minimal media were switched to minimal media containing no carbon, no nitrogen or no phosphate. After the indicated duration of starvation, the metabolome was quantified by LC‐MS. For media composition, see Supplementary Table S2. For the list of absolute concentration of metabolties, see Supplementary Table S3. Data are shown in heat map format, with each line reflecting the dynamics of a particular compound in a particular culture condition. Metabolite levels of biological duplicates were averaged, normalized to cells growing steadily in glucose (time zero), and the resulting fold changes log2 transformed."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Experimental", "design", "for", "demonstrating", "metabolite", "production", "via", "macromolecule", "degradation", ".", "Yeast", "cells", "were", "grown", "on", "2", "%", "unlabeled", "glucose", ",", "and", "then", "switched", "to", "U", "‐", "13C", "‐", "glucose", "for", "70", " ", "min", ",", "which", "completely", "labels", "free", "metabolite", "but", "only", "partially", "labels", "macromolecules", ".", "Thereafter", ",", "glucose", "was", "removed", "and", "the", "metabolome", "analyzed", "by", "LC", "‐", "MS", ".", "(", "B", ")", "Fraction", "of", "unlabeled", "nucleosides", ",", "nucleic", "bases", "and", "PPP", "intermediates", "as", "a", "function", "of", "starvation", "time", ",", "in", "wild", "‐", "type", "and", "autophagy", "deficient", "(", "atg7", "deletion", ")", "yeast", ".", "The", "x", "axis", "represents", "minutes", "after", "carbon", "starvation", ",", "and", "the", "y", "axis", "represents", "fraction", "of", "unlabeled", "metabolites", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "C", ")", "Ratio", "of", "metabolite", "levels", "in", "atg7", "strain", "versus", "wild", "‐", "type", "strain", "in", "carbon", "starvation", ".", "(", "D", ")", "Ratio", "of", "metabolite", "levels", "in", "bcy1", "strain", "and", "snf1", "strain", "versus", "wild", "‐", "type", "strain", "in", "carbon", "starvation", ".", "(", "E", ")", "Ratio", "of", "metabolite", "levels", "in", "rapamycin", "treatment", "versus", "nitrogen", "starvation", "for", "wild", "‐", "type", "yeast", ".", "In", "(", "C", ")", "to", "(", "E", ")", ",", "all", "reported", "values", "are", "log2", "transformed", "ratios", ";", "data", "are", "mean", "of", "duplicate", "samples", "at", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Experimental design for demonstrating metabolite production via macromolecule degradation. Yeast cells were grown on 2% unlabeled glucose, and then switched to U‐13C‐glucose for 70 min, which completely labels free metabolite but only partially labels macromolecules. Thereafter, glucose was removed and the metabolome analyzed by LC‐MS.(B) Fraction of unlabeled nucleosides, nucleic bases and PPP intermediates as a function of starvation time, in wild‐type and autophagy deficient (atg7 deletion) yeast. The x axis represents minutes after carbon starvation, and the y axis represents fraction of unlabeled metabolites (mean±range of N=2 biological replicates).(C) Ratio of metabolite levels in atg7 strain versus wild‐type strain in carbon starvation.(D) Ratio of metabolite levels in bcy1 strain and snf1 strain versus wild‐type strain in carbon starvation.(E) Ratio of metabolite levels in rapamycin treatment versus nitrogen starvation for wild‐type yeast. In (C) to (E), all reported values are log2 transformed ratios; data are mean of duplicate samples at each time point."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Ratio", "of", "metabolite", "levels", "in", "sdt1", "and", "phm8", "strains", "versus", "wild", "‐", "type", "strain", "in", "carbon", "starvation", ".", "All", "reported", "values", "are", "log2", "transformed", "ratios", ";", "data", "are", "mean", "of", "duplicate", "samples", "at", "each", "time", "point", ".", "(", "B", ")", "Summary", "of", "transcripts", "data", "of", "PHM8", ",", "SDT1", "and", "other", "enzymes", "in", "the", "pathway", "(", "Gasch", "et", "al", ",", "2000", ";", "Bradley", "et", "al", ",", "2009", ";", "Klosinska", "et", "al", ",", "2011", ")", ".", "All", "values", "are", "log2", "transformed", "fold", "changes", ".", "(", "C", ")", "Screening", "of", "Phm8", "'", "s", "phosphatase", "activity", "against", "90", "phosphorylated", "compounds", ".", "Phosphatase", "activity", "was", "measured", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "5", " ", "mM", "substrate", "and", "5", " ", "mM", "Mg2", "+", "(", "pH", "=", "7", ".", "0", ",", "30", "°", "C", ")", ".", "Compounds", "with", "specific", "activity", "higher", "than", "0", ".", "1", " ", "μmol", "/", "mg", "/", "min", "are", "shown", ".", "The", "x", "axis", "represents", "specific", "phosphatase", "activity", "(", "μmol", "of", "phosphate", "produced", "per", "minute", "per", "mg", "of", "enzyme", ",", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "replicates", ")", ".", "(", "D", ")", "Top", "table", ":", "absolute", "intracellular", "concentration", "of", "nucleotide", "monophosphates", "in", "carbon", "starvation", ".", "Bottom", "plots", ":", "Phosphatase", "activity", "of", "Phm8", "and", "Sdt1", "as", "a", "function", "of", "CMP", "concentration", ".", "The", "x", "axis", "represents", "CMP", "concentration", "and", "the", "y", "axis", "represents", "specific", "phosphatase", "activity", "(", "μmol", "of", "phosphate", "produced", "per", "minute", "per", "mg", "of", "enzyme", ",", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Ratio of metabolite levels in sdt1 and phm8 strains versus wild‐type strain in carbon starvation. All reported values are log2 transformed ratios; data are mean of duplicate samples at each time point.(B) Summary of transcripts data of PHM8, SDT1 and other enzymes in the pathway (Gasch et al, 2000; Bradley et al, 2009; Klosinska et al, 2011). All values are log2 transformed fold changes.(C) Screening of Phm8's phosphatase activity against 90 phosphorylated compounds. Phosphatase activity was measured in the presence of 0.5 mM substrate and 5 mM Mg2+ (pH=7.0, 30°C). Compounds with specific activity higher than 0.1 μmol/mg/min are shown. The x axis represents specific phosphatase activity (μmol of phosphate produced per minute per mg of enzyme, mean±range of N=2 replicates).(D) Top table: absolute intracellular concentration of nucleotide monophosphates in carbon starvation. Bottom plots: Phosphatase activity of Phm8 and Sdt1 as a function of CMP concentration. The x axis represents CMP concentration and the y axis represents specific phosphatase activity (μmol of phosphate produced per minute per mg of enzyme, mean±range of N=2 replicates)."}
{"words": ["Figure", "5Confirmation", "that", "Pnp1", "is", "the", "physiological", "purine", "nucleoside", "phosphorylase", ",", "Urh1", "is", "the", "pyrimidine", "hydrolase", ",", "and", "Prm15", "(", "Pgm3", ")", "is", "the", "phosphoribomutase", ".", "Ratio", "of", "metabolite", "levels", "in", "pnp1", "/", "urh1", ",", "pnp1", ",", "urh1", "and", "prm15", "(", "pgm3", ")", "strains", "versus", "wild", "‐", "type", "strain", "during", "carbon", "starvation", ".", "Data", "are", "shown", "in", "heat", "map", "format", ",", "with", "each", "line", "reflecting", "the", "dynamics", "of", "the", "ratio", "of", "the", "metabolite", "levels", "in", "a", "particular", "strain", "versus", "wild", "‐", "type", "strain", ".", "All", "reported", "values", "are", "log2", "transformed", "ratios", ";", "data", "are", "mean", "of", "duplicate", "samples", "at", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Confirmation that Pnp1 is the physiological purine nucleoside phosphorylase, Urh1 is the pyrimidine hydrolase, and Prm15 (Pgm3) is the phosphoribomutase. Ratio of metabolite levels in pnp1/urh1, pnp1, urh1 and prm15 (pgm3) strains versus wild‐type strain during carbon starvation. Data are shown in heat map format, with each line reflecting the dynamics of the ratio of the metabolite levels in a particular strain versus wild‐type strain. All reported values are log2 transformed ratios; data are mean of duplicate samples at each time point."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", "‐", "E", ")", "DHAP", ",", "SBP", "and", "S7P", "levels", "in", "wild", "type", ",", "tkl1", "/", "tkl2", "(", "B", ")", ",", "tal1", "/", "nqm1", "(", "C", ")", "and", "pfk1", "(", "E", ")", "strains", "upon", "carbon", "starvation", ",", "and", "wild", "‐", "type", "strain", "upon", "abruptly", "switching", "from", "glucose", "to", "no", "carbon", "(", "WT", ")", "versus", "to", "dihydroxyacetone", "(", "WT", "+", "DHA", ")", "as", "the", "sole", "carbon", "source", "(", "D", ")", ".", "The", "x", "axis", "represents", "hours", "after", "carbon", "starvation", ",", "and", "the", "logarithmic", "y", "axis", "represents", "absolute", "intracellular", "concentration", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B‐E) DHAP, SBP and S7P levels in wild type, tkl1/tkl2 (B), tal1/nqm1 (C) and pfk1 (E) strains upon carbon starvation, and wild‐type strain upon abruptly switching from glucose to no carbon (WT) versus to dihydroxyacetone (WT+DHA) as the sole carbon source (D). The x axis represents hours after carbon starvation, and the logarithmic y axis represents absolute intracellular concentration (mean±range of N=2 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Level", "of", "hallmark", "metabolites", "and", "energy", "charge", "in", "wild", "type", ",", "phm8", "and", "pnp1", "/", "urh1", "strains", "in", "starvation", ".", "The", "x", "axis", "represents", "hours", "after", "starvation", ",", "and", "the", "logarithmic", "y", "axis", "represents", "energy", "charge", "(", "[", "ATP", "]", "+", "0", ".", "5", "[", "ADP", "]", "/", "(", "[", "ATP", "]", "+", "[", "ADP", "]", "+", "[", "AMP", "]", ")", "or", "absolute", "intracellular", "concentration", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Growth", "and", "viability", "of", "wild", "type", ",", "phm8", "and", "pnp1", "/", "urh1", "strains", "in", "starvation", ".", "(", "D", ")", "Growth", "of", "wild", "type", ",", "phm8", "and", "pnp1", "/", "urh1", "strains", "in", "the", "switch", "from", "glucose", "to", "glycerol", "+", "ethanol", ".", "The", "x", "axis", "represents", "hours", "after", "starvation", "and", "the", "logarithmic", "y", "axis", "represents", "optical", "density", "(", "A600", ")", "in", "(", "B", "and", "D", ")", "and", "percentage", "of", "live", "cells", "calculated", "by", "dividing", "the", "number", "of", "colonies", "formed", "after", "starvation", "by", "the", "number", "of", "colonies", "formed", "before", "starvation", "in", "(", "C", ")", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Level of hallmark metabolites and energy charge in wild type, phm8 and pnp1/urh1 strains in starvation. The x axis represents hours after starvation, and the logarithmic y axis represents energy charge ([ATP]+0.5[ADP]/([ATP]+[ADP]+[AMP]) or absolute intracellular concentration (mean±range of N=2 biological replicates).(B and C) Growth and viability of wild type, phm8 and pnp1/urh1 strains in starvation.(D) Growth of wild type, phm8 and pnp1/urh1 strains in the switch from glucose to glycerol+ethanol. The x axis represents hours after starvation and the logarithmic y axis represents optical density (A600) in (B and D) and percentage of live cells calculated by dividing the number of colonies formed after starvation by the number of colonies formed before starvation in (C) (mean±range of N=2 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", "and", "D", ")", "DHAP", ",", "S7P", ",", "G6P", ",", "and", "glutathione", "levels", "and", "NADPH", "/", "NADP", "+", "ratio", "in", "wild", "type", ",", "phm8", "and", "pnp1", "/", "urh1", "strains", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "(", "A", ")", "The", "x", "axis", "represents", "minutes", "after", "oxidative", "stress", ",", "and", "the", "y", "axis", "represents", "absolute", "intracellular", "concentration", "or", "ratio", "of", "intracellular", "concentration", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "E", ")", "Viability", "of", "wild", "type", ",", "phm8", "and", "pnp1", "/", "urh1", "strains", "in", "oxidative", "stress", ".", "The", "y", "axis", "represents", "percentage", "of", "survived", "cells", "calculated", "by", "dividing", "the", "number", "of", "colonies", "formed", "after", "oxidative", "stress", "by", "the", "number", "of", "colonies", "formed", "under", "the", "same", "starvation", "condition", "but", "without", "H2O2", "treatment", "(", "mean", "±", "range", "of", "N", "=", "2", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C and D) DHAP, S7P, G6P, and glutathione levels and NADPH/NADP+ ratio in wild type, phm8 and pnp1/urh1 strains in the experiment shown in (A) The x axis represents minutes after oxidative stress, and the y axis represents absolute intracellular concentration or ratio of intracellular concentration (mean±range of N=2 biological replicates).(E) Viability of wild type, phm8 and pnp1/urh1 strains in oxidative stress. The y axis represents percentage of survived cells calculated by dividing the number of colonies formed after oxidative stress by the number of colonies formed under the same starvation condition but without H2O2 treatment (mean±range of N=2 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "2", "Fluorescence", "intensity", "of", "the", "FRET", "donor", "(", "GFP", ")", "is", "shown", "before", "and", "after", "photobleaching", "of", "the", "FRET", "acceptor", "(", "mCherry", ")", "in", "ImageJ", "Smart", "pseudocolor", "scheme", "(", "for", "intensity", "values", "see", "bars", "on", "the", "right", ")", ".", "FRET", "is", "observed", "as", "an", "increase", "of", "donor", "fluorescence", "after", "acceptor", "photobleaching", ".", "The", "indicated", "GFP", "-", "and", "mCherry", "-", "tagged", "endocytic", "proteins", "localize", "at", "the", "endocytic", "patches", "on", "the", "plasma", "membrane", "of", "live", "yeast", "cells", ".", "The", "enrichment", "of", "individual", "endocytic", "patches", "(", "diameter", "of", "50", "-", "80", "nm", ")", "on", "the", "plasma", "membrane", ",", "caused", "by", "the", "latA", "-", "induced", "block", "of", "their", "subsequent", "invagination", "and", "/", "or", "their", "higher", "abundance", "at", "incipient", "buds", ",", "resulted", "in", "their", "apparent", "clustering", "on", "the", "diffraction", "-", "limited", "fluorescence", "images", "(", "pixel", "size", ",", "178", "nm", ")", ".", "All", "raw", "acquisitions", "of", "GFP", "fluorescence", "intensities", "before", "and", "after", "photobleaching", "are", "shown"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Fluorescence intensity of the FRET donor (GFP) is shown before and after photobleaching of the FRET acceptor (mCherry) in ImageJ Smart pseudocolor scheme (for intensity values see bars on the right). FRET is observed as an increase of donor fluorescence after acceptor photobleaching. The indicated GFP- and mCherry-tagged endocytic proteins localize at the endocytic patches on the plasma membrane of live yeast cells. The enrichment of individual endocytic patches (diameter of 50-80 nm) on the plasma membrane, caused by the latA-induced block of their subsequent invagination and/or their higher abundance at incipient buds, resulted in their apparent clustering on the diffraction-limited fluorescence images (pixel size, 178 nm). All raw acquisitions of GFP fluorescence intensities before and after photobleaching are shown "}
{"words": ["Figure", "4", "Partial", "loss", "of", "FRET", "between", "Ent1", "-", "mTurquoise2", "and", "Sla1", "-", "mNeonGreen", "during", "endocytic", "membrane", "invagination", ".", "FRET", "values", "(", "in", "%", ")", "of", "individual", "endocytic", "patches", "(", "n", "=", "74", ",", "75", ";", "69", ",", "73", "for", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "respectively", ")", "sorted", "according", "to", "the", "absence", "/", "presence", "of", "Abp1", "protein", "are", "shown", "as", "box", "plots", ".", "Center", ",", "top", "and", "bottom", "lines", "of", "box", "plots", "show", "the", "medians", ",", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "of", "individual", "datasets", ",", "respectively", ".", "Whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Notches", "indicate", "95", "%", "confidence", "intervals", "of", "the", "medians", ".", "presence", "of", "FRET", "between", "Ent1", "-", "mTurquoise2", "and", "Sla2", "-", "mNeonGreen", "during", "endocytic", "membrane", "invagination", ".", "FRET", "values", "(", "in", "%", ")", "of", "individual", "endocytic", "patches", "(", "n", "=", "74", ",", "75", ";", "69", ",", "73", "for", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "respectively", ")", "sorted", "according", "to", "the", "absence", "/", "presence", "of", "Abp1", "protein", "are", "shown", "as", "box", "plots", ".", "Center", ",", "top", "and", "bottom", "lines", "of", "box", "plots", "show", "the", "medians", ",", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "of", "individual", "datasets", ",", "respectively", ".", "Whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Notches", "indicate", "95", "%", "confidence", "intervals", "of", "the", "medians", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Partial loss of FRET between Ent1-mTurquoise2 and Sla1-mNeonGreen during endocytic membrane invagination. FRET values (in %) of individual endocytic patches (n=74, 75; 69, 73 for (B) and (C), respectively) sorted according to the absence/presence of Abp1 protein are shown as box plots. Center, top and bottom lines of box plots show the medians, the 25th and 75th percentiles of individual datasets, respectively. Whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Notches indicate 95% confidence intervals of the medians.  presence of FRET between Ent1-mTurquoise2 and Sla2-mNeonGreen during endocytic membrane invagination. FRET values (in %) of individual endocytic patches (n=74, 75; 69, 73 for (B) and (C), respectively) sorted according to the absence/presence of Abp1 protein are shown as box plots. Center, top and bottom lines of box plots show the medians, the 25th and 75th percentiles of individual datasets, respectively. Whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Notches indicate 95% confidence intervals of the medians. "}
{"words": ["Figure", "5", "Ede1", ",", "Apl1", ",", "Yap1801", ",", "Gts1", ",", "Bzz1", ",", "Lsb3", ",", "Las17", ",", "and", "Vrp1", "proteins", "tagged", "with", "mNeonGreen", "were", "photobleached", "in", "individual", "endocytic", "sites", "of", "LatA", "-", "treated", "cells", "and", "fluorescence", "recovery", "was", "followed", "every", "0", ".", "5", "s", "for", "60", "s", "(", "40", "s", "in", "case", "of", "the", "highly", "dynamic", "Bzz1", "protein", ")", ".", "The", "curves", "represent", "means", "±", "95", "%", "confidence", "intervals", "(", "n", "=", "9", "-", "17", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 Ede1, Apl1, Yap1801, Gts1, Bzz1, Lsb3, Las17, and Vrp1 proteins tagged with mNeonGreen were photobleached in individual endocytic sites of LatA-treated cells and fluorescence recovery was followed every 0.5 s for 60 s (40 s in case of the highly dynamic Bzz1 protein). The curves represent means ± 95% confidence intervals (n = 9-17). "}
{"words": ["Figure", "1C", ")", "RNA", "binding", "-", "deficient", "TDP", "-", "43", "mutants", "generated", "by", "site", "-", "directed", "substitutions", "in", "RRM1", "(", "F2L", ")", "or", "in", "both", "RRM", "domains", "(", "F4L", ")", "and", "substitution", "of", "RRM1", "and", "RRM2", "with", "monomeric", "GFP", "(", "N", "-", "GFP", "-", "C", ")", ".", "Phase", "separation", "of", "the", "mutants", "without", "added", "RNA", "(", "control", ")", "or", "in", "the", "presence", "A", "(", "GU", ")", "6", "(", "8", "μM", ")", ",", "A", "(", "GU", ")", "18", "(", "2", ".", "6", "μM", ")", ",", "or", "A", "(", "CA", ")", "6", "(", "8", "μM", ")", "at", "150", "mM", "NaCl", "(", "4", "µM", "protein", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C) RNA binding-deficient TDP-43 mutants generated by site-directed substitutions in RRM1 (F2L) or in both RRM domains (F4L) and substitution of RRM1 and RRM2 with monomeric GFP (N-GFP-C). Phase separation of the mutants without added RNA (control) or in the presence A(GU)6 (8 μM), A(GU)18 (2.6 μM), or A(CA)6 (8 μM) at 150 mM NaCl (4 µM protein)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "TDP", "-", "43", "condensates", "in", "the", "presence", "of", "the", "different", "RNA", "sequences", ".", "TDP", "-", "43", "and", "RNA", "oligonucleotide", "concentration", "is", "4", "μM", "and", "3", ".", "9", "μM", ",", "respectively", ".", "Representative", "images", "for", "3", "biological", "replicates", "using", "2", "different", "protein", "preparations", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "C", ")", "LLPS", "measured", "by", "turbidity", "in", "the", "same", "experimental", "conditions", "as", "panel", "B", ".", "Mean", "and", "SD", "from", "3", "biological", "replicates", "with", "2", "different", "protein", "preparations", ".", "D", ")", "Lysate", "from", "HEK", "293", "cells", "expressing", "a", "GFP", "-", "tagged", "copy", "of", "either", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "F147", "/", "149", "/", "229", "/", "231L", "(", "F4L", ")", "TDP", "-", "43", "was", "added", "to", "a", "mixture", "of", "recombinant", "WT", "or", "F4L", "TDP", "-", "43", "(", "5", ".", "3", "μM", ",", "10", "%", "Cy3", "-", "labeled", "protein", ")", "and", "A", "(", "GU", ")", "6", "(", "22", ".", "8", "μM", ")", ",", "A", "(", "CA", ")", "18", "(", "7", ".", "6", "μM", ")", ",", "A", "(", "GU", ")", "18", "(", "7", ".", "6", "μM", ")", ",", "or", "no", "RNA", "control", "at", "250", "mM", "NaCl", ".", "Droplets", "were", "imaged", "by", "brightfield", "and", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "for", "3", "biological", "replicates", "using", "2", "protein", "preparations", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "E", ")", "LLPS", "measured", "by", "turbidity", "in", "the", "same", "experimental", "conditions", "as", "panel", "D", ".", "Mean", "and", "SD", "of", "4", "biological", "replicates", "using", "2", "recombinant", "protein", "preparations", ".", "Analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "F", "(", "7", ",", "24", ")", "=", "69", ".", "30", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "used", "to", "compare", "selected", "groups", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) TDP-43 condensates in the presence of the different RNA sequences. TDP-43 and RNA oligonucleotide concentration is 4 μM and 3.9 μM, respectively. Representative images for 3 biological replicates using 2 different protein preparations. Scale bars, 10 μm. C) LLPS measured by turbidity in the same experimental conditions as panel B. Mean and SD from 3 biological replicates with 2 different protein preparations. D) Lysate from HEK 293 cells expressing a GFP-tagged copy of either wild-type (WT) or F147/149/229/231L (F4L) TDP-43 was added to a mixture of recombinant WT or F4L TDP-43 (5.3 μM, 10% Cy3-labeled protein) and A(GU)6 (22.8 μM), A(CA)18 (7.6 μM), A(GU)18 (7.6 μM), or no RNA control at 250 mM NaCl. Droplets were imaged by brightfield and fluorescence microscopy. Representative images for 3 biological replicates using 2 protein preparations. Scale bars, 10 μm. E) LLPS measured by turbidity in the same experimental conditions as panel D. Mean and SD of 4 biological replicates using 2 recombinant protein preparations. Analyzed by one-way ANOVA (F(7,24)=69.30, P<0.0001). Sidak's multiple comparisons test was used to compare selected groups. *P<0.05, ****P<0.0001. "}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Liquid", "droplets", "observed", "by", "brightfield", "and", "fluorescence", "microscopy", "when", "Oregon", "green", "labeled", "TDP", "-", "43", "(", "4", "μM", ",", "10", "%", "labeled", "protein", ")", "was", "mixed", "with", "no", "RNA", "control", "or", "increasing", "A", "(", "GU", ")", "18", "RNA", "concentration", "at", "250", "mM", "salt", ".", "Representative", "images", "from", "3", "biological", "replicates", "using", "2", "different", "protein", "preparations", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "D", ")", "Phase", "separation", "of", "TDP", "-", "43", "(", "4", "μM", ")", "at", "increasing", "salt", "concentration", "without", "RNA", "or", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "A", "(", "GU", ")", "18", "concentration", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Inlay", "added", "to", "top", "right", "panel", "for", "increased", "visibility", ",", "scale", "bar", "1", "μm", ".", "E", ")", "Phase", "diagram", "derived", "from", "panel", "D", ",", "denoting", "either", "no", "droplets", "or", "droplet", "formation", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Liquid droplets observed by brightfield and fluorescence microscopy when Oregon green labeled TDP-43 (4 μM, 10% labeled protein) was mixed with no RNA control or increasing A(GU)18 RNA concentration at 250 mM salt. Representative images from 3 biological replicates using 2 different protein preparations. Scale bars, 10 μm.D) Phase separation of TDP-43 (4 μM) at increasing salt concentration without RNA or in the presence of increasing A(GU)18 concentration. Scale bars, 10 μm. Inlay added to top right panel for increased visibility, scale bar 1 μm. E) Phase diagram derived from panel D, denoting either no droplets or droplet formation for each condition. "}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "TDP", "-", "43", "droplets", "observed", "by", "brightfield", "and", "fluorescence", "microscopy", "when", "Oregon", "green", "labeled", "TDP", "-", "43", "(", "4", "μM", ",", "10", "%", "labeled", "protein", ")", "was", "mixed", "with", "no", "RNA", "control", "or", "GU", "-", "repeat", "RNA", "oligonucleotides", "of", "increasing", "length", "at", "250", "mM", "salt", ".", "As", "indicated", ",", "RNA", "concentration", "varied", "to", "maintain", "a", "constant", "total", "number", "of", "TDP", "-", "43", "binding", "sites", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "B", ")", "The", "plot", "shows", "droplet", "area", "quantified", "as", "a", "function", "of", "GU", "-", "repeat", "length", ".", "Mean", "and", "SD", "of", ">", "300", "droplets", "from", "3", "biological", "replicates", "using", "3", "different", "protein", "preparations", ".", "C", ")", "TDP", "-", "43", "concentration", "in", "the", "light", "phase", "(", "Cout", ")", "as", "a", "function", "of", "GU", "(", "blue", ")", "or", "CA", "(", "red", ")", "-", "repeat", "length", "quantified", "by", "Bradford", "protein", "assay", ".", "Mean", "and", "SD", "from", ">", "5", "biological", "replicates", "using", "2", "different", "protein", "preparations", ".", "(", "250", "mM", "NaCl", ",", "4", "µM", "TDP", "-", "43", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) TDP-43 droplets observed by brightfield and fluorescence microscopy when Oregon green labeled TDP-43 (4 μM, 10% labeled protein) was mixed with no RNA control or GU-repeat RNA oligonucleotides of increasing length at 250 mM salt. As indicated, RNA concentration varied to maintain a constant total number of TDP-43 binding sites. Scale bars, 10 μm. B) The plot shows droplet area quantified as a function of GU-repeat length. Mean and SD of >300 droplets from 3 biological replicates using 3 different protein preparations. C) TDP-43 concentration in the light phase (Cout) as a function of GU (blue) or CA (red)-repeat length quantified by Bradford protein assay. Mean and SD from >5 biological replicates using 2 different protein preparations. (250 mM NaCl, 4 µM TDP-43) "}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "Phase", "separation", "of", "full", "-", "length", "and", "TDP", "-", "43", "variants", "(", "4", "μM", ")", "mixed", "with", "A", "(", "GU", ")", "30", "RNA", "(", "0", ".", "8", "μM", ")", "or", "no", "RNA", "control", "at", "250", "mM", "NaCl", "observed", "by", "brightfield", "microscopy", ".", "Representative", "images", "for", "3", "biological", "replicates", "using", "2", "different", "protein", "preparations", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) Phase separation of full-length and TDP-43 variants (4 μM) mixed with A(GU)30 RNA (0.8 μM) or no RNA control at 250 mM NaCl observed by brightfield microscopy. Representative images for 3 biological replicates using 2 different protein preparations. Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "TDP", "-", "43", "ALS", "-", "linked", "amino", "acid", "substitutions", "K181E", ",", "A315T", "/", "E", ",", "A321G", ",", "Q331K", ",", "M337V", ",", "and", "A382T", ".", "Boxed", "in", "the", "C", "-", "terminal", "domain", "is", "the", "α", "-", "helical", "structure", "within", "the", "conserved", "region", "(", "a", ".", "a", ".", "320", "-", "343", ")", ".", "Droplets", "formed", "by", "TDP", "-", "43", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "the", "different", "mutants", "(", "4", "μM", ")", "observed", "by", "brightfield", "microscopy", "in", "the", "presence", "of", "no", "RNA", "control", "or", "A", "(", "GU", ")", "18", "RNA", "(", "3", ".", "9", "μM", ")", "at", "250", "mM", "NaCl", ".", "Mutations", "A321G", "and", "M337V", ",", "showing", "decreased", "liquidity", "of", "the", "condensates", "in", "the", "presence", "of", "A", "(", "GU", ")", "18", ",", "are", "boxed", "in", "red", ".", "Representative", "images", "for", "3", "biological", "replicates", "using", "3", "different", "protein", "preparations", "of", "WT", "and", "M337V", ",", "2", "preparations", "of", "A321G", ",", "Q331K", ",", "K181E", "and", "one", "preparation", "of", "A315T", "/", "E", "and", "A382T", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "B", ")", "Phase", "separation", "of", "WT", "(", "4", "μM", ",", "10", "%", "Oregon", "green", "-", "labeled", "protein", ")", "and", "M337V", "(", "4", "μM", ",", "10", "%", "Cy", "-", "3", "-", "labeled", "protein", ")", "observed", "by", "brightfield", "and", "fluorescence", "microscopy", "in", "the", "presence", "of", "A", "(", "GU", ")", "18", "(", "3", ".", "9", "μM", ")", "at", "250", "mM", "NaCl", ".", "The", "middle", "panel", "shows", "mixing", "of", "these", "WT", "(", "2", "μM", ")", "and", "M337V", "(", "2", "μM", ")", "samples", ".", "Representative", "images", "for", "3", "biological", "replicates", "using", "2", "protein", "preparations", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) TDP-43 ALS-linked amino acid substitutions K181E, A315T/E, A321G, Q331K, M337V, and A382T. Boxed in the C-terminal domain is the α-helical structure within the conserved region (a.a. 320-343). Droplets formed by TDP-43 wild-type (WT) and the different mutants (4 μM) observed by brightfield microscopy in the presence of no RNA control or A(GU)18 RNA (3.9 μM) at 250 mM NaCl. Mutations A321G and M337V, showing decreased liquidity of the condensates in the presence of A(GU)18, are boxed in red. Representative images for 3 biological replicates using 3 different protein preparations of WT and M337V, 2 preparations of A321G, Q331K, K181E and one preparation of A315T/E and A382T. Scale bars, 10 μm.B) Phase separation of WT (4 μM, 10% Oregon green-labeled protein) and M337V (4 μM, 10% Cy-3-labeled protein) observed by brightfield and fluorescence microscopy in the presence of A(GU)18 (3.9 μM) at 250 mM NaCl. The middle panel shows mixing of these WT (2 μM) and M337V (2 μM) samples. Representative images for 3 biological replicates using 2 protein preparations. Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Binding", "of", "TDP", "-", "43", "to", "GU", "-", "rich", "RNA", "promotes", "liquid", "properties", "of", "TDP", "-", "43", "condensates", ",", "as", "shown", "by", "the", "fusion", "of", "small", "condensates", "into", "larger", "droplets", ".", "This", "fluidity", "is", "impaired", "by", "the", "loss", "of", "RNA", "binding", "affinity", "or", "disease", "-", "linked", "mutations", "that", "alter", "phase", "separation", ",", "such", "as", "M337V", "and", "A321G", ",", "which", "could", "explain", "increased", "TDP", "-", "43", "aggregation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Binding of TDP-43 to GU-rich RNA promotes liquid properties of TDP-43 condensates, as shown by the fusion of small condensates into larger droplets. This fluidity is impaired by the loss of RNA binding affinity or disease-linked mutations that alter phase separation, such as M337V and A321G, which could explain increased TDP-43 aggregation."}
{"words": ["Figure", "1stoichiometry", "'", "s", "for", "B56α", "measured", "by", "ITC", ".", "Global", "direct", "fitting", "shown", "for", "one", "experiment", "(", "reverse", ")", ".", "Each", "dot", "is", "the", "integrated", "heat", "per", "injection", "and", "the", "error", "bars", "represent", "uncertainty", "with", "this", "integrated", "value", ".", "The", "experiment", "was", "done", "in", "both", "direct", "(", "B56", "in", "cell", ")", "and", "reverse", "(", "B56", "in", "syringe", ")", "with", "similar", "results", ".", "C", ")", "Time", "from", "Nuclear", "envelope", "breakdown", "(", "NEBD", ")", "to", "mitotic", "exit", "of", "cells", "expressing", "the", "indicated", "B56", "inhibitors", "with", "each", "circle", "representing", "a", "single", "cell", ".", "Only", "cells", "with", "similar", "expression", "levels", "of", "the", "various", "B56", "inhibitor", "constructs", "were", "analysed", ".", "Median", "time", "is", "indicated", "by", "red", "line", ".", "­", "A", "representative", "result", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "At", "least", "25", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "in", "the", "experiment", "shown", ".", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "‐", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "ns", ":", "non", "‐", "significant", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ")", ".", "D", ")", "Volcano", "plot", "representing", "mass", "spectrometry", "identified", "proteins", "co", "-", "purifying", "with", "B56", "inhibitor", "versus", "control", "inhibitor", "from", "HeLa", "cells", ".", "PP2A", "-", "B56", "subunits", "co", "-", "purifying", "with", "the", "B56", "inhibitor", "are", "indicated", ".", "E", ")", "and", "F", ")", "Competition", "assay", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "RFP", "-", "tagged", "B56", "inhibitor", "(", "LxxIxE", ")", "or", "control", "inhibitor", "(", "AxxAxA", ")", ".", "YFP", "-", "B56α", "was", "transfected", "into", "and", "subsequently", "purified", "from", "these", "cell", "lines", ".", "Loss", "of", "binding", "of", "indicated", "proteins", "determined", "by", "either", "mass", "spectrometry", "(", "pink", "-", "B56", "SLIM", "containing", "protein", "and", "known", "B56", "interactor", ";", "blue", "-", "known", "B56", "interactor", ",", "green", "-", "B56", "SLIM", "containing", "protein", ")", "(", "E", ")", "or", "Western", "blotting", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1stoichiometry's for B56α measured by ITC. Global direct fitting shown for one experiment (reverse). Each dot is the integrated heat per injection and the error bars represent uncertainty with this integrated value. The experiment was done in both direct (B56 in cell) and reverse (B56 in syringe) with similar results.C) Time from Nuclear envelope breakdown (NEBD) to mitotic exit of cells expressing the indicated B56 inhibitors with each circle representing a single cell. Only cells with similar expression levels of the various B56 inhibitor constructs were analysed. Median time is indicated by red line. ­A representative result from at least three independent experiments is shown. At least 25 cells were counted per condition in the experiment shown. A Mann-Whitney U‐test was used for statistical analysis (ns: non‐significant, ***P ≤ 0.001).D) Volcano plot representing mass spectrometry identified proteins co-purifying with B56 inhibitor versus control inhibitor from HeLa cells. PP2A-B56 subunits co-purifying with the B56 inhibitor are indicated.E) and F) Competition assay in HeLa cells stably expressing RFP-tagged B56 inhibitor (LxxIxE) or control inhibitor (AxxAxA). YFP-B56α was transfected into and subsequently purified from these cell lines. Loss of binding of indicated proteins determined by either mass spectrometry (pink - B56 SLIM containing protein and known B56 interactor; blue - known B56 interactor, green - B56 SLIM containing protein) (E) or Western blotting (F)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "B", ")", "Schematic", "of", "synchronisation", "protocol", "for", "G1", "/", "S", "(", "A", ")", "or", "mitotic", "(", "B", ")", "arrested", "cells", "and", "accompanying", "volcano", "plot", "of", "phosphorylation", "sites", "quantified", ".", "The", "phosphorylation", "sites", "showing", "an", "increase", "in", "the", "presence", "of", "the", "B56", "inhibitor", "are", "shown", "in", "light", "grey", ".", "Phosphorylation", "sites", "in", "a", "protein", "containing", "an", "LxxIxE", "motif", "are", "coloured", "pink", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-B) Schematic of synchronisation protocol for G1/S (A) or mitotic (B) arrested cells and accompanying volcano plot of phosphorylation sites quantified. The phosphorylation sites showing an increase in the presence of the B56 inhibitor are shown in light grey. Phosphorylation sites in a protein containing an LxxIxE motif are coloured pink."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetic", "parameters", "of", "purified", "PP2A", "-", "B56α", "and", "PP2A", "-", "B55α", "holoenzymes", "were", "determined", "against", "the", "indicated", "phospho", "-", "peptides", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "B", "-", "D", ")", "In", "vitro", "dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B55α", "and", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzymes", "of", "panels", "of", "phosphorylated", "peptides", "as", "indicated", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Michaelis-Menten kinetic parameters of purified PP2A-B56α and PP2A-B55α holoenzymes were determined against the indicated phospho-peptides. Mean and standard deviation shown in plots as black bars (n=3 independent experiments)B-D) In vitro dephosphorylation by the PP2A-B55α and PP2A-B56α holoenzymes of panels of phosphorylated peptides as indicated. Mean and standard deviation shown in plots as black bars (n=3 independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "4B", ")", "The", "indicated", "YFP", "-", "FoxO3", "constructs", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ",", "purified", "using", "YFP", "resin", "and", "PP2A", "-", "B56", "binding", "determined", "by", "Western", "blotting", ".", "PP2A", "-", "A", ";", "scaffold", "subunit", ".", "C", ")", "-", "D", ")", "YFP", "-", "FoxO3", "constructs", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "and", "lysates", "(", "pS413", ")", "or", "YFP", "purifications", "(", "pS253", ")", "were", "subjected", "to", "Western", "Blotting", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "phosphoantibodies", ".", "Quantifications", "arise", "from", "five", "(", "pS413", ")", "or", "three", "(", "pS253", ")", "independent", "experiments", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "shown", "in", "plots", "as", "black", "bars", ".", "E", ")", "Steady", "-", "state", "localization", "of", "the", "indicated", "YFP", "-", "FOXO3", "variants", "in", "HeLa", "cells", ".", "Each", "data", "point", "represents", "quantification", "from", "a", "single", "cell", ".", "­", "A", "representative", "result", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "At", "least", "25", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "in", "the", "experiment", "shown", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "significance", "values", ";", "∗", "p", "<", "0", ".", "02", ",", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "0002", ".", "F", ")", "Dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", "complex", "of", "substrates", "with", "increasing", "length", "between", "phosphorylation", "sites", "and", "binding", "motifs", "as", "depicted", ".", "Engineered", "substrates", "containing", "three", "TP", "sites", "were", "phosphorylated", "with", "radioactive", "ATP", "using", "Cdk1", "and", "incubated", "with", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", ".", "Removal", "of", "radioactive", "phosphate", "was", "monitored", "over", "time", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "from", "3", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B) The indicated YFP-FoxO3 constructs were transfected into HeLa cells, purified using YFP resin and PP2A-B56 binding determined by Western blotting. PP2A-A; scaffold subunit.C) - D) YFP-FoxO3 constructs were transfected into HeLa cells and lysates (pS413) or YFP purifications (pS253) were subjected to Western Blotting and probed with the indicated phosphoantibodies. Quantifications arise from five (pS413) or three (pS253) independent experiments. Mean and standard deviation shown in plots as black bars.E) Steady-state localization of the indicated YFP-FOXO3 variants in HeLa cells. Each data point represents quantification from a single cell. ­A representative result from at least three independent experiments is shown. At least 25 cells were counted per condition in the experiment shown. Scale bar is 10 μm. Mann-Whitney test significance values; ∗p < 0.02, ∗∗∗p < 0.0002.F) Dephosphorylation by the PP2A-B56α holoenzyme complex of substrates with increasing length between phosphorylation sites and binding motifs as depicted. Engineered substrates containing three TP sites were phosphorylated with radioactive ATP using Cdk1 and incubated with the PP2A-B56α holoenzyme. Removal of radioactive phosphate was monitored over time. Mean and standard deviation from 3 experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "KD", "values", "obtained", "by", "ITC", "measurements", "with", "full", "-", "length", "recombinant", "B56α", "and", "indicated", "ADAM17", "variant", "peptides", ".", "C", ")", "The", "indicated", "full", "-", "length", "murine", "Myc", "-", "ADAM17", "derivatives", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "B56α", ".", "YFP", "-", "B56α", "was", "purified", "(", "IP", ")", "and", "ADAM17", "binding", "determined", "by", "Western", "blotting", ".", "PP2A", "-", "C", ";", "catalytic", "subunit", ",", "PP2A", "-", "A", ";", "scaffold", "subunit", ".", "D", ")", "Dephosphorylation", "by", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", "complex", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "GST", "-", "ADAM17", "(", "V724", "-", "C827", ")", "fragments", ".", "The", "GST", "-", "ADAM17", "(", "V724", "-", "C827", ")", "substrates", "was", "phosphorylated", "with", "radioactive", "ATP", "using", "Protein", "Kinase", "A", "and", "incubated", "with", "the", "PP2A", "-", "B56α", "holoenzyme", ".", "Removal", "of", "radioactive", "phosphate", "was", "monitored", "over", "time", ".", "The", "mean", "and", "Standard", "deviation", "of", "4", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "E", ")", "Protein", "expression", "of", "ADAM17", "variants", "in", "the", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cell", "line", ",", "determined", "by", "Western", "blot", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "loading", "control", ".", "F", ")", "Amphiregulin", "(", "AREG", ")", "shedding", "measured", "by", "ELISA", "of", "conditioned", "media", "from", "untreated", ",", "H2O2", "treated", "or", "irradiated", "with", "x", "-", "ray", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "(", "clone", "#", "1", ")", "expressing", "full", "-", "length", "ADAM17", "variants", "(", "wt", ",", "I762A", "or", "LEE", ")", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "G", ")", "Exogenous", "wt", "and", "I762A", "full", "length", "ADAM17", "was", "immuno", "-", "purified", "from", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "treated", "with", "H2O2", "and", "subjected", "to", "label", "-", "free", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "to", "determine", "differential", "phosphorylation", "status", "of", "T735", "and", "S808", "(", "S811", "in", "murine", "ADAM17", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) KD values obtained by ITC measurements with full-length recombinant B56α and indicated ADAM17 variant peptides.C) The indicated full-length murine Myc-ADAM17 derivatives were transfected into HeLa cells stably expressing YFP-B56α. YFP-B56α was purified (IP) and ADAM17 binding determined by Western blotting. PP2A-C; catalytic subunit, PP2A-A; scaffold subunit.D) Dephosphorylation by the PP2A-B56α holoenzyme complex of the indicated phosphorylated GST-ADAM17 (V724-C827) fragments. The GST-ADAM17 (V724-C827) substrates was phosphorylated with radioactive ATP using Protein Kinase A and incubated with the PP2A-B56α holoenzyme. Removal of radioactive phosphate was monitored over time. The mean and Standard deviation of 4 independent experiments are shown.E) Protein expression of ADAM17 variants in the DLD-1 Adam17-/- cell line, determined by Western blot. GAPDH was used as an internal loading control.F) Amphiregulin (AREG) shedding measured by ELISA of conditioned media from untreated, H2O2 treated or irradiated with x-ray DLD-1 Adam17-/- cells (clone #1) expressing full-length ADAM17 variants (wt, I762A or LEE). Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Mean and standard deviation indicated from at least three independent experiments.G) Exogenous wt and I762A full length ADAM17 was immuno-purified from Adam17-/- cells treated with H2O2 and subjected to label-free LC-MS/MS to determine differential phosphorylation status of T735 and S808 (S811 in murine ADAM17)."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "EGFR", "activation", "in", "the", "ADAM17", "variant", "expressing", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "upon", "H2O2", "treatment", ",", "determined", "by", "Western", "blot", "and", "quantified", "below", "as", "the", "ratio", "of", "EGFR", "autophosphorylated", "at", "Tyr1068", "to", "total", "EGFR", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "B", ")", "Cell", "proliferation", "and", "C", ")", "Matrigel", "invasion", "of", "the", "ADAM17", "variant", "expressing", "DLD", "-", "1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "indicated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ")", "Protein", "expression", "of", "the", "ADAM17", "variants", "in", "the", "mouse", "breast", "cancer", "cell", "line", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", ",", "determined", "by", "Western", "blot", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "loading", "control", ".", "E", ")", "Average", "tumor", "volume", "±", "SEM", "of", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "the", "ADAM17", "variants", "injected", "into", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "Balb", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "Indicated", "significances", "are", "between", "the", "I762A", "and", "LEE", "tumors", ".", "Two", "sided", ",", "unpaired", "Students", "t", "-", "test", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Mean", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "indicated", ".", "F", ")", "Survival", "curve", "of", "the", "tumor", "bearing", "mice", "injected", "with", "4T1", "Adam17", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "the", "ADAM17", "variants", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "The", "indicated", "significances", "are", "between", "the", "LEE", "and", "wt", "tumor", "bearing", "mice", ",", "and", "the", "LEE", "and", "I762A", "tumor", "bearing", "mice", ".", "Log", "-", "rank", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "significant", "differences", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) EGFR activation in the ADAM17 variant expressing DLD-1 Adam17-/- cells upon H2O2 treatment, determined by Western blot and quantified below as the ratio of EGFR autophosphorylated at Tyr1068 to total EGFR. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01. Mean and standard deviation indicated from three independent experiments.(B, C) B) Cell proliferation and C) Matrigel invasion of the ADAM17 variant expressing DLD-1 Adam17-/- cells. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05, **p<0.01. Mean and standard deviation indicated from three independent experiments.D) Protein expression of the ADAM17 variants in the mouse breast cancer cell line 4T1 Adam17-/-, determined by Western blot. GAPDH was used as an internal loading control.E) Average tumor volume ± SEM of 4T1 Adam17-/- cells expressing the ADAM17 variants injected into the mammary fat pad of Balb/c mice (n=10 for each group). Indicated significances are between the I762A and LEE tumors. Two sided, unpaired Students t-test test was applied to test for significant differences *p<0.05. Mean and standard error of the mean indicated.F) Survival curve of the tumor bearing mice injected with 4T1 Adam17-/- cells expressing the ADAM17 variants (n=10 for each group). The indicated significances are between the LEE and wt tumor bearing mice, and the LEE and I762A tumor bearing mice. Log-rank test was applied to test for significant differences. *p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1A", "Western", "blot", "analysis", "of", "lysates", "from", "WT", "and", "MIC10", "KO", "or", "MIC60", "KO", "HAP1", "cells", ".", "MIC10", "KO", "cells", "show", "a", "drastic", "reduction", "of", "MIC13", ",", "MIC26", "and", "MIC27", "protein", "levels", "while", "protein", "levels", "of", "other", "MICOS", "components", "remain", "unchanged", ".", "MIC60", "KO", "cells", "show", "a", "drastic", "reduction", "of", "protein", "levels", "of", "all", "MICOS", "components", ".", "B", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "WT", ",", "MIC10", "KO", "and", "MIC60", "KO", "HAP1", "cells", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "C", "Quantification", "of", "CJs", "per", "mitochondrial", "section", "from", "different", "mitochondria", "in", "WT", ",", "MIC10", "and", "MIC60", "KO", "HAP1", "cells", "using", "EM", "represented", "as", "boxplots", ".", "Boxplots", "show", "median", "and", "interquartile", "range", "from", "25", "to", "75", "percentile", "and", "whiskers", "represent", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "Data", "from", "n", "=", "55", "-", "69", "mitochondria", "(", "from", "2", "independent", "experiments", ")", "are", "shown", "as", "data", "points", "in", "the", "boxplots", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Quantification", "of", "cristae", "per", "mitochondrial", "section", "from", "different", "mitochondria", "in", "WT", ",", "MIC10", "and", "MIC60", "KO", "HAP1", "cells", "using", "EM", "represented", "as", "boxplots", ".", "Boxplots", "show", "median", "and", "interquartile", "range", "from", "25", "to", "75", "percentile", "and", "whiskers", "represent", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "Data", "from", "n", "=", "55", "-", "69", "mitochondria", "(", "from", "2", "independent", "experiments", ")", "are", "shown", "as", "data", "points", "in", "the", "boxplots", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "Comparison", "of", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "pmol", "O2", "/", "s", ",", "normalized", "for", "cell", "numbers", "by", "Hoechst", "staining", ")", "of", "basal", ",", "proton", "leak", ",", "maximum", "and", "non", "-", "mitochondrial", "respiration", "in", "WT", "and", "MIC10", "KO", "cells", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "data", "is", "normalized", "to", "basal", "respiration", "from", "HAP1", "WT", ".", "Bar", "and", "error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "034", "for", "basal", "(", "using", "one", "sample", "t", "-", "test", ")", "and", "*", "P", "=", "0", ".", "018", "for", "maximum", "respiration", "(", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Comparison", "of", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "pmol", "O2", "/", "s", ",", "normalized", "for", "cell", "numbers", "by", "Hoechst", "staining", ")", "of", "basal", ",", "proton", "leak", ",", "maximum", "and", "non", "-", "mitochondrial", "respiration", "in", "WT", "and", "MIC60", "KO", "cells", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "data", "is", "normalized", "to", "basal", "respiration", "from", "HAP1", "WT", ".", "Bar", "and", "error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "01", "for", "basal", "(", "using", "one", "sample", "t", "-", "test", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", "for", "maximum", "respiration", "and", "*", "P", "=", "0", ".", "012", "for", "non", "-", "mitochondrial", "respiration", "(", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Western blot analysis of lysates from WT and MIC10 KO or MIC60 KO HAP1 cells. MIC10 KO cells show a drastic reduction of MIC13, MIC26 and MIC27 protein levels while protein levels of other MICOS components remain unchanged. MIC60 KO cells show a drastic reduction of protein levels of all MICOS components.B Representative electron micrographs of WT, MIC10 KO and MIC60 KO HAP1 cells. Scale bar 500 nm.C Quantification of CJs per mitochondrial section from different mitochondria in WT, MIC10 and MIC60 KO HAP1 cells using EM represented as boxplots. Boxplots show median and interquartile range from 25 to 75 percentile and whiskers represent minimum and maximum value. Data from n = 55-69 mitochondria (from 2 independent experiments) are shown as data points in the boxplots. ****P < 0.0001 (using unpaired Student's t-test).D Quantification of cristae per mitochondrial section from different mitochondria in WT, MIC10 and MIC60 KO HAP1 cells using EM represented as boxplots. Boxplots show median and interquartile range from 25 to 75 percentile and whiskers represent minimum and maximum value. Data from n = 55-69 mitochondria (from 2 independent experiments) are shown as data points in the boxplots. ****P < 0.0001 (using unpaired Student's t-test).E Comparison of oxygen consumption rates (pmol O2/s, normalized for cell numbers by Hoechst staining) of basal, proton leak, maximum and non-mitochondrial respiration in WT and MIC10 KO cells obtained from 3 independent experiments. The data is normalized to basal respiration from HAP1 WT. Bar and error bar represent mean ± SEM from 3 independent experiments. *P = 0.034 for basal (using one sample t-test) and *P = 0.018 for maximum respiration (using unpaired Student's t-test).F Comparison of oxygen consumption rates (pmol O2/s, normalized for cell numbers by Hoechst staining) of basal, proton leak, maximum and non-mitochondrial respiration in WT and MIC60 KO cells obtained from 3 independent experiments. The data is normalized to basal respiration from HAP1 WT. Bar and error bar represent mean ± SEM from 3 independent experiments. *P = 0.01 for basal (using one sample t-test), ***P = 0.0004 for maximum respiration and *P = 0.012 for non-mitochondrial respiration (using unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Representative", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "of", "WT", "and", "MIC10", "KO", "HAP1", "cells", "immunostained", "with", "MIC60", "or", "MIC10", "antibodies", "(", "top", "panel", ")", "and", "TOMM70", "(", "middle", "panel", ")", ".", "Bottom", "panel", "shows", "merged", "images", ".", "Arrowheads", "show", "colocalization", "of", "MIC60", "and", "TOMM70", "punctae", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "B", "Quantification", "of", "median", "interpunctae", "distance", "(", "IPD", ")", "per", "mitochondrion", "between", "MIC60", "or", "MIC10", "punctae", "in", "indicated", "cell", "lines", "represented", "by", "boxplots", ".", "Boxplots", "show", "median", "and", "interquartile", "range", "from", "25", "to", "75", "percentile", "and", "whiskers", "represent", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "Median", "IPD", "from", "n", "=", "10", "-", "16", "mitochondria", "(", "from", "2", "independent", "experiments", ")", "are", "shown", "as", "data", "points", "in", "the", "boxplots", ".", "ns", ",", "not", "significant", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Representative STED super-resolution images of WT and MIC10 KO HAP1 cells immunostained with MIC60 or MIC10 antibodies (top panel) and TOMM70 (middle panel). Bottom panel shows merged images. Arrowheads show colocalization of MIC60 and TOMM70 punctae. Scale bar 500 nm.B Quantification of median interpunctae distance (IPD) per mitochondrion between MIC60 or MIC10 punctae in indicated cell lines represented by boxplots. Boxplots show median and interquartile range from 25 to 75 percentile and whiskers represent minimum and maximum value. Median IPD from n = 10-16 mitochondria (from 2 independent experiments) are shown as data points in the boxplots. ns, not significant, unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3FRAP", "curves", "(", "curve", "fitted", ")", "of", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "fusion", "proteins", "of", "MIC60", "(", "CJs", ")", ",", "MIC10", "(", "CJs", ")", ",", "TOMM20", "(", "OM", ")", ",", "TIMM23", "(", "IBM", ")", "and", "ATP5I", "(", "CM", ")", ".", "Average", "FRAP", "curves", "(", "intensities", "in", "arbitrary", "units", ")", "for", "each", "marker", "were", "obtained", "(", "3", "independent", "experiments", ",", "6", "-", "10", "mitochondria", "for", "each", "experiment", ")", ".", "Error", "bars", "for", "each", "time", "point", "representing", "SEM", "are", "shown", ".", "C", "FRAP", "curves", "(", "curve", "fitted", ")", "of", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "fusion", "proteins", "of", "MIC60", "(", "CJs", ")", ",", "MIC10", "(", "CJs", ")", ",", "TOMM20", "(", "OM", ")", ",", "TIMM23", "(", "IBM", ")", "and", "ATP5I", "(", "CM", ")", ".", "Average", "FRAP", "curves", "(", "intensities", "in", "arbitrary", "units", ")", "for", "each", "marker", "were", "obtained", "(", "3", "independent", "experiments", ",", "6", "-", "10", "mitochondria", "for", "each", "experiment", ")", ".", "Error", "bars", "for", "each", "time", "point", "representing", "SEM", "are", "shown", ".", "D", "Histogram", "showing", "average", "percentage", "of", "mobile", "fractions", ",", "obtained", "from", "curve", "fits", "of", "all", "mitochondria", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "versions", "of", "MIC60", "(", "CJs", ")", ",", "MIC10", "(", "CJs", ")", ",", "TOMM20", "(", "OM", ")", ",", "TIMM23", "(", "IBM", ")", "and", "ATP5I", "(", "CM", ")", "in", "WT", "and", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "(", "data", "calculated", "from", "FRAP", "curves", "shown", "in", "Figure", "3B", "and", "3C", "that", "are", "obtained", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "6", "-", "10", "mitochondria", "from", "each", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3FRAP curves (curve fitted) of WT Hela cells expressing GFP-tagged fusion proteins of MIC60 (CJs), MIC10 (CJs), TOMM20 (OM), TIMM23 (IBM) and ATP5I (CM). Average FRAP curves (intensities in arbitrary units) for each marker were obtained (3 independent experiments, 6-10 mitochondria for each experiment). Error bars for each time point representing SEM are shown.C FRAP curves (curve fitted) of MIC13 KO Hela cells expressing GFP-tagged fusion proteins of MIC60 (CJs), MIC10 (CJs), TOMM20 (OM), TIMM23 (IBM) and ATP5I (CM). Average FRAP curves (intensities in arbitrary units) for each marker were obtained (3 independent experiments, 6-10 mitochondria for each experiment). Error bars for each time point representing SEM are shown.D Histogram showing average percentage of mobile fractions, obtained from curve fits of all mitochondria expressing GFP-tagged versions of MIC60 (CJs), MIC10 (CJs), TOMM20 (OM), TIMM23 (IBM) and ATP5I (CM) in WT and MIC13 KO Hela cells (data calculated from FRAP curves shown in Figure 3B and 3C that are obtained from 3 independent experiments, 6-10 mitochondria from each experiment)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "Representative", "single", "particle", "tracks", "of", "cells", "expressing", "MIC60", "-", "(", "A", ")", "and", "MIC10", "-", "SNAP", "(", "B", ")", "in", "WT", "Hela", "cells", "and", "MIC60", "-", "(", "C", ")", "and", "MIC10", "-", "SNAP", "(", "D", ")", "in", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", ",", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", "dye", ",", "and", "imaged", "at", "a", "rate", "of", "33", "ms", "/", "frame", ".", "Single", "tracks", "were", "colour", "-", "coded", "according", "to", "temporal", "appearance", ".", "Scale", "Bar", "5", "µm", ".", "Insets", "in", "each", "image", "show", "zoomed", "-", "in", "images", "of", "few", "representative", "tracks", ".", "E", "Cumulative", "frequency", "of", "tracks", "having", "corresponding", "values", "of", "instantaneous", "diffusion", "coefficients", "(", "insD", ")", "in", "WT", "and", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "MIC60", "-", "and", "MIC10", "-", "SNAP", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Number", "of", "tracks", "analysed", "(", "obtained", "from", "2", "independent", "experiments", ")", ":", "n", "=", "2541", ",", "2540", ",", "3560", "and", "1441", "in", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "MIC60", "-", "SNAP", "and", "MIC10", "-", "SNAP", ",", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "MIC60", "-", "SNAP", "and", "MIC10", "-", "SNAP", ",", "respectively", ".", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "for", "all", "possible", "comparisons", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Percentage", "of", "subtracks", "having", "directed", "motion", "in", "WT", "and", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "MIC60", "-", "and", "MIC10", "-", "SNAP", "and", "in", "WT", "and", "MIC60", "KO", "HAP1", "cells", "expressing", "MIC10", "-", "SNAP", ".", "Number", "of", "corresponding", "subtracks", "analysed", "(", "obtained", "from", "2", "independent", "experiments", ")", ":", "n", "=", "2561", ",", "2443", ",", "3402", ",", "1360", ",", "561", "and", "1110", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D Representative single particle tracks of cells expressing MIC60- (A) and MIC10-SNAP (B) in WT Hela cells and MIC60- (C) and MIC10-SNAP (D) in MIC13 KO Hela cells, stained with silicone-rhodamine dye, and imaged at a rate of 33 ms/frame. Single tracks were colour-coded according to temporal appearance. Scale Bar 5 µm. Insets in each image show zoomed-in images of few representative tracks.E Cumulative frequency of tracks having corresponding values of instantaneous diffusion coefficients (insD) in WT and MIC13 KO Hela cells expressing MIC60- and MIC10-SNAP stained with silicone-rhodamine. Number of tracks analysed (obtained from 2 independent experiments): n = 2541, 2540, 3560 and 1441 in WT Hela cells expressing MIC60-SNAP and MIC10-SNAP, MIC13 KO Hela cells expressing MIC60-SNAP and MIC10-SNAP, respectively. (****P ≤ 0.0001 for all possible comparisons, unpaired Student's t-test).F Percentage of subtracks having directed motion in WT and MIC13 KO Hela cells expressing MIC60- and MIC10-SNAP and in WT and MIC60 KO HAP1 cells expressing MIC10-SNAP. Number of corresponding subtracks analysed (obtained from 2 independent experiments): n = 2561, 2443, 3402, 1360, 561 and 1110. Data are mean ± SEM. *P ≤ 0.05, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "C", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", "showing", "WT", "(", "A", ")", "and", "MIC13", "KO", "(", "C", ")", "Hela", "cells", "expressing", "MIC10", "-", "SNAP", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Box", "in", "(", "A", "and", "C", ")", "mark", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "B", "and", "D", ")", "respectively", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "E", "Blind", "quantification", "of", "merging", "and", "splitting", "events", "of", "CJs", "in", "WT", "and", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "MIC10", "-", "SNAP", "(", "3", "independent", "experiments", ",", "5", "-", "8", "mitochondria", "for", "each", "experiment", ")", "represented", "as", "boxplots", ".", "Boxplots", "show", "median", "and", "interquartile", "range", "from", "25", "to", "75", "percentile", "and", "whiskers", "represent", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "026", "(", "merging", "and", "splitting", "events", "in", "WT", "cells", ")", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "merging", "and", "splitting", "events", "of", "WT", "vs", ".", "MIC13", "KO", ")", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, C Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s) showing WT (A) and MIC13 KO (C) Hela cells expressing MIC10-SNAP stained with silicone-rhodamine. Box in (A and C) mark selection shown as a zoom in panel (B and D) respectively. Scale bar 500 nm.E Blind quantification of merging and splitting events of CJs in WT and MIC13 KO Hela cells expressing MIC10-SNAP (3 independent experiments, 5-8 mitochondria for each experiment) represented as boxplots. Boxplots show median and interquartile range from 25 to 75 percentile and whiskers represent minimum and maximum value. *P = 0.026 (merging and splitting events in WT cells) and ****P < 0.0001 (merging and splitting events of WT vs. MIC13 KO), unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", ",", "showing", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "MIC13", "-", "SNAP", ",", "from", "a", "time", "-", "series", "of", "images", "acquired", "at", "a", "time", "interval", "of", "2", ".", "5", "s", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "C", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", ",", "showing", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "MIC13", "-", "SNAP", ",", "from", "a", "time", "-", "series", "of", "images", "acquired", "at", "a", "time", "interval", "of", "1", ".", "3", "s", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "D", "Time", "-", "lapse", "image", "series", "of", "a", "mitochondrion", "expressing", "MIC13", "-", "SNAP", "imaged", "at", "a", "time", "interval", "of", "1", ".", "3", "s", "/", "frame", ".", "Green", "and", "magenta", "asterisks", "show", "cycles", "of", "cristae", "merging", "and", "splitting", "marked", "by", "MIC13", "-", "SNAP", ".", "Green", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "and", "magenta", "arrows", "pointing", "outward", "connected", "by", "dotted", "line", "show", "sites", "of", "imminent", "merging", "and", "splitting", "events", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "E", "First", "image", "from", "(", "D", ")", "was", "used", "for", "showing", "the", "intensity", "profiles", "along", "the", "length", "of", "three", "cristae", "(", "numbered", "1", "-", "3", "and", "marked", "with", "white", "arrows", ")", "in", "(", "F", ")", ".", "F", "Intensity", "profiles", "of", "lines", "drawn", "across", "the", "length", "of", "cristae", "show", "increased", "intensities", "at", "the", "edges", "of", "the", "line", "scans", "representing", "the", "IBM", ".", "Magenta", "boxes", "depict", "intensity", "maxima", "at", "IBM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s), showing WT Hela cells expressing MIC13-SNAP, from a time-series of images acquired at a time interval of 2.5 s stained with silicone-rhodamine. Box marks selection shown as a zoom in panel (B). Scale bar 500 nm.C Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s), showing WT Hela cells expressing MIC13-SNAP, from a time-series of images acquired at a time interval of 1.3 s stained with silicone-rhodamine. Box marks selection shown as a zoom in panel (D). Scale bar 500 nm. D Time-lapse image series of a mitochondrion expressing MIC13-SNAP imaged at a time interval of 1.3 s/ frame. Green and magenta asterisks show cycles of cristae merging and splitting marked by MIC13-SNAP. Green arrows pointing inward connected by solid line and magenta arrows pointing outward connected by dotted line show sites of imminent merging and splitting events, respectively. Scale bar 500 nm. E First image from (D) was used for showing the intensity profiles along the length of three cristae (numbered 1-3 and marked with white arrows) in (F). F Intensity profiles of lines drawn across the length of cristae show increased intensities at the edges of the line scans representing the IBM. Magenta boxes depict intensity maxima at IBM. "}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", "showing", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "ATP5I", "-", "SNAP", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "B", "Time", "-", "lapse", "image", "series", "of", "a", "mitochondrion", "expressing", "ATP5I", "-", "SNAP", "in", "WT", "Hela", "cells", "(", "2", ".", "5", "s", "/", "frame", ")", ".", "Green", "and", "magenta", "asterisks", "show", "merging", "and", "splitting", "events", "of", "cristae", "marked", "by", "ATP5I", "-", "SNAP", "respectively", ".", "Green", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "and", "magenta", "arrows", "pointing", "outward", "connected", "by", "dotted", "line", "show", "sites", "of", "imminent", "merging", "and", "splitting", "events", ",", "respectively", ".", "Green", "`", "Y", "´", "represent", "Y", "-", "type", "imminent", "mergence", "event", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "C", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", "showing", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "ATP5I", "-", "SNAP", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "D", "Time", "-", "lapse", "image", "series", "of", "a", "mitochondrion", "expressing", "ATP5I", "-", "SNAP", "in", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "(", "2", ".", "5", "s", "/", "frame", ")", ".", "Green", "and", "magenta", "asterisks", "show", "merging", "and", "splitting", "events", "of", "cristae", "marked", "by", "ATP5I", "-", "SNAP", "respectively", ".", "Green", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "and", "magenta", "arrows", "pointing", "outward", "connected", "by", "dotted", "line", "show", "sites", "of", "imminent", "merging", "and", "splitting", "events", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "E", "First", "image", "from", "(", "B", ")", "was", "used", "for", "showing", "the", "intensity", "profiles", "along", "the", "length", "of", "three", "cristae", "(", "numbered", "1", "-", "3", "and", "marked", "with", "white", "arrows", ")", "in", "(", "F", ")", ".", "F", "Intensity", "profiles", "of", "lines", "drawn", "across", "the", "length", "of", "cristae", "show", "increased", "intensities", "in", "the", "middle", "of", "the", "line", "scans", "representing", "the", "CM", ".", "The", "represented", "IBM", "area", "is", "superimposed", "from", "intensities", "of", "MIC13", "-", "SNAP", "from", "Figure", "6F", ".", "Magenta", "box", "depicts", "intensity", "maxima", "at", "cristae", "membrane", "apart", "from", "IBM", ".", "G", "Blind", "quantification", "of", "cristae", "merging", "and", "splitting", "events", "in", "WT", "and", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "expressing", "ATP5I", "-", "SNAP", "(", "3", "independent", "experiments", ",", "3", "-", "7", "mitochondria", "for", "each", "experiment", ")", "represented", "as", "boxplots", ".", "Boxplots", "show", "median", "and", "interquartile", "range", "from", "25", "to", "75", "percentile", "and", "whiskers", "represent", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s) showing WT Hela cells expressing ATP5I-SNAP stained with silicone-rhodamine. Box marks selection shown as a zoom in panel (B). Scale bar 500 nm. B Time-lapse image series of a mitochondrion expressing ATP5I-SNAP in WT Hela cells (2.5 s/frame). Green and magenta asterisks show merging and splitting events of cristae marked by ATP5I-SNAP respectively. Green arrows pointing inward connected by solid line and magenta arrows pointing outward connected by dotted line show sites of imminent merging and splitting events, respectively. Green `Y´ represent Y- type imminent mergence event . Scale bar 500 nm. C Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s) showing MIC13 KO Hela cells expressing ATP5I-SNAP stained with silicone-rhodamine. Box marks selection shown as a zoom in panel (D). Scale bar 500 nm. D Time-lapse image series of a mitochondrion expressing ATP5I-SNAP in MIC13 KO Hela cells (2.5 s/frame). Green and magenta asterisks show merging and splitting events of cristae marked by ATP5I-SNAP respectively. Green arrows pointing inward connected by solid line and magenta arrows pointing outward connected by dotted line show sites of imminent merging and splitting events, respectively. Scale bar 500 nm. E First image from (B) was used for showing the intensity profiles along the length of three cristae (numbered 1-3 and marked with white arrows) in (F). F Intensity profiles of lines drawn across the length of cristae show increased intensities in the middle of the line scans representing the CM. The represented IBM area is superimposed from intensities of MIC13-SNAP from Figure 6F. Magenta box depicts intensity maxima at cristae membrane apart from IBM. G Blind quantification of cristae merging and splitting events in WT and MIC13 KO Hela cells expressing ATP5I-SNAP (3 independent experiments, 3-7 mitochondria for each experiment) represented as boxplots. Boxplots show median and interquartile range from 25 to 75 percentile and whiskers represent minimum and maximum value. ****P < 0.0001, unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "8A", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", "showing", "WT", "Hela", "cells", "stained", "with", "TMRM", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "B", ")", "(", "red", "hot", "LUT", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "B", "Time", "-", "lapse", "image", "series", "of", "two", "mitochondria", "stained", "with", "TMRM", "(", "1", ".", "5", "s", "/", "frame", ")", ".", "Green", "asterisks", "show", "merging", "events", "and", "redistribution", "of", "TMRM", "intensity", "from", "a", "high", "-", "intensity", "cristae", "to", "a", "low", "-", "intensity", "cristae", "(", "two", "such", "instances", "are", "shown", "at", "3", "and", "7", ".", "4", "s", ")", ".", "Green", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "at", "1", ".", "5", "and", "5", ".", "9", "s", "indicate", "imminent", "merging", "events", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "C", "Representative", "live", "-", "cell", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "(", "t", "=", "0", "s", ")", "showing", "WT", "Hela", "cells", "stained", "with", "TMRM", ".", "Box", "marks", "selection", "shown", "as", "a", "zoom", "in", "panel", "(", "D", ")", "(", "red", "hot", "LUT", ")", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "D", "Time", "-", "lapse", "image", "series", "of", "two", "mitochondria", "stained", "with", "TMRM", "(", "1", ".", "5", "s", "/", "frame", ")", ".", "Green", "and", "magenta", "asterisks", "show", "cristae", "merging", "and", "splitting", "cycles", "(", "shown", "at", "5", ".", "9", "s", "and", "7", ".", "4", "s", ")", ".", "Green", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "and", "magenta", "arrows", "pointing", "outward", "connected", "by", "dotted", "line", "show", "sites", "of", "imminent", "merging", "and", "splitting", "events", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "E", "Representative", "time", "-", "lapse", "images", "of", "WT", "Hela", "cells", "stained", "with", "NAO", ",", "and", "imaged", "using", "Airyscan", "microscope", ",", "indicate", "cristae", "merging", "and", "splitting", "dynamics", ".", "Yellow", "and", "magenta", "asterisks", "show", "merging", "and", "splitting", "events", "of", "cristae", "respectively", ".", "Yellow", "arrows", "pointing", "inward", "connected", "by", "solid", "line", "and", "magenta", "arrows", "pointing", "outward", "connected", "by", "dotted", "line", "show", "sites", "of", "imminent", "merging", "and", "splitting", "events", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s) showing WT Hela cells stained with TMRM. Box marks selection shown as a zoom in panel (B) (red hot LUT). Scale bar 500 nm. B Time-lapse image series of two mitochondria stained with TMRM (1.5 s/frame). Green asterisks show merging events and redistribution of TMRM intensity from a high-intensity cristae to a low-intensity cristae (two such instances are shown at 3 and 7.4 s). Green arrows pointing inward connected by solid line at 1.5 and 5.9 s indicate imminent merging events. Scale bar 500 nm. C Representative live-cell STED super-resolution images (t=0 s) showing WT Hela cells stained with TMRM. Box marks selection shown as a zoom in panel (D) (red hot LUT). Scale bar 500 nm. D Time-lapse image series of two mitochondria stained with TMRM (1.5 s/frame). Green and magenta asterisks show cristae merging and splitting cycles (shown at 5.9 s and 7.4 s). Green arrows pointing inward connected by solid line and magenta arrows pointing outward connected by dotted line show sites of imminent merging and splitting events, respectively. Scale bar 500 nm. E Representative time-lapse images of WT Hela cells stained with NAO, and imaged using Airyscan microscope, indicate cristae merging and splitting dynamics. Yellow and magenta asterisks show merging and splitting events of cristae respectively. Yellow arrows pointing inward connected by solid line and magenta arrows pointing outward connected by dotted line show sites of imminent merging and splitting events, respectively. Scale bar 500 nm."}
{"words": ["Figure", "9A", "Mitochondrion", "in", "WT", "Hela", "cells", "expressing", "ATP5I", "-", "PAGFP", "was", "photoactivated", ",", "in", "the", "area", "shown", "by", "a", "blue", "box", ",", "at", "0", "s", ".", "Inset", "of", "white", "box", "at", "0", ".", "98", "s", "clearly", "shows", "fluorescent", "crista", "(", "red", "arrow", ")", ",", "absent", "at", "0", ".", "38", "s", ",", "0", ".", "59", "s", "&", "0", ".", "78", "s", "(", "red", "arrowhead", "showing", "the", "area", "enclosed", "by", "white", "dotted", "lines", ")", ",", "confirming", "merging", "of", "non", "-", "fluorescent", "cristae", "vesicle", "with", "the", "IBM", ".", "Threshold", "images", "of", "insets", "are", "shown", "above", "the", "whole", "images", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", ".", "B", "Dual", "-", "colour", "STED", "super", "-", "resolution", "images", "of", "fused", "mitochondrion", "in", "WT", "Hela", "cells", "(", "Left", "Panel", ")", "showing", "colocalization", "of", "cristae", "marked", "with", "ATP5I", "-", "GFP", "(", "using", "anti", "-", "GFP", "antibody", ")", "and", "ATP5I", "-", "SNAP", "(", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ")", ".", "(", "Right", "Panel", ")", "Fused", "mitochondrion", "in", "MIC13", "KO", "Hela", "cells", "showing", "cristae", "marked", "with", "either", "ATP5I", "-", "GFP", "(", "using", "anti", "-", "GFP", "antibody", ")", "or", "ATP5I", "-", "SNAP", "(", "stained", "with", "silicone", "-", "rhodamine", ")", ".", "Arrowheads", "show", "merged", "cristae", "while", "arrows", "show", "cristae", "that", "maintain", "their", "individual", "identity", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A Mitochondrion in WT Hela cells expressing ATP5I-PAGFP was photoactivated, in the area shown by a blue box, at 0 s. Inset of white box at 0.98 s clearly shows fluorescent crista (red arrow), absent at 0.38 s, 0.59 s & 0.78 s (red arrowhead showing the area enclosed by white dotted lines), confirming merging of non-fluorescent cristae vesicle with the IBM. Threshold images of insets are shown above the whole images. Scale bar 500 nm.B Dual-colour STED super-resolution images of fused mitochondrion in WT Hela cells (Left Panel) showing colocalization of cristae marked with ATP5I-GFP (using anti-GFP antibody) and ATP5I-SNAP (stained with silicone-rhodamine). (Right Panel) Fused mitochondrion in MIC13 KO Hela cells showing cristae marked with either ATP5I-GFP (using anti-GFP antibody) or ATP5I-SNAP (stained with silicone-rhodamine). Arrowheads show merged cristae while arrows show cristae that maintain their individual identity. Scale bar 500 nm."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "siRNA", "for", "84", "h", ".", "(", "b", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "a", "second", "independent", "siRNA", "targeting", "ATG5", ",", "ATG7", "or", "NDP52", ".", "GAPDH", "and", "total", "protein", "stained", "with", "Coomassie", "blue", "serve", "as", "loading", "controls", ".", "(", "c", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "cultured", "in", "Hank", "'", "s", "buffered", "salt", "solution", "(", "Starved", ")", "or", "DMEM", "+", "10", "%", "FBS", "(", "Serum", ")", ".", "(", "d", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "(", "48", "h", ")", "with", "an", "inhibitor", "of", "mTORC1", "(", "RAP", ",", "20", "nM", ")", "or", "control", "(", "DMSO", ")", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "analysis", "comparing", "the", "levels", "of", "DICER", "in", "MDA", "-", "231", ",", "T47D", "and", "MDA", "-", "435", "cells", ".", "(", "f", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "MDA", "-", "231", ",", "T47D", "and", "MDA", "-", "435", "cells", "treated", "(", "48", " ", "h", ")", "with", "inhibitors", "of", "mTORC1", "(", "RAP", ",", "20", " ", "nM", ")", ",", "mTORC1", "and", "2", "(", "PP242", ",", "100", " ", "nM", ")", ",", "or", "DMSO", "(", "control", ")", ".", "(", "g", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "CQ", "or", "DMSO", "for", "12", " ", "h", ".", "(", "h", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "BAF", "(", "200", " ", "nM", ",", "12", " ", "h", ")", ",", "RAP", "(", "20", " ", "nM", ",", "24", " ", "h", ")", ",", "or", "RAP", "and", "BAF", ".", "The", "results", "in", "a", "-", "h", "are", "representative", "of", "three", "experiments", "and", "use", "α", "-", "tubulin", "(", "TUBA", ")", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "i", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "DICER", "(", "monoclonal", "antibody", "13D6", ")", "or", "control", "(", "EEF1A1", ")", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "DICER", ".", "(", "j", ")", "Confocal", "analysis", "of", "the", "signal", "from", "an", "anti", "-", "DICER", "monoclonal", "antibody", "(", "clone", "13D6", ")", "or", "an", "isotype", "control", "monoclonal", "antibody", "in", "HeLa", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "k", ",", "l", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "AGO1", ",", "AGO2", "and", "DICER", "mRNA", "in", "HeLa", "cells", "treated", "for", "12", " ", "h", "with", "DMSO", ",", "BAF", "or", "CQ", "(", "k", ")", "or", "siRNA", "for", "84", " ", "h", "(", "l", ")", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Western blot analysis of HeLa cells treated with siRNA for 84 h.(b) Western blot analysis of HeLa cells treated with a second independent siRNA targeting ATG5, ATG7 or NDP52. GAPDH and total protein stained with Coomassie blue serve as loading controls.(c) Western blot analysis of HeLa cells cultured in Hank's buffered salt solution (Starved) or DMEM+ 10% FBS (Serum).(d) Western blot analysis of HeLa cells treated (48 h) with an inhibitor of mTORC1 (RAP, 20 nM) or control (DMSO).(e) Western blot analysis comparing the levels of DICER in MDA-231, T47D and MDA-435 cells.(f) Western blot analysis of MDA-231, T47D and MDA-435 cells treated (48 h) with inhibitors of mTORC1 (RAP, 20 nM), mTORC1 and 2 (PP242, 100 nM), or DMSO (control).(g) Western blot analysis of HeLa cells treated with CQ or DMSO for 12 h.(h) Western blot analysis of HeLa cells treated with BAF (200 nM, 12 h), RAP (20 nM, 24 h), or RAP and BAF. The results in a-h are representative of three experiments and use α-tubulin (TUBA) as a loading control.(i) Western blot analysis of DICER (monoclonal antibody 13D6) or control (EEF1A1) in HeLa cells treated with control siRNA or siRNA targeting DICER.(j) Confocal analysis of the signal from an anti-DICER monoclonal antibody (clone 13D6) or an isotype control monoclonal antibody in HeLa cells. Scale bar, 10 μm.(k,l) RT-qPCR analysis of AGO1, AGO2 and DICER mRNA in HeLa cells treated for 12 h with DMSO, BAF or CQ (k) or siRNA for 84 h (l). Error bars show s.e.m. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S3."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Localization", "using", "confocal", "microscopy", "of", "endogenous", "DICER", "(", "monoclonal", "antibody", "13D6", ")", "and", "NDP52", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "RAP", "or", "control", ".", "The", "arrows", "highlight", "some", "examples", "of", "co", "-", "localization", ".", "The", "lower", "left", "insets", "show", "higher", "magnifications", "of", "the", "areas", "outlined", "in", "the", "main", "panel", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "DICER", "co", "-", "localization", "with", "NDP52", ".", "Total", "fluorescence", "intensity", "of", "DICER", "co", "-", "localized", "with", "punctae", "(", ">", "0", ".", "2", " ", "μm3", ")", "of", "NDP52", "was", "quantified", "with", "Volocity", "software", "in", "RAP", "-", "treated", "cells", "/", "control", "-", "treated", "cells", "over", "several", "Z", "-", "stacked", "microscope", "fields", "per", "experiment", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ",", "error", "bars", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "(", "c", ")", "Localization", "using", "confocal", "microscopy", "of", "endogenous", "DICER", "(", "monoclonal", "antibody", "13D6", ")", "and", "HcRed", "-", "LC3", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "BAF", "or", "control", ".", "The", "arrows", "highlight", "some", "examples", "of", "co", "-", "localization", ".", "Insets", "as", "in", "a", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "DICER", "co", "-", "localization", "with", "HcRed", "-", "LC3", "was", "performed", "as", "for", "NDP52", "in", "b", ".", "(", "e", ")", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "GFP", "-", "DCP1A", "and", "HcRed", "-", "LC3wt", "in", "HeLa", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "f", "-", "i", ")", "Localization", "of", "DICER", "(", "monoclonal", "antibody", "13D6", ")", "detected", "with", "anti", "-", "mouse", "IgG", "(", "10", " ", "nm", "gold", "beads", ")", "by", "electron", "microscopy", "in", "CQ", "-", "(", "20", " ", "μM", ",", "12", " ", "h", ")", "treated", "HeLa", "cells", ".", "Mito", ",", "mitochondria", ";", "MVB", ",", "multivesicular", "body", ".", "The", "black", "arrows", "highlight", "all", "gold", "beads", ".", "(", "j", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "fractions", "from", "a", "discontinuous", "gradient", "of", "Histodenz", "(", "15", "%", ",", "20", "%", ",", "24", "%", ",", "26", "%", ")", "described", "to", "enrich", "autophagosomes", "(", "light", "AV", ")", "and", "autophagolysosomes", "(", "heavy", "AV", ";", "ref", ".", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "CQ", "(", "20", " ", "μM", ",", "16", " ", "h", ")", ".", "Fractions", "enriched", "in", "multivesicular", "body", "and", "lysosomal", "markers", "are", "indicated", ".", "Material", "that", "was", "pelleted", "by", "centrifugation", "at", "100", ",", "000g", "(", "100", " ", "K", "pellet", ")", "or", "that", "remained", "in", "solution", "after", "the", "100", ",", "000g", "spin", "(", "soluble", ")", "was", "not", "added", "to", "the", "gradient", ".", "(", "k", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "UB", "and", "p62", "in", "discontinuous", "Histodenz", "gradients", "(", "as", "in", "j", ")", "of", "HEK293T", "cells", "treated", "with", "control", "(", "DMSO", ")", "or", "CQ", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Localization using confocal microscopy of endogenous DICER (monoclonal antibody 13D6) and NDP52 in HeLa cells treated with RAP or control. The arrows highlight some examples of co-localization. The lower left insets show higher magnifications of the areas outlined in the main panel. Scale bars, 5 μm. (b) Quantification of DICER co-localization with NDP52. Total fluorescence intensity of DICER co-localized with punctae (>0.2 μm3) of NDP52 was quantified with Volocity software in RAP-treated cells/control-treated cells over several Z-stacked microscope fields per experiment (n = 4, error bars s.e.m.).(c) Localization using confocal microscopy of endogenous DICER (monoclonal antibody 13D6) and HcRed-LC3 in HeLa cells treated with BAF or control. The arrows highlight some examples of co-localization. Insets as in a. Scale bar, 5 μm. (d) Quantification of DICER co-localization with HcRed-LC3 was performed as for NDP52 in b.(e) Confocal microscopy analysis of GFP-DCP1A and HcRed-LC3wt in HeLa cells. Scale bar, 10 μm.(f-i) Localization of DICER (monoclonal antibody 13D6) detected with anti-mouse IgG (10 nm gold beads) by electron microscopy in CQ- (20 μM, 12 h) treated HeLa cells. Mito, mitochondria; MVB, multivesicular body. The black arrows highlight all gold beads.(j) Western blot analysis of fractions from a discontinuous gradient of Histodenz (15%, 20%, 24%, 26%) described to enrich autophagosomes (light AV) and autophagolysosomes (heavy AV; ref. ). HEK293T cells were treated with CQ (20 μM, 16 h). Fractions enriched in multivesicular body and lysosomal markers are indicated. Material that was pelleted by centrifugation at 100,000g (100 K pellet) or that remained in solution after the 100,000g spin (soluble) was not added to the gradient.(k) Western blot analysis of UB and p62 in discontinuous Histodenz gradients (as in j) of HEK293T cells treated with control (DMSO) or CQ. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S3."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "GEMIN4", "in", "fractions", "from", "a", "discontinuous", "gradient", "of", "Histodenz", "(", "15", "%", ",", "20", "%", ",", "24", "%", ",", "26", "%", ")", "described", "to", "enrich", "autophagosomes", "(", "light", "AV", ")", "and", "autophagolysosomes", "(", "heavy", "AV", ")", ".", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "CQ", "(", "20", " ", "μM", ",", "16", " ", "h", ")", ".", "Fractions", "enriched", "in", "multivesicular", "body", "(", "MVB", ")", "and", "lysosomal", "markers", "are", "indicated", ".", "(", "b", ")", "Western", "blot", "of", "GEMIN4", "or", "loading", "control", "(", "TUBA", ")", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "ATG5", ",", "ATG6", "or", "ATG7", ".", "(", "c", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "GEMIN4", "or", "control", "(", "TUBA", ")", "in", "HeLa", "cells", "cultured", "in", "DMEM", "10", "%", "FBS", "(", "Serum", ")", ",", "Hank", "'", "s", "buffered", "salt", "solution", "(", "Starve", ")", "for", "2", " ", "h", ",", "or", "treated", "for", "16", " ", "h", "with", "control", "(", "DMSO", ")", ",", "BAF", "(", "200", " ", "nM", ")", ",", "RAP", "(", "20", " ", "nM", ")", ",", "RAP", "+", "BAF", ",", "or", "PP242", "(", "100", " ", "nM", ")", ".", "(", "d", ")", "Top", ",", "western", "blot", "of", "GEMIN4", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "from", "HeLa", "cells", ".", "Bottom", ",", "western", "blot", "analysis", "of", "GEMIN4", "in", "immunoprecipitates", "of", "anti", "-", "NDP52", ",", "-", "p62", "or", "control", "antibody", "from", "HeLa", "cells", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "of", "DICER", "immunoprecipitates", "from", "HeLa", "cells", ".", "(", "f", ")", "Western", "blot", "of", "AGO2", "immunoprecipitates", "from", "HeLa", "cells", ".", "(", "g", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "GEMIN4", ",", "compared", "with", "loading", "controls", "(", "DCP1A", ",", "CLN3", ")", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "GEMIN3", "and", "GEMIN4", ".", "(", "h", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "indicated", "combinations", "of", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "GEMIN3", ",", "GEMIN4", "and", "ATG5", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "CLN3", "and", "DCP1A", "are", "used", "to", "demonstrate", "equal", "loading", "of", "wells", ".", "(", "i", ")", "Western", "blot", "analysis", "with", "anti", "-", "UB", "monoclonal", "antibody", "(", "mono", "-", "and", "polyubiquitylated", "proteins", ",", "FK2", "clone", ")", "in", "Flag", "immunoprecipitates", "performed", "under", "stringent", "denaturing", "conditions", ".", "Flag", "-", "AGO2", "was", "induced", "for", "24", " ", "h", "with", "tetracycline", "in", "HEK293T", "cells", "with", "Tet", "-", "inducible", "Flag", "-", "AGO2", "stably", "integrated", "that", "had", "been", "treated", "24", " ", "h", "before", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "(", "j", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "ATG5", "for", "24", " ", "h", ".", "TUBA", ",", "α", "-", "tubulin", "loading", "control", ".", "(", "k", ")", "Top", ",", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "miR", "-", "16", "or", "let", "-", "7a", "levels", "in", "AGO2", "immunoprecipitates", "from", "DMSO", "-", "and", "BAF", "-", "treated", "HeLa", "cells", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Bottom", ",", "a", "representative", "western", "blot", "of", "AGO2", "immunoprecipitates", "used", "in", "one", "replicate", "of", "these", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Western blot analysis of GEMIN4 in fractions from a discontinuous gradient of Histodenz (15%, 20%, 24%, 26%) described to enrich autophagosomes (light AV) and autophagolysosomes (heavy AV). HEK293T cells were treated with CQ (20 μM, 16 h). Fractions enriched in multivesicular body (MVB) and lysosomal markers are indicated.(b) Western blot of GEMIN4 or loading control (TUBA) in HeLa cells treated with control siRNA or siRNA targeting ATG5, ATG6 or ATG7.(c) Western blot analysis of GEMIN4 or control (TUBA) in HeLa cells cultured in DMEM 10% FBS (Serum), Hank's buffered salt solution (Starve) for 2 h, or treated for 16 h with control (DMSO), BAF (200 nM), RAP (20 nM), RAP+BAF, or PP242 (100 nM).(d) Top, western blot of GEMIN4 immunoprecipitates (IP) from HeLa cells. Bottom, western blot analysis of GEMIN4 in immunoprecipitates of anti-NDP52, -p62 or control antibody from HeLa cells.(e) Western blot of DICER immunoprecipitates from HeLa cells.(f) Western blot of AGO2 immunoprecipitates from HeLa cells.(g) Western blot analysis of GEMIN4, compared with loading controls (DCP1A, CLN3) in HeLa cells treated with control siRNA or siRNA targeting GEMIN3 and GEMIN4.(h) Western blot analysis of HeLa cells treated with indicated combinations of control siRNA or siRNA targeting GEMIN3, GEMIN4 and ATG5. Western blot analysis of CLN3 and DCP1A are used to demonstrate equal loading of wells.(i) Western blot analysis with anti-UB monoclonal antibody (mono- and polyubiquitylated proteins, FK2 clone) in Flag immunoprecipitates performed under stringent denaturing conditions. Flag-AGO2 was induced for 24 h with tetracycline in HEK293T cells with Tet-inducible Flag-AGO2 stably integrated that had been treated 24 h before with the indicated siRNAs.(j) Western blot analysis of HeLa cells treated with control siRNA or siRNA targeting ATG5 for 24 h. TUBA, α-tubulin loading control.(k) Top, RT-qPCR analysis of miR-16 or let-7a levels in AGO2 immunoprecipitates from DMSO- and BAF-treated HeLa cells. Error bars represent s.e.m. Bottom, a representative western blot of AGO2 immunoprecipitates used in one replicate of these experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S3."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Northern", "blot", "of", "miR", "-", "16", "and", "let", "-", "7a", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "siRNA", "for", "84", " ", "h", ".", "Levels", "of", "U6", ",", "ethidium", "-", "bromide", "-", "stained", "total", "RNA", "on", "northern", "membrane", "(", "loading", ")", "and", "28S", "and", "18S", "ribosomal", "RNA", "on", "1", "%", "agarose", "gel", "are", "shown", "as", "controls", "for", "equal", "loading", ".", "(", "b", "-", "d", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "let", "-", "7a", "and", "miR", "-", "16", "(", "b", ")", ",", "pre", "-", "let", "-", "7a", "and", "pre", "-", "miR", "-", "16", "(", "c", ")", "and", "let", "-", "7a", "*", "and", "miR", "-", "16", "*", "(", "d", ")", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "NDP52", "or", "ATG5", "with", "siRNA", "(", "84", " ", "h", ")", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "fluorescence", "signal", "in", "AGO2", "immunoprecipitates", "from", "HeLa", "cell", "extracts", "incubated", "with", "duplexes", "of", "let", "-", "7a", "-", "let", "-", "7a", "*", "labelled", "on", "the", "3", "′", "end", "of", "either", "let", "-", "7", "or", "let", "-", "7a", "*", "with", "FITC", ".", "Cells", "were", "treated", "16", " ", "h", "before", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "BAF", "(", "200", " ", "nm", ")", "or", "geldanamycin", "(", "10", " ", "μM", ")", ".", "Representative", "results", "of", "one", "experiment", "are", "shown", ".", "(", "f", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "AGO2", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "used", "in", "e", ".", "(", "g", ")", "Normalized", "results", "of", "four", "independent", "experiments", "(", "n", " ", "=", " ", "4", ")", "identical", "to", "e", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Northern blot of miR-16 and let-7a in HeLa cells treated with siRNA for 84 h. Levels of U6, ethidium-bromide-stained total RNA on northern membrane (loading) and 28S and 18S ribosomal RNA on 1% agarose gel are shown as controls for equal loading.(b-d) RT-qPCR analysis of let-7a and miR-16 (b), pre-let-7a and pre-miR-16 (c) and let-7a* and miR-16* (d) in HeLa cells depleted of NDP52 or ATG5 with siRNA (84 h). n = 3 independent experiments; error bars represent s.e.m.(e) Quantification of fluorescence signal in AGO2 immunoprecipitates from HeLa cell extracts incubated with duplexes of let-7a-let-7a* labelled on the 3′ end of either let-7 or let-7a* with FITC. Cells were treated 16 h before with DMSO (control), BAF (200 nm) or geldanamycin (10 μM). Representative results of one experiment are shown.(f) Western blot analysis of AGO2 immunoprecipitates (IP) used in e.(g) Normalized results of four independent experiments (n = 4) identical to e. Error bars represent s.e.m. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S3."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Renilla", "luciferase", "expression", "controlled", "by", "an", "exogenous", "siRNA", "-", "siRNA", "*", "duplex", "targeting", "two", "partially", "complementary", "sites", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "ATG5", "or", "ATG7", "with", "siRNA", "(", "black", "and", "grey", "bars", "correspond", "to", "two", "independent", "siRNAs", ")", ".", "Results", "are", "normalized", "to", "firefly", "luciferase", "and", "Renilla", "luciferase", "expression", "in", "cells", "treated", "with", "a", "nonspecific", "siRNA", "-", "siRNA", "*", "duplex", ".", "n", " ", "=", " ", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Renilla", "luciferase", "expression", "controlled", "by", "let", "-", "7", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "NDP52", "or", "ATG5", "with", "siRNA", "(", "black", "and", "grey", "bars", "are", "independent", "siRNAs", ")", ".", "Results", "are", "normalized", "to", "firefly", "luciferase", "and", "a", "version", "of", "the", "Renilla", "luciferase", "construct", "with", "mutated", "let", "-", "7", "binding", "sites", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "asterisks", "denote", "mutations", "in", "the", "let", "-", "7", "target", "sites", "of", "the", "reporter", ".", "(", "c", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "endogenous", "miRNA", "-", "repressed", "proteins", "(", "RAS", ",", "HMGA2", "and", "CDK6", "are", "repressed", "by", "let", "-", "7", ";", "CDK6", "is", "also", "repressed", "by", "miR", "-", "16", "(", "bottom", "panel", ")", ")", "or", "control", "(", "TUBA", ",", "α", "-", "tubulin", ")", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "either", "of", "two", "independent", "siRNAs", "targeting", "ATG7", ".", "Cells", "were", "treated", "in", "parallel", "with", "nonspecific", "antagomir", "or", "let", "-", "7", "targeting", "antagomir", ".", "(", "d", ")", "Renilla", "luciferase", "expression", "controlled", "by", "the", "DICER", "3", "′", "UTR", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "antagomir", "or", "anti", "-", "let", "-", "7", "antagomir", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "DICER", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "either", "of", "two", "independent", "siRNAs", "targeting", "ATG7", ".", "Cells", "were", "also", "treated", "with", "nonspecific", "antagomir", "or", "let", "-", "7", "targeting", "antagomir", ".", "(", "f", ")", "Renilla", "luciferase", "expression", "controlled", "by", "the", "DICER", "3", "′", "UTR", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "either", "of", "two", "independent", "siRNAs", "targeting", "ATG5", "or", "a", "control", "siRNA", ".", "All", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Renilla luciferase expression controlled by an exogenous siRNA-siRNA* duplex targeting two partially complementary sites in HeLa cells depleted of ATG5 or ATG7 with siRNA (black and grey bars correspond to two independent siRNAs). Results are normalized to firefly luciferase and Renilla luciferase expression in cells treated with a nonspecific siRNA-siRNA* duplex. n = 2 independent experiments.(b) Renilla luciferase expression controlled by let-7 in HeLa cells depleted of NDP52 or ATG5 with siRNA (black and grey bars are independent siRNAs). Results are normalized to firefly luciferase and a version of the Renilla luciferase construct with mutated let-7 binding sites. n = 3 independent experiments. The asterisks denote mutations in the let-7 target sites of the reporter.(c) Western blot analysis of endogenous miRNA-repressed proteins (RAS, HMGA2 and CDK6 are repressed by let-7; CDK6 is also repressed by miR-16 (bottom panel)) or control (TUBA, α-tubulin) in HeLa cells treated with control siRNA or either of two independent siRNAs targeting ATG7. Cells were treated in parallel with nonspecific antagomir or let-7 targeting antagomir.(d) Renilla luciferase expression controlled by the DICER 3′UTR in HeLa cells treated with control antagomir or anti-let-7 antagomir.(e) Western blot analysis of DICER in HeLa cells treated with control siRNA or either of two independent siRNAs targeting ATG7. Cells were also treated with nonspecific antagomir or let-7 targeting antagomir.(f) Renilla luciferase expression controlled by the DICER 3′UTR in HeLa cells treated with either of two independent siRNAs targeting ATG5 or a control siRNA. All error bars are s.e.m. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S3."}
{"words": ["Figure", "1A", "The", "first", "400", "nt", "of", "all", "3", "'", "UTRs", "represented", "in", "the", "UPF1", "RIP", "-", "Seq", "dataset", "were", "analyzed", "for", "the", "occurrence", "of", "motifs", "corresponding", "to", "the", "indicated", "RNA", "-", "binding", "proteins", ".", "Transcripts", "were", "divided", "into", "groups", "based", "on", "the", "number", "of", "motifs", "present", "(", "0", ",", "1", ",", "more", "than", "1", ")", ",", "indicated", "by", "the", "gradient", "triangle", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "mean", "RIP", "-", "Seq", "efficiency", "for", "all", "transcripts", "used", "in", "the", "analysis", ".", "Mean", "and", "SD", "are", "plotted", "for", "all", "groups", ".", "B", "CDF", "plot", "of", "relative", "abundance", "of", "transcripts", "with", "3", "'", "UTRs", ">", "1000", "nt", "in", "K562", "cells", "under", "conditions", "of", "UPF1", "or", "non", "-", "targeting", "shRNA", ",", "for", "transcripts", "with", "hnRNP", "L", "eCLIP", "peaks", "in", "the", "indicated", "intervals", "Each", "trace", "represents", "a", "category", "of", "CLIP", "peak", "locations", ".", "For", "mRNAs", "with", "peaks", ">", "400", "nt", "from", "the", "TC", "or", "with", "peaks", "in", "the", "5", "'", "UTR", "or", "CDS", ",", "transcripts", "with", "peaks", "at", "3", "'", "UTR", "positions", "1", "-", "400", "were", "excluded", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", "and", "was", "determined", "based", "on", "comparison", "to", "the", "set", "with", "no", "3", "'", "UTR", "CLIP", "peaks", ".", "C", "Representative", "northern", "blots", "assaying", "the", "stability", "of", "β", "-", "globin", "reporter", "transcripts", "containing", "the", "SMG5", "3", "'", "UTR", "alone", "or", "supplemented", "with", "cassettes", "containing", "the", "indicated", "RSE", "variants", "in", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", ".", "Half", "-", "lives", "were", "determined", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "decay", "curves", "are", "shown", "with", "points", "representing", "mean", "and", "standard", "deviation", "at", "each", "timepoint", ".", "Significance", "was", "measured", "compared", "to", "the", "SMG5", "3", "'", "UTR", "reporter", "using", "the", "sum", "-", "of", "-", "squares", "F", "test", ".", "D", "RNA", "immunoprecipitation", "experiments", "evaluating", "hnRNP", "L", "association", "with", "deletion", "and", "replacement", "reporter", "transcripts", "from", "(", "C", ")", ".", "\"", "AS", "\"", "indicates", "a", "reporter", "in", "which", "the", "antisense", "sequence", "of", "the", "RSE", "was", "inserted", "in", "the", "SMG5", "3", "'", "UTR", "in", "the", "same", "position", "as", "the", "RSE", ".", "The", "northern", "blot", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "and", "quantification", "is", "presented", "in", "the", "accompanying", "bar", "graph", "with", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "*", "indicates", "P", "=", "0", ".", "0146", "in", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "The", "reporter", "containing", "the", "GAP", "3", "'", "UTR", "used", "here", "as", "a", "transfection", "control", "contains", "a", "predicted", "hnRNP", "L", "binding", "site", ",", "allowing", "its", "consistent", "recovery", "in", "the", "IPs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A The first 400 nt of all 3'UTRs represented in the UPF1 RIP-Seq dataset were analyzed for the occurrence of motifs corresponding to the indicated RNA-binding proteins. Transcripts were divided into groups based on the number of motifs present (0, 1, more than 1), indicated by the gradient triangle. The dotted line indicates the mean RIP-Seq efficiency for all transcripts used in the analysis. Mean and SD are plotted for all groups.B CDF plot of relative abundance of transcripts with 3'UTRs > 1000 nt in K562 cells under conditions of UPF1 or non-targeting shRNA, for transcripts with hnRNP L eCLIP peaks in the indicated intervals Each trace represents a category of CLIP peak locations. For mRNAs with peaks > 400 nt from the TC or with peaks in the 5'UTR or CDS, transcripts with peaks at 3'UTR positions 1-400 were excluded. Statistical significance was determined by Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for multiple comparisons and was determined based on comparison to the set with no 3'UTR CLIP peaks.C Representative northern blots assaying the stability of β-globin reporter transcripts containing the SMG5 3'UTR alone or supplemented with cassettes containing the indicated RSE variants in HeLa Tet-off cells. Half-lives were determined from at least 3 independent experiments and decay curves are shown with points representing mean and standard deviation at each timepoint. Significance was measured compared to the SMG5 3'UTR reporter using the sum-of-squares F test.D RNA immunoprecipitation experiments evaluating hnRNP L association with deletion and replacement reporter transcripts from (C). \"AS\" indicates a reporter in which the antisense sequence of the RSE was inserted in the SMG5 3'UTR in the same position as the RSE. The northern blot is representative of 3 independent experiments and quantification is presented in the accompanying bar graph with mean and standard deviation. * indicates P = 0.0146 in two-tailed Student's t-test. The reporter containing the GAP 3'UTR used here as a transfection control contains a predicted hnRNP L binding site, allowing its consistent recovery in the IPs."}
{"words": ["Figure", "2A", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "cells", "treated", "with", "hnRNP", "L", "siRNA", "or", "a", "combination", "of", "siRNAs", "against", "hnRNP", "L", "and", "UPF1", "identifies", "populations", "of", "transcripts", "that", "decreased", "in", "abundance", "upon", "hnRNP", "L", "knockdown", "in", "a", "UPF1", "-", "dependent", "manner", ".", "B", "CDF", "plot", "of", "transcript", "3", "'", "UTR", "lengths", "for", "subsets", "identified", "in", "(", "A", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "two", "-", "sided", "K", "-", "S", "test", ".", "P", "value", "for", "decreased", "set", "is", "from", "comparison", "to", "the", "set", "of", "total", "transcripts", ".", "P", "value", "for", "rescued", "set", "is", "from", "comparison", "to", "decreased", "set", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A RNA-seq analysis of cells treated with hnRNP L siRNA or a combination of siRNAs against hnRNP L and UPF1 identifies populations of transcripts that decreased in abundance upon hnRNP L knockdown in a UPF1-dependent manner. B CDF plot of transcript 3'UTR lengths for subsets identified in (A). Statistical significance was determined by two-sided K-S test. P value for decreased set is from comparison to the set of total transcripts. P value for rescued set is from comparison to decreased set. "}
{"words": ["Figure", "3A", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "found", "by", "RNA", "-", "Seq", "to", "decrease", "in", "abundance", "in", "the", "absence", "of", "hnRNP", "L", ".", "Values", "represent", "the", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", ".", "Significance", "of", "hnRNP", "L", "KD", "and", "UPF1", "KD", "were", "compared", "to", "NT", ",", "and", "the", "double", "knockdown", "was", "compared", "to", "hnRNP", "L", "KD", ".", "For", "clarity", ",", "only", "a", "single", "star", "is", "used", "to", "indicate", "significance", ";", "in", "all", "cases", "P", "≤", "0", ".", "025", "in", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "B", "Half", "-", "lives", "of", "selected", "transcripts", "under", "conditions", "of", "non", "-", "targeting", "or", "hnRNP", "L", "knockdown", ".", "Measurements", "were", "calculated", "based", "on", "proportional", "recovery", "of", "transcript", "labeled", "with", "5", "-", "EU", "in", "1", "hour", "versus", "total", "transcript", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Values", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "3", "independent", "replicates", ".", "C", "The", "stability", "of", "β", "globin", "reporters", "with", "the", "CSRP1", "3", "'", "UTR", ",", "along", "with", "several", "variants", "in", "which", "putative", "hnRNP", "L", "motifs", "in", "the", "indicated", "intervals", "were", "mutated", ",", "were", "evaluated", "in", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", ".", "The", "schematic", "indicates", "areas", "of", "3", "'", "UTR", "CA", "-", "enrichment", "in", "light", "blue", "and", "includes", "the", "sequence", "of", "the", "first", "200", "nucleotides", "of", "the", "CSRP1", "3", "'", "UTR", ",", "where", "putative", "hnRNP", "L", "binding", "elements", "are", "in", "red", "typeface", ".", "The", "northern", "blot", "is", "a", "representative", "example", "from", "3", "independent", "replicates", ".", "Mean", "values", "plotted", "with", "SD", "at", "each", "timepoint", "were", "used", "to", "quantify", "decay", "(", "right", "panel", ")", ".", "Significance", "is", "measured", "compared", "to", "the", "WT", "reporter", "using", "the", "sum", "-", "of", "-", "squares", "F", "test", ".", "D", "The", "stability", "of", "the", "WT", "and", "L", "mut", "1", "-", "200", "CSRP1", "reporters", "in", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "treated", "with", "non", "-", "targeting", "RNAi", "or", "siRNA", "against", "UPF1", "was", "evaluated", ".", "The", "northern", "blot", "is", "a", "representative", "example", "from", "at", "least", "3", "biological", "replicates", ".", "Decay", "quantification", "and", "statistics", "were", "performed", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "with", "significance", "measured", "compared", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A qPCR of selected transcripts found by RNA-Seq to decrease in abundance in the absence of hnRNP L. Values represent the mean and standard deviation of 3 independent biological replicates. Significance of hnRNP L KD and UPF1 KD were compared to NT, and the double knockdown was compared to hnRNP L KD. For clarity, only a single star is used to indicate significance; in all cases P ≤ 0.025 in two-tailed Student's t-tests.B Half-lives of selected transcripts under conditions of non-targeting or hnRNP L knockdown. Measurements were calculated based on proportional recovery of transcript labeled with 5-EU in 1 hour versus total transcript. Significance was determined using two-tailed Student's t-test: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ****P ≤ 0.0001. Values represent mean and standard deviation of 3 independent replicates.C The stability of β globin reporters with the CSRP1 3'UTR, along with several variants in which putative hnRNP L motifs in the indicated intervals were mutated, were evaluated in HeLa Tet-off cells. The schematic indicates areas of 3' UTR CA-enrichment in light blue and includes the sequence of the first 200 nucleotides of the CSRP1 3'UTR, where putative hnRNP L binding elements are in red typeface. The northern blot is a representative example from 3 independent replicates. Mean values plotted with SD at each timepoint were used to quantify decay (right panel). Significance is measured compared to the WT reporter using the sum-of-squares F test.D The stability of the WT and L mut 1-200 CSRP1 reporters in HeLa Tet-off cells treated with non-targeting RNAi or siRNA against UPF1 was evaluated. The northern blot is a representative example from at least 3 biological replicates. Decay quantification and statistics were performed as in (C), with significance measured compared to the non-targeting condition."}
{"words": ["Figure", "4A", "Motif", "analysis", "of", "recovered", "UPF1", "-", "associated", "transcripts", "analyzed", "by", "RIP", "-", "Seq", "Transcripts", "were", "binned", "into", "three", "3", "'", "UTR", "length", "classes", ",", "which", "were", "then", "further", "subdivided", "based", "on", "hnRNP", "L", "motif", "density", ".", "Each", "box", "plot", "represents", "the", "median", "and", "interquartile", "range", "with", "extensions", "from", "10", "%", "to", "90", "%", "of", "the", "indicated", "subset", ".", "Dotted", "line", "represents", "the", "median", "RIP", "-", "Seq", "efficiency", "of", "the", "class", "of", "transcripts", "with", "the", "shortest", "3", "'", "UTR", "and", "no", "hnRNP", "L", "binding", "motifs", ".", "Significance", "was", "computed", "using", "Kruskal", "-", "Wallis", "tests", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "B", "CDF", "plots", "of", "selected", "transcript", "classes", "from", "(", "A", ")", ".", "Log2", "(", "FC", ")", "of", "UPF1", "knockdown", "as", "compared", "to", "the", "non", "-", "targeting", "control", "indicates", "NMD", "sensitivity", "of", "each", "class", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "C", "Motif", "analysis", "of", "recovered", "UPF1", "-", "associated", "transcripts", "analyzed", "by", "RIP", "-", "Seq", "Transcripts", "are", "divided", "into", "tertiles", "by", "hnRNP", "L", "and", "PTBP1", "binding", "motif", "density", "and", "3", "'", "UTR", "length", ".", "Data", "are", "represented", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Dotted", "line", "represents", "the", "median", "RIP", "-", "Seq", "efficiency", "of", "the", "class", "of", "transcripts", "with", "the", "shortest", "3", "'", "UTR", "and", "low", "PTBP1", "/", "hnRNP", "L", "motif", "density", ".", "D", "CDF", "plots", "of", "selected", "transcript", "classes", "from", "(", "C", ")", "analyzed", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Motif analysis of recovered UPF1-associated transcripts analyzed by RIP-Seq Transcripts were binned into three 3'UTR length classes, which were then further subdivided based on hnRNP L motif density. Each box plot represents the median and interquartile range with extensions from 10% to 90% of the indicated subset. Dotted line represents the median RIP-Seq efficiency of the class of transcripts with the shortest 3'UTR and no hnRNP L binding motifs. Significance was computed using Kruskal-Wallis tests with Dunn's correction for multiple comparisons. B CDF plots of selected transcript classes from (A). Log2(FC) of UPF1 knockdown as compared to the non-targeting control indicates NMD sensitivity of each class. Significance was determined by Kruskal-Wallis test with Dunn's correction for multiple comparisons Data information: **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.C Motif analysis of recovered UPF1-associated transcripts analyzed by RIP-Seq Transcripts are divided into tertiles by hnRNP L and PTBP1 binding motif density and 3'UTR length. Data are represented and analyzed as in (A). Dotted line represents the median RIP-Seq efficiency of the class of transcripts with the shortest 3'UTR and low PTBP1/hnRNP L motif density. D CDF plots of selected transcript classes from (C) analyzed as in (B). Data information: **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5C", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "in", "SU", "-", "DHL", "-", "4", "cells", "under", "conditions", "of", "non", "-", "targeting", "RNAi", "or", "hnRNP", "L", "knockdown", "with", "or", "without", "50", "μg", "/", "mL", "cycloheximide", "treatment", "(", "for", "4", "hours", ";", "n", "≥", "3", ")", ".", "Significance", "of", "hnRNP", "L", "KD", "+", "DMSO", "and", "NT", "+", "CHX", "were", "compared", "to", "NT", "+", "DMSO", ",", "and", "hnRNP", "L", "KD", "+", "CHX", "was", "compared", "to", "hnRNP", "L", "KD", "+", "DMSO", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "For", "clarity", ",", "only", "a", "single", "star", "was", "used", "to", "indicate", "significance", ";", "in", "all", "cases", "P", "≤", "0", ".", "05", "in", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "E", "Half", "-", "life", "determination", "from", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "reporter", "constructs", "in", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "or", "UPF1", "siRNAs", ".", "For", "plots", "comparing", "non", "-", "targeting", "with", "UPF1", "knockdown", ",", "significance", "is", "compared", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "using", "the", "the", "sum", "-", "of", "-", "squares", "F", "test", ".", "The", "fourth", "plot", "compares", "the", "non", "-", "targeting", "decay", "curves", "of", "the", "three", "reporters", ",", "and", "significance", "is", "compared", "to", "the", "decay", "of", "the", "fusion", "transcript", ".", "Points", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "from", "qRT", "-", "PCR", "at", "each", "time", "point", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C qPCR of selected transcripts in SU-DHL-4 cells under conditions of non-targeting RNAi or hnRNP L knockdown with or without 50 μg/mL cycloheximide treatment (for 4 hours; n ≥ 3). Significance of hnRNP L KD + DMSO and NT + CHX were compared to NT + DMSO, and hnRNP L KD + CHX was compared to hnRNP L KD + DMSO. Bars represent the mean ± SD. For clarity, only a single star was used to indicate significance; in all cases P ≤ 0.05 in two-tailed Student's t-tests.E Half-life determination from RT-qPCR detection of reporter constructs in HeLa Tet-off cells transfected with non-targeting or UPF1 siRNAs. For plots comparing non-targeting with UPF1 knockdown, significance is compared to the non-targeting condition using the the sum-of-squares F test. The fourth plot compares the non-targeting decay curves of the three reporters, and significance is compared to the decay of the fusion transcript. Points represent the mean ± SD from qRT-PCR at each time point of at least 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "in", "SU", "-", "DHL", "-", "4", "cells", "under", "conditions", "of", "BCL2", "knockdown", ",", "hnRNP", "L", "knockdown", ",", "or", "non", "-", "targeting", "control", "siRNA", "Nucleofection", "(", "n", "≥", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "Significance", "was", "determined", "compared", "to", "NT", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Quantification", "of", "protein", "reduction", "in", "knockdown", "experiments", "and", "a", "representative", "western", "blot", ".", "Each", "point", "represents", "a", "trial", "(", "n", "≥", "5", "for", "a", "given", "condition", ")", ".", "Mean", "with", "standard", "deviation", "are", "indicated", "on", "the", "plot", ".", "Target", "protein", "levels", "from", "all", "biological", "replicates", "were", "normalized", "to", "MATRIN3", ",", "with", "statistical", "analysis", "as", "in", "panel", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "C", "FACS", "-", "based", "apoptosis", "analysis", "of", "SU", "-", "DHL", "-", "4", "cells", "Nucleofected", "using", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "exposed", "to", "5", "μM", "MCL1", "inhibitor", "for", "24", "hours", ".", "Quantification", "of", "relative", "change", "in", "each", "quadrant", "is", "provided", "where", "points", "represent", "individual", "experiments", "(", "n", "≥", "5", "for", "a", "given", "condition", ")", ".", "Mean", "with", "standard", "deviation", "are", "indicated", "on", "the", "plot", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "as", "in", "panel", "(", "A", ")", ".", "A", "representative", "FACS", "experiment", "is", "shown", "with", "the", "percentage", "of", "cells", "in", "each", "gate", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A qPCR of selected transcripts in SU-DHL-4 cells under conditions of BCL2 knockdown, hnRNP L knockdown, or non-targeting control siRNA Nucleofection (n ≥ 4 independent experiments). Bars indicate mean ± SD. Significance was determined compared to NT using two-tailed Student's t-tests. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.Quantification of protein reduction in knockdown experiments and a representative western blot. Each point represents a trial (n ≥ 5 for a given condition). Mean with standard deviation are indicated on the plot. Target protein levels from all biological replicates were normalized to MATRIN3, with statistical analysis as in panel (A). Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001.C FACS-based apoptosis analysis of SU-DHL-4 cells Nucleofected using the indicated siRNAs and exposed to 5 μM MCL1 inhibitor for 24 hours. Quantification of relative change in each quadrant is provided where points represent individual experiments (n ≥ 5 for a given condition). Mean with standard deviation are indicated on the plot and statistical analysis was performed as in panel (A). A representative FACS experiment is shown with the percentage of cells in each gate indicated. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "7B", "SU", "-", "DHL", "-", "4", "and", "SU", "-", "DHL", "-", "6", "cells", "were", "treated", "with", "varying", "doses", "of", "BCL2", "inhibitor", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "after", "24", "hours", "of", "drug", "treatment", "using", "an", "assay", "for", "ATP", "concentration", "as", "a", "proxy", "for", "live", "cells", ".", "Traces", "were", "generated", "from", "at", "least", "5", "independent", "biological", "replicates", ".", "Points", "represent", "mean", "±", "SD", "at", "each", "dose", ".", "P", "value", "from", "comparison", "of", "dose", "response", "between", "SU", "-", "DHL", "-", "4", "and", "SU", "-", "DHL", "-", "6", "cells", "calculated", "using", "sum", "-", "of", "-", "squares", "F", "test", "is", "given", "in", "the", "graph", "key", ".", "Significance", "of", "individual", "points", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "is", "marked", "using", "asterisks", "on", "the", "graph", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "C", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "in", "SU", "-", "DHL", "-", "6", "cells", "under", "conditions", "of", "hnRNP", "L", "knockdown", "or", "non", "-", "targeting", "control", "(", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "Significance", "of", "hnRNP", "L", "KD", "was", "determined", "compared", "to", "NT", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "D", "Representative", "amplification", "of", "the", "region", "of", "chromosomal", "deletion", "in", "edited", "cells", ".", "PCR", "products", "were", "run", "on", "a", "1", "%", "agarose", "gel", "to", "resolve", "the", "amplicons", "from", "edited", "and", "unedited", "chromosomes", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "E", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "in", "edited", "SU", "-", "DHL", "-", "6", "cells", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Significance", "was", "determined", "as", "compared", "to", "control", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "F", "Quantification", "of", "protein", "reduction", "and", "western", "blot", "of", "lysates", "from", "a", "representative", "experiment", "of", "edited", "cells", ".", "Target", "protein", "levels", "from", "all", "biological", "replicates", "were", "normalized", "to", "MATRIN3", ".", "Each", "point", "represents", "a", "trial", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "Significance", "was", "determined", "compared", "to", "NT", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "G", "FACS", "-", "based", "apoptosis", "analysis", "of", "edited", "SU", "-", "DHL", "-", "6", ".", "Quantification", "of", "relative", "change", "in", "each", "quadrant", "is", "provided", ",", "where", "points", "represent", "individual", "experiments", "(", "n", "=", "6", "for", "a", "given", "condition", ")", ".", "Mean", "with", "standard", "deviation", "are", "indicated", "on", "the", "plot", ",", "analyzed", "as", "in", "(", "F", ")", ".", "Shown", "is", "a", "representative", "FACS", "experiment", ".", "Percentage", "of", "cells", "in", "each", "gate", "is", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B SU-DHL-4 and SU-DHL-6 cells were treated with varying doses of BCL2 inhibitor. Cell viability was measured after 24 hours of drug treatment using an assay for ATP concentration as a proxy for live cells. Traces were generated from at least 5 independent biological replicates. Points represent mean ± SD at each dose. P value from comparison of dose response between SU-DHL-4 and SU-DHL-6 cells calculated using sum-of-squares F test is given in the graph key. Significance of individual points calculated using two-tailed Student's t-tests is marked using asterisks on the graph. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.C qPCR of selected transcripts in SU-DHL-6 cells under conditions of hnRNP L knockdown or non-targeting control (n = 5 independent experiments). Bars indicate mean ± SD. Significance of hnRNP L KD was determined compared to NT using two-tailed Student's t-tests. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.D Representative amplification of the region of chromosomal deletion in edited cells. PCR products were run on a 1% agarose gel to resolve the amplicons from edited and unedited chromosomes. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.E qPCR of selected transcripts in edited SU-DHL-6 cells (n = 4 independent experiments). Significance was determined as compared to control Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.F Quantification of protein reduction and western blot of lysates from a representative experiment of edited cells. Target protein levels from all biological replicates were normalized to MATRIN3. Each point represents a trial (n = 4). Bars indicate mean ± SD. Significance was determined compared to NT using two-tailed Student's t-tests. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.G FACS-based apoptosis analysis of edited SU-DHL-6. Quantification of relative change in each quadrant is provided, where points represent individual experiments (n = 6 for a given condition). Mean with standard deviation are indicated on the plot, analyzed as in (F). Shown is a representative FACS experiment. Percentage of cells in each gate is indicated. Data information: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "(", "BY4741", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "-", "phase", "in", "YPD", "and", "were", "then", "preincubated", "with", "50", "µM", "cerulenin", "or", "50", "µM", "cerulenin", "+", "0", ".", "1", "mM", "palmitic", "/", "stearic", "/", "myristic", "acids", "or", "with", "DMSO", "(", "-", ")", "in", "the", "rich", "medium", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "washed", "and", "shifted", "to", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", "(", "SD", "-", "N", ")", "for", "4", "h", "in", "the", "presence", "of", "50", "µM", "cerulenin", "or", "50", "µM", "cerulenin", "+", "0", ".", "1", "mM", "palmitic", "/", "stearic", "/", "myristic", "acids", "or", "DMSO", ".", "Cells", "were", "then", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Pgk1", "antibodies", "(", "A", ")", ",", "(", "A", ",", "B", ")", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "(", "BY4741", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "-", "phase", "in", "YPD", "and", "were", "then", "preincubated", "with", "50", "µM", "cerulenin", "or", "50", "µM", "cerulenin", "+", "0", ".", "1", "mM", "palmitic", "/", "stearic", "/", "myristic", "acids", "or", "with", "DMSO", "(", "-", ")", "in", "the", "rich", "medium", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "washed", "and", "shifted", "to", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", "(", "SD", "-", "N", ")", "for", "4", "h", "in", "the", "presence", "of", "50", "µM", "cerulenin", "or", "50", "µM", "cerulenin", "+", "0", ".", "1", "mM", "palmitic", "/", "stearic", "/", "myristic", "acids", "or", "DMSO", ".", "Cells", "were", "then", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Pgk1", "antibodies", "(", "A", ")", ",", "or", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "B", ")", "(", "C", ")", "Cells", "(", "TOS038", ")", "expressing", "Atg1", "-", "GFP", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "and", "were", "then", "preincubated", "in", "YPD", "with", "50", "µM", "cerulenin", "or", "with", "DMSO", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "washed", ",", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "4", "h", ",", "and", "then", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", "and", "pep4", "∆", "(", "TOS015", ")", "strains", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "and", "preincubated", "in", "YPD", "with", "cerulenin", "or", "DMSO", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "pulse", "-", "labeled", "for", "10", "min", "with", "[", "35S", "]", "methionine", "and", "cysteine", "and", "chased", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "Ape1", "antibodies", "followed", "by", "SDS", "‒", "PAGE", "and", "X", "-", "ray", "film", "to", "detect", "radioactive", "signals", ".", "prApe1", ",", "premature", "Ape1", ";", "mApe1", ",", "mature", "Ape1", ".", "(", "(", "E", ")", "Cells", "of", "the", "fas1", "∆", "(", "TOS029", ")", "strain", "expressing", "GFP", "‒", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "+", "0", ".", "1", "mM", "palmitic", "/", "stearic", "/", "myristic", "acids", "and", "shifted", "either", "to", "the", "same", "medium", "or", "to", "YPD", "without", "fatty", "acids", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "then", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "‒", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", "cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "and", "then", "preincubated", "in", "YPD", "with", "25", "µM", "or", "50", "µM", "cerulenin", "(", "25", ",", "50", ")", "or", "with", "DMSO", "(", "-", ")", "in", "rich", "medium", "for", "30", "min", ".", "Cells", "were", "washed", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "in", "the", "presence", "of", "cerulenin", "(", "25", ",", "50", ")", "or", "DMSO", "(", "-", ")", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "‒", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Pgk1", "antibodies", ".", "cer", ",", "cerulenin", ";", "DIC", ",", "Differential", "interference", "contrast", ";", "FA", ",", "fatty", "acids", ";", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "-", "type", "YPD", ",", "complete", "medium", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Wild-type (WT) (BY4741) cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log-phase in YPD and were then preincubated with 50 µM cerulenin or 50 µM cerulenin + 0.1 mM palmitic/stearic/myristic acids or with DMSO (-) in the rich medium for 30 min. Cells were washed and shifted to nitrogen-starvation medium (SD-N) for 4 h in the presence of 50 µM cerulenin or 50 µM cerulenin + 0.1 mM palmitic/stearic/myristic acids or DMSO. Cells were then lysed and subjected to SDS−PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP and anti-Pgk1 antibodies (A),(A, B) Wild-type (WT) (BY4741) cells expressing GFP−Atg8were grown to mid-log-phase in YPD and were then preincubated with 50 µM cerulenin or 50 µM cerulenin + 0.1 mM palmitic/stearic/myristic acids or with DMSO (-) in the rich medium for 30 min. Cells were washed and shifted to nitrogen-starvation medium (SD-N) for 4 h in the presence of 50 µM cerulenin or 50 µM cerulenin + 0.1 mM palmitic/stearic/myristic acids or DMSO. Cells were then lysed and subjected to SDS−PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP and anti-Pgk1 antibodies (A), or were visualized by fluorescence microscopy (B)(C) Cells (TOS038) expressing Atg1-GFP were grown to mid-log phase and were then preincubated in YPD with 50 µM cerulenin or with DMSO for 30 min. Cells were washed, shifted to SD-N for 4 h, and then visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm.(D) WT (BY4741) and pep4∆ (TOS015) strains were grown to mid-log phase and preincubated in YPD with cerulenin or DMSO for 30 min. Cells were pulse-labeled for 10 min with [35S] methionine and cysteine and chased for the indicated time periods. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with anti-Ape1 antibodies followed by SDS‒PAGE and X-ray film to detect radioactive signals. prApe1, premature Ape1; mApe1, mature Ape1. ((E) Cells of the fas1∆ (TOS029) strain expressing GFP‒Atg8 were grown to mid-log phase in YPD + 0.1 mM palmitic/stearic/myristic acids and shifted either to the same medium or to YPD without fatty acids for 30 min. Cells were then shifted to SD-N for the indicated times. Cell lysates were subjected to SDS‒PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP antibodies.(F) WT (BY4741) cells were grown to mid-log phase and then preincubated in YPD with 25 µM or 50 µM cerulenin (25, 50) or with DMSO (-) in rich medium for 30 min. Cells were washed and shifted to SD-N in the presence of cerulenin (25, 50) or DMSO (-). Cells were lysed and subjected to SDS‒PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP and anti-Pgk1 antibodies. cer, cerulenin; DIC, Differential interference contrast; FA, fatty acids; SD-N, nitrogen-starvation medium; WT, wild-type YPD, complete medium."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Cells", "(", "TN124", "strain", ")", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "and", "preincubated", "in", "YPD", "with", "50", "µM", "cerulenin", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "(", "Cer", "preincubation", ")", "or", "incubated", "with", "DMSO", "without", "preincubation", "]", "(", "-", ")", ".", "Cells", "were", "then", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "3", "h", "with", "the", "addition", "of", "DMSO", "or", "50", "µM", "cerulenin", "(", "cer", ")", ".", "Autophagic", "activity", "was", "measured", "by", "alkaline", "phosphatase", "assay", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "Cells", "were", "grown", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "stained", "with", "BODIPY", ",", "and", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", "and", "tagΔsteΔ", "(", "H1246", ")", "cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "3", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "Nile", "red", "and", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", "and", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", ",", "anti", "-", "Ape1", "(", "prApe1", ",", "premature", "Ape1", ";", "mApe1", ",", "mature", "Ape1", ")", ",", "and", "anti", "-", "Fas1", "and", "anti", "-", "Pgk1", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", "and", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", "cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "2", "h", ".", "GFP", "−", "Atg8", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "cer", ",", "cerulenin", ";", "DIC", ",", "Differential", "interference", "contrast", ";", "FA", ",", "fatty", "acids", ";", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "-", "type", ",", "YPD", ",", "complete", "medium", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Cells (TN124 strain) were grown to mid-log phase and preincubated in YPD with 50 µM cerulenin for the indicated time periods (Cer preincubation) or incubated with DMSO without preincubation] (-). Cells were then shifted to SD-N for 3 h with the addition of DMSO or 50 µM cerulenin (cer). Autophagic activity was measured by alkaline phosphatase assay. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05 (Student's t-test).(B) Cells were grown as in (A), stained with BODIPY, and visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm.(C) WT (SCY62) and tagΔsteΔ (H1246) cells were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for 3 h. Cells were stained with Nile red and visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm.(D) WT (SCY62) and tag∆ste∆ (H1246) cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for the indicated time periods. Cell lysates were subjected to SDS−PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP, anti-Ape1 (prApe1, premature Ape1; mApe1, mature Ape1), and anti-Fas1 and anti-Pgk1 antibodies.(E) WT (SCY62) and tag∆ste∆ (H1246) cells were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for 2 h. GFP−Atg8 was visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm. cer, cerulenin; DIC, Differential interference contrast; FA, fatty acids; SD-N, nitrogen-starvation medium; WT, wild-type, YPD, complete medium."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "GAL", "-", "DGA1GAL", "-", "ARE2lro1Δ", "are1Δ", "(", "FYS118", "strain", ")", "was", "grown", "on", "SC", "(", "synthetic", "minimal", "medium", "without", "dextrose", ")", "+", "raffinoseovernight", ",", "diluted", "to", "OD", "0", ".", "4", ",", "and", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "either", "SC", "+", "glucose", "or", "SC", "+", "galactose", "medium", ".", "Cells", "were", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "2", "h", ",", "stained", "with", "BODIPY", ",", "and", "visualized", "by", "fluorescencemicroscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", "and", "GAL", "-", "DGA1", "GAL", "-", "ARE2", "lro1", "∆", "are1", "∆", "(", "FYS118", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "as", "in", "A", ".", "Cells", "were", "lysed", "at", "the", "indicated", "times", "and", "subjected", "to", "SDS", "‒", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "(", "(", "C", ",", "D", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", "and", "GAL", "-", "DGA1", "GAL", "-", "ARE2", "lro1", "∆", "are1", "∆", "(", "FYS118", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "(", "C", ")", "or", "GFP", "−", "Atg1", "(", "D", ")", "were", "grown", "as", "in", "A", "and", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", "after", "2", "h", "in", "SD", "-", "N", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "DIC", ",", "Differential", "interference", "contrast", ";", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) GAL-DGA1GAL-ARE2lro1Δ are1Δ (FYS118 strain) was grown on SC (synthetic minimal medium without dextrose) + raffinoseovernight, diluted to OD 0.4, and grown to mid-log phase in either SC + glucose or SC + galactose medium. Cells were shifted to SD-N for 2 h, stained with BODIPY, and visualized by fluorescencemicroscopy. Scale bar, 5 μm.(B) WT (BY4741) and GAL-DGA1 GAL-ARE2 lro1∆ are1∆ (FYS118) cells expressing GFP−Atg8 were grown as in A. Cells were lysed at the indicated times and subjected to SDS‒PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP antibodies. ((C, D) WT (BY4741) and GAL-DGA1 GAL-ARE2 lro1∆ are1∆ (FYS118) cells expressing GFP−Atg8 (C) or GFP−Atg1 (D) were grown as in A and visualized by fluorescence microscopy after 2 h in SD-N. Scale bar, 5 μm. DIC, Differential interference contrast; SD-N, nitrogen-starvation medium; WT, wild-type."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", ",", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", ",", "tag", "∆", "(", "H1226", ")", "and", "ste", "∆", "(", "H1112", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "BODIPY", "and", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) WT (SCY62), tag∆ste∆ (H1246), tag∆ (H1226) and ste∆ (H1112) cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for 6 h. Cells were stained with BODIPY and visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", ",", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", ",", "tag", "∆", "(", "H1226", ")", "and", "ste", "∆", "(", "H1112", ")", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", ".", "(", "C", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", ",", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", ",", "tag", "∆", "(", "H1226", ")", "and", "ste", "∆", "(", "H1112", ")", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "2", "h", ".", "GFP", "−", "Atg8", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "(", "D", ")", "WT", "(", "SCY62", ")", ",", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", ",", "tag", "∆", "(", "H1226", ")", "and", "ste", "∆", "(", "H1112", ")", "cells", "were", "grown", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", "in", "urea", "gel", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "Atg8", "and", "anti", "-", "Pgk1", "antibodies", ".", "Atg8", "I", ",", "non", "-", "lipidated", "Atg8", ";", "Atg8", "II", ",", "lipidated", "Atg8", ".", "DIC", ",", "Differential", "interference", "contrast", ";", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) WT (SCY62), tag∆ste∆ (H1246), tag∆ (H1226) and ste∆ (H1112) cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for the indicated time periods. Cells were lysed and subjected to SDS−PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP antibodies. (B) Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05 (Student's t-test). (. (C) WT (SCY62), tag∆ste∆ (H1246), tag∆ (H1226) and ste∆ (H1112) cells expressing GFP-Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for 2 h. GFP−Atg8 was visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm. ((D) WT (SCY62), tag∆ste∆ (H1246), tag∆ (H1226) and ste∆ (H1112) cells were grown as in (A). Lysates were subjected to SDS−PAGE in urea gel, followed by western blot analysis using anti-Atg8 and anti-Pgk1 antibodies. Atg8 I, non-lipidated Atg8; Atg8 II, lipidated Atg8. DIC, Differential interference contrast; SD-N, nitrogen-starvation medium; WT, wild type."}
{"words": ["Figure", "6Fig", ".", "6", "Lack", "of", "lipid", "droplets", "inhibits", "starvation", "-", "induced", "formation", "of", "autophagosomes", ".", "(", "A", ",", "H", ")", "WT", "pep4", "∆", "(", "pep4", "∆", ")", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "tag", "∆", "ste", "∆", "pep4", "∆", "(", "tag", "∆", "ste", "∆", "pep4", "∆", ")", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "ste", "∆", "pep4", "∆", "(", "ste", "∆", "pep4", "∆", ")", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "tag", "∆", "pep4", "∆", "(", "tag", "∆", "pep4", "∆", ")", "(", "G", ",", "H", ")", "cells", "were", "grown", "to", "an", "exponential", "phase", "in", "YPD", "before", "being", "starved", "in", "SD", "-", "N", "for", "2", "h", ",", "and", "were", "then", "processed", "for", "electron", "microscopy", ".", "H", "is", "a", "magnification", "of", "the", "box", "in", "panel", "G", ".", "Magnification", "of", "proliferating", "ER", "in", "a", "tag", "∆", "ste", "∆", "(", "H1246", ")", "cell", "is", "shown", "in", "(", "I", ")", "Asterisks", "indicate", "autophagic", "bodies", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "PM", ",", "plasma", "membrane", ";", "CW", ",", "cell", "wall", ";", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", ";", "M", ",", "mitochondrion", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "#", ",", "trehalose", ";", "F", ",", "ER", "proliferation", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "µm", "(", "A", "-", "H", ")", "and", "200", "nm", "(", "I", ")", ".", "(", "J", ")", "Average", "number", "of", "autophagic", "bodies", "per", "cell", "section", "was", "determined", "by", "counting", "100", "randomly", "selected", "cell", "profiles", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "fromcounting", "of", "the", "three", "grids", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "type", "YPD", ",", "complete", "medium", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Fig. 6 Lack of lipid droplets inhibits starvation-induced formation of autophagosomes. (A, H) WT pep4∆ (pep4∆) (A,B), tag∆ste∆ pep4∆ (tag∆ste∆pep4∆)(C,D), ste∆ pep4∆ (ste∆pep4∆)(E,F) and tag∆ pep4∆ (tag∆pep4∆) (G,H) cells were grown to an exponential phase in YPD before being starved in SD-N for 2 h, and were then processed for electron microscopy. H is a magnification of the box in panel G. Magnification of proliferating ER in a tag∆ste∆ (H1246) cell is shown in (I) Asterisks indicate autophagic bodies. N, nucleus; PM, plasma membrane; CW, cell wall; ER, endoplasmic reticulum; M, mitochondrion; V, vacuole; #, trehalose; F, ER proliferation. Scale bars: 1 µm (A-H) and 200 nm (I). (J) Average number of autophagic bodies per cell section was determined by counting 100 randomly selected cell profiles. Error bars represent standard deviations fromcounting of the three grids. ***P < 0.001 (Student's t-test). SD-N,nitrogen-starvation medium; WT, wild type YPD, complete medium."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", ",", "tgl1", "∆", ",", "yeh1", "∆", ",", "and", "yeh2", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "−", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", "is", "presented", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", "and", "tgl3", "∆", "tgl4", "∆", "tgl5", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", ",", "treated", ",", "lysed", ",", "and", "western", "blotted", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", "is", "presented", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "(", "C", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", ",", "ayr1", "∆", "and", "ldh1", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", ",", "treated", ",", "lysed", ",", "and", "western", "blotted", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", "is", "presented", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", ",", "ldh1", "∆", "ayr1", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", ",", "treated", ",", "lysed", ",", "and", "western", "blotted", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", "is", "presented", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "-", "t", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", ",", "ice2", "∆", "and", "ldb16", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", ",", "treated", ",", "lysed", ",", "and", "western", "blotted", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "/", "GFP", "−", "Atg8", "ratio", "is", "presented", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "WT", "(", "BY4741", ")", ",", "ice2", "∆", "and", "yeh1", "∆", "cells", "expressing", "GFP", "−", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "YPD", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "4", "h", ".", "GFP", "−", "Atg8", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "DIC", ",", "Differential", "interference", "contrast", ";", "SD", "-", "N", ",", "nitrogen", "-", "starvation", "medium", ";", "WT", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) WT (BY4741), tgl1∆, yeh1∆ ,and yeh2∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for the indicated time periods. Cells were lysed and subjected to SDS−PAGE, followed by western blot analysis using anti-GFP antibodies. Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio is presented on the right. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05 (Student's t-test).(B) WT (BY4741) and tgl3∆tgl4∆tgl5∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown, treated, lysed, and western blotted as in (A). Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio is presented on the right. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05 (Student's t-test). ((C) WT (BY4741), ayr1∆ and ldh1∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown, treated, lysed, and western blotted as in (A). Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio is presented on the right. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05 (Student's t-test).(D) WT (BY4741), ldh1∆ayr1∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown, treated, lysed, and western blotted as in (A). Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio is presented on the right. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. **P < 0.01 (Student's-t test).(E) WT (BY4741), ice2∆ and ldb16∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown, treated, lysed, and western blotted as in (A). Quantification of the GFP/GFP−Atg8 ratio is presented on the right. Error bars represent the s.e.m. of three independent experiments. *P < 0.05, **P < 0.01 ***P < 0.001 (Student's t-test).(F) WT (BY4741), ice2∆ and yeh1∆ cells expressing GFP−Atg8 were grown to mid-log phase in YPD and shifted to SD-N for 4 h. GFP−Atg8 was visualized by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm. DIC, Differential interference contrast; SD-N, nitrogen-starvation medium; WT, wild type."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Total", "lysates", "of", "different", "mouse", "organs", "underwent", "immunoblotting", "analysis", "using", "anti", "-", "Pdia4", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", ")", "Min6", "cells", "were", "treated", "with", "glucose", "and", "palmitate", "at", "the", "indicated", "dosages", ".", "Total", "lysate", "underwent", "immunoblotting", "analysis", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "Human", "islets", "were", "treated", "with", "glucose", "and", "palmitate", "at", "the", "indicated", "dosages", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "analysis", ".", "(", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "(", "G", ")", "Sera", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "BKS", "and", "Leprdb", "/", "db", "mice", ",", "aged", "4", ",", "8", ",", "and", "18", "weeks", ",", "B6", "mice", ",", "fed", "with", "a", "normal", "diet", "(", "ND", ")", "and", "a", "high", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "4", "weeks", ",", "and", "humans", ",", "healthy", "volunteers", "and", "diabetic", "patients", "(", "T2D", ")", ",", "were", "quantified", "for", "Pdia4", "level", "using", "an", "anti", "-", "Pdia4", "ELISA", "kit", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "more", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "H", ")", "Immunoblotting", "analysis", "of", "Pdia4", "and", "markers", "in", "the", "cytosolic", "(", "Cyto", ")", ",", "nuclear", "(", "Nuc", ")", ",", "membrane", "(", "Mem", ")", ",", "mitochondrial", "(", "Mito", ")", ",", "and", "ER", "compartments", "of", "Ming", "6", "cells", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Total lysates of different mouse organs underwent immunoblotting analysis using anti-Pdia4 and anti-actin antibodies. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD.(C) Min6 cells were treated with glucose and palmitate at the indicated dosages. Total lysate underwent immunoblotting analysis using the indicated antibodies. (D) Human islets were treated with glucose and palmitate at the indicated dosages, followed by immunoblotting analysis. ( Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD.(G) Sera from wild-type (WT) BKS and Leprdb/db mice, aged 4, 8, and 18 weeks, B6 mice, fed with a normal diet (ND) and a high fat diet (HFD) for 4 weeks, and humans, healthy volunteers and diabetic patients (T2D), were quantified for Pdia4 level using an anti-Pdia4 ELISA kit. Data information: Data from 3 experiments more are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(H) Immunoblotting analysis of Pdia4 and markers in the cytosolic (Cyto), nuclear (Nuc), membrane (Mem), mitochondrial (Mito), and ER compartments of Ming 6 cells using the indicated antibodies. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Survival", "rate", "and", "life", "span", "of", "WT", ",", "Pdia4", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", ",", "and", "Pdia4tg", "/", "tg", "(", "TG", ")", "mice", "on", "Leprdb", "/", "db", "background", "from", "birth", "to", "120", "weeks", "Data", "information", ":", "The", "number", "of", "mice", "(", "n", ")", "is", "indicated", "in", "parentheses", ".", "Data", "from", "over", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Log", "rank", "test", "were", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "B", ")", "Pancreata", "of", "18", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "Pdia4", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "mice", "on", "BKS", "or", "Leprdb", "/", "db", "background", "were", "stained", "with", "anti", "-", "insulin", "(", "αIns", ")", "antibody", "and", "dihydroethidium", "(", "DHE", ")", "(", "left", ")", ".", "Islet", "area", "(", "μm2", ")", "and", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "RFI", ")", "were", "quantified", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "The", "dash", "circles", "indicate", "islet", "regions", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "over", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "were", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "D", ")", "The", "same", "batch", "mice", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "given", "water", "containing", "BrdU", ".", "The", "BrdU", "+", "cells", "of", "the", "islets", "were", "visualized", "and", "quantified", "(", "BrdU", "+", "labeling", ")", ".", "TUNEL", "-", "positive", "cells", "in", "the", "islets", "of", "the", "mice", "(", "B", ")", "were", "visualized", "and", "quantified", "(", "TUNEL", "assay", ")", ".", "BrdU", "+", "cells", "per", "islet", "area", "(", "0", ".", "01", "mm2", ")", "and", "TUNEL", "+", "cells", "per", "islet", "area", "(", "0", ".", "05", "mm2", ")", "are", "expressed", "in", "arbitrary", "units", "(", "AU", ")", ".", "The", "dash", "circles", "indicate", "islet", "regions", "and", "the", "black", "arrowheads", "indicate", "TUNEL", "+", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "over", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "were", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "F", ")", "insulin", "in", "supernatants", "of", "the", "mouse", "islets", "(", "F", ")", "in", "GSIS", "assays", ".", "High", "glucose", "(", "HG", ",", "16", ".", "7", "mM", ")", "or", "low", "glucose", "(", "LG", ",", "3", ".", "3", ")", "were", "used", "in", "GSIS", "assays", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "over", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "were", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Survival rate and life span of WT, Pdia4-/-(KO), and Pdia4tg/tg (TG) mice on Leprdb/db background from birth to 120 weeks Data information: The number of mice (n) is indicated in parentheses. Data from over 3 experiments are presented as the mean ± SD. Log rank test were used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(B) Pancreata of 18-week-old WT and Pdia4-/- (KO) mice on BKS or Leprdb/db background were stained with anti-insulin (αIns) antibody and dihydroethidium (DHE) (left). Islet area (μm2) and relative fluorescence intensity (RFI) were quantified (right). Scale bar: 100 μm. The dash circles indicate islet regions. Data information: Data from over 3 experiments are presented as the mean ± SD. one-way ANOVA test were used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(D) The same batch mice as in (B) were given water containing BrdU. The BrdU+ cells of the islets were visualized and quantified (BrdU+ labeling). TUNEL-positive cells in the islets of the mice (B) were visualized and quantified (TUNEL assay). BrdU+ cells per islet area (0.01 mm2) and TUNEL+ cells per islet area (0.05 mm2) are expressed in arbitrary units (AU). The dash circles indicate islet regions and the black arrowheads indicate TUNEL+ cells. Data information: Data from over 3 experiments are presented as the mean ± SD. one-way ANOVA test were used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.F) insulin in supernatants of the mouse islets (F) in GSIS assays. High glucose (HG, 16.7 mM) or low glucose (LG, 3.3) were used in GSIS assays. Data information: Data from over 3 experiments are presented as the mean ± SD. one-way ANOVA test were used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Pancreata", "of", "the", "same", "batch", "of", "mice", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "at", "the", "age", "of", "14", "weeks", ",", "were", "stained", "with", "anti", "-", "insulin", "(", "αIns", ")", "antibody", "and", "DHE", "(", "left", ")", ".", "Islet", "area", "(", "μm2", ")", "and", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "RFI", ")", "were", "quantified", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "The", "dash", "circles", "indicate", "islet", "regions", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "more", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "D", ")", "The", "islets", "of", "the", "mice", "from", "(", "C", ")", "were", "tested", "for", "GSIS", ".", "High", "glucose", "(", "HG", ",", "16", ".", "7", "mM", ")", "or", "low", "glucose", "(", "LG", ",", "3", ".", "3", "mM", ")", "were", "used", "in", "GSIS", "assays", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "more", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Pancreata of the same batch of mice as in (A), at the age of 14 weeks, were stained with anti-insulin (αIns) antibody and DHE (left). Islet area (μm2) and relative fluorescence intensity (RFI) were quantified (right). Scale bar = 100 μm. The dash circles indicate islet regions. Data information: Data from 3 experiments more are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(D) The islets of the mice from (C) were tested for GSIS. High glucose (HG, 16.7 mM) or low glucose (LG, 3.3 mM) were used in GSIS assays. Data information: Data from 3 experiments more are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "islets", "of", "WT", ",", "Pdia4", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "and", "Pdia4tg", "/", "tg", "(", "TG", ")", "BKS", "mice", "were", "isolated", "and", "grown", "in", "complete", "DMEM", "medium", "containing", "3", ".", "3", "mM", "(", "LG", ")", "and", "30", "mM", "glucose", "(", "HG", ")", "for", "12", "h", ".", "The", "islets", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", ",", "photographed", ",", "and", "quantified", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "The", "islets", "from", "the", "mice", "(", "A", ")", "were", "incubated", "with", "MitoGreen", "plus", "MitoSOX", "in", "the", "presence", "of", "glucose", "at", "3", ".", "3", "mM", "(", "LG", ")", "and", "16", ".", "7", "mM", "(", "HG", ")", ".", "Mitochondrial", "ROS", "in", "the", "islets", "were", "visualized", "and", "quantified", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "The", "islets", "from", "the", "mice", "(", "A", ")", "were", "incubated", "with", "Hoechst", "33342", "(", "Ho", ")", "plus", "CM", "-", "H2DCFDA", "in", "the", "presence", "of", "glucose", "at", "3", ".", "3", "mM", "(", "LG", ")", "and", "16", ".", "7", "mM", "(", "HG", ")", ".", "cytosolic", "ROS", "in", "the", "islets", "were", "visualized", "and", "quantified", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "E", ")", "Mitochondria", "isolated", "from", "the", "mouse", "islets", "(", "A", ")", "were", "measured", "for", "the", "activity", "of", "ETC", "CI", "(", "left", ")", ",", "CII", "/", "III", "(", "middle", ")", "and", "CIV", "(", "right", ")", "using", "MitoCheck", "assays", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The islets of WT, Pdia4-/- (KO) and Pdia4tg/tg (TG) BKS mice were isolated and grown in complete DMEM medium containing 3.3 mM (LG) and 30 mM glucose (HG) for 12 h. The islets stained with propidium iodide (PI), photographed, and quantified. Scale bar = 50 μm. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.The islets from the mice (A) were incubated with MitoGreen plus MitoSOX in the presence of glucose at 3.3 mM (LG) and 16.7 mM (HG). Mitochondrial ROS in the islets were visualized and quantified. Scale bar = 100 μm. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.The islets from the mice (A) were incubated with Hoechst 33342 (Ho) plus CM-H2DCFDA in the presence of glucose at 3.3 mM (LG) and 16.7 mM (HG). cytosolic ROS in the islets were visualized and quantified. Scale bar = 100 μm. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(E) Mitochondria isolated from the mouse islets (A) were measured for the activity of ETC CI (left), CII/III (middle) and CIV (right) using MitoCheck assays. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Ultrastructure", "of", "mitochondria", "and", "insulin", "granules", "in", "typical", "β", "-", "cells", "of", "3", "mouse", "lines", "on", "BKS", "and", "Leprdb", "/", "db", "backgrounds", ".", "Arrows", "indicate", "the", "mitochondria", "whereas", "arrowheads", "indicate", "insulin", "granules", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "μm", ".", "Data", "information", ":", "A", "total", "of", "15", "-", "23", "images", "per", "group", "were", "analyzed", ".", "Data", "from", "each", "group", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Ultrastructure of mitochondria and insulin granules in typical β-cells of 3 mouse lines on BKS and Leprdb/db backgrounds. Arrows indicate the mitochondria whereas arrowheads indicate insulin granules. Scale bar = 1 μm. Data information: A total of 15-23 images per group were analyzed. Data from each group are presented as the mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "The", "construct", "encoding", "Flag", "-", "Pdia4", "or", "its", "mutants", "and", "that", "expressing", "Myc", "/", "Flag", "-", "tagged", "Ndufs3", "(", "left", ")", "or", "p22phox", "(", "right", ")", "were", "co", "-", "transfected", "into", "293T", "cells", ".", "Total", "lysates", "(", "TL", ")", "and", "anti", "-", "Myc", "immunoprecipitates", "(", "Myc", "IP", ")", "underwent", "immunoblotting", "analysis", ".", "N", "-", "terminal", "Flag", "tag", ",", "catalytic", "domains", "(", "a", ",", "a", "'", "and", "a", "'", "'", ")", ",", "non", "-", "catalytic", "domains", "(", "b", "and", "b", "'", ")", ",", "and", "C", "-", "terminal", "KEEL", "are", "indicated", ".", "Pdia4", "*", "is", "a", "mutant", "of", "Pdia4", "whose", "3", "CGHC", "motifs", "were", "changed", "into", "3", "SGHS", "motifs", "(", "a", "*", ",", "a", "'", "*", "and", "a", "'", "'", "*", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "construct", "encoding", "Myc", "/", "Flag", "-", "tagged", "p22phox", ",", "Ndufs3", "or", "their", "mutants", "and", "that", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "Pdia4", "were", "co", "-", "transfected", "into", "293T", "cells", ".", "Total", "lysates", "(", "TL", ")", "and", "anti", "-", "Myc", "immunoprecipitates", "(", "Myc", "IP", ")", "underwent", "immunoblotting", "analysis", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) The construct encoding Flag-Pdia4 or its mutants and that expressing Myc/Flag-tagged Ndufs3 (left) or p22phox (right) were co-transfected into 293T cells. Total lysates (TL) and anti-Myc immunoprecipitates (Myc IP) underwent immunoblotting analysis. N-terminal Flag tag, catalytic domains (a, a' and a''), non-catalytic domains (b and b'), and C-terminal KEEL are indicated. Pdia4* is a mutant of Pdia4 whose 3 CGHC motifs were changed into 3 SGHS motifs (a*, a'* and a''*).(F) The construct encoding Myc/Flag-tagged p22phox, Ndufs3 or their mutants and that expressing Flag-tagged Pdia4 were co-transfected into 293T cells. Total lysates (TL) and anti-Myc immunoprecipitates (Myc IP) underwent immunoblotting analysis using anti-Flag antibody."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Min6", "cells", "infected", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "a", "scramble", "RNAi", "(", "GK", ")", ",", "a", "Pdia4", "RNAi", "(", "KD", ")", "and", "a", "Pdia4", "cDNA", "(", "OVE", ")", "were", "sorted", "and", "tested", "for", "the", "Pdia4", "protein", "level", "(", "left", ")", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "with", "NAC", "(", "1", "mM", ")", "and", "then", "stained", "with", "MitoSOX", "or", "CellROX", "in", "response", "to", "0", ".", "5", "mM", "(", "LG", ")", "and", "25", "mM", "(", "HG", ")", "glucose", "for", "an", "additional", "30", "min", ".", "Signal", "from", "MitoSOX", "(", "middle", ")", "and", "CellROX", "(", "right", ")", "was", "re", "-", "plotted", "into", "histograms", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", ".", "(", "B", ")", "Min6", "cells", "infected", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "a", "scramble", "RNAi", "(", "GK", ")", "and", "an", "RNAi", "of", "Ndufs3", "(", "Ndufs3", "KD", ")", "or", "p22phox", "(", "p22phox", "KD", ")", "were", "selected", "and", "tested", "for", "levels", "of", "Ndufs3", "(", "1st", "column", ")", ",", "mitochondrial", "ROS", "(", "2nd", "column", ",", "MitoSOX", ")", ",", "p22phox", "(", "3rd", "column", ")", ",", "and", "cytosolic", "ROS", "(", "4th", "column", ",", "CellROX", ")", ".", "The", "cells", "were", "grown", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "5", "mM", "(", "LG", ")", "and", "25", "mM", "(", "HG", ")", "glucose", ".", "(", "C", ")", "The", "same", "experiments", "as", "(", "B", ")", "were", "conducted", "except", "that", "Min6", "cells", "were", "infected", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "a", "cDNA", "of", "truncated", "Ndufs3", "(", "tNdufs3", ")", "and", "p22phox", "(", "tp22phox", ")", ".", "(", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Min6 cells infected with a lentivirus expressing a scramble RNAi (GK), a Pdia4 RNAi (KD) and a Pdia4 cDNA (OVE) were sorted and tested for the Pdia4 protein level (left). The cells were incubated with NAC (1 mM) and then stained with MitoSOX or CellROX in response to 0.5 mM (LG) and 25 mM (HG) glucose for an additional 30 min. Signal from MitoSOX (middle) and CellROX (right) was re-plotted into histograms. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant.(B) Min6 cells infected with a lentivirus expressing a scramble RNAi (GK) and an RNAi of Ndufs3 (Ndufs3 KD) or p22phox (p22phox KD) were selected and tested for levels of Ndufs3 (1st column), mitochondrial ROS (2nd column, MitoSOX), p22phox (3rd column), and cytosolic ROS (4th column, CellROX). The cells were grown in the presence of 0.5 mM (LG) and 25 mM (HG) glucose. (C) The same experiments as (B) were conducted except that Min6 cells were infected with a lentivirus expressing a cDNA of truncated Ndufs3 (tNdufs3) and p22phox (tp22phox). ( Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. One-way ANOVA test was used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "D", ")", "293T", "cells", ",", "which", "were", "transfected", "with", "the", "construct", "encoding", "Flag", "-", "Pdia4", "and", "that", "expressing", "Myc", "/", "Flag", "-", "tagged", "p22phox", "or", "Ndufs3", ",", "were", "treated", "with", "GHTT", "(", "28", "μM", ")", "for", "30", "min", ".", "The", "cells", "were", "lysed", "and", "incubated", "with", "anti", "-", "Pdia4", "antibodies", "plus", "protein", "G", "beads", ".", "Their", "total", "lysates", "(", "TL", ")", "and", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "underwent", "immunoblotting", "analysis", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "F", ")", "The", "sections", "of", "pancreata", "of", "the", "mice", "(", "E", ")", "were", "stained", "with", "anti", "-", "insulin", "(", "αIns", ")", "antibody", "and", "dihydroethidium", "(", "DHE", ")", "(", "left", ")", ".", "Islet", "area", "(", "μm2", ")", "and", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "RFI", ")", "were", "quantified", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "The", "dash", "circles", "indicate", "islet", "regions", ".", "Data", "information", ":", "Data", "from", "3", "experiments", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "were", "used", "for", "statistical", "analysis", "of", "differences", "between", "groups", ",", "and", "P", "(", "*", ")", "<", "0", ".", "05", ";", "P", "(", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "(", "*", "*", "*", ")", "<", "0", ".", "001", "are", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(D) 293T cells, which were transfected with the construct encoding Flag-Pdia4 and that expressing Myc/Flag-tagged p22phox or Ndufs3, were treated with GHTT (28 μM) for 30 min. The cells were lysed and incubated with anti-Pdia4 antibodies plus protein G beads. Their total lysates (TL) and immunoprecipitates (IP) underwent immunoblotting analysis with anti-Flag antibody.(F) The sections of pancreata of the mice (E) were stained with anti-insulin (αIns) antibody and dihydroethidium (DHE) (left). Islet area (μm2) and relative fluorescence intensity (RFI) were quantified (right). Scale bar: 100 μm. The dash circles indicate islet regions. Data information: Data from 3 experiments are presented as the mean ± SD. one-way ANOVA test were used for statistical analysis of differences between groups, and P (*) < 0.05; P (**) < 0.01 and P (***) < 0.001 are considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "1C", ",", "Microscale", "thermophoresis", "(", "MST", ")", "with", "purified", "ts5", "dDATGAT", "construct", "displaying", "affinity", "of", "10", "µM", "for", "NO711", ".", "D", ",", "dDATmfc", "did", "not", "show", "any", "interactions", "with", "NO711", "in", "the", "MST", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "All", "measurements", "of", "inhibition", "potency", "were", "the", "result", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "all", "the", "points", "were", "used", "for", "calculating", "the", "values", "where", "the", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "E", ",", "SKF89976a", "interacts", "with", "purified", "ts5", "dDATGAT", "construct", "with", "an", "affinity", "of", "34", "µM", ".", "F", ",", "MST", "experiments", "display", "no", "interactions", "of", "purified", "dDATmfc", "with", "SKF89976a", ".", "The", "MST", "profiles", "shown", "are", "one", "of", "two", "independent", "measurements", ".", "Data", "information", ":", "All", "measurements", "of", "inhibition", "potency", "were", "the", "result", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "all", "the", "points", "were", "used", "for", "calculating", "the", "values", "where", "the", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "G", ",", "Michaelis", "-", "Menten", "uptake", "kinetics", "of", "3H", "-", "GABA", "by", "the", "GAT1WT", "used", "in", "the", "study", "displaying", "a", "KM", "value", "of", "11", ".", "4", "μM", ".", "H", ",", "Inhibition", "of", "3H", "-", "GABA", "uptake", "by", "the", "substrate", "analogue", "nipecotic", "acid", "displaying", "a", "Ki", "value", "of", "14", ".", "4", "μM", ".", "Data", "information", ":", "All", "measurements", "of", "inhibition", "potency", "were", "the", "result", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "all", "the", "points", "were", "used", "for", "calculating", "the", "values", "where", "the", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "I", ",", "Inhibition", "of", "3H", "-", "GABA", "uptake", "through", "GAT1WT", "by", "tiagabine", "(", "Ki", "=", "725", "nM", ")", ",", "NO711", "(", "1", ".", "07", "μM", ")", "and", "SKF89976a", "(", "7", ".", "3", "μM", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "measurements", "of", "inhibition", "potency", "were", "the", "result", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "all", "the", "points", "were", "used", "for", "calculating", "the", "values", "where", "the", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C, Microscale thermophoresis (MST) with purified ts5 dDATGAT construct displaying affinity of 10 µM for NO711. D, dDATmfc did not show any interactions with NO711 in the MST experiments. Data information: All measurements of inhibition potency were the result of two independent experiments performed in triplicate (n=6) and all the points were used for calculating the values where the error bars represent s.e.m.E, SKF89976a interacts with purified ts5 dDATGAT construct with an affinity of 34 µM. F, MST experiments display no interactions of purified dDATmfc with SKF89976a. The MST profiles shown are one of two independent measurements. Data information: All measurements of inhibition potency were the result of two independent experiments performed in triplicate (n=6) and all the points were used for calculating the values where the error bars represent s.e.m.G, Michaelis-Menten uptake kinetics of 3H-GABA by the GAT1WT used in the study displaying a KM value of 11.4 μM.H, Inhibition of 3H-GABA uptake by the substrate analogue nipecotic acid displaying a Ki value of 14.4 μM. Data information: All measurements of inhibition potency were the result of two independent experiments performed in triplicate (n=6) and all the points were used for calculating the values where the error bars represent s.e.m.I, Inhibition of 3H-GABA uptake through GAT1WT by tiagabine (Ki= 725 nM), NO711 (1.07 μM) and SKF89976a (7.3 μM). Data information: All measurements of inhibition potency were the result of two independent experiments performed in triplicate (n=6) and all the points were used for calculating the values where the error bars represent s.e.m."}
{"words": ["Figure", "4B", ",", "Substitution", "of", "L300", "to", "other", "hydrophobic", "side", "chains", "and", "the", "consequences", "on", "transport", "activity", ".", "L300W", "has", "the", "maximal", "effect", "on", "the", "transport", "activity", ".", "The", "histogram", "represents", "mean", "of", "a", "total", "6", "measurements", "(", "n", "=", "6", ")", "done", "as", "two", "independent", "measurements", ".", "Individual", "datapoints", "are", "represented", "as", "black", "dots", "around", "the", "error", "bar", "that", "represents", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Changes", "to", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetics", "for", "L300F", "mutant", "that", "displays", "weakened", "3H", "-", "GABA", "uptake", "activity", "with", "KM", "=", "20", ".", "9", "μM", ".", "A", "near", "10", "-", "fold", "loss", "of", "nipecotic", "acid", "inhibition", "potency", "was", "observed", "at", "a", "value", "of", "134", ".", "3", "μM", ".", "The", "inhibition", "potencies", "of", "the", "inhibitors", "display", "lowered", "value", "suggesting", "an", "improved", "ability", "to", "compete", "for", "the", "GABA", "uptake", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "plots", "were", "performed", "as", "two", "independent", "experiments", "each", "time", "done", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Error", "bars", "in", "the", "data", "display", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Statistical", "significance", "of", "inhibition", "potencies", "were", "measured", "between", "the", "mutant", "and", "GAT1WT", "transporter", "measured", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "display", "p", "values", "as", "follows", ";", "nipecotic", "acid", ",", "Changes", "to", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetics", "for", "L300F", "mutant", "that", "displays", "weakened", "3H", "-", "GABA", "uptake", "activity", "with", "KM", "=", "20", ".", "9", "μM", ".", "The", "inhibition", "potencies", "of", "the", "inhibitors", "display", "lowered", "value", "suggesting", "an", "improved", "ability", "to", "compete", "for", "the", "GABA", "uptake", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "plots", "were", "performed", "as", "two", "independent", "experiments", "each", "time", "done", "in", "triplicate", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Error", "bars", "in", "the", "data", "display", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Statistical", "significance", "of", "inhibition", "potencies", "were", "measured", "between", "the", "mutant", "and", "GAT1WT", "transporter", "measured", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "display", "p", "values", "as", "follows", "panel", "E", "-", "0", ".", "0001", ";", "tiagabine", ",", "panel", "F", "-", "0", ".", "0017", ";", "NO711", ",", "panel", "G", "-", "0", ".", "018", ";"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B, Substitution of L300 to other hydrophobic side chains and the consequences on transport activity. L300W has the maximal effect on the transport activity. The histogram represents mean of a total 6 measurements (n=6) done as two independent measurements. Individual datapoints are represented as black dots around the error bar that represents s.e.m.Changes to Michaelis-Menten kinetics for L300F mutant that displays weakened 3H-GABA uptake activity with KM = 20.9 μM. A near 10-fold loss of nipecotic acid inhibition potency was observed at a value of 134.3 μM. The inhibition potencies of the inhibitors display lowered value suggesting an improved ability to compete for the GABA uptake. Data information: All data plots were performed as two independent experiments each time done in triplicate (n=6). Error bars in the data display s.e.m. Statistical significance of inhibition potencies were measured between the mutant and GAT1WT transporter measured with an unpaired t-test display p values as follows; nipecotic acid,Changes to Michaelis-Menten kinetics for L300F mutant that displays weakened 3H-GABA uptake activity with KM = 20.9 μM. The inhibition potencies of the inhibitors display lowered value suggesting an improved ability to compete for the GABA uptake. Data information: All data plots were performed as two independent experiments each time done in triplicate (n=6). Error bars in the data display s.e.m. Statistical significance of inhibition potencies were measured between the mutant and GAT1WT transporter measured with an unpaired t-test display p values as follows panel E-0.0001; tiagabine, panel F-0.0017; NO711, panel G-0.018; SKF89976a"}
{"words": ["Figure", "5E", ",", "F", ",", "Eadie", "-", "Hofstee", "plots", "of", "E", ",", "tiagabine", "and", "F", ",", "NO711", "display", "competitive", "mode", "of", "inhibition", "of", "3H", "GABA", "uptake", "in", "GAT1WT", ".", "G", ",", "Eadie", "-", "Hofstee", "plot", "of", "SKF89976a", "displaying", "mixed", "(", "competitive", "+", "non", "-", "competitive", ")", "inhibition", "of", "3H", "-", "GABA", "uptake", "in", "GAT1WT", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", "-", "G", ")", "Concentrations", "of", "the", "inhibitors", "were", "decided", "based", "on", "the", "Ki", "values", "calculated", "for", "individual", "inhibitors", ".", "Each", "data", "point", "was", "plotted", "using", "6", "measurements", "carried", "out", "in", "two", "independent", "measurements", "in", "triplicates", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5E, F, Eadie-Hofstee plots of E, tiagabine and F, NO711 display competitive mode of inhibition of 3H GABA uptake in GAT1WT. G, Eadie-Hofstee plot of SKF89976a displaying mixed (competitive+non-competitive) inhibition of 3H-GABA uptake in GAT1WT. Data information: (E-G) Concentrations of the inhibitors were decided based on the Ki values calculated for individual inhibitors. Each data point was plotted using 6 measurements carried out in two independent measurements in triplicates. Error bars represent s.e.m."}
{"words": ["Figure", "6C", ",", "Michaelis", "-", "Menten", "kinetics", "of", "GAT1WT", "and", "GAT1", "S359E", "displays", "a", "weakened", "KM", "value", "(", "28", ".", "54", "±", "2", ".", "3", "μM", ")", ".", "The", "enhanced", "Vmax", "is", "a", "consequence", "of", "the", "enhanced", "expression", "of", "the", "mutant", "transporter", "in", "the", "assayed", "cells", "monitored", "by", "FSEC", ".", "Data", "information", ":", "The", "kinetic", "plots", "were", "plotted", "as", "a", "mean", "of", "6", "measurements", "carried", "out", "in", "two", "independent", "measurements", "in", "triplicate", ".", "The", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "D", ",", "3H", "-", "GABA", "uptake", "inhibition", "by", "the", "substrate", "analogue", "nipecotic", "acid", "for", "GAT1", "S359E", "displaying", "a", "Ki", "value", "of", "30", ".", "1", "μM", "Data", "information", ":", "The", "kinetic", "plots", "were", "plotted", "as", "a", "mean", "of", "6", "measurements", "carried", "out", "in", "two", "independent", "measurements", "in", "triplicate", ".", "The", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "E", ",", "The", "equivalent", "mutation", "in", "dDATWT", "E384S", "causes", "a", "complete", "ablation", "of", "transport", "activity", "despite", "retaining", "similar", "expression", "levels", "as", "dDATWT", ".", "Data", "information", ":", "The", "kinetic", "plots", "were", "plotted", "as", "a", "mean", "of", "6", "measurements", "carried", "out", "in", "two", "independent", "measurements", "in", "triplicate", ".", "The", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C, Michaelis-Menten kinetics of GAT1WT and GAT1 S359E displays a weakened KM value (28.54 ± 2.3 μM). The enhanced Vmax is a consequence of the enhanced expression of the mutant transporter in the assayed cells monitored by FSEC. Data information: The kinetic plots were plotted as a mean of 6 measurements carried out in two independent measurements in triplicate. The error bars represent s.e.m.D, 3H-GABA uptake inhibition by the substrate analogue nipecotic acid for GAT1 S359E displaying a Ki value of 30.1 μM Data information: The kinetic plots were plotted as a mean of 6 measurements carried out in two independent measurements in triplicate. The error bars represent s.e.m.E, The equivalent mutation in dDATWT E384S causes a complete ablation of transport activity despite retaining similar expression levels as dDATWT. Data information: The kinetic plots were plotted as a mean of 6 measurements carried out in two independent measurements in triplicate. The error bars represent s.e.m."}
{"words": ["Figure", "2HEp", "-", "2", "cells", "remained", "untreated", "or", "were", "incubated", "with", "20", "µg", "/", "ml", "of", "whole", "cell", "extract", "of", "Y", ".", "pseudotuberculosis", "expressing", "full", "-", "length", "CNF1", ",", "CNFY", "or", "the", "N", "-", "or", "C", "-", "terminally", "deleted", "toxin", "variants", "at", "37", "°", "C", "for", "4", "h", ".", "The", "cells", "were", "thoroughly", "washed", ",", "pelleted", ",", "lysed", "and", "the", "toxin", "variants", "bound", "to", "the", "cells", "were", "identified", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HEp-2 cells remained untreated or were incubated with 20 µg/ml of whole cell extract of Y. pseudotuberculosis expressing full-length CNF1, CNFY or the N- or C-terminally deleted toxin variants at 37°C for 4 h. The cells were thoroughly washed, pelleted, lysed and the toxin variants bound to the cells were identified by western blotting using an anti-Flag antibody."}
{"words": ["Figure", "3Left", "upper", "and", "right", "panel", ":", "HEp", "-", "2", "cells", "re", "­", "mained", "untreated", "or", "were", "incubated", "with", "20", "µg", "/", "ml", "of", "whole", "cell", "extract", "of", "Y", ".", "pseudotuberculosis", "expressing", "full", "-", "length", "CNFY", "or", "the", "N", "-", "or", "C", "-", "terminally", "deleted", "toxin", "variants", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "the", "de", "­", "amidation", "of", "RhoA", "was", "analyzed", "by", "the", "shift", "of", "the", "modified", "Rho", "GTPase", "band", "in", "SDS", "PAGE", "gels", ";", "left", "lower", "panel", ":", "HEp", "-", "2", "cells", "were", "lysed", "and", "the", "cell", "extracts", "were", "incubated", "with", "full", "-", "length", "CNFY", "or", "the", "N", "-", "ter", "­", "minally", "deleted", "toxin", "variants", "for", "4", "h", ".", "The", "de", "­", "amidation", "of", "RhoA", "in", "the", "cell", "extracts", "was", "analyzed", "by", "the", "mobility", "shift", "of", "the", "modified", "Rho", "GTPase", "on", "SDS", "PAGE", "after", "detection", "with", "anti", "-", "RhoA", "antibodies", ".", "HEp", "-", "2", "cells", "were", "incubated", "with", "20", "µg", "/", "ml", "of", "whole", "cell", "extract", "of", "Y", ".", "pseudotuberculosis", "expressing", "full", "-", "length", "CNFY", "or", "the", "N", "-", "or", "C", "-", "terminally", "deleted", "toxin", "variants", "for", "24", "h", ".", "The", "cell", "nuclei", "were", "strained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "the", "actin", "cytoskeleton", "was", "stained", "using", "FITC", "-", "phalloidin", "(", "green", ")", ".", "The", "formation", "of", "large", ",", "multinuclear", "cells", "was", "ob", "­", "served", "by", "fluorescence", "micro", "­", "­", "scopy", "and", "the", "formation", "of", "thick", "actin", "stress", "fibers", "and", "membrane", "actin", "folding", "were", "only", "observed", "with", "CNFY", "-", "treated", "cells", ".", "The", "white", "scale", "bar", "is", "40", "µm", ".", "Cells", "incubated", "with", "extracts", "of", "YP147", "(", "ΔcnfY", ")", "harboring", "the", "empty", "expression", "vector", "were", "used", "as", "negative", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Left upper and right panel: HEp-2 cells re­mained untreated or were incubated with 20 µg/ml of whole cell extract of Y. pseudotuberculosis expressing full-length CNFY or the N- or C-terminally deleted toxin variants for 4 h. Cells were lysed and the de­amidation of RhoA was analyzed by the shift of the modified Rho GTPase band in SDS PAGE gels; left lower panel: HEp-2 cells were lysed and the cell extracts were incubated with full-length CNFY or the N-ter­minally deleted toxin variants for 4 h. The de­amidation of RhoA in the cell extracts was analyzed by the mobility shift of the modified Rho GTPase on SDS PAGE after detection with anti-RhoA antibodies.HEp-2 cells were incubated with 20 µg/ml of whole cell extract of Y. pseudotuberculosis expressing full-length CNFY or the N- or C-terminally deleted toxin variants for 24 h. The cell nuclei were strained with DAPI (blue) and the actin cytoskeleton was stained using FITC-phalloidin (green). The formation of large, multinuclear cells was ob­served by fluorescence micro­­scopy and the formation of thick actin stress fibers and membrane actin folding were only observed with CNFY-treated cells. The white scale bar is 40 µm. Cells incubated with extracts of YP147 (ΔcnfY) harboring the empty expression vector were used as negative controls."}
{"words": ["Figure", "4HEp", "-", "2", "cells", "were", "incubated", "with", "20", "µg", "/", "ml", "of", "whole", "cell", "extract", "of", "Y", ".", "pseudotuberculosis", "expressing", "full", "-", "length", "CNFY", ",", "N", "-", "or", "C", "-", "terminal", "deletion", "variants", "fused", "to", "GFP", "(", "green", ")", "for", "90", "or", "180", "min", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "fluorescence", "microscopy", ".", "The", "red", "fluorescent", "signal", "represents", "late", "endosomes", "(", "CellLight", "Late", "Endosomes", "-", "RFP", "(", "Rab7a", ")", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "A", "merged", "image", "of", "the", "different", "channels", "is", "shown", ",", "and", "smaller", "images", "are", "magnified", "views", "of", "boxed", "areas", ".", "White", "scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HEp-2 cells were incubated with 20 µg/ml of whole cell extract of Y. pseudotuberculosis expressing full-length CNFY, N- or C-terminal deletion variants fused to GFP (green) for 90 or 180 min. Cells were fixed and processed for fluorescence microscopy. The red fluorescent signal represents late endosomes (CellLight Late Endosomes-RFP (Rab7a)). Nuclei were stained with DAPI (blue). A merged image of the different channels is shown, and smaller images are magnified views of boxed areas. White scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6Nitrocefin", "(", "2", "mM", ")", "was", "added", "to", "the", "supernatant", "from", "25", "°", "C", "overnight", "Yersinia", "cultures", "expressing", "the", "indicated", "CNFY", "derivatives", "to", "determine", "β", "-", "lactamase", "activity", "by", "measuring", "changes", "in", "absorbance", "at", "390", "nm", "(", "yellow", ")", "and", "486", "nm", "(", "red", ")", ".", "The", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "carried", "out", "in", "triplicates", ".", "The", "viability", "of", "Y", ".", "pseudotuberculosis", "YPIII", "expressing", "the", "indicated", "CNFY", "derivatives", "was", "assessed", "in", "equalized", "bacterial", "cultures", "using", "the", "BacTiter", "-", "Glo", "Microbial", "Cell", "Viability", "Assay", "kit", "(", "Promega", ")", ".", "The", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "carried", "out", "in", "triplicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Nitrocefin (2 mM) was added to the supernatant from 25°C overnight Yersinia cultures expressing the indicated CNFY derivatives to determine β-lactamase activity by measuring changes in absorbance at 390 nm (yellow) and 486 nm (red). The data represent the mean ± SD of three independent experiments, carried out in triplicates.The viability of Y. pseudotuberculosis YPIII expressing the indicated CNFY derivatives was assessed in equalized bacterial cultures using the BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay kit (Promega). The data represent the mean ± SD of three independent experiments, carried out in triplicates."}
{"words": ["Figure", "7Comparative", "analysis", "of", "RhoA", "activation", "in", "HEp", "-", "2", "cell", "lysate", "by", "CNFY", "and", "the", "recombinant", "D4", "-", "5", "protein", ".", "Purified", "CNFY", "or", "the", "D4", "-", "5", "fragment", "(", "1", "µM", ")", "was", "added", "to", "extracts", "of", "HEp", "-", "2", "cells", "and", "incubated", "for", "10", ",", "20", ",", "30", "or", "60", "min", ".", "De", "­", "amidation", "of", "RhoA", "was", "analyzed", "by", "the", "shift", "of", "the", "modified", "Rho", "GTPase", "band", "in", "SDS", "PAGE", "gels", "after", "detection", "with", "anti", "-", "RhoA", "antibodies", ".", "Comparative", "analysis", "of", "recombinant", "RhoA", "deamidation", "by", "CNFY", "and", "the", "D4", "-", "5", "fragment", ".", "Recombinant", "RhoA", "was", "incubated", "with", "purified", "CNFY", "or", "the", "D4", "-", "5", "fragment", "and", "samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "after", "the", "indicated", "times", "before", "subjecting", "to", "trypsin", "digestion", "and", "quantification", "of", "deamidation", "of", "Q63", "by", "mass", "spectrometry", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "of", "triplicate", "measurements", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Comparative analysis of RhoA activation in HEp-2 cell lysate by CNFY and the recombinant D4-5 protein. Purified CNFY or the D4-5 fragment (1 µM) was added to extracts of HEp-2 cells and incubated for 10, 20, 30 or 60 min. De­amidation of RhoA was analyzed by the shift of the modified Rho GTPase band in SDS PAGE gels after detection with anti-RhoA antibodies.Comparative analysis of recombinant RhoA deamidation by CNFY and the D4-5 fragment. Recombinant RhoA was incubated with purified CNFY or the D4-5 fragment and samples were separated by SDS-PAGE after the indicated times before subjecting to trypsin digestion and quantification of deamidation of Q63 by mass spectrometry. Error bars represent standard deviations of triplicate measurements."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Dot", "-", "plot", "showing", "the", "fold", "change", "(", "log2", ")", "in", "number", "of", "reads", "between", "vehicle", "and", "AZD8186", "-", "treated", "conditions", "vs", "the", "p", "-", "value", "of", "the", "difference", "between", "the", "two", "treatment", "conditions", "for", "each", "shRNA", ".", "9", "out", "of", "18", "shRNAs", "targeting", "EGFR", "showed", "a", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "2", "and", "are", "highlighted", "in", "the", "plot", ".", "The", "plot", "was", "generated", "considering", "the", "results", "from", "biological", "triplicate", "of", "the", "experiment", ".", "(", "C", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "infected", "with", "the", "indicated", "shRNAs", "targeting", "EGFR", "and", "selected", "by", "puromycin", ".", "EGFR", "mRNA", "was", "then", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "C", ")", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "infected", "with", "the", "indicated", "shRNAs", "targeting", "EGFR", "and", "selected", "by", "puromycin", ".", "cell", "viability", "was", "measured", "after", "4", "days", "of", "treatment", "with", "serial", "dilutions", "of", "AZD8186", "(", "D", ")", ".", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "gefitinib", "(", "E", ")", "in", "the", "presence", "of", "vehicle", ",", "AZD8186", "(", "0", ".", "25", "μM", ")", ",", "GDC0941", "(", "0", ".", "25", "μM", ")", "or", "MK2206", "(", "0", ".", "45", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "after", "4", "days", "and", "normalised", "within", "each", "of", "the", "PI3K", "pathway", "inhibitor", "-", "treated", "condition", "to", "the", "viability", "in", "the", "absence", "of", "gefitinib", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "F", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "lapatinib", "(", "F", ")", "in", "the", "presence", "of", "vehicle", ",", "AZD8186", "(", "0", ".", "25", "μM", ")", ",", "GDC0941", "(", "0", ".", "25", "μM", ")", "or", "MK2206", "(", "0", ".", "45", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "after", "4", "days", "and", "normalised", "within", "each", "of", "the", "PI3K", "pathway", "inhibitor", "-", "treated", "condition", "to", "the", "viability", "in", "the", "absence", "of", "lapatinib", ".", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Viability", "of", "six", "PTEN", "-", "null", "VS", "five", "PTEN", "-", "WT", "TNBC", "cell", "lines", "-", "not", "carrying", "other", "known", "mutations", "in", "PIK3CA", ",", "PIK3CB", "or", "PIK3R1", "genes", "-", "treated", "with", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", "90", "nM", ")", ",", "EGFRi", "(", "gefitinib", "3", "μM", ")", "alone", "or", "in", "combination", "for", "6", "days", ".", "Mean", "of", "3", "independent", "experiments", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "of", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "t", "-", "test", "in", "PTEN", "-", "null", "PI3Kbi", "versus", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0059", ",", "PTEN", "-", "null", "EGFRi", "versus", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0047", ",", "PTEN", "-", "null", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "versus", "PTEN", "-", "WT", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "*", "P", "=", "0", ".", "0459", ",", "PTEN", "-", "WT", "PI3Kbi", "versus", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "*", "P", "=", "0", ".", "0108", ",", "PTEN", "-", "WT", "EGFRi", "versus", "PI3Kbi", "+", "EGFRi", "n", ".", "s", ".", "P", "=", "0", ".", "1926", ".", "PTEN", "-", "null", "cell", "lines", "used", "in", "the", "experiments", "were", ":", "MDA", "-", "MB", "-", "468", ",", "HCC70", ",", "HCC1937", ",", "HCC38", ",", "HCC1395", "and", "BT", "-", "549", ";", "PTEN", "-", "WT", "cell", "lines", "were", ":", "MDA", "-", "MB", "-", "157", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "231", ",", "HCC1187", ",", "HCC1428", "and", "HCC1806", ".", "(", "H", ")", "Synergy", "score", "for", "combinations", "of", "serial", "dilutions", "of", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", ")", "plus", "EGFRi", "(", "gefitinib", ")", "tested", "on", "six", "PTEN", "-", "null", "and", "five", "PTEN", "-", "WT", "TNBC", "cell", "lines", "for", "6", "days", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "score", "was", "obtained", "analysing", "the", "viability", "data", "through", "the", "software", "Chalice", "Analyser", ".", "Mean", "of", "the", "synergy", "scores", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "of", "Mann", "Whitney", "two", "-", "tailed", "test", "*", "P", "=", "0", ".", "0303", ".", "(", "I", ")", "Patient", "samples", "from", "METABRIC", "dataset", "classified", "as", "TNBCs", "were", "assigned", "to", "the", "groups", "\"", "PTEN", "-", "low", "\"", "when", "falling", "in", "the", "lower", "quartile", "for", "PTEN", "expression", ",", "\"", "PTEN", "-", "mut", "\"", "when", "harbouring", "a", "non", "-", "synonymous", "mutation", "on", "PTEN", "gene", ",", "\"", "PTEN", "-", "WT", "\"", "in", "all", "other", "cases", ".", "Comparison", "of", "the", "expression", "of", "EGFR", "between", "the", "PTEN", "low", "or", "mut", "and", "the", "PTEN", "-", "WT", "groups", ".", "Data", "presented", "in", "a", "box", "and", "whisker", "plot", "with", "the", "central", "band", "indicating", "the", "median", ",", "the", "upper", "and", "lower", "extremes", "of", "the", "box", "or", "hinge", "being", "the", "third", "and", "first", "quartiles", "respectively", "and", "the", "whiskers", "extending", "to", "the", "most", "extreme", "data", "values", "Mean", "±", "SD", ".", "P", "value", "calculated", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Dot-plot showing the fold change (log2) in number of reads between vehicle and AZD8186-treated conditions vs the p-value of the difference between the two treatment conditions for each shRNA. 9 out of 18 shRNAs targeting EGFR showed a p-value <0.2 and are highlighted in the plot. The plot was generated considering the results from biological triplicate of the experiment.(C MDA-MB-468 were infected with the indicated shRNAs targeting EGFR and selected by puromycin. EGFR mRNA was then measured by RT-qPCR (C) Average ± SD of triplicates and representative of three independent experiments.D) MDA-MB-468 were infected with the indicated shRNAs targeting EGFR and selected by puromycin. cell viability was measured after 4 days of treatment with serial dilutions of AZD8186 (D). Average ± SD of triplicates and representative of three independent experiments.(E MDA-MB-468 were treated with serial dilutions of gefitinib (E) in the presence of vehicle, AZD8186 (0.25 μM), GDC0941 (0.25 μM) or MK2206 (0.45 μM), as indicated. Cell viability was measured after 4 days and normalised within each of the PI3K pathway inhibitor-treated condition to the viability in the absence of gefitinib Average ± SD of triplicates and representative of two independent experiments.F) MDA-MB-468 were treated with serial dilutions of lapatinib (F) in the presence of vehicle, AZD8186 (0.25 μM), GDC0941 (0.25 μM) or MK2206 (0.45 μM), as indicated. Cell viability was measured after 4 days and normalised within each of the PI3K pathway inhibitor-treated condition to the viability in the absence of lapatinib. Average ± SD of triplicates and representative of two independent experiments.(G) Viability of six PTEN-null VS five PTEN-WT TNBC cell lines - not carrying other known mutations in PIK3CA, PIK3CB or PIK3R1 genes - treated with PI3Kβi (AZD8186 90 nM), EGFRi (gefitinib 3 μM) alone or in combination for 6 days. Mean of 3 independent experiments ± SD. Statistical significance of two-tailed unpaired student t-test in PTEN-null PI3Kbi versus PI3Kbi+EGFRi **P=0.0059, PTEN-null EGFRi versus PI3Kbi+EGFRi **P=0.0047, PTEN-null PI3Kbi+EGFRi versus PTEN-WT PI3Kbi+EGFRi *P=0.0459, PTEN-WT PI3Kbi versus PI3Kbi+EGFRi *P=0.0108, PTEN-WT EGFRi versus PI3Kbi+EGFRi n.s. P=0.1926. PTEN-null cell lines used in the experiments were: MDA-MB-468, HCC70, HCC1937, HCC38, HCC1395 and BT-549; PTEN-WT cell lines were: MDA-MB-157, MDA-MB-231, HCC1187, HCC1428 and HCC1806.(H) Synergy score for combinations of serial dilutions of PI3Kβi (AZD8186) plus EGFRi (gefitinib) tested on six PTEN-null and five PTEN-WT TNBC cell lines for 6 days in three independent experiments. The score was obtained analysing the viability data through the software Chalice Analyser. Mean of the synergy scores ± SD. Statistical significance of Mann Whitney two-tailed test *P=0.0303.(I) Patient samples from METABRIC dataset classified as TNBCs were assigned to the groups \"PTEN-low\" when falling in the lower quartile for PTEN expression, \"PTEN-mut\" when harbouring a non-synonymous mutation on PTEN gene, \"PTEN-WT\" in all other cases. Comparison of the expression of EGFR between the PTEN low or mut and the PTEN-WT groups. Data presented in a box and whisker plot with the central band indicating the median, the upper and lower extremes of the box or hinge being the third and first quartiles respectively and the whiskers extending to the most extreme data values Mean ± SD. P value calculated by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Tumor", "volume", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "mammary", "fat", "-", "pad", "xenografts", "treated", "with", "vehicle", ",", "AZD8186", "(", "50", "mg", "/", "kg", ",", "og", "twice", "/", "day", ")", ",", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", "IP", "once", "/", "day", ")", "alone", "or", "in", "combination", "(", "5", "-", "6", "mice", "per", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Statistical", "significance", "of", "two", "-", "way", "ANOVA", "statistical", "test", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0028", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", ")", "Tumor", "volume", "of", "HCC", "-", "70", "mammary", "fat", "-", "pad", "xenografts", "treated", "with", "vehicle", ",", "AZD8186", "(", "150", "mg", "/", "kg", ",", "og", "once", "/", "day", ")", ",", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", "IP", "once", "/", "day", ")", "alone", "or", "in", "combination", "(", "6", "-", "7", "mice", "per", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Growth", "curves", "were", "compared", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "statistical", "test", ".", "Statistical", "significance", "of", "two", "-", "way", "ANOVA", "statistical", "test", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Waterfall", "representation", "of", "changes", "in", "the", "volume", "of", "individual", "HCC", "-", "70", "tumors", "during", "the", "treatment", ".", "Statistical", "comparison", "between", "different", "treatment", "groups", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0023", "and", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "(", "D", ")", "Change", "in", "the", "body", "weight", "of", "mice", "harbouring", "HCC70", "xenograft", "tumors", "(", "6", "-", "7", "mice", "per", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "during", "21", "days", "of", "treatment", ".", "(", "E", ")", "A", "cell", "line", "derived", "from", "a", "mammary", "tumor", "spontaneously", "developed", "in", "a", "Wap", "-", "cre", ":", "Ptenfl", "/", "fl", ":", "Tp53fl", "/", "fl", "mouse", "was", "cloned", "and", "injected", "in", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "syngeneic", "C57BL6", "/", "J", "recipient", "mice", ".", "Tumours", "grew", "in", "12", "out", "of", "35", "transplanted", "mice", "and", "only", "these", "tumours", "were", "selected", "for", "the", "treatments", "described", "in", "the", "figure", ".", "When", "tumours", "reached", "an", "average", "volume", "of", "100mm3", ",", "they", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "a", "combination", "of", "AZD8186", "(", "150mg", "/", "kg", ",", "og", "once", "/", "day", ")", "and", "erlotinib", "(", "50mg", "/", "kg", "IP", "once", "/", "day", ")", ".", "Tumours", "were", "then", "measured", "during", "the", "treatment", "(", "6", "mice", "per", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Statistical", "significance", "of", "two", "-", "way", "ANOVA", "statistical", "test", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Tumor volume of MDA-MB-468 mammary fat-pad xenografts treated with vehicle, AZD8186 (50 mg/kg, og twice/day), erlotinib (50 mg/kg IP once/day) alone or in combination (5-6 mice per group, mean±SEM). Statistical significance of two-way ANOVA statistical test **P=0.0028 and ***P<0.0001. (B) Tumor volume of HCC-70 mammary fat-pad xenografts treated with vehicle, AZD8186 (150 mg/kg, og once/day), erlotinib (50 mg/kg IP once/day) alone or in combination (6-7 mice per group, mean±SEM). Growth curves were compared using two-way ANOVA statistical test. Statistical significance of two-way ANOVA statistical test ***P=0.0006 and ****P<0.0001.(C) Waterfall representation of changes in the volume of individual HCC-70 tumors during the treatment. Statistical comparison between different treatment groups by Mann-Whitney test **P=0.0023 and ***P=0.0006.(D) Change in the body weight of mice harbouring HCC70 xenograft tumors (6-7 mice per group, mean±SEM) during 21 days of treatment.(E) A cell line derived from a mammary tumor spontaneously developed in a Wap-cre:Ptenfl/fl:Tp53fl/fl mouse was cloned and injected in the mammary fat pad of syngeneic C57BL6/J recipient mice. Tumours grew in 12 out of 35 transplanted mice and only these tumours were selected for the treatments described in the figure. When tumours reached an average volume of 100mm3, they were treated with vehicle or a combination of AZD8186 (150mg/kg, og once/day) and erlotinib (50mg/kg IP once/day). Tumours were then measured during the treatment (6 mice per group, mean±SEM). Statistical significance of two-way ANOVA statistical test ****P<0.0001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "were", "treated", "for", "24h", "with", "vehicle", ",", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", "250", "nM", ")", ",", "EGFRi", "(", "gefitinib", "3", "μM", ")", "or", "cetuximab", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "were", "treated", "for", "24h", "with", "vehicle", ",", "AKTi", "(", "MK2206", "450", "nM", ")", ",", "gefitinib", "(", "3", "μM", ")", "or", "cetuximab", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", ",", "alone", "or", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "HCC70", "(", "C", ")", "and", "ZR", "-", "75", "-", "1", "(", "D", ")", "parental", "cells", "or", "PI3Kβi", "-", "Res", "(", "derivative", "cells", "with", "acquired", "resistance", "to", "AZD8186", ")", ",", "or", "AKTi", "-", "Res", "(", "acquired", "resistance", "models", "to", "MK2206", ")", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", "250", "nM", ")", "or", "AKTi", "(", "MK2206", "1", "μM", ")", "for", "24", "hours", ".", "The", "whole", "cell", "lysates", "were", "then", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Spliced", "images", "of", "parental", "and", "resistant", "paired", "samples", "were", "taken", "from", "the", "same", "original", "blot", "and", "blots", "showing", "P", "-", "S6", "and", "S6", "tot", "in", "(", "D", ")", "have", "been", "cut", "and", "reassembled", "for", "figure", "purposes", ".", "(", "E", ")", "HCC70", "parental", ",", "PI3Kβi", "-", "Res", "or", "AKTi", "-", "Res", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "AKTi", "(", "MK2206", "250", "nM", ")", "or", "gefitinib", "(", "3", "μM", ")", ",", "alone", "or", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "HCC70", "MK", "res", "(", "acquired", "resistance", "models", "to", "MK2206", ")", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "gefitinib", ",", "alone", "or", "in", "combination", "with", "MK2206", "(", "810", "nM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "and", "viability", "measured", "after", "4", "days", "of", "treatment", ".", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "HCC70", "AZD", "res", "(", "acquired", "resistance", "models", "to", "AZD8186", ")", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "gefitinib", ",", "alone", "or", "in", "combination", "with", "AZD8186", "(", "270", "nM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "and", "viability", "measured", "after", "4", "days", ".", "Average", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "p110β", "co", "-", "immunoprecipitates", "with", "EGFR", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "H", ")", "and", "in", "HCC70", "(", "I", ")", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "different", "inhibitors", ",", "including", "vehicle", ",", "pan", "-", "PI3Ki", "GDC0941", "(", "1", "μM", "for", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "or", "0", ".", "5", "μM", "for", "HCC70", ")", ",", "EGFRi", "(", "gefitinib", "3", "μM", ")", ",", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", "250", "nM", ")", "or", "a", "combination", "of", "EGFRi", "and", "PI3Kβi", ".", "Cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "IgG", "control", "or", "anti", "-", "EGFR", "antibody", "and", "the", "immuno", "-", "complexes", "or", "the", "total", "lysates", "were", "immune", "-", "blotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "J", ")", "EGF", "-", "induced", "increase", "in", "phospho", "-", "AKT", "is", "dependent", "on", "p110β", "kinase", "activity", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "starved", "in", "0", "%", "FBS", "and", "pre", "-", "treated", "with", "vehicle", "or", "PI3Kβi", "(", "AZD8186", "250", "nM", ")", "for", "1h", ".", "Cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Phospho", "-", "AKT", "and", "pan", "-", "AKT", "bands", "were", "quantified", "by", "the", "use", "of", "ImageLite", "software", ":", "the", "ratio", "of", "phospho", "-", "AKT", "to", "pan", "-", "AKT", "normalised", "to", "the", "control", "(", "left", "hand", "lane", ")", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) MDA-MB-468 cells were treated for 24h with vehicle, PI3Kβi (AZD8186 250 nM), EGFRi (gefitinib 3 μM) or cetuximab (100 μg/ml), alone or in combination. The cell lysates were probed with the indicated antibodies.(B) MDA-MB-468 cells were treated for 24h with vehicle, AKTi (MK2206 450 nM), gefitinib (3 μM) or cetuximab (100 μg/ml), alone or in the indicated combinations. The cell lysates were probed with the indicated antibodies.(C, D) HCC70 (C) and ZR-75-1 (D) parental cells or PI3Kβi-Res (derivative cells with acquired resistance to AZD8186), or AKTi-Res (acquired resistance models to MK2206) were treated with vehicle, PI3Kβi (AZD8186 250 nM) or AKTi (MK2206 1 μM) for 24 hours. The whole cell lysates were then probed with the indicated antibodies. Spliced images of parental and resistant paired samples were taken from the same original blot and blots showing P-S6 and S6 tot in (D) have been cut and reassembled for figure purposes.(E) HCC70 parental, PI3Kβi-Res or AKTi-Res cells were treated with vehicle, AKTi (MK2206 250 nM) or gefitinib (3 μM), alone or in the indicated combinations. The cell lysates were probed with the indicated antibodies.(F) HCC70 MK res (acquired resistance models to MK2206) were treated with serial dilutions of gefitinib, alone or in combination with MK2206 (810 nM), as indicated, and viability measured after 4 days of treatment. Average ± SD of triplicates and representative of two independent experiments.(G) HCC70 AZD res (acquired resistance models to AZD8186) were treated with serial dilutions of gefitinib, alone or in combination with AZD8186 (270 nM), as indicated, and viability measured after 4 days. Average ± SD of triplicates and representative of two independent experiments.(H,I) p110β co-immunoprecipitates with EGFR in MDA-MB-468 (H) and in HCC70 (I). Cells were pre-treated with different inhibitors, including vehicle, pan-PI3Ki GDC0941 (1 μM for MDA-MB-468 or 0.5 μM for HCC70), EGFRi (gefitinib 3 μM), PI3Kβi (AZD8186 250 nM) or a combination of EGFRi and PI3Kβi. Cell lysates were incubated with IgG control or anti-EGFR antibody and the immuno-complexes or the total lysates were immune-blotted with the indicated antibodies.(J) EGF-induced increase in phospho-AKT is dependent on p110β kinase activity. MDA-MB-468 were starved in 0% FBS and pre-treated with vehicle or PI3Kβi (AZD8186 250 nM) for 1h. Cell lysates were probed with the indicated antibodies. Phospho-AKT and pan-AKT bands were quantified by the use of ImageLite software: the ratio of phospho-AKT to pan-AKT normalised to the control (left hand lane) is shown."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "Results", "of", "CRISPR", "-", "Cas9", "screening", "in", "combination", "with", "AZD8186", "100nM", "(", "A", ")", "The", "dot", "-", "plots", "show", "for", "each", "gene", "knocked", "-", "out", "by", "sgRNAs", "the", "fold", "change", "(", "log2", ")", "between", "treated", "conditions", "(", "AZD8186", "and", "vehicle", "in", "the", "fluorescence", "signal", "(", "anti", "-", "phosphoS6", "immunofluorescence", ")", "versus", "the", "p", "-", "value", "of", "the", "difference", "calculated", "by", "two", "sided", "t", "-", "test", ".", "The", "plots", "represent", "means", "of", "biological", "triplicates", ".", "Genes", "for", "which", "it", "was", "calculated", "a", "p", "<", "0", ".", "0001", "and", "Log2", "(", "fold", "change", ")", ">", "0", ".", "25", "are", "reported", "and", "highlighted", "in", "green", ";", "genes", "having", "a", "0", ".", "0001", "0", ".", "25", "are", "reported", "and", "shown", "in", "red", ".", "Gefitinib", "combined", "with", "AZD8186", "represents", "the", "positive", "control", "of", "the", "experiment", "(", "A", ")", ".", "<", "0", ".", "05", ">", "B", ")", "Results", "of", "CRISPR", "-", "Cas9", "screening", "in", "combination", "with", "GDC0941", "400nM", "(", "B", ")", ".", "The", "dot", "-", "plots", "show", "for", "each", "gene", "knocked", "-", "out", "by", "sgRNAs", "the", "fold", "change", "(", "log2", ")", "between", "treated", "conditions", "GDC0941", ",", "and", "vehicle", "in", "the", "fluorescence", "signal", "(", "anti", "-", "phosphoS6", "immunofluorescence", ")", "versus", "the", "p", "-", "value", "of", "the", "difference", "calculated", "by", "two", "sided", "t", "-", "test", ".", "The", "plots", "represent", "means", "of", "biological", "triplicates", ".", "Genes", "for", "which", "it", "was", "calculated", "a", "p", "<", "0", ".", "0001", "and", "Log2", "(", "fold", "change", ")", ">", "0", ".", "25", "are", "reported", "and", "highlighted", "in", "green", ";", "genes", "having", "a", "0", ".", "0001", "0", ".", "25", "are", "reported", "and", "shown", "in", "red", ".", "<", "0", ".", "05", ">", "(", "C", ")", "Box", "&", "Whisker", "plot", "showing", "the", "fold", "change", "in", "fluorescence", "signal", "between", "vehicle", "and", "GDC0941", "-", "treated", "conditions", "for", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "transduced", "with", "non", "-", "target", "Control", ",", "GNB2", "or", "GNG5", "sgRNAs", "(", "N", "=", "2", "or", "3", ")", ".", "Data", "presented", "in", "a", "box", "and", "whisker", "plot", "with", "the", "central", "band", "indicating", "the", "median", ",", "the", "upper", "and", "lower", "extremes", "of", "the", "box", "or", "hinge", "being", "the", "third", "and", "first", "quartiles", "respectively", "and", "the", "whiskers", "extending", "to", "the", "most", "extreme", "data", "values", "within", "1", ".", "5", "times", "the", "inter", "-", "quartile", "range", ".", "Statistical", "significance", "of", "unpaired", "t", "-", "test", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ")", "Biochemical", "analysis", "of", "GNB2", "KO", "cells", ".", "Cell", "lysates", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "parental", "cells", "and", "three", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "GNB2", "KO", "clones", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "the", "bands", "was", "performed", "by", "ImageLite", "software", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A Results of CRISPR-Cas9 screening in combination with AZD8186 100nM (A) The dot-plots show for each gene knocked-out by sgRNAs the fold change (log2) between treated conditions (AZD8186 and vehicle in the fluorescence signal (anti-phosphoS6 immunofluorescence) versus the p-value of the difference calculated by two sided t-test. The plots represent means of biological triplicates. Genes for which it was calculated a p<0.0001 and Log2 (fold change)>0.25 are reported and highlighted in green; genes having a 0.0001 0.25 are reported and shown in red. Gefitinib combined with AZD8186 represents the positive control of the experiment (A). <0.05>B) Results of CRISPR-Cas9 screening in combination with GDC0941 400nM (B). The dot-plots show for each gene knocked-out by sgRNAs the fold change (log2) between treated conditions GDC0941, and vehicle in the fluorescence signal (anti-phosphoS6 immunofluorescence) versus the p-value of the difference calculated by two sided t-test. The plots represent means of biological triplicates. Genes for which it was calculated a p<0.0001 and Log2 (fold change)>0.25 are reported and highlighted in green; genes having a 0.0001 0.25 are reported and shown in red. <0.05>(C) Box & Whisker plot showing the fold change in fluorescence signal between vehicle and GDC0941-treated conditions for MDA-MB-468 cells transduced with non-target Control, GNB2 or GNG5 sgRNAs (N=2 or 3). Data presented in a box and whisker plot with the central band indicating the median, the upper and lower extremes of the box or hinge being the third and first quartiles respectively and the whiskers extending to the most extreme data values within 1.5 times the inter-quartile range. Statistical significance of unpaired t-test ****P<0.0001.(D) Biochemical analysis of GNB2 KO cells. Cell lysates of MDA-MB-468 parental cells and three MDA-MB-468 GNB2 KO clones were probed with the indicated antibodies. Quantification of the bands was performed by ImageLite software."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "parental", "cells", "and", "three", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "GNB2", "KO", "clones", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "GDC0941", "1", "μM", ",", "gefitinib", "3", "μM", "or", "lapatinib", "1", "μM", "for", "24", "hours", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Viability", "assays", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "parental", "cells", "and", "three", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "GNB2", "KO", "clones", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "drugs", "for", "six", "days", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "triplicates", "and", "representative", "of", "two", "or", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Patient", "samples", "from", "METABRIC", "dataset", "classified", "as", "TNBCs", "(", "N", "=", "299", ")", "were", "assigned", "to", "the", "groups", "\"", "PTEN", "-", "low", "\"", "when", "falling", "in", "the", "lower", "quartile", "for", "PTEN", "expression", ",", "\"", "PTEN", "-", "mut", "\"", "when", "harbouring", "a", "non", "-", "synonymous", "mutation", "on", "PTEN", "gene", ",", "\"", "PTEN", "-", "WT", "\"", "in", "all", "other", "cases", ".", "Comparison", "of", "the", "expression", "of", "GNB2", "between", "the", "PTEN", "low", "or", "mut", "and", "the", "PTEN", "-", "WT", "groups", ".", "Box", "&", "Whisker", "plot", "(", "Median", "/", "IQR", "/", "1", ".", "5", "*", "IQR", "Whiskers", ")", ".", "P", "value", "calculated", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) MDA-MB-468 parental cells and three MDA-MB-468 GNB2 KO clones were treated with vehicle, GDC0941 1 μM, gefitinib 3 μM or lapatinib 1 μM for 24 hours. The cell lysates were probed with the indicated antibodies.(B-D) Viability assays of MDA-MB-468 parental cells and three MDA-MB-468 GNB2 KO clones treated with serial dilutions of the indicated drugs for six days. Mean ± SD of triplicates and representative of two or three independent experiments.(E) Patient samples from METABRIC dataset classified as TNBCs (N=299) were assigned to the groups \"PTEN-low\" when falling in the lower quartile for PTEN expression, \"PTEN-mut\" when harbouring a non-synonymous mutation on PTEN gene, \"PTEN-WT\" in all other cases. Comparison of the expression of GNB2 between the PTEN low or mut and the PTEN-WT groups. Box & Whisker plot (Median/IQR/1.5*IQR Whiskers). P value calculated by unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Schematic", "of", "the", "results", "from", "the", "drug", "screening", "with", "compounds", "targeting", "GPCR", "signaling", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "were", "treated", "with", "the", "compounds", "of", "the", "GPCR", "-", "targeted", "library", "at", "three", "different", "concentrations", "(", "0", ".", "1", ",", "1", "or", "10", "μM", ")", "in", "combination", "with", "vehicle", ",", "GDC0941", "450", "nM", "or", "lapatinib", "1", "μM", ".", "The", "pS6", "signal", "was", "measured", "by", "IF", "after", "24", "hours", "of", "treatment", "and", "normalized", "to", "DAPI", ".", "Z", "scores", "of", "the", "normalized", "fluorescence", "values", "for", "each", "drug", "measured", "in", "the", "presence", "of", "vehicle", ",", "GDC0941", "or", "lapatinib", "are", "reported", "on", "the", "y", "axis", "or", "on", "the", "left", "or", "right", "x", "axis", "of", "the", "dot", "plot", ",", "respectively", ".", "Readings", "acquired", "following", "treatment", "with", "the", "three", "different", "concentrations", "of", "the", "GPCR", "-", "targeted", "drugs", "are", "reported", "in", "3", "different", "colours", ".", "Dots", "corresponding", "to", "vorapaxar", "treatments", "at", "the", "three", "different", "concentrations", "are", "highlighted", "in", "the", "plot", ".", "The", "values", "reported", "are", "mean", "of", "a", "biological", "triplicate", "of", "the", "experiment", ".", "(", "B", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "were", "treated", "for", "24", "h", "with", "vehicle", ",", "vorapaxar", "(", "10", "μM", ")", ",", "GDC0941", "(", "1", "μM", ")", "or", "lapatinib", "(", "1", "μM", ")", "alone", "or", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "parental", "cells", "or", "GNB2", "KO", "clones", "were", "starved", "and", "treated", "with", "scramble", "or", "PAR1", "activating", "peptide", "for", "5", "minutes", ",", "alone", "or", "in", "combination", "with", "vorapaxar", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Phospho", "-", "AKT", ",", "pan", "-", "AKT", ",", "phospho", "-", "ERK1", "/", "2", "and", "pan", "-", "ERK1", "/", "2", "bands", "were", "quantified", "by", "the", "use", "of", "ImageLite", "software", ":", "the", "ratio", "of", "phospho", "-", "AKT", "to", "pan", "-", "AKT", "and", "phospho", "-", "ERK1", "/", "2", "to", "pan", "-", "ERK1", "/", "2", "normalised", "to", "the", "control", "peptide", "-", "treated", "conditions", "for", "WT", "and", "GNB2", "KO", "cells", "(", "first", "and", "forth", "lanes", ",", "respectively", ")", "is", "shown", ".", "(", "D", ")", "p", "-", "S6", "/", "loading", "control", "signal", "from", "western", "blots", "experiments", "in", "which", "a", "panel", "of", "six", "TNBC", "PTEN", "-", "null", "cell", "lines", "and", "HCC70", "cells", "that", "acquired", "resistance", "to", "AZD8186", "or", "MK2206", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "vorapaxar", "(", "10", "μM", ")", ",", "GDC0941", "(", "1", "μM", ")", "or", "lapatinib", "(", "1", "μM", ")", "alone", "or", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "The", "values", "were", "normalised", "to", "vehicle", "treatment", "for", "all", "cell", "lines", ".", "Mean", "of", "2", "independent", "experiments", "±", "SD", ".", "P", "values", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "paired", "student", "t", "-", "test", "*", "P", "=", "0", ".", "0235", "and", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "002", ".", "Cell", "lines", "used", "in", "the", "experiments", "were", ":", "MDA", "-", "MB", "-", "468", ",", "HCC70", ",", "HCC1937", ",", "HCC38", ",", "HCC1395", ",", "BT", "-", "549", ",", "HCC70", "AZD8186", "-", "resistant", "and", "HCC70", "MK2206", "-", "resistant", ".", "(", "E", ")", "Long", "-", "term", "proliferation", "assay", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "treated", "with", "vorapaxar", "(", "5", "or", "2", ".", "5", "μM", ")", ",", "GDC0941", "(", "1", "μM", ")", "or", "lapatinib", "(", "1", "μM", ")", ",", "alone", "or", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "Cells", "were", "treated", "for", "two", "weeks", "and", "stained", "by", "crystal", "violet", ".", "One", "representative", "experiment", "of", "three", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Schematic of the results from the drug screening with compounds targeting GPCR signaling. MDA-MB-468 cells were treated with the compounds of the GPCR-targeted library at three different concentrations (0.1, 1 or 10 μM) in combination with vehicle, GDC0941 450 nM or lapatinib 1 μM. The pS6 signal was measured by IF after 24 hours of treatment and normalized to DAPI. Z scores of the normalized fluorescence values for each drug measured in the presence of vehicle, GDC0941 or lapatinib are reported on the y axis or on the left or right x axis of the dot plot, respectively. Readings acquired following treatment with the three different concentrations of the GPCR-targeted drugs are reported in 3 different colours. Dots corresponding to vorapaxar treatments at the three different concentrations are highlighted in the plot. The values reported are mean of a biological triplicate of the experiment.(B) MDA-MB-468 were treated for 24 h with vehicle, vorapaxar (10 μM), GDC0941 (1 μM) or lapatinib (1 μM) alone or in the indicated combinations. The cell lysates were probed with the indicated antibodies.(C) MDA-MB-468 parental cells or GNB2 KO clones were starved and treated with scramble or PAR1 activating peptide for 5 minutes, alone or in combination with vorapaxar. The cell lysates were probed with the indicated antibodies. Phospho-AKT, pan-AKT, phospho-ERK1/2 and pan-ERK1/2 bands were quantified by the use of ImageLite software: the ratio of phospho-AKT to pan-AKT and phospho-ERK1/2 to pan-ERK1/2 normalised to the control peptide-treated conditions for WT and GNB2 KO cells (first and forth lanes, respectively) is shown.(D) p-S6/loading control signal from western blots experiments in which a panel of six TNBC PTEN-null cell lines and HCC70 cells that acquired resistance to AZD8186 or MK2206 were treated with vehicle, vorapaxar (10 μM), GDC0941 (1 μM) or lapatinib (1 μM) alone or in the indicated combinations. The values were normalised to vehicle treatment for all cell lines. Mean of 2 independent experiments ± SD. P values calculated by two-tailed paired student t-test *P=0.0235 and **P=0.002. Cell lines used in the experiments were: MDA-MB-468, HCC70, HCC1937, HCC38, HCC1395, BT-549, HCC70 AZD8186-resistant and HCC70 MK2206-resistant.(E) Long-term proliferation assay of MDA-MB-468 cells treated with vorapaxar (5 or 2.5 μM), GDC0941 (1 μM) or lapatinib (1 μM), alone or in the indicated combinations. Cells were treated for two weeks and stained by crystal violet. One representative experiment of three is shown."}
{"words": ["f1b", ",", "Carboxy", "-", "terminal", "V5immunoblot", "of", "full", "-", "length", "(", "68", " ", "kDa", ")", "and", "cleaved", "(", "36", " ", "kDa", ")", "ATG16L1β", ".", "Silver", "stain", "(", "bottom", "gels", ")", "depicts", "total", "protein", ".", "Data", "represent", "3", "independent", "experiments", ".", "IB", ",", "immunoblot", ".", "c", ",", "TNF", "-", "α", "-", "mediated", "processing", "of", "humanATG16L1", "in", "monocyte", "-", "derived", "macrophages", ".", "Scatter", "plot", "of", "immunoblot", "densitometry", "depicts", "a", "ratio", "of", "cleaved", ":", "full", "-", "length", "ATG16L1", "(", "Extended", "Data", "Fig", ".", "2", ")", ".", "n", "=", "7", "donors", ".", "d", ",", "TNF", "-", "α", "-", "mediated", "processing", "of", "murineATG16L1", "in", "macrophages", ".", "Immunoblot", "represents", "5", "independent", "experiments", ".", "Scatterplot", "represents", "data", "pooled", "from", "5", "independent", "experiments", ".", "WT", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1b, Carboxy-terminal V5immunoblot of full-length (68 kDa) and cleaved (36 kDa) ATG16L1β. Silver stain (bottom gels) depicts total protein. Data represent 3 independent experiments. IB, immunoblot.c, TNF-α-mediated processing of humanATG16L1 in monocyte-derived macrophages. Scatter plot of immunoblot densitometry depicts a ratio of cleaved:full-length ATG16L1 (Extended Data Fig. 2). n = 7 donors.d, TNF-α-mediated processing of murineATG16L1 in macrophages. Immunoblot represents 5 independent experiments. Scatterplot represents data pooled from 5 independent experiments. WT, wild type."}
{"words": ["f2a", ",", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "siCaspase", "8", "were", "stimulated", "with", "2", ".", "0", "μM", "staurosporine", "or", "20", "ng", "ml", "−", "1", "TNF", "+", "10", "μg", "ml", "−", "1", "CHX", ".", "b", ",", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "siCaspase", "9", "were", "stimulated", "as", "in", "a", ".", "c", ",", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "caspase", "-", "3", "-", "or", "caspase", "-", "7", "-", "specific", "siRNAs", "were", "stimulated", "with", "20", "ng", "ml", "−", "1", "TNF", "+", "10", "&", "amp", ";", "amp", ";", "mgr", ";", "g", "ml", "−", "1", "CHX", ".", "d", ",", "Wild", "-", "type", "or", "caspase", "-", "3", "-", "knockout", "macrophages", "were", "stimulated", "with", "2", ".", "0", " ", "µM", "staurosporine", "or", "20", " ", "ng", " ", "ml", "−", "1", "TNF", "+", "10", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", "CHX", ".", "Data", "in", "a", "-", "c", "represent", "2", "independent", "experiments", ";", "data", "in", "d", "represent", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, HeLa cells transfected with control siRNA (siCTL) or siCaspase 8 were stimulated with 2.0 μM staurosporine or 20 ng ml−1 TNF + 10 μg ml−1 CHX.b, HeLa cells transfected with control siRNA or siCaspase 9 were stimulated as in a.c, HeLa cells transfected with control, caspase-3- or caspase-7-specific siRNAs were stimulated with 20 ng ml−1 TNF + 10 &amp;amp;mgr;g ml−1 CHX.d, Wild-type or caspase-3-knockout macrophages were stimulated with 2.0 µM staurosporine or 20 ng ml−1 TNF + 10 µg ml−1 CHX. Data in a-c represent 2 independent experiments; data in d represent 4 independent experiments."}
{"words": ["f3a", ",", "Intracellular", "staining", "for", "LC3", "and", "ATG16L1", "following", "glucose", "starvation", "in", "the", "presence", "of", "bafilomycin", "A1", ".", "White", "mask", "in", "LC3", "channel", "illustrates", "punctate", "LC3", "staining", ",", "representing", "LC3", "-", "II", ".", "Histogram", "depicts", "mean", "fluorescence", "intensity", "of", "10", ",", "000", "cells", "per", "sample", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "mean", "ATG16L1", "fluorescence", "intensity", "in", "a", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "Glu", ".", ",", "glucose", ".", "c", ",", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "AMPK", "&", "amp", ";", "amp", ";", "agr", ";", "(", "Thr", "172", ")", "and", "lipidated", "LC3", "(", "LC3", "-", "II", ")", ".", "d", ",", "Quantification", "of", "mean", "LC3", "-", "II", "area", "in", "murine", "macrophages", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "e", ",", "Caspase", "3", "activity", "in", "murine", "macrophages", "following", "glucose", "starvation", ",", "n", "=", "3", "mice", ".", "RLU", ",", "relative", "light", "units", ".", "f", ",", "Quantification", "of", "mean", "LC3", "-", "II", "area", "in", "wild", "-", "type", "(", "Casp3", "+", "/", "+", ")", "or", "Casp3", "-", "knockout", "(", "Casp3", "−", "/", "−", ")", "macrophages", ",", "n", "=", "3", "mice", ".", "Data", "in", "a", "-", "f", "represent", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Intracellular staining for LC3 and ATG16L1 following glucose starvation in the presence of bafilomycin A1. White mask in LC3 channel illustrates punctate LC3 staining, representing LC3-II. Histogram depicts mean fluorescence intensity of 10,000 cells per sample. b, Quantification of mean ATG16L1 fluorescence intensity in a, n = 4 mice. Glu., glucose.c, Immunoblot of phosphorylated (p-) AMPK&amp;amp;agr; (Thr 172) and lipidated LC3 (LC3-II).d, Quantification of mean LC3-II area in murine macrophages, n = 4 mice.e, Caspase 3 activity in murine macrophages following glucose starvation, n = 3 mice. RLU, relative light units.f, Quantification of mean LC3-II area in wild-type (Casp3+/+) or Casp3-knockout (Casp3−/−) macrophages, n = 3 mice. Data in a-f represent 2 independent experiments."}
{"words": ["f4a", ",", "Quantification", "of", "ATG16L1", "mean", "fluorescence", "intensity", "by", "image", "-", "based", "flow", "cytometry", "of", "10", ",", "000", "cells", ",", "n", "=", "4", "(", "wild", "-", "type", ",", "WT", ")", ",", "5", "(", "T300A", ")", ".", "Data", "represent", "3", "independent", "experiments", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "caspase", "3", "activity", "upon", "glucose", "starvation", "of", "2", " ", "×", " ", "104", "cells", ",", "n", "=", "5", ".", "Data", "represent", "2", "independent", "experiments", ".", "c", ",", "Quantification", "of", "mean", "LC3", "-", "II", "area", "of", "samples", "in", "a", ".", "Data", "represent", "3", "independent", "experiments", ".", "d", ",", "Visualization", "of", "early", "autophagosomes", "by", "transmission", "electron", "micrographs", "(", "TEM", ")", ".", "Red", "arrows", ",", "early", "autophagosomes", ",", "characterized", "by", "vesicular", "structures", "with", "a", "double", "-", "membrane", ".", "Blue", "arrows", ",", "multivesicular", "lysosomal", "structures", ",", "identified", "by", "degraded", "intravesicular", "cargo", ".", "Micrographs", "representative", "of", "10", "-", "12", "images", "per", "donor", ",", "n", "=", "4", "(", "WT", ")", ",", "n", "=", "3", "(", "T300A", ")", ".", "A", "total", "of", "29", "(", "WT", ")", "and", "26", "(", "T300A", ")", "images", "containing", "autophagosomes", "was", "analysed", ".", "Histogram", "quantifies", "autophagic", "vesicles", "as", "a", "ratio", "of", "autophagosome", ":", "cytosolic", "area", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, Quantification of ATG16L1 mean fluorescence intensity by image-based flow cytometry of 10,000 cells, n = 4 (wild-type, WT), 5 (T300A). Data represent 3 independent experiments. b, Quantification of caspase 3 activity upon glucose starvation of 2 × 104 cells, n = 5. Data represent 2 independent experiments. c, Quantification of mean LC3-II area of samples in a. Data represent 3 independent experiments.d, Visualization of early autophagosomes by transmission electron micrographs (TEM). Red arrows, early autophagosomes, characterized by vesicular structures with a double-membrane. Blue arrows, multivesicular lysosomal structures, identified by degraded intravesicular cargo. Micrographs representative of 10-12 images per donor, n = 4 (WT), n = 3 (T300A). A total of 29 (WT) and 26 (T300A) images containing autophagosomes was analysed. Histogram quantifies autophagic vesicles as a ratio of autophagosome:cytosolic area."}
{"words": ["f5a", "-", "c", ",", "Y", ".", "enterocolitica", "colony", "forming", "units", "(", "c", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "in", "human", "and", "murine", "macrophages", "infected", "for", "6", " ", "h", "(", "20", " ", "m", ".", "o", ".", "i", ".", ")", ".", "Data", "in", "a", "are", "pooled", "from", "4", "independent", "cohorts", "of", "3", "or", "4", "donors", "per", "genotype", ",", "total", "n", "=", "16", "(", "non", "-", "risk", ",", "WT", ")", ",", "15", "(", "T300A", ",", "risk", ")", ".", "Data", "in", "b", "represent", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "Data", "in", "c", "represent", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "6", ".", "d", ",", "TNF", "-", "α", ",", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "6", "levels", "in", "culture", "media", "of", "WT", "and", "T316A", "macrophages", "infected", "with", "20", " ", "m", ".", "o", ".", "i", ".", "Y", ".", "enterocolitica", ".", "Data", "represent", "2", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "e", ",", "Ileum", "and", "colon", "histology", "(", "haematoxylin", "and", "eosin", "staining", ")", "of", "WT", "mice", ".", "Images", "are", "representative", "of", "3", "(", "PBS", ")", "and", "8", "(", "Y", ".", "enterocolitica", ")", "treated", "male", "mice", ".", "f", ",", "Measurement", "of", "cytokine", "mRNA", "transcripts", "in", "mesenteric", "lymph", "nodes", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", "of", "3", "mice", "(", "PBS", ")", "and", "7", "mice", "(", "Y", ".", "enterocolitica", ")", "per", "experiment", ".", "Transcripts", "are", "normalized", "to", "Gapdh", "(", "2", "−", "Dgr", ";", "Ct", ")", ".", "g", ",", "Y", ".", "enterocolitica", "c", ".", "f", ".", "u", ".", "in", "mesenteric", "lymph", "nodes", "of", "WT", "and", "T316A", "knock", "-", "in", "mice", "48", "h", "following", "oral", "gavage", ".", "Data", "represent", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "9", "male", "mice", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5a-c, Y. enterocolitica colony forming units (c.f.u.) in human and murine macrophages infected for 6 h (20 m.o.i.). Data in a are pooled from 4 independent cohorts of 3 or 4 donors per genotype, total n = 16 (non-risk, WT), 15 (T300A, risk). Data in b represent 3 independent experiments, n = 4 mice. Data in c represent 3 independent experiments, n = 6.d, TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in culture media of WT and T316A macrophages infected with 20 m.o.i. Y. enterocolitica. Data represent 2 independent experiments, n = 4 mice.e, Ileum and colon histology (haematoxylin and eosin staining) of WT mice. Images are representative of 3 (PBS) and 8 (Y. enterocolitica) treated male mice.f, Measurement of cytokine mRNA transcripts in mesenteric lymph nodes. Data are pooled from 2 independent experiments of 3 mice (PBS) and 7 mice (Y. enterocolitica) per experiment. Transcripts are normalized to Gapdh (2−Dgr;Ct).g, Y. enterocolitica c.f.u. in mesenteric lymph nodes of WT and T316A knock-in mice 48 h following oral gavage. Data represent 3 independent experiments, n = 9 male mice."}
{"words": ["Figure", "1D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "caspase", "-", "1", "(", "Casp", "-", "1", ")", ",", "caspase", "-", "11", "(", "Casp", "-", "11", ")", ",", "gasdermin", "D", "(", "GSDMD", ")", "and", "GAPDH", "(", "loading", "control", ")", "in", "WT", "and", "mutant", "BMDMs", "left", "untreated", "or", "assessed", "20", "h", "after", "infection", "with", "M", ".", "catarrhalis", "(", "Ne11", ",", "MOI", "100", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "one", "three", "independent", "experiments", "(", "DE", ".", "Release", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "18", ",", "TNF", "and", "LDH", "from", "BMDMs", "after", "treatment", "as", "in", "D", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "biological", "replicate", "(", "E", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "(", "E", ")", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "E", ";", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "EG", ".", "IncuCyte", "live", "-", "imaging", "analysis", "of", "WT", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDM", "viability", "after", "infection", "with", "M", ".", "catarrhalis", "as", "in", "D", ",", "or", "transfection", "with", "LPS", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "(", "G", ")", "independent", "experiments", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D. Immunoblot analysis of caspase-1 (Casp-1), caspase-11 (Casp-11), gasdermin D (GSDMD) and GAPDH (loading control) in WT and mutant BMDMs left untreated or assessed 20 h after infection with M. catarrhalis (Ne11, MOI 100). Data information: Data are from one three independent experiments (DE. Release of IL-1β, IL-18, TNF and LDH from BMDMs after treatment as in D. Data information: Each symbol represents an independent biological replicate (E). **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test (E). Data are from three independent experiments E; mean and s.e.m. in EG. IncuCyte live-imaging analysis of WT and Casp11-/- BMDM viability after infection with M. catarrhalis as in D, or transfection with LPS. Data information: Data are pooled from two (G) independent experiments mean and s.e.m. in G)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "caspase", "-", "1", "(", "Casp", "-", "1", ")", ",", "caspase", "-", "11", "(", "Casp", "-", "11", ")", "and", "gasdermin", "D", "(", "GSDMD", ")", "in", "WT", ",", "Nlrp3", "-", "/", "-", ",", "Casp11", "-", "/", "-", "and", "Aim2", "-", "/", "-", "BMDMs", "left", "untreated", "(", "Med", ".", ")", "or", "5", "h", "after", "transfection", "with", "5", "µg", "of", "LOS", "from", "M", ".", "catarrhalis", "(", "O35E", ")", "or", "5", "µg", "of", "LPS", "from", "E", ".", "coli", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "A", ",", "B", ".", "Release", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "18", ",", "TNF", "and", "LDH", "from", "BMDMs", "after", "treatment", "as", "in", "A", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "biological", "replicate", "(", "B", ",", "NS", ",", "no", "statistical", "significance", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "(", "B", ",", "Data", "are", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "B", ",", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "B", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of caspase-1 (Casp-1), caspase-11 (Casp-11) and gasdermin D (GSDMD) in WT, Nlrp3-/-, Casp11-/- and Aim2-/- BMDMs left untreated (Med.) or 5 h after transfection with 5 µg of LOS from M. catarrhalis (O35E) or 5 µg of LPS from E. coli. Data information: Data are from three independent experiments (A,B. Release of IL-1β, IL-18, TNF and LDH from BMDMs after treatment as in A. Data information: Each symbol represents an independent biological replicate (B, NS, no statistical significance; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test (B, Data are pooled from three independent experiments (B, mean and s.e.m. in B,"}
{"words": ["Figure", "3F", ".", "Transcript", "abundance", "for", "genes", "encoding", "GTPases", "in", "WT", "and", "Ifnar1", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "with", "M", ".", "catarrhalis", "as", "in", "C", ".", "Transcript", "abundance", "is", "provided", "in", "counts", "per", "million", "(", "CPM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "pooled", "from", "three", "independent", "experimentsG", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "genes", "encoding", "the", "family", "of", "guanylate", "binding", "proteins", "(", "GBP1", "-", "11", ")", "in", "WT", "and", "Ifnar1", "-", "/", "-", "BMDMs", "left", "untreated", "(", "Med", ".", ")", "or", "following", "treated", "as", "in", "C", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "biological", "replicate", "G", ")", ".", "NS", ",", "no", "statistical", "significance", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "G", ")", ")", ".", "Data", "are", "from", "one", "experiment", "representative", "of", "four", "(", "G", ")", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3F. Transcript abundance for genes encoding GTPases in WT and Ifnar1-/- BMDMs infected with M. catarrhalis as in C. Transcript abundance is provided in counts per million (CPM). Data information: Data are pooled from three independent experimentsG. qRT-PCR analysis of genes encoding the family of guanylate binding proteins (GBP1-11) in WT and Ifnar1-/- BMDMs left untreated (Med.) or following treated as in C. Data information: Each symbol represents an independent biological replicate G). NS, no statistical significance; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test G)). Data are from one experiment representative of four (G) independent experiments (mean and s.e.m. in G)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "intracellular", "M", ".", "catarrhalis", "(", "green", ")", "and", "GBP1", ",", "GBP2", ",", "GBP3", ",", "GBP5", "or", "GBP7", "(", "red", ")", "in", "WT", "BMDMs", "left", "untreated", "(", "Med", ".", ")", "or", "assessed", "12", "h", "after", "infection", "with", "M", ".", "catarrhalis", "(", "Ne11", ",", "MOI", "20", ")", ".", "B", ".", "Quantitation", "of", "GBP1", "-", ",", "GBP2", "-", ",", "GBP3", "-", ",", "GBP5", "-", "and", "GBP7", "-", "postive", "M", ".", "catarrhalis", "in", "WT", "BMDMs", "as", "treated", "in", "A", ".", "Data", "information", ":", "Arrowheads", "indicate", "bacteria", "colocalised", "with", "GBPs", ".", "To", "quantify", "the", "proportion", "of", "GBP", "-", "positive", "bacteria", "in", "a", "field", "of", "view", ",", "we", "used", "the", "single", "red", "channel", "(", "anti", "-", "GBP", "staining", ")", "and", "compared", "this", "to", "the", "green", "channel", "(", "anti", "-", "M", ".", "catarrhalis", "staining", ")", ".", "The", "number", "of", "GBP", "-", "positive", "M", ".", "catarrhalis", "was", "divided", "by", "the", "total", "number", "of", "M", ".", "catarrhalis", "counted", "to", "obtain", "the", "proportion", "of", "GBP", "-", "positive", "bacteria", "(", "B", ")", ".", "A", "total", "of", "100", "BMDMs", "were", "analysed", "to", "quantify", "the", "proportion", "of", "GBP", "-", "positive", "bacteria", "per", "cell", "using", "confocal", "microscopy", "(", "B", ")", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "A", ",", "or", "are", "pooled", "from", "two", "(", "B", ")", "independent", "experiments", "Scale", "bars", ",", "5", "µm", "(", "A", ",", "F", ".", "Recovery", "of", "M", ".", "catarrhalis", "(", "as", "colony", "-", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "from", "primary", "WT", ",", "Gbpchr3", "-", "KO", "and", "Ifnar1", "-", "/", "-", "lung", "fibroblasts", "4", ",", "8", "and", "12", "h", "after", "infection", "with", "M", ".", "catarrhalis", "(", "Ne11", ",", "MOI", "100", ")", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "biological", "replicate", "F", ")", ".", "NS", ",", "no", "statistical", "significance", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "F", ";", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "G", ".", "Quantitation", "of", "intracellular", "bacteria", "by", "Transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "in", "WT", ",", "Gbpchr3", "-", "KO", "and", "Ifnar1", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "with", "M", ".", "catarrhalis", "(", "Ne11", ",", "MOI", "50", ")", "for", "12", "h", ".", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "experiment", "(", "E", "and", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "A", "total", "of", "100", "BMDMs", "were", "analysed", "to", "quantify", "the", "intracellular", "bacterial", "burden", "using", "electron", "microscopy", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "from", "one", "experiment", "representative", "of", "two", "(", "G", ")", "independent", "experiments", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Confocal microscopy analysis of intracellular M. catarrhalis (green) and GBP1, GBP2, GBP3, GBP5 or GBP7 (red) in WT BMDMs left untreated (Med.) or assessed 12 h after infection with M. catarrhalis (Ne11, MOI 20). B. Quantitation of GBP1-, GBP2-, GBP3-, GBP5- and GBP7-postive M. catarrhalis in WT BMDMs as treated in A. Data information: Arrowheads indicate bacteria colocalised with GBPs. To quantify the proportion of GBP-positive bacteria in a field of view, we used the single red channel (anti-GBP staining) and compared this to the green channel (anti-M. catarrhalis staining). The number of GBP-positive M. catarrhalis was divided by the total number of M. catarrhalis counted to obtain the proportion of GBP-positive bacteria (B). A total of 100 BMDMs were analysed to quantify the proportion of GBP-positive bacteria per cell using confocal microscopy (B) Data are from three independent experiments (A, or are pooled from two (B) independent experiments Scale bars, 5 µm (A,F. Recovery of M. catarrhalis (as colony-forming units (CFU) from primary WT, Gbpchr3-KO and Ifnar1-/- lung fibroblasts 4, 8 and 12 h after infection with M. catarrhalis (Ne11, MOI 100). Data information: Each symbol represents an independent biological replicate F). NS, no statistical significance; * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test Data are from three independent experiments F; mean and s.e.m.G. Quantitation of intracellular bacteria by Transmission electron microscopy (TEM) in WT, Gbpchr3-KO and Ifnar1-/- BMDMs infected with M. catarrhalis (Ne11, MOI 50) for 12 h. Each symbol represents an independent experiment (E and F). Data information: A total of 100 BMDMs were analysed to quantify the intracellular bacterial burden using electron microscopy (G). Data are from one experiment representative of two (G) independent experiments mean and s.e.m."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "caspase", "-", "1", "(", "Casp", "-", "1", ")", ",", "caspase", "-", "11", "(", "Casp", "-", "11", ")", "and", "gasdermin", "D", "(", "GSDMD", ")", "in", "WT", ",", "Gbp1", "-", "/", "-", ",", "Gbp2", "-", "/", "-", ",", "Gbp3", "-", "/", "-", ",", "Gbp5", "-", "/", "-", ",", "Gbp7", "-", "/", "-", ",", "Gbp4", "/", "8", "/", "9", "-", "/", "-", ",", "Gbp11", "­", "­", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDMs", "left", "untreated", "(", "Med", ".", ")", "or", "assessed", "10", "h", "after", "infection", "with", "M", ".", "catarrhalis", "(", "Ne11", ",", "MOI", "100", ")", ",", "or", "5", "h", "after", "transfection", "with", "5", "µg", "LPS", "from", "E", ".", "coli", ".", "B", ".", "Release", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "18", ",", "LDH", ",", "TNF", ",", "IL", "-", "6", "and", "KC", "from", "BMDMs", "after", "treatment", "as", "in", "A", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "an", "independent", "biological", "replicate", "(", "B", ")", ".", "NS", ",", "no", "statistical", "significance", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "(", "B", ")", ")", ".", "Data", "are", "are", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "B", ";", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Immunoblot analysis of caspase-1 (Casp-1), caspase-11 (Casp-11) and gasdermin D (GSDMD) in WT, Gbp1-/-, Gbp2-/-, Gbp3-/-, Gbp5-/-, Gbp7-/-, Gbp4/8/9-/-, Gbp11­­-/- and Casp11-/- BMDMs left untreated (Med.) or assessed 10 h after infection with M. catarrhalis (Ne11, MOI 100), or 5 h after transfection with 5 µg LPS from E. coli.B. Release of IL-1β, IL-18, LDH, TNF, IL-6 and KC from BMDMs after treatment as in A. Data information: Each symbol represents an independent biological replicate (B). NS, no statistical significance; * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test (B)). Data are are pooled from three independent experiments (B; mean and s.e.m. in B)."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Quantification", "of", "OD600", "of", "M", ".", "catarrhalis", "in", "BHI", "media", "over", "6", "h", "in", "the", "presence", "of", "solvent", "control", "(", "Sol", ".", "Ctrl", ".", ")", ",", "80", "µg", "/", "mL", "recombinant", "GBP2", "or", "50", "µg", "/", "mL", "kanamycin", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "(", "B", "Data", "are", "from", "one", "experiment", "representative", "of", "two", "(", "A", ")", "or", "three", "(", "B", ",", "Each", "independent", "experiment", "consists", "of", "three", "(", "B", ",", "technical", "replicates", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "ATP", "from", "M", ".", "catarrhalis", "in", "BHI", "media", "over", "6", "h", "in", "the", "presence", "of", "Sol", ".", "Ctrl", ".", ",", "30", "µg", "/", "mL", "recombinant", "GBP2", "or", "50", "µg", "/", "mL", "kanamycin", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "pooled", "from", "two", "(", "C", ")", "independent", "experiments", "Each", "independent", "experiment", "consists", "of", "two", "(", "C", ")", "technical", "replicates", ".", "D", ".", "Viability", "of", "M", ".", "catarrhalis", "(", "as", "a", "percentage", "of", "CFU", "in", "relation", "to", "Sol", ".", "Ctrl", ".", ")", "assessed", "6", "h", "after", "incubation", "with", "recombinant", "GBP2", "at", "3", ",", "30", "or", "300", "µg", "/", "mL", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "-", "comparisons", "test", "D", ")", "Data", "are", "from", "one", "experiment", "representative", "of", "three", "D", ",", "independent", "experiments", "Each", "independent", "experiment", "consists", "of", "three", "D", ",", "technical", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Quantification of OD600 of M. catarrhalis in BHI media over 6 h in the presence of solvent control (Sol. Ctrl.), 80 µg/mL recombinant GBP2 or 50 µg/mL kanamycin. Data information: ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test (B Data are from one experiment representative of two (A) or three (B, Each independent experiment consists of three (B, technical replicates.C. Quantification of ATP from M. catarrhalis in BHI media over 6 h in the presence of Sol. Ctrl., 30 µg/mL recombinant GBP2 or 50 µg/mL kanamycin. Data information: Data are pooled from two (C) independent experiments Each independent experiment consists of two (C) technical replicates.D. Viability of M. catarrhalis (as a percentage of CFU in relation to Sol. Ctrl.) assessed 6 h after incubation with recombinant GBP2 at 3, 30 or 300 µg/mL. Data information: ** P<0.01; *** P<0.001; **** P<0.0001 (one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparisons test D) Data are from one experiment representative of three D, independent experiments Each independent experiment consists of three D, technical replicates."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "C", ",", "D", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Nlrp3", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "11", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "E", ",", "F", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Gbp1", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "9", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "G", ",", "H", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Gbp2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "I", ",", "J", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Gbp3", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "K", ",", "L", ".", "Bacterial", "burden", "and", "concentration", "of", "IL", "-", "18", "in", "the", "spleen", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Gbp5", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "after", "M", ".", "catarrhalis", "infection", ".", "Data", "information", ":", "A", "mix", "of", "male", "and", "female", "mice", "6", "-", "8", "weeks", "old", "were", "used", "in", "each", "experiment", "and", "were", "injected", "i", ".", "p", ".", "with", "2", "×", "107", "CFU", "of", "M", ".", "catarrhalis", "and", "analysed", "after", "6", "h", ".", "Each", "symbol", "represents", "an", "individual", "mouse", "(", "A", "-", "L", ")", ".", "Each", "panel", "represents", "data", "from", "a", "single", "experiment", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "A", "-", "L", ")", ".", "Each", "experiment", "was", "performed", "at", "least", "two", "times", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "A", "-", "L", ")", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=10) and Casp11-/- mice (n=10) after M. catarrhalis infection. C, D. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=10) and Nlrp3-/- mice (n=11) after M. catarrhalis infection. E, F. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=10) and Gbp1-/- mice (n=9) after M. catarrhalis infection. G, H. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=10) and Gbp2-/- mice (n=8) after M. catarrhalis infection. I, J. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=10) and Gbp3-/- mice (n=8) after M. catarrhalis infection. K, L. Bacterial burden and concentration of IL-18 in the spleen of WT mice (n=5) and Gbp5-/- mice (n=8) after M. catarrhalis infection. Data information: A mix of male and female mice 6-8 weeks old were used in each experiment and were injected i.p. with 2×107 CFU of M. catarrhalis and analysed after 6 h. Each symbol represents an individual mouse (A-L). Each panel represents data from a single experiment (mean and s.e.m. in A-L). Each experiment was performed at least two times. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001 (two-tailed t-test (A-L))."}
{"words": ["Figure", "1C", "Frequency", "of", "C179", "+", "or", "V5", "-", "tag", "+", "293T", "cells", "24h", "after", "transfection", "of", "AAV", "-", "vector", "plasmids", "as", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Symbols", "represent", "single", "experiments", "and", "bars", "the", "mean", "±", "SE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", "Immunoblot", "of", "293T", "cells", "72", "h", "after", "transduction", "with", "AAV", "-", "vectors", "at", "a", "MOI", "of", "106", ".", "Antigen", "expression", "was", "detected", "with", "an", "anti", "-", "V5", "-", "tag", "antibody", ".", "Equal", "loading", "was", "controlled", "with", "a", "GAPDH", "antibody", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Frequency of C179+ or V5-tag+ 293T cells 24h after transfection of AAV-vector plasmids as measured by flow cytometry. Symbols represent single experiments and bars the mean ± SE (n = 3).D Immunoblot of 293T cells 72 h after transduction with AAV-vectors at a MOI of 106. Antigen expression was detected with an anti-V5-tag antibody. Equal loading was controlled with a GAPDH antibody (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "2", "Total", "IgG", "ELISA", "titers", "expressed", "as", "area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ")", "against", "homologous", "Cal", "/", "7", "/", "9", "virus", "of", "pre", "-", "immune", "and", "pre", "-", "challenge", "sera", "of", "individual", "animals", "of", "the", "indicated", "vaccine", "groups", "(", "AAV", "-", "HA", ",", "-", "cHA", ",", "-", "GFP", ",", "WIV", "n", "=", "18", ",", "AAV", "-", "NP", "n", "=", "11", ")", ".", "Background", "reactivity", "of", "pooled", "AAV", "-", "GFP", "pre", "-", "challenge", "serum", "is", "shown", "as", "dashed", "line", ".", "ELISAs", "were", "performed", "in", "technical", "duplicates", ".", "IgA", "ELISA", "titers", "in", "post", "-", "challenge", "lung", "homogenates", "against", "Cal", "/", "7", "/", "9", "of", "individual", "mice", "of", "the", "indicated", "vaccine", "groups", "(", "AAV", "-", "HA", ",", "-", "cHA", ",", "-", "GFP", ",", "-", "NP", ",", "WIV", "n", "=", "11", ")", ".", "of", "the", "Cal", "/", "7", "/", "9", "(", "blue", "symbols", ")", "and", "PR8", "low", "dose", "(", "red", "symbols", ")", "challenge", "groups", ".", "ELISAs", "were", "performed", "in", "technical", "duplicates", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Total IgG ELISA titers expressed as area under the curve (AUC) against homologous Cal/7/9 virus of pre-immune and pre-challenge sera of individual animals of the indicated vaccine groups (AAV-HA, -cHA, -GFP, WIV n = 18, AAV-NP n = 11). Background reactivity of pooled AAV-GFP pre-challenge serum is shown as dashed line. ELISAs were performed in technical duplicates.  IgA ELISA titers in post-challenge lung homogenates against Cal/7/9 of individual mice of the indicated vaccine groups (AAV-HA, -cHA, -GFP, -NP, WIV n = 11). of the Cal/7/9 (blue symbols) and PR8 low dose (red symbols) challenge groups. ELISAs were performed in technical duplicates. "}
{"words": ["Figure", "3", "A", "Immunoblot", "analysis", "of", "purified", "H1N1", "viruses", "A", "/", "California", "/", "7", "/", "2009", "(", "Cal", "/", "7", "/", "9", ")", ",", "A", "/", "Brevig", "Mission", "/", "1", "/", "1918", "(", "BM", "/", "1", "/", "1918", ")", ",", "A", "/", "Puerto", "Rico", "/", "8", "/", "1934", "(", "PR8", ")", "or", "A", "/", "Brisbane", "/", "59", "/", "2007", "(", "Bris", "/", "59", "/", "7", ")", "separated", "under", "reducing", "and", "denaturing", "conditions", ".", "Uncleaved", "HA0", "and", "cleavage", "products", "HA1", "and", "HA2", "were", "detected", "with", "pooled", "pre", "-", "challenge", "sera", "(", "AAV", "-", "HA", ",", "-", "cHA", ",", "-", "GFP", ",", "WIV", "n", "=", "18", ",", "AAV", "-", "NP", "n", "=", "11", ")", "as", "indicated", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", "to", "F", "Binding", "of", "C179", "(", "C", ")", ",", "or", "antibodies", "present", "in", "AAV", "-", "HA", "(", "D", ")", ",", "AAV", "-", "cHA", "(", "E", ")", "or", "WIV", "(", "F", ")", "pooled", "pre", "-", "challenge", "sera", "(", "n", "=", "18", "mice", "per", "group", ")", "to", "Cal", "/", "7", "/", "9", "or", "PR8", "virus", "after", "incubation", "of", "the", "virions", "at", "pH", "=", "7", ".", "2", ",", "5", ".", "8", ",", "5", ".", "4", ",", "5", ".", "0", ",", "4", ".", "4", "or", "4", ".", "4", "+", "DTT", "to", "induce", "conformational", "changes", "in", "HA", "or", "remove", "the", "HA1", "subdomain", ".", "Mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ",", "in", "technical", "triplicates", ")", ".", "Statistical", "significance", "between", "pH", "=", "7", ".", "2", "and", "other", "conditions", "was", "determined", "using", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "testing", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A Immunoblot analysis of purified H1N1 viruses A/California/7/2009 (Cal/7/9), A/Brevig Mission/1/1918 (BM/1/1918), A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) or A/Brisbane/59/2007 (Bris/59/7) separated under reducing and denaturing conditions. Uncleaved HA0 and cleavage products HA1 and HA2 were detected with pooled pre-challenge sera (AAV-HA, -cHA, -GFP , WIV n = 18, AAV-NP n = 11) as indicated (n = 3). C to F Binding of C179 (C), or antibodies present in AAV-HA (D), AAV-cHA (E) or WIV (F) pooled pre-challenge sera (n = 18 mice per group) to Cal/7/9 or PR8 virus after incubation of the virions at pH = 7.2, 5.8, 5.4, 5.0, 4.4 or 4.4+DTT to induce conformational changes in HA or remove the HA1 subdomain. Mean ± SD (n = 3, in technical triplicates). Statistical significance between pH = 7.2 and other conditions was determined using Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison testing (*p<0.05, **p<0.01). "}
{"words": ["Figure", "4", "A", "and", "B", "Influenza", "virus", "specific", "activation", "of", "the", "murine", "FcγRI", ",", "FcγRII", ",", "FcγRIII", "and", "FcγRIV", "by", "antibodies", "in", "pooled", "pre", "-", "challenge", "sera", "(", "AAV", "-", "HA", ",", "-", "cHA", ",", "-", "GFP", ",", "WIV", "n", "=", "18", ",", "AAV", "-", "NP", "n", "=", "11", "mice", "per", "group", ")", ".", "MDCKII", "cells", "were", "infected", "with", "Cal", "/", "7", "/", "9", "(", "A", ")", "or", "PR8", "(", "B", ")", "before", "mouse", "serum", "and", "FcγR", "-", "expressing", "reporter", "cells", "were", "added", ".", "Influenza", "specific", "Fc", "-", "FcγR", "interaction", "induces", "the", "production", "of", "IL", "-", "2", "in", "the", "FcγR", "-", "expressing", "reporter", "cell", ",", "which", "was", "measured", "by", "anti", "-", "IL2", "ELISA", "(", "n", "=", "3", ",", "technical", "duplicates", ")", ".", "Mean", "±", "SE", ".", "C", "HA", "-", "specific", "activation", "of", "FcγR", "by", "AAV", "-", "HA", ",", "AAV", "-", "cHA", "or", "WIV", "pooled", "pre", "-", "challenge", "sera", "(", "n", "=", "18", "mice", "per", "group", ")", ".", "MDCKII", "cells", "were", "transfected", "with", "wildtype", "HA", "(", "pAAV", "-", "HA", ")", "or", "a", "stalk", "-", "only", "HA", "(", "pAAV", "-", "mHL1", ")", "before", "mouse", "serum", "and", "FcγR", "-", "I", "-", "expressing", "reporter", "cells", "were", "added", "(", "n", "=", "2", ",", "technical", "duplicates", ")", ".", "Mean", "±", "SE", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A and B Influenza virus specific activation of the murine FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcγRIV by antibodies in pooled pre-challenge sera (AAV-HA, -cHA, -GFP, WIV n = 18, AAV-NP n = 11 mice per group). MDCKII cells were infected with Cal/7/9 (A) or PR8 (B) before mouse serum and FcγR-expressing reporter cells were added. Influenza specific Fc-FcγR interaction induces the production of IL-2 in the FcγR-expressing reporter cell, which was measured by anti-IL2 ELISA (n = 3, technical duplicates). Mean ± SE.  C HA-specific activation of FcγR by AAV-HA, AAV-cHA or WIV pooled pre-challenge sera (n = 18 mice per group). MDCKII cells were transfected with wildtype HA (pAAV-HA) or a stalk-only HA (pAAV-mHL1) before mouse serum and FcγR-I-expressing reporter cells were added (n = 2, technical duplicates). Mean ± SE. "}
{"words": ["Figure", "5", "A", "to", "F", "Mice", "were", "vaccinated", "three", "times", "with", "AAV", "-", "vectors", "or", "two", "times", "with", "WIV", "and", "then", "challenged", "with", "a", "lethal", "dose", "of", "homologous", "influenza", "virus", "(", "Cal", "/", "7", "/", "9", ")", "(", "A", ",", "B", ";", "n", "=", "5", ")", "or", "two", "different", "lethal", "doses", "of", "the", "heterologous", "PR8", "strain", "(", "C", ",", "D", ";", "n", "=", "6", "and", "E", ",", "F", ";", "n", "=", "7", ")", ".", "Survival", "was", "monitored", "over", "a", "14", "-", "day", "period", "and", "is", "depicted", "as", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "(", "A", ",", "C", ",", "E", ")", ".", "Weight", "loss", "was", "determined", "during", "the", "14", "-", "day", "period", ",", "which", "is", "shown", "in", "relation", "to", "the", "weight", "at", "day", "0", "(", "B", ",", "D", ",", "F", ")", ".", "Mean", "±", "SE", ".", "Statistical", "significance", "between", "negative", "control", "group", "(", "AAV", "-", "GFP", ")", "or", "WIV", "group", "(", "E", ")", "and", "each", "vaccine", "group", "was", "determined", "using", "Log", "-", "Rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A to F Mice were vaccinated three times with AAV-vectors or two times with WIV and then challenged with a lethal dose of homologous influenza virus (Cal/7/9) (A, B; n = 5) or two different lethal doses of the heterologous PR8 strain (C, D; n = 6 and E, F; n = 7). Survival was monitored over a 14-day period and is depicted as Kaplan-Meier plot (A, C, E). Weight loss was determined during the 14-day period, which is shown in relation to the weight at day 0 (B, D, F). Mean ± SE. Statistical significance between negative control group (AAV-GFP) or WIV group (E) and each vaccine group was determined using Log-Rank (Mantel-Cox) test (*p<0.05, **p<0.01). "}
{"words": ["Figure", "6", "B", "Cal", "/", "7", "/", "9", "-", "specific", "serum", "antibody", "titers", "in", "individual", "sera", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Black", "lines", ":", "individual", "animals", ",", "red", "lines", ":", "mean", "titer", ".", "Statistical", "significance", "between", "pre", "-", "immune", "and", "immune", "sera", "was", "determined", "using", "Friedman", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "testing", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "lower", "table", "indicates", "Cal", "/", "7", "/", "9", "-", "specific", "MN50", "and", "HAI", "mean", "titers", ".", "Assays", "were", "performed", "in", "technical", "duplicates", ".", "C", "to", "E", "Clinical", "score", "(", "C", ")", ",", "body", "temperature", "(", "D", ")", ",", "and", "relative", "weight", "(", "E", ")", "during", "challenge", "period", ".", "Statistical", "significance", "between", "pre", "-", "immune", "and", "immune", "sera", "was", "determined", "using", "Friedman", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "testing", "(", "AAV", "-", "HA", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "AAV", "-", "cHA", "§", "§", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "AAV", "-", "GFP", "$", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "$", "$", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "QIV", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", ")", ".", "Mean", "±", "SD", "F", "Virus", "titers", "in", "nasal", "turbinates", "(", "NT", ")", ",", "trachea", "or", "lung", "homogenates", ".", "Statistical", "significance", "between", "AAV", "-", "GFP", "and", "vaccine", "groups", "was", "determined", "using", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "testing", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Lines", "indicate", "the", "GMT", ".", "Assays", "were", "performed", "in", "technical", "duplicates", ".", "G", "and", "H", "IHC", "staining", "of", "submucosal", "glands", "(", "SMG", ")", "(", "G", ")", "or", "bronchi", "(", "H", ")", "with", "an", "anti", "-", "H1N1", "polyclonal", "antibody", "(", "bar", ":", "100", "µm", ";", "red", ":", "influenza", "antigen", "(", "neufuchsin", ")", ";", "blue", ":", "nuclei", "(", "haematoxylin", ")", ")", ".", "I", "and", "J", "H", "&", "E", "stained", "histological", "sections", "of", "bronchi", "(", "I", ")", "and", "lung", "parenchyma", "with", "alveolar", "epithelial", "cells", "(", "AEC", ",", "J", ")", ".", "Arrowheads", ":", "areas", "of", "suppurative", "bronchitis", "/", "bronchiolitis", ";", "arrows", ":", "interstitial", "pneumonia", ",", "necrosis", "of", "AEC", "(", "bar", ":", "(", "I", ")", "100", "µm", ";", "(", "J", ")", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 B Cal/7/9-specific serum antibody titers in individual sera at indicated time points. Black lines: individual animals, red lines: mean titer. Statistical significance between pre-immune and immune sera was determined using Friedman test with Dunn's multiple comparison testing (*p<0.05, **p<0.01). The lower table indicates Cal/7/9-specific MN50 and HAI mean titers. Assays were performed in technical duplicates.  C to E Clinical score (C), body temperature (D), and relative weight (E) during challenge period. Statistical significance between pre-immune and immune sera was determined using Friedman test with Dunn's multiple comparison testing (AAV-HA ##p<0.01; AAV-cHA §§p<0.01; AAV-GFP $p<0.05; $$p<0.01; QIV *p<0.05;). Mean ± SD  F Virus titers in nasal turbinates (NT), trachea or lung homogenates. Statistical significance between AAV-GFP and vaccine groups was determined using Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparison testing (*p<0.05). Lines indicate the GMT. Assays were performed in technical duplicates.  G and H IHC staining of submucosal glands (SMG) (G) or bronchi (H) with an anti-H1N1 polyclonal antibody (bar: 100 µm; red: influenza antigen (neufuchsin); blue: nuclei (haematoxylin)).  I and J H&E stained histological sections of bronchi (I) and lung parenchyma with alveolar epithelial cells (AEC, J). Arrowheads: areas of suppurative bronchitis/bronchiolitis; arrows: interstitial pneumonia, necrosis of AEC (bar: (I) 100 µm; (J) 50 µm). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "The", "concentration", "-", "effect", "relationships", "of", "PARP1", "inhibition", "by", "thioparib", ",", "talazoparib", ",", "and", "olaparib", ",", "as", "assayed", "by", "histone", "-", "based", "ELISA", ".", "Data", "are", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "C", ")", "Concentration", "-", "dependent", "increase", "in", "PARP1", "-", "DNA", "binding", "by", "three", "PARP", "inhibitors", "using", "DSB", "FA", "assays", ".", "FA", "was", "measured", "60", "min", "after", "adding", "NAD", "+", ",", "and", "the", "ΔFA", "values", "represent", "the", "changes", "in", "PARP1", "-", "DNA", "binding", ".", "Data", "from", "four", "biological", "replicates", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "(", "F", ")", "and", "(", "G", ")", "Effects", "of", "thioparib", "on", "BRCA1", "-", "deficient", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "(", "F", ")", "and", "BRCA2", "-", "deficient", "Capan", "-", "1", "(", "G", ")", "xenografts", ".", "Mice", "bearing", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "tumors", "were", "dosed", "orally", "with", "10", "mg", "/", "kg", "thioparib", ",", "100", "mg", "/", "kg", "olaparib", ",", "or", "vehicle", "(", "Veh", ")", "once", "daily", "for", "3", "weeks", ";", "and", "mice", "bearing", "Capan", "-", "1", "tumors", "were", "dosed", "orally", "with", "5", "or", "25", "mg", "/", "kg", "thioparib", ",", "0", ".", "3", "mg", "/", "kg", "talazoparib", ",", "or", "vehicle", "(", "Veh", ")", "once", "daily", "for", "3", "weeks", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Representative", "images", "of", "xenograft", "tumors", "are", "shown", ",", "and", "mice", "tails", "represent", "complete", "regression", "of", "tumors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) The concentration-effect relationships of PARP1 inhibition by thioparib, talazoparib, and olaparib, as assayed by histone-based ELISA. Data are obtained from three biological replicates and depicted as mean ± SEM. (C) Concentration-dependent increase in PARP1-DNA binding by three PARP inhibitors using DSB FA assays. FA was measured 60 min after adding NAD+, and the ΔFA values represent the changes in PARP1-DNA binding. Data from four biological replicates are presented as mean ± SEM. ((F) and (G) Effects of thioparib on BRCA1-deficient MDA-MB-436 (F) and BRCA2-deficient Capan-1 (G) xenografts. Mice bearing MDA-MB-436 tumors were dosed orally with 10 mg/kg thioparib, 100 mg/kg olaparib, or vehicle (Veh) once daily for 3 weeks; and mice bearing Capan-1 tumors were dosed orally with 5 or 25 mg/kg thioparib, 0.3 mg/kg talazoparib, or vehicle (Veh) once daily for 3 weeks (n = 6). Data are shown as mean ± SEM. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. ***P < 0.0001. Representative images of xenograft tumors are shown, and mice tails represent complete regression of tumors."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "The", "IC50", "values", "of", "thioparib", "in", "six", "acquired", "PARPi", "-", "resistant", "cell", "lines", ".", "Numbers", "1", "-", "6", "represent", "the", "PARPi", "-", "resistant", "Capan", "-", "1", "/", "OP", ",", "Capan", "-", "1", "/", "TP", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "/", "OP", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "/", "TP", ",", "U251", "/", "OP", ",", "and", "U251", "/", "TP", "cells", ",", "respectively", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "PARP", "inhibitors", "for", "7", "days", "and", "then", "subjected", "to", "SRB", "assay", ".", "The", "IC50", "values", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", " ", "SD", "from", "three", "separate", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Efficacy", "of", "thioparib", "in", "the", "PDX", "model", "BR", "-", "05", "-", "0028", "(", "BRCA1", "-", "deficient", ")", ".", "Mice", "bearing", "BR", "-", "05", "-", "0028", "tumors", "derived", "from", "a", "patient", "with", "breast", "cancer", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "treated", "with", "10", "or", "30", "mg", "/", "kg", "thioparib", "or", "100", "mg", "/", "kg", "olaparib", "for", "6", "weeks", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) The IC50 values of thioparib in six acquired PARPi-resistant cell lines. Numbers 1-6 represent the PARPi-resistant Capan-1/OP, Capan-1/TP, MDA-MB-436/OP, MDA-MB-436/TP, U251/OP, and U251/TP cells, respectively. Cells were treated with the indicated PARP inhibitors for 7 days and then subjected to SRB assay. The IC50 values are expressed as the mean ± SD from three separate experiments.(E) Efficacy of thioparib in the PDX model BR-05-0028 (BRCA1-deficient). Mice bearing BR-05-0028 tumors derived from a patient with breast cancer (n = 6) were treated with 10 or 30 mg/kg thioparib or 100 mg/kg olaparib for 6 weeks. Data are depicted as mean ± SEM. ***P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Concentration", "-", "dependent", "effects", "of", "thioparib", "on", "the", "viability", "of", "malignant", "hematologic", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "thioparib", "or", "other", "PARP", "inhibitors", "for", "72", "h", "and", "then", "subjected", "to", "CCK8", "assay", ".", "Data", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "of", "M", "-", "NSG", "mice", "transplanted", "with", "JeKo", "-", "1", "cells", "treated", "with", "10", "mg", "/", "kg", "thioparib", ",", "0", ".", "3", "mg", "/", "kg", "talazoparib", ",", "or", "vehicle", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ":", "P", "=", "0", ".", "3526", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Concentration-dependent effects of thioparib on the viability of malignant hematologic cells. Cells were treated with thioparib or other PARP inhibitors for 72 h and then subjected to CCK8 assay. Data from three independent experiments were presented as mean ± SEM.(D) Kaplan-Meier survival curve of M-NSG mice transplanted with JeKo-1 cells treated with 10 mg/kg thioparib, 0.3 mg/kg talazoparib, or vehicle (n = 10). Statistical analysis was performed by log-rank (Mantel-Cox) test. ***P < 0.0001, ns: P = 0.3526."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Western", "blotting", "of", "γH2AX", "and", "phosphor", "-", "RPA32", "in", "cells", "exposed", "to", "thioparib", ",", "talazoparib", ",", "or", "olaparib", "for", "12", "h", ".", "(", "E", ")", "and", "(", "F", ")", ".", "Thioparib", "caused", "changes", "in", "apoptosis", "-", "related", "proteins", "in", "JeKo", "-", "1", "or", "THP", "-", "1", "cells", ",", "as", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "thioparib", ",", "talazoparib", ",", "olaparib", ",", "or", "Cpd", "391", "for", "24", "h", "and", "then", "subjected", "to", "western", "blotting", ".", "(", "G", ")", "and", "(", "H", ")", ".", "Depletion", "of", "PARP1", "in", "HT", "-", "29", "and", "Capan", "-", "1", "/", "TP", "cells", "resulted", "in", "a", "decrease", "in", "DNA", "damage", "and", "thioparib", "resistance", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "the", "changes", "in", "γH2AX", "and", "phospho", "-", "RPA32", "in", "HT", "-", "29", "PARP1", "knockout", "(", "KO", ")", "clones", "(", "G", ")", "or", "Capan", "-", "1", "/", "TP", "PARP1", "KO", "clones", "(", "H", ")", "and", "their", "parental", "cells", "after", "exposure", "to", "thioparib", "for", "24", "h", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "IC50", "values", "of", "thioparib", "in", "these", "PARP1", "KO", "clones", "and", "parental", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "thioparib", "for", "5", "or", "7", "d", "and", "the", "IC50", "values", "were", "determined", "by", "SRB", "assay", "from", "three", "separate", "experiments", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "ThP", ":", "Thioparib", ",", "OP", ":", "Olaparib", ",", "TP", ":", "Talazoparib", ",", "391", ":", "Cpd", "391", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Western blotting of γH2AX and phosphor-RPA32 in cells exposed to thioparib, talazoparib, or olaparib for 12 h.(E) and (F). Thioparib caused changes in apoptosis-related proteins in JeKo-1 or THP-1 cells, as determined by western blotting. Cells were exposed to thioparib, talazoparib, olaparib, or Cpd 391 for 24 h and then subjected to western blotting.(G) and (H). Depletion of PARP1 in HT-29 and Capan-1/TP cells resulted in a decrease in DNA damage and thioparib resistance. The upper panel shows the changes in γH2AX and phospho-RPA32 in HT-29 PARP1 knockout (KO) clones (G) or Capan-1/TP PARP1 KO clones (H) and their parental cells after exposure to thioparib for 24 h. The lower panel shows the IC50 values of thioparib in these PARP1 KO clones and parental cells. Cells were treated with thioparib for 5 or 7 d and the IC50 values were determined by SRB assay from three separate experiments. Data are presented as the mean ± SD. ThP: Thioparib, OP: Olaparib, TP: Talazoparib, 391: Cpd 391."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HR", "repair", "assays", "in", "U2OS", "-", "DR", "-", "GFP", "cells", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "thioparib", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "drugs", "at", "the", "time", "of", "I", "-", "SceI", "introduction", "for", "48", "h", ".", "GFP", "-", "positive", "cells", "were", "analyzed", "after", "I", "-", "SceI", "transfection", "for", "72", "h", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "ATR", "inhibitor", "VE", "-", "821", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "and", "data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "and", "all", "groups", "were", "compared", "with", "control", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0205", ",", "0", ".", "0101", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "RAD51", "foci", "in", "U2OS", "-", "DR", "-", "GFP", "cells", "with", "or", "without", "radiation", ".", "Graphs", "(", "right", "panel", ")", "show", "quantification", "of", "cells", "with", "≥", "5", "RAD51", "foci", "in", "vehicle", "-", "and", "drug", "-", "treated", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "Data", "are", "obtained", "from", "three", "biological", "replicates", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Left", "to", "right", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "=", "0", ".", "0033", ",", "<", "0", ".", "0001", ",", "=", "0", ".", "0006", ",", "=", "0", ".", "0031", ",", "=", "0", ".", "0015", ".", "(", "H", ")", "HR", "repair", "assay", ".", "U2OS", "-", "DR", "-", "GFP", "(", "WT", ")", "and", "PARP1", "KO", "cells", "(", "KO1", "and", "KO2", ")", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "48", "h", "and", "collected", "after", "72", "h", "of", "I", "-", "SceI", "transfection", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "VE", "-", "821", "served", "as", "a", "positive", "control", ".", "PARP1", "knockout", "efficiency", "was", "evaluated", "by", "western", "blotting", ".", "Data", "from", "three", "biological", "replicates", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "and", "each", "group", "was", "compared", "with", "the", "control", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0143", ",", "0", ".", "0483", ",", "ns", ":", "P", "=", "0", ".", "3061", ",", "0", ".", "8269", ",", "0", ".", "9997", ",", "0", ".", "3906", "(", "from", "left", "to", "right", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HR repair assays in U2OS-DR-GFP cells treated with increasing concentrations of thioparib. Cells were incubated with the indicated drugs at the time of I-SceI introduction for 48 h. GFP-positive cells were analyzed after I-SceI transfection for 72 h by flow cytometry. The ATR inhibitor VE-821 was used as a positive control. Three independent experiments were performed and data are expressed as mean ± SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA, and all groups were compared with control. ***P < 0.0001, *P = 0.0205, 0.0101 (from left to right).(C) Representative images of RAD51 foci in U2OS-DR-GFP cells with or without radiation. Graphs (right panel) show quantification of cells with ≥ 5 RAD51 foci in vehicle- and drug-treated cells. Scale bar: 5 μm. Data are obtained from three biological replicates and presented as mean ± SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA. Left to right: P < 0.0001, = 0.0033, < 0.0001, = 0.0006, = 0.0031, = 0.0015.(H) HR repair assay. U2OS-DR-GFP (WT) and PARP1 KO cells (KO1 and KO2) were treated with the indicated drugs for 48 h and collected after 72 h of I-SceI transfection as in (A). VE-821 served as a positive control. PARP1 knockout efficiency was evaluated by western blotting. Data from three biological replicates are presented as mean ± SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA, and each group was compared with the control. ***P < 0.0001, *P = 0.0143, 0.0483, ns: P = 0.3061, 0.8269, 0.9997, 0.3906 (from left to right)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Effects", "of", "thioparib", "on", "CXCL9", ",", "CXCL10", ",", "and", "IL15", "mRNA", "in", "JeKo", "-", "1", "cells", ".", "Data", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Left", "panel", ":", "*", "P", "=", "0", ".", "0367", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", ";", "median", "panel", ":", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "<", "0", ".", "0001", ",", "<", "0", ".", "0001", ";", "right", "panel", ":", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0005", ",", "0", ".", "0009", ",", "0", ".", "0001", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "protein", "levels", "of", "p", "-", "STAT1", ",", "p", "-", "TBK1", ",", "γH2AX", ",", "and", "phospho", "-", "RPA32", "in", "HT", "-", "29", "parent", ",", "PARP1", "−", "/", "−", "(", "#", "KO1", ")", ",", "and", "PARP7", "−", "/", "−", "cell", "lines", "after", "24", "or", "48", "h", "thioparib", "treatment", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "p", "-", "STAT1", ",", "p", "-", "TBK1", ",", "and", "γH2AX", "in", "HT", "-", "29", "parent", ",", "STING", "−", "/", "−", ",", "and", "TBK1", "−", "/", "−", "cells", "after", "24", "or", "48", "h", "thioparib", "treatment", ".", "(", "H", ")", "Immunohistochemistry", "staining", "of", "CD4", ",", "CD8", ",", "and", "CD45", "expression", "in", "MC38", "tumor", "tissue", "sections", ".", "Quantification", "of", "cells", "positive", "of", "CD4", ",", "CD8", ",", "CD45", "were", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "Data", "from", "ten", "technical", "replicates", "from", "each", "of", "the", "two", "mice", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ":", "P", "=", "0", ".", "1958", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Effects of thioparib on CXCL9, CXCL10, and IL15 mRNA in JeKo-1 cells. Data from three independent experiments are shown as the mean ± SD. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. Left panel: *P = 0.0367, **P = 0.0011; median panel: ***P = 0.0002, < 0.0001, < 0.0001; right panel: ***P = 0.0005, 0.0009, 0.0001 (from left to right).(D) The protein levels of p-STAT1, p-TBK1, γH2AX, and phospho-RPA32 in HT-29 parent, PARP1−/− (#KO1), and PARP7−/− cell lines after 24 or 48 h thioparib treatment.(F) Western blot analysis of p-STAT1, p-TBK1, and γH2AX in HT-29 parent, STING−/−, and TBK1−/−cells after 24 or 48 h thioparib treatment.(H) Immunohistochemistry staining of CD4, CD8, and CD45 expression in MC38 tumor tissue sections. Quantification of cells positive of CD4, CD8, CD45 were shown. Scale bar: 25 μm. Data from ten technical replicates from each of the two mice are presented as mean ± SD. Statistical analysis was performed by unpaired t-test. ***P < 0.0001, ns: P = 0.1958."}
{"words": ["Figure", "1Western", "blot", "analysis", "of", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "(", "Red", "-", "and", "yellow", "rectangles", ",", "highlights", "CTF", "-", "35", "and", "CTF", "-", "25", "respectively", "in", "the", "insoluble", "fraction", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Western blot analysis of soluble and insoluble fractions (Red- and yellow rectangles, highlights CTF-35 and CTF-25 respectively in the insoluble fraction)."}
{"words": ["Figure", "2Immunofluorescent", "analysis", "showing", "fluorescence", "intensity", "of", "phosphorylated", "TDP", "-", "43", "(", "pTDP", "-", "43", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20µm", ".", "Presented", "immunofluorescent", "images", "of", "control", "(", "C2", ")", "and", "mutant", "TDP", "-", "43", "(", "P2", ")", ".", "I", "represents", "its", "corresponding", "profile", "intensity", "plot", "of", "the", "selected", "(", "square", ")", "region", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ",", "J", "quantification", "pooled", "control", "(", "C0", "=", "10", ",", "C1", "=", "10", "and", "C2", "=", "10", ")", "n", "=", "30", "and", "pooled", "mutant", "TDP", "-", "43", "(", "P1", "=", "10", ",", "P2", "=", "10", "and", "P3", "=", "10", ")", "n", "=", "30", "cells", "from", "each", "differentiation", ".", "Unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunofluorescent analysis showing fluorescence intensity of phosphorylated TDP-43 (pTDP-43). Scale bar: 20µm. Presented immunofluorescent images of control (C2) and mutant TDP-43 (P2). I represents its corresponding profile intensity plot of the selected (square) region. Scale bar: 10µm, J quantification pooled control (C0=10, C1=10 and C2=10) n=30 and pooled mutant TDP-43 (P1=10, P2=10 and P3=10) n=30 cells from each differentiation. Unpaired Mann-Whitney-test."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blots", "showing", "nucleo", "-", "cytoplasmic", "fractionation", "of", "WT", "-", "mCherry", "and", "MUT", "-", "mCherry", "iPSC", "-", "derived", "motor", "neurons", "with", "F", "(", "left", "panel", ")", "quantification", "of", "total", "mCherry", "and", "total", "untagged", "TDP", "-", "43", "on", "α", "-", "tubulin", "and", "(", "right", "panel", ")", "relative", "cytoplasmic", "mCherry", "and", "untagged", "TDP", "-", "43", "on", "total", "mCherry", "and", "total", "untagged", "TDP", "-", "43"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blots showing nucleo-cytoplasmic fractionation of WT-mCherry and MUT-mCherry iPSC-derived motor neurons with F (left panel) quantification of total mCherry and total untagged TDP-43 on α-tubulin and (right panel) relative cytoplasmic mCherry and untagged TDP-43 on total mCherry and total untagged TDP-43 respectively"}
{"words": ["Figure", "4Representative", "kymographs", "from", "control", "and", "mutant", "TDP", "-", "43", "iPSC", "-", "derived", "motor", "neurons", ".", "The", "x", "-", "axis", "represent", "distance", "in", "µm", "while", "on", "the", "y", "-", "axis", "time", "in", "seconds", "is", "revealed", ".", "Stationary", "mitochondria", "are", "visible", "as", "straight", "vertical", "lines", ",", "while", "moving", "mitochondria", "are", "depicted", "as", "skewed", "lines", ".", "B", "Quantification", "of", "percentage", "of", "moving", "mitochondria", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative kymographs from control and mutant TDP-43 iPSC-derived motor neurons. The x-axis represent distance in µm while on the y-axis time in seconds is revealed. Stationary mitochondria are visible as straight vertical lines, while moving mitochondria are depicted as skewed lines. B Quantification of percentage of moving mitochondria."}
{"words": ["Figure", "6Immunofluorescent", "analysis", "showing", "fluorescence", "intensity", "of", "pTDP", "-", "43", "in", "motor", "neurons", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", "and", "its", "perspective", "intensity", "plot", "in", "F", ".", "G", "Quantification", "of", "E", ",", "each", "dot", "represents", "one", "analysed", "cell", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", ".", "axonal", "transport", "analysis", ".", "Quantification", "of", "percentage", "of", "moving", "mitochondria", "(", "J", ")", ",", "number", "of", "moving", "mitochondria", "(", "K", ")", "and", "number", "of", "stationary", "mitochondria", "(", "L", ")", "normalized", "to", "neurite", "length", "100µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immunofluorescent analysis showing fluorescence intensity of pTDP-43 in motor neurons. Scale bar: 10µm and its perspective intensity plot in F. G Quantification of E, each dot represents one analysed cell, unpaired Mann-Whitney-test.axonal transport analysis. Quantification of percentage of moving mitochondria (J), number of moving mitochondria (K) and number of stationary mitochondria (L) normalized to neurite length 100µm."}
{"words": ["Figure", "7Total", "cell", "lysates", "were", "fractionated", "into", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "and", "analysed", "by", "Western", "blot", ",", "representative", "Western", "blots", "of", "soluble", "and", "insoluble", "fraction", "without", "C", "and", "with", "D", "HDAC6", "inhibitor", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Total cell lysates were fractionated into soluble and insoluble fractions and analysed by Western blot, representative Western blots of soluble and insoluble fraction without C and with D HDAC6 inhibitor treatment."}
{"words": ["Figure", "8Immunofluorescent", "analysis", "of", "TDP", "-", "43", "in", "control", ",", "mutant", "TDP", "-", "43", "and", "mutant", "TDP", "-", "43", "+", "HDAC6", "inhibitor", "after", "12", "h", "treatment", ".", "Presented", "immunofluorescent", "images", "of", "control", "(", "C2", ")", "and", "mutant", "TDP", "-", "43", "(", "P2", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "25µm", ".", "B", "Profile", "intensity", "plot", "of", "control", ",", "mutant", "TDP", "-", "43", "and", "mutant", "TDP", "-", "43", "+", "HDAC6", "inhibitor", ".", "C", "Quantification", "of", "nucleo", "-", "cytoplasmic", "ratio", "(", "N", "/", "C", ")", "fluorescent", "intensity", "of", "TDP", "-", "43", "in", "motor", "neurons", ",", "each", "dot", "represents", "one", "analyzed", "cell", ",", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Immunofluorescent analysis of TDP-43 in control, mutant TDP-43 and mutant TDP-43+HDAC6 inhibitor after 12 h treatment. Presented immunofluorescent images of control (C2) and mutant TDP-43 (P2). Scale bar: 25µm. B Profile intensity plot of control, mutant TDP-43 and mutant TDP-43+HDAC6 inhibitor. C Quantification of nucleo-cytoplasmic ratio (N/C) fluorescent intensity of TDP-43 in motor neurons, each dot represents one analyzed cell, unpaired Mann-Whitney-test."}
{"words": ["Figure", "9Quantification", "of", "relative", "nuclear", "mCherry", "TDP", "-", "43", "on", "total", "fraction", ",", "ratio", "paired", "-", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Quantification of relative nuclear mCherry TDP-43 on total fraction, ratio paired-t-test."}
{"words": ["Figure", "10Quantification", "of", "percentage", "of", "moving", "mitochondria", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10Quantification of percentage of moving mitochondria,"}
{"words": ["Figure", "1P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "30", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "40", ")", "infected", "individuals", ",", "as", "well", "as", "light", "-", "microscopy", "and", "PCR", "parasite", "-", "negative", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "31", ")", "were", "recruited", "for", "the", "study", ".", "A", "-", "F", ".", "Clinical", "parameters", "determined", "in", "the", "study", "include", "age", "(", "A", ")", ",", "gender", "(", "B", ")", ",", "parasitemia", "(", "C", ")", ",", "hemoglobin", "(", "g", "/", "dL", "blood", ")", "(", "D", ")", ",", "hematocrit", "(", "E", ")", ",", "and", "platelet", "count", "(", "F", ")", ".", "Boxes", "represent", "the", "25th", "to", "75th", "percentiles", ",", "whiskers", "show", "the", "range", "(", "minimum", "to", "maximum", ")", ",", "and", "lines", "represent", "the", "median", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "the", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", ",", "the", "Chi", "-", "square", "test", "(", "B", ")", ",", "and", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "C", ")", "using", "30", "(", "symptomatic", ")", ",", "40", "(", "asymptomatic", ")", "and", "31", "(", "healthy", "immune", "controls", ")", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "30", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "40", ")", "infected", "individuals", ",", "as", "well", "as", "light", "-", "microscopy", "and", "PCR", "parasite", "-", "negative", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "31", ")", "were", "recruited", "for", "the", "study", ".", "G", ".", "Antibody", "titers", "specific", "for", "P", ".", "falciparum", "parasite", "lysate", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "using", "29", "(", "symptomatic", ")", ",", "35", "(", "asymptomatic", ")", "and", "26", "(", "healthy", "immune", "controls", ")", "biological", "replicates", ".", "The", "dotted", "line", "depicts", "the", "average", "antibody", "background", "levels", "of", "malaria", "-", "naive", "healthy", "Melbourne", "controls", ".", "H", ".", "Mean", "antibody", "titers", "as", "determined", "by", "ELISA", "to", "the", "P", ".", "falciparum", "recombinant", "proteins", "EBA", "-", "175", ",", "EBA", "-", "140", ",", "PfRh2", ",", "PfRh4", ",", "PfRh5", ",", "and", "PfRipr", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1P. falciparum symptomatic (n=30) and asymptomatic (n=40) infected individuals, as well as light-microscopy and PCR parasite-negative healthy immune controls (n=31) were recruited for the study. A-F. Clinical parameters determined in the study include age (A), gender (B), parasitemia (C), hemoglobin (g/dL blood) (D), hematocrit (E), and platelet count (F). Boxes represent the 25th to 75th percentiles, whiskers show the range (minimum to maximum), and lines represent the median. Significance was determined by the Kruskal-Wallis test with Dunn's multiple comparisons (A, D-F), the Chi-square test (B), and the Mann-Whitney test (C) using 30 (symptomatic), 40 (asymptomatic) and 31 (healthy immune controls) biological replicates. ****p<0.0001.P. falciparum symptomatic (n=30) and asymptomatic (n=40) infected individuals, as well as light-microscopy and PCR parasite-negative healthy immune controls (n=31) were recruited for the study. G. Antibody titers specific for P. falciparum parasite lysate. Bars represent the mean ± SD of using 29 (symptomatic), 35 (asymptomatic) and 26 (healthy immune controls) biological replicates. The dotted line depicts the average antibody background levels of malaria-naive healthy Melbourne controls. H. Mean antibody titers as determined by ELISA to the P. falciparum recombinant proteins EBA-175, EBA-140, PfRh2, PfRh4, PfRh5, and PfRipr."}
{"words": ["Figure", "2PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "24", ")", "infected", "individuals", "as", "well", "as", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "24", ")", "were", "stained", "with", "a", "panel", "of", "metal", "-", "labelled", "antibodies", "and", "analysed", "by", "CyTOF", ".", "tSNE", "analysis", "was", "performed", "and", "FlowSOM", "clustering", "was", "used", "to", "identify", "individual", "cell", "sub", "-", "populations", "within", "gated", ":", "A", ".", "TH1", "-", "like", "memory", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "CD19", "-", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD45RA", "-", "CCR6", "-", "CXCR3", "+", ")", "B", ".", "TH2", "-", "like", "memory", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "CD19", "-", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD45RA", "-", "CCR6", "-", "CXCR3", "-", ")", "C", ".", "Circulating", "memory", "TFH", "cells", "(", "CD19", "-", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD45RA", "-", "CXCR5", "+", ")", "D", ".", "Classical", "MBCs", "(", "CD3", "-", "CD19", "+", "CD20", "+", "CD10", "-", "CD27", "+", "CD21", "+", ")", "E", ".", "Atypical", "MBCs", "(", "CD3", "-", "CD19", "+", "CD20", "+", "CD10", "-", "CD27", "-", "CD21", "-", ")", "F", ".", "Activated", "MBCs", "(", "CD3", "-", "CD19", "+", "CD20", "+", "CD10", "-", "CD27", "+", "CD21", "-", ")", "The", "tSNE", "plots", "in", "the", "top", "panel", "display", "cell", "density", "and", "represent", "the", "pooled", "data", "for", "each", "group", ",", "while", "the", "lower", "panel", "shows", "a", "projection", "of", "the", "FlowSOM", "clusters", "on", "a", "tSNE", "plot", ".", "Heatmaps", "show", "the", "median", "marker", "expression", "for", "each", "FlowSOM", "cluster", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2PBMCs from P. falciparum symptomatic (n=16) and asymptomatic (n=24) infected individuals as well as healthy immune controls (n=24) were stained with a panel of metal-labelled antibodies and analysed by CyTOF. tSNE analysis was performed and FlowSOM clustering was used to identify individual cell sub-populations within gated: A. TH1-like memory CD4+ T cells (CD19-CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CXCR3+) B. TH2-like memory CD4+ T cells (CD19-CD3+CD4+CD45RA-CCR6-CXCR3-) C. Circulating memory TFH cells (CD19-CD3+CD4+CD45RA-CXCR5+) D. Classical MBCs (CD3-CD19+CD20+CD10-CD27+CD21+) E. Atypical MBCs (CD3-CD19+CD20+CD10-CD27-CD21-) F. Activated MBCs (CD3-CD19+CD20+CD10-CD27+CD21-) The tSNE plots in the top panel display cell density and represent the pooled data for each group, while the lower panel shows a projection of the FlowSOM clusters on a tSNE plot. Heatmaps show the median marker expression for each FlowSOM cluster."}
{"words": ["Figure", "3Unsupervised", "identification", "of", "differentially", "abundant", "high", "-", "dimensional", "cell", "populations", "between", "clinical", "groups", "was", "performed", "using", "CITRUS", "(", "FDR", "<", "5", "%", ")", ".", "between", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "infected", "individuals", "and", "asymptomatic", "participants", "or", "healthy", "immune", "controls", ".", "A", "-", "E", ".", "tSNE", "plots", "of", "clinical", "groups", "and", "viSNE", "plots", "depicting", "expression", "of", "selected", "surface", "markers", ",", "relative", "abundance", "and", "cellular", "phenotype", "of", "differentially", "abundant", "clusters", "identified", "among", "CXCR3", "+", "CCR6", "-", "memory", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "A", ")", ",", "CXCR3", "-", "CCR6", "-", "memory", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "B", ")", ",", "circulating", "memory", "TFH", "cells", "(", "C", ")", ",", "classical", "MBCs", "(", "D", ")", ",", "and", "atypical", "MBCs", "(", "E", ")", ".", "The", "tSNE", "plots", "in", "the", "top", "or", "each", "panel", "display", "cell", "density", "and", "represent", "pooled", "data", "for", "each", "group", "as", "calculated", "in", "the", "clustering", "analysis", "while", "the", "viSNE", "plots", "on", "each", "top", "panel", "depict", "relevant", "marker", "expression", "on", "tSNE", "overlays", ".", "The", "lower", "panels", "from", "left", "to", "right", "show", "differentially", "abundant", "populations", "identified", "in", "purple", "on", "a", "tSNE", "overlay", ",", "whiskers", "showing", "the", "range", "(", "minimum", "to", "maximum", ")", ",", "with", "lines", "representing", "the", "median", "of", "16", "(", "symptomatic", ")", ",", "24", "(", "asymptomatic", ")", "and", "24", "(", "healthy", "immune", "controls", ")", "biological", "replicates", ",", "while", "the", "pink", "histograms", "illustrate", "marker", "expression", "in", "identified", "differentially", "abundant", "populations", ",", "relative", "to", "background", "expression", ",", "shown", "in", "lilac", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Unsupervised identification of differentially abundant high-dimensional cell populations between clinical groups was performed using CITRUS (FDR<5%). between P. falciparum symptomatic infected individuals and asymptomatic participants or healthy immune controls. A-E. tSNE plots of clinical groups and viSNE plots depicting expression of selected surface markers, relative abundance and cellular phenotype of differentially abundant clusters identified among CXCR3+CCR6- memory CD4+ T cells (A), CXCR3-CCR6- memory CD4+ T cells (B), circulating memory TFH cells (C), classical MBCs (D), and atypical MBCs (E). The tSNE plots in the top or each panel display cell density and represent pooled data for each group as calculated in the clustering analysis while the viSNE plots on each top panel depict relevant marker expression on tSNE overlays. The lower panels from left to right show differentially abundant populations identified in purple on a tSNE overlay, whiskers showing the range (minimum to maximum), with lines representing the median of 16 (symptomatic), 24 (asymptomatic) and 24 (healthy immune controls) biological replicates, while the pink histograms illustrate marker expression in identified differentially abundant populations, relative to background expression, shown in lilac."}
{"words": ["Figure", "4PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "5", ")", "infected", "individuals", "as", "well", "as", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "selected", "for", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "A", ".", "Estimated", "proportions", "of", "PBMC", "sub", "-", "populations", "determined", "from", "cell", "-", "type", "deconvolution", "from", "study", "participant", "transcriptional", "profiles", ".", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "5", ")", "infected", "individuals", "as", "well", "as", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "selected", "for", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "D", ".", "Blood", "transcriptional", "module", "(", "BTM", ")", "analysis", "showing", "significant", "BTMs", "differentially", "enriched", "for", "pairwise", "comparisons", "(", "FDR", "<", "15", "%", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4PBMCs from P. falciparum symptomatic (n=6) and asymptomatic (n=5) infected individuals as well as healthy immune controls (n=6) were selected for RNA-seq analysis. A. Estimated proportions of PBMC sub-populations determined from cell-type deconvolution from study participant transcriptional profiles.PBMCs from P. falciparum symptomatic (n=6) and asymptomatic (n=5) infected individuals as well as healthy immune controls (n=6) were selected for RNA-seq analysis. D. Blood transcriptional module (BTM) analysis showing significant BTMs differentially enriched for pairwise comparisons (FDR<15%)."}
{"words": ["Figure", "5Gene", "expression", "profiles", "of", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "healthy", "immune", "controls", "were", "compared", ".", "A", ".", "Unsupervised", "hierarchical", "clustering", "heat", "map", "of", "the", "922", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "between", "symptomatic", "P", ".", "falciparum", "malaria", "and", "healthy", "immune", "controls", "using", "the", "complete", "method", "and", "Euclidian", "measure", "of", "distance", ".", "B", ".", "Mean", "-", "difference", "plot", "displaying", "genes", "differentially", "expressed", "between", "symptomatic", "P", ".", "falciparum", "malaria", "and", "healthy", "immune", "controls", ".", "Each", "gene", "is", "plotted", "as", "a", "single", "point", "determined", "by", "log", "-", "fold", "-", "change", "and", "average", "transcript", "abundance", ".", "Red", "genes", "are", "overrepresented", ",", "and", "blue", "genes", "are", "underrepresented", "in", "symptomatic", "malaria", ".", "Gene", "expression", "profiles", "of", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "healthy", "immune", "controls", "were", "compared", ".", "F", ".", "Upstream", "regulator", "analysis", "of", "the", "922", "DEGs", "between", "symptomatic", "P", ".", "falciparum", "malaria", "and", "healthy", "immune", "controls", ".", "The", "red", "lines", "represent", "a", "significant", "activation", "z", "-", "score", "of", "±", "2", ".", "Gene", "expression", "profiles", "of", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "healthy", "immune", "controls", "were", "compared", ".", "Hierarchical", "clustering", "heatmap", "(", "G", ")", "displaying", "DEGs", "in", "symptomatic", "P", ".", "falciparum", "malaria", "and", "healthy", "immune", "controls", "predicted", "to", "be", "controlled", "by", "IFN", "-", "γ", "and", "IL", "-", "13", "upstream", "regulators", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Gene expression profiles of PBMCs from P. falciparum symptomatic and healthy immune controls were compared. A. Unsupervised hierarchical clustering heat map of the 922 differentially expressed genes (DEGs) between symptomatic P. falciparum malaria and healthy immune controls using the complete method and Euclidian measure of distance. B. Mean-difference plot displaying genes differentially expressed between symptomatic P. falciparum malaria and healthy immune controls. Each gene is plotted as a single point determined by log-fold-change and average transcript abundance. Red genes are overrepresented, and blue genes are underrepresented in symptomatic malaria.Gene expression profiles of PBMCs from P. falciparum symptomatic and healthy immune controls were compared. F. Upstream regulator analysis of the 922 DEGs between symptomatic P. falciparum malaria and healthy immune controls. The red lines represent a significant activation z-score of ±2.Gene expression profiles of PBMCs from P. falciparum symptomatic and healthy immune controls were compared. Hierarchical clustering heatmap (G) displaying DEGs in symptomatic P. falciparum malaria and healthy immune controls predicted to be controlled by IFN-γ and IL-13 upstream regulators."}
{"words": ["Figure", "6Gene", "expression", "profiles", "of", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "asymptomatic", "infected", "participants", "were", "compared", ".", "C", ".", "Heat", "map", "of", "the", "418", "DEGs", "in", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "asymptomatic", "infected", "participants", "as", "well", "as", "in", "healthy", "immune", "controls", ".", "E", ".", "Volcano", "plot", "displaying", "selected", "genes", "clusters", "1", "and", "2", "from", "heatmap", "in", "C", "scaled", "by", "Log2", "-", "fold", "-", "change", "and", "-", "Log10", "(", "P", "-", "value", ")", "differentially", "expressed", "between", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "asymptomatic", "infected", "individuals", ".", "Genes", "in", "red", "are", "overrepresented", "in", "symptomatic", "malaria", "and", "genes", "in", "blue", "are", "overrepresented", "in", "asymptomatic", "malaria", ".", "Gene", "expression", "profiles", "of", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "and", "asymptomatic", "infected", "participants", "were", "compared", ".", "F", ".", "Mean", "RPKMs", "+", "SEM", "of", "selected", "genes", "in", "P", ".", "falciparum", "malaria", "symptomatic", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "5", ")", "individuals", ".", "Dotted", "red", "lines", "depict", "transcriptional", "levels", "of", "healthy", "immune", "controls", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "of", "biological", "replicates", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Gene expression profiles of PBMCs from P. falciparum symptomatic and asymptomatic infected participants were compared. C. Heat map of the 418 DEGs in P. falciparum symptomatic and asymptomatic infected participants as well as in healthy immune controls. E. Volcano plot displaying selected genes clusters 1 and 2 from heatmap in C scaled by Log2-fold-change and -Log10(P-value) differentially expressed between P. falciparum symptomatic and asymptomatic infected individuals. Genes in red are overrepresented in symptomatic malaria and genes in blue are overrepresented in asymptomatic malaria.Gene expression profiles of PBMCs from P. falciparum symptomatic and asymptomatic infected participants were compared. F. Mean RPKMs + SEM of selected genes in P. falciparum malaria symptomatic (n=6) and asymptomatic (n=5) individuals. Dotted red lines depict transcriptional levels of healthy immune controls, Mann-Whitney test of biological replicates,*p<0.05."}
{"words": ["Figure", "7Gene", "expression", "profiles", "of", "bulk", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "-", "infected", "asymptomatic", "individuals", "and", "healthy", "immune", "controls", "were", "compared", ".", "A", ".", "Hierarchical", "clustering", "heat", "map", "of", "the", "171", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "in", "P", ".", "falciparum", "asymptomatic", "and", "healthy", "immune", "control", "participants", ".", "C", ".", "Mean", "-", "difference", "plot", "displaying", "DEGs", "between", "asyptomatic", "P", ".", "falciparum", "malaria", "and", "healthy", "immune", "controls", ".", "Each", "gene", "is", "plotted", "as", "a", "single", "point", "determined", "by", "log", "-", "fold", "-", "change", "and", "average", "transcript", "abundance", ".", "Red", "genes", "are", "overrepresented", ",", "and", "blue", "genes", "are", "underrepresented", "in", "asymptomatic", "malaria", ".", "Gene", "expression", "profiles", "of", "bulk", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "-", "infected", "asymptomatic", "individuals", "and", "healthy", "immune", "controls", "were", "compared", ".", "E", ".", "Mean", "RPKMs", "+", "SEM", "of", "selected", "genes", "in", "P", ".", "falciparum", "malaria", "asymptomatic", "individuals", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Dotted", "red", "lines", "depict", "transcriptional", "levels", "of", "P", ".", "falciparum", "-", "infected", "symptomatic", "individuals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "of", "biological", "replicates", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Gene expression profiles of bulk PBMCs from P. falciparum-infected asymptomatic individuals and healthy immune controls were compared. A. Hierarchical clustering heat map of the 171 differentially expressed genes (DEGs) in P. falciparum asymptomatic and healthy immune control participants. C. Mean-difference plot displaying DEGs between asyptomatic P. falciparum malaria and healthy immune controls. Each gene is plotted as a single point determined by log-fold-change and average transcript abundance. Red genes are overrepresented, and blue genes are underrepresented in asymptomatic malaria.Gene expression profiles of bulk PBMCs from P. falciparum-infected asymptomatic individuals and healthy immune controls were compared. E. Mean RPKMs + SEM of selected genes in P. falciparum malaria asymptomatic individuals (n=5) and healthy immune controls (n=6). Dotted red lines depict transcriptional levels of P. falciparum-infected symptomatic individuals, Mann-Whitney test of biological replicates, *p<0.05."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Volcano", "plot", "showing", "genes", "upregulated", "in", "symptomatic", "individuals", "that", "were", "significantly", "correlated", "with", "IgM", "+", "activated", "MBCs", ".", "B", ".", "Volcano", "plot", "showing", "genes", "upregulated", "in", "symptomatic", "individuals", "that", "were", "significantly", "correlated", "with", "T", "-", "bet", "+", "CD4", "+", "T", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Volcano plot showing genes upregulated in symptomatic individuals that were significantly correlated with IgM+ activated MBCs. B. Volcano plot showing genes upregulated in symptomatic individuals that were significantly correlated with T-bet+ CD4+ T cells."}
{"words": ["Figure", "9B", "-", "G", ".", "PBMCs", "from", "P", ".", "falciparum", "symptomatic", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "asymptomatic", "(", "n", "=", "6", ")", "infected", "individuals", "as", "well", "as", "healthy", "immune", "controls", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "stained", "with", "a", "panel", "of", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "tSNE", "plots", "(", "B", ")", "display", "cell", "density", "of", "the", "pooled", "data", "for", "each", "group", ",", "(", "C", ")", "shows", "a", "projection", "of", "the", "FlowSOM", "clusters", "on", "a", "tSNE", "plot", ",", "and", "(", "D", ")", "is", "a", "heatmap", "depicting", "the", "celluar", "phenotype", "of", "clusters", "of", "CTLA", "-", "4", "+", "CD3", "+", "CD19", "-", "cells", ".", "Bar", "plots", "representing", "mean", "relative", "abundance", "of", "biological", "replicates", "+", "SEM", "of", "relevant", "clusters", "among", "clinical", "groups", "(", "E", ")", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "panel", "on", "the", "left", "shows", "the", "average", "CTLA", "-", "4", "mean", "fluorescent", "intensity", "(", "MFI", ")", "or", "6", "biological", "replicates", "in", "cluster", "4", "+", "SEM", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "while", "representative", "histograms", "of", "CTLA", "-", "4", "expression", "in", "cluster", "4", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "F", ")", ".", "Marker", "intensity", "within", "clusters", "1", "and", "6", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9B-G. PBMCs from P. falciparum symptomatic (n=6) and asymptomatic (n=6) infected individuals as well as healthy immune controls (n=6) were stained with a panel of antibodies and analyzed by flow cytometry. tSNE plots (B) display cell density of the pooled data for each group, (C) shows a projection of the FlowSOM clusters on a tSNE plot, and (D) is a heatmap depicting the celluar phenotype of clusters of CTLA-4+CD3+CD19- cells. Bar plots representing mean relative abundance of biological replicates + SEM of relevant clusters among clinical groups (E), Mann-Whitney test, *p<0.05. The panel on the left shows the average CTLA-4 mean fluorescent intensity (MFI) or 6 biological replicates in cluster 4 + SEM, Mann-Whitney test, **p<0.01, while representative histograms of CTLA-4 expression in cluster 4 are shown on the right (F). Marker intensity within clusters 1 and 6 (G)."}
{"words": ["Figure", "1Human", "Aβ", "exhibits", "a", "biphasic", "profile", "in", "CSF", "of", "APP", "transgenic", "miceA", ",", "B", "Aβ40", "and", "Aβ42", "concentrations", "in", "CSF", "of", "male", "APP23", "mice", "(", "heterozygous", ";", "3", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "6", "(", "n", "=", "12", ")", ",", "8", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "12", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "19", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "and", "25", "(", "n", "=", "6", ")", "months", "of", "age", ")", ".", "CSF", "Aβ40", "(", "F", "(", "1", ",", "56", ")", "=", "22", ".", "351", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "as", "well", "as", "CSFAβ42", "(", "F", "(", "1", ",", "56", ")", "=", "38", ".", "597", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "followed", "a", "significant", "quadratic", "trend", ".", "C", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "in", "CSF", "of", "APP23", "mice", "showed", "a", "delayed", "decrease", "with", "age", "(", "F", "(", "1", ",", "56", ")", "=", "53", ".", "894", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", ",", "E", "Aβ40", "and", "Aβ42", "concentrations", "in", "CSF", "of", "male", "and", "female", "APP24", "mice", "(", "homozygous", ";", "2", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "3", "-", "4", "(", "n", "=", "16", ")", ",", "7", "-", "8", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "18", "-", "19", "(", "n", "=", "14", ")", ",", "24", "(", "n", "=", "16", ")", ",", "and", "30", "(", "n", "=", "18", ")", "months", "of", "age", ")", ".", "CSF", "Aβ40", "followed", "a", "significant", "quadratic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "86", ")", "=", "6", ".", "678", ",", "P", "=", "0", ".", "011", ")", "and", "CSF", "Aβ42", "best", "fitted", "a", "cubic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "86", ")", "=", "30", ".", "599", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "F", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "in", "CSF", "of", "APP24", "mice", "showed", "a", "delayed", "decrease", "with", "age", "(", "F", "(", "1", ",", "86", ")", "=", "64", ".", "936", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "G", ",", "H", "Aβ40", "and", "Aβ42", "in", "the", "CSF", "of", "female", "APP51", "mice", "(", "heterozygous", ";", "3", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "15", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "and", "24", "(", "n", "=", "8", ")", "months", "of", "age", ";", "22", "mice", "in", "total", ")", ".", "CSF", "Aβ40", "(", "F", "(", "1", ",", "19", ")", "=", "37", ".", "349", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "as", "well", "as", "CSFAβ42", "(", "F", "(", "1", ",", "19", ")", "=", "107", ".", "670", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "followed", "a", "significant", "quadratic", "trend", ".", "I", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "in", "CSF", "of", "APP51", "mice", "showed", "a", "delayed", "decrease", "with", "age", "(", "F", "(", "1", ",", "19", ")", "=", "26", ".", "367", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Human Aβ exhibits a biphasic profile in CSF of APP transgenic miceA, B Aβ40 and Aβ42 concentrations in CSF of male APP23 mice (heterozygous; 3 (n = 14), 6 (n = 12), 8 (n = 10), 12 (n = 11), 19 (n = 9), and 25 (n = 6) months of age). CSF Aβ40 (F(1, 56) = 22.351, P < 0.001) as well as CSFAβ42 (F(1, 56) = 38.597, P < 0.001) followed a significant quadratic trend.C Aβ42/40 ratio in CSF of APP23 mice showed a delayed decrease with age (F(1, 56) = 53.894, P < 0.001).D, E Aβ40 and Aβ42 concentrations in CSF of male and female APP24 mice (homozygous; 2 (n = 13), 3-4 (n = 16), 7-8 (n = 15), 18-19 (n = 14), 24 (n = 16), and 30 (n = 18) months of age). CSF Aβ40 followed a significant quadratic trend (F(1, 86) = 6.678, P = 0.011) and CSF Aβ42 best fitted a cubic trend (F(1, 86) = 30.599, P < 0.001).F Aβ42/40 ratio in CSF of APP24 mice showed a delayed decrease with age (F(1, 86) = 64.936, P < 0.001).G, H Aβ40 and Aβ42 in the CSF of female APP51 mice (heterozygous; 3 (n = 6), 15 (n = 8), and 24 (n = 8) months of age; 22 mice in total). CSF Aβ40 (F(1, 19) = 37.349, P < 0.001) as well as CSFAβ42 (F(1, 19) = 107.670, P < 0.001) followed a significant quadratic trend.I Aβ42/40 ratio in CSF of APP51 mice showed a delayed decrease with age (F(1, 19) = 26.367, P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "2HumanAβ", "in", "CSF", "and", "brain", "of", "APP", "transgenic", "miceA", "APP23CSFAβ40", "and", "Aβ42", "in", "the", "same", "animals", "as", "shown", "in", "Fig1", ".", "CSFAβ42", "and", "Aβ40", "are", "expressed", "as", "percentages", "of", "levels", "measured", "in", "the", "youngest", "age", "group", ".", "B", ",", "C", "Aβ40", "and", "Aβ42", "(", "pmol", "/", "g", "wet", "brain", ")", "in", "the", "FA", "-", "soluble", "brain", "extract", "from", "the", "same", "APP23mice", "showed", "a", "robust", "increase", "with", "age", ";", "ANOVA", "revealed", "a", "significant", "cubic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "56", ")", "=", "221", ".", "114", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "F", "(", "1", ",", "56", ")", "=", "370", ".", "947", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ")", ".", "D", "APP24", "CSF", "Aβ40", "and", "Aβ42", "in", "the", "same", "animals", "shown", "in", "Fig1", "as", "percentage", "of", "the", "youngest", "age", "group", ".", "E", ",", "F", "Aβ40", "and", "Aβ42", "(", "pmol", "/", "g", "wet", "brain", ")", "in", "the", "brain", "from", "the", "same", "APP24mice", "also", "showed", "a", "robust", "increase", "with", "age", ";", "ANOVA", "revealed", "a", "significant", "cubic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "86", ")", "=", "202", ".", "173", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "F", "(", "1", ",", "86", ")", "=", "139", ".", "941", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ")", ".", "G", "APP51", "CSF", "Aβ40", "and", "Aβ42", "in", "the", "same", "animals", "shown", "in", "Fig1", "as", "percentages", "of", "levels", "in", "the", "youngest", "age", "group", ".", "H", ",", "I", "Aβ40", "and", "Aβ42", "(", "pmol", "/", "g", "wet", "brain", ")", "in", "the", "brain", "from", "the", "same", "APP51", "mice", "showed", "a", "robust", "increase", "with", "age", ";", "ANOVA", "revealed", "a", "significant", "quadratic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "19", ")", "=", "12", ".", "960", ",", "P", "=", "0", ".", "002", "and", "F", "(", "1", ",", "19", ")", "=", "19", ".", "366", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HumanAβ in CSF and brain of APP transgenic miceA APP23CSFAβ40 and Aβ42 in the same animals as shown in Fig1. CSFAβ42 and Aβ40 are expressed as percentages of levels measured in the youngest age group.B, C Aβ40 and Aβ42 (pmol/g wet brain) in the FA-soluble brain extract from the same APP23mice showed a robust increase with age; ANOVA revealed a significant cubic trend (F(1, 56) = 221.114, P < 0.001 and F(1, 56) = 370.947, P < 0.001, respectively).D APP24 CSF Aβ40 and Aβ42 in the same animals shown in Fig1 as percentage of the youngest age group.E, F Aβ40 and Aβ42 (pmol/g wet brain) in the brain from the same APP24mice also showed a robust increase with age; ANOVA revealed a significant cubic trend (F(1, 86) = 202.173, P < 0.001 and F(1, 86) = 139.941, P < 0.001, respectively).G APP51 CSF Aβ40 and Aβ42 in the same animals shown in Fig1 as percentages of levels in the youngest age group.H, I Aβ40 and Aβ42 (pmol/g wet brain) in the brain from the same APP51 mice showed a robust increase with age; ANOVA revealed a significant quadratic trend (F(1, 19) = 12.960, P = 0.002 and F(1, 19) = 19.366, P < 0.001, respectively)."}
{"words": ["Figure", "3Aβplaque", "pathology", "in", "the", "brains", "of", "APP23miceAβimmunostaining", "(", "CN3", "antibody", ",", "dark", "blue", ")", "in", "25", "-", "μm", "sagittal", "brain", "sections", "shows", "only", "sparse", "Aβ", "deposits", "primarily", "in", "the", "frontal", "cortex", "of", "6", "-", "to", "8", "-", "month", "-", "old", "APP23mice", ".", "At", "12", "months", "and", "thereafter", ",", "there", "is", "a", "progressive", "increase", "in", "plaque", "number", "and", "size", "and", "a", "progressive", "involvement", "of", "different", "brain", "regions", ".", "Insets", "highlight", "the", "plaque", "characteristics", "at", "the", "different", "ages", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "The", "mean", "number", "of", "Aβ", "plaques", "per", "section", "per", "hemibrain", "increased", "with", "age", "in", "3", "-", "to", "12", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "Only", "four", "mice", "were", "analyzed", "in", "the", "3", "-", "month", "-", "old", "age", "group", ",", "as", "APP23mice", "do", "not", "develop", "plaques", "at", "this", "age", "(", "Sturchler", "-", "Pierrat", "et", "al", ",", "1997", ")", ".", "The", "6", "-", ",", "8", "-", ",", "and", "12", "-", "month", "-", "old", "age", "groups", "included", "12", ",", "10", ",", "and", "11", "mice", ",", "respectively", "(", "these", "are", "the", "same", "mice", "that", "were", "used", "for", "CSF", "and", "brainAβ", "measurements", ")", ".", "Note", "that", "the", "Aβ", "plaques", "became", "too", "numerous", "and", "often", "could", "no", "longer", "be", "individually", "distinguished", "in", "the", "age", "groups", ">", "12", "months", "of", "age", ".", "Data", "are", "represented", "as", "group", "means", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Aβplaque pathology in the brains of APP23miceAβimmunostaining (CN3 antibody, dark blue) in 25-μm sagittal brain sections shows only sparse Aβ deposits primarily in the frontal cortex of 6- to 8-month-old APP23mice. At 12 months and thereafter, there is a progressive increase in plaque number and size and a progressive involvement of different brain regions. Insets highlight the plaque characteristics at the different ages. Scale bar, 100 μm.The mean number of Aβ plaques per section per hemibrain increased with age in 3- to 12-month-old mice. Only four mice were analyzed in the 3-month-old age group, as APP23mice do not develop plaques at this age (Sturchler-Pierrat et al, 1997). The 6-, 8-, and 12-month-old age groups included 12, 10, and 11 mice, respectively (these are the same mice that were used for CSF and brainAβ measurements). Note that the Aβ plaques became too numerous and often could no longer be individually distinguished in the age groups > 12 months of age. Data are represented as group means ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4Brain", "sAPPβ", "shows", "an", "age", "-", "related", "increase", "in", "APP23", ",", "APP24", ",", "and", "APP51", "micesAPPβ", "was", "measured", "in", "Triton", "X", "-", "100", "brain", "extracts", "from", "largely", "the", "same", "mice", "as", "analyzed", "in", "Figs1", "and2", "and", "is", "expressed", "as", "percentages", "of", "levels", "measured", "in", "the", "youngest", "age", "group", ".", "Swedish", "sAPPβ", "showed", "an", "age", "-", "dependent", "increase", "in", "APP23", "mice", "following", "a", "linear", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "83", ")", "=", "52", ".", "914", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ";", "APP23", "from", "two", "independent", "batches", "were", "included", "in", "this", "analysis", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", "and", "Supplementary", "Fig", "S2", "for", "details", ")", ".", "Swedish", "sAPPβ", "showed", "an", "age", "-", "dependent", "increase", "in", "APP24mice", "following", "a", "linear", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "84", ")", "=", "11", ".", "264", ",", "P", "=", "0", ".", "001", ")", ".", "Human", "wild", "-", "type", "sAPPβ", "showed", "an", "age", "-", "dependent", "increase", "in", "APP51", "following", "a", "quadratic", "trend", "(", "F", "(", "1", ",", "18", ")", "=", "68", ".", "980", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Data", "information", ":", "Post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "test", "group", "comparisons", "were", "always", "conducted", "between", "the", "youngest", "group", "and", "all", "other", "groups", ".", "All", "data", "are", "represented", "as", "group", "means", "±", "SEM", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "For", "absolute", "values", ",", "see", "Supplementary", "Fig", "S2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Brain sAPPβ shows an age-related increase in APP23, APP24, and APP51 micesAPPβ was measured in Triton X-100 brain extracts from largely the same mice as analyzed in Figs1 and2 and is expressed as percentages of levels measured in the youngest age group.Swedish sAPPβ showed an age-dependent increase in APP23 mice following a linear trend (F(1, 83) = 52.914, P < 0.001); APP23 from two independent batches were included in this analysis (see Materials and Methods and Supplementary Fig S2 for details).Swedish sAPPβ showed an age-dependent increase in APP24mice following a linear trend (F(1, 84) = 11.264, P = 0.001).Human wild-type sAPPβ showed an age-dependent increase in APP51 following a quadratic trend (F(1, 18) = 68.980, P < 0.001).Data information: Post hoc Dunnett's test group comparisons were always conducted between the youngest group and all other groups. All data are represented as group means ± SEM; *P < 0.05; **P < 0.01; and ***P < 0.001. For absolute values, see Supplementary Fig S2."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "embryos", "that", "expressing", "the", "ZGA", "reporter", "(", "MERVL", ":", ":", "tdTomato", ")", "after", "injection", "with", "a", "siRNA", "-", "repressor", "or", "mRNA", "-", "inducer", ".", "N", ",", "the", "total", "number", "of", "embryos", "analyzed", "for", "each", "condition", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Representative", "fluorescence", "image", "of", "SCNT", "embryos", "derived", "by", "different", "methods", ".", "The", "SCNT", "embryos", "produced", "by", "transfer", "of", "MERVL", ":", ":", "tdTomato", "cumulus", "cells", "(", "B6D2F1", "background", ")", "into", "WT", "enucleated", "oocytes", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Stacked", "bar", "plots", "show", "the", "fraction", "of", "embryos", "at", "blastocyst", "stages", "after", "injection", "with", "different", "mRNA", ",", "as", "indicated", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ";", "N", ",", "total", "number", "of", "embryos", "analyzed", "for", "each", "condition", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "as", "compared", "with", "control", "group", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "
", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "Representative", "live", "-", "cell", "images", "of", "dynamic", "ZGA", "-", "reporter", "expression", "during", "SCNT", "embryo", "development", ".", "The", "time", "after", "initial", "observation", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "of", "the", "image", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Preimplantation", "development", "of", "SCNT", "embryos", ".", "The", "percentage", "of", "embryos", "reaching", "each", "indicated", "stage", "is", "shown", ".", "The", "D", "-", "SCNT", "embryos", "produced", "by", "transfer", "of", "dox", "-", "Dux", "cumulus", "cell", "(", "B6D2F1", "background", ")", "into", "WT", "enucleated", "oocytes", "(", "B6D2F1", "background", ")", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "J", ")", "Image", "of", "full", "-", "term", "cloned", "mice", "derived", "by", "canonical", "SCNT", "and", "D", "-", "SCNT", "method", "(", "left", ")", ".", "The", "birth", "rate", "of", "SCNT", "embryos", "derived", "by", "different", "methods", "is", "indicated", "(", "right", ")", ".", "N", ",", "the", "total", "number", "of", "cloned", "pups", "obtained", "from", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Quantification of embryos that expressing the ZGA reporter (MERVL::tdTomato) after injection with a siRNA-repressor or mRNA-inducer. N, the total number of embryos analyzed for each condition. Error bars, mean ± S.D.; n = 3 biological replicates per group.(C) Representative fluorescence image of SCNT embryos derived by different methods. The SCNT embryos produced by transfer of MERVL::tdTomato cumulus cells (B6D2F1 background) into WT enucleated oocytes. n = 3 biological replicates per group. Scale bar, 100 μm.(D) Stacked bar plots show the fraction of embryos at blastocyst stages after injection with different mRNA, as indicated. Error bars, mean ± S.D.; n = 3 biological replicates per group; N, total number of embryos analyzed for each condition; **P < 0.01, ***P < 0.001 as compared with control group, by two-tailed Student's
 t-test.(E) Representative live-cell images of dynamic ZGA-reporter expression during SCNT embryo development. The time after initial observation is shown at the bottom of the image. n = 3 biological replicates per group. Scale bar, 50 μm.(G) Preimplantation development of SCNT embryos. The percentage of embryos reaching each indicated stage is shown. The D-SCNT embryos produced by transfer of dox-Dux cumulus cell (B6D2F1 background) into WT enucleated oocytes (B6D2F1 background). Error bars, mean ± S.D.; n = 3 biological replicates per group. Scale bar, 100 μm.(J) Image of full-term cloned mice derived by canonical SCNT and D-SCNT method (left). The birth rate of SCNT embryos derived by different methods is indicated (right). N, the total number of cloned pups obtained from each condition."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Durations", "of", "dox", "addition", "at", "different", "time", "points", "during", "chemical", "induction", "(", "upper", ")", "and", "assessment", "of", "AP", "+", "colonies", "(", "bottom", ")", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "condition", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "as", "compared", "with", "condition", "-", "1", ",", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "
", "t", "-", "test", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "C", ")", "Morphological", "changes", "at", "distinct", "time", "points", "during", "D", "-", "CiPS", "induction", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "the", "number", "of", "AP", "+", "positive", "colonies", ".", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "per", "condition", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "select", "ZGA", "-", "related", "genes", "in", "dox", "-", "untreated", "D", "-", "CiPSCs", "and", "canonical", "CiPSCs", "at", "passage", "1", ".", "The", "value", "in", "CiPSCs", "was", "set", "as", "1", ",", "and", "data", "shown", "are", "mean", "expression", "values", "relative", "to", "GAPDH", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "group", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunostaining", "images", "of", "D", "-", "CiPSCs", "expressing", "pluripotency", "markers", ".", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Histology", "by", "H", "&", "E", "staining", "of", "teratoma", "tissues", "derived", "by", "D", "-", "CiPS", "cells", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "(", "I", ")", "Karyotype", "analysis", "of", "D", "-", "CiPSCs", "and", "canonical", "CiPSCs", ".", "The", "majority", "of", "D", "-", "CiPSCs", "and", "CiPSCs", "cells", "possessed", "a", "normal", "karyotype", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "J", ")", "Bisulfite", "sequencing", "analysis", "of", "demethylation", "of", "Oct4", "and", "Nanog", "promoters", "in", "D", "-", "CiPSCs", "or", "canonical", "CiPSCs", ".", "Filled", "and", "empty", "squares", "represent", "methylated", "and", "unmethylated", "CpGs", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Durations of dox addition at different time points during chemical induction (upper) and assessment of AP+ colonies (bottom). Error bars, mean ± S.D.; n = 3 biological replicates per condition; **P < 0.01, ***P < 0.001 as compared with condition-1, by two-tailed Student's
 t-test. n.s., not significant.(C) Morphological changes at distinct time points during D-CiPS induction. Scale bar, 100 μm.(D) Representative images of the number of AP+ positive colonies. n = 5 biological replicates per condition.(E) RT-qPCR analysis of select ZGA-related genes in dox-untreated D-CiPSCs and canonical CiPSCs at passage 1. The value in CiPSCs was set as 1, and data shown are mean expression values relative to GAPDH. Error bars, mean ± S.E.M.; n = 3 biological replicates per group; ***P < 0.001 by two-tailed Student's t-test.(F) Representative immunostaining images of D-CiPSCs expressing pluripotency markers. n = 5 biological replicates. Scale bar, 50 μm.(G) Histology by H&E staining of teratoma tissues derived by D-CiPS cells. n = 3 biological replicates. Scale bar, 200 μm.(I) Karyotype analysis of D-CiPSCs and canonical CiPSCs. The majority of D-CiPSCs and CiPSCs cells possessed a normal karyotype. Scale bar, 10 μm.(J) Bisulfite sequencing analysis of demethylation of Oct4 and Nanog promoters in D-CiPSCs or canonical CiPSCs. Filled and empty squares represent methylated and unmethylated CpGs, respectively."}
{"words": ["Figure", "1Ookinete", "formation", "in", "vitro", ".", "After", "12", "h", "of", "culture", ",", "the", "ookinetes", "were", "Giemsa", "-", "stained", "and", "analyzed", "for", "ookinete", "morphology", ".", "The", "ookinete", "conversion", "rate", "was", "calculated", "as", "the", "number", "of", "mature", "ookinetes", "per", "100", "female", "gametocytes", ".", "Oocyst", "counts", "in", "the", "mosquitoes", "at", "day", "7", "post", "blood", "-", "feeding", ".", "x", "/", "y", "on", "the", "top", "is", "the", "number", "of", "mosquitoes", "containing", "oocyst", "/", "the", "number", "of", "mosquitoes", "dissected", ";", "the", "percentage", "number", "is", "the", "mosquito", "infection", "prevalence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Ookinete formation in vitro. After 12 h of culture, the ookinetes were Giemsa-stained and analyzed for ookinete morphology. The ookinete conversion rate was calculated as the number of mature ookinetes per 100 female gametocytes.Oocyst counts in the mosquitoes at day 7 post blood-feeding. x/y on the top is the number of mosquitoes containing oocyst/the number of mosquitoes dissected; the percentage number is the mosquito infection prevalence."}
{"words": ["Figure", "2Co", "-", "staining", "of", "P28", "and", "GAP45", "(", "IMC", "protein", ")", "in", "female", "gametes", "(", "P28", "+", "only", ")", "and", "zygotes", "(", "P28", "+", "/", "GAP45", "+", ")", "of", "the", "17XNL", ",", "Δap2", "-", "o3", "and", "Δcdpk4", "strains", ".", "Percentages", "of", "female", "gametes", "and", "zygotes", "were", "indicated", "respectively", ".", "n", "is", "the", "number", "of", "cells", "counted", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "Note", ":", "the", "signal", "of", "P28", "and", "GAP45", "is", "reduced", "similarly", "in", "all", "Δap2", "-", "o3", "female", "gametes", "and", "zygotes", "compared", "to", "that", "of", "17XNL", ".", "Day", "7", "midgut", "oocyst", "counts", "from", "mosquitoes", "infected", "with", "parasites", ",", "including", "17XNL", ",", "Δap2", "-", "o3", ",", "Δmap2", ",", "or", "Δnek4", "strain", "alone", "as", "well", "as", "mixtures", "of", "Δmap2", "/", "Δnek4", ",", "Δap2", "-", "o3", "/", "Δmap2", ",", "and", "Δap2", "-", "o3", "/", "Δnek4", ".", "Δnek4", "and", "Δmap2", "are", "female", "and", "male", "gamete", "-", "defect", "parasites", ",", "respectively", ".", "n", "is", "the", "number", "of", "mosquitoes", "dissected", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "applied", ",", "two", "experiments", "repeated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Co-staining of P28 and GAP45 (IMC protein) in female gametes (P28+ only) and zygotes (P28+/GAP45+) of the 17XNL, Δap2-o3 and Δcdpk4 strains. Percentages of female gametes and zygotes were indicated respectively. n is the number of cells counted. Scale bars = 5 μm. Note: the signal of P28 and GAP45 is reduced similarly in all Δap2-o3 female gametes and zygotes compared to that of 17XNL.Day 7 midgut oocyst counts from mosquitoes infected with parasites, including 17XNL, Δap2-o3, Δmap2, or Δnek4 strain alone as well as mixtures of Δmap2/Δnek4, Δap2-o3/Δmap2, and Δap2-o3/Δnek4. Δnek4 and Δmap2 are female and male gamete-defect parasites, respectively. n is the number of mosquitoes dissected, Mann-Whitney test applied, two experiments repeated."}
{"words": ["Figure", "3Transcript", "expression", "heatmap", "by", "RNA", "-", "seq", "of", "26", "genes", "involving", "DNA", "replication", "and", "DNA", "repair", "between", "DFsc7", "(", "WT", ")", "and", "DFsc7", ";", "Δap2", "-", "o3", "(", "KO", ")", "strains", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Transcript expression heatmap by RNA-seq of 26 genes involving DNA replication and DNA repair between DFsc7 (WT) and DFsc7;Δap2-o3 (KO) strains."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "mCherry", "and", "DPOD2", ":", ":", "GFP", "expression", "in", "female", "and", "male", "gametocytes", "of", "the", "DTS1", "(", "ccp2", ":", ":", "mCherry", ";", "dpod2", ":", ":", "gfp", ")", "and", "DTS1", ";", "Δap2", "-", "o3", "strains", ".", "mCherry", "is", "specifically", "expressed", "in", "female", "gametocytes", ".", "Flow", "cytometry", "detection", "of", "mCherry", "and", "DPOD2", ":", ":", "GFP", "expression", "in", "female", "and", "male", "gametocytes", "of", "the", "DTS1", "and", "DTS1", ";", "Δap2", "-", "o3", "strains", ".", "The", "female", "and", "male", "gametocyte", "populations", "are", "circled", "by", "solid", "and", "dashed", "line", "respectively", ".", "E", ",", "F", "Similar", "analysis", "(", "as", "in", "C", ",", "D", ")", "in", "DTS2", "(", "ccp2", ":", ":", "mCherry", ";", "dpod1", ":", ":", "gfp", ")", "and", "DTS2", ";", "Δap2", "-", "o3", "strains", ".", "G", ",", "H", "Similar", "analysis", "(", "as", "in", "C", ",", "D", ")", "in", "DTS3", "(", "ccp2", ":", ":", "mCherry", ";", "rpa1", ":", ":", "gfp", ")", "and", "DTS3", ";", "Δap2", "-", "o3", "strains", ".", "I", ",", "J", "Similar", "analysis", "(", "as", "in", "C", ",", "D", ")", "in", "DTS4", "(", "ccp2", ":", ":", "mCherry", ";", "mcm7", ":", ":", "gfp", ")", "and", "DTS4", ";", "Δap2", "-", "o3", "strains", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative fluorescence microscopy images of mCherry and DPOD2::GFP expression in female and male gametocytes of the DTS1 (ccp2::mCherry;dpod2::gfp) and DTS1;Δap2-o3 strains. mCherry is specifically expressed in female gametocytes. Flow cytometry detection of mCherry and DPOD2::GFP expression in female and male gametocytes of the DTS1 and DTS1;Δap2-o3 strains. The female and male gametocyte populations are circled by solid and dashed line respectively. E,F Similar analysis (as in C, D) in DTS2 (ccp2::mCherry;dpod1::gfp) and DTS2;Δap2-o3 strains. G,H Similar analysis (as in C, D) in DTS3 (ccp2::mCherry;rpa1::gfp) and DTS3;Δap2-o3 strains. I,J Similar analysis (as in C, D) in DTS4 (ccp2::mCherry;mcm7::gfp) and DTS4;Δap2-o3 strains."}
{"words": ["Figure", "5EMSA", "using", "the", "recombinant", "GST", "-", "fused", "AP2", "domain", "of", "AP2", "-", "O3", "and", "a", "synthesized", "DNA", "probe", "containing", "three", "repeats", "of", "predicted", "motif", ".", "GST", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "An", "arrowhead", "indicates", "the", "shifted", "band", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "validation", "of", "the", "binding", "between", "AP2", "-", "O3", "and", "the", "upstream", "region", "of", "four", "male", "genes", "The", "regions", "detected", "via", "ChIP", "-", "qPCR", "are", "indicated", "by", "pink", "line", "(", "in", "the", "peak", ")", "and", "purple", "line", "(", "out", "of", "the", "peak", ")", ".", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5EMSA using the recombinant GST-fused AP2 domain of AP2-O3 and a synthesized DNA probe containing three repeats of predicted motif. GST was used as a negative control. An arrowhead indicates the shifted band.ChIP-qPCR validation of the binding between AP2-O3 and the upstream region of four male genes The regions detected via ChIP-qPCR are indicated by pink line (in the peak) and purple line (out of the peak). mean±SEM from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6qRT", "-", "PCR", "detecting", "mRNA", "transcript", "level", "of", "ten", "selected", "highly", "expressed", "genes", "The", "numbers", "indicate", "the", "gene", "ID", ".", "Western", "blot", "of", "GAP45", "protein", "expression", "in", "non", "-", "activated", "(", "NAG", ")", "and", "activated", "gametocyte", "(", "AG", ")", "of", "17XNL", "and", "Δap2", "-", "o3", "strains", ".", "BiP", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6qRT-PCR detecting mRNA transcript level of ten selected highly expressed genes The numbers indicate the gene ID.Western blot of GAP45 protein expression in non-activated (NAG) and activated gametocyte (AG) of 17XNL and Δap2-o3 strains. BiP as loading control."}
{"words": ["Figure", "7IFA", "of", "AP2", "-", "O3", "protein", "expression", "in", "activated", "gametocytes", "of", "Pccp2", "strains", ".", "Oocyst", "counts", "in", "the", "mosquitoes", "at", "day", "7", "post", "blood", "-", "feeding", ".", "x", "/", "y", "on", "the", "top", "is", "the", "number", "of", "mosquitoes", "containing", "oocyst", "/", "the", "number", "of", "mosquitoes", "dissected", ";", "the", "percentage", "number", "is", "the", "mosquito", "infection", "prevalence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7IFA of AP2-O3 protein expression in activated gametocytes of Pccp2 strains.Oocyst counts in the mosquitoes at day 7 post blood-feeding. x/y on the top is the number of mosquitoes containing oocyst/the number of mosquitoes dissected; the percentage number is the mosquito infection prevalence."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "Brains", "of", "the", "'", "rescued", "'", "mice", "(", "Becn1", "−", "/", "−", ";", "Becn1EGFP", "/", "+", ")", "and", "of", "control", "Becn1", "+", "/", "+", "littermates", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "immune", "isolation", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "Proteins", "bound", "to", "anti", "-", "GFP", "antibody", "were", "isolated", ",", "detected", "and", "identified", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "Coomassie", "brilliant", "blue", "staining", "and", "mass", "spectrometry", ".", "Seven", "bands", "pulled", "down", "by", "anti", "-", "GFP", "antibody", "specifically", "from", "'", "rescued", "'", "mice", "lysate", "are", "numbered", "(", "this", "is", "a", "copy", "of", "image", "from", "our", "previous", "report", "with", "modification", ")", ".", "(", "b", ")", "Mouse", "brain", "lysates", "were", "subjected", "to", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "co", "-", "IP", ")", "followed", "by", "WB", "analysis", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "c", ")", "Mouse", "brain", "lysates", "were", "subjected", "to", "co", "-", "IP", "by", "NRBF2", "antibody", "and", "followed", "by", "WB", "analysis", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "d", ")", "Gel", "filtration", "analysis", ".", "The", "supernatant", "fraction", "of", "mouse", "brain", "lysates", "was", "subjected", "to", "a", "Superdex", "200", "HR", "10", "/", "30", "column", "and", "each", "fraction", "was", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Relative", "amounts", "of", "each", "fraction", "determined", "by", "Odyssey", "software", "are", "plotted", ".", "(", "e", ")", "The", "deficiency", "of", "Atg14L", "impairs", "the", "protein", "interaction", "between", "Beclin", "1", "and", "NRBF2", ".", "NIH3T3", "cells", "were", "transfected", "with", "Atg14L", "or", "NRBF2", "RNAi", "for", "72", "h", ",", "respectively", ",", "and", "then", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "IP", "using", "Beclin", "1", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitants", "were", "immunoblotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "f", ")", "Direct", "binding", "between", "Atg14L", "and", "NRBF2", ".", "Flag", "-", "tagged", "Atg14L", "purified", "from", "HEK293T", "cells", "overexpressing", "Flag", "-", "Atg14L", "was", "incubated", "with", "GST", "or", "NRBF2", "-", "GST", "purified", "from", "Escherichia", "coli", ".", "The", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "to", "examine", "the", "direct", "binding", "between", "Flag", "-", "Atg14L", "and", "NRBF2", "-", "GST", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) Brains of the 'rescued' mice (Becn1−/−; Becn1EGFP/+) and of control Becn1+/+ littermates were lysed and subjected to immune isolation using an anti-GFP antibody. Proteins bound to anti-GFP antibody were isolated, detected and identified by SDS-PAGE, Coomassie brilliant blue staining and mass spectrometry. Seven bands pulled down by anti-GFP antibody specifically from 'rescued' mice lysate are numbered (this is a copy of image from our previous report with modification).(b) Mouse brain lysates were subjected to co-immunoprecipitation (co-IP) followed by WB analysis using the indicated antibodies.(c) Mouse brain lysates were subjected to co-IP by NRBF2 antibody and followed by WB analysis using the indicated antibodies.(d) Gel filtration analysis. The supernatant fraction of mouse brain lysates was subjected to a Superdex 200 HR 10/30 column and each fraction was immunoblotted with the indicated antibodies. Relative amounts of each fraction determined by Odyssey software are plotted.(e) The deficiency of Atg14L impairs the protein interaction between Beclin 1 and NRBF2. NIH3T3 cells were transfected with Atg14L or NRBF2 RNAi for 72 h, respectively, and then were lysed and subjected to IP using Beclin 1 antibody. The immunoprecipitants were immunoblotted using the indicated antibodies.(f) Direct binding between Atg14L and NRBF2. Flag-tagged Atg14L purified from HEK293T cells overexpressing Flag-Atg14L was incubated with GST or NRBF2-GST purified from Escherichia coli. The GST pull-down assay was performed to examine the direct binding between Flag-Atg14L and NRBF2-GST."}
{"words": ["f2", "(", "b", ")", "NRBF2", "KO", "MEFs", "were", "transfected", "with", "CFP", ",", "NRBF2", "-", "CFP", ",", "dMIT", "-", "CFP", "or", "dCCD", "-", "CFP", "for", "48", " ", "h", ".", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34", "was", "pulled", "down", "by", "an", "anti", "-", "Atg14L", "antibody", "and", "subjected", "to", "KA", ".", "IP", "products", "and", "inputs", "were", "immunoblotted", "using", "the", "antibodies", "indicated", ".", "(", "c", ")", "Quantification", "of", "IPed", "Vps34", "kinase", "activity", "(", "PI", "(", "3", ")", "P", ")", ",", "Vps34", "and", "Vps15", "protein", "versus", "IPed", "Atg14L", "protein", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "multiple", "t", "-", "test", "are", "followed", "by", "Bonferroni", "correction", ",", "n", "=", "4", "(", "otherwise", "indicated", ",", "n", "means", "number", "of", "independent", "experiments", ";", "NS", ",", "not", "significant", ")", ")", ".", "(", "d", ")", "Overexpression", "of", "NRBF2", "enhances", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34kinase", "activity", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "Vps34", "-", "Vps15", "-", "His", "and", "Flag", "-", "Atg14L", "in", "the", "presence", "of", "CFP", "or", "NRBF2", "-", "CFP", ".", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34", "is", "pulled", "down", "by", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "subjected", "to", "KA", "(", "upper", "panel", ")", ".", "IP", "products", "and", "inputs", "were", "immunoblotted", "using", "the", "antibodies", "indicated", "(", "upper", "panel", ")", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "Vps34kinase", "activity", "(", "lower", "panel", ")", "shows", "the", "significant", "difference", "between", "two", "groups", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "value", "is", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "one", "sample", "t", "-", "test", "versus", "hypothetical", "mean", "1", ",", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(b) NRBF2 KO MEFs were transfected with CFP, NRBF2-CFP, dMIT-CFP or dCCD-CFP for 48 h. Atg14L-linked Vps34 was pulled down by an anti-Atg14L antibody and subjected to KA. IP products and inputs were immunoblotted using the antibodies indicated. (c) Quantification of IPed Vps34 kinase activity (PI(3)P), Vps34 and Vps15 protein versus IPed Atg14L protein. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, multiple t-test are followed by Bonferroni correction, n=4 (otherwise indicated, n means number of independent experiments; NS, not significant)).(d) Overexpression of NRBF2 enhances Atg14L-linked Vps34kinase activity. HEK293T cells were co-transfected with Myc-Vps34-Vps15-His and Flag-Atg14L in the presence of CFP or NRBF2-CFP. Atg14L-linked Vps34 is pulled down by an anti-Flag antibody and subjected to KA (upper panel). IP products and inputs were immunoblotted using the antibodies indicated (upper panel). (e) Quantification of Vps34kinase activity (lower panel) shows the significant difference between two groups. (Data are shown as mean±s.e.m., P value is indicated on the figures, one sample t-test versus hypothetical mean 1, n=5)."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Starvation", "-", "induced", "long", "-", "lived", "protein", "degradation", "is", "impaired", "after", "NRBF2", "knockdown", ".", "Compared", "with", "control", "(", "con", ")", "siRNA", ",", "NRBF2", "siRNA", "decreases", "long", "-", "lived", "protein", "degradation", "(", "proteolysis", "rate", ")", "in", "NIH3T3", "cells", "under", "starvation", "(", "ST", ")", "condition", ".", "This", "difference", "is", "diminished", "when", "the", "starved", "cells", "are", "co", "-", "treated", "with", "wortmannin", "(", "WM", ",", "100", " ", "nM", ")", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "with", "Dunnett", "as", "post", "hoc", "test", ",", "n", "=", "4", ";", "NS", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "b", ")", "Rapamycin", "(", "Rap", ")", "-", "induced", "autophagy", "is", "impaired", "in", "the", "NRBF2", "KO", "cells", ".", "The", "MEFs", "were", "treated", "with", "(", "dimethyl", "sulfoxide", ")", "DMSO", "or", "50", " ", "μg", " ", "ml", "−", "1", "of", "Rap", "for", "4", " ", "h", "then", "the", "cell", "lysates", "were", "immunoprobed", "with", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "p62", "antibodies", ".", "(", "c", ")", "LC3", "-", "II", "and", "p62", "levels", "were", "quantified", "and", "normalized", "with", "β", "-", "actin", ".", "Quantification", "results", "show", "that", "Rap", "-", "induced", "LC3", "lipidation", "(", "upper", ")", "and", "p62", "degradation", "(", "lower", ")", "were", "markedly", "impaired", "in", "the", "NRBF2", "KO", "MEFs", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "one", "sample", "t", "-", "test", "(", "WT", "con", "versus", "KO", "con", ")", "or", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "WT", "Rap", "versus", "KO", "Rap", ")", ")", ".", "p62", "blots", "quantification", ",", "n", "=", "6", ";", "LC3", "blots", "quantification", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "The", "MEFs", "were", "subjected", "to", "Rap", "(", "50", " ", "μg", " ", "ml", "−", "1", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ")", "treatment", "then", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "(", "d", ")", "or", "anti", "-", "WIPI2", "(", "e", ")", "antibody", ".", "(", "f", ")", "The", "LC3", "and", "WIPI2", "puncta", "per", "cell", "were", "counted", "and", "quantified", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "independent", "samples", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "pairwise", "comparisons", ",", "n", "=", "30", "randomly", "selected", "cells", ",", "a", "representative", "result", "from", "three", "independent", "repeats", ")", ".", "(", "g", ")", "NRBF2", "-", "CFP", "stable", "cells", "were", "starved", "in", "HBSS", "for", "4", " ", "h", "and", "then", "subjected", "to", "WIPI2", "staining", ".", "Under", "starved", "condition", ",", "NRBF2", "-", "CFP", "forms", "puncta", "structures", "that", "co", "-", "localized", "with", "WIPI2", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "h", ")", "The", "NRBF2", "KO", "MEFs", "were", "transfected", "with", "CFP", ",", "NRBF2", "-", "CFP", ",", "dMIT", "-", "CFP", "or", "dCCD", "-", "CFP", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "followed", "by", "co", "-", "immunostaining", "with", "GFP", "and", "WIPI2", "antibodies", ".", "(", "i", ")", "The", "WIPI2", "puncta", "number", "per", "cell", "in", "GFP", "-", "positive", "cells", "were", "counted", "and", "quantified", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "independent", "samples", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "pairwise", "comparisons", ",", "n", "=", "30", "randomly", "selected", "cells", ",", "a", "representative", "result", "from", "two", "independent", "repeats", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ",", "or", "length", "indicated", "on", "the", "figure", ".", "CM", ",", "culture", "medium", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Starvation-induced long-lived protein degradation is impaired after NRBF2 knockdown. Compared with control (con) siRNA, NRBF2 siRNA decreases long-lived protein degradation (proteolysis rate) in NIH3T3 cells under starvation (ST) condition. This difference is diminished when the starved cells are co-treated with wortmannin (WM, 100 nM). (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, one-way analysis of variance with Dunnett as post hoc test, n=4; NS, not significant).(b) Rapamycin (Rap)-induced autophagy is impaired in the NRBF2 KO cells. The MEFs were treated with (dimethyl sulfoxide) DMSO or 50 μg ml−1 of Rap for 4 h then the cell lysates were immunoprobed with anti-LC3 and anti-p62 antibodies. (c) LC3-II and p62 levels were quantified and normalized with β-actin. Quantification results show that Rap-induced LC3 lipidation (upper) and p62 degradation (lower) were markedly impaired in the NRBF2 KO MEFs. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, one sample t-test (WT con versus KO con) or unpaired t-test (WT Rap versus KO Rap)). p62 blots quantification, n=6; LC3 blots quantification, n=3).(d,e) The MEFs were subjected to Rap (50 μg ml−1) or starvation (HBSS) treatment then stained with anti-LC3 (d) or anti-WIPI2 (e) antibody. (f) The LC3 and WIPI2 puncta per cell were counted and quantified. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, independent samples Kruskal-Wallis test followed by pairwise comparisons, n=30 randomly selected cells, a representative result from three independent repeats).(g) NRBF2-CFP stable cells were starved in HBSS for 4 h and then subjected to WIPI2 staining. Under starved condition, NRBF2-CFP forms puncta structures that co-localized with WIPI2. This is a representative image from three independent experiments.(h) The NRBF2 KO MEFs were transfected with CFP, NRBF2-CFP, dMIT-CFP or dCCD-CFP for 24 h and then followed by co-immunostaining with GFP and WIPI2 antibodies. (i) The WIPI2 puncta number per cell in GFP-positive cells were counted and quantified. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, independent samples Kruskal-Wallis test followed by pairwise comparisons, n=30 randomly selected cells, a representative result from two independent repeats). Scale bars, 20 μm, or length indicated on the figure. CM, culture medium."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "NRBF2", "KO", "MEFs", "display", "impaired", "autophagosome", "acidification", ".", "WT", "and", "NRBF2", "KO", "MEFs", "are", "transiently", "transfected", "with", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3B", ".", "WT", "MEFs", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3B", "contain", "many", "red", "-", "only", "puncta", "along", "with", "yellow", "(", "presence", "of", "both", "red", "and", "green", ")", "puncta", ".", "The", "number", "of", "both", "red", "-", "only", "puncta", "and", "yellow", "puncta", "markedly", "increases", "after", "rapamycin", "(", "Rap", ";", "50", " ", "μg", " ", "ml", "−", "1", ",", "4", " ", "h", ")", "or", "starvation", "(", "HBSS", ",", "4", " ", "h", ")", "treatment", ",", "suggesting", "the", "increased", "autophagolysosomes", "and", "nascent", "autophagosomes", ".", "In", "contrast", ",", "NRBF2", "KO", "MEFs", "expressing", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3B", "contain", "quite", "fewer", "red", "-", "only", "puncta", "and", "yellow", "puncta", ",", "even", "after", "Rap", "or", "starvation", "treatment", ".", "(", "b", ")", "The", "quantification", "results", "show", "that", "both", "the", "numbers", "of", "red", "-", "only", "puncta", "and", "percentage", "of", "red", "-", "only", "puncta", "(", "verses", "total", "puncta", ")", "in", "KO", "MEFs", "were", "markedly", "reduced", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "n", "=", "20", "randomly", "selected", "cells", ",", "a", "representative", "result", "from", "three", "independent", "repeats", ")", ",", "indicating", "both", "the", "autophagolysome", "number", "and", "autophagosome", "acidification", "rate", "are", "reduced", "in", "KO", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "or", "10", " ", "μm", "(", "amplified", "regions", ")", ".", "(", "c", ")", "Autophagolysome", "formation", "is", "impaired", "in", "NRBF2", "KO", "MEFs", ".", "WT", "and", "NRBF2", "KO", "MEFs", "were", "transiently", "transfected", "with", "RFP", "-", "LC3", "then", "stained", "with", "LAMP2", "antibody", ".", "The", "co", "-", "localization", "between", "RFP", "-", "LC3", "and", "LAMP2", "are", "illustrated", "by", "line", "profile", ".", "RFP", "-", "LC3", "puncta", "recruit", "much", "stronger", "LAMP2", "signal", "in", "WT", "MEFs", "than", "in", "NRBF2", "KO", "MEFs", "(", "as", "indicated", "by", "white", "arrows", ")", ",", "suggesting", "the", "impairment", "of", "autophagolysosome", "formation", "in", "KO", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "or", "10", " ", "μm", "(", "amplified", "regions", ")", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "d", ")", "Overexpression", "of", "NRBF2", "enhances", "UVRAG", "-", "linked", "Vps34", "kinase", "activity", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "Vps34", "-", "Vps15", "-", "His", "and", "FLAG", "-", "UVRAG", ",", "in", "the", "presence", "of", "CFP", "or", "NRBF2", "-", "CFP", ".", "UVRAG", "-", "linked", "Vps34", "was", "pulled", "down", "by", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "subjected", "to", "KA", ".", "IP", "products", "and", "inputs", "are", "immunoblotted", "using", "the", "antibodies", "indicated", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "Vps34", "kinase", "activity", "normalized", "with", "immunoprecipitated", "Vps34", "shows", "the", "significant", "difference", "between", "two", "groups", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "value", "is", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "one", "sample", "t", "-", "test", "versus", "hypothetical", "mean", "1", ",", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) NRBF2 KO MEFs display impaired autophagosome acidification. WT and NRBF2 KO MEFs are transiently transfected with mCherry-GFP-LC3B. WT MEFs expressing mCherry-GFP-LC3B contain many red-only puncta along with yellow (presence of both red and green) puncta. The number of both red-only puncta and yellow puncta markedly increases after rapamycin (Rap; 50 μg ml−1, 4 h) or starvation (HBSS, 4 h) treatment, suggesting the increased autophagolysosomes and nascent autophagosomes. In contrast, NRBF2 KO MEFs expressing mCherry-GFP-LC3B contain quite fewer red-only puncta and yellow puncta, even after Rap or starvation treatment. (b) The quantification results show that both the numbers of red-only puncta and percentage of red-only puncta (verses total puncta) in KO MEFs were markedly reduced. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, Mann-Whitney U-test, n=20 randomly selected cells, a representative result from three independent repeats), indicating both the autophagolysome number and autophagosome acidification rate are reduced in KO cells. Scale bars, 20 μm or 10 μm (amplified regions).(c) Autophagolysome formation is impaired in NRBF2 KO MEFs. WT and NRBF2 KO MEFs were transiently transfected with RFP-LC3 then stained with LAMP2 antibody. The co-localization between RFP-LC3 and LAMP2 are illustrated by line profile. RFP-LC3 puncta recruit much stronger LAMP2 signal in WT MEFs than in NRBF2 KO MEFs (as indicated by white arrows), suggesting the impairment of autophagolysosome formation in KO cells. Scale bars, 20 μm or 10 μm (amplified regions). This is a representative image from three independent experiments.(d) Overexpression of NRBF2 enhances UVRAG-linked Vps34 kinase activity. HEK293T cells were co-transfected with Myc-Vps34-Vps15-His and FLAG-UVRAG, in the presence of CFP or NRBF2-CFP. UVRAG-linked Vps34 was pulled down by an anti-FLAG antibody and subjected to KA. IP products and inputs are immunoblotted using the antibodies indicated. (e) Quantification of Vps34 kinase activity normalized with immunoprecipitated Vps34 shows the significant difference between two groups. (Data are shown as mean±s.e.m., P value is indicated on the figures, one sample t-test versus hypothetical mean 1, n=5)."}
{"words": ["f5", "(", "a", ")", "The", "gross", "anatomical", "views", "of", "representative", "4", "%", "paraformaldehyde", "-", "fixed", "livers", "and", "quantification", "of", "liver", "index", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1", " ", "cm", ".", "(", "b", ")", "The", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "and", "CD45", "staining", "of", "10", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "NRBF2", "KO", "mice", "livers", ".", "The", "NRBF2", "KO", "liver", "shows", "mild", "increase", "of", "ductular", "reaction", "(", "yellow", "arrow", ")", "and", "isolated", "necrosis", "(", "red", "arrows", ")", ".", "The", "necrotic", "foci", "were", "further", "confirmed", "by", "CD45", "staining", "(", "black", "arrow", ")", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "four", "mice", "per", "genotype", ".", "Scale", "bar", ",", "50", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "The", "number", "of", "necrotic", "foci", "and", "ductular", "reaction", "scores", "were", "recorded", "under", "bright", "-", "field", "microscope", ".", "At", "least", "10", "randomly", "selected", "fields", "(", "10", "×", ")", "from", "each", "mouse", "and", "four", "mice", "per", "genotype", "were", "analysed", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ".", "Ductular", "reaction", "scores", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "necrotic", "foci", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ")", ".", "BD", ",", "bile", "duct", ";", "CV", ",", "central", "vein", ";", "PV", ",", "portal", "vein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a) The gross anatomical views of representative 4% paraformaldehyde-fixed livers and quantification of liver index. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, unpaired Student's t-test, n=3 mice each group). Scale bar, 1 cm.(b) The haematoxylin and eosin (HE) and CD45 staining of 10-month-old WT and NRBF2 KO mice livers. The NRBF2 KO liver shows mild increase of ductular reaction (yellow arrow) and isolated necrosis (red arrows). The necrotic foci were further confirmed by CD45 staining (black arrow). This is a representative image from four mice per genotype. Scale bar, 50 μm. (c) The number of necrotic foci and ductular reaction scores were recorded under bright-field microscope. At least 10 randomly selected fields (10 × ) from each mouse and four mice per genotype were analysed. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures. Ductular reaction scores, unpaired Student's t-test; necrotic foci, Mann-Whitney U-test, n=4 mice each group). BD, bile duct; CV, central vein; PV, portal vein."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "WB", "analysis", "shows", "accumulation", "of", "p62", "in", "the", "liver", "of", "NRBF2", "KO", "mice", ".", "Liver", "lysates", "were", "immunoprobed", "with", "antibodies", "indicated", ".", "p62", "protein", "levels", "are", "upregulated", "in", "the", "KO", "mouse", "liver", ".", "(", "b", ")", "The", "quantification", "result", "shows", "that", "the", "p62", "level", "increased", "more", "than", "threefold", "in", "the", "NRBF2", "KO", "miceliver", "compared", "with", "WT", "miceliver", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "WT", ",", "n", "=", "5", "mice", ";", "KO", ",", "n", "=", "4", "mice", ")", ".", "(", "c", ")", "WB", "analysis", "shows", "accumulation", "of", "high", "-", "molecular", "weight", "(", "HMW", ")", "ubiquitin", "in", "the", "liver", "of", "NRBF2", "KO", "mice", ".", "Insoluble", "fractions", "of", "liver", "lysates", "were", "immunoprobed", "with", "an", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "genotype", ".", "(", "d", ")", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34kinase", "activity", "is", "impaired", "in", "the", "mice", "of", "NRBF2", "KO", "mice", ".", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34", "is", "pulled", "down", "by", "an", "anti", "-", "Atg14L", "antibody", "and", "is", "subjected", "to", "KA", ".", "IP", "products", "and", "inputs", "were", "immunoblotted", "using", "the", "antibodies", "indicated", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "IPed", "Vps34kinase", "activity", "versus", "IPed", "Atg14L", "shows", "the", "significant", "difference", "between", "WT", "and", "NRBF2", "KO", "miceliver", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figure", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ")", ".", "(", "f", ")", "Focal", "accumulation", "of", "p62", "in", "the", "liver", "of", "NRBF2", "KO", "mice", ".", "Liver", "frozen", "sections", "(", "15", " ", "μm", "in", "thickness", ")", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "p62", "antibody", ".", "Focal", "accumulation", "of", "p62", "is", "observed", "in", "the", "KO", "mice", "liver", "but", "not", "in", "the", "WT", "mice", "liver", ".", "Scale", "bars", ",", "100", " ", "μm", "or", "20", " ", "μm", "(", "amplified", "regions", ")", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "four", "mice", "per", "genotype", ".", "(", "g", ")", "Accumulated", "p62", "colocalizes", "with", "NQO1", ".", "Liver", "frozen", "sections", "were", "double", "stained", "with", "an", "anti", "-", "p62", "antibody", "and", "an", "anti", "-", "NQO1", "antibody", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "four", "mice", "per", "genotype", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) WB analysis shows accumulation of p62 in the liver of NRBF2 KO mice. Liver lysates were immunoprobed with antibodies indicated. p62 protein levels are upregulated in the KO mouse liver. (b) The quantification result shows that the p62 level increased more than threefold in the NRBF2 KO miceliver compared with WT miceliver. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, unpaired Student's t-test; WT, n=5 mice; KO, n=4 mice).(c) WB analysis shows accumulation of high-molecular weight (HMW) ubiquitin in the liver of NRBF2 KO mice. Insoluble fractions of liver lysates were immunoprobed with an anti-ubiquitin antibody, n=4 mice per genotype.(d) Atg14L-linked Vps34kinase activity is impaired in the mice of NRBF2 KO mice. Atg14L-linked Vps34 is pulled down by an anti-Atg14L antibody and is subjected to KA. IP products and inputs were immunoblotted using the antibodies indicated. (e) Quantification of IPed Vps34kinase activity versus IPed Atg14L shows the significant difference between WT and NRBF2 KO miceliver. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figure, unpaired Student's t-test, n=4 mice each group).(f) Focal accumulation of p62 in the liver of NRBF2 KO mice. Liver frozen sections (15 μm in thickness) were stained with an anti-p62 antibody. Focal accumulation of p62 is observed in the KO mice liver but not in the WT mice liver. Scale bars, 100 μm or 20 μm (amplified regions). This is a representative image from four mice per genotype.(g) Accumulated p62 colocalizes with NQO1. Liver frozen sections were double stained with an anti-p62 antibody and an anti-NQO1 antibody. This is a representative image from four mice per genotype. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["f7WT", "and", "NRBF2", "KO", "MEFs", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "1", "μM", "thapsigargin", "(", "TP", ")", "or", "1", "μM", "tunicamycin", "(", "TN", ")", "for", "24", "or", "48", "h", ".", "(", "a", ")", "Then", "cells", "were", "either", "imaged", "under", "phase", "-", "contrast", "microscope", "or", "(", "b", ")", "stained", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "and", "subjected", "to", "cell", "death", "rate", "analysis", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "representative", "images", "of", "cell", "morphology", "after", "treatments", "and", "quantitative", "analysis", "of", "PI", "-", "positive", "cells", "rate", "show", "marked", "increase", "of", "cell", "death", "in", "the", "NRBF2", "KO", "MEFs", "compared", "with", "WT", "MEFs", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figure", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ";", "Con", ",", "control", ".", "(", "c", ")", "Re", "-", "introducing", "NRBF2", "to", "NRBF2", "KO", "MEFs", "reverses", "the", "vulnerability", "of", "cells", "to", "ER", "stress", ".", "NRBF2", "-", "CFP", "stably", "expressing", "cells", "were", "established", "in", "the", "NRBF2", "KO", "background", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "1", " ", "μM", "TP", "for", "24", " ", "h", "then", "stained", "with", "PI", "and", "subjected", "to", "cell", "death", "rate", "analysis", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "cell", "death", "rate", "in", "CFP", "-", "positive", "(", "+", ")", "population", "(", "NRBF2", "-", "CFP", "expression", ")", "and", "negative", "(", "−", ")", "population", "(", "no", "NRBF2", "-", "CFP", "expression", ")", "were", "recorded", "and", "analysed", ",", "respectively", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figure", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "ER", "stress", "inducers", "trigger", "caspase", "-", "8", "and", "caspase", "-", "3", "activation", "in", "NRBF2", "KO", "MEFs", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "1", " ", "μM", "TP", "or", "1", " ", "μM", "TN", "for", "24", " ", "h", ",", "and", "then", "immunoprobed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Marked", "accumulation", "of", "cleaved", "caspase", "-", "8", "(", "C", "-", "Cas", "8", ";", "p43", "and", "p18", "units", ")", "and", "cleaved", "caspase", "-", "3", "(", "C", "-", "Cas", "3", ")", "are", "observed", "in", "the", "NRBF2", "KO", "MEFs", "but", "not", "WT", "MEFs", "treated", "with", "TP", "or", "TN", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "e", ")", "C", "-", "Cas", "8", "preferentially", "localizes", "at", "p62", "aggregation", "foci", ".", "MEFs", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "1", " ", "μM", "TP", "for", "24", " ", "h", ",", "and", "then", "co", "-", "stained", "with", "an", "anti", "-", "p62", "antibody", "and", "an", "anti", "-", "cleaved", "caspase", "-", "8", "antibody", ".", "The", "C", "-", "Cas", "8", "fluorescence", "signals", "are", "triggered", "in", "NRBF2", "KO", "MEFs", "treated", "with", "TP", "and", "preferentially", "localize", "at", "p62", "aggregation", "foci", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "This", "is", "a", "representative", "image", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7WT and NRBF2 KO MEFs were treated with DMSO, 1 μM thapsigargin(TP) or 1 μM tunicamycin (TN) for 24 or 48 h. (a) Then cells were either imaged under phase-contrast microscope or (b) stained with propidium iodide (PI) and subjected to cell death rate analysis by flow cytometry. The representative images of cell morphology after treatments and quantitative analysis of PI-positive cells rate show marked increase of cell death in the NRBF2 KO MEFs compared with WT MEFs. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figure, unpaired Student's t-test, n=5). Scale bars, 100 μm; Con, control.(c) Re-introducing NRBF2 to NRBF2 KO MEFs reverses the vulnerability of cells to ER stress. NRBF2-CFP stably expressing cells were established in the NRBF2 KO background. Cells were treated with DMSO or 1 μM TP for 24 h then stained with PI and subjected to cell death rate analysis by flow cytometry. The cell death rate in CFP-positive (+) population (NRBF2-CFP expression) and negative (−) population (no NRBF2-CFP expression) were recorded and analysed, respectively. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figure, unpaired Student's t-test, n=3).(d) ER stress inducers trigger caspase-8 and caspase-3 activation in NRBF2 KO MEFs. MEFs were treated with DMSO, 1 μM TP or 1 μM TN for 24 h, and then immunoprobed with indicated antibodies. Marked accumulation of cleaved caspase-8 (C-Cas 8; p43 and p18 units) and cleaved caspase-3 (C-Cas 3) are observed in the NRBF2 KO MEFs but not WT MEFs treated with TP or TN. This is a representative image from three independent experiments.(e) C-Cas 8 preferentially localizes at p62 aggregation foci. MEFs were treated with DMSO or 1 μM TP for 24 h, and then co-stained with an anti-p62 antibody and an anti-cleaved caspase-8 antibody. The C-Cas 8 fluorescence signals are triggered in NRBF2 KO MEFs treated with TP and preferentially localize at p62 aggregation foci. Scale bars, 20 μm. This is a representative image from three independent experiments."}
{"words": ["f8", "(", "a", ")", "NRBF2", "is", "critical", "for", "the", "assembly", "of", "Vps34", "-", "Vps15", "and", "Atg14L", "-", "Beclin", "1", "complex", ".", "Brain", "lysate", "from", "WT", "and", "NRBF2", "KO", "mice", "were", "subjected", "to", "co", "-", "IP", "by", "Vps34", "antibody", "and", "Atg14L", "antibody", ".", "The", "IP", "products", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "lipid", "KA", "and", "WB", "analysis", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Quantification", "results", "shows", "that", "Vps34", "-", "Vps15", "and", "Atg14L", "-", "Beclin", "1", "complex", "interactions", "as", "well", "as", "Atg14L", "-", "linked", "Vps34", "kinase", "activity", "are", "markedly", "impaired", "in", "NRBF2", "KO", "mice", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "4", "mice", "in", "each", "group", ";", "NS", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "d", ")", "Overexpression", "of", "NRBF2", "enhances", "overall", "Vps34kinase", "activity", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "Vps34", "-", "Vps15", "-", "His", "and", "CFP", ",", "NRBF2", "-", "CFP", ",", "dMIT", "-", "CFP", "or", "dCCD", "-", "CFP", ".", "Total", "Vps34", "was", "pulled", "down", "by", "an", "anti", "-", "myc", "antibody", "and", "subjected", "to", "KA", ".", "IP", "products", "and", "inputs", "are", "immunoblotted", "using", "the", "antibodies", "indicated", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "IPed", "Vps34kinase", "activity", ",", "Vps15", "protein", "normalized", "with", "IPed", "Vps34", "shows", "that", "NRBF2", "-", "CFP", ",", "but", "not", "CFP", ",", "dMIT", "-", "CFP", "or", "dCCD", "-", "CFP", "significantly", "enhance", "Vps34kinase", "activity", "and", "Vps34", "-", "Vps15", "interaction", ".", "(", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "P", "values", "are", "indicated", "on", "the", "figures", ".", "IPed", "Vps15", "/", "IPed", "Vps34", ",", "one", "sample", "t", "-", "test", "versus", "hypothetical", "mean", "1", ",", "Bonferroni", "correction", ",", "n", "=", "3", ";", "IPed", "Vps34kinase", "activity", "/", "IPed", "Vps34", ",", "multiple", "t", "-", "test", "followed", "by", "Bonferroni", "correction", ",", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f8(a) NRBF2 is critical for the assembly of Vps34-Vps15 and Atg14L-Beclin 1 complex. Brain lysate from WT and NRBF2 KO mice were subjected to co-IP by Vps34 antibody and Atg14L antibody. The IP products were subjected to in vitro lipid KA and WB analysis using the indicated antibodies. (b,c) Quantification results shows that Vps34-Vps15 and Atg14L-Beclin 1 complex interactions as well as Atg14L-linked Vps34 kinase activity are markedly impaired in NRBF2 KO mice. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures, unpaired Student's t-test, n=4 mice in each group; NS, not significant).(d) Overexpression of NRBF2 enhances overall Vps34kinase activity. HEK293T cells were co-transfected with Myc-Vps34-Vps15-His and CFP, NRBF2-CFP, dMIT-CFP or dCCD-CFP. Total Vps34 was pulled down by an anti-myc antibody and subjected to KA. IP products and inputs are immunoblotted using the antibodies indicated. (e) Quantification of IPed Vps34kinase activity, Vps15 protein normalized with IPed Vps34 shows that NRBF2-CFP, but not CFP, dMIT-CFP or dCCD-CFP significantly enhance Vps34kinase activity and Vps34-Vps15 interaction. (Data are shown as mean±s.e.m., P values are indicated on the figures. IPed Vps15/IPed Vps34, one sample t-test versus hypothetical mean 1, Bonferroni correction, n=3; IPed Vps34kinase activity/IPed Vps34, multiple t-test followed by Bonferroni correction, n=3)."}
{"words": ["Figure", "1A", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "were", "grown", "in", "complete", "media", "or", "5", "h", "serum", "starvation", ",", "then", "immunostained", "with", "LAMP1", "antibody", ".", "Dashed", "lines", "in", "images", "outline", "cell", "boundaries", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "C", "Quantitative", "analyses", "of", "lysosome", "perinuclear", "distribution", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "The", "intracellular", "distribution", "of", "LAMP1", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "as", "described", "in", "the", "Methods", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "30", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "B", "Wildtype", "(", "Ocrl", "+", "/", "y", ")", "and", "Ocrl", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "were", "grown", "in", "complete", "media", "or", "5", "h", "serum", "starvation", ",", "then", "immunostained", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Dashed", "lines", "in", "images", "outline", "cell", "boundaries", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "D", ",", "E", "Quantitative", "analyses", "of", "lysosome", "and", "mTOR", "perinuclear", "distribution", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "B", ".", "The", "intracellular", "distribution", "of", "mTOR", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "as", "described", "in", "the", "Methods", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "30", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "Data", "information", ":", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "I", "Snap", "images", "of", "WT", "(", "Ocrl", "+", "/", "y", ")", ",", "OCRL", "knockout", "(", "Ocrl", "-", "/", "-", ")", "and", "IOB", "MEFs", "transfected", "with", "lysosome", "-", "GFP", ".", "After", "transfection", ",", "WT", ",", "OCRL", "knockout", "and", "IOB", "MEFs", "were", "left", "in", "serum", "starvation", "for", "8", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "J", "Quantitative", "analyses", "of", "tubulated", "lysosomes", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "H", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "10", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "D", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells were grown in complete media or 5 h serum starvation, then immunostained with LAMP1 antibody. Dashed lines in images outline cell boundaries. Scale bar, 10 μm. C Quantitative analyses of lysosome perinuclear distribution in the experiments shown in A. The intracellular distribution of LAMP1 positive vesicles was quantified as described in the Methods. n = 3 per group in which 30 cells were counted per condition per experiment. Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, ***≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-tailed Student's t-test.B Wildtype (Ocrl+/y) and Ocrl-/- MEF cells were grown in complete media or 5 h serum starvation, then immunostained with indicated antibodies. Dashed lines in images outline cell boundaries. Scale bar, 10 μm.D, E Quantitative analyses of lysosome and mTOR perinuclear distribution in the experiments shown in B. The intracellular distribution of mTOR positive vesicles was quantified as described in the Methods. n = 3 per group in which 30 cells were counted per condition per experiment. Data information: , data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, ***≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-tailed Student's t-test.I Snap images of WT (Ocrl+/y), OCRL knockout (Ocrl-/-) and IOB MEFs transfected with lysosome-GFP. After transfection, WT, OCRL knockout and IOB MEFs were left in serum starvation for 8 h. Scale bar, 5 μm. J Quantitative analyses of tubulated lysosomes in the experiments shown in H. n = 3 per group in which 10 cells were counted per condition per experiment. D Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, ***≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2A", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "p", "-", "mTOR", "(", "Ser2448", ")", ",", "total", "mTOR", ",", "p", "-", "p70", "S6K", "(", "Thr389", ")", "and", "total", "p70", "S6K", "in", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "grown", "in", "complete", "media", "or", "5", "h", "serum", "starvation", ".", "p", "-", "p70", "S6K", "(", "Thr389", ")", "over", "total", "p70", "S6K", "ratios", "normalized", "to", "NHF", "cells", ",", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "p", "-", "mTOR", "(", "Ser2448", ")", ",", "total", "mTOR", ",", "p", "-", "p70", "S6K", "(", "Thr389", ")", "and", "total", "p70", "S6K", "in", "WT", "(", "Ocrl", "+", "/", "y", ")", "and", "IOB", "MEFs", "grown", "in", "complete", "medium", "or", "5", "h", "serum", "starvation", ".", "p", "-", "p70", "S6K", "(", "Thr389", ")", "over", "total", "p70", "S6K", "ratios", "normalized", "to", "NHF", "cells", ",", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "unless", "otherwise", "stated", ".", "D", "NHF", "and", "Lowe", "1676", "cells", "were", "grown", "in", "complete", "media", ",", "amino", "-", "acid", "(", "aa", ")", "/", "FBS", "starved", "for", "5", "h", ",", "or", "starved", "and", "then", "recovered", "in", "amino", "-", "acid", "/", "FBS", "-", "containing", "medium", ",", "then", "immunoblotted", "using", "antibodies", "against", "endogenous", "p", "-", "mTOR", "(", "Ser2448", ")", ",", "total", "mTOR", ",", "p", "-", "p70", "S6K", "(", "Thr389", ")", "and", "total", "p70", "S6K", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "unless", "otherwise", "stated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Immunoblot analysis of endogenous p-mTOR (Ser2448), total mTOR, p-p70 S6K (Thr389) and total p70 S6K in NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells grown in complete media or 5 h serum starvation. p-p70 S6K (Thr389) over total p70 S6K ratios normalized to NHF cells, three independent experiments. B Immunoblot analysis of endogenous p-mTOR (Ser2448), total mTOR , p-p70 S6K (Thr389) and total p70 S6K in WT (Ocrl+/y) and IOB MEFs grown in complete medium or 5 h serum starvation. p-p70 S6K (Thr389) over total p70 S6K ratios normalized to NHF cells, three independent experiments. C Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, ***≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-tailed Student's t-test unless otherwise stated.D NHF and Lowe 1676 cells were grown in complete media, amino-acid (aa)/FBS starved for 5 h, or starved and then recovered in amino-acid/FBS-containing medium, then immunoblotted using antibodies against endogenous p-mTOR (Ser2448), total mTOR, p-p70 S6K (Thr389) and total p70 S6K. Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, ***≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-tailed Student's t-test unless otherwise stated."}
{"words": ["Figure", "3A", "Representative", "images", "of", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "immunostained", "with", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "γ", "-", "tubulin", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", "Quantitative", "analyses", "of", "focused", "microtubule", "arrays", "numbers", "at", "γ", "-", "tubulin", "(", "microtubule", "organizing", "center", "MTOC", ")", "measured", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "n", "=", "3", "cells", "per", "group", ",", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "calculated", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", ".", "C", "WT", "(", "Ocrl", "+", "/", "y", ")", ",", "OCRL", "knockout", "(", "Ocrl", "-", "/", "-", ")", "and", "IOB", "MEFs", "derived", "from", "the", "corresponding", "mice", "were", "costained", "with", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "and", "anti", "-", "γ", "-", "tubulin", "antibodies", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "D", "Quantitative", "analyses", "of", "focused", "microtubule", "arrays", "numbers", "at", "γ", "-", "tubulin", "(", "microtubule", "organizing", "center", "MTOC", ")", "measured", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "C", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "30", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "E", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "calculated", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", ".", "E", "Microtubule", "regrowth", "assay", "was", "performed", "on", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "with", "20", "μM", "nocodazole", "for", "2", "h", "on", "ice", ",", "followed", "by", "rinse", "with", "PBS", ",", "and", "addition", "of", "pre", "-", "warmed", "medium", "to", "induce", "microtubule", "regrowth", ".", "Cells", "were", "then", "immunostained", "with", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "and", "anti", "-", "γ", "-", "tubulin", "antibodies", "at", "the", "indicated", "time", "point", "after", "addition", "of", "pre", "-", "warmed", "medium", ".", "The", "magnified", "view", "shows", "the", "cytoplasmic", "microtubules", "organization", "center", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "F", "Quantitative", "analyses", "of", "focused", "microtubule", "arrays", "numbers", "at", "γ", "-", "tubulin", "(", "microtubule", "organizing", "center", ",", "MTOC", ")", "measured", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "E", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "30", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "D", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "≤", "0", ".", "01", ",", "calculated", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Representative images of NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells immunostained with anti-α-tubulin (red) and anti-γ-tubulin (green) antibodies. Scale bar, 10 μm. B Quantitative analyses of focused microtubule arrays numbers at γ-tubulin (microtubule organizing center MTOC) measured in the experiments shown in A. n = 3 cells per group, three independent experiments. C Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, calculated by two-way ANOVA, multiple comparisons.C WT (Ocrl+/y), OCRL knockout (Ocrl-/-) and IOB MEFs derived from the corresponding mice were costained with anti-α-tubulin and anti- γ-tubulin antibodies. Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm. D Quantitative analyses of focused microtubule arrays numbers at γ-tubulin (microtubule organizing center MTOC) measured in the experiments shown in C. n = 3 per group in which 30 cells were counted per condition per experiment. E Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, calculated by two-way ANOVA, multiple comparisons.E Microtubule regrowth assay was performed on NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells with 20 μM nocodazole for 2 h on ice, followed by rinse with PBS, and addition of pre-warmed medium to induce microtubule regrowth. Cells were then immunostained with anti-α-tubulin and anti-γ-tubulin antibodies at the indicated time point after addition of pre-warmed medium. The magnified view shows the cytoplasmic microtubules organization center. Scale bar, 10 μm. F Quantitative analyses of focused microtubule arrays numbers at γ-tubulin (microtubule organizing center, MTOC) measured in the experiments shown in E. n = 3 per group in which 30 cells were counted per condition per experiment. D Data information: data are presented as mean ± SEM. * ≤ 0.05, ** ≤ 0.01, calculated by two-way ANOVA, multiple comparisons."}
{"words": ["Figure", "4E", "Super", "-", "resolution", "images", "of", "centrosome", "stained", "with", "anti", "-", "CEP164", "(", "red", ",", "labeling", "distal", "appendages", "of", "mother", "centriole", ")", "and", "anti", "-", "OCRL", "(", "blue", ")", "were", "acquired", "using", "Centrin2", "-", "GFP", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "by", "DeltaVision", "OMX", "V4", "BLAZE", "system", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "μm", ".", "F", "Super", "-", "resolution", "images", "of", "centrosome", "stained", "with", "anti", "-", "CNAP1", "(", "red", ",", "labeling", "proximal", "ends", "of", "centriole", ")", "and", "anti", "-", "OCRL", "(", "blue", ")", "were", "acquired", "using", "Centrin2", "-", "GFP", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "by", "DeltaVision", "OMX", "V4", "BLAZE", "system", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "μm", ".", "G", "H", "Representative", "images", "of", "the", "co", "-", "localization", "of", "OCRL", "-", "WT", ",", "GFP", "-", "OCRL", "-", "△", "RhoGAP", "and", "GFP", "-", "OCRL", "-", "△", "ASH", "+", "RhoGAP", "with", "γ", "-", "tubulin", ".", "Insets", ",", "enlargements", "of", "the", "outlined", "areas", ".", "Scale", "bars", ",", "10", " ", "μm", ".", "I", "Quantitative", "analysis", "of", "cells", "with", "and", "without", "centrosomal", "OCRL", "(", "centrosomal", "GFP", "signal", ")", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "10", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "Means", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4E Super-resolution images of centrosome stained with anti-CEP164 (red, labeling distal appendages of mother centriole) and anti-OCRL (blue) were acquired using Centrin2-GFP-RPE-1 cells by DeltaVision OMX V4 BLAZE system. Scale bar, 0.5 μm. F Super-resolution images of centrosome stained with anti-CNAP1 (red, labeling proximal ends of centriole) and anti-OCRL (blue) were acquired using Centrin2-GFP-RPE-1 cells by DeltaVision OMX V4 BLAZE system. Scale bar, 0.5 μm. G H Representative images of the co-localization of OCRL-WT, GFP-OCRL-△RhoGAP and GFP-OCRL-△ASH+RhoGAP with γ-tubulin. Insets, enlargements of the outlined areas. Scale bars, 10 μm. I Quantitative analysis of cells with and without centrosomal OCRL (centrosomal GFP signal) in the experiments shown in A. n = 3 per group in which 10 cells were counted per condition per experiment. Means ±SEM, ****P < 0.0001, n.s., not significant, calculated by two-way ANOVA, multiple comparisons. "}
{"words": ["Figure", "5A", "RPE", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "nontargeting", "control", "siRNA", "or", "OCRL", "siRNA", ",", "were", "left", "for", "48", "h", ",", "then", "subjected", "to", "IF", "microscopy", "to", "visualize", "PI", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "(", "green", ")", ",", "γ", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ",", "DAPI", "staining", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", "Quantitative", "analyses", "of", "centrosomal", "PI", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "50", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "C", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "were", "subjected", "to", "IF", "microscopy", "to", "visualize", "PI", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "(", "green", ")", ",", "gamma", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ",", "DAPI", "staining", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "D", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "PI", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "on", "centrosomes", "in", "C", "was", "measured", ".", "n", "=", "3", "per", "group", "in", "which", "50", "cells", "were", "counted", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "D", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "calculated", "by", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A RPE-1 cells transfected with nontargeting control siRNA or OCRL siRNA, were left for 48 h, then subjected to IF microscopy to visualize PI(4,5)P2 (green), γ-tubulin (red) and nuclei (blue, DAPI staining). Scale bar, 10 μm. B Quantitative analyses of centrosomal PI(4,5)P2 fluorescence intensity in the experiments shown in A. n = 3 per group in which 50 cells were counted per condition per experiment. C Data information: data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, calculated by calculated by two-tailed Student's t-test.C NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells were subjected to IF microscopy to visualize PI(4,5)P2 (green), gamma-tubulin (red) and nuclei (blue, DAPI staining). Scale bar, 10 μm. D The fluorescence intensity of PI (4,5)P2 on centrosomes in C was measured. n = 3 per group in which 50 cells were counted per condition per experiment. D Data information: data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, calculated by calculated by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "6A", "SSX2IP", "interacts", "with", "OCRL", ".", "Plasmids", "carrying", "GFP", "-", "OCRL", "-", "WT", ",", "GFP", "-", "OCRL", "-", "△", "RhoGAP", "and", "GFP", "-", "OCRL", "-", "△", "ASH", "+", "RhoGAP", "were", "transfected", "into", "RPE", "-", "1", "cells", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "GFP", "-", "Trap", ",", "followed", "by", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "D", "NHF", ",", "Lowe", "1676", "and", "Lowe", "3265", "cells", "were", "transfected", "with", "wildtype", "GFP", "-", "SSX2IP", "or", "GFP", "-", "PACT", "-", "SSX2IP", "for", "48", "h", ",", "then", "immunostained", "with", "anti", "-", "β", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "antibody", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "The", "centrosomal", "microtubule", "nucleation", "in", "GFP", "-", "PACT", "-", "SSX2IP", "transfected", "cells", "was", "indicated", "by", "white", "arrowhead", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "F", "Western", "blot", "analysis", "of", "GFP", ",", "endogenous", "phospho", "-", "mTOR", ",", "total", "mTOR", ",", "in", "NHF", "and", "Lowe", "1676", "cells", ".", "NHF", "and", "Lowe", "1676", "cells", "were", "left", "untransfected", ",", "transfected", "with", "GFP", "-", "SSX2IP", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "PACT", "-", "SSX2IP", ",", "then", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A SSX2IP interacts with OCRL. Plasmids carrying GFP-OCRL-WT, GFP-OCRL-△RhoGAP and GFP-OCRL-△ASH+RhoGAP were transfected into RPE-1 cells. Immunoprecipitation was performed with GFP-Trap, followed by blotting with the indicated antibodies.D NHF, Lowe 1676 and Lowe 3265 cells were transfected with wildtype GFP-SSX2IP or GFP-PACT-SSX2IP for 48 h, then immunostained with anti-β-tubulin (red) antibody. Nuclei (blue) were stained with DAPI. The centrosomal microtubule nucleation in GFP-PACT-SSX2IP transfected cells was indicated by white arrowhead. Scale bar, 5 μm.F Western blot analysis of GFP, endogenous phospho-mTOR, total mTOR, in NHF and Lowe 1676 cells. NHF and Lowe 1676 cells were left untransfected, transfected with GFP-SSX2IP-WT or GFP-PACT-SSX2IP, then immunoblotted with indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "2A", "Z", "score", "for", "AUC", "and", "IC50", "of", "37", "different", "drugs", "(", "shown", "along", "the", "horizontal", "axis", ")", "identified", "as", "hits", "in", "13", "of", "17", "samples", "screened", ".", "A", "drug", "hit", "is", "defined", "as", "z", "score", "of", "less", "than", "-", "2", "for", "both", "AUC", "and", "IC50", ".", "Each", "dot", "in", "a", "column", "represents", "a", "sample", "screened", "for", "that", "drug", ".", "The", "size", "of", "the", "dot", "corresponds", "to", "the", "IC50", "z", "score", "for", "that", "sample", "(", "the", "larger", "the", "dot", ",", "the", "smaller", "the", "IC50", ")", ".", "Dots", "below", "the", "black", "horizontal", "line", "represent", "sample", "with", "AUC", "z", "score", "of", "less", "than", "-", "2", ".", "Dots", "are", "color", "coded", "for", "drug", "hit", "types", ".", "All", "color", "dots", "below", "the", "black", "line", "represent", "a", "hit", "for", "the", "corresponding", "drug", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Z score for AUC and IC50 of 37 different drugs (shown along the horizontal axis) identified as hits in 13 of 17 samples screened. A drug hit is defined as z score of less than -2 for both AUC and IC50. Each dot in a column represents a sample screened for that drug. The size of the dot corresponds to the IC50 z score for that sample (the larger the dot, the smaller the IC50). Dots below the black horizontal line represent sample with AUC z score of less than -2. Dots are color coded for drug hit types. All color dots below the black line represent a hit for the corresponding drug."}
{"words": ["Figure", "3Event", "-", "free", "survival", "(", "EFS", ")", "and", "percentage", "of", "human", "CD45", "+", "leukocytes", "in", "peripheral", "blood", "in", "acute", "lymphoblastic", "leukemia", "(", "ALL", ")", "orthotopic", "models", ".", "Event", "-", "free", "survival", "(", "EFS", ")", "and", "percentage", "of", "human", "CD45", "+", "leukocytes", "in", "peripheral", "blood", "in", "acute", "lymphoblastic", "leukemia", "(", "ALL", ")", "orthotopic", "models", ".", "EFS", "and", "tumor", "volume", "in", "non", "-", "CNS", "subcutaneous", "PDX", "models", "which", "demonstrated", "objective", "response", "in", "1", "or", "more", "treatments", ".", "EFS", "and", "tumor", "volume", "in", "non", "-", "CNS", "subcutaneous", "PDX", "models", "which", "demonstrated", "objective", "response", "in", "1", "or", "more", "treatments", ".", "L", "EFS", "in", "a", "CNS", "orthotopic", "model", "in", "which", "drug", "sensitivity", "was", "observed", ".", "EFS", "is", "time", "of", "inoculation", "of", "tumor", "cells", "to", "event", "(", "defined", "by", "neurologic", "symptoms", "or", "weight", "loss", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Event-free survival (EFS) and percentage of human CD45+ leukocytes in peripheral blood in acute lymphoblastic leukemia (ALL) orthotopic models.Event-free survival (EFS) and percentage of human CD45+ leukocytes in peripheral blood in acute lymphoblastic leukemia (ALL) orthotopic models.EFS and tumor volume in non-CNS subcutaneous PDX models which demonstrated objective response in 1 or more treatments.EFS and tumor volume in non-CNS subcutaneous PDX models which demonstrated objective response in 1 or more treatments.L EFS in a CNS orthotopic model in which drug sensitivity was observed. EFS is time of inoculation of tumor cells to event (defined by neurologic symptoms or weight loss)."}
{"words": ["Figure", "4D", "Treatment", "response", "by", "therapy", "tier", ".", "14", "of", "29", "patients", "with", "molecular", "-", "based", "therapeutic", "options", "received", "the", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D Treatment response by therapy tier. 14 of 29 patients with molecular-based therapeutic options received the treatment."}
{"words": ["Figure", "1Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "Serum", "SUA", "levelMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "body", "weight", "gainMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "fatMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "lean", "massMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "gastrocnemius", "index", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "Gastrointestinal", "muscle", "fiber", "immunofluorescent", "laminin", "stainingMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "frequency", "histogram", "of", "fiber", "cross", "-", "sectional", "area", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. Serum SUA levelMale C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. body weight gainMale C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. fatMale C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. lean massMale C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. gastrocnemius index.Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. Gastrointestinal muscle fiber immunofluorescent laminin stainingMale C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. frequency histogram of fiber cross-sectional area."}
{"words": ["Figure", "2male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "The", "muscle", "grip", "strengthmale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "running", "time", "in", "low", "speedmale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "four", "-", "limb", "handing", "timemale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "running", "time", "in", "high", "speed", ".", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "serum", "concentration", "of", "RBCmale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "HGB", "in", "whole", "bloodmale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "ex", "vivo", "gastrocnemius", "muscle", "forcemale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "ex", "vivo", "gastrocnemius", "muscle", "forcemale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "fatigabilitymale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "glucose", "consumptionmale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "lactate", "production", "were", "tested", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2male C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. The muscle grip strengthmale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. running time in low speedmale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. four-limb handing timemale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. running time in high speed.male C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. serum concentration of RBCmale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. HGB in whole bloodmale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. ex vivo gastrocnemius muscle forcemale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. ex vivo gastrocnemius muscle forcemale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. fatigabilitymale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. glucose consumptionmale C57BL/6J mice fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. lactate production were tested."}
{"words": ["Figure", "3Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "mRNA", "expression", "of", "MyHC", "I", ",", "MyHC", "IIa", ",", "PGC", "-", "1α", ",", "myoglobin", ",", "TnnT1", "MyHC", "IIb", ",", "MyHC", "IIx", "and", "TnnT3", "in", "the", "gastrocnemius", "muscle", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "of", "MyHC", "-", "I", ",", "IIa", "and", "IIb", "protein", "expression", "in", "gastrocnemius", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "%", ",", "1", "%", "SUC", "for", "8", "weeks", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "Laminin", "(", "green", ")", ",", "MyHC", "-", "I", "and", "IIb", "immunofluorescent", "staining", "(", "red", ")", "in", "gastrocnemius", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "(", "C", ")", "represents", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. mRNA expression of MyHC I, MyHC IIa, PGC-1α, myoglobin, TnnT1 MyHC IIb, MyHC IIx and TnnT3 in the gastrocnemius muscle (n=5-6).Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. Immunoblots and quantification of MyHC-I, IIa and IIb protein expression in gastrocnemius (n=3-4).Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0, 0.5%, 1% SUC for 8 weeks. Representative images and quantification of Laminin (green), MyHC-I and IIb immunofluorescent staining (red) in gastrocnemius (n=3). Scale bar in (C) represents 100 µm."}
{"words": ["Figure", "4Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "O2", "consumption", "(", "VO2", ")", "and", "respiratory", "exchange", "ratio", "(", "RER", ")", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Serum", "concentration", "of", "(", "E", ")", "NEFA", "in", "whole", "blood", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "enzymes", "activity", "of", "(", "F", ")", "SDH", ",", "(", "G", ")", "HK", ",", "and", "(", "H", ")", "LDH", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "of", "of", "p", "-", "AMPK", "，", "PGC", "-", "1α", "and", "myoglobin", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Quantification", "of", "mitochondrial", "and", "electron", "transport", "chain", "(", "ETC", ")", "related", "genes", "expression", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "and1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "OCRs", "were", "measured", "under", "basal", "condition", "in", "gastrocnemius", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. The O2 consumption (VO2) and respiratory exchange ratio (RER)Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. Serum concentration of (E) NEFA in whole blood.Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. The enzymes activity of (F) SDH, (G) HK, and (H) LDH in gastrocnemius.Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. Immunoblots and quantification of of p-AMPK，PGC-1α and myoglobin in gastrocnemius.Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. Quantification of mitochondrial and electron transport chain (ETC) related genes expression in gastrocnemius.Male C57BL/6J mice were fed with chow diet supplemented with 0 and1% SUC for 6 weeks. OCRs were measured under basal condition in gastrocnemius."}
{"words": ["Figure", "5C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "Representative", "images", "of", "MyHC", "-", "I", "and", "IIb", "immunofluorescent", "staining", "(", "green", ")", "in", "C2C12", "cells", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "quantification", "of", "MyHC", "-", "I", "and", "IIb", "immunofluorescent", "staining", "(", "green", ")", "in", "C2C12", "cells", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "The", "enzymes", "activity", "of", "(", "C", ")", "SDH", ",", "(", "D", ")", "LDHC2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "lactate", "production", "in", "C2C12", "cells", ".", "C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "Quantification", "of", "mitochondrial", "DNA", "contents", "in", "C2C12", "cells", ".", "C2C12", "cells", "were", "treated", "with", "0", ",", "0", ".", "5", "and", "2", "mM", "SUC", "for", "48", "h", ".", "Mitochondrial", "electron", "microscopy", "showed", "the", "(", "H", ")", "mitochondrial", "density", ",", "(", "I", ")", "mitochondrial", "coverage", ",", "and", "(", "J", ")", "average", "mitochondrial", "area", "in", "C2C12", "cell", ".", "Scale", "bar", "in", "(", "A", ")", "represents", "50", "μm", ",", "scale", "bar", "in", "(", "G", ")", "represents", "0", ".", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. Representative images of MyHC-I and IIb immunofluorescent staining (green) in C2C12 cells (n=16).C2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. quantification of MyHC-I and IIb immunofluorescent staining (green) in C2C12 cells (n=16).C2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. The enzymes activity of (C) SDH, (D) LDHC2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. lactate production in C2C12 cells.C2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. Quantification of mitochondrial DNA contents in C2C12 cells.C2C12 cells were treated with 0, 0.5 and 2 mM SUC for 48 h. Mitochondrial electron microscopy showed the (H) mitochondrial density, (I) mitochondrial coverage, and (J) average mitochondrial area in C2C12 cell. Scale bar in (A) represents 50 μm, scale bar in (G) represents 0.5 μm."}
{"words": ["Figure", "6SUNCR1", "protein", "expression", "in", "the", "gastrocnemius", "from", "sedentary", "or", "post", "-", "running", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "mRNA", "level", "of", "SUNCR1", "in", "gastrocnemius", "and", "soleus", "(", "n", "=", "7", "-", "8", ")", ".", "[", "Ca2", "+", "]", "i", "in", "C2C12", "cells", "treated", "with", "0", "or", "2", "mM", "SUC", "(", "n", "=", "18", "-", "20", ")", ".", "NFAT", "protein", "expression", "in", "nucleus", "and", "cytoplasm", "of", "gastrocnemius", "0", ".", "5", "h", "or", "3", "h", "after", "i", ".", "p", ".", "injection", "of", "15", "mg", "/", "kg", "succinate", "in", "C57BL", "/", "6J", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "SUNCR1", "protein", "expression", "in", "C2C12", "cells", "transfected", "with", "vector", "or", "siSUNCR1", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "[", "Ca2", "+", "]", "i", ",", "in", "vector", "or", "siSUNCR1", "transfected", "C2C12", "cells", "treated", "with", "0", "or", "2", "mM", "SUC", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "enzymes", "activity", "(", "n", "=", "9", "-", "10", ")", "of", "(", "J", ")", "HK", ",", "(", "K", ")", "LDH", ",", "and", "(", "L", ")", "SDH", "in", "vector", "or", "siSUNCR1", "transfected", "C2C12", "cells", "treated", "with", "0", "or", "2", "mM", "SUC", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "MyHC", "-", "I", "and", "IIb", "immunofluorescent", "staining", "(", "green", ")", "in", "C2C12", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "(", "M", ")", "represents", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6SUNCR1 protein expression in the gastrocnemius from sedentary or post-running mice (n=4).The mRNA level of SUNCR1 in gastrocnemius and soleus (n=7-8).[Ca2+]i in C2C12 cells treated with 0 or 2 mM SUC (n=18-20).NFAT protein expression in nucleus and cytoplasm of gastrocnemius 0.5 h or 3 h after i. p. injection of 15 mg/kg succinate in C57BL/6J mice (n=4).SUNCR1 protein expression in C2C12 cells transfected with vector or siSUNCR1 (n=3).[Ca2+]i, in vector or siSUNCR1 transfected C2C12 cells treated with 0 or 2 mM SUC (n=5-6).enzymes activity (n=9-10)of (J) HK, (K) LDH, and (L) SDH in vector or siSUNCR1 transfected C2C12 cells treated with 0 or 2 mM SUC (n=5-6).Representative images and quantification of MyHC-I and IIb immunofluorescent staining (green) in C2C12 cells (n=3). Scale bar in (M) represents 50 μm."}
{"words": ["Figure", "7Male", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "O2", "consumption", "(", "VO2", ")", ",", "RERMale", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "muscle", "grip", "strengthMale", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "four", "-", "limb", "handing", "timeMale", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "low", "speed", "running", "time", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "enzymes", "activity", "of", "(", "H", ")", "HK", ",", "(", "I", ")", "LDH", ",", "and", "(", "J", ")", "SDH", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "of", "MyHC", "-", "I", ",", "IIb", ",", "NFAT", ",", "and", "PGC", "-", "1α", "protein", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "or", "SUNCR1", "KO", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "Laminin", "(", "green", ")", ",", "or", "MyHC", "-", "I", "and", "IIb", "(", "red", ")", "immunofluorescent", "staining", "in", "gastrocnemius", "muscle", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "(", "M", ")", "represents", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Male C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. The O2 consumption (VO2), RERMale C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. muscle grip strengthMale C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. four-limb handing timeMale C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. low speed running time.Male C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. The enzymes activity of (H) HK, (I) LDH, and (J) SDH in gastrocnemius.Male C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. Immunoblots and quantification of MyHC-I, IIb, NFAT, and PGC-1α protein in gastrocnemius.Male C57BL/6J or SUNCR1 KO mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. Representative images and quantification of Laminin (green), or MyHC-I and IIb (red) immunofluorescent staining in gastrocnemius muscle (n=3). Scale bar in (M) represents 100 µm."}
{"words": ["Figure", "8Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "SUNCR1", "protein", "expression", "in", "gastrocnemius", "from", "mice", "transfected", "with", "shSUNCR1", "lentivirus", "or", "LV", "-", "shScrambled", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "running", "time", "in", "low", "speedMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "four", "-", "limb", "handing", "timeMale", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "muscle", "grip", "strength", "of", "both", "control", "and", "gastrocnemius", "-", "specific", "SUNCR1", "knockdown", "mice", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "The", "enzymes", "activity", "of", "(", "F", ")", "HK", ",", "(", "G", ")", "LDH", ",", "(", "H", ")", "SDH", "in", "gastrocnemius", ".", "Male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "injected", "with", "LV", "-", "shScrambled", "or", "shSUNCR1", "lentivirus", "specifically", "into", "the", "gastrocnemius", "at", "6", "weeks", "of", "age", ".", "After", "two", "weeks", "of", "recovery", ",", "mice", "were", "fed", "with", "chow", "diet", "supplemented", "with", "0", "or", "1", "%", "SUC", "for", "6", "weeks", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "of", "MyHC", "-", "I", ",", "IIb", ",", "NFAT", ",", "and", "PGC", "-", "1α", "protein", "in", "gastrocnemius", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Male C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. SUNCR1 protein expression in gastrocnemius from mice transfected with shSUNCR1 lentivirus or LV-shScrambled (n=3).Male C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. The running time in low speedMale C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. four-limb handing timeMale C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. muscle grip strength of both control and gastrocnemius-specific SUNCR1 knockdown mice.Male C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. The enzymes activity of (F) HK, (G) LDH, (H) SDH in gastrocnemius.Male C57BL/6J mice were injected with LV-shScrambled or shSUNCR1 lentivirus specifically into the gastrocnemius at 6 weeks of age. After two weeks of recovery, mice were fed with chow diet supplemented with 0 or 1% SUC for 6 weeks. Immunoblots and quantification of MyHC-I, IIb, NFAT, and PGC-1α protein in gastrocnemius (n=3)."}
{"words": ["Figure", "1C", "Western", "blots", "of", "total", "protein", "of", "CHO", "cells", "transfected", "with", "ApCatSper", "2", "or", "3", ",", "non", "‐", "transfected", "control", "cells", "(", "‐", ")", ",", "and", "A", ".", "punctulata", "sperm", "(", "Sp", ")", ".", "The", "Western", "blots", "were", "probed", "with", "anti", "‐", "HA", ",", "anti", "‐", "ApCatSper", "2", ",", "or", "anti", "‐", "ApCatSper", "3", "antibodies", ".", "Arrows", "indicate", "bands", "representing", "ApCatSper", "2", "and", "3", ".", "D", "Immunocytochemistry", "analysis", "of", "sperm", "stained", "with", "anti", "‐", "ApCatSper", "3", ",", "anti", "‐", "GC", ",", "or", "anti", "‐", "CNGK", "antibodies", ";", "superposition", "of", "images", "obtained", "by", "fluorescence", "microscopy", "and", "bright", "‐", "field", "light", "microscopy", ";", "scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "The", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "E", "Western", "blot", "analysis", "of", "co", "‐", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "of", "A", ".", "punctulata", "sperm", "proteins", ".", "The", "input", "(", "I", ")", ",", "flow", "through", "(", "FT", ")", ",", "washes", "(", "W1", "‐", "5", ")", ",", "and", "the", "eluate", "(", "E", ")", "of", "the", "IP", "using", "the", "anti", "‐", "ApCatSper", "2", "antibody", "were", "probed", "with", "the", "anti", "‐", "ApCatSper", "3", "antibody", "(", "upper", "panel", ")", "and", "vice", "versa", "(", "lower", "panel", ")", ".", "ApCatSper", "3", "and", "ApCatSper", "2", "were", "co", "‐", "immunoprecipitated", "with", "the", "anti", "‐", "ApCatSper", "2", "(", "upper", "panel", ")", "and", "anti", "‐", "ApCatSper", "3", "antibody", "(", "lower", "panel", ")", ",", "respectively", ".", "F", "Analysis", "by", "mass", "spectrometry", "of", "immunoprecipitated", "proteins", ".", "ApCatSper", "1", "‐", "4", ",", "β", ",", "γ", ",", "and", "δ", "were", "identified", "in", "the", "immunoprecipitates", "obtained", "with", "both", "the", "anti", "‐", "ApCatSper", "2", "and", "anti", "‐", "ApCatSper", "3", "antibodies", ".", "The", "number", "of", "tryptic", "peptides", "identified", "and", "the", "respective", "sequence", "coverage", "are", "given", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Western blots of total protein of CHO cells transfected with ApCatSper 2 or 3, non‐transfected control cells (‐), and A. punctulata sperm (Sp). The Western blots were probed with anti‐HA, anti‐ApCatSper 2, or anti‐ApCatSper 3 antibodies. Arrows indicate bands representing ApCatSper 2 and 3.D Immunocytochemistry analysis of sperm stained with anti‐ApCatSper 3, anti‐GC, or anti‐CNGK antibodies; superposition of images obtained by fluorescence microscopy and bright‐field light microscopy; scale bar = 10 μm. The DNA was stained with DAPI (blue).E Western blot analysis of co‐immunoprecipitation (IP) of A. punctulata sperm proteins. The input (I), flow through (FT), washes (W1‐5), and the eluate (E) of the IP using the anti‐ApCatSper 2 antibody were probed with the anti‐ApCatSper 3 antibody (upper panel) and vice versa (lower panel). ApCatSper 3 and ApCatSper 2 were co‐immunoprecipitated with the anti‐ApCatSper 2 (upper panel) and anti‐ApCatSper 3 antibody (lower panel), respectively.F Analysis by mass spectrometry of immunoprecipitated proteins. ApCatSper 1‐4, β, γ, and δ were identified in the immunoprecipitates obtained with both the anti‐ApCatSper 2 and anti‐ApCatSper 3 antibodies. The number of tryptic peptides identified and the respective sequence coverage are given."}
{"words": ["Figure", "2A", "Alkaline", "‐", "evoked", "Ca2", "+", "signals", "in", "sperm", "mixed", "with", "NH4Cl", ";", "sperm", "were", "loaded", "with", "the", "Ca2", "+", "indicator", "Fluo", "‐", "4", ".", "ΔF", "/", "F", "(", "%", ")", "indicates", "the", "change", "in", "Fluo", "‐", "4", "fluorescence", "(", "ΔF", ")", "with", "respect", "to", "the", "basal", "fluorescence", "(", "F", ",", "mean", "of", "the", "first", "3", "-", "5", "data", "points", ")", ".", "B", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "mixing", "of", "sperm", "simultaneously", "with", "NH4Cl", "(", "30", "mM", ")", "and", "the", "CatSper", "inhibitor", "MDL12330A", ".", "C", "Dose", "-", "response", "relation", "of", "inhibition", "of", "the", "Ca2", "+", "signals", "shown", "in", "panel", "(", "B", ")", ",", "Ki", "=", "20", "μM", ",", "amplitudes", "were", "determined", "at", "t", "=", "4", "s", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Alkaline‐evoked Ca2+ signals in sperm mixed with NH4Cl; sperm were loaded with the Ca2+ indicator Fluo‐4. ΔF/F (%) indicates the change in Fluo‐4 fluorescence (ΔF) with respect to the basal fluorescence (F, mean of the first 3-5 data points).B Ca2+ signals evoked by mixing of sperm simultaneously with NH4Cl (30 mM) and the CatSper inhibitor MDL12330A.C Dose-response relation of inhibition of the Ca2+ signals shown in panel (B), Ki = 20 μM, amplitudes were determined at t = 4 s."}
{"words": ["Figure", "3A", "Changes", "in", "pHi", "evoked", "by", "mixing", "with", "pHi", "‐", "clamp", "solutions", "(", "see", "explanation", "in", "the", "text", ")", ";", "sperm", "were", "loaded", "with", "the", "pHi", "indicator", "BCECF", ".", "ΔR", "/", "R", "(", "%", ")", "indicates", "the", "change", "in", "the", "BCECF", "fluorescence", "emission", "ratio", "(", "ΔR", "=", "F494", "/", "F540", ")", "with", "respect", "to", "the", "basal", "ratio", "(", "R", ",", "mean", "of", "the", "first", "3", "-", "5", "data", "points", ")", ".", "B", "Steady", "‐", "state", "change", "(", "at", "t", "=", "14", "s", ")", "of", "BCECF", "fluorescence", "for", "the", "pHi", "signals", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "intercept", "of", "the", "fitted", "straight", "line", "with", "the", "x", "‐", "axis", "yields", "the", "resting", "pHi", ";", "the", "slope", "of", "the", "straight", "line", "yields", "the", "ΔR", "/", "R", "(", "%", ")", "×", "ΔpH", "−", "1", ".", "Inset", ":", "calibrated", "changes", "in", "pHi", "evoked", "by", "various", "pHi", "‐", "clamp", "solutions", ".", "C", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "mixing", "of", "sperm", "with", "pHi", "‐", "clamp", "solutions", ".", "D", "Dose", "-", "response", "relation", "for", "the", "Ca2", "+", "signals", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "E", "Calibrated", "pHi", "increase", "(", "red", ")", "and", "respective", "Ca2", "+", "response", "(", "black", ")", "evoked", "by", "mixing", "of", "sperm", "with", "a", "pHi", "7", ".", "6", "‐", "clamp", "solution", ";", "depicted", "are", ",", "on", "an", "extended", "time", "scale", ",", "the", "first", "500", "ms", "of", "the", "respective", "pHi", "increase", "and", "Ca2", "+", "signal", "shown", "in", "(", "B", ",", "inset", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "respectively", ".", "The", "threshold", "pHi", "for", "CatSper", "activation", "was", "deduced", "from", "the", "latency", "of", "the", "Ca2", "+", "signal", ".", "F", "Threshold", "pHi", "and", "latency", "of", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "various", "pHi", "‐", "clamp", "solutions", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "≥", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Changes in pHi evoked by mixing with pHi‐clamp solutions (see explanation in the text); sperm were loaded with the pHi indicator BCECF. ΔR/R (%) indicates the change in the BCECF fluorescence emission ratio (ΔR = F494/F540) with respect to the basal ratio (R, mean of the first 3-5 data points).B Steady‐state change (at t = 14 s) of BCECF fluorescence for the pHi signals shown in (A). The intercept of the fitted straight line with the x‐axis yields the resting pHi; the slope of the straight line yields the ΔR/R (%) × ΔpH−1. Inset: calibrated changes in pHi evoked by various pHi‐clamp solutions.C Ca2+ signals evoked by mixing of sperm with pHi‐clamp solutions.D Dose-response relation for the Ca2+ signals shown in (C).E Calibrated pHi increase (red) and respective Ca2+ response (black) evoked by mixing of sperm with a pHi 7.6‐clamp solution; depicted are, on an extended time scale, the first 500 ms of the respective pHi increase and Ca2+ signal shown in (B, inset) and (C), respectively. The threshold pHi for CatSper activation was deduced from the latency of the Ca2+ signal.F Threshold pHi and latency of Ca2+ signals evoked by various pHi‐clamp solutions (mean ± SD; n ≥ 3)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Depolarization", "‐", "evoked", "Ca2", "+", "signals", "in", "sperm", "mixed", "with", "ASW", "containing", "high", "KCl", "concentrations", ".", "B", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "mixing", "of", "sperm", "with", "80", "mM", "KCl", "and", "the", "CatSper", "inhibitor", "MDL12330A", ".", "C", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "mixing", "of", "sperm", "with", "160", "mM", "KCl", "and", "MDL12330A", ".", "D", "Dose", "-", "response", "relation", "for", "the", "Ca2", "+", "signals", "shown", "in", "(", "B", ",", "C", ")", "at", "t", "=", "1", "-", "2", "s", ".", "E", "Threshold", "pHi", "for", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "pHi", "‐", "clamp", "solutions", "in", "sperm", "bathed", "in", "ASW", "containing", "low", "(", "3", "mM", ")", ",", "high", "(", "191", "mM", ")", ",", "and", "normal", "(", "9", "mM", ")", "KCl", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "≥", "3", ")", ";", "data", "for", "9", "mM", "KCl", "are", "from", "Fig", "F", ".", "F", "Resting", "pHi", "and", "resting", "Vm", "in", "sperm", "bathed", "in", "ASW", "containing", "low", "(", "3", "mM", ")", ",", "high", "(", "191", "mM", ")", ",", "and", "normal", "(", "9", "mM", ")", "KCl", "(", "black", ")", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "≥", "3", ")", ".", "Mean", "threshold", "pHi", "for", "CatSper", "activation", "at", "different", "membrane", "potentials", "(", "red", ")", ";", "mean", "threshold", "pHi", "was", "derived", "from", "data", "shown", "in", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Depolarization‐evoked Ca2+ signals in sperm mixed with ASW containing high KCl concentrations.B Ca2+ signals evoked by mixing of sperm with 80 mM KCl and the CatSper inhibitor MDL12330A.C Ca2+ signals evoked by mixing of sperm with 160 mM KCl and MDL12330A.D Dose-response relation for the Ca2+ signals shown in (B, C) at t = 1-2 s.E Threshold pHi for Ca2+ signals evoked by pHi‐clamp solutions in sperm bathed in ASW containing low (3 mM), high (191 mM), and normal (9 mM) KCl (mean ± SD; n ≥ 3); data for 9 mM KCl are from Fig F.F Resting pHi and resting Vm in sperm bathed in ASW containing low (3 mM), high (191 mM), and normal (9 mM) KCl (black) (mean ± SD; n ≥ 3). Mean threshold pHi for CatSper activation at different membrane potentials (red); mean threshold pHi was derived from data shown in (E)."}
{"words": ["Figure", "5A", "Ca2", "+", "signals", "in", "sperm", "evoked", "by", "photorelease", "(", "at", "t", "=", "0", ")", "of", "resact", "from", "caged", "resact", "in", "the", "presence", "of", "the", "CatSper", "inhibitor", "MDL12330A", ".", "B", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "intracellular", "photorelease", "(", "at", "t", "=", "0", ")", "of", "cGMP", "in", "sperm", "loaded", "with", "caged", "cGMP", "in", "the", "presence", "of", "the", "CatSper", "inhibitor", "MDL12330A", ".", "C", "Normalized", "dose", "-", "response", "relation", "for", "inhibition", "of", "the", "resact", "‐", "and", "cGMP", "‐", "induced", "Ca2", "+", "signals", "shown", "in", "(", "A", ",", "B", ")", "(", "Ki", "=", "6", ".", "2", "and", "4", ".", "3", "μM", ",", "respectively", ")", ".", "D", "Normalized", "dose", "‐", "response", "relation", "for", "inhibition", "of", "the", "resact", "‐", "and", "cGMP", "‐", "induced", "Ca2", "+", "signals", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S4", "by", "the", "CatSper", "inhibitor", "mibefradil", "(", "Ki", "=", "7", ".", "7", "and", "20", ".", "9", "μM", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Ca2+ signals in sperm evoked by photorelease (at t = 0) of resact from caged resact in the presence of the CatSper inhibitor MDL12330A.B Ca2+ signals evoked by intracellular photorelease (at t = 0) of cGMP in sperm loaded with caged cGMP in the presence of the CatSper inhibitor MDL12330A.C Normalized dose-response relation for inhibition of the resact‐ and cGMP‐induced Ca2+ signals shown in (A, B) (Ki = 6.2 and 4.3 μM, respectively).D Normalized dose‐response relation for inhibition of the resact‐ and cGMP‐induced Ca2+ signals shown in Supplementary Fig S4 by the CatSper inhibitor mibefradil (Ki = 7.7 and 20.9 μM, respectively)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Calibrated", "Vm", "(", "left", ")", "and", "pHi", "(", "right", ")", "changes", "and", "Ca2", "+", "signals", "(", "middle", ")", "evoked", "by", "resact", ".", "B", "Normalized", "Vm", ",", "pHi", ",", "and", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "10", "pM", "resact", ";", "the", "first", "600", "ms", "after", "mixing", "are", "shown", ".", "The", "hyperpolarization", "precedes", "the", "pHi", "increase", ",", "whereas", "the", "pHi", "increase", "precedes", "the", "Ca2", "+", "increase", ".", "C", "Latency", "of", "the", "Vm", ",", "the", "pHi", ",", "and", "the", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "various", "resact", "concentrations", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "D", "Normalized", "pHi", "and", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "photorelease", "of", "cGMP", "in", "sperm", "loaded", "with", "caged", "cGMP", ".", "E", "Calibrated", "Vm", "and", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "1", "nM", "resact", ";", "the", "threshold", "voltage", "(", "Vthr", ")", "for", "the", "Ca2", "+", "influx", "was", "deduced", "from", "the", "latency", "of", "the", "Ca2", "+", "signal", ".", "F", "Calibrated", "pHi", "and", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "1", "nM", "resact", ";", "the", "threshold", "pHi", "(", "pHthr", ")", "at", "which", "the", "Ca2", "+", "influx", "commences", "was", "deduced", "from", "the", "latency", "of", "the", "Ca2", "+", "signal", ".", "G", "Linear", "relationship", "between", "pHthr", "and", "Vthr", "for", "activation", "of", "Ca2", "+", "influx", "by", "various", "resact", "concentrations", "(", "data", "derived", "from", "Supplementary", "Fig", "S6", ";", "mean", "±", "SD", ";", "n", "≥", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Calibrated Vm (left) and pHi (right) changes and Ca2+ signals (middle) evoked by resact.B Normalized Vm, pHi, and Ca2+ signals evoked by 10 pM resact; the first 600 ms after mixing are shown. The hyperpolarization precedes the pHi increase, whereas the pHi increase precedes the Ca2+ increase.C Latency of the Vm, the pHi, and the Ca2+ signals evoked by various resact concentrations (mean ± SD; n = 3).D Normalized pHi and Ca2+ signals evoked by photorelease of cGMP in sperm loaded with caged cGMP.E Calibrated Vm and Ca2+ signals evoked by 1 nM resact; the threshold voltage (Vthr) for the Ca2+ influx was deduced from the latency of the Ca2+ signal.F Calibrated pHi and Ca2+ signals evoked by 1 nM resact; the threshold pHi (pHthr) at which the Ca2+ influx commences was deduced from the latency of the Ca2+ signal.G Linear relationship between pHthr and Vthr for activation of Ca2+ influx by various resact concentrations (data derived from Supplementary Fig S6; mean ± SD; n ≥ 3)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Dark", "‐", "field", "light", "microscopy", "images", "of", "a", "sperm", "suspension", "before", "(", "top", ")", "and", "after", "(", "bottom", ")", "photorelease", "of", "a", "resact", "gradient", "(", "middle", ")", "in", "the", "absence", "(", "control", ";", "left", ")", "or", "presence", "of", "the", "CatSper", "inhibitor", "MDL12330A", "(", "10", "μM", ";", "right", ")", ".", "MDL12330A", "abolishes", "resact", "‐", "induced", "sperm", "accumulation", ".", "B", "Relative", "change", "of", "the", "sperm", "dispersion", "in", "the", "field", "of", "view", "evoked", "by", "photorelease", "of", "resact", "(", "t", "=", "0", ",", "flash", ")", "in", "the", "absence", "(", "control", ";", "blue", ")", "or", "presence", "of", "MDL12330A", "(", "red", ")", ";", "a", "decrease", "in", "dispersion", "indicates", "sperm", "accumulation", "in", "the", "irradiated", "area", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Dark‐field light microscopy images of a sperm suspension before (top) and after (bottom) photorelease of a resact gradient (middle) in the absence (control; left) or presence of the CatSper inhibitor MDL12330A (10 μM; right). MDL12330A abolishes resact‐induced sperm accumulation.B Relative change of the sperm dispersion in the field of view evoked by photorelease of resact (t = 0, flash) in the absence (control; blue) or presence of MDL12330A (red); a decrease in dispersion indicates sperm accumulation in the irradiated area (mean ± SD; n = 4)."}
{"words": ["Figure", "8C", "Changes", "in", "pHi", "evoked", "by", "repetitive", "release", "(", "arrows", ")", "of", "cGMP", "from", "caged", "cGMP", ".", "The", "first", "UV", "flash", "was", "delivered", "at", "t", "=", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C Changes in pHi evoked by repetitive release (arrows) of cGMP from caged cGMP. The first UV flash was delivered at t = 0."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Bcl", "-", "xL", "was", "cotransfected", "into", "HeLa", "cells", "with", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Beclin", "1", "-", "Flag", ",", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "HA", "-", "Bim", "(", "EL", ")", ",", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "HA", "-", "Puma", ",", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "HA", "-", "Noxa", ",", "or", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "Bad", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "proteins", "were", "detected", "with", "anti", "-", "Bcl", "-", "xL", ",", "anti", "-", "HA", ",", "or", "anti", "-", "Bad", ",", "anti", "-", "Flag", "(", "Rabbit", ")", ".", "(", "B", ")", "HA", "-", "Bim", "(", "wild", "-", "type", ")", "was", "cotransfected", "into", "Bax", "/", "Bak", "double", "-", "knockout", "(", "DKO", ")", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "with", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", "or", "Beclin", "1", "-", "Flag", ".", "Immunoprecipitations", "were", "performed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "C", ")", "Beclin", "1", "-", "Flag", "was", "cotransfected", "into", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "MEFs", "with", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", "or", "HA", "-", "Bim", "(", "wild", "-", "type", ")", ".", "Anti", "-", "HA", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "∗", ",", "antibody", "heavy", "chain", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "GFP", "antibody", "(", "negative", "control", ")", "and", "anti", "-", "Bim", "antibody", "immunoprecipitation", ".", "Proteins", "were", "detected", "with", "anti", "-", "Beclin", "1", "and", "anti", "-", "Bim", ".", "∗", "∗", ",", "antibody", "heavy", "chain", ";", "∗", ",", "antibody", "light", "chain", ".", "(", "E", ")", "Bcl", "-", "xL", "was", "cotransfected", "into", "HeLa", "cells", "with", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "wild", "-", "type", "HA", "-", "Bim", "(", "EL", ")", ",", "or", "HA", "-", "Bim", "L152E", "F159E", "[", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "]", ".", "Anti", "-", "Bim", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "∗", ",", "antibody", "light", "chain", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", ",", "wild", "-", "type", "HA", "-", "Bim", ",", "or", "HA", "-", "BimEE", ".", "Lysates", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "HeLa", "cells", "treated", "with", "staurosporine", "(", "STS", ")", "for", "5", "hr", "were", "a", "positive", "control", ".", "Note", "that", "wild", "-", "type", "Bim", "causes", "apoptosis", ",", "which", "reduces", "its", "levels", "compared", "to", "BimEE", ".", "(", "G", ")", "Vector", ",", "wild", "-", "type", "Bim", "(", "EL", ")", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "L152E", "F159E", "(", "BimEE", ")", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Transfection", "efficiency", "was", ">", "90", "%", ".", "After", "20", "hr", ",", "cell", "viability", "was", "determined", "by", "measurement", "pf", "ATP", "levels", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", "/", "GFP", "(", "3", ":", "1", ")", ",", "wild", "-", "type", "HA", "-", "Bim", "/", "GFP", "(", "3", ":", "1", ")", ",", "or", "HA", "-", "BimEE", "/", "GFP", "(", "3", ":", "1", ")", "(", "to", "ensure", "that", "Bim", "-", "transfected", "cells", "also", "contain", "GFP", ")", ".", "After", "16", "hr", ",", "cells", "were", "stained", "with", "Annexin", "V", "-", "APC", "and", "analyzed", "by", "FACS", ".", "The", "percentage", "of", "APC", "and", "GFP", "double", "-", "positive", "cells", "/", "GFP", "-", "positive", "cells", "are", "shown", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "I", ")", "Bim", "(", "EL", ")", "/", "Bcl", "-", "xL", "were", "cotransfected", "into", "HeLa", "cells", "with", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", "or", "Beclin", "1", "-", "Flag", ";", "Bim", "(", "EL", ")", "-", "EE", "/", "Bcl", "-", "xL", "were", "also", "cotransfected", "into", "HeLa", "cells", "with", "Beclin", "1", "-", "Flag", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "(", "J", ")", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", ",", "BimL", "-", "EE", "(", "L", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", ",", "and", "BimS", "-", "EE", "(", "S", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Bcl-xL was cotransfected into HeLa cells with empty vector (IP negative control), Beclin 1-Flag, Beclin 1-Flag/HA-Bim(EL), Beclin 1-Flag/HA-Puma, Beclin 1-Flag/HA-Noxa, or Beclin 1-Flag/Bad. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation, and proteins were detected with anti-Bcl-xL, anti-HA, or anti-Bad, anti-Flag (Rabbit).(B) HA-Bim (wild-type) was cotransfected into Bax/Bak double-knockout (DKO) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with empty vector (IP negative control) or Beclin 1-Flag. Immunoprecipitations were performed as in (A).(C) Beclin 1-Flag was cotransfected into Bax/Bak DKO MEFs with empty vector (IP negative control) or HA-Bim (wild-type). Anti-HA was used for immunoprecipitation. ∗, antibody heavy chain.(D) HeLa cell lysates were subjected to GFP antibody (negative control) and anti-Bim antibody immunoprecipitation. Proteins were detected with anti-Beclin 1 and anti-Bim. ∗∗, antibody heavy chain; ∗, antibody light chain.(E) Bcl-xL was cotransfected into HeLa cells with empty vector (IP negative control), wild-type HA-Bim(EL), or HA-Bim L152E F159E [Bim(EL)EE]. Anti-Bim was used for immunoprecipitation. ∗, antibody light chain.(F) HeLa cells were transfected with vector, wild-type HA-Bim, or HA-BimEE. Lysates were probed with the indicated antibodies. HeLa cells treated with staurosporine (STS) for 5 hr were a positive control. Note that wild-type Bim causes apoptosis, which reduces its levels compared to BimEE.(G) Vector, wild-type Bim(EL), or Bim(EL) L152E F159E (BimEE) was transfected into HeLa cells. Transfection efficiency was >90%. After 20 hr, cell viability was determined by measurement pf ATP levels. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(H) HeLa cells were transfected with vector/GFP (3:1), wild-type HA-Bim/GFP (3:1), or HA-BimEE/GFP (3:1) (to ensure that Bim-transfected cells also contain GFP). After 16 hr, cells were stained with Annexin V-APC and analyzed by FACS. The percentage of APC and GFP double-positive cells/GFP-positive cells are shown. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(I) Bim(EL)/Bcl-xL were cotransfected into HeLa cells with empty vector (IP negative control) or Beclin 1-Flag; Bim(EL)-EE/Bcl-xL were also cotransfected into HeLa cells with Beclin 1-Flag. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation. Data are shown as mean ± SD. NS, not significant.(J) BimEL-EE (EL)/vector (IP negative control), BimEL-EE (EL)/Beclin 1-Flag, BimL-EE (L)/Beclin 1-Flag, and BimS-EE (S)/Beclin 1-Flag were transfected into HeLa cells. Anti-Flag was used for immunoprecipitation. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001; NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Bim", "−", "/", "−", "and", "Bim", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "cultured", "in", "6", "-", "well", "dishes", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ")", "for", "4", "hr", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "LC3", "-", "II", "/", "tubulin", "in", "wild", "-", "type", "control", "MEFs", "is", "set", "as", "1", ".", "The", "relative", "value", "of", "LC3", "-", "II", "/", "tubulin", "in", "Bim", "-", "knockout", "MEFs", "is", "shown", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "and", "Bim", "siRNA", ".", "After", "48", "hr", ",", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "Baf", "for", "4", "hr", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "and", "analyzed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "Bim", "−", "/", "−", "and", "Bim", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "(", "pMKO", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", "or", "pMKO", "-", "BimshRNA", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "to", "ensure", "that", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "cells", "also", "contain", "BimshRNA", "or", "control", "plasmid", ",", "the", "ratio", "of", "pMKO", "or", "pMKO", "-", "BimshRNA", "/", "GFP", "-", "LC3", "is", "3", ":", "1", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "(", "pMKO", ")", "or", "pMKO", "-", "BimshRNA", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "(", "pMKO", ")", "/", "GFP", "-", "PX", "or", "pMKO", "-", "BimshRNA", "/", "GFP", "-", "PX", "(", "3", ":", "1", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "G", ")", "DFCP1", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "Bim", "siRNA", ".", "The", "numbers", "of", "GFP", "puncta", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Images", "represent", "DFCP1", "-", "GFP", "vesicles", "in", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "and", "Bim", "siRNA", ".", "Arrows", "mark", "DFCP1", "-", "GFP", "puncta", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "Bim", "siRNA", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "I", ")", "Bim", "(", "EL", ")", "/", "control", "siRNA", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "/", "Bim", "siRNA", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "control", "siRNA", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Bim", "siRNA", ",", "vector", "/", "control", "siRNA", ",", "and", "vector", "/", "Bim", "siRNA", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "J", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "K", ")", "Bax", "/", "Bak", "DKO", "MEFs", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "wild", "-", "type", "Bim", "(", "EL", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "GFP", "-", "LC3", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "L", ")", "Two", "independent", "control", "vector", "(", "pcDNA3", ")", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "stably", "expressing", "HeLa", "cell", "clones", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "respectively", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "M", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "/", "GFP", "-", "PX", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "GFP", "-", "PX", "(", "3", ":", "1", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Fluorescent", "microscope", "images", "show", "GFP", "-", "PX", "vesicles", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Bim−/− and Bim+/+ MEFs were cultured in 6-well dishes. Cells were treated with vehicle or Bafilomycin A1 (Baf) for 4 hr. Blots were probed with the indicated antibodies. LC3-II/tubulin in wild-type control MEFs is set as 1. The relative value of LC3-II/tubulin in Bim-knockout MEFs is shown (n = 5). Data are mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(B) HeLa cells were transfected with control siRNA and Bim siRNA. After 48 hr, cells were treated with vehicle or Baf for 4 hr. Blots were probed with the indicated antibodies and analyzed as described in (A). ∗∗∗p < 0.001.(C) Bim−/− and Bim+/+ MEFs were transfected with GFP-LC3. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(D) HeLa cells were transfected with control plasmid (pMKO)/GFP-LC3 or pMKO-BimshRNA/GFP-LC3 (to ensure that GFP-LC3-positive cells also contain BimshRNA or control plasmid, the ratio of pMKO or pMKO-BimshRNA/GFP-LC3 is 3:1). The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(E) HeLa cells were transfected with control plasmid (pMKO) or pMKO-BimshRNA. Blots were probed with the indicated antibodies. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(F) HeLa cells were transfected with control plasmid (pMKO)/GFP-PX or pMKO-BimshRNA/GFP-PX (3:1). The percentages of cells with GFP-vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(G) DFCP1-GFP cells were transfected with control siRNA or Bim siRNA. The numbers of GFP puncta were assessed. Data are shown as mean ± SD.∗p < 0.05.Images represent DFCP1-GFP vesicles in cells transfected with control siRNA and Bim siRNA. Arrows mark DFCP1-GFP puncta.(H) HeLa cells were treated with control siRNA or Bim siRNA. Blots were probed with the indicated antibodies. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(I) Bim(EL)/control siRNA, Bim(EL)/Bim siRNA, Bim(EL)EE/control siRNA, Bim(EL)EE/Bim siRNA, vector/control siRNA, and vector/Bim siRNA were transfected into HeLa cells. Blots were probed with the indicated antibodies. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(J) HeLa cells were transfected with control plasmid or Bim(EL)EE. Blots were probed with the indicated antibodies. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(K) Bax/Bak DKO MEFs were transfected with control plasmid /GFP-LC3, wild-type Bim(EL)/GFP-LC3 (3:1), or Bim (EL) EE/GFP-LC3. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(L) Two independent control vector (pcDNA3) or Bim(EL)EE stably expressing HeLa cell clones were transfected with GFP-LC3 respectively. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(M) HeLa cells were transfected with control plasmid/GFP-PX or Bim(EL)EE/GFP-PX (3:1). The percentages of cells with GFP-vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01. Fluorescent microscope images show GFP-PX vesicles."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Lysates", "from", "spleen", "-", "derived", "T", "cells", "of", "wild", "-", "type", "(", "Bim", "+", "/", "+", ")", "and", "Bim", "-", "knockout", "(", "Bim", "−", "/", "−", ")", "mice", "were", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Statistics", "were", "from", "three", "knockout", "and", "control", "mice", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "T", "cells", "from", "Bim", "+", "/", "+", "and", "Bim", "−", "/", "−", "mice", "were", "cultured", "with", "/", "without", "Baf", "for", "4", "hr", "preceding", "harvest", ",", "immunoblotted", ",", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "Spleen", "-", "derived", "T", "cells", "from", "Bim", "+", "/", "+", "or", "Bim", "−", "/", "−", "mice", "were", "stained", "with", "rabbit", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Representative", "confocal", "images", "and", "quantification", "from", "triplicates", "(", "n", "=", "100", "-", "110", ")", "are", "shown", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ")", "Bim", "+", "/", "+", "and", "Bim", "−", "/", "−", "mouse", "liver", "lysates", "were", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", ")", "Bim", "+", "/", "+", "and", "Bim", "−", "/", "−", "mouse", "liver", "lysates", "were", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "RNA", "from", "Bim", "wild", "-", "type", "or", "Bim", "-", "knockout", "mouse", "livers", "was", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "for", "p62", "/", "beta", "-", "actin", "mRNA", ".", "The", "mean", "±", "SD", "from", "three", "mice", "per", "group", "is", "shown", ".", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Lysates from spleen-derived T cells of wild-type (Bim+/+) and Bim-knockout (Bim−/−) mice were immunoblotted and probed with indicated antibodies. Statistics were from three knockout and control mice. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(B) T cells from Bim+/+ and Bim−/− mice were cultured with/without Baf for 4 hr preceding harvest, immunoblotted, and probed with the indicated antibodies.(C) Spleen-derived T cells from Bim+/+ or Bim−/− mice were stained with rabbit anti-LC3 antibody. Representative confocal images and quantification from triplicates (n = 100-110) are shown. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.0001.(D) Bim+/+ and Bim−/− mouse liver lysates were immunoblotted and probed with the indicated antibodies (n = 3). Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(E) Bim+/+ and Bim−/− mouse liver lysates were immunoblotted and probed with the indicated antibodies (n = 3). Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(F) RNA from Bim wild-type or Bim-knockout mouse livers was analyzed by qRT-PCR for p62/beta-actin mRNA. The mean ± SD from three mice per group is shown. NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", ",", "Bim", "siRNA", "+", "control", "siRNA", ",", "control", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", ",", "or", "Bim", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", ".", "Blots", "were", "probed", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", ",", "Bim", "siRNA", "+", "control", "siRNA", ",", "control", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", ",", "or", "Bim", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", ".", "After", "24", "hr", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "PX", "for", "24", "hr", ".", "GFP", "-", "PX", "vesicles", "were", "assessed", "with", "a", "confocal", "microscope", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Arrows", "label", "cells", "with", "increased", "number", "/", "size", "of", "GFP", "-", "PX", "vesicles", ".", "(", "C", ")", "GFP", "-", "mRFP", "-", "LC3", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", ",", "Bim", "siRNA", ",", "or", "Bcl", "-", "2", "siRNA", "and", "then", "analyzed", "with", "Cellomics", "microscope", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "GFP", "-", "mRFP", "-", "LC3", "stable", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", ",", "Bim", "siRNA", "+", "control", "siRNA", ",", "control", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", ",", "or", "Bim", "siRNA", "+", "Beclin", "1", "siRNA", "and", "then", "analyzed", "with", "Cellomics", "microscope", "and", "matching", "confocal", "images", "are", "shown", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cells were treated with control siRNA, Bim siRNA + control siRNA, control siRNA + Beclin 1 siRNA, or Bim siRNA + Beclin 1 siRNA. Blots were probed as indicated. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01.(B) HeLa cells were treated with control siRNA, Bim siRNA + control siRNA, control siRNA + Beclin 1 siRNA, or Bim siRNA + Beclin 1 siRNA. After 24 hr, cells were transfected with GFP-PX for 24 hr. GFP-PX vesicles were assessed with a confocal microscope. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01. Arrows label cells with increased number/size of GFP-PX vesicles.(C) GFP-mRFP-LC3 HeLa cells were treated with control, Bim siRNA, or Bcl-2 siRNA and then analyzed with Cellomics microscope. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(D) GFP-mRFP-LC3 stable HeLa cells were treated with control siRNA, Bim siRNA + control siRNA, control siRNA + Beclin 1 siRNA, or Bim siRNA + Beclin 1 siRNA and then analyzed with Cellomics microscope and matching confocal images are shown. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "empty", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "(", "in", "duplicate", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "cells", "with", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "were", "starved", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", ".", "Anti", "-", "Flag", "antibody", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "blots", "were", "probed", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Panel", "i", ":", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "Bim", "siRNA", ".", "After", "48", "hr", ",", "one", "set", "of", "transfections", "were", "starved", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", ".", "Blots", "were", "probed", "as", "indicated", ".", "LC3", "-", "II", "/", "tubulin", "ratio", "of", "siRNA", "-", "transfected", "cells", "is", "set", "as", "1", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Panel", "ii", ":", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "Bim", "siRNA", ".", "After", "48", "hr", ",", "one", "set", "of", "transfections", "were", "treated", "with", "Baf", "for", "2", "hr", ";", "one", "set", "of", "transfections", "were", "starved", "and", "treated", "with", "Baf", "for", "2", "hr", ".", "Blots", "were", "probed", "as", "indicated", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "Bi", ")", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "transfected", "cells", "were", "starved", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", "and", "then", "fixed", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "(", "D", ")", "BimS", "-", "Beclin", "1", "binding", "is", "not", "sensitive", "to", "HBSS", "starvation", ".", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "(", "two", "replicates", ")", ",", "BimL", "-", "EE", "(", "L", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "(", "two", "replicates", ")", "or", "BimS", "-", "EE", "(", "S", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "(", "two", "replicates", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "of", "EL", "-", "Beclin", "1", "-", "Flag", "transfections", ",", "one", "of", "L", "-", "Beclin", "-", "Flag", "transfections", "and", "one", "of", "S", "-", "Beclin", "1", "-", "Flag", "transfections", "were", "subjected", "to", "2", "hr", "HBSS", "starvation", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "E", ")", "HBSS", "starvation", "increases", "Bim", "T116", "phosphorylation", ".", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "or", "BimEE", "(", "EL", ")", "-", "T116A", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "transfections", "and", "one", "of", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "T116A", "were", "starved", "for", "2", "hr", "in", "HBSS", ".", "Blots", "were", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "Bim", "T116", "phosphorylation", "disables", "Bim", "-", "Beclin", "1", "interaction", ".", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "(", "in", "duplicate", ")", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "T116E", "(", "phospho", "-", "mimic", ",", "designated", "as", "T116E", "here", ")", "/", "Beclin", "-", "Flag", "(", "in", "duplicate", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "transfections", "and", "one", "of", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "T116E", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "transfections", "were", "starved", "for", "2", "hr", "in", "HBSS", "(", "Starv", ")", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "plasmid", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "-", "EE", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "-", "EE", "T116E", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "transfected", "cells", "were", "starved", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", "and", "the", "cells", "were", "then", "fixed", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Bim(EL)EE/empty vector (IP negative control) or Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag (in duplicate) were transfected into HeLa cells. After 20 hr, one set of cells with Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag were starved in HBSS for 2 hr. Anti-Flag antibody (M2) was used for immunoprecipitation, and blots were probed as indicated. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(B) Panel i: HeLa cells were treated with control siRNA or Bim siRNA. After 48 hr, one set of transfections were starved in HBSS for 2 hr. Blots were probed as indicated. LC3-II/tubulin ratio of siRNA-transfected cells is set as 1 (n = 3). Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001; NS, not significant. Panel ii: HeLa cells were treated with control siRNA or Bim siRNA. After 48 hr, one set of transfections were treated with Baf for 2 hr; one set of transfections were starved and treated with Baf for 2 hr. Blots were probed as indicated and analyzed as in (Bi). ∗∗p < 0.01; NS, not significant.(C) HeLa cells were transfected with control plasmid /GFP-LC3 (3:1), or Bim(EL)EE/GFP-LC3 (3:1). After 20 hr, one set of transfected cells were starved in HBSS for 2 hr and then fixed. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01. NS, not significant.(D) BimS-Beclin 1 binding is not sensitive to HBSS starvation. BimEL-EE (EL)/vector (IP negative control), BimEL-EE (EL)/Beclin 1-Flag (two replicates), BimL-EE (L)/Beclin 1-Flag (two replicates) or BimS-EE (S)/Beclin 1-Flag (two replicates) were transfected into HeLa cells. After 20 hr, one of EL-Beclin 1-Flag transfections, one of L-Beclin-Flag transfections and one of S-Beclin 1-Flag transfections were subjected to 2 hr HBSS starvation. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation.(E) HBSS starvation increases Bim T116 phosphorylation. Bim(EL)EE or BimEE(EL)-T116A were transfected into HeLa cells. After 20 hr, one set of Bim(EL)EE transfections and one of Bim(EL)EE-T116A were starved for 2 hr in HBSS. Blots were probed with the indicated antibodies.(F) Bim T116 phosphorylation disables Bim-Beclin 1 interaction. Bim(EL)EE /vector (IP negative control), Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag (in duplicate), or Bim(EL)EE-T116E (phospho-mimic, designated as T116E here)/Beclin-Flag (in duplicate) were transfected into HeLa cells. After 20 hr, one set of Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag transfections and one of Bim(EL)EE-T116E/Beclin 1-Flag transfections were starved for 2 hr in HBSS (Starv). Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation.(G) HeLa cells were transfected with control plasmid /GFP-LC3, Bim(EL)-EE/GFP-LC3 (3:1), or Bim(EL)-EE T116E/GFP-LC3 (3:1). After 20 hr, one set of transfected cells were starved in HBSS for 2 hr and the cells were then fixed. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01; NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Bim", "-", "147", "does", "not", "bind", "to", "Beclin", "1", ".", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "Myc", "-", "BimEL", "-", "1", "-", "147aa", "(", "Myc", "-", "147", ")", ",", "or", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "Myc", "-", "BimEL", "-", "ΔBH3", "(", "Myc", "-", "ΔBH3", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "Rabbit", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "B", ")", "Bim", "-", "147", "is", "competent", "for", "LC8", "binding", ".", "LC8", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "LC8", "/", "Myc", "-", "BimEL", "-", "1", "-", "147aa", "(", "Myc", "-", "147", ")", ",", "or", "LC8", "/", "Myc", "-", "BimEL", "-", "ΔBH3", "(", "Myc", "-", "ΔBH3", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "Rabbit", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "C", ")", "Mutating", "LC8", "binding", "consensus", "sites", "within", "Bim", "disrupts", "the", "Bim", "-", "LC8", "interaction", ".", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Myc", "-", "LC8", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "S109A", ",", "S113A", ",", "T114A", "(", "AAA", ")", "/", "Myc", "-", "LC8", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "T116E", "/", "Myc", "-", "LC8", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "Rabbit", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "Mutating", "LC8", "binding", "consensus", "sites", "within", "Bim", "disrupts", "the", "Bim", "-", "Beclin", "1", "interaction", ".", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", ",", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "S109A", ",", "S113A", ",", "T114A", "(", "AAA", ")", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", ",", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "-", "T116E", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Bim", "-", "S", "does", "not", "bind", "to", "LC8", ".", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "Myc", "-", "LC8", ",", "BimL", "-", "EE", "(", "L", ")", "/", "Myc", "-", "LC8", ",", "or", "BimS", "-", "EE", "(", "S", ")", "/", "Myc", "-", "LC8", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "Rabbit", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "G", ")", "LC8", "enhances", "Bim", "-", "Beclin", "1", "interaction", "in", "vitro", ".", "His", "-", "Bim", ",", "His", "-", "LC8", "and", "GST", "-", "Beclin", "1", "were", "expressed", "in", "BL21", "(", "DE3", ")", "E", ".", "coli", "and", "purified", ".", "Two", "micrograms", "of", "His", "-", "Bim", "was", "combined", "with", "2", "μg", "GST", "without", "or", "with", "1", "μg", "His", "-", "LC8", "(", "as", "controls", ")", ";", "2", "μg", "His", "-", "Bim", "was", "combined", "with", "2", "μg", "GST", "-", "Beclin", "1", "without", "or", "with", "1", "μg", "His", "-", "LC8", ".", "The", "mixtures", "were", "incubated", "in", "buffer", "A", "for", "3", "hr", ".", "Glutathione", "beads", "were", "then", "used", "to", "pull", "down", "GST", "or", "GST", "-", "Beclin", "1", ".", "The", "pulldown", "products", "were", "detected", "with", "anti", "-", "Bim", "and", "anti", "-", "Beclin", "1", ".", "(", "H", ")", "LC8", "siRNA", "knockdown", "reduces", "the", "Bim", "-", "Beclin", "1", "interaction", ".", "Control", "siRNA", "or", "LC8", "siRNA", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "48", "hr", ",", "HA", "-", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "vector", "(", "IP", "negative", "control", ")", "or", "HA", "-", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "was", "transfected", "into", "control", "siRNA", "transfected", "HeLa", "cells", ";", "HA", "-", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "was", "transfected", "into", "LC8", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "Note", "that", "in", "the", "presence", "of", "BimEE", ",", "endogenous", "LC8", "was", "pulled", "down", "by", "Beclin", "1", "when", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Bim-147 does not bind to Beclin 1. Beclin 1-Flag/vector (IP negative control), Beclin 1-Flag/Myc-BimEL-1-147aa (Myc-147), or Beclin 1-Flag/Myc-BimEL-ΔBH3 (Myc-ΔBH3) were transfected into HeLa cells. Anti-Myc (Rabbit) was used for immunoprecipitation.(B) Bim-147 is competent for LC8 binding. LC8/vector (IP negative control), LC8/Myc-BimEL-1-147aa (Myc-147), or LC8/Myc-BimEL-ΔBH3 (Myc-ΔBH3) were transfected into HeLa cells. Anti-Myc (Rabbit) was used for immunoprecipitation.(C) Mutating LC8 binding consensus sites within Bim disrupts the Bim-LC8 interaction. Bim(EL)EE/vector (IP negative control), Bim(EL)EE/Myc-LC8, Bim(EL)EE-S109A, S113A, T114A (AAA)/ Myc-LC8, or Bim(EL)EE-T116E/ Myc-LC8 were transfected into HeLa cells. Anti-Myc (Rabbit) was used for immunoprecipitation. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(D) Mutating LC8 binding consensus sites within Bim disrupts the Bim-Beclin 1 interaction. Bim(EL)EE/vector (IP negative control), Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag, Bim(EL)EE-S109A, S113A, T114A (AAA)/Beclin 1-Flag, or Bim(EL)EE-T116E/Beclin 1-Flag were transfected into HeLa cells. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001.(E) Bim-S does not bind to LC8. BimEL-EE (EL)/vector (IP negative control), BimEL-EE (EL)/Myc-LC8, BimL-EE (L)/Myc-LC8, or BimS-EE (S)/Myc-LC8 were transfected into HeLa cells. Anti-Myc (Rabbit) was used for immunoprecipitation.(G) LC8 enhances Bim-Beclin 1 interaction in vitro. His-Bim, His-LC8 and GST-Beclin 1 were expressed in BL21(DE3) E. coli and purified. Two micrograms of His-Bim was combined with 2 μg GST without or with 1 μg His-LC8 (as controls); 2 μg His-Bim was combined with 2 μg GST-Beclin 1 without or with 1 μg His-LC8. The mixtures were incubated in buffer A for 3 hr. Glutathione beads were then used to pull down GST or GST-Beclin 1. The pulldown products were detected with anti-Bim and anti-Beclin 1.(H) LC8 siRNA knockdown reduces the Bim-Beclin 1 interaction. Control siRNA or LC8 siRNA were transfected into HeLa cells. After 48 hr, HA-Bim(EL)EE/vector (IP negative control) or HA-Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag was transfected into control siRNA transfected HeLa cells; HA-Bim(EL)EE/Beclin 1-Flag was transfected into LC8 siRNA-transfected HeLa cells. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation. Note that in the presence of BimEE, endogenous LC8 was pulled down by Beclin 1 when cells were treated with control siRNA. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", "(", "vec", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "BimL", "-", "EE", "(", "L", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "BimS", "-", "EE", "(", "S", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", ",", "or", "BimEL", "-", "EE", "-", "AAA", "(", "AAA", ")", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Note", "that", "BimEL", "-", "EE", "-", "S109A", ",", "S113A", ",", "T114A", "is", "designated", "as", "BimEL", "-", "EE", "-", "AAA", ".", "(", "B", ")", "Bim", "bridges", "the", "Beclin", "1", "-", "LC8", "interaction", ".", "Dynein", "light", "chain1", "(", "Myc", "-", "LC8", ")", "/", "empty", "vectors", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "empty", "vector", ",", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "BimEL", "-", "EE", "(", "EL", ")", ",", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "BimL", "-", "EE", "(", "L", ")", ",", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "BimS", "-", "EE", "(", "S", ")", ",", "and", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "BimEL", "-", "EE", "-", "S109A", ",", "S113A", ",", "T114A", "(", "AAA", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "C", ")", "Starvation", "reduces", "the", "ability", "of", "Bim", "to", "bridge", "the", "Beclin", "1", "-", "LC8", "interaction", ".", "Myc", "-", "LC8", "/", "empty", "vectors", "(", "IP", "negative", "control", ")", ",", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Myc", "/", "empty", "vector", ",", "or", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "HA", "-", "BimEL", "-", "EE", "(", "HA", "-", "Bim", ")", "(", "two", "replicates", ")", "were", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ".", "After", "20", "hr", ",", "one", "set", "of", "cells", "with", "Myc", "-", "LC8", "/", "Beclin", "1", "-", "Flag", "/", "HA", "-", "HA", "-", "Bim", "was", "starved", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", ".", "Anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "with", "DMEM", "with", "10", "%", "serum", "(", "Control", ")", "or", "starved", "(", "Starve", ")", "in", "HBSS", "for", "2", "hr", ".", "The", "fixed", "cells", "were", "stained", "with", "Beclin", "1", "and", "tubulin", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "White", "boxes", "show", "the", "areas", "where", "Beclin", "1", "is", "enriched", ".", "Yellow", "boxes", "show", "enlarged", "areas", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", "or", "LC8", "siRNA", ".", "After", "24", "hr", ",", "cells", "were", "split", ".", "Vector", "/", "GFP", "-", "LC3", "or", "Bim", "(", "EL", ")", "EE", "/", "GFP", "-", "LC3", "(", "3", ":", "1", ")", "were", "transfected", "into", "the", "control", "siRNA", "-", "transfected", "or", "LC8", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "with", "GFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNA", ",", "Bim", "siRNA", ",", "or", "LC8", "siRNA", "for", "48", "hr", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "in", "37", "°", "C", ",", "4", "%", "PFA", "for", "10", "min", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "Beclin", "1", "and", "tubulin", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "White", "boxes", "/", "triangle", "show", "areas", "where", "Beclin", "1", "is", "enriched", ".", "Yellow", "boxes", "show", "enlarged", "areas", ".", "Colocalizations", "were", "quantified", "from", "images", "in", "12", "-", "15", "cells", "with", "Volocity", "program", "(", "Colocalization", "coefficient", "Mx", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) HeLa cells were transfected with vector (vec) /GFP-LC3, BimEL-EE (EL)/GFP-LC3, BimL-EE (L)/GFP-LC3, BimS-EE (S)/GFP-LC3, or BimEL-EE-AAA (AAA)/GFP-LC3 (3:1). The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001; ∗∗p < 0.01; NS, not significant. Note that BimEL-EE-S109A, S113A, T114A is designated as BimEL-EE-AAA.(B) Bim bridges the Beclin 1-LC8 interaction. Dynein light chain1 (Myc-LC8)/empty vectors (IP negative control), Myc-LC8/Beclin 1-Flag/empty vector, Myc-LC8/Beclin 1-Flag/BimEL-EE (EL), Myc-LC8/Beclin 1-Flag/BimL-EE (L), Myc-LC8/Beclin 1-Flag/BimS-EE (S), and Myc-LC8/Beclin 1-Flag/BimEL-EE-S109A, S113A, T114A (AAA) were transfected into HeLa cells. Anti-Flag (M2) was used for immunoprecipitation.(C) Starvation reduces the ability of Bim to bridge the Beclin 1-LC8 interaction. Myc-LC8/empty vectors (IP negative control), Myc-LC8/Beclin 1-Myc/empty vector, or Myc-LC8/Beclin 1-Flag/HA-BimEL-EE (HA-Bim) (two replicates) were transfected into HeLa cells. After 20 hr, one set of cells with Myc-LC8/Beclin 1-Flag/HA-HA-Bim was starved in HBSS for 2 hr. Anti-Flag (M2) antibody was used for immunoprecipitation.(D) HeLa cells were cultured with DMEM with 10% serum (Control) or starved (Starve) in HBSS for 2 hr. The fixed cells were stained with Beclin 1 and tubulin antibodies and analyzed by confocal microscopy. White boxes show the areas where Beclin 1 is enriched. Yellow boxes show enlarged areas.(E) HeLa cells were treated with control siRNA or LC8 siRNA. After 24 hr, cells were split. Vector/GFP-LC3 or Bim(EL)EE/GFP-LC3 (3:1) were transfected into the control siRNA-transfected or LC8 siRNA-transfected cells. The percentages of cells with GFP-LC3 vesicles were assessed. Data are shown as mean ± SD. ∗∗p < 0.01; NS, not significant.(F) HeLa cells were treated with control siRNA, Bim siRNA, or LC8 siRNA for 48 hr. Cells were then fixed in 37°C, 4% PFA for 10 min. Cells were stained with Beclin 1 and tubulin antibodies and analyzed by confocal microscopy. White boxes/triangle show areas where Beclin 1 is enriched. Yellow boxes show enlarged areas. Colocalizations were quantified from images in 12-15 cells with Volocity program (Colocalization coefficient Mx). Data are shown as mean ± SD. ∗∗∗p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "Figure", "1", ".", "Breast", "cancer", "cells", "derived", "from", "tumor", "-", "draining", "lymph", "nodes", "gain", "aggressive", "malignancy", "(", "A", "and", "B", ")", "Inguinal", "LNs", "were", "harvested", "from", "4T1", "-", "injected", "mice", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "LN", "tissues", "were", "fixed", "and", "paraffin", "-", "embedded", ".", "Immunoflurorescence", "was", "performed", "with", "anti", "-", "GFP", "antibody", "to", "visualize", "GFP", "+", "4T1", "cells", ".", "(", "A", ")", "Confocal", "micrographs", "of", "the", "representative", "field", "of", "the", "LN", "section", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "Figure", "1", ".", "Breast", "cancer", "cells", "derived", "from", "tumor", "-", "draining", "lymph", "nodes", "gain", "aggressive", "malignancy", "(", "A", "and", "B", ")", "Inguinal", "LNs", "were", "harvested", "from", "4T1", "-", "injected", "mice", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "LN", "tissues", "were", "fixed", "and", "paraffin", "-", "embedded", ".", "Immunoflurorescence", "was", "performed", "with", "anti", "-", "GFP", "antibody", "to", "visualize", "GFP", "+", "4T1", "cells", ".", "(", "B", ")", "Histograms", "illustrated", "that", "the", "dynamic", "changes", "of", "GFP", "+", "4T1", "cells", "metastasized", "to", "the", "inguinal", "LN", ".", "Cells", "were", "counted", "in", "whole", "sections", "(", "2", "non", "-", "consecutive", "sections", "per", "LN", "per", "mouse", ")", ".", "Each", "group", "was", "composed", "of", "at", "least", "two", "mice", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", "-", "I", ")", "4T1", "-", "injected", "or", "EMT6", "-", "injected", "mice", "were", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "Collagenase", "-", "digested", "specimens", "from", "the", "primary", "tumors", "or", "inguinal", "LN", "tissues", "were", "cultured", "in", "culture", "dish", "for", "cancer", "cell", "enrichment", ".", "The", "detailed", "process", "is", "described", "in", "the", "methods", "section", ".", "After", "several", "days", "selection", "/", "culture", ",", "viable", "4T1PT", ",", "4T1LN", ",", "EMT6PT", ",", "and", "EMT6LN", "cells", "were", "used", "for", "the", "following", "assays", ":", "(", "C", ")", "Soft", "-", "agar", "colony", "forming", "activity", "was", "examined", "in", "4T1PT", "and", "4T1LN", "cells", "(", "5x102", "cells", "/", "well", ",", "n", "=", "4", "wells", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "In", "(", "C", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000088", "and", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000004", "for", "the", "4T1LN", "cells", "at", "week", "2", "and", "week", "3", ",", "respectively", ".", "(", "C", "-", "I", ")", "4T1", "-", "injected", "or", "EMT6", "-", "injected", "mice", "were", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "Collagenase", "-", "digested", "specimens", "from", "the", "primary", "tumors", "or", "inguinal", "LN", "tissues", "were", "cultured", "in", "culture", "dish", "for", "cancer", "cell", "enrichment", ".", "The", "detailed", "process", "is", "described", "in", "the", "methods", "section", ".", "After", "several", "days", "selection", "/", "culture", ",", "viable", "4T1PT", ",", "4T1LN", ",", "EMT6PT", ",", "and", "EMT6LN", "cells", "were", "used", "for", "the", "following", "assays", ":", "(", "D", "and", "E", ")", "Tumorigenesis", "assays", "were", "determined", "in", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "orthotopically", "injected", "with", "5x102", "4T1PT", "or", "4T1LN", "cells", ".", "Tumor", "mass", "(", "D", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "E", ")", "were", "measured", "on", "day", "28", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Tumorigenesis", "assays", "were", "determined", "in", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "orthotopically", "injected", "with", "5x102", "4T1PT", "or", "4T1LN", "cells", ".", "Tumor", "mass", "(", "D", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "E", ")", "were", "measured", "on", "day", "28", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "In", "(", "E", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000006", ".", "In", "(", "G", ")", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "000734", ".", "Level", "of", "significance", "was", "determined", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "2x105", "4T1PT", "or", "4T1LN", "cells", "via", "tail", "-", "vein", ".", "Lung", "colonization", "was", "examined", "by", "lung", "morphology", "(", "F", ")", "and", "the", "numbers", "of", "tumor", "nodule", "(", "G", ")", "on", "day", "21", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "2x105", "4T1PT", "or", "4T1LN", "cells", "via", "tail", "-", "vein", ".", "Lung", "colonization", "was", "examined", "by", "lung", "morphology", "(", "F", ")", "and", "the", "numbers", "of", "tumor", "nodule", "(", "G", ")", "on", "day", "21", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "all", "experimental", "data", "were", "verified", "in", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "All", "values", "are", "presented", "as", "mean", "or", "mean", "±", "SD", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "NSG", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "4T1PT", "(", "5x102", ")", ",", "4T1LN", "(", "5x102", ")", ",", "EMT6PT", "(", "1x102", ")", ",", "or", "EMT6LN", "(", "1x102", ")", "cells", ".", "Distant", "organ", "metastasis", "was", "examined", "by", "bioluminscent", "images", "on", "day", "28", ".", "The", "bioluminescent", "signal", "(", "pseudocolor", ")", "was", "recorded", "as", "photons", "per", "second", "per", "centimeter", "squared", "per", "steradian", "(", "p", "/", "s", "/", "cm2", "/", "sr", ")", "and", "the", "luminescent", "image", "was", "overlaid", "on", "the", "photographic", "image", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "NSG", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "4T1PT", "(", "5x102", ")", ",", "4T1LN", "(", "5x102", ")", ",", "EMT6PT", "(", "1x102", ")", ",", "or", "EMT6LN", "(", "1x102", ")", "cells", ".", "Distant", "organ", "metastasis", "was", "examined", "by", "bioluminscent", "images", "on", "day", "28", ".", "The", "bioluminescent", "signal", "(", "pseudocolor", ")", "was", "recorded", "as", "photons", "per", "second", "per", "centimeter", "squared", "per", "steradian", "(", "p", "/", "s", "/", "cm2", "/", "sr", ")", "and", "the", "luminescent", "image", "was", "overlaid", "on", "the", "photographic", "image", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 Figure 1. Breast cancer cells derived from tumor-draining lymph nodes gain aggressive malignancy (A and B) Inguinal LNs were harvested from 4T1-injected mice at the indicated week after initial injection. LN tissues were fixed and paraffin-embedded. Immunoflurorescence was performed with anti-GFP antibody to visualize GFP+ 4T1 cells. (A) Confocal micrographs of the representative field of the LN section. Scale bar: 10 μm. Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD. Figure 1. Breast cancer cells derived from tumor-draining lymph nodes gain aggressive malignancy (A and B) Inguinal LNs were harvested from 4T1-injected mice at the indicated week after initial injection. LN tissues were fixed and paraffin-embedded. Immunoflurorescence was performed with anti-GFP antibody to visualize GFP+ 4T1 cells. (B) Histograms illustrated that the dynamic changes of GFP+ 4T1 cells metastasized to the inguinal LN. Cells were counted in whole sections (2 non-consecutive sections per LN per mouse). Each group was composed of at least two mice.Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD. (C-I) 4T1-injected or EMT6-injected mice were sacrificed at the indicated week after initial injection. Collagenase-digested specimens from the primary tumors or inguinal LN tissues were cultured in culture dish for cancer cell enrichment. The detailed process is described in the methods section. After several days selection/culture, viable 4T1PT, 4T1LN, EMT6PT, and EMT6LN cells were used for the following assays: (C) Soft-agar colony forming activity was examined in 4T1PT and 4T1LN cells (5x102 cells/well, n = 4 wells per group). Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD. In (C), **P = 0.000088 and **P = 0.000004 for the 4T1LN cells at week 2 and week 3, respectively.(C-I) 4T1-injected or EMT6-injected mice were sacrificed at the indicated week after initial injection. Collagenase-digested specimens from the primary tumors or inguinal LN tissues were cultured in culture dish for cancer cell enrichment. The detailed process is described in the methods section. After several days selection/culture, viable 4T1PT, 4T1LN, EMT6PT, and EMT6LN cells were used for the following assays:(D and E) Tumorigenesis assays were determined in BALB/c mice (n = 3 mice per group) orthotopically injected with 5x102 4T1PT or 4T1LN cells. Tumor mass (D) and tumor weight (E) were measured on day 28. Scale bar: 1 cm.Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD.(D and E) Tumorigenesis assays were determined in BALB/c mice (n = 3 mice per group) orthotopically injected with 5x102 4T1PT or 4T1LN cells. Tumor mass (D) and tumor weight (E) were measured on day 28. Scale bar: 1 cm.Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD. In (E), **P = 0.000006. In (G) **P = 0.000734. Level of significance was determined using two-tailed unpaired t-test.(F and G) BALB/c mice (n = 3 mice per group) were injected with 2x105 4T1PT or 4T1LN cells via tail-vein. Lung colonization was examined by lung morphology (F) and the numbers of tumor nodule (G) on day 21. Scale bar: 1 cm.Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD.(F and G) BALB/c mice (n = 3 mice per group) were injected with 2x105 4T1PT or 4T1LN cells via tail-vein. Lung colonization was examined by lung morphology (F) and the numbers of tumor nodule (G) on day 21. Scale bar: 1 cm.Data information: In (A-G), all experimental data were verified in at least two independent experiments. All values are presented as mean or mean ± SD.(H and I) NSG mice (n = 5 mice per group) were injected with 4T1PT (5x102), 4T1LN (5x102), EMT6PT (1x102), or EMT6LN (1x102) cells. Distant organ metastasis was examined by bioluminscent images on day 28. The bioluminescent signal (pseudocolor) was recorded as photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr) and the luminescent image was overlaid on the photographic image.(H and I) NSG mice (n = 5 mice per group) were injected with 4T1PT (5x102), 4T1LN (5x102), EMT6PT (1x102), or EMT6LN (1x102) cells. Distant organ metastasis was examined by bioluminscent images on day 28. The bioluminescent signal (pseudocolor) was recorded as photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr) and the luminescent image was overlaid on the photographic image."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", "and", "D", ")", "Distant", "organ", "metastasis", "was", "examined", "by", "bioluminscent", "images", "of", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", "after", "tumor", "resection", "with", "(", "n", "=", "13", "mice", ")", "or", "without", "(", "n", "=", "10", "mice", ")", "tumor", "-", "draining", "lymph", "node", "dissection", "on", "week", "5", ".", "The", "bioluminescent", "signal", "(", "pseudocolor", ")", "was", "recorded", "as", "photons", "per", "second", "per", "centimeter", "squared", "per", "steradian", "(", "p", "/", "s", "/", "cm2", "/", "sr", ")", "and", "the", "luminescent", "image", "was", "overlaid", "on", "the", "photographic", "image", ".", "For", "the", "additional", "details", ",", "see", "the", "methods", "section", ".", "(", "E", "and", "I", ")", "Summary", "table", "of", "distant", "organ", "metastasis", "derived", "from", "each", "surgery", "group", ".", "(", "E", "and", "I", ")", "Summary", "table", "of", "distant", "organ", "metastasis", "derived", "from", "each", "surgery", "group", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Distant", "organ", "metastasis", "was", "examined", "by", "bioluminscent", "images", "of", "inguinal", "lymph", "node", "pre", "-", "removed", "tumor", "-", "bearing", "mice", "(", "n", "=", "9", "mice", ")", "or", "sham", "surgery", "tumor", "-", "bearing", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "after", "tumor", "resection", "on", "week", "5", ".", "The", "bioluminescent", "signal", "(", "pseudocolor", ")", "was", "recorded", "as", "photons", "per", "second", "per", "centimeter", "squared", "per", "steradian", "(", "p", "/", "s", "/", "cm2", "/", "sr", ")", "and", "the", "luminescent", "image", "was", "overlaid", "on", "the", "photographic", "image", ".", "For", "the", "additional", "details", ",", "see", "the", "methods", "section", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (C and D) Distant organ metastasis was examined by bioluminscent images of 4T1 tumor-bearing mice after tumor resection with (n=13 mice) or without (n=10 mice) tumor-draining lymph node dissection on week 5. The bioluminescent signal (pseudocolor) was recorded as photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr) and the luminescent image was overlaid on the photographic image. For the additional details, see the methods section. (E and I) Summary table of distant organ metastasis derived from each surgery group. (E and I) Summary table of distant organ metastasis derived from each surgery group.(G and H) Distant organ metastasis was examined by bioluminscent images of inguinal lymph node pre-removed tumor-bearing mice (n=9 mice) or sham surgery tumor-bearing mice (n=5 mice) after tumor resection on week 5. The bioluminescent signal (pseudocolor) was recorded as photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr) and the luminescent image was overlaid on the photographic image. For the additional details, see the methods section."}
{"words": ["Figure", "3", "Figure", "3", ".", "Up", "-", "regulation", "of", "Il", "-", "17rb", "contributes", "to", "the", "aggressive", "malignancy", "phenotypes", "of", "breast", "cancer", "cell", "derived", "from", "tumor", "-", "draining", "lymph", "node", "(", "A", ")", "Gene", "expression", "profiles", "were", "shown", "at", "4T1PT", "to", "4T1LN", "cells", ".", "Five", "genes", "encoding", "cell", "surface", "proteins", "were", "identified", "among", "up", "-", "regulated", "genes", ".", "(", "B", ")", "mRNA", "expression", "of", "each", "candidate", "gene", "in", "4T1PT", "and", "4T1LN", "cells", "was", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Il", "-", "17rb", ",", "Gpr56", ",", "and", "Scara5", "expression", "in", "4T1PT", "and", "4T1LN", "cells", "were", "examined", "by", "Western", "blotting", "analysis", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Il", "-", "17rb", ",", "Gpr56", ",", "and", "Scara5", "expression", "in", "4T1PT", "and", "4T1LN", "cells", "were", "examined", "by", "Western", "blotting", "analysis", ".", "(", "E", ")", "Western", "blotting", "and", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Il", "-", "17rb", ",", "Gpr56", ",", "and", "Scara5", "expression", "in", "4T1", "cells", "transduced", "with", "Il", "-", "17rb", ",", "Gpr56", ",", "Scara5", ",", "or", "control", "LacZ", "shRNA", "lentivirus", "respectively", ".", "(", "F", ")", "Soft", "-", "agar", "colony", "forming", "activity", "was", "examined", "in", "lentivirus", "transduced", "shIl", "-", "17rb", ",", "shGpr56", ",", "shScara5", ",", "or", "shLacZ", "4T1", "cells", "(", "5x102", "cells", "/", "well", ",", "n", "=", "6", "wells", "per", "group", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blotting", "analysis", "was", "used", "to", "detect", "ectopic", "expression", "of", "Il", "-", "17rb", "in", "4T1", "cells", "infected", "with", "either", "lentiviruses", "carrying", "Il", "-", "17rb", "cDNA", "or", "empty", "vector", ".", "(", "H", ")", "Soft", "-", "agar", "colony", "forming", "activity", "was", "examined", "using", "control", "or", "Il", "-", "17rb", "over", "-", "expressing", "4T1", "cells", "(", "5x102", "cells", "/", "well", ",", "n", "=", "6", "wells", "per", "group", ")", ".", "(", "I", ")", "Western", "blotting", "analysis", "was", "used", "to", "examine", "Il", "-", "17rb", "in", "a", "representative", "Il", "-", "17rbDel", "4T1", "clone", "derived", "from", "Il", "-", "17rb", "knocked", "-", "out", "4T1", "cells", "using", "a", "CRISPR", "/", "Cas9", "system", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Tumorigenesis", "assays", "were", "determined", "in", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "orthotopically", "injected", "with", "5x102", "4T1", "cells", "from", "WT", "or", "Il", "-", "17rbDel", "clone", ".", "Tumor", "mass", "(", "J", ")", "and", "weight", "(", "K", ")", "were", "measured", "on", "day", "28", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "(", "L", "and", "M", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "5x105", "4T1", "cells", "from", "WT", "or", "Il", "-", "17rbDel", "clone", "via", "tail", "-", "vein", ".", "Lung", "colonization", "was", "examined", "by", "lung", "morphology", "(", "L", ")", "and", "the", "numbers", "of", "tumor", "nodule", "(", "M", ")", "on", "day", "21", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Figure 3. Up-regulation of Il-17rb contributes to the aggressive malignancy phenotypes of breast cancer cell derived from tumor-draining lymph node (A) Gene expression profiles were shown at 4T1PT to 4T1LN cells. Five genes encoding cell surface proteins were identified among up-regulated genes. (B) mRNA expression of each candidate gene in 4T1PT and 4T1LN cells was determined by RT-qPCR. Gapdh was used as an internal control.(C and D) Il-17rb, Gpr56, and Scara5 expression in 4T1PT and 4T1LN cells were examined by Western blotting analysis.(C and D) Il-17rb, Gpr56, and Scara5 expression in 4T1PT and 4T1LN cells were examined by Western blotting analysis.(E) Western blotting and RT-qPCR analysis of Il-17rb, Gpr56, and Scara5 expression in 4T1 cells transduced with Il-17rb, Gpr56, Scara5, or control LacZ shRNA lentivirus respectively.(F) Soft-agar colony forming activity was examined in lentivirus transduced shIl-17rb, shGpr56, shScara5, or shLacZ 4T1 cells (5x102 cells/well, n = 6 wells per group).(G) Western blotting analysis was used to detect ectopic expression of Il-17rb in 4T1 cells infected with either lentiviruses carrying Il-17rb cDNA or empty vector.(H) Soft-agar colony forming activity was examined using control or Il-17rb over-expressing 4T1 cells (5x102 cells/well, n = 6 wells per group).(I) Western blotting analysis was used to examine Il-17rb in a representative Il-17rbDel 4T1 clone derived from Il-17rb knocked-out 4T1 cells using a CRISPR/Cas9 system.(J and K) Tumorigenesis assays were determined in BALB/c mice (n = 3 mice per group) orthotopically injected with 5x102 4T1 cells from WT or Il-17rbDel clone. Tumor mass (J) and weight (K) were measured on day 28. Scale bar: 1 cm.(L and M) BALB/c mice (n = 3 mice per group) were injected with 5x105 4T1 cells from WT or Il-17rbDel clone via tail-vein. Lung colonization was examined by lung morphology (L) and the numbers of tumor nodule (M) on day 21. Scale bar: 1 cm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "and", "C", ")", "Inguinal", "lymph", "node", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "Total", "cells", "isolated", "from", "inguinal", "lymph", "node", "tissues", "were", "transwell", "co", "-", "cultured", "with", "4T1", "cells", ".", "Inguinal", "lymph", "node", "tissues", "came", "from", "un", "-", "injection", "BALB", "/", "c", "mice", "as", "control", ".", "After", "5", "-", "day", "co", "-", "culture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "examined", "in", "the", "RT", "-", "qPCR", "(", "B", ")", "analyses", "of", "Il", "-", "17rb", "expression", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "or", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "4T1", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "sacrificed", "at", "the", "indicated", "week", "after", "initial", "injection", ".", "Total", "cells", "isolated", "from", "inguinal", "lymph", "node", "tissues", "were", "transwell", "co", "-", "cultured", "with", "4T1", "cells", ".", "Inguinal", "lymph", "node", "tissues", "came", "from", "un", "-", "injection", "BALB", "/", "c", "mice", "as", "control", ".", "After", "5", "-", "day", "co", "-", "culture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "examined", "in", "the", "Western", "blotting", "(", "C", ")", "analyses", "of", "Il", "-", "17rb", "expression", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "or", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "D", ")", "Soft", "-", "agar", "colony", "forming", "activity", "was", "examined", "using", "co", "-", "cultured", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "(", "5x102", "cells", "/", "well", ",", "n", "=", "4", "wells", "per", "group", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "4T1", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "sacrificed", "at", "three", "weeks", "post", "initial", "injection", ".", "Each", "lymphocyte", "subsets", "isolated", "from", "inguinal", "lymph", "node", "tissues", "by", "FACS", "sorting", "were", "transwell", "co", "-", "cultured", "with", "4T1", "cells", ".", "After", "5", "-", "day", "co", "-", "culture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "used", "for", "the", "RT", "-", "qPCR", "(", "E", ")", "analyses", "of", "Il", "-", "17rb", "expression", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "internal", "control", "or", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "4T1", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "sacrificed", "at", "three", "weeks", "post", "initial", "injection", ".", "Each", "lymphocyte", "subsets", "isolated", "from", "inguinal", "lymph", "node", "tissues", "by", "FACS", "sorting", "were", "transwell", "co", "-", "cultured", "with", "4T1", "cells", ".", "After", "5", "-", "day", "co", "-", "culture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "used", "for", "the", "Western", "blotting", "(", "F", ")", "analyses", "of", "Il", "-", "17rb", "expression", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "internal", "control", "or", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "CD4", "+", "Foxp3", "+", "Tregs", "of", "total", "CD4", "+", "cells", "in", "inguinal", "LN", ",", "spleen", "and", "peripheral", "blood", "of", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", "injected", "with", "4T1", "(", "Blue", ")", "or", "γ", "-", "irradiated", "4T1", "(", "Red", ")", "cancer", "cells", "was", "analyzed", "by", "FACS", ".", "(", "H", ")", "4T1", "cells", "co", "-", "cultured", "with", "the", "indicated", "lymphocyte", "populations", "isolated", "from", "inguinal", "LN", "of", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", "by", "FACS", "sorting", ".", "After", "5", "-", "day", "co", "-", "culture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "analyzed", "for", "Il", "-", "17rb", "expression", "by", "RT", "-", "qPCR", "analysis", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "internal", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B and C) Inguinal lymph node-injected BALB/c mice were sacrificed at the indicated week after initial injection. Total cells isolated from inguinal lymph node tissues were transwell co-cultured with 4T1 cells. Inguinal lymph node tissues came from un-injection BALB/c mice as control. After 5-day co-culture, 4T1 cells at lower well were examined in the RT-qPCR (B)analyses of Il-17rb expression. Gapdh was used as an internal control or as a loading control.(B and C) 4T1-injected BALB/c mice were sacrificed at the indicated week after initial injection. Total cells isolated from inguinal lymph node tissues were transwell co-cultured with 4T1 cells. Inguinal lymph node tissues came from un-injection BALB/c mice as control. After 5-day co-culture, 4T1 cells at lower well were examined in the Western blotting (C) analyses of Il-17rb expression. Gapdh was used as an internal control or as a loading control.(D) Soft-agar colony forming activity was examined using co-cultured 4T1 cells at lower well (5x102 cells/well, n = 4 wells per group).(E and F) 4T1-injected BALB/c mice were sacrificed at three weeks post initial injection. Each lymphocyte subsets isolated from inguinal lymph node tissues by FACS sorting were transwell co-cultured with 4T1 cells. After 5-day co-culture, 4T1 cells at lower well were used for the RT-qPCR (E)analyses of Il-17rb expression. Gapdh was used as internal control or as a loading control.(E and F) 4T1-injected BALB/c mice were sacrificed at three weeks post initial injection. Each lymphocyte subsets isolated from inguinal lymph node tissues by FACS sorting were transwell co-cultured with 4T1 cells. After 5-day co-culture, 4T1 cells at lower well were used for the Western blotting (F) analyses of Il-17rb expression. Gapdh was used as internal control or as a loading control.(G) Percentage of CD4+Foxp3+ Tregs of total CD4+ cells in inguinal LN, spleen and peripheral blood of BALB/c mice (n = 3 mice per group) injected with 4T1 (Blue) or γ-irradiated 4T1 (Red) cancer cells was analyzed by FACS.(H) 4T1 cells co-cultured with the indicated lymphocyte populations isolated from inguinal LN of 4T1 tumor-bearing mice by FACS sorting. After 5-day co-culture, 4T1 cells at lower well were analyzed for Il-17rb expression by RT-qPCR analysis. Gapdh was used as internal control."}
{"words": ["Figure", "5", "Figure", "5", ".", "Depletion", "of", "Tregs", "in", "the", "tumor", "-", "draining", "lymph", "node", "microenvironment", "abolishes", "Il", "-", "17rb", "induction", "and", "enhanced", "malignancy", "in", "breast", "cancer", "cells", ".", "(", "A", ")", "4T1", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "treated", "with", "control", "IgG", ",", "anti", "-", "CD4", "or", "anti", "-", "CD25", "neutralizing", "antibody", "at", "the", "day", "15", "and", "day", "18", "after", "initial", "injection", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "three", "weeks", "after", "initial", "injection", ".", "Depletion", "of", "CD4", "+", "Foxp3", "+", "Tregs", "in", "inguinal", "LNs", "was", "confirmed", "by", "FACS", "analysis", ".", "(", "B", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "Il", "-", "17rb", "expression", "was", "performed", "in", "4T1LN", "or", "4T1PT", "cells", "collected", "from", "control", "IgG", "-", ",", "anti", "-", "CD4", ",", "or", "anti", "-", "CD25", "antibody", "-", "treated", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "orthotopically", "injected", "with", "5x102", "4T1LN", "or", "4T1PT", "cells", "collected", "from", "control", "IgG", "-", ",", "anti", "-", "CD4", ",", "or", "anti", "-", "CD25", "antibody", "-", "treated", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", ".", "Tumor", "mass", "(", "D", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "E", ")", "were", "measured", "on", "day", "28", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "orthotopically", "injected", "with", "5x102", "4T1LN", "or", "4T1PT", "cells", "collected", "from", "control", "IgG", "-", ",", "anti", "-", "CD4", ",", "or", "anti", "-", "CD25", "antibody", "-", "treated", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", ".", "Tumor", "mass", "(", "D", ")", "and", "tumor", "weight", "(", "E", ")", "were", "measured", "on", "day", "28", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "(", "E", ")", "NSG", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", "were", "injected", "with", "5x102", "4T1LN", "or", "4T1PT", "cells", "collected", "from", "control", "IgG", "-", ",", "anti", "-", "CD4", ",", "or", "anti", "-", "CD25", "antibody", "-", "treated", "4T1", "tumor", "-", "bearing", "mice", ".", "Distant", "organ", "metastasis", "was", "examined", "by", "bioluminscent", "images", "on", "day", "21", ".", "The", "bioluminescent", "signal", "(", "pseudocolor", ")", "was", "recorded", "as", "photons", "per", "second", "per", "centimeter", "squared", "per", "steradian", "(", "p", "/", "s", "/", "cm2", "/", "sr", ")", "and", "the", "luminescent", "image", "was", "overlaid", "on", "the", "photographic", "image", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 Figure 5. Depletion of Tregs in the tumor-draining lymph node microenvironment abolishes Il-17rb induction and enhanced malignancy in breast cancer cells. (A) 4T1-injected BALB/c mice were treated with control IgG, anti-CD4 or anti-CD25 neutralizing antibody at the day 15 and day 18 after initial injection. Mice were sacrificed at three weeks after initial injection. Depletion of CD4+Foxp3+ Tregs in inguinal LNs was confirmed by FACS analysis. (B) Western blotting analysis of Il-17rb expression was performed in 4T1LN or 4T1PT cells collected from control IgG-, anti-CD4, or anti-CD25 antibody-treated 4T1 tumor-bearing mice.(C and D) BALB/c mice were orthotopically injected with 5x102 4T1LN or 4T1PT cells collected from control IgG-, anti-CD4, or anti-CD25 antibody-treated 4T1 tumor-bearing mice. (n = 3 mice per group). Tumor mass (D) and tumor weight (E) were measured on day 28. Scale bar: 1 cm.(C and D) BALB/c mice were orthotopically injected with 5x102 4T1LN or 4T1PT cells collected from control IgG-, anti-CD4, or anti-CD25 antibody-treated 4T1 tumor-bearing mice. (n = 3 mice per group). Tumor mass (D) and tumor weight (E) were measured on day 28. Scale bar: 1 cm.(E) NSG mice (n = 5 mice per group) were injected with 5x102 4T1LN or 4T1PT cells collected from control IgG-, anti-CD4, or anti-CD25 antibody-treated 4T1 tumor-bearing mice. Distant organ metastasis was examined by bioluminscent images on day 21. The bioluminescent signal (pseudocolor) was recorded as photons per second per centimeter squared per steradian (p/s/cm2/sr) and the luminescent image was overlaid on the photographic image."}
{"words": ["Figure", "6", "Figure", "6", ".", "TGF", "-", "β1", "secreted", "from", "Tregs", "induces", "Il", "-", "17rb", "expression", "of", "breast", "cancer", "cells", "via", "Smad2", "/", "3", "/", "4", "signaling", ".", "(", "A", ")", "CD4", "+", "CD25", "+", "Tregs", "were", "isolated", "from", "inguinal", "LN", "of", "BALB", "/", "c", "mice", "injected", "with", "4T1", "cells", "for", "three", "weeks", ",", "and", "were", "transwell", "cocultured", "with", "4T1", "cells", "in", "the", "presence", "of", "control", "IgG", "or", "neutralizing", "antibodies", "against", "IL", "-", "10", "or", "TGF", "-", "β1", ".", "After", "5", "-", "day", "coculture", ",", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", "were", "analyzed", "for", "Il", "-", "17rb", "expression", "by", "RT", "-", "qPCR", "analysis", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "internal", "control", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "(", "B", ")", "proteins", "for", "5", "days", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "IL", "-", "10", "(", "C", ")", "proteins", "for", "5", "days", ".", "(", "D", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "shLacZ", "or", "shTgfbr1", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "for", "5", "days", ".", "(", "E", ")", "4T1", "-", "injected", "BALB", "/", "c", "mice", "were", "sacrificed", "at", "three", "weeks", "post", "initial", "injection", ".", "Total", "cells", "isolated", "from", "inguinal", "lymph", "node", "tissues", "were", "transwell", "co", "-", "cultured", "with", "4T1", "cells", ".", "After", "5", "-", "day", "coculture", ",", "soft", "-", "agar", "colony", "forming", "activity", "was", "determined", "in", "co", "-", "cultured", "shLacZ", "or", "shTgfbr1", "4T1", "cells", "at", "lower", "well", ".", "(", "5x102", "cells", "/", "well", ",", "n", "=", "6", "wells", "per", "group", ")", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "shLacZ", ",", "shSmad2", "(", "F", ")", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "for", "5", "days", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "shLacZ", ",", "shSmad3", "(", "G", ")", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "for", "5", "days", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Western", "blotting", "analyzed", "Il", "-", "17rb", "in", "shLacZ", ",", "shSmad4", "(", "H", ")", "4T1", "cells", "treated", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "for", "5", "days", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "WT", "4T1", "(", "I", ")", "or", "Il", "-", "17rbDel", "4T1", "(", "J", ")", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "for", "5", "days", ".", "After", "treatment", ",", "nuclear", "translocation", "of", "NF", "-", "κB", "p65", "was", "assayed", "by", "Western", "blotting", "in", "cells", "treated", "with", "recombinant", "Il", "-", "17b", "for", "2", "hours", ".", "Nuclear", "Matrix", "Protein", "p84", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "of", "nuclear", "extracts", ".", "f", "triplicate", "measurement", ".", "In", "(", "B", ",", "C", ",", "D", ",", "F", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "and", "J", ")", ",", "the", "intensity", "of", "each", "band", "was", "quantified", "using", "the", "Image", "J", "software", ".", "Gapdh", ",", "α", "-", "tubulin", ",", "or", "p84", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Relative", "expression", "(", "RE", ")", "of", "protein", "levels", "in", "each", "sample", "to", "control", "4T1", "cells", "or", "Il", "-", "17rbDel", "4T1", "clone", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Figure 6. TGF-β1 secreted from Tregs induces Il-17rb expression of breast cancer cells via Smad2/3/4 signaling. (A) CD4+CD25+ Tregs were isolated from inguinal LN of BALB/c mice injected with 4T1 cells for three weeks, and were transwell cocultured with 4T1 cells in the presence of control IgG or neutralizing antibodies against IL-10 or TGF-β1. After 5-day coculture, 4T1 cells at lower well were analyzed for Il-17rb expression by RT-qPCR analysis. Gapdh was used as internal control. (B and C) Western blotting analyzed Il-17rb in 4T1 cells treated with recombinant TGF-β1 (B)proteins for 5 days.(B and C) Western blotting analyzed Il-17rb in 4T1 cells treated with recombinant IL-10 (C) proteins for 5 days.(D) Western blotting analyzed Il-17rb in shLacZ or shTgfbr1 4T1 cells treated with recombinant TGF-β1 for 5 days.(E) 4T1-injected BALB/c mice were sacrificed at three weeks post initial injection. Total cells isolated from inguinal lymph node tissues were transwell co-cultured with 4T1 cells. After 5-day coculture, soft-agar colony forming activity was determined in co-cultured shLacZ or shTgfbr1 4T1 cells at lower well. (5x102 cells/well, n = 6 wells per group).(F-H) Western blotting analyzed Il-17rb in shLacZ, shSmad2 (F)4T1 cells treated with recombinant TGF-β1 for 5 days.(F-H) Western blotting analyzed Il-17rb in shLacZ,shSmad3 (G)4T1 cells treated with recombinant TGF-β1 for 5 days.(F-H) Western blotting analyzed Il-17rb in shLacZ, shSmad4 (H) 4T1 cells treated with recombinant TGF-β1 for 5 days. (I and J) WT 4T1 (I) or Il-17rbDel 4T1 (J) cells were treated with or without recombinant TGF-β1 for 5 days. After treatment, nuclear translocation of NF-κB p65 was assayed by Western blotting in cells treated with recombinant Il-17b for 2 hours. Nuclear Matrix Protein p84 was used as a loading control of nuclear extracts.f triplicate measurement. In (B, C, D, F, G, H, I, and J), the intensity of each band was quantified using the Image J software. Gapdh, α-tubulin, or p84 was used as a loading control. Relative expression (RE) of protein levels in each sample to control 4T1 cells or Il-17rbDel 4T1 clone is indicated."}
{"words": ["Figure", "7Figure", "7", ".", "IL", "-", "17RB", "expression", "is", "correlated", "with", "the", "elevated", "prevalence", "of", "regulatory", "T", "cells", "in", "the", "tumor", "-", "draining", "lymph", "nodes", "of", "breast", "cancer", "patients", ".", "(", "A", "and", "C", ")", "Representative", "IHC", "images", "of", "IL", "-", "17RB", "(", "A", ")", "and", "Foxp3", "(", "C", ")", "were", "taken", "in", "breast", "specimens", "from", "primary", "tumors", "and", "their", "paired", "LN", "metastasis", "specimens", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μmFigure", "7", ".", "IL", "-", "17RB", "expression", "is", "correlated", "with", "the", "elevated", "prevalence", "of", "regulatory", "T", "cells", "in", "the", "tumor", "-", "draining", "lymph", "nodes", "of", "breast", "cancer", "patients", ".", "(", "A", "and", "C", ")", "Representative", "IHC", "images", "of", "IL", "-", "17RB", "(", "A", ")", "and", "Foxp3", "(", "C", ")", "were", "taken", "in", "breast", "specimens", "from", "primary", "tumors", "and", "their", "paired", "LN", "metastasis", "specimens", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Figure 7. IL-17RB expression is correlated with the elevated prevalence of regulatory T cells in the tumor-draining lymph nodes of breast cancer patients. (A and C) Representative IHC images of IL-17RB (A) and Foxp3 (C) were taken in breast specimens from primary tumors and their paired LN metastasis specimens. Scale bar: 10 μmFigure 7. IL-17RB expression is correlated with the elevated prevalence of regulatory T cells in the tumor-draining lymph nodes of breast cancer patients. (A and C) Representative IHC images of IL-17RB (A) and Foxp3 (C) were taken in breast specimens from primary tumors and their paired LN metastasis specimens. Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "8", "Figure", "8", ".", "Elevated", "IL", "-", "17RB", "expression", "in", "cancer", "cells", "derived", "from", "tumor", "-", "draining", "lymph", "nodes", "in", "breast", "cancer", "patients", "correlates", "with", "aggressive", "growth", "nature", ".", "(", "A", ")", "Freshly", "collected", "humanbreast", "cancer", "(", "hBC", ")", "specimens", "(", "PT", ",", "primary", "tumors", ";", "LN", ",", "paired", "LN", "metastasis", "from", "the", "same", "breast", "cancer", "patient", ")", "were", "digested", "with", "collagenase", "-", "containing", "buffer", "overnight", ".", "Depletion", "of", "hematopoietic", "cells", "by", "CD45", "Dyna", "beads", "(", "Invitrogen", ")", "enriched", "the", "EpCAM", "+", "cells", "for", "following", "xenografts", ".", "Percentages", "of", "EpCAM", "+", "cells", "in", "human", "primary", "breast", "cancer", "cells", "were", "confirmed", "by", "FACS", "analysis", "(", "Left", "panel", ":", "before", "enrichment", ";", "Right", "panel", ":", "after", "enrichment", ")", ".", "All", "of", "the", "histograms", "were", "shown", "that", "they", "were", "EpCAM", "expressing", "(", "black", "line", ")", ",", "compared", "to", "isotype", "control", "(", "gray", "filled", ")", ".", "(", "B", ")", "Tumorigenesis", "assay", "were", "determined", "in", "NOD", "/", "SCID", "/", "IL2Rγnull", "mice", "orthotopically", "injected", "with", "hBCPT", "and", "hBCLN", "cells", ".", "Representative", "data", "on", "day", "180", "were", "shown", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "H", "&", "E", "stainings", "and", "IHC", "stainings", "of", "pan", "-", "keratin", "were", "shown", "in", "the", "representative", "cases", "of", "fat", "-", "pad", "sections", "from", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", "(", "left", "panel", ")", ",", "100", "μm", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "H", "&", "E", "stainings", "and", "IHC", "stainings", "of", "pan", "-", "keratin", "were", "shown", "in", "the", "representative", "cases", "of", "fat", "-", "pad", "sections", "from", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", "(", "left", "panel", ")", ",", "100", "μm", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "F", ")", "IHC", "stainings", "of", "IL", "-", "17RB", "were", "shown", "in", "the", "representative", "cases", "of", "fat", "-", "pad", "sections", "from", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "The", "correlation", "of", "tumor", "volumes", "and", "IL", "-", "17RB", "expression", "(", "composite", "IHC", "score", ")", "in", "hBCLN", "cells", "-", "injected", "NOD", "/", "SCID", "/", "IL2Rγnull", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 Figure 8. Elevated IL-17RB expression in cancer cells derived from tumor-draining lymph nodes in breast cancer patients correlates with aggressive growth nature. (A) Freshly collected humanbreast cancer (hBC) specimens (PT, primary tumors; LN, paired LN metastasis from the same breast cancer patient) were digested with collagenase-containing buffer overnight. Depletion of hematopoietic cells by CD45 Dyna beads (Invitrogen) enriched the EpCAM+ cells for following xenografts. Percentages of EpCAM+ cells in human primary breast cancer cells were confirmed by FACS analysis (Left panel: before enrichment; Right panel: after enrichment). All of the histograms were shown that they were EpCAM expressing (black line), compared to isotype control (gray filled). (B) Tumorigenesis assay were determined in NOD/SCID/IL2Rγnull mice orthotopically injected with hBCPT and hBCLN cells. Representative data on day 180 were shown.(D and E) H&E stainings and IHC stainings of pan-keratin were shown in the representative cases of fat-pad sections from (B). Scale bar: 1 mm (left panel), 100 μm (right panel).(D and E) H&E stainings and IHC stainings of pan-keratin were shown in the representative cases of fat-pad sections from (B). Scale bar: 1 mm (left panel), 100 μm (right panel).(F) IHC stainings of IL-17RB were shown in the representative cases of fat-pad sections from (B). Scale bar: 10 μm.(G) The correlation of tumor volumes and IL-17RB expression (composite IHC score) in hBCLN cells-injected NOD/SCID/IL2Rγnull mice."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Bar", "diagram", "representation", "of", "the", "relative", "SUMO", "conjugation", "activity", "of", "Nse2", ",", "full", "-", "length", "Smc5", "-", "Nse2", ",", "ΔHinge", "/", "Smc5", "-", "Nse2", ",", "ΔHead", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "and", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "truncation", "constructs", "(", "schematic", "representation", "above", ")", ".", "Orange", "bars", "indicate", "the", "presence", "of", "ssDNA", "(", "virion", "ϕx174", ")", "and", "red", "bars", "absence", "of", "ssDNA", ".", "Reaction", "rates", "were", "performed", "at", "least", "in", "three", "different", "independent", "experiments", "(", "see", "Fig", "EV2", ")", ".", "Data", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "and", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "Significance", "was", "measured", "by", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "relative", "to", "wild", "-", "type", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "C", ")", "SYPRO", "-", "stained", "(", "left", ")", "and", "Western", "blot", "(", "right", ")", "time", "course", "SUMO", "conjugation", "reaction", "using", "and", "ΔHead", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "truncation", "construct", "in", "the", "presence", "of", "ssDNA", ".", "T7", "-", "tagged", "Smc5", "and", "E1", "were", "immunodetected", "by", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", ".", "Reactions", "were", "run", "at", "30", "°", "C", "and", "stopped", "at", "indicated", "times", "by", "adding", "SDS", "-", "loading", "buffer", "(", "D", ")", "SYPRO", "-", "stained", "(", "left", ")", "and", "Western", "blot", "(", "right", ")", "time", "course", "SUMO", "conjugation", "reaction", "using", "and", "ΔHinge", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "truncation", "construct", "in", "the", "presence", "of", "ssDNA", ".", "T7", "-", "tagged", "Smc5", "and", "E1", "were", "immunodetected", "by", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", ".", "Reactions", "were", "run", "at", "30", "°", "C", "and", "stopped", "at", "indicated", "times", "by", "adding", "SDS", "-", "loading", "buffer", "(", "E", ")", "Western", "blot", "of", "the", "time", "-", "course", "SUMO", "conjugation", "reaction", "in", "the", "presence", "of", "ssDNA", "(", "virion", "ϕx174", ")", "using", "either", "Nse2", "(", "left", ")", "or", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "complex", "(", "right", ")", ".", "The", "reactions", "were", "run", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cNse4", "external", "substrate", ".", "Reaction", "was", "run", "at", "30", "°", "C", "and", "stopped", "at", "indicated", "minutes", "by", "adding", "SDS", "-", "loading", "buffer", "(", "N", "-", "S2", ",", "cNse4", "-", "SUMO2", ";", "N", "-", "2S2", ",", "cNse4", "-", "2SUMO2", ";", "N", "-", "3S2", ",", "cNse4", "-", "3SUMO2", "and", "pS2", ",", "poly", "-", "SUMO2", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (B) Bar diagram representation of the relative SUMO conjugation activity of Nse2, full-length Smc5-Nse2, ΔHinge/Smc5-Nse2, ΔHead/Smc5-Nse2 and Arm/Smc5-Nse2 truncation constructs (schematic representation above). Orange bars indicate the presence of ssDNA (virion ϕx174) and red bars absence of ssDNA. Reaction rates were performed at least in three different independent experiments (see Fig EV2). Data values are mean ± s.e.m.; and n=3 technical replicates. Significance was measured by a two-tailed unpaired t-test relative to wild-type. **P<0.01  (C) SYPRO-stained (left) and Western blot (right) time course SUMO conjugation reaction using and ΔHead/Smc5-Nse2 truncation construct in the presence of ssDNA. T7-tagged Smc5 and E1 were immunodetected by an anti-T7 antibody. Reactions were run at 30 °C and stopped at indicated times by adding SDS-loading buffer  (D) SYPRO-stained (left) and Western blot (right) time course SUMO conjugation reaction using and ΔHinge/Smc5-Nse2 truncation construct in the presence of ssDNA. T7-tagged Smc5 and E1 were immunodetected by an anti-T7 antibody. Reactions were run at 30 °C and stopped at indicated times by adding SDS-loading buffer  (E) Western blot of the time-course SUMO conjugation reaction in the presence of ssDNA (virion ϕx174) using either Nse2 (left) or Arm/Smc5-Nse2 complex (right). The reactions were run in the presence or absence of cNse4 external substrate. Reaction was run at 30°C and stopped at indicated minutes by adding SDS-loading buffer (N-S2, cNse4-SUMO2; N-2S2, cNse4-2SUMO2; N-3S2, cNse4-3SUMO2 and pS2, poly-SUMO2) "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "Bar", "diagram", "representation", "of", "the", "SUMO", "conjugation", "rates", "of", "activity", "assays", "of", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "KE", "mutants", "in", "the", "presence", "(", "orange", "bars", ")", "or", "absence", "(", "red", "bars", ")", "of", "ssDNA", "(", "virion", "ϕx174", ")", ",", "relative", "to", "wild", "-", "type", "(", "set", "to", "1", ")", ".", "Reactions", "rates", "were", "performed", "at", "least", "in", "three", "different", "independent", "experiments", ".", "Data", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "and", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "Significance", "was", "measured", "by", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "relative", "to", "wild", "-", "type", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (D) Bar diagram representation of the SUMO conjugation rates of activity assays of Arm/Smc5-Nse2 KE mutants in the presence (orange bars) or absence (red bars) of ssDNA (virion ϕx174), relative to wild-type (set to 1). Reactions rates were performed at least in three different independent experiments. Data values are mean ± s.e.m. and n=3 technical replicates. Significance was measured by a two-tailed unpaired t-test relative to wild-type. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Degree", "of", "conformational", "changes", "in", "CM", "induced", "by", "60b", "linear", "ssDNA", ".", "Blue", "bar", ",", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "(", "wild", "-", "type", ")", ";", "grey", "bar", ",", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "(", "K333E", "/", "K344E", ")", ";", "green", "bar", ",", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "(", "K764E", ")", ";", "pink", "bar", ",", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "(", "K333E", "/", "K344E", "/", "K764E", ")", ";", "red", "bar", ",", "Arm", "/", "Smc5", "-", "Nse2", "(", "K743E", "/", "K745E", ")", ".", "Reactions", "were", "performed", "at", "least", "in", "three", "different", "independent", "experiments", ".", "Data", "values", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "Significance", "was", "measured", "by", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "relative", "to", "wild", "-", "type", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (C) Degree of conformational changes in CM induced by 60b linear ssDNA. Blue bar, Arm/Smc5-Nse2 (wild-type); grey bar, Arm/Smc5-Nse2 (K333E/K344E); green bar, Arm/Smc5-Nse2 (K764E); pink bar, Arm/Smc5-Nse2 (K333E/K344E/K764E); red bar, Arm/Smc5-Nse2 (K743E/K745E). Reactions were performed at least in three different independent experiments. Data values are mean ± s.d. and n=3 technical replicates. Significance was measured by a two-tailed unpaired t-test relative to wild-type. ****P < 0.0001 "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Growth", "test", "analysis", "of", "wild", "-", "type", ",", "nse2", "-", "CH", "and", "the", "indicated", "smc5", "-", "KE", "mutants", ";", "10", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "the", "liquid", "cultures", "were", "spotted", "in", "YPD", "and", "pictures", "taken", "after", "48", "hours", "(", "C", ")", "Same", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "using", "the", "nse2", "-", "CH", ",", "smc5", "-", "3KE", ",", "smc5", "-", "K743", ",", "745E", ",", "smc5", "-", "K743", ",", "745R", ",", "smc5", "-", "7KE", "and", "smc5", "-", "7KR", "mutants"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (B) Growth test analysis of wild-type, nse2-CH and the indicated smc5-KE mutants; 10-fold serial dilutions of the liquid cultures were spotted in YPD and pictures taken after 48 hours  (C) Same as in (B) but using the nse2-CH, smc5-3KE, smc5-K743,745E, smc5-K743,745R, smc5-7KE and smc5-7KR mutants "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Protein", "extracts", "from", "exponentially", "growing", "wild", "-", "type", ",", "smc5", "-", "3KE", ",", "smc5", "-", "K743", ",", "745E", ",", "smc5", "-", "4KE", "and", "smc5", "-", "K743", ",", "745R", "cells", "were", "prepared", "under", "denaturing", "conditions", ";", "6xHis", "-", "Flag", "tagged", "SUMO", "(", "HF", "-", "SUMO", ")", "was", "pulled", "down", "from", "protein", "extracts", "to", "purify", "sumoylated", "species", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "A", "strain", "with", "no", "HF", "-", "tag", "was", "used", "as", "control", ";", "arrow", "points", "to", "unmodified", "form", "of", "the", "protein", ",", "vertical", "bar", "to", "sumoylated", "forms", "(", "B", ")", "Left", ",", "same", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "but", "using", "wild", "-", "type", "and", "two", "independent", "clones", "of", "smc5", "-", "7KE", ";", "right", ",", "same", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "but", "using", "wild", "-", "type", ",", "smc5", "-", "7KE", "and", "smc5", "-", "7KR", "mutant", "cells", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Smc5", "sumoylated", "species", "in", "pull", "downs", "from", "the", "indicated", "smc5", "-", "KE", "mutants", ",", "relative", "to", "wild", "-", "type", "controls", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Boxes", ",", "25", "-", "75", "%", "data", "range", ";", "whiskers", ",", "total", "data", "range", ";", "black", "bar", ",", "median", ";", "grey", "cross", ",", "mean", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "number", "of", "samples", "analyzed", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "Smc5", "-", "Nse2", "interactions", ".", "NSE2", "-", "6HA", "cells", "were", "transformed", "with", "centromeric", "plasmids", "expressing", "the", "indicated", "SMC5", "alleles", ",", "and", "protein", "extracts", "from", "exponentially", "growing", "cells", "subjected", "to", "anti", "-", "HA", "immunoprecipitation", ".", "A", "strain", "with", "no", "HA", "tag", "was", "used", "as", "control", "(", "E", ")", "Same", "as", "in", "(", "D", ")", ",", "but", "using", "SMC6", "-", "6HA", "cells", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "Smc5", "-", "6HA", "signal", "from", "immunofluorescence", "on", "chromosome", "spreads", "prepared", "from", "exponentially", "growing", "cultures", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "The", "mean", "value", "on", "wild", "-", "type", "spreads", "was", "arbitrarily", "set", "to", "1", ";", "each", "dot", "represents", "one", "nucleus", ";", "red", "line", ",", "median", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "number", "of", "nuclei", "analyzed", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 (A) Protein extracts from exponentially growing wild-type, smc5-3KE, smc5-K743,745E, smc5-4KE and smc5-K743,745R cells were prepared under denaturing conditions; 6xHis-Flag tagged SUMO (HF-SUMO) was pulled down from protein extracts to purify sumoylated species and analyzed by western blot. A strain with no HF-tag was used as control; arrow points to unmodified form of the protein, vertical bar to sumoylated forms  (B) Left, same as in (A), but using wild-type and two independent clones of smc5-7KE; right, same as in (A), but using wild-type, smc5-7KE and smc5-7KR mutant cells  (C) Quantification of Smc5 sumoylated species in pull downs from the indicated smc5-KE mutants, relative to wild-type controls from at least three independent experiments. Boxes, 25-75% data range; whiskers, total data range; black bar, median; grey cross, mean. ****P < 0.0001; ***P<0.001; **P < 0.01; *P<0.05. 1-way ANOVA, n = number of samples analyzed  (D) Co-immunoprecipitation analysis of the Smc5-Nse2 interactions. NSE2-6HA cells were transformed with centromeric plasmids expressing the indicated SMC5 alleles, and protein extracts from exponentially growing cells subjected to anti-HA immunoprecipitation. A strain with no HA tag was used as control  (E) Same as in (D), but using SMC6-6HA cells  (F) Quantification of Smc5-6HA signal from immunofluorescence on chromosome spreads prepared from exponentially growing cultures of the indicated genotypes. The mean value on wild-type spreads was arbitrarily set to 1; each dot represents one nucleus; red line, median. 1-way ANOVA, n=number of nuclei analyzed. ****P < 0.0001 "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "b", ")", "RNAscope", "analysis", "of", "Lgr5", "mRNA", "in", "DSS", "colitis", "demonstrating", "loss", "of", "Lgr5", "transcript", "(", "N", "=", "3", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50µm", "(", "c", ")", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "staining", "of", "the", "colonic", "epithelium", "following", "DSS", "induced", "damaged", ".", "Crypts", "are", "dramatically", "injured", "by", "d5", ".", "At", "d8", "through", "d12", ",", "regenerating", "crypts", "are", "observed", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50µm", "(", "d", "-", "e", ")", "Compared", "to", "untreated", "controls", ",", "DSS", "treatment", "ablates", "Lgr5", "-", "GFP", "+", "stem", "cells", "and", "results", "in", "functional", "loss", "of", "tdTomato", "+", "lineage", "tracing", "as", "early", "as", "d5", ".", "Lgr5", "-", "GFP", "+", "stem", "cells", "reappear", "by", "d12", "(", "N", "=", "3", "-", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50µm", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "e", ")", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "f", ")", "Effects", "of", "DSS", "colitis", "injury", "on", "RNA", "expression", "levels", "of", "stem", "(", "Lgr5", "and", "Krt19", ")", "and", "progenitor", "(", "Atoh1", "and", "Notch1", ")", "cell", "markers", ".", "Lgr5", "mRNA", "expression", "is", "significantly", "decreased", "after", "exposure", "to", "DSS", "(", "N", "=", "6", "-", "7", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "Mice", "body", "weight", "(", "h", ")", "are", "comparable", "between", "three", "treatments", ":", "DSS", "+", "DT", "(", "N", "=", "12", ")", ",", "only", "DSS", "(", "N", "=", "8", ")", "or", "only", "DT", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "Mice", "survival", "(", "i", ")", "are", "comparable", "between", "three", "treatments", ":", "DSS", "+", "DT", "(", "N", "=", "12", ")", ",", "only", "DSS", "(", "N", "=", "8", ")", "or", "only", "DT", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "j", ")", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "staining", "of", "the", "colonic", "epithelium", "shows", "no", "morphological", "difference", "between", "DSS", "alone", "and", "DSS", "+", "DT", "treated", "mice", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "scale", "bar", "(", "j", ")", "=", "500µm", ".", "(", "k", ")", "The", "extent", "of", "epithelial", "damage", "is", "similar", "in", "mice", "treated", "with", "DSS", "alone", "versus", "DSS", "+", "DT", "(", "to", "ablate", "Lgr5", "+", "stem", "cells", ")", "(", "N", "=", "3", "DSS", ";", "N", "=", "6", "DSS", "+", "DT", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "l", ")", "RNAscope", "for", "Lgr5", "in", "Lgr5DTR", "-", "GFP", "mice", "showing", "loss", "of", "Lgr5", "transcripts", "after", "DT", "treatment", "(", "N", "=", "3", "-", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "="], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(b) RNAscope analysis of Lgr5 mRNA in DSS colitis demonstrating loss of Lgr5 transcript (N=3 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50µm(c) Hematoxylin and Eosin staining of the colonic epithelium following DSS induced damaged. Crypts are dramatically injured by d5. At d8 through d12, regenerating crypts are observed. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50µm(d-e) Compared to untreated controls, DSS treatment ablates Lgr5-GFP+ stem cells and results in functional loss of tdTomato+ lineage tracing as early as d5. Lgr5-GFP+ stem cells reappear by d12 (N=3-4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50µm Data are represented as mean ± SD (e) analyzed using Student's t-test. *P≤0.05, ** P≤0.01.(f) Effects of DSS colitis injury on RNA expression levels of stem (Lgr5 and Krt19) and progenitor (Atoh1 and Notch1) cell markers. Lgr5 mRNA expression is significantly decreased after exposure to DSS (N=6-7 per condition). Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05, ** P≤0.01.Mice body weight (h) are comparable between three treatments: DSS+DT (N=12), only DSS (N=8) or only DT (N=3). Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05, ** P≤0.01.Mice survival (i) are comparable between three treatments: DSS+DT (N=12), only DSS (N=8) or only DT (N=3). Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05, ** P≤0.01.(j) Hematoxylin and Eosin staining of the colonic epithelium shows no morphological difference between DSS alone and DSS+DT treated mice. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. scale bar (j) =500µm.(k) The extent of epithelial damage is similar in mice treated with DSS alone versus DSS+DT (to ablate Lgr5+ stem cells) (N=3 DSS; N=6 DSS+DT). Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05, ** P≤0.01.(l) RNAscope for Lgr5 in Lgr5DTR-GFP mice showing loss of Lgr5 transcripts after DT treatment (N=3-4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50µm"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "b", "-", "c", ")", "Krt19", "+", "cells", "lineage", "trace", "entire", "colonic", "crypts", "during", "both", "normal", "homeostasis", "and", "injury", "(", "N", "=", "3", "-", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "outline", "the", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "(", "b", ")", "=", "45µm", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "DT", "ablation", "of", "Krt19", "+", "cells", "(", "N", "≥", "3", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "outline", "the", "basement", "membrane", ".", "scale", "bar", "(", "e", ")", "=", "30µmDT", "ablation", "of", "Krt19", "+", "cells", "significantly", "reduced", "the", "number", "of", "lineage", "labeled", "crypts", "(", "N", "≥", "3", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "g", ")", "Mice", "body", "weight", "and", "survival", "remain", "unchanged", "between", "DSS", "and", "DSS", "+", "DT", "treated", "groups", "(", "N", "=", "6", "control", ";", "N", "=", "7", "DT", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "staining", "of", "the", "colonic", "epithelium", "after", "DSS", "versus", "DSS", "+", "DT", "showing", "more", "damage", "is", "seen", "in", "mice", "treated", "with", "both", "DSS", "+", "DT", "treatment", "(", "N", "=", "6", "control", ";", "N", "=", "7", "DT", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "outline", "the", "basement", "membrane", ".", "scale", "bar", "(", "h", ")", "=", "1mm", ".", "quantification", "of", "damaged", "epithelial", "area", "(", "i", ")", ",", "showing", "more", "damage", "is", "seen", "in", "mice", "treated", "with", "both", "DSS", "+", "DT", "treatment", "(", "N", "=", "6", "control", ";", "N", "=", "7", "DT", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(b-c) Krt19+ cells lineage trace entire colonic crypts during both normal homeostasis and injury (N=3-4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines outline the basement membrane. Scale bars (b) =45µm Data are represented as mean ± SEM *P≤0.05, **P≤0.01.DT ablation of Krt19+ cells (N≥3 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines outline the basement membrane. scale bar (e) =30µmDT ablation of Krt19+ cells significantly reduced the number of lineage labeled crypts (N≥3 per condition). Data are represented as mean ± SEM using Student's t-test *P≤0.05, **P≤0.01.(g) Mice body weight and survival remain unchanged between DSS and DSS+DT treated groups (N=6 control; N=7 DT). Data are represented as mean ± SEM using Student's t-test P≤0.05, **P≤0.01.Hematoxylin and Eosin staining of the colonic epithelium after DSS versus DSS+DT showing more damage is seen in mice treated with both DSS+DT treatment (N=6 control; N=7 DT). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines outline the basement membrane. scale bar (h) =1mm.quantification of damaged epithelial area (i), showing more damage is seen in mice treated with both DSS+DT treatment (N=6 control; N=7 DT). Data are represented as mean ± SEM using Student's t-test *P≤0.05, **P≤0.01."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "b", "-", "c", ")", "Notch1", "+", "progenitors", "are", "able", "to", "generate", "Lgr5", "+", "stem", "cells", "and", "contribute", "to", "epithelial", "renewal", "in", "homeostasis", ";", "however", ",", "do", "not", "contribute", "to", "regeneration", "after", "colitis", "(", "N", "=", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Images", "of", "whole", "mount", "showing", "Notch1", "lineage", "labeled", "crypts", ".", "No", "partially", "labeled", "crypts", "were", "found", "after", "Lgr5", "+", "stem", "cell", "ablation", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μm", ".", "Images", "of", "tissue", "sections", "Notch1CreERT2", ";", "ROSA26tdTomato", ";", "Lgr5DTR", "-", "GFP", "mice", "(", "f", ")", "showing", "Notch1", "lineage", "labeled", "crypts", ".", "No", "partially", "labeled", "crypts", "were", "found", "after", "Lgr5", "+", "stem", "cell", "ablation", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(b-c) Notch1+ progenitors are able to generate Lgr5+ stem cells and contribute to epithelial renewal in homeostasis; however, do not contribute to regeneration after colitis (N=4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars=50μm. Data are represented as mean ± SD analyzed using two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test. ****P≤0.0001.Images of whole mount showing Notch1 lineage labeled crypts. No partially labeled crypts were found after Lgr5+ stem cell ablation. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars=50μm.Images of tissue sections Notch1CreERT2; ROSA26tdTomato;Lgr5DTR-GFP mice (f) showing Notch1 lineage labeled crypts. No partially labeled crypts were found after Lgr5+ stem cell ablation. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars=50μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", "-", "b", ")", "Atoh1", "+", "progenitors", "show", "stem", "cell", "capacity", "during", "normal", "homeostasis", "and", "regeneration", ".", "At", "early", "stages", "of", "recovery", ",", "d10", "-", "12", ",", "Atoh1", "+", "cells", "lineage", "trace", "the", "colonic", "crypt", "(", "N", "=", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μm", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "(", "c", "-", "d", ")", "By", "d30", "after", "DSS", ",", "Atoh1", "derived", "stem", "cells", "continue", "to", "lineage", "trace", "complete", "colonic", "crypts", "(", "N", "=", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "first", "two", "panels", "of", "c", "=", "50μm", ";", "scale", "bars", "(", "last", "panel", "of", "c", "=", "100μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "Whole", "mount", "(", "f", ")", "images", "of", "Atoh1", "lineage", "labeled", "crypts", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μmsection", "(", "g", ")", "images", "of", "Atoh1", "lineage", "labeled", "crypts", ".", "Majority", "of", "crypts", "are", "labeled", "after", "Lgr5", "+", "stem", "cell", "ablation", "and", "remain", "label", "with", "the", "appearance", "of", "Lgr5", "+", "stem", "cells", "(", "inset", ",", "arrowheads", ")", ".", "Atoh1", "lineage", "labeled", "crypts", "remain", "by", "d30", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "scale", "bars", "=", "100μm", ".", "(", "h", ")", "Significantly", "increased", "labeling", "of", "crypt", "base", "was", "observed", "at", "d8", "in", "DT", "treated", "mice", "(", "N", "=", "4", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "(", "j", "-", "k", ")", "Scattered", "labeling", "of", "Atoh1", "+", "cells", "in", "control", "conditions", ",", "while", "DSS", "injury", "lead", "to", "Atoh1", "lineage", "labeled", "crypts", "lacking", "Lgr5", "+", "stem", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "blue", ")", ";", "white", "dashed", "lines", "indicate", "basement", "membrane", ".", "Scale", "bars", "=", "50μm", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a-b) Atoh1+ progenitors show stem cell capacity during normal homeostasis and regeneration. At early stages of recovery, d10-12, Atoh1+ cells lineage trace the colonic crypt (N=4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50μm Data are represented as mean ± SD analyzed using two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test *P≤0.05, ***P≤0.001.(c-d) By d30 after DSS, Atoh1 derived stem cells continue to lineage trace complete colonic crypts (N=4 per condition). Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars first two panels of c =50μm; scale bars (last panel of c =100μm. Data are represented as mean ± SD analyzed using two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test *P≤0.05, ***P≤0.001.Whole mount (f) images of Atoh1 lineage labeled crypts. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50μmsection (g) images of Atoh1 lineage labeled crypts. Majority of crypts are labeled after Lgr5+ stem cell ablation and remain label with the appearance of Lgr5+ stem cells (inset, arrowheads). Atoh1 lineage labeled crypts remain by d30. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. scale bars =100μm.(h) Significantly increased labeling of crypt base was observed at d8 in DT treated mice (N=4 per condition). Data are represented as mean ± SD analyzed using Student's t-test with Welch's correction *P≤0.05, ***P≤0.001.(j-k) Scattered labeling of Atoh1+ cells in control conditions, while DSS injury lead to Atoh1 lineage labeled crypts lacking Lgr5+ stem cells. Data information: Nuclei are counterstained with Dapi (blue); white dashed lines indicate basement membrane. Scale bars =50μm Data are represented as mean ± SD analyzed using Student's t-test with Welch's correction *P≤0.05, ***P≤0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "b", "-", "c", ")", "Sporadic", "labeling", "of", "Atoh1", "+", "cells", "after", "4", "-", "OHT", "induction", ".", "Following", "irradiation", ",", "entire", "colonic", "organoids", "exhibit", "full", "lineage", "labeling", "of", "Atoh1", "+", "cells", ",", "characteristic", "of", "multipotent", "stem", "cells", "(", "N", "=", "3", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "100μm", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "c", ")", "(", "d", "-", "e", ")", "Flow", "cytometry", "for", "tdTomato", "+", "cells", "in", "crypt", "epithelium", "from", "DT", "treated", "Atoh1CreERT2", ";", "Lgr5DTR", "-", "GFP", ";", "ROSA26tdTomato", "mice", ".", "(", "f", ")", "tdTomato", "+", "colonic", "organoids", "from", "single", "Atoh1", "-", "tdTomato", "+", "/", "Lgr5", "-", "negative", "cells", "(", "N", "=", "1", ";", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "100μm", "(", "g", ")", "Post", "-", "passage", "colonic", "organoids", "from", "RFP", "+", "cells", "of", "control", "or", "DT", "treated", "mice", "continue", "growing", ".", "tdTomato", "-", "negative", "cells", "of", "control", "or", "DT", "treated", "mice", "also", "form", "colonic", "organoids", "after", "passaging", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "(", "g", ")", "=", "50μm", ".", "(", "h", ")", "tdTomato", "+", "colonic", "organoids", "established", "from", "mice", "in", "which", "Lgr5", "+", "stem", "cells", "have", "been", "ablated", "show", "higher", "growth", "efficiency", "compared", "to", "their", "colonic", "organoid", "counterparts", "(", "N", "=", "1", ";", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "condition", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "analyzed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "h", ")", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(b-c) Sporadic labeling of Atoh1+ cells after 4-OHT induction. Following irradiation, entire colonic organoids exhibit full lineage labeling of Atoh1+ cells, characteristic of multipotent stem cells (N=3 per condition). Data information: Scale bars =100μm Data are represented as mean ± SD analyzed using Student's t-test (c)(d-e) Flow cytometry for tdTomato+ cells in crypt epithelium from DT treated Atoh1CreERT2;Lgr5DTR-GFP;ROSA26tdTomato mice.(f) tdTomato+ colonic organoids from single Atoh1-tdTomato+/Lgr5-negative cells (N=1; n=3 technical replicates per condition). Data information: Scale bars =100μm(g) Post-passage colonic organoids from RFP+ cells of control or DT treated mice continue growing. tdTomato-negative cells of control or DT treated mice also form colonic organoids after passaging. Data information scale bars (g) =50μm.(h) tdTomato+ colonic organoids established from mice in which Lgr5+ stem cells have been ablated show higher growth efficiency compared to their colonic organoid counterparts (N=1; n=3 technical replicates per condition). Data are represented as mean ± SD analyzed using two-way ANOVA with Sidak's multiple comparisons test (h). *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "b", ")", "Atoh1", "+", "lineage", "labelling", "post", "-", "DSS", "and", "DSS", "+", "DT", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "(", "b", ")", "=", "200μm", "(", "c", ")", "DSS", "+", "DT", "treated", "-", "mice", "exhibit", "significant", "weight", "loss", "and", "lower", "survival", "compared", "to", "DSS", "alone", "(", "N", "=", "4", "-", "7", "control", ";", "N", "=", "3", "-", "4", "DSS", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "d", "-", "e", ")", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "staining", "of", "colonic", "epithelium", "after", "DSS", "versus", "DSS", "+", "DT", "(", "d", ")", ".", "Extensive", "epithelial", "damage", "was", "observed", "(", "d", ",", "arrow", ")", "and", "quantified", "of", "in", "DSS", "+", "DT", "treated", "mice", "(", "N", "=", "7", "control", ";", "N", "=", "4", "DSS", ")", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "(", "d", ")", "=", "400μ", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "g", "-", "h", ")", "DT", "treatment", "effectively", "ablates", "Atoh1", "+", "cells", "shown", "by", "reduced", "number", "of", "tdTomato", "+", "cells", "per", "organoid", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "=", "100μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "i", "-", "j", ")", "Concurrent", "irradiation", "injury", "and", "Atoh1", "+", "cell", "ablation", "results", "in", "significantly", "reduced", "organoid", "survival", "(", "N", "=", "3", ";", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", ";", "scale", "bars", "=", "100μm", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(b) Atoh1+ lineage labelling post-DSS and DSS+DT. Data information: Scale bars (b)=200μm (c) DSS+DT treated-mice exhibit significant weight loss and lower survival compared to DSS alone (N=4-7 control; N=3-4 DSS). Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05.(d-e) Hematoxylin and Eosin staining of colonic epithelium after DSS versus DSS+DT (d). Extensive epithelial damage was observed (d, arrow) and quantified of in DSS+DT treated mice (N=7 control; N=4 DSS). Data information scale bars (d)=400μ Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05.(g-h) DT treatment effectively ablates Atoh1+ cells shown by reduced number of tdTomato+ cells per organoid. Data information scale bars =100μm. Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05.(i-j) Concurrent irradiation injury and Atoh1+ cell ablation results in significantly reduced organoid survival (N=3; n=3 technical replicates per condition). Data information: ; scale bars =100μm. Data are represented as mean ± SEM analyzed using Student's t-test. *P≤0.05."}
{"words": ["Figure", "1B", ":", "Double", "-", "IHC", "of", "coronal", "brain", "sections", "(", "40", "μm", ")", "of", "a", "littermate", "(", "LM", ")", "and", "a", "NexCre", "cTKO", "mouse", "(", "age", ":", "5", "months", ")", "stained", "for", "Ctip2", "(", "green", ",", "expressed", "in", "layer", "V", "/", "VI", ")", "and", "Calbindin", "(", "red", ",", "expressed", "in", "layer", "II", "/", "III", "and", "to", "some", "extent", "in", "layer", "V", ")", ".", "Note", "that", "no", "gross", "abnormalities", "in", "cortical", "lamination", "were", "observed", ".", "Layers", "of", "DAPI", "stained", "cell", "nuclei", "are", "denoted", "on", "the", "right", "(", "I", "-", "VI", ")", ",", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "C", ":", "Giemsa", "-", "stained", ",", "glycolmethacrylate", "-", "embedded", "coronal", "brain", "sections", "(", "bregma", "-", "1", ".", "9", ")", "displaying", "the", "hippocampus", "and", "adjacent", "callosal", "fiber", "tracts", "of", "a", "wildtype", "(", "WT", ",", "top", ")", ",", "littermate", "control", "(", "LM", ",", "middle", ")", "and", "a", "NexCre", "cTKO", "(", "cTKO", ",", "bottom", ";", "age", ":", "5", "-", "6", "months", ")", ".", "Note", "the", "agenesis", "of", "the", "corpus", "callosum", "(", "no", "CC", ")", "in", "NexCre", "cTKO", "mice", ",", "which", "should", "always", "be", "present", "at", "this", "bregma", "and", "in", "sections", "in", "which", "the", "medial", "habenula", "(", "mHb", ")", "is", "present", "(", "CC", "in", "WT", "and", "LM", ")", ".", "While", "WTs", "and", "LMs", "show", "a", "compact", "layer", "of", "CA1", "cells", ",", "NexCre", "cTKOs", "display", "a", "bilaminar", "cytoarchitecture", "(", "boxed", "regions", "marking", "higher", "magnification", "to", "the", "right", ")", "with", "scattered", "ectopic", "cells", "in", "the", "stratum", "radiatum", "(", "white", "arrowheads", ")", ".", "In", "addition", ",", "the", "CA3", "appears", "less", "compact", "(", "red", "arrowheads", ")", ".", "Layer", "identity", "visualized", "via", "Calbindin", "staining", "(", "right", "panel", ",", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B: Double-IHC of coronal brain sections (40 μm) of a littermate (LM) and a NexCre cTKO mouse (age: 5 months) stained for Ctip2 (green, expressed in layer V/VI) and Calbindin (red, expressed in layer II/III and to some extent in layer V). Note that no gross abnormalities in cortical lamination were observed. Layers of DAPI stained cell nuclei are denoted on the right (I-VI), scale bar: 100 µm.C: Giemsa-stained, glycolmethacrylate-embedded coronal brain sections (bregma -1.9) displaying the hippocampus and adjacent callosal fiber tracts of a wildtype (WT, top), littermate control (LM, middle) and a NexCre cTKO (cTKO, bottom; age: 5-6 months). Note the agenesis of the corpus callosum (no CC) in NexCre cTKO mice, which should always be present at this bregma and in sections in which the medial habenula (mHb) is present (CC in WT and LM). While WTs and LMs show a compact layer of CA1 cells, NexCre cTKOs display a bilaminar cytoarchitecture (boxed regions marking higher magnification to the right) with scattered ectopic cells in the stratum radiatum (white arrowheads). In addition, the CA3 appears less compact (red arrowheads). Layer identity visualized via Calbindin staining (right panel, scale bar: 50 µm)."}
{"words": ["Figure", "2C", ":", "Representative", "3D", "reconstructions", "of", "CA1", "pyramidal", "neurons", "from", "deep", "(", "left", ",", "dark", "blue", ")", "and", "superficial", "(", "right", ",", "light", "blue", ")", "radial", "layers", ".", "D", ":", "Sholl", "analysis", "reveals", "no", "genotype", "effect", "on", "basal", "dendritic", "segments", "of", "deep", "CA1", "pyramidal", "neurons", "(", "dCA1", ";", "LM", ":", "n", "=", "21", ",", "N", "=", "7", ";", "cTKO", ":", "n", "=", "21", "/", "N", "=", "6", ")", ".", "E", ":", "Compared", "to", "littermate", "controls", ",", "dCA1", "neurons", "of", "NexCre", "cTKO", "animals", "show", "no", "significant", "reduction", "in", "total", "dendritic", "length", "in", "basal", "dendrites", "(", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "nsp", "=", "0", ".", "4979", ")", ".", "F", ":", "The", "number", "of", "primary", "basal", "dendrites", "is", "significantly", "reduced", "in", "NexCre", "cTKO", "animals", "compared", "to", "LM", "in", "dCA1", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0032", ")", ".", "G", ":"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C: Representative 3D reconstructions of CA1 pyramidal neurons from deep (left, dark blue) and superficial (right, light blue) radial layers.D: Sholl analysis reveals no genotype effect on basal dendritic segments of deep CA1 pyramidal neurons (dCA1; LM: n=21, N=7; cTKO: n=21/N=6). E: Compared to littermate controls, dCA1 neurons of NexCre cTKO animals show no significant reduction in total dendritic length in basal dendrites (unpaired Student's t-test, nsp = 0.4979). F: The number of primary basal dendrites is significantly reduced in NexCre cTKO animals compared to LM in dCA1 (Mann-Whitney test, **p = 0.0032). G: "}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ":", "Spine", "density", "of", "deep", "CA1", "pyramidal", "cells", "is", "significantly", "reduced", "in", "basal", "dendritic", "segments", "(", "A", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0067", ")", ",", "while", "it", "is", "unchanged", "in", "midapical", "dendritic", "segments", "(", "B", ";", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "nsp", "=", "0", ".", "4949", ")", ".", "C", ":", "Representative", "images", "of", "basal", "and", "midapical", "dendritic", "segments", "from", "both", "radial", "layers", ".", "Brightness", "and", "contrast", "were", "adjusted", "to", "ensure", "a", "uniform", "appearance", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "D"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B: Spine density of deep CA1 pyramidal cells is significantly reduced in basal dendritic segments (A; unpaired Student's t-test, **p = 0.0067), while it is unchanged in midapical dendritic segments (B; unpaired Student's t-test, nsp = 0.4949). C: Representative images of basal and midapical dendritic segments from both radial layers. Brightness and contrast were adjusted to ensure a uniform appearance. Scale bar: 5 µm. D "}
{"words": ["Figure", "4A", ":", "mEPSC", "and", "mIPSC", "sample", "traces", "of", "recordings", "from", "deep", "CA1", "pyramidal", "cells", ".", "B", "-", "E", ":", "Bar", "graphs", "of", "mEPSC", "and", "mIPSC", "frequencies", "and", "amplitudes", "in", "deep", "CA1", "pyramidal", "cells", ".", "mEPSC", "frequency", "was", "not", "different", "in", "deep", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "adult", "(", "4", "months", ")", "NexCre", "cTKO", "versus", "littermate", "controls", "(", "B", ",", "p", "=", "0", ".", "6415", ")", ".", "mEPSC", "amplitude", "was", "increased", "in", "deep", "CA1", "pyramidal", "cells", "of", "NexCre", "cTKO", "compared", "to", "LM", "control", "cells", "(", "C", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0363", ")", ".", "mIPSC", "frequency", "was", "not", "different", "in", "deep", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "adult", "(", "4", "months", ")", "NexCre", "cTKO", "versus", "littermate", "controls", "(", "D", ",", "p", "=", "0", ".", "0564", ")", "and", "mIPSC", "amplitude", "was", "increased", "in", "deep", "CA1", "pyramidal", "cells", "of", "NexCre", "cTKO", "compared", "to", "LM", "(", "E", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0356", ")", ".", "F", ":", "mEPSC", "and", "mIPSC", "sample", "traces", "of", "recordings", "from", "superficial", "CA1", "pyramidal", "cells", ".", "G"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A: mEPSC and mIPSC sample traces of recordings from deep CA1 pyramidal cells. B - E: Bar graphs of mEPSC and mIPSC frequencies and amplitudes in deep CA1 pyramidal cells. mEPSC frequency was not different in deep CA1 pyramidal neurons of adult (4 months) NexCre cTKO versus littermate controls (B, p = 0.6415). mEPSC amplitude was increased in deep CA1 pyramidal cells of NexCre cTKO compared to LM control cells (C, *p = 0.0363). mIPSC frequency was not different in deep CA1 pyramidal neurons of adult (4 months) NexCre cTKO versus littermate controls (D, p = 0.0564) and mIPSC amplitude was increased in deep CA1 pyramidal cells of NexCre cTKO compared to LM (E, *p = 0.0356). F: mEPSC and mIPSC sample traces of recordings from superficial CA1 pyramidal cells. G "}
{"words": ["Figure", "5A", ":", "Diurnal", "behavior", "in", "the", "home", "cage", "(", "HC", ")", ".", "NexCre", "cTKOs", "show", "overshooting", "activity", "in", "the", "dark", "phase", ".", "Line", "graphs", "illustrate", "the", "average", "locomotion", "per", "hour", ".", "[", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "geno", "F", "(", "1", ",", "32", ")", "=", "9", ".", "503", ",", "p", "=", "0", ".", "0042", ";", "timepoint", "F", "(", "6", ".", "102", ",", "195", ".", "3", ")", "=", "10", ".", "51", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "timepoint", "×", "geno", "F", "(", "47", ",", "1504", ")", "=", "5", ".", "874", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "]", ".", "I", ":", "Sociability", "in", "the", "three", "chambers", "test", "(", "3CT", ")", ".", "LM", "controls", "spend", "more", "time", "with", "mouse", "stranger", "1", "(", "S1", ")", "whereas", "NexCre", "cTKOs", "spend", "comparable", "time", "exploring", "the", "novel", "object", "(", "NO", ")", "or", "S1", ".", "Bottom", ":", "schematic", "representation", "of", "test", ".", "[", "Paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparison", "between", "chambers", "LM", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ";", "Wilcoxon", "test", "between", "chambers", "NexCre", "cTKO", "ns", "p", "=", "0", ".", "5412", "]", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A: Diurnal behavior in the home cage (HC). NexCre cTKOs show overshooting activity in the dark phase. Line graphs illustrate the average locomotion per hour. [Sidak's multiple comparisons test, geno F(1,32) = 9.503, p = 0.0042; timepoint F(6.102,195.3) = 10.51, p < 0.0001; timepoint × geno F(47,1504) = 5.874, p < 0.0001].I: Sociability in the three chambers test (3CT). LM controls spend more time with mouse stranger 1 (S1) whereas NexCre cTKOs spend comparable time exploring the novel object (NO) or S1. Bottom: schematic representation of test. [Paired Student's t-test comparison between chambers LM ***p = 0.0002; Wilcoxon test between chambers NexCre cTKO ns p = 0.5412]."}
{"words": ["Figure", "6C", ":", "T", "-", "Maze", "alternation", "test", "shows", "that", "spontaneous", "alternation", "is", "absent", "in", "NexCre", "cTKOs", ".", "[", "geno", "F", "(", "1", ",", "16", ")", "=", "18", ".", "29", ",", "p", "=", "0", ".", "0006", "]", ".", "Chance", "level", "is", "indicated", "by", "a", "dotted", "line", ".", "N", ":", "Morris", "Water", "Maze", "(", "MWM", ")", ",", "escape", "latency", ".", "During", "place", "navigation", "training", ",", "NexCre", "cTKO", "animals", "showed", "no", "evidence", "of", "learning", ".", "[", "geno", "F", "(", "1", ",", "18", ")", "=", "30", ".", "53", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "day", "F", "(", "4", ",", "72", ")", "=", "13", ".", "35", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "day", "×", "geno", "F", "(", "4", ",", "72", ")", "=", "11", ".", "77", "p", "<", "0", ".", "0001", "]", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C: T-Maze alternation test shows that spontaneous alternation is absent in NexCre cTKOs. [geno F(1,16) = 18.29, p = 0.0006]. Chance level is indicated by a dotted line.N: Morris Water Maze (MWM), escape latency. During place navigation training, NexCre cTKO animals showed no evidence of learning. [geno F(1,18) = 30.53, p < 0.0001; day F(4,72) = 13.35, p < 0.0001 ; day × geno F(4,72) = 11.77 p < 0.0001]."}
{"words": ["Figure", "1A", "The", "expression", "of", "LINC00839", "in", "CRC", "tissues", "and", "normal", "mucosa", "tissues", "in", "the", "UALCAN", "database", ".", "B", ",", "C", ",", "D", "The", "expression", "of", "LINC00839", "in", "unpaired", "CRC", "and", "normal", "samples", "in", "the", "LnCAR", "database", "(", "GSE37364", ",", "GSE71187", ",", "and", "GSE33113", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", "middle", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "upper", "and", "lower", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "E", ",", "F", "The", "expression", "levels", "of", "LINC00839", "in", "tumour", "tissues", "and", "NATs", "from", "the", "CRC", "cohort", "(", "n", "=", "45", ")", ".", "nmCRC", "denotes", "CRC", "patients", "without", "metastases", ",", "and", "mCRC", "denotes", "CRC", "patients", "with", "metastases", ".", "Data", "information", ":", "In", "E", ",", "F", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "G", "Representative", "ISH", "staining", "of", "LINC00839", "in", "paraffin", "-", "embedded", "samples", "of", "CRC", "tumour", "tissues", "and", "NATs", ".", "(", "a", ")", "Expression", "of", "LINC00839", "in", "tumour", "tissues", "and", "NATs", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "b", ")", "Magnification", "of", "normal", "mucosal", "area", "and", "(", "c", ")", "magnification", "of", "the", "tumour", "area", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "d", ")", "Weakly", "positive", "staining", "of", "LINC00839", "in", "normal", "mucosa", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "e", ")", "Strong", "positive", "staining", "of", "LINC00839", "in", "tumours", "and", "(", "f", ")", "magnification", "of", "the", "local", "area", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "H", "The", "expression", "score", "of", "the", "tumours", "and", "NATs", "in", "the", "ISH", "cohort", "(", "n", "=", "222", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "H", "the", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "I", "Differential", "expression", "of", "LINC00839", "in", "nonmetastatic", "CRC", "patients", "(", "nmCRC", ")", "and", "metastatic", "CRC", "patients", "(", "mCRC", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "I", ",", "the", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "J", "Expression", "of", "LINC00839", "in", "CRC", "patients", "with", "early", "-", "stage", "(", "stage", "I", "and", "II", ")", "and", "advanced", "-", "stage", "(", "stage", "III", "and", "IV", ")", "disease", ".", "Data", "information", ":", "In", "J", ",", "middle", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "upper", "and", "lower", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "overall", "survival", "rate", "of", "the", "ISH", "CRC", "cohort", ".", "L", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "overall", "disease", "-", "free", "survival", "rate", "of", "the", "ISH", "CRC", "cohort", ".", "M", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "the", "disease", "-", "free", "survival", "rate", "of", "CRC", "patients", "in", "the", "LnCAR", "database", "(", "GSE33113", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A The expression of LINC00839 in CRC tissues and normal mucosa tissues in the UALCAN database. B, C, D The expression of LINC00839 in unpaired CRC and normal samples in the LnCAR database (GSE37364, GSE71187, and GSE33113). Data information: In A, B, C, D middle lines represent the median, and the upper and lower lines represent the upper and lower quartiles. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.E, F The expression levels of LINC00839 in tumour tissues and NATs from the CRC cohort (n = 45). nmCRC denotes CRC patients without metastases, and mCRC denotes CRC patients with metastases. Data information: In E, F, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.G Representative ISH staining of LINC00839 in paraffin-embedded samples of CRC tumour tissues and NATs. (a) Expression of LINC00839 in tumour tissues and NATs. Scale bars, 100 μm. (b) Magnification of normal mucosal area and (c) magnification of the tumour area. Scale bars, 50 μm. (d) Weakly positive staining of LINC00839 in normal mucosa. Scale bars, 50 μm. (e) Strong positive staining of LINC00839 in tumours and (f) magnification of the local area. Scale bars, 100 μm.H The expression score of the tumours and NATs in the ISH cohort (n = 222). Data information: In H the data are shown as the mean ± SD and were analysed by Student's t test. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.I Differential expression of LINC00839 in nonmetastatic CRC patients (nmCRC) and metastatic CRC patients (mCRC). Data information: In I, the data are shown as the mean ± SD and were analysed by Student's t test. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.J Expression of LINC00839 in CRC patients with early-stage (stage I and II) and advanced-stage (stage III and IV) disease. Data information: In J, middle lines represent the median, and the upper and lower lines represent the upper and lower quartiles. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.Kaplan-Meier analysis of overall survival rate of the ISH CRC cohort.L Kaplan-Meier analysis of overall disease-free survival rate of the ISH CRC cohort. M Kaplan-Meier analysis of the disease-free survival rate of CRC patients in the LnCAR database (GSE33113)."}
{"words": ["Figure", "2C", "Colony", "formation", "assay", "was", "performed", "with", "LINC00839", "-", "overexpressing", "cells", "and", "vector", "control", "cells", ".", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "000D", "Wound", "-", "healing", "assay", "was", "performed", "with", "LINC00839", "-", "overexpressing", "cells", "and", "vector", "control", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "000E", "Matrigel", "invasion", "assay", "was", "performed", "with", "LINC00839", "-", "overexpressing", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "000F", "The", "CDX", "model", "showing", "the", "effect", "of", "LINC00839", "on", "tumour", "growth", ".", "Representative", "image", "of", "tumours", "harvested", "from", "the", "mouse", "model", "(", "upper", "panel", ")", ",", "the", "quantitative", "analysis", "of", "tumour", "weight", "and", "tumour", "volume", "(", "medium", "panel", ")", ",", "and", "representative", "images", "and", "quantification", "of", "IHC", "staining", "of", "Ki", "-", "67", "in", "tumours", "(", "bottom", "panel", ")", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "cohort", ",", "and", "the", "results", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "medium", "left", "and", "low", "right", "panel", ")", "and", "ANOVA", "(", "medium", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "(", "n", " ", "=", " ", "6", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "000", ".", "G", "The", "CRC", "orthotopic", "mouse", "model", "revealed", "the", "effect", "of", "LINC00839", "on", "tumour", "development", ".", "Representative", "images", "of", "primary", "tumours", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "and", "liver", "metastasis", "(", "blue", "arrowheads", ")", "in", "the", "model", "(", "upper", "panel", ")", ",", "analysis", "of", "tumour", "volume", "and", "the", "number", "of", "mice", "with", "liver", "metastasis", "(", "medium", "panel", ")", ",", "and", "H", "&", "E", "staining", "of", "tumours", "and", "metastases", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "cohort", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "(", "n", " ", "=", " ", "6", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Colony formation assay was performed with LINC00839-overexpressing cells and vector control cells. , the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 biological replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000D Wound-healing assay was performed with LINC00839-overexpressing cells and vector control cells. Scale bars, 100 μm. , the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 biological replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000E Matrigel invasion assay was performed with LINC00839-overexpressing cells. Scale bars, 100 μm. , the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 biological replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000F The CDX model showing the effect of LINC00839 on tumour growth. Representative image of tumours harvested from the mouse model (upper panel), the quantitative analysis of tumour weight and tumour volume (medium panel), and representative images and quantification of IHC staining of Ki-67 in tumours (bottom panel) (n = 6 for each cohort, and the results are presented as the mean ± SD, Student's t test (medium left and low right panel) and ANOVA (medium right). Scale bars, 100 μm (n = 6 biological replicates . Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000. G The CRC orthotopic mouse model revealed the effect of LINC00839 on tumour development. Representative images of primary tumours (yellow arrowheads) and liver metastasis (blue arrowheads) in the model (upper panel), analysis of tumour volume and the number of mice with liver metastasis (medium panel), and H&E staining of tumours and metastases (n = 6 for each cohort). Scale bars, 100 μm (n = 6 biological replicates . Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000"}
{"words": ["Figure", "3A", "An", "RNA", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "to", "identify", "proteins", "that", "bind", "to", "LINC00839", "in", "HCT116", "cells", ".", "B", "RNA", "pull", "-", "down", "assay", "and", "WB", "showed", "that", "biotinylated", "LINC00839", "can", "bind", "to", "Ruvb1", "in", "HCT116", "cells", ".", "Dot", "blot", "of", "RNA", "-", "protein", "interactions", "indicating", "equal", "amounts", "of", "RNA", "used", "in", "the", "assay", ".", "C", "RIP", "experiments", "were", "performed", "to", "confirm", "the", "binding", "of", "LINC00839", "to", "Ruvb1", ".", "IgG", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "antibody", ".", "Primers", "specific", "for", "U6", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "negative", "control", "primers", ".", "Data", "information", ":", "In", "C", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "D", "Different", "fragments", "of", "LINC00839", "(", "solid", "line", ")", "and", "its", "antisense", "sequence", "(", "dotted", "line", ")", "were", "used", "for", "the", "RNA", "pull", "-", "down", "assay", "and", "the", "subsequent", "WB", ".", "E", "Full", "length", "LINC00839", ",", "antisense", "sequence", "of", "LINC00839", ",", "and", "LINC00839", "sequence", "lacking", "nucleotides", "1033", "-", "1290", "were", "used", "for", "the", "RNA", "pull", "-", "down", "assay", "and", "the", "subsequent", "WB", ".", "F", "RIP", "experiments", "were", "performed", "by", "incubating", "Tip60", ",", "INO80", ",", "SRCAP", ",", "and", "PIH1D1", "antibodies", "with", "HCT116", "cell", "lysates", ".", "Data", "information", ":", "In", "F", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "G", "The", "effect", "of", "LINC00839", "on", "the", "expression", "of", "Tip60", "and", "Ruvb1", "was", "determined", "by", "WB", ".", "H", "Interaction", "of", "endogenous", "Ruvb1", "and", "Tip60", "in", "CRC", "cells", "was", "confirmed", "by", "Co", "-", "IP", ".", "I", "The", "interaction", "between", "Ruvb1", "and", "Tip60", "in", "cells", "overexpressing", "wild", "-", "type", "LINC00839", "and", "LINC", "-", "Δ5", "was", "confirmed", "by", "Co", "-", "IP", ".", "J", "The", "interaction", "between", "Ruvb1", "and", "Tip60", "in", "LINC00839", "-", "KD", "cells", "and", "cells", "expressing", "LINC", "-", "Δ5", "was", "confirmed", "by", "Co", "-", "IP", ".", "K", "Acetylase", "activity", "assays", "were", "performed", "with", "LINC00839", "-", "overexpressing", "and", "LINC00839", "-", "knockdown", "cells", ".", "Data", "information", ":", "In", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "L", "Acetylase", "activity", "was", "measured", "in", "SW480", "and", "LoVo", "cells", "subjected", "to", "different", "treatments", ".", "Data", "information", ":", "In", "L", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A An RNA pull-down assay was performed to identify proteins that bind to LINC00839 in HCT116 cells.B RNA pull-down assay and WB showed that biotinylated LINC00839 can bind to Ruvb1 in HCT116 cells. Dot blot of RNA-protein interactions indicating equal amounts of RNA used in the assay.C RIP experiments were performed to confirm the binding of LINC00839 to Ruvb1. IgG was used as a negative control antibody. Primers specific for U6 and GAPDH were used as negative control primers. Data information: In C, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by unpaired t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.D Different fragments of LINC00839 (solid line) and its antisense sequence (dotted line) were used for the RNA pull-down assay and the subsequent WB.E Full length LINC00839, antisense sequence of LINC00839, and LINC00839 sequence lacking nucleotides 1033-1290 were used for the RNA pull-down assay and the subsequent WB.F RIP experiments were performed by incubating Tip60, INO80, SRCAP, and PIH1D1 antibodies with HCT116 cell lysates. Data information: In F, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by unpaired t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.G The effect of LINC00839 on the expression of Tip60 and Ruvb1 was determined by WB.H Interaction of endogenous Ruvb1 and Tip60 in CRC cells was confirmed by Co-IP.I The interaction between Ruvb1 and Tip60 in cells overexpressing wild-type LINC00839 and LINC-Δ5 was confirmed by Co-IP.J The interaction between Ruvb1 and Tip60 in LINC00839-KD cells and cells expressing LINC-Δ5 was confirmed by Co-IP.K Acetylase activity assays were performed with LINC00839-overexpressing and LINC00839-knockdown cells. Data information: In the data are presented as the mean ± SD and were analysed by unpaired t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.L Acetylase activity was measured in SW480 and LoVo cells subjected to different treatments. Data information: In L, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by unpaired t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "4B", "Heatmap", "of", "DEGs", "related", "to", "OXPHOS", "and", "mitochondrial", "biogenesis", ".", "Expression", "levels", "are", "shown", "in", "log2", "scale", "of", "normalized", "intensity", "values", "(", "see", "colour", "gradient", ")", "ranging", "from", "low", "(", "blue", ")", "to", "high", "(", "red", ")", "expression", ".", "D", ",", "E", "The", "ATP", "levels", "and", "the", "NAD", "/", "NADH", "ratio", "were", "measured", "in", "LINC00839", "-", "overexpressing", "and", "LINC00839", "-", "KD", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "F", "Expression", "of", "MT", "-", "ND5", ",", "MT", "-", "CYB", ",", "MT", "-", "CO1", ",", "and", "TFAM", "in", "LINC00839", "-", "overexpressing", "and", "LINC00839", "-", "KD", "cells", "as", "determined", "by", "WB", ".", "G", "Analysis", "of", "NRF1", "expression", "in", "CRC", "tissues", "(", "T", ")", "and", "normal", "tissues", "(", "N", ")", "the", "GEPIA", "database", ".", "Data", "information", ":", "In", "G", ",", "the", "middle", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "upper", "and", "lower", "lines", "represent", "the", "upper", "and", "lower", "quartiles", ";", "the", "data", "were", "analysed", "by", "ANOVA", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05H", "Correlation", "analysis", "of", "LINC00839", "and", "NRF1", "mRNA", "levels", "in", "the", "TCGA", "and", "GTEx", "databases", "(", "Pearson", ")", ".", "I", ",", "Expression", "of", "NRF1", "in", "LINC00839", "-", "overexpressin", "and", "LINC00839", "-", "KD", "cells", "was", "measured", "by", "qPCR", "Data", "information", ":", "In", "I", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "J", "Expression", "of", "NRF1", "in", "LINC00839", "-", "overexpressin", "and", "LINC00839", "-", "KD", "cells", "was", "measured", "by", "WB", ".", "K", ",", "L", "The", "enrichment", "of", "the", "NRF1", "promoter", "(", "P1", "-", "P10", ")", "by", "H4K5ac", "and", "H4K8ac", "antibodies", "in", "LINC00839", "-", "overexpressing", "and", "control", "LoVo", "cells", "as", "determined", "by", "CHIP", "assay", ".", "Normal", "IgG", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "In", "K", ",", "L", ",", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "M", ",", "N", "The", "enrichment", "of", "the", "P2", "and", "P3", "fragments", "by", "H4K5ac", "and", "H4K8ac", "antibodies", "in", "LoVo", "cells", "as", "determined", "by", "CHIP", "assay", ".", "Normal", "IgG", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "In", "M", ",", "N", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "O", "The", "enrichment", "of", "NRF1", "with", "a", "probe", "targeting", "LINC00839", "relative", "to", "a", "NC", "probe", "in", "HCT116", "cells", ",", "as", "determined", "by", "ChIRP", "assay", ".", "LacZ", "served", "as", "a", "negative", "control", "(", "NC", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "O", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "technical", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Heatmap of DEGs related to OXPHOS and mitochondrial biogenesis. Expression levels are shown in log2 scale of normalized intensity values (see colour gradient) ranging from low (blue) to high (red) expression.D, E The ATP levels and the NAD/NADH ratio were measured in LINC00839-overexpressing and LINC00839-KD cells (mean ± SD, Student's t test, n = 3 biological replicates). Data information: Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.F Expression of MT-ND5, MT-CYB, MT-CO1, and TFAM in LINC00839-overexpressing and LINC00839-KD cells as determined by WB.G Analysis of NRF1 expression in CRC tissues (T) and normal tissues (N) the GEPIA database. Data information: In G, the middle lines represent the median, and the upper and lower lines represent the upper and lower quartiles; the data were analysed by ANOVA. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05H Correlation analysis of LINC00839 and NRF1 mRNA levels in the TCGA and GTEx databases (Pearson).I, Expression of NRF1 in LINC00839-overexpressin and LINC00839-KD cells was measured by qPCR Data information: In I, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.J Expression of NRF1 in LINC00839-overexpressin and LINC00839-KD cells was measured by WB.K, L The enrichment of the NRF1 promoter (P1-P10) by H4K5ac and H4K8ac antibodies in LINC00839-overexpressing and control LoVo cells as determined by CHIP assay. Normal IgG was used as a negative control. Data information: In K, L, , the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.M, N The enrichment of the P2 and P3 fragments by H4K5ac and H4K8ac antibodies in LoVo cells as determined by CHIP assay. Normal IgG was used as a negative control. Data information: In M, N , the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.O The enrichment of NRF1 with a probe targeting LINC00839 relative to a NC probe in HCT116 cells, as determined by ChIRP assay. LacZ served as a negative control (NC). Data information: In O, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 technical replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "ATP", "levels", "and", "NAD", "/", "NADH", "ratios", "were", "measured", "in", "SW480", "and", "LoVo", "cells", ".", "Data", "information", ":", "In", "A", ",", "B", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "C", "Expression", "of", "genes", "related", "to", "mitochondrial", "biogenesis", "and", "EMT", "in", "SW480", "and", "LoVo", "cells", "as", "determined", "by", "WB", ".", "D", "Invasion", "of", "SW480", "and", "LoVo", "cells", "was", "assessed", "by", "Matrigel", "invasion", "assay", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "In", "D", ",", "the", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "and", "were", "analysed", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "biological", "replicates", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "E", "Representative", "images", "of", "primary", "tumours", "(", "yellow", "arrowhead", ")", "and", "metastases", "in", "the", "orthotopic", "implantation", "models", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "cohort", ",", "left", "panel", ")", ".", "The", "number", "of", "mice", "with", "liver", "metastasis", "(", "blue", "arrowhead", ")", "was", "determined", ".", "The", "primary", "tumour", "volume", "in", "each", "group", "was", "calculated", "(", "right", "panel", ")", ".", "H", "&", "E", "staining", "of", "tumours", "and", "metastases", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", "(", "n", " ", "=", " ", "6", "biological", "replicates", ")", ".", "F", "ISH", "staining", "of", "LINC00839", "and", "IHC", "staining", "of", "NRF1", ",", "H4K5ac", ",", "and", "H4K8ac", "in", "paraffin", "-", "embedded", "samples", "of", "CRC", "tumour", "tissues", "and", "NATs", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "G", ",", "H", ",", "Correlation", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "LINC00839", "and", "NRF1", "(", "G", ")", ",", "H4K5ac", "(", "H", ")", "in", "CRC", "patients", "(", "n", "=", "120", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "G", ",", "H", "show", "the", "Pearson", "correlation", "coefficient", "results", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "I", "Correlation", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "LINC00839", "and", "H4K8ac", "(", "I", ")", "in", "CRC", "patients", "(", "n", "=", "120", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "I", "show", "the", "Pearson", "correlation", "coefficient", "results", ".", "Across", "experiments", ",", "the", "P", "values", "are", "as", "follows", ":", "ns", " ", "=", " ", "not", "significant", ",", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "J", "Correlation", "of", "NRF1", "expression", "with", "the", "overall", "survival", "rate", "in", "patients", "with", "CRC", "(", "n", "=", "120", ")", ".", "NRF1", "expression", "was", "stratified", "as", "high", "and", "low", "according", "to", "the", "median", "expression", "level", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B ATP levels and NAD/NADH ratios were measured in SW480 and LoVo cells. Data information: In A, B, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 biological replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.C Expression of genes related to mitochondrial biogenesis and EMT in SW480 and LoVo cells as determined by WB.D Invasion of SW480 and LoVo cells was assessed by Matrigel invasion assay. Scale bars, 100 μm. Data information: In D, the data are presented as the mean ± SD and were analysed by Student's t test, n = 3 biological replicates. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.E Representative images of primary tumours (yellow arrowhead) and metastases in the orthotopic implantation models (n = 6 for each cohort, left panel). The number of mice with liver metastasis (blue arrowhead) was determined. The primary tumour volume in each group was calculated (right panel). H&E staining of tumours and metastases (bottom panel). Scale bars, 200 μm (n = 6 biological replicates).F ISH staining of LINC00839 and IHC staining of NRF1, H4K5ac, and H4K8ac in paraffin-embedded samples of CRC tumour tissues and NATs. Scale bars, 200 μm.G, H, Correlation analysis of the expression of LINC00839 and NRF1 (G), H4K5ac (H) in CRC patients (n = 120). Data information: In G, H show the Pearson correlation coefficient results. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.I Correlation analysis of the expression of LINC00839 and H4K8ac (I) in CRC patients (n = 120). Data information: In I show the Pearson correlation coefficient results. Across experiments, the P values are as follows: ns = not significant, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.J Correlation of NRF1 expression with the overall survival rate in patients with CRC (n = 120). NRF1 expression was stratified as high and low according to the median expression level."}
{"words": ["Figure", "1One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNA", "encoding", "dkk1", "(", "35", "/", "45", "pg", ")", "protein", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "ten", "control", "embryos", "at", "neurula", "stage", "17", "(", "lane", "2", ")", "and", "ten", "embryos", "from", "each", "dkk1", "injected", "group", "(", "lanes", "3", "-", "4", ")", ".", "Various", "neural", "AP", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "cement", "gland", "and", "forebrain", "(", "xag1", ",", "xanf1", ",", "otx2", ")", ",", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb3", ")", ",", "hindbrain", "/", "spinal", "cord", "border", "(", "hoxb4", ")", ",", "and", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "cdx1", "-", "2", "-", "4", ",", "hoxd10", ")", ".", "Ef1α", "serves", "as", "a", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "the", "zygotic", "-", "expressing", "Nxfz8", "/", "pCS2", "encoding", "plasmid", "(", "100", "/", "200", "pg", ")", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "ten", "control", "embryos", "at", "neurula", "stage", "17", "(", "lane", "2", ")", "and", "ten", "embryos", "from", "each", "Nxfz8", "injected", "group", "(", "lanes", "3", "-", "4", ")", ".", "Various", "neural", "AP", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "cement", "gland", "and", "forebrain", "(", "xag1", ",", "xanf1", ",", "otx2", ")", ",", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb3", ")", ",", "hindbrain", "/", "spinal", "cord", "border", "(", "hoxb4", ")", ",", "and", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "cdx1", "-", "2", "-", "4", ",", "hoxd10", ")", ".", "Ef1α", "serves", "as", "a", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "Embryos", "from", "the", "same", "experiment", "as", "in", "(", "A", ")", "underwent", "in", "situ", "hybridization", ".", "Expression", "of", "the", "hindbrain", "marker", "krox20", "(", "upper", "two", "panels", ")", "was", "reduced", "by", "Dkk1", "(", "45pg", ")", "in", "83", "%", "of", "the", "embryos", "(", "n", "=", "18", ")", ".", "Expression", "of", "spinal", "cord", "markers", "(", "hoxb9", ",", "cdx4", ",", "hox10", ")", "was", "normal", ",", "being", "unchanged", "in", "89", "%", "of", "the", "embryos", "(", "n", "=", "18", "for", "each", "marker", ")", ".", "Control", "embryos", ",", "(", "CE", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1One-cell stage embryos were injected animally with mRNA encoding dkk1 (35/45 pg) protein. Total RNA was isolated from ten control embryos at neurula stage 17 (lane 2) and ten embryos from each dkk1 injected group (lanes 3-4). Various neural AP markers were examined by sqRT-PCR: cement gland and forebrain (xag1, xanf1, otx2), hindbrain (krox20, hoxb3), hindbrain/spinal cord border (hoxb4), and spinal cord (hoxb9, cdx1-2-4, hoxd10). Ef1α serves as a control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with the zygotic-expressing Nxfz8/pCS2 encoding plasmid (100/200 pg). Total RNA was isolated from ten control embryos at neurula stage 17 (lane 2) and ten embryos from each Nxfz8 injected group (lanes 3-4). Various neural AP markers were examined by sqRT-PCR: cement gland and forebrain (xag1, xanf1, otx2), hindbrain (krox20, hoxb3), hindbrain/spinal cord border (hoxb4), and spinal cord (hoxb9, cdx1-2-4, hoxd10). Ef1α serves as a control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).Embryos from the same experiment as in (A) underwent in situ hybridization. Expression of the hindbrain marker krox20 (upper two panels) was reduced by Dkk1 (45pg) in 83% of the embryos (n=18). Expression of spinal cord markers (hoxb9, cdx4, hox10) was normal, being unchanged in 89% of the embryos (n=18 for each marker). Control embryos, (CE)."}
{"words": ["Figure", "2One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "the", "Zic1", "-", "MO", "(", "25", "/", "40", "ng", ")", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "ten", "control", "embryos", "at", "neurula", "stage", "18", "(", "lane", "2", ")", "and", "ten", "embryos", "from", "each", "Zic1", "-", "MO", "injected", "group", "(", "lanes", "3", "-", "4", ")", ".", "Neural", "AP", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "forebrain", "(", "xanf1", ",", "otx2", ")", ",", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb1", ",", "hoxb3", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "cdx1", "-", "4", ")", "and", "panneural", "(", "soxd", ")", ".", "Ef1α", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNA", "encoding", "Zic5", "dominant", "-", "negative", "(", "0", ".", "5", "ng", ")", "protein", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "at", "neurula", "stage", "18", "(", "lane", "1", ")", "and", "five", "embryos", "from", "the", "injected", "group", "(", "lanes", "2", ")", ".", "Neural", "AP", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "hindbrain", "(", "krox20", ")", "and", "spinal", "cord", "(", "cdx1", "-", "4", ")", ".", "Ef1α", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "3", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "the", "Zic1", "-", "MO", "(", "25", "ng", ")", ".", "Embryos", "underwent", "in", "situ", "hybridization", ".", "Expression", "of", "the", "panneural", "sox2", "marker", "was", "normal", ",", "the", "forebrain", "marker", "xanf1", "was", "expanded", "in", "80", "%", "of", "the", "embryos", ",", "the", "hindbrain", "representative", "marker", "krox20", "was", "reduced", "in", "80", "%", "of", "the", "embryos", "and", "the", "representative", "spinal", "cord", "marker", "cdx4", "was", "expanded", "in", "90", "%", "of", "the", "embryos", ".", "N", "=", "23", "embryos", "were", "per", "marker", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2One-cell stage embryos were injected animally with the Zic1-MO (25/40 ng). Total RNA was isolated from ten control embryos at neurula stage 18 (lane 2) and ten embryos from each Zic1-MO injected group (lanes 3-4). Neural AP markers were examined by sqRT-PCR: forebrain (xanf1, otx2), hindbrain (krox20, hoxb1, hoxb3), spinal cord (hoxb9, cdx1-4) and panneural (soxd). Ef1α is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with mRNA encoding Zic5 dominant-negative (0.5 ng) protein. Total RNA was isolated from five control embryos at neurula stage 18 (lane 1) and five embryos from the injected group (lanes 2). Neural AP markers were examined by sqRT-PCR: hindbrain (krox20) and spinal cord (cdx1-4). Ef1α is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 3).One-cell stage embryos were injected animally with the Zic1-MO (25 ng). Embryos underwent in situ hybridization. Expression of the panneural sox2 marker was normal, the forebrain marker xanf1 was expanded in 80% of the embryos, the hindbrain representative marker krox20 was reduced in 80% of the embryos and the representative spinal cord marker cdx4 was expanded in 90% of the embryos. N = 23 embryos were per marker."}
{"words": ["Figure", "3One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNAs", "encoding", "the", "noggin", "(", "5", "/", "20", "pg", ")", "and", "/", "or", "meis3", "(", "0", ".", "5", "ng", ")", "proteins", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "neurula", "stage", "17", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "seven", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "8", ")", ".", "Neural", "AP", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "forebrain", "(", "xanf1", ",", "otx2", ")", ",", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb1", ",", "hoxb3", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "cdx1", "-", "4", ")", "and", "panneural", "(", "soxd", ")", ".", "Ef1α", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNA", "encoding", "bmp4", "(", "0", ".", "2", "ng", ")", "protein", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "at", "neurula", "stage", "17", "(", "lane", "1", ")", "and", "five", "embryos", "from", "the", "injected", "group", "(", "lanes", "2", ")", ".", "Neural", "and", "mesodermal", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "forebrain", "(", "otx2", ")", ",", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb3", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "hoxc10", ",", "cdx4", ")", ",", "panneural", "(", "nrp1", ",", "ncam", ")", "and", "mesodermal", "(", "muscle", "actin", "-", "MA", ")", ".", "ODC", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNA", "encoding", "bmp4", "(", "0", ".", "2", "ng", ")", "protein", "Embryos", "underwent", "in", "situ", "hybridization", ".", "Expression", "of", "the", "hindbrain", "marker", "hoxb3", "was", "reduced", "/", "eliminated", "by", "bmp4", "(", "0", ".", "2", "ng", ")", "in", "68", "%", "of", "the", "embryos", "(", "n", "=", "19", ")", ".", "Expression", "of", "the", "spinal", "cord", "marker", "cdx4", "was", "slightly", "increased", "/", "normal", ",", "in", "100", "%", "of", "the", "embryos", "(", "n", "=", "19", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3One-cell stage embryos were injected animally with mRNAs encoding the noggin (5/20 pg) and/or meis3 (0.5 ng) proteins. AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to neurula stage 17. Total RNA was isolated from seven control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-8). Neural AP markers were examined by sqRT-PCR: forebrain (xanf1, otx2), hindbrain (krox20, hoxb1, hoxb3), spinal cord (hoxb9, cdx1-4) and panneural (soxd). Ef1α is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with mRNA encoding bmp4 (0.2 ng) protein. Total RNA was isolated from five control embryos at neurula stage 17 (lane 1) and five embryos from the injected group (lanes 2). Neural and mesodermal markers were examined by sqRT-PCR: forebrain (otx2), hindbrain (krox20, hoxb3), spinal cord (hoxb9, hoxc10, cdx4), panneural (nrp1, ncam) and mesodermal (muscle actin - MA). ODC is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with mRNA encoding bmp4 (0.2 ng) protein Embryos underwent in situ hybridization. Expression of the hindbrain marker hoxb3 was reduced/eliminated by bmp4 (0.2 ng) in 68% of the embryos (n=19). Expression of the spinal cord marker cdx4 was slightly increased/normal, in 100% of the embryos (n=19)."}
{"words": ["Figure", "4One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "increasing", "concentrations", "of", "bmp4", "encoding", "mRNA", "(", "5", "-", "50", "pg", ")", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "neurula", "stage", "16", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "7", ")", ".", "Neural", ",", "epidermal", "and", "mesodermal", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "hindbrain", "(", "krox20", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "hoxc10", "/", "d10", ",", "cdx1", "-", "2", "-", "4", ")", ",", "epidermal", "cytokeratin", "(", "E13", ")", ",", "lateral", "mesoderm", "(", "osr1", "-", "2", ")", "and", "dorsal", "-", "lateral", "mesoderm", "muscle", "actin", "(", "MA", ")", ".", "ODC", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "the", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNAs", "encoding", "the", "bmp4", "(", "50", "/", "150", "pg", ")", "and", "/", "or", "meis3", "(", "0", ".", "7", "ng", ")", "proteins", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "neurula", "stage", "16", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "8", ")", ".", "Neural", "and", "mesodermal", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "hindbrain", "(", "krox20", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "hoxc10", ",", "cdx2", ")", ",", "and", "lateral", "mesoderm", "(", "osr1", ")", ".", "Ef1α", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "the", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "increasing", "concentrations", "of", "bmp4", "encoding", "mRNA", "(", "75", "-", "200", "pg", ")", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "gastrula", "stage", "11", "-", "11", ".", "5", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "6", ")", ".", "Marker", "expression", "was", "determined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ".", "Xenopus", "brachyury", "(", "xbra", ")", "expression", "was", "induced", "by", "BMP4", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", ".", "Marker", "expression", "was", "determined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ".", "Neither", "dorsal", "(", "chd", ",", "goosecoid", "-", "gsc", ")", "or", "ventral", "-", "lateral", "(", "osr1", ")", "mesoderm", "markers", "were", "induced", "by", "BMP4", ".", "Sox2", "/", "3", "neural", "markers", "are", "expressed", "in", "the", "ACs", "and", "are", "unchanged", "by", "BMP", "expression", ".", "EF1α", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4One-cell stage embryos were injected animally with increasing concentrations of bmp4 encoding mRNA (5-50 pg). AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to neurula stage 16. Total RNA was isolated from five control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-7). Neural, epidermal and mesodermal markers were examined by sqRT-PCR: hindbrain (krox20), spinal cord (hoxb9, hoxc10/d10, cdx1-2-4), epidermal cytokeratin (E13), lateral mesoderm (osr1-2) and dorsal-lateral mesoderm muscle actin (MA). ODC is the control for quantitating the RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with mRNAs encoding the bmp4 (50/150 pg) and/or meis3 (0.7 ng) proteins. AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to neurula stage 16. Total RNA was isolated from five control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-8). Neural and mesodermal markers were examined by sqRT-PCR: hindbrain (krox20), spinal cord (hoxb9, hoxc10, cdx2), and lateral mesoderm (osr1). Ef1α is the control for quantitating the RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with increasing concentrations of bmp4 encoding mRNA (75-200 pg). AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to gastrula stage 11-11.5. Total RNA was isolated from five control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-6). Marker expression was determined by sqRT-PCR. Xenopus brachyury (xbra) expression was induced by BMP4 in a dose-dependent manner. Marker expression was determined by sqRT-PCR. Neither dorsal (chd, goosecoid-gsc) or ventral-lateral (osr1) mesoderm markers were induced by BMP4. Sox2/3 neural markers are expressed in the ACs and are unchanged by BMP expression. EF1α is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1)."}
{"words": ["Figure", "5One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "increasing", "concentrations", "of", "bmp4", "encoding", "mRNA", "(", "5", "-", "50", "pg", ")", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "neurula", "stage", "16", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "6", ")", ".", "FGF3", "-", "4", "-", "8", "expression", "was", "determined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ".", "ODC", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", ".", "One", "-", "cell", "stage", "embryos", "were", "injected", "animally", "with", "mRNAs", "encoding", "the", "bmp4", "(", "50", "pg", ")", "and", "/", "or", "FGF", "dominant", "-", "negative", "receptor", "(", "FGF", "-", "DNR", ",", "1", ".", "5", "ng", ")", "proteins", ".", "AC", "explants", "were", "removed", "from", "control", "and", "injected", "embryos", "at", "blastula", "stage", "9", ",", "and", "explants", "were", "cultured", "to", "neurula", "stage", "16", ".", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "five", "control", "embryos", "(", "lane", "2", ")", ",", "and", "from", "eighteen", "ACs", "from", "each", "group", "(", "lanes", "3", "-", "6", ")", ".", "In", "addition", "to", "fgf3", ",", "neural", ",", "epidermal", "and", "mesodermal", "markers", "were", "examined", "by", "sqRT", "-", "PCR", ":", "hindbrain", "(", "krox20", ",", "hoxb3", ")", ",", "spinal", "cord", "(", "hoxb9", ",", "hoxc10", ",", "cdx4", ")", ",", "lateral", "mesoderm", "(", "osr1", ")", ",", "dorsal", "-", "lateral", "mesoderm", "muscle", "actin", "(", "MA", ")", ",", "and", "epidermal", "cytokeratin", "(", "E13", ")", ".", "ODC", "is", "the", "control", "for", "quantitating", "RNA", "levels", ".", "-", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "isolated", "from", "control", "embryos", "(", "lane", "1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5One-cell stage embryos were injected animally with increasing concentrations of bmp4 encoding mRNA (5-50 pg). AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to neurula stage 16. Total RNA was isolated from five control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-6). FGF3-4-8 expression was determined by sqRT-PCR. ODC is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1).One-cell stage embryos were injected animally with mRNAs encoding the bmp4 (50 pg) and/or FGF dominant-negative receptor (FGF-DNR, 1.5 ng) proteins. AC explants were removed from control and injected embryos at blastula stage 9, and explants were cultured to neurula stage 16. Total RNA was isolated from five control embryos (lane 2), and from eighteen ACs from each group (lanes 3-6). In addition to fgf3, neural, epidermal and mesodermal markers were examined by sqRT-PCR: hindbrain (krox20, hoxb3), spinal cord (hoxb9, hoxc10, cdx4), lateral mesoderm (osr1), dorsal-lateral mesoderm muscle actin (MA), and epidermal cytokeratin (E13). ODC is the control for quantitating RNA levels. -RT-PCR was performed on total RNA isolated from control embryos (lane 1)."}
{"words": ["Figure", "1", "[", "a", "]", "Sagittal", "sections", "obtained", "from", "mice", "(", "p15", ")", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "immunostained", "for", "ADP", "-", "ribose", "using", "the", "pan", "-", "ADP", "-", "ribose", "detection", "reagent", "MABE1016", ".", "Representative", "images", "showing", "levels", "of", "ADP", "-", "ribose", "in", "the", "hippocampal", "regions", "CA1", ",", "CA3", ",", "and", "dentate", "gyrus", "(", "DG", ")", ",", "and", "in", "the", "cerebral", "cortex", ".", "Red", "dotted", "boxes", "highlight", "the", "elevated", "ADP", "-", "ribose", "staining", "in", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "cerebellum", "(", "left", "dotted", "box", ")", "and", "hippocampus", "(", "right", "doted", "box", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "mm", ",", "50", "μm", ".", "WT", "(", "n", "=", "4", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Summary", "histograms", "show", "mean", "±", "SEM", ".", "Pairwise", "comparisons", "between", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "and", "WT", "versus", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "were", "conducted", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "ANOVA", "with", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", "and", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "are", "shown", ".", "[", "b", "]", "Protein", "extracts", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "forebrain", "tissue", ",", "containing", "hippocampus", "and", "cortex", ",", "were", "incubated", "with", "1", "mM", "NAD", "+", "for", "45", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "PARP", "inhibitor", "as", "indicated", ",", "and", "ADP", "-", "ribosylation", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "the", "poly", "(", "ADP", "-", "ribose", ")", "-", "specific", "detection", "reagent", "MABE1031", ".", "Representative", "images", "from", "two", "or", "more", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "A", "western", "blot", "showing", "the", "level", "of", "Parp1", "and", "Xrcc1", "in", "the", "forebrain", "tissue", "extracts", "is", "also", "shown", ",", "Inset", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 [a] Sagittal sections obtained from mice (p15) of the indicated genotypes were immunostained for ADP-ribose using the pan-ADP-ribose detection reagent MABE1016. Representative images showing levels of ADP-ribose in the hippocampal regions CA1, CA3, and dentate gyrus (DG), and in the cerebral cortex. Red dotted boxes highlight the elevated ADP-ribose staining in Xrcc1Nes-Cre cerebellum (left dotted box) and hippocampus (right doted box). Scale bars: 5 mm, 50 μm. WT (n = 4 mice), Xrcc1Nes-Cre (n = 4), Parp1+/- /Xrcc1Nes-Cre (n = 4), Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3) and Parp1-/- (n = 3). Summary histograms show mean ± SEM. Pairwise comparisons between WT versus Xrcc1Nes-Cre mice and WT versus Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre mice were conducted by Kruskal-Wallis ANOVA with Dunn's post-hoc test and statistically significant differences (*p<0.05) are shown.  [b] Protein extracts from wild type (WT), Xrcc1Nes-Cre, and Parp1-/- forebrain tissue, containing hippocampus and cortex, were incubated with 1 mM NAD+ for 45 min in the presence or absence of PARP inhibitor as indicated, and ADP-ribosylation detected by western blotting using the poly(ADP-ribose)-specific detection reagent MABE1031. Representative images from two or more independent experiments are shown. A western blot showing the level of Parp1 and Xrcc1 in the forebrain tissue extracts is also shown, Inset. "}
{"words": ["Figure", "2", "[", "a", "]", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "survival", "of", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "The", "table", "shows", "number", "of", "individuals", "in", "each", "group", ",", "median", "survival", "(", "weeks", ")", ",", "and", "p", "-", "values", "from", "pairwise", "curve", "comparisons", ";", "Und", ":", "undetermined", "(", "Log", "-", "rank", "Mantel", "-", "Cox", "tests", ")", ".", "[", "b", "]", "Video", "monitoring", "and", "recording", "of", "generalised", "running", "/", "bouncing", "seizures", "in", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "from", "P15", "-", "P19", ".", "The", "point", "of", "death", "of", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "by", "fatal", "seizure", "is", "indicated", "(", "cross", ")", ".", "Note", "no", "seizures", "from", "mice", "of", "other", "genotypes", "were", "detected", ".", "WT", "(", "n", "=", "9", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "cre", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 [a] Kaplan-Meier curves for survival of mice of the indicated genotypes. The table shows number of individuals in each group, median survival (weeks), and p-values from pairwise curve comparisons; Und: undetermined (Log-rank Mantel-Cox tests).  [b] Video monitoring and recording of generalised running/bouncing seizures in mice of the indicated genotypes from P15-P19. The point of death of Xrcc1Nes-Cre mice by fatal seizure is indicated (cross). Note no seizures from mice of other genotypes were detected. WT (n = 9 mice), Xrcc1Nes-cre (n = 3 mice), Parp1+/- /Xrcc1Nes-Cre (n = 3 mice), and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3). "}
{"words": ["Figure", "3", "[", "b", "]", "Heatplots", "of", "cumulative", "SLEs", ":", "WT", "(", "n", "=", "11", "slices", "from", "3", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "12", "slices", "from", "4", "mice", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "12", "slices", "from", "3", "mice", ")", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "10", "slices", "from", "3", "mice", ")", ".", "Each", "horizontal", "bar", "corresponds", "to", "one", "slice", "with", "the", "colour", "code", "indicating", "cumulative", "SLEs", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 [b] Heatplots of cumulative SLEs: WT (n=11 slices from 3 mice), Xrcc1Nes-Cre (n=12 slices from 4 mice), Parp1+/-/Xrcc1Nes-Cre (n=12 slices from 3 mice) and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n=10 slices from 3 mice). Each horizontal bar corresponds to one slice with the colour code indicating cumulative SLEs. "}
{"words": ["Figure", "4", "[", "e", "]", "Summary", "histograms", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "of", "cumulative", "seizure", "-", "like", "activity", "at", "5", ",", "10", ",", "and", "15", "min", "timepoints", "in", "cortex", ",", "CA1", ",", "and", "CA3", "regions", "of", "wild", "type", "and", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "brain", "slices", "from", "mice", "treated", "or", "not", "for", "5", "-", "8", "days", "ad", "libitum", "with", "PARP1", "inhibitor", "(", "ABT", "-", "888", ")", "prior", "to", "analysis", ".", "WT", "(", "n", "=", "8", "slices", "from", "4", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "10", "from", "5", "mice", ")", ",", "WT", "+", "PARPi", "(", "n", "=", "6", "from", "3", "mice", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "+", "PARPi", "(", "n", "=", "9", "from", "3", "mice", ")", ".", "Pairwise", "comparisons", "at", "the", "15", "min", "time", "point", "between", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "and", "WT", "versus", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mice", "+", "PARPi", "were", "conducted", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "tests", "and", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "are", "shown", "."], "labels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text": "Figure 4 [e] Summary histograms (mean ± SEM) of cumulative seizure-like activity at 5, 10, and 15 min timepoints in cortex, CA1, and CA3 regions of wild type and Xrcc1Nes-Cre brain slices from mice treated or not for 5-8 days ad libitum with PARP1 inhibitor (ABT-888) prior to analysis. WT (n = 8 slices from 4 mice), Xrcc1Nes-Cre (n = 10 from 5 mice), WT + PARPi (n = 6 from 3 mice), Xrcc1Nes-Cre + PARPi (n = 9 from 3 mice). Pairwise comparisons at the 15 min time point between WT versus Xrcc1Nes-Cre mice and WT versus Xrcc1Nes-Cre mice + PARPi were conducted by Kruskal-Wallis with Dunn's post-hoc tests and statistically significant differences (*p<0.05) are shown. "}
{"words": ["Figure", "5", "[", "a", "]", "Representative", "images", "of", "indirect", "immunofluorescence", "of", "DIV6", "hippocampal", "neurons", "cultured", "from", "P1", "WT", "and", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "mouse", "pups", ",", "immunostained", "for", "ADP", "-", "ribose", "(", "red", ")", ",", "NeuN", "to", "identify", "neurons", "(", "green", ")", ",", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "PARP", "inhibitor", "(", "10", "µM", ")", "or", "vehicle", "for", "2", "h", "prior", "to", "fixation", ",", "with", "PARG", "inhibitor", "(", "10", "μM", ")", "additionally", "present", "for", "the", "final", "hour", ".", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "[", "b", "]", "Histogram", "of", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "relative", "pan", "-", "ADP", "-", "ribose", "fluorescence", "in", "NeuN", "-", "positive", "hippocampal", "neurons", "pretreated", "with", "PARP", "inhibitor", "(", "5", "µM", ")", "or", "vehicle", "for", "5", "h", "prior", "to", "fixation", ",", "with", "PARG", "inhibitor", "(", "10", "μM", ")", "additionally", "present", "for", "the", "final", "hour", ".", "Neurons", "were", "cultured", "from", "WT", "(", "n", "=", "6", "mice", ",", ">", "180", "cells", "per", "condition", ")", ",", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "6", ",", ">", "180", ")", ",", "Parp1", "+", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ",", ">", "90", ")", ",", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "n", "=", "3", ",", ">", "90", ")", ".", "*", "indicates", "significant", "differences", "from", "WT", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "ANOVA", ",", "p", "=", "0", ".", "0013", "and", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "hoc", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 [a] Representative images of indirect immunofluorescence of DIV6 hippocampal neurons cultured from P1 WT and Xrcc1Nes-Cre mouse pups, immunostained for ADP-ribose (red), NeuN to identify neurons (green), and counterstained with DAPI (blue). Cells were pretreated with PARP inhibitor (10 µM) or vehicle for 2 h prior to fixation, with PARG inhibitor (10 μM) additionally present for the final hour. Scale bar 10 µm. [b] Histogram of mean (± SEM) relative pan-ADP-ribose fluorescence in NeuN-positive hippocampal neurons pretreated with PARP inhibitor (5 µM) or vehicle for 5 h prior to fixation, with PARG inhibitor (10 μM) additionally present for the final hour. Neurons were cultured from WT (n = 6 mice, > 180 cells per condition), Xrcc1Nes-Cre (n = 6, > 180), Parp1+/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3, > 90), and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (n = 3, > 90). * indicates significant differences from WT (Kruskal-Wallis ANOVA, p = 0.0013 and Dunn's post-hoc tests). "}
{"words": ["Figure", "6Summary", "histogram", "of", "the", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "of", "the", "integrated", "fluorescence", "responses", "for", "all", "individual", "synapses", "for", "each", "condition", ".", "Synapse", "number", "is", "the", "same", "as", "in", "(", "D", "-", "F", ")", ".", "Responses", "are", "significantly", "higher", "in", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "synapses", "versus", "both", "WT", "and", "Parp1", "-", "/", "-", "/", "Xrcc1Nes", "-", "Cre", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "0033", ",", "and", "pairwise", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Summary histogram of the mean (± SEM) of the integrated fluorescence responses for all individual synapses for each condition. Synapse number is the same as in (D-F). Responses are significantly higher in Xrcc1Nes-Cre synapses versus both WT and Parp1-/-/Xrcc1Nes-Cre (one-way ANOVA, *p < 0.0033, and pairwise student's t-tests)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "The", "survival", "of", "age", "-", "and", "sex", "-", "matched", "HDAC6", "+", "/", "+", "mice", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "was", "monitored", "for", "9", "days", "after", "intravenous", "VSV", "-", "Indiana", "infection", "(", "2", "×", "108", "pfu", "/", "mouse", ";", "n", "=", "12", "per", "group", ";", "log", "-", "rank", "test", ")", ".", "B", ".", "Determination", "of", "the", "viral", "load", "in", "organs", "by", "standard", "plaque", "assay", ".", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "-", "Indiana", ",", "and", "the", "brain", "and", "spleen", "were", "collected", "at", "5", "dpi", "(", "2", "×", "108", "pfu", "/", "mouse", ";", "n", "=", "6", "per", "group", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "C", ".", "Determination", "of", "viral", "loads", "in", "organs", "by", "Q", "-", "PCR", "of", "VSV", "viral", "transcripts", ".", "The", "brain", "and", "spleen", "were", "collected", "at", "5", "dpi", "after", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "-", "Indiana", "(", "2", "×", "108", "pfu", "/", "mouse", ";", "n", "=", "9", "per", "group", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "D", ".", "The", "viral", "load", "in", "the", "serum", "was", "assessed", "by", "standard", "plaque", "assay", ".", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "were", "intravenously", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", ".", "Serum", "was", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "analyzed", "(", "4", "×", "108", "pfu", "/", "mouse", ";", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ".", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "(", "left", ")", "and", "IL", "-", "6", "(", "right", ")", "in", "the", "serum", "of", "mice", "described", "in", "(", "d", ")", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "ELISA", "of", "serum", "IFN", "-", "β", "(", "left", ")", "and", "IL", "-", "6", "(", "right", ")", "after", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "injection", ".", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "were", "intravenously", "injected", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Serum", "was", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "analyzed", "(", "200", "μg", "/", "mouse", ";", "n", "=", "3", "per", "group", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. The survival of age- and sex-matched HDAC6+/+ mice and HDAC6-/- mice was monitored for 9 days after intravenous VSV-Indiana infection (2 × 108 pfu/mouse; n = 12 per group; log-rank test).B. Determination of the viral load in organs by standard plaque assay. HDAC6+/+ and HDAC6-/- mice were intravenously infected with VSV-Indiana, and the brain and spleen were collected at 5 dpi (2 × 108 pfu/mouse; n = 6 per group; Mann-Whitney test).C. Determination of viral loads in organs by Q-PCR of VSV viral transcripts. The brain and spleen were collected at 5 dpi after HDAC6+/+and HDAC6-/- mice were intravenously infected with VSV-Indiana (2 × 108 pfu/mouse; n = 9 per group; Mann-Whitney test).D. The viral load in the serum was assessed by standard plaque assay. HDAC6+/+ and HDAC6-/- mice were intravenously infected with VSV-GFP. Serum was collected at the indicated time points and analyzed (4 × 108 pfu/mouse; n = 3 per group; Student's t-test).E. ELISA of IFN-β (left) and IL-6 (right) in the serum of mice described in (d) (Student's t-test).F. ELISA of serum IFN-β (left) and IL-6 (right) after poly(I:C) injection. HDAC6+/+ and HDAC6-/- mice were intravenously injected with poly(I:C). Serum was collected at the indicated time points and analyzed (200 μg/mouse; n = 3 per group; Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ".", "virus", "replication", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", "in", "response", "to", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "10", ")", "infection", "(", "A", ")", "and", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "5", ")", "infection", "(", "B", ")", ".", "C", ".", "Virus", "replication", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", "in", "response", "to", "HSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "2", ")", "infection", ".", "D", ".", "Virus", "replication", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "PBMCs", "in", "response", "to", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "10", ")", "infection", ".", "E", ".", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "(", "upper", ")", ",", "IL", "-", "6", "(", "lower", ")", "levels", "in", "the", "supernatant", "of", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ",", "and", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "20", "µg", "/", "ml", ")", "or", "transfected", "with", "5", "'", "ppp", "-", "dsRNA", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "F", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "phosphorylated", "and", "inactive", "forms", "of", "IRF3", ",", "IKBα", ",", "TBK1", ",", "RIG", "-", "I", ",", "MAVS", ",", "HDAC6", ",", "and", "β", "-", "actin", "at", "the", "indicated", "times", "(", "0", ",", "2", ",", "4", ",", "8", ",", "and", "16", "h", ")", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", ".", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Induction", "of", "mRNA", "for", "type", "I", "IFN", ",", "IL", "-", "6", ",", "and", "other", "IFN", "-", "related", "antiviral", "genes", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", "in", "response", "to", "a", "RIG", "-", "I", "agonist", "stimulation", "at", "6", "h", ".", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "5", "'", "ppp", "-", "dsRNA", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "6", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B. virus replication at 12 and 24 hpi, in HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs in response to VSV-GFP (MOI = 10) infection (A) and PR8-GFP (MOI = 5) infection (B).C. Virus replication in HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs in response to HSV-GFP (MOI = 2) infection.D. Virus replication in HDAC6+/+ and HDAC6-/- PBMCs in response to VSV-GFP (MOI = 10) infection.E. ELISA of IFN-β (upper), IL-6 (lower) levels in the supernatant of (A) and (B), and in HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs treated with poly(I:C) (20 µg/ml) or transfected with 5'ppp-dsRNA (1 µg/ml).F. Immunoblot analysis of the phosphorylated and inactive forms of IRF3, IKBα, TBK1, RIG-I, MAVS, HDAC6, and β-actin at the indicated times (0, 2, 4, 8, and 16 h) in HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs. BMDMs were stimulated with PR8-GFP (MOI = 3).G. Induction of mRNA for type I IFN, IL-6, and other IFN-related antiviral genes in HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs in response to a RIG-I agonist stimulation at 6 h. HDAC6+/+ and HDAC6-/- BMDMs were stimulated with 5'ppp-dsRNA (0.5 µg/ml) for 6 h."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "Fluorescence", "microscopy", "at", "24", "hpi", "showing", "green", "fluorescence", "absorbance", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "and", "virus", "replication", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "in", "control", "and", "HDAC6", "knockdown", "RAW264", ".", "7", "cells", "in", "response", "to", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "A", ")", "and", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "B", ")", ".", "bar", ",", "100µmC", ".", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "(", "upper", ")", ",", "IL", "-", "6", "(", "lower", ")", "levels", "in", "the", "supernatant", "of", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ",", "and", "in", "control", "and", "HDAC6", "knockdown", "RAW264", ".", "7", "cells", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "20", "µg", "/", "ml", ")", "or", "transfected", "with", "5", "'", "ppp", "-", "dsRNA", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Fluorescence", "microscopy", "at", "24", "hpi", "showing", "green", "fluorescence", "absorbance", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "and", "virus", "replication", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "in", "response", "to", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "D", ")", "and", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "E", ")", ".", "bar", ",", "50µmF", ".", "ELISA", "of", "IFN", "-", "β", "(", "upper", ")", ",", "IL", "-", "6", "(", "lower", ")", "levels", "in", "the", "supernatant", "of", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", ",", "and", "in", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "transfected", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. Fluorescence microscopy at 24 hpi showing green fluorescence absorbance at 12 and 24 hpi, and virus replication at 12 and 24 hpi, in control and HDAC6 knockdown RAW264.7 cells in response to VSV-GFP (MOI = 1) infection (A) and PR8-GFP (MOI = 1) infection (B). bar, 100µmC. ELISA of IFN-β (upper), IL-6 (lower) levels in the supernatant of (A) and (B), and in control and HDAC6 knockdown RAW264.7 cells treated with poly(I:C) (20 µg/ml) or transfected with 5'ppp-dsRNA (1 µg/ml).D, E. Fluorescence microscopy at 24 hpi showing green fluorescence absorbance at 12 and 24 hpi, and virus replication at 12 and 24 hpi, in HDAC6+/+ and HDAC6-/- MEFs in response to VSV-GFP (MOI = 1) infection (D) and PR8-GFP (MOI = 1) infection (E). bar, 50µmF. ELISA of IFN-β (upper), IL-6 (lower) levels in the supernatant of (D) and (E), and in HDAC6+/+ and HDAC6-/- MEFs transfected with poly(I:C) (1 µg/ml)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", ".", "Fluorescence", "microscopy", "at", "24", "hpi", "showing", "green", "fluorescence", "absorbance", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "and", "virus", "replication", "at", "12", "and", "24", "hpi", ",", "in", "vector", ",", "HDAC6", ",", "or", "HDAC6", "-", "CDM", "-", "overexpressing", "stable", "RAW264", ".", "7", "cells", "in", "response", "to", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "A", ")", "and", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", "infection", "(", "B", ")", ".", "bar", ",", "100µm", ".", "C", ".", "ELISA", "of", "IFN", "-", "b", "(", "upper", ")", "and", "IL", "-", "6", "(", "lower", ")", "levels", "in", "the", "supernatant", "of", "(", "A", ")", ",", "(", "B", ")", ",", "and", "in", "vector", ",", "HDAC6", ",", "or", "HDAC6", "-", "CDM", "-", "overexpressing", "stable", "RAW264", ".", "7", "cells", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "20", "μg", "/", "ml", ")", "or", "transfected", "with", "5", "'", "ppp", "-", "dsRNA", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Luciferase", "assay", "in", "293T", "cells", "transfected", "with", "an", "IFN", "-", "β", "luciferase", "promoter", "and", "TK", "-", "Renilla", "together", "with", "mutant", "HDAC6", "or", "HDAC6", "-", "CDM", "(", "100", ",", "200", ",", "400", ",", "or", "800", "ng", ")", ",", "followed", "by", "PR8", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "2", ")", "infection", "(", "D", ")", "or", "by", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "E", ")", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "transfection", "for", "another", "12", "h", ".", "F", ",", "G", ".", "Luciferase", "assay", "in", "293T", "cells", "transfected", "with", "RIG", "-", "I", "(", "F", ")", ",", "MDA", "-", "5", "(", "G", ")", ",", "an", "IFN", "-", "β", "luciferase", "promoter", ",", "and", "TK", "-", "Renilla", "together", "with", "mutant", "HDAC6", "or", "HDAC6", "-", "CDM", "(", "100", ",", "200", ",", "400", ",", "or", "800", "ng", ")", ".", "24", "h", "later", ",", "IFN", "-", "β", "activity", "was", "measured", "by", "luciferase", "reporter", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B. Fluorescence microscopy at 24 hpi showing green fluorescence absorbance at 12 and 24 hpi, and virus replication at 12 and 24 hpi, in vector, HDAC6, or HDAC6-CDM-overexpressing stable RAW264.7 cells in response to VSV-GFP (MOI = 1) infection (A) and PR8-GFP (MOI = 1) infection (B). bar, 100µm.C. ELISA of IFN-b (upper) and IL-6 (lower) levels in the supernatant of (A), (B), and in vector, HDAC6, or HDAC6-CDM-overexpressing stable RAW264.7 cells treated with poly(I:C) (20 μg/ml) or transfected with 5'ppp-dsRNA (1 µg/ml).D, E. Luciferase assay in 293T cells transfected with an IFN-β luciferase promoter and TK-Renilla together with mutant HDAC6 or HDAC6-CDM (100, 200, 400, or 800 ng), followed by PR8-GFP (MOI = 2) infection (D) or by poly(I:C) (E) (1 μg/ml) transfection for another 12 h.F, G. Luciferase assay in 293T cells transfected with RIG-I (F), MDA-5 (G), an IFN-β luciferase promoter, and TK-Renilla together with mutant HDAC6 or HDAC6-CDM (100, 200, 400, or 800 ng). 24 h later, IFN-β activity was measured by luciferase reporter assay."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "and", "cell", "lysates", "were", "prepared", "at", "the", "indicated", "times", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "endogenous", "HDAC6", "and", "RIG", "-", "I", ".", "Actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "B", ".", "BMDMs", "were", "isolated", "from", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "mice", "and", "were", "transfected", "with", "5ˊppp", "-", "dsRNA", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "after", "8", "h", "of", "transfection", "and", "co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "RIG", "-", "I", "and", "HDAC6", "was", "performed", ".", "C", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "5ˊppp", "-", "dsRNA", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "RIG", "-", "I", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "HDAC6", "H300", "(", "green", ")", "antibodies", "after", "8", "h", "of", "transfection", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "(", "bar", ",", "20µm", ")", ".", "D", ".", "Fluorescence", "microscopy", ",", "green", "fluorescence", "absorbance", "and", "virus", "replication", "at", "24hpi", "in", "RIG", "-", "I", "+", "/", "+", "and", "RIG", "-", "I", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "si", "-", "HDAC6", "and", "si", "-", "control", "for", "36", "h", ",", "followed", "infection", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "bar", ",", "100µm", ".", "E", ".", "HDAC6", "+", "/", "+", ",", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", ",", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "reconstituted", "with", "HDAC6", "wild", "-", "type", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "using", "an", "anti", "-", "RIG", "-", "I", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "acetyl", "-", "lysine", "and", "anti", "-", "RIG", "-", "I", "antibodies", ".", "Acetyl", "-", "tubulin", "was", "measured", "in", "total", "lysates", "to", "determine", "HDAC6", "deacetylase", "activity", ".", "F", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "HDAC6", "+", "/", "+", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "were", "prepared", "and", "used", "in", "dsRNA", "pull", "-", "down", "assays", ".", "Pull", "-", "down", "samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "RIG", "-", "I", ",", "anti", "-", "HDAC6", ",", "and", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", ".", "Intensity", "of", "pull", "-", "downed", "RIG", "-", "I", "was", "quantified", ".", "G", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "and", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "reconstituted", "with", "HDAC6", "wild", "-", "type", "and", "HDAC6", "-", "CDM", "were", "prepared", "and", "used", "in", "dsRNA", "pull", "-", "down", "assays", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "RIG", "-", "I", "and", "anti", "-", "HDAC6", "antibodies", ".", "Intensity", "of", "pull", "-", "downed", "RIG", "-", "I", "was", "quantified", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. 293T cells were transfected with poly(I:C) and cell lysates were prepared at the indicated times for co-immunoprecipitation analysis of endogenous HDAC6 and RIG-I. Actin was used as the loading control.B. BMDMs were isolated from HDAC6+/+ and HDAC6-/- mice and were transfected with 5ˊppp-dsRNA. Whole cell lysates were prepared after 8 h of transfection and co-immunoprecipitation analysis of RIG-I and HDAC6 was performed.C. HeLa cells were transfected with 5ˊppp-dsRNA. Cells were stained with anti-RIG-I (red) and anti-HDAC6 H300 (green) antibodies after 8 h of transfection. Nuclei were stained with DAPI (blue) (bar, 20µm).D. Fluorescence microscopy, green fluorescence absorbance and virus replication at 24hpi in RIG-I+/+ and RIG-I-/- MEFs. Cells were transfected with si-HDAC6 and si-control for 36 h, followed infection with VSV-GFP (MOI = 1). bar, 100µm.E. HDAC6+/+, HDAC6-/- MEFs, and HDAC6-/- MEFs reconstituted with HDAC6 wild-type were subjected to immunoprecipitation using an anti-RIG-I antibody and immunoblotted with anti-acetyl-lysine and anti-RIG-I antibodies. Acetyl-tubulin was measured in total lysates to determine HDAC6 deacetylase activity.F. Whole cell lysates from HDAC6+/+ and HDAC6-/- MEFs were prepared and used in dsRNA pull-down assays. Pull-down samples were analyzed by western blotting with anti-RIG-I, anti-HDAC6, and anti-β-actin antibodies. Intensity of pull-downed RIG-I was quantified.G. Whole cell lysates from HDAC6-/- MEFs and HDAC6-/- MEFs reconstituted with HDAC6 wild-type and HDAC6-CDM were prepared and used in dsRNA pull-down assays. Samples were analyzed by western blotting with anti-RIG-I and anti-HDAC6 antibodies. Intensity of pull-downed RIG-I was quantified."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "expression", "plasmids", ".", "At", "1", "day", "post", "-", "transfection", ",", "whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "dsRNA", "pull", "-", "down", "assays", ".", "Pull", "-", "down", "samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "C", ".", "A", "luciferase", "assay", "was", "performed", "using", "293T", "cells", "transfected", "with", "the", "IFN", "-", "βluciferase", "promoter", "and", "TK", "-", "Renilla", "together", "with", "2", "ng", "of", "RIG", "-", "I", "wild", "-", "type", ",", "RIG", "-", "I", "858Q", ",", "RIG", "-", "I", "858R", ",", "RIG", "-", "I", "K909Q", ",", "or", "RIG", "-", "I", "K909R", "mutant", ",", "followed", "by", "transfection", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "another", "12", "h", ".", "D", ".", "Fluorescence", "microscopy", ",", "green", "fluorescence", "absorbance", ",", "and", "virus", "replication", "at", "24", "hpi", "in", "RIG", "-", "I", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "empty", "vector", ",", "RIG", "-", "I", "wild", "-", "type", ",", "RIG", "-", "I", "K909Q", ",", "or", "RIG", "-", "I", "K909R", "mutant", "for", "24", "h", ",", "followed", "infection", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ")", ".", "bar", ",", "100µmE", ".", "HDAC6", "-", "/", "-", "MEFs", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "expression", "plasmids", ".", "At", "1", "day", "post", "-", "transfection", ",", "whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "and", "used", "in", "dsRNA", "pull", "-", "down", "assays", ".", "Pull", "-", "down", "samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "RIG", "-", "I", "and", "anti", "-", "β", "-", "actin", "antibodies", ".", "F", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "2", "μg", "of", "FLAG", "-", "tagged", "RIG", "-", "I", "and", "1", ",", "5", ",", "or", "10", "μg", "of", "V5", "-", "tagged", "HDAC6", ".", "At", "36", "h", "post", "-", "transfection", ",", "whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "V5", "-", "tagged", "HDAC6", "and", "acetylated", "K909", "(", "on", "RIG", "-", "I", "wild", "-", "type", ")", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "a", "K909", "acetylation", "-", "specific", "antibody", ".", "G", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "2", "μg", "of", "FLAG", "-", "tagged", "RIG", "-", "I", ".", "At", "24", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", ".", "At", "2", "and", "4", "h", "post", "-", "infection", ",", "whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "for", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "acetylated", "K909", "(", "on", "RIG", "-", "I", "wild", "-", "type", ")", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "a", "K909", "acetylation", "-", "specific", "antibody", ".", "Intensity", "of", "ac", "-", "909K", "normalized", "to", "Flag", "-", "RIG", "-", "I", "was", "quantified", ".", "H", ".", "whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "for", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "acetylated", "K909", "(", "on", "RIG", "-", "I", "wild", "-", "type", ")", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "a", "K909", "acetylation", "-", "specific", "antibody", ".", "Intensity", "of", "ac", "-", "909K", "normalized", "to", "RIG", "-", "I", "was", "quantified", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B. 293T cells were transfected with the indicated expression plasmids. At 1 day post-transfection, whole cell lysates were subjected to dsRNA pull-down assays. Pull-down samples were analyzed by western blotting with an anti-FLAG antibody.C. A luciferase assay was performed using 293T cells transfected with the IFN-βluciferase promoter and TK-Renilla together with 2 ng of RIG-I wild-type, RIG-I 858Q, RIG-I 858R, RIG-I K909Q, or RIG-I K909R mutant, followed by transfection with poly(I:C) (1 μg/ml) for another 12 h.D. Fluorescence microscopy, green fluorescence absorbance, and virus replication at 24 hpi in RIG-I-/- MEFs. Cells were transiently transfected with empty vector, RIG-I wild-type, RIG-I K909Q, or RIG-I K909R mutant for 24 h, followed infection with VSV-GFP (MOI = 1). bar, 100µmE. HDAC6-/- MEFs were transfected with the indicated expression plasmids. At 1 day post-transfection, whole cell lysates were prepared and used in dsRNA pull-down assays. Pull-down samples were analyzed by western blotting with anti-RIG-I and anti-β-actin antibodies.F. 293T cells were transfected with 2 μg of FLAG-tagged RIG-I and 1, 5, or 10 μg of V5-tagged HDAC6. At 36 h post-transfection, whole cell lysates were prepared for co-immunoprecipitation analysis of V5-tagged HDAC6 and acetylated K909 (on RIG-I wild-type). Samples were analyzed by western blotting with a K909 acetylation-specific antibody.G. 293T cells were transfected with 2 μg of FLAG-tagged RIG-I. At 24 h post-transfection, cells were infected with VSV-GFP (MOI = 0.1). At 2 and 4 h post-infection, whole cell lysates were prepared for immunoprecipitation analysis of acetylated K909 (on RIG-I wild-type). Samples were analyzed by western blotting with a K909 acetylation-specific antibody. Intensity of ac-909K normalized to Flag-RIG-I was quantified.H. whole cell lysates were prepared for immunoprecipitation analysis of acetylated K909 (on RIG-I wild-type). Samples were analyzed by western blotting with a K909 acetylation-specific antibody. Intensity of ac-909K normalized to RIG-I was quantified."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "The", "structural", "modeling", "result", "of", "RIG", "-", "I", "/", "dsRNA", "complex", "and", "positions", "of", "the", "lysine", "residue", "were", "presented", ".", "RIG", "-", "I", "helicase", "A", "and", "B", "are", "shown", "as", "green", "and", "pale", "blue", "ribbons", ".", "The", "dsRNA", "strands", "were", "presented", "as", "purple", "and", "yellow", "rods", ",", "respectively", ".", "Two", "lysine", "residues", ",", "K907", "and", "K909", ",", "on", "RIG", "-", "I", "that", "interact", "with", "dsRNA", "are", "indicated", "as", "violet", "sticks", ".", "K907", "forms", "hydrogen", "bonding", "with", "neither", "5", "´", "-", "ppp", "dsRNA", "nor", "K907", ".", "B", ",", "C", ".", "Acetylated", "K909", "and", "K907", "on", "RIG", "-", "I", "are", "indicated", "as", "green", "sticks", ".", "There", "were", "hydrogen", "bonding", "between", "NH2", "of", "K907", "and", "oxygen", "of", "acetyl", "-", "K909", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. The structural modeling result of RIG-I/dsRNA complex and positions of the lysine residue were presented. RIG-I helicase A and B are shown as green and pale blue ribbons. The dsRNA strands were presented as purple and yellow rods, respectively. Two lysine residues, K907 and K909, on RIG-I that interact with dsRNA are indicated as violet sticks. K907 forms hydrogen bonding with neither 5´-ppp dsRNA nor K907.B, C. Acetylated K909 and K907 on RIG-I are indicated as green sticks. There were hydrogen bonding between NH2 of K907 and oxygen of acetyl-K909."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Intracellular", "endogenous", "Aβ42", "(", "green", ")", ",", "Ankyrin", "-", "G", "(", "AnkG", ";", "magenta", ")", "and", "GFP", "(", "blue", ")", "in", "siBin1", "-", ",", "siCD2AP", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "primary", "cortical", "neurons", "(", "neurons", ")", "expressing", "GFP", "immunolabelled", "at", "9", "DIV", "with", "anti", "-", "Aβ42", "(", "clone", "12F4", ")", "and", "anti", "-", "AnkG", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "The", "white", "rectangles", "indicate", "the", "dendrites", "(", "Dd", ")", "and", "axons", "(", "Ax", ")", "magnified", "below", "showing", "Aβ42", "in", "axons", "and", "dendrites", "outlined", "based", "on", "AnkG", "(", "magenta", ")", "and", "GFP", "(", "blue", ")", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Aβ42", "line", "profiles", "in", "dendrites", "(", "Dd", ")", "of", "siControl", "(", "grey", "line", ")", ",", "siBin1", "(", "blue", "line", ")", "and", "siCD2AP", "(", "red", "line", ")", "neurons", "shown", "in", "(", "c", ")", ".", "(", "C", ")", "Aβ42", "line", "profiles", "in", "axons", "(", "Ax", ")", "of", "siControl", "(", "grey", "line", ")", ",", "siBin1", "(", "blue", "line", ")", "and", "siCD2AP", "(", "red", "line", ")", "neurons", "shown", "in", "(", "c", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Aβ42", "(", "12F4", ")", "intensity", "in", "cell", "body", "(", "CB", ")", ",", "dendrite", "(", "Dd", ")", "and", "axon", "(", "Ax", ")", "(", "n", "=", "5", ",", "NCB", "=", "44", "-", "53", ",", "NDd", "=", "90", "-", "120", ",", "NAx", "=", "60", "-", "74", ";", "*", "*", "*", "*", "PCB", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "PCB", "<", "0", ".", "001", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "*", "PDd", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "*", "PDd", "<", "0", ".", "0001", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "*", "PAx", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "extracellular", "endogenous", "Aβ40", ",", "Aβ42", "and", "of", "Aβ42", "/", "Aβ40", "ratio", "by", "ELISA", "analysis", "of", "conditioned", "media", "of", "9", "DIV", "siBin1", ",", "siCD2AP", "or", "siControl", "neurons", "(", "n", "=", "6", ";", "*", "PAβ40", "=", "0", ".", "0270", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "PAβ42", "/", "40", "=", "0", ".", "0378", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "PAβ42", "/", "40", "=", "0", ".", "0463", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "F", ")", "Endogenous", "APP", "and", "APP", "-", "CTFs", "levels", "by", "western", "blot", "with", "anti", "-", "APP", "antibody", "(", "Y188", ")", "of", "siBin1", "-", ",", "siCD2AP", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "at", "9", "DIV", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "APP", "and", "APP", "-", "CTFs", "levels", "normalized", "to", "APP", "(", "n", "=", "4", ";", "*", "PAPP", "=", "0", ".", "0355", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "PAPPCTFs", "/", "APP", "<", "0", ".", "001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "*", "PAPPCTFs", "/", "APP", "<", "0", ".", "0001", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Intracellular endogenous Aβ42 (green), Ankyrin-G (AnkG; magenta) and GFP (blue) in siBin1- , siCD2AP- and siControl-treated primary cortical neurons (neurons) expressing GFP immunolabelled at 9 DIV with anti-Aβ42 (clone 12F4) and anti-AnkG, analysed by spinning-disk confocal microscopy. The white rectangles indicate the dendrites (Dd) and axons (Ax) magnified below showing Aβ42 in axons and dendrites outlined based on AnkG (magenta) and GFP (blue), respectively. Scale bars, 10 µm.(B) Aβ42 line profiles in dendrites (Dd) of siControl (grey line), siBin1 (blue line) and siCD2AP (red line) neurons shown in (c).(C) Aβ42 line profiles in axons (Ax) of siControl (grey line), siBin1 (blue line) and siCD2AP (red line) neurons shown in (c).(D) Quantification of Aβ42 (12F4) intensity in cell body (CB), dendrite (Dd) and axon (Ax) (n=5, NCB=44-53, NDd=90-120, NAx=60-74; ****PCB<0.0001 siBin1 vs. siControl, ***PCB<0.001 siCD2AP vs. siControl, ****PDd<0.0001 siBin1 vs. siControl, ****PDd<0.0001 siCD2AP vs. siControl, ****PAx<0.0001 siBin1 vs. siControl, t-test, mean ± SEM).(E) Quantification of extracellular endogenous Aβ40, Aβ42 and of Aβ42/Aβ40 ratio by ELISA analysis of conditioned media of 9 DIV siBin1, siCD2AP or siControl neurons (n=6; *PAβ40=0.0270 siBin1 vs. siControl, *PAβ42/40=0.0378 siBin1 vs. siControl, *PAβ42/40=0.0463 siCD2AP vs. siControl, t-test, mean ± SEM).(F) Endogenous APP and APP-CTFs levels by western blot with anti-APP antibody (Y188) of siBin1-, siCD2AP- or siControl-treated neurons at 9 DIV.(G) Quantification of APP and APP-CTFs levels normalized to APP (n=4; *PAPP=0.0355 siBin1 vs. siControl, ***PAPPCTFs/APP<0.001 siBin1 vs. siControl, ****PAPPCTFs/APP<0.0001 siCD2AP vs. siControl, t-test, mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "2N2a", "cells", "treated", "with", "siBin1", ",", "siCD2AP", "or", "siControl", ".", "(", "B", ")", "Endocytosed", "APP", "detected", "after", "a", "10", "min", "pulse", "with", "22C11", "and", "APP", "-", "RFP", "(", "insets", ")", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "amount", "of", "endocytosed", "APP", "fluorescence", "at", "10", "min", "was", "quantified", "and", "normalized", "to", "APP", "-", "RFP", "fluorescence", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "56", ",", "NsiBin1", "=", "70", ",", "NsiCD2AP", "=", "42", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "D", ")", "Non", "-", "degraded", "APP", "detected", "after", "10", "min", "pulse", "and", "60", "min", "chase", "with", "22C11", "and", "APP", "-", "RFP", "(", "insets", ")", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Cells", "are", "outlined", "in", "white", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "E", ")", "APP", "degradation", "was", "assessed", "by", "the", "decrease", "in", "the", "amount", "of", "endocytosed", "APP", "fluorescence", "at", "60", "min", "relative", "to", "time", "0", "(", "10", "min", "pulse", ")", "in", "siControl", "cells", "normalized", "to", "APP", "-", "RFP", "fluorescence", "(", "n60min", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "68", ",", "NsiBin1", "=", "43", ",", "NsiCD2AP", "=", "64", ";", "*", "*", "*", "*", "PAPP60min", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "N2a", "cells", "treated", "with", "siBin1", ",", "siCD2AP", "or", "siControl", ".", "(", "G", ")", "Endocytosed", "BACE1", "detected", "upon", "5", "min", "pulse", "with", "M1", "and", "BACE1", "-", "GFP", "(", "insets", ")", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "H", ")", "The", "amount", "of", "endocytosed", "BACE1", "per", "cell", "was", "quantified", "as", "percentage", "of", "siControl", "normalized", "to", "BACE1", "-", "GFP", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "86", ",", "NsiBin1", "=", "72", ",", "NsiCD2AP", "=", "113", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "I", ")", "Recycled", "BACE1", "detected", "at", "the", "plasma", "membrane", "of", "non", "-", "permeabilized", "cells", "with", "M1", ",", "upon", "a", "10", "min", "pulse", ",", "acid", "stripping", "and", "20", "min", "chase", ",", "and", "BACE1", "-", "GFP", "(", "insets", ")", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "J", ")", "The", "amount", "of", "recycled", "BACE1", "was", "quantified", "as", "in", "(", "h", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "94", ",", "NsiBin1", "=", "58", ",", "NsiCD2AP", "=", "109", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "K", ")", "Non", "-", "recycled", "BACE1", "detected", "in", "acid", "-", "stripped", "permeabilized", "cells", "pulse", "-", "chased", "as", "in", "(", "i", ")", "with", "M1", "and", "BACE1", "-", "GFP", "(", "insets", ")", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "L", ")", "The", "amount", "of", "non", "-", "recycled", "BACE1", "was", "quantified", "as", "in", "(", "h", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "61", ",", "NsiBin1", "=", "51", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ";", "n", "=", "2", ",", "NsiCD2AP", "=", "37", ";", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2N2a cells treated with siBin1, siCD2AP or siControl.(B) Endocytosed APP detected after a 10 min pulse with 22C11 and APP-RFP (insets), analysed by epifluorescence microscopy. Scale bars, 10 µm.(C) The amount of endocytosed APP fluorescence at 10 min was quantified and normalized to APP-RFP fluorescence (n=3, NsiControl=56, NsiBin1=70, NsiCD2AP =42; mean ± SEM).(D) Non-degraded APP detected after 10 min pulse and 60 min chase with 22C11 and APP-RFP (insets), analysed by epifluorescence microscopy. Cells are outlined in white. Scale bars, 10 µm.(E) APP degradation was assessed by the decrease in the amount of endocytosed APP fluorescence at 60 min relative to time 0 (10 min pulse) in siControl cells normalized to APP-RFP fluorescence (n60min=3, NsiControl=68, NsiBin1=43, NsiCD2AP=64; ****PAPP60min<0.0001, t-test, mean ± SEM).N2a cells treated with siBin1, siCD2AP or siControl.(G) Endocytosed BACE1 detected upon 5 min pulse with M1 and BACE1-GFP (insets), analysed by epifluorescence microscopy. Scale bars, 10 µm.(H) The amount of endocytosed BACE1 per cell was quantified as percentage of siControl normalized to BACE1-GFP (n=3, NsiControl=86, NsiBin1=72, NsiCD2AP=113; mean ± SEM).(I) Recycled BACE1 detected at the plasma membrane of non-permeabilized cells with M1, upon a 10 min pulse, acid stripping and 20 min chase, and BACE1-GFP (insets), analysed by epifluorescence microscopy. Scale bars, 10 µm.(J) The amount of recycled BACE1 was quantified as in (h) (n=3, NsiControl=94, NsiBin1=58, NsiCD2AP=109; ****P<0.0001 siBin1 vs. siControl, t-test, mean ± SEM).(K) Non-recycled BACE1 detected in acid-stripped permeabilized cells pulse-chased as in (i) with M1 and BACE1-GFP (insets), analysed by epifluorescence microscopy. Scale bars, 10 µm.(L) The amount of non-recycled BACE1 was quantified as in (h) (n=3, NsiControl=61, NsiBin1=51; ****P<0.0001 siBin1 vs. siControl, t-test; n=2, NsiCD2AP=37; mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "D", ")", "APP", "endocytic", "trafficking", "followed", "in", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", "treated", "with", "siCD2AP", "or", "siControl", "using", "a", "pulse", "-", "chase", "assay", "with", "22C11", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "(", "A", ")", "Endocytosed", "APP", "detected", "with", "22C11", "(", "10", "min", "pulse", ";", "top", "panels", ")", "and", "APP", "-", "RFP", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Arrowheads", "identify", "axons", "(", "Ax", ")", "and", "dendrites", "(", "Dd", ")", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "The", "amount", "of", "endocytosed", "APP", "(", "10", "min", ")", "in", "cell", "body", ",", "dendrites", "and", "axons", "normalized", "to", "APP", "-", "RFP", "expression", "in", "the", "cell", "body", "quantified", "as", "percentage", "of", "siControl", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "19", ",", "NsiCD2AP", "=", "20", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "C", ")", "Endocytosed", "APP", "detected", "with", "22C11", "(", "10", "min", "pulse", ",", "60", "min", "chase", ";", "top", "panels", ")", "and", "APP", "-", "RFP", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Arrowheads", "identify", "axons", "(", "Ax", ")", "and", "dendrites", "(", "Dd", ")", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "The", "amount", "of", "endocytosed", "APP", "(", "60", "min", "chase", ")", "was", "quantified", "as", "in", "(", "b", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "23", ",", "NsiCD2AP", "=", "19", ";", "*", "*", "PCB", "=", "0", ".", "001", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "*", "*", "*", "PDd", "=", "0", ".", "0004", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ";", "#", "P", "=", "0", ".", "0347", "Dendrite", "vs", ".", "Cell", "body", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0008", "Dendrite", "vs", ".", "Axon", ",", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", ")", "Degradation", "of", "surface", "biotinylated", "APP", "(", "biotin", "APP", ")", "(", "time", "0", ")", "chased", "for", "20", "and", "60", "min", "in", "neurons", "treated", "with", "siCD2AP", ",", "siBin1", "or", "siControl", ".", "Biotin", "APP", "and", "total", "APP", "were", "detected", "with", "anti", "-", "APP", "(", "Y188", ")", "by", "western", "blot", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "biotinylated", "APP", "normalized", "to", "levels", "at", "time", "0", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ",", "*", "P60min", "=", "0", ".", "0198", ",", "t", "-", "test", ";", "replicates", "and", "mean", ")", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "CD2AP", "(", "green", ")", "and", "APP", "(", "magenta", ")", "localisation", "in", "dendrites", "(", "G", ")", "and", "axons", "(", "I", ")", "of", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", "immunolabelled", "at", "11", "DIV", "with", "anti", "-", "CD2AP", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "The", "white", "squares", "are", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "CD2AP", "and", "APP", "in", "axons", "and", "dendrites", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ",", "NDd", "=", "19", ",", "NAx", "=", "17", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "CD2AP", "(", "green", ")", "and", "Rab5", "(", "magenta", ")", "localisation", "in", "dendrites", "(", "J", ")", "and", "axons", "(", "K", ")", "of", "neurons", "expressing", "Rab5", "-", "GFP", "analysed", "as", "in", "(", "G", "and", "H", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "The", "white", "squares", "are", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "CD2AP", "and", "Rab5", "-", "positive", "endosomes", "in", "dendrites", "(", "Dd", ")", "and", "axons", "(", "Ax", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NDd", "=", "17", ",", "NAx", "=", "23", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A - D) APP endocytic trafficking followed in neurons expressing APP-RFP treated with siCD2AP or siControl using a pulse-chase assay with 22C11, analysed by epifluorescence microscopy.(A) Endocytosed APP detected with 22C11 (10 min pulse; top panels) and APP-RFP (bottom panels). Arrowheads identify axons (Ax) and dendrites (Dd) magnified on the right. Scale bars, 10 µm.(B) The amount of endocytosed APP (10 min) in cell body, dendrites and axons normalized to APP-RFP expression in the cell body quantified as percentage of siControl (n=3, NsiControl=19, NsiCD2AP=20; mean ± SEM).(C) Endocytosed APP detected with 22C11 (10 min pulse, 60 min chase; top panels) and APP-RFP (bottom panels). Arrowheads identify axons (Ax) and dendrites (Dd) magnified on the right. Scale bars, 10 µm.(D) The amount of endocytosed APP (60 min chase) was quantified as in (b) (n=3, NsiControl=23, NsiCD2AP=19; **PCB=0.001 siCD2AP vs. siControl, ***PDd=0.0004 siCD2AP vs. siControl, t-test; #P=0.0347 Dendrite vs. Cell body, ###P=0.0008 Dendrite vs. Axon, 1-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test; mean ± SEM).(E) Degradation of surface biotinylated APP (biotin APP) (time 0) chased for 20 and 60 min in neurons treated with siCD2AP, siBin1 or siControl. Biotin APP and total APP were detected with anti-APP (Y188) by western blot.(F) Quantification of biotinylated APP normalized to levels at time 0 (n=3-4, *P60min=0.0198, t-test; replicates and mean).(G and H) CD2AP (green) and APP (magenta) localisation in dendrites (G) and axons (I) of neurons expressing APP-RFP immunolabelled at 11 DIV with anti-CD2AP, analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bars, 10 µm. The white squares are magnified on the right. Scale bars, 1 µm.(I) Quantification of colocalisation between CD2AP and APP in axons and dendrites (n=3-4, NDd=19, NAx=17; ****P<0.0001, t-test, mean ± SEM).(J and K) CD2AP (green) and Rab5 (magenta) localisation in dendrites (J) and axons (K) of neurons expressing Rab5-GFP analysed as in (G and H). Scale bars, 10 µm. The white squares are magnified on the right. Scale bars, 1 µm.(L) Quantification of colocalisation between CD2AP and Rab5-positive endosomes in dendrites (Dd) and axons (Ax) (n=3, NDd=17, NAx=23, ****P<0.0001, t-test, mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "D", ")", "BACE1", "endocytic", "trafficking", "followed", "in", "siBin1", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "BACE1", "-", "GFP", "N", "-", "terminally", "tagged", "with", "FLAG", "using", "a", "pulse", "/", "chase", "assay", "with", "M1", ",", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "(", "A", ")", "Endocytosed", "BACE1", "detected", "with", "M1", "(", "15", "min", "pulse", ";", "top", "panels", ")", "and", "BACE1", "-", "GFP", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Arrowheads", "identify", "axons", "(", "Ax", ")", "and", "dendrites", "(", "Dd", ")", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "The", "amount", "of", "endocytosed", "BACE1", "per", "cell", "body", ",", "dendrite", "and", "axons", "was", "normalized", "to", "BACE1", "-", "GFP", "expression", "in", "the", "cell", "body", "and", "quantified", "as", "percentage", "of", "siControl", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "17", ",", "NsiBin1", "=", "19", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "C", ")", "Recycled", "BACE1", "detected", "with", "M1", "(", "15", "min", "pulse", ",", "acid", "stripping", "and", "20", "min", "chase", ";", "top", "panels", ")", "at", "the", "plasma", "membrane", "of", "non", "-", "permeabilized", "neurons", "and", "BACE1", "-", "GFP", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Arrowheads", "identify", "axons", "(", "Ax", ")", "and", "dendrites", "(", "Dd", ")", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "The", "amount", "of", "recycled", "BACE1", "analysed", "as", "in", "(", "b", ")", "(", "n", "=", "4", ",", "NsiControl", "=", "31", ",", "NsiBin1", "=", "38", ",", "*", "*", "*", "PCB", "=", "0", ".", "0002", "and", "*", "*", "*", "*", "PAx", "<", "0", ".", "0001", "siBin1", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ";", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0014", "Axon", "vs", ".", "Dendrite", ",", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "multiple", "comparisons", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Bin1", "(", "green", ")", "and", "BACE1", "(", "magenta", ")", "localisation", "in", "axons", "(", "E", ")", "and", "dendrites", "(", "F", ")", "of", "neurons", "expressing", "BACE1", "-", "GFP", "immunolabelled", "at", "11", "DIV", "with", "anti", "-", "Bin1", ",", "and", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "The", "white", "squares", "are", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "Bin1", "and", "BACE1", "in", "axons", "and", "dendrites", "(", "n", "=", "3", ",", "NDd", "=", "17", ",", "NAx", "=", "21", ";", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", "Axon", "vs", ".", "Dendrite", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Bin1", "(", "green", ")", "and", "Rab5", "(", "magenta", ")", "localisation", "in", "axons", "(", "H", ")", "and", "dendrites", "(", "I", ")", "of", "neurons", "expressing", "Rab5", "-", "GFP", "analysed", "as", "in", "(", "E", "and", "F", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "The", "white", "squares", "are", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "Bin1", "and", "Rab5", "-", "positive", "endosomes", "in", "axons", "(", "Ax", ")", "and", "dendrites", "(", "Dd", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NAx", "=", "39", ",", "NDd", "=", "16", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A - D) BACE1 endocytic trafficking followed in siBin1- and siControl-treated neurons expressing BACE1-GFP N-terminally tagged with FLAG using a pulse/chase assay with M1, an anti-FLAG antibody, analysed by epifluorescence microscopy.(A) Endocytosed BACE1 detected with M1 (15 min pulse; top panels) and BACE1-GFP (bottom panels). Arrowheads identify axons (Ax) and dendrites (Dd) magnified on the right. Scale bars, 10 µm.(B) The amount of endocytosed BACE1 per cell body, dendrite and axons was normalized to BACE1-GFP expression in the cell body and quantified as percentage of siControl (n=3, NsiControl=17, NsiBin1=19, mean ± SEM).(C) Recycled BACE1 detected with M1 (15 min pulse, acid stripping and 20 min chase; top panels) at the plasma membrane of non-permeabilized neurons and BACE1-GFP (bottom panels). Arrowheads identify axons (Ax) and dendrites (Dd) magnified on the right. Scale bars, 10 µm.(D) The amount of recycled BACE1 analysed as in (b) (n=4, NsiControl=31, NsiBin1=38, ***PCB=0.0002 and ****PAx<0.0001 siBin1 vs. siControl, t-test; ##P=0.0014 Axon vs. Dendrite, 1-way ANOVA with Tukey multiple comparisons test; mean ± SEM).(E and F) Bin1 (green) and BACE1 (magenta) localisation in axons (E) and dendrites (F) of neurons expressing BACE1-GFP immunolabelled at 11 DIV with anti-Bin1, and analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bars, 10 µm. The white squares are magnified on the right. Scale bars, 1 µm.(G) Quantification of colocalisation between Bin1 and BACE1 in axons and dendrites (n=3, NDd=17, NAx=21; ***P=0.0006 Axon vs. Dendrite, t-test; mean ± SEM).(H and I) Bin1 (green) and Rab5 (magenta) localisation in axons (H) and dendrites (I) of neurons expressing Rab5-GFP analysed as in (E and F). Scale bars, 10 µm. The white squares are magnified on the right. Scale bars, 1 µm.(J) Quantification of colocalisation between Bin1 and Rab5-positive endosomes in axons (Ax) and dendrites (Dd) (n=3, NAx=39, NDd=16, ****P<0.0001, t-test, mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Endocytosed", "APP", "(", "green", ")", "detected", "with", "22C11", "(", "10", "min", "pulse", "and", "60", "min", "chase", ")", "in", "EEA1", "-", "positive", "early", "endosomes", "(", "magenta", ")", "in", "dendrites", "of", "siCD2AP", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "The", "white", "squares", "indicate", "an", "EEA1", "-", "positive", "endosome", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "endocytosed", "APP", "and", "EEA1", "in", "dendrites", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "26", "NsiCD2AP", "=", "18", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "C", ")", "Non", "-", "recycled", "BACE1", "(", "green", ")", "detected", "with", "M1", "(", "15", "min", "pulse", ",", "acid", "stripping", "and", "20", "min", "chase", ")", "in", "Rab5", "-", "positive", "early", "endosomes", "(", "magenta", ")", "in", "axons", "of", "siControl", "-", "and", "siBin1", "-", "treated", "neurons", "expressing", "Rab5", "-", "mCherry", "and", "BACE1", "-", "GFP", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "White", "squares", "indicate", "a", "Rab5", "-", "positive", "endosome", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "non", "-", "recycled", "BACE1", "and", "Rab5", "in", "axons", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "19", ",", "NsiBin1", "=", "24", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", ")", "APP", "(", "magenta", ")", "and", "BACE1", "(", "green", ")", "colocalisation", "in", "dendrites", "of", "siCD2AP", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", "and", "BACE1", "-", "GFP", "upon", "DAPT", "treatment", ",", "recorded", "by", "time", "-", "lapse", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", "for", "120", "sec", "(", "1", "fps", ")", "(", "see", "supplementary", "movie", "1", ")", ".", "APP", "and", "BACE1", "in", "dendrites", "at", "0", "sec", "are", "shown", "and", "during", "120", "sec", "in", "kymographs", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Dotted", "white", "lines", "in", "kymographs", "highlight", "APP", "vesicles", "positive", "for", "BACE1", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalisation", "between", "APP", "and", "BACE1", "in", "dendrites", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "18", ",", "NsiCD2AP", "=", "21", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", "(", "G", ")", "APP", "(", "magenta", ")", "and", "BACE1", "(", "green", ")", "colocalisation", "in", "axons", "of", "siBin1", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", "and", "BACE1", "-", "GFP", "upon", "DAPT", "treatment", ",", "recorded", "by", "time", "-", "lapse", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", "for", "120", "sec", "(", "1", "fps", ")", "(", "see", "supplementary", "movie", "2", ")", ".", "APP", "and", "BACE1", "in", "axons", "at", "0", "sec", "are", "shown", "and", "during", "120", "sec", "in", "kymographs", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Dotted", "white", "lines", "in", "kymographs", "highlight", "APP", "vesicles", "positive", "for", "BACE1", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalisation", "between", "APP", "and", "BACE1", "in", "axons", "(", "n", "=", "4", ",", "NsiControl", "=", "17", ",", "NsiBin1", "=", "27", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Endocytosed APP (green) detected with 22C11 (10 min pulse and 60 min chase) in EEA1-positive early endosomes (magenta) in dendrites of siCD2AP- and siControl-treated neurons expressing APP-RFP, analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. The white squares indicate an EEA1-positive endosome magnified on the right. Scale bar, 1 µm.(B) Quantification of colocalisation between endocytosed APP and EEA1 in dendrites (n=3, NsiControl=26 NsiCD2AP=18; ****P<0.0001, t-test; mean ± SEM).(C) Non-recycled BACE1 (green) detected with M1 (15 min pulse, acid stripping and 20 min chase) in Rab5-positive early endosomes (magenta) in axons of siControl- and siBin1-treated neurons expressing Rab5-mCherry and BACE1-GFP, analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. White squares indicate a Rab5-positive endosome magnified on the right. Scale bar, 1 µm.(D) Quantification of colocalisation between non-recycled BACE1 and Rab5 in axons (n=3, NsiControl=19, NsiBin1=24; ****P<0.0001, t-test; mean ± SEM).(E) APP (magenta) and BACE1 (green) colocalisation in dendrites of siCD2AP- and siControl-treated neurons expressing APP-RFP and BACE1-GFP upon DAPT treatment, recorded by time-lapse spinning-disk confocal microscopy for 120 sec (1 fps) (see supplementary movie 1). APP and BACE1 in dendrites at 0 sec are shown and during 120 sec in kymographs (bottom panels). Dotted white lines in kymographs highlight APP vesicles positive for BACE1. Scale bar, 10 µm.(F) Quantification of the colocalisation between APP and BACE1 in dendrites (n=3, NsiControl=18, NsiCD2AP=21; ****P<0.0001, t-test; mean ± SEM)(G) APP (magenta) and BACE1 (green) colocalisation in axons of siBin1- and siControl-treated neurons expressing APP-RFP and BACE1-GFP upon DAPT treatment, recorded by time-lapse spinning-disk confocal microscopy for 120 sec (1 fps) (see supplementary movie 2). APP and BACE1 in axons at 0 sec are shown and during 120 sec in kymographs (bottom panels). Dotted white lines in kymographs highlight APP vesicles positive for BACE1. Scale bar, 10 µm.(H) Quantification of the colocalisation between APP and BACE1 in axons (n=4, NsiControl =17, NsiBin1=27; ****P<0.0001, t-test; mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "BACE1", "carriers", "in", "axons", "of", "siBin1", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "BACE1", "-", "GFP", ",", "analysed", "by", "epifluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "White", "rectangles", "indicate", "a", "BACE1", "-", "positive", "carrier", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "siBin1", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "displaying", "extended", "BACE1", "carriers", "(", "as", "shown", "in", "(", "a", ")", ")", ";", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "67", "cells", ",", "NsiBin1", "=", "68", "cells", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "0199", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "circularity", "of", "individual", "BACE1", "carriers", "in", "axons", "and", "in", "dendrites", "of", "siBin1", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", ".", "The", "percentage", "of", "BACE1", "tubules", "(", "defined", "by", "circularity", "<", "0", ".", "5", ";", "n", "=", "2", ",", "NAx", "=", "116", "and", "NDd", "=", "134", "of", "siControl", "carriers", ",", "NAx", "=", "71", "and", "NDd", "=", "134", "of", "siBin1", "carriers", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "0105", "siBin1", "-", "axons", "compared", "to", "siControl", "-", "axons", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "average", "size", "(", "μm2", ")", "of", "individual", "BACE1", "carriers", "in", "axons", "and", "in", "dendrites", "of", "siBin1", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "(", "n", "=", "2", ",", "NAx", "=", "116", "and", "NDd", "=", "134", "siControl", ",", "NAx", "=", "71", "and", "NDd", "=", "134", "siBin1", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "BACE1", "(", "green", ")", "exit", "in", "tubular", "carriers", "from", "Rab5", "-", "positive", "early", "endosomes", "(", "magenta", ")", "in", "axons", "of", "siBin1", "-", "(", "f", ")", "and", "siControl", "-", "(", "e", ")", "treated", "neurons", "expressing", "BACE1", "-", "GFP", "and", "Rab5", "-", "mCherry", "using", "time", "-", "lapse", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", "(", "4", "fps", ")", "(", "see", "EV", "movie", "3", ")", ".", "BACE1", "and", "Rab5", "are", "shown", "in", "axons", "at", "0", "sec", "and", "4", ".", "75", "sec", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "White", "rectangles", "indicate", "the", "region", "used", "in", "kymographs", "shown", "on", "the", "right", ".", "Arrows", "and", "kymographs", "(", "covering", "3", "or", "4", ".", "75", "sec", ")", "of", "merged", "BACE1", "and", "Rab5", "or", "BACE1", "alone", "indicate", "in", "(", "E", ")", "a", "BACE1", "punctum", "that", "exits", "in", "a", "tubular", "carrier", "from", "a", "Rab5", "-", "positive", "early", "endosome", "(", "asterisk", ")", "and", "in", "(", "F", ")", "a", "BACE1", "tubule", "that", "emanates", "from", "a", "Rab5", "-", "positive", "early", "endosome", ".", "Scale", "bars", ",", "1"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) BACE1 carriers in axons of siBin1- or siControl-treated neurons expressing BACE1-GFP, analysed by epifluorescence microscopy. Scale bar, 10 µm. White rectangles indicate a BACE1-positive carrier magnified on the right. Scale bar, 1 µm.(B) Quantification of the percentage of siBin1- or siControl-treated neurons displaying extended BACE1 carriers (as shown in (a)); (n=3, NsiControl=67 cells, NsiBin1=68 cells; *P=0.0199, t-test, mean ± SEM).(C) Quantification of circularity of individual BACE1 carriers in axons and in dendrites of siBin1- or siControl-treated neurons. The percentage of BACE1 tubules (defined by circularity < 0.5; n=2, NAx=116 and NDd=134 of siControl carriers, NAx=71 and NDd=134 of siBin1 carriers; *P=0.0105 siBin1-axons compared to siControl-axons, t-test, mean ± SEM).(D) Quantification of average size (μm2) of individual BACE1 carriers in axons and in dendrites of siBin1- or siControl-treated neurons (n=2, NAx=116 and NDd=134 siControl, NAx=71 and NDd=134 siBin1; **P=0.0019, Mann-Whitney test, mean ± SEM).(E and F) BACE1 (green) exit in tubular carriers from Rab5-positive early endosomes (magenta) in axons of siBin1- (f) and siControl- (e) treated neurons expressing BACE1-GFP and Rab5-mCherry using time-lapse spinning-disk confocal microscopy (4 fps) (see EV movie 3). BACE1 and Rab5 are shown in axons at 0 sec and 4.75 sec. Scale bars, 10 µm. White rectangles indicate the region used in kymographs shown on the right. Arrows and kymographs (covering 3 or 4.75 sec) of merged BACE1 and Rab5 or BACE1 alone indicate in (E) a BACE1 punctum that exits in a tubular carrier from a Rab5-positive early endosome (asterisk) and in (F) a BACE1 tubule that emanates from a Rab5-positive early endosome. Scale bars, 1 µm"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "APP", "detected", "with", "anti", "-", "APP", "(", "Y188", ",", "green", ")", "at", "early", "endosomes", "(", "anti", "-", "EEA1", ",", "magenta", ")", "in", "dendrites", "of", "siCD2AP", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "with", "or", "without", "DAPT", "treatment", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "White", "squares", "are", "magnified", "on", "the", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "colocalisation", "between", "APP", "and", "EEA1", "-", "positive", "dendritic", "endosomes", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "DMSO", "=", "15", ",", "NsiControl", "DAPT", "=", "14", ";", "NsiCD2AP", "DMSO", "=", "21", ",", "NsiCD2AP", "DAPT", "=", "22", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "siCD2AP", "DMSO", "vs", ".", "siControl", "DMSO", ",", "#", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "0001", "siCD2AP", "DAPT", "vs", ".", "siCD2AP", "DMSO", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "C", ")", "APP", "(", "green", ")", "distribution", "within", "enlarged", "Rab5QL", "-", "GFP", "endosomes", "(", "magenta", ")", "in", "dendrites", "of", "siCD2AP", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", "and", "Rab5QL", "-", "GFP", "upon", "DAPT", "treatment", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "White", "squares", "indicate", "a", "Rab5QL", "-", "positive", "endosome", "magnified", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "µm", ".", "(", "D", ")", "Qualitative", "analysis", "of", "APP", "distribution", "between", "the", "lumen", "and", "the", "membrane", "of", "Rab5QL", "-", "endosomes", "(", "n", "=", "4", ",", "NsiControl", "=", "45", "(", "774", "endosomes", ")", ",", "NsiCD2AP", "=", "52", "(", "888", "endosomes", ")", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "0368", "siCD2AP", "vs", ".", "siControl", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "APP", "(", "green", ")", "distribution", "within", "enlarged", "Rab5QL", "-", "GFP", "endosomes", "(", "magenta", ")", "in", "cell", "bodies", "of", "siCD2AP", "-", "(", "f", ")", "or", "siControl", "-", "(", "e", ")", "treated", "neurons", "expressing", "APP", "-", "RFP", ",", "upon", "DAPT", "treatment", ",", "analysed", "by", "spinning", "-", "disk", "confocal", "microscopy", ".", "APP", "(", "green", ")", "and", "Rab5QL", "(", "magenta", ")", "line", "intensity", "profiles", "along", "the", "endosome", "(", "see", "inset", "line", ")", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "amount", "of", "APP", "fluorescence", "at", "the", "limiting", "endosomal", "membrane", "normalized", "to", "total", "APP", "fluorescence", "per", "endosome", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "32", "endosomes", "(", "11", "cells", ")", ",", "NsiCD2AP", "=", "39", "endosomes", "(", "15", "cells", ")", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "H", ")", "APP", "detected", "with", "anti", "-", "APP", "(", "Y188", ",", "green", ")", "at", "early", "endosomes", "(", "anti", "-", "EEA1", ",", "magenta", ")", "in", "dendrites", "of", "siCD2AP", "-", "and", "siControl", "-", "treated", "neurons", "upon", "DAPT", "treatment", ",", "analysed", "by", "super", "-", "resolution", "dSTORM", "imaging", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "nm", ".", "(", "I", ")", "Qualitative", "analysis", "of", "super", "-", "resolved", "APP", "distribution", "between", "the", "lumen", "and", "the", "membrane", "of", "EEA1", "-", "positive", "endosomes", "of", "siCD2AP", "-", "or", "siControl", "-", "treated", "neurons", "upon", "DAPT", "treatment", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "35", ",", "NsiCD2AP", "=", "57", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "distance", "of", "APP", "puncta", "present", "in", "EEA1", "-", "positive", "early", "endosomes", "to", "its", "centroid", "over", "the", "endosome", "radius", ".", "The", "closer", "the", "ratio", "is", "to", "1", "the", "closer", "APP", "is", "to", "the", "endosomal", "membrane", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "distance", "equals", "radius", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "NsiControl", "=", "6", ",", "NsiCD2AP", "=", "6", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0051", ",", "t", "-", "test", ",", "mean", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) APP detected with anti-APP (Y188, green) at early endosomes (anti-EEA1, magenta) in dendrites of siCD2AP- and siControl-treated neurons with or without DAPT treatment, analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. White squares are magnified on the right panels. Scale bar, 1 µm.(B) Quantification of colocalisation between APP and EEA1-positive dendritic endosomes (n=3, NsiControl DMSO=15, NsiControl DAPT=14; NsiCD2AP DMSO=21, NsiCD2AP DAPT=22; ****P<0.0001 siCD2AP DMSO vs. siControl DMSO, ####P<0.0001 siCD2AP DAPT vs. siCD2AP DMSO, t-test, mean ± SEM).(C) APP (green) distribution within enlarged Rab5QL-GFP endosomes (magenta) in dendrites of siCD2AP- or siControl-treated neurons expressing APP-RFP and Rab5QL-GFP upon DAPT treatment, analysed by spinning-disk confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. White squares indicate a Rab5QL-positive endosome magnified on the right. Scale bar, 1 µm.(D) Qualitative analysis of APP distribution between the lumen and the membrane of Rab5QL-endosomes (n=4, NsiControl=45 (774 endosomes), NsiCD2AP=52 (888 endosomes); *P=0.0368 siCD2AP vs. siControl, t-test, mean ± SEM).(E - F) APP (green) distribution within enlarged Rab5QL-GFP endosomes (magenta) in cell bodies of siCD2AP- (f) or siControl- (e) treated neurons expressing APP-RFP, upon DAPT treatment, analysed by spinning-disk confocal microscopy. APP (green) and Rab5QL (magenta) line intensity profiles along the endosome (see inset line) are shown on the right. Scale bars, 1 µm.(G) Quantification of the amount of APP fluorescence at the limiting endosomal membrane normalized to total APP fluorescence per endosome (n=3, NsiControl=32 endosomes (11 cells), NsiCD2AP=39 endosomes (15 cells); ****P<0.0001, t-test, mean ± SEM).(H) APP detected with anti-APP (Y188, green) at early endosomes (anti-EEA1, magenta) in dendrites of siCD2AP- and siControl-treated neurons upon DAPT treatment, analysed by super-resolution dSTORM imaging. Scale bars, 200 nm.(I) Qualitative analysis of super-resolved APP distribution between the lumen and the membrane of EEA1-positive endosomes of siCD2AP- or siControl-treated neurons upon DAPT treatment (n=3, NsiControl=35, NsiCD2AP=57, **P=0.0012, Mann-Whitney test, mean ± SEM).(J) Quantification of the distance of APP puncta present in EEA1-positive early endosomes to its centroid over the endosome radius. The closer the ratio is to 1 the closer APP is to the endosomal membrane (i.e., distance equals radius) (n=3, NsiControl=6, NsiCD2AP =6; **P=0.0051, t-test, mean ± SEM)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Direct", "sequencing", "of", "PARN", "in", "a", "control", ",", "P1", "and", "her", "parents", ".", "(", "D", ")", "Direct", "sequencing", "of", "PARN", "in", "a", "control", ",", "P2", "and", "her", "parents", ".", "(", "E", ")", "Aberrant", "splicing", "products", "detected", "in", "P2", "and", "her", "mother", "but", "not", "in", "P2", "'", "s", "father", "nor", "in", "a", "healthy", "control", ".", "GAPDH", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "as", "control", ".", "(", "F", ")", "Detection", "of", "the", "exon6", "/", "7", "deletion", "by", "PCR", "with", "specific", "primers", "(", "1F", "/", "2R", ")", ".", "(", "G", ")", "PARN", "detection", "in", "cell", "lysates", "from", "P1", "and", "P2", "and", "a", "healthy", "control", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "H", ")", "In", "vitro", "deadenylation", "activity", "using", "protein", "extracts", "from", "control", "and", "P1", "and", "P2", "SV40T", "-", "transformed", "fibroblasts", ".", "Mixing", "protein", "extracts", "from", "control", "together", "with", "P1", "or", "P2", "eliminated", "the", "deadenylation", "defect", "whereas", "pairwise", "mixing", "of", "P1", "and", "P2", "failed", "to", "complement", "the", "deadenylation", "defect", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Direct sequencing of PARN in a control, P1 and her parents.(D) Direct sequencing of PARN in a control, P2 and her parents.(E) Aberrant splicing products detected in P2 and her mother but not in P2's father nor in a healthy control. GAPDH RT-PCR was performed as control.(F) Detection of the exon6/7 deletion by PCR with specific primers (1F/2R).(G) PARN detection in cell lysates from P1 and P2 and a healthy control. Actin was used as loading control.(H) In vitro deadenylation activity using protein extracts from control and P1 and P2 SV40T-transformed fibroblasts. Mixing protein extracts from control together with P1 or P2 eliminated the deadenylation defect whereas pairwise mixing of P1 and P2 failed to complement the deadenylation defect."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Mean", "telomere", "length", "(", "kb", ")", "of", "whole", "blood", "cells", "from", "patients", "and", "their", "parents", "estimated", "with", "the", "TRF", "method", ".", "(", "B", ")", "Representative", "picture", "of", "telomeric", "signals", "used", "for", "Q", "-", "FISH", "analysis", "on", "metaphase", "spreads", "from", "SV40T", "-", "transfomed", "fibroblasts", "and", "Muntjac", "cells", "used", "to", "normalize", "the", "signals", ".", "(", "C", ")", "Individual", "and", "mean", "values", "of", "Q", "-", "FISH", "analyses", "for", "control", "and", "patients", ".", "Mean", "fluorescence", "intensity", "of", "Muntjac", "cells", "was", "set", "to", "1", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", ".", "(", "D", ")", "Graphical", "representation", "of", "(", "C", ")", "showing", "the", "average", "of", "fluorescence", "ratios", "(", "relative", "to", "Muntjac", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "The", "non", "-", "parametric", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "was", "applied", "to", "compare", "relative", "fluorescence", "values", "between", "Ctl", "and", "P1", ",", "and", "Ctl", "and", "P2", ".", "(", "E", ")", "Representative", "pictures", "of", "nuclei", "from", "two", "controls", "and", "patient", "'", "s", "primary", "fibroblasts", "showing", "53BP1", "foci", "(", "green", ")", "and", "telomeres", "(", "red", ",", "detected", "by", "Telo", "-", "FISH", ")", ".", "Yellow", "arrows", "indicate", "telomere", "dysfunction", "-", "induced", "foci", "(", "TIF", ")", ".", "The", "scale", "bar", "corresponds", "to", "5µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "(", "E", ")", "in", "primary", "fibroblasts", "from", "two", "healthy", "controls", "(", "passages", ">", "4", ")", "and", "from", "patient", "1", "(", "passages", "<", "4", ")", ".", "Control", "1", ":", "n", "=", "224", ";", "Control", "2", ":", "n", "=", "263", ";", "Patient", "1", ":", "n", "=", "231", ".", "Averages", "are", "shown", "and", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "tests", "were", "applied", "when", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Representative", "pictures", "of", "SA", "-", "β", "-", "galactosidase", "staining", "in", "control", "(", "passage", "15", ")", "and", "P1", "'", "s", "primary", "fibroblasts", "(", "passage", "6", ")", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "the", "percentage", "of", "SA", "-", "β", "-", "galactosidase", "-", "positive", "cells", "(", "averages", ",", "lower", "panel", ")", ".", "Control", ":", "n", "=", "436", ";", "P1", ":", "n", "=", "436", ".", "A", "test", "to", "compare", "two", "population", "proportions", "was", "applied", ".", "(", "H", ")", "Representative", "pictures", "of", "chromosomes", "with", "normal", "or", "aberrant", "telomeres", "detected", "by", "Telo", "-", "FISH", ".", "The", "scale", "bar", "corresponds", "to", "1µm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "terminal", "deletions", "and", "sister", "telomere", "losses", "(", "J", ")", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "counted", "chromatids", ":", "Ctl1", ":", "n", "=", "2224", ";", "Ctl2", ":", "n", "=", "5696", ";", "P1", ":", "n", "=", "4764", ";", "P2", ":", "n", "=", "7908", ")", ".", "Averages", "are", "shown", "and", "χ2", "-", "tests", "were", "applied", "to", "compare", "Ctl1", "/", "2", "with", "either", "P1", "or", "P2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Mean telomere length (kb) of whole blood cells from patients and their parents estimated with the TRF method.(B) Representative picture of telomeric signals used for Q-FISH analysis on metaphase spreads from SV40T-transfomed fibroblasts and Muntjac cells used to normalize the signals. (C) Individual and mean values of Q-FISH analyses for control and patients. Mean fluorescence intensity of Muntjac cells was set to 1. Error bars indicate s.d.. (D) Graphical representation of (C) showing the average of fluorescence ratios (relative to Muntjac). Error bars indicate s.e.m.. The non-parametric Kruskal-Wallis test was applied to compare relative fluorescence values between Ctl and P1, and Ctl and P2.(E) Representative pictures of nuclei from two controls and patient's primary fibroblasts showing 53BP1 foci (green) and telomeres (red, detected by Telo-FISH). Yellow arrows indicate telomere dysfunction-induced foci (TIF). The scale bar corresponds to 5µm. (F) Quantification of (E) in primary fibroblasts from two healthy controls (passages > 4) and from patient 1 (passages < 4). Control 1: n = 224; Control 2: n = 263; Patient 1: n = 231. Averages are shown and error bars indicate s.e.m.. Unpaired Student's t tests were applied when indicated.(G) Representative pictures of SA-β-galactosidase staining in control (passage 15) and P1's primary fibroblasts (passage 6). Results are expressed as the percentage of SA-β-galactosidase-positive cells (averages, lower panel). Control: n = 436; P1: n = 436. A test to compare two population proportions was applied.(H) Representative pictures of chromosomes with normal or aberrant telomeres detected by Telo-FISH. The scale bar corresponds to 1µm. (I) Quantification of terminal deletions and sister telomere losses (J) from three independent experiments (counted chromatids: Ctl1: n=2224; Ctl2: n= 5696; P1: n=4764; P2: n=7908). Averages are shown and χ2-tests were applied to compare Ctl1/2 with either P1 or P2."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Validation", "of", "PARN", "KO", "in", "HT1080", "cells", "by", "Western", "blot", ".", "GAPDH", "is", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "deadenylation", "activity", "assay", "using", "protein", "extracts", "from", "HT1080", "(", "WT", ")", "and", "HT1080PARN", "KO", "(", "PARN", "KO", ")", "cells", ".", "(", "C", ")", "TRAP", "assay", "using", "successive", "dilutions", "(", "500", "ng", ",", "250", "ng", ",", "125", "ng", "and", "62", ".", "5", "ng", ")", "of", "cell", "extracts", "from", "WT", "or", "PARN", "KO", "cells", ".", "An", "internal", "control", "(", "IC", ")", "for", "PCR", "was", "used", ".", "(", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "hTR", "expression", "in", "WT", "and", "PARN", "KO", "cells", ".", "Expression", "levels", "were", "normalized", "first", "to", "ACTB", "and", "then", "to", "WT", ".", "Three", "independent", "RNA", "extractions", "were", "performed", "for", "each", "cell", "line", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "(", "E", ")", "Representative", "pictures", "of", "FISH", "against", "hTR", "in", "WT", "and", "PARN", "KO", "cells", ".", "Arrows", "indicate", "hTR", "foci", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "PARN", "detection", "by", "Western", "blot", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "Expression", "was", "induced", "by", "incubating", "cells", "with", "10", "ng", "/", "ml", "doxycycline", "for", "72", "h", ".", "Actin", "is", "used", "as", "loading", "control", ".", "PARN", "/", "actin", "ratios", ",", "normalized", "to", "doxycycline", "-", "treated", "WT", "/", "PARN", "cells", ",", "are", "shown", "below", ".", "(", "G", ")", "In", "vitro", "deadenylation", "activity", "assay", "using", "protein", "extracts", "from", "doxycycline", "-", "treated", "WT", "/", "empty", ",", "WT", "/", "PARN", ",", "KO", "/", "empty", "and", "KO", "/", "PARN", "cells", ".", "(", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "gene", "transcripts", "in", "doxycycline", "-", "treated", "WT", "/", "empty", ",", "WT", "/", "PARN", ",", "KO", "/", "empty", "and", "KO", "/", "PARN", "cells", ".", "Expression", "levels", "were", "normalized", "first", "to", "ACTB", "and", "then", "to", "WT", "/", "empty", ".", "Three", "independent", "doxycycline", "inductions", "were", "performed", "for", "each", "cell", "line", ".", "Averages", "are", "shown", "and", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "tests", "were", "applied", ".", "(", "I", ")", "Representative", "western", "blot", "analysis", "of", "PARN", ",", "TRF2", "and", "p53", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Mean", "TRF2", "/", "Actin", "levels", "from", "two", "independent", "experiments", "are", "indicated", "below", ".", "(", "J", ")", "Same", "as", "(", "H", ")", "for", "p53", "and", "p21", "transcripts", ".", "Averages", "are", "shown", "and", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "tests", "were", "applied", ".", "(", "K", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "TERRA", "from", "the", "indicated", "chromosome", "ends", "in", "doxycycline", "-", "treated", "KO", "/", "empty", "and", "KO", "/", "PARN", "cells", ".", "Expression", "levels", "were", "normalized", "first", "to", "ACTB", "and", "then", "to", "KO", "/", "empty", ".", "Three", "independent", "doxycycline", "inductions", "were", "performed", "for", "each", "cell", "line", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Validation of PARN KO in HT1080 cells by Western blot. GAPDH is used as loading control.(B) In vitro deadenylation activity assay using protein extracts from HT1080 (WT) and HT1080PARN KO (PARN KO) cells.(C) TRAP assay using successive dilutions (500 ng, 250 ng, 125 ng and 62.5 ng) of cell extracts from WT or PARN KO cells. An internal control (IC) for PCR was used.(D) qRT-PCR analysis of hTR expression in WT and PARN KO cells. Expression levels were normalized first to ACTB and then to WT. Three independent RNA extractions were performed for each cell line. Error bars indicate s.e.m..(E) Representative pictures of FISH against hTR in WT and PARN KO cells. Arrows indicate hTR foci. Scale bar 5 μm.(F) PARN detection by Western blot in the indicated conditions. Expression was induced by incubating cells with 10 ng/ml doxycycline for 72 h. Actin is used as loading control. PARN/actin ratios, normalized to doxycycline-treated WT/PARN cells, are shown below.(G) In vitro deadenylation activity assay using protein extracts from doxycycline-treated WT/empty, WT/PARN, KO/empty and KO/PARN cells.(H) qRT-PCR analysis of the indicated gene transcripts in doxycycline-treated WT/empty, WT/PARN, KO/empty and KO/PARN cells. Expression levels were normalized first to ACTB and then to WT/empty. Three independent doxycycline inductions were performed for each cell line. Averages are shown and error bars indicate s.e.m.. Unpaired Student's t tests were applied.(I) Representative western blot analysis of PARN, TRF2 and p53. Actin was used as loading control. Mean TRF2/Actin levels from two independent experiments are indicated below.(J) Same as (H) for p53 and p21 transcripts. Averages are shown and error bars indicate s.e.m.. Unpaired Student's t tests were applied.(K) qRT-PCR analysis of TERRA from the indicated chromosome ends in doxycycline-treated KO/empty and KO/PARN cells. Expression levels were normalized first to ACTB and then to KO/empty. Three independent doxycycline inductions were performed for each cell line. Error bars indicate s.e.m.."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Analysis", "of", "telomeric", "aberrations", "by", "Telo", "-", "FISH", "in", "doxycycline", "-", "treated", "WT", "/", "empty", ",", "WT", "/", "PARN", ",", "KO", "/", "empty", "and", "KO", "/", "PARN", "cells", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Counted", "chromatids", ":", "WT", "/", "empty", ":", "n", "=", "1824", ";", "WT", "/", "PARN", ":", "n", "=", "1744", ";", "KO", "/", "empty", ":", "n", "=", "1452", ";", "KO", "/", "PARN", ":", "n", "=", "1920", ".", "Averages", "are", "shown", "and", "χ2", "-", "tests", "were", "applied", "to", "compare", "KO", "/", "empty", "with", "either", "WT", "/", "empty", "or", "KO", "/", "PARN", ".", "(", "B", ")", "TRF", "analysis", "of", "telomere", "length", "(", "kb", ")", "in", "KO", "/", "empty", "and", "KO", "/", "PARN", "cells", "treated", "with", "10", "ng", "/", "ml", "Dox", "for", "72h", ".", "A", "control", "Western", "blot", "with", "PARN", "and", "Actin", "is", "shown", "below", "for", "the", "corresponding", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Analysis of telomeric aberrations by Telo-FISH in doxycycline-treated WT/empty, WT/PARN, KO/empty and KO/PARN cells. Two independent experiments were performed. Counted chromatids: WT/empty: n=1824; WT/PARN: n= 1744; KO/empty: n=1452; KO/PARN: n=1920. Averages are shown and χ2-tests were applied to compare KO/empty with either WT/empty or KO/PARN.(B) TRF analysis of telomere length (kb) in KO/empty and KO/PARN cells treated with 10 ng/ml Dox for 72h. A control Western blot with PARN and Actin is shown below for the corresponding samples."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HT1080", "(", "WT", ")", "and", "HT1080PARN", "KO", "(", "KO", ")", "cells", "stably", "transfected", "with", "GFP", "plasmid", "(", "empty", ")", "were", "transfected", "with", "siRNAs", "against", "p53", "for", "72h", "before", "RNA", "extraction", "and", "qRT", "-", "PCR", ".", "siRNAs", "against", "luciferase", "(", "siLuci", ")", "were", "used", "as", "control", ".", "p53", "expression", "levels", "were", "normalized", "first", "to", "ACTB", "and", "then", "to", "WT", "/", "empty", "/", "siLuci", "cells", ".", "Experiment", "was", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "B", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "transcript", "levels", "of", "the", "indicated", "genes", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "cDNA", "expression", "levels", "were", "normalized", "first", "to", "ACTB", "and", "then", "to", "WT", "/", "empty", "/", "siLuci", "cells", ".", "Experiment", "was", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "C", ")", "qRT", "-", "PCR", "analyses", "of", "the", "indicated", "genes", "were", "performed", "on", "RNA", "extracted", "from", "P1", "'", "s", "primary", "or", "SV40T", "-", "transformed", "fibroblasts", ".", "cDNA", "expression", "levels", "were", "normalized", "to", "primary", "fibroblasts", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HT1080 (WT) and HT1080PARN KO (KO) cells stably transfected with GFP plasmid (empty) were transfected with siRNAs against p53 for 72h before RNA extraction and qRT-PCR. siRNAs against luciferase (siLuci) were used as control. p53 expression levels were normalized first to ACTB and then to WT/empty/siLuci cells. Experiment was performed in triplicate. Error bars indicate s.e.m.(B) Cells were treated as in (A) and transcript levels of the indicated genes were measured by qRT-PCR. cDNA expression levels were normalized first to ACTB and then to WT/empty/siLuci cells. Experiment was performed in triplicate. Error bars indicate s.e.m.(C) qRT-PCR analyses of the indicated genes were performed on RNA extracted from P1's primary or SV40T-transformed fibroblasts. cDNA expression levels were normalized to primary fibroblasts."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Northern", "blot", "analysis", "of", "pre", "-", "rRNAs", "from", "control", "and", "patient", "B", "-", "LCLs", ".", "(", "D", ")", "Log2", "values", "of", "18S", "-", "E", "/", "21S", "and", "18S", "-", "EFL", "/", "21S", "for", "P1", "and", "P2", "were", "normalized", "to", "the", "values", "of", "the", "control", "and", "presented", "in", "a", "graphical", "format", ",", "as", "Log", "averages", "+", "standard", "deviation", "for", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Northern", "blot", "analysis", "of", "pre", "-", "rRNAs", "from", "HT1080PARN", "WT", "and", "HT1080PARN", "KO", "cells", ",", "transduced", "with", "an", "empty", "vector", ".", "(", "F", ")", "Ectopic", "expression", "of", "PARN", "was", "induced", "in", "HT1080PARN", "KO", "cells", "and", "compared", "to", "cells", "transduced", "with", "an", "empty", "vector", ".", "Western", "blot", "relative", "to", "actin", "assessed", "PARN", "levels", ".", "(", "G", ")", "Quantitative", "analyses", "of", "18S", "-", "E", "/", "21S", "and", "18S", "-", "E", "FL", "/", "21S", "ratios", "were", "as", "described", "in", "(", "D", ")", "for", "HT1080PARN", "KO", "cells", "relative", "to", "HT1080PARN", "WT", "(", "left", "panel", ";", "see", "(", "E", ")", ")", ",", "and", "for", "HT1080PARN", "KO", "cells", "rescued", "by", "ectopic", "expression", "of", "PARN", "relative", "to", "HT1080PARN", "KO", "cells", "transduced", "with", "an", "empty", "expression", "vector", "(", "right", "panel", ";", "see", "(", "F", ")", ")", ",", "with", "Log", "averages", "+", "standard", "deviation", "for", "four", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Northern blot analysis of pre-rRNAs from control and patient B-LCLs. (D) Log2 values of 18S-E/21S and 18S-EFL/21S for P1 and P2 were normalized to the values of the control and presented in a graphical format, as Log averages + standard deviation for two independent experiments.(E) Northern blot analysis of pre-rRNAs from HT1080PARN WT and HT1080PARN KO cells, transduced with an empty vector. (F) Ectopic expression of PARN was induced in HT1080PARN KO cells and compared to cells transduced with an empty vector. Western blot relative to actin assessed PARN levels. (G) Quantitative analyses of 18S-E/21S and 18S-E FL/21S ratios were as described in (D) for HT1080PARN KO cells relative to HT1080PARN WT (left panel; see (E)), and for HT1080PARN KO cells rescued by ectopic expression of PARN relative to HT1080PARN KO cells transduced with an empty expression vector (right panel; see (F)), with Log averages + standard deviation for four independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "Parn", "expression", "in", "control", "and", "Parn", "+", "/", "-", "MEFs", ".", "(", "B", ")", "Northern", "blot", "analysis", "of", "total", "RNAs", "from", "WT", "and", "Parn", "+", "/", "-", "MEFs", ".", "(", "D", ")", "Frequencies", "of", "expected", "and", "observed", "newborns", "of", "the", "indicated", "genotype", "obtained", "from", "Parn", "+", "/", "-", "intercrosses", ".", "n", "indicates", "the", "number", "of", "animal", "analyzed", ".", "Statistical", "significance", "(", "P", "=", "1", ".", "5417E", "-", "08", ")", "of", "the", "differences", "between", "the", "observed", "and", "expected", "genotype", "distributions", "was", "assessed", "by", "χ2", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "Frequencies", "of", "expected", "and", "observed", "E11", ".", "5", "embryos", "of", "the", "indicated", "genotype", "obtained", "from", "Parn", "+", "/", "-", "intercrosses", ".", "n", "indicates", "the", "number", "of", "animal", "analysed", ".", "Statistical", "significance", "(", "P", "=", "0", ".", "02535", ")", "of", "the", "differences", "between", "the", "observed", "and", "expected", "genotype", "distributions", "was", "assessed", "by", "χ2", "-", "test", ".", "(", "F", ")", ",", "(", "G", ")", "p53", "knock", "-", "out", "does", "not", "rescue", "Parn", "-", "/", "-", ".", "No", "Parn", "-", "/", "-", "p53", "-", "/", "-", "mouse", "was", "born", "from", "various", "combinations", "of", "Parn", "+", "/", "-", "and", "either", "p53", "+", "/", "-", "or", "p53", "-", "/", "-", "crosses", "(", "49", "and", "56", "pups", ",", "respectively", ")", ".", "Statistical", "significance", "(", "P", "=", "0", ".", "000886", ")", "of", "the", "differences", "between", "the", "observed", "and", "expected", "genotype", "distributions", "was", "assessed", "by", "χ2", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blot analysis of Parn expression in control and Parn+/- MEFs.(B) Northern blot analysis of total RNAs from WT and Parn+/- MEFs.(D) Frequencies of expected and observed newborns of the indicated genotype obtained from Parn+/- intercrosses. n indicates the number of animal analyzed. Statistical significance (P = 1.5417E-08) of the differences between the observed and expected genotype distributions was assessed by χ2-test. (E) Frequencies of expected and observed E11.5 embryos of the indicated genotype obtained from Parn+/- intercrosses. n indicates the number of animal analysed. Statistical significance (P = 0.02535) of the differences between the observed and expected genotype distributions was assessed by χ2-test.(F), (G) p53 knock-out does not rescue Parn-/-. No Parn-/- p53-/- mouse was born from various combinations of Parn+/- and either p53+/- or p53-/- crosses (49 and 56 pups, respectively). Statistical significance (P = 0.000886) of the differences between the observed and expected genotype distributions was assessed by χ2-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Streptavidin", "Western", "blotting", "of", "total", "biotinylated", "proteins", "in", "APEX2", ":", "RAB", "or", "APEX2", "only", "Flp", "-", "In", "/", "T", "-", "REx", "HeLa", "cells", ".", "(", "D", ")", "APEX2", ":", "RAB", "biotinylated", "proteins", "(", "streptavidin", ")", "are", "partially", "colocalized", "with", "EEA1", "in", "HeLa", "cells", ",", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bars", ":", "10µm", "or", "5µm", "in", "enlarged", "views", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Streptavidin Western blotting of total biotinylated proteins in APEX2:RAB or APEX2 only Flp-In/T-REx HeLa cells.(D) APEX2:RAB biotinylated proteins (streptavidin) are partially colocalized with EEA1 in HeLa cells, n=2 independent experiments. Scale bars: 10µm or 5µm in enlarged views."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "ProHits", "-", "viz", "generated", "dotblots", "of", "RAB", "effectors", ",", "GEFs", ",", "GAPs", "and", "sorting", "complexes", ".", "Green", ",", "blue", "and", "beige", "shadings", "along", "with", "RAB", "names", "refer", "to", "previously", "identified", "interactions", "between", "RABs", "and", "the", "depicted", "proteins", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) ProHits-viz generated dotblots of RAB effectors, GEFs, GAPs and sorting complexes. Green, blue and beige shadings along with RAB names refer to previously identified interactions between RABs and the depicted proteins."}
{"words": ["Figure", "3Strumpellin", "and", "VPS35", "are", "in", "close", "proximity", "to", "RAB5", "and", "RAB21", ".", "(", "A", ")", "Anti", "-", "biotin", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "of", "endogenous", "Strumpellin", "and", "VPS35", ".", "Lysates", "correspond", "to", "1", "%", "of", "input", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "RAB21", "can", "be", "seen", "interacting", "with", "various", "WASH", "and", "retromer", "complexes", "subunits", ".", "GFP", "trap", "IP", "of", "WT", ",", "Q78L", "and", "T33N", "RAB21", "variants", "in", "HeLa", "cells", "followed", "by", "GFP", "immunoblot", "and", "endogenous", "(", "B", ")", "VPS26", "immunoblot", "Lysates", "correspond", "to", "5", "%", "of", "input", ",", "n", "≥", "3", "independent", "experiments", ".", "GFP", "trap", "IP", "of", "WT", ",", "Q78L", "and", "T33N", "RAB21", "variants", "in", "HeLa", "cells", "followed", "by", "GFP", "immunoblot", "and", "(", "C", ")", "FAM21", ",", "Strumpellin", "and", "VPS35", "immunoblots", ".", "Lysates", "correspond", "to", "5", "%", "of", "input", ",", "n", "≥", "3", "independent", "experiments", ".", "RAB21", "actively", "pull", "-", "downs", "WASH", "and", "retromer", "complex", "subunits", "(", "D", ")", "Bacterially", "-", "purified", "and", "GTP", "-", "loaded", "GST", ":", "RAB21", "pull", "-", "down", "of", "HeLa", "cell", "lysates", "followed", "by", "Strumpellin", ",", "FAM21", ",", "CAPZα", "and", "VPS35", "immunoblots", ".", "Ponceau", "staining", "reveals", "the", "purity", "of", "the", "GST", "and", "GST", ":", "RAB21", "used", "for", "the", "pull", "-", "downs", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "RAB21", "colocalizes", "with", "the", "WASH", "and", "retromer", "complexes", ".", "Transiently", "expressing", "GFP", ":", "RAB21", "HeLa", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA1", ",", "FAM21", ",", "WASH", "and", "VPS26", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "and", "single", "channels", "are", "depicted", ".", "Scale", "bars", ":", "10µm", "or", "5µm", "in", "enlarged", "view", ".", "(", "F", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "RAB21", "and", "the", "various", "markers", ".", "Error", "bars", "are", "SEM", ",", "n", "=", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Strumpellin and VPS35 are in close proximity to RAB5 and RAB21. (A) Anti-biotin immunoprecipitation and immunoblot of endogenous Strumpellin and VPS35. Lysates correspond to 1% of input, n=3 independent experiments. RAB21 can be seen interacting with various WASH and retromer complexes subunits.GFP trap IP of WT, Q78L and T33N RAB21 variants in HeLa cells followed by GFP immunoblot and endogenous (B) VPS26 immunoblot Lysates correspond to 5% of input, n≥ 3 independent experiments.GFP trap IP of WT, Q78L and T33N RAB21 variants in HeLa cells followed by GFP immunoblot and (C) FAM21, Strumpellin and VPS35 immunoblots. Lysates correspond to 5% of input, n≥ 3 independent experiments.RAB21 actively pull-downs WASH and retromer complex subunits (D) Bacterially-purified and GTP-loaded GST:RAB21 pull-down of HeLa cell lysates followed by Strumpellin, FAM21, CAPZα and VPS35 immunoblots. Ponceau staining reveals the purity of the GST and GST:RAB21 used for the pull-downs. n=3 independent experiments.(E) RAB21 colocalizes with the WASH and retromer complexes. Transiently expressing GFP:RAB21 HeLa cells were fixed and stained for endogenous EEA1, FAM21, WASH and VPS26. Boxed region is magnified and single channels are depicted. Scale bars: 10µm or 5µm in enlarged view.(F) Per cell Pearson Correlation between RAB21 and the various markers. Error bars are SEM, n=2 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Low", "RAB21", "expression", "levels", "in", "two", "independent", "RAB21", "KO", "cell", "populations", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "RAB21", ",", "RAB5", ",", "RAB7", "and", "GAPDH", ".", "(", "B", ")", "Endo", "-", "lysosomal", "compartments", "are", "unaffected", "by", "the", "loss", "of", "RAB21", ".", "Immunofluorescences", "of", "APPL1", ",", "TfR", ",", "RAB7", "and", "LAMP1", "in", "parental", "HeLa", "cells", "and", "in", "the", "two", "RAB21", "knockout", "cell", "populations", ".", "Scale", "bars", ":", "10µm", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Low RAB21 expression levels in two independent RAB21 KO cell populations. Immunoblot analysis of endogenous RAB21, RAB5, RAB7 and GAPDH.(B) Endo-lysosomal compartments are unaffected by the loss of RAB21. Immunofluorescences of APPL1, TfR, RAB7 and LAMP1 in parental HeLa cells and in the two RAB21 knockout cell populations. Scale bars :10µm, n=3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5The", "stability", "of", "the", "retromer", "cargo", "sorting", "complex", "is", "affected", "in", "RAB21", "KO", "cells", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "VPS35", ",", "VPS26", ",", "VPS29", ",", "GAPDH", "and", "RAB21", "in", "parental", "and", "the", "two", "RAB21", "KO", "cell", "populations", ".", "Ratio", "of", "VPS35", ",", "VPS26", "and", "VPS29", "integrated", "densities", "to", "GAPDH", "for", "four", "independent", "experiments", ";", "SEM", ".", "*", "represents", "p", "<", "0", ".", "05", "Statistical", "tests", "used", ":", "One", "sample", "t", "-", "tests", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "(", "B", ")", "WASH", "complex", "proteins", "are", "not", "affected", "by", "RAB21", "deletion", ".", "Immunoblot", "of", "Strumpellin", ",", "WASH", ",", "FAM21", ",", "CAPZα", ",", "GAPDH", "and", "RAB21", ".", "Ratio", "of", "WASH", ",", "FAM21", ",", "Strumpellin", "and", "CAPZα", "integrated", "densities", "to", "GAPDH", "for", "four", "independent", "experiments", ";", "SEM", ".", "Data", "information", "Statistical", "tests", "used", ":", "One", "sample", "t", "-", "tests", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "RAB21", "knockout", "decreases", "VPS35", "localization", "at", "endosomes", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "of", "endogenous", "VPS35", "and", "EEA1", "in", "RAB21", "-", "depleted", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "and", "single", "channel", "images", "are", "depicted", ".", "(", "D", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "VPS35", "and", "EEA1", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "represent", "10µm", "or", "2", ".", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "(", "D", ")", "-", "Unpaired", "t", "-", "tests", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "RAB21", "knockout", "decreases", "VPS35", "localization", "at", "endosomes", ".", "(", "E", ")", "Average", "number", "of", "VPS35", "puncta", "per", "cell", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", "Statistical", "tests", "used", ":", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "RAB21", "loss", "impairs", "endosomal", "recruitment", "of", "the", "WASH", "complex", ".", "(", "F", ")", "Immunofluorescence", "of", "endogenous", "WASH", "and", "EEA1", "in", "RAB21", "-", "depleted", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "and", "single", "channel", "images", "are", "depicted", ".", "(", "G", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "VPS35", "and", "EEA1", "and", "(", "H", ")", "FAM21", "and", "EEA1", ";", "SEM", ",", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "represent", "10µm", "or", "2", ".", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "RAB21", "knockout", "reduces", "endosomal", "F", "-", "actin", "levels", ".", "(", "I", ")", "Immunofluorescence", "of", "endogenous", "F", "-", "actin", "using", "Alexa", "-", "488", "conjugated", "phalloidin", "and", "EEA1", "in", "RAB21", "-", "depleted", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "and", "single", "channel", "images", "are", "depicted", ".", "(", "J", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "internal", "F", "-", "actin", "and", "EEA1", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "represent", "10µm", "or", "2", ".", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The stability of the retromer cargo sorting complex is affected in RAB21 KO cells. Immunoblot analysis of VPS35, VPS26, VPS29, GAPDH and RAB21 in parental and the two RAB21 KO cell populations. Ratio of VPS35, VPS26 and VPS29 integrated densities to GAPDH for four independent experiments; SEM. * represents p <0.05 Statistical tests used: One sample t-tests All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.(B) WASH complex proteins are not affected by RAB21 deletion. Immunoblot of Strumpellin, WASH, FAM21, CAPZα, GAPDH and RAB21. Ratio of WASH, FAM21, Strumpellin and CAPZα integrated densities to GAPDH for four independent experiments; SEM. Data information Statistical tests used: One sample t-tests All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.RAB21 knockout decreases VPS35 localization at endosomes. (C) Immunofluorescence of endogenous VPS35 and EEA1 in RAB21-depleted cells. Boxed region is magnified and single channel images are depicted. (D) Per cell Pearson Correlation between VPS35 and EEA1; SEM, n=3 independent experiments. Data information scale bars represent 10µm or 2.5µm in enlarged views. Statistical tests used: (D) - Unpaired t-tests All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.RAB21 knockout decreases VPS35 localization at endosomes. (E) Average number of VPS35 puncta per cell; SEM, n=3 independent experiments. Data information Statistical tests used: Mann-Whitney tests. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.(F-H) RAB21 loss impairs endosomal recruitment of the WASH complex. (F) Immunofluorescence of endogenous WASH and EEA1 in RAB21-depleted cells. Boxed region is magnified and single channel images are depicted. (G) Per cell Pearson Correlation between VPS35 and EEA1 and (H) FAM21 and EEA1; SEM, n=2 independent experiments. Data information: scale bars represent 10µm or 2.5µm in enlarged views. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.(I-J) RAB21 knockout reduces endosomal F-actin levels. (I) Immunofluorescence of endogenous F-actin using Alexa-488 conjugated phalloidin and EEA1 in RAB21-depleted cells. Boxed region is magnified and single channel images are depicted. (J) Per cell Pearson Correlation between internal F-actin and EEA1; SEM, n=3 independent experiments. Data information scale bars represent 10µm or 2.5µm in enlarged views. Statistical tests used: Mann-Whitney tests. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "C", ")", "RAB21", "is", "not", "required", "for", "CI", "-", "MPR", "or", "GLUT1", "trafficking", ".", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "of", "endogenous", "CI", "-", "MPR", "and", "TGN46", "or", "GLUT1", "with", "LAMP1", "in", "RAB21", "-", "knockout", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", ".", "(", "B", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "CI", "-", "MPR", "and", "TGN46", "or", "(", "C", ")", "GLUT1", "and", "LAMP1", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "A", ")", ",", "scale", "bars", "represent", "20µm", "or", "5µm", "in", "enlarged", "views", "for", "CI", "-", "MPR", ",", "while", "they", "represent", "10µm", "in", "enlarged", "views", "for", "GLUT1", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "(", "B", ")", "-", "Unpaired", "t", "-", "tests", "(", "C", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeatsMCT1", "trafficking", "requires", "RAB21", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "of", "endogenous", "MCT1", "in", "wild", "type", "or", "RAB21", "-", "depleted", "cells", ".", "(", "E", ")", "Per", "cell", "integrated", "MCT1", "intensity", "(", "in", "Relative", "Fluorescence", "Unit", ")", ";", "SEM", ",", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "represent", "20µm", "or", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", "(", "F", ")", "RAB21", "interacts", "with", "SLC3A2", ".", "FLAG", "immunoprecipitation", "of", "FLAG", ":", "RAB21", "and", "immunoblot", "of", "co", "-", "expressed", "SLC3A2", ":", "HA", ".", "Lysates", "correspond", "to", "5", "%", "input", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "RAB21", "is", "required", "for", "appropriate", "SLC3A2", ",", "Basigin", "and", "CD44", "trafficking", ".", "(", "G", ")", "Antibody", "-", "uptake", "assays", "in", "parental", "or", "knockout", "RAB21", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "an", "Alexa488", "conjugated", "anti", "-", "mouse", "antibody", ".", "Arrowheads", "point", "to", "endosomal", "tubules", ".", "Note", "that", "non", "-", "internalized", "antibodies", "were", "removed", "by", "an", "acid", "wash", ",", "which", "was", "not", "fully", "efficient", "for", "CD147", "and", "CD44", ",", "explaining", "plasma", "membrane", "labeling", ".", "(", "H", ")", "Percentage", "of", "cells", "with", "tubules", "in", "parental", "or", "RAB21", "knockout", "cells", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "represent", "20µm", "or", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "Statistical", "tests", "used", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-C) RAB21 is not required for CI-MPR or GLUT1 trafficking. (A) Immunofluorescence of endogenous CI-MPR and TGN46 or GLUT1 with LAMP1 in RAB21-knockout cells. Boxed region is magnified. (B) Per cell Pearson Correlation between CI-MPR and TGN46 or (C) GLUT1 and LAMP1; SEM, n=3 independent experiments. Data information: In (A), scale bars represent 20µm or 5µm in enlarged views for CI-MPR, while they represent 10µm in enlarged views for GLUT1. Statistical tests used: (B) - Unpaired t-tests (C Mann-Whitney tests. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeatsMCT1 trafficking requires RAB21. (D) Immunofluorescence of endogenous MCT1 in wild type or RAB21-depleted cells. (E) Per cell integrated MCT1 intensity (in Relative Fluorescence Unit); SEM, n=2 independent experiments. Data information: scale bars represent 20µm or 5µm in enlarged views. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats(F) RAB21 interacts with SLC3A2. FLAG immunoprecipitation of FLAG:RAB21 and immunoblot of co-expressed SLC3A2:HA. Lysates correspond to 5% input, n=3 independent experiments.(G-H) RAB21 is required for appropriate SLC3A2, Basigin and CD44 trafficking. (G) Antibody-uptake assays in parental or knockout RAB21 cells. Cells were stained with an Alexa488 conjugated anti-mouse antibody. Arrowheads point to endosomal tubules. Note that non-internalized antibodies were removed by an acid wash, which was not fully efficient for CD147 and CD44, explaining plasma membrane labeling. (H) Percentage of cells with tubules in parental or RAB21 knockout cells; SEM, n=3 independent experiments. Data information scale bars represent 20µm or 5µm in enlarged views. Statistical tests used Mann-Whitney tests. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Validation", "of", "WASH", "and", "retromer", "knockouts", "and", "SLC3A2", "protein", "levels", ".", "Immunoblots", "of", "parental", "or", "FAM21", ",", "VARP", "and", "VPS29", "knockout", "cell", "populations", ".", "(", "B", ")", "Antibody", "-", "uptake", "assays", "in", "parental", "or", "knockout", "FAM21", ",", "VARP", "and", "VPS29", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "an", "Alexa488", "conjugated", "anti", "-", "mouse", "antibody", ".", "Arrowheads", "point", "to", "endosomal", "tubules", ".", "Data", "information", ":", "(", "B", ")", "scale", "bars", "represent", "20µm", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "cells", "with", "tubules", "in", "parental", "or", "in", "various", "knockout", "cells", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "(", "C", ")", "-", "Unpaired", "t", "-", "tests", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "(", "D", ")", "Ratio", "of", "SLC3A2", "integrated", "densities", "to", "GAPDH", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "(", "D", ")", "One", "sample", "T", "-", "tests", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", ".", "Retromer", "is", "required", "for", "endosomal", "localization", "of", "RAB21", ".", "Immunofluorescence", "of", "transiently", "expressed", "GFP", ":", "RAB21", "with", "endogenous", "(", "E", ")", "EEA1", "in", "parental", "or", "VARP", "-", "and", "VPS29", "-", "deleted", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "underneath", ".", "Data", "information", "scale", "bars", "represent", "10µm", "or", "2", ".", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "Retromer", "is", "required", "for", "endosomal", "localization", "of", "RAB21", ".", "Immunofluorescence", "of", "transiently", "expressed", "GFP", ":", "RAB21", "with", "endogenous", "(", "F", ")", "VPS26", "in", "parental", "or", "VARP", "-", "and", "VPS29", "-", "deleted", "cells", ".", "Boxed", "region", "is", "magnified", "underneath", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "represent", "10µm", "or", "2", ".", "5µm", "in", "enlarged", "views", ".", "(", "G", ")", "Per", "cell", "Pearson", "Correlation", "between", "GFP", ":", "RAB21", "and", "EEA1", "or", "VPS26", ";", "SEM", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "tests", "used", ":", "(", "G", ")", "-", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "All", "error", "bars", "are", "SEM", ".", "Number", "of", "cells", "presented", "on", "each", "graph", "represents", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "for", "all", "repeats", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Validation of WASH and retromer knockouts and SLC3A2 protein levels. Immunoblots of parental or FAM21, VARP and VPS29 knockout cell populations.(B) Antibody-uptake assays in parental or knockout FAM21, VARP and VPS29 cells. Cells were stained with an Alexa488 conjugated anti-mouse antibody. Arrowheads point to endosomal tubules. Data information: (B) scale bars represent 20µm(C) Percentage of cells with tubules in parental or in various knockout cells; SEM, n=3 independent experiments. Statistical tests used: (C) - Unpaired t-tests All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.(D) Ratio of SLC3A2 integrated densities to GAPDH; SEM, n=3 independent experiments. Statistical tests used: (D) One sample T-tests All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats.Retromer is required for endosomal localization of RAB21. Immunofluorescence of transiently expressed GFP:RAB21 with endogenous (E) EEA1 in parental or VARP- and VPS29-deleted cells. Boxed region is magnified underneath. Data information scale bars represent 10µm or 2.5µm in enlarged views.Retromer is required for endosomal localization of RAB21. Immunofluorescence of transiently expressed GFP:RAB21 with endogenous (F) VPS26 in parental or VARP- and VPS29-deleted cells. Boxed region is magnified underneath. Data information: scale bars represent 10µm or 2.5µm in enlarged views.(G) Per cell Pearson Correlation between GFP:RAB21 and EEA1 or VPS26; SEM, n=3 independent experiments. Statistical tests used: (G) - Mann-Whitney tests. All error bars are SEM. Number of cells presented on each graph represents the total number of cells analyzed for all repeats."}
{"words": ["Fig", "1A", ",", "C", ")", "After", "24", ",", "48", ",", "and", "72", "h", "incubation", "bortezomib", "inhibited", "cell", "growth", "in", "a", "concentration", "dependent", "manner", ".", "Untreated", "cells", "were", "measured", "as", "controls", "(", "n", "=", "12", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ")", ".", "B", ",", "D", ")", "Dynamic", "proliferation", "curves", "for", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", "in", "the", "presence", "of", "0", "(", "red", ")", ",", "2", ".", "5", "nM", "(", "green", ")", ",", "5", "nM", "(", "blue", ")", ",", "and", "10", "nM", "(", "purple", ")", "bortezomib", ".", "Data", "shown", "are", "representatives", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ",", "measured", "in", "biological", "quadruplicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1A,C) After 24, 48, and 72 h incubation bortezomib inhibited cell growth in a concentration dependent manner. Untreated cells were measured as controls (n = 12, mean ± S.D.).B,D) Dynamic proliferation curves for Cal-78 and SW-1353 cells in the presence of 0 (red), 2.5 nM (green), 5 nM (blue), and 10 nM (purple) bortezomib. Data shown are representatives from three independent experiments (n = 3, measured in biological quadruplicates)."}
{"words": ["Fig", "2A", ",", "C", ")", "Bortezomib", "treated", "chondrosarcoma", "cells", "showed", "a", "significantly", "higher", "level", "of", "caspase", "3", "/", "7", "activity", "than", "untreated", "cells", ".", "Untreated", "control", "cells", "served", "as", "reference", "value", "(", "ratio", "=", "1", ")", ".", "B", ",", "D", ")", "Cleavage", "of", "caspase", "-", "3", "was", "detected", "after", "24", "h", "of", "bortezomib", "treatment", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "y", "-", "axis", "denotes", "cell", "counts", "and", "the", "x", "-", "axis", "represents", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "APC", "antibody", ".", "The", "black", "filled", "histogram", "represents", "untreated", "control", "cells", ",", "the", "striated", "histogram", "represents", "5", "nM", ",", "and", "the", "checkered", "histogram", "shows", "10", "nM", "bortezomib", "treated", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 2A,C) Bortezomib treated chondrosarcoma cells showed a significantly higher level of caspase 3/7 activity than untreated cells. Untreated control cells served as reference value (ratio = 1).B,D) Cleavage of caspase-3 was detected after 24 h of bortezomib treatment by flow cytometry. The y-axis denotes cell counts and the x-axis represents fluorescence intensity of the APC antibody. The black filled histogram represents untreated control cells, the striated histogram represents 5 nM, and the checkered histogram shows 10 nM bortezomib treated cells."}
{"words": ["Fig", "3A", ",", "B", ")", "Relative", "gene", "expression", "analysis", "of", "the", "pro", "-", "and", "anti", "-", "apoptotic", "markers", "Bax", ",", "Bak", ",", "Bcl", "-", "2", ",", "and", "Bcl", "-", "xl", "in", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", "treated", "with", "the", "respective", "IC50", "values", "of", "bortezomib", "for", "24", "h", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "C", ")", "The", "human", "apoptosis", "antibody", "protein", "array", "revealed", "the", "downregulation", "of", "the", "heat", "shock", " ", "proteins", " ", "HSP27", ",", "HSP60", ",", "and", "HSP70", "as", "well", "as", "HTRA", ",", "Livin", ",", "p27", ",", "and", "p53", "in", "both", "cell", "lines", ".", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "showed", "an", "upregulation", "of", "cytochrome", "C", "in", "the", "cytoplasmic", "fraction", "after", "bortezomib", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 3A,B) Relative gene expression analysis of the pro- and anti-apoptotic markers Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-xl in Cal-78 and SW-1353 cells treated with the respective IC50 values of bortezomib for 24 h (n = 10).C) The human apoptosis antibody protein array revealed the downregulation of the heat shock proteins HSP27, HSP60, and HSP70 as well as HTRA, Livin, p27, and p53 in both cell lines.D) Western blot analysis showed an upregulation of cytochrome C in the cytoplasmic fraction after bortezomib treatment."}
{"words": ["Fig", "4A", ",", "B", ")", "Relative", "gene", "expression", "analysis", "of", "IGF1R", ",", "Fas", ",", "and", "the", "death", "receptors", "TRAILR", "-", "1", "and", "TRAILR", "-", "2", "after", "bortezomib", "treatment", "with", "the", "respective", "IC50", "concentrations", "for", "48", "h", ".", "Untreated", "control", "cells", "served", "as", "reference", "value", "(", "ratio", "=", "1", ")", ".", "C", ")", "The", "human", "apoptosis", "antibody", "protein", "array", "supported", "the", "important", "role", "of", "the", "IGF", "binding", "proteins", "(", "IGFBP", "-", "1", "to", "IGFBP", "-", "6", ")", ",", "the", "TNF", "receptor", "family", ",", "and", "the", "TRAIL", "receptors", "in", "both", "cell", "lines", ".", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "showed", "the", "downregulation", "of", "Fas", "and", "TNF", "-", "R1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4A,B) Relative gene expression analysis of IGF1R, Fas, and the death receptors TRAILR-1 and TRAILR-2 after bortezomib treatment with the respective IC50 concentrations for 48 h. Untreated control cells served as reference value (ratio = 1).C) The human apoptosis antibody protein array supported the important role of the IGF binding proteins (IGFBP-1 to IGFBP-6), the TNF receptor family, and the TRAIL receptors in both cell lines.D) Western blot analysis showed the downregulation of Fas and TNF-R1."}
{"words": ["Fig", "5A", ")", "Relative", "gene", "expression", "and", "B", ")", "western", "blot", "analysis", "of", "whole", "cell", " ", "lysates", "for", "the", "expression", "of", "the", "autophagy", "markers", "Atg", "5", "/", "12", "and", "Beclin", "in", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", "treated", "with", "the", "respective", "IC50", "values", "of", "bortezomib", "for", "24", "h", ".", "B", ")", "western", "blot", "analysis", "of", "whole", "cell", " ", "lysates", "for", "the", "expression", "of", "the", "autophagy", "markers", "Atg", "5", "/", "12", "and", "Beclin", "in", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", "treated", "with", "the", "respective", "IC50", "values", "of", "bortezomib", "for", "24", "h", ".", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "LC3BI", "-", "II", ".", "The", "lysosomal", " ", "protease", "inhibitors", " ", "E64d", "and", "pepstatin", "A", "(", "Inh", ")", "blocked", "the", "autophagic", "flux", "and", "inhibited", "the", "degradation", "of", "LC3B", "-", "II", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "LC3B", " ", "protein", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5A) Relative gene expression and B) western blot analysis of whole cell lysates for the expression of the autophagy markers Atg 5/12 and Beclin in Cal-78 and SW-1353 cells treated with the respective IC50 values of bortezomib for 24 h.B) western blot analysis of whole cell lysates for the expression of the autophagy markers Atg 5/12 and Beclin in Cal-78 and SW-1353 cells treated with the respective IC50 values of bortezomib for 24 h.C) Western blot analysis for the expression of LC3BI-II. The lysosomal protease inhibitors E64d and pepstatin A (Inh) blocked the autophagic flux and inhibited the degradation of LC3B-II.D) Quantification of the relative LC3B protein expression."}
{"words": ["Fig", "6A", ")", "Effect", "of", "bortezomib", "treatment", "on", "LC3B", " ", "immunostaining", "of", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", ".", "Double", "immunolabeling", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "anti", "-", "LC3B", "(", "green", ")", "antibodies", "was", "performed", "as", "described", "in", "the", "methods", "section", ".", "The", "lysosomal", " ", "protease", "inhibitors", " ", "E64d", "and", "pepstatin", "A", "(", "Inh", ")", "blocked", "the", "autophagic", "flux", "and", "inhibited", "the", "degradation", "of", "LC3B", "-", "II", "(", "bar", ":", "20", "μm", ")", ".", "B", ")", "Cal", "-", "78", "and", "SW", "-", "1353", "cells", "were", "treated", "either", "with", "bortezomib", "alone", "or", "in", "combination", "with", "the", "lysosomal", " ", "protease", "inhibitors", " ", "E64d", "and", "pepstatin", "A", "(", "Inh", ";", "striated", "bars", ")", "and", "cell", "viability", "was", "analysed", "by", "the", "MTS", "assay", ".", "Untreated", "cells", "were", "measured", "as", "controls", "(", "light", "grey", ";", "n", "=", "8", ",", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6A) Effect of bortezomib treatment on LC3B immunostaining of Cal-78 and SW-1353 cells. Double immunolabeling with DAPI (blue) and anti-LC3B (green) antibodies was performed as described in the methods section. The lysosomal protease inhibitors E64d and pepstatin A (Inh) blocked the autophagic flux and inhibited the degradation of LC3B-II (bar: 20 μm).B) Cal-78 and SW-1353 cells were treated either with bortezomib alone or in combination with the lysosomal protease inhibitors E64d and pepstatin A (Inh; striated bars) and cell viability was analysed by the MTS assay. Untreated cells were measured as controls (light grey; n = 8, mean ± S.D.)."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "Accumulation", "of", "Ub", "in", "autophagy", "-", "deficient", "brain", ".", "Ub", "profile", "from", "the", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "-", "soluble", "and", "-", "insoluble", "fraction", "of", "autophagy", "-", "deficient", "brain", "homogenates", "captured", "with", "P2UBA", "resin", ".", "(", "A", ")", "Age", "-", "matched", "control", "Atg7", "littermates", "(", "Atg7flox", "/", "+", ";", "nestin", "-", "Cre", ":", "p62", "+", "/", "−", ";", "denoted", "+", ")", "at", "6", "wk", "(", "open", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", "or", "Atg7", "KO", "(", "Atg7flox", "/", "flox", ";", "nestin", "-", "Cre", ":", "p62", "+", "/", "−", ";", "denoted", "−", ")", "at", "6", "wk", "(", "closed", "diamonds", ";", "n", "=", "3", ")", "are", "shown", ".", "Accumulation", "of", "Ub", "in", "autophagy", "-", "deficient", "brain", ".", "Ub", "profile", "from", "the", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "-", "soluble", "and", "-", "insoluble", "fraction", "of", "autophagy", "-", "deficient", "brain", "homogenates", "captured", "with", "P2UBA", "resin", ".", "(", "B", ")", "Control", "Atg5", "littermates", "(", "Atg5flox", "/", "+", ";", "nestin", "-", "Cre", ";", "denoted", "+", ")", "at", "16", "(", "open", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", "and", "26", "wk", "(", "open", "diamonds", ";", "n", "=", "3", ")", "or", "Atg5", "KO", "(", "Atg5flox", "/", "flox", ";", "nestin", "-", "Cre", ";", "denoted", "−", ")", "at", "16", "(", "closed", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", "and", "26", "wk", "(", "closed", "diamonds", ";", "n", "=", "3", ")", "are", "shown", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "animal", ".", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.Accumulation of Ub in autophagy-deficient brain. Ub profile from the 1% Triton X-100-soluble and -insoluble fraction of autophagy-deficient brain homogenates captured with P2UBA resin. (A) Age-matched control Atg7 littermates (Atg7flox/+;nestin-Cre:p62+/−; denoted +) at 6 wk (open circles; n = 4) or Atg7 KO (Atg7flox/flox;nestin-Cre:p62+/−; denoted −) at 6 wk (closed diamonds; n = 3) are shown.Accumulation of Ub in autophagy-deficient brain. Ub profile from the 1% Triton X-100-soluble and -insoluble fraction of autophagy-deficient brain homogenates captured with P2UBA resin. (B) Control Atg5 littermates (Atg5flox/+;nestin-Cre; denoted +) at 16 (open circles; n = 4) and 26 wk (open diamonds; n = 3) or Atg5 KO (Atg5flox/flox;nestin-Cre; denoted −) at 16 (closed circles; n = 4) and 26 wk (closed diamonds; n = 3) are shown. Each symbol represents one animal. *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.005."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "Suppressed", "accumulation", "of", "Ub", "in", "Atg7", "-", "/", "p62", "-", "deficient", "brains", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "Quantitative", "mass", "spectrometry", "analysis", "of", "P2UBA", "captured", "total", "(", "A", ")", "and", "isopeptide", "-", "linked", "(", "B", ")", "Ub", "from", "the", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "of", "autophagy", "-", "deficient", "brains", ".", "Age", "-", "matched", "control", "Atg7", "littermates", "(", "Atg7flox", "/", "+", ":", "nestin", "-", "Cre", ":", "p62", "+", "/", "−", ";", "denoted", "+", ")", "at", "6", "wk", "(", "open", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", ",", "p62", "KO", "(", "Atg7flox", "/", "flox", ":", "p62", "−", "/", "−", ";", "denoted", "−", ")", "at", "6", "wk", "(", "closed", "circles", ";", "n", "=", "3", ")", ",", "Atg7", "KO", "(", "Atg7flox", "/", "flox", ":", "nestin", "-", "Cre", ":", "p62", "+", "/", "−", ";", "denoted", "−", ")", "at", "6", "wk", "(", "closed", "diamonds", ";", "n", "=", "3", ")", ",", "or", "Atg7", "-", "/", "p62", "-", "DKO", "(", "Atg7flox", "/", "flox", ":", "nestin", "-", "Cre", ":", "p62", "−", "/", "−", ")", "at", "6", "wk", "(", "closed", "triangles", ";", "n", "=", "3", ")", "are", "shown", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "animal", ".", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.Suppressed accumulation of Ub in Atg7-/p62-deficient brains. (A and B) Quantitative mass spectrometry analysis of P2UBA captured total (A) and isopeptide-linked (B) Ub from the soluble and insoluble fractions of autophagy-deficient brains. Age-matched control Atg7 littermates (Atg7flox/+:nestin-Cre:p62+/−; denoted +) at 6 wk (open circles; n = 4), p62 KO (Atg7flox/flox:p62−/−; denoted −) at 6 wk (closed circles; n = 3), Atg7 KO (Atg7flox/flox:nestin-Cre:p62+/−; denoted −) at 6 wk (closed diamonds; n = 3), or Atg7-/p62-DKO (Atg7flox/flox:nestin-Cre:p62−/−) at 6 wk (closed triangles; n = 3) are shown. Each symbol represents one animal. *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.005."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "Suppressed", "accumulation", "of", "Ub", "in", "Atg7", "-", "/", "Nrf2", "-", "deficient", "livers", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "Quantitative", "mass", "spectrometry", "analysis", "of", "P2UBA", "captured", "p62", "(", "A", ")", ",", "total", "(", "A", ")", ",", "and", "isopeptide", "-", "linked", "(", "B", ")", "Ub", "from", "the", "soluble", "and", "insoluble", "fraction", "of", "autophagy", "-", "deficient", "livers", "(", "28", "d", "after", "pIpC", "injection", ")", ".", "Control", "littermates", "(", "F", "/", "F", "or", "F", "/", "F", ":", "Nrf2", "+", "/", "−", ";", "denoted", "+", ";", "open", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", ",", "Nrf2", "KO", "(", "F", "/", "F", ":", "Nrf2", "−", "/", "−", ";", "denoted", "−", ";", "closed", "circles", ";", "n", "=", "4", ")", ",", "Atg7", "KO", "(", "F", "/", "F", ":", "Mx1", "or", "F", "/", "F", ":", "Mx1", ":", "Nrf2", "+", "/", "−", ";", "denoted", "−", ";", "closed", "diamonds", ";", "n", "=", "6", ")", ",", "or", "Atg7", "-", "/", "Nrf2", "-", "DKO", "(", "F", "/", "F", ":", "Mx1", ":", "Nrf2", "−", "/", "−", ";", "closed", "triangles", ";", "n", "=", "6", ")", "are", "shown", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "animal", ".", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.Suppressed accumulation of Ub in Atg7-/Nrf2-deficient livers. (A and B) Quantitative mass spectrometry analysis of P2UBA captured p62 (A), total (A), and isopeptide-linked (B) Ub from the soluble and insoluble fraction of autophagy-deficient livers (28 d after pIpC injection). Control littermates (F/F or F/F:Nrf2+/−; denoted +; open circles; n = 4), Nrf2 KO (F/F:Nrf2−/−; denoted −; closed circles; n = 4), Atg7 KO (F/F:Mx1 or F/F:Mx1:Nrf2+/−; denoted −; closed diamonds; n = 6), or Atg7-/Nrf2-DKO (F/F:Mx1:Nrf2−/−; closed triangles; n = 6) are shown. Each symbol represents one animal. **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.005."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "(", "B", ")", "Elevated", "Ub", "mRNA", "levels", "from", "Atg5", "-", "deficient", "brains", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", "from", "control", "Atg5", "littermates", "(", "Atg5flox", "/", "+", ";", "nestin", "-", "Cre", ")", "at", "16", "wk", "or", "Atg5", "KO", "(", "Atg5flox", "/", "flox", ";", "nestin", "-", "Cre", ")", "at", "16", "wk", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ";", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ")", "and", "the", "amount", "of", "transcript", "from", "Ubc", ",", "Ubb", ",", "Uba52", ",", "and", "Uba80", "genes", "was", "quantified", "using", "real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "au", ",", "arbitrary", "unit", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.(B) Elevated Ub mRNA levels from Atg5-deficient brains. Total RNA was extracted from control Atg5 littermates (Atg5flox/+;nestin-Cre) at 16 wk or Atg5 KO (Atg5flox/flox;nestin-Cre) at 16 wk (n = 4 for each genotype; **, P ≤ 0.01) and the amount of transcript from Ubc, Ubb, Uba52, and Uba80 genes was quantified using real-time RT-PCR and normalized to actin. Error bars indicate SEM. au, arbitrary unit."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "(", "B", ")", "The", "addition", "of", "dox", "for", "96", "h", "decreased", "autophagy", "in", "the", "bicistronic", "stably", "expressing", "cell", "lines", "similar", "to", "the", "parental", "line", ",", "m5", "-", "7", ",", "as", "measured", "by", "the", "decreased", "levels", "of", "phosphatidylethanolamine", "-", "modified", "LC3", "(", "LC3", "-", "II", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "(", "WB", ")", "analysis", "of", "the", "accumulation", "of", "htt", "(", "Q", ")", "-", "GFP", "after", "autophagy", "shutoff", ".", "At", "steady", "-", "state", "(", "t", "=", "0", "h", ")", ",", "the", "levels", "of", "both", "htt", "(", "Q25", ")", "-", "GFP", "and", "htt", "(", "Q47", ")", "-", "GFP", "were", "virtually", "undetectable", ".", "After", "autophagy", "shutoff", ",", "there", "was", "a", "robust", "increase", "in", "the", "level", "of", "htt", "(", "Q47", ")", "-", "GFP", ",", "as", "detected", "by", "GFP", "Western", "blot", ",", "whereas", "there", "was", "very", "little", "or", "no", "detectable", "increase", "in", "htt", "(", "Q25", ")", "-", "GFP", ",", "GAPDH", ",", "LDH", ",", "or", "chFP", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "flow", "cytometry", "time", "course", "analysis", "measuring", "selective", "autophagy", "in", "live", "cells", ".", "The", "ASI", "is", "the", "ratio", "of", "the", "relative", "increase", "in", "green", "and", "red", "fluorescence", ",", "as", "assessed", "by", "two", "-", "color", "flow", "cytometry", ",", "in", "response", "to", "dox", ".", "In", "control", "experiments", ",", "the", "ASI", "of", "two", "soluble", ",", "nonaggregating", "proteins", ",", "htt", "(", "Q25", ")", "-", "GFP", "and", "chFP", ",", "was", "1", ".", "In", "contrast", ",", "the", "ASI", "of", "the", "aggregation", "-", "prone", "protein", ",", "htt", "(", "Q47", ")", "-", "GFP", ",", "compared", "with", "chFP", "after", "autophagy", "shutoff", "(", "+", "dox", ";", "100", "h", ")", "was", "2", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "performed", "on", "different", "days", ".", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "005", ".", "(", "E", ")", "Flow", "cytometry", "time", "course", "analysis", "of", "cell", "death", "at", "different", "time", "points", "after", "autophagy", "shutoff", "(", "+", "dox", ")", ".", "The", "degree", "of", "cell", "death", "correlated", "directly", "with", "increased", "htt", "(", "Q47", ")", "-", "GFP", "levels", "after", "autophagy", "shutoff", "and", "was", "significantly", "enhanced", "in", "cells", "expressing", "htt", "(", "Q47", ")", "-", "GFP", "compared", "with", "htt", "(", "Q25", ")", "-", "GFP", "(", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "005", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "performed", "on", "different", "days", ".", "(", "F", ")", "AQUA", "using", "heavy", "isotope", "-", "labeled", "GFP", "standard", "in", "addition", "to", "the", "routine", "Ub", "standards", "after", "P2UBA", "pull", "-", "down", "of", "soluble", "and", "insoluble", "lysates", "from", "htt", "(", "Q", ")", "-", "GFP", "-", "IRES", "-", "chFP", "bicistronic", "expressing", "cells", "before", "(", "−", "dox", ")", "and", "after", "autophagy", "shutoff", "(", "+", "dox", ")", ".", "The", "experimental", "GFP", "peptide", "was", "only", "detected", "in", "two", "of", "the", "four", "experiments", ",", "and", "the", "data", "shown", "are", "representative", "of", "these", ".", "In", "the", "other", "two", "experiments", ",", "the", "experimental", "GFP", "peptide", "was", "below", "the", "threshold", "of", "detection", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.(B) The addition of dox for 96 h decreased autophagy in the bicistronic stably expressing cell lines similar to the parental line, m5-7, as measured by the decreased levels of phosphatidylethanolamine-modified LC3 (LC3-II).(C) Western blot (WB) analysis of the accumulation of htt(Q)-GFP after autophagy shutoff. At steady-state (t = 0 h), the levels of both htt(Q25)-GFP and htt(Q47)-GFP were virtually undetectable. After autophagy shutoff, there was a robust increase in the level of htt(Q47)-GFP, as detected by GFP Western blot, whereas there was very little or no detectable increase in htt(Q25)-GFP, GAPDH, LDH, or chFP.(D) Quantitative flow cytometry time course analysis measuring selective autophagy in live cells. The ASI is the ratio of the relative increase in green and red fluorescence, as assessed by two-color flow cytometry, in response to dox. In control experiments, the ASI of two soluble, nonaggregating proteins, htt(Q25)-GFP and chFP, was 1. In contrast, the ASI of the aggregation-prone protein, htt(Q47)-GFP, compared with chFP after autophagy shutoff (+dox; 100 h) was 2. Data represent three independent experiments performed on different days. **, P ≤ 0.01; ***, P ≤ 0.005.(E) Flow cytometry time course analysis of cell death at different time points after autophagy shutoff (+dox). The degree of cell death correlated directly with increased htt(Q47)-GFP levels after autophagy shutoff and was significantly enhanced in cells expressing htt(Q47)-GFP compared with htt(Q25)-GFP (***, P ≤ 0.005). Data represent three independent experiments performed on different days.(F) AQUA using heavy isotope-labeled GFP standard in addition to the routine Ub standards after P2UBA pull-down of soluble and insoluble lysates from htt(Q)-GFP-IRES-chFP bicistronic expressing cells before (−dox) and after autophagy shutoff (+dox). The experimental GFP peptide was only detected in two of the four experiments, and the data shown are representative of these. In the other two experiments, the experimental GFP peptide was below the threshold of detection."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "The", "relative", "levels", "of", "(", "A", ")", "canalicular", "membrane", "(", "BA", ")", "transporter", "Bsep", ",", "Mrp2", ",", "Mdr1b", ",", "Mdr2", ",", "Abcg5", "and", "Abcg8", "mRNA", "transcripts", ",", "(", "B", ")", "basolateral", "membrane", "BA", "transporter", "Mrp3", ",", "Mrp4", ",", "Ostβ", ",", "Ntcp", "and", "Oatp1a1", "mRNA", "transcripts", ",", "and", "(", "C", ")", "BA", "synthetic", "enzyme", "Cyp7a1", ",", "Cyp7b1", ",", "Cyp8b1", ",", "Cyp27a1", ",", "and", "Cyp2c70", "mRNA", "transcripts", ".", "Wild", "type", ",", "wild", "type", "mice", ",", "n", "=", "6", ";", "Heterozygote", ",", "Sema7aR145W", "heterozygous", "mice", ",", "n", "=", "5", ";", "Homozygote", ",", "Sema7aR145W", "homozygous", "mice", ",", "n", "=", "7", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "the", "WT", "mice", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "the", "heterozygous", "mutant", "mice", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "by", "the", "independent", "-", "samples", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "the", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "relative", "levels", "of", "Bsep", ",", "Mrp2", ",", "Mdr2", ",", "Mrp3", ",", "Mrp4", ",", "Ostα", "/", "β", ",", "Ntcp", ",", "Cyp7a1", "and", "Cyp8b1", "protein", "expression", "in", "mouse", "livers", ".", "Contrary", "to", "the", "mRNA", "alterations", ",", "the", "levels", "of", "canalicular", "membrane", "Bsep", "and", "Mrp2", "proteins", "were", "dramatically", "reduced", "in", "homozygous", "mouse", "livers", ",", "suggesting", "that", "the", "decreased", "these", "proteins", "were", "might", "be", "mediated", "by", "post", "-", "translational", "regulation", "in", "the", "livers", "of", "Sema7aR145W", "mutant", "mice", ".", "Wild", "type", ",", "wild", "type", "mice", ",", "n", "=", "4", ";", "Heterozygote", ",", "Sema7aR145W", "heterozygous", "mice", ",", "n", "=", "5", ";", "Homozygote", ",", "Sema7aR145W", "homozygous", "mice", ",", "n", "=", "5", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "the", "WT", "mice", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "versus", "the", "heterozygous", "mutant", "mice", ".", "The", "data", "were", "analyzed", "by", "the", "independent", "-", "samples", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "the", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Multiplex", "IF", "analyses", "of", "Bsep", "and", "Mrp2", "expression", "in", "the", "livers", "(", "E", ")", "and", "primary", "hepatocytes", "in", "sandwich", "cultures", "(", "F", ")", "from", "WT", "and", "homozygous", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "G", ")", "Multiplex", "IF", "analyses", "revealed", "that", "transfection", "with", "the", "SEMA7A", "_", "WT", "or", "SEMA7A", "_", "R148W", "construct", "decreased", "the", "levels", "of", "canalicular", "membrane", "Bsep", "and", "Mrp2", "expression", "in", "mouse", "primary", "hepatocytes", "in", "collagen", "sandwich", "cultures", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", "(", "0", ",", "0", ".", "2", ",", "1", ".", "0", "μg", "per", "well", "of", "6", "-", "well", "plate", ";", "1", ".", "5", "ml", "culture", "medium", "per", "well", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Together", ",", "the", "Sema7aR145W", "mutation", "can", "reduce", "hepatic", "Bsep", "and", "Mrp2", "protein", "expression", "and", "lead", "to", "intrahepatic", "BA", "accumulation", "and", "cholestasis", "(", "Appendix", "Table", "S16", ")", ".", "Subsequently", ",", "cholestasis", "triggered", "an", "adaptive", "response", "in", "the", "liver", "by", "down", "-", "regulating", "the", "expression", "of", "BA", "synthetic", "enzymes", "of", "Cyp7a1", "and", "Cyp8b1", "and", "up", "-", "regulating", "the", "expression", "of", "BA", "efflux", "transporters", "Mrp3", ",", "Mrp4", "and", "Ostα", "/", "β", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) The relative levels of (A) canalicular membrane (BA) transporter Bsep, Mrp2, Mdr1b, Mdr2, Abcg5 and Abcg8 mRNA transcripts, (B) basolateral membrane BA transporter Mrp3, Mrp4, Ostβ, Ntcp and Oatp1a1 mRNA transcripts, and (C) BA synthetic enzyme Cyp7a1, Cyp7b1, Cyp8b1, Cyp27a1, and Cyp2c70 mRNA transcripts. Wild type, wild type mice, n=6; Heterozygote, Sema7aR145W heterozygous mice, n=5; Homozygote, Sema7aR145W homozygous mice, n=7. Data are shown as means ± SD. *P < 0.05 versus the WT mice, #P < 0.05 versus the heterozygous mutant mice. The data were analyzed by the independent-samples Student's t-test and the Mann-Whitney U test.(D) Western blot analysis of the relative levels of Bsep, Mrp2, Mdr2, Mrp3, Mrp4, Ostα/β, Ntcp, Cyp7a1 and Cyp8b1 protein expression in mouse livers. Contrary to the mRNA alterations, the levels of canalicular membrane Bsep and Mrp2 proteins were dramatically reduced in homozygous mouse livers, suggesting that the decreased these proteins were might be mediated by post-translational regulation in the livers of Sema7aR145W mutant mice. Wild type, wild type mice, n=4; Heterozygote, Sema7aR145W heterozygous mice, n=5; Homozygote, Sema7aR145W homozygous mice, n=5. *P < 0.05 versus the WT mice, #P < 0.05 versus the heterozygous mutant mice. The data were analyzed by the independent-samples Student's t-test and the Mann-Whitney U test.(E, F) Multiplex IF analyses of Bsep and Mrp2 expression in the livers (E) and primary hepatocytes in sandwich cultures (F) from WT and homozygous mice. Scale bar, 50 µm.(G) Multiplex IF analyses revealed that transfection with the SEMA7A_WT or SEMA7A_R148W construct decreased the levels of canalicular membrane Bsep and Mrp2 expression in mouse primary hepatocytes in collagen sandwich cultures in a dose-dependent manner (0, 0.2, 1.0 μg per well of 6-well plate; 1.5 ml culture medium per well). Scale bar, 50 µm. Together, the Sema7aR145W mutation can reduce hepatic Bsep and Mrp2 protein expression and lead to intrahepatic BA accumulation and cholestasis (Appendix Table S16). Subsequently, cholestasis triggered an adaptive response in the liver by down-regulating the expression of BA synthetic enzymes of Cyp7a1 and Cyp8b1 and up-regulating the expression of BA efflux transporters Mrp3, Mrp4 and Ostα/β."}
{"words": ["Figure", "3Treatment", "with", "UDCA", "(", "13", "mg", "/", "kg", "/", "d", ")", "and", "GSH", "(", "40", "mg", "/", "kg", "/", "d", ")", "for", "2", "weeks", "restored", "normal", "liver", "function", "in", "the", "child", ".", "However", ",", "when", "the", "treatment", "was", "ceased", "the", "levels", "of", "serum", "ALT", ",", "AST", "and", "TBA", "returned", "to", "abnormally", "high", "levels", "in", "the", "patient", ".", "Interestingly", ",", "treatment", "with", "half", "of", "the", "dose", "of", "UDCA", "and", "GSH", "also", "maintained", "the", "normal", "levels", "of", "serum", "ALT", "and", "AST", ",", "and", "reduced", "serum", "TBA", "in", "the", "child", "patient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Treatment with UDCA (13 mg/kg/d) and GSH (40 mg/kg/d) for 2 weeks restored normal liver function in the child. However, when the treatment was ceased the levels of serum ALT, AST and TBA returned to abnormally high levels in the patient. Interestingly, treatment with half of the dose of UDCA and GSH also maintained the normal levels of serum ALT and AST, and reduced serum TBA in the child patient."}
{"words": ["Figure", "1", "C", ",", "Dose", "-", "response", "curves", "of", "BEAS", "-", "2B", "and", "BEAS", "-", "2B", "-", "KRAS", "cells", "treated", "for", "72", "hours", "with", "inhibitors", "of", "FGFR", "(", "AZD4547", ",", "BGJ398", ")", "and", "PLK1", "(", "BI2536", ",", "BI6727", ")", ",", "alone", "or", "combination", ".", "Values", "of", "Fa", "and", "CI", "are", "shown", "underneath", ",", "with", "CI", "<", "1", ".", "0", "indicating", "synergistic", "effect", ".", "Data", "were", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "error", "bar", ":", "SD", "D", ",", "BEAS", "-", "2B", "and", "BEAS", "-", "2B", "-", "KRAS", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", ",", "alone", "or", "combination", "for", "72", "hours", ",", "were", "cultured", "in", "drug", "-", "free", "medium", "for", "additional", "7", "-", "21", "days", ".", "Surviving", "cells", "after", "the", "treatment", "were", "fixed", "and", "visualized", "by", "crystal", "violet", "staining", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 C, Dose-response curves of BEAS-2B and BEAS-2B-KRAS cells treated for 72 hours with inhibitors of FGFR (AZD4547, BGJ398) and PLK1 (BI2536, BI6727), alone or combination. Values of Fa and CI are shown underneath, with CI<1.0 indicating synergistic effect. Data were from three independent experiments (n=3), error bar: SD  D, BEAS-2B and BEAS-2B-KRAS treated with the indicated drugs, alone or combination for 72 hours, were cultured in drug-free medium for additional 7-21 days. Surviving cells after the treatment were fixed and visualized by crystal violet staining. "}
{"words": ["Figure", "2", "C", ",", "Clongenic", "assay", "of", "KRAS", "-", "mutant", "lung", "and", "pancreatic", "cells", "(", "MIA", "PaCa", "-", "2", ",", "H2122", ",", "H2009", ",", "H23", ",", "H358", "and", "A549", ")", "treated", "with", "control", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "alone", "or", "combination", ".", "D", ",", "Apoptotic", "assay", "of", "KRAS", "-", "mutant", "cancer", "cells", "(", "H358", ",", "H441", ",", "A549", ",", "and", "SW620", ")", "and", "KRAS", "-", "WT", "lung", "cancer", "cells", "(", "EBC", "-", "1", ")", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", "for", "48h", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "E", ",", "KRAS", "mutant", "lung", "(", "A549", ",", "H358", "，", "H441", ")", ",", "pancreatic", "(", "MIAPaCa", "-", "2", ")", "and", "colon", "(", "SW620", ")", "cancer", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNAs", ",", "FGFR1", "-", "and", "PLK1", "-", "specific", "siRNAs", ",", "alone", "or", "combination", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "72", "h", "post", "transfection", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "and", "ns", "P", "＞", "0", ".", "05", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "ns", ",", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 C, Clongenic assay of KRAS-mutant lung and pancreatic cells (MIA PaCa-2, H2122, H2009, H23, H358 and A549) treated with control (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), alone or combination.  D, Apoptotic assay of KRAS-mutant cancer cells (H358, H441, A549, and SW620) and KRAS-WT lung cancer cells (EBC-1) treated with vehicle (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), alone or in combination for 48h. Data are presented as mean ± SD (n=3). ***P<0.001 and ****P<0.0001 by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.  E, KRAS mutant lung (A549, H358，H441), pancreatic (MIAPaCa-2) and colon (SW620) cancer cells were transfected with control siRNAs, FGFR1- and PLK1-specific siRNAs, alone or combination. Cell viability was determined 72 h post transfection. Data are presented as mean ± SD (n=3). **p<0.01, ****p<0.0001, and ns P＞0.05 by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. ns, no significance. "}
{"words": ["Figure", "3", "D", ",", "Clonogenic", "assay", "of", "H358", ",", "A549", "and", "MIA", "PaCa", "-", "2", "cells", "treated", "with", "AZD4547", ",", "BI2536", ",", "and", "NAC", ",", "alone", "or", "in", "combination", "as", "indicated", ".", "E", ",", "Immunoblots", "of", "H358", "and", "A549", "cells", "treated", "for", "24", "h", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NAC", "(", "5", "mM", ")", ".", "clonogenic", "assay", "of", "H358", "cells", "treated", "for", "48", "h", "with", "vehicle", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Q", "-", "VD", "-", "OPh", "(", "20", "µM", ")", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 D, Clonogenic assay of H358, A549 and MIA PaCa-2 cells treated with AZD4547, BI2536, and NAC, alone or in combination as indicated.  E, Immunoblots of H358 and A549 cells treated for 24 h with vehicle (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), in the presence or absence of NAC (5 mM).  clonogenic assay of H358 cells treated for 48 h with vehicle, AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), in the presence or absence of Q-VD-OPh (20 µM). Data shown as mean ± SD (n=3). ***P<0.001 and ****P<0.0001 by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. "}
{"words": ["Figure", "4", "B", ",", "C", ",", "Immunoblots", "(", "B", ")", "and", "viability", "assay", "(", "C", ")", "of", "H358", "and", "A549", "cells", "preincubated", "overnight", "with", "SP600125", "(", "2", "µM", ")", "and", "SB203580", "(", "1", "µM", ")", "and", "subsequently", "treated", "with", "AZD", "4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", "for", "24", "hours", ".", "Data", "were", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "D", ",", "E", ",", "Immunoblots", "(", "D", ")", "and", "viability", "assay", "(", "E", ")", "of", "H358", "and", "A549", "cells", "transfected", "with", "E2F1", "-", "specific", "or", "control", "siRNAs", "followed", "by", "treatment", "(", "48", "h", "post", "transfection", ")", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "combined", "AZD", "4547", "(", "5", "µM", ")", "/", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", "for", "additional", "24", "hours", ".", "Data", "were", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "F", ",", "H358", "cells", "transfected", "with", "E2F1", "-", "specific", "or", "control", "siRNAs", "for", "24h", "were", "subsequently", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "alone", "or", "combination", "for", "48h", "before", "apoptotic", "assay", ".", "Data", "were", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 B, C, Immunoblots (B) and viability assay (C) of H358 and A549 cells preincubated overnight with SP600125 (2 µM) and SB203580 (1 µM) and subsequently treated with AZD 4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM) for 24 hours. Data were shown as mean ± SD (n=3); ***P<0.001, ****P<0.0001 and P＞0.05 (ns) by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.  D, E, Immunoblots (D) and viability assay (E) of H358 and A549 cells transfected with E2F1-specific or control siRNAs followed by treatment (48 h post transfection) with vehicle (DMSO) or combined AZD 4547 (5 µM)/BI2536(5 nM) for additional 24 hours. Data were shown as mean ± SD (n=3). **P<0.01, ****P<0.0001 and P＞0.05 (ns) by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.  F, H358 cells transfected with E2F1-specific or control siRNAs for 24h were subsequently treated with vehicle (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), alone or combination for 48h before apoptotic assay. Data were shown as mean ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01 and P＞0.05 (ns) by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. "}
{"words": ["Figure", "5", "B", ",", "A549", "cells", "stably", "expressing", "mCHerry", "-", "GFP", "-", "LC3B", "were", "exposed", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", "for", "24h", ".", "Cell", "were", "then", "fixed", "and", "processed", "for", "immunofluorescence", ",", "scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "E", ",", "Flow", "cytometry", "-", "based", "ROS", "measure", "in", "H358", ",", "A549", "and", "MIA", "PaCa", "-", "2", "cells", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ",", "AZD4547", "(", "5", "µM", ")", "and", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", ",", "alone", "or", "the", "combination", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "HCQ", "(", "10", "µM", ")", "for", "24h", ".", "Quantification", "of", "relative", "ROS", "levels", "was", "shown", "to", "the", "right", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "F", ",", "Immunoblots", "of", "H358", "cells", "transfected", "with", "ATG5", "-", "specific", "or", "control", "siRNAs", "for", "48h", "and", "before", "treated", "for", "24h", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "combined", "AZD", "4547", "(", "5", "µM", ")", "/", "BI2536", "(", "5", "nM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 B, A549 cells stably expressing mCHerry-GFP-LC3B were exposed to vehicle (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), alone or in combination for 24h. Cell were then fixed and processed for immunofluorescence, scale bar=10 µm.  E, Flow cytometry-based ROS measure in H358, A549 and MIA PaCa-2 cells treated with vehicle (DMSO), AZD4547 (5 µM) and BI2536 (5 nM), alone or the combination, in the presence or absence of HCQ (10 µM) for 24h. Quantification of relative ROS levels was shown to the right. Data are presented as mean ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001 and P＞0.05 (ns) by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.  F, Immunoblots of H358 cells transfected with ATG5-specific or control siRNAs for 48h and before treated for 24h with vehicle (DMSO) or combined AZD 4547 (5 µM)/BI2536 (5 nM). "}
{"words": ["Figure", "6", "A", ",", "Growth", "curve", "of", "a", "KRAS", "-", "mutant", "lung", "cancer", "PDX", "(", "BE564T", ")", "treated", "with", "vehicle", ",", "HCQ", "(", "30", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "AZD4547", "(", "10", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", "and", "BI6727", "(", "5", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Data", "are", "the", "mean", "of", "tumor", "volume", "of", "each", "group", "(", "5", "mice", "/", "group", ")", ";", "error", "bar", ":", "SD", "D", ",", "E", ",", "H", "&", "E", "and", "IHC", "analysis", "(", "Ki67", "and", "Caspase", "-", "3", ")", "of", "PDX", "(", "BE", "564T", ")", "tumors", "after", "the", "treatment", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "IHC", "data", "for", "the", "positivity", "of", "Ki", "-", "67", "and", "Caspase", "-", "3", "are", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "(", "error", "bar", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "F", "-", "K", ",", "Growth", "curves", "(", "F", ",", "I", ")", "of", "KRAS", "-", "mutant", "lung", "cancer", "PDXs", "(", "PF139", ",", "PF563", ")", "treated", "with", "vehicle", ",", "HCQ", "(", "30", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "AZD4547", "(", "10", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", "and", "BI6727", "(", "5", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "Data", "are", "the", "mean", "of", "tumor", "volume", "of", "each", "group", "(", "4", "mice", "/", "group", ")", ";", "error", "bar", ":", "SD", "Relative", "tumor", "volume", "(", "G", ",", "J", ")", "and", "weights", "(", "H", ",", "K", ")", "of", "the", "PDX", "tumors", "after", "the", "treatment", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "error", "bar", ")", "of", "tumor", "weights", "of", "each", "group", "(", "4", "mice", "/", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A, Growth curve of a KRAS-mutant lung cancer PDX (BE564T) treated with vehicle, HCQ (30 mg/kg/day), AZD4547 (10 mg/kg/day) and BI6727 (5 mg/kg/day), alone or in combination. *P<0.05, ***P<0.001 and P＞0.05 (ns) by one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Data are the mean of tumor volume of each group (5 mice/group); error bar: SD  D, E, H&E and IHC analysis (Ki67 and Caspase-3) of PDX (BE 564T) tumors after the treatment (D). Quantification of the IHC data for the positivity of Ki-67 and Caspase-3 are shown in (E). *P<0.05 and **P<0.01 by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Data are shown as mean ± SD (error bar) of three independent experiments (n=3).  F-K, Growth curves (F, I) of KRAS-mutant lung cancer PDXs (PF139, PF563) treated with vehicle, HCQ (30 mg/kg/day), AZD4547 (10 mg/kg/day) and BI6727 (5 mg/kg/day), alone or in combination. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 by one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. Data are the mean of tumor volume of each group (4 mice/group); error bar: SD Relative tumor volume (G, J) and weights (H, K) of the PDX tumors after the treatment. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 and P＞0.05 (ns) by unpaired two-tailed t-test. Data are the mean ± SD (error bar) of tumor weights of each group (4 mice/group). "}
{"words": ["Figure", "7", "F", ",", "Box", "plots", "showing", "the", "percentage", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "in", "different", "treatment", "groups", ".", "Data", "are", "based", "on", "IHC", "staining", "of", "lung", "tissue", "section", "of", "LSL", "-", "KrasG12D", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "P", "＞", "0", ".", "05", "(", "ns", ")", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "The", "boxplots", "span", "from", "the", "first", "to", "third", "quartile", ",", "the", "whiskers", "extend", "to", "1", ".", "5", "×", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ".", "The", "horzontal", "line", "within", "the", "boxes", "represents", "the", "median", "of", "each", "group", "of", "10", "replicates", "(", "n", "=", "10", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 F, Box plots showing the percentage of Ki67-positive cells in different treatment groups. Data are based on IHC staining of lung tissue section of LSL-KrasG12D mice. *P<0.05 and P＞0.05 (ns) by two-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test. The boxplots span from the first to third quartile, the whiskers extend to 1.5× the interquartile range (IQR). The horzontal line within the boxes represents the median of each group of 10 replicates (n=10). "}
{"words": ["Figure", "1A", "Representative", "IF", "image", "of", "NPCs", "stained", "for", "Nestin", ",", "FoxG1", "and", "Pank2", ".", "B", "NPCs", "differentiated", "into", "neurons", "by", "overexpressing", "Ngn2", "(", "one", "representative", "experiment", "is", "shown", ")", ".", "Two", "weeks", "after", "the", "infection", "differentiated", "NPC", "were", "positive", "for", "neuronal", "markers", "βIII", "-", "tubulin", "(", "Tuj1", ")", ",", "Map2", ",", "NeuN", "and", "humannuclei", "(", "hNu", ")", "and", "synaptic", "markers", ",", "the", "voltage", "-", "gated", "Na", "+", "channels", "(", "PanNav", ")", "and", "the", "vesicular", "glutamate", "transporter", "1", "(", "VGlut1", ")", ".", "C", "Western", "blot", "of", "soluble", "cell", "homogenates", "from", "humanneurons", "probed", "with", "PANK2", "and", "β", "-", "actin", "antibodies", "(", "arrows", ")", ".", "Asterisk", "indicates", "nonspecific", "band", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", "Plots", "showing", "the", "total", "dendritic", "length", "and", "branching", "points", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "and", "+", "SEM", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "A", "total", "of", "38", "neurons", "were", "counted", "for", "each", "sample", ".", "Statistics", "were", "determined", "by", "the", "t", "-", "test", "and", "resulted", "not", "significant", ".", "E", "Representative", "example", "of", "co", "-", "culture", "containing", "control", "(", "green", ")", ",", "PKAN", "(", "red", ")", "humanneurons", ",", "and", "E18", "cortical", "miceneurons", ".", "Control", "and", "PKAN", "NPCs", "were", "infected", "with", "GFP", "-", "LV", "and", "tdT", "-", "LV", "expressing", "vectors", ",", "respectively", ",", "and", "differentiated", "for", "8", "weeks", ".", "Scale", "bars", "20", "μm", ".", "F", "Examples", "of", "electrophysiological", "properties", "of", "humanneurons", ":", "control", "individual", "(", "top", ")", ";", "PKAN", "patient", "(", "bottom", ")", ".", "Traces", "on", "the", "left", "represent", "trains", "of", "action", "potentials", "induced", "by", "injection", "of", "a", "suprathreshold", "current", "step", "through", "the", "patch", "electrode", "in", "current", "-", "clamp", "mode", ".", "Middle", "traces", "show", "Na", "+", "and", "K", "+", "currents", "(", "down", "-", "and", "upward", "-", "deflecting", "from", "baseline", ",", "respectively", ")", "in", "response", "to", "a", "60", "mV", "step", "from", "a", "holding", "voltage", "of", "-", "70", "mV", "in", "voltage", "-", "clamp", "mode", ".", "Insets", "on", "the", "right", "display", "enlarged", "portions", "of", "the", "traces", "to", "magnify", "fast", "Na", "+", "currents", ".", "G", "Histogram", "with", "percentages", "of", "recorded", "cells", "showing", "repetitively", "firing", "(", "z", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Representative IF image of NPCs stained for Nestin, FoxG1 and Pank2.B NPCs differentiated into neurons by overexpressing Ngn2 (one representative experiment is shown). Two weeks after the infection differentiated NPC were positive for neuronal markers βIII-tubulin (Tuj1), Map2, NeuN and humannuclei (hNu) and synaptic markers, the voltage-gated Na+ channels (PanNav) and the vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1).C Western blot of soluble cell homogenates from humanneurons probed with PANK2 and β-actin antibodies (arrows). Asterisk indicates nonspecific band. Data are representative of three independent experiments.D Plots showing the total dendritic length and branching points. Data presented as mean and + SEM from at least three independent experiments. A total of 38 neurons were counted for each sample. Statistics were determined by the t-test and resulted not significant.E Representative example of co-culture containing control (green), PKAN (red) humanneurons, and E18 cortical miceneurons. Control and PKAN NPCs were infected with GFP-LV and tdT-LV expressing vectors, respectively, and differentiated for 8 weeks. Scale bars 20 μm.F Examples of electrophysiological properties of humanneurons: control individual (top); PKAN patient (bottom). Traces on the left represent trains of action potentials induced by injection of a suprathreshold current step through the patch electrode in current-clamp mode. Middle traces show Na+ and K+ currents (down- and upward-deflecting from baseline, respectively) in response to a 60 mV step from a holding voltage of -70 mV in voltage-clamp mode. Insets on the right display enlarged portions of the traces to magnify fast Na+ currents. G Histogram with percentages of recorded cells showing repetitively firing (z-test)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Representative", "images", "of", "humanneurons", "cells", "stained", "with", "the", "mitochondrial", "membrane", "potential", "sensible", "fluorescent", "probe", "TMRM", ",", "the", "neuronal", "specific", "anti", "-", "NCAM", "antibody", "and", "the", "nuclear", "staining", "Hoechst", ".", "Left", "panel", ",", "basal", "conditions", ".", "Right", "panel", ",", "after", "addition", "of", "the", "mitochondrial", "uncoupler", "FCCP", ".", "Scale", "bar", "20", "μm", ".", "Plot", "showing", "the", "quantification", "of", "TMRM", "fluorescence", "signal", "from", "NCAM", "+", "neurons", ".", "Data", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Representative", "images", "of", "ultrastructural", "analysis", "of", "fixed", "neurons", "examined", "with", "electron", "microscope", ".", "PANK2", "panel", "represents", "PKAN", "neuronal", "cells", "overexpressing", "PANK2", "protein", ".", "Scale", "bar", "500nm", ".", "Mitochondrial", "size", "was", "measured", "at", "level", "of", "the", "larger", "diameter", "along", "the", "perpendicular", "axis", "for", "all", "the", "mitochondria", "in", ">", "30", "field", "(", "200", "mitochondria", "in", "total", ")", "for", "each", "sample", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "C", "OCR", "measurements", "of", "controls", "and", "each", "PKAN", "patients", "analyzed", "individually", "and", "D", "data", "obtained", "by", "individual", "analysis", "and", "plotted", "as", "grouped", "controls", ",", "PKAN", "patients", "and", "PKAN", "patients", "overexpressing", "PANK2", ".", "The", "plots", "show", "OCR", "normalization", "to", "cell", "number", ".", "OCR", "was", "measured", "in", "basal", "conditions", ",", "and", "after", "oligomycin", "and", "FCCP", "addition", ".", "Bars", "indicate", "means", "+", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Representative images of humanneurons cells stained with the mitochondrial membrane potential sensible fluorescent probe TMRM, the neuronal specific anti-NCAM antibody and the nuclear staining Hoechst. Left panel, basal conditions. Right panel, after addition of the mitochondrial uncoupler FCCP. Scale bar 20 μm. Plot showing the quantification of TMRM fluorescence signal from NCAM+neurons. Data presented as means + SEM of three independent experiments (unpaired, two-tailed t-test).B Representative images of ultrastructural analysis of fixed neurons examined with electron microscope. PANK2 panel represents PKAN neuronal cells overexpressing PANK2 protein. Scale bar 500nm. Mitochondrial size was measured at level of the larger diameter along the perpendicular axis for all the mitochondria in >30 field (200 mitochondria in total) for each sample (one-way ANOVA).C OCR measurements of controls and each PKAN patients analyzed individually and D data obtained by individual analysis and plotted as grouped controls, PKAN patients and PKAN patients overexpressing PANK2. The plots show OCR normalization to cell number. OCR was measured in basal conditions, and after oligomycin and FCCP addition. Bars indicate means + SEM of three independent experiments (Two-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Representative", "images", "of", "neurons", "stained", "with", "the", "neuron", "specific", "anti", "-", "NCAM", "antibody", ",", "ROS", "sensible", "fluorescent", "probe", "DCF", ",", "and", "the", "nuclei", "dye", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", "20", "μm", ".", "Plots", "of", "the", "DCF", "fluorescence", "signal", "from", "NCAM", "positive", "controls", "-", "and", "PKAN", "humanneurons", ",", "infected", "or", "not", "with", "Ngn2", "-", "PANK2", "-", "LV", ".", "Data", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "B", "Representative", "images", "of", "neurons", "stained", "with", "ThiolTracker", "Violet", "and", "the", "anti", "Tuj1", ".", "Scale", "bar", "20", "μm", ".", "ThiolTracker", "Violet", "fluorescence", "signal", "from", "Tuj1", "positive", "neurons", "were", "quantified", "and", "shown", "in", "the", "plots", ".", "Data", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Representative images of neurons stained with the neuron specific anti-NCAM antibody, ROS sensible fluorescent probe DCF, and the nuclei dye Hoechst. Scale bar 20 μm. Plots of the DCF fluorescence signal from NCAM positive controls- and PKAN humanneurons, infected or not with Ngn2-PANK2-LV. Data presented as means + SEM of at least three independent experiments (One-way ANOVA).B Representative images of neurons stained with ThiolTracker Violet and the anti Tuj1. Scale bar 20 μm. ThiolTracker Violet fluorescence signal from Tuj1 positive neurons were quantified and shown in the plots. Data presented as means + SEM of at least three independent experiments (unpaired, two-tailed t-test)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Upper", "panel", ":", "representative", "images", "of", "in", "-", "gel", "enzymatic", "activity", "of", "mitochondrial", "and", "cytosolic", "aconitase", "(", "mAco", "and", "cAco", ",", "respectively", ")", ".", "The", "lower", "part", "of", "the", "gel", "was", "cut", ",", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ",", "and", "a", "protein", "band", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "Loading", ")", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "mAco", "and", "cAco", "enzymatic", "activity", "by", "densitometry", ".", "B", "Upper", "panel", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "mitochondrial", "and", "cytosolic", "aconitases", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "mAco", "and", "cAco", "by", "densitometry", ".", "C", "Hemequantification", "by", "absorbance", "at", "400", "nm", "of", "the", "soluble", "cell", "lysates", ".", "D", "Upper", "panel", ":", "western", "blot", "analysis", "of", "transferrin", "receptor", "(", "TfR1", ")", "and", "ferritin", "(", "FtH", ")", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "TfR1", "or", "FtH", "normalized", "on", "actin", "by", "densitometry", ".", "All", "the", "data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Upper panel: representative images of in-gel enzymatic activity of mitochondrial and cytosolic aconitase (mAco and cAco, respectively). The lower part of the gel was cut, stained with Coomassie blue, and a protein band was used as loading control (Loading). Lower panel: quantification of mAco and cAco enzymatic activity by densitometry.B Upper panel: Western blot analysis of mitochondrial and cytosolic aconitases. Lower panel: quantification of mAco and cAco by densitometry.C Hemequantification by absorbance at 400 nm of the soluble cell lysates.D Upper panel: western blot analysis of transferrin receptor (TfR1) and ferritin (FtH). Lower panel: quantification of TfR1 or FtH normalized on actin by densitometry. All the data are presented as means + SEM of at least three independent experiments (unpaired, two-tailed t-test)."}
{"words": ["Figure", "5A", "Representative", "images", "of", "co", "-", "cultures", "of", "control", "and", "PKAN", "NPCs", "infected", "with", "GFP", "-", "LV", "and", "tdT", "-", "LV", "expressing", "vectors", ",", "respectively", ",", "at", "the", "beginning", "(", "Day", "1", ")", ",", "after", "120", "(", "Day", "120", ")", "and", "150", "days", "of", "differentiation", "(", "Day", "150", ")", ".", "Scale", "bar", "20", "μm", ".", "Plots", "show", "the", "number", "of", "green", "and", "red", "humanneurons", "counted", "at", "different", "time", "points", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "B", "Example", "of", "electrophysiological", "properties", "of", "cultured", "PKAN", "humanneurons", "with", "or", "without", "CoA", "incubation", "for", "30", "days", ".", "Repetitive", "firing", "activity", "(", "left", ")", "and", "relatively", "large", "Na", "+", "and", "K", "+", "currents", "(", "right", ")", ",", "were", "restored", "by", "CoA", ".", "The", "histogram", "on", "the", "right", "shows", "fractions", "of", "repetitively", "firing", "cells", "recorded", "in", "untreated", "vs", ".", "CoA", "-", "treated", "neurons", "from", "control", "and", "PKAN", "patients", "(", "z", "-", "test", ")", ".", "C", "An", "example", "of", "neurons", "stained", "with", "the", "ROS", "sensible", "fluorescent", "probe", "DCF", "and", "the", "nuclei", "dye", "Hoechst", ".", "Anti", "-", "NCAM", "antibody", "was", "used", "to", "detect", "neurons", ".", "Scale", "bar", "20", "μm", ".", "Plots", "of", "the", "DCF", "fluorescence", "signal", "from", "NCAM", "+", "controls", "-", "and", "PKAN", "humanneurons", "differentiated", "or", "not", "in", "the", "presence", "of", "CoA", "(", "25", "μM", ")", "in", "the", "medium", "for", "3", "weeks", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "D", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "with", "and", "without", "CoA", "on", "controls", "and", "PKAN", "patients", ".", "Basal", "and", "uncoupled", "(", "FCCP", ")", "respiration", "increased", "after", "CoA", "supplementation", ".", "Data", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "24", "independent", "replicates", "for", "each", "condition", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "E", "Heme", "quantification", "by", "absorbance", "at", "400", "nm", "of", "the", "soluble", "NPC", "cell", "lysates", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Representative images of co-cultures of control and PKAN NPCs infected with GFP-LV and tdT-LV expressing vectors, respectively, at the beginning (Day 1), after 120 (Day 120) and 150 days of differentiation (Day 150). Scale bar 20 μm. Plots show the number of green and red humanneurons counted at different time points. All data are presented as means + SEM of at least three independent experiments (One-way ANOVA).B Example of electrophysiological properties of cultured PKAN humanneurons with or without CoA incubation for 30 days. Repetitive firing activity (left) and relatively large Na+ and K+ currents (right), were restored by CoA. The histogram on the right shows fractions of repetitively firing cells recorded in untreated vs. CoA-treated neurons from control and PKAN patients (z-test).C An example of neurons stained with the ROS sensible fluorescent probe DCF and the nuclei dye Hoechst. Anti-NCAM antibody was used to detect neurons. Scale bar 20 μm. Plots of the DCF fluorescence signal from NCAM+ controls- and PKAN humanneurons differentiated or not in the presence of CoA (25 μM) in the medium for 3 weeks. All data are presented as means + SEM of at least three independent experiments (One-way ANOVA).D Oxygen consumption rate (OCR) with and without CoA on controls and PKAN patients. Basal and uncoupled (FCCP) respiration increased after CoA supplementation. Data presented as means + SEM of 24 independent replicates for each condition (Two-way ANOVA).E Heme quantification by absorbance at 400 nm of the soluble NPC cell lysates. All data are presented as means + SEM of at least three independent experiments (One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "images", "of", "changes", "in", "intracellular", "calcium", ",", "as", "measured", "in", "fluorescence", "ratio", "images", "(", "F340", "/", "380", ")", "(", "A", ")", "Examples", "show", "a", "TRPM8", "-", "expressing", "DRG", "neuron", "(", "left", "in", "A", "responding", "to", "both", "the", "TRPM8", "agonist", "menthol", "(", "300", "μM", ")", "and", "to", "a", "cold", "stimulus", "from", "32", "°", "C", "to", "4", "°", "C", "a", "neuron", "that", "responds", "to", "cold", "(", "right", "in", "A", "but", "does", "not", "express", "any", "of", "TRPM8", ",", "TRPA1", "or", "TRPC5", ",", "as", "shown", "by", "lack", "of", "response", "to", "the", "TRPM8", "agonist", "menthol", "(", "300", "μM", ")", "Calcium", "increase", "is", "due", "to", "influx", "from", "extracellular", "solutionexperiments", "showing", "an", "SCG", "neuron", "responding", "to", "the", "TRPA1", "agonist", "AITC", "(", "left", "in", "E", "and", "a", "novel", "cold", "-", "sensitive", "SCG", "neuron", "that", "responds", "to", "cold", "but", "does", "not", "express", "any", "of", "TRPM8", ",", "TRPA1", "or", "TRPC5", "(", "right", "in", "E", "Many", "glial", "cells", "are", "also", "visibly", "activated", "by", "AITC", "but", "not", "by", "cold", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative images of changes in intracellular calcium, as measured in fluorescence ratio images (F340/380) (A) Examples show a TRPM8-expressing DRG neuron (left in A responding to both the TRPM8 agonist menthol (300 μM) and to a cold stimulus from 32°C to 4°C a neuron that responds to cold (right in A but does not express any of TRPM8, TRPA1 or TRPC5, as shown by lack of response to the TRPM8 agonist menthol (300 μM) Calcium increase is due to influx from extracellular solutionexperiments showing an SCG neuron responding to the TRPA1 agonist AITC (left in E and a novel cold-sensitive SCG neuron that responds to cold but does not express any of TRPM8, TRPA1 or TRPC5 (right in E Many glial cells are also visibly activated by AITC but not by cold."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "G", ")", "Mean", "current", "voltage", "relation", "of", "10", "SCG", "neurons", "at", "32", "°", "C", "(", "dashed", "line", ")", ",", "4", "°", "C", "(", "blue", ")", "and", "32", "°", "C", "(", "red", "dots", ")", ".", "(", "H", ")", "Difference", "trace", "from", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(G) Mean current voltage relation of 10 SCG neurons at 32°C (dashed line), 4°C (blue) and 32°C (red dots). (H) Difference trace from (G)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Mean", "cold", "-", "sensitive", "increase", "in", "calcium", "-", "dependent", "fluorescence", "ratio", "F340", "/", "380", "in", "SCG", "neurons", "is", "significantly", "smaller", "in", "neurons", "recorded", "in", "voltage", "-", "clamp", "at", "-", "60mV", "(", "0", ".", "56", "±", "0", ".", "08", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "21", "neurons", ")", "than", "in", "neurons", "recorded", "in", "current", "-", "clamp", "mode", "(", "1", ".", "16", "±", "0", ".", "29", ",", "n", "=", "11", "neurons", ",", "p", "=", "0", ".", "0165", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Summary", "of", "results", "of", "experiments", "on", "SCG", "neurons", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "115", "neurons", ",", "4", "separate", "cultures", ")", ".", "YM58483", "caused", "a", "significant", "decrease", "in", "cold", "-", "response", "amplitude", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "RM", "one", "-", "way", "ANOVA", "+", "Dunnett", "'", "s", "test", ")", ",", "with", "only", "partial", "recovery", ".", "Temperature", "trace", "below", ".", "(", "G", ")", "In", "neurons", "with", "a", "small", "response", "to", "cold", "(", "F340", "/", "380", "increase", "<", "0", ".", "2", ";", "n", "=", "24", "neurons", ")", ",", "many", "responses", "are", "potentiated", "by", "verapamil", "(", "31", "%", "of", "cold", "-", "insensitive", "neurons", ")", "and", "are", "fully", "blocked", "by", "ORAI", "channel", "antagonist", "YM58483", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "RM", "one", "-", "way", "ANOVA", "+", "Dunnett", "'", "s", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Mean cold-sensitive increase in calcium-dependent fluorescence ratio F340/380 in SCG neurons is significantly smaller in neurons recorded in voltage-clamp at -60mV (0.56 ±0.08, mean ± SEM, n=21 neurons) than in neurons recorded in current-clamp mode (1.16 ±0.29, n=11 neurons, p=0.0165, unpaired t-test).(F) Summary of results of experiments on SCG neurons (mean ±SEM, n=115 neurons, 4 separate cultures). YM58483 caused a significant decrease in cold-response amplitude (p<0.0001, RM one-way ANOVA + Dunnett's test), with only partial recovery. Temperature trace below. (G) In neurons with a small response to cold (F340/380 increase <0.2; n=24 neurons), many responses are potentiated by verapamil (31% of cold-insensitive neurons) and are fully blocked by ORAI channel antagonist YM58483 (p<0.0001, RM one-way ANOVA + Dunnett's test)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "Representative", "fluorescence", "images", "of", "SCG", "neurons", "from", "neonatal", "mice", "(", "age", "P5", "-", "7", ")", "electroporated", "with", "plasmids", "coding", "for", "mCherry", "and", "for", "siRNA", "targeting", "STIM1", ".", "Neurons", "were", "cooled", "from", "35", "°", "C", "to", "7", "°", "C", "in", "the", "presence", "of", "100μM", "verapamil", ".", "Electroporation", "was", "indicated", "by", "expression", "of", "mCherry", "(", "#", "in", "left", "-", "hand", "panel", ")", ";", "in", "these", "neurons", "a", "cold", "response", "was", "absent", "(", "#", "in", "right", "-", "hand", "panel", ")", "while", "in", "neurons", "not", "expressing", "mCherry", "(", "*", ")", "cold", "responses", "were", "still", "observed", ".", "Scale", "bar", "20μm", ".", "(", "F", ")", "Cold", "response", "amplitudes", "(", "F340", "/", "380", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Successfully", "electroporated", "neurons", "(", "mCherry", "positive", ",", "red", "bar", ",", "n", "=", "111", "neurons", "from", "four", "separate", "cultures", ")", "had", "a", "significantly", "lower", "cold", "response", "amplitude", "than", "neurons", "not", "electroporated", "(", "mCherry", "negative", ",", "black", "bar", ",", "n", "=", "104", "neurons", "from", "same", "cultures", ",", "p", "=", "0", ".", "0082", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "neurons", "that", "responded", "to", "cold", "ramp", "with", "F340", "/", "380", "increase", ">", "0", ".", "2", ".", "Only", "5", "%", "of", "mCherry", "-", "positive", "neurons", "(", "successfully", "electroporated", ",", "red", "bar", ")", "responded", "to", "cold", ",", "compared", "to", "19", "%", "of", "mCherry", "-", "negative", "neurons", "in", "same", "cultures", "(", "non", "-", "electroporated", ",", "black", "bar", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "chi", "-", "square", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) Representative fluorescence images of SCG neurons from neonatal mice (age P5-7) electroporated with plasmids coding for mCherry and for siRNA targeting STIM1. Neurons were cooled from 35°C to 7°C in the presence of 100μM verapamil. Electroporation was indicated by expression of mCherry (# in left-hand panel); in these neurons a cold response was absent (# in right-hand panel) while in neurons not expressing mCherry (*) cold responses were still observed. Scale bar 20μm.(F) Cold response amplitudes (F340/380, mean ±SEM). Successfully electroporated neurons (mCherry positive, red bar, n=111 neurons from four separate cultures) had a significantly lower cold response amplitude than neurons not electroporated (mCherry negative, black bar, n=104 neurons from same cultures, p=0.0082, unpaired t-test). (G) Percentage of neurons that responded to cold ramp with F340/380 increase >0.2. Only 5% of mCherry-positive neurons (successfully electroporated, red bar) responded to cold, compared to 19% of mCherry-negative neurons in same cultures (non-electroporated, black bar, p<0.001, chi-square test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "TIRF", "microscopy", "images", "(", "imaging", "depth", "100nm", ")", "showing", "that", "cooling", "from", "35", "°", "C", "to", "13", "°", "C", "increases", "ORAI1", "puncta", "formation", "and", "colocalization", "of", "ORAI1", "with", "STIM1", "in", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "ORAI1", "-", "CFP", "and", "STIM1", "-", "YFP", ".", "Cooling", "to", "13", "°", "C", "causes", "the", "appearance", "of", "new", "ORAI1", "puncta", "(", "examples", "shown", "by", "*", ")", "that", "are", "not", "present", "in", "the", "35", "°", "C", "image", "and", "are", "colocalised", "with", "STIM1", ".", "Cooling", "also", "causes", "STIM1", "to", "move", "towards", "the", "cell", "surface", "in", "edge", "-", "on", "views", "(", "arrows", ")", ".", "To", "reduce", "cell", "motility", ",", "the", "experiment", "was", "conducted", "in", "nominal", "0", "[", "Ca", "]", "e", ",", "which", "potentially", "caused", "partial", "formation", "of", "STIM1", "puncta", "before", "the", "images", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "5μm", ".", "Temperature", "trace", "shown", "below", ".", "Mean", "fluorescence", "intensity", "adjusted", "to", "compensate", "for", "increase", "in", "intrinsic", "fluorescence", "of", "CFP", "and", "YFP", "caused", "by", "cooling", "(", "see", "Fig", ".", "S12", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative TIRF microscopy images (imaging depth 100nm) showing that cooling from 35°C to 13°C increases ORAI1 puncta formation and colocalization of ORAI1 with STIM1 in HEK293 cells transfected with ORAI1-CFP and STIM1-YFP. Cooling to 13°C causes the appearance of new ORAI1 puncta (examples shown by *) that are not present in the 35°C image and are colocalised with STIM1. Cooling also causes STIM1 to move towards the cell surface in edge-on views (arrows). To reduce cell motility, the experiment was conducted in nominal 0[Ca]e, which potentially caused partial formation of STIM1 puncta before the images shown. Scale bar = 5μm. Temperature trace shown below. Mean fluorescence intensity adjusted to compensate for increase in intrinsic fluorescence of CFP and YFP caused by cooling (see Fig. S12)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "showing", "adult", "mouse", "stellate", "ganglion", "(", "SG", ")", "sections", "stained", "for", "nNOS", "(", "red", ")", ",", "to", "label", "nitrergic", "neurons", ",", "βIII", "Tubulin", "(", "green", ")", "to", "label", "all", "neurons", ",", "and", "DAPI", "to", "label", "nuclei", ".", "nNOS", "is", "widely", "expressed", "in", "neurons", "of", "the", "stellate", "ganglion", ",", "but", "is", "absent", "from", "glial", "cells", "(", "glial", "nuclei", "identifiable", "in", "merged", "image", ",", "similar", "results", "in", "n", "=", "5", "animals", ")", ".", "Antibody", "against", "nNOS", "from", "Abcam", ";", "similar", "results", "obtained", "with", "antibodies", "from", "ECM", "and", "Millipore", ".", "All", "three", "antibodies", "show", "nNOS", "widely", "expressed", "in", "SG", "cell", "bodies", "and", "neurites", ".", "(", "B", ")", "Adult", "mouse", "SCG", "(", "n", "=", "2", "animals", ",", "upper", ")", "and", "SG", "(", "n", "=", "5", "animals", ",", "lower", ")", "sections", "stained", "for", "nNOS", "(", "red", ")", ",", "tyrosine", "hydroxylase", "(", "TH", ",", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "to", "label", "nitrergic", "neurons", ",", "noradrenergic", "neurons", "and", "nuclei", "respectively", ".", "Many", "noradrenergic", "cells", "also", "express", "nNOS", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative immunofluorescence images showing adult mouse stellate ganglion (SG) sections stained for nNOS (red), to label nitrergic neurons, βIII Tubulin (green) to label all neurons, and DAPI to label nuclei. nNOS is widely expressed in neurons of the stellate ganglion, but is absent from glial cells (glial nuclei identifiable in merged image, similar results in n=5 animals). Antibody against nNOS from Abcam; similar results obtained with antibodies from ECM and Millipore. All three antibodies show nNOS widely expressed in SG cell bodies and neurites.(B) Adult mouse SCG (n=2 animals, upper) and SG (n=5 animals, lower) sections stained for nNOS (red), tyrosine hydroxylase (TH, green) and DAPI (blue) to label nitrergic neurons, noradrenergic neurons and nuclei respectively. Many noradrenergic cells also express nNOS."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "The", "ratio", "of", "unique", "histone", "iCLIP", "-", "seq", "read", "population", "to", "unique", "histone", "RNA", "-", "seq", "read", "population", "was", "calculated", "and", "shown", ",", "with", "the", "unique", "histone", "RNA", "-", "seq", "read", "population", "set", "as", "\"", "1", "\"", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "three", "replicates", "of", "ALYREF", "iCLIP", "data", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "ALYREF", "RIP", "-", "qPCRs", "to", "examine", "ALYREF", "binding", "on", "histone", "mRNAs", ".", "Relative", "RIP", "efficiencies", "are", "shown", ".", "A", "tRNA", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "for", "ALYREF", "binding", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "D", ")", "The", "distribution", "of", "histone", "reads", "in", "5", "'", "UTR", ",", "CDS", "and", "3", "'", "UTR", "in", "rRNA", "-", "depleted", "nuclear", "RNA", "-", "seq", "and", "ALYREF", "-", "iCLIP", "-", "seq", ".", "(", "E", ")", "Metagene", "analysis", "of", "normalized", "ALYREF", "signals", "on", "histone", "mRNA", "based", "on", "iCLIP", "-", "seq", "data", ".", "iCLIP", "-", "seq", "signal", "at", "each", "position", "of", "an", "mRNA", "is", "divided", "by", "the", "sum", "of", "signal", "of", "the", "mRNA", "to", "normalize", "each", "mRNA", "'", "s", "contribution", "to", "the", "plot", ".", "(", "F", ")", "Screenshots", "of", "two", "histone", "mRNAs", "showing", "clustered", "ALYREF", "binding", "sites", ".", "The", "3", "'", "UTR", "regions", "are", "highlighted", ".", "(", "G", ")", "Distribution", "profile", "of", "clustered", "ALYREF", "binding", "sites", "on", "histone", "mRNA", "3", "'", "UTRs", "relative", "to", "the", "cleavage", "site", "(", "CS", ")", ".", "The", "CS", "is", "set", "as", "\"", "0", "\"", "in", "the", "x", "axis", ",", "and", "the", "relative", "position", "to", "the", "CS", "is", "marked", ".", "The", "y", "axis", "shows", "the", "total", "occurrence", "of", "binding", "sites", "in", "three", "repeats", "at", "each", "nucleotide", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) The ratio of unique histone iCLIP-seq read population to unique histone RNA-seq read population was calculated and shown, with the unique histone RNA-seq read population set as \"1\". Error bars represent standard deviations from three replicates of ALYREF iCLIP data. Statistical analysis was performed using Student's t-test. ***P< 0.001.(C) ALYREF RIP-qPCRs to examine ALYREF binding on histone mRNAs. Relative RIP efficiencies are shown. A tRNA was used as a negative control for ALYREF binding. Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. **P < 0.01, ***P< 0.001, n.s., not significant.(D) The distribution of histone reads in 5' UTR, CDS and 3' UTR in rRNA-depleted nuclear RNA-seq and ALYREF-iCLIP-seq.(E) Metagene analysis of normalized ALYREF signals on histone mRNA based on iCLIP-seq data. iCLIP-seq signal at each position of an mRNA is divided by the sum of signal of the mRNA to normalize each mRNA's contribution to the plot.(F) Screenshots of two histone mRNAs showing clustered ALYREF binding sites. The 3' UTR regions are highlighted.(G) Distribution profile of clustered ALYREF binding sites on histone mRNA 3' UTRs relative to the cleavage site (CS). The CS is set as \"0\" in the x axis, and the relative position to the CS is marked. The y axis shows the total occurrence of binding sites in three repeats at each nucleotide."}
{"words": ["Figure", "2IPs", "from", "RNase", "A", "-", "treated", "S", "-", "phase", "HeLa", "cell", "lysate", "using", "the", "SLBP", "antibody", "or", "IgG", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "was", "performed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "2", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "*", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blotsIPs", "from", "RNase", "A", "-", "treated", "S", "-", "phase", "HeLa", "cell", "lysate", "using", "the", "ALYREF", "antibody", "or", "IgG", "(", "B", ")", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "2", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "*", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blots", "(", "C", ")", "Pull", "-", "downs", "of", "in", "vitro", "translated", "35S", "labelled", "SLBP", "and", "luciferase", "(", "Cntl", ")", "using", "MBP", "or", "MBP", "-", "ALYREF", "in", "the", "presence", "of", "RNase", "A", ".", "The", "proteins", "pulled", "down", "were", "visualized", "by", "coomassie", "staining", "(", "left", ")", "or", "phosphoimager", "(", "right", ")", ".", "3", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "(", "D", ")", "GST", "-", "SLBP", ",", "GST", "-", "UAP56", "and", "GST", "were", "used", "for", "pull", "-", "down", "of", "purified", "MBP", "-", "ALYREF", "or", "MBP", "in", "the", "presence", "of", "RNase", "A", ".", "Proteins", "pulled", "down", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "coomassie", "staining", ".", "37", ".", "5", "%", "of", "input", "proteins", "were", "loaded", ".", "(", "E", ")", "(", "Top", ")", "Domain", "schematic", "representation", "of", "SLBP", ".", "(", "Bottom", ")", "Flag", "IPs", "from", "RNase", "A", "-", "treated", "HeLa", "cell", "lysate", "individually", "expressing", "indicated", "Flag", "tagged", "proteins", ",", "followed", "by", "western", "blotting", "using", "Flag", "and", "ALYREF", "antibodies", ".", "3", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "The", "*", "indicates", "a", "band", "probably", "resulted", "from", "degradation", "of", "Flag", "-", "SLBP", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blot", "(", "E", ")", "(", "Top", ")", "Domain", "schematic", "representation", "of", "SLBP", ".", "followed", "by", "western", "blotting", "using", "Flag", "and", "ALYREF", "antibodies", ".", "3", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "The", "*", "indicates", "a", "band", "probably", "resulted", "from", "degradation", "of", "Flag", "-", "SLBP", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blot", "except", "that", "Flag", "IPs", "were", "carried", "out", "from", "HA", "-", "SLBP", "stable", "expression", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "expressing", "ALYREF", "fragments", ".", "(", "G", ")", "Western", "blotting", "to", "examine", "the", "KD", "efficiency", "of", "SLBP", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blotCntl", "-", "or", "SLBP", "-", "siRNA", "treated", "HeLa", "cells", "were", "used", "for", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "ALYREF", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "western", "analysis", "(", "H", ")", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "Cntl", "-", "or", "SLBP", "-", "siRNA", "treated", "HeLa", "cells", "were", "used", "for", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "ALYREF", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "RT", "-", "qPCRs", "(", "I", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "J", ")", "Metagene", "analysis", "of", "normalized", "ALYREF", "signals", "on", "histone", "mRNAs", "in", "Cntl", "and", "SLBP", "KD", "cells", "based", "on", "iCLIP", "-", "seq", "data", ".", "iCLIP", "-", "seq", "signal", "at", "each", "position", "of", "an", "mRNA", "is", "divided", "by", "the", "sum", "of", "signal", "of", "the", "mRNA", "to", "normalize", "each", "mRNA", "'", "s", "contribution", "to", "the", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2IPs from RNase A-treated S-phase HeLa cell lysate using the SLBP antibody or IgG (A) Western blotting was performed with indicated antibodies. 2% of input was loaded. * indicates a nonspecific band. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blotsIPs from RNase A-treated S-phase HeLa cell lysate using the ALYREF antibody or IgG (B). Western blotting was performed with indicated antibodies. 2% of input was loaded. * indicates a nonspecific band. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blots(C) Pull-downs of in vitro translated 35S labelled SLBP and luciferase (Cntl) using MBP or MBP-ALYREF in the presence of RNase A. The proteins pulled down were visualized by coomassie staining (left) or phosphoimager (right). 3% of input was loaded.(D) GST-SLBP, GST-UAP56 and GST were used for pull-down of purified MBP-ALYREF or MBP in the presence of RNase A. Proteins pulled down were separated by SDS-PAGE, followed by coomassie staining. 37.5% of input proteins were loaded.(E) (Top) Domain schematic representation of SLBP. (Bottom) Flag IPs from RNase A-treated HeLa cell lysate individually expressing indicated Flag tagged proteins, followed by western blotting using Flag and ALYREF antibodies. 3% of input was loaded. The * indicates a band probably resulted from degradation of Flag-SLBP. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blot(E) (Top) Domain schematic representation of SLBP. followed by western blotting using Flag and ALYREF antibodies. 3% of input was loaded. The * indicates a band probably resulted from degradation of Flag-SLBP. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blot except that Flag IPs were carried out from HA-SLBP stable expression cells transfected with plasmids expressing ALYREF fragments.(G) Western blotting to examine the KD efficiency of SLBP. GAPDH was used as a loading control. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blotCntl- or SLBP-siRNA treated HeLa cells were used for IPs with IgG or the ALYREF antibody. The immunoprecipitates were subjected to western analysis (H) Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001, n.s., not significant.Cntl- or SLBP-siRNA treated HeLa cells were used for IPs with IgG or the ALYREF antibody. The immunoprecipitates were subjected to RT-qPCRs (I). Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001, n.s., not significant.(J) Metagene analysis of normalized ALYREF signals on histone mRNAs in Cntl and SLBP KD cells based on iCLIP-seq data. iCLIP-seq signal at each position of an mRNA is divided by the sum of signal of the mRNA to normalize each mRNA's contribution to the plot."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "List", "of", "histone", "genes", "with", "defective", "3", "'", "-", "end", "processing", "detected", "by", "polyA", "+", "and", "polyA", "-", "RNA", "-", "seq", ".", "PolyA", "+", "ALYREF", "/", "Cntl", "shows", "polyA", "+", "RNA", "-", "seq", "RPM", "ratio", "of", "each", "histone", "gene", "in", "ALYREF", "KD", "versus", "Cntl", ".", "(", "C", ")", "Screenshots", "of", "two", "exemplified", "histone", "mRNAs", "with", "3", "'", "-", "end", "processing", "defects", "are", "shown", ".", "Transcription", "direction", "is", "indicated", ".", "Black", "arrowheads", "and", "the", "corresponding", "lines", "mark", "the", "position", "of", "CS", ".", "(", "D", ")", "RPM", "of", "each", "histone", "mRNA", "in", "Cntl", "cells", "and", "RPM", "ratio", "of", "each", "histone", "mRNA", "in", "KDs", "to", "Cntl", "detected", "in", "3", "'", "READS", "+", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "RT", "-", "qPCRs", "to", "detect", "histone", "mRNA", "levels", "in", "the", "polyA", "+", "(", "E", ")", "or", "the", "polyA", "-", "fraction", "(", "F", ")", "in", "cells", "treated", "with", "Cntl", ",", "ALYREF", "or", "ARS2", "siRNA", ".", "The", "arrowhead", "and", "arrows", "indicate", "the", "cleavage", "site", "and", "primer", "location", ",", "respectively", ".", "The", "bars", "show", "the", "relative", "abundance", "of", "polyA", "+", "forms", "to", "the", "actin", "mRNA", "(", "E", ")", "and", "that", "of", "polyA", "-", "forms", "relative", "to", "the", "18S", "rRNA", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Western", "blotting", "to", "examine", "ALYREF", "protein", "level", "(", "G", ")", "in", "Flag", "-", "Cntl", "(", "eIF4A3", ")", "or", "siRNA", "-", "resistant", "Flag", "-", "ALYREF", "stable", "expression", "cells", "treated", "with", "Cntl", "or", "ALYREF", "siRNA", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blotRT", "-", "qPCRs", "to", "detect", "polyA", "+", "histone", "mRNA", "levels", "(", "H", ")", "in", "Flag", "-", "Cntl", "(", "eIF4A3", ")", "or", "siRNA", "-", "resistant", "Flag", "-", "ALYREF", "stable", "expression", "cells", "treated", "with", "Cntl", "or", "ALYREF", "siRNA", ".", "The", "bars", "show", "the", "relative", "abundance", "of", "histone", "mRNAs", "to", "the", "GAPDH", "mRNA", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) List of histone genes with defective 3'-end processing detected by polyA+ and polyA- RNA-seq. PolyA+ ALYREF/Cntl shows polyA+ RNA-seq RPM ratio of each histone gene in ALYREF KD versus Cntl.(C) Screenshots of two exemplified histone mRNAs with 3'-end processing defects are shown. Transcription direction is indicated. Black arrowheads and the corresponding lines mark the position of CS.(D) RPM of each histone mRNA in Cntl cells and RPM ratio of each histone mRNA in KDs to Cntl detected in 3'READS+.(E, F) RT-qPCRs to detect histone mRNA levels in the polyA+ (E) or the polyA- fraction (F) in cells treated with Cntl, ALYREF or ARS2 siRNA. The arrowhead and arrows indicate the cleavage site and primer location, respectively. The bars show the relative abundance of polyA+ forms to the actin mRNA (E) and that of polyA- forms relative to the 18S rRNA (F). Data information Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001.Western blotting to examine ALYREF protein level (G) in Flag-Cntl (eIF4A3) or siRNA-resistant Flag-ALYREF stable expression cells treated with Cntl or ALYREF siRNA. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blotRT-qPCRs to detect polyA+ histone mRNA levels (H) in Flag-Cntl (eIF4A3) or siRNA-resistant Flag-ALYREF stable expression cells treated with Cntl or ALYREF siRNA. The bars show the relative abundance of histone mRNAs to the GAPDH mRNA. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001."}
{"words": ["Figure", "4IPs", "were", "carried", "out", "from", "RNase", "A", "-", "treated", "S", "-", "phase", "HeLa", "cell", "lysate", "using", "the", "Lsm11", "antibody", "and", "IgG", "(", "A", ")", "followed", "by", "western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "2", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "*", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blotIPs", "were", "carried", "out", "from", "RNase", "A", "-", "treated", "S", "-", "phase", "HeLa", "cell", "lysate", "using", "the", "ALYREF", "antibody", "and", "IgG", "(", "B", ")", ",", "followed", "by", "western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "2", "%", "of", "input", "was", "loaded", ".", "*", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blot", "(", "C", ")", "Pull", "-", "down", "of", "purified", "His", "-", "Cntl", "(", "PGK1", ")", "or", "His", "-", "Lsm11", "using", "equal", "amount", "of", "GST", "and", "GST", "-", "ALYREF", "proteins", "in", "the", "presence", "of", "RNase", "A", ".", "Proteins", "pulled", "down", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "coomassie", "staining", ".", "*", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "Cntl", "or", "ALYREF", "siRNA", "treated", "Flag", "-", "Lsm11", "stable", "expression", "cells", "were", "used", "for", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "Flag", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "western", "analysis", "(", "D", ")", ".", "*", "indicates", "the", "antibody", "heavy", "chain", ".", "Cntl", "or", "ALYREF", "siRNA", "treated", "Flag", "-", "Lsm11", "stable", "expression", "cells", "were", "used", "for", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "Flag", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "RT", "-", "qPCRs", "(", "E", ")", "*", "indicates", "the", "antibody", "heavy", "chain", ".", "The", "bars", "show", "the", "relative", "IP", "efficiencies", "of", "histone", "pre", "-", "mRNAs", "to", "U7", "snRNA", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4IPs were carried out from RNase A-treated S-phase HeLa cell lysate using the Lsm11 antibody and IgG (A) followed by western blotting with indicated antibodies. 2 % of input was loaded. * indicates a nonspecific band. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blotIPs were carried out from RNase A-treated S-phase HeLa cell lysate using the ALYREF antibody and IgG (B), followed by western blotting with indicated antibodies. 2 % of input was loaded. * indicates a nonspecific band. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blot(C) Pull-down of purified His-Cntl (PGK1) or His-Lsm11 using equal amount of GST and GST-ALYREF proteins in the presence of RNase A. Proteins pulled down were separated by SDS-PAGE followed by coomassie staining. * indicates a nonspecific band.Cntl or ALYREF siRNA treated Flag-Lsm11 stable expression cells were used for IPs with IgG or the Flag antibody. The immunoprecipitates were subjected western analysis (D). * indicates the antibody heavy chain.Cntl or ALYREF siRNA treated Flag-Lsm11 stable expression cells were used for IPs with IgG or the Flag antibody. The immunoprecipitates were subjected to RT-qPCRs (E) * indicates the antibody heavy chain. The bars show the relative IP efficiencies of histone pre-mRNAs to U7 snRNA. Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "(", "Top", ")", "Illustration", "of", "the", "HIST2H2AA3", "reporter", "construct", ".", "(", "Bottom", ")", "FISH", "to", "detect", "the", "distribution", "of", "the", "HIST2H2AA3", "mRNA", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "Cntl", ",", "ALYREF", ",", "THOC2", "(", "THO", ")", "and", "UAP56", ".", "DAPI", "staining", "served", "as", "a", "nuclear", "marker", ".", "N", "and", "C", "indicate", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "FISH", "signals", ",", "respectively", ".", "N", "/", "C", "ratios", "were", "determined", "for", "20", "cells", "in", "each", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "the", "endogenous", "HIST2H2AA3", "mRNA", "was", "detected", "with", "the", "transcript", "-", "specific", "probe", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "Cntl", ",", "ALYREF", ",", "THOC2", "(", "THO", ")", "and", "UAP56", ".", "N", "and", "C", "indicate", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "FISH", "signals", ",", "respectively", ".", "N", "/", "C", "ratios", "were", "calculated", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Western", "analysis", "to", "examine", "the", "purities", "of", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", "(", "C", ")", "in", "Cntl", "and", "UAP56", "KD", "cells", ".", "MTR4", "and", "Tubulin", "were", "used", "as", "the", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "marker", ",", "respectively", ".", "RT", "-", "qPCRs", "to", "examine", "N", "/", "C", "distribution", "of", "each", "histone", "mRNA", "(", "D", ")", "in", "Cntl", "and", "UAP56", "KD", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "Relative", "NXF1", "iCLIP", "read", "populations", "on", "histone", "mRNAs", "in", "Cntl", ",", "ALYREF", "and", "SLBP", "KD", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "n", "=", "2", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "G", ")", "NXF1", "iCLIP", "signals", "along", "the", "histone", "mRNA", ".", "The", "histone", "mRNA", "is", "divided", "into", "10", "fractions", "based", "on", "their", "mRNA", "size", ".", "Each", "fraction", "represents", "10", "%", "of", "each", "histone", "mRNA", ".", "The", "tenth", "fractions", "that", "contains", "the", "SL", "is", "boxed", "by", "green", "dashed", "lines", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) (Top) Illustration of the HIST2H2AA3 reporter construct. (Bottom) FISH to detect the distribution of the HIST2H2AA3 mRNA in HeLa cells depleted of Cntl, ALYREF, THOC2 (THO) and UAP56. DAPI staining served as a nuclear marker. N and C indicate nuclear and cytoplasmic FISH signals, respectively. N/C ratios were determined for 20 cells in each experiment. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3 Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001.(B) Distribution of the endogenous HIST2H2AA3 mRNA was detected with the transcript-specific probe in HeLa cells depleted of Cntl, ALYREF, THOC2 (THO) and UAP56. N and C indicate nuclear and cytoplasmic FISH signals, respectively. N/C ratios were calculated Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3 Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001.Western analysis to examine the purities of nuclear and cytoplasmic fractions (C) in Cntl and UAP56 KD cells. MTR4 and Tubulin were used as the nuclear and cytoplasmic marker, respectively.RT-qPCRs to examine N/C distribution of each histone mRNA (D) in Cntl and UAP56 KD cells. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3 Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001.(F) Relative NXF1 iCLIP read populations on histone mRNAs in Cntl, ALYREF and SLBP KD cells. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats n=2 Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001.(G) NXF1 iCLIP signals along the histone mRNA. The histone mRNA is divided into 10 fractions based on their mRNA size. Each fraction represents 10% of each histone mRNA. The tenth fractions that contains the SL is boxed by green dashed lines."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "(", "Top", ")", "Illustration", "of", "the", "reporter", "constructs", ".", "The", "black", "and", "red", "lines", "indicate", "H2AA3", "-", "SL", "and", "H2AA3", "-", "SLD", "PCR", "products", ",", "respectively", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "FISH", "probe", ".", "(", "Bottom", ")", "FISH", "to", "detect", "the", "distribution", "of", "the", "corresponding", "mRNA", "at", "2", "hr", "after", "injection", "of", "H2AA3", "-", "SL", "and", "H2AA3", "-", "SLD", "PCR", "products", ".", "C", "and", "N", "indicate", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "FISH", "signals", ",", "respectively", ".", "C", "/", "N", "ratios", "were", "determined", "for", "20", "cells", "in", "each", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "(", "Top", ")", "Illustration", "of", "the", "reporter", "constructs", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "FISH", "probe", ".", "FISH", "to", "detect", "mRNA", "distribution", "at", "24", "hr", "after", "transfection", "of", "the", "H1C", "-", "SL", "-", "Rb", "(", "cH1C", ")", "and", "H1C", "-", "SLD", "-", "Rb", "(", "pH1C", ")", "constructs", ".", "C", "/", "N", "ratios", "were", "quantified", "Data", "information", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "Top", ")", "Illustration", "of", "the", "reporter", "constructs", ".", "PCR", "products", "of", "cG", "-", "SL", "and", "cG", "-", "SLD", "were", "used", "instead", ".", "cG", ",", "β", "-", "globin", "cDNA", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "H1C", "-", "SL", "-", "Rb", "or", "H1C", "-", "SLD", "-", "Rb", "construct", ",", "together", "with", "VSV", "M", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ",", "followed", "by", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "ALYREF", "antibody", "at", "24", "hr", "post", "-", "transfection", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "western", "analysis", "to", "detect", "ALYREF", "(", "D", ")", "H1C", "-", "SL", "-", "Rb", "or", "H1C", "-", "SLD", "-", "Rb", "construct", ",", "together", "with", "VSV", "M", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ",", "followed", "by", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "ALYREF", "antibody", "at", "24", "hr", "post", "-", "transfection", ".", "RT", "-", "qPCRs", "to", "detect", "RNAs", "(", "E", ")", ".", "The", "bars", "in", "the", "graph", "shows", "the", "relative", "ALYREF", "IP", "efficiency", ",", "with", "that", "for", "the", "H1C", "-", "SL", "-", "Rb", "mRNA", "set", "as", "\"", "1", "\"", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "H1C", "-", "SLD", "-", "Rb", "construct", "with", "wild", "-", "type", "(", "H1C", "-", "SLDWT", "-", "Rb", ")", "or", "mutant", "(", "H1C", "-", "SLDmut", "-", "Rb", ")", "U7", "-", "binding", "sequence", ",", "together", "with", "VSV", "M", ",", "was", "co", "-", "transfected", "into", "HeLa", "cells", ",", "followed", "by", "IPs", "with", "IgG", "or", "the", "ALYREF", "antibody", "at", "24", "hr", "post", "-", "transfection", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "western", "analysis", "(", "left", "panel", ")", "and", "RT", "-", "qPCRs", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "bars", "in", "the", "right", "graph", "show", "the", "relative", "ALYREF", "IP", "efficiency", ",", "with", "that", "for", "the", "H1C", "-", "SLDWT", "-", "Rb", "mRNA", "set", "as", "\"", "1", "\"", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) (Top) Illustration of the reporter constructs. The black and red lines indicate H2AA3-SL and H2AA3-SLD PCR products, respectively. The dashed line indicates the FISH probe. (Bottom) FISH to detect the distribution of the corresponding mRNA at 2 hr after injection of H2AA3-SL and H2AA3-SLD PCR products. C and N indicate cytoplasmic and nuclear FISH signals, respectively. C/N ratios were determined for 20 cells in each experiment. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, ***P< 0.001.(B) (Top) Illustration of the reporter constructs. The dashed line indicates the FISH probe. FISH to detect mRNA distribution at 24 hr after transfection of the H1C-SL-Rb (cH1C) and H1C-SLD-Rb (pH1C) constructs. C/N ratios were quantified Data information Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, ***P< 0.001.(Top) Illustration of the reporter constructs. PCR products of cG-SL and cG-SLD were used instead. cG, β-globin cDNA. Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, ***P< 0.001.H1C-SL-Rb or H1C-SLD-Rb construct, together with VSV M were co-transfected into HeLa cells, followed by IPs with IgG or the ALYREF antibody at 24 hr post-transfection. The immunoprecipitates were subjected to western analysis to detect ALYREF (D)H1C-SL-Rb or H1C-SLD-Rb construct, together with VSV M were co-transfected into HeLa cells, followed by IPs with IgG or the ALYREF antibody at 24 hr post-transfection. RT-qPCRs to detect RNAs (E). The bars in the graph shows the relative ALYREF IP efficiency, with that for the H1C-SL-Rb mRNA set as \"1\". Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, ***P< 0.001.(F) H1C-SLD-Rb construct with wild-type (H1C-SLDWT-Rb) or mutant (H1C-SLDmut-Rb) U7-binding sequence, together with VSV M, was co-transfected into HeLa cells, followed by IPs with IgG or the ALYREF antibody at 24 hr post-transfection. The immunoprecipitates were subjected to western analysis (left panel) and RT-qPCRs (right panel). The bars in the right graph show the relative ALYREF IP efficiency, with that for the H1C-SLDWT-Rb mRNA set as \"1\". Data information: Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. *P < 0.05, ***P< 0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "to", "examine", "the", "expression", "levels", "of", "H2B", "and", "H4", "in", "Cntl", ",", "ALYREF", "and", "ARS2", "KD", "cells", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "white", "line", "delineates", "the", "boundary", "where", "irrelevant", "lanes", "have", "been", "removed", "from", "the", "same", "blot", "(", "B", ")", "Growth", "curve", "of", "Cntl", "and", "ALYREF", "KD", "cells", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "from", "biological", "repeats", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Cell", "cycle", "analysis", "of", "Cntl", ",", "ALYREF", "and", "ARS2", "KD", "cells", ".", "Quantifications", "of", "cells", "in", "G0", "/", "G1", "(", "1N", ")", ",", "G2", "(", "2N", ")", "and", "S", "-", "phase", "(", "intermediate", ")", "of", "the", "cell", "cycle", "are", "shown", "in", "the", "upper", "right", "corner", "of", "each", "histogram", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blotting to examine the expression levels of H2B and H4 in Cntl, ALYREF and ARS2 KD cells. GAPDH was used as a loading control. The white line delineates the boundary where irrelevant lanes have been removed from the same blot(B) Growth curve of Cntl and ALYREF KD cells. Error bars represent standard deviations from biological repeats (n=3). Statistical analysis was performed using Student's t-test. **P < 0.01.(C) Cell cycle analysis of Cntl, ALYREF and ARS2 KD cells. Quantifications of cells in G0/G1 (1N), G2 (2N) and S-phase (intermediate) of the cell cycle are shown in the upper right corner of each histogram."}
{"words": ["Figure", "4Results", "from", "multiplex", "ACE2", "competition", "assay", "are", "shown", "for", "the", "three", "spike", "-", "derived", "antigens", ":", "RBD", ",", "S1", "-", "domain", "(", "S1", ")", "and", "homotrimeric", "spike", "(", "Spike", ")", ".", "Color", "-", "coded", "beads", "coated", "with", "the", "respective", "antigens", "were", "co", "-", "incubated", "with", "biotinylated", "ACE2", "and", "dilution", "series", "of", "NM1267", "(", "8", "pM", "to", "126", "nM", ")", "followed", "by", "measuring", "residual", "binding", "of", "ACE2", ".", "MFI", "signals", "were", "normalized", "to", "the", "maximum", "detectable", "signal", "per", "antigen", "given", "by", "the", "ACE2", "-", "only", "control", ".", "IC50", "values", "were", "calculated", "from", "a", "four", "-", "parametric", "sigmoidal", "model", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "E", "Neutralization", "potency", "of", "NM1267", "was", "analyzed", "in", "Caco", "‑", "2", "cells", "using", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "mNG", "infectious", "clones", ".", "Infection", "rate", "normalized", "to", "virus", "-", "only", "infection", "control", "is", "illustrated", "as", "percent", "of", "infection", "(", "%", "Infection", ")", ".", "IC50", "value", "was", "calculated", "from", "a", "four", "-", "parametric", "sigmoidal", "model", "and", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Results from multiplex ACE2 competition assay are shown for the three spike-derived antigens: RBD, S1-domain (S1) and homotrimeric spike (Spike). Color-coded beads coated with the respective antigens were co-incubated with biotinylated ACE2 and dilution series of NM1267 (8 pM to 126 nM) followed by measuring residual binding of ACE2. MFI signals were normalized to the maximum detectable signal per antigen given by the ACE2-only control. IC50 values were calculated from a four-parametric sigmoidal model. Data are presented as mean ± s.d. of three technical replicates.E Neutralization potency of NM1267 was analyzed in Caco‑2 cells using the SARS-CoV-2-mNG infectious clones. Infection rate normalized to virus-only infection control is illustrated as percent of infection (% Infection). IC50 value was calculated from a four-parametric sigmoidal model and data are presented as mean ± s.e.m. of three biological replicates (n = 3).  "}
{"words": ["Figure", "5B", "For", "the", "NeutrobodyPlex", ",", "antigen", "-", "coated", "beads", "comprising", "RBD", ",", "S1", "or", "spike", "were", "co", "-", "incubated", "with", "serum", "samples", "from", "5", "patients", "and", "a", "dilution", "series", "of", "NM1267", "(", "1", "µM", "to", "6", "pM", ")", "(", "n", "=", "1", ")", ".", "Mean", "fluorescent", "intensities", "(", "MFI", ")", "derived", "from", "antigen", "-", "bound", "IgGs", "in", "the", "presence", "of", "bipNb", "normalized", "to", "the", "MFI", "values", "of", "IgGs", "in", "the", "serum", "-", "only", "samples", ",", "illustrated", "as", "MFI", "(", "%", "control", ")", ",", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B For the NeutrobodyPlex, antigen-coated beads comprising RBD, S1 or spike were co-incubated with serum samples from 5 patients and a dilution series of NM1267 (1 µM to 6 pM) (n = 1). Mean fluorescent intensities (MFI) derived from antigen-bound IgGs in the presence of bipNb normalized to the MFI values of IgGs in the serum-only samples, illustrated as MFI (% control), are shown."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "Total", "IgGs", "derived", "from", "spike", "-", "binding", "IgGs", "were", "plotted", "against", "normalized", "MFI", "values", "from", "IgGs", "binding", "to", "RBD", "(", "MFI", "RBD", "(", "%", "control", ")", ")", "in", "the", "presence", "of", "both", "concentrations", "of", "NM1267", "(", "1", "µM", ";", "1", "nM", ",", ")", ".", "C", ",", "D", "Total", "IgGs", "derived", "from", "N", "-", "binding", "IgGs", "were", "plotted", "against", "normalized", "MFI", "values", "from", "IgGs", "binding", "to", "RBD", "(", "MFI", "RBD", "(", "%", "control", ")", ")", "in", "the", "presence", "of", "both", "concentrations", "of", "NM1267", "(", "1", "µM", ";", "1", "nM", ",", ")", ".", "F"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A ,B Total IgGs derived from spike-binding IgGs were plotted against normalized MFI values from IgGs binding to RBD (MFI RBD (%control)) in the presence of both concentrations of NM1267 (1 µM; 1 nM,). C, D Total IgGs derived from N-binding IgGs were plotted against normalized MFI values from IgGs binding to RBD (MFI RBD (%control)) in the presence of both concentrations of NM1267 (1 µM; 1 nM,). F "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Graph", "derived", "from", "two", "published", "data", "available", "in", "the", "PubMed", "GEO", "database", "(", "GSE6919", "and", "GSE35988", ")", ".", "The", "box", "charts", "depict", "the", "relative", "expression", "of", "ESM1", "in", "benign", ",", "primary", ",", "and", "metastatic", "prostate", "cancer", "patients", ".", "The", "centre", "line", "donates", "the", "median", "value", "while", "the", "box", "contains", "the", "25th", "to", "75th", "percentiles", "of", "dataset", ".", "The", "whiskers", "mark", "the", "5th", "and", "95th", "percentiles", ",", "and", "values", "beyond", "these", "upper", "and", "lower", "bounds", "are", "considered", "outliers", ".", "(", "B", ")", "Relative", "ESM1", "mRNA", "expression", "and", "ESM1", "protein", "expression", "in", "two", "sets", "of", "human", "metastatic", "PCa", "cell", "lines", ".", "P", ":", "parental", "cells", ",", "M", ":", "metastatic", "cells", ".", "(", "C", ")", "Cell", "invasion", "assays", "of", "22Rv1", "-", "M", "and", "PC3", "-", "M", "cells", "transfected", "with", "either", "Scramble", "-", "shRNA", "or", "ESM1", "-", "shRNA", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "the", "relative", "fold", "change", "of", "invasive", "cells", "compared", "with", "the", "shScramble", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "lungs", ",", "livers", ",", "intestines", ",", "and", "kidneys", "from", "mice", "8", "weeks", "after", "orthotopical", "injection", "of", "22Rv1", "-", "M", "cells", "transfected", "with", "either", "Scramble", "-", "shRNA", "or", "ESM1", "-", "shRNA", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "cm", ".", "Tumors", "were", "removed", "and", "weighed", ".", "Quantitative", "summary", "of", "tumor", "luminescence", "in", "different", "metastases", "measured", "in", "photons", "/", "second", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "Formalin", "-", "fixed", ",", "paraffin", "-", "embedded", "tissue", "microarray", "sections", "of", "59", "normal", "prostate", "tissues", "and", "65", "prostate", "adenocarcinoma", "tissues", "with", "and", "without", "metastasis", "(", "n", "=", "16", "and", "n", "=", "49", ",", "respectively", ")", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "ESM1", "antibody", ".", "Tissue", "-", "bound", "ESM1", "is", "shown", "in", "brown", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Arrowheads", "indicate", "positively", "stained", "nucleus", "of", "cancer", "cells", ".", "Plot", "representation", "of", "scores", "according", "to", "immunohistochemical", "expression", "of", "ESM1", "in", "normal", "prostate", "tissue", "related", "to", "the", "prostate", "adenocarcinoma", "tissue", "with", "and", "without", "metastasis", ".", "The", "scores", "are", "calculated", "by", "intensity", "(", "score", "1", "-", "3", ")", "x", "percentage", "(", "score", "1", "-", "4", ")", "of", "stained", "cells", ".", "The", "line", "in", "the", "middle", "of", "the", "box", "is", "plotted", "at", "the", "median", ".", "The", "box", "extends", "from", "the", "25th", "to", "75th", "percentiles", ".", "Whiskers", "above", "and", "below", "the", "box", "indicate", "the", "5th", "and", "95th", "percentiles", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Graph derived from two published data available in the PubMed GEO database (GSE6919 and GSE35988). The box charts depict the relative expression of ESM1 in benign, primary, and metastatic prostate cancer patients. The centre line donates the median value while the box contains the 25th to 75th percentiles of dataset. The whiskers mark the 5th and 95th percentiles, and values beyond these upper and lower bounds are considered outliers.(B) Relative ESM1 mRNA expression and ESM1 protein expression in two sets of human metastatic PCa cell lines. P: parental cells, M: metastatic cells.(C) Cell invasion assays of 22Rv1-M and PC3-M cells transfected with either Scramble-shRNA or ESM1-shRNA. The data are shown as the relative fold change of invasive cells compared with the shScramble group. Scale bar: 100 μm.(D) Representative images of lungs, livers, intestines, and kidneys from mice 8 weeks after orthotopical injection of 22Rv1-M cells transfected with either Scramble-shRNA or ESM1-shRNA. Scale bar: 0.5 cm. Tumors were removed and weighed. Quantitative summary of tumor luminescence in different metastases measured in photons/second are shown.(E) Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue microarray sections of 59 normal prostate tissues and 65 prostate adenocarcinoma tissues with and without metastasis (n=16 and n=49, respectively) were stained with an anti-ESM1 antibody. Tissue-bound ESM1 is shown in brown. Scale bar: 50 μm. Arrowheads indicate positively stained nucleus of cancer cells. Plot representation of scores according to immunohistochemical expression of ESM1 in normal prostate tissue related to the prostate adenocarcinoma tissue with and without metastasis. The scores are calculated by intensity (score 1-3) x percentage (score 1-4) of stained cells. The line in the middle of the box is plotted at the median. The box extends from the 25th to 75th percentiles. Whiskers above and below the box indicate the 5th and 95th percentiles."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Immunoblotting", "analysis", "of", "ESM1", "in", "supernatant", "(", "S", ")", ",", "nucleus", "(", "N", ")", ",", "and", "cytoplasm", "(", "C", ")", "was", "performed", ".", "Ponceau", "S", ",", "Lamin", "A", "/", "C", ",", "and", "α", "-", "tubulin", "were", "used", "as", "loading", "control", "in", "supernatant", ",", "nucleus", ",", "and", "cytoplasm", ",", "respectively", ".", "P", ":", "parental", "cells", ",", "M", ":", "metastatic", "cells", ".", "(", "B", ")", "Left", ",", "representative", "images", "of", "cells", "in", "the", "transwell", "invasion", "assay", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "cells", "that", "invaded", "through", "the", "matrigel", "-", "coated", "membrane", "following", "treatment", "with", "PBS", "or", "human", "recombinant", "ESM1", "(", "rhESM1", ")", "or", "normal", "goat", "IgG", "control", "or", "anti", "-", "ESM1", "neutralizing", "antibody", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Elicitation", "of", "ESM1", "overexpression", "using", "HA", "-", "tag", "antibody", "results", "in", "detectable", "ESM1", "expression", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "of", "22Rv1", "-", "P", "cells", ".", "Lamin", "A", "/", "C", "and", "α", "-", "tubulin", "were", "used", "as", "loading", "control", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Immunoblotting", "of", "ESM1", "expression", "with", "different", "expressing", "patterns", "in", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "of", "22Rv1", "-", "P", "cells", ".", "(", "F", ")", "Left", ",", "representative", "images", "of", "22Rv1", "-", "P", "cells", "in", "the", "transwell", "invasion", "assay", ".", "Right", ",", "statistic", "data", "of", "invasive", "ability", "of", "ESM1", "expressing", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "(", "G", ")", "Left", ",", "representative", "bioluminescence", "images", "of", "lung", "metastasis", "in", "mice", "after", "tail", "vein", "injection", "of", "22Rv1", "-", "Luc", "cells", "with", "different", "ESM1", "expression", "patterns", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "cm", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "lung", "bioluminescence", "by", "photons", "/", "seconds", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Immunoblotting analysis of ESM1 in supernatant (S), nucleus (N), and cytoplasm (C) was performed. Ponceau S, Lamin A/C, and α-tubulin were used as loading control in supernatant, nucleus, and cytoplasm, respectively. P: parental cells, M: metastatic cells.(B) Left, representative images of cells in the transwell invasion assay. Right, quantification of cells that invaded through the matrigel-coated membrane following treatment with PBS or human recombinant ESM1 (rhESM1) or normal goat IgG control or anti-ESM1 neutralizing antibody. Scale bar: 100 μm.(D) Elicitation of ESM1 overexpression using HA-tag antibody results in detectable ESM1 expression in the nucleus and cytoplasm of 22Rv1-P cells. Lamin A/C and α-tubulin were used as loading control in the nucleus and cytoplasm, respectively.(E) Immunoblotting of ESM1 expression with different expressing patterns in the supernatant (S) of 22Rv1-P cells.(F) Left, representative images of 22Rv1-P cells in the transwell invasion assay. Right, statistic data of invasive ability of ESM1 expressing cells. Scale bar: 100 μm.(G) Left, representative bioluminescence images of lung metastasis in mice after tail vein injection of 22Rv1-Luc cells with different ESM1 expression patterns. Scale bar: 0.5 cm. Right, quantification of the lung bioluminescence by photons/ seconds."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Tumor", "spheroid", "formation", ".", "Representative", "images", "of", "tumor", "spheres", "formed", "and", "quantitative", "data", "comparing", "the", "average", "number", "of", "spheres", "formed", "in", "the", "indicated", "cells", "treated", "with", "PBS", "or", "human", "recombinant", "ESM1", "(", "rhESM1", ")", "or", "normal", "goat", "IgG", "control", "or", "anti", "-", "ESM1", "neutralizing", "antibody", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "tumor", "spheres", ".", "Spheres", "were", "cultured", "for", "14", "days", "before", "counting", ".", "Histogram", "shows", "the", "mean", "numbers", "of", "spheres", "cultured", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "22Rv1", "-", "P", "cells", "stably", "expressing", "ESM1", "were", "treated", "with", "docetaxel", "at", "the", "indicated", "concentrations", "for", "48", "h", ".", "*", "*", "(", "D", ")", "Cells", "with", "or", "without", "ESM1", "-", "NLS", "overexpression", "were", "subcutaneously", "injected", "(", "10", ",", "100", ",", "1000", "cells", "per", "mouse", ")", "into", "NOD", "/", "SCID", "mice", ".", "Tumor", "formation", "ability", "and", "tumor", "weight", "were", "analyzed", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "indicated", "(", "n", ")", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "the", "ratio", "of", "CD44", "+", "and", "CD133", "+", "cells", "in", "the", "indicated", "cells", "with", "different", "subcellular", "localization", "types", "of", "ESM1", "overexpression", "were", "performed", ".", "(", "F", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "levels", "of", "the", "indicated", "genes", "in", "cells", "with", "different", "types", "of", "ESM1", "overexpression", ".", "Differences", "in", "mRNA", "levels", "compared", "with", "vector", "cells", "are", "shown", "as", "fold", "changes", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Tumor spheroid formation. Representative images of tumor spheres formed and quantitative data comparing the average number of spheres formed in the indicated cells treated with PBS or human recombinant ESM1 (rhESM1) or normal goat IgG control or anti-ESM1 neutralizing antibody.(B) Representative images of tumor spheres. Spheres were cultured for 14 days before counting. Histogram shows the mean numbers of spheres cultured. Scale bar: 100 μm. Bars are the mean ± SD of three independent experiments.(C) 22Rv1-P cells stably expressing ESM1 were treated with docetaxel at the indicated concentrations for 48 h. **(D) Cells with or without ESM1-NLS overexpression were subcutaneously injected (10, 100, 1000 cells per mouse) into NOD/SCID mice. Tumor formation ability and tumor weight were analyzed. Scale bar: 1 cm. Bars are the mean ± SD of indicated (n) independent experiments.(E) Flow cytometry analysis of the ratio of CD44+ and CD133+ cells in the indicated cells with different subcellular localization types of ESM1 overexpression were performed.(F) qRT-PCR analysis of the mRNA levels of the indicated genes in cells with different types of ESM1 overexpression. Differences in mRNA levels compared with vector cells are shown as fold changes presented as the mean ± SD of three independent experiments. *"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "IPA", "analysis", "of", "RNA", "-", "seq", "data", "showing", "the", "14", "top", "-", "predicted", "upstream", "regulators", "of", "differentially", "expressed", "genes", ".", "Positive", "Z", "-", "scores", "(", "orange", ")", "represent", "activated", "upstream", "regulators", ",", "negative", "Z", "-", "scores", "(", "blue", ")", "represent", "inhibited", "upstream", "regulators", ".", "(", "E", ")", "The", "transcriptional", "activity", "of", "β", "-", "catenin", "in", "22Rv1", "-", "P", "cells", "with", "different", "patterns", "of", "ESM1", "overexpression", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Manipulating", "ESM1", "expression", "impacts", "transcriptional", "activity", "of", "NFκB", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) IPA analysis of RNA-seq data showing the 14 top-predicted upstream regulators of differentially expressed genes. Positive Z-scores (orange) represent activated upstream regulators, negative Z-scores (blue) represent inhibited upstream regulators.(E) The transcriptional activity of β-catenin in 22Rv1-P cells with different patterns of ESM1 overexpression. Bars are the mean ± SD of three independent experiments.(F) Manipulating ESM1 expression impacts transcriptional activity of NFκB. Bars are the mean ± SD of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "levels", "of", "the", "genes", "related", "to", "β", "-", "catenin", "downstream", "signaling", "pathway", ".", "Differences", "in", "mRNA", "levels", "compared", "with", "vector", "cells", "are", "shown", "as", "fold", "changes", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "levels", "of", "NFκB", "targeting", "genes", ".", "Differences", "in", "mRNA", "levels", "compared", "with", "vector", "cells", "are", "shown", "as", "fold", "changes", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Immunoblotting", "analysis", "of", "22Rv1", "-", "P", "cells", "with", "different", "ESM1", "overexpression", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "were", "performed", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "(", "D", ")", "Suppression", "of", "β", "-", "catenin", "or", "NFκB", "in", "22Rv1", "-", "P", "cells", "stably", "expressing", "ESM1", "-", "NLS", "were", "treated", "with", "docetaxel", "at", "the", "indicated", "concentrations", "for", "48", "h", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "vector", "-", "shScramble", "cells", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "and", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Tumor", "spheres", "formed", "by", "22Rv1", "-", "P", "cells", "stably", "expressing", "ESM1", "-", "NLS", "with", "either", "β", "-", "catenin", "or", "NFκB", "shRNAs", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "vector", "-", "shScramble", "cells", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "ESM1", "-", "NLS", "-", "shScramble", "cells", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "and", "quantitative", "data", "comparing", "cell", "invasion", "of", "the", "indicated", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "vector", "-", "shScramble", "cells", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "when", "compared", "to", "ESM1", "-", "NLS", "-", "shScramble", "cells", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) qRT-PCR analysis of the mRNA levels of the genes related to β-catenin downstream signaling pathway. Differences in mRNA levels compared with vector cells are shown as fold changes presented as the mean ± SD of three independent experiments.(B) qRT-PCR analysis of the mRNA levels of NFκB targeting genes. Differences in mRNA levels compared with vector cells are shown as fold changes presented as the mean ± SD of three independent experiments.(C) Immunoblotting analysis of 22Rv1-P cells with different ESM1 overexpression in the nucleus and cytoplasm were performed with the antibodies indicated.(D) Suppression of β-catenin or NFκB in 22Rv1-P cells stably expressing ESM1-NLS were treated with docetaxel at the indicated concentrations for 48 h. ** P < 0.01 when compared to vector-shScramble cells by two-tailed Student's t test and error bars represent the standard deviation of three independent experiments.(E) Tumor spheres formed by 22Rv1-P cells stably expressing ESM1-NLS with either β-catenin or NFκB shRNAs. Scale bar: 100 μm. Bars are the mean ± SD of three independent experiments. ## P< 0.01 when compared to vector-shScramble cells, ** P< 0.01 when compared to ESM1-NLS-shScramble cells by two-tailed Student's t test.(F) Representative images and quantitative data comparing cell invasion of the indicated cells. Scale bar: 100 μm. Bars are the mean ± SD of three independent experiments. ## P< 0.01 when compared to vector-shScramble cells, ** P< 0.01 when compared to ESM1-NLS-shScramble cells by two-tailed Student's t test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Nuclear", "and", "cytosolic", "extracts", "of", "22Rv1", "-", "M", "cells", "transfected", "with", "either", "shScramble", "or", "shCTNNB1", "were", "prepared", "and", "the", "levels", "of", "indicated", "proteins", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "Nuclear", "or", "cytosolic", "extracts", "of", "22Rv1", "-", "M", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "ESM1", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Human", "recombinant", "His", "-", "ESM1", "and", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "protein", "were", "pull", "down", "with", "either", "Ni", "sepharose", "or", "Glutathione", "sepharose", ".", "(", "E", ")", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "β", "-", "catenin", "-", "Flag", "and", "ESM1", "-", "HA", "constructs", ".", "Cell", "extracts", "were", "immunoprecipitated", "with", "Flag", "-", "M2", "agarose", "beads", ".", "Light", "chain", "was", "labeled", "as", "l", ".", "c", ".", "(", "F", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "ESM1", "-", "HA", "constructs", "and", "pull", "-", "down", "was", "carried", "out", "with", "different", "purified", "GST", "-", "ARM", "fragments", ".", "(", "G", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "ESM1", "-", "GFP", "constructs", ".", "Cell", "extracts", "were", "pulled", "down", "with", "purified", "GST", "-", "ARM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Nuclear and cytosolic extracts of 22Rv1-M cells transfected with either shScramble or shCTNNB1 were prepared and the levels of indicated proteins were detected by immunoblotting.(B) Nuclear or cytosolic extracts of 22Rv1-M cells were immunoprecipitated with an ESM1 antibody.(C) Human recombinant His-ESM1 and GST-β-catenin protein were pull down with either Ni sepharose or Glutathione sepharose.(E) HEK293T cells were co-transfected with the indicated β-catenin-Flag and ESM1-HA constructs. Cell extracts were immunoprecipitated with Flag-M2 agarose beads. Light chain was labeled as l.c.(F) HEK293T cells were transfected with ESM1-HA constructs and pull-down was carried out with different purified GST-ARM fragments.(G) HEK293T cells were transfected with the indicated ESM1-GFP constructs. Cell extracts were pulled down with purified GST-ARM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "ESM1", "point", "mutant", "constructs", ".", "Cell", "extracts", "were", "pulled", "down", "with", "purified", "GST", "-", "ARM", ".", "(", "C", ")", "Cell", "extracts", "of", "22Rv1", "-", "M", "transfected", "with", "either", "Scramble", "-", "shRNA", "or", "ESM1", "-", "shRNA", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "β", "-", "catenin", "antibody", "and", "blotted", "with", "anti", "-", "TCF4", "and", "anti", "-", "BCL9", "antibody", ".", "(", "E", ")", "Upper", ",", "Schematic", "diagram", "of", "ESM1", "-", "targeting", "short", "peptides", ".", "Lower", ",", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "ESM1", "-", "HA", "constructs", ".", "Cell", "extracts", "were", "treated", "with", "the", "short", "peptides", ",", "pulled", "down", "with", "purified", "GST", "-", "ARM", "and", "blotted", "with", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "TCF4", "antibody", ".", "(", "F", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "ESM1", "point", "mutant", "constructs", ".", "Cell", "extracts", "were", "pulled", "down", "with", "purified", "GST", "-", "ARM", "and", "blotted", "with", "an", "anti", "-", "TCF4", "antibody", ".", "(", "G", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "validation", "of", "β", "-", "catenin", "binding", "to", "the", "CCND1", "and", "c", "-", "Myc", "promoter", "in", "22Rv1", "-", "M", "cells", "transfected", "with", "either", "Scramble", "-", "shRNA", "or", "ESM1", "-", "shRNA", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Upper", ",", "Schematic", "diagram", "of", "ChIP", "-", "qPCR", "primers", "targeting", "regions", "upstream", "of", "the", "CCND1", "and", "c", "-", "Myc", "transcription", "start", "sites", "(", "TSSs", ")", ".", "Bar", "graphs", "show", "β", "-", "catenin", "and", "ESM1", "binding", "at", "the", "CCND1", "and", "c", "-", "Myc", "promoter", "regions", ".", "Differences", "in", "DNA", "levels", "compared", "with", "IgG", "control", "are", "shown", "as", "fold", "changes", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "The", "effects", "of", "ESM1", "targeting", "peptides", "on", "tumor", "invasion", "and", "spheroid", "formation", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "J", ")", "The", "effects", "of", "ESM1", "point", "mutants", "on", "tumor", "invasion", "and", "spheroid", "formation", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) HEK293T cells were transfected with the indicated ESM1 point mutant constructs. Cell extracts were pulled down with purified GST-ARM.(C) Cell extracts of 22Rv1-M transfected with either Scramble-shRNA or ESM1-shRNA were immunoprecipitated with an β-catenin antibody and blotted with anti-TCF4 and anti-BCL9 antibody.(E) Upper, Schematic diagram of ESM1-targeting short peptides. Lower, HEK293T cells were transfected with ESM1-HA constructs. Cell extracts were treated with the short peptides, pulled down with purified GST-ARM and blotted with anti-HA and anti-TCF4 antibody.(F) HEK293T cells were transfected with the indicated ESM1 point mutant constructs. Cell extracts were pulled down with purified GST-ARM and blotted with an anti-TCF4 antibody.(G) ChIP-qPCR validation of β-catenin binding to the CCND1 and c-Myc promoter in 22Rv1-M cells transfected with either Scramble-shRNA or ESM1-shRNA. Bars are the mean ± SD of three independent experiments.(H) Upper, Schematic diagram of ChIP-qPCR primers targeting regions upstream of the CCND1 and c-Myc transcription start sites (TSSs). Bar graphs show β-catenin and ESM1 binding at the CCND1 and c-Myc promoter regions. Differences in DNA levels compared with IgG control are shown as fold changes presented as the mean ± SD of three independent experiments.(I) The effects of ESM1 targeting peptides on tumor invasion and spheroid formation. Scale bar: 100 μm. Bars are the mean ± SD of three independent experiments.(J) The effects of ESM1 point mutants on tumor invasion and spheroid formation. Scale bar: 100 μm. Bars are the mean ± SD of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "-", "C", ")", "Fluorescent", "dye", "release", "from", "the", "mitochondria", "-", "mimic", "liposomes", "by", "the", "indicated", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", "or", "mutant", "Bax", "in", "the", "presence", "(", "B", ")", "or", "absence", "(", "C", ")", "of", "tBid", "or", "by", "tBid", "alone", "(", "C", ")", "was", "measured", "by", "quenching", "the", "fluorescence", "of", "the", "released", "dyes", "by", "the", "dye", "-", "specific", "antibodies", "outside", "the", "liposomes", "during", "a", "time", "course", ".", "The", "fraction", "of", "dye", "release", "was", "normalized", "to", "that", "by", "detergent", ".", "The", "data", "shown", "were", "obtained", "from", "n", "=", "3", "independent", "replicates", "using", "the", "same", "preparations", "of", "the", "proteins", "and", "liposomes", ".", "(", "D", ")", "Digitonin", "permeabilized", "BMK", "Bax", "-", "/", "-", "/", "Bak", "-", "/", "-", "cells", "expressing", "SMAC", "-", "mCherry", "in", "the", "mitochondria", "intermembrane", "space", "(", "50", "μL", ",", "500", ",", "000", "total", "cells", ")", "were", "incubated", "with", "25", "nM", "of", "Bax", "and", "2", "nM", "cBid", "for", "the", "indicated", "time", "at", "37", "°", "C", "in", "a", "96", "-", "well", "plate", ".", "The", "samples", "were", "centrifuged", "for", "10", "min", "and", "separated", "into", "supernatant", "and", "pellet", "fractions", ".", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "was", "calculated", "as", "the", "fraction", "of", "total", "(", "supernatant", "+", "pellet", ")", "mCherry", "fluorescence", "coming", "from", "the", "supernatant", "fraction", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "percent", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "of", "wt", "Bax", "and", "cBid", "at", "60", "min", ".", "Each", "symbol", "represents", "the", "normalized", "SMAC", "-", "mCherry", "release", "for", "one", "single", "replicate", "(", "n", "=", "3", "or", "more", "independent", "replicates", ")", ".", "Where", "applicable", "the", "data", "was", "fit", "with", "the", "[", "Agonist", "]", "vs", ".", "response", "-", "Variable", "slope", "equation", "in", "Graphpad", "Prism", "8", ".", "0", ".", "1", ".", "The", "dotted", "lines", "represent", "the", "95", "%", "confidence", "interval", "of", "the", "fit", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B-C) Fluorescent dye release from the mitochondria-mimic liposomes by the indicated wild-type (wt) or mutant Bax in the presence (B) or absence (C) of tBid or by tBid alone (C) was measured by quenching the fluorescence of the released dyes by the dye-specific antibodies outside the liposomes during a time course. The fraction of dye release was normalized to that by detergent. The data shown were obtained from n = 3 independent replicates using the same preparations of the proteins and liposomes.(D) Digitonin permeabilized BMK Bax-/-/Bak-/- cells expressing SMAC-mCherry in the mitochondria intermembrane space (50 μL, 500,000 total cells) were incubated with 25 nM of Bax and 2 nM cBid for the indicated time at 37°C in a 96-well plate. The samples were centrifuged for 10 min and separated into supernatant and pellet fractions. SMAC-mCherry release was calculated as the fraction of total (supernatant + pellet) mCherry fluorescence coming from the supernatant fraction. The data was normalized to the percent SMAC-mCherry release of wt Bax and cBid at 60 min. Each symbol represents the normalized SMAC-mCherry release for one single replicate (n = 3 or more independent replicates). Where applicable the data was fit with the [Agonist] vs. response - Variable slope equation in Graphpad Prism 8.0.1. The dotted lines represent the 95% confidence interval of the fit."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Western", "blots", "in", "HCT116", "cells", "treated", "for", "24", "hrs", "with", "increasing", "concentrations", "of", "MPA", ",", "or", "5", "nM", "Actinomycin", "D", "(", "ActD", ")", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hrs", "with", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", ",", "1", "µM", "MPA", ",", "10", "µM", "MPA", ",", "or", "the", "combination", "of", "10", "µM", "MPA", "with", "400", "µM", "guanosine", ".", "Guanylate", "nucleotides", "levels", "were", "measured", "by", "LC", "-", "MS", ",", "and", "normalized", "to", "protein", "content", ".", "Mean", "±", "SEM", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", "data", "are", "presented", "as", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "Parental", "HCT116", "cells", "expressing", "a", "stable", "tetracycline", "-", "inducible", "shRNA", "against", "IMPDH2", "(", "IM2iKD", ")", "and", "either", "a", "stable", "inducible", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "shRNA", "(", "IM2iKD", "-", "shNT", ")", "or", "an", "shRNA", "targeting", "IMPDH1", "(", "IM2iKD", "-", "shIM1", ")", ",", "were", "grown", "for", "7", "days", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "doxycycline", "(", "2", "µg", "/", "mL", ")", "(", "-", "dox", "or", "+", "dox", ",", "respectively", ")", ".", "mRNAs", "of", "IMPDH1", "and", "IMPDH2", "were", "quantified", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "in", "2", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", "and", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "mRNA", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "Parental", "HCT116", "cells", "expressing", "a", "stable", "tetracycline", "-", "inducible", "shRNA", "against", "IMPDH2", "(", "IM2iKD", ")", "and", "either", "a", "stable", "inducible", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "shRNA", "(", "IM2iKD", "-", "shNT", ")", "or", "an", "shRNA", "targeting", "IMPDH1", "(", "IM2iKD", "-", "shIM1", ")", ",", "were", "grown", "for", "7", "days", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "doxycycline", "(", "2", "µg", "/", "mL", ")", "(", "-", "dox", "or", "+", "dox", ",", "respectively", ")", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "band", "intensity", "of", "p53", "and", "p21", "is", "shown", ".", "Mean", "±", "SD", "is", "representative", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "(", "right", "panel", ")", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "E", ",", "Western", "blots", "in", "HCT116", "cells", "treated", "for", "24", "hrs", "with", "the", "indicated", "concentration", "of", "MPA", ",", "in", "presence", "of", "dimethyl", "sulfoxide", "(", "DMSO", ")", "or", "400", "µM", "guanosine", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Western blots in HCT116 cells treated for 24 hrs with increasing concentrations of MPA, or 5 nM Actinomycin D (ActD). GAPDH served as a loading control.B, HCT116 cells were treated for 24 hrs with vehicle alone (-), 1 µM MPA, 10 µM MPA, or the combination of 10 µM MPA with 400 µM guanosine. Guanylate nucleotides levels were measured by LC-MS, and normalized to protein content. Mean ± SEM is representative of 3 independent experiments carried out in triplicate. Data information data are presented as relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 by two tail T-Student's test.Parental HCT116 cells expressing a stable tetracycline-inducible shRNA against IMPDH2 (IM2iKD) and either a stable inducible non-targeting (NT) shRNA (IM2iKD-shNT) or an shRNA targeting IMPDH1 (IM2iKD - shIM1), were grown for 7 days in the absence or presence of doxycycline (2 µg/mL) (- dox or + dox, respectively). mRNAs of IMPDH1 and IMPDH2 were quantified by real-time qPCR in 2 independent experiments carried out in triplicate and normalized to β-actin mRNA (C). Data information: data are presented as relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 by two tail T-Student's test.Parental HCT116 cells expressing a stable tetracycline-inducible shRNA against IMPDH2 (IM2iKD) and either a stable inducible non-targeting (NT) shRNA (IM2iKD-shNT) or an shRNA targeting IMPDH1 (IM2iKD - shIM1), were grown for 7 days in the absence or presence of doxycycline (2 µg/mL) (- dox or + dox, respectively). Whole cell extracts were analyzed on Western blots with the indicated antibodies. GAPDH was used as a loading control. Quantification of band intensity of p53 and p21 is shown. Mean ± SD is representative of four independent experiments. (right panel) (D). Data information: data are presented as relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 by two tail T-Student's test.E, Western blots in HCT116 cells treated for 24 hrs with the indicated concentration of MPA, in presence of dimethyl sulfoxide (DMSO) or 400 µM guanosine. GAPDH was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "a", "NT", "or", "a", "siRNA", "against", "RPL11", "for", "24", "hrs", "and", "treated", "with", "the", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", "or", "the", "indicated", "concentration", "of", "MPA", "for", "24", "hrs", ".", "The", "levels", "of", "p53", "and", "p21", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "band", "intensity", "of", "p53", "and", "p21", "of", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "B", ",", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", "and", "24", "hrs", "later", "treated", "with", "the", "vehicle", "alone", "or", "10", "µM", "MPA", "for", "6", "hrs", "and", "the", "levels", "of", "p53", "and", "p21", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "band", "intensity", "of", "p53", "of", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "C", ",", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "a", "NT", "siRNA", "or", "a", "siRNA", "against", "RPL11", "for", "24", "hrs", "and", "were", "pretreated", "for", "30", "mins", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "the", "presence", "(", "+", ")", "of", "the", "combination", "of", "10", "µM", "of", "the", "ATR", "inhibitor", "VE", "-", "821", "(", "ATRi", ")", "and", "10", "µM", "the", "ATM", "inhibitor", "KU", "-", "55933", "(", "ATMi", ")", ",", "followed", "by", "addition", "of", "the", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", "or", "MPA", "10", "µM", "for", "additional", "24", "hrs", ".", "The", "levels", "of", "p53", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "band", "intensity", "of", "p53", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "Mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, HCT116 cells were transfected with either a NT or a siRNA against RPL11 for 24 hrs and treated with the vehicle alone (-) or the indicated concentration of MPA for 24 hrs. The levels of p53 and p21 were analyzed on Western blots. GAPDH was used as a loading control. Quantification of band intensity of p53 and p21 of four independent experiments is shown (right panel). Data information: All data are presented as Mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test.B, HCT116 cells were transfected with the indicated siRNA and 24 hrs later treated with the vehicle alone or 10 µM MPA for 6 hrs and the levels of p53 and p21 were analyzed on Western blots. GAPDH was used as a loading control. Quantification of band intensity of p53 of at least four independent experiments is shown (right panel). Data information: All data are presented as Mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test.C, HCT116 cells were transfected with either a NT siRNA or a siRNA against RPL11 for 24 hrs and were pretreated for 30 mins in the absence (-) or the presence (+) of the combination of 10 µM of the ATR inhibitor VE-821 (ATRi) and 10 µM the ATM inhibitor KU-55933 (ATMi), followed by addition of the vehicle alone (-) or MPA 10 µM for additional 24 hrs. The levels of p53 were analyzed on Western blots. GAPDH was used as a loading control. Quantification of band intensity of p53 of at least two independent experiments is shown (right panel). Data information: All data are presented as Mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "either", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", ",", "1", "µM", "MPA", ",", "10", "µM", "MPA", "or", "5", "nM", "ActD", "for", "24", "hrs", "and", "mRNA", "levels", "of", "p21", "were", "quantified", "by", "real", "-", "time", "qPCR", "in", "2", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicate", "and", "normalized", "to", "28S", "rRNA", ".", "Data", "information", ":", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "B", ",", "Autoradiogram", "(", "upper", "panel", ")", "and", "Ethidium", "Bromide", "(", "EtBr", ")", "-", "stained", "agarose", "gel", "(", "lower", "panel", ")", "of", "18S", "and", "28S", "rRNA", "from", "HCT116", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "the", "Methods", "section", ".", "C", ",", "Autoradiogram", "(", "upper", "panel", ")", "and", "EtBr", "-", "stained", "TBE", "-", "urea", "polyacrylamide", "gel", "(", "lower", "panel", ")", "of", "5S", ",", "5", ".", "8S", "rRNA", "and", "tRNAs", "in", "lysatesHCT116", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hrs", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", ",", "subjected", "to", "ultracentrifugation", ",", "spiked", "with", "firefly", "luciferase", "mRNA", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HDM2", "rabbit", "antibody", "(", "IP", "HDM2", ")", "or", "the", "IgG", "control", "(", "IgG", ")", ".", "D", ",", "Levels", "of", "HDM2", ",", "RPL5", ",", "RPL11", ",", "and", "the", "IP", "negative", "control", "mTOR", "in", "the", "whole", "cell", "extract", "(", "WCE", ")", ",", "the", "post", "-", "ribosomal", "lysates", "(", "INPUT", ",", "left", "panel", ")", "and", "in", "the", "HDM2", "immunoprecipitated", "fraction", "(", "right", "panel", ")", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "of", "band", "intensity", "of", "HDM2", ",", "RPL5", "and", "RPL11", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "lower", "right", "panel", ")", ".", "HCT116", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hrs", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", ",", "subjected", "to", "ultracentrifugation", ",", "spiked", "with", "firefly", "luciferase", "mRNA", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HDM2", "rabbit", "antibody", "(", "IP", "HDM2", ")", "or", "the", "IgG", "control", "(", "IgG", ")", ".", "E", ",", "the", "Levels", "of", "immunoprecipitated", "5S", "rRNA", "were", "determined", "by", "real", "time", "qPCR", "and", "normalized", "to", "the", "firefly", "luciferase", "mRNA", ".", "Data", "are", "normalized", "and", "presented", "as", "relative", "to", "untreated", "cells", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HDM2", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "carried", "out", "in", "triplicates", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", ".", "F", ",", "HCT116", "cells", "were", "pretreated", "with", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", ",", "1", "µM", ",", "or", "10", "µM", "MPA", "for", "24", "hrs", ",", "and", "the", "levels", "of", "p53", "and", "p21", "were", "followed", "on", "Western", "blots", "in", "presence", "of", "100", "µg", "/", "mL", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "the", "indicated", "time", ",", "in", "the", "continued", "presence", "of", "the", "treatment", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "band", "intensities", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panels", "as", "relative", "to", "time", "0", "of", "CHX", "treatment", ".", "G", ",", "HCT116", "cells", "were", "pretreated", "as", "in", "(", "F", ")", "and", "10", "µM", "of", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "was", "added", "for", "4", "hrs", "when", "indicated", ".", "The", "levels", "of", "p53", "and", "p21", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "p21", "band", "intensity", "of", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", ".", "Data", "information", ":", "In", "panels", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "relative", "to", "control", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "two", "tail", "T", "-", "Student", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, HCT116 cells were treated with either vehicle alone (-), 1 µM MPA, 10 µM MPA or 5 nM ActD for 24 hrs and mRNA levels of p21 were quantified by real-time qPCR in 2 independent experiments carried out in triplicate and normalized to 28S rRNA. Data information: , data are presented as mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test.B, Autoradiogram (upper panel) and Ethidium Bromide (EtBr)-stained agarose gel (lower panel) of 18S and 28S rRNA from HCT116 cells treated as indicated in the Methods section.C, Autoradiogram (upper panel) and EtBr-stained TBE-urea polyacrylamide gel (lower panel) of 5S, 5.8S rRNA and tRNAs in lysatesHCT116 cells were treated for 24 hrs. Cell lysates were collected, subjected to ultracentrifugation, spiked with firefly luciferase mRNA and immunoprecipitated with anti-HDM2 rabbit antibody (IP HDM2) or the IgG control (IgG). D, Levels of HDM2, RPL5, RPL11, and the IP negative control mTOR in the whole cell extract (WCE), the post-ribosomal lysates (INPUT, left panel) and in the HDM2 immunoprecipitated fraction (right panel) were analyzed on Western blots. The results are representative of two independent experiments. Quantification of band intensity of HDM2, RPL5 and RPL11 of at least two independent experiments is shown (lower right panel).HCT116 cells were treated for 24 hrs. Cell lysates were collected, subjected to ultracentrifugation, spiked with firefly luciferase mRNA and immunoprecipitated with anti-HDM2 rabbit antibody (IP HDM2) or the IgG control (IgG). E, the Levels of immunoprecipitated 5S rRNA were determined by real time qPCR and normalized to the firefly luciferase mRNA. Data are normalized and presented as relative to untreated cells immunoprecipitated with anti-HDM2. The results are representative of three independent experiments carried out in triplicates. Data information: data are presented as mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test.F, HCT116 cells were pretreated with vehicle alone (-), 1 µM, or 10 µM MPA for 24 hrs, and the levels of p53 and p21 were followed on Western blots in presence of 100 µg/mL cycloheximide (CHX) for the indicated time, in the continued presence of the treatment. GAPDH was used as a loading control. Quantification of band intensities is shown in the lower panels as relative to time 0 of CHX treatment.G, HCT116 cells were pretreated as in (F) and 10 µM of the proteasome inhibitor MG132 was added for 4 hrs when indicated. The levels of p53 and p21 were analyzed on Western blots. GAPDH was used as a loading control. Quantification of p21 band intensity of at least four independent experiments is shown in the lower panel. Data information: In panels data are presented as mean ± SD, relative to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, by two tail T-Student's test."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "HCT116", "were", "treated", "as", "indicated", "for", "24", "hrs", ",", "subjected", "to", "propidium", "iodide", "staining", "and", "analyzed", "by", "fluorescence", "-", "activated", "cell", "sorting", "(", "FACS", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "B", ",", "Colon", "adenocarcinoma", "cell", "lines", "HCT116", "(", "circles", ")", ",", "LoVo", "(", "squares", ")", ",", "LS174", "(", "triangles", ")", ",", "or", "RKO", "(", "inversed", "triangles", ")", "were", "treated", "with", "the", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", ",", "1", "µM", "MPA", "or", "10", "µM", "MPA", "for", "24", "hrs", "and", "subjected", "to", "propidium", "iodide", "staining", "and", "FACS", "analysis", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "fold", "induction", "of", "the", "cell", "number", "in", "G0", "/", "G1", "phases", "(", "blue", ")", ",", "S", "phase", "(", "red", ")", ",", "and", "G2", "/", "M", "phases", "upon", "treatment", "with", "1", "µM", "MPA", "(", "dark", ")", "or", "10", "µM", "MPA", "(", "clear", ")", "over", "vehicle", "treated", "cells", ".", "C", ",", "IdU", "track", "length", "distribution", ",", "and", "distribution", "of", "long", "fork", "/", "short", "fork", "IdU", "track", "length", "ratios", "(", "insert", ")", ".", "IdU", "track", "length", "of", "at", "least", "300", "fibers", "was", "measured", "for", "each", "condition", ".", "For", "fork", "symmetry", "analyses", ",", "IdU", "track", "length", "was", "measure", "in", "at", "least", "38", "bidirectional", "forks", "(", "see", "methods", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "of", "the", "means", ".", "D", ",", "Representative", "images", "from", "(", "C", ")", ".", "E", ",", "HCT116", "cells", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "10", "µM", "BrdU", "for", "48", "hrs", "were", "treated", "with", "Vehicle", "(", "-", ")", ",", "10µM", "MPA", "for", "6", "or", "24", "hrs", ",", "or", "20", "µM", "Hydroxyurea", "for", "4", "hrs", "before", "cell", "permeabilization", "and", "fixation", "(", "see", "Method", ")", ".", "Cells", "were", "immunostained", "for", "native", "BrDU", "(", "green", ")", ",", "or", "RPA", "(", "red", ")", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "One", "representative", "z", "-", "confocal", "stack", "is", "shown", "per", "condition", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "5", "μm", ".", "F", ",", "HCT116", "cells", "treated", "with", "10", "µM", "MPA", "for", "increasing", "time", "were", "analyzed", "by", "Western", "blots", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "α", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, HCT116 were treated as indicated for 24 hrs, subjected to propidium iodide staining and analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Data are representative of at least three independent experiments.B, Colon adenocarcinoma cell lines HCT116 (circles), LoVo (squares), LS174 (triangles), or RKO (inversed triangles) were treated with the vehicle alone (-), 1 µM MPA or 10 µM MPA for 24 hrs and subjected to propidium iodide staining and FACS analysis. Data are shown as the fold induction of the cell number in G0/G1 phases (blue), S phase (red), and G2/M phases upon treatment with 1 µM MPA (dark) or 10 µM MPA (clear) over vehicle treated cells.C, IdU track length distribution, and distribution of long fork / short fork IdU track length ratios (insert). IdU track length of at least 300 fibers was measured for each condition. For fork symmetry analyses, IdU track length was measure in at least 38 bidirectional forks (see methods). ***p<0.001, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test of the means. D, Representative images from (C). E, HCT116 cells, pre-incubated with 10 µM BrdU for 48 hrs were treated with Vehicle (-), 10µM MPA for 6 or 24 hrs, or 20 µM Hydroxyurea for 4 hrs before cell permeabilization and fixation (see Method). Cells were immunostained for native BrDU (green), or RPA (red). DNA was counterstained with DAPI (blue). One representative z-confocal stack is shown per condition. Scale bars correspond to 5 μm.F, HCT116 cells treated with 10 µM MPA for increasing time were analyzed by Western blots for the indicated proteins. α-tubulin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "either", "the", "vehicle", "alone", "(", "-", ")", ",", "1", "µM", "MPA", "or", "10", "µM", "MPA", "for", "24", "hrs", ",", "before", "p21", "immuno", "-", "labeling", ",", "propidium", "iodide", "staining", "and", "FACS", "analysis", ".", "Cell", "cycle", "profiles", "of", "the", "total", "cell", "population", "(", "upper", "panel", ",", "left", ")", ",", "the", "total", "intensity", "of", "p21", "and", "propidium", "iodide", "were", "determined", "in", "20", ",", "000", "cells", "and", "plotted", "in", "a", "scatter", "diagram", "(", "lower", "panel", ",", "left", ")", ".", "The", "specific", "cell", "cycle", "profiles", "are", "shown", "of", "p21high", "(", "upper", "panel", ",", "right", ")", "and", "p21low", "(", "lower", "panel", ",", "right", ")", "cell", "populations", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "in", "each", "cell", "cycle", "phase", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", "in", "the", "right", "panels", ".", "B", ",", "HCT116", "p21", "-", "/", "-", "isogenic", "cell", "lines", "were", "transfected", "for", "24", "hrs", "with", "an", "empty", "plasmid", "(", "EV", ")", "or", "a", "plasmid", "encoding", "a", "p21wt", "cDNA", "(", "p21", "-", "OE", ")", ",", "then", "cells", "were", "serum", "-", "deprived", "for", "16", "hrs", "before", "the", "re", "-", "addition", "of", "serum", "for", "additional", "24", "hrs", "in", "absence", "or", "presence", "of", "10", "µM", "MPA", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "p21", "immunolabeling", ",", "propidium", "iodide", "staining", "and", "FACS", "analysis", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, HCT116 cells were treated with either the vehicle alone (-), 1 µM MPA or 10 µM MPA for 24 hrs, before p21 immuno-labeling, propidium iodide staining and FACS analysis. Cell cycle profiles of the total cell population (upper panel, left), the total intensity of p21 and propidium iodide were determined in 20,000 cells and plotted in a scatter diagram (lower panel, left). The specific cell cycle profiles are shown of p21high (upper panel, right) and p21low (lower panel, right) cell populations. Mean ± SD of the percentage of cells in each cell cycle phase of at least two independent experiments is shown in the right panels.B, HCT116 p21-/- isogenic cell lines were transfected for 24 hrs with an empty plasmid (EV) or a plasmid encoding a p21wt cDNA (p21-OE), then cells were serum-deprived for 16 hrs before the re-addition of serum for additional 24 hrs in absence or presence of 10 µM MPA. Cells were subjected to p21 immunolabeling, propidium iodide staining and FACS analysis. The results are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "HCT116", "cells", "were", "transfected", "for", "8", "hrs", "with", "the", "indicated", "siRNA", "then", "treated", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "Fig", "5B", ")", ".", "Here", "are", "shown", "the", "cell", "cycle", "profiles", "after", "16", "hrs", "of", "serum", "deprivation", "(", "top", "panels", ")", ",", "or", "after", "an", "additional", "24", "hrs", "of", "serum", "re", "-", "addition", "in", "absence", "(", "middle", "panels", ")", ",", "or", "presence", "of", "10", "µM", "MPA", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "The", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "B", ",", "HCT116", "cells", "transfected", "with", "a", "NT", "siRNA", "or", "a", "siRNA", "against", "RPL11", "for", "24", "hrs", "were", "treated", "with", "10", "µM", "MPA", "for", "additional", "72", "hrs", ".", "The", "levels", "of", "γ", "-", "H2AX", "were", "analyzed", "on", "Western", "blots", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "immunostaining", "of", "γ", "-", "H2AX", "(", "C", ")", "in", "HCT116", "cells", "treated", "Total", "nuclear", "intensities", "were", "obtained", "on", ">", "6000", "(", "γ", "-", "H2AX", ")", "individual", "cells", "for", "each", "condition", "from", "four", "or", "two", "independent", "biological", "replicates", ",", "respectively", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "A", ".", "U", ".", "Arbitrary", "Units", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "immunostaining", "of", "53BP1", "(", "D", ")", "in", "HCT116", "cells", "treated", "Total", "nuclear", "intensities", "were", "obtained", "on", ">", "1000", "(", "53BP1", ")", "individual", "cells", "for", "each", "condition", "from", "four", "or", "two", "independent", "biological", "replicates", ",", "respectively", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ".", "A", ".", "U", ".", "Arbitrary", "Units", ".", "E", ",", "Representative", "images", "cells", "labeled", "with", "γ", "-", "H2AX", "(", "green", ")", ",", "53BP1", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "10", "μmF", ",", "HCT116", "cells", "treated", "were", "analyzed", "by", "the", "comet", "assay", ".", "The", "percentage", "of", "tail", "DNA", "/", "total", "DNA", "was", "analyzed", "in", "a", "total", "of", "300", "cells", "for", "each", "condition", "from", "three", "independent", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, HCT116 cells were transfected for 8 hrs with the indicated siRNA then treated and analyzed as in (Fig 5B). Here are shown the cell cycle profiles after 16 hrs of serum deprivation (top panels), or after an additional 24 hrs of serum re-addition in absence (middle panels), or presence of 10 µM MPA (bottom panels). The results are representative of at least three independent experiments.B, HCT116 cells transfected with a NT siRNA or a siRNA against RPL11 for 24 hrs were treated with 10 µM MPA for additional 72 hrs. The levels of γ-H2AX were analyzed on Western blots. GAPDH was used as a loading control.Statistical analysis of the immunostaining of γ-H2AX (C) in HCT116 cells treated Total nuclear intensities were obtained on >6000 (γ-H2AX) individual cells for each condition from four or two independent biological replicates, respectively. **p<0.01, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test. A.U. Arbitrary Units.Statistical analysis of the immunostaining of 53BP1 (D) in HCT116 cells treated Total nuclear intensities were obtained on > 1000 (53BP1) individual cells for each condition from four or two independent biological replicates, respectively. **p<0.01, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test. A.U. Arbitrary Units.E, Representative images cells labeled with γ-H2AX (green), 53BP1 (red) and DAPI (blue). Scale bars correspond to 10 μmF, HCT116 cells treated were analyzed by the comet assay. The percentage of tail DNA/total DNA was analyzed in a total of 300 cells for each condition from three independent biological replicates. ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test"}
{"words": ["Figure", "1b", ".", "Heatmap", "depicting", "mean", "expression", "of", "the", "top", "20", "upregulated", "genes", "of", "fibroblast", "isolated", "from", "wound", "-", "induced", "tumours", "(", "Pap", ")", "compared", "to", "fibroblasts", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "inflamed", "(", "InvEE", ")", "back", "skin", "(", "n", "=", "3", "per", "condition", ")", ".", "PRSS35", "is", "indicated", "in", "red", "as", "a", "top", "upregulated", "gene", "in", "CAFs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b. Heatmap depicting mean expression of the top 20 upregulated genes of fibroblast isolated from wound-induced tumours (Pap) compared to fibroblasts from wild-type (WT) and inflamed (InvEE) back skin (n=3 per condition). PRSS35 is indicated in red as a top upregulated gene in CAFs."}
{"words": ["Figure", "2a", ".", "Immunofluorescent", "images", "of", "skin", "sections", "from", "PDGFRα", "-", "eGFP", "reporter", "mice", "with", "normal", "(", "WT", ",", "n", "=", "4", ")", ",", "inflamed", "(", "InvEE", ",", "n", "=", "4", ")", ",", "wounded", "(", "d14", "post", "-", "wounding", ";", "wound", ",", "n", "=", "4", ")", ",", "or", "tumour", "-", "associated", "(", "Papilloma", ",", "Pap", "d17", "and", "d30", "post", "-", "wounding", ",", "n", "=", "4", "per", "condition", ")", "skin", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Dapi", "(", "4", "'", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "blue", ")", ".", "Dotted", "line", "represents", "epidermal", "-", "dermal", "boundary", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "b", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "fibroblasts", "present", "in", "different", "skin", "conditions", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "condition", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", "testing", ")", ".", "Data", "represent", "means", "of", "multiple", "microscopic", "fields", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "c", ".", "Herovici", "staining", "of", "sections", "of", "normal", "(", "WT", ")", ",", "inflamed", "(", "InvEE", ")", ",", "wound", ",", "or", "tumour", "-", "associated", "(", "Papilloma", ")", "skin", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2a. Immunofluorescent images of skin sections from PDGFRα-eGFP reporter mice with normal (WT, n=4), inflamed (InvEE, n=4), wounded (d14 post-wounding; wound, n=4), or tumour-associated (Papilloma, Pap d17 and d30 post-wounding, n=4 per condition) skin. Nuclei were stained with Dapi (4', 6-diamidino- 2- phenylindole; blue). Dotted line represents epidermal-dermal boundary. Scale bars: 50 μm. b. Quantification of the number of fibroblasts present in different skin conditions (n=4 mice per condition; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001; One-way ANOVA testing). Data represent means of multiple microscopic fields ± S.E.M. c. Herovici staining of sections of normal (WT), inflamed (InvEE), wound, or tumour-associated (Papilloma) skin. Scale bars: 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3c", ".", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "PRSS35", "in", "lysates", "from", "normal", "skin", "(", "WT", ",", "n", "=", "4", "mice", ")", ",", "inflamed", "skin", "(", "InvEE", ",", "n", "=", "4", "mice", ")", ",", "wounds", "(", "d14pw", ",", "n", "=", "4", "mice", ")", "and", "wound", "-", "induced", "papillomas", "(", "Pap", ",", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0159", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "represent", "means", "of", "three", "technical", "replicates", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "f", ".", "H", "&", "E", "-", "stained", "skin", "sections", "of", "WT", "and", "PRSS35", "-", "/", "-", "wounds", "at", "different", "days", "post", "-", "wounding", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3c. Relative mRNA levels of PRSS35 in lysates from normal skin (WT, n=4 mice), inflamed skin (InvEE, n=4 mice), wounds (d14pw, n=4 mice) and wound-induced papillomas (Pap, n=5 mice). (* p=0.0159; Mann-Whitney test). Data represent means of three technical replicates ± S.E.M.f. H&E-stained skin sections of WT and PRSS35-/- wounds at different days post-wounding. Scale bars: 100 µm."}
{"words": ["Figure", "4c", ",", "d", ".", "Incidence", "of", "papilloma", "formation", "(", "ns", ":", "non", "-", "significant", ";", "Gehan", "-", "Breslow", "-", "Wilcoxon", "test", ")", "(", "c", ")", "and", "number", "of", "tumours", "per", "mouse", "(", "d", ")", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ",", "n", "=", "17", ")", "and", "PRSS35", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "22", ")", "mice", "treated", "with", "DMBA", "-", "TPA", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0171", ";", "Wilcoxon", "matched", "-", "paired", "rank", "test", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4c, d. Incidence of papilloma formation (ns: non-significant; Gehan-Breslow-Wilcoxon test) (c) and number of tumours per mouse (d) in wild-type (WT, n=17) and PRSS35-/- (n=22) mice treated with DMBA-TPA (*p=0.0171; Wilcoxon matched-paired rank test). Data represent means ± S.E.M."}
{"words": ["Figure", "5b", ".", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "the", "indicated", "ECM", "genes", "in", "primary", "fibroblast", "cultures", "(", "col1a1", ":", "collagen", "type", "1", "alpha", "1", ";", "αSMA", ",", "alpha", "smooth", "muscle", "actin", ";", "Cyr61", ":", "Cysteine", "-", "rich", "angiogenic", "inducer", "61", "(", "=", "CCN1", ")", ")", "in", "primary", "fibroblast", "cultures", "isolated", "from", "WT", "and", "PRSS35", "-", "/", "-", "mice", ",", "untreated", "or", "after", "24", "hours", "stimulation", "with", "10", "ng", "/", "mL", "TGFβ1", "(", "n", "≥", "7", "biological", "replicates", "per", "condition", ")", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", ";", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "c", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "the", "indicated", "cytokines", "/", "growth", "factors", "in", "primary", "fibroblast", "cultures", "(", "n", "≥", "8", "per", "condition", ")", "(", "VEGF", "-", "α", ",", "vascular", "endothelial", "growth", "factor", "-", "alpha", ";", "FGF2", ":", "basic", "fibroblast", "growth", "factor", ";", "FGF7", ":", "keratinocyte", "growth", "factor", ")", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", ";", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "d", ".", "Picrosirius", "red", "staining", "of", "normal", "skin", ",", "day", "14", "post", "-", "wounding", "(", "d14pw", ")", "skin", "or", "wound", "-", "induced", "papillomas", "from", "WT", "and", "PRSS35", "KO", "mice", ".", "Red", "colouring", "indicates", "thick", "fibres", ",", "green", "colouring", "indicates", "thin", "fibres", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "µm", ".", "e", ".", "Quantification", "of", "picrosirius", "red", "staining", "as", "total", "collagen", "density", "(", "upper", "panel", ")", "and", "ratio", "of", "red", "versus", "green", "picrosirius", "staining", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Using", "QuPath", "Bioimage", "analysis", "software", "pixels", "colouring", "red", "or", "green", "were", "determined", "per", "area", ".", "(", "n", "≥", "4", "technical", "replicates", "per", "condition", ")", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", ";", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparisons", ")", ".", "Data", "represent", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5b. Relative mRNA expression levels of the indicated ECM genes in primary fibroblast cultures (col1a1: collagen type 1 alpha 1; αSMA, alpha smooth muscle actin; Cyr61: Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (=CCN1)) in primary fibroblast cultures isolated from WT and PRSS35-/- mice, untreated or after 24 hours stimulation with 10 ng/mL TGFβ1 (n≥7 biological replicates per condition) (** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001.; Two-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± S.E.M. c Relative mRNA expression levels of the indicated cytokines/growth factors in primary fibroblast cultures (n≥8 per condition) (VEGF-α, vascular endothelial growth factor-alpha; FGF2: basic fibroblast growth factor; FGF7: keratinocyte growth factor) (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001.; Two-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± S.E.M. d. Picrosirius red staining of normal skin, day 14 post-wounding (d14pw) skin or wound-induced papillomas from WT and PRSS35 KO mice. Red colouring indicates thick fibres, green colouring indicates thin fibres. Scale bars: 200 µm. e. Quantification of picrosirius red staining as total collagen density (upper panel) and ratio of red versus green picrosirius staining (lower panel). Using QuPath Bioimage analysis software pixels colouring red or green were determined per area. (n≥4 technical replicates per condition) (* p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001.; Two-way ANOVA with multiple comparisons). Data represent means ± S.E.M. "}
{"words": ["Figure", "6a", ".", "Human", "skin", "sections", "were", "stained", "with", "a", "PRSS35", "-", "specific", "antibody", "(", "red", ")", "and", "counterstained", "with", "Dapi", "(", "n", "=", "5", "per", "condition", ")", ".", "Boxed", "areas", "are", "magnifications", "as", "shown", "in", "the", "lower", "panel", "and", "dotted", "line", "represents", "the", "epidermal", "-", "dermal", "boundary", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "b", ".", "Quantification", "of", "PRSS35", "positive", "signal", "by", "Volocity", "analysis", "(", "n", "≥", "4", "per", "condition", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", "testing", ")", ".", "Data", "represent", "means", "of", "multiple", "microscopic", "fields", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6a. Human skin sections were stained with a PRSS35-specific antibody (red) and counterstained with Dapi (n=5 per condition). Boxed areas are magnifications as shown in the lower panel and dotted line represents the epidermal-dermal boundary. Scale bars: 100 μm. b. Quantification of PRSS35 positive signal by Volocity analysis (n≥4 per condition; ** p<0.01; One-way ANOVA testing). Data represent means of multiple microscopic fields ± S.E.M. "}
{"words": ["Figure", "1Balb", "/", "C", "mice", "were", "aerosolically", "challenged", "with", "Rv", ",", "Rv", "∆", "aosR", ",", "and", "Rv", "∆", "aosR", ":", ":", "aosR", "strains", ".", "Each", "data", "point", "represents", "log10", "CFU", "obtained", "from", "the", "infected", "lung", "of", "mice", "and", "e", "­", "rror", "bar", "depicts", "the", "median", "with", "interquartile", "range", "for", "each", "group", ".", "Each", "data", "point", "represents", "log10", "CFU", "obtained", "from", "the", "infected", "spleen", "of", "a", "mice", "and", "the", "error", "bar", "depicts", "the", "mean", "with", "SD", "for", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Balb/C mice were aerosolically challenged with Rv, Rv∆aosR, and Rv∆aosR::aosR strains. Each data point represents log10 CFU obtained from the infected lung of mice and e­rror bar depicts the median with interquartile range for each group. Each data point represents log10 CFU obtained from the infected spleen of a mice and the error bar depicts the mean with SD for each group."}
{"words": ["Figure", "2Each", "data", "point", "represents", "Log10", "CFU", "/", "lung", "of", "an", "infected", "animal", "and", "the", "error", "bar", "depicts", "the", "median", "with", "interquartile", "range", "for", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Each data point represents Log10 CFU/lung of an infected animal and the error bar depicts the median with interquartile range for each group."}
{"words": ["Figure", "3Relative", "gene", "expression", "of", "selected", "DEGs", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "Rv", "compared", "with", "Rv", "treated", "with", "CHP", "(", "g", ")", "and", "Rv", "as", "compared", "with", "Rv", "∆", "aosR", "under", "oxidative", "conditions", "(", "h", ")", ".", "Data", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "16s", "rRNA", "and", "results", "are", "expressed", "as", "mean", "log2", "fold", "change", "+", "SD", "of", "three", "independent", "replicates", "and", "is", "representative", "of", "one", "of", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Relative gene expression of selected DEGs measured by qRT-PCR in Rv compared with Rv treated with CHP (g) and Rv as compared with Rv∆aosR under oxidative conditions (h). Data were normalized with respect to 16s rRNA and results are expressed as mean log2 fold change + SD of three independent replicates and is representative of one of two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4WCLs", "of", "Rv", ",", "Rv", "∆", "aosR", ",", "and", "Rv", "∆", "aosR", ":", ":", "aosR", "subjected", "to", "0", "or", "50", "µM", "of", "CHP", "for", "6", "h", "were", "resolved", "on", "15", "%", "SDS", "-", "PAGE", ",", "transferred", "to", "nitrocellulose", "membrane", ",", "and", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "pΦ", "from", "B6", "were", "infected", "with", "indicated", "strains", "and", "intracellular", "bacterial", "viability", "was", "monitored", "96", "h", "p", ".", "i", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4WCLs of Rv, Rv∆aosR, and Rv∆aosR::aosR subjected to 0 or 50 µM of CHP for 6 h were resolved on 15% SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membrane, and probed with indicated antibodies.pΦ from B6 were infected with indicated strains and intracellular bacterial viability was monitored 96 h p.i (mean ± SEM; n=3)."}
{"words": ["Figure", "5The", "promoter", "of", "sigA", "and", "mec", "was", "fused", "to", "luciferase", ",", "and", "transformed", "cells", "were", "either", "left", "untreated", "or", "exposed", "to", "CHP", "stress", "for", "6", "h", "and", "luciferase", "activity", "was", "measured", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "6", ")", "Rv", ":", ":", "pN", "and", "Rv", ":", ":", "pN", "-", "F", "-", "sigH", "were", "either", "subjected", "to", "none", "or", "50", "µM", "of", "CHP", "for", "6", "h", "followed", "by", "cross", "-", "linking", ".", "1", "mg", "WCL", "was", "used", "to", "immunoprecipitate", "FLAG", "-", "SigH", "and", "1", "/", "10th", "IP", "was", "probed", "with", "α", "-", "FLAG", "and", "9", "/", "10th", "IP", "with", "α", "-", "AosR", ".", "50", "µg", "WCLs", "were", "probed", "with", "α", "-", "FLAG", ",", "α", "-", "AosR", ",", "and", "α", "-", "SigA", "as", "controls", ".", "Expression", "of", "CysO", ",", "CysM", ",", "AosR", "and", "GroEL1", "(", "control", ")", "was", "analyzed", "in", "WCLs", "of", "indicated", "bacterial", "strains", "treated", "with", "0", "or", "50", "µM", "of", "CHP", "for", "6", "h", ".", "5", "-", "7", ".", "5", "x", "104", "end", "labelled", "100", "bp", "double", "-", "stranded", "oligonucleotide", "was", "incubated", "with", "no", "protein", "(", "lanes", "1", "and", "6", ")", "or", "4", "μΜ", "BSA", "(", "lanes", "2", "and", "7", ")", "or", "2", "μΜ", "His", "-", "AosR", "+", "2", "μΜ", "BSA", "(", "lanes", "3", "and", "8", ")", "or", ",", "2", "μΜ", "His", "-", "SigH", "+", "2", "μΜ", "BSA", "(", "lanes", "4", "and", "9", ")", "or", "2", "μΜ", "His", "-", "AosR", "+", "2", "μΜ", "His", "-", "SigH", "(", "lanes", "5", "and", "10", ")", ".", "The", "reactions", "were", "either", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "10", "mM", "reduced", "DTT", "or", "10", "mM", "diamide", "to", "reduce", "or", "oxidize", "thiols", ",", "respectively", ",", "and", "resolved", "on", "8", "%", "PAGE", "gel", ".", "Protein", "-", "DNA", "complexes", "(", "bound", ")", "and", "free", "probe", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "To", "confirm", "the", "specificity", "of", "DNA", "-", "protein", "interaction", ",", "EMSA", "reaction", "was", "performed", "in", "the", "presence", "of", "5", ",", "10", ",", "25", ",", "50", ",", "and", "100", "molar", "excess", "of", "unlabelled", "100", "bp", "double", "-", "stranded", "oligonucleotide", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The promoter of sigA and mec was fused to luciferase, and transformed cells were either left untreated or exposed to CHP stress for 6 h and luciferase activity was measured (mean ±SD; n=6)Rv::pN and Rv::pN-F-sigH were either subjected to none or 50 µM of CHP for 6 h followed by cross-linking. 1 mg WCL was used to immunoprecipitate FLAG-SigH and 1/10th IP was probed with α-FLAG and 9/10th IP with α-AosR. 50 µg WCLs were probed with α-FLAG,α-AosR, and α-SigA as controls.Expression of CysO, CysM, AosR and GroEL1 (control) was analyzed in WCLs of indicated bacterial strains treated with 0 or 50 µM of CHP for 6 h.5-7.5 x 104 end labelled 100 bp double-stranded oligonucleotide was incubated with no protein (lanes 1 and 6) or 4 μΜ BSA (lanes 2 and 7) or 2 μΜ His-AosR + 2 μΜ BSA (lanes 3 and 8) or , 2 μΜ His-SigH + 2 μΜ BSA (lanes 4 and 9) or 2 μΜ His-AosR + 2 μΜ His-SigH (lanes 5 and 10). The reactions were either incubated in the presence of 10 mM reduced DTT or 10 mM diamide to reduce or oxidize thiols, respectively, and resolved on 8% PAGE gel. Protein-DNA complexes (bound) and free probe are indicated by arrows. To confirm the specificity of DNA-protein interaction, EMSA reaction was performed in the presence of 5, 10, 25, 50, and 100 molar excess of unlabelled 100 bp double-stranded oligonucleotide."}
{"words": ["Figure", "6Msm", ":", ":", "FLAG", "-", "SigH", ",", "Msm", ":", ":", "FLAG", "-", "SigH", "-", "AosR", "-", "HA", "and", "Msm", ":", ":", "FLAG", "-", "SigH", "-", "AosRAxxxA", "-", "HA", "were", "either", "subjected", "to", "none", "or", "50", "µM", "of", "CHP", "for", "3", "h", "followed", "by", "cross", "-", "linking", ".", "1", "mg", "WCL", "was", "used", "to", "immunoprecipitate", "FLAG", "-", "SigH", "and", "1", "/", "10th", "IP", "was", "probed", "with", "α", "-", "FLAG", "and", "9", "/", "10th", "IP", "with", "α", "-", "HA", ".", "50", "µg", "WCLs", "were", "probed", "with", "α", "-", "FLAG", ",", "α", "-", "HA", "and", "α", "-", "SigA", "as", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Msm::FLAG-SigH, Msm::FLAG-SigH-AosR-HA and Msm::FLAG-SigH-AosRAxxxA-HA were either subjected to none or 50 µM of CHP for 3 h followed by cross-linking. 1 mg WCL was used to immunoprecipitate FLAG-SigH and 1/10th IP was probed with α-FLAG and 9/10th IP with α-HA. 50 µg WCLs were probed with α-FLAG, α-HA and α-SigA as controls."}
{"words": ["Figure", "7Indicated", "bacterial", "strains", "were", "subjected", "to", "oxidative", "stress", "with", "50", "µM", "CHP", "for", "6", "h", "and", "free", "thiol", "content", "was", "quantified", ".", "Data", "presented", "is", "representative", "of", "one", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "each", "performed", "in", "triplicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Y", "-", "axis", "represents", "µM", "thiol", "/", "µg", "of", "WCL", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "Metabolite", "levels", "of", "reduced", "mycothiol", ",", "MSH", "ergothioneine", ",", "ERG", "were", "measured", "in", "Rv", ",", "Rv", "∆", "aosR", ",", "and", "Rv", "∆", "aosR", ":", ":", "aosR", "in", "normal", "and", "CHP", "stressed", "cells", "using", "LC", "-", "MRM", "MS", "/", "MS", "analysis", ".", "The", "absolute", "values", "obtained", "under", "normal", "conditions", "were", "normalized", "to", "100", "%", "for", "each", "strain", "and", "the", "relative", "values", "were", "calculated", "for", "samples", "processed", "from", "CHP", "treated", "cells", ".", "The", "data", "indicates", "relative", "levels", "of", "metabolites", "(", "mean", "percent", "±", "SD", ")", "of", "four", "replicates", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "measurements", "for", "the", "log2", "fold", "induction", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", "for", "indicated", "genes", "in", "Rv", "∆", "aosR", "and", "Rv", "∆", "aosR", "treated", "with", "1mM", "L", "-", "cysteine", "as", "compared", "with", "Rv", ".", "All", "strains", "were", "treated", "with", "50", "μM", "CHP", ".", "Data", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "16s", "rRNA", "and", "is", "representative", "of", "one", "of", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Indicated bacterial strains were subjected to oxidative stress with 50 µM CHP for 6 h and free thiol content was quantified. Data presented is representative of one of two biological replicates, each performed in triplicates (n=3). Y-axis represents µM thiol /µg of WCL (mean ± SD). Metabolite levels of reduced mycothiol, MSH ergothioneine, ERG were measured in Rv, Rv∆aosR, and Rv∆aosR::aosR in normal and CHP stressed cells using LC-MRM MS/MS analysis. The absolute values obtained under normal conditions were normalized to 100% for each strain and the relative values were calculated for samples processed from CHP treated cells. The data indicates relative levels of metabolites (mean percent ± SD) of four replicates (n=4).qRT-PCR measurements for the log2 fold induction (mean ±SD, n=3) for indicated genes in Rv∆aosR and Rv∆aosR treated with 1mM L-cysteine as compared with Rv. All strains were treated with 50 μM CHP. Data were normalized with respect to 16s rRNA and is representative of one of two biological replicates."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ",", "b", ")", "Survival", "of", "wild", "-", "type", "(", "Oregon", "R", ")", ",", "yw", ",", "PGRP", "-", "LE112", ",", "PGRP", "-", "LC7454", "and", "PGRP", "-", "LE112", ",", "PGRP", "-", "LC7454", "flies", "after", "injection", "of", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "(", "a", ")", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "(", "b", ")", "at", "28", "°", "C", ".", "(", "c", ")", "Survival", "of", "wild", "-", "type", ",", "yw", "and", "PGRP", "-", "LE112", "flies", ",", "as", "well", "as", "flies", "treated", "with", "RNAi", "targeting", "PGRP", "-", "LE", "with", "the", "hml", "-", "Gal4", "driver", "(", "hml", "-", "Gal4", ">", "PGRP", "-", "LE", "RNAi", ")", "and", "PGRP", "-", "LE112", "flies", "with", "hml", "-", "Gal4", "-", "driven", "PGRP", "-", "LE", "expression", "(", "PGRP", "-", "LE112", ",", "hml", "-", "Gal4", ">", "PGRP", "-", "LE", ")", ",", "after", "injection", "of", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "at", "28", "°", "C", ".", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", ",", "P", "0", ".", "01", "(", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ":", "P", "=", "0", ".", "0006", ",", "0", ".", "0043", "or", "0", ".", "0043", ",", "for", "yw", "versus", "PGRP", "-", "LE112", ",", "PGRP", "-", "LC7454", "or", "PGRP", "-", "LE112", ",", "PGRP", "-", "LC7454", ",", "respectively", "(", "a", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0095", ",", "for", "yw", "versus", "RNAi", "targeting", "PGRP", "-", "LE", "(", "c", ")", ".", "Data", "represent", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", "with", "over", "30", "flies", "of", "each", "genotype", "examined", "at", "the", "same", "time", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a,b) Survival of wild-type (Oregon R), yw, PGRP-LE112, PGRP-LC7454 and PGRP-LE112,PGRP-LC7454 flies after injection of wild-type L. monocytogenes (a) or Δhly L. monocytogenes (b) at 28 °C.(c) Survival of wild-type, yw and PGRP-LE112 flies, as well as flies treated with RNAi targeting PGRP-LE with the hml-Gal4 driver (hml-Gal4>PGRP-LE RNAi) and PGRP-LE112 flies with hml-Gal4-driven PGRP-LE expression (PGRP-LE112,hml-Gal4>PGRP-LE), after injection of wild-type L. monocytogenes at 28 °C. NS, not significant; *, P 0.01 (Wilcoxon-Mann-Whitney test): P = 0.0006, 0.0043 or 0.0043, for yw versus PGRP-LE112, PGRP-LC7454 or PGRP-LE112,PGRP-LC7454, respectively (a); P = 0.0095, for yw versus RNAi targeting PGRP-LE (c). Data represent the average of four independent experiments with over 30 flies of each genotype examined at the same time."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Microscopy", "of", "hemocytes", "from", "third", "instar", "larvae", "cultured", "ex", "vivo", "and", "infected", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", ".", "Hemocyte", "nuclei", "(", "filled", "arrowhead", ")", "and", "DNA", "of", "L", ".", "monocytogenes", "(", "open", "arrowhead", ")", "are", "visualized", "by", "DAPI", "staining", "(", "blue", "or", "white", ")", ";", "the", "actin", "cytoskeleton", "is", "stained", "with", "rhodamine", "-", "labeled", "phalloidin", "(", "red", ")", ".", "hml", "-", "Gal4", ">", "Atg5IR", ",", "expression", "of", "an", "inverted", "repeat", "sequence", "of", "Atg5", "to", "induce", "RNAi", "against", "Atg5", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "b", ")", "Intracellular", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "(", "WT", "Lm", ")", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "(", "Δhly", "Lm", ")", "counted", "manually", "in", "DAPI", "-", "stained", "infected", "hemocytes", ".", "LE112", ",", "hml", ">", "LE", ",", "hml", "-", "Gal4", "-", "driven", "expression", "of", "PGRP", "-", "LE", "in", "PGRP", "-", "LE112", "hemocytes", ";", "imd1", ",", "imd", ";", "RelE20", ",", "RelishE20", ";", "hml", ">", "Atg5IR", ",", "inverted", "repeat", "sequence", "described", "in", "a", ";", "w", ",", "hml", ">", "Atg1", ",", "hml", "-", "Gal4", "-", "driven", "expression", "of", "Atg1", "in", "w", "hemocytes", ";", "LE112", ",", "hml", ">", "Atg1", ",", "hml", "-", "Gal4", "-", "driven", "expression", "of", "Atg1", "in", "PGRP", "-", "LE112", "hemocytes", ";", "PGRP", "-", "LE112", "+", "rap", ",", "PGRP", "-", "LE112", "hemocytes", "plus", "rapamycin", ".", "*", ",", "P", "0", ".", "001", ",", "compared", "with", "wild", "type", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "four", "experiments", "(", "a", ")", "or", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "b", ";", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", "of", "triplicate", "measurements", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Microscopy of hemocytes from third instar larvae cultured ex vivo and infected with wild-type L. monocytogenes. Hemocyte nuclei (filled arrowhead) and DNA of L. monocytogenes (open arrowhead) are visualized by DAPI staining (blue or white); the actin cytoskeleton is stained with rhodamine-labeled phalloidin (red). hml-Gal4>Atg5IR, expression of an inverted repeat sequence of Atg5 to induce RNAi against Atg5. Scale bars, 10 μm.(b) Intracellular wild-type L. monocytogenes (WT Lm) or Δhly L. monocytogenes (Δhly Lm) counted manually in DAPI-stained infected hemocytes. LE112,hml>LE, hml-Gal4-driven expression of PGRP-LE in PGRP-LE112 hemocytes; imd1, imd; RelE20, RelishE20; hml>Atg5IR, inverted repeat sequence described in a; w, hml>Atg1, hml-Gal4-driven expression of Atg1 in w hemocytes; LE112,hml>Atg1, hml-Gal4-driven expression of Atg1 in PGRP-LE112 hemocytes; PGRP-LE112+rap, PGRP-LE112 hemocytes plus rapamycin. *, P 0.001, compared with wild type (t-test). Data are representative of four experiments (a) or at least three independent experiments (b; error bars, s.d. of triplicate measurements)."}
{"words": ["figf3Survival", "of", "yw", "flies", ",", "PGRP", "-", "LE112", "flies", ",", "flies", "treated", "with", "Atg5", "-", "directed", "RNAi", "(", "hml", "-", "Gal4", ">", "Atg5IR", ")", "and", "control", "flies", "carrying", "hml", "-", "Gal4", "(", "hml", "-", "Gal4", ">", "GFP", ")", ",", "after", "injection", "of", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "(", "a", ")", ",", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "(", "b", ")", "or", "E", ".", "carotovora", "(", "c", ")", "into", "adult", "flies", ".", "*", ",", "P", "0", ".", "01", "(", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ":", "P", "=", "0", ".", "0024", ",", "Atg5", "-", "directed", "RNAi", "versus", "control", "(", "a", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "PGRP", "-", "LE112", "versus", "control", "(", "a", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0055", ",", "PGRP", "-", "LC7454", "versus", "yw", "(", "c", ")", ".", "Data", "represent", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3Survival of yw flies, PGRP-LE112 flies, flies treated with Atg5-directed RNAi (hml-Gal4>Atg5IR) and control flies carrying hml-Gal4 (hml-Gal4>GFP), after injection of wild-type L. monocytogenes (a), Δhly L. monocytogenes (b) or E. carotovora (c) into adult flies. *, P 0.01 (Wilcoxon-Mann-Whitney test): P = 0.0024, Atg5-directed RNAi versus control (a), P = 0.0007, PGRP-LE112 versus control (a); P = 0.0055, PGRP-LC7454 versus yw (c). Data represent the average of four independent experiments."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Growth", "of", "L", ".", "monocytogenes", "in", "S2", "cells", "(", "S2", ")", "or", "S2", "cells", "expressing", "PGRP", "-", "LE", "(", "S2", "-", "LE", ")", "transfected", "with", "double", "-", "stranded", "RNA", "(", "RNAi", ")", "specific", "for", "Atg5", ",", "Rel", "or", "Dif", "and", "dl", "(", "Dif", "-", "dl", ")", "and", "infected", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "wild", "-", "type", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", ",", "followed", "by", "6", "h", "of", "incubation", "in", "medium", "containing", "CuSO4", "and", "gentamicin", ",", "quantified", "by", "plate", "assay", "of", "colony", "-", "forming", "units", ".", "*", ",", "P", "0", ".", "001", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Fluorescence", "confocal", "microscopy", "of", "the", "localization", "of", "PGRP", "-", "LE", "together", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "in", "S2", "cells", "engineered", "to", "express", "YFP", "-", "PGRP", "-", "LE", "(", "YFP", "-", "LE", ")", "and", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "(", "b", ")", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "(", "c", ")", ",", "followed", "by", "1", "h", "of", "incubation", "in", "gentamicin", "-", "containing", "medium", ",", "then", "DAPI", "staining", ".", "Merge", ",", "YFP", "-", "PGRP", "-", "LE", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "magenta", ")", ".", "Filled", "arrowheads", "indicate", "L", ".", "monocytogenes", ";", "open", "arrowhead", "indicates", "accumulation", "of", "YFP", "-", "PGRP", "-", "LE", "around", "the", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Growth of L. monocytogenes in S2 cells (S2) or S2 cells expressing PGRP-LE (S2-LE) transfected with double-stranded RNA (RNAi) specific for Atg5, Rel or Dif and dl (Dif-dl) and infected for 1.5 h with wild-type or Δhly L. monocytogenes, followed by 6 h of incubation in medium containing CuSO4 and gentamicin, quantified by plate assay of colony-forming units. *, P 0.001 (t-test). Data are representative of two independent experiments (error bars, s.d.).(b,c) Fluorescence confocal microscopy of the localization of PGRP-LE together with wild-type L. monocytogenes in S2 cells engineered to express YFP-PGRP-LE (YFP-LE) and infected for 0.5 h with wild-type L. monocytogenes (b) or Δhly L. monocytogenes (c), followed by 1 h of incubation in gentamicin-containing medium, then DAPI staining. Merge, YFP-PGRP-LE (green) and DAPI (magenta). Filled arrowheads indicate L. monocytogenes; open arrowhead indicates accumulation of YFP-PGRP-LE around the bacteria. Scale bars, 5 μm. Data are representative of three experiments."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "GFP", "-", "LC3", "(", "LC3", "dot", ")", "signals", "in", "S2", "cells", "expressing", "both", "PGRP", "-", "LE", "and", "GFP", "-", "LC3", "under", "the", "control", "of", "an", "actin", "promoter", "(", "PGRP", "-", "LE", "GFP", "-", "LC3", ")", "or", "GFP", "-", "LC3", "alone", "(", "GFP", "-", "LC3", ")", "after", "infection", "with", "wild", "-", "type", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "or", "after", "1", ".", "5", "h", "of", "incubation", "with", "5", "μM", "rapamycin", "(", "rap", ")", ".", "-", ",", "no", "infection", ".", "(", "b", ")", "Colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "and", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "in", "S2", "cells", ",", "quantified", "by", "confocal", "microscopy", ".", "(", "c", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "S2", "cells", "expressing", "PGRP", "-", "LE", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "infected", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "magenta", ")", ".", "Arrow", "indicates", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "and", "L", ".", "monocytogenes", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysates", "of", "S2", "cells", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "infected", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", "or", "treated", "with", "5", "μM", "rapamycin", ".", "(", "e", "-", "i", ")", "Ultrastructural", "analysis", "of", "S2", "cells", "expressing", "PGRP", "-", "LE", "and", "GFP", "-", "LC3", "and", "infected", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Fluorescence", "microscopy", "(", "e", ")", "and", "electron", "microscopy", "(", "f", ")", "of", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "and", "stained", "with", "DAPI", "(", "magenta", ")", ".", "(", "g", ")", "Enlargement", "of", "a", "bacteria", "-", "containing", "vacuole", "from", "f", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "Enlargement", "of", "the", "fields", "outlined", "in", "g", ".", "Arrows", "indicate", "double", "-", "membrane", "structure", "that", "surrounds", "the", "bacteria", ";", "arrowheads", "indicate", "an", "endoplasmic", "reticulum", "-", "like", "membrane", ".", "(", "j", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "hemocytes", "infected", "with", "wild", "-", "type", "L", ".", "monocytogenes", ".", "Green", ",", "GFP", "-", "LC3", ";", "magenta", ",", "DAPI", ".", "Arrow", "indicates", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "and", "L", ".", "monocytogenes", ".", "(", "k", ")", "Dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "GFP", "-", "LC3", "signals", "in", "ex", "vivo", "-", "cultured", "hemocytes", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "(", "infection", "and", "treatment", ",", "horizontal", "axis", ")", ".", "(", "l", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysates", "of", "hemocytes", "from", "third", "instar", "larvae", "cultured", "ex", "vivo", "and", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "or", "treated", "with", "rapamycin", ".", "Arrowhead", "indicates", "processed", "form", "of", "GFP", "-", "LC3", ".", "(", "m", ")", "GFP", "-", "LC3", "dots", "in", "S2", "cells", "expressing", "PGRP", "-", "LE", "and", "GFP", "-", "LC3", "and", "treated", "with", "RNAi", "(", "below", "graph", ")", "and", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "L", ".", "monocytogenes", "then", "incubated", "for", "1", "h", "in", "gentamicin", "-", "containing", "medium", ";", "dots", "quantified", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "(", "c", ",", "j", ")", ",", "1", "μm", "(", "e", ",", "f", ")", "or", "500", "nm", "(", "g", ")", ".", "*", ",", "P", "0", ".", "001", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "(", "a", ",", "k", ",", "m", ")", ",", "two", "(", "b", ",", "e", "-", "i", ")", ",", "six", "(", "c", ")", ",", "four", "(", "d", ")", "or", "five", "(", "j", ",", "l", ")", "experiments", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", "of", "triplicate", "measurements", "(", "a", ",", "b", ",", "l", ")", "or", "at", "least", "triplicate", "measurements", "(", "m", ")", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Dot- or ring-shaped GFP-LC3 (LC3 dot) signals in S2 cells expressing both PGRP-LE and GFP-LC3 under the control of an actin promoter (PGRP-LE GFP-LC3) or GFP-LC3 alone (GFP-LC3) after infection with wild-type or Δhly L. monocytogenes or after 1.5 h of incubation with 5 μM rapamycin (rap). -, no infection.(b) Colocalization of GFP-LC3 dots and wild-type L. monocytogenes in S2 cells, quantified by confocal microscopy.(c) Confocal microscopy of S2 cells expressing PGRP-LE and GFP-LC3 (green) infected with wild-type L. monocytogenes and stained with DAPI (magenta). Arrow indicates colocalization of GFP-LC3 and L. monocytogenes.(d) Immunoblot analysis of lysates of S2 cells left untreated (-) or infected with wild-type L. monocytogenes or treated with 5 μM rapamycin.(e-i) Ultrastructural analysis of S2 cells expressing PGRP-LE and GFP-LC3 and infected with wild-type L. monocytogenes. (e,f) Fluorescence microscopy (e) and electron microscopy (f) of cells expressing GFP-LC3 (green) and stained with DAPI (magenta). (g) Enlargement of a bacteria-containing vacuole from f. (h,i) Enlargement of the fields outlined in g. Arrows indicate double-membrane structure that surrounds the bacteria; arrowheads indicate an endoplasmic reticulum-like membrane.(j) Confocal microscopy of hemocytes infected with wild-type L. monocytogenes. Green, GFP-LC3; magenta, DAPI. Arrow indicates colocalization of GFP-LC3 and L. monocytogenes.(k) Dot- or ring-shaped GFP-LC3 signals in ex vivo-cultured hemocytes expressing GFP-LC3 (infection and treatment, horizontal axis).(l) Immunoblot analysis of lysates of hemocytes from third instar larvae cultured ex vivo and infected with L. monocytogenes or treated with rapamycin. Arrowhead indicates processed form of GFP-LC3.(m) GFP-LC3 dots in S2 cells expressing PGRP-LE and GFP-LC3 and treated with RNAi (below graph) and infected for 0.5 h with L. monocytogenes then incubated for 1 h in gentamicin-containing medium; dots quantified by confocal microscopy. Scale bars, 5 μm (c,j), 1 μm (e,f) or 500 nm (g). *, P 0.001 (t-test). Data are representative of three (a,k,m), two (b,e-i), six (c), four (d) or five (j,l) experiments (error bars, s.d. of triplicate measurements (a,b,l) or at least triplicate measurements (m))."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "GFP", "-", "LC3", "dots", "in", "S2", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "alone", "or", "PGRP", "-", "LE", "and", "GFP", "-", "LC3", ",", "treated", "for", "2", "h", "with", "TCT", "(", "100", "nM", ")", ",", "highly", "purified", "DAP", "-", "type", "PGN", "from", "L", ".", "plantarum", "(", "DAP", ";", "100", "μg", "/", "ml", ")", "or", "lysine", "-", "type", "PGN", "from", "S", ".", "epidermidis", "(", "Lys", ")", ".", "(", "b", ")", "Dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "GFP", "-", "LC3", "signals", "in", "hemocytes", "after", "infection", "with", "wild", "-", "type", "or", "Δhly", "L", ".", "monocytogenes", "or", "treatment", "with", "rapamycin", "(", "5", "μM", ")", "or", "with", "TCT", ",", "DAP", "-", "type", "PGN", "or", "lysine", "-", "type", "PGN", ".", "*", ",", "P", "0", ".", "001", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) GFP-LC3 dots in S2 cells expressing GFP-LC3 alone or PGRP-LE and GFP-LC3, treated for 2 h with TCT (100 nM), highly purified DAP-type PGN from L. plantarum (DAP; 100 μg/ml) or lysine-type PGN from S. epidermidis (Lys).(b) Dot- or ring-shaped GFP-LC3 signals in hemocytes after infection with wild-type or Δhly L. monocytogenes or treatment with rapamycin (5 μM) or with TCT, DAP-type PGN or lysine-type PGN. *, P 0.001 (t-test). Data are representative of two independent experiments (error bars, s.d.)."}
{"words": ["Figure", "1Left", ":", "Fluorescence", "changes", "of", "IRDye700", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "125", "nM", ")", "when", "incubated", "at", "increasing", "ID2", "(", "I", "+", "D2", ",", "IUb", "+", "D2Ub", ",", "I", "+", "D2Ub", ")", "or", "ubiquitinated", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", "concentrations", "(", "ranging", "from", "1", ".", "3", "nM", "to", "5", ".", "9", "µM", ")", ".", "Measurement", "of", "fluorescence", "enhancement", "for", "each", "ID2", "complex", "was", "conducted", "for", "two", "separately", "prepared", "complexes", "(", "two", "technical", "repeats", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Right", ":", "Bar", "graph", "showing", "mean", "apparent", "Kd", "values", "calculated", "from", "model", "fitting", ".", "Error", "bars", ":", "Asymmetric", "95", "%", "confidence", "intervals", "from", "non", "-", "linear", "regression", "(", "23", "-", "24", "data", "points", "each", ")", ".", "Assessment", "of", "protein", "-", "DNA", "interactions", "using", "Electro", "-", "mobility", "shift", "assays", "(", "EMSA", ")", ".", "IRDye700", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "2", "nM", ")", "was", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "non", "/", "single", "/", "double", "-", "ubiquitinated", "ID2", "(", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "and", "FLAG", "-", "FANCD2", ")", "protein", "complexes", "(", "I", "+", "D2", ",", "IUb", "+", "D2Ub", ",", "I", "+", "D2Ub", "­", ")", "or", "ubiquitinated", "FLAG", "-", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", ".", "Mixes", "were", "ran", "on", "non", "-", "denaturing", "gels", ",", "and", "the", "resolved", "free", "-", "and", "protein", "-", "bound", "DNA", "bands", "were", "visualized", "using", "an", "infrared", "scanner", ".", "EMSA", "gels", "of", "ID2", "complexes", "are", "representative", "of", "3", "replicate", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Left: Fluorescence changes of IRDye700 labelled dsDNA (at 125 nM) when incubated at increasing ID2 (I+D2, IUb+D2Ub, I+D2Ub) or ubiquitinated FANCD2 (D2Ub) concentrations (ranging from 1.3 nM to 5.9 µM). Measurement of fluorescence enhancement for each ID2 complex was conducted for two separately prepared complexes (two technical repeats) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Right: Bar graph showing mean apparent Kd values calculated from model fitting. Error bars: Asymmetric 95% confidence intervals from non-linear regression (23-24 data points each).Assessment of protein-DNA interactions using Electro-mobility shift assays (EMSA). IRDye700 labelled dsDNA (at 2 nM) was incubated with indicated amounts of non/single/double-ubiquitinated ID2 (His6-TEV-V5-FANCI and FLAG-FANCD2) protein complexes (I+D2, IUb+D2Ub, I+D2Ub­) or ubiquitinated FLAG-FANCD2 (D2Ub). Mixes were ran on non-denaturing gels, and the resolved free- and protein-bound DNA bands were visualized using an infrared scanner. EMSA gels of ID2 complexes are representative of 3 replicate experiments."}
{"words": ["Figure", "2Left", ":", "CryoEM", "2D", "classes", "of", "ID2Ub", "and", "IUbD2Ub", "-", "dsDNA", ".", "Right", ":", "3D", "reconstructions", "of", "ID2Ub", "(", "EMD", "-", "10843", ")", "and", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "(", "EMD", "-", "10844", ")", ".", "Both", "structures", "exhibit", "a", "torus", "-", "like", "shape", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Left: CryoEM 2D classes of ID2Ub and IUbD2Ub-dsDNA. Right: 3D reconstructions of ID2Ub (EMD-10843) and IUbD2Ub-DNA (EMD-10844). Both structures exhibit a torus-like shape."}
{"words": ["Figure", "3Both", "wild", "-", "type", "(", "IWT", ")", "and", "R1285Q", "mutant", "(", "IR1285Q", ")", "FANCI", "can", "be", "efficiently", "ubiquitinated", "in", "the", "presence", "of", "DNA", ".", "Reactions", "were", "performed", "at", "2", "μM", "FANCI", "substrate", "for", "60", "min", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "4", "µM", "ssDNA", ".", "Both", "wild", "-", "type", "(", "IWT", ")", "and", "R1285Q", "mutant", "(", "IR1285Q", ")", "FANCI", "efficiently", "associate", "with", "FANCD2", ".", "Fluorescence", "changes", "occurring", "when", "RED", "-", "tris", "-", "NTA", "-", "labelled", "FANCI", "(", "IWT", "or", "IR1285Q", ";", "both", "at", "60", "nM", ")", "is", "incubated", "at", "increasing", "concentrations", "of", "FANCD2", "(", "ranging", "from", "2", ".", "48", "nM", "to", "5", ".", "08", "µM", ")", ".", "Titrations", "were", "conducted", "twice", "(", "two", "technical", "replicates", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Apparent", "Kd", "values", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "derived", "from", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", "to", "the", "24", "data", "points", "of", "the", "two", "technical", "replicates", "are", "shown", ".", "FANCD2", "within", "an", "IR1285QD2", "complex", "is", "resistant", "to", "ubiquitination", ".", "Reactions", "were", "performed", "at", "4", "μM", "ID2", "substrate", "and", "16", "μM", "dsDNA", ".", "Progress", "of", "FANCD2", "and", "FANCI", "ubiquitination", "was", "monitored", "by", "western", "blotting", "following", "SDS", "-", "PAGE", ".", "FANCD2", "ubiquitination", "cannot", "robustly", "enhance", "ID2", "-", "DNA", "binding", "when", "complexed", "with", "IR1285Q", ",", "as", "determined", "by", "PIFE", ".", "Left", ":", "Fluorescence", "changes", "when", "IRD700", "-", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "125", "nM", ")", "is", "incubated", "at", "increasing", "concentrations", "of", "IR1285Q", "+", "D2", "or", "IR1285Q", "+", "D2Ub", "(", "complex", "concentrations", "ranging", "from", "1", ".", "54", "nM", "to", "3", ".", "8", "µM", ")", ".", "Measurement", "of", "fluorescence", "enhancement", "for", "each", "protein", "combination", "was", "conducted", "for", "two", "separately", "prepared", "complexes", "(", "two", "technical", "repeats", ")", "and", "all", "data", "points", "for", "each", "protein", "-", "combination", "were", "used", "in", "fitting", "of", "a", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Right", ":", "Bar", "graph", "showing", "mean", "apparent", "Kd", "values", "calculated", "from", "the", "one", "-", "site", "binding", "model", ".", "Error", "bars", ":", "Asymmetric", "95", "%", "confidence", "intervals", "from", "non", "-", "linear", "regression", "(", "22", "data", "points", "each", ")", ".", "IWT", "+", "D2", "and", "IWT", "+", "D2Ub", "previously", "calculated", "curves", "and", "corresponding", "Kd", "values", "(", "from", "data", "points", "shown", "in", "Figure", "1A", ")", "are", "also", "shown", "for", "comparison", ".", "FANCD2", "ubiquitination", "cannot", "robustly", "enhance", "ID2", "-", "DNA", "binding", "when", "complexed", "with", "IR1285Q", ",", "as", "determined", "by", "EMSAs", ".", "IRDye700", "-", "labelled", "dsDNA", "(", "at", "2", "nM", ")", "was", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "ID2", "(", "His6", "-", "FANCI", "or", "His6", "-", "FANCIR1285Q", "mixed", "with", "non", "-", "ubiquitinated", "or", "ubiquitinated", "FLAG", "-", "FANCD2", ".", "Mixes", "were", "ran", "on", "non", "-", "denaturing", "gels", ",", "and", "the", "resolved", "free", "-", "and", "protein", "-", "bound", "DNA", "bands", "were", "visualized", "using", "an", "infrared", "scanner", ".", "Gels", "shown", "are", "representative", "of", "two", "replicate", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Both wild-type (IWT) and R1285Q mutant (IR1285Q) FANCI can be efficiently ubiquitinated in the presence of DNA. Reactions were performed at 2 μM FANCI substrate for 60 min in the absence or presence of 4 µM ssDNA.Both wild-type (IWT) and R1285Q mutant (IR1285Q) FANCI efficiently associate with FANCD2. Fluorescence changes occurring when RED-tris-NTA-labelled FANCI (IWT or IR1285Q; both at 60 nM) is incubated at increasing concentrations of FANCD2 (ranging from 2.48 nM to 5.08 µM). Titrations were conducted twice (two technical replicates) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Apparent Kd values (mean ± SEM) derived from fitting of a one-site binding model to the 24 data points of the two technical replicates are shown.FANCD2 within an IR1285QD2 complex is resistant to ubiquitination. Reactions were performed at 4 μM ID2 substrate and 16 μM dsDNA. Progress of FANCD2 and FANCI ubiquitination was monitored by western blotting following SDS-PAGE.FANCD2 ubiquitination cannot robustly enhance ID2-DNA binding when complexed with IR1285Q, as determined by PIFE. Left: Fluorescence changes when IRD700-labelled dsDNA (at 125 nM) is incubated at increasing concentrations of IR1285Q +D2 or IR1285Q +D2Ub (complex concentrations ranging from 1.54 nM to 3.8 µM). Measurement of fluorescence enhancement for each protein combination was conducted for two separately prepared complexes (two technical repeats) and all data points for each protein-combination were used in fitting of a one-site binding model. Right: Bar graph showing mean apparent Kd values calculated from the one-site binding model. Error bars: Asymmetric 95% confidence intervals from non-linear regression (22 data points each). IWT + D2 and IWT + D2Ub previously calculated curves and corresponding Kd values (from data points shown in Figure 1A) are also shown for comparison.FANCD2 ubiquitination cannot robustly enhance ID2-DNA binding when complexed with IR1285Q, as determined by EMSAs. IRDye700-labelled dsDNA (at 2 nM) was incubated with indicated amounts of ID2 (His6-FANCI or His6-FANCIR1285Q mixed with non-ubiquitinated or ubiquitinated FLAG-FANCD2. Mixes were ran on non-denaturing gels, and the resolved free- and protein-bound DNA bands were visualized using an infrared scanner. Gels shown are representative of two replicate experiments."}
{"words": ["Figure", "4USP1", "-", "UAF1", "can", "efficiently", "deubiquitinate", "D2Ub", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "FANCI", "(", "I", ")", ",", "but", "not", "in", "the", "presence", "of", "ubiquitinated", "FANCI", "(", "IUb", ")", ".", "Ubiquitinated", "FANCD2", "(", "D2Ub", ")", "was", "mixed", "with", "a", "50", "base", "pair", "dsDNA", "and", "either", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "(", "I", ")", ",", "ubiquitinated", "His6", "-", "TEV", "-", "V5", "-", "FANCI", "(", "IUb", ")", "or", "no", "protein", ";", "protein", "-", "DNA", "mixes", "were", "subsequently", "incubated", "with", "USP1", "-", "UAF1", "(", "at", "25", "nM", "or", "100", "nM", ")", "for", "indicated", "time", "periods", ".", "Deubiquitination", "of", "D2Ub", "and", "IUb", "was", "assessed", ",", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "Coomassie", "staining", "of", "the", "gels", ",", "as", "well", "as", "by", "western", "blotting", "of", "transferred", "blots", "with", "a", "specific", "FANCD2", "antibody", ".", "USP7", "and", "USP2", "can", "deubiquitinate", "D2Ub", ",", "but", "their", "activity", "towards", "D2Ub", "is", "greatly", "reduced", "in", "the", "presence", "of", "FANCI", "(", "I", ")", "or", "ubiquitinated", "FANCI", "(", "IUb", ")", ".", "Reactions", "were", "set", "-", "up", "as", "in", "A", ",", "but", "with", "100", "nM", "USP7", "or", "USP2", ".", "Deubiquitination", "was", "assessed", ",", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "Coomassie", "staining", ".", "Time", "course", "of", "FANCI", "ubiquitination", "with", "various", "ubiquitin", "mutants", "and", "corresponding", "sensitivity", "/", "resistance", "to", "USP1", "-", "UAF1", "mediated", "deubiquitination", "of", "resulting", "products", ".", "Deubiquitination", "reactions", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "USP1", "-", "UAF1", "(", "100", "nM", ")", "incubated", "for", "30", "minutes", ".", "Time", "course", "of", "USP1", "-", "UAF1", "mediated", "deubiquitination", "of", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "complexes", "consisting", "of", "D2Ub", "a", "50", "base", "pair", "dsDNA", "and", "IUb", "produced", "with", "various", "ubiquitin", "mutants", "or", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "ubiquitin", ".", "Progress", "of", "deubiquitination", "reaction", "was", "assessed", "following", "SDS", "-", "PAGE", ",", "by", "both", "Coomassie", "staining", "of", "the", "gels", ",", "as", "well", "as", "by", "western", "blotting", "of", "transferred", "blots", "with", "a", "specific", "FANCD2", "antibody", ".", "FANCI", "ubiquitination", "with", "indicated", "ubiquitin", "-", "mutants", "(", "or", "WT", ")", "and", "subsequent", "deubiquitination", "of", "resulting", "IUbD2Ub", "-", "DNA", "complexes", "were", "conducted", "twice", ";", "the", "residual", "FANCD2", "ubiquitination", ",", "calculated", "from", "the", "FANCD2", "blots", "for", "each", "time", "-", "point", ",", "was", "plotted", "for", "each", "type", "of", "ubiquitin", "in", "the", "protein", "complex", ",", "and", "corresponding", "deubiquitination", "progress", "curves", "were", "fitted", "using", "a", "one", "-", "phase", "decay", "model", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4USP1-UAF1 can efficiently deubiquitinate D2Ub in the presence or absence of FANCI (I), but not in the presence of ubiquitinated FANCI (IUb). Ubiquitinated FANCD2 (D2Ub) was mixed with a 50 base pair dsDNA and either His6-TEV-V5-FANCI (I), ubiquitinated His6-TEV-V5-FANCI (IUb) or no protein; protein-DNA mixes were subsequently incubated with USP1-UAF1 (at 25 nM or 100 nM) for indicated time periods. Deubiquitination of D2Ub and IUb was assessed, following SDS-PAGE, by Coomassie staining of the gels, as well as by western blotting of transferred blots with a specific FANCD2 antibody.USP7 and USP2 can deubiquitinate D2Ub, but their activity towards D2Ub is greatly reduced in the presence of FANCI (I) or ubiquitinated FANCI (IUb). Reactions were set-up as in A, but with 100 nM USP7 or USP2. Deubiquitination was assessed, following SDS-PAGE, by Coomassie staining.Time course of FANCI ubiquitination with various ubiquitin mutants and corresponding sensitivity/resistance to USP1-UAF1 mediated deubiquitination of resulting products. Deubiquitination reactions in the presence or absence of USP1-UAF1 (100 nM) incubated for 30 minutes.Time course of USP1-UAF1 mediated deubiquitination of IUbD2Ub-DNA complexes consisting of D2Ub a 50 base pair dsDNA and IUb produced with various ubiquitin mutants or wild-type (WT) ubiquitin. Progress of deubiquitination reaction was assessed following SDS-PAGE, by both Coomassie staining of the gels, as well as by western blotting of transferred blots with a specific FANCD2 antibody. FANCI ubiquitination with indicated ubiquitin-mutants (or WT) and subsequent deubiquitination of resulting IUbD2Ub-DNA complexes were conducted twice; the residual FANCD2 ubiquitination, calculated from the FANCD2 blots for each time-point, was plotted for each type of ubiquitin in the protein complex, and corresponding deubiquitination progress curves were fitted using a one-phase decay model."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "the", "α", "-", "AR", "antagonists", "prazosin", ",", "ARC", "239", ",", "doxazosin", ",", "BMY", "7378", ",", "and", "terazosin", ".", "GICs", "were", "treated", "with", "the", "antagonists", "or", "corresponding", "vehicles", "for", "72", "h", ",", "and", "viability", "was", "assayed", "using", "WST", "-", "1", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "GIC", "survival", "using", "trypan", "blue", "exclusion", "after", "24", "h", "and", "72", "h", "of", "treatment", "with", "prazosin", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "C", ".", "Viability", "analysis", "of", "patient", "-", "derived", "GICs", "(", "TG1", ",", "TG16", ",", "GBM5", ",", "GBM44", ")", "and", "NSCs", "(", "NSC24", ",", "NSC25", ",", "NSC5031", ",", "NSC8853", ")", "treated", "with", "prazosin", "for", "72", "h", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "D", ".", "Analysis", "of", "the", "sphere", "-", "forming", "capabilities", "of", "GICs", "using", "the", "extreme", "limiting", "dilution", "assay", ".", "Cells", "were", "seeded", "in", "presence", "of", "vehicle", "or", "30", "µM", "prazosin", "(", "PRZ", ")", ".", "Sphere", "formation", "was", "scored", "10", "days", "post", "-", "seeding", ".", "Frequency", "of", "sphere", "-", "forming", "cells", ":", "Control", "=", "1", "/", "3", ".", "88", "(", "lower", "8", ".", "61", ",", "upper", "1", ".", "95", ")", ";", "prazosin", "1", "/", "248", "(", "lower", "1003", ",", "upper", "62", ")", ",", "n", "=", "12", ",", "p", "=", "1", ".", "13", "10", "-", "10", ".", "Overall", "test", "for", "difference", "in", "stem", "cell", "number", "between", "groups", ".", "E", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "after", "sorting", "cells", "according", "to", "their", "expression", "of", "EGFR", ",", "and", "the", "neural", "stem", "cell", "markers", "CD15", "and", "CD133", ".", "Prazosin", "inhibits", "cell", "viability", "regardless", "of", "CD133", "or", "CD15", "expression", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "F", ".", "Imunocytochemical", "staining", "of", "NSCs", "and", "GICs", "cultured", "in", "media", "favoring", "neuronal", "(", "ß3", "-", "tubulin", ")", ",", "astroglial", "(", "GFAP", ")", "or", "oligodendroglial", "(", "O4", ")", "differentiation", "(", "Diff", "media", ")", ".", "ß3", "-", "tub", ":", "ß3", "-", "tubulin", ".", "G", ".", "Viability", "analysis", "of", "differentiated", "NSCs", "and", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "72", "h", ".", "Diff", ":", "differentiation", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Viability analysis of GICs treated with the α-AR antagonists prazosin, ARC 239, doxazosin, BMY 7378, and terazosin. GICs were treated with the antagonists or corresponding vehicles for 72 h, and viability was assayed using WST-1. *P<0.05, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.B. Quantification of GIC survival using trypan blue exclusion after 24 h and 72 h of treatment with prazosin. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.C. Viability analysis of patient-derived GICs (TG1, TG16, GBM5, GBM44) and NSCs (NSC24, NSC25, NSC5031, NSC8853) treated with prazosin for 72 h. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.D. Analysis of the sphere-forming capabilities of GICs using the extreme limiting dilution assay. Cells were seeded in presence of vehicle or 30 µM prazosin (PRZ). Sphere formation was scored 10 days post-seeding. Frequency of sphere-forming cells: Control=1/3.88 (lower 8.61, upper 1.95); prazosin 1/248 (lower 1003, upper 62), n=12, p= 1.13 10-10. Overall test for difference in stem cell number between groups.E. Viability analysis of GICs treated with prazosin after sorting cells according to their expression of EGFR, and the neural stem cell markers CD15 and CD133. Prazosin inhibits cell viability regardless of CD133 or CD15 expression. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.F. Imunocytochemical staining of NSCs and GICs cultured in media favoring neuronal (ß3-tubulin), astroglial (GFAP) or oligodendroglial (O4) differentiation (Diff media). ß3-tub: ß3-tubulin.G. Viability analysis of differentiated NSCs and GICs treated with prazosin for 72 h. Diff: differentiation. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test."}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "C", ".", "In", "vivo", "effect", "of", "prazosin", "treatment", "(", "1", ".", "5mg", "/", "Kg", ")", "on", "glioblastoma", "growth", ".", "Tumors", "were", "initiated", "with", "GBM44", "GICs", "(", "B", ")", "or", "GMB5", "GICs", "(", "C", ")", ".", "Left", "panels", ":", "Bioluminescent", "in", "vivo", "images", "of", "tumors", "in", "mice", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", "for", "45", "days", ".", "Middle", "panels", ":", "Quantification", "of", "the", "bioluminescent", "signals", ".", "Fold", "change", "in", "total", "flux", "represents", "the", "ratio", ":", "total", "flux", "after", "treatment", "/", "total", "flux", "before", "treatment", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", "and", "*", "P", "=", "0", ".", "003", "for", "GBM44", "and", "GBM5", "respectively", ",", "n", "=", "8", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Right", "panels", ":", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "mice", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", "demonstrating", "a", "significant", "survival", "benefit", "of", "prazosin", "as", "compared", "to", "vehicle", ",", "log", "-", "rank", "Mantel", "-", "Cox", "test", ".", "The", "treatment", "period", "is", "shaded", "in", "gray", ".", "D", ".", "Example", "of", "hematoxilin", "/", "eosin", "staining", "of", "brain", "coronal", "sections", "from", "mice", "sacrificed", "after", "45", "days", "of", "treatment", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", ".", "i", ":", "tumor", "infiltration", ".", "n", ":", "tumor", "necrosis", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "mm", ".", "GBM44", "GICs", ".", "E", ".", "Left", "panel", ":", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "depicting", "the", "percentage", "of", "CD133", "+", "glioblastoma", "cells", "(", "GFP", "+", ")", "isolated", "from", "mice", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", ".", "Tumors", "were", "initiated", "with", "GBM44", "GICs", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "flow", "cytometry", "analyses", "of", "CD133", "expression", "by", "GFP", "+", "-", "tumor", "cells", "isolated", "from", "xenografts", "of", "three", "prazosin", "-", "treated", "(", "PRZ", ")", "mice", "and", "three", "vehicle", "-", "treated", "mice", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "n", "=", "6", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "F", ".", "Secondary", "grafting", "of", "tumor", "cells", "(", "GBM44", "-", "GFP", "+", ")", "isolated", "from", "vehicle", "or", "prazosin", "-", "treated", "mice", "bearing", "primary", "tumors", ".", "Mice", "injected", "with", "glioblastoma", "cells", "isolated", "from", "prazosin", "-", "treated", "mice", "developed", "tumors", "at", "a", "lower", "frequency", "(", "50", "%", "versus", "100", "%", ")", ".", "Moreover", ",", "mice", "injected", "with", "glioblastoma", "cells", "isolated", "from", "prazosin", "-", "treated", "mice", "presented", "a", "statistically", "significant", "survival", "benefit", ".", "Left", "Panel", ":", "Bioluminescent", "in", "vivo", "images", "of", "secondary", "grafts", ".", "Middle", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "bioluminescent", "signals", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ",", "n", "=", "8", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "mice", "bearing", "secondary", "graft", "from", "glioblastoma", "cells", "isolated", "from", "vehicle", "-", "and", "prazosin", "-", "treated", "mice", ".", "G", ".", "Inhibitory", "effect", "of", "low", "doses", "of", "prazosin", "(", "0", ".", "15", "mg", "/", "Kg", ")", "on", "glioblastoma", "growth", "in", "vivo", ".", "Left", "panel", ":", "Bioluminescent", "in", "vivo", "images", "of", "tumors", "in", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "for", "45", "days", ".", "Tumors", "were", "initiated", "with", "GBM44", "GICs", "(", "compare", "with", "panel", "B", ")", ".", "Middle", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "bioluminescent", "signals", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "n", "=", "8", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "mice", "demonstrating", "a", "significant", "survival", "benefit", "of", "a", "treatment", "with", "low", "doses", "of", "prazosin", ",", "log", "-", "rank", "Mantel", "-", "Cox", "test", ".", "The", "treatment", "period", "is", "shaded", "in", "gray", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, C. In vivo effect of prazosin treatment (1.5mg/Kg) on glioblastoma growth. Tumors were initiated with GBM44 GICs (B) or GMB5 GICs (C). Left panels: Bioluminescent in vivo images of tumors in mice treated with prazosin (PRZ) or vehicle for 45 days. Middle panels: Quantification of the bioluminescent signals. Fold change in total flux represents the ratio: total flux after treatment/total flux before treatment. *P=0.0002 and *P=0.003 for GBM44 and GBM5 respectively, n=8, two-sided Mann-Whitney U-test. Right panels: Kaplan-Meyer survival curves of mice treated with prazosin (PRZ) or vehicle demonstrating a significant survival benefit of prazosin as compared to vehicle, log-rank Mantel-Cox test. The treatment period is shaded in gray.D. Example of hematoxilin/eosin staining of brain coronal sections from mice sacrificed after 45 days of treatment with prazosin (PRZ) or vehicle. i: tumor infiltration. n: tumor necrosis. Scale bar = 2 mm. GBM44 GICs.E. Left panel: Representative flow cytometry plots depicting the percentage of CD133+ glioblastoma cells (GFP+) isolated from mice treated with prazosin (PRZ) or vehicle. Tumors were initiated with GBM44 GICs. Right panel: Quantification of flow cytometry analyses of CD133 expression by GFP+-tumor cells isolated from xenografts of three prazosin-treated (PRZ) mice and three vehicle-treated mice. *P=0.0003, n=6, two-sided Mann-Whitney U-test.F. Secondary grafting of tumor cells (GBM44-GFP+) isolated from vehicle or prazosin-treated mice bearing primary tumors. Mice injected with glioblastoma cells isolated from prazosin-treated mice developed tumors at a lower frequency (50% versus 100%). Moreover, mice injected with glioblastoma cells isolated from prazosin-treated mice presented a statistically significant survival benefit. Left Panel: Bioluminescent in vivo images of secondary grafts. Middle panel: Quantification of the bioluminescent signals. *P=0.0004, n=8, two-sided Mann-Whitney U-test. Right panel: Kaplan-Meyer survival curves of mice bearing secondary graft from glioblastoma cells isolated from vehicle- and prazosin-treated mice.G. Inhibitory effect of low doses of prazosin (0.15 mg/Kg) on glioblastoma growth in vivo. Left panel: Bioluminescent in vivo images of tumors in mice treated with vehicle or prazosin (PRZ) for 45 days. Tumors were initiated with GBM44 GICs (compare with panel B). Middle panel: Quantification of the bioluminescent signals. *P=0.0007, n=8, two-sided Mann-Whitney U-test. Right panel: Kaplan-Meyer survival curves of mice demonstrating a significant survival benefit of a treatment with low doses of prazosin, log-rank Mantel-Cox test. The treatment period is shaded in gray."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Viability", "analysis", "of", "GL261", "treated", "with", "prazosin", "in", "vitro", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "C", ".", "Prazosin", "inhibits", "in", "vivo", "tumorgrowth", "in", "an", "immunocompetent", "model", "of", "glioblastoma", ".", "Left", "panel", ":", "Bioluminescent", "in", "vivo", "images", "of", "tumors", "in", "C57", "/", "Bl6mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "for", "14", "days", ".", "Middle", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "bioluminescent", "signals", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "n", "=", "8", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Right", "panel", ":", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "of", "mice", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", ".", "log", "-", "rank", "Mantel", "-", "Cox", "test", ".", "The", "treatment", "period", "is", "shaded", "in", "gray", ".", "D", ".", "Hematoxilin", "/", "eosin", "staining", "of", "C57", "/", "Bl6", "mice", "brain", "coronal", "sections", "sacrificed", "after", "14", "days", "of", "treatment", "with", "prazosin", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "mm", ".", "E", ".", "Fluorescence", "imaging", "of", "GL261", "intra", "-", "striatal", "grafts", "at", "1", "and", "2", "h", "after", "an", "intra", "-", "peritoneal", "injection", "of", "BODIPY", "FL", "prazosin", ",", "the", "green", "-", "fluorescent", "derivative", "of", "prazosin", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Viability analysis of GL261 treated with prazosin in vitro. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.C. Prazosin inhibits in vivo tumorgrowth in an immunocompetent model of glioblastoma. Left panel: Bioluminescent in vivo images of tumors in C57/Bl6mice treated with vehicle or prazosin (PRZ) for 14 days.Middle panel: Quantification of the bioluminescent signals. *P=0.0002, n=8, two-sided Mann-Whitney U-test. Right panel: Kaplan-Meyer survival curves of mice treated with prazosin (PRZ) or vehicle. log-rank Mantel-Cox test. The treatment period is shaded in gray.D. Hematoxilin/eosin staining of C57/Bl6 mice brain coronal sections sacrificed after 14 days of treatment with prazosin. Scale bar = 2 mm.E. Fluorescence imaging of GL261 intra-striatal grafts at 1 and 2 h after an intra-peritoneal injection of BODIPY FL prazosin, the green-fluorescent derivative of prazosin. Scale bar = 2 mm."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Immunoblotting", "for", "pro", "-", "caspase", "-", "3", "(", "pro", "-", "CASP3", ")", "and", "active", "caspase", "-", "3", "(", "CASP3", ")", "in", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", "(", "V", ")", "demonstrating", "that", "prazosin", "activates", "caspase", "-", "3", ".", "ZVAD", ",", "a", "caspase", "inhibitor", ",", "prevents", "prazosin", "-", "induced", "caspase", "-", "3", "activation", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "B", ".", "Immunoblotting", "for", "pro", "-", "caspase", "-", "9", "(", "pro", "-", "CASP9", ")", "and", "active", "caspase", "-", "9", "(", "CASP9", ")", "in", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "or", "vehicle", "(", "V", ")", "demonstrating", "that", "prazosin", "does", "not", "activate", "caspase", "-", "9", ".", "C", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "24h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ZVAD", ",", "a", "caspase", "inhibitor", ".", "ZVAD", "counteracts", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "D", ".", "Prazosin", "induces", "glioblastoma", "cell", "apoptosis", "in", "vivo", ".", "GFP", "+", "and", "GFP", "-", "cells", "were", "analyzed", "from", "tumors", "in", "vehicle", "or", "prazosin", "-", "treated", "mice", ".", "Annexin", "V", "/", "DAPI", "staining", "was", "used", "to", "identify", "apoptotic", "cells", "by", "FACS", ".", "Tumors", "were", "initiated", "by", "GBM44", "GICs", "implantation", ".", "E", ".", "Dose", "-", "response", "curve", "of", "prazosin", "on", "GIC", "survival", "(", "24h", "treatment", ")", ".", "EC50", "was", "determined", "with", "curve", "fit", "using", "nonlinear", "regression", ".", "F", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "24h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cirazoline", ",", "a", "subtype", "agonist", "of", "the", "α", "-", "ARs", ".", "Cirazoline", "did", "not", "alter", "GIC", "survival", "and", "counteracted", "only", "poorly", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "G", ".", "Membrane", "binding", "assays", "demonstrating", "the", "absence", "of", "prazosin", "binding", "sites", "in", "GIC", "membrane", "preparations", ".", "Positive", "control", "shows", "that", "prazosin", "binds", "to", "membrane", "preparations", "of", "yeast", "expressing", "1", "-", "AR", ".", "PRZ", ":", "prazosin", ".", "CRZ", ":", "cirazoline", ".", "H", ".", "Immunoblotting", "for", "phosphorylated", "ERK1", "/", "2", "(", "P", "-", "ERK1", "/", "2", ")", "and", "total", "ERK1", "/", "2", "following", "prazosin", "treatment", "for", "30", "min", ".", "Prazosin", "induces", "ERK1", "/", "2", "phosphorylation", "in", "GICs", ".", "I", ".", "SRE", "-", "luciferase", "reporter", "activity", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "in", "absence", "or", "presence", "of", "U0126", "(", "10", "μM", ")", ",", "an", "inhibitor", "of", "the", "ERK", "-", "activating", "kinase", "MEK", ".", "U0126", "prevented", "prazosin", "-", "induced", "SRE", "-", "luciferase", "activation", "in", "GICs", ".", "J", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "24", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "U0126", "(", "10", "μM", ")", ",", "an", "inhibitor", "of", "the", "ERK", "-", "activating", "kinase", "MEK", ".", "U0126", "did", "not", "counteract", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "Blockade", "of", "prazosin", "-", "induced", "ERK1", "/", "2", "phosphorylation", "by", "U0126", "was", "confirmed", "by", "immunoblotting", "(", "insert", ")", ".", "PRZ", ":", "prazosin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Immunoblotting for pro-caspase-3 (pro-CASP3) and active caspase-3 (CASP3) in GICs treated with prazosin (PRZ) or vehicle (V) demonstrating that prazosin activates caspase-3. ZVAD, a caspase inhibitor, prevents prazosin-induced caspase-3 activation. kDa: kilodaltons.B. Immunoblotting for pro-caspase-9 (pro-CASP9) and active caspase-9 (CASP9) in GICs treated with prazosin (PRZ) or vehicle (V) demonstrating that prazosin does not activate caspase-9.C. Viability analysis of GICs treated with prazosin for 24h in the presence or absence of ZVAD, a caspase inhibitor. ZVAD counteracts prazosin-induced GIC death. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.D. Prazosin induces glioblastoma cell apoptosis in vivo. GFP+ and GFP- cells were analyzed from tumors in vehicle or prazosin-treated mice. Annexin V / DAPI staining was used to identify apoptotic cells by FACS. Tumors were initiated by GBM44 GICs implantation.E. Dose-response curve of prazosin on GIC survival (24h treatment). EC50 was determined with curve fit using nonlinear regression.F. Viability analysis of GICs treated with prazosin for 24h in the presence or absence of cirazoline, a subtype agonist of the α-ARs. Cirazoline did not alter GIC survival and counteracted only poorly prazosin-induced GIC death. *P<0.05, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.G. Membrane binding assays demonstrating the absence of prazosin binding sites in GIC membrane preparations. Positive control shows that prazosin binds to membrane preparations of yeast expressing 1-AR. PRZ: prazosin. CRZ: cirazoline.H. Immunoblotting for phosphorylated ERK1/2 (P-ERK1/2) and total ERK1/2 following prazosin treatment for 30 min. Prazosin induces ERK1/2 phosphorylation in GICs.I. SRE-luciferase reporter activity analysis of GICs treated with prazosin in absence or presence of U0126 (10 μM), an inhibitor of the ERK-activating kinase MEK. U0126 prevented prazosin-induced SRE-luciferase activation in GICs.J. Viability analysis of GICs treated with prazosin for 24 h in the presence or absence of U0126 (10 μM), an inhibitor of the ERK-activating kinase MEK. U0126 did not counteract prazosin-induced GIC death. Blockade of prazosin-induced ERK1/2 phosphorylation by U0126 was confirmed by immunoblotting (insert). PRZ: prazosin."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "PKCδ", "expression", "analysis", "in", "two", "patient", "-", "derived", "GICs", "and", "NSCs", "by", "immunoblotting", ".", "GICs", "express", "higher", "levels", "of", "PKCδ", "than", "NSCs", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "B", ".", "PKCδ", "by", "immunostaining", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Enhanced", "PKCδ", "punctate", "nuclear", "expression", "in", "prazosin", "-", "treated", "(", "PRZ", ",", "5µM", ")", "GICs", ",", "as", "compared", "to", "vehicle", "-", "treated", "GICs", ".", "PRZ", ":", "prazosin", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "C", ".", "Total", "PKCδ", "(", "PKCδ", "78kDa", ")", "and", "cleaved", "PKCδ", "(", "PKCδ", "41kDa", ")", "expression", "analysis", "in", "GICs", "by", "immunoblotting", ".", "Prazosin", "(", "PRZ", ")", "induces", "PKCδ", "cleavage", "into", "a", "41kDa", "active", "fragment", ".", "2", "µM", "rottlerin", "(", "Rott", ")", ",", "a", "PKCδ", "inhibitor", ",", "inhibits", "prazosin", "-", "induced", "PKCδ", "cleavage", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "D", ".", "Pro", "-", "caspase", "-", "3", "(", "Pro", "-", "CASP3", ")", "and", "activated", "caspase", "-", "3", "(", "CASP3", ")", "expression", "analysis", "in", "GICs", "by", "immunoblotting", ".", "2", "µM", "rottlerin", "(", "Rott", ")", "inhibits", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "-", "induced", "caspase", "-", "3", "activation", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "E", ".", "Inhibition", "of", "PKCδ", "by", "rottlerin", "prevents", ",", "in", "a", "concentration", "-", "dependent", "manner", ",", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "72", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "rottlerin", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ",", "n", "=", "4", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "F", ".", "Inhibition", "of", "PKCδ", "by", "the", "specific", "anti", "-", "PKCδ", "RACK", "peptide", "δV1", ".", "1", "(", "10", "μM", ")", "counteracts", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "treated", "with", "prazosin", "for", "72", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "δV1", ".", "1", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "for", "Prazosin", "1", "and", "5", "µM", "and", "P", "<", "0", ".", "001", "for", "Prazosin", "10", "µM", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "4", ".", "G", ".", "Decreased", "PKCδ", "expression", "using", "shRNA", "counteracts", "prazosin", "-", "induced", "GIC", "death", ".", "Viability", "analysis", "of", "GICs", "transduced", "with", "scrambled", "or", "PKCδ", "shRNA", "and", "treated", "with", "prazosin", "for", "72", "h", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "4", ".", "H", ".", "Prazosin", "inhibits", "AKT", "phosphorylation", "in", "GICs", ".", "LY294002", "(", "LY", ",", "30", "µM", ")", ",", "an", "inhibitor", "of", "the", "PI3K", "/", "AKT", "pathway", ",", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "Terazosin", ",", "which", "does", "not", "affect", "GIC", "viability", ",", "does", "not", "alter", "AKT", "phosphorylation", "(", "see", "the", "corresponding", "cell", "viability", "counting", "in", "Fig", "EV4C", ")", ".", "Phosphorylated", "AKT", "(", "P", "-", "AKT", ")", "and", "total", "AKT", "(", "AKT", ")", "expression", "analysis", "in", "GICs", "by", "immunoblotting", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "I", ".", "Prazosin", "(", "10", "µM", ")", "does", "not", "inhibit", "AKT", "phosphorylation", "in", "NSCs", ".", "Analysis", "by", "immunoblotting", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "J", ".", "β", "-", "catenin", "expression", ",", "a", "downstream", "target", "of", "AKT", ",", "is", "decreased", "in", "prazosin", "-", "treated", "GICs", ",", "as", "opposed", "to", "NSCs", ".", "Analysis", "by", "immunoblotting", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", ".", "K", ".", "L", ".", "Inhibition", "of", "PKCδ", "using", "rottlerin", "(", "Rott", ",", "2", "µM", ")", "or", "δV1", ".", "1", "(", "10", "µM", ")", "counteracts", "prazosin", "inhibition", "of", "AKT", "phosphorylation", ".", "Analysis", "by", "immunoblotting", ".", "V", ":", "vehicle", ".", "kDa", ":", "kilodaltons", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. PKCδ expression analysis in two patient-derived GICs and NSCs by immunoblotting. GICs express higher levels of PKCδ than NSCs. kDa: kilodaltons.B. PKCδ by immunostaining (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Enhanced PKCδ punctate nuclear expression in prazosin-treated (PRZ, 5µM) GICs, as compared to vehicle-treated GICs. PRZ: prazosin. Scale bar: 10 µm.C. Total PKCδ (PKCδ 78kDa) and cleaved PKCδ (PKCδ 41kDa) expression analysis in GICs by immunoblotting. Prazosin (PRZ) induces PKCδ cleavage into a 41kDa active fragment. 2 µM rottlerin (Rott), a PKCδ inhibitor, inhibits prazosin-induced PKCδ cleavage. V: vehicle. kDa: kilodaltons.D. Pro-caspase-3 (Pro-CASP3) and activated caspase-3 (CASP3) expression analysis in GICs by immunoblotting. 2 µM rottlerin (Rott) inhibits prazosin (PRZ)-induced caspase-3 activation. V: vehicle. kDa: kilodaltons.E. Inhibition of PKCδ by rottlerin prevents, in a concentration-dependent manner, prazosin-induced GIC death. Viability analysis of GICs treated with prazosin for 72 h in the presence or absence of rottlerin. *P=0.0286, n=4, two-sided Mann-Whitney U-test.F. Inhibition of PKCδ by the specific anti-PKCδ RACK peptide δV1.1 (10 μM) counteracts prazosin-induced GIC death. Viability analysis of GICs treated with prazosin for 72 h in the presence or absence of δV1.1. *P < 0.005 for Prazosin 1 and 5 µM and P<0.001 for Prazosin 10 µM by two-tailed unpaired Student's t-test, n=4.G. Decreased PKCδ expression using shRNA counteracts prazosin-induced GIC death. Viability analysis of GICs transduced with scrambled or PKCδ shRNA and treated with prazosin for 72 h. *P < 0.005 by two-tailed unpaired Student's t-test, n=4.H. Prazosin inhibits AKT phosphorylation in GICs. LY294002 (LY, 30 µM), an inhibitor of the PI3K/AKT pathway, was used as positive control. Terazosin, which does not affect GIC viability, does not alter AKT phosphorylation (see the corresponding cell viability counting in Fig EV4C). Phosphorylated AKT (P-AKT) and total AKT (AKT) expression analysis in GICs by immunoblotting. V: vehicle. kDa: kilodaltons.I. Prazosin (10 µM) does not inhibit AKT phosphorylation in NSCs. Analysis by immunoblotting. V: vehicle. kDa: kilodaltons.J. β-catenin expression, a downstream target of AKT, is decreased in prazosin-treated GICs, as opposed to NSCs. Analysis by immunoblotting. V: vehicle. kDa: kilodaltons.K. L. Inhibition of PKCδ using rottlerin (Rott, 2 µM) or δV1.1 (10 µM) counteracts prazosin inhibition of AKT phosphorylation. Analysis by immunoblotting. V: vehicle. kDa: kilodaltons."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Bioluminescent", "in", "vivo", "images", "of", "tumors", "in", "mice", "grafted", "with", "GICs", "expressing", "either", "scrambled", "or", "PKCδ", "shRNA", ".", "All", "mice", "were", "treated", "with", "prazosin", "(", "PRZ", ")", "for", "45", "days", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "bioluminescent", "signals", "showing", "that", "decreased", "expression", "of", "PKC", "counteracts", "prazosin", "inhibition", "of", "tumor", "growth", ".", "Fold", "change", "in", "total", "flux", "represents", "the", "ratio", ":", "total", "flux", "after", "treatment", "/", "total", "flux", "prior", "treatment", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "n", "=", "8", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Bioluminescent in vivo images of tumors in mice grafted with GICs expressing either scrambled or PKCδ shRNA. All mice were treated with prazosin (PRZ) for 45 days.C. Quantification of the bioluminescent signals showing that decreased expression of PKC counteracts prazosin inhibition of tumor growth. Fold change in total flux represents the ratio: total flux after treatment/total flux prior treatment. *P=0.0007, n=8, two-sided Mann-Whitney U-test."}
{"words": ["Figure", "1Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", ",", "snc1", ",", "and", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "SNIPER1", "OE", "into", "snc1", "background", ".", "OE", "stands", "for", "overexpression", "of", "SNIPER1", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "SNIPER1", "gene", "expression", "in", "the", "indicated", "plants", "as", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Quantification", "of", "H", ".", "a", ".", "Noco2", "sporulation", "in", "the", "indicated", "genotypes", "7", "days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", "with", "105", "spores", "per", "ml", "water", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Growth", "of", "P", ".", "s", ".", "m", ".", "ES4326", "on", "four", "-", "week", "-", "old", "leaves", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "0", "and", "3", "dpi", "with", "bacterial", "inoculum", "of", "OD600", "=", "0", ".", "001", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "for", "day", "0", ";", "n", "=", "5", "for", "day", "3", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "SNIPER1", "OE", "in", "Col", "-", "0", "background", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "No", "difference", "in", "growth", "and", "development", "was", "observed", ".", "SNIPER1", "gene", "expression", "in", "the", "indicated", "plants", "as", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Quantification", "of", "H", ".", "a", ".", "Noco2", "sporulation", "in", "the", "indicated", "genotypes", "7", "days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", "with", "105", "spores", "per", "ml", "water", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Growth", "of", "P", ".", "s", ".", "t", ".", "DC3000", "on", "four", "-", "week", "-", "old", "leaves", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "0", "and", "3", "dpi", "with", "bacterial", "inoculum", "of", "OD600", "=", "0", ".", "001", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "for", "day", "0", ";", "n", "=", "5", "for", "day", "3", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0, snc1, and two independent transgenic lines of SNIPER1 OE into snc1 background. OE stands for overexpression of SNIPER1. Scale bar = 1 cm. SNIPER1 gene expression in the indicated plants as determined by RT-PCR. Error bars represent mean ± SD (n = 3). Two independent experiments were carried out with similar results. Quantification of H.a. Noco2 sporulation in the indicated genotypes 7 days post inoculation (dpi) with 105 spores per ml water. Error bars represent mean ± SD (n=4). Three independent experiments were carried out with similar results. Growth of P.s.m. ES4326 on four-week-old leaves of the indicated genotypes at 0 and 3 dpi with bacterial inoculum of OD600 = 0.001. Error bars represent mean ± SD (n=4 for day 0; n=5 for day 3). Three independent experiments were carried out with similar results.Morphology of four-week-old soil-grown plants of two independent transgenic lines of SNIPER1 OE in Col-0 background. Scale bar = 1 cm. No difference in growth and development was observed. SNIPER1 gene expression in the indicated plants as determined by RT-PCR. Error bars represent mean ± SD (n = 3). Two independent experiments were carried out with similar results. Quantification of H.a. Noco2 sporulation in the indicated genotypes 7 days post inoculation (dpi) with 105 spores per ml water. Error bars represent mean ± SD (n=4). Three independent experiments were carried out with similar results. Growth of P.s.t. DC3000 on four-week-old leaves of the indicated genotypes at 0 and 3 dpi with bacterial inoculum of OD600 = 0.001. Error bars represent mean ± SD (n=4 for day 0; n=5 for day 3). Three independent experiments were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "2Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", ",", "chs1", "-", "2", "(", "A", ")", ",", "chs2", "-", "1", "(", "B", ")", "and", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "SNIPER1", "OE", "into", "chs1", "-", "2", "(", "A", ")", "and", "chs2", "-", "1", "(", "B", ")", "backgrounds", ".", "Plants", "were", "grown", "at", "16", "°", "C", "under", "long", "day", "conditions", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", ",", "chs3", "-", "2D", "(", "C", ")", ",", "snc2", "-", "1D", "eds5", "npr1", "(", "D", ")", "and", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "SNIPER1", "OE", "into", "chs3", "-", "2D", "(", "C", ")", "and", "snc2", "-", "1D", "eds5", "npr1", "(", "D", ")", "backgrounds", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0, chs1-2 (A), chs2-1 (B) and two independent transgenic lines of SNIPER1 OE into chs1-2 (A) and chs2-1 (B) backgrounds. Plants were grown at 16 °C under long day conditions. Scale bar = 1 cm.Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0, chs3-2D (C), snc2-1D eds5 npr1 (D) and two independent transgenic lines of SNIPER1 OE into chs3-2D (C) and snc2-1D eds5 npr1 (D) backgrounds. Scale bar = 1 cm."}
{"words": ["Figure", "3Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", ",", "mekk1", "-", "5", "ndr1", ",", "and", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "SNIPER1", "OE", "into", "mekk1", "-", "5", "ndr1", "background", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "The", "mekk1", "ndr1", "double", "mutant", "was", "used", "instead", "of", "the", "mekk1", "-", "5", "single", "mutant", "is", "to", "overcome", "the", "sterility", ".", "SNIPER1", "gene", "expression", "in", "the", "indicated", "plants", "as", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Quantification", "of", "H", ".", "a", ".", "Noco2", "sporulation", "in", "the", "indicated", "genotypes", "7", "days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", "with", "105", "spores", "per", "ml", "water", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Growth", "of", "P", ".", "s", ".", "m", ".", "ES4326", "on", "four", "-", "week", "-", "old", "leaves", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "0", "and", "3", "dpi", "with", "bacterial", "inoculum", "of", "OD600", "=", "0", ".", "001", ".", "mn", "stands", "for", "mekk1", "-", "5", "ndr1", "double", "mutant", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "using", "E", ".", " ", "coli", "-", "expressed", "SNIPER1", "-", "myc", "(", "E3", ")", ",", "AtUBC8", "(", "E2", ")", ",", "AtUBA1", "(", "E1", ")", "and", "/", "or", "HIS", "-", "FLAG", "-", "Ubiquitin", ".", "The", "molecular", "mass", "markers", "are", "indicated", "on", "the", "left", "(", "kDa", ")", ".", "Asterisk", "indicates", "SNIPER1", "-", "myc", ".", "Arrow", "points", "to", "His", "-", "FLAG", "-", "Ub", "and", "straight", "lines", "on", "the", "right", "indicate", "self", "-", "ubiquitinated", "SNIPER1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0, mekk1-5 ndr1, and two independent transgenic lines of SNIPER1 OE into mekk1-5 ndr1 background. Scale bar = 1 cm. The mekk1 ndr1 double mutant was used instead of the mekk1-5 single mutant is to overcome the sterility. SNIPER1 gene expression in the indicated plants as determined by RT-PCR. Error bars represent mean ± SD (n = 3). Two independent experiments were carried out with similar results. Quantification of H.a. Noco2 sporulation in the indicated genotypes 7 days post inoculation (dpi) with 105 spores per ml water. Error bars represent mean ± SD (n=4). Three independent experiments were carried out with similar results. Growth of P.s.m. ES4326 on four-week-old leaves of the indicated genotypes at 0 and 3 dpi with bacterial inoculum of OD600 = 0.001. mn stands for mekk1-5 ndr1 double mutant. Error bars represent mean ± SD (n=4). Three independent experiments were carried out with similar results.In vitro ubiquitination assay using E. coli-expressed SNIPER1-myc (E3), AtUBC8 (E2), AtUBA1 (E1) and/or HIS-FLAG-Ubiquitin. The molecular mass markers are indicated on the left (kDa). Asterisk indicates SNIPER1-myc. Arrow points to His-FLAG-Ub and straight lines on the right indicate self-ubiquitinated SNIPER1."}
{"words": ["Figure", "4Immunoblot", "analysis", "of", "SNC1", "(", "A", "-", "B", ")", ",", "SUMM2", "-", "3HA", "(", "C", ")", ",", "RPS4HA", "(", "D", ")", ",", "RPP4myc", "(", "E", ")", ",", "RPS2HA", "(", "F", ")", "and", "RPM1myc", "(", "G", ")", "protein", "levels", "in", "the", "indicated", "genotypes", ".", "For", "all", "panels", ",", "equal", "loading", "is", "shown", "by", "Ponceau", "S", "staining", "of", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "The", "numbers", "below", "represent", "the", "normalized", "ratio", "between", "the", "intensity", "of", "the", "protein", "band", "and", "the", "Ponceau", "S", "band", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Molecular", "mass", "marker", "in", "kilo", "Daltons", "is", "indicated", "on", "the", "left", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblot analysis of SNC1 (A-B), SUMM2-3HA (C), RPS4HA (D), RPP4myc (E), RPS2HA (F) and RPM1myc (G) protein levels in the indicated genotypes. For all panels, equal loading is shown by Ponceau S staining of a non-specific band. The numbers below represent the normalized ratio between the intensity of the protein band and the Ponceau S band ± SD (n=3). Molecular mass marker in kilo Daltons is indicated on the left. Three independent experiments were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "5Growth", "of", "P", ".", "s", ".", "t", ".", "avrRps4", "(", "A", ")", ",", "avrRpt2", "(", "B", ")", "and", "avrRpm1", "(", "C", ")", "on", "four", "-", "week", "-", "old", "leaves", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "3", "dpi", "with", "bacterial", "inoculum", "of", "OD600", "=", "0", ".", "0001", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Appendix", "Figure", "S4", "shows", "the", "growth", "of", "P", ".", "s", ".", "t", ".", "avrRps4", ",", "avrRpt2", "and", "avrRpm1", "at", "0", "dpi", ".", "Quantification", "of", "H", ".", "a", ".", "Emwa1", "sporulation", "in", "the", "indicated", "genotypes", "7", "days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", "with", "105", "spores", "per", "ml", "water", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Growth of P.s.t. avrRps4 (A), avrRpt2 (B) and avrRpm1 (C) on four-week-old leaves of the indicated genotypes at 3 dpi with bacterial inoculum of OD600 = 0.0001. Error bars represent mean ± SD (n=5). Three independent experiments were carried out with similar results. Appendix Figure S4 shows the growth of P.s.t. avrRps4, avrRpt2 and avrRpm1 at 0 dpi. Quantification of H.a. Emwa1 sporulation in the indicated genotypes 7 days post inoculation (dpi) with 105 spores per ml water. Error bars represent mean ± SD (n=4). Three independent experiments were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "6Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", "and", "two", "independent", "transgenic", "lines", "of", "35S", "-", "SNIPER1H129Y", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "PR1", "and", "PR2", "gene", "expression", "in", "the", "indicated", "plants", "as", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Morphology", "of", "four", "-", "week", "-", "old", "soil", "-", "grown", "plants", "of", "Col", "-", "0", ",", "sniper1", "-", "1", ",", "sniper2", "-", "1", ",", "eds1", "-", "2", ",", "SNIPER1H129Y", ",", "SNIPER1H129Y", "eds1", "-", "2", ",", "sniper1", "-", "1", "sniper2", "-", "1", "eds1", "-", "2", "and", "sniper1", "-", "c1", "sniper2", "-", "1", "eds1", "-", "2", ".", "sniper1", "-", "1", "is", "an", "exonic", "T", "-", "DNA", "insertional", "mutant", ".", "sniper1", "-", "c1", "is", "a", "SNIPER1", "knockout", "mutant", "containing", "807bp", "deletion", "that", "was", "generated", "by", "CRISPR", "-", "Cas9", "system", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "Quantification", "of", "H", ".", "a", ".", "Noco2", "sporulation", "in", "the", "indicated", "plants", "7", "days", "post", "inoculation", "(", "dpi", ")", "with", "105", "spores", "per", "ml", "water", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Immunoblot", "of", "RPS4HA", "(", "E", ")", ",", "SNC1", "(", "F", ")", ",", "RPS2HA", "(", "G", ")", ",", "and", "RPM1myc", "(", "H", ")", "in", "SNIPER1H129Y", "background", ".", "Equal", "loading", "is", "shown", "by", "Ponceau", "S", "staining", "of", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "The", "numbers", "below", "represent", "the", "normalized", "ratio", "between", "the", "intensity", "of", "the", "protein", "band", "and", "the", "Ponceau", "S", "band", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Molecular", "mass", "marker", "in", "kilo", "Daltons", "is", "indicated", "on", "the", "left", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0 and two independent transgenic lines of 35S-SNIPER1H129Y. Scale bar = 1 cm.PR1 and PR2 gene expression in the indicated plants as determined by RT-PCR. Error bars represent mean ± SD (n = 3). Two independent experiments were carried out with similar results.Morphology of four-week-old soil-grown plants of Col-0, sniper1-1, sniper2-1, eds1-2, SNIPER1H129Y, SNIPER1H129Y eds1-2, sniper1-1 sniper2-1 eds1-2 and sniper1-c1 sniper2-1 eds1-2. sniper1-1 is an exonic T-DNA insertional mutant. sniper1-c1 is a SNIPER1 knockout mutant containing 807bp deletion that was generated by CRISPR-Cas9 system. Scale bar = 1 cm.Quantification of H.a. Noco2 sporulation in the indicated plants 7 days post inoculation (dpi) with 105 spores per ml water. Error bars represent mean ± SD (n=4). Two independent experiments were carried out with similar results.Immunoblot of RPS4HA (E), SNC1 (F), RPS2HA (G), and RPM1myc (H) in SNIPER1H129Y background. Equal loading is shown by Ponceau S staining of a non-specific band. The numbers below represent the normalized ratio between the intensity of the protein band and the Ponceau S band ± SD (n=3). Molecular mass marker in kilo Daltons is indicated on the left. Three independent experiments were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "7Immunoprecipitation", "and", "biotinylation", "of", "SUMM2NB", "-", "FLAG", "(", "A", ")", ",", "RPP4NB", "-", "FLAG", "(", "B", ")", ",", "or", "CHS1NB", "-", "FLAG", "(", "C", ")", "by", "SNIPER1", "H129Y", "-", "HATurboID", "in", "N", ".", "benthamiana", ".", "Two", "biological", "repeats", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", ".", "Interaction", "of", "SNIPER1", "H129Y", "-", "CLuc", "and", "SUMM2NB", "-", "NLuc", "(", "D", ")", ",", "RPP4NB", "-", "NLuc", "(", "E", ")", "or", "CHS1NB", "-", "NLuc", "(", "F", ")", "as", "tested", "by", "split", "-", "luciferase", "complementary", "assay", "in", "N", ".", "benthamiana", ".", "Three", "biological", "repeats", "with", "four", "technical", "repeats", "each", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Immunoprecipitation and biotinylation of SUMM2NB-FLAG (A), RPP4NB-FLAG (B), or CHS1NB-FLAG (C) by SNIPER1 H129Y-HATurboID in N. benthamiana. Two biological repeats were carried out with similar results.Interaction of SNIPER1 H129Y-CLuc and SUMM2NB-NLuc (D), RPP4NB-NLuc (E) or CHS1NB-NLuc (F) as tested by split-luciferase complementary assay in N. benthamiana. Three biological repeats with four technical repeats each were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "8Ubiquitination", "of", "the", "NB", "domains", "from", "SUMM2", "(", "A", ")", ",", "RPP4", "(", "B", ")", "and", "CHS1", "(", "C", ")", ".", "Immunoblot", "of", "bacterial", "lysates", "form", "E", ".", "coil", "strains", "expressing", "AtUBA1", "-", "S", ",", "MBP", "-", "NB", "-", "HA", ",", "AtUBC8", "-", "S", ",", "HIS", "-", "FLAG", "-", "UBQ10", "and", "SNIPER1", "-", "myc", ",", "or", "strains", "without", "one", "of", "these", "components", ".", "Two", "biological", "repeats", "were", "carried", "out", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Ubiquitination of the NB domains from SUMM2 (A), RPP4 (B) and CHS1 (C). Immunoblot of bacterial lysates form E. coil strains expressing AtUBA1-S, MBP-NB-HA, AtUBC8-S, HIS-FLAG-UBQ10 and SNIPER1-myc, or strains without one of these components. Two biological repeats were carried out with similar results."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "G", ")", "Reduced", "NMDA", "/", "AMPA", "ratio", "at", "SC", "-", "CA1", "synapses", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "P17", "-", "21", ")", ".", "The", "NMDAR", "component", "was", "obtained", "60", "ms", "after", "stimulation", ".", "(", "ratio", ",", "n", "=", "11", "cells", "from", "8", "mice", "for", "WT", "and", "8", "(", "8", ")", "for", "ΔC", ";", "decay", ",", "n", "=", "12", "cells", "from", "8", "mice", "for", "WT", "and", "11", "(", "8", ")", "for", "ΔC", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Reduced", "amplitude", "but", "not", "frequency", "of", "NMDA", "-", "mEPSCs", "at", "PtenΔC", "/", "ΔC", "CA1", "pyramidal", "neurons", ".", "(", "n", "=", "17", "cells", "from", "4", "mice", "for", "WT", "and", "18", "(", "4", ")", "for", "ΔC", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "I", ")", "Reduced", "NMDA", "/", "AMPA", "ratio", "at", "synapses", "in", "layer", "II", "/", "III", "pyramidal", "neurons", "in", "the", "prelimbic", "region", "of", "the", "mPFC", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "P20", "-", "21", ")", ".", "The", "NMDAR", "component", "was", "obtained", "60", "ms", "after", "stimulation", ".", "(", "n", "=", "9", "cells", "from", "3", "mice", "for", "WT", "and", "10", "(", "3", ")", "for", "ΔC", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "(", "C", "-", "F", ")", "Results", "from", "the", "last", "10", "-", "minute", "recordings", "are", "shown", "in", "scatter", "plots", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(G) Reduced NMDA/AMPA ratio at SC-CA1 synapses of PtenΔC/ΔC mice (P17-21). The NMDAR component was obtained 60 ms after stimulation. (ratio, n = 11 cells from 8 mice for WT and 8 (8) for ΔC; decay, n = 12 cells from 8 mice for WT and 11 (8) for ΔC, **P < 0.01, ns, not significant, Mann-Whitney U test). The error bars represent SEM. (H) Reduced amplitude but not frequency of NMDA -mEPSCs at PtenΔC/ΔC CA1 pyramidal neurons. (n = 17 cells from 4 mice for WT and 18 (4) for ΔC, **P < 0.01, ns, not significant, Mann-Whitney U test, Student's t-test). The error bars represent SEM. (I) Reduced NMDA/AMPA ratio at synapses in layer II/III pyramidal neurons in the prelimbic region of the mPFC of PtenΔC/ΔC mice (P20-21). The NMDAR component was obtained 60 ms after stimulation. (n = 9 cells from 3 mice for WT and 10 (3) for ΔC, *P < 0.05, **P < 0.01, Student's t-test, Mann-Whitney U test). The error bars represent SEM. Data information: (C-F) Results from the last 10-minute recordings are shown in scatter plots. "}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "A", "volcano", "plot", "showing", "DEGs", "(", "adjusted", "p", "value", "<", "0", ".", "1", ")", "derived", "from", "RNA", "-", "Seq", "results", "for", "PtenΔC", "/", "ΔC", "and", "WT", "mice", "(", "P21", ")", ".", "For", "the", "calculation", "of", "adjusted", "p", "value", ",", "we", "have", "employed", "the", "R", "package", "DESeq2", "where", "the", "P", "‐", "values", "obtained", "by", "the", "Wald", "test", "are", "corrected", "for", "multiple", "testing", "using", "the", "Benjamini", "and", "Hochberg", "method", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "WT", "and", "ΔC", ")", ".", "See", "also", "Dataset", "EV1", "for", "the", "full", "RNA", "-", "Seq", "results", ".", "C", ")", "Immunoblot", "validation", "of", "the", "increase", "in", "SLC6A20", "protein", "levels", "in", "hippocampal", "lysates", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "P21", ")", ".", "We", "denoted", "the", "antibody", "as", "'", "SLC6A20", "'", "here", ",", "not", "'", "SLC6A20A", "'", ",", "because", "this", "antibody", "was", "generated", "using", "a", "synthetic", "peptide", "sequence", "(", "YNEPSNNCQKHAI", ")", "that", "is", "commonly", "present", "in", "SLC6A20A", "and", "SLC6A20B", ",", "being", "a", "pan", "-", "SLC6A20", "antibody", "(", "ThermoFisher", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "WT", "and", "∆", "C", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Increased", "phosphorylation", "of", "β", "-", "catenin", "at", "Ser", "-", "675", "but", "not", "at", "Ser", "-", "552", "in", "the", "nucleus", "-", "enriched", "P1", "fraction", "but", "not", "in", "whole", "-", "brain", "lysates", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "3", "months", ")", ".", "Note", "that", "total", "levels", "of", "β", "-", "catenin", "were", "not", "changed", "in", "the", "P1", "fraction", "or", "whole", "-", "brain", "lysates", ".", "(", "n", "=", "4", "mice", "for", "WT", "-", "WB", "/", "P1", "and", "ΔC", "-", "WB", "/", "P1", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) A volcano plot showing DEGs (adjusted p value < 0.1) derived from RNA-Seq results for PtenΔC/ΔC and WT mice (P21). For the calculation of adjusted p value, we have employed the R package DESeq2 where the P‐values obtained by the Wald test are corrected for multiple testing using the Benjamini and Hochberg method. (n = 3 mice for WT and ΔC). See also Dataset EV1 for the full RNA-Seq results.C) Immunoblot validation of the increase in SLC6A20 protein levels in hippocampal lysates of PtenΔC/ΔC mice (P21). We denoted the antibody as 'SLC6A20' here, not 'SLC6A20A', because this antibody was generated using a synthetic peptide sequence (YNEPSNNCQKHAI) that is commonly present in SLC6A20A and SLC6A20B, being a pan-SLC6A20 antibody (ThermoFisher). (n = 3 mice for WT and ∆C, *P < 0.05, Student's t-test). The error bars represent SEM.(D,E) Increased phosphorylation of β-catenin at Ser-675 but not at Ser-552 in the nucleus-enriched P1 fraction but not in whole-brain lysates of PtenΔC/ΔC mice (3 months). Note that total levels of β-catenin were not changed in the P1 fraction or whole-brain lysates. (n = 4 mice for WT-WB/P1 and ΔC-WB/P1, *P < 0.05, ns, not significant, Student's t-test). The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ",", "C", ")", "Decreased", "extracellular", "levels", "of", "proline", "and", "glycine", "in", "the", "brains", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "2", "-", "4", "month", ")", ",", "as", "determined", "by", "microdialysis", "in", "the", "hippocampus", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", "for", "details", ")", ".", "(", "proline", ",", "n", "=", "13", "mice", "for", "WT", "and", "8", "for", "ΔC", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "glycine", ",", "n", "=", "9", "for", "WT", "and", "5", "for", "∆", "C", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B,C) Decreased extracellular levels of proline and glycine in the brains of PtenΔC/ΔC mice (2-4 month), as determined by microdialysis in the hippocampus (see Materials and Methods for details). (proline, n = 13 mice for WT and 8 for ΔC, **P < 0.01, Student's t-test; glycine, n = 9 for WT and 5 for ∆C, **P < 0.01, Student's t-test, Mann-Whitney U test). The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Normalization", "of", "NMDAR", "-", "dependent", "HFS", "-", "LTP", "at", "synapses", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "4", "-", "5", "weeks", ")", "by", "DCS", "treatment", "(", "20", "μM", ")", ",", "as", "shown", "by", "fEPSP", "slopes", ".", "(", "n", "=", "15", "slices", "from", "9", "mice", "for", "WT", "-", "V", "/", "vehicle", ",", "11", "(", "5", ")", "for", "WT", "-", "D", "/", "DCS", ",", "16", "(", "10", ")", "for", "ΔC", "-", "V", ",", "13", "(", "7", ")", "for", "ΔC", "-", "D", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "test", ")", ".", "The", "grey", "traces", "represent", "the", "baseline", "fEPSP", "prior", "to", "LTP", "induction", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "F", ")", "Normalization", "of", "NMDAR", "-", "dependent", "HFS", "-", "LTP", "at", "synapses", "of", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "4", "-", "5", "weeks", ")", "by", "sarcosine", "treatment", "(", "750", "µM", ")", ",", "as", "shown", "by", "fEPSP", "slopes", ".", "Note", "that", "the", "data", "for", "WT", "-", "V", "and", "ΔC", "-", "V", "are", "identical", "to", "those", "shown", "in", "Fig", ".", "4B", "because", "the", "whole", "experiments", "were", "performed", "together", ";", "we", "generated", "independent", "figures", "for", "DCS", "and", "sarcosine", "results", "for", "the", "clear", "presentation", "of", "the", "data", ".", "(", "n", "=", "15", "slices", "from", "9", "mice", "for", "WT", "-", "V", "/", "vehicle", ",", "9", "(", "4", ")", "for", "WT", "-", "Sarc", "/", "Sarcosine", ",", "16", "(", "10", ")", "for", "ΔC", "-", "V", "/", "Vehicle", ",", "18", "(", "4", ")", "for", "ΔC", "-", "S", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "test", ")", ".", "The", "grey", "traces", "represent", "the", "baseline", "fEPSP", "prior", "to", "LTP", "induction", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Normalization of NMDAR-dependent HFS-LTP at synapses of PtenΔC/ΔC mice (4-5 weeks) by DCS treatment (20 μM), as shown by fEPSP slopes. (n = 15 slices from 9 mice for WT-V/vehicle, 11 (5) for WT-D/DCS, 16 (10) for ΔC-V, 13 (7) for ΔC-D, **P < 0.01, ns, not significant, two-way ANOVA with Tukey's test). The grey traces represent the baseline fEPSP prior to LTP induction. The error bars represent SEM.(F) Normalization of NMDAR-dependent HFS-LTP at synapses of PtenΔC/ΔC mice (4-5 weeks) by sarcosine treatment (750 µM), as shown by fEPSP slopes. Note that the data for WT-V and ΔC-V are identical to those shown in Fig. 4B because the whole experiments were performed together; we generated independent figures for DCS and sarcosine results for the clear presentation of the data. (n = 15 slices from 9 mice for WT-V/vehicle, 9 (4) for WT-Sarc/Sarcosine, 16 (10) for ΔC-V/Vehicle, 18 (4) for ΔC-S, *P < 0.05, ***P < 0.001, ns, not significant, two-way ANOVA with Tukey's test). The grey traces represent the baseline fEPSP prior to LTP induction. The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "2", "-", "4", "months", ")", "treated", "with", "Slc6a20a", "-", "ASO", "display", "partially", "normalized", "levels", "of", "whole", "-", "brain", "glycine", ",", "as", "shown", "by", "the", "lack", "of", "difference", "between", "saline", "-", "treated", "WT", "and", "ASO", "-", "treated", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", ".", "Note", "that", "the", "glycine", "levels", "observed", "here", "are", "~", "4", "times", "lower", "than", "those", "measured", "in", "Fig", ".", "3A", ",", "which", "could", "be", "attributable", "to", "different", "mouse", "ages", "(", "P21", "in", "Fig", ".", "3A", "vs", ".", "2", "-", "4", "months", "in", "Fig", ".", "5D", ")", ",", "absence", "and", "presence", "of", "ASO", "injection", ",", "or", "lot", "-", "to", "-", "lot", "variation", "of", "the", "ELISA", "kits", ".", "(", "n", "=", "8", "mice", "for", "WT", "-", "saline", ",", "5", "for", "WT", "-", "ASO", ",", "7", "for", "ΔC", "-", "saline", ",", "and", "8", "for", "ΔC", "-", "ASO", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "E", ")", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "P20", "-", "37", ")", "treated", "with", "Slc6a20a", "-", "ASO", "display", "an", "NMDA", "/", "AMPA", "ratio", "at", "hippocampal", "SC", "-", "CA1", "synapses", "that", "is", "comparable", "to", "that", "in", "ASO", "-", "treated", "WT", "mice", ".", "(", "n", "=", "11", "neurons", "from", "5", "mice", "for", "WT", "-", "ASO", ",", "10", "(", "4", ")", "for", "ΔC", "-", "ASO", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "Mann", "-", "Whitney", "'", "s", "U", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", ".", "(", "G", ")", "PtenΔC", "/", "ΔC", "mice", "(", "2", "-", "4", "months", ")", "treated", "with", "Slc6a20a", "-", "ASO", "display", "normal", "levels", "of", "climbing", "in", "the", "Laboras", "test", ".", "n", "=", "6", "mice", "for", "WT", "-", "saline", ",", "7", "for", "WT", "-", "ASO", ",", "7", "for", "ΔC", "-", "saline", ",", "and", "8", "for", "ΔC", "-", "ASO", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "test", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) PtenΔC/ΔC mice (2-4 months) treated with Slc6a20a-ASO display partially normalized levels of whole-brain glycine, as shown by the lack of difference between saline-treated WT and ASO-treated PtenΔC/ΔC mice. Note that the glycine levels observed here are ~4 times lower than those measured in Fig. 3A, which could be attributable to different mouse ages (P21 in Fig. 3A vs. 2-4 months in Fig. 5D), absence and presence of ASO injection, or lot-to-lot variation of the ELISA kits. (n = 8 mice for WT-saline, 5 for WT-ASO, 7 for ΔC-saline, and 8 for ΔC-ASO, **P < 0.01, ns, not significant, two-way ANOVA with Tukey's test). The error bars represent SEM.(E) PtenΔC/ΔC mice (P20-37) treated with Slc6a20a-ASO display an NMDA/AMPA ratio at hippocampal SC-CA1 synapses that is comparable to that in ASO-treated WT mice. (n = 11 neurons from 5 mice for WT-ASO, 10 (4) for ΔC-ASO, ns, not significant, Mann-Whitney's U test). The error bars represent SEM.(G) PtenΔC/ΔC mice (2-4 months) treated with Slc6a20a-ASO display normal levels of climbing in the Laboras test. n = 6 mice for WT-saline, 7 for WT-ASO, 7 for ΔC-saline, and 8 for ΔC-ASO, *P < 0.05, **P <0.01, ns, not significant, two-way ANOVA with Bonferroni's test. The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "Increased", "extracellular", "levels", "of", "glycine", "and", "proline", "in", "the", "brain", "of", "Slc6a20a", "+", "/", "-", "and", "Slc6a20a", "-", "/", "-", "mice", ",", "as", "shown", "by", "microdialysis", "analyses", ".", "Note", "that", "glycine", "levels", "are", "increased", "in", "both", "Slc6a20a", "+", "/", "-", "and", "Slc6a20a", "-", "/", "-", "mice", ",", "whereas", "proline", "levels", "are", "increased", "only", "in", "Slc6a20a", "-", "/", "-", "mice", ".", "(", "glycine", ",", "n", "=", "19", "mice", "for", "WT", ",", "11", "for", "HT", ",", "8", "for", "KO", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ";", "proline", ",", "n", "=", "15", "mice", "for", "WT", ",", "11", "for", "HT", ",", "14", "for", "KO", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) Increased extracellular levels of glycine and proline in the brain of Slc6a20a+/- and Slc6a20a-/- mice, as shown by microdialysis analyses. Note that glycine levels are increased in both Slc6a20a+/- and Slc6a20a-/- mice, whereas proline levels are increased only in Slc6a20a-/- mice. (glycine, n = 19 mice for WT, 11 for HT, 8 for KO, **P < 0.01, Mann-Whitney U test; proline, n = 15 mice for WT, 11 for HT, 14 for KO, ***P < 0.001, ns, not significant, Mann-Whitney U test). The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Glycine", "/", "proline", "-", "induced", "currents", "for", "mouse", "SLC6A20A", "are", "dependent", "on", "sodium", "chloride", ",", "as", "shown", "by", "the", "suppression", "of", "the", "currents", "when", "sodium", "chloride", "is", "replaced", "with", "choline", "chloride", "or", "sodium", "gluconate", ".", "Each", "experimental", "condition", "was", "sequentially", "applied", "to", "HEK293T", "cells", ",", "as", "shown", "in", "Appendix", "Fig", ".", "S7B", ".", "The", "indicated", "currents", "are", "average", "values", "from", "an", "ensemble", "of", "multiple", "(", "~", "20", ")", "cells", "in", "a", "single", "well", ".", "(", "glycine", ",", "n", "=", "21", "cells", "for", "untransfected", "/", "blank", ",", "17", "for", "human", "SLC6A20", "-", "V1", ",", "25", "for", "human", "SLC6A20", "-", "V2", ",", "33", "for", "mSLC6A20A", ",", "28", "for", "mSLC6A20B", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "relative", "to", "buffer", "not", "containing", "glycine", ")", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "test", ";", "proline", ",", "n", "=", "17", "cells", "for", "untransfected", ",", "23", "for", "human", "SLC6A20", "-", "V1", ",", "47", "for", "SLC6A20", "-", "V2", ",", "31", "for", "mSLC6A20A", ",", "and", "31", "for", "mSLC6A20B", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "test", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Glycine/proline-induced currents for mouse SLC6A20A are dependent on sodium chloride, as shown by the suppression of the currents when sodium chloride is replaced with choline chloride or sodium gluconate. Each experimental condition was sequentially applied to HEK293T cells, as shown in Appendix Fig. S7B. The indicated currents are average values from an ensemble of multiple (~20) cells in a single well. (glycine, n = 21 cells for untransfected/blank, 17 for human SLC6A20-V1, 25 for human SLC6A20-V2, 33 for mSLC6A20A, 28 for mSLC6A20B ***P < 0.001 (relative to buffer not containing glycine), two-way ANOVA with Bonferroni's test; proline, n = 17 cells for untransfected, 23 for human SLC6A20-V1, 47 for SLC6A20-V2, 31 for mSLC6A20A, and 31 for mSLC6A20B, ***P < 0.001, two-way ANOVA with Bonferroni's test). The error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "C", ")", "Immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "BAT", ",", "extensor", "digitorum", "longus", "(", "EDL", ")", ",", "epididymal", "white", "adipose", "tissue", "(", "eWAT", ")", "and", "heart", "from", "10", "‐", "to", "12", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", ".", "Arrows", "depict", "LC3", "‐", "I", "and", "II", ".", "(", "D", ")", "ATG5", "and", "ATG7", "mRNA", "levels", "in", "indicated", "tissues", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "E", ")", "immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "spleen", ",", "liver", ",", "lung", ",", "kidney", ",", "mediobasal", "hypothalamus", "(", "MBH", ")", ",", "inguinal", "white", "adipose", "tissue", "(", "ingWAT", ")", "and", "perinephric", "fat", "(", "pnWAT", ")", "from", "10", "‐", "to", "12", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", ".", "(", "F", ")", "Body", "weights", "(", "wt", ")", "of", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "(", "n", "=", "6", "-", "29", ")", ",", "and", "(", "G", ")", "high", "‐", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "at", "indicated", "ages", "(", "n", "=", "4", "-", "17", ")", ".", "(", "H", ")", "Total", "body", "fat", "and", "lean", "mass", "of", "4", "-", "7", "mo", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "8", "-", "12", ")", ".", "(", "I", ")", "BAT", "wt", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ",", "(", "J", ")", "gastrocnemius", "(", "GA", ")", "wt", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", ",", "(", "K", ")", "soleus", "wt", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ",", "(", "L", ")", "eWAT", "wt", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", "and", "(", "M", ")", "visceral", "(", "Visc", ")", "and", "subcutaneous", "(", "Subc", ")", "body", "fat", "distribution", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-C) Immunoblots for indicated proteins in BAT, extensor digitorum longus (EDL), epididymal white adipose tissue (eWAT) and heart from 10‐ to 12‐month (mo)‐old control (Con) and knock out (KO) mice. Arrows depict LC3‐I and II.(D) ATG5 and ATG7 mRNA levels in indicated tissues (n=4)(E) immunoblots for indicated proteins in spleen, liver, lung, kidney, mediobasal hypothalamus (MBH), inguinal white adipose tissue (ingWAT) and perinephric fat (pnWAT) from 10‐ to 12‐mo‐old Con and KO mice.(F) Body weights (wt) of chow diet (RD)‐fed (n=6-29), and (G) high‐fat diet (HFD)‐fed Con and KO mice at indicated ages (n=4-17).(H) Total body fat and lean mass of 4-7 mo RD‐fed Con and KO mice (n=8-12).(I) BAT wt (n=4-7), (J) gastrocnemius (GA) wt (n=5-7), (K) soleus wt (n=4-7), (L) eWAT wt (n=5-7) and (M) visceral (Visc) and subcutaneous (Subc) body fat distribution in 10‐mo‐old Con and KO mice (n=4). Values are mean±s.e., *P0.05, **P0.01, ***P0.001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "mRNA", "for", "indicated", "genes", "in", "BAT", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "c", ")", "mRNA", "for", "the", "indicated", "genes", "in", "epididymal", "white", "adipose", "tissue", "(", "eWAT", ")", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "D", ")", "immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "BAT", "from", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", ".", "Arrows", "depict", "protein", "isoforms", ".", "(", "E", ")", "immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "eWAT", "from", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", ".", "Arrows", "depict", "protein", "isoforms", ".", "(", "F", ")", "Electron", "micrographs", "(", "×", "10", ",", "000", "magnification", ")", "of", "BAT", "depicting", "mitochondria", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", ".", "m", ",", "mitochondria", ";", "LD", ",", "lipid", "droplet", ";", "n", ",", "nucleus", ".", "(", "G", ")", "mRNA", "levels", "(", "n", "=", "4", ")", "in", "BAT", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "H", ")", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "and", "(", "I", ")", "Sirius", "Red", "stains", "in", "BAT", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "Average", "adipocyte", "and", "LD", "size", ",", "and", "LD", "number", "in", "BAT", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "BAT", "mRNA", "levels", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "cold", "‐", "challenged", "for", "75", "min", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) mRNA for indicated genes in BAT (n=4)(c) mRNA for the indicated genes in epididymal white adipose tissue (eWAT) (n=4)(D) immunoblots for indicated proteins in BAT from 10‐month (mo)‐old chow diet (RD)‐fed control (Con) and knock out (KO) mice. Arrows depict protein isoforms.(E) immunoblots for indicated proteins in eWAT from 10‐month (mo)‐old chow diet (RD)‐fed control (Con) and knock out (KO) mice. Arrows depict protein isoforms.(F) Electron micrographs ( × 10,000 magnification) of BAT depicting mitochondria from 4‐mo‐old Con and KO mice. m, mitochondria; LD, lipid droplet; n, nucleus.(G) mRNA levels (n=4) in BAT from 10‐mo‐old Con and KO mice(H) hematoxylin and eosin (HE) and (I) Sirius Red stains in BAT from 10‐mo‐old Con and KO mice (n=3-4). Average adipocyte and LD size, and LD number in BAT are shown. Scale bar, 50 μm.(J) BAT mRNA levels from 4‐mo‐old RD‐fed Con and KO mice cold‐challenged for 75 min (n=3). Values are mean±s.e. ***P0.001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Body", "temperature", "before", "(", "Basal", ")", "and", "during", "cold", "exposure", "(", "n", "=", "7", "-", "8", ")", "in", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", "(", "B", ")", "Oxygen", "consumption", "(", "VO2", ")", ",", "(", "C", ")", "carbon", "dioxide", "production", "(", "VCO2", ")", "in", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "D", ")", "energy", "expenditure", "in", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "knock", "out", "(", "KO", ")", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "E", ")", "VO2", ",", "(", "F", ")", "VCO2", "and", "(", "G", ")", "energy", "expenditure", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "high", "‐", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "5", ")", ".", "(", "H", ")", "Ambulation", "(", "AMB", ")", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "HFD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "5", ")", ".", "(", "I", ")", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "‐", "stained", "epididymal", "white", "adipose", "tissue", "(", "eWAT", ")", "from", "6", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", ".", "Quantification", "for", "cell", "size", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "Adβ3", "mRNA", "in", "eWAT", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "and", "in", "(", "K", ")", "inguinal", "(", "ingWAT", ")", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "oldcold", "‐", "challenged", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "L", ")", "Serum", "‐", "free", "fatty", "acid", "(", "FFA", ")", "and", "glycerol", "(", "Gly", ")", "from", "4", "‐", "to", "6", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "untreated", "(", "basal", ")", "or", "treated", "with", "isoproterenol", "(", "Iso", ")", "i", ".", "p", ".", "for", "20", "min", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ",", "and", "(", "M", ")", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "cold", "‐", "challenged", "(", "75", "min", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "Values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Body temperature before (Basal) and during cold exposure (n=7-8) in 10‐month (mo)‐old chow diet (RD)‐fed control (Con) and knock out (KO) mice(B) Oxygen consumption (VO2), (C) carbon dioxide production (VCO2) in 10‐month (mo)‐old chow diet (RD)‐fed control (Con) and knock out (KO) mice (n=4).(D) energy expenditure in 10‐month (mo)‐old chow diet (RD)‐fed control (Con) and knock out (KO) mice (n=4)(E) VO2, (F) VCO2 and (G) energy expenditure in 10‐mo‐old high‐fat diet (HFD)‐fed Con and KO mice (n=3-5).(H) Ambulation (AMB) in 10‐mo‐old RD‐fed (n=4) and HFD‐fed Con and KO mice (n=3-5).(I) Hematoxylin and eosin (HE)‐stained epididymal white adipose tissue (eWAT) from 6‐mo‐old RD‐fed Con and KO mice. Quantification for cell size is shown (n=3). Scale bar, 50 μm.(J) Adβ3 mRNA in eWAT from 10‐mo‐old RD‐fed Con and KO mice (n=4), and in (K) inguinal (ingWAT) from 4‐mo‐oldcold‐challenged RD‐fed Con and KO mice (n=3).(L) Serum‐free fatty acid (FFA) and glycerol (Gly) from 4‐ to 6‐mo‐old Con and KO mice untreated (basal) or treated with isoproterenol (Iso) i.p. for 20 min (n=4-6), and (M) from 4‐mo‐old RD‐fed cold‐challenged (75 min) mice (n=3-4). Values are mean±s.e. *P0.05, **P0.01, ***P0.001."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Tmem26", "and", "tbx1", "mRNA", "levels", "in", "epididymal", "eWAT", ",", "and", "(", "C", ",", "D", ")", "ingWAT", "from", "Atg7Flox", "/", "Floxmice", "(", "4", "months", "(", "mo", ")", ")", "injected", "in", "BAT", "with", "empty", "(", "Con", "AdV", ")", "or", "Cre", "‐", "expressing", "(", "Cre", "AdV", ")", "adenoviruses", "and", "cold", "‐", "exposed", "or", "not", "(", "basal", ")", "for", "75", "min", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "‐", "stained", "ingWAT", "section", "from", "Atg7Flox", "/", "Flox", "mice", "(", "4", "months", "(", "mo", ")", ")", "injected", "in", "BAT", "with", "empty", "(", "Con", "AdV", ")", "or", "Cre", "‐", "expressing", "(", "Cre", "AdV", ")", "adenoviruses", "and", "cold", "‐", "exposed", "or", "not", "(", "basal", ")", "for", "75", "min", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "(", "G", ")", "mRNA", "for", "indicated", "genes", "in", "ingWAT", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "cold", "‐", "exposed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "mRNA", "levels", "in", "eWAT", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "J", ")", "β", "‐", "oxidation", "in", "eWAT", "and", "ingWAT", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "K", ")", "mRNA", "levels", "in", "soleus", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "cold", "‐", "exposed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "(", "M", ")", "BAT", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Values", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A,B) Tmem26 and tbx1 mRNA levels in epididymal eWAT, and (C,D) ingWAT from Atg7Flox/Floxmice (4 months (mo)) injected in BAT with empty (Con AdV) or Cre‐expressing (Cre AdV) adenoviruses and cold‐exposed or not (basal) for 75 min (n=4-5).(E,F) hematoxylin and eosin (HE)‐stained ingWAT section from Atg7Flox/Flox mice (4 months (mo)) injected in BAT with empty (Con AdV) or Cre‐expressing (Cre AdV) adenoviruses and cold‐exposed or not (basal) for 75 min (n=4-5).(G) mRNA for indicated genes in ingWAT from 4‐mo‐old cold‐exposed Con and KO mice (n=4).(H,I) mRNA levels in eWAT from 10‐mo‐old Con and KO mice (n=4).(J) β‐oxidation in eWAT and ingWAT from 4‐mo‐old Con and KO mice (n=4).(K) mRNA levels in soleus from 4‐mo‐old cold‐exposed Con and KO mice (n=3-6).(M) BAT from 4‐mo‐old Con and KO mice (n=4). Values are mean±s.e. *P0.05, **P0.01, ***P0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Blood", "glucose", "in", "6", "‐", "to", "10", "‐", "month", "(", "mo", ")", "‐", "old", "mice", "(", "n", "=", "12", "-", "15", ")", ",", "and", "(", "B", ")", "serum", "insulin", "levels", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "fed", "control", "(", "Con", ")", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "C", ")", "Glucose", "tolerance", "tests", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "chow", "diet", "(", "RD", ")", "‐", "fed", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "and", "(", "D", ")", "in", "10", "‐", "to", "12", "‐", "mo", "‐", "old", "high", "‐", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", "-", "9", ")", ".", "(", "E", ")", "Insulin", "tolerance", "test", "in", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "RD", "‐", "fed", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "F", ")", "Immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "skeletal", "muscle", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", ".", "(", "G", ")", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "‐", "stained", "gastrocnemius", "(", "GA", ")", "sections", "from", "6", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", ".", "Myofiber", "cross", "‐", "sectional", "area", "(", "μm2", ")", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "Expression", "of", "MuRF", "‐", "1", "and", "Atrogin", "‐", "1", "in", "GA", "and", "TA", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "I", ")", "myogenic", "genes", "in", "GA", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "J", ")", "Immunoblots", "for", "indicated", "proteins", "in", "tissues", "from", "4", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "K", ")", "mRNA", "for", "IRS1", ",", "(", "L", ")", "IRS2", "in", "epididymal", "white", "adipose", "tissue", "(", "eWAT", ")", "and", "GA", "from", "10", "‐", "mo", "‐", "old", "Con", "and", "KO", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Blood glucose in 6‐ to 10‐month (mo)‐old mice (n=12-15), and (B) serum insulin levels in 10‐mo‐old fed control (Con) and KO mice (n=6).(C) Glucose tolerance tests in 10‐mo‐old chow diet (RD)‐fed (n=5), and (D) in 10‐ to 12‐mo‐old high‐fat diet (HFD)‐fed Con and KO mice (n=4-9).(E) Insulin tolerance test in 10‐mo‐old RD‐fed Con and KO mice (n=5).(F) Immunoblots for indicated proteins in skeletal muscle from 10‐mo‐old Con and KO mice.(G) Hematoxylin and eosin (HE)‐stained gastrocnemius (GA) sections from 6‐mo‐old Con and KO mice. Myofiber cross‐sectional area (μm2) is shown (n=3).(H) Expression of MuRF‐1 and Atrogin‐1 in GA and TA from 10‐mo‐old Con and KO mice (n=4)(I) myogenic genes in GA from 10‐mo‐old Con and KO mice (n=6).(J) Immunoblots for indicated proteins in tissues from 4‐mo‐old Con and KO mice (n=4).(K) mRNA for IRS1, (L) IRS2 in epididymal white adipose tissue (eWAT) and GA from 10‐mo‐old Con and KO mice (n=6)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Cellomics", "images", "(", "top", ")", "of", "GFP", "-", "LC3", "‐", "HEK", "cells", "in", "full", "medium", "(", "FM", ")", "or", "after", "2", "h", "in", "starvation", "medium", "(", "ES", ")", "with", "leupeptin", "(", "EL", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "40", "μm", ".", "Optimised", "automated", "analysis", "(", "bottom", "left", ")", "programme", "detecting", "hoechst", "‐", "labelled", "nuclei", "(", "purple", "line", ")", ",", "cell", "outline", "(", "red", "line", ")", "and", "identifies", "GFP", "-", "LC3", "spots", "(", "red", "spots", ")", "in", "FM", "and", "EL", ".", "Enlarged", "GFP", "-", "LC3", "images", "in", "FM", "and", "EL", "(", "bottom", "right", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "SCPO", ",", "STIPO", "and", "STAPO", "after", "indicated", "siRNA", "treatment", "of", "GFP", "-", "LC3", "‐", "HEK", "cells", "incubated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "‐", "tailed", "paired", "t", "‐", "test", "compared", "with", "RISCfree", "(", "RF", ")", "in", "EL", ":", "SCPO", "siULK1", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ";", "siATG7", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0078", ";", "siNRBP2", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0088", ".", "STIPO", "siULK1", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", ";", "siATG7", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0060", ";", "siNRBP2", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0041", ".", "STAPO", "siULK1", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "0001", ";", "siATG7", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0037", ";", "siNRBP2", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0028", ".", "The", "experiments", "were", "performed", ":", "RISCfree", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "siULK1", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "siATG7", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "siNRBP2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Scatter", "plot", "of", "median", "SCPO", "Z", "‐", "scores", "from", "siRNA", "pools", "in", "the", "primary", "screen", "that", "met", "the", "minimum", "object", "count", "(", "OC", ")", "cutoff", ".", "Dashed", "lines", "represent", "approximate", "cutoff", "for", "500", "best", "increasers", "and", "decreasers", ".", "RP", "of", "known", "autophagy", "genes", "(", "ATG4C", ",", "ATG14", ",", "RB1CC1", ",", "ATG9A", ",", "ATG7", ")", "are", "given", "in", "Supplementary", "Table", "S2", ";", "AMBRA1", "(", "FLJ20294", ")", ",", "TBC1D25", "(", "OATL1", ")", "and", "SH3GLB1", "(", "BIF", "‐", "1", ")", "in", "Supplementary", "Table", "S1", ";", "LAMTOR2", "has", "a", "RP", "=", "708", ".", "7", "and", "RUBICON", "has", "a", "RP", "=", "1126", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Cellomics images (top) of GFP-LC3‐HEK cells in full medium (FM) or after 2 h in starvation medium (ES) with leupeptin (EL). Scale bars=40 μm. Optimised automated analysis (bottom left) programme detecting hoechst‐labelled nuclei (purple line), cell outline (red line) and identifies GFP-LC3 spots (red spots) in FM and EL. Enlarged GFP-LC3 images in FM and EL (bottom right). Scale bars=10 μm.(B) SCPO, STIPO and STAPO after indicated siRNA treatment of GFP-LC3‐HEK cells incubated as in (A). Error bars represent s.e.m. Significance was determined using a two‐tailed paired t‐test compared with RISCfree (RF) in EL: SCPO siULK1, ***P=0.0002; siATG7, **P=0.0078; siNRBP2, **P=0.0088. STIPO siULK1, ***P0.0001; siATG7, **P=0.0060; siNRBP2, **P=0.0041. STAPO siULK1, ***P0.0001; siATG7, **P=0.0037; siNRBP2, **P=0.0028. The experiments were performed: RISCfree (n=5), siULK1 (n=5), siATG7 (n=3), siNRBP2 (n=3).(D) Scatter plot of median SCPO Z‐scores from siRNA pools in the primary screen that met the minimum object count (OC) cutoff. Dashed lines represent approximate cutoff for 500 best increasers and decreasers. RP of known autophagy genes (ATG4C, ATG14, RB1CC1, ATG9A, ATG7) are given in Supplementary Table S2; AMBRA1 (FLJ20294), TBC1D25 (OATL1) and SH3GLB1 (BIF‐1) in Supplementary Table S1; LAMTOR2 has a RP=708.7 and RUBICON has a RP=1126."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "SCPO", ",", "STIPO", "and", "STAPO", "for", "the", "51", "genes", "validated", "by", "two", "out", "of", "four", "individual", "siRNA", "duplexes", "reproducing", "the", "GFP", "-", "LC3", "spot", "phenotype", ",", "above", "a", "cutoff", "of", "greater", "or", "less", "than", "20", "%", "of", "control", ",", "and", "passing", "additional", "criteria", "(", "Supplementary", "Table", "3", ")", ".", "Red", "boxes", "indicate", "an", "increase", ">", "1", ".", "2", ";", "pink", "boxes", "an", "increase", "between", "1", ".", "1", "and", "1", ".", "2", ";", "white", "boxes", "are", "between", "0", ".", "9", "and", "1", ".", "1", ";", "light", "blue", "boxes", "a", "decrease", "between", "0", ".", "9", "and", "0", ".", "8", ";", "dark", "blue", "boxes", "a", "decrease", "to", "0", ".", "8", ".", "Hits", "underlined", "were", "taken", "forward", "as", "three", "out", "of", "four4", "hits", ",", "(", "§", ")", "not", "chosen", "because", "of", "restricted", "tissue", "expression", ",", "(", "*", ")", "are", "three", "out", "of", "four", "when", "alternate", "method", "of", "normalisation", "is", "used", ".", "(", "B", ")", "Table", "summarising", "results", "from", "further", "validation", "of", "20", "genes", ".", "mRNA", "levels", "scored", "as", "(", "+", ")", "or", "(", "−", ")", "indicate", "efficient", "or", "poor", "knockdown", ",", "respectively", "(", "see", "Supplementary", "Figures", "S1", "and", "S2", ")", ".", "Increasers", "(", "left", ")", "or", "decreasers", "(", "right", ")", "assayed", "for", "LC3", "lipidation", "were", "scored", "(", "+", ")", "for", "yes", ",", "(", "−", ")", "for", "no", ",", "(", "+", "/", "−", ")", "subtle", "change", "and", "(", "nd", ")", "not", "done", "(", "Supplementary", "Figure", "S3", ")", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "STIPO", "results", "after", "incubation", "under", "different", "autophagy", "‐", "inducing", "conditions", "following", "(", "C", ")", "SCOC", "knockdown", "(", "D", ")", "SUPT5H", "knockdown", "and", "(", "E", ")", "WAC", "knockdown", ".", "siRNA", "‐", "treated", "cells", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "time", "in", "FL", ":", "full", "medium", "plus", "leupeptin", ";", "ES", ";", "EL", ":", "ES", "plus", "leupeptin", ";", "Torin", ":", "250", "nM", "Torin1", "in", "FL", ";", "Resv", ":", "128", "μM", "Resveratrol", "in", "FL", ";", "LiCl", ":", "10", "mM", "LiCl", "in", "FM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) SCPO, STIPO and STAPO for the 51 genes validated by two out of four individual siRNA duplexes reproducing the GFP-LC3 spot phenotype, above a cutoff of greater or less than 20% of control, and passing additional criteria (Supplementary Table 3). Red boxes indicate an increase >1.2; pink boxes an increase between 1.1 and 1.2; white boxes are between 0.9 and 1.1; light blue boxes a decrease between 0.9 and 0.8; dark blue boxes a decrease to 0.8. Hits underlined were taken forward as three out of four4 hits, (§) not chosen because of restricted tissue expression, (*) are three out of four when alternate method of normalisation is used.(B) Table summarising results from further validation of 20 genes. mRNA levels scored as (+) or (−) indicate efficient or poor knockdown, respectively (see Supplementary Figures S1 and S2). Increasers (left) or decreasers (right) assayed for LC3 lipidation were scored (+) for yes, (−) for no, (+/−) subtle change and (nd) not done (Supplementary Figure S3).(C-E) STIPO results after incubation under different autophagy‐inducing conditions following (C) SCOC knockdown (D) SUPT5H knockdown and (E) WAC knockdown. siRNA‐treated cells were incubated for the indicated time in FL: full medium plus leupeptin; ES; EL: ES plus leupeptin; Torin: 250 nM Torin1 in FL; Resv: 128 μM Resveratrol in FL; LiCl: 10 mM LiCl in FM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Endogenous", "SCOC", "shows", "colocalisation", "with", "Atg9", "(", "red", ")", "and", "TGN46", "(", "blue", ")", ".", "HEK293", "cells", "were", "fixed", "and", "permeabilised", "in", "saponin", ".", "Colocalisation", "indicated", "with", "arrows", ".", "(", "C", ")", "Endogenous", "SCOC", "(", "green", "top", ",", "red", "bottom", ")", "partially", "colocalises", "with", "endogenous", "LC3", "(", "red", ",", "top", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ",", "bottom", ")", "in", "HEK293", "and", "GFP", "-", "LC3", "‐", "HEK", "cells", ",", "respectively", ",", "after", "2", "h", "amino", "‐", "acid", "starvation", ".", "Boxed", "region", "is", "at", "higher", "magnification", "in", "merge", "panel", "on", "right", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Endogenous SCOC shows colocalisation with Atg9 (red) and TGN46 (blue). HEK293 cells were fixed and permeabilised in saponin. Colocalisation indicated with arrows.(C) Endogenous SCOC (green top, red bottom) partially colocalises with endogenous LC3 (red, top) and GFP-LC3 (green, bottom) in HEK293 and GFP-LC3‐HEK cells, respectively, after 2 h amino‐acid starvation. Boxed region is at higher magnification in merge panel on right. Scale bars=10 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "SCOC", "is", "required", "for", "autophagy", "in", "HEK293", "cells", ".", "Anti", "‐", "ULK1", ",", "‐", "Actin", "and", "‐", "LC3", "blot", "after", "siRNA", "treatment", "in", "HEK293", "cells", "in", "FM", ",", "ES", "or", "EL", ".", "Representative", "blot", ";", "quantification", "of", "LC3II", "/", "actin", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "‐", "tailed", "paired", "t", "‐", "test", ":", "RF", "EL", "versus", "siSCOC", "‐", "03", "EL", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0419", ".", "(", "B", ")", "SCOC", "is", "required", "for", "p62", "degradation", ".", "p62", "levels", "were", "determined", "by", "western", "blot", "(", "Supplementary", "Figure", "S5", ")", "after", "incubation", "in", "FM", ",", "ES", "for", "2", "or", "4", "h", ",", "or", "ES", "with", "BafilomycinA1", "(", "ES", "+", "BAF", ")", "for", "2", "and", "4", "h", ".", "Quantification", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "RISCfree", "FM", "versus", "RISCfree", "ES", "2", "and", "4", "h", ",", "*", "*", "*", "P", ">", "0", ".", "0001", "and", "*", "*", "0", ".", "0014", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "SCOC", "-", "GFP", "and", "SCOC", "-", "myc", "levels", "are", "reduced", "by", "SCOC", "siRNA", "duplex", "‐", "03", ".", "Anti", "‐", "GFP", ",", "‐", "Myc", "and", "‐", "Actin", "blots", "of", "HEK293", "cells", "after", "treatment", "with", "ULK1", ",", "RISCfree", "or", "SCOC", "siRNA", "and", "overexpression", "of", "GFP", ",", "SCOC", "-", "myc", "or", "SCOC", "-", "GFP", ".", "(", "D", ")", "Overexpression", "of", "SCOC", "-", "myc", "increases", "autophagy", ".", "Anti", "‐", "Actin", ",", "‐", "LC3", "and", "‐", "Myc", "blots", "of", "HEK293", "cells", "after", "transfection", "of", "pcDNA", "or", "SCOC", "-", "myc", ".", "Representative", "blot", ";", "quantification", "of", "LC3II", "/", "actin", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "SCOC", "-", "myc", "EL", "versus", "pcDNA", "EL", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0215", ".", "(", "E", ")", "Endogenous", "SCOC", "colocalises", "with", "endogenous", "FEZ1", "in", "HEK293", "cells", ".", "Arrows", "show", "partial", "colocalisation", ".", "Boxed", "region", "is", "at", "higher", "magnification", "in", "merge", "panel", "on", "bottom", "right", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) SCOC is required for autophagy in HEK293 cells. Anti‐ULK1, ‐Actin and ‐LC3 blot after siRNA treatment in HEK293 cells in FM, ES or EL. Representative blot; quantification of LC3II/actin of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=3). Significance was determined using a two‐tailed paired t‐test: RF EL versus siSCOC‐03 EL, *P=0.0419.(B) SCOC is required for p62 degradation. p62 levels were determined by western blot (Supplementary Figure S5) after incubation in FM, ES for 2 or 4 h, or ES with BafilomycinA1 (ES+BAF) for 2 and 4 h. Quantification of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=3); RISCfree FM versus RISCfree ES 2 and 4 h, ***P>0.0001 and **0.0014, respectively.(C) SCOC-GFP and SCOC-myc levels are reduced by SCOC siRNA duplex‐03. Anti‐GFP, ‐Myc and ‐Actin blots of HEK293 cells after treatment with ULK1, RISCfree or SCOC siRNA and overexpression of GFP, SCOC-myc or SCOC-GFP.(D) Overexpression of SCOC-myc increases autophagy. Anti‐Actin, ‐LC3 and ‐Myc blots of HEK293 cells after transfection of pcDNA or SCOC-myc. Representative blot; quantification of LC3II/actin of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=5). SCOC-myc EL versus pcDNA EL, *P=0.0215.(E) Endogenous SCOC colocalises with endogenous FEZ1 in HEK293 cells. Arrows show partial colocalisation. Boxed region is at higher magnification in merge panel on bottom right. Scale bars=20 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Knockdown", "of", "FEZ1", "enhances", "LC3", "lipidation", "but", "does", "not", "affect", "p62", "degradation", ".", "Anti", "‐", "Actin", "and", "‐", "LC3", "blot", "after", "siRNA", "treatment", "in", "HEK293", "cells", ".", "Quantification", "of", "LC3II", "/", "actin", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "‐", "tailed", "paired", "t", "‐", "test", ":", "RISCfree", "ES", "versus", "siFEZ1", "‐", "01", "ES", ",", "P", "=", "0", ".", "034", ".", "Quantification", "of", "p62", "/", "actin", "(", "Supplementary", "Figure", "S5", ")", "performed", "as", "in", "Figure", "4B", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "RISCfree", "FM", "versus", "RISCfree", "2", "and", "4", "hP", ">", "0", ".", "0001", "and", "P", "=", "0", ".", "0014", ",", "respectively", ".", "qRT", "-", "PCR", "showing", "FEZ1", "mRNA", "levels", "after", "indicated", "knockdown", "in", "GFP", "-", "LC3", "‐", "HEK", "cells", "(", "error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "(", "B", ")", "Overexpression", "of", "FEZ1", "inhibits", "LC3", "lipidation", "and", "p62", "degradation", ".", "Anti", "‐", "Myc", ",", "‐", "Actin", "and", "‐", "LC3", "blot", "after", "transfection", "with", "pcDNA", "or", "Myc", "-", "FEZ1", "in", "HEK293", "cells", ".", "Quantification", "of", "LC3II", "/", "actin", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "pcDNA", "ES", "versus", "Myc", "-", "FEZ1", "ES", ",", "P", "=", "0", ".", "0318", ".", "Anti", "‐", "GFP", ",", "‐", "Actin", "and", "‐", "p62", "blot", "after", "transfection", "with", "GFP", "or", "FEZ1", "-", "GFP", "and", "treatment", "with", "ES", "or", "ES", "plus", "Bafilomycin", "(", "EB", ")", "for", "4", "h", ".", "Quantification", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "GFP", "FM", "versus", "GFP", "ES", ",", "P", "=", "0", ".", "0077", ";", "GFP", "FM", "versus", "GFP", "EB", ",", "P", "=", "0", ".", "0212", ";", "GFP", "ES", "versus", "FEZ1", "-", "GFP", "ES", ",", "P", "=", "0", ".", "048", ".", "(", "C", ")", "SCOC", "and", "FEZ1", "interact", ".", "Left", "panel", "shows", "anti", "‐", "SCOC", "and", "‐", "FEZ1", "blots", "after", "co", "‐", "expression", "in", "HEK293", "cells", "and", "co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "SCOC", "-", "myc", "and", "FEZ1", "-", "GFP", "with", "anti", "‐", "GFP", "antibody", ".", "Input", "lysate", "(", "Inp", ")", ",", "unbound", "supernatant", "(", "Unb", ")", ".", "Right", "panel", "shows", "anti", "‐", "FEZ1", "and", "‐", "FLAG", "blots", "after", "co", "‐", "expression", "in", "HEK293", "cells", "and", "co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "FLAG", "-", "SCOC", "and", "Myc", "-", "FEZ1", "with", "anti", "‐", "FLAG", "antibody", ".", "(", "D", ")", "FEZ1", "interacts", "with", "SCOC", "in", "vitro", ".", "GST", "‐", "pulldown", "assays", "using", "in", "vitro", "translated", "35S", "‐", "labelled", "Myc", "-", "FEZ1", "(", "right", ")", "or", "35S", "‐", "labelled", "Myc", "‐", "control", "(", "left", ")", "and", "GST", "or", "GST", "-", "SCOC", "(", "asterisk", "in", "bottom", "panel", ")", ".", "Bound", "proteins", "were", "detected", "by", "autoradiography", "following", "SDS", "-", "PAGE", "(", "top", ")", ",", "protein", "loading", "by", "coomassie", "blue", "(", "bottom", ")", ".", "(", "E", ")", "The", "FEZ1", "-", "SCOC", "interaction", "requires", "the", "evolutionary", "conserved", "residues", "L254", "and", "L260", "in", "the", "coiled", "‐", "coil", "domain", "of", "FEZ1", "as", "demonstrated", "in", "GST", "‐", "pulldown", "assays", "with", "in", "vitro", "translated", "35S", "‐", "labelled", "WT", "or", "mutant", "Myc", "‐", "FEZ1", "and", "GST", "or", "GST", "‐", "SCOC", ".", "Autoradiographs", "of", "10", "%", "input", "and", "bound", "proteins", "(", "top", "panels", ")", "and", "Coomassie", "blue", "‐", "stained", "gels", "of", "bead", "‐", "bound", "GST", "and", "GST", "‐", "SCOC", "proteins", "used", "(", "bottom", "panels", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Knockdown of FEZ1 enhances LC3 lipidation but does not affect p62 degradation. Anti‐Actin and ‐LC3 blot after siRNA treatment in HEK293 cells. Quantification of LC3II/actin of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=3). Significance was determined using a two‐tailed paired t‐test: RISCfree ES versus siFEZ1‐01 ES, P=0.034. Quantification of p62/actin ( Supplementary Figure S5) performed as in Figure 4B; error bars represent s.e.m. (n=3); RISCfree FM versus RISCfree 2 and 4 hP>0.0001 and P=0.0014, respectively. qRT-PCR showing FEZ1 mRNA levels after indicated knockdown in GFP-LC3‐HEK cells (error bars represent s.d.).(B) Overexpression of FEZ1 inhibits LC3 lipidation and p62 degradation. Anti‐Myc, ‐Actin and ‐LC3 blot after transfection with pcDNA or Myc-FEZ1 in HEK293 cells. Quantification of LC3II/actin; error bars represent s.e.m. (n=3); pcDNA ES versus Myc-FEZ1 ES, P=0.0318. Anti‐GFP, ‐Actin and ‐p62 blot after transfection with GFP or FEZ1-GFP and treatment with ES or ES plus Bafilomycin (EB) for 4 h. Quantification of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=3); GFP FM versus GFP ES, P=0.0077; GFP FM versus GFP EB, P=0.0212; GFP ES versus FEZ1-GFP ES, P=0.048.(C) SCOC and FEZ1 interact. Left panel shows anti‐SCOC and ‐FEZ1 blots after co‐expression in HEK293 cells and co‐immunoprecipitation of SCOC-myc and FEZ1-GFP with anti‐GFP antibody. Input lysate (Inp), unbound supernatant (Unb). Right panel shows anti‐FEZ1 and ‐FLAG blots after co‐expression in HEK293 cells and co‐immunoprecipitation of FLAG-SCOC and Myc-FEZ1 with anti‐FLAG antibody.(D) FEZ1 interacts with SCOC in vitro. GST‐pulldown assays using in vitro translated 35S‐labelled Myc-FEZ1 (right) or 35S‐labelled Myc‐control (left) and GST or GST-SCOC (asterisk in bottom panel). Bound proteins were detected by autoradiography following SDS-PAGE (top), protein loading by coomassie blue (bottom).(E) The FEZ1-SCOC interaction requires the evolutionary conserved residues L254 and L260 in the coiled‐coil domain of FEZ1 as demonstrated in GST‐pulldown assays with in vitro translated 35S‐labelled WT or mutant Myc‐FEZ1 and GST or GST‐SCOC. Autoradiographs of 10% input and bound proteins (top panels) and Coomassie blue‐stained gels of bead‐bound GST and GST‐SCOC proteins used (bottom panels)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "FEZ1", "interacts", "with", "both", "the", "kinase", "domain", "(", "1", "-", "278", ")", "and", "the", "proline", "-", "serine", "rich", "spacer", "of", "ULK1", "(", "279", "-", "828", ")", ".", "GFP", "‐", "or", "Myc", "‐", "tagged", "ULK1", "fragments", "were", "in", "vitro", "translated", "with", "35S", "‐", "methionine", "and", "subjected", "to", "GST", "‐", "pulldown", "assays", "using", "GST", "and", "GST", "-", "FEZ1", "purified", "from", "E", ".", "coli", "(", "bottom", ")", ".", "Bound", "proteins", "were", "detected", "by", "autoradiography", "following", "SDS", "-", "PAGE", "(", "top", ")", ".", "(", "B", ")", "ULK1", "interacts", "with", "FEZ1", ".", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "from", "HEK293", "lysates", "with", "anti", "‐", "ULK1", "and", "bound", "ULK1", "and", "FEZ1", "were", "detected", "with", "anti", "‐", "ULK1", "and", "anti", "‐", "FEZ1", "antibodies", ".", "Input", "lysate", "(", "Inp", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "FEZ1", "-", "GFP", "and", "Myc", "-", "ULK1", "interaction", "is", "unaffected", "by", "amino", "‐", "acid", "starvation", ".", "Anti", "‐", "Myc", "and", "‐", "GFP", "blots", "after", "HEK293", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "FEZ1", "-", "GFP", "and", "Myc", "-", "ULK1", ",", "incubated", "in", "FM", "or", "ES", "for", "2", "h", ",", "harvested", "and", "the", "complex", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "‐", "GFP", "antibody", ".", "(", "D", ")", "BN", "-", "PAGE", "reveals", "SCOC", "and", "FEZ1", "are", "in", "a", "complex", ".", "FEZ1", "-", "GFP", ",", "FLAG", "-", "SCOC", "and", "Myc", "-", "ULK1", "wild", "type", "or", "kinase", "‐", "inactive", "ULK1K46I", "(", "ULK1KI", ")", "were", "co", "‐", "expressed", "in", "HEK293", "cells", ".", "Anti", "‐", "GFP", ",", "‐", "FLAG", "and", "‐", "Myc", "western", "blots", "are", "shown", "for", "the", "BN", "-", "PAGE", "gel", "(", "top", ")", "or", "the", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "(", "bottom", ")", ".", "In", "GFP", "and", "FLAG", "western", "blots", ",", "two", "different", "exposures", "of", "the", "same", "BN", "-", "PAGE", "blot", "are", "shown", "spliced", "together", ".", "(", "E", ")", "siRNA", "depletion", "of", "ULK1", "does", "not", "affect", "the", "interaction", "of", "FEZ1", "with", "SCOC", ".", "RF", "or", "ULK1", "siRNA", "‐", "treated", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "FEZ1", "-", "GFP", "and", "FLAG", "-", "SCOC", ",", "then", "incubated", "and", "immunoprecipitated", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Western", "blot", "of", "lysates", "for", "ULK1", ",", "GFP", "and", "FLAG", ",", "and", "immunoprecipitates", "with", "GFP", "and", "FLAG", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "siRNA", "depletion", "of", "SCOC", "reduces", "FEZ1", "-", "ULK1", "complex", ".", "HEK293", "cells", "treated", "with", "either", "SCOC", "or", "ULK1", "siRNAs", "were", "transfected", "with", "FEZ1", "-", "GFP", ".", "FEZ1", "-", "GFP", "was", "detected", "with", "anti", "‐", "GFP", "in", "both", "BN", "-", "PAGE", "and", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Endogenous", "ULK1", "was", "detected", "with", "anti", "‐", "ULK1", "antibody", ".", "Arrowheads", "indicate", "a", "FEZ1", "-", "GFP", "and", "endogenous", "ULK1", "complex", "at", "200", "kDa", "and", "a", "larger", "MW", "complex", ">", "1236", "kDa", "also", "detected", "in", "(", "D", ")", "in", "the", "triple", "transfection", ".", "The", "200", "KDa", "complex", "is", "sensitive", "to", "loss", "of", "SCOC", "and", "ULK1", ".", "(", "G", ")", "SCOC", "can", "reduce", "the", "interaction", "of", "ULK1", "with", "MBP", "-", "FEZ1", ".", "Immobilised", "MBP", "-", "FEZ1", "was", "incubated", "with", "in", "vitro", "35S", "‐", "methionine", "‐", "labelled", "Myc", "-", "ULK1", ".", "Addition", "of", "increasing", "amounts", "of", "in", "vitro", "translated", "35S", "‐", "methionine", "SCOC", "reduced", "the", "amount", "of", "Myc", "-", "ULK1", "bound", ".", "Top", "and", "bottom", "panels", "are", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) FEZ1 interacts with both the kinase domain (1-278) and the proline-serine rich spacer of ULK1 (279-828). GFP‐ or Myc‐tagged ULK1 fragments were in vitro translated with 35S‐methionine and subjected to GST‐pulldown assays using GST and GST-FEZ1 purified from E. coli (bottom). Bound proteins were detected by autoradiography following SDS-PAGE (top).(B) ULK1 interacts with FEZ1. ULK1 was immunoprecipitated from HEK293 lysates with anti‐ULK1 and bound ULK1 and FEZ1 were detected with anti‐ULK1 and anti‐FEZ1 antibodies. Input lysate (Inp).(C) The FEZ1-GFP and Myc-ULK1 interaction is unaffected by amino‐acid starvation. Anti‐Myc and ‐GFP blots after HEK293 cells were co‐transfected with FEZ1-GFP and Myc-ULK1, incubated in FM or ES for 2 h, harvested and the complex was immunoprecipitated using anti‐GFP antibody.(D) BN-PAGE reveals SCOC and FEZ1 are in a complex. FEZ1-GFP, FLAG-SCOC and Myc-ULK1 wild type or kinase‐inactive ULK1K46I (ULK1KI) were co‐expressed in HEK293 cells. Anti‐GFP, ‐FLAG and ‐Myc western blots are shown for the BN-PAGE gel (top) or the SDS-PAGE gel (bottom). In GFP and FLAG western blots, two different exposures of the same BN-PAGE blot are shown spliced together.(E) siRNA depletion of ULK1 does not affect the interaction of FEZ1 with SCOC. RF or ULK1 siRNA‐treated cells were co‐transfected with FEZ1-GFP and FLAG-SCOC, then incubated and immunoprecipitated as in (C). Western blot of lysates for ULK1, GFP and FLAG, and immunoprecipitates with GFP and FLAG antibodies.(F) siRNA depletion of SCOC reduces FEZ1-ULK1 complex. HEK293 cells treated with either SCOC or ULK1 siRNAs were transfected with FEZ1-GFP. FEZ1-GFP was detected with anti‐GFP in both BN-PAGE and SDS-PAGE. Endogenous ULK1 was detected with anti‐ULK1 antibody. Arrowheads indicate a FEZ1-GFP and endogenous ULK1 complex at 200 kDa and a larger MW complex >1236 kDa also detected in (D) in the triple transfection. The 200 KDa complex is sensitive to loss of SCOC and ULK1.(G) SCOC can reduce the interaction of ULK1 with MBP-FEZ1. Immobilised MBP-FEZ1 was incubated with in vitro 35S‐methionine‐labelled Myc-ULK1. Addition of increasing amounts of in vitro translated 35S‐methionine SCOC reduced the amount of Myc-ULK1 bound. Top and bottom panels are as described in (A)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "SCOC", "interacts", "with", "UVRAG", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "SCOC", "and", "Myc", "-", "UVRAG", ",", "lysed", "and", "incubated", "with", "anti", "‐", "FLAG", "(", "left", ")", "or", "anti", "‐", "Myc", "(", "right", ")", "antibodies", ".", "Co", "‐", "immunoprecipitation", "of", "Myc", "-", "UVRAG", "(", "left", ")", "and", "FLAG", "-", "SCOC", "(", "right", ")", "was", "confirmed", "using", "anti", "‐", "Myc", "and", "anti", "‐", "FLAG", "antibodies", "for", "western", "blotting", ".", "Asterisk", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "indicates", "non", "‐", "specific", "bands", ".", "(", "B", ")", "Interaction", "of", "SCOC", "with", "UVRAG", "is", "unaffected", "by", "FEZ1", "-", "GFP", ".", "As", "in", "(", "A", ")", ",", "co", "‐", "immunoprecipitation", "was", "preformed", "in", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "SCOC", ",", "Myc", "-", "UVRAG", "and", "FEZ1", "-", "GFP", ".", "Myc", "-", "UVRAG", "was", "detected", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "FEZ1", "-", "GFP", "was", "detected", "with", "anti", "‐", "GFP", "antibody", ".", "(", "C", ")", "The", "SCOC", "and", "UVRAG", "interaction", "is", "reduced", "by", "starvation", ",", "and", "this", "reduction", "is", "inhibited", "by", "FEZ1", "-", "GFP", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "24", "h", "later", "either", "treated", "with", "FM", "or", "ES", "for", "2", "h", ".", "FLAG", "-", "SCOC", "or", "Myc", "-", "UVRAG", "was", "immunoprecipitated", "with", "anti", "‐", "FLAG", "or", "anti", "‐", "Myc", "antibodies", "and", "the", "bound", "proteins", "were", "detected", "with", "anti", "‐", "Myc", ",", "‐", "GFP", "or", "‐", "FLAG", "antibodies", "by", "western", "blotting", ".", "Quantification", "of", "the", "amount", "of", "FLAG", "-", "SCOC", "co", "‐", "immunoprecipitated", "with", "Myc", "-", "UVRAG", "in", "FM", "or", "ES", ",", "without", "overexpressed", "FEZ1", "-", "GFP", "(", "left", ")", "or", "with", "overexpressed", "FEZ1", "-", "GFP", "(", "right", ")", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "‐", "tailed", "paired", "t", "‐", "test", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "FEZ1", "interacts", "directly", "with", "endogenous", "UVRAG", "and", "is", "required", "for", "SCOC", "interaction", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "FEZ1", "-", "GFP", ",", "GFP", "or", "FLAG", "-", "SCOC", "alone", "or", "in", "combination", ".", "Top", "panel", "input", ",", "bottom", "panel", "immunoprecipitation", "with", "anti", "‐", "GFP", "or", "anti", "‐", "FLAG", ".", "Western", "blot", "for", "endogenous", "UVRAG", ",", "GFP", "-", "FEZ1", "GFP", "or", "FLAG", "-", "SCOC", "as", "indicated", ".", "Arrowhead", ":", "endogenous", "UVRAG", ".", "(", "E", ")", "UVRAG", "can", "interact", "with", "both", "FEZ1", "and", "SCOC", "in", "vitro", ".", "GST", ",", "GST", "-", "FEZ1", "or", "GST", "-", "SCOC", "were", "immobilised", "and", "incubated", "with", "35S", "‐", "labelled", "Myc", "-", "UVRAG", "as", "indicated", ".", "Arrowheads", "indicate", "GST", "-", "FEZ1", "(", "left", ")", "and", "GST", "-", "SCOC", "(", "right", ")", ".", "(", "F", ")", "Endogenous", "UVRAG", "partially", "colocalises", "with", "endogenous", "FEZ1", "in", "HEK293", "cells", ".", "Arrows", "show", "colocalisation", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) SCOC interacts with UVRAG. HEK293 cells were transfected with FLAG-SCOC and Myc-UVRAG, lysed and incubated with anti‐FLAG (left) or anti‐Myc (right) antibodies. Co‐immunoprecipitation of Myc-UVRAG (left) and FLAG-SCOC (right) was confirmed using anti‐Myc and anti‐FLAG antibodies for western blotting. Asterisk in (A-C) and (D) indicates non‐specific bands.(B) Interaction of SCOC with UVRAG is unaffected by FEZ1-GFP. As in (A), co‐immunoprecipitation was preformed in HEK293 cells transfected with FLAG-SCOC, Myc-UVRAG and FEZ1-GFP. Myc-UVRAG was detected as in (A), FEZ1-GFP was detected with anti‐GFP antibody.(C) The SCOC and UVRAG interaction is reduced by starvation, and this reduction is inhibited by FEZ1-GFP. HEK293 cells were transfected as in (B) and 24 h later either treated with FM or ES for 2 h. FLAG-SCOC or Myc-UVRAG was immunoprecipitated with anti‐FLAG or anti‐Myc antibodies and the bound proteins were detected with anti‐Myc, ‐GFP or ‐FLAG antibodies by western blotting. Quantification of the amount of FLAG-SCOC co‐immunoprecipitated with Myc-UVRAG in FM or ES, without overexpressed FEZ1-GFP (left) or with overexpressed FEZ1-GFP (right). Significance was determined using a two‐tailed paired t‐test (n=3).(D) FEZ1 interacts directly with endogenous UVRAG and is required for SCOC interaction. HEK293 cells were transfected with FEZ1-GFP, GFP or FLAG-SCOC alone or in combination. Top panel input, bottom panel immunoprecipitation with anti‐GFP or anti‐FLAG. Western blot for endogenous UVRAG, GFP-FEZ1 GFP or FLAG-SCOC as indicated. Arrowhead: endogenous UVRAG.(E) UVRAG can interact with both FEZ1 and SCOC in vitro. GST, GST-FEZ1 or GST-SCOC were immobilised and incubated with 35S‐labelled Myc-UVRAG as indicated. Arrowheads indicate GST-FEZ1 (left) and GST-SCOC (right).(F) Endogenous UVRAG partially colocalises with endogenous FEZ1 in HEK293 cells. Arrows show colocalisation. Scale bar=10 μm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Depletion", "of", "endogenous", "WAC", ".", "Anti", "‐", "WAC", "and", "‐", "Actin", "blot", "and", "WAC", "mRNA", "levels", "by", "qRT", "-", "PCR", "after", "treatment", "with", "RF", "or", "individual", "WAC", "siRNAs", "(", "W", "‐", "01", "to", "W", "‐", "04", ")", "in", "HEK293", "cells", ".", "qRT", "-", "PCR", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "triplicates", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "B", ")", "(", "B", ")", "WAC", "is", "required", "for", "autophagy", ".", "Anti", "‐", "ULK1", ",", "‐", "WAC", ",", "‐", "Actin", "and", "‐", "LC3", "blots", "after", "siRNA", "treatment", "in", "HEK293", "cells", "and", "incubation", "in", "FM", ",", "ES", "or", "EL", ".", "Representative", "blot", ";", "quantification", "of", "LC3II", "/", "actin", "of", "averaged", "duplicates", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "‐", "tailed", "paired", "t", "‐", "test", ":", "RF", "EL", "versus", "siWAC", "‐", "03", "EL", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0079", ".", "(", "C", ")", "p62", "degradation", "requires", "WAC", ".", "Anti", "‐", "p62", "and", "‐", "Actin", "blot", "after", "siRNA", "treatment", "of", "GFP", "-", "LC3", "‐", "HEK", "cells", "in", "FM", "or", "ES", "for", "2", "h", "in", "duplicate", ".", "Bars", "represent", "p62", "/", "actin", "levels", "normalised", "to", "RF", "FM", ";", "quantification", "of", "p62", "/", "actin", ";", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ":", "RF", "FM", "versus", "RF", "ES", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0057", ";", "RF", "FM", "versus", "siWAC", "‐", "03", "FM", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0025", ";", "RF", "ES", "versus", "siWAC", "‐", "03", "ES", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0386", ".", "(", "D", ")", "WAC", "depletion", "accelerates", "degradation", "of", "a", "UPS", "reporter", ".", "Anti", "‐", "p62", ",", "‐", "GFP", ",", "‐", "Actin", ",", "‐", "LC3", ",", "‐", "WAC", "and", "‐", "Atg16", "blots", "after", "siRNA", "treatment", "in", "UbG76V", "-", "YFP", "MelJuSo", "cells", "and", "incubation", "conditions", "FM", ",", "ES", "or", "FM", "with", "10", "μM", "MG132", "(", "MG", ")", "for", "2", "h", ".", "Quantification", "of", "normalised", "average", "GFP", "intensity", "in", "FM", "of", "RISCfree", "compared", "with", "WAC", "‐", "03", "siRNA", "treatment", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "compared", "with", "ATG16", "siRNA", "treatment", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ":", "RF", "FM", "versus", "siWAC", "‐", "03", "FM", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0082", ".", "(", "E", ")", "Soluble", "HttQ25", "-", "CFP", "degradation", "is", "increased", "after", "WAC", "depletion", ".", "Anti", "‐", "WAC", ",", "‐", "Actin", "and", "‐", "GFP", "blots", "after", "indicated", "siRNA", "treatment", "(", "siWAC", "duplexes", "‐", "02", ",", "‐", "03", ",", "‐", "04", ")", "of", "HttPolyQ", "‐", "mutant", "HeLa", "cell", "lines", "and", "incubation", "conditions", "DMSO", "or", "DOX", "(", "Doxycyline", ")", "for", "3", "days", ".", "The", "insoluble", "fraction", "was", "obtained", "by", "pelleting", "the", "HttQ103", "lysates", "(", "see", "Materials", "and", "methods", ")", ".", "Quantification", "of", "normalised", "average", "HttQ25", "-", "CFP", "intensity", "in", "DMSO", "of", "RISCfree", "compared", "with", "WAC", "siRNA", "treatment", ";", "error", "bar", "represents", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ":", "HttQ25", "-", "CFP", "/", "actin", "RF", "DMSO", "versus", "siWAC", "DMSO", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0350", ";", "soluble", "HttQ103", "-", "CFP", "/", "actin", "RF", "DMSO", "versus", "siWAC", "DMSO", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0380", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Depletion of endogenous WAC. Anti‐WAC and ‐Actin blot and WAC mRNA levels by qRT-PCR after treatment with RF or individual WAC siRNAs (W‐01 to W‐04) in HEK293 cells. qRT-PCR error bars represent standard deviation of triplicates (n=2).(B) (B) WAC is required for autophagy. Anti‐ULK1, ‐WAC, ‐Actin and ‐LC3 blots after siRNA treatment in HEK293 cells and incubation in FM, ES or EL. Representative blot; quantification of LC3II/actin of averaged duplicates; error bars represent s.e.m. (n=3). Significance was determined using a two‐tailed paired t‐test: RF EL versus siWAC‐03 EL, **P=0.0079.(C) p62 degradation requires WAC. Anti‐p62 and ‐Actin blot after siRNA treatment of GFP-LC3‐HEK cells in FM or ES for 2 h in duplicate. Bars represent p62/actin levels normalised to RF FM; quantification of p62/actin; error bars represent s.e.m. (n=3): RF FM versus RF ES, **P=0.0057; RF FM versus siWAC‐03 FM, **P=0.0025; RF ES versus siWAC‐03 ES, *P=0.0386.(D) WAC depletion accelerates degradation of a UPS reporter. Anti‐p62, ‐GFP, ‐Actin, ‐LC3, ‐WAC and ‐Atg16 blots after siRNA treatment in UbG76V-YFP MelJuSo cells and incubation conditions FM, ES or FM with 10 μM MG132 (MG) for 2 h. Quantification of normalised average GFP intensity in FM of RISCfree compared with WAC‐03 siRNA treatment (n=3) and compared with ATG16 siRNA treatment (n=2). Error bars represent s.e.m.: RF FM versus siWAC‐03 FM, **P=0.0082.(E) Soluble HttQ25-CFP degradation is increased after WAC depletion. Anti‐WAC, ‐Actin and ‐GFP blots after indicated siRNA treatment (siWAC duplexes ‐02, ‐03, ‐04) of HttPolyQ‐mutant HeLa cell lines and incubation conditions DMSO or DOX (Doxycyline) for 3 days. The insoluble fraction was obtained by pelleting the HttQ103 lysates (see Materials and methods). Quantification of normalised average HttQ25-CFP intensity in DMSO of RISCfree compared with WAC siRNA treatment; error bar represents s.e.m. (n=3): HttQ25-CFP/actin RF DMSO versus siWAC DMSO, *P=0.0350; soluble HttQ103-CFP/actin RF DMSO versus siWAC DMSO, *P=0.0380."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Characterization", "of", "C", ".", "perfringens", "β", "-", "toxin", "(", "CPB", ")", "constructs", "with", "different", "N", "-", "termini", "by", "gel", "electrophoretic", "analysis", "under", "denaturing", "(", "A", ")", "conditions", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "analyis", "of", "CPB", "samples", "in", "cholate", "(", "1μg", "per", "lane", ")", ".", "CPB", "samples", "containing", "cholate", "were", "boiled", "for", "5", "min", "at", "95", "°", "C", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", ".", "B", ".", "Coomassie", "stained", "Blue", "native", "PAGE", "gel", "(", "4", "-", "16", "%", ")", "of", "CPB", "samples", "(", "10ug", "per", "lane", ")", "showing", "oligomer", "formation", "for", "all", "different", "N", "-", "termini", "constructs", ".", "C", ".", "Alignment", "of", "CPB", "N", "-", "terminus", "with", "N", "-", "termini", "of", "different", "hemolysins", "and", "cryo", "-", "EM", "2D", "classification", "and", "average", "of", "N", "-", "terminally", "tagged", "WT", "CPB", "(", "1", ")", ",", "Δ23CPB", "(", "2", ")", ",", "δ", "-", "toxin", "N", "-", "terminus", "Δ23CPB", "(", "3", ")", ",", "C", "-", "terminally", "tagged", "WT", "CPB", "(", "4", ")", ",", "Hla", "N", "-", "terminus", "Δ23CPB", "(", "5", ")", "and", "HlgB", "N", "-", "terminus", "Δ23CPB", "(", "6", ")", ".", "D", ".", "Viability", "of", "HEK", "293FT", "/", "CD31", "-", "GFP", "cells", "(", "transduced", "with", "CD31", "-", "GFP", ")", "as", "a", "percentage", "of", "untreated", "control", "cells", "after", "incubation", "with", "indicated", "concentrations", "of", "toxins", "(", "24", "h", ",", "37", "°", "C", ")", ".", "Data", "(", "technical", "replicates", ")", "are", "represented", "as", "means", "(", "n", "=", "4", ")", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Characterization of C. perfringens β-toxin (CPB) constructs with different N-termini by gel electrophoretic analysis under denaturing (A) conditions. SDS-PAGE gel analyis of CPB samples in cholate (1μg per lane). CPB samples containing cholate were boiled for 5 min at 95°C (+) or not (-).B. Coomassie stained Blue native PAGE gel (4-16%) of CPB samples (10ug per lane) showing oligomer formation for all different N-termini constructs.C. Alignment of CPB N-terminus with N-termini of different hemolysins and cryo-EM 2D classification and average of N-terminally tagged WT CPB (1), Δ23CPB (2), δ-toxin N-terminus Δ23CPB (3), C-terminally tagged WT CPB (4), Hla N-terminus Δ23CPB (5) and HlgB N-terminus Δ23CPB (6).D. Viability of HEK 293FT/CD31-GFP cells (transduced with CD31-GFP) as a percentage of untreated control cells after incubation with indicated concentrations of toxins (24 h, 37°C). Data (technical replicates) are represented as means (n = 4) ± SD."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Cells", "expressing", "fluorescently", "-", "tagged", "α2", "-", "tubulin", "(", "atb2", ")", "were", "imaged", "every", "5", "seconds", "and", "the", "dwell", "time", "of", "~", "100", "individual", "iMTs", "recorded", "within", "the", "final", "1", ".", "1", "µm", "of", "the", "cell", "for", "each", "strain", ".", "Red", "bars", "signify", "the", "mean", "(", "C", ")", " ", "Kymographs", "showing", "fluorescently", "-", "tagged", "Klp5", "/", "Klp6", "(", "Kinesin", ")", "co", "-", "imaged", "with", "fluorescently", "-", "tagged", "microtubules", "(", "MT", ")", "in", "the", "presence", "(", "top", "panels", ")", "and", "absence", "(", "bottom", "panels", ")", "of", "Mcp1", ".", "Banding", "on", "MT", ",", "caused", "by", "unequal", "incorporation", "of", "fluorescence", ",", "illustrates", "the", "force", "exerted", "on", "the", "MT", "by", "continued", "growth", "into", "the", "cell", "cortex", ".", "Dashed", "yellow", "line", "indicates", "the", "cell", "end", "(", "D", ")", " ", "MT", " ", "growth", "speed", "was", "calculated", "from", "kymographs", "from", "control", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "∆", "mcp1", "cells", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "Klp5", "/", "Klp6", "walk", "speed", "was", "calculated", "from", "multiple", "individual", "runs", "on", "the", "MT", "lattice", "in", "control", "(", "n", "=", "44", ")", "and", "∆", "mcp1", "cells", "(", "n", "=", "32", ")", "(", "E", ")", "Average", "intensity", "of", "Klp5", "/", "Klp6", "at", "the", "plus", "ends", "of", "iMTs", "from", "multiple", "kymographs", "of", "control", "(", "n", "=", "19", ")", "or", "∆", "mcp1", "cells", "(", "n", "=", "14", ")", "(", "F", ")", "Mixing", "experiment", "to", "compare", "fluorescently", "-", "tagged", "Klp5", "/", "Klp6", "levels", "between", "cells", "either", "expressing", "(", "blue", ",", "closed", "arrowheads", ")", "or", "deleted", "(", "red", ",", "open", "arrowhead", ")", "for", "Mcp1", "distinguished", "by", "the", "absence", "of", "fluorescently", "-", "tagged", "nuclear", "envelope", "protein", "Cut11", "(", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5µm", ".", "Box", "plot", "(", "right", "panel", ")", "shows", "quantitated", "fluorescence", "values", "for", "nuclear", "levels", "of", "Klp5", "/", "Klp6", "in", "control", "(", "n", "=", "44", ")", "and", "∆", "mcp1", "cells", "(", "n", "=", "45", ")", "and", "at", "the", "MT", "plus", "end", "in", "control", "(", "n", "=", "64", ")", "and", "∆", "mcp1", "cells", "(", "n", "=", "35", ")", "prior", "to"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Cells expressing fluorescently-tagged α2-tubulin (atb2) were imaged every 5 seconds and the dwell time of ~100 individual iMTs recorded within the final 1.1 µm of the cell for each strain. Red bars signify the mean(C) Kymographs showing fluorescently-tagged Klp5/Klp6 (Kinesin) co-imaged with fluorescently-tagged microtubules (MT) in the presence (top panels) and absence (bottom panels) of Mcp1. Banding on MT, caused by unequal incorporation of fluorescence, illustrates the force exerted on the MT by continued growth into the cell cortex. Dashed yellow line indicates the cell end(D) MT growth speed was calculated from kymographs from control (n=16) and ∆mcp1 cells (n=11), Klp5/Klp6 walk speed was calculated from multiple individual runs on the MT lattice in control (n=44) and ∆mcp1 cells (n=32)(E) Average intensity of Klp5/Klp6 at the plus ends of iMTs from multiple kymographs of control (n=19) or ∆mcp1 cells (n=14)(F) Mixing experiment to compare fluorescently-tagged Klp5/Klp6 levels between cells either expressing (blue, closed arrowheads) or deleted (red, open arrowhead) for Mcp1 distinguished by the absence of fluorescently-tagged nuclear envelope protein Cut11 (left panel). Scale bar, 5µm. Box plot (right panel) shows quantitated fluorescence values for nuclear levels of Klp5/Klp6 in control (n=44) and ∆mcp1 cells (n=45) and at the MT plus end in control (n=64) and ∆mcp1 cells (n=35) prior to shrinkage"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Log", "phase", "cells", "expressing", "fluorescently", "-", "tagged", "MTs", "were", "imaged", "and", "the", "levels", "of", "either", "fluorescently", "-", "tagged", "Klp5", "/", "Klp6", "or", "Tea2", "at", "the", "plus", "ends", "of", "growing", "MTs", "determined", ".", "Measurements", "(", "klp5", "-", "mNG", "klp6", "-", "mNG", ",", "n", "=", "305", ";", "tea2", "-", "GFP", ",", "n", "=", "359", ")", "were", "plotted", "against", "microtubule", "(", "MT", ")", "length", "and", "third", "order", "polynomial", "curves", "fitted", "to", "the", "data", "(", "B", ")", " ", "Kymographs", "showing", "fluorescently", "-", "tagged", "MTs", "co", "-", "imaged", "with", "fluorescently", "-", "tagged", "Tea2", " ", "kinesin", "in", "control", "cells", "(", "top", "panels", ")", "or", "in", "the", "absence", "of", "Klp6", "(", "middle", "panels", ")", "or", "Mcp1", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Dashed", "yellow", "line", "indicates", "the", "cell", "end", "(", "C", ")", "Intensity", "of", "Tea2", "at", "plus", "ends", "quantitated", "from", "multiple", "kymographs", "of", "the", "type", "in", "(", "B", ")", "for", "control", "(", "n", "=", "16", ")", ",", "∆", "klp6", "(", "n", "=", "13", ")", "or", "∆", "mcp1", "(", "n", "=", "14", ")", "cells", "(", "D", ")", " ", "Kymographs", "showing", "fluorescently", "-", "tagged", "MTs", "co", "-", "imaged", "with", "fluorescently", "-", "tagged", "Klp5", "/", "Klp6", "in", "control", "(", "top", "panels", ",", "repeated", "from", "1C", ")", "or", "∆", "tea2", "cells", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Dashed", "yellow", "line", "indicates", "the", "cell", "end", "(", "E", ")", "Cells", "expressing", "fluorescently", "-", "tagged", "tubulin", "were", "imaged", "every", "5", "seconds", "and", "the", "dwell", "time", "of", "~", "100", "individual", "iMTs", "for", "each", "condition", "recorded", "within", "the", "final", "1", ".", "1", "µm", "of", "the", "cell", ".", "Red", "bars", "signify", "the"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Log phase cells expressing fluorescently-tagged MTs were imaged and the levels of either fluorescently-tagged Klp5/Klp6 or Tea2 at the plus ends of growing MTs determined. Measurements (klp5-mNG klp6-mNG, n=305; tea2-GFP, n=359) were plotted against microtubule (MT) length and third order polynomial curves fitted to the data(B) Kymographs showing fluorescently-tagged MTs co-imaged with fluorescently-tagged Tea2 kinesin in control cells (top panels) or in the absence of Klp6 (middle panels) or Mcp1 (bottom panels). Dashed yellow line indicates the cell end (C) Intensity of Tea2 at plus ends quantitated from multiple kymographs of the type in (B) for control (n=16), ∆klp6 (n=13) or ∆mcp1 (n=14) cells (D) Kymographs showing fluorescently-tagged MTs co-imaged with fluorescently-tagged Klp5/Klp6 in control (top panels, repeated from 1C) or ∆tea2 cells (bottom panels). Dashed yellow line indicates the cell end(E) Cells expressing fluorescently-tagged tubulin were imaged every 5 seconds and the dwell time of ~100 individual iMTs for each condition recorded within the final 1.1 µm of the cell. Red bars signify the mean"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", " ", "Kymograph", "(", "top", "left", "panels", ")", "showing", "fluorescently", "-", "tagged", "Tea2", "(", "Kinesin", ")", "co", "-", "imaged", "with", "fluorescently", "-", "tagged", "Tip1", "(", "Tip1", "-", "Tdtom", ")", ".", "Dashed", "yellow", "line", "indicates", "the", "position", "of", "the", "cell", "end", ".", "Plots", "(", "bottom", "left", "panels", ")", "show", "both", "the", "relative", "fluorescence", "intensity", "and", "position", "for", "Tea2", "(", "green", ")", "and", "Tip1", "(", "magenta", ")", "corresponding", "to", "the", "numbered", "sections", "of", "the", "kymograph", ".", "Scale", "bar", "2µm", ".", "Data", "quantitated", "from", "this", "kymograph", "by", "extracting", "the", "maximal", "intensity", "pixel", "value", "at", "the", "MT", "plus", "end", "for", "Tea2", "(", "green", ")", "and", "Tip1", "(", "magenta", ")", "over", "time", "(", "top", "right", ")", "and", "the", "distance", "of", "these", "pixels", "from", "the", "cell", "end", "(", "bottom", "right", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Kymograph (top left panels) showing fluorescently-tagged Tea2 (Kinesin) co-imaged with fluorescently-tagged Tip1 (Tip1-Tdtom). Dashed yellow line indicates the position of the cell end. Plots (bottom left panels) show both the relative fluorescence intensity and position for Tea2 (green) and Tip1 (magenta) corresponding to the numbered sections of the kymograph. Scale bar 2µm. Data quantitated from this kymograph by extracting the maximal intensity pixel value at the MT plus end for Tea2 (green) and Tip1 (magenta) over time (top right) and the distance of these pixels from the cell end (bottom right)"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Kymograph", "(", "top", "left", "panels", ")", "showing", "fluorescently", "-", "tagged", "Klp5", "/", "Klp6", "(", "Kinesin", ")", "co", "-", "imaged", "with", "fluorescently", "-", "tagged", "Tip1", "(", "Tip1", "-", "Tdtom", ")", ".", "Dashed", "yellow", "line", "indicates", "the", "cell", "end", ".", "Plots", "(", "bottom", "left", "panels", ")", "show", "both", "the", "fluorescence", "intensity", "and", "position", "of", "Klp5", "/", "Klp6", "(", "green", ")", "and", "Tip1", "(", "magenta", ")", "corresponding", "to", "the", "numbered", "sections", "of", "the", "kymograph", ".", "Scale", "bar", ",", "2µm", ".", "Intensity", "of", "the", "maximal", "value", "pixel", "at", "the", "plus", "end", "(", "top", "right", "panel", ")", "and", "its", "position", "relative", "to", "the", "cell", "end", "(", "bottom", "right", "panel", ")", "for", "both", "Klp5", "/", "Klp6", "(", "green", ")", "and", "Tip1", "(", "magenta", ")", "plotted", "relative", "to", "MT", "shrinkage", "for", "this", "kymograph"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A) Kymograph (top left panels) showing fluorescently-tagged Klp5/Klp6 (Kinesin) co-imaged with fluorescently-tagged Tip1 (Tip1-Tdtom). Dashed yellow line indicates the cell end. Plots (bottom left panels) show both the fluorescence intensity and position of Klp5/Klp6 (green) and Tip1 (magenta) corresponding to the numbered sections of the kymograph. Scale bar, 2µm. Intensity of the maximal value pixel at the plus end (top right panel) and its position relative to the cell end (bottom right panel) for both Klp5/Klp6 (green) and Tip1 (magenta) plotted relative to MT shrinkage for this kymograph "}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "The", "absolute", "abundance", "of", "centrosomal", "proteins", "in", "whole", "cell", "lysates", ",", "prepared", "from", "asynchronous", "growing", "cells", ",", "was", "determined", "using", "SRM", "mass", "spectrometry", "combined", "with", "stable", "isotope", "dilution", ".", "Copy", "numbers", "per", "cell", "were", "measured", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "Because", "not", "all", "peptides", "could", "be", "detected", "in", "all", "experiments", ",", "histograms", "show", "average", "values", "determined", "in", "those", "two", "measurements", "in", "which", "most", "peptides", "could", "be", "measured", "reliably", ";", "Results", "presented", "are", "means", "±", "SEM", ".", "RPE", "-", "1", "(", "non", "-", "transformed", ")", "cells", "were", "compared", "with", "various", "tumor", "-", "derived", "(", "U2OS", ",", "HeLa", ",", "KE37", ")", "or", "transformed", "cells", "(", "HEK293T", ")", ".", "Note", "the", "different", "scale", "for", "γ", "-", "tubulin", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "B", ")", "Representative", "image", "showing", "centrosome", "preparation", "stained", "with", "antibodies", "to", "NEDD1", "(", "green", ")", "and", "CP110", "(", "red", ")", ".", "Bar", ":", "10", "μm", ".", "C", ")", "Purified", "centrosomes", "from", "KE37", "cells", "were", "analyzed", "by", "SRM", "with", "stable", "isotope", "dilution", ".", "Histogram", "a", "priori", "represents", "relative", "copy", "numbers", "per", "centrosome", "(", "Results", "presented", "are", "means", "±", "SEM", ".", ")", ".", "To", "predict", "protein", "abundance", "in", "absolute", "numbers", "(", "average", "number", "of", "copies", "/", "centrosome", ")", ",", "data", "were", "normalized", "to", "1340", "γ", "-", "tubulin", "molecules", ",", "i", ".", "e", ".", "the", "average", "number", "of", "γ", "-", "tubulin", "per", "centrosome", "as", "deduced", "by", "combining", "SRM", "and", "EGFP", "fluorescence", "measurements", "(", "Figs", "4", "and", "5", ")", ".", "Bars", "for", "Sas", "-", "6", "and", "STIL", "are", "marked", "in", "red", "to", "indicate", "that", "the", "corresponding", "values", "should", "be", "approximately", "doubled", "to", "correct", "for", "the", "fact", "that", "some", "50", "%", "of", "purified", "centrosomes", "are", "derived", "from", "G1", "phase", "cells", "that", "mostly", "lack", "these", "two", "proteins", ".", "Note", "the", "different", "scale", "for", "γ", "-", "tubulin", "on", "the", "y", "-", "axis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) The absolute abundance of centrosomal proteins in whole cell lysates, prepared from asynchronous growing cells, was determined using SRM mass spectrometry combined with stable isotope dilution. Copy numbers per cell were measured in three independent experiments. Because not all peptides could be detected in all experiments, histograms show average values determined in those two measurements in which most peptides could be measured reliably; Results presented are means ± SEM. RPE-1 (non-transformed) cells were compared with various tumor-derived (U2OS, HeLa, KE37) or transformed cells (HEK293T). Note the different scale for γ-tubulin on the y-axis.B) Representative image showing centrosome preparation stained with antibodies to NEDD1 (green) and CP110 (red). Bar: 10 μm.C) Purified centrosomes from KE37 cells were analyzed by SRM with stable isotope dilution. Histogram a priori represents relative copy numbers per centrosome (Results presented are means ± SEM.). To predict protein abundance in absolute numbers (average number of copies/centrosome), data were normalized to 1340 γ-tubulin molecules, i.e. the average number of γ-tubulin per centrosome as deduced by combining SRM and EGFP fluorescence measurements (Figs 4 and 5). Bars for Sas-6 and STIL are marked in red to indicate that the corresponding values should be approximately doubled to correct for the fact that some 50% of purified centrosomes are derived from G1 phase cells that mostly lack these two proteins. Note the different scale for γ-tubulin on the y-axis."}
{"words": ["Figure", "3Centrosome", "preparations", "from", "KE37", "cells", "were", "analyzed", "by", "shotgun", "proteomics", "and", "relative", "protein", "abundances", "determined", "using", "the", "iBAQ", "shotgun", "proteomics", "method", ".", "The", "iBAQ", "values", "were", "normalized", "with", "the", "trendline", "as", "obtained", "from", "the", "SRM", "measurements", "(", "Fig", "EV1", ",", "panel", "E", ")", "and", "γ", "-", "tubulin", "was", "normalized", "to", "1340", "copies", "/", "centrosome", ".", "A", "subset", "of", "centrosomal", "proteins", "is", "shown", "as", "described", "in", "(", "Azimzadeh", "et", "al", ",", "2012", ")", ".", "Black", "bars", "represent", "the", "centrosome", "subset", "and", "red", "bars", "represent", "the", "values", "obtained", "by", "SRM", ".", "Results", "presented", "are", "means", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Centrosome preparations from KE37 cells were analyzed by shotgun proteomics and relative protein abundances determined using the iBAQ shotgun proteomics method. The iBAQ values were normalized with the trendline as obtained from the SRM measurements (Fig EV1, panel E) and γ-tubulin was normalized to 1340 copies/centrosome. A subset of centrosomal proteins is shown as described in (Azimzadeh et al, 2012). Black bars represent the centrosome subset and red bars represent the values obtained by SRM. Results presented are means ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Fluorescence", "analysis", "of", "RPE", "-", "1", "cells", "expressing", "endogenously", "tagged", "γ", "-", "tubulin", "-", "EGFP", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G2", ",", "using", "RO", "-", "3306", ",", "to", "allow", "for", "a", "clear", "distinction", "of", "the", "two", "centrosomes", "present", "at", "this", "cell", "cycle", "stage", ".", "Panels", "illustrate", "sum", "projections", "of", "the", "stacks", "from", "an", "original", "picture", "(", "left", ")", ",", "a", "whole", "cell", "mask", "(", "middle", ")", "and", "a", "centrosome", "mask", "(", "right", ")", ";", "both", "masks", "are", "based", "on", "intensity", "thresholding", ".", "Bar", ":", "10", "μm", ".", "B", ")", "EGFP", "-", "tagged", "viral", "like", "particles", "(", "GFP", "-", "VLP2", "/", "6", ")", "are", "used", "as", "a", "reference", "for", "quantification", "of", "γ", "-", "tubulin", "-", "EGFP", ".", "The", "histogram", "shows", "the", "distribution", "of", "the", "total", "fluorescence", "intensity", "associated", "with", "single", "GFP", "-", "VLP2", "/", "6", ";", "the", "2", "dashed", "lines", "delimit", "the", "population", "used", "for", "assigning", "an", "average", "fluorescence", "intensity", "value", "to", "represent", "the", "120", "GFP", "molecules", "associated", "with", "each", "VLP2", "/", "6", "particle", "(", "Charpilienne", "et", "al", ",", "2001", ")", ".", "The", "inset", "shows", "a", "sum", "projection", "of", "EGFP", "-", "VLPs", "fluorescence", "image", ".", "Bar", ":", "10", "μm", ".", "C", ")", "Scatter", "plots", "show", "the", "numbers", "of", "γ", "-", "tubulin", "molecules", "per", "centrosome", "determined", "by", "calibrations", "using", "either", "SRM", "measurements", "(", "n", "=", "46", "cells", ")", "or", "EGFP", "-", "VLP2", "/", "6", "fluorescence", "(", "n", "=", "40", "cells", ")", ".", "The", "black", "lines", "represent", "mean", "values", ";", "numbers", "±", "SEM", "are", "indicated", "on", "top", "of", "each", "scatter", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Fluorescence analysis of RPE-1 cells expressing endogenously tagged γ-tubulin-EGFP. Cells were synchronized in G2, using RO-3306, to allow for a clear distinction of the two centrosomes present at this cell cycle stage. Panels illustrate sum projections of the stacks from an original picture (left), a whole cell mask (middle) and a centrosome mask (right); both masks are based on intensity thresholding. Bar: 10 μm.B) EGFP-tagged viral like particles (GFP-VLP2/6) are used as a reference for quantification of γ-tubulin-EGFP. The histogram shows the distribution of the total fluorescence intensity associated with single GFP-VLP2/6; the 2 dashed lines delimit the population used for assigning an average fluorescence intensity value to represent the 120 GFP molecules associated with each VLP2/6 particle (Charpilienne et al, 2001). The inset shows a sum projection of EGFP-VLPs fluorescence image. Bar: 10 μm.C) Scatter plots show the numbers of γ-tubulin molecules per centrosome determined by calibrations using either SRM measurements (n=46 cells) or EGFP-VLP2/6 fluorescence (n=40 cells). The black lines represent mean values; numbers ± SEM are indicated on top of each scatter plot."}
{"words": ["Figure", "5To", "determine", "the", "cell", "cycle", "dependence", "of", "centrosomal", "protein", "abundance", "by", "fluorescence", "quantification", ",", "endogenously", "tagged", "RPE", "-", "1", "cells", "were", "synchronized", "as", "described", "under", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "See", "also", "Fig", "EV5", ",", "panel", "D", ")", ".", "A", "-", "C", ")", "Top", "panels", ":", "RPE", "-", "1", "cells", "expressing", "(", "endogenous", ")", "γ", "-", "tubulin", "-", "EGFP", "(", "A", ")", "at", "the", "indicted", "cell", "cycle", "stages", ".", "Fluorescence", "images", "of", "representative", "cells", "are", "shown", "as", "maximum", "projections", ".", "Bars", ":", "10μm", ".", "Bottom", "panels", ":", "Fluorescence", "quantifications", "were", "performed", "using", "the", "EGFP", "-", "VLP2", "/", "6", "method", "for", "calibration", ".", "Scatter", "plots", "represent", "the", "number", "of", "γ", "-", "tubulin", "(", "A", ")", "molecules", "per", "centrosome", "at", "the", "indicated", "cell", "cycle", "stages", ".", "The", "black", "lines", "represent", "mean", "values", ";", "numbers", "±", "SEM", "are", "indicated", "on", "top", "of", "each", "scatter", "plot", ".", "The", "following", "numbers", "of", "cells", "were", "analyzed", "in", "early", "S", "phase", ":", "γ", "-", "tubulin", ":", "45", ";", "in", "late", "S", "/", "G2", "phase", ":", "γ", "-", "tubulin", ":", "45", ";", "in", "late", "G2", "phase", ":", "γ", "-", "tubulin", ":", "48", ";", "in", "early", "mitosis", ":", "γ", "-", "tubulin", ":", "31", ".", "Note", "that", "fluorescence", "images", "were", "recorded", "using", "identical", "settings", ".", "P", "values", "from", "t", "-", "tests", "are", "indicated", "by", "the", "following", "symbols", ":", "*", "*", "*", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "*", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "001", "-", "0", ".", "01", ")", ",", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "01", "-", "0", ".", "05", ")", "and", "ns", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "To", "determine", "the", "cell", "cycle", "dependence", "of", "centrosomal", "protein", "abundance", "by", "fluorescence", "quantification", ",", "endogenously", "tagged", "RPE", "-", "1", "cells", "were", "synchronized", "as", "described", "under", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "See", "also", "Fig", "EV5", ",", "panel", "D", ")", ".", "A", "-", "C", ")", "Top", "panels", ":", "RPE", "-", "1", "cells", "expressing", "Sas", "-", "6", "(", "B", ")", "at", "the", "indicted", "cell", "cycle", "stages", ".", "Fluorescence", "images", "of", "representative", "cells", "are", "shown", "as", "maximum", "projections", ".", "Bars", ":", "10μm", ".", "Bottom", "panels", ":", "Fluorescence", "quantifications", "were", "performed", "using", "the", "EGFP", "-", "VLP2", "/", "6", "method", "for", "calibration", ".", "Scatter", "plots", "represent", "the", "number", "of", "molecules", "per", "centrosome", "at", "the", "indicated", "cell", "cycle", "stages", ".", "The", "black", "lines", "represent", "mean", "values", ";", "numbers", "±", "SEM", "are", "indicated", "on", "top", "of", "each", "scatter", "plot", ".", "The", "following", "numbers", "of", "cells", "were", "analyzed", "in", "early", "S", "phase", ":", "Sas", "-", "6", ":", "43", ";", "in", "late", "S", "/", "G2", "phase", ":", "Sas", "-", "6", ":", "46", ";", "in", "late", "G2", "phase", ":", "Sas", "-", "6", ":", "48", ".", "Note", "that", "fluorescence", "images", "were", "recorded", "using", "identical", "settings", ".", "P", "values", "from", "t", "-", "tests", "are", "indicated", "by", "the", "following", "symbols", ":", "*", "*", "*", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "*", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "001", "-", "0", ".", "01", ")", ",", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "01", "-", "0", ".", "05", ")", "and", "ns", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "To", "determine", "the", "cell", "cycle", "dependence", "of", "centrosomal", "protein", "abundance", "by", "fluorescence", "quantification", ",", "endogenously", "tagged", "RPE", "-", "1", "cells", "were", "synchronized", "as", "described", "under", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "See", "also", "Fig", "EV5", ",", "panel", "D", ")", ".", "A", "-", "C", ")", "Top", "panels", ":", "RPE", "-", "1", "cells", "expressing", "STIL", "(", "C", ")", "at", "the", "indicted", "cell", "cycle", "stages", ".", "Fluorescence", "images", "of", "representative", "cells", "are", "shown", "as", "maximum", "projections", ".", "Bars", ":", "10μm", ".", "Bottom", "panels", ":", "Fluorescence", "quantifications", "were", "performed", "using", "the", "EGFP", "-", "VLP2", "/", "6", "method", "for", "calibration", ".", "Scatter", "plots", "represent", "the", "number", "of", "STIL", "(", "C", ")", "molecules", "per", "centrosome", "at", "the", "indicated", "cell", "cycle", "stages", ".", "The", "black", "lines", "represent", "mean", "values", ";", "numbers", "±", "SEM", "are", "indicated", "on", "top", "of", "each", "scatter", "plot", ".", "The", "following", "numbers", "of", "cells", "were", "analyzed", "in", "early", "S", "phase", ":", "STIL", ":", "79", ";", "in", "late", "S", "/", "G2", "phase", ":", "STIL", ":", "68", ";", "in", "late", "G2", "phase", ":", "STIL", ":", "68", ".", "Note", "that", "fluorescence", "images", "were", "recorded", "using", "identical", "settings", ".", "P", "values", "from", "t", "-", "tests", "are", "indicated", "by", "the", "following", "symbols", ":", "*", "*", "*", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "*", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "001", "-", "0", ".", "01", ")", ",", "*", "(", "P", "=", "0", ".", "01", "-", "0", ".", "05", ")", "and", "ns", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5To determine the cell cycle dependence of centrosomal protein abundance by fluorescence quantification, endogenously tagged RPE-1 cells were synchronized as described under Materials and Methods. (See also Fig EV5, panel D). A-C) Top panels: RPE-1 cells expressing (endogenous) γ-tubulin-EGFP (A) at the indicted cell cycle stages. Fluorescence images of representative cells are shown as maximum projections. Bars: 10μm. Bottom panels: Fluorescence quantifications were performed using the EGFP-VLP2/6 method for calibration. Scatter plots represent the number of γ-tubulin (A) molecules per centrosome at the indicated cell cycle stages. The black lines represent mean values; numbers ± SEM are indicated on top of each scatter plot. The following numbers of cells were analyzed in early S phase: γ-tubulin: 45; in late S/G2 phase: γ-tubulin: 45; in late G2 phase: γ-tubulin: 48; in early mitosis: γ-tubulin: 31. Note that fluorescence images were recorded using identical settings. P values from t-tests are indicated by the following symbols: *** (P < 0.001), ** (P = 0.001-0.01), * (P = 0.01-0.05) and ns (P > 0.05).To determine the cell cycle dependence of centrosomal protein abundance by fluorescence quantification, endogenously tagged RPE-1 cells were synchronized as described under Materials and Methods. (See also Fig EV5, panel D). A-C) Top panels: RPE-1 cells expressing Sas-6 (B) at the indicted cell cycle stages. Fluorescence images of representative cells are shown as maximum projections. Bars: 10μm. Bottom panels: Fluorescence quantifications were performed using the EGFP-VLP2/6 method for calibration. Scatter plots represent the number of molecules per centrosome at the indicated cell cycle stages. The black lines represent mean values; numbers ± SEM are indicated on top of each scatter plot. The following numbers of cells were analyzed in early S phase: Sas-6: 43; in late S/G2 phase: Sas-6: 46; in late G2 phase: Sas-6: 48. Note that fluorescence images were recorded using identical settings. P values from t-tests are indicated by the following symbols: *** (P < 0.001), ** (P = 0.001-0.01), * (P = 0.01-0.05) and ns (P > 0.05).To determine the cell cycle dependence of centrosomal protein abundance by fluorescence quantification, endogenously tagged RPE-1 cells were synchronized as described under Materials and Methods. (See also Fig EV5, panel D). A-C) Top panels: RPE-1 cells expressing STIL (C) at the indicted cell cycle stages. Fluorescence images of representative cells are shown as maximum projections. Bars: 10μm. Bottom panels: Fluorescence quantifications were performed using the EGFP-VLP2/6 method for calibration. Scatter plots represent the number of STIL (C) molecules per centrosome at the indicated cell cycle stages. The black lines represent mean values; numbers ± SEM are indicated on top of each scatter plot. The following numbers of cells were analyzed in early S phase: STIL: 79; in late S/G2 phase: STIL: 68; in late G2 phase: STIL: 68. Note that fluorescence images were recorded using identical settings. P values from t-tests are indicated by the following symbols: *** (P < 0.001), ** (P = 0.001-0.01), * (P = 0.01-0.05) and ns (P > 0.05)."}
{"words": ["f1a", ",", "Correlative", "light", "and", "electron", "microscopy", "of", "HeLa", "/", "GFP", "-", "LC3", "cell", "infected", "with", "SIN", "/", "mCherry", ".", "capsid", "virus", ".", "Top", "left", ",", "deconvolved", "image", "of", "red", "and", "green", "fluorescence", "channels", ";", "middle", ",", "three", "-", "dimensional", "surface", "reconstruction", "of", "red", "and", "green", "channels", ";", "right", ",", "yellow", "(", "red", "+", "green", ")", "colocalization", "channel", ".", "Arrows", "denote", "yellow", "puncta", "that", "correspond", "to", "'", "1", "'", "and", "'", "2", "'", "in", "electron", "microscopy", "images", "below", ".", "Bottom", "left", ",", "electron", "microscopy", "of", "identical", "cell", ";", "middle", "and", "right", ",", "high", "magnification", "images", "of", "insets", "'", "1", "'", "and", "'", "2", "'", ".", "Scale", "bars", ",", "left", ",", "10", "µm", ";", "middle", "and", "right", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, Correlative light and electron microscopy of HeLa/GFP-LC3 cell infected with SIN/mCherry.capsid virus. Top left, deconvolved image of red and green fluorescence channels; middle, three-dimensional surface reconstruction of red and green channels; right, yellow (red + green) colocalization channel. Arrows denote yellow puncta that correspond to '1' and '2' in electron microscopy images below. Bottom left, electron microscopy of identical cell; middle and right, high magnification images of insets '1' and '2'. Scale bars, left, 10 µm; middle and right, 200 nm."}
{"words": ["f3a", ",", "Electron", "microscopy", "analysis", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Smurf1", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "MEFs", "grown", "in", "normal", "media", "or", "EBSS", "(", "starvation", ")", "for", "4", "h", ".", "Arrowheads", ",", "representative", "autophagosomes", ";", "arrows", ",", "representative", "autolysosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "nm", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analyses", "of", "LC3", "-", "I", "/", "II", "(", "non", "-", "lipidated", "and", "lipidated", "forms", "of", "MAP1LC3", ",", "respectively", ")", "and", "p62", "levels", "in", "MEFs", "of", "indicated", "genotype", ".", "c", ",", "Quantification", "of", "colocalization", "of", "SIN", "/", "mCherry", ".", "capsid", "and", "GFP", "-", "LC3", "in", "indicated", "MEFs", "16", "h", "after", "SIN", "/", "mCherry", ".", "capsid", "/", "GFP", "-", "LC3", "infection", ".", "Data", "shown", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "number", "of", "colocalized", "red", "and", "green", "puncta", "per", "cell", "for", "50", "cells", "per", "well", "in", "triplicate", "samples", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "against", "wild", "-", "type", ",", "Students", "t", "-", "test", ".", "d", ",", "Representative", "confocal", "micrographs", "of", "colocalization", "of", "SIN", "/", "mCherry", ".", "capsid", "and", "GFP", "-", "LC3", "in", "indicated", "MEFs", "16", " ", "h", "after", "SIN", "/", "mCherry", ".", "capsid", "/", "GFP", "-", "LC3", "infection", "images", "used", "for", "quantification", "in", "c", ".", "Arrows", ",", "colocalized", "red", "and", "green", "puncta", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "&", "amp", ";", "amp", ";", "mgr", ";", "m", ".", "e", ",", "Representative", "electron", "microscopy", "images", "of", "indicated", "MEFs", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "(", "strain", "17termA", ")", ".", "White", "arrowheads", ",", "partially", "degraded", "viral", "nucleocapsids", "inside", "autolysosomes", ";", "black", "arrowheads", ",", "intact", "viral", "nucleocapsids", "inside", "viral", "vesicles", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "µm", ".", "For", "a", "-", "e", ",", "similar", "results", "were", "obtained", "in", "3", "-", "5", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Electron microscopy analysis of wild-type (WT) and Smurf1-/- (KO) MEFs grown in normal media or EBSS (starvation) for 4 h. Arrowheads, representative autophagosomes; arrows, representative autolysosomes. Scale bars, 500 nm.b, Western blot analyses of LC3-I/II (non-lipidated and lipidated forms of MAP1LC3, respectively) and p62 levels in MEFs of indicated genotype.c, Quantification of colocalization of SIN/mCherry.capsid and GFP-LC3 in indicated MEFs 16 h after SIN/mCherry.capsid/GFP-LC3 infection. Data shown represent mean ± s.e.m. number of colocalized red and green puncta per cell for 50 cells per well in triplicate samples. *P<0.001 against wild-type, Students t-test.d, Representative confocal micrographs of colocalization of SIN/mCherry.capsid and GFP-LC3 in indicated MEFs 16 h after SIN/mCherry.capsid/GFP-LC3 infection images used for quantification in c. Arrows, colocalized red and green puncta. Scale bar, 15 &amp;amp;mgr;m.e, Representative electron microscopy images of indicated MEFs infected with HSV-1 (strain 17termA). White arrowheads, partially degraded viral nucleocapsids inside autolysosomes; black arrowheads, intact viral nucleocapsids inside viral vesicles. Scale bar, 0.5 µm. For a-e, similar results were obtained in 3-5 independent experiments."}
{"words": ["f4a", ",", "Representative", "mitochondrial", "morphology", "in", "Smurf1", "+", "/", "+", "(", "wild", "-", "type", ")", "and", "Smurf1", "−", "/", "−", "(", "KO", ")", "MEFs", "transfected", "with", "indicated", "construct", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "10", " ", "µM", "CCCP", "for", "24", " ", "h", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "percentage", "of", "total", "cells", "with", "a", "diffuse", "accumulation", "of", "abnormal", "fragmented", "mitochondria", "and", "lack", "of", "mitochondrial", "clearance", ".", "Results", "shown", "represent", "combined", "data", "from", "3", "-", "5", "experiments", "per", "condition", "with", "triplicate", "wells", "(", "of", "at", "least", "100", "cells", "per", "well", ")", "analysed", "for", "each", "condition", "per", "experiment", ".", "Shown", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "average", "values", "from", "each", "experiment", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "001", ",", "Students", "t", "-", "test", ".", "c", ",", "Measurement", "of", "mitochondrial", "fractional", "area", "(", "percentage", "of", "total", "cellular", "area", ")", "in", "MEFs", "treated", "as", "in", "a", ".", "Results", "shown", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "50", "cells", "per", "condition", ".", "d", ",", "Representative", "confocal", "micrographs", "of", "KO", "MEFs", "transfected", "with", "YFP", "-", "SMURF1", "wild", "-", "type", "or", "YFP", "-", "SMURF1Dgr", ";", "C2", "(", "Dgr", ";", "C2", ")", "and", "treated", "for", "4", " ", "h", "with", "DMSO", "or", "CCCP", ".", "e", ",", "Representative", "confocal", "micrographs", "of", "KO", "MEFs", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "wild", "-", "type", "mCherry", "-", "SMURF1", "(", "WT", ")", "or", "mCherry", "-", "SMURF1Dgr", ";", "C2", "(", "Dgr", ";", "C2", ")", "and", "treated", "for", "4", " ", "h", "with", "CCCP", ".", "Inset", ",", "upper", "right", ",", "formation", "of", "completed", "autophagosome", "around", "a", "damaged", "mitochondrion", "associated", "with", "wild", "-", "type", "SMURF1", ";", "insets", ",", "lower", "right", ",", "incomplete", "autophagosomes", "or", "absence", "of", "LC3", "signal", "around", "mitochondria", "associated", "with", "SMURF1Dgr", ";", "C2", ".", "See", "also", "Supplementary", "Figs", "10", "and", "11", "for", "enlarged", "images", ".", "f", ",", "Representative", "electron", "microscopy", "images", "of", "indicated", "tissues", "from", "10", "-", "month", "-", "oldSmurf1", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", "or", "Smurf1", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "mice", ".", "Arrows", ",", "representative", "abnormal", "mitochondria", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", ".", "Similar", "abnormalities", "were", "observed", "throughout", "entire", "electron", "microscopy", "tissue", "section", "for", "each", "mouse", "and", "in", "tissue", "samples", "from", "three", "different", "mice", "for", "each", "genotype", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, Representative mitochondrial morphology in Smurf1+/+ (wild-type) and Smurf1−/− (KO) MEFs transfected with indicated construct and treated with DMSO or 10 µM CCCP for 24 h. b, Quantification of percentage of total cells with a diffuse accumulation of abnormal fragmented mitochondria and lack of mitochondrial clearance. Results shown represent combined data from 3-5 experiments per condition with triplicate wells (of at least 100 cells per well) analysed for each condition per experiment. Shown are mean ± s.e.m. for average values from each experiment. Similar results were observed in each independent experiment. *P  0.001, Students t-test. c, Measurement of mitochondrial fractional area (percentage of total cellular area) in MEFs treated as in a. Results shown represent mean ± s.e.m. for 50 cells per condition.d, Representative confocal micrographs of KO MEFs transfected with YFP-SMURF1 wild-type or YFP-SMURF1Dgr;C2 (Dgr;C2) and treated for 4 h with DMSO or CCCP.e, Representative confocal micrographs of KO MEFs transfected with GFP-LC3 and wild-type mCherry-SMURF1 (WT) or mCherry-SMURF1Dgr;C2 (Dgr;C2) and treated for 4 h with CCCP. Inset, upper right, formation of completed autophagosome around a damaged mitochondrion associated with wild-type SMURF1; insets, lower right, incomplete autophagosomes or absence of LC3 signal around mitochondria associated with SMURF1Dgr;C2. See also Supplementary Figs 10 and 11 for enlarged images.f, Representative electron microscopy images of indicated tissues from 10-month-oldSmurf1+/+ (WT) or Smurf1-/- (KO) mice. Arrows, representative abnormal mitochondria. Scale bars, 1 µm. Similar abnormalities were observed throughout entire electron microscopy tissue section for each mouse and in tissue samples from three different mice for each genotype."}
{"words": ["Figure", "1B", "Latency", "to", "enter", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "(", "blue", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", ".", "A", "significant", "reduction", "was", "found", "in", "the", "Gadd45a", "-", "KO", "at", "24", "hours", "and", "7", "days", "after", "the", "training", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "C", "In", "situ", "hybridization", "to", "detect", "Gadd45a", "mRNA", "in", "adult", "wild", "-", "type", "hippocampus", "(", "n", "=", "8", "animals", ";", "antisense", ",", "left", "panel", ";", "sense", ",", "middle", "panel", ")", "and", "in", "Gadd45a", "-", "KO", "sections", "(", "n", "=", "6", "animals", ";", "right", "panel", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "(", "black", "bar", ")", ".", "D", "Experience", "-", "dependent", "changes", "in", "mRNA", "levels", "were", "evaluated", "under", "control", "conditions", "(", "home", "cage", ")", "and", "exposed", "to", "the", "PA", "(", "context", ",", "and", "context", "+", "shock", "groups", ";", "n", "=", "6", "for", "all", "groups", ")", ",", "respectively", ".", "Hippocampal", "Gadd45a", "mRNA", "levels", "remained", "unchanged", ",", "while", "Gadd45b", "was", "induced", "(", "context", ";", "t10", "=", "2", ".", "427", ",", "context", "+", "shock", "t10", "=", "2", ".", "319", ")", ".", "Concomitantly", ",", "mRNA", "levels", "of", "activity", "-", "regulated", "cytoskeleton", "protein", "(", "Arc", ")", ",", "as", "a", "proxy", "of", "neuronal", "activation", ",", "were", "increased", "in", "mice", "exposed", "to", "the", "PA", "context", "(", "t10", "=", "3", ".", "406", ")", "and", "context", "+", "shock", "(", "t10", "=", "3", ".", "141", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "1", "-", "Way", "ANOVA", "and", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Latency to enter dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=11) and Gadd45a-KO (blue bars, n=11). A significant reduction was found in the Gadd45a-KO at 24 hours and 7 days after the training. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: * = p<0.05.C In situ hybridization to detect Gadd45a mRNA in adult wild-type hippocampus (n=8 animals; antisense, left panel; sense, middle panel) and in Gadd45a-KO sections (n=6 animals; right panel). Scale bars: 500 µm (black bar).D Experience-dependent changes in mRNA levels were evaluated under control conditions (home cage) and exposed to the PA (context, and context + shock groups; n=6 for all groups), respectively. Hippocampal Gadd45a mRNA levels remained unchanged, while Gadd45b was induced (context; t10=2.427, context + shock t10=2.319). Concomitantly, mRNA levels of activity-regulated cytoskeleton protein (Arc), as a proxy of neuronal activation, were increased in mice exposed to the PA context (t10=3.406) and context + shock (t10=3.141). Values shown are mean ± SEM; 1-Way ANOVA and unpaired t-test: * = p<0.05, *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "2Gadd45a", "mRNA", "level", "in", "the", "hippocampus", "of", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "7", ")", "was", "significantly", "increased", "(", "t10", "=", "4", ".", "189", ")", "as", "compared", "to", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Immunohistochemistry", "for", "hemagglutinin", "(", "HA", ",", "fused", "to", "Gadd45α", ")", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "Nex", "-", "Cre", "(", "-", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "5", ")", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "hippocampi", "(", "Nex", "-", "Cre", "(", "+", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "5", ")", "8", "weeks", "after", "AAV", "injection", ".", "Note", "that", "the", "Gadd45α", "-", "HA", "signal", "in", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "is", "predominantly", "found", "in", "the", "stratum", "pyramidale", "(", "sp", ")", "but", "also", "in", "the", "stratum", "oriens", "and", "stratum", "radiatum", "(", "so", "and", "sr", ",", "respectively", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "µm", ".", "D", "Cellular", "distribution", "of", "Gadd45α", "was", "analyzed", "by", "HA", "-", "western", "blot", "on", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "protein", "fractions", "of", "Gadd45a", "-", "WT", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "n", "=", "2", "for", "both", "groups", ")", ".", "HA", "was", "found", "predominantly", "in", "the", "nuclear", "fraction", "of", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "hippocampi", ",", "with", "a", "smaller", "but", "recognizable", "expression", "also", "in", "the", "cytoplasm", ".", "E", "Latency", "to", "enter", "the", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "10", ")", "and", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", "bars", ",", "n", "=", "12", ")", "in", "the", "PA", "test", ".", "A", "significant", "increase", "was", "found", "24", "hours", "and", "7", "days", "after", "the", "PA", "training", "in", "the", "Gadd45a", "-", "overexpresion", "group", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Gadd45a mRNA level in the hippocampus of Gadd45a-overexpressing mice (red, n=7) was significantly increased (t10=4.189) as compared to Gadd45a-WT (n=5). Values shown are mean ± SEM; unpaired t-test: ** = p<0.01.C Immunohistochemistry for hemagglutinin (HA, fused to Gadd45α) in Gadd45a-WT (Nex-Cre(-/-), n=5) and Gadd45a-overexpressing hippocampi (Nex-Cre(+/-), n=5) 8 weeks after AAV injection. Note that the Gadd45α-HA signal in Gadd45a-overexpressing mice is predominantly found in the stratum pyramidale (sp) but also in the stratum oriens and stratum radiatum (so and sr, respectively). Scale bar: 250 µm.D Cellular distribution of Gadd45α was analyzed by HA-western blot on nuclear and cytoplasmic protein fractions of Gadd45a-WT and Gadd45a-overexpressing mice (n=2 for both groups). HA was found predominantly in the nuclear fraction of Gadd45a-overexpressing hippocampi, with a smaller but recognizable expression also in the cytoplasm.E Latency to enter the dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=10) and Gadd45a-overexpressing mice (red bars, n=12) in the PA test. A significant increase was found 24 hours and 7 days after the PA training in the Gadd45a-overexpresion group. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: * = p<0.05."}
{"words": ["Figure", "3B", "LTP", "protocol", "was", "applied", "to", "16", "slices", "of", "Gadd45a", "-", "WT", "mice", "(", "white", "dots", ",", "n", "=", "5", "animals", ")", "and", "11", "slices", "of", "Gadd45a", "-", "KO", "mice", "(", "blue", "dots", ",", "n", "=", "5", "animals", ")", ",", "resulting", "in", "a", "significantly", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "t", "-", "test", ")", "lowered", "induction", "of", "LTP", "in", "Gadd45a", "-", "KO", "mice", "as", "compared", "with", "Gadd45a", "-", "WT", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ".", "C", "Gadd45a", "-", "overexpressing", "mice", "(", "red", "dots", ",", "n", "=", "10", "slices", "from", "6", "animals", ")", "presented", "a", "slightly", "increased", "LTP", "as", "compared", "with", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "dots", ",", "n", "=", "8", "slices", "from", "6", "animals", ")", ",", "which", "became", "more", "pronounced", "during", "the", "late", "phase", "of", "the", "experiment", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B LTP protocol was applied to 16 slices of Gadd45a-WT mice (white dots, n=5 animals) and 11 slices of Gadd45a-KO mice (blue dots, n=5 animals), resulting in a significantly (p<0.05, Student t-test) lowered induction of LTP in Gadd45a-KO mice as compared with Gadd45a-WT. Values shown are mean ± SEM. C Gadd45a-overexpressing mice (red dots, n=10 slices from 6 animals) presented a slightly increased LTP as compared with Gadd45a-WT (white dots, n=8 slices from 6 animals), which became more pronounced during the late phase of the experiment. Values shown are mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "4A", "MA", "plot", "of", "DESeq", "differential", "expression", "analysis", "with", "the", "1", "%", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "hits", "in", "red", "(", "5", "/", "402", ";", "and", "with", ">", "2", "-", "fold", "change", "1", "/", "65", ",", "up", "-", "/", "down", "-", "regulated", "respectively", ")", ".", "D", "UCSC", "browser", "view", "of", "reads", "-", "per", "-", "million", "-", "normalised", "RNA", "-", "seq", "coverage", "for", "Grin2a", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "black", ")", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "(", "blue", ")", "representative", "samples", ".", "Gene", "structure", "of", "Grin2a", "(", "colored", "in", "purple", ")", ",", "and", "the", "direction", "of", "transcription", "(", "red", "arrow", ")", ".", "Upper", "pannel", "covers", "the", "entire", "transcript", "while", "lower", "panel", "is", "an", "enlargement", "of", "exons", "4", "-", "8", ".", "E", "Detailed", "view", "of", "the", "extended", "3", "´", "UTR", "of", "Grin2a", "showing", "a", "significant", "5", "´", "<", "3", "´", "gradient", "in", "RNA", "-", "seq", "coverage", ".", "Note", "that", "the", "normalised", "read", "coverage", "is", "similar", "between", "genotypes", "at", "the", "actual", "3", "´", "UTR", "end", "but", "differs", "significantly", "upstream", "including", "the", "annotated", "exons", ".", "For", "subsequent", "experiments", ",", "position", "of", "the", "designed", "primers", "covering", "proximal", "and", "distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "are", "indicated", "below", ".", "F", ",", "G", "Validation", "of", "Gadd45α", "-", "regulated", "levels", "of", "Grin2a", "mRNA", "by", "qPCR", "with", "primers", "covering", "exons", "3", "-", "4", ".", "Grin2a", "mRNA", "levels", "were", "analyzed", "in", "the", "hippocampus", "of", "mice", "under", "control", "conditions", "(", "white", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "7", "and", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "7", ")", "and", "1", "hour", "after", "PA", "(", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "5", ",", "black", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "6", ",", "blue", "bars", ")", ".", "Random", "primed", "cDNA", "levels", "(", "F", ")", ",", "were", "very", "similar", "in", "all", "the", "experimental", "groups", ".", "Oligo", "(", "dT", ")", "-", "primed", "cDNA", "(", "G", ")", "revealed", "a", "significant", "increase", "of", "Grin2a", "1h", "after", "PA", ",", "which", "was", "only", "observed", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "mice", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "H", ",", "I", "mRNA", "levels", "of", "proximal", "vs", ".", "distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "analyzed", "in", "the", "same", "set", "of", "oligo", "(", "dT", ")", "-", "primed", "cDNA", ".", "(", "H", ")", "Significant", "increase", "in", "Grin2a", "mRNA", "levels", "was", "found", "for", "the", "proximal", "part", "only", "in", "Gadd45a", "-", "WT", ".", "(", "I", ")", "Distal", "parts", "of", "the", "3", "´", "UTR", "remained", "unchanged", "(", "n", "=", "6", "for", "all", "groups", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A MA plot of DESeq differential expression analysis with the 1% false discovery rate (FDR) hits in red (5/402; and with >2-fold change 1/65, up-/down-regulated respectively).D UCSC browser view of reads-per-million-normalised RNA-seq coverage for Grin2a in Gadd45a-WT (black) and Gadd45a-KO (blue) representative samples. Gene structure of Grin2a (colored in purple), and the direction of transcription (red arrow). Upper pannel covers the entire transcript while lower panel is an enlargement of exons 4-8.E Detailed view of the extended 3´UTR of Grin2a showing a significant 5´<3´ gradient in RNA-seq coverage. Note that the normalised read coverage is similar between genotypes at the actual 3´UTR end but differs significantly upstream including the annotated exons. For subsequent experiments, position of the designed primers covering proximal and distal parts of the 3´UTR are indicated below.F, G Validation of Gadd45α-regulated levels of Grin2a mRNA by qPCR with primers covering exons 3-4. Grin2a mRNA levels were analyzed in the hippocampus of mice under control conditions (white bars; Gadd45a-WT=7 and Gadd45a-KO=7) and 1 hour after PA (Gadd45a-WT=5, black bars; Gadd45a-KO=6, blue bars). Random primed cDNA levels (F), were very similar in all the experimental groups. Oligo(dT)-primed cDNA (G) revealed a significant increase of Grin2a 1h after PA, which was only observed in Gadd45a-WT mice. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: ** = p<0.01, *** = p<0.001. H, I mRNA levels of proximal vs. distal parts of the 3´UTR analyzed in the same set of oligo(dT)-primed cDNA. (H) Significant increase in Grin2a mRNA levels was found for the proximal part only in Gadd45a-WT. (I) Distal parts of the 3´UTR remained unchanged (n=6 for all groups). Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: * = p<0.05. "}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "NR2A", "protein", "levels", "were", "analyzed", "in", "the", "hippocampus", "of", "mice", "under", "control", "conditions", "(", "white", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", ",", "n", "=", "13", "and", "Gadd45a", "-", "KO", ",", "n", "=", "14", ")", "and", "1", "hour", "after", "PA", "(", "black", "bars", ";", "Gadd45a", "-", "WT", "=", "14", ",", "Gadd45a", "-", "KO", "=", "14", ")", ".", "NR2A", "signal", "(", "160", "kDa", ")", "was", "normalized", "to", "the", "loading", "control", "(", "tubulin", "(", "55", "kDa", ")", "for", "the", "total", "fraction", ",", "and", "synaptotagmin", "(", "68", "kDa", ")", "for", "the", "synaptosomal", "fraction", ")", "and", "calculated", "as", "percentage", "of", "control", ".", "In", "Gadd45a", "-", "WT", "samples", "(", "A", ")", ",", "NR2A", "protein", "levels", "were", "unchanged", "in", "the", "total", "fraction", "during", "memory", "formation", ",", "while", "in", "the", "synaptosomal", "fraction", ",", "a", "significant", "increase", "was", "detected", "(", "t20", "=", "3", ".", "199", ")", ".", "In", "Gadd45a", "-", "KO", "hippocampi", "(", "B", ")", ",", "levels", "of", "NR2A", "protein", "in", "both", "fractions", "remained", "unaltered", "during", "memory", "consolidation", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Gadd45α", "pulldown", "experiments", "were", "carried", "out", "in", "wild", "-", "type", "hippocampal", "lysates", "(", "n", "=", "12", "for", "all", "groups", ")", ".", "Percentage", "of", "input", "recovery", "was", "unchanged", "between", "GFP", "-", "FLAG", "(", "green", "bars", ")", "and", "Gadd45α", "-", "FLAG", "(", "black", "bars", ")", "for", "genes", "that", "are", "not", "regulated", "by", "Gadd45α", ",", "such", "as", "succinate", "dehydrogenase", "complex", "flavoprotein", "subunit", "A", "(", "Sdha", ",", "no", "3", "´", "UTR", "extension", ")", ",", "and", "mitogen", "-", "activated", "protein", "kinase", "6", "(", "Map2K6", ",", "containing", "3", "´", "UTR", "extension", "of", "10", "kb", ")", ".", "On", "the", "contrary", ",", "Gadd45α", "-", "FLAG", "bound", "fraction", "revealed", "a", "significant", "increase", "in", "Grin2a", "(", "t22", "=", "4", ".", "992", ")", "and", "Grm5", "mRNA", "(", "t22", "=", "4", ".", "939", ")", "as", "compared", "to", "GFP", "-", "FLAG", "fraction", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B NR2A protein levels were analyzed in the hippocampus of mice under control conditions (white bars; Gadd45a-WT, n=13 and Gadd45a-KO, n=14) and 1 hour after PA (black bars; Gadd45a-WT=14, Gadd45a-KO=14). NR2A signal (160 kDa) was normalized to the loading control (tubulin (55 kDa) for the total fraction, and synaptotagmin (68 kDa) for the synaptosomal fraction) and calculated as percentage of control. In Gadd45a-WT samples (A), NR2A protein levels were unchanged in the total fraction during memory formation, while in the synaptosomal fraction, a significant increase was detected (t20=3.199). In Gadd45a-KO hippocampi (B), levels of NR2A protein in both fractions remained unaltered during memory consolidation. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni post-hoc test: ** = p<0.01.C Gadd45α pulldown experiments were carried out in wild-type hippocampal lysates (n=12 for all groups). Percentage of input recovery was unchanged between GFP-FLAG (green bars) and Gadd45α-FLAG (black bars) for genes that are not regulated by Gadd45α, such as succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A (Sdha, no 3´UTR extension), and mitogen-activated protein kinase 6 (Map2K6, containing 3´UTR extension of 10 kb). On the contrary, Gadd45α-FLAG bound fraction revealed a significant increase in Grin2a (t22=4.992) and Grm5 mRNA (t22=4.939) as compared to GFP-FLAG fraction. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "6B", "Hippocampal", "Gadd45a", "mRNA", "levels", "were", "significantly", "upregulated", "in", "both", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "q24", "=", "4", ".", "094", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "groups", "(", "q24", "=", "4", ".", "726", ")", "(", "n", "=", "9", "for", "all", "groups", ")", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "Tukey", "´", "s", "multiple", "comparison", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "Immunohistochemistry", "for", "hemagglutinin", "(", "HA", ",", "fused", "to", "Gadd45α", ")", "in", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "left", ")", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "middle", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "(", "right", ")", "samples", "8", "weeks", "after", "AAV", "injection", "(", "n", "=", "3", "for", "all", "groups", ")", ".", "Upper", "row", "depicts", "the", "entire", "hippocampus", ",", "while", "center", "and", "lower", "rows", "show", "magnifications", "of", "the", "CA3", "area", "in", "which", "the", "HA", "signal", "(", "red", ")", "is", "not", "restricted", "to", "the", "nuclei", "(", "blue", "and", "white", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "µm", ".", "D", "Gadd45α", "-", "overexpression", "was", "confirmed", "at", "the", "protein", "level", "by", "HA", "-", "western", "blot", "on", "hippocampal", "samples", "from", "Gadd45a", "-", "WT", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "mice", "(", "n", "=", "3", "for", "all", "groups", ")", ".", "Hippocampus", "scale", "bars", ":", "250", "µm", ";", "CA3", "scale", "bars", ":", "50µm", ".", "E", "Latency", "to", "enter", "the", "dark", "compartment", "for", "Gadd45a", "-", "WT", "(", "white", "bars", ",", "n", "=", "12", ")", ",", "Gadd45a", "-", "overexpression", "(", "red", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "and", "Gadd45aK45E", "-", "overexpression", "mice", "(", "grey", "bars", ",", "n", "=", "11", ")", "in", "the", "PA", "test", ".", "Note", "that", ",", "unlike", "Gadd45a", "-", "overexpression", "mice", ",", "those", "expressing", "the", "mutated", "form", "of", "Gadd45α", "(", "no", "RNA", "-", "binding", "capacity", ")", "did", "not", "show", "an", "increase", "in", "memory", "retention", ".", "Values", "shown", "are", "mean", "±", "SEM", ";", "2", "-", "Way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "Post", "-", "hoc", "test", ":", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Hippocampal Gadd45a mRNA levels were significantly upregulated in both Gadd45a-overexpression (q24 = 4.094) and Gadd45aK45E-overexpression groups (q24 = 4.726) (n=9 for all groups). Values shown are mean ± SEM; Tukey´s multiple comparison test: * = p<0.05, ** = p<0.01.C Immunohistochemistry for hemagglutinin (HA, fused to Gadd45α) in Gadd45a-WT (left), Gadd45a-overexpression (middle) and Gadd45aK45E-overexpression (right) samples 8 weeks after AAV injection (n=3 for all groups). Upper row depicts the entire hippocampus, while center and lower rows show magnifications of the CA3 area in which the HA signal (red) is not restricted to the nuclei (blue and white). Scale bar: 250 µm.D Gadd45α-overexpression was confirmed at the protein level by HA-western blot on hippocampal samples from Gadd45a-WT, Gadd45a-overexpression and Gadd45aK45E-overexpression mice (n=3 for all groups). Hippocampus scale bars: 250 µm; CA3 scale bars: 50µm.E Latency to enter the dark compartment for Gadd45a-WT (white bars, n=12), Gadd45a-overexpression (red bars, n=11) and Gadd45aK45E-overexpression mice (grey bars, n=11) in the PA test. Note that, unlike Gadd45a-overexpression mice, those expressing the mutated form of Gadd45α (no RNA-binding capacity) did not show an increase in memory retention. Values shown are mean ± SEM; 2-Way ANOVA and Bonferroni Post-hoc test: * = p<0.05, *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Mutations", "in", "the", "kinase", "motif", "abolished", "the", "yeast", "toxicity", "of", "MavQ", ".", "S", ".", "cerevisiae", "was", "transformed", "with", "plasmids", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "MavQ", "or", "the", "indicated", "MavQ", "mutants", "under", "the", "galactose", "-", "inducible", "promoter", ".", "Yeast", "cells", "were", "spotted", "on", "synthetic", "medium", "supplemented", "with", "glucose", "or", "galactose", "for", "3", "days", "before", "image", "acquisition", ".", "B", ".", "The", "expression", "of", "MavQ", "in", "the", "yeast", "was", "detected", "by", "Flag", "antibody", ".", "The", "PGK", "(", "3", "-", "phosphoglyceric", "phosphokinase", ")", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Mutations in the kinase motif abolished the yeast toxicity of MavQ. S. cerevisiae was transformed with plasmids expressing Flag-tagged wild-type MavQ or the indicated MavQ mutants under the galactose-inducible promoter. Yeast cells were spotted on synthetic medium supplemented with glucose or galactose for 3 days before image acquisition.B. The expression of MavQ in the yeast was detected by Flag antibody. The PGK (3-phosphoglyceric phosphokinase) was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Biochemical", "assays", "for", "the", "kinase", "activity", "of", "MavQ", ".", "Purified", "MavQ", "was", "incubated", "with", "or", "without", "specific", "PI", "substrates", ",", "the", "conversion", "of", "ATP", "to", "ADP", "was", "measured", "by", "the", "ADP", "-", "Glo", "assay", ".", "RLU", ",", "relative", "luminescence", "units", ".", "B", ".", "H149", ",", "N152", "and", "D160", "in", "MavQ", "are", "critical", "for", "its", "kinase", "activity", ".", "Purified", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "MavQ", "were", "reacted", "with", "PtdIns", "and", "ATP", ".", "The", "kinase", "activity", "was", "determined", "by", "the", "ADP", "-", "Glo", "assay", ".", "C", ".", "The", "PI", "product", "produced", "by", "MavQ", "determined", "by", "TLC", "assays", ".", "di", "-", "C8", "-", "Bodipy", "-", "FL", "-", "PtdIns", "was", "used", "to", "react", "with", "MavQ", "(", "lane", "4", ")", "and", "samples", "were", "further", "incubated", "with", "the", "3", "-", "phosphatase", "MTM", "which", "hydrolyzes", "both", "PtdIns3P", "and", "PtdIns", "(", "3", ",", "5", ")", "P2", "(", "lane", "5", ")", "or", "with", "the", "PI4K", "LepB", "_", "NTD", "which", "phosphorylates", "PtdIns3P", "into", "PtdIns", "(", "3", ",", "4", ")", "P2", "(", "lane", "6", ")", ".", "A", "schematic", "illustration", "of", "the", "enzymatic", "reactions", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", ".", "D", ".", "Mutations", "in", "H149", ",", "N152", "and", "D160", "abolish", "the", "ability", "of", "MavQ", "to", "convert", "PtdIns", "into", "PtdIns3P", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Biochemical assays for the kinase activity of MavQ. Purified MavQ was incubated with or without specific PI substrates, the conversion of ATP to ADP was measured by the ADP-Glo assay. RLU, relative luminescence units.B. H149, N152 and D160 in MavQ are critical for its kinase activity. Purified wild-type and mutant MavQ were reacted with PtdIns and ATP. The kinase activity was determined by the ADP-Glo assay.C. The PI product produced by MavQ determined by TLC assays. di-C8-Bodipy-FL-PtdIns was used to react with MavQ (lane 4) and samples were further incubated with the 3-phosphatase MTM which hydrolyzes both PtdIns3P and PtdIns(3,5)P2 (lane 5) or with the PI4K LepB_NTD which phosphorylates PtdIns3P into PtdIns (3,4)P2 (lane 6). A schematic illustration of the enzymatic reactions is shown in the lower panel.D. Mutations in H149, N152 and D160 abolish the ability of MavQ to convert PtdIns into PtdIns3P."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Representative", "fluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "PtdIns3P", "probe", "GFP", "-", "2xFYVEHrs", "and", "MavQ", "with", "or", "without", "wortmannin", "treatment", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "B", ".", "Percentage", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "in", "which", "GFP", "-", "2xFYVEHrs", "localizes", "to", "vesicle", "-", "like", "structures", ".", "At", "least", "100", "cells", "(", "n", "≥", "100", ")", "were", "counted", "for", "each", "sample", ".", "Wort", ",", "wortmannin", ".", "C", ".", "Induction", "of", "the", "ATP", "hydrolysis", "activity", "of", "MavQ", "by", "PtdIns", "is", "not", "affected", "by", "wortmannin", ".", "Recombinant", "MavQ", "was", "incubated", "with", "increasing", "amounts", "of", "wortmannin", "for", "30", "min", "at", "room", "temperature", "prior", "to", "the", "addition", "of", "PtdIns", "and", "ATP", ".", "The", "wortamannin", "-", "sensitive", "PI3K", "p110α", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "The", "ADP", "-", "Glo", "assay", "was", "used", "to", "measure", "the", "kinase", "activity", ".", "D", ".", "Wortmannin", "does", "not", "affect", "the", "production", "of", "PtdIns3P", "by", "MavQ", ".", "Purified", "MavQ", "was", "pretreated", "with", "100", "μM", "of", "wortmannin", "for", "30", "min", "at", "room", "temperature", ".", "di", "-", "C8", "-", "Bodipy", "-", "FL", "-", "PtdIns", "and", "ATP", "were", "then", "added", "to", "the", "reaction", "mixtures", ".", "The", "TLC", "assay", "was", "employed", "to", "detect", "the", "generation", "of", "PtdIns3P", "by", "MavQ", ".", "The", "wortamannin", "-", "sensitive", "PI3K", "p110α", "was", "included", "as", "a", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Representative fluorescence images of HeLa cells expressing the PtdIns3P probe GFP-2xFYVEHrs and MavQ with or without wortmannin treatment. Scale bars, 5 μm.B. Percentage of HeLa cells transfected with the indicated plasmids in which GFP-2xFYVEHrs localizes to vesicle-like structures. At least 100 cells (n≥100) were counted for each sample. Wort, wortmannin.C. Induction of the ATP hydrolysis activity of MavQ by PtdIns is not affected by wortmannin. Recombinant MavQ was incubated with increasing amounts of wortmannin for 30 min at room temperature prior to the addition of PtdIns and ATP. The wortamannin-sensitive PI3K p110α was used as a control. The ADP-Glo assay was used to measure the kinase activity.D. Wortmannin does not affect the production of PtdIns3P by MavQ. Purified MavQ was pretreated with 100 μM of wortmannin for 30 min at room temperature. di-C8-Bodipy-FL-PtdIns and ATP were then added to the reaction mixtures. The TLC assay was employed to detect the generation of PtdIns3P by MavQ. The wortamannin-sensitive PI3K p110α was included as a control."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "the", "association", "of", "MavQ", "with", "the", "LCV", ".", "BMDM", "cells", "infected", "with", "wild", "-", "type", "or", "Dot", "/", "Icm", "-", "deficient", "(", "dotA", "-", ")", "L", ".", "pneumophila", "were", "sequentially", "stained", "with", "antibodies", "against", "L", ".", "pneumophila", "and", "MavQ", ".", "Images", "were", "taken", "under", "a", "fluorescence", "microscope", ".", "Insets", "represent", "3x", "magnification", "of", "regions", "defined", "by", "dash", "lines", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "B", ".", "The", "rates", "of", "of", "LCVs", "positively", "stained", "for", "MavQ", "2", "h", "post", "-", "infection", ".", "At", "least", "100", "LCVs", "(", "n", "≥", "100", ")", "were", "scored", "for", "each", "sample", ".", "C", ".", "Dynamics", "of", "MavQ", "association", "with", "LCV", ".", "BMDMs", "were", "infected", "with", "the", "wild", "-", "type", "L", ".", "pneumophila", "strain", "at", "an", "MOI", "of", "2", "for", "the", "indicated", "experimental", "durations", ".", "At", "least", "100", "phagosomes", "(", "n", "≥", "100", ")", "were", "counted", "for", "each", "sample", "to", "obtain", "the", "percentage", "of", "MavQ", "-", "positive", "LCVs", ".", "D", ".", "Intracellular", "growth", "of", "L", ".", "pneumophila", "in", "macrophages", ".", "BMDMs", "were", "infected", "with", "indicated", "L", ".", "pneumophila", "strains", "at", "an", "MOI", "of", "0", ".", "05", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "CFUs", "were", "determined", "by", "plating", "the", "saponin", "-", "solubilized", "lysates", "of", "infected", "cells", "on", "CYE", "plates", ".", "E", ".", "Expression", "of", "mavQ", "in", "L", ".", "pneumophila", "strains", "used", "for", "infection", ".", "Total", "proteins", "of", "bacteria", "cultured", "to", "the", "post", "-", "exponential", "phase", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "were", "probed", "with", "MavQ", "-", "specific", "antibodies", ".", "ICDH", "was", "detected", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Representative immunofluorescence images of the association of MavQ with the LCV. BMDM cells infected with wild-type or Dot/Icm-deficient (dotA-) L. pneumophila were sequentially stained with antibodies against L. pneumophila and MavQ. Images were taken under a fluorescence microscope. Insets represent 3x magnification of regions defined by dash lines. Scale bar, 5 μm.B. The rates of of LCVs positively stained for MavQ 2 h post-infection. At least 100 LCVs (n≥100) were scored for each sample.C. Dynamics of MavQ association with LCV. BMDMs were infected with the wild-type L. pneumophila strain at an MOI of 2 for the indicated experimental durations. At least 100 phagosomes (n≥100) were counted for each sample to obtain the percentage of MavQ-positive LCVs.D. Intracellular growth of L. pneumophila in macrophages. BMDMs were infected with indicated L. pneumophila strains at an MOI of 0.05. At the indicated time points, CFUs were determined by plating the saponin-solubilized lysates of infected cells on CYE plates.E. Expression of mavQ in L. pneumophila strains used for infection. Total proteins of bacteria cultured to the post-exponential phase separated by SDS-PAGE were probed with MavQ-specific antibodies. ICDH was detected as a loading control."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Biochemical", "synthesis", "of", "PtdIns4P", "from", "PtdIns", "by", "sequential", "reactions", "catalyzed", "by", "MavQ", ",", "LepB", "_", "NTD", "and", "SidF", ".", "MavQ", "was", "reacted", "with", "di", "-", "C8", "-", "Bodipy", "-", "FL", "-", "PtdIns", ",", "resulting", "in", "the", "production", "of", "PtdIns3P", "(", "lane", "6", ")", ".", "The", "PtdIns3P", "-", "specific", "PI4K", "LepB", "-", "NTD", "was", "then", "added", "into", "the", "reaction", ",", "yielding", "PtdIns", "(", "3", ",", "4", ")", "P2", "(", "lane", "7", ")", ".", "The", "product", "of", "the", "sample", "receiving", "LepB", "_", "NTD", "was", "further", "incubated", "with", "the", "3", "-", "phosphatase", "SidF", "to", "yield", "PtdIns4P", "(", "lane", "8", ")", ".", "The", "lipid", "products", "were", "detected", "and", "visualized", "by", "TLC", ".", "A", "schematic", "illustration", "of", "the", "enzymatic", "reactions", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "SidC", "anchoring", "on", "LCVs", ".", "BMDMs", "infected", "with", "the", "indicated", "L", ".", "pneumophila", "strains", "at", "an", "MOI", "of", "2", "for", "2", "h", "were", "sequentially", "stained", "with", "antibodies", "against", "the", "bacteria", "and", "SidC", ".", "Images", "were", "acquired", "using", "a", "fluorescence", "microscope", ".", "Insets", "represent", "3x", "magnification", "of", "regions", "defined", "by", "dash", "lines", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "C", ".", "Quantitation", "of", "SidC", "-", "positive", "LCVs", ".", "At", "least", "100", "phagosomes", "(", "n", "≥", "100", ")", "were", "scored", "for", "each", "sample", ".", "D", ".", "Expression", "and", "translocation", "of", "SidC", ".", "The", "lysates", "of", "L", ".", "pneumophila", "strains", "used", "for", "infection", "were", "probed", "for", "protein", "expression", ",", "ICDH", "was", "detected", "as", "a", "loading", "control", "(", "top", "panel", ")", ".", "SidC", "translocation", "was", "detected", "by", "probing", "the", "saponin", "-", "soluble", "fractions", "of", "infected", "U937", "cells", "with", "SidC", "-", "specific", "antibodies", ".", "Tubulin", "was", "probed", "as", "a", "loading", "control", "(", "bottom", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Biochemical synthesis of PtdIns4P from PtdIns by sequential reactions catalyzed by MavQ, LepB_NTD and SidF. MavQ was reacted with di-C8-Bodipy-FL-PtdIns, resulting in the production of PtdIns3P (lane 6). The PtdIns3P-specific PI4K LepB-NTD was then added into the reaction, yielding PtdIns(3,4)P2 (lane 7). The product of the sample receiving LepB_NTD was further incubated with the 3-phosphatase SidF to yield PtdIns4P (lane 8). The lipid products were detected and visualized by TLC. A schematic illustration of the enzymatic reactions is shown in the lower panel.B. Representative images of SidC anchoring on LCVs. BMDMs infected with the indicated L. pneumophila strains at an MOI of 2 for 2 h were sequentially stained with antibodies against the bacteria and SidC. Images were acquired using a fluorescence microscope. Insets represent 3x magnification of regions defined by dash lines. Scale bar, 5 μm.C. Quantitation of SidC-positive LCVs. At least 100 phagosomes (n≥100) were scored for each sample.D. Expression and translocation of SidC. The lysates of L. pneumophila strains used for infection were probed for protein expression, ICDH was detected as a loading control (top panel). SidC translocation was detected by probing the saponin-soluble fractions of infected U937 cells with SidC-specific antibodies. Tubulin was probed as a loading control (bottom panel)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Direct", "interactions", "between", "SidP", "and", "MavQ", "in", "the", "GST", "pull", "-", "down", "assay", ".", "GST", "beads", "coated", "with", "GST", "-", "SidP", "or", "GST", "were", "incubated", "with", "His6", "-", "MavQ", ".", "After", "washing", "the", "beads", "with", "GST", "binding", "buffer", ",", "the", "proteins", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "were", "detected", "by", "Coomassie", "brilliant", "blue", "staining", ".", "B", ",", "SidP", "does", "not", "impair", "the", "kinase", "activity", "of", "MavQ", "in", "vitro", ".", "MavQ", "was", "preincubated", "with", "increasing", "amounts", "of", "SidP", ",", "and", "the", "kinase", "activity", "of", "MavQ", "was", "measured", "by", "the", "ADP", "-", "Glo", "assay", "(", "B", ")", "C", ".", "SidP", "does", "not", "impair", "the", "kinase", "activity", "of", "MavQ", "in", "vitro", ".", "MavQ", "was", "preincubated", "with", "increasing", "amounts", "of", "SidP", ",", "and", "the", "kinase", "activity", "of", "MavQ", "was", "measured", "by", "TLC", "assay", "(", "C", ")", ".", "D", ".", "Co", "-", "expression", "of", "SidP", "with", "MavQ", "in", "HeLa", "cells", "does", "not", "influence", "the", "production", "of", "PtdIns3P", "caused", "by", "MavQ", ".", "The", "association", "of", "the", "fluorescence", "probe", "GFP", "-", "2xFYVEHrs", "with", "vesicle", "-", "like", "structures", "was", "used", "to", "indicate", "the", "distribution", "of", "PtdIns3P", "in", "cells", ".", "At", "least", "100", "cells", "were", "scored", "in", "each", "sample", "(", "n", "≥", "100", ")", "(", "left", "panel", ")", ".", "Wort", ",", "wortmannin", ".", "Expression", "of", "MavQ", "and", "SidP", "in", "the", "samples", "were", "shown", "in", "the", "right", "panel", ".", "EV", "represents", "empty", "vector", ".", "E", ".", "Deletion", "of", "sidP", "does", "not", "impact", "the", "association", "of", "SidC", "with", "the", "LCV", ".", "BMDMs", "infected", "with", "the", "indicated", "L", ".", "pneumophila", "stains", "were", "stained", "and", "the", "association", "of", "SidC", "with", "bacterial", "phagosomes", "was", "similarly", "determined", "(", "n", "≥", "100", ")", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "infected", "cells", "harboring", "bacterial", "phagosomes", "were", "also", "shown", "(", "right", "panel", ")", ".", "Insets", "represent", "3x", "magnification", "of", "regions", "defined", "by", "dash", "lines", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Direct interactions between SidP and MavQ in the GST pull-down assay. GST beads coated with GST-SidP or GST were incubated with His6-MavQ. After washing the beads with GST binding buffer, the proteins resolved by SDS-PAGE were detected by Coomassie brilliant blue staining.B, SidP does not impair the kinase activity of MavQ in vitro. MavQ was preincubated with increasing amounts of SidP, and the kinase activity of MavQ was measured by the ADP-Glo assay (B)C. SidP does not impair the kinase activity of MavQ in vitro. MavQ was preincubated with increasing amounts of SidP, and the kinase activity of MavQ was measured by TLC assay (C).D. Co-expression of SidP with MavQ in HeLa cells does not influence the production of PtdIns3P caused by MavQ. The association of the fluorescence probe GFP-2xFYVEHrs with vesicle-like structures was used to indicate the distribution of PtdIns3P in cells. At least 100 cells were scored in each sample (n≥100) (left panel). Wort, wortmannin. Expression of MavQ and SidP in the samples were shown in the right panel. EV represents empty vector.E. Deletion of sidP does not impact the association of SidC with the LCV. BMDMs infected with the indicated L. pneumophila stains were stained and the association of SidC with bacterial phagosomes was similarly determined (n≥100) (left panel). Representative images of infected cells harboring bacterial phagosomes were also shown (right panel). Insets represent 3x magnification of regions defined by dash lines. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", "WT", "MDFs", "were", "treated", "±", "TSI", "individually", "or", "in", "combination", "for", "3", "hrs", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "and", "UBA", "-", "pull", "down", "(", "UBA", "-", "PD", ")", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Samples", "of", "UBA", "-", "pull", "down", "in", "following", "figures", "were", "analysed", "in", "the", "same", "way", "unless", "otherwise", "indicated", ".", "B", "WT", ",", "Ripk3", "-", "/", "-", ",", "Mlkl", "-", "/", "-", ",", "Tnfr1", "-", "/", "-", "and", "Traf2", "-", "/", "-", "MDFs", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSI", "for", "3", "hrs", ".", "Nec", "-", "1", "and", "GSK872", "were", "added", "to", "inhibit", "RIPK1", "and", "RIPK3", "kinase", "activities", "respectively", ".", "E", "RIPK3", "-", "gyrase", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Ripk3", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "(", "dox", ")", "for", "5", "hrs", ",", "and", "cells", "were", "then", "treated", "±", "combination", "of", "TSI", ",", "or", "coumermycin", "(", "coum", ")", "for", "3", "hrs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A WT MDFs were treated ± TSI individually or in combination for 3 hrs. Whole cell lysates (WCL) and UBA-pull down (UBA-PD) fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments. Samples of UBA-pull down in following figures were analysed in the same way unless otherwise indicated.B WT, Ripk3-/-, Mlkl-/-, Tnfr1-/- and Traf2-/- MDFs were untreated (UT) or treated with TSI for 3 hrs. Nec-1 and GSK872 were added to inhibit RIPK1 and RIPK3 kinase activities respectively.E RIPK3-gyrase were inducibly expressed in Ripk3-/- MDFs by doxycycline (dox) for 5 hrs, and cells were then treated ± combination of TSI, or coumermycin (coum) for 3 hrs."}
{"words": ["Figure", "2B", "UBA", "-", "pull", "down", "from", "WT", "MDFs", "treated", "with", "TSI", "for", "3", "hrs", "were", "subjected", "to", "the", "DUBs", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Beads", "eluates", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "1", ".", "4", "mL", "cleared", "cell", "lysate", "from", "4", "x", "106", "TSI", "-", "treated", "WT", "MDFs", "was", "split", "into", "three", "parts", "of", "the", "indicated", "volume", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "DUB", "incubation", ".", "Bead", "eluates", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B UBA-pull down from WT MDFs treated with TSI for 3 hrs were subjected to the DUBs shown in (A). Beads eluates were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments.C 1.4 mL cleared cell lysate from 4 x 106 TSI-treated WT MDFs was split into three parts of the indicated volume, followed by UBA-pull down and DUB incubation. Bead eluates were analysed by Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", "WT", "MDFs", "were", "treated", "with", "TSI", "for", "indicated", "time", ".", "Cells", "were", "fractionated", "into", "cytosol", "and", "crude", "membrane", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "All", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "WT", "USP21", "-", "CaaX", "and", "USP21C221R", "-", "CaaX", "(", "CR", ")", "were", "inducibly", "expressed", "in", "WT", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "5", "hrs", ".", "Ubiquitylated", "proteins", "were", "enriched", "followed", "by", "TSI", "stimulation", "and", "cellular", "fractionation", ".", "All", "fractions", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A WT MDFs were treated with TSI for indicated time. Cells were fractionated into cytosol and crude membrane, followed by UBA-pull down. All fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments.B WT USP21-CaaX and USP21C221R-CaaX (CR) were inducibly expressed in WT MDFs by doxycycline for 5 hrs. Ubiquitylated proteins were enriched followed by TSI stimulation and cellular fractionation. All fractions were analysed by Western blot and probed with antibodies as indicated. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", "WT", "and", "R105AD106A", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", ",", "at", "the", "same", "time", "cells", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSQ", "for", "6", "hrs", ".", "Cells", "were", "fractionated", "into", "cytosol", "(", "C", ")", "and", "crude", "membrane", "(", "M", ")", ".", "Fractions", "were", "analysed", "by", "BN", "-", "or", "SDS", "-", "PAGE", ",", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Cell", "lysates", "from", "(", "A", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "analysed", "as", "described", "above", ".", "E", "HT29", "cells", "were", "stimulated", "with", "TSI", ",", "±", "NSA", "(", "500", "nM", ")", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", "for", "16", "hrs", ",", "followed", "by", "cellular", "fractionation", ".", "Fractions", "were", "analysed", "by", "BN", "-", "or", "SDS", "-", "PAGE", ",", "Western", "blot", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "F", "Cell", "lysates", "from", "(", "E", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pulldown", "and", "analysed", "as", "described", "above", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A WT and R105AD106A mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline, at the same time cells were untreated (UT) or treated with TSQ for 6 hrs. Cells were fractionated into cytosol (C) and crude membrane (M). Fractions were analysed by BN- or SDS-PAGE, Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments. B Cell lysates from (A) were subjected to UBA-pull down and analysed as described above.E HT29 cells were stimulated with TSI, ± NSA (500 nM), or left untreated (UT) for 16 hrs, followed by cellular fractionation. Fractions were analysed by BN- or SDS-PAGE, Western blot and probed with the indicated antibodies. Representative of three independent experiments. F Cell lysates from (E) were subjected to UBA-pulldown and analysed as described above."}
{"words": ["Figure", "5A", "WT", "and", "E109AE110A", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", ",", "cells", "were", "untreated", "or", "treated", "with", "TSQ", "for", "6", "hrs", "(", "please", "note", "that", "the", "same", "WT", "control", "was", "used", "in", "Fig", ".", "EV3A", ")", ".", "Cell", "death", "was", "measured", "by", "PI", "staining", "based", "on", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Cellular", "fractions", "from", "(", "A", ")", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "from", "BN", "-", "PAGE", "or", "SDS", "-", "PAGE", "using", "antibodies", "as", "indicated", ".", "The", "same", "WT", "control", "was", "used", "in", "Fig", ".", "4A", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "C", "Cell", "lysates", "from", "(", "A", ")", "were", "subjected", "to", "UBA", "-", "pull", "down", "and", "analysed", "as", "described", "above", ".", "D", "N", "-", "FLAG", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "overnight", ",", "and", "cells", "were", "treated", "with", "TSI", "for", "indicated", "time", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "N", "-", "FLAG", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "16", "hrs", ".", "Cells", "were", "stimulated", "±", "TSI", "for", "3", "hrs", "after", "withdrawal", "of", "doxycycline", ".", "Then", "TSI", "medium", "was", "removed", "and", "replaced", "to", "medium", "containing", "inhibitors", "Bafilomycin", "A1", "(", "BAF", ")", ",", "PS341", "(", "PS", ")", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "IDN", "-", "6556", "was", "added", "to", "all", "conditions", "to", "block", "apoptosis", ".", "Cells", "were", "collected", "0", ",", "2", ",", "4", ",", "6", "hrs", "after", "medium", "replacement", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A WT and E109AE110A mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline, cells were untreated or treated with TSQ for 6 hrs (please note that the same WT control was used in Fig. EV3A). Cell death was measured by PI staining based on flow cytometry. Data are plotted as mean ± SEM of three independent experiments. B Cellular fractions from (A) were analysed by Western blot from BN-PAGE or SDS-PAGE using antibodies as indicated. The same WT control was used in Fig. 4A. Representative of three independent experiments. C Cell lysates from (A) were subjected to UBA-pull down and analysed as described above.D N-FLAG MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline overnight, and cells were treated with TSI for indicated time, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments. E N-FLAG MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline for 16 hrs. Cells were stimulated ± TSI for 3 hrs after withdrawal of doxycycline. Then TSI medium was removed and replaced to medium containing inhibitors Bafilomycin A1 (BAF), PS341 (PS) or left untreated (UT). IDN-6556 was added to all conditions to block apoptosis. Cells were collected 0, 2, 4, 6 hrs after medium replacement, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6B", "WT", "and", "4KR", "mutant", "MLKL", "were", "inducibly", "expressed", "in", "Mlkl", "-", "/", "-", "MDFs", "by", "doxycycline", "for", "6", "hrs", "and", "cells", "were", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "TSI", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pull", "down", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B WT and 4KR mutant MLKL were inducibly expressed in Mlkl-/- MDFs by doxycycline for 6 hrs and cells were untreated (UT) or treated with TSI, followed by UBA-pull down. Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7D", "MLKL", "-", "/", "-", "HT29", "cells", "stably", "transfected", "with", "constructs", "encoding", "human", "MLKL", "-", "USP21", "and", "MLKL", "-", "USP21C221R", ",", "were", "treated", "with", "doxycycline", ",", "NSA", "(", "1", "μM", ")", ",", "TSI", "or", "combinations", "thereof", "(", "added", "simultaneously", ")", ".", "Sytox", "Green", "positive", "cells", "were", "quantified", "in", "real", "time", "by", "live", "cell", "imaging", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "(", "A", "red", "dashed", "line", "is", "shown", "to", "highlight", "the", "delay", "in", "death", "kinetics", "upon", "treatment", "with", "NSA", ")", ".", "E", "Human", "MLKL", "-", "USP21", "and", "MLKL", "-", "USP21C221R", "were", "inducibly", "expressed", "in", "MLKL", "-", "/", "-", "HT29", "cells", "by", "doxycycline", "(", "10", "ng", "/", "mL", ")", "for", "16", "hrs", ",", "TSI", "was", "added", "for", "the", "indicated", "times", "but", "all", "samples", "were", "collected", "25", "hrs", "post", "-", "induction", ",", "followed", "by", "UBA", "-", "pulldown", ".", "Representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D MLKL-/- HT29 cells stably transfected with constructs encoding human MLKL-USP21 and MLKL-USP21C221R, were treated with doxycycline, NSA (1 μM), TSI or combinations thereof (added simultaneously). Sytox Green positive cells were quantified in real time by live cell imaging. Data are plotted as mean ± SEM of six independent experiments. (A red dashed line is shown to highlight the delay in death kinetics upon treatment with NSA). E Human MLKL-USP21 and MLKL-USP21C221R were inducibly expressed in MLKL-/- HT29 cells by doxycycline (10 ng/mL) for 16 hrs, TSI was added for the indicated times but all samples were collected 25 hrs post-induction, followed by UBA-pulldown . Representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", ")", "Tadpoles", "at", "NF50", "were", "amputated", ",", "fixed", "at", "the", "indicated", "time", "and", "then", "processed", "for", "whole", "mount", "in", "situ", "hybridisation", "using", "a", "probe", "specific", "for", "foxm1", ".", "The", "two", "last", "panels", "show", "transverse", "section", "in", "the", "non", "-", "regenerating", "spinal", "cord", "(", "nr", ")", "and", "the", "regenerate", "at", "3dpa", ".", "The", "red", "circle", "highlights", "the", "spinal", "cord", "and", "the", "asterisk", "the", "notochord", ".", "(", "F", ")", "Total", "RNA", "was", "isolated", "from", "regenerating", "tails", "at", "indicated", "time", "points", "post", "amputation", ",", "reversed", "transcribed", "into", "cDNA", "and", "analysed", "for", "foxm1", "expression", "by", "qPCR", ",", "using", "ef1α", "as", "a", "reference", "gene", ".", "The", "graph", "represents", "the", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "used", ".", "*", "p", "=", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E) Tadpoles at NF50 were amputated, fixed at the indicated time and then processed for whole mount in situ hybridisation using a probe specific for foxm1. The two last panels show transverse section in the non-regenerating spinal cord (nr) and the regenerate at 3dpa. The red circle highlights the spinal cord and the asterisk the notochord.(F) Total RNA was isolated from regenerating tails at indicated time points post amputation, reversed transcribed into cDNA and analysed for foxm1 expression by qPCR, using ef1α as a reference gene. The graph represents the mean +/- SD of three independent experiments. One-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test was used. * p=0.0149"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "NF40", "tadpoles", "with", "the", "following", "genotypes", "foxm1", "-", "/", "-", "(", "mut", ")", ",", "foxm1", "+", "/", "-", "(", "het", ")", "and", "foxm1", "+", "/", "+", "(", "wt", ")", "were", "amputated", "and", "left", "to", "regenerate", "for", "7", "days", ".", "The", "images", "show", "representative", "tails", "at", "3", "and", "7", "dpa", ".", "The", "white", "arrowheads", "indicate", "the", "amputation", "site", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "rate", "of", "regeneration", ".", "The", "ratio", "of", "the", "length", "of", "the", "regenerate", "to", "the", "length", "that", "has", "originally", "be", "amputated", "was", "compared", "for", "the", "whole", "tail", "at", "3", "and", "7", "dpa", ".", "The", "graph", "represents", "the", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "5", "independent", "experiments", "from", "3", "different", "clutches", "with", "at", "least", "5", "tadpoles", "in", "each", "experiment", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "EdU", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "staining", "at", "5", "dpa", ".", "(", "E", ")", "The", "graph", "represents", "the", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "EdU", "+", "cells", "over", "the", "total", "number", "of", "cells", "in", "the", "spinal", "cord", "of", "5", "to", "12", "tadpoles", ".", "Each", "data", "point", "represents", "a", "tadpole", ",", "with", "an", "average", "of", "9", "sections", "analysed", "per", "animal", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "EdU", "(", "green", ")", ",", "BrdU", "(", "magenta", ")", ",", "Sox3", "(", "white", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "staining", "at", "3", "dpa", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "images", "in", "(", "G", ")", ".", "The", "graph", "represents", "the", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "6", "tadpoles", "with", "an", "average", "of", "13", "sections", "per", "tadpole", "analysed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) NF40 tadpoles with the following genotypes foxm1-/- (mut), foxm1+/- (het) and foxm1+/+ (wt) were amputated and left to regenerate for 7 days. The images show representative tails at 3 and 7 dpa. The white arrowheads indicate the amputation site. (B) Quantification of the rate of regeneration. The ratio of the length of the regenerate to the length that has originally be amputated was compared for the whole tail at 3 and 7 dpa. The graph represents the mean+/-SD of 5 independent experiments from 3 different clutches with at least 5 tadpoles in each experiment. (D) Representative images of EdU (red) and DAPI (blue) staining at 5 dpa. (E) The graph represents the mean +/- SD of EdU+ cells over the total number of cells in the spinal cord of 5 to 12 tadpoles. Each data point represents a tadpole, with an average of 9 sections analysed per animal. (G) Representative images of EdU (green), BrdU (magenta), Sox3 (white) and DAPI (blue) staining at 3 dpa. (H) Quantification of images in (G). The graph represents the mean +/- SD of 6 tadpoles with an average of 13 sections per tadpole analysed. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Representative", "sections", "labelled", "with", "an", "anti", "-", "PCNA", "antibody", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "at", "the", "indicated", "day", "after", "amputation", "(", "dpa", ")", ".", "The", "white", "arrowheads", "point", "to", "cells", "in", "S", "phase", "in", "the", "spinal", "cord", "and", "the", "yellow", "arrowhead", "at", "cells", "in", "G1", ",", "G2", "and", "M", "phases", ".", "The", "right", "panels", "correspond", "to", "the", "inset", "indicated", "as", "a", "white", "box", "in", "the", "middle", "panels", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Representative sections labelled with an anti-PCNA antibody (red) and DAPI (blue) at the indicated day after amputation (dpa). The white arrowheads point to cells in S phase in the spinal cord and the yellow arrowhead at cells in G1, G2 and M phases. The right panels correspond to the inset indicated as a white box in the middle panels."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "sections", "of", "spinal", "cords", "from", "tadpoles", "injected", "with", "EdU", "at", "3", "dpa", "and", "fixed", "at", "5", "dpa", ".", "After", "sectioning", ",", "the", "samples", "were", "labelled", "with", "antibodies", "against", "Sox3", "(", "green", ")", ",", "EdU", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "White", "arrowheads", "show", "Sox3", "positive", "extensions", ".", "(", "B", ")", "Sections", "of", "spinal", "cords", "at", "5", "dpa", "in", "the", "stump", "(", "non", "-", "regen", ".", ")", "or", "in", "the", "regenerate", "(", "regen", ")", "labelled", "with", "anti", "-", "Sox3", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "Acetylated", "Tubulin", "(", "AcTub", ",", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "White", "arrowheads", "show", "Sox3", "positive", "extensions", ".", "(", "E", ")", "Representative", "sections", "of", "spinal", "cords", "from", "tadpoles", "injected", "with", "EdU", "at", "3", "dpa", "and", "fixed", "at", "5", "dpa", ".", "After", "sectioning", ",", "the", "samples", "were", "labelled", "with", "antibodies", "against", "Myt1", "(", "green", ")", ",", "EdU", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "images", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "The", "graph", "represents", "the", "mean", "+", "/", "-", "SD", "from", "3", "tadpoles", "with", "an", "average", "of", "12", "sections", "each", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative sections of spinal cords from tadpoles injected with EdU at 3 dpa and fixed at 5 dpa. After sectioning, the samples were labelled with antibodies against Sox3 (green), EdU (magenta) and DAPI (blue). White arrowheads show Sox3 positive extensions.(B) Sections of spinal cords at 5 dpa in the stump (non-regen.) or in the regenerate (regen) labelled with anti-Sox3 (green), anti-Acetylated Tubulin (AcTub, magenta) and DAPI (blue). White arrowheads show Sox3 positive extensions.(E) Representative sections of spinal cords from tadpoles injected with EdU at 3 dpa and fixed at 5 dpa. After sectioning, the samples were labelled with antibodies against Myt1 (green), EdU (magenta) and DAPI (blue). (F) Quantification of images shown in (E). The graph represents the mean +/- SD from 3 tadpoles with an average of 12 sections each. "}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Fluorescence", "microscopy", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "transduced", "HeLa", "cells", "left", "unstimulated", "(", "Unstim", ")", "or", "stimulated", "for", "4", "h", "with", "C12", "-", "iEDAP", "(", "2", ".", "5", "μg", "/", "ml", ")", "or", "for", "2", "h", "with", "rapamycin", "(", "Rapa", ";", "50", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Green", ",", "GFP", "-", "LC3", ";", "blue", ",", "DAPI", "(", "DNA", "-", "intercalating", "dye", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "GFP", "-", "LC3", "signals", "(", "representing", "autophagosomes", ")", "in", "HeLa", "cells", "stimulated", "as", "described", "in", "a", ".", "(", "c", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nod2", "-", "deficient", "BMDMs", "transduced", "with", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "and", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "for", "4", "h", "with", "LPS", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "or", "MDP", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", "or", "for", "2", "h", "with", "rapamycin", "(", "50", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "15", "μm", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "in", "BMDMs", "stimulated", "as", "described", "in", "c", ".", "(", "e", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "macrophages", "recovered", "from", "the", "peritoneal", "cavities", "of", "thioglycolate", "-", "injected", "wild", "-", "type", ",", "Nod1", "-", "and", "Nod2", "-", "deficient", "mice", "4", "h", "after", "intraperitoneal", "injection", "of", "MDP", "(", "300", "μg", "/", "ml", ")", ",", "FK565", "(", "300", "μg", "/", "ml", ")", "or", "rapamycin", "(", "300", "μg", "/", "ml", ")", ";", "after", "centrifugation", "by", "cytospin", ",", "cells", "were", "stained", "for", "endogenous", "LC3", "(", "red", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "dot", "-", "or", "ring", "-", "shaped", "LC3", "signals", "in", "macrophages", "recovered", "from", "the", "peritoneal", "cavities", "of", "mice", "treated", "as", "described", "in", "c", ".", "Data", "are", "representative", "of", "four", "(", "a", "-", "d", ")", "or", "two", "(", "e", ",", "f", ")", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "per", "condition", "(", "error", "bars", "(", "b", ",", "d", ",", "f", ")", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Fluorescence microscopy of GFP-LC3-transduced HeLa cells left unstimulated (Unstim) or stimulated for 4 h with C12-iEDAP (2.5 μg/ml) or for 2 h with rapamycin (Rapa; 50 μg/ml). Green, GFP-LC3; blue, DAPI (DNA-intercalating dye). Scale bar, 5 μm. (b) Quantification of dot- or ring-shaped GFP-LC3 signals (representing autophagosomes) in HeLa cells stimulated as described in a.(c) Confocal microscopy of wild-type and Nod2-deficient BMDMs transduced with GFP-LC3 (green) and left unstimulated or stimulated for 4 h with LPS (1 μg/ml) or MDP (100 μg/ml) or for 2 h with rapamycin (50 μg/ml). Scale bar, 15 μm. (d) Quantification of dot- or ring-shaped GFP-LC3 (green) in BMDMs stimulated as described in c.(e) Immunofluorescence microscopy of macrophages recovered from the peritoneal cavities of thioglycolate-injected wild-type, Nod1- and Nod2-deficient mice 4 h after intraperitoneal injection of MDP (300 μg/ml), FK565 (300 μg/ml) or rapamycin (300 μg/ml); after centrifugation by cytospin, cells were stained for endogenous LC3 (red) and with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm. (f) Quantification of dot- or ring-shaped LC3 signals in macrophages recovered from the peritoneal cavities of mice treated as described in c. Data are representative of four (a-d) or two (e,f) independent experiments with at least 100 cells per condition (error bars (b,d,f), s.d.)."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nod1", "-", "deficient", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "MEFs", "infected", "for", "2", "h", "with", "wild", "-", "type", "S", ".", "flexneri", "M90T", "-", "RFP", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "with", "bacteria", "in", "a", ".", "(", "c", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nod1", "-", "deficient", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "MEFs", "infected", "for", "2", "h", "with", "S", ".", "flexneri", "ΔIcsB", "-", "RFP", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "with", "bacteria", "in", "c", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Plate", "assay", "of", "bacteria", "in", "wild", "-", "type", "or", "Nod1", "-", "deficient", "MEFs", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "S", ".", "flexneri", "ΔIcsB", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "autophagy", "blocker", "LY294002", "(", "LY", ")", "or", "protease", "inhibitors", "(", "PI", ")", ",", "followed", "by", "5", ".", "5", "h", "of", "incubation", "in", "the", "presence", "of", "gentamicin", ".", "(", "g", "-", "j", ")", "Confocal", "microscopy", "(", "g", ",", "i", ")", "and", "quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "with", "M90T", "and", "ΔIcsB", "(", "h", ",", "j", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "RIP2", "-", "deficient", "(", "Ripk2", "−", "/", "−", ")", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "MEFs", "infected", "for", "2", "h", "with", "wild", "-", "type", "S", ".", "flexneri", "(", "M90T", ";", "g", ",", "h", ")", "or", "ΔIcsB", "S", ".", "flexneri", "(", "i", ",", "j", ")", ".", "(", "k", ")", "Enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "of", "KC", "secretion", "by", "wild", "-", "type", "and", "RIP2", "-", "deficient", "MEFs", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "M90T", "and", "incubated", "for", "5", ".", "5", "h", "in", "the", "presence", "of", "gentamicin", ".", "(", "l", ",", "m", ")", "Confocal", "microscopy", "(", "l", ")", "and", "quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "(", "green", ")", "with", "M90T", "and", "ΔIcsB", "(", "m", ")", "of", "wild", "-", "type", "and", "NEMO", "-", "deficient", "(", "Ikbkg", "−", "/", "−", ")", "GFP", "-", "LC3", "-", "expressing", "MEFs", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "wild", "-", "type", "S", ".", "flexneri", "(", "M90T", ")", "or", "S", ".", "flexneri", "ΔIcsB", "and", "incubated", "for", "1", ".", "5", "h", "in", "the", "presence", "of", "gentamicin", ".", "Red", ",", "RFP", ".", "Arrows", "indicate", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "with", "S", ".", "flexneri", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "and", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "each", "(", "error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Confocal microscopy of wild-type and Nod1-deficient GFP-LC3-expressing MEFs infected for 2 h with wild-type S. flexneri M90T-RFP. (b) Quantification of the colocalization of GFP-LC3 signals with bacteria in a.(c) Confocal microscopy of wild-type and Nod1-deficient GFP-LC3-expressing MEFs infected for 2 h with S. flexneri ΔIcsB-RFP. (d) Quantification of the colocalization of GFP-LC3 signals with bacteria in c.(e,f) Plate assay of bacteria in wild-type or Nod1-deficient MEFs infected for 0.5 h with S. flexneri ΔIcsB in the presence or absence of the autophagy blocker LY294002 (LY) or protease inhibitors (PI), followed by 5.5 h of incubation in the presence of gentamicin.(g-j) Confocal microscopy (g,i) and quantification of the colocalization of GFP-LC3 signals with M90T and ΔIcsB (h,j) in wild-type and RIP2-deficient (Ripk2−/−) GFP-LC3-expressing MEFs infected for 2 h with wild-type S. flexneri (M90T; g,h) or ΔIcsB S. flexneri (i,j).(k) Enzyme-linked immunosorbent assay of KC secretion by wild-type and RIP2-deficient MEFs infected for 0.5 h with M90T and incubated for 5.5 h in the presence of gentamicin.(l,m) Confocal microscopy (l) and quantification of the colocalization of GFP-LC3 signals (green) with M90T and ΔIcsB (m) of wild-type and NEMO-deficient (Ikbkg−/−) GFP-LC3-expressing MEFs infected for 0.5 h with wild-type S. flexneri (M90T) or S. flexneri ΔIcsB and incubated for 1.5 h in the presence of gentamicin. Red, RFP. Arrows indicate colocalization of GFP-LC3 signals with S. flexneri. Scale bars, 10 μm. *P 0.05, and **P 0.01 (t-test). Data represent three independent experiments with at least 100 cells each (error bars, s.e.m.)."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Immunofluorescence", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "hemagglutinin", "-", "tagged", "Nod1", "(", "HA", "-", "Nod1", "(", "red", ")", ";", "top", ")", "or", "HA", "-", "Nod2", "(", "red", ";", "bottom", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "(", "b", ")", "Immunofluorescence", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "Myc", "-", "tagged", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", ")", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Immunofluorescence", "of", "HeLa", "cells", "coexpressing", "HA", "-", "Nod1", "(", "red", ";", "c", ")", "or", "HA", "-", "Nod2", "(", "red", ";", "d", ")", "and", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "green", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "(", "e", ")", "Immunofluorescence", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "a", "Flag", "-", "tagged", "truncated", "form", "of", "ATG16L1", "(", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", ";", "green", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "(", "f", ")", "Immunofluorescence", "of", "HeLa", "cells", "coexpressing", "HA", "-", "Nod2", "(", "red", ")", "and", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "green", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "(", "g", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "Mode", "-", "K", "cells", "stained", "for", "endogenous", "Nod2", "(", "green", ")", "and", "ATG16L1", "(", "red", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "For", "a", "-", "g", ",", "arrows", "indicate", "membrane", "colocalization", "of", "ATG16", "and", "Nod2", ";", "area", "outlined", "at", "left", "is", "enlarged", "at", "right", "(", "a", ",", "b", ",", "e", ")", "or", "in", "other", "images", "(", "c", ",", "d", ",", "f", ",", ")", ";", "scale", "bars", ",", "8", "μm", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "and", "immunoblot", "(", "IB", ")", "analysis", "of", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "h", ")", "or", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "i", ")", ",", "together", "with", "HA", "-", "Nod1", ",", "HA", "-", "Nod2", "or", "HA", "-", "tagged", "enhanced", "GFP", "(", "EGFP", "-", "HA", ")", ".", "Ig", ",", "immunoglobulin", "(", "loading", "control", ")", ".", "Results", "are", "representative", "of", "one", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "a", "-", "g", ")", "or", "one", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "h", ",", "i", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Immunofluorescence of HeLa cells expressing hemagglutinin-tagged Nod1 (HA-Nod1 (red); top) or HA-Nod2 (red; bottom). Blue, DAPI.(b) Immunofluorescence of HeLa cells expressing Myc-tagged FL-ATG16L1 (Myc-FL-ATG16L1).(c,d) Immunofluorescence of HeLa cells coexpressing HA-Nod1 (red; c) or HA-Nod2 (red; d) and Myc-FL-ATG16L1 (green). Blue, DAPI.(e) Immunofluorescence of HeLa cells expressing a Flag-tagged truncated form of ATG16L1 (Flag-ΔN85-ATG16L1; green). Blue, DAPI.(f) Immunofluorescence of HeLa cells coexpressing HA-Nod2 (red) and Flag-ΔN85-ATG16L1 (green). Blue, DAPI.(g) Immunofluorescence microscopy of Mode-K cells stained for endogenous Nod2 (green) and ATG16L1 (red) and with DAPI (blue). For a-g, arrows indicate membrane colocalization of ATG16 and Nod2; area outlined at left is enlarged at right (a,b,e) or in other images (c,d,f,); scale bars, 8 μm.(h,i) Immunoprecipitation (IP) and immunoblot (IB) analysis of HEK293 cells transfected with Flag-ΔN85-ATG16L1 (h) or Myc-FL-ATG16L1 (i), together with HA-Nod1, HA-Nod2 or HA-tagged enhanced GFP (EGFP-HA). Ig, immunoglobulin (loading control). Results are representative of one of at least three independent experiments (a-g) or one of three independent experiments (h,i)."}
{"words": ["figf4Immunofluorescence", "microscopy", "of", "wild", "-", "type", "and", "RIP2", "-", "deficient", "MEFs", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "and", "HA", "-", "Nod1", "(", "a", ")", "or", "HA", "-", "Nod2", "(", "b", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Area", "outlined", "at", "far", "left", "is", "enlarged", "at", "right", ".", "Data", "are", "representative", "one", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4Immunofluorescence microscopy of wild-type and RIP2-deficient MEFs expressing Flag-tagged ΔN85-ATG16L1 and HA-Nod1 (a) or HA-Nod2 (b). Scale bars, 10 μm. Area outlined at far left is enlarged at right. Data are representative one of two independent experiments."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Fluorescence", "microscopy", "of", "immortalized", "GFP", "-", "LC3", "-", "transduced", "lymphoblasts", "from", "donors", "homozygous", "for", "the", "normal", "ATG16L1", "*", "300T", "allele", "(", "300T", ")", "or", "risk", "allele", "ATG16L1", "*", "300A", "(", "300A", ")", ",", "left", "unstimulated", "or", "treated", "for", "2", "h", "with", "rapamycin", "(", "50", "μg", "/", "ml", ")", "or", "for", "4", "h", "with", "MDP", "(", "20", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Green", ",", "GFP", "-", "LC3", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "b", ")", "Induction", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "by", "rapamycin", ",", "MDP", "or", "Gram", "-", "positive", "peptidoglycan", "(", "PG", "+", ";", "20", "μg", "/", "ml", ")", "in", "cells", "treated", "as", "described", "in", "a", ",", "presented", "relative", "to", "GFP", "-", "LC3", "signals", "in", "unstimulated", "control", "cells", ".", "*", "P", "0", ".", "05", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", "(", "b", ")", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Fluorescence microscopy of immortalized GFP-LC3-transduced lymphoblasts from donors homozygous for the normal ATG16L1*300T allele (300T) or risk allele ATG16L1*300A (300A), left unstimulated or treated for 2 h with rapamycin (50 μg/ml) or for 4 h with MDP (20 μg/ml). Green, GFP-LC3. Scale bar, 5 μm. (b) Induction of GFP-LC3 signals by rapamycin, MDP or Gram-positive peptidoglycan (PG+; 20 μg/ml) in cells treated as described in a, presented relative to GFP-LC3 signals in unstimulated control cells. *P 0.05 (t-test). Data represent three independent experiments (error bars (b), s.d.)."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "Nod2", "(", "red", ")", "and", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "green", ")", "and", "infected", "for", "10", "-", "20", "min", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Arrows", "indicate", "colocalization", "of", "Nod2", "and", "ATG16L1", "around", "invading", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "endogenous", "Nod2", "and", "ATG16L1", "in", "Mode", "-", "K", "cells", "and", "infected", "for", "10", "-", "20", "min", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Arrows", "indicate", "colocalization", "of", "Nod2", "and", "ATG16L1", "around", "invading", "bacteria", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Immunofluorescence microscopy of HeLa cells transfected with HA-Nod2 (red) and Flag-ΔN85-ATG16L1(green) and infected for 10-20 min with S. flexneri M90T. Blue, DAPI. Arrows indicate colocalization of Nod2 and ATG16L1 around invading bacteria. Scale bars, 5 μm. Data are representative of one of three independent experiments.(b) Immunofluorescence microscopy of endogenous Nod2 and ATG16L1 in Mode-K cells and infected for 10-20 min with S. flexneri M90T. Blue, DAPI. Arrows indicate colocalization of Nod2 and ATG16L1 around invading bacteria. Scale bars, 5 μm. Data are representative of one of three independent experiments."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ",", "b", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "green", ";", "a", ")", "or", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "green", ";", "b", ")", "and", "HA", "-", "tagged", "Nod2", "L1007fsinsC", "(", "HA", "-", "Nod2", ",", "1007fs", ")", ".", "Area", "outlined", "at", "left", "is", "enlarged", "in", "other", "images", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "c", ")", "or", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "d", ")", "together", "with", "HA", "-", "tagged", "Nod2fs", "(", "red", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "(", "c", ")", "or", "Myc", "-", "FL", "-", "ATG16L1", "(", "d", ")", "together", "with", "HA", "-", "tagged", "Nod2fs", "(", "red", ")", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "(", "e", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nod2fs", "-", "KI", "BMDMs", "transduced", "with", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "and", "infected", "for", "0", ".", "5", "h", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", "-", "RFP", "(", "red", ")", ",", "followed", "by", "incubation", "for", "1", "h", "with", "gentamicin", ".", "Arrows", "indicate", "no", "colocalization", "of", "Nod2", "with", "ΔN85", "-", "ATG16L1", "or", "FL", "-", "ATG16L1", ".", "Scale", "bar", ",", "15", "μm", ".", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "GFP", "-", "LC3", "signals", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", "-", "RFP", "in", "experiments", "as", "described", "in", "e", ".", "Data", "are", "representative", "of", "one", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "error", "bars", "(", "f", ")", ",", "s", ".", "d", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a,b) Immunofluorescence microscopy of HeLa cells expressing Flag-ΔN85-ATG16L1 (green; a) or Myc-FL-ATG16L1 (green; b) and HA-tagged Nod2 L1007fsinsC (HA-Nod2, 1007fs). Area outlined at left is enlarged in other images.(c,d) Immunofluorescence microscopy of HeLa cells expressing Flag-ΔN85-ATG16L1 (c) or Myc-FL-ATG16L1 (d) together with HA-tagged Nod2fs (red). Blue, DAPI. Scale bar, 8 μm.(c,d) Immunofluorescence microscopy of HeLa cells expressing Flag-ΔN85-ATG16L1 (c) or Myc-FL-ATG16L1 (d) together with HA-tagged Nod2fs (red). Blue, DAPI. Scale bar, 8 μm.(e) Immunofluorescence microscopy of wild-type and Nod2fs-KI BMDMs transduced with GFP-LC3 (green) and infected for 0.5 h with S. flexneri M90T-RFP (red), followed by incubation for 1 h with gentamicin. Arrows indicate no colocalization of Nod2 with ΔN85-ATG16L1 or FL-ATG16L1. Scale bar, 15 μm. (f) Quantification of the colocalization of GFP-LC3 signals with S. flexneri M90T-RFP in experiments as described in e. Data are representative of one of three independent experiments (error bars (f), s.d.)."}
{"words": ["Figure", "1D", ")", "The", "heart", ",", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "and", "triceps", "muscle", "were", "isolated", "and", "analyzed", "to", "identify", "the", "presence", "of", "the", "duplication", "from", "exons", "18", "to", "30", "via", "RT", "-", "PCR", "using", "primers", "represented", "by", "the", "arrows", ".", "Sanger", "sequencing", "confirmed", "correct", "splicing", "of", "exons", "30", "and", "18", "at", "the", "duplication", "junction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D) The heart, tibialis anterior (TA) and triceps muscle were isolated and analyzed to identify the presence of the duplication from exons 18 to 30 via RT-PCR using primers represented by the arrows. Sanger sequencing confirmed correct splicing of exons 30 and 18 at the duplication junction."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "8", "-", "µm", "cross", "section", "of", "15", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "Dup18", "-", "30", "TA", "and", "triceps", "were", "analyzed", "for", "dystrophin", "localization", "by", "immunofluorescence", ".", "Asterisk", "indicates", "clusters", "of", "revertant", "fibers", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "B", ")", "The", "muscle", "architecture", "of", "the", "same", "muscles", "was", "investigated", "by", "H", "&", "E", "staining", ".", "A", "representative", "image", "is", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Asterisk", "indicates", "areas", "with", "necrotic", "fibers", "and", "fibrosis", ".", "Arrows", "indicate", "fibers", "with", "central", "nuclei", ".", "G", ",", "H", ")", "Mice", "were", "tested", "in", "an", "open", "-", "field", "chamber", "in", "which", "total", "distance", "travelled", "(", "G", ")", "and", "vertical", "activity", "(", "H", ")", "were", "assessed", ".", "WT", ",", "n", "=", "9", ";", "Dup18", "-", "30", "n", "=", "12", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) 8-µm cross section of 15-week-old WT and Dup18-30 TA and triceps were analyzed for dystrophin localization by immunofluorescence. Asterisk indicates clusters of revertant fibers. Scale bars, 100 μm. B) The muscle architecture of the same muscles was investigated by H&E staining. A representative image is shown. Scale bars, 100 μm. Asterisk indicates areas with necrotic fibers and fibrosis. Arrows indicate fibers with central nuclei.G, H) Mice were tested in an open-field chamber in which total distance travelled (G) and vertical activity (H) were assessed. WT, n = 9; Dup18-30 n = 12."}
{"words": ["Figure", "3F", ",", "G", ")", "Western", "blotting", "detected", "restoration", "of", "dystrophin", "expression", "in", "(", "F", ")", "heart", "and", "(", "G", ")", "TA", "in", "the", "Dup18", "-", "30", "mice", ".", "25", "%", "and", "50", "%", "of", "the", "WT", "proteins", "compared", "to", "Dup18", "-", "30", "mice", "have", "been", "loaded", "on", "the", "gel", ".", "Calnexin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "H", ")", "Immunostaining", "showed", "restoration", "of", "dystrophin", "expression", "in", "the", "heart", "and", "TA", ".", "A", "representative", "sample", "is", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3F, G ) Western blotting detected restoration of dystrophin expression in (F) heart and (G) TA in the Dup18-30 mice. 25% and 50% of the WT proteins compared to Dup18-30 mice have been loaded on the gel. Calnexin was used as a loading control.H) Immunostaining showed restoration of dystrophin expression in the heart and TA. A representative sample is shown. Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "for", "alpha", "-", "syntrophin", "and", "beta", "-", "sarcoglycan", "in", "the", "TA", "and", "triceps", "muscles", "of", "the", "Dup18", "-", "30", "mice", ".", "A", "representative", "image", "is", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "B", ")", "TA", ",", "triceps", "and", "diaphragm", "muscle", "architecture", "was", "analyzed", "by", "H", "&", "E", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Immunofluorescence staining for alpha-syntrophin and beta-sarcoglycan in the TA and triceps muscles of the Dup18-30 mice. A representative image is shown. Scale bars, 100 μm.B) TA, triceps and diaphragm muscle architecture was analyzed by H&E staining. Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Fibrosis", "was", "analyzed", "in", "the", "diaphragm", "via", "Masson", "Trichrome", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "WT", ",", "Dup18", "-", "30", "untreated", "and", "Dup18", "-", "30", "treated", "mice", "were", "tested", "7", "weeks", "after", "treatment", "by", "measuring", "(", "C", ")", "forelimbs", "grip"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Fibrosis was analyzed in the diaphragm via Masson Trichrome staining. Scale bars, 100 μm.WT, Dup18-30 untreated and Dup18-30 treated mice were tested 7 weeks after treatment by measuring (C) forelimbs grip strength"}
{"words": ["Figure", "1A", "HEK293T", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kBluciferase", "reporter", "plasmid", "and", "FLAG", "-", "tagged", "full", "-", "length", "CARD14", "(", "FL", ")", "or", "CARD14sh", "(", "short", ")", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "analyzed", "24", "h", "later", ".", "(", "A", ")", "NF", "-", "kB", "reporter", "gene", "expression", ".", "HEK293T", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "luciferase", "reporter", "plasmid", "and", "FLAG", "-", "tagged", "full", "-", "length", "CARD14", "(", "FL", ")", "or", "CARD14sh", "(", "short", ")", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "analyzed", "24", "h", "later", ".", "(", "B", ")", "IL", "-", "8", "secretion", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "P", "-", "values", "are", "compared", "against", "empty", "vector", "treatment", ".", "Significance", "levels", ",", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "student", "t", "test", ".", "Unless", "otherwise", "stated", ",", "p", "-", "values", "are", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "HEK293T", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "luciferase", "reporter", "plasmid", "and", "FLAG", "-", "tagged", "full", "-", "length", "CARD14", "(", "FL", ")", "or", "CARD14sh", "(", "short", ")", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "analyzed", "24", "h", "later", ".", "(", "C", ")", "Immunoblotting", "for", "c", "-", "Jun", ",", "phospho", "-", "c", "-", "Jun", ",", "JNK", ",", "phospho", "-", "JNK", ",", "p38", "and", "phospho", "-", "p38", "as", "indicated", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A HEK293T were transfected with NF-kBluciferase reporter plasmid and FLAG-tagged full-length CARD14 (FL) or CARD14sh (short) at the indicated concentrations and analyzed 24 h later. (A) NF-kB reporter gene expression.HEK293T were transfected with NF-kB luciferase reporter plasmid and FLAG-tagged full-length CARD14 (FL) or CARD14sh (short) at the indicated concentrations and analyzed 24 h later. (B) IL-8 secretion. Values are the mean of triplicates ± s.e. P-values are compared against empty vector treatment. Significance levels, ns P>0.05, *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 by student t test. Unless otherwise stated, p-values are p<0.001.HEK293T were transfected with NF-kB luciferase reporter plasmid and FLAG-tagged full-length CARD14 (FL) or CARD14sh (short) at the indicated concentrations and analyzed 24 h later. (C) Immunoblotting for c-Jun, phospho-c-Jun, JNK, phospho-JNK, p38 and phospho-p38 as indicated. Actin was used as a loading control. Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "MALT1", "interacts", "with", "CARD14sh", "in", "a", "BCL10", "-", "dependent", "manner", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "CARD14sh", ",", "Myc", "-", "MALT1", "and", "FLAG", "-", "BCL10", "as", "indicated", ".", "24", "h", "later", ",", "MALT1", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "cell", "lysates", "with", "anti", "-", "MALT1", ".", "CARD14sh", "and", "BCL10", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "MALT1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", ".", "Immunoprecipitated", "MALT1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "myc", ".", "The", "closed", "arrowhead", "shows", "the", "position", "of", "CARD14", ",", "the", "double", "arrowhead", "shows", "the", "position", "of", "BCL10", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "Total", "expression", "levels", "of", "transfected", "proteins", "are", "shown", "by", "immunoblotting", "of", "a", "fraction", "of", "the", "cell", "lysates", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "B", ")", "MALT1", "co", "-", "expression", "potentiates", "CARD14sh", "-", "induced", "JNK", "and", "p38", "MAP", "kinase", "activation", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "FLAG", "-", "tagged", "CARD14sh", ",", "with", "or", "without", "MALT1", "(", "30ng", ")", ".", "Transfection", "with", "FLAG", "-", "TRAF6", "and", "FLAG", "-", "CARD11", "(", "L232LI", ")", "were", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "c", "-", "Jun", "accumulation", ",", "JNK", "and", "p38", "phosphorylation", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "MALT1", "co", "-", "expression", "potentiates", "NF", "-", "kB", "activation", "by", "pathogenic", "CARD14", "mutants", ".", "HEK293T", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "reporter", "plasmid", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "FLAG", "-", "CARD14", "or", "the", "indicated", "psoriasis", "-", "associated", "CARD14", "mutants", "(", "15ng", ")", ",", "with", "or", "without", "MALT1", "(", "15ng", ")", ".", "Luciferase", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "measured", "after", "24", "h", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Significance", "levels", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "student", "t", "test", ".", "Expression", "of", "transfected", "proteins", "was", "verified", "by", "western", "blotting", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "D", ")", "CARD14", "(", "E138A", ")", "mutation", "enhances", "MALT1", "binding", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "FLAG", "-", "CARD14sh", "or", "the", "indicated", "CARD14sh", "mutants", "and", "Myc", "-", "MALT1", ".", "24", "h", "later", ",", "MALT1", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "cell", "lysates", "with", "anti", "-", "MALT1", "and", "CARD14", "co", "-", "immunoprecipitation", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "FLAG", ".", "Immunoprecipitated", "MALT1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "MALT1", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "Immunoprecipitation", "with", "a", "non", "-", "relevant", "antibody", "(", "rIgG", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "(", "first", "lane", ")", ".", "Total", "expression", "levels", "of", "transfected", "proteins", "are", "shown", "by", "immunoblotting", "of", "total", "cell", "lysates", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) MALT1 interacts with CARD14sh in a BCL10-dependent manner. HEK293T cells were transfected with FLAG-CARD14sh, Myc-MALT1 and FLAG-BCL10 as indicated. 24 h later, MALT1 was immunoprecipitated (IP) from cell lysates with anti-MALT1. CARD14sh and BCL10 co-immunoprecipitation with MALT1 was detected by immunoblotting with anti-FLAG. Immunoprecipitated MALT1 was detected by immunoblotting with anti-myc. The closed arrowhead shows the position of CARD14, the double arrowhead shows the position of BCL10. The asterisk indicates a non-specific band. Total expression levels of transfected proteins are shown by immunoblotting of a fraction of the cell lysates with the indicated antibodies (bottom panel).(B) MALT1 co-expression potentiates CARD14sh-induced JNK and p38 MAP kinase activation. HEK293T cells were transfected with the indicated concentrations of FLAG-tagged CARD14sh, with or without MALT1 (30ng). Transfection with FLAG-TRAF6 and FLAG-CARD11(L232LI) were used as a positive control. c-Jun accumulation, JNK and p38 phosphorylation were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated. Actin was used as a loading control.(C) MALT1 co-expression potentiates NF-kB activation by pathogenic CARD14 mutants. HEK293T were transfected with NF-kB reporter plasmid and wild-type (WT) FLAG-CARD14 or the indicated psoriasis-associated CARD14 mutants (15ng), with or without MALT1 (15ng). Luciferase activity in cell lysates was measured after 24 h. Values are the mean of triplicates ± s.e. Significance levels, *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 by student t test. Expression of transfected proteins was verified by western blotting (bottom panel).(D) CARD14(E138A) mutation enhances MALT1 binding. HEK293T cells were transfected with wild-type (WT) FLAG-CARD14sh or the indicated CARD14sh mutants and Myc-MALT1. 24 h later, MALT1 was immunoprecipitated (IP) from cell lysates with anti-MALT1 and CARD14 co-immunoprecipitation was detected by immunoblotting with anti-FLAG. Immunoprecipitated MALT1 was detected by immunoblotting with anti-MALT1. The asterisk indicates a non-specific band. Immunoprecipitation with a non-relevant antibody (rIgG) was used as a negative control (first lane). Total expression levels of transfected proteins are shown by immunoblotting of total cell lysates (bottom panel). Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "MALT1", "expression", "is", "essential", "for", "CARD14sh", "-", "induced", "NF", "-", "kB", "activation", ".", "MALT1", "-", "deficient", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "reporter", "plasmid", "and", "the", "indicated", "expression", "plasmids", ".", "Luciferase", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "measured", "24", "h", "later", ".", "CARD11", "(", "L232LI", ")", "and", "TRAF6", "transfection", "were", "used", "as", "MALT1", "-", "dependent", "and", "MALT1", "-", "independent", "controls", ",", "respectively", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Expression", "of", "the", "transfected", "plasmids", "was", "verified", "by", "immunoblotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "B", ")", "MALT1", "expression", "is", "essential", "for", "CARD14sh", "-", "induced", "JNK", "activation", ".", "MALT1", "-", "deficient", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "CARD14sh", "(", "30ng", ")", "either", "alone", "or", "together", "with", "either", "wild", "-", "type", "(", "MALT1WT", ")", "or", "catalytically", "inactive", "MALT1", "(", "MALT1C", "/", "A", ")", "as", "indicated", ".", "c", "-", "Jun", "accumulation", "and", "JNK", "phosphorylation", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "MALT1", "deficiency", "inhibits", "CARD14", "-", "induced", "gene", "expression", "in", "HaCaT", "keratinocytes", ".", "HaCaT", "cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", "or", "MALT1", "-", "targeting", "siRNA", "prior", "to", "doxycycline", "-", "induced", "CARD14", "expression", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", ".", "IL", "-", "8", "and", "MCP", "-", "1", "concentration", "in", "the", "cell", "supernatants", "was", "measured", "8", "h", "(", "IL", "-", "8", ")", "or", "24", "h", "(", "MCP", "-", "1", ")", "later", "by", "ELISA", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Doxycycline", "-", "induced", "CARD14", "expression", "and", "MALT1", "knock", "-", "down", "were", "verified", "by", "immunoblotting", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) MALT1 expression is essential for CARD14sh-induced NF-kB activation. MALT1-deficient HEK293T cells were transfected with NF-kB reporter plasmid and the indicated expression plasmids. Luciferase activity in cell lysates was measured 24 h later. CARD11(L232LI) and TRAF6 transfection were used as MALT1-dependent and MALT1-independent controls, respectively. Values are the mean of triplicates ± s.e. Expression of the transfected plasmids was verified by immunoblotting (lower panel).(B) MALT1 expression is essential for CARD14sh-induced JNK activation. MALT1-deficient HEK293T cells were transfected with FLAG-CARD14sh (30ng) either alone or together with either wild-type (MALT1WT) or catalytically inactive MALT1 (MALT1C/A) as indicated. c-Jun accumulation and JNK phosphorylation were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated. Actin was used as a loading control.(C) MALT1 deficiency inhibits CARD14-induced gene expression in HaCaT keratinocytes. HaCaT cells were transfected with scrambled (scr) or MALT1-targeting siRNA prior to doxycycline-induced CARD14 expression as described in materials and methods. IL-8 and MCP-1 concentration in the cell supernatants was measured 8 h (IL-8) or 24 h (MCP-1) later by ELISA. Values are the mean of triplicates ± s.e. Doxycycline-induced CARD14 expression and MALT1 knock-down were verified by immunoblotting (right panel). Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "CARD14", "signaling", "induces", "CYLD", "and", "A20", "cleavage", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "different", "concentrations", "of", "FLAG", "-", "CARD14", ",", "with", "or", "without", "MALT1", "as", "indicated", ".", "CARD11", "(", "L232LI", ")", "transfection", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "Endogenous", "CYLD", "and", "A20", "processing", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "CYLD", "and", "A20", "cleavage", "fragments", "are", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "(", "B", ")", "CARD14", "signaling", "induces", "CYLD", "cleavage", "after", "R324", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "different", "concentrations", "of", "FLAG", "-", "CARD14sh", "and", "either", "wild", "-", "type", "(", "CYLDWT", ")", "or", "non", "-", "cleavable", "CYLD", "(", "CYLDR324A", ")", ".", "CYLD", "processing", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "CYLD", "cleavage", "fragment", "is", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "(", "C", ")", "Expression", "of", "catalytically", "active", "MALT1", "is", "necessary", "for", "CARD14", "-", "induced", "CYLD", "cleavage", ".", "MALT1", "-", "deficient", "HEK293T", "cells", "in", "which", "MALT1", "expression", "was", "restored", "by", "transfection", "with", "different", "concentrations", "of", "either", "wild", "-", "type", "(", "MALT1WT", ")", "or", "catalytically", "inactive", "MALT1", "(", "MALT1C", "/", "A", ")", ",", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FLAG", "-", "CARD14sh", "and", "CYLD", "as", "indicated", ".", "CYLD", "processing", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "CYLD", "cleavage", "fragment", "is", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "(", "D", ")", "Psoriasis", "-", "associated", "CARD14", "mutation", "enhances", "activation", "of", "MALT1", "proteolytic", "activity", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "FLAG", "-", "CARD14", "or", "different", "psoriasis", "-", "associated", "CARD14", "mutants", "(", "20ng", ")", ",", "with", "or", "without", "MALT1", "(", "20", "ng", ")", "as", "indicated", ".", "Endogenous", "CYLD", "and", "A20", "processing", ",", "as", "well", "as", "IκBα", "phosphorylation", ",", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "The", "CYLD", "and", "A20", "cleavage", "fragments", "are", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "(", "E", ")", "Pharmacological", "inhibition", "of", "MALT1", "proteolytic", "activity", "prevents", "CARD14", "-", "induced", "gene", "expression", "in", "HaCaT", "keratinocytes", ".", "CARD14", "expression", "was", "induced", "by", "doxycycline", "(", "dox", ")", "treatment", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "different", "concentrations", "of", "mepazine", "as", "indicated", ".", "The", "next", "morning", ",", "cell", "culture", "medium", "was", "refreshed", "and", "IL", "-", "8", "and", "MCP", "-", "1", "concentration", "in", "the", "cell", "supernatant", "was", "measured", "8", "h", "later", "by", "ELISA", ".", "TNF", "stimulation", "(", "MALT1", "-", "independent", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Significance", "levels", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "student", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) CARD14 signaling induces CYLD and A20 cleavage. HEK293T cells were transfected with different concentrations of FLAG-CARD14, with or without MALT1 as indicated. CARD11(L232LI) transfection was used as a positive control. Endogenous CYLD and A20 processing was analyzed by immunoblotting. CYLD and A20 cleavage fragments are indicated by an arrow.(B) CARD14 signaling induces CYLD cleavage after R324. HEK293T cells were transfected with different concentrations of FLAG-CARD14sh and either wild-type (CYLDWT) or non-cleavable CYLD (CYLDR324A). CYLD processing was analyzed by immunoblotting. The CYLD cleavage fragment is indicated by an arrow.(C) Expression of catalytically active MALT1 is necessary for CARD14-induced CYLD cleavage. MALT1-deficient HEK293T cells in which MALT1 expression was restored by transfection with different concentrations of either wild-type (MALT1WT) or catalytically inactive MALT1 (MALT1C/A), were co-transfected with FLAG-CARD14sh and CYLD as indicated. CYLD processing was analyzed by immunoblotting. The CYLD cleavage fragment is indicated by an arrow.(D) Psoriasis-associated CARD14 mutation enhances activation of MALT1 proteolytic activity. HEK293T cells were transfected with wild-type (WT) FLAG-CARD14 or different psoriasis-associated CARD14 mutants (20ng), with or without MALT1 (20 ng) as indicated. Endogenous CYLD and A20 processing, as well as IκBα phosphorylation, were analyzed by immunoblotting. The CYLD and A20 cleavage fragments are indicated by an arrow.(E) Pharmacological inhibition of MALT1 proteolytic activity prevents CARD14-induced gene expression in HaCaT keratinocytes. CARD14 expression was induced by doxycycline (dox) treatment in the absence or presence of different concentrations of mepazine as indicated. The next morning, cell culture medium was refreshed and IL-8 and MCP-1 concentration in the cell supernatant was measured 8 h later by ELISA. TNF stimulation (MALT1-independent) was used as a negative control. Values are the mean of triplicates ± s.e. Data are representative of two independent experiments. Significance levels, *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001 by student t test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "B", ")", "CYLD", "and", "A20", "inhibit", "CARD14sh", "-", "induced", "NF", "-", "kB", "activation", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "reporter", "plasmid", "and", "FLAG", "-", "tagged", "CARD14sh", "(", "30ng", ")", ",", "with", "or", "without", "the", "indicated", "concentrations", "of", "CYLD", "(", "A", ")", "or", "A20", "(", "B", ")", ".", "Luciferase", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "measured", "24", "h", "later", ".", "Closed", "arrowheads", "indicate", "full", "length", "A20", "and", "CYLD", ";", "arrows", "indicate", "cleaved", "A20", "and", "CYLD", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "A20", "and", "ABIN", "-", "1", "inhibit", "CARD14", "-", "induced", "NF", "-", "kB", "activation", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "reporter", "plasmid", ",", "A20", "(", "3", "ng", ")", "or", "ABIN1", "(", "15ng", ")", "and", "the", "indicated", "concentrations", "of", "FLAG", "-", "tagged", "CARD14sh", ".", "Luciferase", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "measured", "24", "h", "later", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Protein", "expression", "of", "transfected", "plasmids", "was", "verified", "by", "western", "blot", "and", "is", "shown", "in", "the", "accompanying", "panels", ".", "(", "D", ")", "A20", "inhibits", "CARD14", "-", "induced", "NF", "-", "kB", "activation", "through", "its", "ZnF", "domains", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NF", "-", "kB", "reporter", "plasmid", ",", "FLAG", "-", "CARD14sh", "(", "20ng", ")", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutant", "A20", "expression", "plasmids", "(", "3ng", ")", "as", "indicated", ".", "Luciferase", "activity", "in", "cell", "lysates", "was", "measured", "after", "24", "h", ".", "CARD14", "and", "A20", "expression", "was", "measured", "by", "immunoblotting", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-B) CYLD and A20 inhibit CARD14sh-induced NF-kB activation. HEK293T cells were transfected with NF-kB reporter plasmid and FLAG-tagged CARD14sh (30ng), with or without the indicated concentrations of CYLD (A) or A20 (B). Luciferase activity in cell lysates was measured 24 h later. Closed arrowheads indicate full length A20 and CYLD; arrows indicate cleaved A20 and CYLD. Data are representative of three independent experiments.(C) A20 and ABIN-1 inhibit CARD14-induced NF-kB activation. HEK293T cells were transfected with NF-kB reporter plasmid, A20 (3 ng) or ABIN1 (15ng) and the indicated concentrations of FLAG-tagged CARD14sh. Luciferase activity in cell lysates was measured 24 h later. Values are the mean of triplicates ± s.e. Protein expression of transfected plasmids was verified by western blot and is shown in the accompanying panels.(D) A20 inhibits CARD14-induced NF-kB activation through its ZnF domains. HEK293T cells were transfected with NF-kB reporter plasmid, FLAG-CARD14sh (20ng) and wild-type (WT) or mutant A20 expression plasmids (3ng) as indicated. Luciferase activity in cell lysates was measured after 24 h. CARD14 and A20 expression was measured by immunoblotting (bottom panel). Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "CARD14", "(", "E138A", ")", "induces", "cytokine", "and", "chemokine", "expression", "in", "human", "primary", "keratinocytes", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "CARD14", "(", "E138A", ")", "as", "indicated", ".", "24", "h", "later", ",", "the", "secretion", "of", "36", "different", "human", "cytokines", ",", "chemokines", ",", "and", "acute", "phase", "proteins", "was", "analyzed", "via", "a", "multiplex", "antibody", "array", ".", "Quantification", "was", "done", "using", "ImageJ", "software", "and", "is", "expressed", "as", "relative", "CARD14", "/", "EV", "values", "for", "a", "selected", "number", "of", "proteins", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "B", ")", "MALT1", "deficiency", "inhibits", "CARD14", "(", "E138A", ")", "-", "induced", "cytokine", "and", "chemokine", "expression", "in", "human", "primary", "keratinocytes", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", "or", "MALT1", "-", "targeting", "siRNA", "as", "indicated", ",", "48", "h", "later", "followed", "by", "transfection", "with", "CARD14", "(", "E138A", ")", ".", "After", "24", "h", ",", "cytokine", "and", "chemokine", "expression", "was", "analyzed", "and", "is", "expressed", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "C", ")", "Pathogenic", "CARD14", "mutation", "enhances", "MALT1", "-", "dependent", "CARD14", "-", "induced", "IL", "-", "8", "expression", "in", "human", "primary", "keratinocytes", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "(", "scr", ")", "or", "MALT1", "-", "targeting", "siRNA", "as", "indicated", ",", "48", "h", "later", "followed", "by", "transfection", "with", "CARD14", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "CARD14", "(", "G117S", ")", "or", "CARD14", "(", "E138A", ")", "as", "indicated", ".", "TNF", "treatment", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "After", "24", "h", ",", "IL", "-", "8", "concentration", "in", "the", "cell", "supernatant", "was", "analyzed", "via", "ELISA", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Expression", "levels", "of", "MALT1", "and", "CARD14", "variants", "is", "verified", "by", "immunoblotting", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "D", ")", "Pharmacological", "inhibition", "of", "MALT1", "proteolytic", "activity", "inhibits", "CARD14", "-", "induced", "IL", "-", "8", "production", "and", "A20", "processing", "in", "human", "primary", "keratinocytes", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "different", "CARD14", "variants", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "mepazine", "as", "indicated", ".", "TNF", "treatment", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "24", "h", "later", ",", "IL", "-", "8", "levels", "in", "the", "cell", "supernatant", "were", "measured", "by", "ELISA", ".", "Values", "are", "the", "mean", "of", "triplicates", "±", "s", ".", "e", ".", "Expression", "of", "different", "CARD14", "variants", "and", "CARD14", "-", "induced", "processing", "of", "endogenous", "A20", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Significance", "levels", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "student", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) CARD14(E138A) induces cytokine and chemokine expression in human primary keratinocytes. Cells were transfected with empty vector (EV) or CARD14(E138A) as indicated. 24 h later, the secretion of 36 different human cytokines, chemokines, and acute phase proteins was analyzed via a multiplex antibody array. Quantification was done using ImageJ software and is expressed as relative CARD14/EV values for a selected number of proteins (bottom panel).(B) MALT1 deficiency inhibits CARD14(E138A)-induced cytokine and chemokine expression in human primary keratinocytes. Cells were transfected with scrambled (scr) or MALT1-targeting siRNA as indicated, 48 h later followed by transfection with CARD14(E138A). After 24 h, cytokine and chemokine expression was analyzed and is expressed as described in (A).(C) Pathogenic CARD14 mutation enhances MALT1-dependent CARD14-induced IL-8 expression in human primary keratinocytes. Cells were transfected with scrambled (scr) or MALT1-targeting siRNA as indicated, 48 h later followed by transfection with CARD14 wild-type (WT), CARD14(G117S) or CARD14(E138A) as indicated. TNF treatment was used as a control. After 24 h, IL-8 concentration in the cell supernatant was analyzed via ELISA. Values are the mean of triplicates ± s.e. Expression levels of MALT1 and CARD14 variants is verified by immunoblotting (bottom panel).(D) Pharmacological inhibition of MALT1 proteolytic activity inhibits CARD14-induced IL-8 production and A20 processing in human primary keratinocytes. Cells were transfected with different CARD14 variants in the presence or absence of mepazine as indicated. TNF treatment was used as a control. 24 h later, IL-8 levels in the cell supernatant were measured by ELISA. Values are the mean of triplicates ± s.e. Expression of different CARD14 variants and CARD14-induced processing of endogenous A20 were analyzed by immunoblotting. Data are representative of two independent experiments. Significance levels, *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001 by student t test."}
{"words": ["Figure", "1", "A", ")", "Treadmill", "analysis", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", "(", "T3", ")", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "T4", ")", ".", "Only", "p", "values", "for", "rapamycin", "-", "treated", "vs", ".", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", "mice", "are", "shown", "B", ")", "Histological", "and", "histochemical", "characterization", "of", "skeletal", "muscle", "in", "rapamycin", "-", "treated", "and", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", "and", "WT", "mice", ".", "H", "&", "E", ":", "hematoxylin", "and", "eosin", ";", "PAS", ":", "periodic", "acid", "Schiff", "reaction", ";", "COX", ":", "cytochrome", "c", "oxidase", ";", "SDH", ":", "succinate", "dehydrogenase", ".", "White", "bars", "correspond", "to", "50µm", "C", ")", "Analysis", "of", "the", "cross", "-", "sectional", "area", "of", "muscle", "fibers", "in", "the", "different", "genotypes", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ":", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "006", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "D", ")", "Analysis", "of", "the", "number", "of", "centralized", "nuclei", "in", "muscle", "fibers", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0018", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0052", "E", ")", "Analysis", "of", "PAS", "-", "reaction", "intensity", "in", "muscle", "fibers", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0293", "(", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", "and", "*", "p", "=", "0", ".", "0150", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "Rapa", ")", "F", ")", "Analysis", "of", "COX", "-", "reaction", "intensity", "in", "muscle", "fibers", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0031", "G", ")", "Analysis", "of", "SDH", "-", "reaction", "intensity", "in", "muscle", "fibers", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0199", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0091"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 A) Treadmill analysis (n=8/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by unpaired, two-tailed Student's t test ***p=0.005; ***p=0.0007 (T3) and ****p<0.0001 (T4). Only p values for rapamycin-treated vs. untreated Cox15sm/sm mice are shown  B) Histological and histochemical characterization of skeletal muscle in rapamycin-treated and untreated Cox15sm/sm and WT mice. H&E: hematoxylin and eosin; PAS: periodic acid Schiff reaction; COX: cytochrome c oxidase; SDH: succinate dehydrogenase. White bars correspond to 50µm  C) Analysis of the cross-sectional area of muscle fibers in the different genotypes (n=3/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test: ***p=0.001; ***p=0.006, ****p<0.0001  D) Analysis of the number of centralized nuclei in muscle fibers (n=3/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test **p=0.0018, **p=0.0052  E) Analysis of PAS-reaction intensity in muscle fibers (n=4/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test *p=0.0293 (WT vs. Cox15sm/sm) and *p=0.0150 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm Rapa)  F) Analysis of COX-reaction intensity in muscle fibers (n=3). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test ****p<0.0001; **p=0.0031  G) Analysis of SDH-reaction intensity in muscle fibers (n=3). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test *p=0.0199, **p=0.0091 "}
{"words": ["Figure", "2", "A", ")", "Spectrophotometric", "activities", "of", "the", "respiratory", "chain", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "/", "group", ")", ".", "CS", ":", "citrate", "synthase", ";", "CIV", ":", "complex", "IV", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "two", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "CS", ":", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0010", "(", "CS", ":", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "rapamycin", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "CIV", ":", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0060", "(", "CIV", "/", "CS", ":", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", "B", ")", "Western", "blot", "immunovisualization", "of", "subunits", "of", "the", "respiratory", "complexes", ".", "Note", "the", "increased", "protein", "levels", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "WT", "samples", ",", "which", "are", "reduced", "to", "normal", "levels", "upon", "rapamycin", "treatment", ".", "Additional", "samples", "were", "run", "on", "a", "separate", "gel", "(", "not", "shown", ")", "C", ")", "BNGE", "in", "gel", "activity", "for", "cIV", ".", "Sc", ":", "supercomplexes", ".", "Note", "that", "the", "COX", "reaction", "is", "slightly", "increased", "in", "rapamycin", "-", "treated", "vs", ".", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", "samples", "D", ")", "Immunoblot", "of", "1D", "-", "BNGE", "using", "an", "anti", "-", "cIV", "antibody", "(", "COX1", ")", ".", "Note", "that", "COX", "amount", "is", "slightly", "increased", "in", "rapamycin", "treated", "vs", ".", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", "muscles", ".", "SDHB", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "E", ")", "State", "III", "(", "succinate", "-", "driven", ")", "oxygen", "consumption", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "unpaired", ",", "two", "tail", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0016", "(", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "047", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "rapamycin", ")", "F", ")", "Analysis", "of", "mtDNA", "amount", "(", "n", "=", "9", "/", "group", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0020", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0296"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A) Spectrophotometric activities of the respiratory chain (n=4-5/group). CS: citrate synthase; CIV: complex IV. Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by two way ANOVA with Tukey's correction ****p<0.0001 (CS: WT vs. Cox15sm/sm), ***p=0.0010 (CS: Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm rapamycin), ****p<0.0001 (CIV: WT vs. Cox15sm/sm), **p=0.0060 (CIV/CS: WT vs. Cox15sm/sm)  B) Western blot immunovisualization of subunits of the respiratory complexes. Note the increased protein levels in Cox15sm/sm vs. WT samples, which are reduced to normal levels upon rapamycin treatment. Additional samples were run on a separate gel (not shown)  C) BNGE in gel activity for cIV. Sc: supercomplexes. Note that the COX reaction is slightly increased in rapamycin-treated vs. untreated Cox15sm/sm samples  D) Immunoblot of 1D-BNGE using an anti-cIV antibody (COX1). Note that COX amount is slightly increased in rapamycin treated vs. untreated Cox15sm/sm muscles. SDHB was used as a loading control  E) State III (succinate-driven) oxygen consumption (n=3/group). Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by unpaired, two tail Student's t test **p=0.0016 (WT vs. Cox15sm/sm); *p=0.047 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm rapamycin)  F) Analysis of mtDNA amount (n=9/group). Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey's correction: **p=0.0020; *p=0.0296 "}
{"words": ["Figure", "3", "Note", "the", "accumulation", "of", "profoundly", "altered", "mitochondria", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "muscles", "(", "white", "arrows", ")", ",", "possibly", "as", "a", "result", "of", "partially", "digested", "organelles", "within", "endolysosomes", ".", "Black", "arrows", "indicate", "examples", "of", "normal", "mitochondria", ".", "In", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", "animals", "only", "a", "few", "of", "these", "structures", "are", "present", ",", "which", "can", "be", "detected", "also", "in", "rapamycin", "-", "treated", "WT", "samples", ".", "The", "bar", "corresponds", "to", "1136", "nm", "(", "4400X", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Note the accumulation of profoundly altered mitochondria in Cox15sm/sm muscles (white arrows), possibly as a result of partially digested organelles within endolysosomes. Black arrows indicate examples of normal mitochondria. In rapamycin-treated Cox15sm/sm animals only a few of these structures are present, which can be detected also in rapamycin-treated WT samples. The bar corresponds to 1136 nm (4400X) "}
{"words": ["Figure", "4", "A", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "autophagy", "markers", "at", "steady", "state", "in", "skeletal", "muscle", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", ")", "Densitometric", "analysis", "of", "immunoblots", "similar", "to", "that", "shown", "in", "A", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0068", "(", "LC3", "-", "II", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0063", "(", "P62", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", "*", "p", "=", "0", ".", "025", "(", "P62", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0098", "(", "S6", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "034", "(", "P", "-", "S6", "WT", "vs", "WT", "+", "rapamycin", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "014", "(", "P", "-", "S6", "WT", "vs", ".", "WT", "+", "rapamycin", ")", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", ")", "C", ")", "Analysis", "of", "the", "autophagic", "flux", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Upper", "panel", ":", "representative", "western", "blot", "of", "Cox15sm", "/", "sm", "and", "WT", "muscles", "treated", "with", "colchicine", ",", "rapamycin", ",", "or", "rapamycin", "plus", "colchicine", ".", "Note", "that", "LC3", "-", "II", "was", "increased", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "WT", "samples", ".", "Colchicine", "did", "not", "increase", "LC3", "-", "II", "levels", "suggesting", "a", "block", "in", "the", "autophagic", "flux", ";", "rapamycin", "plus", "colchicine", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", "mice", "showed", "higher", "levels", "of", "LC3", "-", "II", ",", "suggesting", "that", "rapamycin", "increased", "the", "autophagic", "flux", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "muscles", ".", "Black", ":", "WT", ";", "dark", "grey", ":", "colchicine", "-", "treated", "WT", ";", "middle", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "light", "grey", ":", "colchicine", "plus", "rapamycin", "treated", "mice", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "orange", ":", "colchicine", "-", "treated", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "purple", ":", "colchicine", "plus", "rapamycin", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0049", "(", "WT", "vs", ".", "WT", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0046", "(", "WT", "+", "rapamycin", "vs", ".", "WT", "+", "rapamycin", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0225", "(", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0057", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "colchicine", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0003", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "rapamycin", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", "+", "colchicine", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A) Representative western blot of autophagy markers at steady state in skeletal muscle. GAPDH was used as a loading control. B) Densitometric analysis of immunoblots similar to that shown in A (n=4/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test **p=0.0068 (LC3-II WT vs. Cox15sm/sm), **p=0.0063 (P62 WT vs. Cox15sm/sm) *p=0.025 (P62 Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rapamycin), **p=0.0098 (S6 WT vs. Cox15sm/sm), *p=0.034 (P-S6 WT vs WT+rapamycin), ***p=0.0002 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rapamycin), *p=0.014 (P-S6 WT vs. WT+rapamycin) ***p=0.0007 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rapamycin) C) Analysis of the autophagic flux (n=3/group). Upper panel: representative western blot of Cox15sm/sm and WT muscles treated with colchicine, rapamycin, or rapamycin plus colchicine. Note that LC3-II was increased in Cox15sm/sm vs. WT samples. Colchicine did not increase LC3-II levels suggesting a block in the autophagic flux; rapamycin plus colchicine treated Cox15sm/sm mice showed higher levels of LC3-II, suggesting that rapamycin increased the autophagic flux in Cox15sm/sm muscles. Black: WT; dark grey: colchicine-treated WT; middle grey: rapamycin-treated WT; light grey: colchicine plus rapamycin treated mice; red: untreated Cox15sm/sm; orange: colchicine-treated; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm; purple: colchicine plus rapamycin treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test **p=0.0049 (WT vs. WT+colchicine), **p=0.0046 (WT+rapamycin vs. WT+rapamycin+colchicine), *p=0.0225 (WT vs. Cox15sm/sm), **p=0.0057 (Cox15sm/sm colchicine vs. Cox15sm/sm+rapamycin+colchicine), ***p=0.0003 (Cox15sm/sm rapamycin vs. Cox15sm/sm+rapamycin+colchicine)"}
{"words": ["Figure", "5", "A", ")", "Analysis", "of", "the", "autophagic", "flux", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", ".", "Upper", "panel", ":", "representative", "western", "blot", "of", "Cox15sm", "/", "sm", "and", "WT", "muscles", "treated", "with", "colchicine", ",", "rilmenidine", ",", "or", "rilmenidine", "plus", "colchicine", ".", "Colchicine", "alone", "increased", "LC3", "-", "II", "in", "WT", "but", "not", "Cox15sm", "/", "sm", "mice", ";", "rilmenidine", "had", "no", "effect", "on", "WT", "LC3", "-", "II", "levels", ",", "but", "reduced", "them", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "mice", ".", "Rilmenidine", "plus", "colchicine", "increased", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "both", "WT", "and", "Cox15sm", "/", "sm", "mice", ".", "Black", ":", "WT", ";", "dark", "grey", ":", "colchicine", "-", "treated", "WT", ";", "middle", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "light", "grey", ":", "colchicine", "plus", "rapamycin", "treated", "mice", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "orange", ":", "colchicine", "-", "treated", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "purple", ":", "colchicine", "plus", "rapamycin", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0093", "(", "WT", "vs", ".", "WT", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "(", "WT", "+", "rilmenidine", "vs", ".", "WT", "+", "rilmenidine", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "WT", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", ")", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0083", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rilmenidine", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0112", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rilmenidine", "+", "colchicine", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "000", "B", ")", "Treadmill", "analysis", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "C", ")", "Histological", "and", "histochemical", "characterization", "of", "skeletal", "muscle", "in", "rapamycin", "-", "treated", "and", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", "and", "WT", "mice", ".", "H", "&", "E", ":", "hematoxylin", "and", "eosin", ";", "GT", ":", "Gomori", "trichrome", ";", "PAS", ":", "periodic", "acid", "Schiff", "reaction", "D", ")", "Analysis", "of", "the", "cross", "-", "sectional", "area", "of", "muscle", "fibers", "in", "the", "different", "genotypes", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "E", ")", "Analysis", "of", "the", "number", "of", "centralized", "nuclei", "in", "muscle", "fibres", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rilmenidine", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0091"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A) Analysis of the autophagic flux (n=4/group). Upper panel: representative western blot of Cox15sm/sm and WT muscles treated with colchicine, rilmenidine, or rilmenidine plus colchicine. Colchicine alone increased LC3-II in WT but not Cox15sm/sm mice; rilmenidine had no effect on WT LC3-II levels, but reduced them in Cox15sm/sm mice. Rilmenidine plus colchicine increased LC3-II levels in both WT and Cox15sm/sm mice. Black: WT; dark grey: colchicine-treated WT; middle grey: rapamycin-treated WT; light grey: colchicine plus rapamycin treated mice; red: untreated Cox15sm/sm; orange: colchicine-treated; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm; purple: colchicine plus rapamycin treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test: **p=0.0093 (WT vs. WT+colchicine), ****p<0.0001 (WT+rilmenidine vs. WT+rilmenidine+colchicine), **p=0.0001 (WT vs. Cox15sm/sm), **p=0.0083 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rilmenidine), *p=0.0112 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rilmenidine+colchicine), ****p<0.000 B) Treadmill analysis (n=4/group). Black: untreated WT; grey: rilmenidine-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rilmenidine-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM  C) Histological and histochemical characterization of skeletal muscle in rapamycin-treated and untreated Cox15sm/sm and WT mice. H&E: hematoxylin and eosin; GT: Gomori trichrome; PAS: periodic acid Schiff reaction  D) Analysis of the cross-sectional area of muscle fibers in the different genotypes (n=3/group). Black: untreated WT; grey: rilmenidine-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rilmenidine-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test ***p=0.0002, ****p<0.0001  E) Analysis of the number of centralized nuclei in muscle fibres (n=3/group). Black: untreated WT; grey: rilmenidine-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rilmenidine-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test **p=0.0091 "}
{"words": ["Figure", "6", "A", ")", "anti", "-", "TFEB", "immunofluorescence", "on", "rapamycin", "-", "and", "rilmenidine", "-", "treated", "WT", "and", "Cox15sm", "/", "sm", "muscles", "vs", ".", "untreated", "(", "UT", ")", "samples", ".", "CD11C", "(", "blue", "signal", ")", "indicates", "inflammatory", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "n", "=", "3", "animals", "/", "group", ".", "The", "scale", "bars", "correspond", "to", "30µm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "TFEB", "-", "positive", "nuclei", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Quantification", "was", "performed", "using", "Imaris", "spots", "surface", "excluding", "the", "CD11C", "positive", "nuclei", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0199", "(", "WT", "vs", ".", "WT", "+", "rapamycin", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0150", "(", "Cox15sm", "/", "sm", "vs", ".", "Cox15sm", "/", "sm", "+", "rapamycin", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A) anti-TFEB immunofluorescence on rapamycin- and rilmenidine-treated WT and Cox15sm/sm muscles vs. untreated (UT) samples. CD11C (blue signal) indicates inflammatory cells. Right panel: quantification of n=3 animals/group. The scale bars correspond to 30µm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test B) Quantification of the TFEB-positive nuclei (n=3/group). Quantification was performed using Imaris spots surface excluding the CD11C positive nuclei. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test *p=0.0199 (WT vs. WT+rapamycin), *p=0.0150 (Cox15sm/sm vs. Cox15sm/sm+rapamycin), ***p=0.0001 "}
{"words": ["Figure", "7", "A", ")", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Lamp1", "transcript", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Black", ":", "untreated", "WT", ";", "grey", ":", "rapamycin", "-", "treated", "WT", ";", "red", ":", "untreated", "Cox15sm", "/", "sm", ";", "blue", ":", "rapamycin", "-", "treated", "Cox15sm", "/", "sm", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "008", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "038", "B", ")", "Anti", "-", "LAMP1", "staining", "in", "rapamycin", "-", "and", "rilmenidine", "-", "treated", "WT", "and", "Cox15sm", "/", "sm", "muscles", "vs", ".", "untreated", "(", "UT", ")", "samples", ".", "Rapamycin", ",", "but", "not", "rilmendine", ",", "increases", "the", "number", "of", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "in", "Cox15sm", "/", "sm", "samples", "(", "inset", ")", ".", "The", "scale", "bars", "correspond", "to", "30µm", "C", ")", "Quantification", "of", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "D", ")", "Cathepsin", "L", "specific", "activity", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "The", "asterisks", "represent", "the", "significance", "levels", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0133"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 A) Real-time PCR analysis of Lamp1 transcript (n=3/group). Black: untreated WT; grey: rapamycin-treated WT; red: untreated Cox15sm/sm; blue: rapamycin-treated Cox15sm/sm. Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by Student's t test **p=0.008, *p=0.038  B) Anti-LAMP1 staining in rapamycin- and rilmenidine-treated WT and Cox15sm/sm muscles vs. untreated (UT) samples. Rapamycin, but not rilmendine, increases the number of LAMP1-positive vesicles in Cox15sm/sm samples (inset). The scale bars correspond to 30µm  C) Quantification of LAMP1-positive vesicles (n=3/group). Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by one-way ANOVA with Tukey post-hoc multiple comparison test ****p<0.0001  D) Cathepsin L specific activity (n=3/group). Error bars represent SEM. The asterisks represent the significance levels calculated by Student's t test *p=0.0133 "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Cleavage", "of", "supercoiled", "(", "SC", ")", "plasmid", "DNA", "substrates", "using", "purified", "Cas12l", "nuclease", "and", "respective", "sgRNA", "variants", ".", "Efficient", "full", "length", "linearization", "(", "FLL", ")", "of", "the", "substrate", "resulting", "from", "a", "complete", "double", "-", "strand", "break", "was", "only", "observed", "when", "using", "sgRNAs", "bearing", "the", "5", "'", "most", "end", "of", "the", "tracrRNA", "(", "variants", "1", "and", "3", ")", ".", "Moreover", ",", "the", "terminator", "-", "like", "Hairpin", "3", "is", "not", "required", "for", "target", "cleavage", "(", "variant", "1", ")", ".", "OC", "-", "open", "circular", ";", "FLL", "-", "full", "length", "linear", ";", "SC", "-", "supercoiled", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Cleavage of supercoiled (SC) plasmid DNA substrates using purified Cas12l nuclease and respective sgRNA variants. Efficient full length linearization (FLL) of the substrate resulting from a complete double-strand break was only observed when using sgRNAs bearing the 5' most end of the tracrRNA (variants 1 and 3). Moreover, the terminator-like Hairpin 3 is not required for target cleavage (variant 1). OC - open circular; FLL - full length linear; SC- supercoiled."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Substitution", "of", "alanine", "residues", "disrupts", "linear", "dsDNA", "cleavage", "confirming", "key", "catalytic", "positions", "within", "the", "RuvC", "nuclease", "domain", "of", "Asp2Cas12l", "and", "Asp3Cas12l", ".", "wt", "-", "wildtype", ".", "(", "C", ")", "Cleavage", "of", "oligoduplex", "dsDNA", "substrates", "with", "purified", "RNP", "complexes", "confirm", "PAM", "recognition", ".", "The", "molar", "ratio", "of", "RNP", "to", "substrate", "was", "kept", "low", "(", "5", ":", "1", ")", "to", "increase", "reaction", "stringency", ".", "Asp2Cas12l", "predominantly", "recognizes", "a", "5", "'", "-", "CCY", "-", "3", "'", "PAM", "and", "Asp3Cas12l", "a", "5", "'", "-", "CCB", "-", "3", "'", "PAM", ".", "N", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "C", ")", ",", "individual", "data", "points", "are", "plotted", ",", "where", "n", "=", "4", "replicates", "from", "independent", "experiments", "(", "Asp2Cas12l", ")", "and", "n", "=", "3", "replicates", "from", "independent", "experiments", "(", "Asp3Cas12l", ")", ".", "The", "data", "points", "were", "fitted", "to", "a", "single", "exponential", "association", "curve", "(", "solid", "lines", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Substitution of alanine residues disrupts linear dsDNA cleavage confirming key catalytic positions within the RuvC nuclease domain of Asp2Cas12l and Asp3Cas12l. wt - wildtype.(C) Cleavage of oligoduplex dsDNA substrates with purified RNP complexes confirm PAM recognition. The molar ratio of RNP to substrate was kept low (5:1) to increase reaction stringency. Asp2Cas12l predominantly recognizes a 5'-CCY-3' PAM and Asp3Cas12l a 5'-CCB-3' PAM. N=3. Data information: In (C), individual data points are plotted, where n = 4 replicates from independent experiments (Asp2Cas12l) and n = 3 replicates from independent experiments (Asp3Cas12l). The data points were fitted to a single exponential association curve (solid lines)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Asp2", "and", "Asp3Cas12l", "RNP", "complexes", "degrade", "M13", "ssDNA", "in", "the", "presence", "of", "single", "-", "stranded", "(", "ss", ")", "DNA", "or", "dsDNA", "(", "including", "PAM", ")", "activators", "with", "target", "sequences", "complementary", "to", "the", "gRNA", "spacer", ".", "NS", "activator", "-", "non", "specific", "activator", "(", "ssDNA", "oligonucleotide", "or", "dsDNA", "duplex", ")", "with", "no", "sequence", "complementarity", "to", "the", "spacer", "of", "the", "gRNA", ".", "(", "B", ")", "Asp2Cas12l", "RNP", "complexes", "activated", "with", "ss", "or", "dsDNA", "degrade", "quenched", "fluorescent", "ssDNA", "or", "ssRNA", "probes", ".", "Background", "-", "subtracted", "traces", "from", "fluorescent", "reporter", "assays", "with", "favored", "ssDNA", "(", "5", "'", "-", "CCCCCCCC", "-", "3", "'", ")", "or", "ssRNA", "(", "5", "'", "-", "CCCCCCCC", "-", "3", "'", ")", "probes", ".", "RFU", "-", "relative", "fluorescence", "units", ".", "(", "C", ")", "Background", "-", "subtracted", "traces", "of", "fluorescent", "reporter", "cleavage", "using", "ssDNA", "or", "ssRNA", "probes", ".", "(", "D", ")", "Rates", "of", "trans", "-", "degradation", "with", "ssRNA", "or", "ssDNA", "reporters", "activated", "with", "either", "ssDNA", "or", "dsDNA", "targets", ".", "Collateral", "ssDNAse", "activity", "is", "about", "3", "-", "fold", "higher", "than", "the", "rate", "of", "ssRNA", "degradation", ".", "Fluorescence", "intensities", "in", "B", "-", "C", "were", "normalized", "against", "the", "fluorescence", "of", "a", "reaction", "containing", "only", "the", "probe", "to", "account", "for", "imperfect", "quenching", "or", "degradation", "of", "reporters", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", "-", "D", ")", ",", "individual", "data", "points", "from", "n", "=", "3", "replicates", "from", "independent", "experiments", "are", "plotted", ".", "In", "(", "D", ")", ",", "bars", "represent", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Asp2 and Asp3Cas12l RNP complexes degrade M13 ssDNA in the presence of single-stranded (ss) DNA or dsDNA (including PAM) activators with target sequences complementary to the gRNA spacer. NS activator - non specific activator (ssDNA oligonucleotide or dsDNA duplex) with no sequence complementarity to the spacer of the gRNA.(B) Asp2Cas12l RNP complexes activated with ss or dsDNA degrade quenched fluorescent ssDNA or ssRNA probes. Background-subtracted traces from fluorescent reporter assays with favored ssDNA (5'-CCCCCCCC-3') or ssRNA (5'-CCCCCCCC-3') probes. RFU - relative fluorescence units. (C) Background-subtracted traces of fluorescent reporter cleavage using ssDNA or ssRNA probes. (D) Rates of trans-degradation with ssRNA or ssDNA reporters activated with either ssDNA or dsDNA targets. Collateral ssDNAse activity is about 3-fold higher than the rate of ssRNA degradation. Fluorescence intensities in B-C were normalized against the fluorescence of a reaction containing only the probe to account for imperfect quenching or degradation of reporters. Data information: In (B-D), individual data points from n = 3 replicates from independent experiments are plotted. In (D), bars represent the mean."}
{"words": ["Figure", "1Distribution", "of", "25", "-", "35", "mer", "reads", "mapping", "to", "the", "mouse", "genome", ".", "Proportion", "of", "30", "-", "35", "nt", "genomic", "reads", "matching", "mouse", "tRNA", "sequences", ".", "The", "sequencing", "was", "done", "in", "duplicates", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Perbase", "sequence", "coverage", "of", "30", "-", "35", "nt", "reads", "across", "parental", "tRNA", "sequence", ".", "Anticodon", "positions", "are", "demarcated", "by", "discontinuous", "lines", "(", "Blue", "=", "LIF", "-", "treated", ",", "Grey", "=", "Wnt3", "+", "LIF", "-", "treated", ",", "Red", "=", "RA", "-", "treated", "mESCs", ")", ".", "Perbase", "coverage", "of", "30", "-", "35", "nt", "reads", "across", "the", "468", "individual", "parental", "tRNAs", "plotted", "as", "heatmaps", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Distribution of 25-35 mer reads mapping to the mouse genome. Proportion of 30-35 nt genomic reads matching mouse tRNA sequences. The sequencing was done in duplicates. Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Perbase sequence coverage of 30-35 nt reads across parental tRNA sequence. Anticodon positions are demarcated by discontinuous lines (Blue = LIF-treated, Grey = Wnt3+LIF- treated, Red = RA- treated mESCs). Perbase coverage of 30-35 nt reads across the 468 individual parental tRNAs plotted as heatmaps."}
{"words": ["Figure", "2Northern", "blot", "of", "candidate", "tRNAs", "and", "tsRNAs", "tsGlnCTG", ",", "tsGlyGCC", ",", "tsGluTTC", ",", "tsValCAC", "and", "tsLysTTT", ".", "The", "black", "arrows", "represent", "the", "tRNAs", "and", "the", "red", "arrows", "mark", "the", "tsRNAs", ".", "Northern", "Blot", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", ";", "tsGlyGCC", ",", "tsGlnCTG", ",", "tsGluTTC", ",", "tsLysTTT", ",", "tsValCAC", "at", "various", "timepoints", "of", "RA", "-", "induced", "mESCs", "differentiation", "showing", "dynamic", "expression", "of", "these", "5", "'", "-", "tsRNAs", ".", "Relative", "quantification", "of", "the", "tsRNA", "bands", "from", "northern", "hybridization", "tested", "across", "two", "biological", "replicates", ".", "The", "solid", "lines", "represent", "the", "expression", "of", "tsRNAs", "and", "the", "dashed", "lines", "represent", "tRNAs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Northern blot of candidate tRNAs and tsRNAs tsGlnCTG, tsGlyGCC, tsGluTTC, tsValCAC and tsLysTTT. The black arrows represent the tRNAs and the red arrows mark the tsRNAs.Northern Blot of 5'-tsRNAs; tsGlyGCC, tsGlnCTG, tsGluTTC, tsLysTTT, tsValCAC at various timepoints of RA-induced mESCs differentiation showing dynamic expression of these 5'-tsRNAs. Relative quantification of the tsRNA bands from northern hybridization tested across two biological replicates. The solid lines represent the expression of tsRNAs and the dashed lines represent tRNAs."}
{"words": ["Figure", "3Effect", "of", "ASO", "-", "mediated", "inhibition", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", "on", "alkaline", "phosphatase", "activity", "in", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "expression", "of", "stemness", "markers", "in", "RA", "-", "induced", "differentiation", "mESCs", "blocked", "for", "5", "'", "-", "tsRNA", "function", "with", "ASOs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Volcano", "plot", "of", "the", "transcriptome", "depicting", "the", "overexpressed", "transcripts", "(", "in", "green", ")", "and", "downregulated", "transcripts", "(", "in", "pink", ")", "in", "ASO", "treated", "-", "differentiating", "cells", ".", "QPCR", "validation", "of", "transcripts", "involved", "in", "the", "stem", "cell", "signalling", "pathway", "that", "are", "upregulated", "upon", "5", "'", "-", "tsRNA", "knockdowns", "using", "ASOs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SEM", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Effect of ASO-mediated inhibition of 5'-tsRNAs on alkaline phosphatase activity in RA-treated mESCs. (n = 3), Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Relative expression of stemness markers in RA-induced differentiation mESCs blocked for 5'-tsRNA function with ASOs. (n = 2) Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test.Volcano plot of the transcriptome depicting the overexpressed transcripts (in green) and downregulated transcripts (in pink) in ASO treated-differentiating cells.QPCR validation of transcripts involved in the stem cell signalling pathway that are upregulated upon 5'-tsRNA knockdowns using ASOs. (n =2) Error bars represent SEM, significance was calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "4Scatter", "plot", "showing", "Log2", "fold", "-", "change", "enrichment", "of", "protein", "interactome", "between", "LIF", "-", "and", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "All", "peptides", "identified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "had", "<", "1", "%", "FDR", "(", "Fig", "EV4E", ")", ".", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "was", "conducted", "twice", "(", "R2", "=", "0", ".", "85", "between", "LIF", "duplicates", "and", "R2", "=", "0", ".", "82", "between", "RA", "-", "treated", "mESCs", "duplicates", ")", ".", "Scatter", "plot", "showing", "Log2", "fold", "-", "change", "enrichment", "of", "mRNAs", "associated", "with", "tsGlnCTG", "over", "Scramble", "(", "Scr1", ")", "in", "LIF", "-", "versus", "RA", "-", "treated", "mESCs", ".", "Bar", "plots", "and", "representative", "gene", "lists", "depicting", "association", "of", "tsGlnCTG", "with", "'", "pluripotency", "-", "associated", "'", "(", "D", ")", "and", "'", "differentiation", "-", "responsive", "'", "(", "D", "'", ")", "genes", "in", "LIF", "-", "or", "RA", "-", "treated", "mESCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Scatter plot showing Log2 fold-change enrichment of protein interactome between LIF- and RA-treated mESCs. All peptides identified by LC-MS/MS had < 1% FDR (Fig EV4E). LC-MS/MS was conducted twice (R2 = 0.85 between LIF duplicates and R2 = 0.82 between RA-treated mESCs duplicates).Scatter plot showing Log2 fold-change enrichment of mRNAs associated with tsGlnCTG over Scramble (Scr1) in LIF- versus RA-treated mESCs.Bar plots and representative gene lists depicting association of tsGlnCTG with 'pluripotency-associated' (D) and 'differentiation-responsive' (D') genes in LIF- or RA-treated mESCs."}
{"words": ["Figure", "5In", "vitro", "binding", "analysis", "of", "tsGlnCTG", "to", "Igf2bp1", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "antisense", "oligo", "(", "ASO", ")", "against", "tsGlnCTG", ".", "ASOs", "effectively", "disrupt", "the", "binding", "of", "tsGlnCTG", "to", "Igf2bp1", ".", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Quantification", "of", "the", "Igf2bp1", "bound", "c", "-", "Myc", "mRNA", "between", "LIF", "-", "versus", "RA", "-", "treated", "mESCs", "(", "n", "=", "2", ";", "see", "Fig", ".", "EV5F", "for", "duplicate", "data", ")", ".", "Association", "of", "c", "-", "Myc", "transcript", "in", "different", "translating", "pools", "in", "RA", "treated", "mESCs", "as", "compared", "to", "LIF", "condition", ".", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "by", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "enrichment", "of", "c", "-", "Myc", "mRNA", "in", "translating", "(", "80S", "and", "Polysome", ")", "and", "non", "-", "translating", "(", "mRNPs", ")", "pools", "(", "fractionated", "from", "polysome", "profiling", ")", "between", "ASO", "-", "treated", "and", "Mock", "-", "treated", "RA", "-", "induced", "differentiating", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "2", ")", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Relative", "levels", "of", "c", "-", "Myc", "mRNA", "in", "ASO", "-", "treated", "and", "Mock", "-", "treated", "RA", "-", "induced", "differentiating", "mESCs", "compared", "to", "LIF", "treated", "mESCs", ".", "(", "n", "=", "3", ")", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Epistatic", "analysis", "of", "5", "'", "-", "tsRNAs", "and", "IGF2BP1", "in", "regulating", "Myc", "transcriptional", "reporter", "activity", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "Error", "bars", "represent", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In vitro binding analysis of tsGlnCTG to Igf2bp1 in the presence and absence of antisense oligo (ASO) against tsGlnCTG. ASOs effectively disrupt the binding of tsGlnCTG to Igf2bp1. (n = 2), Error bars represent S.E.M.Quantification of the Igf2bp1 bound c-Myc mRNA between LIF- versus RA-treated mESCs (n = 2; see Fig. EV5F for duplicate data).Association of c-Myc transcript in different translating pools in RA treated mESCs as compared to LIF condition. (n = 2), Error bars represent SD, significance was calculated by one-tailed unpaired t-test.Relative enrichment of c-Myc mRNA in translating (80S and Polysome) and non-translating (mRNPs) pools (fractionated from polysome profiling) between ASO-treated and Mock-treated RA-induced differentiating mESCs. (n =2) Error bars represent SD, significance was calculated using one-tailed unpaired t-test.Relative levels of c-Myc mRNA in ASO-treated and Mock-treated RA-induced differentiating mESCs compared to LIF treated mESCs. (n = 3) Error bars represent SD, significance was calculated using one-tailed unpaired t-test.Epistatic analysis of 5'-tsRNAs and IGF2BP1 in regulating Myc transcriptional reporter activity. (n = 3), Error bars represent SD, significance was calculated using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "Immune", "response", "and", "physiology", "of", "monkeys", "immunized", "with", "recombinant", "adenovirus", "vaccine", ".", "Time", "course", "of", "antibody", "response", ".", "Serum", "samples", "were", "diluted", "40", "-", "fold", "prior", "to", "ELISA", "analysis", ".", "Animals", "in", "the", "high", "-", "dose", "and", "low", "-", "dose", "group", "were", "immunized", "with", "1", "×", "109", "and", "1", "×", "108", "pfu", "virus", "each", "time", ",", "respectively", ".", "Arrows", "indicate", "the", "time", "point", "for", "immunization", ".", "Immune", "response", "and", "physiology", "of", "monkeys", "immunized", "with", "recombinant", "adenovirus", "vaccine", ".", "Determination", "of", "virus", "neutralization", "antibody", "titer", "using", "96", "-", "well", "microneutralization", "assay", ".", "An", "arbitrate", "titer", "of", "2", "was", "assigned", "to", "animals", "in", "the", "placebo", "and", "control", "group", "since", "there", "was", "no", "detectable", "neutralization", "activity", "in", "these", "samples", ".", "Statistical", "significance", "between", "different", "data", "sets", "was", "calculated", "using", "t", "-", "test", ".", "Immune", "response", "and", "physiology", "of", "monkeys", "immunized", "with", "recombinant", "adenovirus", "vaccine", ".", "ELISPOT", "analysis", "of", "IFN", "-", "γ", "response", "in", "PBMC", "samples", ".", "Pool", "A", "and", "B", "contain", "peptides", "corresponding", "to", "S1", "-", "orf8", "fusion", "and", "N", ",", "respectively", ".", "Data", "represent", "two", "animals", "from", "each", "group", ".", "Immune", "response", "and", "physiology", "of", "monkeys", "immunized", "with", "recombinant", "adenovirus", "vaccine", ".", "Average", "food", "consumption", "after", "live", "virus", "challenge", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.Immune response and physiology of monkeys immunized with recombinant adenovirus vaccine. Time course of antibody response. Serum samples were diluted 40-fold prior to ELISA analysis. Animals in the high-dose and low-dose group were immunized with 1×109 and 1×108 pfu virus each time, respectively. Arrows indicate the time point for immunization.Immune response and physiology of monkeys immunized with recombinant adenovirus vaccine. Determination of virus neutralization antibody titer using 96-well microneutralization assay. An arbitrate titer of 2 was assigned to animals in the placebo and control group since there was no detectable neutralization activity in these samples. Statistical significance between different data sets was calculated using t-test.Immune response and physiology of monkeys immunized with recombinant adenovirus vaccine. ELISPOT analysis of IFN-γ response in PBMC samples. Pool A and B contain peptides corresponding to S1-orf8 fusion and N, respectively. Data represent two animals from each group.Immune response and physiology of monkeys immunized with recombinant adenovirus vaccine. Average food consumption after live virus challenge."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "Histology", "and", "IHC", "study", "on", "postmortem", "lung", "sections", "from", "rhesus", "macaques", "infected", "with", "live", "SARS", "-", "CoV", ".", "All", "animals", "were", "euthanized", "7", "days", "after", "viral", "challenge", ",", "and", "anti", "-", "SARS", "-", "CoV", "monoclonal", "antibody", "was", "used", "to", "identify", "SARS", "antigens", "in", "the", "tissue", ".", "Representative", "data", "from", "lung", "sections", "were", "shown", ".", "Histology", "samples", "include", ":", "a", ".", "Control", "group", ".", "b", ".", "High", "-", "dose", "group", ".", "c", ".", "Placebo", "group", ".", "The", "arrowheads", "point", "to", "alveoli", "space", "filled", "with", "proteinaceous", "fluid", ".", "IHC", "samples", "include", ":", "d", ".", "Control", "group", ".", "e", ".", "High", "-", "dose", "group", ".", "f", ".", "Placebo", "group", ".", "Arrows", "point", "to", "cells", "that", "were", "positive", "for", "SARS", "antigen", "expression", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2. Histology and IHC study on postmortem lung sections from rhesus macaques infected with live SARS-CoV. All animals were euthanized 7 days after viral challenge, and anti-SARS-CoV monoclonal antibody was used to identify SARS antigens in the tissue. Representative data from lung sections were shown. Histology samples include: a. Control group. b. High-dose group. c. Placebo group. The arrowheads point to alveoli space filled with proteinaceous fluid. IHC samples include: d. Control group. e. High-dose group. f. Placebo group. Arrows point to cells that were positive for SARS antigen expression. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "the", "neuronal", "ATP", "/", "ATP", "+", "ADP", "ratio", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "glutamate", "stimulation", "for", "5", "minutes", ",", "on", "glutamate", "stimulation", "with", "anisomycin", "(", "25μM", ")", "and", "on", "glutamate", "stimulation", "with", "cycloheximide", "(", "350μM", ")", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "basal", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "5", "independent", "platings", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "neuronal", "ATP", "/", "ATP", "+", "ADP", "ratio", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "glutamate", "stimulation", "for", "5", "minutes", ",", "on", "glutamate", "stimulation", "with", "MPEP", ",", "on", "glutamate", "stimulation", "with", "CNQX", "+", "D", "-", "AP5", "and", "on", "glutamate", "stimulation", "with", "CNQX", "+", "D", "-", "AP5", "+", "anisomycin", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "basal", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", ".", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "4", "-", "5", "independent", "platings", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "(", "D", ")", "Representative", "current", "-", "clamp", "and", "voltage", "-", "clamp", "traces", "showing", "a", "single", "neuron", "firing", "spontaneous", "bursts", "of", "action", "potentials", ".", "The", "traces", "on", "the", "right", "shows", "a", "single", "representative", "burst", "at", "a", "higher", "temporal", "resolution", ".", "(", "E", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "burst", "frequency", "and", "burst", "duration", "both", "in", "the", "voltage", "and", "current", "-", "clamp", "mode", ".", "n", "=", "16", "neurons", "from", "≥", "3", "independent", "platings", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "(", "F", ")", "Representative", "voltage", "-", "clamp", "traces", "of", "miniature", "EPSCs", "recorded", "(", "Vhold", "=", "-", "70mV", ")", "from", "a", "neuron", "in", "presence", "of", "TTX", ".", "(", "G", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "baseline", "mEPSC", "frequency", "and", "amplitude", "in", "the", "current", "-", "clamp", "mode", ".", "N", "=", "11", "neurons", "from", "≥", "3", "independent", "platings", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "(", "I", ")", "Immunoblots", "depicting", "levels", "of", "PSD", "95", ",", "GFAP", ",", "Synapsin", "1", "and", "tubulin", "in", "the", "whole", "cortical", "lysate", "and", "the", "synaptoneurosome", "preparations", ".", "Quantification", "representing", "the", "average", "fold", "enrichments", "of", "PSD", "95", ",", "Synapsin", "1", "and", "GFAP", "in", "the", "synaptoneurosome", "preparations", "compared", "to", "the", "whole", "cortical", "lysate", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "Data", "points", "for", "all", "the", "proteins", "were", "normalized", "to", "their", "respective", "whole", "lysate", "values", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "≥", "7", "animals", "for", "each", "group", ".", "One", "-", "sample", "t", "-", "test", ".", "(", "J", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "synaptic", "ATP", "level", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", ",", "on", "DHPG", "treatment", "with", "MPEP", ",", "on", "DHPG", "treatment", "with", "anisomycin", "and", "on", "DHPG", "treatment", "with", "cycloheximide", "(", "350μM", ")", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "basal", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "8", "animals", ".", "(", "K", ")", "Bar", "graph", "representing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "the", "synaptic", "ATP", "level", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", "and", "on", "NMDA", "treatment", "with", "D", "-", "AP5", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "with", "scattered", "data", "points", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "basal", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", ".", "n", "=", "8", "independent", "platings", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Bar graph representing the normalized average value of the neuronal ATP/ATP+ADP ratio on the basal condition, on glutamate stimulation for 5 minutes, on glutamate stimulation with anisomycin (25μM) and on glutamate stimulation with cycloheximide (350μM). Data presented as mean ± SEM with scattered data points. Values in all other groups were normalized to the basal group for the corresponding experiment. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, n=5 independent platings. One-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison test.(C) Bar graph representing the normalized average value of neuronal ATP/ATP+ADP ratio on the basal condition, on glutamate stimulation for 5 minutes, on glutamate stimulation with MPEP, on glutamate stimulation with CNQX + D-AP5 and on glutamate stimulation with CNQX + D-AP5 + anisomycin. Data presented as mean ± SEM with scattered data points. Values in all other groups were normalized to the basal group for the corresponding experiment.. *p<0.05, ***p<0.001, n=4-5 independent platings. One-way ANOVA followed by Bonferroni's multiple comparison test.(D) Representative current-clamp and voltage-clamp traces showing a single neuron firing spontaneous bursts of action potentials. The traces on the right shows a single representative burst at a higher temporal resolution.(E) Bar graph representing the burst frequency and burst duration both in the voltage and current-clamp mode. n=16 neurons from ≥3 independent platings. Data presented as mean ± SEM with scattered data points.(F) Representative voltage-clamp traces of miniature EPSCs recorded (Vhold= -70mV) from a neuron in presence of TTX.(G) Bar graph representing the baseline mEPSC frequency and amplitude in the current-clamp mode. N=11 neurons from ≥3 independent platings. Data presented as mean ± SEM with scattered data points.(I) Immunoblots depicting levels of PSD 95, GFAP, Synapsin 1 and tubulin in the whole cortical lysate and the synaptoneurosome preparations. Quantification representing the average fold enrichments of PSD 95, Synapsin 1 and GFAP in the synaptoneurosome preparations compared to the whole cortical lysate. Data presented as mean ± SEM with scattered data points. Data points for all the proteins were normalized to their respective whole lysate values. **p<0.05, **p<0.01, n ≥ 7 animals for each group. One-sample t-test.(J) Bar graph representing the normalized average value of synaptic ATP level on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes, on DHPG treatment with MPEP, on DHPG treatment with anisomycin and on DHPG treatment with cycloheximide (350μM). Data presented as mean ± SEM with scattered data points. Values in all other groups were normalized to the basal group for the corresponding experiment. *p<0.05, n=8 animals.(K) Bar graph representing the normalized average value of the synaptic ATP level on the basal condition, on NMDA treatment for 5 minutes and on NMDA treatment with D-AP5. Data presented as mean +/- SEM with scattered data points. Values in all other groups were normalized to the basal group for the corresponding experiment. n=8 independent platings."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Representative", "neurons", "showing", "changes", "in", "the", "PercevalHR", "fluorescence", "ratio", "(", "~", "ATP", "/", "ADP", "ratio", ")", "in", "somatic", "compartments", "on", "the", "bath", "application", "of", "DHPG", "and", "NMDA", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "neurons", "showing", "changes", "in", "the", "PercevalHR", "fluorescence", "ratio", "(", "~", "ATP", "/", "ADP", "ratio", ")", "in", "dendritic", "compartments", "on", "the", "bath", "application", "of", "DHPG", "and", "NMDA", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "D", ")", "Average", "traces", "depicting", "the", "time", "course", "of", "the", "normalized", "somatic", "ATP", "/", "ADP", "ratio", "on", "the", "basal", "conditions", ",", "on", "DHPG", "treatment", ",", "and", "on", "NMDA", "treatment", ".", "The", "curved", "arrow", "on", "the", "top", "indicates", "the", "time", "when", "the", "agonists", "were", "added", "and", "kept", "in", "the", "imaging", "media", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "n", "=", "5", "-", "6", "cells", "from", "≥", "3", "independent", "platings", ".", "(", "E", ")", "Average", "traces", "depicting", "the", "time", "course", "of", "normalized", "dendritic", "ATP", "/", "ADP", "ratio", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "the", "basal", "condition", "in", "the", "presence", "of", "anisomycin", ",", "on", "DHPG", "treatment", ",", "on", "NMDA", "treatment", ",", "on", "DHPG", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "anisomycin", "and", "on", "NMDA", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "anisomycin", ".", "The", "curved", "arrow", "on", "the", "top", "indicates", "the", "time", "when", "the", "agonists", "were", "added", "and", "kept", "in", "the", "imaging", "media", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "n", "=", "6", "-", "9", "cells", "from", "≥", "3", "independent", "platings", ".", "(", "G", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "average", "normalized", "synaptic", "ATP", "level", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "treatment", "until", "5", "minutes", "of", "recovery", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "comparison", "with", "0", "minute", ".", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "#", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "comparison", "between", "DHPG", "+", "anisomycin", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "n", "≥", "5", "animals", "per", "group", ".", "(", "H", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "average", "normalized", "synaptic", "ATP", "level", "at", "various", "time", "points", "after", "NMDA", "treatment", "until", "5", "minutes", "after", "recovery", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "for", "comparison", "with", "0", "minutes", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "n", "≥", "4", "animals", "per", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Representative neurons showing changes in the PercevalHR fluorescence ratio (~ATP/ADP ratio) in somatic compartments on the bath application of DHPG and NMDA. Scale bar 10μm. (C) Representative neurons showing changes in the PercevalHR fluorescence ratio (~ATP/ADP ratio) in dendritic compartments on the bath application of DHPG and NMDA. Scale bar 10μm.(D) Average traces depicting the time course of the normalized somatic ATP/ADP ratio on the basal conditions, on DHPG treatment, and on NMDA treatment. The curved arrow on the top indicates the time when the agonists were added and kept in the imaging media. Data presented as mean +/- SEM. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. n= 5-6 cells from ≥3 independent platings.(E) Average traces depicting the time course of normalized dendritic ATP/ADP ratio on the basal condition, on the basal condition in the presence of anisomycin, on DHPG treatment, on NMDA treatment, on DHPG treatment in the presence of anisomycin and on NMDA treatment in the presence of anisomycin. The curved arrow on the top indicates the time when the agonists were added and kept in the imaging media. Data presented as mean +/- SEM. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. n= 6-9 cells from ≥3 independent platings.(G) Line graph showing the average normalized synaptic ATP level at various time points after DHPG treatment until 5 minutes of recovery in the presence or absence of anisomycin. Data presented as mean +/- SEM, *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 for comparison with 0 minute. ##p<0.01 and ####p<0.0001 for comparison between DHPG + anisomycin. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. n≥ 5 animals per group.(H) Line graph showing the average normalized synaptic ATP level at various time points after NMDA treatment until 5 minutes after recovery in the presence or absence of anisomycin. Data presented as mean +/- SEM, **p<0.01 for comparison with 0 minutes. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. n≥ 4 animals per group."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Representative", "images", "showing", "newly", "synthesized", "proteins", "on", "the", "basal", "condition", "visualized", "through", "FUNCAT", "metabolic", "labeling", "(", "pseudo", "-", "colored", ")", "in", "cortical", "neurons", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "showing", "newly", "synthesized", "proteins", "visualized", "through", "FUNCAT", "metabolic", "labeling", "(", "pseudo", "-", "colored", ")", "in", "cortical", "neurons", "at", "various", "time", "points", "following", "DHPG", "and", "NMDA", "treatment", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "D", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "change", "in", "the", "average", "normalized", "FUNCAT", "intensity", "representing", "the", "quantity", "of", "newly", "synthesized", "proteins", "at", "various", "time", "points", "following", "DHPG", "and", "NMDA", "treatments", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "n", "=", "21", "-", "54", "neurons", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "showing", "phospho", "-", "eEF2", "immunolabeling", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "in", "low", "-", "density", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "and", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "F", ")", "Box", "plot", "showing", "phospho", "-", "eEF2", "normalized", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "and", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "31", "-", "49", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunoblots", "describing", "changes", "in", "the", "phospho", "-", "eEF2", "and", "total", "-", "eEF2", "levels", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "and", "NMDA", "treatment", "in", "cortical", "synaptoneurosomes", ".", "Note", "in", "each", "case", "phospho", "and", "total", "eEF2", "levels", "were", "normalized", "individually", "to", "their", "respective", "tubulin", "levels", "for", "calculating", "the", "phospho", "/", "total", "undefined", "ratio", ".", "(", "H", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "average", "value", "of", "the", "synaptic", "phospho", "/", "total", "ratio", "of", "eEF2", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "and", "NMDA", "treatment", "until", "5", "minutes", "of", "recovery", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "≥", "5", "animals", "per", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Representative images showing newly synthesized proteins on the basal condition visualized through FUNCAT metabolic labeling (pseudo-colored) in cortical neurons. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(C) Representative images showing newly synthesized proteins visualized through FUNCAT metabolic labeling (pseudo-colored) in cortical neurons at various time points following DHPG and NMDA treatment. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(D) Line graph showing the change in the average normalized FUNCAT intensity representing the quantity of newly synthesized proteins at various time points following DHPG and NMDA treatments. Data presented as mean +/- SEM. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. ***p<0.001 n= 21-54 neurons per group from 3 independent platings.(E) Representative images showing phospho-eEF2 immunolabeling (Pseudo-colored) in low-density cortical neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes and on NMDA treatment for 5 minutes. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(F) Box plot showing phospho-eEF2 normalized intensity distribution across multiple neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes and on NMDA treatment for 5 minutes. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, **p<0.01, n=31-49 cells per group from 3 independent platings.(G) Representative immunoblots describing changes in the phospho-eEF2 and total-eEF2 levels at various time points after DHPG and NMDA treatment in cortical synaptoneurosomes. Note in each case phospho and total eEF2 levels were normalized individually to their respective tubulin levels for calculating the phospho/total undefined ratio.(H) Line graph showing the average value of the synaptic phospho/total ratio of eEF2 at various time points after DHPG and NMDA treatment until 5 minutes of recovery. Data presented as mean +/- SEM, **p<0.01. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. ***p<0.001, ****p<0.0001, n≥ 5 animals per group."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "showing", "phospho", "-", "AMPK", "immunolabeling", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "in", "low", "-", "density", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "and", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "B", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "normalized", "phospho", "-", "AMPK", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "and", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "30", "-", "46", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunoblots", "describing", "changes", "in", "the", "phospho", "-", "AMPK", "and", "total", "-", "AMPK", "levels", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "treatment", "in", "cortical", "synaptoneurosomes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "Note", "in", "each", "case", "phospho", "and", "total", "AMPK", "levels", "were", "normalized", "individually", "to", "their", "respective", "tubulin", "levels", "before", "calculating", "the", "phospho", "/", "total", "ratio", "of", "AMPK", ".", "(", "D", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "the", "synaptic", "phospho", "/", "total", "ratio", "of", "AMPK", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "treatment", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "5", "animals", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunoblots", "depicting", "the", "changes", "in", "the", "α", "-", "SNAP", "protein", "levels", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "treatment", "in", "cortical", "synaptoneurosomes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "(", "F", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "normalized", "average", "value", "of", "the", "synaptic", "α", "-", "SNAP", "protein", "levels", "at", "various", "time", "points", "after", "DHPG", "treatment", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "anisomycin", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "≥", "4", "animals", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "α", "-", "SNAP", "(", "cyan", ")", "and", "AMPK", "(", "magenta", ")", "immunolabeling", "in", "low", "-", "density", "cortical", "neurons", ".", "Merge", "shows", "the", "colocalization", "of", "the", "two", "channels", "both", "on", "the", "basal", "condition", "and", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "Zoomed", "in", "representative", "images", "of", "dendrites", "showing", "the", "merge", "of", "both", "channels", "on", "the", "basal", "and", "DHPG", "treated", "conditions", ".", "Scale", "bar", "5μm", ".", "(", "H", ")", "Box", "plot", "depicting", "the", "quantification", "of", "co", "-", "localization", "through", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "between", "α", "-", "SNAP", "and", "AMPK", "in", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", "and", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "≥", "35", "cells", "per", "group", "from", "4", "independent", "platings", ".", "Unpaired", "-", "sample", "t", "-", "test", ".", "(", "I", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "phospho", "-", "AMPK", "immunolabeling", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "in", "low", "-", "density", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", "and", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "in", "the", "presence", "of", "scrambled", "siRNA", "and", "in", "the", "presence", "of", "α", "-", "SNAP", "siRNA", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "J", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "normalized", "phospho", "-", "AMPK", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", "in", "the", "presence", "of", "scrambled", "siRNA", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "in", "the", "presence", "of", "scrambled", "siRNA", ",", "on", "the", "basal", "condition", "in", "the", "presence", "of", "α", "-", "SNAP", "siRNA", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", "in", "the", "presence", "of", "α", "-", "SNAP", "siRNA", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "scrambled", "siRNA", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "29", "-", "35", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images showing phospho-AMPK immunolabeling (Pseudo-colored) in low-density cortical neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes and on NMDA treatment for 5 minutes. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(B) Box plot showing the normalized phospho-AMPK intensity distribution across multiple neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes and on NMDA treatment for 5 minutes. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, **p<0.01, n=30-46 cells per group from 3 independent platings.(C) Representative immunoblots describing changes in the phospho-AMPK and total-AMPK levels at various time points after DHPG treatment in cortical synaptoneurosomes in the presence or absence of anisomycin. Note in each case phospho and total AMPK levels were normalized individually to their respective tubulin levels before calculating the phospho/total ratio of AMPK.(D) Line graph showing the normalized average value of the synaptic phospho/total ratio of AMPK at various time points after DHPG treatment in the presence or absence of anisomycin. Data presented as mean +/- SEM. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, n= 5 animals per group.(E) Representative immunoblots depicting the changes in the α-SNAP protein levels at various time points after DHPG treatment in cortical synaptoneurosomes in the presence or absence of anisomycin.(F) Line graph showing the normalized average value of the synaptic α-SNAP protein levels at various time points after DHPG treatment in the presence or absence of anisomycin. Data presented as mean +/- SEM. *p<0.05. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. **p<0.01, n≥ 4 animals per group.(G) Representative images showing the α-SNAP (cyan) and AMPK (magenta) immunolabeling in low-density cortical neurons. Merge shows the colocalization of the two channels both on the basal condition and on DHPG treatment for 5 minutes. Scale bar 10μm. Zoomed in representative images of dendrites showing the merge of both channels on the basal and DHPG treated conditions. Scale bar 5μm.(H) Box plot depicting the quantification of co-localization through Pearson's correlation coefficient between α-SNAP and AMPK in cortical neurons on the basal condition and on DHPG treatment for 5 minutes. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.01, n≥35 cells per group from 4 independent platings. Unpaired-sample t-test.(I) Representative images showing the phospho-AMPK immunolabeling (Pseudo-colored) in low-density cortical neurons on the basal condition and on DHPG treatment for 5 minutes in the presence of scrambled siRNA and in the presence of α-SNAP siRNA. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(J) Box plot showing the normalized phospho-AMPK intensity distribution across multiple neurons on the basal condition in the presence of scrambled siRNA, on DHPG treatment for 5 minutes in the presence of scrambled siRNA, on the basal condition in the presence of α-SNAP siRNA, on DHPG treatment for 5 minutes in the presence of α-SNAP siRNA. Data points in all groups were normalized to the average of the scrambled siRNA basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, n=29-35 cells per group from 3 independent platings."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "describing", "changes", "in", "the", "phospho", "-", "AMPK", "and", "total", "-", "AMPK", "levels", "at", "various", "time", "points", "after", "NMDA", "treatment", "in", "cortical", "synaptoneurosomes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "extracellular", "Ca2", "+", ".", "Note", "in", "each", "case", "phospho", "and", "total", "AMPK", "levels", "were", "normalized", "individually", "to", "their", "respective", "tubulin", "levels", "before", "calculating", "the", "phospho", "/", "total", "AMPK", "ratio", ".", "(", "B", ")", "Line", "graph", "showing", "the", "normalized", "average", "value", "for", "the", "synaptic", "phospho", "/", "total", "ratio", "of", "AMPK", "at", "various", "time", "points", "after", "NMDA", "treatment", "until", "5", "minutes", "of", "recovery", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "extracellular", "Ca2", "+", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "0", "min", "group", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "6", "animals", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "depicting", "intracellular", "Ca2", "+", "levels", "through", "Fluo8", "fluorescence", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "of", "a", "cortical", "neuron", "plated", "at", "low", "-", "density", "before", "stimulation", ",", "15", "sec", "(", "immediate", ")", "after", "NMDA", "treatment", ",", "300", "sec", "(", "delayed", ")", "after", "NMDA", "treatment", "and", "after", "ionomycin", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "10mM", "Ca2", "+", ".", "Scale", "bar", "20μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "time", "trace", "showing", "the", "normalized", "change", "in", "Fluo8", "fluorescence", "on", "NMDA", "treatment", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "extracellular", "Ca2", "+", "and", "D", "-", "AP5", ".", "Values", "in", "all", "other", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "unsimulated", "condition", "for", "the", "corresponding", "experiment", "and", "all", "the", "data", "points", "are", "represented", "as", "a", "fraction", "of", "the", "initial", "time", "point", ".", "Ionomycin", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "10mM", "Ca2", "+", "was", "used", "to", "calculate", "fluorescence", "maximum", "for", "a", "particular", "cell", ".", "(", "E", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "distribution", "of", "ΔF", "/", "F0", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "NMDA", "treatment", "in", "the", "presence", "Ca2", "+", ",", "on", "NMDA", "treatment", "in", "the", "absence", "of", "Ca2", "+", ",", "on", "NMDA", "treatment", "with", "D", "-", "AP5", "and", "on", "NMDA", "treatment", "along", "with", "MK", "-", "801", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "≥", "30", "neurons", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative immunoblots describing changes in the phospho-AMPK and total-AMPK levels at various time points after NMDA treatment in cortical synaptoneurosomes in the presence or absence of extracellular Ca2+. Note in each case phospho and total AMPK levels were normalized individually to their respective tubulin levels before calculating the phospho/total AMPK ratio.(B) Line graph showing the normalized average value for the synaptic phospho/total ratio of AMPK at various time points after NMDA treatment until 5 minutes of recovery in the presence or absence of extracellular Ca2+. Data presented as mean +/- SEM. Values in all other groups were normalized to the 0 min group for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. **p<0.01, ****p<0.0001, n= 6 animals per group.(C) Representative images depicting intracellular Ca2+ levels through Fluo8 fluorescence (Pseudo-colored) of a cortical neuron plated at low-density before stimulation, 15 sec (immediate) after NMDA treatment, 300 sec (delayed) after NMDA treatment and after ionomycin treatment in the presence of 10mM Ca2+. Scale bar 20μm.(D) Representative time trace showing the normalized change in Fluo8 fluorescence on NMDA treatment in the presence or absence of extracellular Ca2+ and D-AP5. Values in all other groups were normalized to the unsimulated condition for the corresponding experiment and all the data points are represented as a fraction of the initial time point. Ionomycin treatment in the presence of 10mM Ca2+ was used to calculate fluorescence maximum for a particular cell.(E) Box plot showing the distribution of ΔF/F0 across multiple neurons on the basal condition, on NMDA treatment in the presence Ca2+, on NMDA treatment in the absence of Ca2+, on NMDA treatment with D-AP5 and on NMDA treatment along with MK-801. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. ****p<0.0001, n≥30 neurons per group from 3 independent platings."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "phospho", "-", "eEF2", "immunolabeling", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "and", "newly", "synthesized", "proteins", "as", "FUNCAT", "signal", "(", "pseudo", "-", "colored", ")", "in", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", "and", "on", "DHPG", "(", "50μM", ")", "treatment", "for", "5", "minutes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "AICAR", "(", "1mM", ")", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "C", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "normalized", "phospho", "-", "eEF2", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", ",", "on", "AICAR", "treatment", "and", "on", "DHPG", "treatment", "with", "AICAR", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "17", "-", "46", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "D", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "FUNCAT", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "DHPG", "treatment", "for", "5", "minutes", ",", "on", "AICAR", "treatment", "and", "on", "DHPG", "treatment", "with", "AICAR", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "18", "-", "57", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "phospho", "-", "eEF2", "immunolabeling", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "and", "newly", "synthesized", "proteins", "as", "FUNCAT", "signal", "(", "Pseudo", "-", "colored", ")", "in", "cortical", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", "and", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Compound", "C", ".", "MAP2B", "immunolabeling", "was", "used", "for", "identifying", "neurons", "and", "intensity", "was", "used", "for", "normalization", ".", "Scale", "bar", "10μm", ".", "(", "F", ")", "Box", "plot", "showing", "phospho", "-", "eEF2", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "basal", "condition", "(", "Vehicle", "control", ")", ",", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ",", "on", "Compound", "C", "treatment", "and", "on", "NMDA", "treatment", "with", "Compound", "C", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "21", "-", "36", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", ".", "(", "G", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "FUNCAT", "intensity", "distribution", "across", "multiple", "neurons", "on", "the", "basal", "condition", ",", "on", "NMDA", "treatment", "for", "5", "minutes", ",", "on", "Compound", "C", "treatment", "and", "on", "NMDA", "treatment", "with", "Compound", "C", ".", "Data", "points", "in", "all", "groups", "were", "normalized", "to", "the", "average", "of", "the", "basal", "group", ".", "The", "box", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", "with", "the", "middlemost", "line", "representing", "the", "median", "of", "the", "dataset", ".", "Whiskers", "range", "from", "minimum", "to", "maximum", "data", "point", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "24", "-", "52", "cells", "per", "group", "from", "3", "independent", "platings", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Representative images showing the phospho-eEF2 immunolabeling (Pseudo-colored) and newly synthesized proteins as FUNCAT signal (pseudo-colored) in cortical neurons on the basal condition and on DHPG (50μM) treatment for 5 minutes in the presence or absence of AICAR (1mM). MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(C) Box plot showing the normalized phospho-eEF2 intensity distribution across multiple neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes, on AICAR treatment and on DHPG treatment with AICAR. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, n=17-46 cells per group from 3 independent platings.(D) Box plot showing the FUNCAT intensity distribution across multiple neurons on the basal condition, on DHPG treatment for 5 minutes, on AICAR treatment and on DHPG treatment with AICAR. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. ****p<0.0001, n=18-57 cells per group from 3 independent platings.(E) Representative images showing the phospho-eEF2 immunolabeling (Pseudo-colored) and newly synthesized proteins as FUNCAT signal (Pseudo-colored) in cortical neurons on the basal condition and on NMDA treatment for 5 minutes in the presence or absence of Compound C. MAP2B immunolabeling was used for identifying neurons and intensity was used for normalization. Scale bar 10μm.(F) Box plot showing phospho-eEF2 intensity distribution across multiple neurons on basal condition (Vehicle control), on NMDA treatment for 5 minutes, on Compound C treatment and on NMDA treatment with Compound C. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, **p<0.01, n=21-36 cells per group from 3 independent platings.(G) Box plot showing the FUNCAT intensity distribution across multiple neurons on the basal condition, on NMDA treatment for 5 minutes, on Compound C treatment and on NMDA treatment with Compound C. Data points in all groups were normalized to the average of the basal group. The box extends from 25th to 75th percentile with the middlemost line representing the median of the dataset. Whiskers range from minimum to maximum data point. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, n=24-52 cells per group from 3 independent platings."}
{"words": ["Figure", "1Freezing", "phenotype", "(", "A", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1", "(", "#", "10", ")", "plants", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", "for", "non", "-", "acclimation", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", "for", "cold", "acclimation", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "survival", "rate", "(", "B", ")", ",", "and", "ion", "leakage", "(", "C", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1", "(", "#", "10", ")", "plants", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", "for", "non", "-", "acclimation", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", "for", "cold", "acclimation", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Expression", "of", "CBFs", "(", "D", ")", "in", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1", "(", "#", "10", ")", "plants", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "placed", "at", "4", "°", "C", "for", "3", "h", "(", "D", ")", "and", "total", "RNA", "was", "extracted", "and", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "Relative", "transcript", "levels", "in", "untreated", "Col", "-", "0", "plants", "were", "set", "to", "1", ".", "Expression", "of", "CBFs", "targets", "(", "E", ")", "in", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1", "(", "#", "10", ")", "plants", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "placed", "at", "4", "°", "C", "for", "24", "h", "(", "E", ")", ",", "and", "total", "RNA", "was", "extracted", "and", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "Relative", "transcript", "levels", "in", "untreated", "Col", "-", "0", "plants", "were", "set", "to", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Freezing phenotype (A) of Col-0, atann1, and atann1 AtANN1 (#10) plants. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA for non-acclimation, −5°C, 30 min; CA for cold acclimation, −8°C, 40 min). Representative pictures are shown in (A).survival rate (B), and ion leakage (C) of Col-0, atann1, and atann1 AtANN1 (#10) plants. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA for non-acclimation, −5°C, 30 min; CA for cold acclimation, −8°C, 40 min).Expression of CBFs (D) in Col-0, atann1, and atann1 AtANN1 (#10) plants. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were placed at 4°C for 3 h (D) and total RNA was extracted and subjected to qRT-PCR analysis. Relative transcript levels in untreated Col-0 plants were set to 1.Expression of CBFs targets (E) in Col-0, atann1, and atann1 AtANN1 (#10) plants. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were placed at 4°C for 24 h (E), and total RNA was extracted and subjected to qRT-PCR analysis. Relative transcript levels in untreated Col-0 plants were set to 1."}
{"words": ["Figure", "2A", "Time", "-", "course", "analysis", "of", "cytosolic", "free", "calcium", "concentration", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", ")", "dynamics", "in", "10", "-", "d", "-", "old", "wild", "type", "(", "Col", "-", "0", ")", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1", "complementation", "line", "(", "#", "10", ")", "after", "treatment", "with", "ice", "-", "cold", "water", "or", "ice", "-", "cold", "water", "containing", "10", "mM", "LaCl3", "(", "arrow", "shows", "the", "time", "point", "of", "treatment", ")", ".", "Luminescence", "was", "recorded", "at", "1", "-", "s", "intervals", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "cold", "-", "induced", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "changes", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Peak", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "indicates", "the", "highest", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "after", "treatment", ".", "C", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "showing", "that", "OST1", "interacts", "with", "AtANN1", "in", "vitro", ".", "Purified", "recombinant", "GST", "-", "OST1", ",", "GST", "-", "OST1G33R", ",", "or", "GST", "proteins", "from", "E", ".", "coli", "were", "immunoprecipitated", "with", "GST", "beads", "and", "then", "incubated", "with", "MBP", "-", "His", "-", "AtANN1", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "detected", "with", "anti", "-", "GST", "and", "anti", "-", "His", "antibodies", ".", "D", "Interaction", "of", "OST1", "and", "AtANN1", "detected", "by", "bimolecular", "fluorescence", "complementation", "(", "BiFC", ")", "assays", ".", "The", "construct", "combinations", "were", "co", "-", "transformed", "into", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "and", "expressed", "for", "2", "d", ".", "The", "signal", "was", "detected", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "was", "scanned", "using", "the", "ImageJ", "plot", "profile", "tool", ".", "The", "y", "-", "axes", "indicate", "relative", "pixel", "intensity", ".", "E", ",", "F", "Interaction", "of", "OST1", "and", "AtANN1", "detected", "by", "Co", "-", "IP", "assays", "in", "Arabidopsis", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "OST1", "-", "Myc", "overexpressing", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "placed", "at", "4", "°", "C", "for", "0", ",", "0", ".", "5", ",", "2", "h", ",", "and", "total", "proteins", "were", "extracted", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Myc", "agarose", "beads", ".", "The", "wild", "type", "(", "Col", "-", "0", ")", "treated", "with", "4", "°", "C", "for", "2", "h", "was", "used", "as", "control", ".", "The", "OST1", "-", "Myc", "protein", "was", "detected", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", "and", "the", "AtANN1", "protein", "was", "detected", "with", "anti", "-", "AtANN1", "antibody", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "E", ")", "and", "relative", "protein", "level", "in", "(", "F", ")", ".", "G", "Co", "-", "IP", "assay", "showing", "the", "interaction", "between", "OST1", "and", "AtANN1", "in", "vivo", ".", "The", "construct", "combinations", "were", "expressed", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "Total", "proteins", "were", "extracted", "after", "the", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "treated", "with", "4oC", "or", "22oC", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Myc", "agarose", "beads", ".", "The", "proteins", "were", "detected", "with", "anti", "-", "Myc", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Time-course analysis of cytosolic free calcium concentration ([Ca2+]cyt) dynamics in 10-d-old wild type (Col-0), atann1, and atann1 AtANN1 complementation line (#10) after treatment with ice-cold water or ice-cold water containing 10 mM LaCl3 (arrow shows the time point of treatment). Luminescence was recorded at 1-s intervals. B Quantification of the cold-induced [Ca2+]cyt changes shown in (A). Peak [Ca2+]cyt indicates the highest [Ca2+]cyt after treatment. C GST pull-down assay showing that OST1 interacts with AtANN1 in vitro. Purified recombinant GST-OST1, GST-OST1G33R, or GST proteins from E. coli were immunoprecipitated with GST beads and then incubated with MBP-His-AtANN1. Precipitated proteins were detected with anti-GST and anti-His antibodies.D Interaction of OST1 and AtANN1 detected by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays. The construct combinations were co-transformed into N. benthamiana leaves and expressed for 2 d. The signal was detected by confocal microscopy. Scale bar, 25 µm. The fluorescence intensity was scanned using the ImageJ plot profile tool. The y-axes indicate relative pixel intensity.E,F Interaction of OST1 and AtANN1 detected by Co-IP assays in Arabidopsis. Twelve-day-old OST1-Myc overexpressing plants grown on MS medium at 22°C were placed at 4°C for 0, 0.5, 2 h, and total proteins were extracted and immunoprecipitated with anti-Myc agarose beads. The wild type (Col-0) treated with 4°C for 2 h was used as control. The OST1-Myc protein was detected with anti-Myc antibody and the AtANN1 protein was detected with anti-AtANN1 antibody. Representative pictures are shown in (E) and relative protein level in (F).G Co-IP assay showing the interaction between OST1 and AtANN1 in vivo. The construct combinations were expressed in N. benthamiana leaves. Total proteins were extracted after the N. benthamiana leaves treated with 4oC or 22oC and immunoprecipitated with anti-Myc agarose beads. The proteins were detected with anti-Myc and anti-GFP antibodies."}
{"words": ["Figure", "3Freezing", "phenotype", "(", "A", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "ost1", "-", "3", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "ost1", "-", "3", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "survival", "rate", "(", "B", ")", "and", "ion", "leakage", "(", "C", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "ost1", "-", "3", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "ost1", "-", "3", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "OST1", "gene", "expression", "D", ")", "in", "Col", "-", "0", ",", "OST1", "-", "Myc", ",", "atann1", "and", "OST1", "-", "Myc", "atann1", ".", "protein", "levels", "of", "OST1", "and", "AtANN1", "(", "E", ")", "in", "Col", "-", "0", ",", "OST1", "-", "Myc", ",", "atann1", "and", "OST1", "-", "Myc", "atann1", ".", "OST1", "and", "AtANN1", "proteins", "were", "detected", "with", "anti", "-", "Myc", "and", "anti", "-", "AtANN1", "antibodies", ".", "HSP90", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "Freezing", "phenotype", "(", "F", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "OST1", "-", "Myc", ",", "atann1", "and", "OST1", "-", "Myc", "atann1", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "-", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "-", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "survival", "rate", "(", "G", ")", ",", "and", "ion", "leakage", "(", "H", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "OST1", "-", "Myc", ",", "atann1", "and", "OST1", "-", "Myc", "atann1", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "-", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "-", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Freezing phenotype (A) of Col-0, ost1-3, atann1, and atann1 ost1-3. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min). Representative pictures are shown in (A).survival rate (B) and ion leakage (C) of Col-0, ost1-3, atann1, and atann1 ost1-3. Twelve-day-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min).OST1 gene expression D) in Col-0, OST1-Myc, atann1 and OST1-Myc atann1.protein levels of OST1 and AtANN1 (E) in Col-0, OST1-Myc, atann1 and OST1-Myc atann1. OST1 and AtANN1 proteins were detected with anti-Myc and anti-AtANN1 antibodies. HSP90 was used as a control.Freezing phenotype (F) of Col-0, OST1-Myc, atann1 and OST1-Myc atann1. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, -5°C, 30 min; CA, -8°C, 40 min). Representative pictures are shown in (F).survival rate (G), and ion leakage (H) of Col-0, OST1-Myc, atann1 and OST1-Myc atann1. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, -5°C, 30 min; CA, -8°C, 40 min)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "OST1", "phosphorylates", "AtANN1", "(", "A", ")", "and", "AtANN4", "(", "B", ")", "in", "vitro", ".", "Purified", "recombinant", "MBP", "-", "His", "-", "OST1", "was", "incubated", "with", "GST", "-", "AtANN1", ",", "GST", "-", "AtANN4", "or", "GST", "in", "kinase", "reaction", "buffer", "with", "1", "µCi", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "for", "30", "min", "at", "30", "°", "C", ",", "followed", "by", "separation", "with", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Phosphorylated", "AtANN1", "and", "AtANN4", "were", "detected", "by", "autoradiography", ".", "Recombinant", "OST1", ",", "AtANN1", "and", "AtANN4", "were", "stained", "by", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", ".", "C", "In", "-", "gel", "kinase", "assays", "of", "OST1", "in", "Col", "-", "0", "and", "ost1", "-", "3", "mutant", "under", "cold", "stress", ".", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "Col", "-", "0", "and", "ost1", "-", "3", "mutant", "were", "treated", "at", "4", "°", "C", "for", "2", "h", ".", "Total", "protein", "extracts", "were", "prepared", "and", "separated", "on", "a", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "containing", "0", ".", "2", "mg", "/", "mL", "GST", "-", "AtANN1", "as", "a", "substrate", ",", "and", "incubated", "with", "70", "µCi", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", ".", "Top", ",", "autoradiograph", ";", "bottom", ",", "CBB", "staining", ".", "D", "In", "vitro", "kinase", "analysis", "of", "the", "indicated", "mutant", "forms", "of", "AtANN1", "by", "OST1", ".", "After", "phosphorylation", ",", "the", "proteins", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "subjected", "to", "autoradiography", ".", "Top", ",", "autoradiograph", ";", "bottom", ",", "CBB", "staining", ".", "E", "OST1", "phosphorylates", "AtANN1", "at", "S289", "in", "vivo", "in", "LC", "/", "MS", "analysis", ".", "Total", "proteins", "were", "extracted", "from", "12", "-", "d", "-", "old", "AtANN1", "-", "Myc", "overexpressing", "plants", "treated", "at", "4", "°", "C", "for", "0", ",", "10", ",", "30", "and", "120", "min", ",", "followed", "by", "trypsin", "digestion", ".", "Phosphopeptides", "were", "enriched", "for", "mass", "spectrometry", "analysis", ".", "Representative", "picture", "for", "10", "min", "was", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A,B OST1 phosphorylates AtANN1 (A) and AtANN4 (B) in vitro. Purified recombinant MBP-His-OST1 was incubated with GST-AtANN1, GST-AtANN4 or GST in kinase reaction buffer with 1 µCi [γ-32P] ATP for 30 min at 30°C, followed by separation with SDS-PAGE. Phosphorylated AtANN1 and AtANN4 were detected by autoradiography. Recombinant OST1, AtANN1 and AtANN4 were stained by Coomassie brilliant blue (CBB).C In-gel kinase assays of OST1 in Col-0 and ost1-3 mutant under cold stress. Twelve-day-old Col-0 and ost1-3 mutant were treated at 4°C for 2 h. Total protein extracts were prepared and separated on a SDS-PAGE gel containing 0.2 mg/mL GST-AtANN1 as a substrate, and incubated with 70 µCi [γ-32P] ATP. Top, autoradiograph; bottom, CBB staining.D In vitro kinase analysis of the indicated mutant forms of AtANN1 by OST1. After phosphorylation, the proteins were separated by SDS-PAGE and subjected to autoradiography. Top, autoradiograph; bottom, CBB staining.E OST1 phosphorylates AtANN1 at S289 in vivo in LC/MS analysis. Total proteins were extracted from 12-d-old AtANN1-Myc overexpressing plants treated at 4°C for 0, 10, 30 and 120 min, followed by trypsin digestion. Phosphopeptides were enriched for mass spectrometry analysis. Representative picture for 10 min was shown."}
{"words": ["Figure", "5Freezing", "phenotype", "(", "A", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1S289E", "(", "#", "5", ")", "plants", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "survival", "rate", "(", "B", ")", ",", "and", "ion", "leakage", "(", "C", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1S289E", "(", "#", "5", ")", "plants", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Freezing", "phenotype", "(", "D", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "Atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1S289A", "(", "#", "16", ")", "plants", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "survival", "rate", "(", "E", ")", ",", "and", "ion", "leakage", "(", "F", ")", "of", "Col", "-", "0", ",", "Atann1", ",", "and", "atann1", "AtANN1S289A", "(", "#", "16", ")", "plants", ".", "12", "-", "d", "-", "old", "plants", "grown", "on", "MS", "medium", "at", "22", "°", "C", "were", "exposed", "to", "freezing", "temperatures", "(", "NA", ",", "−", "5", "°", "C", ",", "30", "min", ";", "CA", ",", "−", "8", "°", "C", ",", "40", "min", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Freezing phenotype (A) of Col-0, atann1, and atann1 AtANN1S289E (#5) plants. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min). Representative pictures are shown in (A).survival rate (B), and ion leakage (C) of Col-0, atann1, and atann1 AtANN1S289E (#5) plants. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min).Freezing phenotype (D) of Col-0, Atann1, and atann1 AtANN1S289A (#16) plants. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min). Representative pictures are shown in (D).survival rate (E), and ion leakage (F) of Col-0, Atann1, and atann1 AtANN1S289A (#16) plants. 12-d-old plants grown on MS medium at 22°C were exposed to freezing temperatures (NA, −5°C, 30 min; CA, −8°C, 40 min)."}
{"words": ["Figure", "6A", "AtANN1", "current", "recordings", "in", "Xenopus", "oocytes", ".", "Whole", "-", "cell", "currents", "were", "recorded", "in", "Xenopus", "oocytes", "injected", "with", "ddH2O", "or", "with", "AtANN1", ",", "OST1", ",", "or", "AtANN1", "+", "OST1", "cRNA", ".", "Bath", "solution", "was", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "The", "voltage", "protocol", "as", "well", "as", "time", "and", "current", "scale", "bars", "for", "the", "recordings", "are", "shown", ".", "B", "Current", "-", "voltage", "(", "I", "-", "V", ")", "relationship", "of", "the", "steady", "-", "state", "whole", "-", "cell", "currents", "in", "Xenopus", "oocytes", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Negative", "current", "is", "influx", "of", "cations", "into", "the", "oocytes", ".", "C", "Percentage", "of", "total", "Xenophus", "oocytes", "in", "different", "nA", "range", "according", "to", "(", "A", ")", ".", "D", "AtANN1", "current", "recordings", "in", "oocytes", ".", "Whole", "-", "cell", "currents", "were", "recorded", "in", "Xenopus", "oocytes", "injected", "with", "ddH2O", "or", "with", "AtANN1", ",", "AtANN1S289A", ",", "OST1", ",", "AtANN1", "+", "OST1", ",", "and", "AtANN1S289A", "+", "OST1", "cRNA", ".", "E", "Current", "-", "voltage", "(", "I", "-", "V", ")", "relationship", "of", "the", "steady", "-", "state", "whole", "-", "cell", "currents", "in", "Xenopus", "oocytes", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "F", "Percentage", "of", "total", "Xenophus", "oocytes", "in", "different", "nA", "range", "according", "to", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A AtANN1 current recordings in Xenopus oocytes. Whole-cell currents were recorded in Xenopus oocytes injected with ddH2O or with AtANN1, OST1, or AtANN1 + OST1 cRNA. Bath solution was described in Materials and Methods. The voltage protocol as well as time and current scale bars for the recordings are shown. B Current-voltage (I-V) relationship of the steady-state whole-cell currents in Xenopus oocytes described in (A). Negative current is influx of cations into the oocytes. C Percentage of total Xenophus oocytes in different nA range according to (A).D AtANN1 current recordings in oocytes. Whole-cell currents were recorded in Xenopus oocytes injected with ddH2O or with AtANN1, AtANN1S289A, OST1, AtANN1 + OST1, and AtANN1S289A + OST1 cRNA. E Current-voltage (I-V) relationship of the steady-state whole-cell currents in Xenopus oocytes described in (D). F Percentage of total Xenophus oocytes in different nA range according to (D)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Time", "-", "course", "analysis", "of", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "dynamics", "between", "10", "-", "day", "-", "old", "wild", "type", "(", "Col", "-", "0", ")", "and", "ost1", "-", "3", "mutant", "after", "treatment", "with", "ice", "-", "cold", "water", "or", "ice", "-", "cold", "water", "containing", "10", "mM", "LaCl3", "(", "arrow", "shows", "the", "time", "point", "of", "treatment", ")", ".", "Luminescence", "was", "recorded", "at", "1", "-", "s", "intervals", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "cold", "-", "induced", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "changes", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Peak", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "indicates", "the", "highest", "[", "Ca2", "+", "]", "cyt", "after", "treatment", ".", "C", "MST", "assays", "of", "the", "calcium", "-", "binding", "affinity", "of", "GST", "-", "AtANN1", ",", "GST", "-", "AtANN1S289A", ",", "and", "GST", "-", "AtANN1S289E", ".", "GST", "was", "used", "as", "a", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Time-course analysis of [Ca2+]cyt dynamics between 10-day-old wild type (Col-0) and ost1-3 mutant after treatment with ice-cold water or ice-cold water containing 10 mM LaCl3 (arrow shows the time point of treatment). Luminescence was recorded at 1-s intervals. B Quantification of the cold-induced [Ca2+]cyt changes shown in (A). Peak [Ca2+]cyt indicates the highest [Ca2+]cyt after treatment. C MST assays of the calcium-binding affinity of GST-AtANN1, GST-AtANN1S289A, and GST-AtANN1S289E. GST was used as a control."}
{"words": ["Figure", "1A", "Scatterplot", "representing", "differences", "in", "ssGSEA", "immune", "signatures", "in", "TERThigh", "versus", "TERTlow", "tumours", "(", "n", "=", "4", ",", "632", "tumours", "in", "each", "group", ")", "across", "TCGA", ".", "-", "log10", "(", "padj", ")", "for", "enrichment", "of", "ssGSEA", "immune", "signatures", "in", "TERThigh", "versus", "TERTlow", "tumours", "is", "shown", "on", "the", "y", "-", "axis", ".", "Signatures", "more", "highly", "represented", "in", "TERThigh", "tumours", "are", "shown", "on", "the", "right", ",", "while", "those", "in", "TERTlow", "tumours", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "D", "-", "F", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "interferon", "-", "related", "genes", "(", "D", ")", ",", "western", "blot", "analysis", "of", "TERT", ",", "TBK1", ",", "pTBK1", ",", "IRF3", ",", "pIRF3", ",", "and", "GAPDH", "levels", "(", "E", ")", ",", "and", "ELISA", "of", "IFNβ", "and", "CXCL10", "in", "culture", "supernatant", "(", "F", ")", "in", "U2OS", "and", "HeLa", "cells", "ectopically", "expressing", "TERT", "-", "WT", "or", "TERT", "-", "K626A", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Scatterplot representing differences in ssGSEA immune signatures in TERThigh versus TERTlow tumours (n = 4,632 tumours in each group) across TCGA. -log10(padj) for enrichment of ssGSEA immune signatures in TERThigh versus TERTlow tumours is shown on the y-axis. Signatures more highly represented in TERThigh tumours are shown on the right, while those in TERTlow tumours are shown on the left.D-F RT-qPCR analysis of interferon-related genes (D), western blot analysis of TERT, TBK1, pTBK1, IRF3, pIRF3, and GAPDH levels (E), and ELISA of IFNβ and CXCL10 in culture supernatant (F) in U2OS and HeLa cells ectopically expressing TERT-WT or TERT-K626A."}
{"words": ["Figure", "2D", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "TA", "-", "ERVs", "in", "U2OS", "and", "HeLa", "cells", "ectopically", "expressing", "TERT", "-", "WT", "or", "TERT", "-", "K626A", ".", "E", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "TA", "-", "ERVs", "in", "HeLa", "and", "HCT116", "cells", "with", "TERT", "knockdown", ".", "FF", "-", "H", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "interferon", "-", "related", "genes", "and", "TA", "-", "ERVs", "(", "F", ")", ",", "western", "blot", "analysis", "of", "TERT", ",", "TBK1", ",", "pTBK1", ",", "IRF3", ",", "pIRF3", ",", "and", "GAPDH", "levels", "(", "G", ")", ",", "and", "ELISA", "of", "IFNβ", "and", "CXCL10", "in", "culture", "supernatant", "(", "H", ")", "in", "U2OS", "cells", "ectopically", "expressing", "TERT", "-", "WT", "or", "TERT", "-", "K626A", "using", "Dox", "-", "inducible", "system", ".", "GFP", "was", "used", "as", "negative", "control", ".", "Relative", "levels", "of", "pTBK1", "and", "pIRF3", "were", "quantified", "with", "ImageJ", "software", "and", "normalized", "to", "GAPDH", ",", "as", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "blot", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D RT-qPCR analysis of TA-ERVs in U2OS and HeLa cells ectopically expressing TERT-WT or TERT-K626A. E RT-qPCR analysis of TA-ERVs in HeLa and HCT116 cells with TERT knockdown. FF-H RT-qPCR analysis of interferon-related genes and TA-ERVs (F), western blot analysis of TERT, TBK1, pTBK1, IRF3, pIRF3, and GAPDH levels (G), and ELISA of IFNβ and CXCL10 in culture supernatant (H) in U2OS cells ectopically expressing TERT-WT or TERT-K626A using Dox-inducible system. GFP was used as negative control. Relative levels of pTBK1 and pIRF3 were quantified with ImageJ software and normalized to GAPDH, as indicated at the bottom of the blot (G)."}
{"words": ["Figure", "3D", "MeDIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "TA", "-", "ERVs", "sites", "in", "HeLa", "cells", "ectopically", "expressing", "TERT", "-", "WT", "or", "TERT", "-", "K626A", ".", "Primer", "sets", "recognizing", "exon", "8", "of", "the", "human", "ZC3H13", "gene", "and", "a", "gene", "desert", "on", "chromosome", "12", "were", "used", "for", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "E", "ChIP", "-", "qPCR", "for", "TERT", "and", "Sp1", "targets", "on", "TA", "-", "ERVs", "in", "U2OS", "cells", "with", "TERT", "ectopic", "expression", "and", "in", "HeLa", "cells", ".", "GAPDH", "promoter", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ",", "and", "VEGF", "promoter", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D MeDIP-qPCR analysis of TA-ERVs sites in HeLa cells ectopically expressing TERT-WT or TERT-K626A. Primer sets recognizing exon 8 of the human ZC3H13 gene and a gene desert on chromosome 12 were used for positive and negative controls, respectively.E ChIP-qPCR for TERT and Sp1 targets on TA-ERVs in U2OS cells with TERT ectopic expression and in HeLa cells. GAPDH promoter was used as a negative control, and VEGF promoter was used as a positive control."}
{"words": ["Figure", "4A", "Expression", "of", "murine", "ERVs", "in", "blood", "of", "WT", "and", "G1", "Tert", "-", "/", "-", "mice", ".", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ".", "B", "Expression", "of", "MMERGLN", "_", "LTR", "and", "MMERGLN", "-", "int", "in", "livers", "of", "WT", "and", "G1", "Tert", "-", "/", "-", "mice", "treated", "with", "ENU", "or", "saline", "(", "control", ")", ".", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ".", "CD", "Heat", "map", "showing", "log2", "fold", "change", "differences", "of", "interferon", "-", "related", "genes", "expression", "between", "ENU", "treatment", "and", "control", "(", "saline", ")", "in", "WT", "and", "G1", "Tert", "-", "/", "-", "mice", "by", "RNA", "-", "seq", ".", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ".", "E", "Heat", "map", "showing", "log2", "fold", "change", "differences", "of", "cytokine", "/", "chemokine", "between", "ENU", "treatment", "and", "control", "(", "saline", ")", "in", "WT", "and", "G1", "Tert", "-", "/", "-", "mice", "by", "cytokine", "/", "chemokine", "array", ".", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Expression of murine ERVs in blood of WT and G1 Tert-/- mice. n = 5 mice per group. B Expression of MMERGLN_LTR and MMERGLN-int in livers of WT and G1 Tert-/- mice treated with ENU or saline (control). n = 3 mice per group. CD Heat map showing log2 fold change differences of interferon-related genes expression between ENU treatment and control (saline) in WT and G1 Tert-/- mice by RNA-seq. n = 3 mice per group. E Heat map showing log2 fold change differences of cytokine/chemokine between ENU treatment and control (saline) in WT and G1 Tert-/- mice by cytokine/chemokine array. n = 5 mice per group. F"}
{"words": ["Figure", "5B", "TCGA", "fragments", "per", "kilobase", "million", "(", "FPKM", ")", "values", "of", "TERT", ",", "CXCL10", ",", "ISG15", ",", "and", "OASL", "in", "tumours", "grouped", "in", "TERThigh", "(", "n", "=", "500", ")", "and", "TERTlow", "groups", "(", "n", "=", "500", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", ".", "P", "-", "values", "were", "analysed", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "C", "TCGA", "FPKM", "values", "of", "interferon", "-", "related", "genes", "in", "tumours", "grouped", "in", "TERThigh", "(", "n", "=", "500", ")", "and", "TERTlow", "(", "n", "=", "500", ")", "groups", ".", "Heat", "map", "showing", "mean", "FPKM", "values", "of", "each", "gene", ".", "Expression", "of", "TERT", "(", "D", ")", "in", "TERThigh", "and", "TERTlow", "cancer", "types", "(", "6", "types", "in", "each", ")", ".", "ACC", "(", "adrenocortical", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "79", ".", "KICH", "(", "kidney", "chromophobe", ")", ",", "n", "=", "66", ".", "KIRP", "(", "kidney", "renal", "papillary", "cell", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "291", ".", "LGG", "(", "brain", "lower", "grade", "glioma", ")", ",", "n", "=", "532", ".", "PRAD", ",", "n", "=", "502", ".", "THCA", ",", "n", "=", "513", ".", "BLCA", "(", "bladder", "urothelial", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "414", ".", "CESC", "(", "cervical", "squamous", "cell", "carcinoma", "and", "endocervical", "adenocarcinoma", ")", ",", "n", "=", "306", ".", "DLBC", "(", "lymphoid", "neoplasm", "diffuse", "large", "B", "-", "cell", "lymphoma", ")", ",", "n", "=", "48", ".", "LUSC", "(", "lung", "squamous", "cell", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "502", ".", "OV", "(", "ovarian", "serous", "cystadenocarcinoma", ")", ",", "n", "=", "430", ".", "All", "boxplots", "include", "the", "median", "line", ",", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "and", "whiskers", "denote", "the", "1", ".", "5", " ", "×", " ", "IQR", ".", "P", "-", "values", "were", "analysed", "using", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "Expression", "of", "DDX58", ",", "IFIH1", ",", "CXCL10", ",", "IFI44", ",", "ISG15", ",", "and", "OASL", "(", "E", ")", "in", "TERThigh", "and", "TERTlow", "cancer", "types", "(", "6", "types", "in", "each", ")", ".", "ACC", "(", "adrenocortical", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "79", ".", "KICH", "(", "kidney", "chromophobe", ")", ",", "n", "=", "66", ".", "KIRP", "(", "kidney", "renal", "papillary", "cell", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "291", ".", "LGG", "(", "brain", "lower", "grade", "glioma", ")", ",", "n", "=", "532", ".", "PRAD", ",", "n", "=", "502", ".", "THCA", ",", "n", "=", "513", ".", "BLCA", "(", "bladder", "urothelial", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "414", ".", "CESC", "(", "cervical", "squamous", "cell", "carcinoma", "and", "endocervical", "adenocarcinoma", ")", ",", "n", "=", "306", ".", "DLBC", "(", "lymphoid", "neoplasm", "diffuse", "large", "B", "-", "cell", "lymphoma", ")", ",", "n", "=", "48", ".", "LUSC", "(", "lung", "squamous", "cell", "carcinoma", ")", ",", "n", "=", "502", ".", "OV", "(", "ovarian", "serous", "cystadenocarcinoma", ")", ",", "n", "=", "430", ".", "All", "boxplots", "include", "the", "median", "line", ",", "box", "indicates", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", "and", "whiskers", "denote", "the", "1", ".", "5", " ", "×", " ", "IQR", ".", "P", "-", "values", "were", "analysed", "using", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "G", "Representative", "sections", "of", "immunohistochemical", "staining", "of", "CD4", "and", "FOXP3", "in", "TERT", "-", "ERVshigh", "and", "TERT", "-", "ERVslow", "colon", "tumours", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "FOXP3", "+", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B TCGA fragments per kilobase million (FPKM) values of TERT, CXCL10, ISG15, and OASL in tumours grouped in TERThigh (n = 500) and TERTlow groups (n = 500). Data represent mean ± SD. P-values were analysed using unpaired two-tailed Student's t-tests.C TCGA FPKM values of interferon-related genes in tumours grouped in TERThigh (n = 500) and TERTlow (n = 500) groups. Heat map showing mean FPKM values of each gene.Expression of TERT (D) in TERThigh and TERTlow cancer types (6 types in each). ACC (adrenocortical carcinoma), n = 79. KICH (kidney chromophobe), n = 66. KIRP (kidney renal papillary cell carcinoma), n = 291. LGG (brain lower grade glioma), n = 532. PRAD, n = 502. THCA, n = 513. BLCA (bladder urothelial carcinoma), n = 414. CESC (cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma), n = 306. DLBC (lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma), n = 48. LUSC (lung squamous cell carcinoma), n = 502. OV (ovarian serous cystadenocarcinoma), n = 430. All boxplots include the median line, box indicates the interquartile range (IQR) and whiskers denote the 1.5 × IQR. P-values were analysed using two-tailed Mann-Whitney U test.Expression of DDX58, IFIH1, CXCL10, IFI44, ISG15, and OASL (E) in TERThigh and TERTlow cancer types (6 types in each). ACC (adrenocortical carcinoma), n = 79. KICH (kidney chromophobe), n = 66. KIRP (kidney renal papillary cell carcinoma), n = 291. LGG (brain lower grade glioma), n = 532. PRAD, n = 502. THCA, n = 513. BLCA (bladder urothelial carcinoma), n = 414. CESC (cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma), n = 306. DLBC (lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma), n = 48. LUSC (lung squamous cell carcinoma), n = 502. OV (ovarian serous cystadenocarcinoma), n = 430. All boxplots include the median line, box indicates the interquartile range (IQR) and whiskers denote the 1.5 × IQR. P-values were analysed using two-tailed Mann-Whitney U test.G Representative sections of immunohistochemical staining of CD4 and FOXP3 in TERT-ERVshigh and TERT-ERVslow colon tumours. Red arrowheads indicate FOXP3+ cells. Scale bar = 100 μm."}
{"words": ["Figure", "1Chaining", "indices", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Statistical", "significance", "was", "compared", "with", "control", ".", ";", "n", "=", "9", ",", "6", ",", "7", "(", "E", ")", "groups", "(", "10", "flies", "per", "group", ")", ".", "Courtship", "indices", "for", "one", "target", "(", "Canton", "-", "S", ")", "male", "and", "one", "tester", "male", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Changes", "were", "determined", "by", "comparing", "the", "data", "with", "control", ".", ";", "n", "=", "9", ",", "8", ",", "9", "(", "F", ")", "flies", ".", "Sexual", "preference", "of", "single", "male", "of", "indicated", "genotypes", "toward", "a", "decapitated", "virgin", "female", "and", "a", "decapitated", "naïve", "male", ".", "Statistical", "significance", "was", "compared", "with", "the", "other", "gender", ".", ";", "n", "=", "10", ",", "10", ",", "10", "(", "F", ")", "flies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Chaining indices of the indicated genotypes. Statistical significance was compared with control. ; n = 9, 6, 7 (E) groups (10 flies per group). Courtship indices for one target (Canton-S) male and one tester male of the indicated genotypes. Changes were determined by comparing the data with control. ; n = 9, 8, 9 (F) flies. Sexual preference of single male of indicated genotypes toward a decapitated virgin female and a decapitated naïve male. Statistical significance was compared with the other gender. ; n = 10, 10, 10 (F) flies."}
{"words": ["Figure", "2Courtship", "indices", "for", "one", "target", "(", "Canton", "-", "S", ")", "male", "and", "one", "tester", "male", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Changes", "were", "determined", "by", "comparing", "the", "data", "with", "relative", "control", ".", "n", "=", "8", ",", "13", ",", "13", "(", "D", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Courtship indices for one target (Canton-S) male and one tester male of the indicated genotypes. Changes were determined by comparing the data with relative control. n = 8, 13, 13 (D)"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "DA", "level", "(", "pictograms", "per", "head", ")", "in", "males", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "n", "=", "3", ",", "3", ",", "3", "(", "A", ")", ";", "n", "=", "4", ",", "5", ",", "3", ",", "3", "(", "B", ")", ";", "n", "=", "3", ",", "3", ",", "3", "(", "C", ")", "times", "(", "100", "heads", "per", "genotype", ")", ".", "(", "D", ")", "Posterior", "confocal", "sections", "of", "UAS", "-", "mCD8", "-", "GFP", ";", "Ddc", "-", "Gal4", "adult", "male", "brain", "in", "combination", "with", "UAS", "-", "LacZ", "or", "UAS", "-", "Myc", ".", "RNAi", "-", "1", "stained", "with", "antibody", "to", "nc82", "(", "pan", "-", "neuropil", "marker", ";", "magenta", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "μm", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Western", "blot", "of", "proteins", "extracted", "from", "adult", "heads", "of", "indicated", "genotypes", ".", "Statistical", "analysis", "showing", "the", "protein", "level", "of", "GFP", "(", "F", ")", "or", "Ddc", "(", "G", ")", "to", "that", "of", "β", "-", "actin", "in", "Western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-C) DA level (pictograms per head) in males of the indicated genotypes. n = 3, 3, 3 (A); n = 4, 5, 3, 3 (B); n = 3, 3, 3 (C) times (100 heads per genotype).(D) Posterior confocal sections of UAS-mCD8-GFP; Ddc-Gal4 adult male brain in combination with UAS-LacZ or UAS-Myc.RNAi-1 stained with antibody to nc82 (pan-neuropil marker; magenta). Scale bars represent 50 μm.(F, G) Western blot of proteins extracted from adult heads of indicated genotypes. Statistical analysis showing the protein level of GFP (F) or Ddc (G) to that of β-actin in Western blot."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Drosophila", "S2", "cells", "transfected", "with", "the", "pUAST", "-", "HA", "empty", "vector", "or", "the", "pUAST", "-", "HA", "-", "Myc", "plasmid", "were", "co", "-", "transfected", "with", "each", "of", "the", "firefly", "luciferase", "reporter", "vector", "bearing", "the", "fragment", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "After", "48", "hours", ",", "the", "luciferase", "activity", "was", "detected", "in", "each", "cell", "lysate", "(", "n", "=", "5", "times", ")", ".", "(", "C", ")", "Drosophila", "S2", "cells", "transfected", "with", "the", "pUAST", "-", "HA", "-", "Myc", "plasmid", "or", "the", "empty", "vector", "were", "used", "for", "quantification", "of", "ChIP", "-", "PCRs", "(", "n", "=", "4", "times", ")", ".", "(", "D", ")", "RNA", "from", "adult", "male", "heads", "(", "n", "=", "50", "heads", "per", "genotype", ")", "of", "indicated", "genotypes", "was", "subjected", "to", "real", "-", "time", "qPCR", ".", "(", "E", ")", "DA", "level", "(", "pictograms", "per", "head", ")", "in", "the", "head", "of", "males", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "n", "=", "4", "(", "100", "heads", "per", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Drosophila S2 cells transfected with the pUAST-HA empty vector or the pUAST-HA-Myc plasmid were co-transfected with each of the firefly luciferase reporter vector bearing the fragment shown in (A). After 48 hours, the luciferase activity was detected in each cell lysate (n = 5 times).(C) Drosophila S2 cells transfected with the pUAST-HA-Myc plasmid or the empty vector were used for quantification of ChIP-PCRs (n = 4 times).(D) RNA from adult male heads (n = 50 heads per genotype) of indicated genotypes was subjected to real-time qPCR.(E) DA level (pictograms per head) in the head of males of the indicated genotypes. n = 4 (100 heads per genotype)."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrographs", "of", "Chm7", "-", "GFP", "and", "truncations", "with", "Nup170", "-", "mCherry", "NE", "marker", "and", "merge", "of", "green", "and", "red", "channels", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "C", ".", "Scatter", "plot", "of", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "with", "SD", "of", "individual", "NE", "foci", "(", "horizontal", "line", "is", "mean", ")", ".", ">", "50", "foci", "were", "measured", "for", "each", "GFP", "fusion", ";", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "is", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "is", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "D", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrographs", "of", "Chm7", "-", "GFP", "and", "Mps3", "-", "mCherry", "with", "merge", "of", "green", "and", "red", "images", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "E", ".", "10", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "chm7Δapq12Δ", "strains", "grown", "at", "the", "indicated", "temperatures", "with", "either", "an", "empty", "pRS416", "plasmid", "(", "-", ")", "or", "those", "expressing", "the", "indicated", "Chm7", "constructs", "(", "pRS416", "-", "HA", "-", "CHM7", ",", "pRS416", "-", "HA", "-", "chm7", "-", "NTD", ",", "pRS416", "-", "HA", "-", "chm7", "-", "CTD", ")", ".", "See", "Appendix", "Figure", "S2A", "for", "protein", "levels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Deconvolved fluorescence micrographs of Chm7-GFP and truncations with Nup170-mCherry NE marker and merge of green and red channels. Scale bar is 5 μm.C. Scatter plot of the mean fluorescence intensity with SD of individual NE foci (horizontal line is mean). >50 foci were measured for each GFP fusion; p values from un-paired student's T-test. *** is p ≤ 0.001; **** is p ≤ 0.0001.D. Deconvolved fluorescence micrographs of Chm7-GFP and Mps3-mCherry with merge of green and red images (right). Scale bar is 5 μm.E. 10-fold serial dilutions of chm7Δapq12Δ strains grown at the indicated temperatures with either an empty pRS416 plasmid (-) or those expressing the indicated Chm7 constructs (pRS416-HA-CHM7, pRS416-HA-chm7-NTD, pRS416-HA-chm7-CTD). See Appendix Figure S2A for protein levels."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescence", "micrographs", "Chm7", "-", "GFP", "and", "truncations", "in", "the", "indicated", "null", "strains", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "B", ".", "Plot", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "SD", "of", "Chm7", "-", "GFP", "(", "and", "truncations", ")", "NE", "foci", "from", "A", ".", "Data", "are", "from", "3", "independent", "replicates", "where", ">", "200", "cells", "were", "counted", "for", "each", "strain", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", ".", "*", "*", "is", "a", "p", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "C", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescence", "micrographs", "of", "Chm7", "-", "GFP", "in", "a", "heh1Δ", "strain", "containing", "either", "an", "empty", "pRS426", "plasmid", "(", "-", ")", "or", "those", "expressing", "HEH1", "(", "pRS426", "-", "HEH1", ")", "or", "HEH2", "(", "pRS426", "-", "HEH2", ")", ".", "D", ".", "Plots", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "from", "C", "with", "Chm7", "-", "GFP", "NE", "-", "foci", ".", "Data", "are", "from", "3", "independent", "replicates", "where", ">", "200", "cells", "were", "counted", "for", "each", "strain", ".", "Error", "bars", "are", "SD", ".", "p", "values", "from", "T", "-", "test", ".", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Deconvolved inverted fluorescence micrographs Chm7-GFP and truncations in the indicated null strains. Scale bar is 5 μm.B. Plot of the percentage of cells with SD of Chm7-GFP (and truncations) NE foci from A. Data are from 3 independent replicates where >200 cells were counted for each strain. p values from un-paired student's T-test. ** is a p value ≤ 0.01; ****, p ≤ 0.0001.C. Deconvolved inverted fluorescence micrographs of Chm7-GFP in a heh1Δ strain containing either an empty pRS426 plasmid (-) or those expressing HEH1 (pRS426-HEH1) or HEH2 (pRS426-HEH2).D. Plots of the percentage of cells from C with Chm7-GFP NE-foci. Data are from 3 independent replicates where >200 cells were counted for each strain. Error bars are SD. p values from T-test. **, p ≤ 0.01; ****, p ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "GST", ",", "GST", "-", "Snf7", "and", "GST", "-", "snf7OPEN", "were", "immobilized", "on", "GT", "-", "resin", "and", "incubated", "with", "buffer", "(", "-", ")", "or", "recombinant", "heh2", "(", "1", "-", "308", ")", "-", "His6", ".", "Bound", "proteins", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "were", "visualized", "by", "coomassie", "stain", "and", "by", "Western", "blot", "with", "anti", "-", "His6", "antibody", "and", "ECL", "detection", "(", "WB", ";", "top", "panel", ")", ".", "Middle", "panel", "shows", "indicated", "cropped", "region", "of", "gel", "where", "contrast", "has", "been", "increased", ".", "Numbers", "on", "side", "of", "gel", "show", "position", "of", "molecular", "weight", "(", "MW", ")", "markers", ".", "D", ".", "In", "vitro", "transcription", "translation", "(", "IVT", ")", "reactions", "generating", "radiolabeled", "(", "35S", ")", "truncations", "of", "Heh2", "(", "inputs", ")", "were", "incubated", "with", "bead", "-", "bound", "GST", ",", "GST", "-", "snf7OPEN", "or", "GST", "-", "Snf7", "before", "washing", ",", "elution", "and", "detection", "of", "bound", "proteins", "by", "autoradiography", "(", "top", "panel", ")", "or", "coomassie", "staining", "(", "bottom", ")", ".", "E", ".", "As", "in", "C", "except", "with", "GST", "-", "Chm7", "constructs", ".", "Upper", "panel", "shows", "western", "blot", "(", "WB", ")", "with", "anti", "-", "His6", "antibody", ".", "*", "chm7", "-", "NTD", "is", "also", "expressed", "with", "a", "His6", "tag", ".", "Bottom", "panel", "is", "coomassie", "stained", ".", "F", ".", "As", "in", "E", "except", "with", "MBP", "-", "Snf7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. GST, GST-Snf7 and GST-snf7OPEN were immobilized on GT-resin and incubated with buffer(-) or recombinant heh2(1-308)-His6. Bound proteins separated by SDS-PAGE were visualized by coomassie stain and by Western blot with anti-His6 antibody and ECL detection (WB; top panel). Middle panel shows indicated cropped region of gel where contrast has been increased. Numbers on side of gel show position of molecular weight (MW) markers.D. In vitro transcription translation (IVT) reactions generating radiolabeled (35S) truncations of Heh2 (inputs) were incubated with bead-bound GST, GST-snf7OPEN or GST-Snf7 before washing, elution and detection of bound proteins by autoradiography (top panel) or coomassie staining (bottom).E. As in C except with GST-Chm7 constructs. Upper panel shows western blot (WB) with anti-His6 antibody. *chm7-NTD is also expressed with a His6 tag. Bottom panel is coomassie stained.F. As in E except with MBP-Snf7."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescent", "micrographs", "of", "BiFC", "signal", "of", "Chm7", "-", "VC", "with", "either", "Heh1", "-", "VN", "or", "Heh2", "-", "VN", ".", "Cell", "borders", "are", "outlined", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "B", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescent", "micrographs", "of", "yeast", "strains", "expressing", "Heh1", "-", "VN", "and", "Snf7", "-", "VC", "with", "either", "Chm7", "-", "mCherry", "or", "Mps3", "-", "mCherry", "and", "merge", "of", "both", "channels", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "C", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescent", "micrographs", "of", "BiFC", "signal", "of", "the", "indicated", "VN", "and", "VC", "fusions", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Cell", "borders", "outlined", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "D", ",", "E", ".", "Plots", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "BiFC", "signal", "of", "the", "indicated", "VN", "VC", "pairs", "in", "the", "indicated", "null", "backgrounds", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "replicates", "where", ">", "225", "cells", "per", "strain", "per", "replicate", "were", "quantified", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "of", "each", "replicate", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "where", "ns", "is", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "F", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescence", "micrographs", "of", "Heh1", "-", "VN", "Snf7", "-", "VC", "BiFC", "signal", "in", "a", "chm7Δ", "strain", "with", "either", "an", "empty", "plasmid", "(", "\"", "-", "\"", ";", "pRS416", ")", "or", "one", "expressing", "CHM7", "(", "pRS416", "-", "HA", "-", "CHM7", ")", ".", "Cell", "borders", "outlined", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "G", ".", "Plot", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "BiFC", "signal", "from", "F", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "of", "each", "replicate", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "where", "ns", "is", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Deconvolved inverted fluorescent micrographs of BiFC signal of Chm7-VC with either Heh1-VN or Heh2-VN. Cell borders are outlined. Scale bar is 5 μm.B. Deconvolved inverted fluorescent micrographs of yeast strains expressing Heh1-VN and Snf7-VC with either Chm7-mCherry or Mps3-mCherry and merge of both channels. Scale bar is 5 μm.C. Deconvolved inverted fluorescent micrographs of BiFC signal of the indicated VN and VC fusions in the indicated strains. Cell borders outlined. Scale bar is 5 μm.D,E. Plots of the percentage of cells with BiFC signal of the indicated VN VC pairs in the indicated null backgrounds. Data are from three independent replicates where > 225 cells per strain per replicate were quantified. Error bars are SD from the mean of each replicate. p values from un-paired student's T-test where ns is p > 0.05. *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001.F. Deconvolved inverted fluorescence micrographs of Heh1-VN Snf7-VC BiFC signal in a chm7Δ strain with either an empty plasmid (\"-\"; pRS416) or one expressing CHM7 (pRS416-HA-CHM7). Cell borders outlined. Scale bar is 5 μm.G. Plot of the percentage of cells with BiFC signal from F. Error bars are SD from the mean of each replicate. p values from un-paired student's T-test where ns is p > 0.05. ***, p ≤ 0.001."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescence", "micrographs", "of", "Chm7", "-", "GFP", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "±", "SD", "with", "Chm7", "-", "GFP", "foci", "is", "indicated", "below", "each", "panel", ".", "B", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "images", "of", "SINC", "-", "containing", "nuclei", "in", "vps4Δ", "and", "vps4Δpom152Δ", "cells", "expressing", "Chm7", "-", "GFP", "and", "Nup170", "-", "mCherry", "(", "green", ",", "red", "and", "merged", "images", "are", "shown", ")", ".", "Scale", "bar", "is", "1", "μm", ".", "C", ".", "Plot", "of", "the", "proportion", "of", "nup", "clusters", "with", "Chm7", "-", "GFP", "enrichment", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "of", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", ".", "D", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrograph", "showing", "the", "lack", "of", "colocalization", "of", "Chm7", "-", "GFP", "and", "clustered", "Nup170", "-", "mCherry", "in", "a", "nup133Δ", "strain", ".", "Scale", "bar", "is", "1", "μm", ".", "E", ".", "Plot", "of", "the", "total", "fluorescence", "/", "integrated", "density", "(", "in", "arbitrary", "units", "(", "A", ".", "U", ".", ")", ")", "of", "Chm7", "-", "GFP", "within", "(", "and", "outside", "of", ")", "the", "SINC", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "deviation", "of", "the", "mean", "from", ">", "50", "SINC", "or", "non", "-", "SINC", "accumulations", "pooled", "from", "3", "independent", "replicates", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "tests", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "*", "*", "*", "*", "is", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "F", ".", "Correlation", "of", "the", "total", "fluorescence", "intensity", "/", "integrated", "density", "of", "SINC", "-", "enriched", "Chm7", "-", "GFP", "and", "Nup170", "-", "mCherry", "within", "individual", "SINCs", ".", "Linear", "regression", "calculated", "from", "150", "SINCs", "pooled", "from", "3", "independent", "replicates", ";", "r", "is", "the", "linear", "correlation", "(", "Pearson", "'", "s", ")", "coefficient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Deconvolved inverted fluorescence micrographs of Chm7-GFP in the indicated strains. Scale bar is 5 μm. The percentage of cells ± SD with Chm7-GFP foci is indicated below each panel.B. Deconvolved fluorescence images of SINC-containing nuclei in vps4Δ and vps4Δpom152Δ cells expressing Chm7-GFP and Nup170-mCherry (green, red and merged images are shown). Scale bar is 1 μm.C. Plot of the proportion of nup clusters with Chm7-GFP enrichment in the indicated genetic backgrounds. Error bars are SD of the mean from 3 independent replicates.D. Deconvolved fluorescence micrograph showing the lack of colocalization of Chm7-GFP and clustered Nup170-mCherry in a nup133Δ strain. Scale bar is 1 μm.E. Plot of the total fluorescence/integrated density (in arbitrary units (A.U.)) of Chm7-GFP within (and outside of) the SINC. Error bars represent SD deviation of the mean from > 50 SINC or non-SINC accumulations pooled from 3 independent replicates. p values from un-paired student's T-tests with Welch's correction. **** is p ≤ 0.0001.F. Correlation of the total fluorescence intensity/integrated density of SINC-enriched Chm7-GFP and Nup170-mCherry within individual SINCs. Linear regression calculated from 150 SINCs pooled from 3 independent replicates; r is the linear correlation (Pearson's) coefficient."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "10", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "yeast", "strains", "were", "grown", "on", "YPD", "at", "23", "°", "C", "for", "3", "days", "before", "imaging", ".", "C", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrographs", "of", "Sna3", "-", "mCherry", "in", "the", "indicated", "genetic", "backgrounds", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "D", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrographs", "(", "maximum", "intensity", "projections", "of", "a", "z", "-", "series", "of", "images", ")", "of", "GFP", "-", "Nup49", "in", "the", "indicated", "yeast", "strains", "(", "arrows", "indicate", "SINCs", ")", ".", "E", ".", "Plot", "of", "proportion", "of", "cells", "in", "the", "indicated", "strains", "with", "SINCs", ".", "Error", "bars", "are", "the", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "quantifying", ">", "300", "cells", "for", "each", "strain", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "tests", "where", "ns", "is", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A.10-fold serial dilutions of the indicated yeast strains were grown on YPD at 23°C for 3 days before imaging.C. Deconvolved fluorescence micrographs of Sna3-mCherry in the indicated genetic backgrounds. Scale bar is 5 μm.D. Deconvolved fluorescence micrographs (maximum intensity projections of a z-series of images) of GFP-Nup49 in the indicated yeast strains (arrows indicate SINCs).E. Plot of proportion of cells in the indicated strains with SINCs. Error bars are the SD from the mean from 3 independent replicates quantifying >300 cells for each strain. p values from un-paired student's T-tests where ns is p > 0.05; *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescent", "micrographs", "of", "the", "indicated", "strains", "expressing", "Chm7", "-", "GFP", "(", "percentages", "±", "SD", "of", "the", "proportion", "of", "cells", "with", "Chm7", "-", "GFP", "foci", "is", "at", "bottom", "of", "each", "panel", ",", "see", "Figure", "EV5B", ")", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "B", ".", "Plot", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "the", "indicated", "number", "of", "Chm7", "-", "GFP", "foci", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "of", ">", "50", "foci", "per", "strain", ".", "p", "values", "from", "2", "-", "way", "ANOVA", "where", "ns", "represents", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "C", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescencemicrographs", "of", "strains", "expressing", "Chm7", "-", "GFP", "after", "5", "h", "at", "23", "°", "C", "(", "top", ")", "or", "37", "°", "C", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "Percentages", "±", "SD", "of", "the", "proportion", "of", "cells", "with", "Chm7", "-", "GFP", "NE", "foci", "are", "shown", "under", "each", "panel", "(", "see", "Figure", "EV5F", ")", ".", "D", ".", "Plots", "of", "percentage", "of", "cells", "from", "C", "with", "the", "indicated", "number", "of", "Chm7", "-", "GFP", "foci", "at", "23", "°", "C", "(", "left", ")", "and", "37", "°", "C", "(", "right", ")", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "of", ">", "50", "foci", "per", "strain", ".", "p", "values", "from", "2", "-", "way", "ANOVA", "where", "ns", "is", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Deconvolved inverted fluorescent micrographs of the indicated strains expressing Chm7-GFP (percentages ± SD of the proportion of cells with Chm7-GFP foci is at bottom of each panel, see Figure EV5B). Scale bar is 5 μm.B. Plot of the percentage of cells with the indicated number of Chm7-GFP foci. Error bars are SD from the mean from 3 independent replicates of > 50 foci per strain. p values from 2-way ANOVA where ns represents p > 0.05; *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ****, p ≤ 0.0001.C. Deconvolved inverted fluorescencemicrographs of strains expressing Chm7-GFP after 5 h at 23°C (top) or 37°C (bottom). Scale bar is 5 μm. Percentages ± SD of the proportion of cells with Chm7-GFP NE foci are shown under each panel (see Figure EV5F).D. Plots of percentage of cells from C with the indicated number of Chm7-GFP foci at 23°C (left) and 37°C (right). Error bars are SD from the mean from 3 independent replicates of > 50 foci per strain. p values from 2-way ANOVA where ns is p > 0.05; *, p ≤ 0.05; ***, p ≤ 0.001."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Plot", "of", "the", "percentage", "of", "nup116Δ", "cells", "incubated", "for", "3", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "nuclear", "rim", "-", "like", "accumulations", "of", "Chm7", "-", "GFP", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "of", ">", "100", "cells", ".", "p", "values", "from", "unpaired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "where", "*", "*", "*", "is", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "B", ".", "Deconvolved", "inverted", "fluorescence", "micrographs", "of", "Chm7", "-", "GFP", "in", "nup116Δ", "cells", "at", "either", "23", "°", "C", "or", "grown", "for", "3", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "Percentages", "±", "SD", "of", "the", "proportion", "of", "cells", "with", "Chm7", "-", "GFP", "NE", "foci", "are", "shown", "under", "each", "panel", "(", "see", "Figure", "EV5F", ")", ".", "C", ".", "Electron", "micrographs", "showing", "herniations", "of", "the", "NE", "in", "nup116Δ", "cells", "after", "incubation", "for", "3", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "N", "denotes", "nuclear", "interior", ".", "Scale", "bars", "are", "100", "nm", ".", "D", ".", "10", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "indicated", "strains", "grown", "in", "medium", "permissive", "(", "-", "URA", ")", "or", "restrictive", "(", "5", "-", "FOA", ")", "of", "the", "retention", "of", "a", "URA3", "/", "NUP116", "plasmid", ".", "Images", "acquired", "after", "incubation", "for", "3", "days", "(", "left", ")", "or", "6", "days", "(", "right", ")", "at", "23", "°", "C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Plot of the percentage of nup116Δ cells incubated for 3 h at 37°C with nuclear rim-like accumulations of Chm7-GFP. Error bars are SD from the mean from 3 independent replicates of >100 cells. p values from unpaired student's T-test where *** is p ≤ 0.001.B. Deconvolved inverted fluorescence micrographs of Chm7-GFP in nup116Δ cells at either 23°C or grown for 3 h at 37°C. Percentages ± SD of the proportion of cells with Chm7-GFP NE foci are shown under each panel (see Figure EV5F).C. Electron micrographs showing herniations of the NE in nup116Δ cells after incubation for 3 h at 37°C. N denotes nuclear interior. Scale bars are 100 nm.D. 10-fold serial dilutions of indicated strains grown in medium permissive (-URA) or restrictive (5-FOA) of the retention of a URA3/NUP116 plasmid. Images acquired after incubation for 3 days (left) or 6 days (right) at 23°C."}
{"words": ["Figure", "9A", ".", "Deconvolved", "fluorescence", "micrographs", "of", "NLS", "-", "GFP", "in", "the", "indicated", "yeast", "strains", "at", "either", "30", "°", "C", "or", "after", "2", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "Scale", "bar", "is", "5", "μm", ".", "B", ".", "Plot", "of", "the", "mean", "nuclear", "to", "cytosolic", "fluorescence", "intensity", "ratio", "of", "NLS", "-", "GFP", "from", "cells", "represented", "in", "A", ".", "Error", "bars", "are", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "of", "150", "cells", "from", "each", "strain", ".", "p", "values", "from", "un", "-", "paired", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "where", "ns", "is", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Only", "chm7Δ", "and", "chm7Δapq12Δ", "cells", "have", "N", ":", "C", "ratios", "below", "1", ".", "2", "(", "dotted", "red", "line", ")", ".", "C", ".", "Re", "-", "plotting", "of", "data", "from", "B", "showing", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "a", "N", ":", "C", "NLS", "-", "GFP", "fluorescence", "ratio", "<", "1", ".", "2", ".", "Error", "bars", "are", "the", "SD", "from", "the", "mean", "from", "3", "independent", "replicates", "of", "150", "cells", "/", "strain", ".", "p", "values", "from", "student", "'", "s", "T", "-", "test", "where", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A. Deconvolved fluorescence micrographs of NLS-GFP in the indicated yeast strains at either 30°C or after 2 h at 37°C. Scale bar is 5 μm.B. Plot of the mean nuclear to cytosolic fluorescence intensity ratio of NLS-GFP from cells represented in A. Error bars are SD from the mean from 3 independent replicates of 150 cells from each strain. p values from un-paired student's T-test where ns is p > 0.05; **, p ≤ 0.01; ****, p ≤ 0.0001. Only chm7Δ and chm7Δapq12Δ cells have N:C ratios below 1.2 (dotted red line).C. Re-plotting of data from B showing the percentage of cells with a N:C NLS-GFP fluorescence ratio <1.2. Error bars are the SD from the mean from 3 independent replicates of 150 cells/strain. p values from student's T-test where *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ****, p ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "High", "magnification", "view", "of", "boxed", "regions", "in", "(", "A", ")", "pseudo", "-", "colored", "to", "show", "actin", "depletion", "in", "anaphase", ".", "Scale", "bar", "-", "1", "µm", ".", "(", "F", ")", "Stills", "from", "time", "-", "lapse", "sequence", "of", "representative", "Hela", "cells", "expressing", "mNeon", "-", "Green", "Aurora", "B", "and", "Cell", "Mask", "to", "label", "cell", "membrane", ",", "exiting", "mitosis", ",", "showing", "the", "dynamic", "re", "-", "localization", "of", "Aurora", "B", "from", "DNA", "to", "the", "overlapping", "microtubules", "and", "cleavage", "furrow", "with", "control", "siRNA", "treatment", "(", "arrows", "top", ")", ".", "With", "knock", "-", "down", "of", "RACGAP1", ",", "Aurora", "B", "still", "re", "-", "localises", "from", "the", "DNA", "to", "the", "microtubules", "and", "furrow", "in", "the", "midzone", "in", "early", "anaphase", "(", "arrows", "bottom", ")", ",", "but", "the", "microtubule", "localization", "is", "lost", "at", "later", "stages", "(", "asterisk", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", "-", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) High magnification view of boxed regions in (A) pseudo-colored to show actin depletion in anaphase. Scale bar -1 µm.(F) Stills from time-lapse sequence of representative Hela cells expressing mNeon-Green Aurora B and Cell Mask to label cell membrane, exiting mitosis, showing the dynamic re-localization of Aurora B from DNA to the overlapping microtubules and cleavage furrow with control siRNA treatment (arrows top). With knock-down of RACGAP1, Aurora B still re-localises from the DNA to the microtubules and furrow in the midzone in early anaphase (arrows bottom), but the microtubule localization is lost at later stages (asterisk bottom). Scale bar - 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "E", ")", "Stills", "of", "representative", "Hela", "cells", "expressing", "Lifeact", "-", "GFP", "and", "H2B", "-", "mCherry", "at", "10", "mins", "following", "forced", "mitotic", "exit", "with", "siControl", ",", "siRACGAP1", ",", "DMSO", "and", "2µM", "ZM447439", "treatment", ".", "Control", "siRNA", ",", "RACGAP1", "siRNA", "and", "DMSO", "treated", "cells", "show", "clearance", "of", "actin", "from", "the", "cortex", "close", "to", "the", "DNA", ",", "while", "ZM447439", "treated", "cells", "fail", "to", "clear", "actin", ",", "quantified", "in", "(", "F", ")", ".", "Note", ",", "failure", "in", "actin", "accumulation", "in", "RACGAP1", "depleted", "cell", ",", "asterisk", ".", "Scale", "bar", "-", "10", "µm", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "actin", "intensity", "across", "the", "perimeter", "of", "the", "cells", "based", "on", "distance", "from", "DNA", ",", "with", "5", "and", "6", "being", "closest", "to", "DNA", "and", "1", "and", "10", "furthest", "away", ",", "as", "in", "cartoon", "(", "B", ")", ".", "Graph", "shows", "decrease", "in", "actin", "intensity", "closer", "to", "the", "DNA", "in", "siControl", "(", "n", "=", "26", ")", ",", "siRACGAP1", "(", "n", "=", "37", ")", "and", "Control", "DMSO", "treated", "cells", "(", "n", "=", "38", "cells", ")", ",", "seen", "by", "levels", "lower", "than", "1", "(", "dotted", "red", "line", ")", ",", "while", "this", "decrease", "is", "absent", "in", "ZM447439", "treated", "cells", "(", "n", "=", "42", "cells", ")", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(E) Stills of representative Hela cells expressing Lifeact-GFP and H2B-mCherry at 10 mins following forced mitotic exit with siControl, siRACGAP1, DMSO and 2µM ZM447439 treatment. Control siRNA, RACGAP1 siRNA and DMSO treated cells show clearance of actin from the cortex close to the DNA, while ZM447439 treated cells fail to clear actin, quantified in (F). Note, failure in actin accumulation in RACGAP1 depleted cell, asterisk. Scale bar - 10 µm(F) Quantification of actin intensity across the perimeter of the cells based on distance from DNA, with 5 and 6 being closest to DNA and 1 and 10 furthest away, as in cartoon (B). Graph shows decrease in actin intensity closer to the DNA in siControl (n=26), siRACGAP1 (n=37) and Control DMSO treated cells (n=38 cells), seen by levels lower than 1 (dotted red line), while this decrease is absent in ZM447439 treated cells (n=42 cells). Data presented as mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Stills", "from", "time", "-", "lapse", "sequence", "of", "the", "basal", "most", "region", "of", "Hela", "cells", "expressing", "Lifeact", "-", "GFP", "and", "H2B", "-", "mCherry", "forced", "to", "undergo", "flat", "monopolar", "mitotic", "exit", ".", "While", "actin", "is", "cleared", "underneath", "the", "DNA", "in", "control", "DMSO", "treated", "cells", ",", "it", "fails", "to", "be", "cleared", "around", "the", "DNA", "when", "cells", "are", "treated", "with", "Aurora", "B", "inhibitor", "ZM447439", "during", "mitotic", "exit", ".", "Dotted", "mask", "shows", "position", "of", "DNA", "in", "actin", "channel", ".", "Scale", "bar", "-", "10µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "clearance", "of", "actin", "underneath", "the", "DNA", "for", "still", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "While", "DNA", "under", "control", "cell", "starts", "clearing", "actin", "within", "10", "mins", ",", "Aurora", "B", "inhibited", "cells", "fail", "to", "do", "so", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Stills from time-lapse sequence of the basal most region of Hela cells expressing Lifeact-GFP and H2B-mCherry forced to undergo flat monopolar mitotic exit. While actin is cleared underneath the DNA in control DMSO treated cells, it fails to be cleared around the DNA when cells are treated with Aurora B inhibitor ZM447439 during mitotic exit. Dotted mask shows position of DNA in actin channel. Scale bar -10µm.(C) Quantification of clearance of actin underneath the DNA for still shown in (B). While DNA under control cell starts clearing actin within 10 mins, Aurora B inhibited cells fail to do so."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "Still", "images", "of", "representative", "Hela", "cells", "expressing", "Lifeact", "-", "GFP", "and", "H2B", "-", "mCherry", "captured", "at", "early", "anaphase", "under", "different", "conditions", "i", ".", "e", ".", "Control", "siRNA", ",", "knock", "-", "down", "of", "centralspindlin", "protein", "RACGAP1", ",", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Aurora", "B", "kinase", "inhibitor", "(", "2µM", "ZM", ")", ".", "Scale", "bar", "-", "10", "µm", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "aspect", "ratio", "of", "cells", "treated", "with", "different", "conditions", "as", "in", "(", "D", ")", "at", "6", "mins", "after", "anaphase", "onset", ",", "before", "furrow", "formation", ".", "Aurora", "B", "inhibition", "and", "siRACGAP1", "individually", "have", "a", "moderate", "effect", "on", "aspect", "ratio", ",", "while", "together", "have", "a", "stronger", "impact", "during", "mitotic", "exit", ".", "In", "combined", "treatment", ",", "mitotic", "cells", "hardly", "undergo", "any", "elongation", "and", "remain", "spherical", "before", "re", "-", "spreading", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparison", ".", "Each", "treatment", "is", "compared", "with", "siControl", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "all", "comparisons", ".", "Data", "represented", "as", "box", "-", "whisker", "plot", ",", "with", "box", "showing", "25th", "-", "75th", "percentile", "values", ",", "whiskers", "-", "min", "to", "max", "value", "and", "line", "representing", "median", ".", "Mean", "±", "SD", "for", "different", "treatments", "-", "siControl", "(", "n", "=", "38", ")", "-", "1", ".", "455", "±", "0", ".", "19", ",", "ZM", "(", "n", "=", "32", ")", "-", "1", ".", "219", "±", "0", ".", "16", ",", "siRACGAP1", "(", "n", "=", "25", ")", "-", "1", ".", "144", "±", "0", ".", "078", "and", "siRACGAP1", "+", "ZM", "(", "n", "=", "16", ")", "-", "1", ".", "013", "±", "0", ".", "03", ".", "Cells", "for", "different", "treatment", "pooled", "from", "n", ">", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) Still images of representative Hela cells expressing Lifeact-GFP and H2B-mCherry captured at early anaphase under different conditions i.e. Control siRNA, knock-down of centralspindlin protein RACGAP1, in the presence and absence of Aurora B kinase inhibitor (2µM ZM). Scale bar - 10 µm (E) Quantification of aspect ratio of cells treated with different conditions as in (D) at 6 mins after anaphase onset, before furrow formation. Aurora B inhibition and siRACGAP1 individually have a moderate effect on aspect ratio, while together have a stronger impact during mitotic exit. In combined treatment, mitotic cells hardly undergo any elongation and remain spherical before re-spreading. Ordinary one-way ANOVA with multiple comparison. Each treatment is compared with siControl, ****p<0.0001 for all comparisons. Data represented as box-whisker plot, with box showing 25th-75th percentile values, whiskers-min to max value and line representing median. Mean±SD for different treatments- siControl (n=38) - 1.455±0.19, ZM (n=32) - 1.219±0.16, siRACGAP1 (n=25) -1.144±0.078 and siRACGAP1+ZM (n=16) - 1.013±0.03. Cells for different treatment pooled from n>3 independent experiments. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "actin", "intensity", "at", "the", "poles", "of", "cells", "at", "6", "mins", "post", "anaphase", "onset", ",", "before", "furrow", "formation", "under", "different", "conditions", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Actin", "fails", "to", "be", "cleared", "from", "the", "poles", "upon", "Aurora", "B", "kinase", "inhibition", "during", "mitotic", "exit", "and", "is", "stronger", "when", "both", "centralspindlin", "and", "Aurora", "B", "kinase", "activity", "are", "affected", ",", "while", "it", "is", "cleared", "upon", "RACGAP1", "depletion", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "for", "treatments", "-", "siControl", "-", "0", ".", "98", "±", "0", ".", "05", ",", "siRACGAP1", "-", "0", ".", "99", "±", "0", ".", "04", ",", "ZM", "-", "1", "±", "0", ".", "039", ",", "siRACGAP1", "+", "ZM", "-", "1", "±", "0", ".", "037", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparison", "-", "siControl", "vs", "siRACGAP1", "-", "n", ".", "s", ".", ",", "p", "=", "0", ".", "896", ",", "siControl", "vs", "ZM", "-", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0018", ",", "siControl", "vs", "siRACGAP1", "+", "ZM", "-", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "and", "ZM", "vs", "siRACGAP1", "+", "ZM", "-", "p", "=", "0", ".", "1528", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "shortest", "distance", "between", "centroid", "of", "DNA", "and", "cortical", "actomyosin", "network", ".", "While", "chromatin", "is", "able", "to", "reach", "close", "to", "the", "cortex", "in", "both", "siControl", "and", "siRACGAP1", "treated", "cells", ",", "the", "distance", "of", "chromatin", "from", "cortex", "increases", "upon", "ZM", "treatment", "and", "is", "further", "enhanced", "in", "the", "double", "treatment", "condition", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "siControl", "-", "4", ".", "7", "±", "0", ".", "87", ",", "siRACGAP1", "-", "4", ".", "4", "±", "0", ".", "64", ",", "ZM", "-", "5", ".", "47", "±", "0", ".", "87", ",", "siRACGAP1", "+", "ZM", "-", "6", ".", "35", "±", "1", ".", "14", "microns", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparison", ",", "siControl", "vs", "ZM", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "002", ",", "siControl", "vs", "siRACGAP1", ",", "p", "=", "0", ".", "2823", ",", "siControl", "vs", "siRACGAP1", "+", "ZM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "siRACGAP1", "vs", "siRACGAP1", "+", "ZM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ZM", "vs", "siRACGAP1", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ZM", "vs", "siRACGAP1", "+", "ZM", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0004", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Quantification of actin intensity at the poles of cells at 6 mins post anaphase onset, before furrow formation under different conditions as in (A). Actin fails to be cleared from the poles upon Aurora B kinase inhibition during mitotic exit and is stronger when both centralspindlin and Aurora B kinase activity are affected, while it is cleared upon RACGAP1 depletion. Data represented as mean±SD for treatments - siControl- 0.98±0.05, siRACGAP1 - 0.99±0.04, ZM - 1±0.039, siRACGAP1+ZM - 1±0.037. Ordinary one-way ANOVA with multiple comparison- siControl vs siRACGAP1 - n.s., p=0.896, siControl vs ZM - **p=0.0018, siControl vs siRACGAP1+ZM - ****p<0.0001 and ZM vs siRACGAP1+ZM - p=0.1528.(G) Quantification of shortest distance between centroid of DNA and cortical actomyosin network. While chromatin is able to reach close to the cortex in both siControl and siRACGAP1 treated cells, the distance of chromatin from cortex increases upon ZM treatment and is further enhanced in the double treatment condition. Data represented as mean±SD. siControl - 4.7±0.87, siRACGAP1 - 4.4±0.64, ZM - 5.47±0.87, siRACGAP1+ZM - 6.35±1.14 microns. Ordinary one-way ANOVA with multiple comparison, siControl vs ZM, ***p=0.002, siControl vs siRACGAP1, p=0.2823, siControl vs siRACGAP1+ZM, ****p<0.0001, siRACGAP1 vs siRACGAP1+ZM, ****p <0.0001, ZM vs siRACGAP1, ****p<0.0001, ZM vs siRACGAP1+ZM, ***p=0.0004 ."}
{"words": ["Figure", "1Differences", "in", "clinical", "variables", "including", "(", "B", ")", "liver", "fat", ",", "plasma", "levels", "of", "(", "C", ")", "ALT", ",", "(", "D", ")", "AST", ",", "(", "E", ")", "uric", "acid", "and", "(", "F", ")", "creatinine", "are", "presented", "in", "the", "CMA", "and", "placebo", "groups", "on", "Days", "0", ",", "14", "and", "70", "after", "weight", "loss", "adjustment", ".", "Adj", ".", "P", "indicates", "p", "value", "after", "weight", "loss", "adjustment", ".", "Statistical", "significance", "is", "defined", "based", "on", "paired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "boxes", "show", "the", "distribution", "of", "the", "clinical", "parameters", "in", "different", "groups", ".", "The", "bottom", "and", "top", "of", "the", "boxes", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", "value", ".", "The", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", "that", "are", "not", "outliers", "and", "dots", "represent", "outlier", "values", ".", "The", "sample", "sizes", "on", "Days", "0", ",", "14", "or", "70", "were", "marked", "in", "each", "boxplot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Differences in clinical variables including (B) liver fat, plasma levels of (C) ALT, (D) AST, (E) uric acid and (F) creatinine are presented in the CMA and placebo groups on Days 0, 14 and 70 after weight loss adjustment. Adj.P indicates p value after weight loss adjustment. Statistical significance is defined based on paired Student's t test. p< 0.05. The boxes show the distribution of the clinical parameters in different groups. The bottom and top of the boxes represent the 25th and 75th percentiles. The central band represents the median value. The whiskers represent the minimum and maximum values that are not outliers and dots represent outlier values. The sample sizes on Days 0, 14 or 70 were marked in each boxplot."}
{"words": ["Figure", "2Differences", "in", "clinical", "variables", "including", "(", "B", ")", "liver", "fat", ",", "plasma", "levels", "of", "(", "C", ")", "ALT", ",", "(", "D", ")", "AST", ",", "(", "E", ")", "uric", "acid", "and", "(", "F", ")", "creatinine", "are", "presented", "in", "the", "CMA", "and", "placebo", "groups", "on", "Days", "0", ",", "14", "and", "70", "after", "weight", "loss", "adjustment", ".", "Adj", ".", "P", "indicates", "p", "value", "after", "weight", "loss", "adjustment", ".", "Statistical", "significance", "is", "defined", "based", "on", "paired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "boxes", "show", "the", "distribution", "of", "the", "clinical", "parameters", "in", "different", "groups", ".", "The", "bottom", "and", "top", "of", "the", "boxes", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", "value", ".", "The", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", "that", "are", "not", "outliers", "and", "dots", "represent", "outlier", "values", ".", "The", "sample", "sizes", "on", "Days", "0", ",", "14", "or", "70", "were", "marked", "in", "each", "boxplot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Differences in clinical variables including (B) liver fat, plasma levels of (C) ALT, (D) AST, (E) uric acid and (F) creatinine are presented in the CMA and placebo groups on Days 0, 14 and 70 after weight loss adjustment. Adj.P indicates p value after weight loss adjustment. Statistical significance is defined based on paired Student's t test. p< 0.05. The boxes show the distribution of the clinical parameters in different groups. The bottom and top of the boxes represent the 25th and 75th percentiles. The central band represents the median value. The whiskers represent the minimum and maximum values that are not outliers and dots represent outlier values. The sample sizes on Days 0, 14 or 70 were marked in each boxplot."}
{"words": ["Figure", "3Association", "between", "the", "plasma", "level", "of", "significantly", "different", "metabolites", "on", "Day", "70", "vs", "Day", "0", "B", ")", "in", "both", "(", "n", "=", "4", ")", ";"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Association between the plasma level of significantly different metabolites on Day 70 vs Day 0 B) in both (n=4);"}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Heatmap", "shows", "log2FC", "based", "alterations", "between", "the", "significantly", "different", "inflammation", "related", "proteins", "on", "Day", "70", "vs", "Day", "0", "in", "the", "CMA", "and", "placebo", "groups", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "based", "on", "paired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "B", ")", "Heatmap", "shows", "the", "correlation", "between", "the", "plasma", "levels", "of", "all", "inflammation", "related", "proteins", "and", "plasma", "levels", "of", "the", "individual", "metabolic", "activators", "including", "serine", ",", "cysteine", ",", "carnitine", "and", "nicotinamide", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "based", "on", "Spearman", "correlation", "analysis", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Heatmap", "shows", "the", "associations", "between", "the", "significantly", "different", "inflammation", "related", "proteins", "(", "CD8A", ",", "CSF", "-", "1", ",", "CCL23", ",", "FGF", "-", "21", "and", "OSM", ")", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "based", "on", "Spearman", "correlation", "analysis", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Heatmap", "shows", "the", "associations", "between", "the", "significantly", "different", "inflammation", "related", "proteins", "(", "CD8A", ",", "CSF", "-", "1", ",", "CCL23", ",", "FGF", "-", "21", "and", "OSM", ")", "C", ")", "with", "the", "10", "most", "significantly", "correlated", "plasma", "metabolites", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Heatmap shows log2FC based alterations between the significantly different inflammation related proteins on Day 70 vs Day 0 in the CMA and placebo groups. Asterisks indicate statistical significance based on paired Student's t test. p < 0.05;B) Heatmap shows the correlation between the plasma levels of all inflammation related proteins and plasma levels of the individual metabolic activators including serine, cysteine, carnitine and nicotinamide. Asterisks indicate statistical significance based on Spearman correlation analysis. p < 0.05; Heatmap shows the associations between the significantly different inflammation related proteins (CD8A, CSF-1, CCL23, FGF-21 and OSM)Asterisks indicate statistical significance based on Spearman correlation analysis. p < 0.05; Heatmap shows the associations between the significantly different inflammation related proteins (CD8A, CSF-1, CCL23, FGF-21 and OSM) C) with the 10 most significantly correlated plasma metabolites,"}
{"words": ["Figure", "5Scatter", "plot", "with", "linear", "regression", "line", "and", "heatmap", "show", "log2FC", "based", "alterations", "of", "the", "significantly", "different", "species", "in", "the", "A", ")", "gut", "microbiome", "between", "CMA", "and", "placebo", "groups", "on", "Day", "70", "vs", "Day", "0", ";", "B", ")", "gut", "microbiome", "between", "Day", "70", "vs", "Day", "0", "in", "the", "CMA", "and", "placebo", "groups", ";", "C", ")", "oral", "microbiome", "between", "CMA", "and", "placebo", "groups", "on", "Day", "70", "vs", "Day", "0", ";", "D", ")", "oral", "microbiome", "between", "Day", "70", "vs", "Day", "0", "in", "the", "CMA", "and", "placebo", "groups", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "species", "and", "it", "has", "been", "colored", "according", "to", "its", "corresponding", "phylum", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "based", "on", "paired", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Log2FC", ":", "log2", "(", "fold", "change", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Scatter plot with linear regression line and heatmap show log2FC based alterations of the significantly different species in the A) gut microbiome between CMA and placebo groups on Day 70 vs Day 0; B) gut microbiome between Day 70 vs Day 0 in the CMA and placebo groups; C) oral microbiome between CMA and placebo groups on Day 70 vs Day 0; D) oral microbiome between Day 70 vs Day 0 in the CMA and placebo groups. Each dot represents a species and it has been colored according to its corresponding phylum. Asterisks indicate statistical significance based on paired Wilcoxon signed-rank test. p< 0.05. Log2FC: log2(fold change)."}
{"words": ["Figure", "6Heatmap", "shows", "the", "association", "between", "the", "plasma", "level", "of", "clinical", "variables", "including", "liver", "fat", ",", "ALT", ",", "AST", ",", "uric", "acid", ",", "and", "creatinine", "with", ",", "B", ")", "plasma", "level", "of", "10", "most", "significant", "inflammation", "related", "proteinsHeatmap", "shows", "the", "association", "between", "the", "plasma", "level", "of", "clinical", "variables", "including", "liver", "fat", ",", "ALT", ",", "AST", ",", "uric", "acid", ",", "and", "creatinine", "with", ",", "C", ")", "the", "abundance", "of", "the", "species", "in", "gut", "microbiomeHeatmap", "shows", "the", "association", "between", "the", "plasma", "level", "of", "clinical", "variables", "including", "liver", "fat", ",", "ALT", ",", "AST", ",", "uric", "acid", ",", "and", "creatinine", "with", "D", ")", "the", "abundance", "of", "the", "species", "in", "oral", "microbiome", ".", "AST", ",", "Aspartate", "aminotransferase", ";", "ALT", ",", "Alanine", "transaminase", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "based", "on", "Spearman", "correlation", "analysis", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Cor", ".", "Coeff", ":", "Correlation", "coefficient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Heatmap shows the association between the plasma level of clinical variables including liver fat, ALT, AST, uric acid, and creatinine with , B) plasma level of 10 most significant inflammation related proteinsHeatmap shows the association between the plasma level of clinical variables including liver fat, ALT, AST, uric acid, and creatinine with , C) the abundance of the species in gut microbiomeHeatmap shows the association between the plasma level of clinical variables including liver fat, ALT, AST, uric acid, and creatinine with D) the abundance of the species in oral microbiome. AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine transaminase. Asterisks indicate statistical significance based on Spearman correlation analysis. p < 0.05; Cor.Coeff: Correlation coefficient."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "(", "A", ")", "Confocal", "imaging", "of", "FOS", "DNA", "FISH", "with", "concurrent", "SPT5", "and", "Pol", "II", "-", "S5P", "IF", "showing", "that", "SPT5", "and", "Pol", "II", "-", "S5P", "occupied", "the", "FOS", "loci", "after", "serum", "starvation", ".", "Zoomed", "-", "in", "views", "of", "the", "merged", "regions", "are", "indicated", "by", "the", "white", "arrow", ".", "(", "B", ")", "Same", "as", "Fig", "1A", ".", "but", "for", "FOS", "DNA", "FISH", "with", "concurrent", "SPT5", "and", "NELFE", "IF", ".", "E", "Confocal", "images", "showing", "that", "SPT5", ",", "NELFA", ",", "Pol", "II", "-", "S5P", "and", "AFF4", "formed", "nuclear", "puncta", "in", "HCT", "116", "cells", "before", "and", "after", "treated", "with", "1", "%", "1", ",", "6", "-", "hexanediol", "(", "abbreviation", "as", "1", ",", "6", "-", "hex", ")", "for", "30", "minutes", ".", "F", "Violin", "plot", "showing", "the", "number", "of", "cells", "containing", "nuclear", "puncta", "in", "Fig", "1E", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "20", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "For", "SPT5", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "1301", ".", "For", "NELFA", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "2756", ".", "For", "Pol", "II", "-", "S5P", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "8179", ".", "For", "AFF4", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "GG", "-", "I", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "that", "the", "occupancies", "of", "Pol", "II", "(", "G", ")", ",", "SPT5", "(", "H", ")", ",", "and", "NELFE", "(", "I", ")", "at", "the", "promoters", "and", "gene", "bodies", "of", "HSP70", ",", "GAPDH", ",", "and", "MYC", "in", "HeLa", "cells", ".", "The", "HEMO", "gene", "serves", "as", "a", "negative", "control", "for", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "means", ".", "Results", "are", "plotted", "with", "four", "technical", "repeats", "from", "two", "biological", "replicates", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "For", "Pol", "II", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0014", ";", "GAPDH", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "8385", ";", "GAPDH", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "MYC", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "1765", ";", "MYC", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0002", ".", "For", "SPT5", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0033", ";", "GAPDH", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "9603", ";", "GAPDH", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0012", ";", "MYC", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "9898", ";", "MYC", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "For", "NELFE", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "3913", ";", "GAPDH", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "9347", ";", "MYC", "_", "promoter", ",", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "8558", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B (A) Confocal imaging of FOS DNA FISH with concurrent SPT5 and Pol II-S5P IF showing that SPT5 and Pol II-S5P occupied the FOS loci after serum starvation. Zoomed-in views of the merged regions are indicated by the white arrow. (B) Same as Fig 1A. but for FOS DNA FISH with concurrent SPT5 and NELFE IF.E Confocal images showing that SPT5, NELFA, Pol II-S5P and AFF4 formed nuclear puncta in HCT 116 cells before and after treated with 1% 1,6-hexanediol (abbreviation as 1,6-hex) for 30 minutes. F Violin plot showing the number of cells containing nuclear puncta in Fig 1E. Results are representative of three biological replicates, each n > 20. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. For SPT5, p = 0.1301. For NELFA, p = 0.2756. For Pol II-S5P, p = 0.8179. For AFF4, ***p < 0.0001. GG-I ChIP-qPCR showing that the occupancies of Pol II (G), SPT5 (H), and NELFE (I) at the promoters and gene bodies of HSP70, GAPDH, and MYC in HeLa cells. The HEMO gene serves as a negative control for ChIP-qPCR. Error bars represent standard error of means. Results are plotted with four technical repeats from two biological replicates. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. For Pol II ChIP, HSP70_promoter, **p = 0.0014; GAPDH_promoter, p = 0.8385; GAPDH_gene body, ***p < 0.0001; MYC_promoter, p = 0.1765; MYC_gene body, ***p = 0.0002. For SPT5 ChIP, HSP70_promoter, **p = 0.0033; GAPDH_promoter, p = 0.9603; GAPDH_gene body, **p = 0.0012; MYC_promoter, p = 0.9898; MYC_gene body, ***p < 0.0001. For NELFE ChIP, HSP70_promoter, p = 0.3913; GAPDH_promoter, p = 0.9347; MYC_promoter, p = 0.8558."}
{"words": ["Figure", "2C", "Normalized", "FRAP", "curves", "for", "eGFP", "-", "SPT5", ".", "The", "bleaching", "events", "occurred", "at", "0", "second", ".", "Confocal", "images", "were", "embedded", "within", "the", "plot", "showing", "FRAP", "of", "the", "in", "vitro", "eGFP", "-", "SPT5", "clusters", ".", "Results", "shown", "are", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "The", "arrowhead", "represents", "the", "bleached", "region", ".", "E", "Live", "cell", "imaging", "of", "HEK", "-", "293T", "cells", "expressing", "eGFP", "-", "SPT5", "together", "with", "mCherry", "-", "SPT5", ",", "mCherry", "-", "SPT5ΔNTR", ",", "or", "mCherry", "-", "SPT5ΔCTR", "close", "to", "endogenous", "level", ".", "F", "Violin", "plot", "showing", "the", "clusters", "area", "(", "top", ")", "and", "circularity", "(", "bottom", ")", "of", "SPT5", "with", "SPT5", ",", "SPT5ΔNTR", ",", "or", "SPT5ΔCTR", "in", "Fig", "2E", ".", "Each", "n", ">", "20", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "20", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "GH", "Confocal", "images", "showing", "FRAP", "analysis", "of", "the", "NELFA", "-", "IDR", "-", "eGFP", "and", "SPT5", "-", "CTR", "-", "mCherry", "clusters", "in", "vitro", ".", "The", "arrowhead", "represents", "the", "bleached", "and", "recovered", "cluster", ".", "I", "Normalized", "FRAP", "curves", "for", "NELFA", "-", "IDR", "-", "eGFP", "and", "SPT5", "-", "CTR", "-", "mCherry", "clusters", ".", "The", "bleaching", "events", "occurred", "at", "0", "second", ".", "Results", "shown", "are", "from", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Normalized FRAP curves for eGFP-SPT5. The bleaching events occurred at 0 second. Confocal images were embedded within the plot showing FRAP of the in vitro eGFP-SPT5 clusters. Results shown are from three biological replicates. The arrowhead represents the bleached region.E Live cell imaging of HEK-293T cells expressing eGFP-SPT5 together with mCherry-SPT5, mCherry-SPT5ΔNTR, or mCherry-SPT5ΔCTR close to endogenous level. F Violin plot showing the clusters area (top) and circularity (bottom) of SPT5 with SPT5, SPT5ΔNTR, or SPT5ΔCTR in Fig 2E. Each n > 20. Results are representative of three biological replicates, each n > 20. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. ***p < 0.001. GH Confocal images showing FRAP analysis of the NELFA-IDR-eGFP and SPT5-CTR-mCherry clusters in vitro. The arrowhead represents the bleached and recovered cluster. I Normalized FRAP curves for NELFA-IDR-eGFP and SPT5-CTR-mCherry clusters. The bleaching events occurred at 0 second. Results shown are from two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "3A", "Western", "blot", "analysis", "of", "re", "-", "expression", "of", "mCherry", "-", "SPT5", ",", "mCherry", "-", "SPT5ΔNTR", "or", "mCherry", "-", "SPT5ΔCTR", "after", "SPT5", "depletion", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Results", "are", "representative", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "B", "Confocal", "imaging", "of", "nascent", "RNA", "labeled", "by", "EU", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", "expressing", "SPT5", ",", "SPT5ΔNTR", "or", "SPT5ΔCTR", "after", "SPT5", "depletion", ".", "G", ",", "H", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "the", "occupancies", "of", "Pol", "II", "at", "the", "promoters", "and", "gene", "bodies", "of", "GAPDH", "(", "G", ")", ",", "and", "MYC", "(", "H", ")", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", "expressing", "SPT5", ",", "SPT5ΔNTR", "or", "SPT5ΔCTR", "after", "SPT5", "depletion", ".", "The", "HEMO", "gene", "serves", "as", "a", "negative", "control", "for", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "means", ".", "Results", "are", "plotted", "with", "four", "technical", "repeats", "from", "two", "biological", "replicates", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ".", "For", "GAPDH", "_", "promoter", ",", "p", " ", "value", "(", "from", "left", "to", "right", ",", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "<", " ", "0", ".", "0001", ",", "0", ".", "0044", ",", "0", ".", "8873", ",", "0", ".", "9310", ",", "0", ".", "6855", ",", "0", ".", "9615", ")", ";", "GAPDH", "_", "gene", "body", ",", "p", " ", "value", "(", "from", "left", "to", "right", ",", "0", ".", "0370", ",", "0", ".", "0214", ",", "0", ".", "0574", ",", "0", ".", "0256", ",", "0", ".", "9536", ",", "0", ".", "8038", ",", "0", ".", "7623", ",", "0", ".", "8773", ")", ";", "For", "MYC", "_", "promoter", ",", "p", " ", "value", "(", "from", "left", "to", "right", ",", "0", ".", "0002", ",", "0", ".", "0014", ",", "0", ".", "0004", ",", "0", ".", "0048", ",", "0", ".", "0670", ",", "0", ".", "7501", ",", "0", ".", "3482", ",", "0", ".", "3284", ")", ";", "MYC", "_", "gene", "body", ",", "p", " ", "value", "(", "from", "left", "to", "right", ",", "0", ".", "0004", ",", "0", ".", "0013", ",", "0", ".", "0081", ",", "0", ".", "0299", ",", "0", ".", "1332", ",", "0", ".", "5839", ",", "0", ".", "4404", ",", "0", ".", "6170", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Western blot analysis of re-expression of mCherry-SPT5, mCherry-SPT5ΔNTR or mCherry-SPT5ΔCTR after SPT5 depletion. α-Tubulin was used as a loading control. Results are representative of two biological replicates.B Confocal imaging of nascent RNA labeled by EU in HEK-293T cells expressing SPT5, SPT5ΔNTR or SPT5ΔCTR after SPT5 depletion.G, H ChIP-qPCR showing the occupancies of Pol II at the promoters and gene bodies of GAPDH (G), and MYC (H) in HEK-293T cells expressing SPT5, SPT5ΔNTR or SPT5ΔCTR after SPT5 depletion. The HEMO gene serves as a negative control for ChIP-qPCR. Error bars represent standard error of means. Results are plotted with four technical repeats from two biological replicates. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s.=not significant. For GAPDH_promoter, p value (from left to right, < 0.0001, < 0.0001, < 0.0001, 0.0044, 0.8873, 0.9310, 0.6855, 0.9615); GAPDH_gene body, p value (from left to right, 0.0370, 0.0214, 0.0574, 0.0256, 0.9536, 0.8038, 0.7623, 0.8773); For MYC_promoter, p value (from left to right, 0.0002, 0.0014, 0.0004, 0.0048, 0.0670, 0.7501, 0.3482, 0.3284); MYC_gene body, p value (from left to right, 0.0004, 0.0013, 0.0081, 0.0299, 0.1332, 0.5839, 0.4404, 0.6170)."}
{"words": ["Figure", "4B", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "phase", "-", "separated", "AFF4", "-", "IDR", "-", "eGFP", "and", "SPT5", "-", "CTR", "-", "mCherry", "droplets", "formed", "in", "50", "mM", "NaCl", "containing", "buffer", "in", "the", "presence", "of", "10", "%", "PEG", "-", "8000", ".", "The", "concentration", "ratios", "are", "indicated", "as", "CAFF4", "-", "IDR", "/", "CSPT5", "-", "CTR", ".", "C", "Dot", "plot", "showing", "the", "droplet", "area", "in", "Fig", "4B", ".", "Fields", "per", "condition", "n", "=", "5", ".", "DD", "Live", "cell", "confocal", "images", "showing", "FRAP", "of", "the", "heterotypic", "eGFP", "-", "AFF4", "+", "ENL", "and", "mCherry", "-", "SPT5", "droplets", ".", "The", "arrowhead", "represents", "the", "bleached", "and", "recovered", "droplet", ".", "E", "Normalized", "FRAP", "curves", "for", "eGFP", "-", "AFF4", "+", "ENL", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "-", "SPT5", "(", "purple", ")", "in", "the", "AFF4", "/", "ENL", "/", "SPT5", "heterotypic", "droplets", ".", "The", "bleaching", "events", "occurred", "at", "0", "second", ".", "Results", "shown", "are", "from", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Fluorescence microscopy images showing the phase-separated AFF4-IDR-eGFP and SPT5-CTR-mCherry droplets formed in 50 mM NaCl containing buffer in the presence of 10% PEG-8000. The concentration ratios are indicated as CAFF4-IDR/CSPT5-CTR. C Dot plot showing the droplet area in Fig 4B. Fields per condition n = 5. DD Live cell confocal images showing FRAP of the heterotypic eGFP-AFF4 + ENL and mCherry-SPT5 droplets. The arrowhead represents the bleached and recovered droplet. E Normalized FRAP curves for eGFP-AFF4 + ENL (green) and mCherry-SPT5 (purple) in the AFF4/ENL/SPT5 heterotypic droplets. The bleaching events occurred at 0 second. Results shown are from three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5C", "Confocal", "imaging", "of", "FOS", "RNA", "FISH", "with", "concurrent", "SPT5", "IF", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "ENL", "KO", "HCT116", "cells", "after", "serum", "treatment", ".", "Zoomed", "-", "in", "views", "of", "the", "merged", "regions", "are", "indicated", "by", "the", "white", "arrow", ".", "H", "Confocal", "images", "showing", "SPT5", "in", "nuclear", "puncta", "in", "WT", "or", "ENL", "KO", "cells", "treatment", "with", "KL", "-", "1", ".", "I", "Violin", "plot", "showing", "the", "number", "of", "cells", "containing", "nuclear", "puncta", "in", "Fig", "5H", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "20", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "J", "-", "M", "(", "J", ")", "Confocal", "images", "showing", "co", "-", "localization", "of", "Pol", "II", "-", "S5P", "with", "SPT5", "in", "nuclear", "puncta", "in", "KL", "-", "1", "treated", "HCT", "116", "cells", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "images", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "K", ")", "Boxplots", "showing", "the", "mean", "values", "of", "the", "Pearson", "correlation", "coefficient", "of", "co", "-", "localization", "ratios", "of", "SPT5", "and", "Pol", "II", "-", "S5P", "in", "Fig", "5J", ".", "Central", "band", "is", "median", ";", "boxes", "represent", "1st", "and", "3rd", "quartile", "(", "25th", "and", "75th", "percentile", ",", "respectively", ")", "and", "whiskers", "1", ".", "5", "×", "interquartile", "range", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "20", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "KL", "-", "1", "vs", ".", "DMSO", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0050", ".", "(", "L", ")", "Same", "as", "Fig", "5J", ".", "but", "for", "SPT5", "and", "NELFA", ".", "(", "M", ")", "Same", "as", "Fig", "5K", ".", "but", "for", "SPT5", "and", "NELFA", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "KL", "-", "1", "vs", ".", "DMSO", ",", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0100", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C Confocal imaging of FOS RNA FISH with concurrent SPT5 IF in wild type (WT) and ENL KO HCT116 cells after serum treatment. Zoomed-in views of the merged regions are indicated by the white arrow.H Confocal images showing SPT5 in nuclear puncta in WT or ENL KO cells treatment with KL-1. I Violin plot showing the number of cells containing nuclear puncta in Fig 5H. Results are representative of three biological replicates, each n > 20. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. ***p < 0.001.J-M (J) Confocal images showing co-localization of Pol II-S5P with SPT5 in nuclear puncta in KL-1 treated HCT 116 cells. Results shown are representative images from three independent experiments. (K) Boxplots showing the mean values of the Pearson correlation coefficient of co-localization ratios of SPT5 and Pol II-S5P in Fig 5J. Central band is median; boxes represent 1st and 3rd quartile (25th and 75th percentile, respectively) and whiskers 1.5× interquartile range. Results are representative of three biological replicates, each n > 20. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. KL-1 vs. DMSO, **p = 0.0050. (L) Same as Fig 5J. but for SPT5 and NELFA. (M) Same as Fig 5K. but for SPT5 and NELFA. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. KL-1 vs. DMSO, *p = 0.0100."}
{"words": ["Figure", "6B", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "that", "2", "μM", "SPT5", "-", "CTR", "-", "eGFP", "formed", "phase", "-", "separated", "droplets", "in", "the", "NaCl", "containing", "buffer", ".", "C", "Droplet", "number", "(", "top", ")", "and", "droplet", "area", "(", "bottom", ")", "analyses", "are", "shown", ".", "Central", "band", "is", "median", ";", "boxes", "represent", "1st", "and", "3rd", "quartile", "(", "25th", "and", "75th", "percentile", ",", "respectively", ")", "and", "whiskers", "1", ".", "5", "×", "interquartile", "range", ".", "Results", "are", "representative", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "6", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "For", "droplet", "number", ",", "SPT5", "-", "CTR", "+", "P", "-", "TEFb", "(", "-", "ATP", ")", "vs", ".", "SPT5", "-", "CTR", ",", "p", " ", "=", " ", "*", "*", "0", ".", "0015", ".", "SPT5", "-", "CTR", "+", "P", "-", "TEFb", "(", "+", "vs", ".", "-", "ATP", ")", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0032", ".", "For", "droplet", "area", ",", "SPT5", "-", "CTR", "+", "P", "-", "TEFb", "(", "+", "vs", ".", "-", "ATP", ")", "E", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "phase", "-", "separated", "droplets", "formed", "in", "50", "mM", "NaCl", "containing", "buffer", "with", "10", "μM", "AFF4", "-", "IDR", "-", "eGFP", "and", "10", "μM", "SPT5", "-", "CTR", "-", "mCherry", "or", "SPT5", "-", "CTR", "-", "TE", "-", "mCherry", "in", "the", "presence", "of", "10", "%", "PEG", "-", "8000", ".", "F", "Droplet", "number", "(", "top", ")", "and", "droplet", "area", "(", "bottom", ")", "analyses", "are", "shown", ".", "Central", "band", "is", "median", ";", "boxes", "represent", "1st", "and", "3rd", "quartile", "(", "25th", "and", "75th", "percentile", ",", "respectively", ")", "and", "whiskers", "1", ".", "5", "×", "interquartile", "range", ".", "Results", "are", "representative", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "each", "n", ">", "6", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "AFF4", "-", "IDR", "+", "SPT5", "-", "CTR", "-", "TE", "vs", ".", "AFF4", "-", "IDR", "+", "SPT5", "-", "CTR", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0029", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Fluorescence microscopy images showing that 2 μM SPT5-CTR-eGFP formed phase-separated droplets in the NaCl containing buffer. C Droplet number (top) and droplet area (bottom) analyses are shown. Central band is median; boxes represent 1st and 3rd quartile (25th and 75th percentile, respectively) and whiskers 1.5× interquartile range. Results are representative of two biological replicates, each n > 6. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. For droplet number, SPT5-CTR + P-TEFb (- ATP) vs. SPT5-CTR, p = **0.0015. SPT5-CTR + P-TEFb (+ vs.- ATP), **p = 0.0032. For droplet area, SPT5-CTR + P-TEFb (+ vs. - ATP)E Fluorescence microscopy images showing the phase-separated droplets formed in 50 mM NaCl containing buffer with 10 μM AFF4-IDR-eGFP and 10 μM SPT5-CTR-mCherry or SPT5-CTR-TE-mCherry in the presence of 10% PEG-8000. F Droplet number (top) and droplet area (bottom) analyses are shown. Central band is median; boxes represent 1st and 3rd quartile (25th and 75th percentile, respectively) and whiskers 1.5× interquartile range. Results are representative of two biological replicates, each n > 6. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. AFF4-IDR + SPT5-CTR-TE vs. AFF4-IDR + SPT5-CTR, **p = 0.0029."}
{"words": ["Figure", "7A", "Confocal", "images", "showing", "co", "-", "localization", "of", "AFF4", "with", "SPT5", "in", "nuclear", "puncta", "in", "AFF4", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "R258W", "cells", ".", "B", "Dotplot", "(", "left", ")", "showing", "the", "AFF4", "or", "SPT5", "puncta", "area", "in", "AFF4", "WT", "or", "R258W", "cells", "(", "Fig", "7A", ")", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "AFF4", "R258W", "vs", ".", "WT", ",", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0254", ".", "Violin", "plot", "(", "right", ")", "showing", "the", "Pearson", "correlation", "coefficient", "of", "co", "-", "localization", "ratio", "(", "Fig", "7A", ")", ".", "Each", "n", ">", "20", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "AFF4", "R258W", "vs", ".", "WT", ",", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0166", ".", "CC", "Droplet", "experiments", "showing", "that", "CHOPS", "syndrome", "patient", "missense", "mutations", "reinforced", "AFF4", "-", "ALF", "domain", "droplet", "formation", ".", "D", "Dotplot", "showing", "the", "droplet", "areas", "in", "Fig", "7C", ".", "Fields", "per", "condition", "n", "=", "5", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "T254S", ",", "T254A", "or", "R258W", "vs", ".", "WT", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "E", "AFF4", "-", "ALF", "-", "mCherry", "condensed", "fraction", "as", "a", "function", "of", "AFF4", "-", "ALF", "-", "mCherry", "concentration", "for", "experiments", "in", "Fig", "7C", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "Fields", "per", "condition", "n", "=", "5", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "T254S", ",", "T254A", "or", "R258W", "vs", ".", "WT", ",", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ".", "FK", "-", "N", "ChIP", "-", "qPCR", "showing", "the", "occupancies", "of", "Pol", "II", "(", "K", ")", ",", "AFF4", "(", "L", ")", ",", "SPT5", "(", "M", ")", ",", "and", "PAF1", "(", "N", ")", "at", "the", "promoter", "and", "gene", "body", "of", "HSP70", "in", "AFF4", "WT", "and", "R258W", "HEK", "-", "293T", "cells", "after", "heat", "shock", "for", "2", "hours", ".", "The", "HEMO", "gene", "serves", "as", "a", "negative", "control", "for", "ChIP", "-", "qPCR", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "means", ".", "Results", "are", "plotted", "with", "four", "technical", "repeats", "from", "two", "biological", "replicates", ".", "Two", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "performed", ".", "For", "Pol", "II", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "HSP70", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0002", ".", "For", "AFF4", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "HSP70", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ".", "For", "SPT5", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "<", " ", "0", ".", "0001", ";", "HSP70", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0086", ".", "For", "PAF1", "ChIP", ",", "HSP70", "_", "promoter", ",", "*", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0007", ";", "HSP70", "_", "gene", "body", ",", "*", "*", "p", " ", "=", " ", "0", ".", "0021", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Confocal images showing co-localization of AFF4 with SPT5 in nuclear puncta in AFF4 wild type (WT) or R258W cells. B Dotplot (left) showing the AFF4 or SPT5 puncta area in AFF4 WT or R258W cells (Fig 7A). Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. AFF4 R258W vs. WT, *p = 0.0254. Violin plot (right) showing the Pearson correlation coefficient of co-localization ratio (Fig 7A). Each n > 20. Results are representative of three biological replicates. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. AFF4 R258W vs. WT, *p = 0.0166. CC Droplet experiments showing that CHOPS syndrome patient missense mutations reinforced AFF4-ALF domain droplet formation. D Dotplot showing the droplet areas in Fig 7C. Fields per condition n = 5. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. T254S, T254A or R258W vs. WT, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. E AFF4-ALF-mCherry condensed fraction as a function of AFF4-ALF-mCherry concentration for experiments in Fig 7C. Error bars represent standard deviations. Fields per condition n = 5. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. T254S, T254A or R258W vs. WT, *p < 0.05, **p < 0.01. FK-N ChIP-qPCR showing the occupancies of Pol II (K), AFF4 (L), SPT5 (M), and PAF1 (N) at the promoter and gene body of HSP70 in AFF4 WT and R258W HEK-293T cells after heat shock for 2 hours. The HEMO gene serves as a negative control for ChIP-qPCR. Error bars represent standard error of means. Results are plotted with four technical repeats from two biological replicates. Two-tailed, unpaired Student's t test was performed. For Pol II ChIP, HSP70_promoter, ***p < 0.0001; HSP70_gene body, ***p = 0.0002. For AFF4 ChIP, HSP70_promoter, ***p < 0.0001; HSP70_gene body, ***p < 0.0001. For SPT5 ChIP, HSP70_promoter, ***p < 0.0001; HSP70_gene body, **p = 0.0086. For PAF1 ChIP, HSP70_promoter, ***p = 0.0007; HSP70_gene body, **p = 0.0021. "}
{"words": ["Figure", "1Western", "blot", "analysis", "and", "quantitation", "of", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "proteins", "in", "the", "livers", "of", "WT", "mice", "at", "3", ",", "9", "and", "24", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "α", "-", "tubulin", ",", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "and", "quantitation", "of", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "proteins", "in", "the", "livers", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "WT", "mice", "under", "fasted", "(", "overnight", ")", "or", "ad", "libitum", "fed", "conditions", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "α", "-", "tubulin", ",", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "and", "quantitation", "of", "ERAD", "proteins", "in", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "livers", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Growth", "curves", "of", "male", "(", "n", "=", "10", "each", ")", "and", "female", "(", "n", "=", "7", "each", ")", "mice", ".", "Representative", "images", "(", "E", ")", "and", "nose", "-", "to", "-", "anus", "length", "(", "F", ")", "of", "male", "mice", "at", "6", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "Organ", "-", "to", "-", "body", "-", "weight", "ratios", "of", "liver", "and", "kidney", "in", "6", "-", "week", "-", "old", "male", "mice", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Daily", "food", "intake", "(", "g", "/", "d", ")", "normalized", "to", "gram", "of", "body", "weight", "(", "gbw", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "measured", "over", "3", "days", ")", ".", "Representative", "estrus", "cycle", "mapping", "in", "2", "-", "4", "-", "month", "old", "females", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "H", "&", "E", "images", "of", "paraffin", "-", "embedded", "liver", "sections", "from", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "cell", "death", "(", "cleaved", "and", "pro", "-", "caspase", "-", "3", ")", "in", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", ",", "with", "WT", "ileum", "as", "positive", "control", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Representative", "transmission", "electron", "microscope", "(", "TEM", ")", "images", "obtained", "from", "9", "-", "week", "-", "old", "female", "mice", "livers", "(", "n", "=", "10", "-", "12", "cells", "from", "one", "mouse", "each", ")", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "mito", ",", "mitochondria", ";", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Western blot analysis and quantitation of Sel1L-Hrd1 ERAD proteins in the livers of WT mice at 3, 9 and 24 weeks of age (n=3-6 per group, 2 independent repeats). α-tubulin, loading controls for Western blot analysis.Western blot analysis and quantitation of Sel1L-Hrd1 ERAD proteins in the livers of 10-week-old WT mice under fasted (overnight) or ad libitum fed conditions (n=3-6 per group, 2 independent repeats). α-tubulin, loading controls for Western blot analysis.Western blot analysis and quantitation of ERAD proteins in Sel1Lf/f and Sel1LAlb livers (n=4 per group, 3 independent repeats). Hsp90 loading controls for Western blot analysis.Growth curves of male (n=10 each) and female (n=7 each) mice.Representative images (E) and nose-to-anus length (F) of male mice at 6 weeks of age (n=6-10 per group).Organ-to-body-weight ratios of liver and kidney in 6-week-old male mice (n=6 per group, 3 independent repeats).Daily food intake (g/d) normalized to gram of body weight (gbw) (n=3 per group, measured over 3 days).Representative estrus cycle mapping in 2-4-month old females (n=6 per group).H&E images of paraffin-embedded liver sections from 9-week-old mice (n=4 per group, 3 independent repeats).Western blot analysis of cell death (cleaved and pro-caspase-3) in livers of 9-week-old mice, with WT ileum as positive control (n=3 per group, 3 independent repeats). Hsp90 loading controls for Western blot analysis.Representative transmission electron microscope (TEM) images obtained from 9-week-old female mice livers (n=10-12 cells from one mouse each). N, nucleus; mito, mitochondria; ER, endoplasmic reticulum."}
{"words": ["Figure", "2Volcano", "plot", "depicting", "transcriptomics", "data", "from", "the", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ";", "dotted", "line", "marks", "p", "=", "0", ".", "05", ";", "black", "dots", "represent", "fold", "change", ">", "2", ".", "qPCR", "analyses", "of", "Fgf21", "expression", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "livers", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "Fgf21", "expression", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "livers", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "α", "-", "tubulin", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "ELISA", "analysis", "of", "Fgf21", "in", "serum", "from", "8", "-", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "6", "-", "7", "per", "group", ")", ".", "Protein", "levels", "of", "Sel1L", "(", "left", "panel", ")", "and", "mRNA", "levels", "of", "Fgf21", "(", "right", "panel", ")", "in", "primary", "mouse", "hepatocytes", "isolated", "from", "the", "tamoxifen", "-", "inducible", "Sel1L", "-", "knockout", "Sel1LERCre", "mice", "(", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Acute", "loss", "-", "of", "-", "function", "model", "where", "8", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "either", "AAV8", "-", "Cre", "or", "control", "AAV8", "-", "GFP", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "hepatic", "and", "control", "adipose", "Sel1L", "protein", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ";", "Hsp90", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Acute", "loss", "-", "of", "-", "function", "model", "where", "8", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "either", "AAV8", "-", "Cre", "or", "control", "AAV8", "-", "GFP", ":", "qPCR", "analysis", "of", "hepatic", "Fgf21", "expression", "and", "ELISA", "analysis", "of", "serum", "Fgf21", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Heatmaps", "of", "top", "15", "significantly", "upregulated", "and", "downregulated", "genes", "in", "Fgf21", "Tg", "livers", "and", "their", "expression", "levels", "in", "Sel1LAlb", "livers", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ".", "Scatter", "plot", "depicting", "the", "logarithmic", "fold", "-", "change", "(", "FC", ")", "for", "16", ",", "402", "genes", "in", "Sel1LAlb", "and", "Fgf21", "transgenic", "(", "Tg", ")", "livers", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ";", "genes", "that", "are", "highly", "upregulated", "or", "downregulated", "in", "both", "datasets", "are", "marked", "in", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ";", "genes", "that", "are", "upregulated", "unique", "to", "each", "data", "set", "(", "e", ".", "g", ".", "Derl3", "for", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "-", "deficient", "liver", ")", "are", "marked", "in", "green", ".", "Data", "from", "rescue", "experiments", "where", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "AAV8", "-", "shFgf21", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ":", "qPCR", "analysis", "of", "Fgf21", "mRNA", "3", "weeks", "after", "injection", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Data", "from", "rescue", "experiments", "where", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "AAV8", "-", "shFgf21", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ":", "ELISA", "analysis", "of", "Fgf21", "in", "serum", "(", "K", ")", "3", "weeks", "after", "injection", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "Data", "from", "rescue", "experiments", "where", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "AAV8", "-", "shFgf21", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ":", "Weight", "gain", "curve", "after", "injection", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Volcano plot depicting transcriptomics data from the livers of 9-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice (n=3 per group); dotted line marks p=0.05; black dots represent fold change>2.qPCR analyses of Fgf21 expression in 9-week-old livers (n=3-6 per group, 3 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Western blot analyses of Fgf21 expression in 9-week-old livers (n=3-6 per group, 3 independent repeats). α-tubulin, loading control for Western blot analysis.ELISA analysis of Fgf21 in serum from 8-9-week-old mice (n=6-7 per group).Protein levels of Sel1L (left panel) and mRNA levels of Fgf21 (right panel) in primary mouse hepatocytes isolated from the tamoxifen-inducible Sel1L-knockout Sel1LERCre mice (2 independent repeats). Hsp90 , loading control for Western blot analysis. Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Acute loss-of-function model where 8-week-old Sel1Lf/f mice were injected i.v. with either AAV8-Cre or control AAV8-GFP: Western blot analysis of hepatic and control adipose Sel1L protein (n=3 per group); Hsp90 loading control for Western blot analysis.Acute loss-of-function model where 8-week-old Sel1Lf/f mice were injected i.v. with either AAV8-Cre or control AAV8-GFP: qPCR analysis of hepatic Fgf21 expression and ELISA analysis of serum Fgf21 (n=3 per group, 2 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Heatmaps of top 15 significantly upregulated and downregulated genes in Fgf21 Tg livers and their expression levels in Sel1LAlb livers (n=3 per group).Scatter plot depicting the logarithmic fold-change (FC) for 16,402 genes in Sel1LAlb and Fgf21 transgenic (Tg) livers (n=3 per group); genes that are highly upregulated or downregulated in both datasets are marked in red and blue, respectively; genes that are upregulated unique to each data set (e.g. Derl3 for Sel1L-Hrd1 ERAD-deficient liver) are marked in green.Data from rescue experiments where 5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. with AAV8-shFgf21 or control AAV8-shLuc: qPCR analysis of Fgf21 mRNA 3 weeks after injection (n=4 per group). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Data from rescue experiments where 5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. with AAV8-shFgf21 or control AAV8-shLuc: ELISA analysis of Fgf21 in serum (K) 3 weeks after injection (n=4 per group).Data from rescue experiments where 5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. with AAV8-shFgf21 or control AAV8-shLuc: Weight gain curve after injection (n=7 per group)."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "of", "p", "-", "Stat5", "in", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ",", "with", "quantitation", "of", "the", "ratio", "of", "p", "-", "to", "total", "Stat5", "shown", "below", "the", "blot", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "qPCR", "analysis", "of", "p", "-", "Stat5", "-", "associated", "growth", "genes", "in", "the", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Z", "ambulatory", "activity", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "male", "mice", "as", "measured", "over", "24", "hr", "(", "n", "=", "4", "males", "per", "group", ")", ".", "Blood", "glucose", "levels", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "6", "hr", "fasting", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "serum", "insulin", "levels", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "6", "hr", "fasting", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "serum", "triglyceride", "(", "TG", ")", "levels", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "6", "hr", "fasting", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "serum", "cholesterol", "(", "CHOL", ")", "levels", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "6", "hr", "fasting", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "H", "&", "E", "images", "of", "inguinal", "white", "adipose", "tissue", "(", "iWAT", ")", "from", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "browning", "-", "related", "genes", "in", "iWAT", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "per", "group", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Ucp1", "in", "iWAT", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Weight", "gain", "curve", "of", "male", "mice", "after", "60", "%", "high", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "starting", "at", "5", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Adipose", "tissue", "weight", "normalized", "to", "body", "weight", "in", "male", "mice", "following", "9", "weeks", "of", "HFD", "feeding", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis of p-Stat5 in livers of 9-week-old mice (n=3 per group, 3 independent repeats), with quantitation of the ratio of p- to total Stat5 shown below the blot. Hsp90, loading control for Western blot analysis.qPCR analysis of p-Stat5-associated growth genes in the livers of 9-week-old mice (n=6 per group, 2 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Z ambulatory activity of 9-week-old male mice as measured over 24 hr (n=4 males per group).Blood glucose levels in 9-week-old mice after 6 hr fasting (n=6-10 per group).serum insulin levels in 9-week-old mice after 6 hr fasting (n=6-10 per group).serum triglyceride (TG) levels in 9-week-old mice after 6 hr fasting (n=6-10 per group).serum cholesterol (CHOL) levels in 9-week-old mice after 6 hr fasting (n=6-10 per group).H&E images of inguinal white adipose tissue (iWAT) from 8-week-old mice (n=3 per group, 2 independent repeats).qPCR analysis of browning-related genes in iWAT (n=3-6 per group). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Western blot analysis of Ucp1 in iWAT of 8-week-old mice (n=3-4 per group, 3 independent repeats). Hsp90, loading control for Western blot analysis.Weight gain curve of male mice after 60% high fat diet (HFD) starting at 5 weeks of age (n=4 per group, 2 independent repeats).Adipose tissue weight normalized to body weight in male mice following 9 weeks of HFD feeding (n=4 per group)."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", ",", "Crebh", "-", "N", ",", "Pparα", "and", "Xbp1s", "in", "whole", "cell", "lysates", "(", "A", ")", "and", "nuclear", "extracts", "(", "B", ")", "in", "WT", "and", "Sel1LAlb", "livers", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "3", "independent", "repeats", ")", "with", "quantitation", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Hsp90", "lamin", ",", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Crebh", ",", "Ppara", "and", "Xbp1s", "in", "WT", "and", "Sel1LAlb", "livers", "(", "n", "=", "4", "-", "6", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", "in", "acute", "Sel1L", "loss", "of", "function", "model", "as", "described", "in", "Figure", "2F", "-", "G", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", "protein", "in", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "WT", "mice", "injected", "i", ".", "p", ".", "with", "tunicamycin", "(", "Tm", ",", "1", ".", "5", "µg", "/", "g", "body", "weight", ")", "for", "72", "hours", "were", "included", "as", "a", "control", ".", "Hsp90", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", "in", "the", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "after", "NP40", "-", "detergent", "fractionation", "into", "NP40", "soluble", "(", "NP40S", ")", "and", "pellet", "(", "NP40P", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", "H2A", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "Crebh", "in", "the", "liver", "cryosections", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", "(", "zoomed", "out", "versions", "in", "Figure", "EV3F", ")", ".", "Note", "that", "a", "fraction", "of", "hepatocytes", "is", "binucleated", ".", "Yellow", "arrows", "represent", "Crebh", "staining", "inside", "in", "the", "hepatocyte", "nucleus", ".", "ChIP", "analysis", "of", "Crebh", "binding", "onto", "the", "Fgf21", "promoter", "in", "the", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", ",", "normalized", "first", "to", "5", "%", "input", "group", "and", "then", "to", "no", "-", "antibody", "ChIP", "samples", "(", "n", "=", "3", "pooled", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "SEL1L", ",", "HRD1", "and", "CREBH", "proteins", "in", "human", "Hep3B", "hepatocytes", "upon", "CRISPR", "deletion", "of", "SEL1L", "with", "two", "different", "guides", ".", ",", "β", "-", "actin", "loading", "controls", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SEL1L", ",", "HRD1", "and", "FGF21", "(", "K", ")", "in", "human", "Hep3B", "hepatocytes", "upon", "CRISPR", "deletion", "of", "SEL1L", "with", "two", "different", "guides", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis of Crebh, Crebh-N, Pparα and Xbp1s in whole cell lysates (A) and nuclear extracts (B) in WT and Sel1LAlb livers (n=3 per group, 3 independent repeats) with quantitation shown in (C). Hsp90 lamin, loading controls for Western blot analysis.qPCR analysis of Crebh, Ppara and Xbp1s in WT and Sel1LAlb livers (n=4-6 per group, 2 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.Western blot analysis of Crebh in acute Sel1L loss of function model as described in Figure 2F-G (n=3 per group). Hsp90 , loading controls for Western blot analysis.Western blot analysis of Crebh protein in 9-week-old mice (n=3 per group, 2 independent repeats). WT mice injected i.p. with tunicamycin (Tm, 1.5 µg/g body weight) for 72 hours were included as a control. Hsp90 loading controls for Western blot analysis.Western blot analysis of Crebh in the livers of 9-week-old mice after NP40-detergent fractionation into NP40 soluble (NP40S) and pellet (NP40P) (n=3 per group, 2 independent repeats). Hsp90 H2A loading controls for Western blot analysis.Representative confocal images of Crebh in the liver cryosections of 8-week-old mice (zoomed out versions in Figure EV3F). Note that a fraction of hepatocytes is binucleated. Yellow arrows represent Crebh staining inside in the hepatocyte nucleus.ChIP analysis of Crebh binding onto the Fgf21 promoter in the livers of 9-week-old mice, normalized first to 5% input group and then to no-antibody ChIP samples (n=3 pooled per group, 2 independent repeats).Western blot analysis of SEL1L, HRD1 and CREBH proteins in human Hep3B hepatocytes upon CRISPR deletion of SEL1L with two different guides. , β-actin loading controls for Western blot analysis.qPCR analysis of SEL1L, HRD1 and FGF21 (K) in human Hep3B hepatocytes upon CRISPR deletion of SEL1L with two different guides. Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis."}
{"words": ["Figure", "5Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", "protein", "half", "-", "life", "in", "transfected", "WT", "and", "HRD1", "-", "/", "-", "HEK293T", "cells", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "indicated", "times", ".", "The", "decay", "of", "protein", "from", "one", "experiment", "is", "shown", "below", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "and", "quantitation", "of", "Crebh", "in", "Crebh", "-", "transfected", "WT", "(", "B", ")", "and", "HRD1", "-", "/", "-", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "the", "proteasomal", "inhibitor", "bortezomib", "(", "BTZ", ")", "or", "lysosomal", "inhibitor", "chloroquine", "(", "CHQ", ")", "for", "2", "hours", "and", "then", "with", "CHX", "for", "additional", "1", "hour", "(", "n", "=", "2", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Crebh", "ubiquitination", "following", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "of", "Crebh", "-", "Flag", "and", "Crebh", "-", "N", "-", "Flag", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", ".", "Samples", "were", "boiled", "with", "SDS", "before", "IP", "for", "denaturing", "IP", "and", "not", "so", "for", "native", "IP", ".", "These", "cells", "were", "treated", "with", "proteasomal", "inhibitor", "BTZ", "for", "the", "last", "6", "hr", "prior", "to", "immunoprecipitation", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "endoglycosidase", "H", "(", "endoH", ")", "-", "sensitivity", "of", "Crebh", "in", "the", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", ";", "'", "r", "'", "refers", "to", "endoH", "-", "cleavage", "-", "resistant", "species", "and", "'", "s", "'", "refers", "to", "endoH", "-", "cleavage", "-", "sensitive", "species", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Western blot analysis of Crebh protein half-life in transfected WT and HRD1-/- HEK293T cells treated with cycloheximide (CHX) for indicated times. The decay of protein from one experiment is shown below. Hsp90, loading control for Western blot analysis.Western blot analysis and quantitation of Crebh in Crebh-transfected WT (B) and HRD1-/- (C) HEK293T cells pre-treated with the proteasomal inhibitor bortezomib (BTZ) or lysosomal inhibitor chloroquine (CHQ) for 2 hours and then with CHX for additional 1 hour (n=2 per group, 2 independent repeats). Hsp90, loading control for Western blot analysis.Western blot analysis of Crebh ubiquitination following immunoprecipitation (IP) of Crebh-Flag and Crebh-N-Flag in HEK293T cells transfected with indicated plasmids. Samples were boiled with SDS before IP for denaturing IP and not so for native IP. These cells were treated with proteasomal inhibitor BTZ for the last 6 hr prior to immunoprecipitation. Hsp90, loading control for Western blot analysis.Western blot analysis of endoglycosidase H (endoH)-sensitivity of Crebh in the livers of 9-week-old mice; 'r' refers to endoH-cleavage-resistant species and 's' refers to endoH-cleavage-sensitive species (n=3 per group, 2 independent repeats). Hsp90, loading control for Western blot analysis."}
{"words": ["Figure", "65", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "hepatic", "Sel1L", "and", "Crebh", "5", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Crebh", "and", "Fgf21", "mRNA", "5", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "ELISA", "analysis", "of", "circulating", "Fgf21", "(", "C", ")", "5", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "qPCR", "analysis", "of", "hepatic", "growth", "-", "associated", "genes", "5", "weeks", "after", "injection", "(", "n", "=", "6", "per", "group", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "Weight", "gain", "6", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "Insulin", "tolerance", "test", "(", "ITT", ")", "5", "-", "weeks", "after", "injection", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "qPCR", "of", "Ucp1", "levels", "in", "inguinal", "white", "adipose", "tissue", "(", "iWAT", ")", "5", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Ribosomal", "L32", ",", "loading", "control", "for", "qPCR", "analysis", ".", "5", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "once", "with", "AAV8", "-", "shCrebh", "or", "control", "AAV8", "-", "shLuc", ".", "Western", "blot", "analysis", "(", "H", ")", "of", "Ucp1", "levels", "in", "inguinal", "white", "adipose", "tissue", "(", "iWAT", ")", "5", "weeks", "post", "injection", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "2", "independent", "repeats", ")", ".", "Hsp90", ",", "loading", "control", "for", "Western", "blot", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 65-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. Western blot analysis of hepatic Sel1L and Crebh 5 weeks post injection (n=3 mice each, 2 independent repeats). Hsp90, loading control for Western blot analysis.5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. qPCR analysis of Crebh and Fgf21 mRNA 5 weeks post injection (n=3 per group, 2 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. ELISA analysis of circulating Fgf21 (C) 5 weeks post injection (n=3 per group, 2 independent repeats).5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. qPCR analysis of hepatic growth-associated genes 5 weeks after injection (n=6 per group). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. Weight gain 6 weeks post injection (n=10 per group).5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. Insulin tolerance test (ITT) 5-weeks after injection (n=10 per group).5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. qPCR of Ucp1 levels in inguinal white adipose tissue (iWAT) 5 weeks post injection (n=3 per group, 2 independent repeats). Ribosomal L32, loading control for qPCR analysis.5-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice were injected i.v. once with AAV8-shCrebh or control AAV8-shLuc. Western blot analysis (H) of Ucp1 levels in inguinal white adipose tissue (iWAT) 5 weeks post injection (n=3 per group, 2 independent repeats). Hsp90, loading control for Western blot analysis."}
{"words": ["Figure", "7Analysis", "of", "correlation", "between", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "-", "Fgf21", "during", "fasting", "-", "feeding", "Western", "blot", "analysis", "of", "hepatic", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "of", "nuclear", "(", "Nuc", ")", "and", "cytosolic", "(", "Cyto", ")", "fractions", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "under", "overnight", "fasted", "or", "fed", "states", ".", "Analysis", "of", "correlation", "between", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "-", "Fgf21", "during", "fasting", "-", "feeding", "Quantitation", "of", "levels", "of", "Sel1L", "/", "Hrd1", "/", "Crebh", "proteins", "and", "Fgf21", "mRNA", "in", "the", "livers", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "mice", ".", "during", "fasting", "-", "feeding", "Quantitation", "of", "total", "Crebh", "(", "Crebh", "+", "Crebh", "-", "N", ")", "protein", "levels", "in", "the", "livers", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", ".", "during", "fasting", "-", "feeding", "Serum", "Fgf21", "levels", "in", "10", "-", "week", "-", "old", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", ".", "Analysis", "of", "correlation", "between", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "-", "Fgf21", "during", "growth", "Western", "blot", "analysis", "of", "hepatic", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "of", "nuclear", "(", "Nuc", ")", "and", "cytosolic", "(", "Cyto", ")", "fractions", "from", "the", "livers", "from", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "at", "3", ",", "9", "and", "24", "weeks", "of", "age", ".", "Analysis", "of", "correlation", "between", "Sel1L", "-", "Hrd1", "ERAD", "and", "Crebh", "-", "Fgf21", "during", "growth", "Quantitation", "of", "levels", "of", "Sel1L", "/", "Hrd1", "/", "Crebh", "proteins", "and", "Fgf21", "mRNA", "with", "the", "livers", "from", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "at", "3", ",", "9", "and", "24", "weeks", "of", "age", ".", "Quantitation", "of", "total", "Crebh", "(", "Crebh", "+", "Crebh", "-", "N", ")", "protein", "levels", "in", "the", "livers", "from", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "at", "3", ",", "9", "and", "24", "weeks", "of", "age", ".", "Serum", "Fgf21", "levels", "in", "the", "livers", "from", "Sel1Lf", "/", "f", "and", "Sel1LAlb", "mice", "at", "3", ",", "9", "and", "24", "weeks", "of", "age", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Analysis of correlation between Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh-Fgf21 during fasting-feeding Western blot analysis of hepatic Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh of nuclear (Nuc) and cytosolic (Cyto) fractions from 10-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice under overnight fasted or fed states.Analysis of correlation between Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh-Fgf21 during fasting-feeding Quantitation of levels of Sel1L/Hrd1/Crebh proteins and Fgf21 mRNA in the livers of 10-week-old Sel1Lf/f mice.during fasting-feeding Quantitation of total Crebh (Crebh+Crebh-N) protein levels in the livers of 10-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice.during fasting-feeding Serum Fgf21 levels in 10-week-old Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice.Analysis of correlation between Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh-Fgf21 during growth Western blot analysis of hepatic Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh of nuclear (Nuc) and cytosolic (Cyto) fractions from the livers from Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice at 3, 9 and 24 weeks of age.Analysis of correlation between Sel1L-Hrd1 ERAD and Crebh-Fgf21 during growth Quantitation of levels of Sel1L/Hrd1/Crebh proteins and Fgf21 mRNA with the livers from Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice at 3, 9 and 24 weeks of age.Quantitation of total Crebh (Crebh+Crebh-N) protein levels in the livers from Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice at 3, 9 and 24 weeks of age.Serum Fgf21 levels in the livers from Sel1Lf/f and Sel1LAlb mice at 3, 9 and 24 weeks of age."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "b", ")", "Upper", "panel", ":", "Representative", "images", "of", "BOEC", "colonies", "from", "PBMC", "cultivation", "10", "days", "post", "-", "seeding", ".", "Dotted", "line", "in", "each", "image", "outlines", "a", "BOEC", "colony", ".", "Lower", "panel", ":", "Stabilized", "BOEC", "cultures", "after", "passaging", "of", "colonies", "(", "scale", "bar", ",", "250", "µm", ")", ".", "(", "c", ")", "Proliferation", "doubling", "time", "for", "NAFLD", "and", "healthy", "BOECs", "based", "on", "passages", "2", "and", "3", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "9", "healthy", ",", "n", "=", "7", "NAFLD", ";", "with", "3", "biological", "replicates", "per", "donor", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "not", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "d", ")", "Left", "panel", ":", "Flow", "cytometry", "characterization", "of", "BOECs", "for", "endothelial", ",", "leukocyte", "and", "progenitor", "cell", "markers", "(", "grey", "-", "isotype", "control", ";", "red", "/", "blue", "/", "green", "/", "purple", "-", "cell", "lineage", "marker", "staining", ")", ".", "HUVEC", "and", "monocytic", "THP", "-", "1", "cells", "were", "used", "as", "positive", "controls", "for", "endothelial", "and", "leukocytic", "markers", "respectively", ".", "Right", "panel", ":", "Percentages", "of", "positively", "expressing", "cells", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "4", "-", "6", "healthy", ",", "n", "=", "2", "-", "7", "NAFLD", ".", "(", "e", ")", "Representative", "images", "of", "immunostaining", "for", "endothelial", "markers", ",", "PECAM1", "and", "CDH5", "(", "scale", "bar", ",", "100", "µm", ")", ".", "(", "f", ")", "Left", "panel", ":", "Longitudinal", "monitoring", "of", "BOEC", "angiogenesis", "in", "fibrin", "gel", "bead", "-", "based", "sprouting", "assays", "over", "24h", "(", "representative", "images", ";", "scale", "bar", ",", "100", "µm", ")", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "-", "whisker", "plots", "of", "quantifications", "of", "sprout", "lengths", "and", "numbers", "of", "sprout", "per", "bead", "at", "24h", ".", "n", "=", "3", "healthy", ",", "n", "=", "3", "NAFLD", ",", "with", "4", "-", "5", "beads", "analyzed", "per", "donor", "and", "5", "-", "11", "sprouts", "per", "bead", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(b) Upper panel: Representative images of BOEC colonies from PBMC cultivation 10 days post-seeding. Dotted line in each image outlines a BOEC colony. Lower panel: Stabilized BOEC cultures after passaging of colonies (scale bar, 250 µm). (c) Proliferation doubling time for NAFLD and healthy BOECs based on passages 2 and 3. Sample sizes are n = 9 healthy, n = 7 NAFLD; with 3 biological replicates per donor. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, not significant (t-test).(d) Left panel: Flow cytometry characterization of BOECs for endothelial, leukocyte and progenitor cell markers (grey - isotype control; red/blue/green/purple - cell lineage marker staining). HUVEC and monocytic THP-1 cells were used as positive controls for endothelial and leukocytic markers respectively. Right panel: Percentages of positively expressing cells. Sample sizes are n = 4-6 healthy, n = 2-7 NAFLD.(e) Representative images of immunostaining for endothelial markers, PECAM1 and CDH5 (scale bar, 100 µm).(f) Left panel: Longitudinal monitoring of BOEC angiogenesis in fibrin gel bead-based sprouting assays over 24h (representative images; scale bar, 100 µm). Right panel: Box-whisker plots of quantifications of sprout lengths and numbers of sprout per bead at 24h. n = 3 healthy, n = 3 NAFLD, with 4-5 beads analyzed per donor and 5-11 sprouts per bead."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "b", ")", "Volcano", "plot", "depicting", "differentially", "expressed", "genes", "comparing", "NAFLD", "BOECs", "with", "healthy", "BOECs", ".", "Red", "and", "blue", "dots", "represent", "upregulated", "and", "downregulated", "genes", "in", "NAFLD", "BOECs", ",", "respectively", ".", "(", "e", ")", "Heatmap", "featuring", "the", "genes", "in", "MCODE", "Cluster", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(b) Volcano plot depicting differentially expressed genes comparing NAFLD BOECs with healthy BOECs. Red and blue dots represent upregulated and downregulated genes in NAFLD BOECs, respectively.(e) Heatmap featuring the genes in MCODE Cluster 1."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "a", ")", "Fold", "change", "in", "gene", "expressions", "of", "CXCL10", ",", "CXCL11", ",", "CXCL12", ",", "CCL20", "and", "CX3CL1", "in", "NAFLD", "(", "n", "=", "10", ")", "BOECs", ",", "normalized", "to", "healthy", "(", "n", "=", "12", ")", "BOECs", ",", "with", "2", "technical", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "c", ")", "Fold", "change", "in", "gene", "expressions", "of", "CXCL10", ",", "CXCL11", ",", "CXCL12", ",", "CCL20", "and", "CX3CL1", "in", "LPS", "+", "FFA", "-", "treated", "or", "non", "-", "treated", "NAFLD", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "healthy", "(", "n", "=", "5", ")", "BOECs", ",", "normalized", "to", "non", "-", "treated", "healthy", "BOECs", ",", "with", "3", "technical", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "b", ")", "Left", ":", "Representative", "images", "showing", "non", "-", "treated", "and", "LPS", "+", "FFA", "-", "treated", "NAFLD", "and", "healthy", "BOECs", ",", "stained", "with", "Nile", "Red", "(", "scale", "bars", ",", "100", "µm", ")", ".", "Right", ":", "Fluorescence", "intensity", "of", "intracellular", "Nile", "Red", "stain", "was", "quantified", "at", "515", "/", "585nm", ",", "and", "readings", "were", "normalized", "with", "blanks", "(", "n", "=", "3", "donors", "/", "group", ")", ".", "(", "d", ")", "Protein", "concentrations", "of", "chemokines", "in", "the", "conditioned", "culture", "media", "of", "healthy", "and", "NAFLD", "BOECs", ".", "*", "(", "e", ")", "Left", ":", "Representative", "images", "(", "Bright", "field", ";", "DAPI", ",", "nuclei", ";", "CDH5", ",", "endothelial", "cells", ";", "CXCL12", ")", "of", "liver", "sections", "from", "chow", "diet", "-", "fed", "and", "HFHC", "diet", "-", "fed", "humanized", "mice", "(", "scale", "bar", ",", "40", "μm", ")", ".", "Boxed", "regions", "were", "further", "magnified", "(", "scale", "bar", ",", "30", "µm", ")", ".", "Right", ":", "Box", "-", "whisker", "plot", "of", "Mander", "'", "s", "Coefficient", "(", "M2", ")", "that", "was", "a", "measure", "of", "the", "degree", "of", "CXCL12", "overlap", "with", "CDH5", "-", "positive", "vasculatures", "in", "the", "livers", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "Chow", "diet", "-", "fed", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "HFHC", "diet", "-", "fed", "(", "n", "=", "4", ")", "humanized", "mice", "were", "analysed", ",", "with", "10", "-", "20", "independent", "regions", "of", "interest", "per", "mouse", "were", "analysed", "for", "image", "quantification", ".", "(", "f", ")", "Left", ":", "Representative", "images", "(", "Bright", "field", ";", "DAPI", ",", "nuclei", ";", "CDH5", ",", "endothelial", "cells", ";", "CXCL12", ")", "of", "aortic", "sections", "from", "chow", "diet", "-", "fed", "and", "LIDPAD", "mice", "(", "scale", "bar", ",", "40", "μm", ")", ".", "Boxed", "regions", "were", "further", "magnified", "(", "scale", "bar", ",", "30", "µm", ")", ".", "Arrows", "point", "at", "aortic", "endothelial", "cells", ".", "AW", ":", "Aortic", "wall", ";", "L", ":", "lumen", ".", "Right", ":", "Box", "-", "whisker", "plot", "of", "CXCL12", "fluorescent", "intensity", "in", "the", "aortic", "vascular", "endothelia", ".", "CXCL12", "fluorescent", "intensity", "for", "each", "delimitated", "endothelial", "region", "is", "represented", "as", "individual", "data", "points", "on", "the", "plot", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "Chow", "diet", "-", "fed", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "LIDPAD", "diet", "-", "fed", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", "were", "analysed", ",", "with", "10", "-", "20", "delimitated", "endothelial", "regions", "per", "mouse", "analysed", "for", "image", "quantification", ".", "(", "g", ")", "Left", ":", "Representative", "images", "showing", "aortic", "sections", "harvested", "from", "mice", "fed", "with", "either", "chow", "or", "LIDPAD", "diet", ".", "Sections", "were", "stained", "for", "leukocyte", "markers", "CD45", "(", "red", ")", "to", "determine", "the", "extent", "of", "leukocyte", "infiltration", ".", "Dotted", "lines", "demarcate", "the", "aortic", "walls", "(", "AW", ")", ".", "L", ":", "lumen", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "µm", ".", "Right", ":", "Box", "-", "whisker", "plot", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "CD45", "signals", "as", "a", "readout", "for", "the", "amount", "of", "infiltrated", "CD45", "+", "leukocytes", "within", "the", "aortic", "walls", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ",", "with", "2", "tissue", "sections", "analyzed", "per", "animal", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(a) Fold change in gene expressions of CXCL10, CXCL11, CXCL12, CCL20 and CX3CL1 in NAFLD (n = 10) BOECs, normalized to healthy (n = 12) BOECs, with 2 technical replicates per donor. (c) Fold change in gene expressions of CXCL10, CXCL11, CXCL12, CCL20 and CX3CL1 in LPS+FFA-treated or non-treated NAFLD (n = 5) and healthy (n = 5) BOECs, normalized to non-treated healthy BOECs, with 3 technical replicates per donor.(b) Left: Representative images showing non-treated and LPS+FFA-treated NAFLD and healthy BOECs, stained with Nile Red (scale bars, 100 µm). Right: Fluorescence intensity of intracellular Nile Red stain was quantified at 515/585nm, and readings were normalized with blanks (n = 3 donors/ group).(d) Protein concentrations of chemokines in the conditioned culture media of healthy and NAFLD BOECs. *(e) Left: Representative images (Bright field; DAPI, nuclei; CDH5, endothelial cells; CXCL12) of liver sections from chow diet-fed and HFHC diet-fed humanized mice (scale bar, 40 μm). Boxed regions were further magnified (scale bar, 30 µm). Right: Box-whisker plot of Mander's Coefficient (M2) that was a measure of the degree of CXCL12 overlap with CDH5-positive vasculatures in the livers. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). Chow diet-fed (n = 4) and HFHC diet-fed (n = 4) humanized mice were analysed, with 10-20 independent regions of interest per mouse were analysed for image quantification.(f) Left: Representative images (Bright field; DAPI, nuclei; CDH5, endothelial cells; CXCL12) of aortic sections from chow diet-fed and LIDPAD mice (scale bar, 40 μm). Boxed regions were further magnified (scale bar, 30 µm). Arrows point at aortic endothelial cells. AW: Aortic wall; L: lumen. Right: Box-whisker plot of CXCL12 fluorescent intensity in the aortic vascular endothelia. CXCL12 fluorescent intensity for each delimitated endothelial region is represented as individual data points on the plot. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). Chow diet-fed (n = 3) and LIDPAD diet-fed (n = 3) mice were analysed, with 10-20 delimitated endothelial regions per mouse analysed for image quantification.(g) Left: Representative images showing aortic sections harvested from mice fed with either chow or LIDPAD diet. Sections were stained for leukocyte markers CD45 (red) to determine the extent of leukocyte infiltration. Dotted lines demarcate the aortic walls (AW). L: lumen. Scale bar: 20 µm. Right: Box-whisker plot of mean fluorescence intensity (MFI) of CD45 signals as a readout for the amount of infiltrated CD45+ leukocytes within the aortic walls. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). n = 3 mice per group, with 2 tissue sections analyzed per animal."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Upper", "panel", ":", "Single", "-", "cell", "UMAP", "of", "sequenced", "PBMCs", "from", "2", "NAFLD", "patients", "and", "4", "healthy", "subjects", ";", "n", "=", "10", ",", "786", "cells", ".", "We", "identified", "15", "distinct", "cell", "types", "by", "DICE", "annotation", ".", "Lower", "panel", ":", "Expression", "patterns", "of", "CXCR3", ",", "CXCR4", ",", "ACKR3", ",", "CX3CR1", ",", "CCR6", "across", "different", "cell", "types", "in", "NAFLD", "and", "healthy", "PBMC", "samples", ".", "(", "c", ")", "Graphic", "shows", "the", "percentage", "composition", "of", "identified", "cell", "types", "in", "NAFLD", "and", "healthy", "PBMCs", "single", "-", "cell", "analysis", ".", "(", "d", ")", "Upper", "panel", ":", "Representative", "flow", "cytometry", "dot", "plots", ",", "characterizing", "the", "isolated", "CD8", "+", "T", "cells", "and", "CD8", "-", "immune", "cell", "fraction", "(", "mainly", "CD4", "+", "T", "cells", ",", "NK", "cells", "and", "monocytes", ")", "from", "PBMCs", "of", "healthy", "and", "NAFLD", "subjects", ".", "Lower", "panel", ":", "Flow", "cytometry", "quantification", "of", "%", "of", "positively", "expressing", "CXCR4", "+", "and", "CX3CR1", "+", "cells", "within", "each", "immune", "subset", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "14", "NAFLD", ";", "n", "=", "6", "healthy", ".", "(", "e", ")", "Heatmap", "of", "gene", "expressions", "of", "endothelial", "antigens", "relevant", "to", "interaction", "with", "T", "lymphocytes", "in", "NAFLD", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "healthy", "(", "n", "=", "3", ")", "BOECs", ",", "with", "3", "biological", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "f", ")", "Upper", "panel", ":", "Representative", "flow", "cytometry", "histograms", "of", "HLA", "-", "A", "/", "B", "/", "C", ",", "HLA", "-", "DM", "and", "IFN", "-", "γR1", "expressions", "in", "NAFLD", "(", "red", ")", "and", "healthy", "(", "blue", ")", "BOECs", ".", "Grey", ",", "isotype", "control", ".", "Lower", "panel", ":", "Box", "-", "whisker", "plots", "reflect", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "a", ".", "u", ".", ",", "arbituary", "unit", ")", ",", "normalized", "to", "isotype", "control", ",", "as", "a", "readout", "for", "epitope", "density", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "4", "donors", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", "for", "HLA", "-", "A", "/", "B", "/", "C", "and", "IFN", "-", "γR1", ";", "t", "-", "test", "for", "HLA", "-", "DM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Upper panel: Single-cell UMAP of sequenced PBMCs from 2 NAFLD patients and 4 healthy subjects; n = 10,786 cells. We identified 15 distinct cell types by DICE annotation. Lower panel: Expression patterns of CXCR3, CXCR4, ACKR3, CX3CR1, CCR6 across different cell types in NAFLD and healthy PBMC samples.(c) Graphic shows the percentage composition of identified cell types in NAFLD and healthy PBMCs single-cell analysis.(d) Upper panel: Representative flow cytometry dot plots, characterizing the isolated CD8+ T cells and CD8- immune cell fraction (mainly CD4+ T cells, NK cells and monocytes) from PBMCs of healthy and NAFLD subjects. Lower panel: Flow cytometry quantification of % of positively expressing CXCR4+ and CX3CR1+ cells within each immune subset. Sample sizes are n = 14 NAFLD; n = 6 healthy.(e) Heatmap of gene expressions of endothelial antigens relevant to interaction with T lymphocytes in NAFLD (n = 3) and healthy (n = 3) BOECs, with 3 biological replicates per donor.(f) Upper panel: Representative flow cytometry histograms of HLA-A/B/C, HLA-DM and IFN-γR1 expressions in NAFLD (red) and healthy (blue) BOECs. Grey, isotype control. Lower panel: Box-whisker plots reflect mean fluorescence intensity (a.u., arbituary unit), normalized to isotype control, as a readout for epitope density. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test). n = 4 donors; *p<0.05; ns, not significant (Mann-Whitney test for HLA-A/B/C and IFN-γR1; t-test for HLA-DM)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "a", ")", "Left", ":", "Workflow", "schematic", "of", "adhesion", "assay", ".", "Middle", ":", "Representative", "images", "of", "labeled", "THP", "-", "1", "and", "Jurkat", "cells", "attached", "to", "BOEC", "monolayers", "(", "Scale", "bars", ",", "100", "µm", ")", ".", "Right", ":", "Box", "-", "whisker", "plots", "of", "the", "numbers", "of", "adhered", "leukocytes", "were", "determined", "fluorometrically", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "9", "NAFLD", "and", "n", "=", "7", "healthy", ",", "with", "3", "biological", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "b", ")", "Left", ":", "Schematic", "of", "chemotaxis", "assay", ".", "Right", ":", "Box", "-", "whisker", "plots", "of", "the", "numbers", "of", "recruited", "THP", "-", "1", "and", "Jurkat", "cells", "by", "the", "BOECs", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "(", "c", ")", "CD8", "+", "T", "cells", "and", "CD8", "-", "cell", "fractions", "were", "isolated", "from", "NAFLD", "and", "healthy", "subjects", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "show", "the", "number", "of", "recruited", "immune", "cells", "to", "their", "respective", "BOECs", "matched", "by", "health", "condition", "in", "coculture", "chemotaxis", "assays", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "11", "NAFLD", "and", "n", "=", "6", "healthy", ",", "with", "3", "-", "4", "technical", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "d", ")", "Box", "-", "whisker", "plots", "show", "percentages", "of", "inhibition", "on", "immune", "cells", "chemotaxis", "by", "treatment", "with", "AMD3100", "(", "CXCR4", "small", "molecule", "inhibitor", ")", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "6", "NAFLD", "and", "n", "=", "4", "healthy", ",", "with", "3", "-", "4", "technical", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "e", ")", "Box", "-", "whisker", "plots", "show", "percentages", "of", "inhibition", "on", "immune", "cells", "chemotaxis", "by", "treatment", "with", "anti", "-", "CXCL12", "IgG", "(", "CXCL12", "neutralizing", "antibody", ")", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Sample", "sizes", "are", "n", "=", "5", "NAFLD", "and", "n", "=", "3", "healthy", ",", "with", "3", "-", "4", "technical", "replicates", "per", "donor", ".", "(", "f", ")", "Left", ":", "Schematic", "of", "transendothelial", "migration", "assay", "with", "patient", "-", "derived", "BOECs", "and", "immune", "cells", ".", "Right", ":", "Transendothelial", "electric", "resistance", "(", "TEER", ")", "measurements", "of", "BOEC", "barrier", "tightness", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "PBMCs", "and", "/", "or", "AMD3100", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "Sample", "size", "is", "n", "=", "5", "patient", "samples", ",", "with", "3", "technical", "TEER", "readings", "recorded", "per", "sample", ".", "(", "g", ")", "Box", "-", "whisker", "plots", "of", "the", "numbers", "of", "circulating", "endothelial", "cells", "per", "million", "PBMCs", "in", "healthy", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "NAFLD", "subjects", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "Box", "-", "whisker", "plots", "indicate", "median", "(", "middle", "line", ")", ",", "25th", ",", "75th", "percentile", "(", "box", ")", "and", "the", "lowest", "/", "highest", "data", "points", "(", "whiskers", ")", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(a) Left: Workflow schematic of adhesion assay. Middle: Representative images of labeled THP-1 and Jurkat cells attached to BOEC monolayers (Scale bars, 100 µm). Right: Box-whisker plots of the numbers of adhered leukocytes were determined fluorometrically. Sample sizes are n = 9 NAFLD and n = 7 healthy, with 3 biological replicates per donor.(b) Left: Schematic of chemotaxis assay. Right: Box-whisker plots of the numbers of recruited THP-1 and Jurkat cells by the BOECs. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers).(c) CD8+ T cells and CD8- cell fractions were isolated from NAFLD and healthy subjects. Box-whisker plots show the number of recruited immune cells to their respective BOECs matched by health condition in coculture chemotaxis assays. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test). Sample sizes are n = 11 NAFLD and n = 6 healthy, with 3-4 technical replicates per donor.(d) Box-whisker plots show percentages of inhibition on immune cells chemotaxis by treatment with AMD3100 (CXCR4 small molecule inhibitor). Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test). Sample sizes are n = 6 NAFLD and n = 4 healthy, with 3-4 technical replicates per donor.(e) Box-whisker plots show percentages of inhibition on immune cells chemotaxis by treatment with anti-CXCL12 IgG (CXCL12 neutralizing antibody). Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test). Sample sizes are n = 5 NAFLD and n = 3 healthy, with 3-4 technical replicates per donor.(f) Left: Schematic of transendothelial migration assay with patient-derived BOECs and immune cells. Right: Transendothelial electric resistance (TEER) measurements of BOEC barrier tightness in the presence and absence of PBMCs and/or AMD3100. Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test). Sample size is n = 5 patient samples, with 3 technical TEER readings recorded per sample.(g) Box-whisker plots of the numbers of circulating endothelial cells per million PBMCs in healthy (n = 6) and NAFLD subjects (n = 11). Box-whisker plots indicate median (middle line), 25th, 75th percentile (box) and the lowest/ highest data points (whiskers). ns, non-significant (t-test)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", ".", "A", "FRET", "assay", "was", "used", "to", "measure", "the", "difference", "in", "melting", "temperature", "(", "ΔTm", ")", "of", "(", "G4C2", ")", "4", "RNA", "or", "DNA", "G", "-", "Qs", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "of", "138", "different", "small", "molecules", ".", "An", "increase", "in", "ΔTm", "indicates", "stabilisation", "of", "the", "G", "-", "Q", ".", "Small", "molecules", "are", "ranked", "on", "the", "x", "axis", "according", "to", "their", "increasing", "thermal", "stabilisation", "of", "the", "DNA", "(", "G4C2", ")", "4", "G", "-", "Q", ".", "Small", "molecules", "that", "preferentially", "stabilise", "RNA", "over", "DNA", "(", "G4C2", ")", "4", "G", "-", "Qs", "reside", "in", "the", "upper", "part", "of", "the", "scatter", "plot", ",", "above", "the", "blue", "curve", ".", "An", "arbitrary", "ΔTm", "threshold", "of", "13", "°", "C", "greater", "than", "vehicle", "(", "grey", "line", ")", "and", "a", "differential", "binding", "to", "RNA", "over", "DNA", "(", "ΔTmRNA", "-", "ΔTmDNA", "≥", "5", "°", "C", ")", "were", "used", "to", "select", "candidate", "small", "molecules", ".", "(", "C", ")", ".", "FRET", "dose", "-", "response", "of", "DB1246", ",", "DB1247", "and", "DB1273", "on", "stabilisation", "of", "RNA", "or", "DNA", "(", "G4C2", ")", "4", "G", "-", "Qs", ".", "(", "D", ")", ".", "Temperature", "unfold", "CD", "spectra", "for", "(", "G4C2", ")", "4", "RNA", "alone", "(", "which", "shows", "a", "characteristic", "G", "-", "Q", "structure", "with", "minima", "at", "237", "nm", ",", "maxima", "at", "264", "nm", "and", "no", "additional", "signal", ")", ",", "or", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "DB1246", ",", "DB1247", "or", "DB1273", ".", "A", "characteristic", "induced", "CD", "spectrum", ",", "in", "the", "350", "nm", "-", "550", "nm", "region", ",", "is", "observed", "only", "in", "the", "presence", "of", "each", "small", "molecule", ",", "confirming", "that", "each", "of", "these", "three", "compounds", "are", "binding", "to", "(", "G4C2", ")", "4", "RNA", "G", "-", "Qs", ".", "Data", "in", "A", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "1", "with", "3", "technical", "replica", ".", "Data", "in", "C", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "in", "D", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A). A FRET assay was used to measure the difference in melting temperature (ΔTm) of (G4C2)4 RNA or DNA G-Qs in the presence of 2 μM of 138 different small molecules. An increase in ΔTm indicates stabilisation of the G-Q. Small molecules are ranked on the x axis according to their increasing thermal stabilisation of the DNA (G4C2)4 G-Q. Small molecules that preferentially stabilise RNA over DNA (G4C2)4 G-Qs reside in the upper part of the scatter plot, above the blue curve. An arbitrary ΔTm threshold of 13 °C greater than vehicle (grey line) and a differential binding to RNA over DNA (ΔTmRNA-ΔTmDNA ≥ 5 °C) were used to select candidate small molecules.(C). FRET dose-response of DB1246, DB1247 and DB1273 on stabilisation of RNA or DNA (G4C2)4 G-Qs.(D). Temperature unfold CD spectra for (G4C2)4 RNA alone (which shows a characteristic G-Q structure with minima at 237 nm, maxima at 264 nm and no additional signal), or in the presence of 2 μM DB1246, DB1247 or DB1273. A characteristic induced CD spectrum, in the 350 nm - 550 nm region, is observed only in the presence of each small molecule, confirming that each of these three compounds are binding to (G4C2)4 RNA G-Qs. Data in A represent mean ± s.d., n=1 with 3 technical replica. Data in C represent mean ± s.d., n=3 independent experiments. Data in D represent mean ± s.d., n=3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "C9orf72", " ", "iPSC", "-", "cortical", "neurons", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", "control", ")", "or", "1", "µM", "of", "DB1246", ",", "DB1247", "or", "DB1273", ",", "for", "4", "days", ".", "RNA", "foci", "are", "shown", "in", "red", "and", "nuclei", "(", "DAPI", ")", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "shows", "RNA", "foci", "are", "significantly", "reduced", "by", "all", "three", "compounds", "in", "iPSC", "-", "cortical", "neurons", "and", "by", "DB1246", "and", "DB1273", "in", "iPSC", "-", "motor", "neurons", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "average", "percentage", "of", "neurons", "containing", "RNA", "foci", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ".", "N", "=", "3", "independent", "C9orf72", "patient", "lines", "with", "2", "-", "3", "inductions", "per", "line", "and", "at", "least", "70", "neurons", "counted", "per", "induction", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "sample", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "versus", "normalised", "control", ".", "For", "cortical", "neurons", ",", "p", "=", "0", ".", "0124", "(", "DB1246", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0065", "(", "DB1247", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0096", "(", "DB1273", ")", ".", "For", "motor", "neurons", ",", "p", "=", "0", ".", "0004", "(", "DB1246", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0030", "(", "DB1273", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of C9orf72 iPSC-cortical neurons treated with DMSO (vehicle control) or 1 µM of DB1246, DB1247 or DB1273, for 4 days. RNA foci are shown in red and nuclei (DAPI) in blue. Scale bar represents 10 µm.(B) Quantification shows RNA foci are significantly reduced by all three compounds in iPSC-cortical neurons and by DB1246 and DB1273 in iPSC-motor neurons. Data are shown as the average percentage of neurons containing RNA foci relative to vehicle (DMSO). N=3 independent C9orf72 patient lines with 2-3 inductions per line and at least 70 neurons counted per induction. *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, one sample two-tailed t-test versus normalised control. For cortical neurons, p=0.0124 (DB1246), p=0.0065 (DB1247), p=0.0096 (DB1273). For motor neurons, p=0.0004 (DB1246), p=0.0030 (DB1273)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Poly", "(", "GP", ")", "levels", "were", "measured", "by", "MSD", "immunoassay", "in", "C9orf72", "patient", "iPSC", "-", "motor", "neurons", "treated", "for", "7", "days", "with", "8", "-", "16", "µM", "of", "the", "G4C2", "repeat", "G", "-", "Q", "binding", "small", "molecules", "DB1247", ",", "DB1247", "and", "DB1273", ".", "Treatment", "with", "DB1246", "or", "DB1273", "leads", "to", "a", "significant", "reduction", "in", "poly", "(", "GP", ")", "levels", "relative", "to", "vehicle", "-", "treated", "controls", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "independent", "C9orf72", "iPSC", "lines", ",", "with", "1", "-", "6", "differentiations", "per", "line", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "sample", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "versus", "normalised", "control", ".", "p", "=", "0", ".", "0068", "(", "DB1246", ",", "12", "µm", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0417", "(", "DB1246", ",", "16", "µm", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0196", "(", "DB1247", ",", "8", "µm", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "DB1273", ",", "8", "µm", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0194", "(", "DB1273", ",", "12", "µm", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0062", "(", "DB1273", ",", "16", "µm", ")", "(", "B", ")", "C9orf72", "patient", "iPSC", "-", "motor", "neurons", "were", "treated", "for", "7", "days", "with", "16", "µM", "of", "each", "small", "molecule", "and", "the", "expression", "levels", "of", "MCM2", "and", "the", "three", "C9orf72", "transcript", "variants", "(", "V1", "-", "V3", ")", "measured", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "3", "independent", "iPSC", "-", "motor", "neuron", "lines", "(", "one", "induction", "per", "line", ")", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "treated", "controls", ".", "No", "significant", "changes", "in", "gene", "expression", "were", "observed", ",", "one", "way", "ANOVA", ",", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "C", ")", "XTT", "cell", "death", "assay", "for", "C9orf72", "iPSC", "-", "motor", "neurons", "treated", "for", "7", "days", "with", "0", "-", "40", "µM", "of", "DB1246", ",", "DB1247", ",", "DB1273", "or", "cisplatin", "as", "a", "positive", "control", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "and", "SEM", "of", "two", "independent", "iPSC", "-", "motor", "neuron", "lines", ".", "Toxicity", "is", "only", "observed", "at", "the", "highest", "dose", "of", "40", "µM", "and", "not", "at", "the", "penultimate", "dose", "of", "20", "µM", ".", "(", "D", ")", "Drosophila", "first", "instar", "larvae", "expressing", "36", "G4C2", "repeats", "were", "placed", "on", "food", "containing", "either", "vehicle", "or", "1", "mM", "DB1273", ",", "and", "the", "number", "reaching", "the", "pupal", "stage", "of", "development", "counted", "after", "7", "days", ".", "DB1273", "treatment", "(", "n", "=", "1200", "flies", ")", "significantly", "improves", "survival", "compared", "to", "vehicle", "(", "n", "=", "1150", "flies", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0320", ",", "chi", "-", "squared", "test", ".", "Data", "are", "shown", "as", "proportion", "reaching", "the", "pupal", "stage", ",", "with", "numbers", "within", "each", "group", "indicated", "on", "the", "bars", ".", "Genotype", "was", "w1118", ";", "(", "GGGGCC", ")", "36", "/", "+", ";", "daGAL4", "/", "+", "(", "daGAL4", ">", "36R", ")", ".", "(", "E", ")", "Drosophila", "first", "instar", "larvae", "ubiquitously", "expressing", "36", "G4C2", "repeats", "(", "36R", ")", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "1", "mM", "DB1273", "for", "5", "days", ",", "until", "the", "third", "instar", "stage", "(", "L3", ")", ",", "and", "poly", "(", "GR", ")", "measured", "by", "MSD", "immunoassay", ".", "Poly", "(", "GR", ")", "was", "also", "measured", "in", "control", "(", "w1118", ")", "larvae", "that", "do", "not", "express", "G4C2", "repeats", ".", "DB1273", "treatment", "significantly", "reduced", "poly", "(", "GR", ")", "expression", ".", "n", "=", "8", "for", "36R", "groups", ",", "n", "=", "7", "for", "control", "group", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "w1118", "versus", "36R", "0", "mM", "larvae", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0019", "(", "0", "mM", "versus", "1", "mM", "36R", "larvae", ")", ".", "Genotypes", "were", "w1118", ";", ";", "and", "w1118", ";", "(", "GGGGCC", ")", "36", "/", "+", ";", "daGAL4", "/", "+", "(", "daGAL4", ">", "36R", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Poly(GP) levels were measured by MSD immunoassay in C9orf72 patient iPSC-motor neurons treated for 7 days with 8-16 µM of the G4C2 repeat G-Q binding small molecules DB1247, DB1247 and DB1273. Treatment with DB1246 or DB1273 leads to a significant reduction in poly(GP) levels relative to vehicle-treated controls. Data are shown as the mean and SEM of 3 independent C9orf72 iPSC lines, with 1-6 differentiations per line. *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001, one sample two-tailed t-test versus normalised control. p=0.0068 (DB1246, 12 µm), p=0.0417 (DB1246, 16 µm), p=0.0196 (DB1247, 8 µm), p=0.0002 (DB1273, 8 µm), p=0.0194 (DB1273, 12 µm), p=0.0062 (DB1273, 16 µm)(B) C9orf72 patient iPSC-motor neurons were treated for 7 days with 16 µM of each small molecule and the expression levels of MCM2 and the three C9orf72 transcript variants (V1-V3) measured by quantitative RT-PCR. Data are shown as the mean and s.d. of 3 independent iPSC-motor neuron lines (one induction per line) relative to vehicle (DMSO) treated controls. No significant changes in gene expression were observed, one way ANOVA, Dunnett's post hoc test, p>0.05.(C) XTT cell death assay for C9orf72 iPSC-motor neurons treated for 7 days with 0 - 40 µM of DB1246, DB1247, DB1273 or cisplatin as a positive control. Data are shown as the mean and SEM of two independent iPSC-motor neuron lines. Toxicity is only observed at the highest dose of 40 µM and not at the penultimate dose of 20 µM.(D) Drosophila first instar larvae expressing 36 G4C2 repeats were placed on food containing either vehicle or 1 mM DB1273, and the number reaching the pupal stage of development counted after 7 days. DB1273 treatment (n=1200 flies) significantly improves survival compared to vehicle (n=1150 flies), p=0.0320, chi-squared test. Data are shown as proportion reaching the pupal stage, with numbers within each group indicated on the bars. Genotype was w1118; (GGGGCC)36/+; daGAL4/+ (daGAL4>36R).(E) Drosophila first instar larvae ubiquitously expressing 36 G4C2 repeats (36R) were treated with vehicle or 1 mM DB1273 for 5 days, until the third instar stage (L3), and poly(GR) measured by MSD immunoassay. Poly(GR) was also measured in control (w1118) larvae that do not express G4C2 repeats. DB1273 treatment significantly reduced poly(GR) expression. n=8 for 36R groups, n=7 for control group. **p<0.01, *** p<0.001, one way ANOVA with Dunnett's post hoc test. p=0.0001 (w1118 versus 36R 0 mM larvae), p=0.0019 (0 mM versus 1 mM 36R larvae). Genotypes were w1118; ; and w1118; (GGGGCC)36/+; daGAL4/+ (daGAL4>36R)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Coomassie", "‐", "stained", "gels", "showing", "the", "results", "of", "liposome", "co", "‐", "sedimentation", "assays", "using", "Folch", "liposomes", "and", "the", "indicated", "proteins", ".", "Liposome", "binding", "allows", "the", "protein", "to", "be", "pelleted", ".", "The", "star", "indicates", "a", "degradation", "product", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "conjugate", ".", "(", "B", ",", "D", ")", "Yeast", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "were", "transformed", "with", "plasmids", "coding", "for", "Atg5", "and", "Atg16", ",", "respectively", ",", "and", "subjected", "to", "fractionation", "experiments", ".", "The", "proteins", "were", "detected", "by", "anti", "‐", "Myc", "western", "blotting", ".", "The", "presence", "of", "the", "protein", "in", "the", "pellet", "fraction", "indicated", "membrane", "binding", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "showing", "the", "relative", "amounts", "of", "Atg5", "-", "9", "×", "Myc", "and", "Atg5", "-", "9", "×", "Myc", "-", "Atg12", "in", "the", "pellet", "fractions", "relative", "to", "Pex30", ".", "The", "amount", "of", "Atg5", "-", "9", "×", "Myc", "and", "Atg5", "-", "9", "×", "Myc", "-", "Atg12", "in", "atg5Δ", "cells", "was", "set", "to", "1", ".", "See", "Supplementary", "Figure", "1", "for", "graph", "based", "on", "non", "‐", "normed", "data", ".", "The", "quantification", "is", "based", "on", "three", "independent", "experiments", "and", "the", "averages", "and", "the", "standard", "deviations", "are", "shown", ".", "The", "numbers", "next", "to", "the", "blots", "indicate", "the", "molecular", "weight", "in", "kDa", ".", "P", ",", "pellet", ";", "S", ",", "supernatant", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Coomassie‐stained gels showing the results of liposome co‐sedimentation assays using Folch liposomes and the indicated proteins. Liposome binding allows the protein to be pelleted. The star indicates a degradation product of the Atg5-Atg12 conjugate.(B, D) Yeast cells of the indicated genotype were transformed with plasmids coding for Atg5 and Atg16, respectively, and subjected to fractionation experiments. The proteins were detected by anti‐Myc western blotting. The presence of the protein in the pellet fraction indicated membrane binding.(C) Quantification showing the relative amounts of Atg5-9 × Myc and Atg5-9 × Myc-Atg12 in the pellet fractions relative to Pex30. The amount of Atg5-9 × Myc and Atg5-9 × Myc-Atg12 in atg5Δ cells was set to 1. See Supplementary Figure 1 for graph based on non‐normed data. The quantification is based on three independent experiments and the averages and the standard deviations are shown. The numbers next to the blots indicate the molecular weight in kDa. P, pellet; S, supernatant. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Coomassie", "‐", "stained", "gels", "of", "liposome", "co", "‐", "sedimentation", "assays", "using", "either", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "(", "upper", "panel", ")", "or", "Atg5", "/", "Atg16", "(", "lower", "panel", ")", "and", "liposomes", "with", "the", "indicated", "lipid", "composition", "(", "Folch", ":", "Folch", "lipids", ",", "PE", "/", "PI3P", ":", "40", "%", "POPC", ",", "35", "%", "POPS", ",", "20", "%", "POPE", ",", "5", "%", "PI3P", ",", "PE", "/", "PI", ":", "40", "%", "POPC", ",", "35", "%", "POPS", ",", "20", "%", "POPE", ",", "5", "%", "PI", ",", "DAG", "/", "PI3P", ":", "40", "%", "POPC", ",", "35", "%", "POPS", ",", "20", "%", "DAG", ",", "5", "%", "PI3P", ",", "DAG", "/", "PI", ":", "40", "%", "POPC", ",", "35", "%", "POPS", ",", "20", "%", "DAG", ",", "5", "%", "PI", ")", ".", "Note", "that", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "and", "the", "Atg5", "/", "Atg16", "complexes", "show", "almost", "identical", "binding", "behaviours", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "showing", "the", "amounts", "of", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "and", "Atg5", "/", "Atg16", "in", "the", "pellet", "fractions", ".", "The", "amount", "of", "protein", "in", "the", "pellet", "fraction", "in", "the", "absence", "of", "liposomes", "(", "background", ")", "was", "subtracted", "from", "the", "amount", "of", "protein", "in", "the", "pellet", "fractions", "in", "the", "presence", "of", "liposomes", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "of", "which", "is", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "Atg5", "-", "Atg12", "and", "Atg5", "bands", "were", "used", "for", "quantification", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "‐", "stained", "gel", "of", "a", "liposome", "co", "‐", "sedimentation", "assay", "showing", "the", "lipid", "requirements", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", ".", "Liposomes", "were", "composed", "of", "40", "%", "POPC", ",", "35", "%", "POPS", ",", "20", "%", "POPE", "and", "5", "%", "PI3P", ".", "In", "the", "liposomes", "containing", "no", "POPE", "or", "POPS", ",", "these", "lipids", "were", "replaced", "with", "POPC", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "in", "the", "pellet", "fraction", "in", "liposome", "co", "‐", "sedimentation", ",", "one", "of", "which", "is", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "six", "independent", "experiments", ".", "The", "Atg5", "-", "Atg12", "was", "used", "for", "quantification", ".", "The", "average", "value", "is", "shown", "and", "the", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "The", "numbers", "next", "to", "the", "gels", "indicate", "the", "molecular", "weight", "in", "kDa", ".", "DAG", ",", "diacylglycerol", ";", "P", ",", "pellet", ";", "PI", ",", "phosphatidylinositol", ";", "PI3P", ",", "phosphatidylinositol", "‐", "3", "‐", "phosphate", ";", "(", "PO", ")", "PC", ",", "(", "1", "‐", "palmitoyl", "‐", "2", "‐", "oleoyl", "‐", ")", "phosphatidylcholine", ";", "(", "PO", ")", "PE", ",", "(", "1", "‐", "palmitoyl", "‐", "2", "‐", "oleoyl", "‐", ")", "phosphatidylethanolamine", ";", "(", "PO", ")", "PS", ",", "(", "1", "‐", "palmitoyl", "‐", "2", "‐", "oleoyl", "‐", ")", "phosphatidylserine", ";", "S", ",", "supernatant", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Coomassie‐stained gels of liposome co‐sedimentation assays using either Atg5-Atg12/Atg16 (upper panel) or Atg5/Atg16 (lower panel) and liposomes with the indicated lipid composition (Folch: Folch lipids, PE/PI3P: 40% POPC, 35% POPS, 20% POPE, 5% PI3P, PE/PI: 40% POPC, 35% POPS, 20% POPE, 5% PI, DAG/PI3P: 40% POPC, 35% POPS, 20% DAG, 5% PI3P, DAG/PI: 40% POPC, 35% POPS, 20% DAG, 5% PI). Note that the Atg5-Atg12/Atg16 and the Atg5/Atg16 complexes show almost identical binding behaviours.(B) Quantification showing the amounts of Atg5-Atg12/Atg16 and Atg5/Atg16 in the pellet fractions. The amount of protein in the pellet fraction in the absence of liposomes (background) was subtracted from the amount of protein in the pellet fractions in the presence of liposomes. Data were obtained from three independent experiments, one of which is shown in (A). The Atg5-Atg12 and Atg5 bands were used for quantification.(C) Coomassie‐stained gel of a liposome co‐sedimentation assay showing the lipid requirements of the Atg5-Atg12/Atg16 complex. Liposomes were composed of 40% POPC, 35% POPS, 20% POPE and 5% PI3P. In the liposomes containing no POPE or POPS, these lipids were replaced with POPC.(D) Quantification of Atg5-Atg12/Atg16 in the pellet fraction in liposome co‐sedimentation, one of which is shown in (C). Data were obtained from six independent experiments. The Atg5-Atg12 was used for quantification. The average value is shown and the error bars represent the standard deviation. P‐values were calculated using Student's t‐test. The numbers next to the gels indicate the molecular weight in kDa. DAG, diacylglycerol; P, pellet; PI, phosphatidylinositol; PI3P, phosphatidylinositol‐3‐phosphate; (PO)PC, (1‐palmitoyl‐2‐oleoyl‐) phosphatidylcholine; (PO)PE, (1‐palmitoyl‐2‐oleoyl‐) phosphatidylethanolamine; (PO)PS, (1‐palmitoyl‐2‐oleoyl‐) phosphatidylserine; S, supernatant. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Coomassie", "‐", "stained", "gels", "showing", "co", "‐", "sedimentation", "assays", "using", "Folch", "liposomes", "and", "the", "indicated", "proteins", ".", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "was", "most", "efficient", "in", "recruiting", "Atg3", "to", "the", "pellet", "fraction", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "Atg3", "in", "the", "pellet", "fraction", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "proteins", ".", "The", "quantification", "is", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "‐", "stained", "gels", "showing", "the", "results", "of", "Atg8", "-", "PE", "conjugation", "assays", "using", "the", "indicated", "proteins", "and", "E", ".", "coli", "lipids", "derived", "liposomes", ".", "Atg8", "-", "PE", "conjugation", "was", "detected", "as", "characteristic", "band", "shift", "as", "the", "conjugated", "form", "runs", "faster", "on", "urea", "‐", "SDS", "gels", ".", "The", "numbers", "above", "the", "gels", "indicate", "the", "time", "in", "minutes", ".", "Note", "that", "at", "least", "under", "these", "conditions", "almost", "no", "Atg8", "-", "PE", "conjugation", "was", "detected", "in", "the", "absence", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "conjugate", "or", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", ".", "The", "numbers", "next", "to", "the", "gels", "indicate", "the", "molecular", "weight", "in", "kDa", ".", "The", "averages", "and", "the", "error", "bars", "representing", "the", "standard", "deviations", "are", "shown", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "NS", ",", "non", "‐", "significant", ";", "P", ",", "pellet", ";", "S", ",", "supernatant", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Coomassie‐stained gels showing co‐sedimentation assays using Folch liposomes and the indicated proteins. Atg5-Atg12/Atg16 was most efficient in recruiting Atg3 to the pellet fraction.(B) Quantification of Atg3 in the pellet fraction in the presence of the indicated proteins. The quantification is based on three independent experiments.(C) Coomassie‐stained gels showing the results of Atg8-PE conjugation assays using the indicated proteins and E. coli lipids derived liposomes. Atg8-PE conjugation was detected as characteristic band shift as the conjugated form runs faster on urea‐SDS gels. The numbers above the gels indicate the time in minutes. Note that at least under these conditions almost no Atg8-PE conjugation was detected in the absence of the Atg5-Atg12 conjugate or the Atg5-Atg12/Atg16 complex. The numbers next to the gels indicate the molecular weight in kDa. The averages and the error bars representing the standard deviations are shown. P‐values were calculated using Student's t‐test. NS, non‐significant; P, pellet; S, supernatant. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "showing", "eGFP", "-", "Atg8", "recruitment", "to", "GUVs", "is", "dependent", "on", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "and", "PE", ".", "The", "membrane", "was", "labelled", "by", "incorporation", "of", "rhodamine", "‐", "PE", ".", "(", "B", ")", "Single", "confocal", "section", "showing", "colocalization", "of", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "-", "eGFP", "and", "mCherry", "-", "Atg8", "on", "GUVs", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "GUV", "‐", "associated", "eGFP", "-", "Atg8", "in", "the", "presence", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "and", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "conjugate", ".", "The", "first", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "GUVs", "associated", "with", "eGFP", "-", "Atg8", "fluorescence", ".", "The", "second", "graph", "shows", "the", "intensity", "of", "eGFP", "-", "Atg8", "on", "the", "GUVs", ".", "The", "quantification", "is", "based", "on", "four", "independent", "experiments", ".", "Inset", ":", "anti", "‐", "Atg12", "western", "blot", "using", "the", "rabbit", "anti", "‐", "Atg12", "antiserum", "showing", "the", "amounts", "of", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "and", "Atg5", "-", "Atg12", "conjugate", "in", "one", "of", "the", "assays", "used", "for", "the", "quantification", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "membrane", "recruitment", "of", "Atg3", "-", "mCherry", "by", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", ",", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "conjugate", "and", "a", "buffer", "control", ".", "The", "graph", "is", "based", "on", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Widefield", "images", "showing", "individual", "frames", "of", "a", "time", "series", "of", "GUVs", "incubated", "with", "Atg3", ",", "Atg7", ",", "Atg8", "and", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "(", "see", "Materials", "and", "methods", "for", "details", ")", ".", "The", "membrane", "was", "labelled", "by", "incorporation", "of", "rhodamine", "‐", "PE", ".", "The", "time", "is", "indicated", "in", "minutes", ".", "(", "F", ")", "Widefield", "images", "of", "GUVs", "incubated", "with", "Atg3", ",", "Atg7", ",", "eGFP", "-", "Atg8", "and", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "for", "35", "min", "(", "left", ")", "or", "70", "min", "(", "right", ")", ".", "The", "membrane", "was", "labelled", "by", "incorporation", "of", "rhodamine", "‐", "PE", ".", "Note", "the", "massive", "accumulation", "of", "eGFP", "-", "Atg8", "at", "the", "interface", "between", "individual", "GUVs", ".", "The", "arrows", "point", "to", "some", "of", "these", "interfaces", ".", "For", "the", "quantifications", ",", "the", "averages", "and", "standard", "deviations", "are", "shown", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Confocal microscopy images showing eGFP-Atg8 recruitment to GUVs is dependent on the Atg5-Atg12/Atg16 complex and PE. The membrane was labelled by incorporation of rhodamine‐PE.(B) Single confocal section showing colocalization of Atg5-Atg12/Atg16-eGFP and mCherry-Atg8 on GUVs.(C) Quantification of GUV‐associated eGFP-Atg8 in the presence of the Atg5-Atg12/Atg16 complex and the Atg5-Atg12 conjugate. The first graph shows the percentage of GUVs associated with eGFP-Atg8 fluorescence. The second graph shows the intensity of eGFP-Atg8 on the GUVs. The quantification is based on four independent experiments. Inset: anti‐Atg12 western blot using the rabbit anti‐Atg12 antiserum showing the amounts of Atg5-Atg12/Atg16 complex and Atg5-Atg12 conjugate in one of the assays used for the quantification shown in (C).(D) Quantification of membrane recruitment of Atg3-mCherry by the Atg5-Atg12/Atg16 complex, the Atg5-Atg12 conjugate and a buffer control. The graph is based on two independent experiments.(E) Widefield images showing individual frames of a time series of GUVs incubated with Atg3, Atg7, Atg8 and the Atg5-Atg12/Atg16 complex (see Materials and methods for details). The membrane was labelled by incorporation of rhodamine‐PE. The time is indicated in minutes.(F) Widefield images of GUVs incubated with Atg3, Atg7, eGFP-Atg8 and the Atg5-Atg12/Atg16 complex for 35 min (left) or 70 min (right). The membrane was labelled by incorporation of rhodamine‐PE. Note the massive accumulation of eGFP-Atg8 at the interface between individual GUVs. The arrows point to some of these interfaces. For the quantifications, the averages and standard deviations are shown. P‐values were calculated using Student's t‐test. Scale bars: 10 μm. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Frames", "of", "widefield", "images", "taken", "from", "a", "time", "series", "of", "rhodamine", "‐", "PE", "labelled", "GUVs", "in", "the", "presence", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", ".", "For", "the", "control", "condition", "buffer", "but", "no", "protein", "was", "added", ".", "Note", "the", "increase", "in", "clustered", "GUVs", "over", "time", ".", "The", "numbers", "indicate", "the", "time", "in", "minutes", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "of", "rhodamine", "‐", "PE", "labelled", "GUVs", "incubated", "with", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "-", "eGFP", "complex", ".", "Note", "the", "accumulation", "of", "the", "complex", "at", "the", "interface", "between", "GUVs", "(", "arrows", ")", ".", "(", "C", ")", "Individual", "confocal", "microscopy", "frames", "of", "a", "time", "series", "of", "rhodamine", "‐", "PE", "labelled", "GUVs", "incubated", "with", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "-", "eGFP", ".", "The", "arrows", "point", "to", "the", "GUV", "-", "GUV", "interface", "where", "the", "protein", "initially", "accumulated", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "rhodamine", "‐", "PE", "labelled", "GUVs", "incubated", "with", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "-", "eGFP", ".", "The", "arrows", "point", "to", "the", "concentrations", "of", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "on", "the", "GUV", "membrane", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "3", "μm", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Frames of widefield images taken from a time series of rhodamine‐PE labelled GUVs in the presence of the Atg5-Atg12/Atg16 complex. For the control condition buffer but no protein was added. Note the increase in clustered GUVs over time. The numbers indicate the time in minutes.(B) Confocal images of rhodamine‐PE labelled GUVs incubated with Atg5-Atg12/Atg16-eGFP complex. Note the accumulation of the complex at the interface between GUVs (arrows).(C) Individual confocal microscopy frames of a time series of rhodamine‐PE labelled GUVs incubated with Atg5-Atg12/Atg16-eGFP. The arrows point to the GUV-GUV interface where the protein initially accumulated.(D) Confocal microscopy images of rhodamine‐PE labelled GUVs incubated with Atg5-Atg12/Atg16-eGFP. The arrows point to the concentrations of Atg5-Atg12/Atg16 on the GUV membrane. Scale bars: 10 μm (A-C) and 3 μm (D)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Widefield", "images", "of", "rhodamine", "‐", "PE", "labelled", "GUVs", "30", "min", "GUVs", "cluster", "only", "in", "the", "presence", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "and", "Atg5", "/", "Atg16", "complexes", ".", "(", "B", ")", "SUV", "aggregation", "assay", "using", "Folch", "liposomes", "and", "the", "indicated", "proteins", ".", "The", "proteins", "were", "added", "after", "a", "short", "delay", ".", "The", "symbols", "above", ",", "below", "the", "images", "or", "next", "to", "the", "curves", "represent", "Atg5", "(", "blue", "oval", ")", ",", "Atg12", "(", "red", "circle", ")", "and", "Atg16", "(", "green", "Y", ")", ".", "The", "overall", "shape", "of", "the", "Atg5", "-", "Atg12", "/", "Atg16", "complex", "is", "according", "to", "the", "structural", "model", "of", "the", "complex", "as", "proposed", "in", "Fujioka", "et", "al", "(", "2010", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Widefield images of rhodamine‐PE labelled GUVs 30 min GUVs cluster only in the presence of the Atg5-Atg12/Atg16 and Atg5/Atg16 complexes.(B) SUV aggregation assay using Folch liposomes and the indicated proteins. The proteins were added after a short delay. The symbols above, below the images or next to the curves represent Atg5 (blue oval), Atg12 (red circle) and Atg16 (green Y). The overall shape of the Atg5-Atg12/Atg16 complex is according to the structural model of the complex as proposed in Fujioka et al (2010). Scale bars: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Liposome", "co", "‐", "sedimentation", "assay", "using", "Folch", "liposomes", "and", "the", "indicated", "Atg5", "proteins", "stabilized", "with", "an", "N", "‐", "terminal", "fragment", "of", "Atg16", "(", "amino", "acids", "1", "-", "46", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "based", "on", "three", "co", "‐", "sedimentation", "assays", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "amount", "of", "protein", "pelleted", "in", "the", "absence", "of", "liposomes", "was", "subtracted", ".", "The", "averages", "and", "the", "standard", "deviations", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "Yeast", "cells", "were", "transformed", "with", "the", "indicated", "expression", "constructs", "and", "Atg5", "-", "2", "×", "Myc", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "‐", "Myc", "antibody", ".", "The", "precipitated", "protein", "was", "subjected", "to", "anti", "‐", "Atg5", "and", "anti", "‐", "Atg12western", "blotting", ".", "The", "substitution", "of", "R171", "and", "K160", "to", "glutamate", "caused", "the", "mutant", "protein", "to", "run", "higher", ".", "The", "same", "phenomenon", "was", "observed", "for", "the", "recombinant", "protein", "(", "Supplementary", "Figure", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Anti", "‐", "Atg12", "western", "blot", "of", "cell", "fractions", "prepared", "from", "rapamycin", "‐", "treated", "yeast", "cells", ".", "The", "anti", "‐", "Pgk1", "and", "anti", "‐", "Pex30", "served", "as", "control", "for", "the", "cytosolic", "and", "membrane", "fractions", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Anti", "‐", "Myc", "and", "anti", "‐", "Pex30western", "blots", "of", "yeast", "cell", "fractions", "from", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "and", "expressing", "Atg16", "and", "Atg5", "or", "Atg5", "K160E", ",", "R171E", ".", "(", "F", ")", "Starvation", "assay", "with", "the", "indicated", "yeast", "strains", "and", "the", "indicated", "rescue", "constructs", ".", "GFP", "was", "detected", "by", "western", "blotting", ".", "Pgk1", "served", "as", "loading", "control", ".", "(", "G", ")", "Same", "assay", "as", "shown", "in", "(", "F", ")", "but", "using", "an", "anti", "‐", "Ape1", "antiserum", "for", "western", "blotting", ".", "(", "H", ")", "Western", "blots", "of", "yeast", "cell", "lysates", "using", "an", "anti", "‐", "Atg8", "antiserum", ".", "(", "I", ")", "Ape1", "protease", "protection", "assay", "with", "the", "indicated", "yeast", "strains", ".", "The", "percentages", "below", "the", "blots", "indicate", "the", "percent", "of", "protected", "ApeI", "in", "the", "+", "protease", "K", ",", "−", "Triton", "X", "‐", "100", "lanes", "and", "are", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", "±", "the", "standard", "deviation", ".", "The", "numbers", "next", "to", "the", "blots", "indicate", "the", "molecular", "weight", "in", "kDa", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Liposome co‐sedimentation assay using Folch liposomes and the indicated Atg5 proteins stabilized with an N‐terminal fragment of Atg16 (amino acids 1-46).(B) Quantification based on three co‐sedimentation assays as shown in (A). The amount of protein pelleted in the absence of liposomes was subtracted. The averages and the standard deviations are shown.(C) Yeast cells were transformed with the indicated expression constructs and Atg5-2 × Myc was immunoprecipitated with an anti‐Myc antibody. The precipitated protein was subjected to anti‐Atg5 and anti‐Atg12western blotting. The substitution of R171 and K160 to glutamate caused the mutant protein to run higher. The same phenomenon was observed for the recombinant protein ( Supplementary Figure 3).(D) Anti‐Atg12 western blot of cell fractions prepared from rapamycin‐treated yeast cells. The anti‐Pgk1 and anti‐Pex30 served as control for the cytosolic and membrane fractions, respectively.(E) Anti‐Myc and anti‐Pex30western blots of yeast cell fractions from cells of the indicated genotype and expressing Atg16 and Atg5 or Atg5 K160E, R171E.(F) Starvation assay with the indicated yeast strains and the indicated rescue constructs. GFP was detected by western blotting. Pgk1 served as loading control.(G) Same assay as shown in (F) but using an anti‐Ape1 antiserum for western blotting.(H) Western blots of yeast cell lysates using an anti‐Atg8 antiserum.(I) Ape1 protease protection assay with the indicated yeast strains. The percentages below the blots indicate the percent of protected ApeI in the +protease K, −Triton X‐100 lanes and are the average of three independent experiments±the standard deviation. The numbers next to the blots indicate the molecular weight in kDa. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Yeast", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "expressing", "Atg5", "-", "3", "×", "mCherry", "or", "Atg5", "K160E", ",", "R171E", "-", "3", "×", "mCherry", "were", "treated", "with", "rapamycin", "and", "imaged", "using", "a", "Deltavision", "microscope", ".", "Maximum", "projections", "of", "z", "‐", "stacks", "are", "shown", ".", "(", "B", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "mCherry", "‐", "positive", "cells", "that", "display", "Atg5", "-", "3", "×", "mCherry", "dots", ".", "In", "total", ",", "3", "independent", "experiments", "were", "conducted", "and", ">", "400", "cells", "were", "counted", ".", "(", "C", ")", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "cells", "that", "display", "Atg16", "-", "3", "×", "mCherry", "dots", ".", "In", "total", ",", "3", "independent", "experiments", "were", "conducted", "and", ">", "750", "cells", "were", "counted", ".", "The", "graphs", "show", "the", "averages", "and", "the", "error", "bars", "representing", "the", "standard", "deviations", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Yeast cells of the indicated genotype expressing Atg5-3 × mCherry or Atg5 K160E, R171E-3 × mCherry were treated with rapamycin and imaged using a Deltavision microscope. Maximum projections of z‐stacks are shown.(B) Graph showing the percentage of mCherry‐positive cells that display Atg5-3 × mCherry dots. In total, 3 independent experiments were conducted and >400 cells were counted.(C) Graph showing the percentage of cells that display Atg16-3 × mCherry dots. In total, 3 independent experiments were conducted and >750 cells were counted. The graphs show the averages and the error bars representing the standard deviations. P‐values were calculated using Student's t‐test. Scale bars: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", "A549", "and", "U937", "cells", "were", "infected", "with", "each", "IAV", "at", "MOI", "1", "or", "5", "for", "24", "h", ",", "and", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "polyclonal", "anti", "-", "PB1", "-", "F2", "antibody", ".", "B", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "plasmid", "encoding", "Flag", "-", "tagged", "PB1", "-", "F2", "derived", "from", "the", "PR8", "or", "1918", "strain", "and", "treated", "with", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "(", "25", "μM", ")", "or", "vehicle", "for", "6", "h", "before", "harvesting", ".", "PB1", "-", "F2", "transcripts", "were", "analyzed", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "top", "panel", ")", ",", "and", "The", "PB1", "-", "F2", "protein", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "monoclonal", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "C", "Representative", "immunofluorescence", "images", "showing", "expression", "of", "PB1", "-", "F2", "(", "red", ")", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "indicated", "PB1", "-", "F2", ".", "At", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", ".", "Magnification", ",", "×", "100", ";", "scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "D", "Each", "HA", "-", "tagged", "PB1", "-", "F2", "was", "transfected", "into", "293T", "cells", "with", "or", "without", "Flag", "-", "ubiquitin", ".", "At", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", ".", "The", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "PR8", ",", "A", "/", "Puerto", "Rico", "/", "8", "/", "34", "(", "H1N1", ")", ";", "1918", ",", "A", "/", "Brevig", "Mission", "/", "1", "/", "1918", "(", "H1N1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A A549 and U937 cells were infected with each IAV at MOI 1 or 5 for 24 h, and lysates were analyzed by Western blotting using polyclonal anti-PB1-F2 antibody.B A549 cells were transfected with a plasmid encoding Flag-tagged PB1-F2 derived from the PR8 or 1918 strain and treated with the proteasome inhibitor MG132 (25 μM) or vehicle for 6 h before harvesting. PB1-F2 transcripts were analyzed by semi-quantitative RT-PCR (top panel), and The PB1-F2 protein was analyzed by Western blotting with monoclonal anti-Flag antibody.C Representative immunofluorescence images showing expression of PB1-F2 (red). A549 cells were transfected with plasmids encoding indicated PB1-F2. At 18 h after transfection, cells were treated with MG132 for 6 h and subjected to immunofluorescence analysis. Magnification, ×100; scale bar, 100 μm.D Each HA-tagged PB1-F2 was transfected into 293T cells with or without Flag-ubiquitin. At 18 h after transfection, cells were treated with MG132 for 6 h. The lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody and analyzed by Western blotting with anti-Flag antibody. PR8, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1); 1918, A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1)."}
{"words": ["Figure", "2B", "-", "D", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "tagged", "PB1", "-", "F2", "derived", "from", "the", "PR8", "or", "1918", "strain", "and", "chimeric", "PB1", "-", "F2", "mutants", ".", "At", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "or", "without", "MG132", "for", "6", "h", ".", "The", "expression", "of", "PB1", "-", "F2", "and", "control", "genes", "was", "detected", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "upper", "panel", ")", "or", "Western", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Results", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "PB1", "-", "F2", "expression", "in", "A549", "cells", ".", "Cells", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "tagged", "PB1", "-", "F2", "plasmid", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Flag", "(", "red", ")", "antibody", "and", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "assay", ".", "Magnification", ",", "×", "400", ";", "scale", "bar", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B-D A549 cells were transfected with the indicated plasmids encoding Flag-tagged PB1-F2 derived from the PR8 or 1918 strain and chimeric PB1-F2 mutants. At 18 h after transfection, cells were treated with or without MG132 for 6 h. The expression of PB1-F2 and control genes was detected by semi-quantitative RT-PCR (upper panel) or Western blotting (lower panel). Results shown are representative of three independent experiments.E Representative immunofluorescence images of PB1-F2 expression in A549 cells. Cells transfected with the Flag-tagged PB1-F2 plasmid were stained with anti-Flag (red) antibody and analyzed by immunofluorescence assay. Magnification, ×400; scale bar, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "3A", "Relative", "activity", "of", "NF", "-", "kB", "luciferase", "reporter", "was", "measured", "in", "A549", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "PB1", "-", "F2", ".", "The", "mRNA", "levels", "of", "pro", "-", "inflammatory", "cytokines", "were", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "PB1", "-", "F2", "-", "expressing", "plasmids", ".", "Relative", "IFNβ", "mRNA", "levels", "were", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "top", ")", "and", "qPCR", "(", "bottom", ")", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", "U937", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "IFNβ", "luciferase", "reporter", "plasmid", "and", "the", "PB1", "-", "F2", "or", "NS1", "expressing", "plasmid", "and", "treated", "with", "polyI", ":", "C", "for", "12", "h", "before", "harvesting", ".", "IFNβ", "promoter", "activity", "was", "determined", "by", "luciferase", "reporter", "assay", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Cells", "were", "infected", "for", "24", "h", "with", "each", "virus", "at", "1", "MOI", ".", "The", "mRNA", "level", "of", "IFNβ", "was", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ",", "and", "PB1", "-", "F2", "protein", "expression", "was", "assessed", "by", "Western", "blotting", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "E", "Cells", "were", "transfected", "with", "each", "plasmid", "encoding", "PB1", "-", "F2", ".", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", "and", "the", "level", "of", "IFNβ", "mRNA", "was", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "left", ")", "and", "qPCR", "(", "right", ")", ".", "PB1", "-", "F2", "protein", "expression", "was", "assessed", "by", "Western", "blotting", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "F", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "PB1", "-", "F2", "clones", "mutated", "at", "positions", "68", "and", "69", ";", "24", "h", "after", "transfection", ",", "the", "IFNβ", "mRNA", "level", "and", "PB1", "-", "F2", "protein", "expression", "were", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "and", "Western", "blotting", ",", "respectively", "(", "left", ")", ".", "The", "relative", "expression", "level", "of", "IFNβ", "mRNA", "was", "also", "analyzed", "by", "qPCR", "(", "right", ")", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", "(", "±", "SEM", ")", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Relative activity of NF-kB luciferase reporter was measured in A549 cells transfected with plasmids encoding PB1-F2. The mRNA levels of pro-inflammatory cytokines were determined by semi-quantitative RT-PCR. All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001).Cells were transfected with PB1-F2-expressing plasmids. Relative IFNβ mRNA levels were determined by semi-quantitative RT-PCR (top) and qPCR (bottom). All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001).C U937 cells were co-transfected with the IFNβ luciferase reporter plasmid and the PB1-F2 or NS1 expressing plasmid and treated with polyI:C for 12 h before harvesting. IFNβ promoter activity was determined by luciferase reporter assay. All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001).Cells were infected for 24 h with each virus at 1 MOI. The mRNA level of IFNβ was determined by semi-quantitative RT-PCR, and PB1-F2 protein expression was assessed by Western blotting. All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001).E Cells were transfected with each plasmid encoding PB1-F2. 18 h after transfection, cells were treated with MG132 for 6 h and the level of IFNβ mRNA was determined by semi-quantitative RT-PCR (left) and qPCR (right). PB1-F2 protein expression was assessed by Western blotting. All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001).F A549 cells were transfected with PB1-F2 clones mutated at positions 68 and 69; 24 h after transfection, the IFNβ mRNA level and PB1-F2 protein expression were determined by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting, respectively (left). The relative expression level of IFNβ mRNA was also analyzed by qPCR (right). All data are shown as mean (±SEM) from at least three independent experiments (*p < 0.05, **p <0.01, ***p <0.001)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Mice", "(", "n", "=", "5", "or", "6", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "IAV", "with", "indicated", "pfu", ".", "Survival", "was", "monitored", "daily", "for", "2", "weeks", ".", "B", "Mice", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "each", "IAV", "as", "indicated", ".", "Body", "weight", "was", "recorded", "daily", "after", "infection", "for", "2", "weeks", ".", "C", "Mice", "(", "n", "=", "5", "or", "6", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "viruses", "(", "1000", "pfu", ")", "carrying", "PR8", "PB1", "-", "F2", "with", "the", "I68T", ",", "L69P", ",", "or", "I68T", "+", "L69P", "mutation", ".", "Body", "weight", "changes", "and", "survival", "rate", "were", "monitored", "daily", ".", "Detailed", "analyses", "on", "the", "virulence", "necessitated", "the", "monitoring", "of", "body", "weight", "below", "the", "standard", "level", "(", "80", "%", ")", "of", "mortality", ".", "Three", "cohorts", "of", "mice", "(", "5", "or", "6", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "500", "pfu", "of", "one", "of", "the", "three", "IAVs", ".", "Viral", "protein", "expression", "in", "mouse", "lung", "was", "determined", "by", "Western", "blotting", "2", "days", "after", "infection", ".", "E", "Mice", "(", "6", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "500", "pfu", "of", "one", "of", "the", "three", "IAVs", ".", "Viral", "titration", "by", "plaque", "assay", "was", "performed", "at", "2", "days", "post", "-", "infection", "using", "lung", "homogenates", ".", "F", "Mice", "(", "5", "-", "9", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "500", "pfu", "of", "each", "virus", ".", "At", "2", "days", "post", "-", "infection", ",", "IFNβ", "mRNA", "levels", "were", "determined", "by", "qPCR", ".", "G", "Mice", "(", "5", "-", "9", "per", "group", ")", "were", "infected", "with", "1", "×", "105", "pfu", "of", "each", "virus", ".", "At", "2", "days", "post", "-", "infection", ",", "IFNβ", "protein", "levels", "in", "lung", "homogenates", "were", "measured", "by", "ELISA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Mice (n = 5 or 6 per group) were infected with IAV with indicated pfu. Survival was monitored daily for 2 weeks.B Mice (n = 6-9 per group) were infected with each IAV as indicated. Body weight was recorded daily after infection for 2 weeks.C Mice (n = 5 or 6 per group) were infected with viruses (1000 pfu) carrying PR8 PB1-F2 with the I68T, L69P, or I68T+L69P mutation. Body weight changes and survival rate were monitored daily. Detailed analyses on the virulence necessitated the monitoring of body weight below the standard level (80%) of mortality.Three cohorts of mice (5 or 6 per group) were infected with 500 pfu of one of the three IAVs. Viral protein expression in mouse lung was determined by Western blotting 2 days after infection.E Mice (6 per group) were infected with 500 pfu of one of the three IAVs. Viral titration by plaque assay was performed at 2 days post-infection using lung homogenates.F Mice (5-9 per group) were infected with 500 pfu of each virus. At 2 days post-infection, IFNβ mRNA levels were determined by qPCR.G Mice (5-9 per group) were infected with 1 × 105 pfu of each virus. At 2 days post-infection, IFNβ protein levels in lung homogenates were measured by ELISA."}
{"words": ["Figure", "5A", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "proteins", "immunoprecipitated", "from", "A549", "cell", "lysates", "using", "HA", "-", "antibody", ".", "Bands", "were", "stained", "by", "Coomassie", "Blue", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "E", "Analysis", "of", "interaction", "between", "DDX3", "and", "1918", "PB1", "-", "F2", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", ";", "18", "h", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Proteins", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "left", "panel", ")", ".", "IAV", "-", "infected", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "PB1", "-", "F2", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "middle", "panel", ")", ".", "Purified", "recombinant", "1918", "PB1", "-", "F2", "protein", "was", "incubated", "with", "recombinant", "LysRS", "or", "LysRS", "-", "DDX3", ",", "and", "the", "interaction", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "(", "right", "panel", ")", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "F", "Analysis", "of", "interaction", "between", "DDX3", "and", "PB1", "-", "F2", "mutants", ".", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "clones", ";", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", "and", "analyzed", "by", "immunoprecipitation", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "G", "A549", "cells", "were", "treated", "with", "IFNβ", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "and", "subjected", "to", "Western", "blotting", "(", "top", ")", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "indicated", "IAV", ".", "At", "24", "h", "post", "-", "infection", ",", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "(", "bottom", ")", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "H", "Representative", "fluorescence", "images", "showing", "expression", "level", "of", "GFP", "-", "DDX3", "(", "green", ")", ".", "A549", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "the", "GEP", "-", "DDX3", "and", "Flag", "-", "tagged", "PR8", "or", "1918", "PB1", "-", "F2", ".", "At", "18", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", "and", "subjected", "to", "fluorescence", "analysis", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "I", "Mice", "were", "infected", "with", "1", "×", "105", "pfu", "of", "each", "virus", ",", "and", "lung", "homogenates", "were", "examined", "for", "endogenous", "Ddx3", "expression", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "J", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "or", "treated", "with", "poly", "I", ":", "C", ".", "Cytoplasmic", "and", "nuclear", "fractions", "were", "separated", "and", "subjected", "to", "Western", "blotting", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "K", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ",", "and", "IFNβ", "mRNA", "levels", "were", "determined", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "top", ")", "and", "qPCR", "(", "middle", ")", ".", "IFNβ", "promoter", "activity", "was", "determined", "by", "luciferase", "reporter", "assay", "(", "bottom", ")", ".", "Results", "were", "confirmed", "in", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A SDS-PAGE analysis of proteins immunoprecipitated from A549 cell lysates using HA-antibody. Bands were stained by Coomassie Blue. Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.E Analysis of interaction between DDX3 and 1918 PB1-F2. Cells were transfected with indicated plasmids; 18 h later, cells were treated with MG132 for 6 h. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody. Proteins were detected by immunoblotting with the indicated antibodies (left panel). IAV-infected cell lysates were immunoprecipitated with anti-PB1-F2 antibody and immunoblotted with the indicated antibodies (middle panel). Purified recombinant 1918 PB1-F2 protein was incubated with recombinant LysRS or LysRS-DDX3, and the interaction was analyzed by immunoblotting (right panel). Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.F Analysis of interaction between DDX3 and PB1-F2 mutants. A549 cells were transfected with the indicated clones; 18 h after transfection, cells were treated with MG132 for 6 h and analyzed by immunoprecipitation. Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.G A549 cells were treated with IFNβ for the indicated time periods and subjected to Western blotting (top). A549 cells were infected with indicated IAV. At 24 h post-infection, cell lysates were analyzed by Western blotting (bottom). Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.H Representative fluorescence images showing expression level of GFP-DDX3 (green). A549 cells were co-transfected with plasmids encoding the GEP-DDX3 and Flag-tagged PR8 or 1918 PB1-F2. At 18 h after transfection, cells were treated with MG132 for 6 h and subjected to fluorescence analysis. Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.I Mice were infected with 1×105 pfu of each virus, and lung homogenates were examined for endogenous Ddx3 expression. Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.J A549 cells were transfected with the indicated plasmids or treated with poly I:C. Cytoplasmic and nuclear fractions were separated and subjected to Western blotting. Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown.K A549 cells were transfected with the indicated plasmids, and IFNβ mRNA levels were determined by semi-quantitative RT-PCR (top) and qPCR (middle). IFNβ promoter activity was determined by luciferase reporter assay (bottom). Results were confirmed in three independent experiments, and representative data are shown."}
{"words": ["Figure", "6Groups", "of", "five", "mice", "were", "intranasally", "infected", "with", "IAV", "(", "1918", ")", ",", "and", "recombinant", "DDX3", "protein", "was", "administered", "intranasally", ".", "Survival", "was", "monitored", "daily", "for", "2", "weeks", ".", "Groups", "of", "five", "mice", "were", "intranasally", "infected", "with", "IAV", "(", "1918", ")", ",", "and", "recombinant", "DDX3", "protein", "was", "administered", "intranasally", ".", "Two", "days", "post", "-", "infection", ",", "virus", "titers", "in", "lung", "homogenates", "were", "determined", "by", "plaque", "assay", ".", "A", "p", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "significant", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Groups", "of", "five", "mice", "were", "intranasally", "infected", "with", "IAV", "(", "1918", ")", ",", "and", "recombinant", "DDX3", "protein", "was", "administered", "intranasally", ".", "Two", "days", "post", "-", "infection", ",", "the", "expression", "level", "of", "IFNβ", "in", "the", "lungs", "was", "analyzed", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "left", "panel", ")", "and", "qPCR", "(", "right", "panel", ")", ".", "A", "p", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "significant", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Groups of five mice were intranasally infected with IAV (1918), and recombinant DDX3 protein was administered intranasally. Survival was monitored daily for 2 weeks.Groups of five mice were intranasally infected with IAV (1918), and recombinant DDX3 protein was administered intranasally. Two days post-infection, virus titers in lung homogenates were determined by plaque assay. A p value of <0.05 was considered significant (** p < 0.01).Groups of five mice were intranasally infected with IAV (1918), and recombinant DDX3 protein was administered intranasally. Two days post-infection, the expression level of IFNβ in the lungs was analyzed by semi-quantitative RT-PCR (left panel) and qPCR (right panel). A p value of <0.05 was considered significant (** p < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Left", ",", "orthogonal", "view", "of", "a", "20μm", "tumor", "section", "labelled", "with", "antibodies", "against", "EpCAM", "(", "in", "red", ")", "and", "DNA", "in", "blue", ".", "Right", ",", "dot", "plot", "bar", "representing", "cell", "heights", "in", "cells", "from", "tumor", "sections", ",", "n", "=", "60", "cells", "from", "1", "tumor", ".", "(", "C", ")", "On", "the", "left", ",", "images", "of", "low", "magnification", "views", "of", "healthy", "tissues", "labelled", "with", "antibodies", "against", "pericentrin", "(", "PCNT", ")", "and", "CDK5RAP2", ",", "shown", "in", "red", "and", "green", ",", "respectively", ".", "DNA", "is", "in", "blue", ".", "The", "white", "dashed", "squares", "represent", "the", "regions", "shown", "in", "higher", "magnifications", "on", "the", "right", ".", "One", "centrosome", "was", "considered", "as", "such", "when", "PCNT", "and", "CDK5RAP2", "signals", "co", "-", "localized", "(", "Inset", "1", ")", ".", "Lack", "of", "co", "-", "localization", "(", "Insets", "2", "and", "3", ")", "was", "noticed", "and", "discarded", "during", "quantification", ".", "(", "D", ")", "Super", "-", "resolution", "microscopy", "of", "healthy", "tissues", "labelled", "for", "the", "centriole", "marker", "CEP135", "(", "in", "green", ")", "and", "PCNT", "(", "in", "red", ")", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Representative", "images", "of", "two", "different", "fields", "of", "the", "same", "tumor", "(", "E", ")", "and", "of", "a", "tumor", "section", "to", "highlight", "different", "centrososome", "phenotypes", ",", "labelled", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "pink", "dashed", "line", "highlights", "an", "area", "of", "cells", "without", "centrosomes", ".", "The", "white", "dashed", "squares", "represent", "the", "regions", "shown", "in", "higher", "magnifications", "in", "insets", "in", "(", "G", "and", "I", ")", "and", "the", "pink", "dashed", "linesurrounds", "nuclei", "without", "centrosomes", ".", "(", "G", ")", "Insets", "from", "(", "F", ")", ".", "(", "H", ")", "Examples", "of", "tumor", "sections", "showing", "small", "(", "left", ")", "and", "large", "(", "right", ")", "regions", "with", "nuclei", "without", "centrosomes", ".", "(", "I", ")", "Insets", "from", "(", "F", ")", "showing", "different", "types", "of", "centrosome", "amplification", "events", ".", "(", "J", ")", "Super", "-", "resolution", "microscopy", "of", "tumor", "tissues", "labelled", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "K", ")", "Maximum", "Z", "-", "projection", "of", "a", "tumor", "section", "labelled", "with", "EpCAM", "antibodies", "(", "Red", ")", "and", "DNA", "in", "blue", ".", "The", "dashed", "line", "shows", "the", "absence", "of", "EpCAM", "staining", ",", "arrows", "show", "a", "disorganized", "region", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Left, orthogonal view of a 20μm tumor section labelled with antibodies against EpCAM (in red) and DNA in blue. Right, dot plot bar representing cell heights in cells from tumor sections, n=60 cells from 1 tumor.(C) On the left, images of low magnification views of healthy tissues labelled with antibodies against pericentrin (PCNT) and CDK5RAP2, shown in red and green, respectively. DNA is in blue. The white dashed squares represent the regions shown in higher magnifications on the right. One centrosome was considered as such when PCNT and CDK5RAP2 signals co-localized (Inset 1). Lack of co-localization (Insets 2 and 3) was noticed and discarded during quantification.(D) Super-resolution microscopy of healthy tissues labelled for the centriole marker CEP135 (in green) and PCNT (in red).(E-F) Representative images of two different fields of the same tumor (E) and of a tumor section to highlight different centrososome phenotypes, labelled as described in (C). The pink dashed line highlights an area of cells without centrosomes. The white dashed squares represent the regions shown in higher magnifications in insets in (G and I) and the pink dashed linesurrounds nuclei without centrosomes. (G) Insets from (F). (H) Examples of tumor sections showing small (left) and large (right) regions with nuclei without centrosomes.(I) Insets from (F) showing different types of centrosome amplification events.(J) Super-resolution microscopy of tumor tissues labelled as in (C).(K) Maximum Z-projection of a tumor section labelled with EpCAM antibodies (Red) and DNA in blue. The dashed line shows the absence of EpCAM staining, arrows show a disorganized region."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Images", "of", "EOC", "tumors", "labelled", "with", "antibodies", "against", "PCNT", "(", "red", ")", "and", "CDKRAP2", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "The", "colored", "arrows", "reflect", "different", "centrosome", "number", ".", "The", "list", "of", "centrosome", "behaviors", "annotated", "it", "is", "not", "exhaustive", "to", "allow", "comprehension", "of", "the", "events", ".", "#", "TT72", ",", "shows", "a", "cyst", "-", "like", "arrangement", "of", "EOC", "nuclei", "where", "it", "is", "impossible", "to", "correspond", "centrosomes", "to", "individual", "nuclei", ".", "The", "white", "bars", "with", "arrows", "of", "different", "colors", "highlight", "possible", "interpretations", "of", "the", "same", "condition", ".", "In", "#", "TT79", ",", "regions", "without", "centrosomes", "can", "be", "identified", ".", "In", "the", "inset", ",", "a", "single", "centrosome", "localized", "in", "the", "lumen", "can", "be", "identified", "and", "it", "is", "not", "possible", "to", "know", "to", "which", "nucleus", "(", "white", "dashed", "lines", ")", "it", "corresponds", "to", ".", "#", "TT88", "presents", "only", "very", "small", "clusters", "of", "centrosomes", ",", "few", "nuclei", "without", "centrosomes", "and", "many", "conditions", "with", "2", "centrosomes", ".", "In", "#", "TT61", ",", "regions", "without", "centrosomes", "can", "be", "distinguished", ",", "in", "addition", "to", "nuclei", "associated", "with", "single", "centrosomes", ".", "In", "#", "TT46", ",", "clusters", "containing", "large", "(", "inset", "1", ")", "or", "small", "clusters", "(", "inset", "3", ")", "can", "be", "identified", ".", "In", "cyst", "-", "like", "arrangements", "several", "centrosomes", "can", "be", "identified", "(", "inset", "2", ")", ",", "suggesting", "that", "all", "cells", "have", "at", "least", "one", "centrosome", "or", ",", "in", "contrast", "just", "one", "centrosome", "(", "inset", "4", ")", ",", "illustrating", "lack", "of", "centrosomes", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Plots", "showing", "the", "frequency", "of", "centrosome", "amplification", "events", "(", "B", ")", "and", "the", "frequency", "of", "nuclei", "without", "centrosomes", "(", "C", ")", "in", "tumor", "tissues", ".", "Note", "that", "in", "B", "and", "C", ",", "the", "order", "of", "the", "tumors", "is", "conserved", "between", "the", "two", "plots", "to", "allow", "for", "comparison", ".", "For", "each", "tumor", ",", "10", "random", "fields", "were", "chosen", "and", "analysed", ",", "with", "an", "average", "of", "5248", "nuclei", "counted", "per", "tumor", ".", "(", "D", ")", "Tumor", "sections", "labelled", "with", "CEP135", "(", "green", ")", "and", "PCNT", "(", "red", ")", "on", "the", "left", "and", "CEP135", "(", "green", ")", "and", "CEP192", "(", "red", ")", "on", "the", "right", ".", "The", "white", "squares", "represent", "the", "regions", "shown", "in", "higher", "magnifications", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Images of EOC tumors labelled with antibodies against PCNT (red) and CDKRAP2 (green). Nuclei are shown in blue. The colored arrows reflect different centrosome number. The list of centrosome behaviors annotated it is not exhaustive to allow comprehension of the events. #TT72, shows a cyst-like arrangement of EOC nuclei where it is impossible to correspond centrosomes to individual nuclei. The white bars with arrows of different colors highlight possible interpretations of the same condition. In #TT79, regions without centrosomes can be identified. In the inset, a single centrosome localized in the lumen can be identified and it is not possible to know to which nucleus (white dashed lines) it corresponds to. #TT88 presents only very small clusters of centrosomes, few nuclei without centrosomes and many conditions with 2 centrosomes. In #TT61, regions without centrosomes can be distinguished, in addition to nuclei associated with single centrosomes. In #TT46, clusters containing large (inset 1) or small clusters (inset 3) can be identified. In cyst-like arrangements several centrosomes can be identified (inset 2), suggesting that all cells have at least one centrosome or, in contrast just one centrosome (inset 4), illustrating lack of centrosomes.(B-C) Plots showing the frequency of centrosome amplification events (B) and the frequency of nuclei without centrosomes (C) in tumor tissues. Note that in B and C, the order of the tumors is conserved between the two plots to allow for comparison. For each tumor, 10 random fields were chosen and analysed, with an average of 5248 nuclei counted per tumor.(D) Tumor sections labelled with CEP135 (green) and PCNT (red) on the left and CEP135 (green) and CEP192 (red) on the right. The white squares represent the regions shown in higher magnifications on the right."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Stills", "of", "a", "time", "-", "lapse", "movie", "of", "Ctrl", "spheroids", ".", "Time", "is", "shown", "in", "hours", "(", "hrs", ")", ".", "(", "C", ")", "z", "-", "view", "of", "Ctrl", "cells", "as", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Note", "the", "red", "-", "colored", "cancer", "cells", "at", "the", "beginning", "of", "the", "movie", "on", "top", "of", "the", "mesothelial", "layer", "(", "green", ")", "while", "at", "later", "time", "points", ",", "they", "have", "cleared", "through", "the", "mesothelial", "cells", ".", "(", "D", ")", "Graph", "bars", "of", "the", "normalized", "clearance", "in", "A", ".", "U", ".", "of", "iOVCAR8", "(", "left", ")", "and", "iSKOV3", "(", "right", ")", "spheroids", "after", "the", "indicated", "treatments", ".", "The", "two", "cell", "lines", "show", "different", "clearance", "capacity", ".", "For", "each", "cell", "line", ",", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "For", "iOVCAR8", ",", "we", "analyzed", "47", "spheroids", "in", "DMSO", "and", "56", "spheroids", "in", "centrinone", ".", "For", "iSKOV3", "we", "analyzed", "56", "spheroids", "in", "DMSO", "and", "48", "spheroids", "in", "centrinone", ".", "Dots", "represent", "the", "mean", "and", "the", "shadow", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "with", "an", "ANCOVA", "test", ".", "Dots", "represent", "the", "mean", "and", "the", "shadow", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "with", "an", "ANOVA", "test", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "DMSO", "(", "left", ")", "and", "centrinone", "(", "right", ")", "spheroids", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "Red", "nuclei", "represent", "false", "colored", "invading", "nuclei", ".", "(", "G", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "quantification", "of", "the", "number", "of", "nuclei", "detected", "on", "the", "bottom", "side", "of", "the", "BM", ".", "Three", "or", "four", "positions", "from", "three", "BM", "inserts", "were", "analyzed", "in", "each", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "with", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "For", "all", "the", "experiments", ",", "the", "centrosome", "number", "was", "verified", "in", "parallel", "to", "confirm", "the", "decreased", "centrosome", "conditions", "compared", "to", "DMSO", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Stills of a time-lapse movie of Ctrl spheroids. Time is shown in hours (hrs). (C) z- view of Ctrl cells as shown in (B). Note the red-colored cancer cells at the beginning of the movie on top of the mesothelial layer (green) while at later time points, they have cleared through the mesothelial cells.(D) Graph bars of the normalized clearance in A.U. of iOVCAR8 (left) and iSKOV3 (right) spheroids after the indicated treatments. The two cell lines show different clearance capacity. For each cell line, three independent experiments were performed. For iOVCAR8, we analyzed 47 spheroids in DMSO and 56 spheroids in centrinone. For iSKOV3 we analyzed 56 spheroids in DMSO and 48 spheroids in centrinone. Dots represent the mean and the shadow±SEM. Statistical significance was assessed with an ANCOVA test. Dots represent the mean and the shadow±SEM. Statistical significance was assessed with an ANOVA test.(F) Representative images of DMSO (left) and centrinone (right) spheroids. Mean±SD. Red nuclei represent false colored invading nuclei. (G) Dot plot showing the quantification of the number of nuclei detected on the bottom side of the BM. Three or four positions from three BM inserts were analyzed in each condition. Mean±SD. Statistical significance was assessed with the Mann-Whitney test. For all the experiments, the centrosome number was verified in parallel to confirm the decreased centrosome conditions compared to DMSO."}
{"words": ["Figure", "1Vero", "and", "Caco", "-", "2", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOIs", "of", "0", ".", "2", "for", "8", "h", ".", "Infected", "cells", "were", "then", "permeabilized", "and", "immunostained", "for", "the", "intracellular", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "nucleoprotein", "(", "NP", ",", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "before", "imaging", "by", "fluorescence", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "Infection", "of", "Vero", "and", "Caco", "-", "2", "cells", "was", "monitored", "over", "24", "h", "using", "the", "same", "flow", "cytometry", "-", "based", "assay", "used", "for", "the", "experiment", "shown", "in", "panel", "D", ".", "Infection", "is", "given", "as", "the", "total", "fluorescence", "associated", "with", "the", "NP", "protein", "-", "positive", "cells", ".", "MFI", ",", "mean", "fluorescence", "intensity", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Vero and Caco-2 cells were infected with SARS-CoV-2 at MOIs of 0.2 for 8 h. Infected cells were then permeabilized and immunostained for the intracellular SARS-CoV-2 nucleoprotein (NP, red). Nuclei were stained with Hoechst (blue) before imaging by fluorescence confocal microscopy. Scale bars: 100 µm.Infection of Vero and Caco-2 cells was monitored over 24 h using the same flow cytometry-based assay used for the experiment shown in panel D. Infection is given as the total fluorescence associated with the NP protein-positive cells. MFI, mean fluorescence intensity. n = 3."}
{"words": ["Figure", "2Cells", "were", "pretreated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "aprotinin", "(", "A", ")", "and", "SB412515", "(", "B", ")", ",", "which", "are", "inhibitors", "of", "TMPRSS2", "and", "cathepsin", "L", ",", "respectively", ".", "Infection", "of", "Calu", "-", "3", ",", "Caco", "-", "2", ",", "A549", "*", ",", "and", "Vero", "cells", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOIs", "of", "0", ".", "3", ",", "0", ".", "4", ",", "0", ".", "2", ",", "and", "0", ".", "3", ",", "respectively", ",", "was", "achieved", "in", "the", "continuous", "presence", "of", "the", "drug", ".", "Infected", "cells", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "samples", "where", "inhibitors", "had", "been", "omitted", ".", "n", "=", "2", "-", "4", "biological", "replicates", ".", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "particles", "were", "bound", "to", "A549", "*", "and", "Vero", "cells", "(", "MOIs", "0", ".", "2", "and", "0", ".", "3", ",", "respectively", ")", "(", "C", ")", "or", "Calu", "-", "3", "and", "Caco", "-", "2", "cells", "(", "0", ".", "6", "and", "0", ".", "5", ",", "respectively", ")", "(", "D", ")", "on", "ice", "for", "90", "min", "and", "subsequently", "warmed", "rapidly", "to", "37", "°", "C", "to", "allow", "infectious", "penetration", ".", "SB412515", "(", "10", "µM", ",", "C", ")", "or", "aprotinin", "(", "30", "µM", ",", "D", ")", "was", "added", "at", "different", "times", "post", "warming", "to", "block", "further", "proteolytic", "activation", ".", "Infection", "was", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "samples", "where", "protease", "inhibitors", "had", "been", "omitted", ".", "n", "=", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cells were pretreated with the indicated concentrations of aprotinin (A) and SB412515 (B), which are inhibitors of TMPRSS2 and cathepsin L, respectively. Infection of Calu-3, Caco-2, A549*, and Vero cells with SARS-CoV-2 at MOIs of 0.3, 0.4, 0.2, and 0.3, respectively, was achieved in the continuous presence of the drug. Infected cells were quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D, and data were normalized to samples where inhibitors had been omitted. n = 2-4 biological replicates.SARS-CoV-2 particles were bound to A549* and Vero cells (MOIs 0.2 and 0.3, respectively) (C) or Calu-3 and Caco-2 cells (0.6 and 0.5, respectively) (D) on ice for 90 min and subsequently warmed rapidly to 37°C to allow infectious penetration. SB412515 (10 µM, C) or aprotinin (30 µM, D) was added at different times post warming to block further proteolytic activation. Infection was analyzed by flow cytometry, and data were normalized to samples where protease inhibitors had been omitted. n = 2."}
{"words": ["Figure", "3Cells", "were", "pretreated", "with", "endosomal", "-", "pH", "interfering", "drugs", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "subsequently", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "as", "described", "in", "Fig", ".", "2A", "and", "2B", "in", "the", "continuous", "presence", "of", "NH4Cl", "(", "A", ")", ",", "chloroquine", "(", "B", ")", ",", "bafilomycin", "A1", "(", "C", ")", ",", "or", "concanamycin", "B", "(", "D", ")", ".", "The", "proportion", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "control", "samples", "that", "were", "not", "treated", "with", "inhibitors", ".", "n", "=", "2", "-", "6", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Cells were pretreated with endosomal-pH interfering drugs at the indicated concentrations and subsequently infected with SARS-CoV-2 as described in Fig. 2A and 2B in the continuous presence of NH4Cl (A), chloroquine (B), bafilomycin A1 (C), or concanamycin B (D). The proportion of infected cells was quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D, and data were normalized to control samples that were not treated with inhibitors. n = 2-6 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4A549", "*", "cells", "expressing", "or", "lacking", "TMPRSS2", "were", "pretreated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "camostat", "mesylate", "(", "B", ")", ",", "SB412515", "(", "C", ")", ",", "and", "bafilomycin", "A1", "(", "D", ")", ".", "Infection", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "~", "0", ".", "2", ")", "was", "achieved", "in", "the", "continuous", "presence", "of", "the", "drug", ".", "Infected", "cells", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "samples", "where", "inhibitors", "had", "been", "omitted", ".", "n", "=", "5", "-", "6", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A549* cells expressing or lacking TMPRSS2 were pretreated with the indicated concentrations of camostat mesylate (B), SB412515 (C), and bafilomycin A1 (D). Infection with SARS-CoV-2 (MOI ~0.2) was achieved in the continuous presence of the drug. Infected cells were quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D, and data were normalized to samples where inhibitors had been omitted. n = 5-6 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5The", "timing", "of", "the", "MG", "-", "132", "-", "sensitive", "step", "during", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "infectious", "entry", "into", "Calu", "-", "3", "and", "Caco", "-", "2", "cells", "was", "assayed", "as", "detailed", "in", "D", "but", "using", "60", "µM", "MG", "-", "132", "for", "Caco", "-", "2", "cells", "and", "MOIs", "of", "0", ".", "5", "and", "0", ".", "6", ",", "respectively", ".", "n", "=", "2", ".", "A549", "*", "cells", "expressing", "or", "lacking", "TMPRSS2", "were", "pretreated", "with", "MG", "-", "132", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "subsequently", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "~", "0", ".", "2", ")", "in", "the", "continuous", "presence", "of", "the", "drug", ".", "The", "proportion", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "that", "from", "control", "samples", "for", "which", "MG", "-", "132", "had", "been", "omitted", ".", "n", "=", "6", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The timing of the MG-132-sensitive step during SARS-CoV-2 infectious entry into Calu-3 and Caco-2 cells was assayed as detailed in D but using 60 µM MG-132 for Caco-2 cells and MOIs of 0.5 and 0.6, respectively. n = 2.A549* cells expressing or lacking TMPRSS2 were pretreated with MG-132 at the indicated concentrations and subsequently infected with SARS-CoV-2 (MOI ~0.2) in the continuous presence of the drug. The proportion of infected cells was quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D, and data were normalized to that from control samples for which MG-132 had been omitted. n = 6 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6SARS", "-", "CoV", "-", "2", "was", "subjected", "to", "pretreatment", "with", "trypsin", "and", "furin", "for", "15", "min", "at", "37", "°", "C", "prior", "to", "infection", "of", "Caco", "-", "2", "and", "Vero", "cells", "(", "MOIs", "of", "0", ".", "4", "and", "0", ".", "3", ",", "respectively", ")", ".", "Infected", "cells", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "samples", "not", "pretreated", "with", "trypsin", ".", "n", "=", "4", "-", "6", "biological", "replicates", ".", "A549", "*", "expressing", "or", "lacking", "TMPRSS2", "cells", "and", "Vero", "cells", "were", "first", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOIs", "of", "0", ".", "1", "and", "0", ".", "2", ",", "respectively", ",", "for", "24", "h", "and", "then", "cocultured", "for", "5", "h", "along", "with", "target", "cells", ",", "not", "infected", "but", "prestained", "with", "CMFDA", ",", "a", "cytosolic", "green", "dye", ".", "Cells", "were", "subsequently", "treated", "with", "trypsin", "or", "furin", "for", "5", "min", "at", "37", "°", "C", "and", "left", "to", "coculture", "for", "an", "additional", "hour", "at", "37", "°", "C", ".", "After", "fixation", ",", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ",", "and", "infected", "cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "against", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "nucleoprotein", "(", "magenta", ")", ".", "Samples", "were", "ultimately", "imaged", "by", "confocal", "fluorescence", "microscopy", ".", "White", "stars", "indicate", "syncytia", "with", "at", "least", "four", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "Images", "of", "microscope", "fields", "obtained", "in", "(", "E", ")", "were", "quantified", "[", "A549", "*", ":", "n", "(", "no", "virus", ")", "=", "30", ",", "n", "(", "no", "protease", ")", "=", "80", ",", "n", "(", "trypsin", ")", "=", "80", ",", "and", "n", "(", "furin", ")", "=", "60", ";", "A549", "*", "TMPRSS2", ":", "n", "(", "no", "virus", ")", "=", "30", ",", "n", "(", "no", "protease", ")", "=", "80", ",", "n", "(", "trypsin", ")", "=", "79", ",", "and", "n", "(", "furin", ")", "=", "60", ";", "Vero", ":", "n", "(", "no", "virus", ")", "=", "40", ",", "n", "(", "no", "protease", ")", "=", "112", ",", "n", "(", "trypsin", ")", "=", "114", ",", "and", "n", "(", "furin", ")", "=", "60", "]", ".", "The", "fusion", "index", "is", "given", "as", "f", "=", "1", "-", "[", "(", "number", "of", "cells", "in", "a", "field", "after", "fusion", ")", "/", "(", "number", "of", "nuclei", ")", "]", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6SARS-CoV-2 was subjected to pretreatment with trypsin and furin for 15 min at 37°C prior to infection of Caco-2 and Vero cells (MOIs of 0.4 and 0.3, respectively). Infected cells were quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D. Data were normalized to samples not pretreated with trypsin. n = 4-6 biological replicates.A549* expressing or lacking TMPRSS2 cells and Vero cells were first infected with SARS-CoV-2 at MOIs of 0.1 and 0.2, respectively, for 24 h and then cocultured for 5 h along with target cells, not infected but prestained with CMFDA, a cytosolic green dye. Cells were subsequently treated with trypsin or furin for 5 min at 37°C and left to coculture for an additional hour at 37°C. After fixation, nuclei were stained with Hoechst (blue), and infected cells were subjected to immunofluorescence staining against SARS-CoV-2 nucleoprotein (magenta). Samples were ultimately imaged by confocal fluorescence microscopy. White stars indicate syncytia with at least four nuclei. Scale bars: 100 µm. Images of microscope fields obtained in (E) were quantified [A549*: n (no virus) = 30, n (no protease) = 80, n (trypsin) = 80, and n (furin) = 60; A549* TMPRSS2: n (no virus) = 30, n (no protease) = 80, n (trypsin) = 79, and n (furin) = 60; Vero: n (no virus) = 40, n (no protease) = 112, n (trypsin) = 114, and n (furin) = 60]. The fusion index is given as f = 1 - [(number of cells in a field after fusion)/(number of nuclei)]."}
{"words": ["Figure", "7SARS", "-", "CoV", "-", "2", "particles", "(", "MOI", "of", "0", ".", "3", ")", "were", "first", "subjected", "to", "trypsin", "treatment", "for", "15", "min", "at", "37", "°", "C", "and", "then", "exposed", "to", "buffers", "at", "the", "indicated", "pH", "for", "10", "min", "at", "37", "°", "C", ",", "and", "vice", "versa", ".", "Calu", "-", "3", "and", "Vero", "cells", "were", "then", "infected", "at", "a", "MOI", "of", "0", ".", "3", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ".", "n", "=", "4", "-", "8", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7SARS-CoV-2 particles (MOI of 0.3) were first subjected to trypsin treatment for 15 min at 37°C and then exposed to buffers at the indicated pH for 10 min at 37°C, and vice versa. Calu-3 and Vero cells were then infected at a MOI of 0.3 and analyzed by flow cytometry as described in Fig. 1D. n = 4-8 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "8SARS", "-", "CoV", "-", "2", "was", "first", "treated", "with", "trypsin", "or", "thermolysin", "and", "then", "allowed", "to", "infect", "A549", "*", "and", "Vero", "cells", "(", "MOIs", "~", "0", ".", "2", "and", "0", ".", "3", ")", "in", "the", "continuous", "presence", "of", "SB412515", "(", "cathepsin", "L", "inhibitor", ")", ".", "Infected", "cells", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1D", ",", "and", "data", "were", "normalized", "to", "samples", "where", "SB412515", "had", "been", "omitted", ".", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8SARS-CoV-2 was first treated with trypsin or thermolysin and then allowed to infect A549* and Vero cells (MOIs ~0.2 and 0.3) in the continuous presence of SB412515 (cathepsin L inhibitor). Infected cells were quantified by flow cytometry as described in Fig. 1D, and data were normalized to samples where SB412515 had been omitted. n = 4 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "Tissue", "distribution", "of", "the", "Ldb2", "protein", ".", "Representative", "western", "-", "blot", "image", "is", "shown", ".", "Yellow", "asterisks", "indicate", "uncharacterized", "bands", ".", "D", ".", "Expression", "of", "Ldb2", "in", "the", "cerebral", "cortex", ".", "DAPI", "-", "stained", "nuclei", "visualized", "(", "right", ")", "in", "the", "cerebral", "cortex", ".", "E", ".", "Expression", "of", "Ldb2", "in", "the", "amygdala", ".", "LA", ";", "lateral", "amygdala", ",", "BLA", ";", "basolateral", "amygdala", ",", "Ce", ";", "central", "nucleus", "of", "amygdala", ".", "F", "-", "G", ".", "Expression", "of", "Ldb2", "in", "neurons", ".", "The", "merged", "images", "obtained", "with", "Ldb2", "(", "stained", "in", "green", ")", "and", "NeuN", "(", "stained", "in", "red", ")", "antibodies", "are", "shown", "for", "cerebral", "cortex", "layers", "I", "-", "VI", "and", "the", "amygdala", "(", "F", ")", ".", "most", "of", "Ldb2", "-", "positive", "cells", "are", "NeuN", "-", "positive", ".", "G", ".", "NeuN", "-", "positive", "cells", "/", "Ldb2", "-", "positive", "cells", "(", "left", ")", "and", "Ldb2", "-", "positive", "cells", "/", "NeuN", "-", "positive", "cells", "were", "counted", "in", "cerebral", "cortex", "layers", "I", "-", "VI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. Tissue distribution of the Ldb2 protein. Representative western-blot image is shown. Yellow asterisks indicate uncharacterized bands.D. Expression of Ldb2 in the cerebral cortex. DAPI-stained nuclei visualized (right) in the cerebral cortex.E. Expression of Ldb2 in the amygdala. LA; lateral amygdala, BLA; basolateral amygdala, Ce; central nucleus of amygdala.F-G. Expression of Ldb2 in neurons. The merged images obtained with Ldb2 (stained in green) and NeuN (stained in red) antibodies are shown for cerebral cortex layers I-VI and the amygdala (F). most of Ldb2-positive cells are NeuN-positive. G. NeuN-positive cells/Ldb2-positive cells (left) and Ldb2-positive cells/NeuN-positive cells were counted in cerebral cortex layers I-VI."}
{"words": ["Figure", "2Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Home", "cage", "-", "activity", "test", "(", "A", ")", ".", "Voluntary", "locomotor", "activities", "in", "the", "home", "cages", "were", "monitored", "for", "a", "week", ".", "Data", "of", "dark", "(", "left", ")", "and", "light", "(", "right", ")", "phases", "are", "indicated", ".", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Open", "-", "field", "test", "(", "B", ")", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Acoustic", "startle", "response", "(", "C", ")", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Prepulse", "-", "inhibition", "test", "(", "D", ")", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", ",", "Morris", "water", "-", "maze", "test", "(", "E", ")", "where", "data", "in", "hidden", "test", "(", "escape", "latency", "and", "moving", "speed", ",", "path", "length", "and", "no", "movement", "time", ")", "and", "probe", "test", "(", "path", "length", ")", "are", "shownLdb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Y", "-", "maze", "test", "(", "F", ")", ".", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Fear", "-", "conditioning", "test", "(", "G", ")", ".", "Results", "of", "contextual", "(", "left", ")", "and", "cued", "(", "right", ")", "tests", "are", "shown", ".", "Ldb2", "KO", "mice", "(", "red", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "were", "compared", "to", "control", "(", "blue", ",", "n", "=", "10", "-", "11", ")", "in", "Hot", "-", "plate", "test", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Home cage-activity test (A). Voluntary locomotor activities in the home cages were monitored for a week. Data of dark (left) and light (right) phases are indicated.Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Open-field test (B)Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Acoustic startle response (C)Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Prepulse-inhibition test (D)Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in , Morris water-maze test (E) where data in hidden test (escape latency and moving speed, path length and no movement time) and probe test (path length) are shownLdb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Y-maze test (F).Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Fear-conditioning test (G). Results of contextual (left) and cued (right) tests are shown.Ldb2 KO mice (red, n = 10-11) were compared to control (blue, n = 10-11) in Hot-plate test (H)."}
{"words": ["Figure", "3Locomotor", "activity", "was", "assessed", "in", "the", "same", "experimental", "set", "as", "in", "the", "open", "-", "field", "test", ".", "After", "acclimation", "for", "120", "min", ",", "mice", "(", "n", "=", "10", "-", "12", "/", "group", ")", "were", "injected", "(", "arrows", ")", "with", "methylphenidate", "(", "MPD", ":", "3", "mg", "/", "kg", ",", "A", ")", "and", "their", "locomotor", "activity", "was", "monitored", ".", "In", "the", "right", "panels", ",", "cumulative", "values", "for", "pre", "-", "and", "post", "-", "injection", "times", "are", "also", "shown", ".", "Locomotor", "activity", "was", "assessed", "in", "the", "same", "experimental", "set", "as", "in", "the", "open", "-", "field", "test", ".", "After", "acclimation", "for", "120", "min", ",", "mice", "(", "n", "=", "10", "-", "12", "/", "group", ")", "were", "injected", "(", "arrows", ")", "with", "MK", "-", "801", "(", "0", ".", "2", "mg", "/", "kg", ",", "B", ")", "and", "their", "locomotor", "activity", "was", "monitored", ".", "In", "the", "right", "panels", ",", "cumulative", "values", "for", "pre", "-", "and", "post", "-", "injection", "times", "are", "also", "shown", ".", "C", ".", "Popping", "behavior", "induced", "by", "the", "injection", "of", "MK", "-", "801", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", ")", "was", "manually", "assessed", "in", "WT", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "KO", "(", "n", "=", "6", ")", "animals", ".", "Typically", ",", "each", "episode", "is", "constituted", "by", "blocks", "of", "5", "-", "15", "successive", "jumping", "behaviors", ".", "Episode", "numbers", "in", "20", "min", "(", "left", ")", "and", "total", "duration", "(", "right", ")", "are", "shown", "in", "a", "box", "-", "whisker", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Locomotor activity was assessed in the same experimental set as in the open-field test. After acclimation for 120 min, mice (n = 10-12/group) were injected (arrows) with methylphenidate (MPD: 3 mg/kg, A) and their locomotor activity was monitored. In the right panels, cumulative values for pre- and post-injection times are also shown.Locomotor activity was assessed in the same experimental set as in the open-field test. After acclimation for 120 min, mice (n = 10-12/group) were injected (arrows) with MK-801 (0.2 mg/kg, B) and their locomotor activity was monitored. In the right panels, cumulative values for pre- and post-injection times are also shown.C. Popping behavior induced by the injection of MK-801 (0.5 mg/kg) was manually assessed in WT (n = 4) and KO (n = 6) animals. Typically, each episode is constituted by blocks of 5-15 successive jumping behaviors. Episode numbers in 20 min (left) and total duration (right) are shown in a box-whisker plot."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Fear", "-", "conditioning", "test", ".", "Freezing", "(", "%", ")", "was", "monitored", "in", "the", "cued", "(", "top", ")", "and", "contextual", "(", "bottom", ")", "tests", "before", "(", "pre", ")", "and", "after", "(", "post", ")", "administration", "of", "clozapine", "(", "left", ")", "or", "haloperidol", "(", "right", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "n", "=", "7", "-", "9", "/", "group", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Tukey", "test", ")", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "t", "-", "test", ",", "KO", "/", "saline", "vs", ".", "KO", "/", "clozapine", ")", ".", "B", ".", "Home", "cage", "-", "activity", "test", ".", "Spontaneous", "locomotor", "activity", "of", "mice", "chronically", "fed", "chow", "with", "or", "without", "0", ".", "24", "%", "(", "w", "/", "w", ")", "lithium", "carbonate", "for", "two", "months", "was", "monitored", "for", "6", "days", "in", "the", "home", "cage", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Fear-conditioning test. Freezing (%) was monitored in the cued (top) and contextual (bottom) tests before (pre) and after (post) administration of clozapine (left) or haloperidol (right). Data are presented as means ± S.E.M. (n = 7-9/group). *, p < 0.05; ***, p < 0.001 (Tukey test); #, p < 0.05 (t-test, KO/saline vs. KO/clozapine).B. Home cage-activity test. Spontaneous locomotor activity of mice chronically fed chow with or without 0.24% (w/w) lithium carbonate for two months was monitored for 6 days in the home cage."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Scatter", "plots", "showing", "Venus", "-", "fluorescent", "intensities", "and", "the", "median", "amplitude", "of", "miniature", "EPSCs", "(", "mEPSC", ")", "in", "the", "LA", "of", "the", "AV", "-", "KO", "mice", "and", "their", "littermates", "(", "AV", "-", "WT", ")", ".", "B", ".", "Scatter", "plots", "showing", "Venus", "-", "fluorescent", "intensities", "and", "the", "mean", "frequency", "of", "miniature", "EPSCs", "in", "the", "LA", "of", "the", "AV", "-", "KO", "and", "their", "control", "littermates", "(", "AV", "-", "WT", ")", ".", "Three", "typical", "pictures", "of", "Venus", "-", "positive", "cells", "with", "various", "fluorescent", "intensities", "are", "shown", ".", "Lines", "in", "each", "panel", "are", "regression", "lines", "showing", "inverse", "correlation", "of", "the", "fluorescent", "intensity", "with", "the", "mEPSC", "amplitude", "(", "A", ")", "or", "the", "mEPSC", "frequency", "(", "B", ")", ".", "The", "black", "dotted", "lines", "are", "regression", "lines", "for", "AV", "-", "WT", "mice", ",", "the", "red", "dotted", "lines", "are", "those", "for", "AV", "-", "KO", "mice", ",", "and", "black", "solid", "lines", "are", "those", "for", "all", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Scatter plots showing Venus-fluorescent intensities and the median amplitude of miniature EPSCs (mEPSC) in the LA of the AV-KO mice and their littermates (AV-WT). B. Scatter plots showing Venus-fluorescent intensities and the mean frequency of miniature EPSCs in the LA of the AV-KO and their control littermates (AV-WT). Three typical pictures of Venus-positive cells with various fluorescent intensities are shown. Lines in each panel are regression lines showing inverse correlation of the fluorescent intensity with the mEPSC amplitude (A) or the mEPSC frequency (B). The black dotted lines are regression lines for AV-WT mice, the red dotted lines are those for AV-KO mice, and black solid lines are those for all cells. "}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Numbers", "of", "Venus", "-", "positive", "neurons", "in", "the", "lateral", "nucleus", "(", "LA", ")", "and", "the", "lateral", "side", "of", "the", "basal", "nucleus", "(", "BAl", ")", "of", "Naive", ",", "Unpaired", ",", "and", "Paired", "groups", ".", "Open", "and", "filled", "bars", "represent", "AV", "-", "WT", "and", "AV", "-", "KO", "mice", ",", "respectively", ".", "Positive", "neurons", "of", "AV", "-", "WT", "was", "increased", "only", "in", "the", "Paired", "group", "compared", "to", "the", "Naïve", "and", "Unpaired", "groups", "in", "the", "LA", "(", "upper", "panel", ")", ".", "AV", "-", "KO", "was", "increased", "in", "the", "Unpaired", "as", "well", "as", "the", "Paired", "groups", "compared", "to", "the", "Naïve", "group", "Positive", "neurons", "both", "in", "the", "Unpaired", "and", "Paired", "AV", "-", "KO", "mice", "were", "increased", "compared", "to", "the", "same", "groups", "of", "the", "AV", "-", "WT", "mice", "In", "the", "BAl", ",", "positive", "neurons", "were", "increased", "both", "in", "the", "Unpaired", "and", "Paired", "groups", "compared", "to", "the", "Naïve", "group", "in", "both", "the", "AV", "-", "WT", "and", "AV", "-", "KO", "mice", "The", "error", "bars", "represent", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "n", "=", "5", "/", "group", ")", ".", "C", ".", "Numbers", "of", "Venus", "-", "positive", "neurons", "classified", "by", "fluorescence", "intensities", "in", "the", "LA", "of", "the", "AV", "-", "WT", "and", "AV", "-", "KO", "mice", ".", "Weak", "positive", "neurons", "were", "increased", "in", "the", "Paired", "group", "compared", "to", "the", "Naïve", "group", "in", "AV", "-", "WT", "Both", "Weak", "and", "Middle", "positive", "neurons", "were", "increased", "in", "the", "Paired", "group", "compared", "to", "the", "Naïve", "group", "in", "AV", "-", "KO", "The", "increment", "of", "the", "Middle", "Venus", "-", "positive", "neurons", "was", "larger", "in", "the", "AV", "-", "KO", "compared", "to", "AV", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Numbers of Venus-positive neurons in the lateral nucleus (LA) and the lateral side of the basal nucleus (BAl) of Naive, Unpaired, and Paired groups. Open and filled bars represent AV-WT and AV-KO mice, respectively. Positive neurons of AV-WT was increased only in the Paired group compared to the Naïve and Unpaired groups in the LA (upper panel). AV-KO was increased in the Unpaired as well as the Paired groups compared to the Naïve group Positive neurons both in the Unpaired and Paired AV-KO mice were increased compared to the same groups of the AV-WT mice In the BAl , positive neurons were increased both in the Unpaired and Paired groups compared to the Naïve group in both the AV-WT and AV-KO mice The error bars represent S.E.M. (n =5/group).C. Numbers of Venus-positive neurons classified by fluorescence intensities in the LA of the AV-WT and AV-KO mice. Weak positive neurons were increased in the Paired group compared to the Naïve group in AV-WT Both Weak and Middle positive neurons were increased in the Paired group compared to the Naïve group in AV-KO The increment of the Middle Venus-positive neurons was larger in the AV-KO compared to AV-WT"}
{"words": ["Figure", "7Results", "of", "coimmunoprecipitation", "between", "overexpressed", "LDB2", "and", "interaction", "candidates", "LDB2", "vs", ".", "LDB2", "(", "A", ")", "LDB2", "(", "WT", ",", "T83N", "or", "P170L", ")", "and", "candidate", "interactors", "were", "tagged", "with", "Flag", "and", "HA", ",", "respectively", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "construct", "and", "HA", "-", "construct", "indicated", ".", "After", "Flag", "-", "LDB2", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "Flag", "antibody", ",", "the", "immunocomplexes", "were", "analyzed", "with", "western", "blotting", "with", "Flag", "and", "HA", "antibodies", ".", "The", "input", "samples", "(", "input", ")", "were", "also", "analyzed", ".", "Green", "and", "black", "arrowhead", "indicate", "positions", "for", "Flag", "-", "Ldb2", "and", "HA", "-", "proteins", ",", "respectively", ".", "Results", "of", "coimmunoprecipitation", "between", "overexpressed", "LDB2", "and", "interaction", "candidates", "LDB2", "vs", ".", "LHX2", "(", "B", ")", "LDB2", "(", "WT", ",", "T83N", "or", "P170L", ")", "and", "candidate", "interactors", "were", "tagged", "with", "Flag", "and", "HA", ",", "respectively", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "construct", "and", "HA", "-", "construct", "indicated", ".", "After", "Flag", "-", "LDB2", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "Flag", "antibody", ",", "the", "immunocomplexes", "were", "analyzed", "with", "western", "blotting", "with", "Flag", "and", "HA", "antibodies", ".", "The", "input", "samples", "(", "input", ")", "were", "also", "analyzed", ".", "Green", "and", "black", "arrowhead", "indicate", "positions", "for", "Flag", "-", "Ldb2", "and", "HA", "-", "proteins", ",", "respectively", ".", "Results", "of", "coimmunoprecipitation", "between", "overexpressed", "LDB2", "and", "interaction", "candidates", "LDB2", "vs", ".", "LMO2", "/", "3", "/", "4", "(", "C", ")", "LDB2", "(", "WT", ",", "T83N", "or", "P170L", ")", "and", "candidate", "interactors", "were", "tagged", "with", "Flag", "and", "HA", ",", "respectively", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "construct", "and", "HA", "-", "construct", "indicated", ".", "After", "Flag", "-", "LDB2", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "Flag", "antibody", ",", "the", "immunocomplexes", "were", "analyzed", "with", "western", "blotting", "with", "Flag", "and", "HA", "antibodies", ".", "The", "input", "samples", "(", "input", ")", "were", "also", "analyzed", ".", "Green", "and", "black", "arrowhead", "indicate", "positions", "for", "Flag", "-", "Ldb2", "and", "HA", "-", "proteins", ",", "respectively", ".", "Results", "of", "coimmunoprecipitation", "between", "overexpressed", "LDB2", "and", "interaction", "candidates", ",", "LDB2", "vs", ".", "SSBP2", "/", "3", "/", "4", "(", "D", ")", "LDB2", "(", "WT", ",", "T83N", "or", "P170L", ")", "and", "candidate", "interactors", "were", "tagged", "with", "Flag", "and", "HA", ",", "respectively", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "construct", "and", "HA", "-", "construct", "indicated", ".", "After", "Flag", "-", "LDB2", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "Flag", "antibody", ",", "the", "immunocomplexes", "were", "analyzed", "with", "western", "blotting", "with", "Flag", "and", "HA", "antibodies", ".", "The", "input", "samples", "(", "input", ")", "were", "also", "analyzed", ".", "Green", "and", "black", "arrowhead", "indicate", "positions", "for", "Flag", "-", "Ldb2", "and", "HA", "-", "proteins", ",", "respectively", ".", "Results", "of", "coimmunoprecipitation", "between", "overexpressed", "LDB2", "and", "interaction", "candidates", "LDB2", "vs", ".", "RLIM", "(", "E", ")", ".", "LDB2", "(", "WT", ",", "T83N", "or", "P170L", ")", "and", "candidate", "interactors", "were", "tagged", "with", "Flag", "and", "HA", ",", "respectively", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "construct", "and", "HA", "-", "construct", "indicated", ".", "After", "Flag", "-", "LDB2", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "Flag", "antibody", ",", "the", "immunocomplexes", "were", "analyzed", "with", "western", "blotting", "with", "Flag", "and", "HA", "antibodies", ".", "The", "input", "samples", "(", "input", ")", "were", "also", "analyzed", ".", "Green", "and", "black", "arrowhead", "indicate", "positions", "for", "Flag", "-", "Ldb2", "and", "HA", "-", "proteins", ",", "respectively", ".", "F", ".", "Coimmunoprecipitation", "of", "endogenous", "Ssbp3", "and", "Lmo3", "with", "Ldb2", ".", "Immunocomplexes", "from", "mouse", "brain", "lysate", "using", "an", "antibody", "against", "Ldb2", ",", "Lmo3", "or", "Ssbp3", ",", "or", "a", "control", "antibody", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "Ldb2", "(", "left", ")", "or", "anti", "-", "Ssbp3", "(", "right", ")", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Results of coimmunoprecipitation between overexpressed LDB2 and interaction candidates LDB2 vs. LDB2 (A) LDB2 (WT, T83N or P170L) and candidate interactors were tagged with Flag and HA, respectively. HEK293T cells were transfected with the Flag-construct and HA-construct indicated. After Flag-LDB2 was immunoprecipitated with a Flag antibody, the immunocomplexes were analyzed with western blotting with Flag and HA antibodies. The input samples (input) were also analyzed. Green and black arrowhead indicate positions for Flag-Ldb2 and HA-proteins, respectively.Results of coimmunoprecipitation between overexpressed LDB2 and interaction candidates LDB2 vs. LHX2 (B) LDB2 (WT, T83N or P170L) and candidate interactors were tagged with Flag and HA, respectively. HEK293T cells were transfected with the Flag-construct and HA-construct indicated. After Flag-LDB2 was immunoprecipitated with a Flag antibody, the immunocomplexes were analyzed with western blotting with Flag and HA antibodies. The input samples (input) were also analyzed. Green and black arrowhead indicate positions for Flag-Ldb2 and HA-proteins, respectively.Results of coimmunoprecipitation between overexpressed LDB2 and interaction candidates LDB2 vs. LMO2/3/4 (C) LDB2 (WT, T83N or P170L) and candidate interactors were tagged with Flag and HA, respectively. HEK293T cells were transfected with the Flag-construct and HA-construct indicated. After Flag-LDB2 was immunoprecipitated with a Flag antibody, the immunocomplexes were analyzed with western blotting with Flag and HA antibodies. The input samples (input) were also analyzed. Green and black arrowhead indicate positions for Flag-Ldb2 and HA-proteins, respectively.Results of coimmunoprecipitation between overexpressed LDB2 and interaction candidates , LDB2 vs. SSBP2/3/4 (D) LDB2 (WT, T83N or P170L) and candidate interactors were tagged with Flag and HA, respectively. HEK293T cells were transfected with the Flag-construct and HA-construct indicated. After Flag-LDB2 was immunoprecipitated with a Flag antibody, the immunocomplexes were analyzed with western blotting with Flag and HA antibodies. The input samples (input) were also analyzed. Green and black arrowhead indicate positions for Flag-Ldb2 and HA-proteins, respectively.Results of coimmunoprecipitation between overexpressed LDB2 and interaction candidates LDB2 vs. RLIM (E). LDB2 (WT, T83N or P170L) and candidate interactors were tagged with Flag and HA, respectively. HEK293T cells were transfected with the Flag-construct and HA-construct indicated. After Flag-LDB2 was immunoprecipitated with a Flag antibody, the immunocomplexes were analyzed with western blotting with Flag and HA antibodies. The input samples (input) were also analyzed. Green and black arrowhead indicate positions for Flag-Ldb2 and HA-proteins, respectively.F. Coimmunoprecipitation of endogenous Ssbp3 and Lmo3 with Ldb2. Immunocomplexes from mouse brain lysate using an antibody against Ldb2, Lmo3 or Ssbp3, or a control antibody were analyzed by western blotting using an anti-Ldb2 (left) or anti-Ssbp3 (right) antibody."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Human", "neurosphere", "(", "bottom", ")", "induced", "from", "iPS", "cells", "(", "top", ")", "from", "a", "healthy", "control", "subject", ".", "C", ".", "Overlap", "of", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "of", "LDB2", "in", "neurosphere", "cells", "and", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "of", "EGR1", "in", "human", "cultured", "cell", "lines", "ECC1", "and", "K562", ",", "at", "ARCD", ".", "Genome", "-", "wide", "pattern", "of", "overlap", "between", "the", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "of", "LDB2", "in", "neurosphere", "cells", "and", "the", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "of", "EGR1", "in", "the", "ECC1", "cell", "line", ".", "Fold", "enrichment", "(", "log2", ")", "of", "ChIP", "-", "seq", "reads", "against", "the", "input", "reads", "were", "calculated", "for", "each", "ChIP", "-", "seq", "peak", "region", "(", "summit", "±", "1", ",", "000", "bp", ")", "in", "each", "category", "(", "neurosphere", "specific", ",", "common", ",", "and", "ECC1", "specific", ")", "and", "displayed", "in", "a", "heatmap", "by", "ngs", ".", "plotE", ".", "Annotation", "of", "ChIP", "-", "seq", "peaks", ".", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "of", "LDB2", "in", "the", "neurosphere", "cells", "(", "all", ",", "neurosphere", "specific", ",", "and", "common", "were", "analyzed", "by", "the", "PAVIS"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Human neurosphere (bottom) induced from iPS cells (top) from a healthy control subject.C. Overlap of ChIP-seq peaks of LDB2 in neurosphere cells and ChIP-seq peaks of EGR1 in human cultured cell lines ECC1 and K562, at ARCD. Genome-wide pattern of overlap between the ChIP-seq peaks of LDB2 in neurosphere cells and the ChIP-seq peaks of EGR1 in the ECC1 cell line. Fold enrichment (log2) of ChIP-seq reads against the input reads were calculated for each ChIP-seq peak region (summit ± 1,000 bp) in each category (neurosphere specific, common, and ECC1 specific) and displayed in a heatmap by ngs.plotE. Annotation of ChIP-seq peaks. ChIP-seq peaks of LDB2 in the neurosphere cells (all, neurosphere specific, and common were analyzed by the PAVIS program"}
{"words": ["Figure", "1", ":", "Westernblot", "of", "producer", "cell", "lysates", "and", "concentrated", "reporter", "particles", ".", "BHK", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "human", "ACE2", "or", "empty", "vector", ",", "subsequently", "infected", "with", "VSV", "-", "reporter", "particles", "pseudotyped", "with", "chimeric", "spikes", ",", "luciferase", "was", "measured", "and", "normalized", "to", "no", "pseudotype", "as", "a", "readout", "for", "cell", "entry", ".", "Shown", "are", "the", "data", "for", "3", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1:Westernblot of producer cell lysates and concentrated reporter particles.BHK cells were transfected with either human ACE2 or empty vector, subsequently infected with VSV-reporter particles pseudotyped with chimeric spikes, luciferase was measured and normalized to no pseudotype as a readout for cell entry. Shown are the data for 3 replicates."}
{"words": ["Figure", "2", ":", "Primate", "cells", ",", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "particles", "pseudotyped", "with", "the", "lineage", "B", "chimeric", "spike", "panel", ".", "Pseudotypes", "were", "either", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "trypsin", "before", "addition", "to", "the", "cells", ".", "Luciferase", "was", "measured", "and", "normalized", "to", "particles", "produced", "without", "pseudotype", ".", "Shown", "are", "the", "data", "for", "3", "replicates", ".", "human", "cells", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "particles", "pseudotyped", "with", "the", "lineage", "B", "chimeric", "spike", "panel", ".", "Pseudotypes", "were", "either", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "trypsin", "before", "addition", "to", "the", "cells", ".", "Luciferase", "was", "measured", "and", "normalized", "to", "particles", "produced", "without", "pseudotype", ".", "Shown", "are", "the", "data", "for", "3", "replicates", ".", "bat", "cells", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "particles", "pseudotyped", "with", "the", "lineage", "B", "chimeric", "spike", "panel", ".", "Pseudotypes", "were", "either", "left", "untreated", "or", "incubated", "with", "trypsin", "before", "addition", "to", "the", "cells", ".", "Luciferase", "was", "measured", "and", "normalized", "to", "particles", "produced", "without", "pseudotype", ".", "Shown", "are", "the", "data", "for", "3", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2:Primate cells, were infected with VSV-particles pseudotyped with the lineage B chimeric spike panel. Pseudotypes were either left untreated or incubated with trypsin before addition to the cells. Luciferase was measured and normalized to particles produced without pseudotype. Shown are the data for 3 replicates.human cells were infected with VSV-particles pseudotyped with the lineage B chimeric spike panel. Pseudotypes were either left untreated or incubated with trypsin before addition to the cells. Luciferase was measured and normalized to particles produced without pseudotype. Shown are the data for 3 replicates.bat cells were infected with VSV-particles pseudotyped with the lineage B chimeric spike panel. Pseudotypes were either left untreated or incubated with trypsin before addition to the cells. Luciferase was measured and normalized to particles produced without pseudotype. Shown are the data for 3 replicates."}
{"words": ["Figure", "3", ":", "Pseudotyped", "particles", "were", "either", "left", "untreated", "and", "treated", "with", "trypsin", "and", "subsequently", "used", "to", "infect", "BHK", "cells", "transfected", "with", "the", "coronavirus", "receptor", "indicated", ".", "Shown", "are", "data", "from", "3", "replicates", ".", "Expression", "and", "pseudotype", "incorporation", "of", "SARS", "-", "S", "-", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "chimeras", ".", "Pseudotypes", "were", "used", "to", "infect", "cells", "expressing", "hACE2", ",", "hDPP4", ",", "hAPN", ",", "or", "empty", "vector", ",", "without", "protease", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3:Pseudotyped particles were either left untreated and treated with trypsin and subsequently used to infect BHK cells transfected with the coronavirus receptor indicated. Shown are data from 3 replicates.Expression and pseudotype incorporation of SARS-S-2019-nCoV RBD chimeras.Pseudotypes were used to infect cells expressing hACE2, hDPP4, hAPN, or empty vector, without protease treatment."}
{"words": ["Figure", "4", ":", "VSV", "pseudotypes", "were", "generated", "with", "the", "indicated", "RBD", "and", "used", "to", "infect", "BHKs", "transfected", "with", "either", "human", "ACE2", "or", "empty", "vector", ".", "Shown", "are", "data", "for", "3", "replicates", ".", "Westernblot", "of", "producer", "cell", "lysates", "and", "concentrated", "pseudotyped", "particles", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4:VSV pseudotypes were generated with the indicated RBD and used to infect BHKs transfected with either human ACE2 or empty vector. Shown are data for 3 replicates.Westernblot of producer cell lysates and concentrated pseudotyped particles."}
{"words": ["Figure", "5", ":", "Westernblot", "of", "producer", "cell", "lysates", "and", "concentrated", "pseudotypes", "particles", ".", "Pseudotypes", "with", "indicated", "spike", "constructs", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "trypsin", "and", "subsequently", "used", "to", "infect", "Huh", "-", "7", ".", "5", "cells", ".", "Shown", "are", "data", "for", "3", "replicates", ".", "Pseudotypes", "with", "indicated", "spike", "constructs", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "trypsin", "and", "subsequently", "used", "to", "infect", "BHK", "cells", "transfected", "with", "human", "ACE2", ".", "Shown", "are", "data", "for", "3", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5:Westernblot of producer cell lysates and concentrated pseudotypes particles.Pseudotypes with indicated spike constructs were left untreated or treated with trypsin and subsequently used to infect Huh-7.5 cells. Shown are data for 3 replicates.Pseudotypes with indicated spike constructs were left untreated or treated with trypsin and subsequently used to infect BHK cells transfected with human ACE2. Shown are data for 3 replicates."}
{"words": ["Figure", "1D", ".", "BiFC", "analysis", "of", "interactions", "between", "VISP1", "or", "VISP1mUIM", "and", "ATG8a", "or", "ATG8f", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "Images", "were", "taken", "at", "60", "hpi", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "E", ".", "Co", "-", "IP", "experiments", "examining", "protein", "interactions", "between", "ATG8a", "with", "VISP1", "or", "VISP1mUIM", ".", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "were", "agroinfiltrated", "and", "treated", "with", "2", "mM", "3", "-", "MA", "at", "48", "hpi", ",", "and", "then", "for", "IP", "with", "anti", "-", "Flag", "beads", "12", "h", "later", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D. BiFC analysis of interactions between VISP1 or VISP1mUIM and ATG8a or ATG8f in N. benthamiana leaves. Images were taken at 60 hpi. Scale bar = 20 μm.E. Co-IP experiments examining protein interactions between ATG8a with VISP1 or VISP1mUIM. N. benthamiana leaves were agroinfiltrated and treated with 2 mM 3-MA at 48 hpi, and then for IP with anti-Flag beads 12 h later."}
{"words": ["Figure", "2Confocal", "microscopy", "of", "YFP", "-", "ATG8e", "-", "labeled", "autophagic", "bodies", "in", "root", "cells", "of", "Col", "-", "0", "/", "YFP", "-", "ATG8e", "and", "VISP1OE", "/", "YFP", "-", "ATG8e", "plants", ".", "7", "-", "day", "-", "old", "seedlings", "were", "inoculated", "in", "liquid", "½MS", "medium", "with", "1", "µM", "ConA", "for", "12", "h", "in", "dark", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Puncta", "numbers", "of", "YFP", "-", "ATG8e", "-", "labeled", "autophagic", "bodies", "per", "10", "cells", "in", "panel", "A", ".", "Data", "points", "represent", "means", "of", "three", "biological", "repeats", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "accumulation", "of", "ATG8a", "and", "ATG8a", "-", "PE", "in", "leaves", "of", "4", "-", "week", "-", "old", "Col", "-", "0", ",", "VISP1OE", ",", "VISP1mUIM", "/", "OE", "and", "VISP1mARM", "/", "OE", "plants", ".", "Representative", "TEM", "images", "of", "autophagic", "structures", "in", "inoculated", "leaves", "of", "Col", "-", "0", "and", "VISP1OE", "plants", "treated", "with", "mock", "buffer", "or", "CMV", "-", "2blm", "infection", "at", "4", "dpi", ".", "The", "leaves", "was", "treated", "with", "1", "µM", "ConA", "at", "4", "dpi", "for", "12", "h", "in", "dark", "before", "TEM", "sampling", ".", "Magenta", "arrowheads", "indicate", "autophagic", "bodies", "inside", "the", "vacuoles", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "μm", ".", "Cp", ",", "chloroplast", ";", "CW", ",", "cell", "wall", ";", "V", ",", "vacuole", ".", "Autophagic", "structure", "numbers", "per", "10", "cells", "in", "panel", "F", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Confocal microscopy of YFP-ATG8e-labeled autophagic bodies in root cells of Col-0/YFP-ATG8e and VISP1OE/YFP-ATG8e plants. 7-day-old seedlings were inoculated in liquid ½MS medium with 1 µM ConA for 12 h in dark. Scale bar = 20 μm.   Puncta numbers of YFP-ATG8e-labeled autophagic bodies per 10 cells in panel A. Data points represent means of three biological repeats. Error bars indicate SD. ***p < 0.001 (Student's t-test).   Western blotting analysis of accumulation of ATG8a and ATG8a-PE in leaves of 4-week-old Col-0, VISP1OE, VISP1mUIM/OE and VISP1mARM/OE plants.Representative TEM images of autophagic structures in inoculated leaves of Col-0 and VISP1OE plants treated with mock buffer or CMV-2blm infection at 4 dpi. The leaves was treated with 1 µM ConA at 4 dpi for 12 h in dark before TEM sampling. Magenta arrowheads indicate autophagic bodies inside the vacuoles. Scale bar = 2 μm. Cp, chloroplast; CW, cell wall; V, vacuole.   Autophagic structure numbers per 10 cells in panel F. Error bars indicate SD. Letters indicate significant differences (ANOVA, P < 0.05).   "}
{"words": ["Figure", "3Long", "-", "term", "symptoms", "of", "Col", "-", "0", ",", "VISP1OE1", ",", "VISP1OE2", ",", "rdr6", "-", "15", ",", "and", "sgs3", "-", "1", "plants", "inoculated", "with", "CMV", "-", "2blm", "at", "50", "dpi", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "cm", ".", "Northern", "blotting", "analyzing", "accumulation", "of", "genomic", "RNAs", "(", "gRNAs", ")", "in", "systemically", "leaves", "of", "Col", "-", "0", ",", "OE1", "(", "VISP1OE1", ")", ",", "OE2", "(", "VISP1OE2", ")", ",", "rdr6", "-", "15", ",", "and", "sgs3", "-", "1", "plants", "infected", "by", "CMV", "-", "2blm", "at", "14", "dpi", ".", "Methylene", "blue", "-", "stained", "rRNA", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "Northern", "blotting", "analyzing", "accumulation", "of", "RNA3", "-", "derived", "vsiRNAs", "in", "the", "same", "samples", "as", "shown", "in", "panel", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Long-term symptoms of Col-0, VISP1OE1, VISP1OE2, rdr6-15, and sgs3-1 plants inoculated with CMV-2blm at 50 dpi. Scale bar = 2 cm.Northern blotting analyzing accumulation of genomic RNAs (gRNAs) in systemically leaves of Col-0, OE1 (VISP1OE1), OE2 (VISP1OE2), rdr6-15, and sgs3-1 plants infected by CMV-2blm at 14 dpi. Methylene blue-stained rRNA were used as loading controls.   Northern blotting analyzing accumulation of RNA3-derived   vsiRNAs in the same samples as shown in panel D."}
{"words": ["Figure", "4Long", "-", "term", "systemic", "symptoms", "of", "Col", "-", "0", ",", "visp1", "-", "1", ",", "visp1", "-", "2", ",", "rdr6", "-", "15", ",", "and", "sgs3", "-", "1", "plants", "inoculated", "with", "CMV", "-", "2blm", "at", "50", "dpi", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "cm", ".", "Northern", "blotting", "detecting", "accumulation", "of", "genomic", "RNAs", "and", "RNA3", "-", "derived", "vsiRNAs", "in", "systemically", "infected", "leaves", "at", "14", "dpi", ".", "Relative", "accumulation", "(", "RA", ")", "of", "gRNA3", "was", "calculated", "from", "band", "densities", ".", "Northern", "blotting", "analyzing", "accumulation", "of", "RNA3", "-", "derived", "vsiRNAs", "in", "the", "same", "samples", "as", "shown", "in", "panel", "D", ".", "Bottom", "values", "represent", "relative", "accumulation", "(", "RA", ")", "of", "RNA3", "-", "derived", "vsiRNAs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Long-term systemic symptoms of Col-0, visp1-1, visp1-2, rdr6-15, and sgs3-1 plants inoculated with CMV-2blm at 50 dpi. Scale bar = 2 cm.Northern blotting detecting accumulation of genomic RNAs and RNA3-derived vsiRNAs in systemically infected leaves at 14 dpi. Relative accumulation (RA) of gRNA3 was calculated from band densities.   Northern blotting analyzing accumulation of RNA3-derived vsiRNAs in the same samples as shown in panel D. Bottom values represent relative accumulation (RA) of RNA3-derived vsiRNAs.   "}
{"words": ["Figure", "5Co", "-", "immunoprecipitation", "analyses", "of", "the", "interactions", "between", "SGS3", ",", "SGS3ΔCC", ",", "or", "SGS3CC", "and", "VISP1", "or", "VISP1mARM", ".", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "were", "agroinfiltrated", "with", "constructs", "as", "indicated", "and", "treated", "with", "2", "mM", "3", "-", "MA", "at", "48", "hpi", ",", "and", "collected", "for", "IP", "with", "anti", "-", "Flag", "beads", "12", "h", "later", ".", "GST", "pull", "-", "down", "analysis", "of", "the", "in", "vitro", "interactions", "of", "SGS3CC", "with", "VISP1", ",", "VISP1mARM", "or", "VISP1mUIM", ".", "GST", "-", "VISP1", ",", "GST", "-", "VISP1mARM", ",", "GST", "-", "VISP1mUIM", "or", "GST", "were", "incubated", "with", "SGS3CC", "-", "His", "for", "IP", "with", "anti", "-", "GST", "beads", ",", "and", "detected", "by", "Western", "blotting", "with", "GST", "or", "His", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Co-immunoprecipitation analyses of the interactions between SGS3, SGS3ΔCC, or SGS3CC and VISP1 or VISP1mARM. N. benthamiana leaves were agroinfiltrated with constructs as indicated and treated with 2 mM 3-MA at 48 hpi, and collected for IP with anti-Flag beads 12 h later.GST pull-down analysis of the in vitro interactions of SGS3CC with VISP1, VISP1mARM or VISP1mUIM. GST- VISP1, GST- VISP1mARM, GST- VISP1mUIM or GST were incubated with SGS3CC-His for IP with anti-GST beads, and detected by Western blotting with GST or His antibodies."}
{"words": ["Figure", "6Confocal", "analysis", "of", "co", "-", "localization", "of", "CFP", "-", "NbATG8f", "-", "labelled", "autophagic", "bodies", "with", "the", "VISP1", "-", "YN", "and", "SGS3", "-", "YC", "bodies", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "The", "infiltrated", "leaves", "were", "treated", "with", "100", "µM", "E64d", "or", "DMSO", "at", "48", "hpi", "and", "examined", "for", "imaging", "at", "60", "hpi", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Confocal", "analysis", "of", "effect", "of", "VISP1", "-", "Flag", "VISP1mARM", "-", "Flag", ",", "and", "VISP1mUIM", "-", "Flag", "on", "RDR6", "-", "YN", "and", "SGS3", "-", "YC", "formed", "bodies", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "at", "60", "hpi", ".", "EV", ":", "empty", "vector", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Numbers", "of", "RDR6", "-", "YN", "and", "SGS3", "-", "YC", "formed", "bodies", "per", "10", "cells", "in", "E", "were", "used", "for", "quantification", ".", "Data", "points", "represent", "means", "of", "three", "biological", "repeats", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Western", "blotting", "detecting", "accumulation", "of", "the", "endogenous", "SGS3", "protein", "in", "leaves", "of", "2", "-", "week", "-", "old", "Col", "-", "0", ",", "VISP1OE", ",", "visp1", ",", "and", "sgs3", "-", "1", "Arabidopsis", "plants", "with", "anti", "-", "SGS3", "antibodies", ".", "Western", "blotting", "detecting", "accumulation", "of", "the", "endogenous", "SGS3", "protein", "in", "leaves", "of", "2", "-", "week", "-", "old", "Col", "-", "0", ",", "VISP1OE", ",", "VISP1mUIM", "/", "OE", ",", "and", "VISP1mARM", "/", "OE", "Arabidopsis", "plants", ".", "Western", "blotting", "detecting", "accumulation", "of", "the", "endogenous", "SGS3", "protein", "in", "2", "-", "week", "-", "old", "VISP1", "-", "overexpressing", "Col", "-", "0", ",", "atg5", "-", "1", ",", "and", "atg7", "-", "1", "mutants", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Confocal analysis of co-localization of CFP-NbATG8f-labelled autophagic bodies with the VISP1-YN and SGS3-YC bodies in N. benthamiana leaves. The infiltrated leaves were treated with 100 µM E64d or DMSO at 48 hpi and examined for imaging at 60 hpi. Scale bar = 20 μm.Confocal analysis of effect of VISP1-Flag VISP1mARM-Flag, and VISP1mUIM-Flag on RDR6-YN and SGS3-YC formed bodies in N. benthamiana leaves at 60 hpi. EV: empty vector. Scale bar = 20 μm.   Numbers of RDR6-YN and SGS3-YC formed bodies per 10 cells in E were used for quantification. Data points represent means of three biological repeats. Error bars indicate SD. Letters indicate significant differences (ANOVA, P < 0.05).   Western blotting detecting accumulation of the endogenous SGS3 protein in leaves of 2-week-old Col-0, VISP1OE, visp1, and sgs3-1 Arabidopsis plants with anti-SGS3 antibodies.   Western blotting detecting accumulation of the endogenous SGS3 protein in leaves of 2-week-old Col-0, VISP1OE, VISP1mUIM/OE, and VISP1mARM/OE Arabidopsis plants.   Western blotting detecting accumulation of the endogenous SGS3 protein in 2-week-old VISP1-overexpressing Col-0, atg5-1, and atg7-1 mutants.   "}
{"words": ["Figure", "7Developmental", "phenotypes", "of", "rosette", "leaves", "of", "5", "-", "week", "-", "old", "Col", "-", "0", ",", "visp1", "-", "1", ",", "visp1", "-", "2", ",", "VISP1OE1", ",", "VISP1OE2", ",", "and", "sgs3", "-", "1", "seedlings", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "8th", "and", "9th", "rosette", "leaves", "from", "the", "top", "leaves", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "cm", ".", "The", "length", "/", "width", "ratios", "of", "the", "8th", "and", "9th", "rosette", "leaves", "of", "the", "seedlings", "shown", "in", "A", ".", "Every", "dot", "represents", "data", "from", "the", "length", "/", "width", "ratio", "of", "one", "leave", "(", "n", "=", "20", ")", ".", "Letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Northern", "blotting", "detecting", "accumulation", "of", "TAS1", "-", "TasiR255", ",", "TAS2", "-", "TasiR1511", ",", "TAS3", "-", "TasiR5", "′", "D8", ",", "miR173", ",", "and", "miR390", "in", "leaves", "of", "Arabidopsis", "plants", "shown", "in", "panel", "A", ".", "Values", "represent", "relative", "accumulation", "(", "RA", ")", "of", "siRNAs", "and", "values", "in", "Col", "-", "0", "plants", "were", "set", "as", "1", ".", "rRNA", "served", "as", "loading", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Developmental phenotypes of rosette leaves of 5-week-old Col-0, visp1-1, visp1-2, VISP1OE1, VISP1OE2, and sgs3-1 seedlings. Arrowheads indicate the 8th and 9th rosette leaves from the top leaves. Scale bar = 2 cm.   The length/width ratios of the 8th and 9th rosette leaves of the seedlings shown in A. Every dot represents data from the length/width ratio of one leave (n = 20). Letters indicate significant   differences (ANOVA, P < 0.05).Northern blotting detecting accumulation of TAS1-TasiR255, TAS2-TasiR1511, TAS3-TasiR5′D8, miR173, and miR390 in leaves of Arabidopsis plants shown in panel A. Values represent relative accumulation (RA) of siRNAs and values in Col-0 plants were set as 1. rRNA served as loading controls."}
{"words": ["Figure", "1", "B", "-", "C", "Competitor", "donor", "derived", "Gr", ",", "B", ",", "CD4", "T", ",", "and", "CD8", "T", "cells", "in", "the", "peripheral", "blood", ".", "In", "the", "control", "group", ",", "competitor", "donor", "cells", "are", "WT", "HSCs", ".", "In", "the", "deficient", "group", ",", "competitor", "donor", "cells", "are", "uMT", "-", "/", "-", "or", "NSG", "HSCs", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "percentages", "of", "the", "total", "number", "of", "white", "blood", "cells", "(", "WBCs", ")", ".", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")", "D", "-", "E", "WT", "donor", "derived", "Gr", ",", "B", ",", "CD4", "T", ",", "and", "CD8", "T", "cells", "in", "the", "peripheral", "blood", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "percentages", "of", "the", "total", "number", "of", "white", "blood", "cells", "(", "WBCs", ")", ".", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")", "F", "-", "G", "Total", "production", "of", "Gr", ",", "B", ",", "CD4", "T", ",", "and", "CD8", "T", "cells", "in", "the", "peripheral", "blood", "(", "derived", "from", "WT", "HSCs", ",", "competitor", "HSCs", ",", "helper", "whole", "bone", "marrow", "cells", ",", "and", "residual", "host", "cells", ")", "shown", "as", "percentages", "of", "the", "total", "number", "of", "white", "blood", "cells", "(", "WBCs", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "percentages", "of", "the", "total", "number", "of", "white", "blood", "cells", "(", "WBCs", ")", ".", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 B-C Competitor donor derived Gr, B, CD4 T, and CD8 T cells in the peripheral blood. In the control group, competitor donor cells are WT HSCs. In the deficient group, competitor donor cells are uMT-/- or NSG HSCs Data information: Data are shown as percentages of the total number of white blood cells (WBCs). Data were collected at month 7 post transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test)  D-E WT donor derived Gr, B, CD4 T, and CD8 T cells in the peripheral blood Data information: Data are shown as percentages of the total number of white blood cells (WBCs). Data were collected at month 7 post transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test)  F-G Total production of Gr, B, CD4 T, and CD8 T cells in the peripheral blood (derived from WT HSCs, competitor HSCs, helper whole bone marrow cells, and residual host cells) shown as percentages of the total number of white blood cells (WBCs). Data information: Data are shown as percentages of the total number of white blood cells (WBCs). Data were collected at month 7 post transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test) "}
{"words": ["Figure", "2", "A", "-", "B", "Total", "numbers", "of", "barcoded", "WT", "clones", "that", "give", "rise", "to", "granulocytes", "(", "Gr", ")", ",", "B", "cells", ",", "CD4", "T", "cells", ",", "and", "CD8", "T", "cells", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")", "C", "-", "J", "Number", "of", "HSC", "clones", "that", "produce", "different", "amounts", "of", "Gr", ",", "B", ",", "CD4", "T", ",", "and", "CD8", "T", "cells", ".", "We", "combined", "the", "sequencing", "data", "with", "the", "flow", "cytometry", "data", "to", "calculate", "clonal", "abundance", "for", "each", "clone", "as", "follows", ":", "Clonal", "abundance", "=", "100", "%", "*", "(", "Each", "cell", "population", "(", "Gr", ",", "B", ",", "CD4T", "or", "CD8T", "cells", ")", "%", "WBCs", ")", "*", "(", "Donor", "%", "Each", "cell", "population", ")", "*", "(", "GFP", "%", "Donor", "cells", ")", "*", "(", "number", "of", "reads", "for", "each", "barcode", ")", "/", "(", "total", "reads", "of", "all", "barcodes", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")", "K", "-", "L", "Production", "of", "Gr", ",", "B", ",", "CD4", "T", ",", "and", "CD8", "T", "cells", "by", "expanding", "WT", "clones", "that", "produce", "more", "than", "0", ".", "1", "%", "of", "WBCs", "in", "each", "lineage", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A-B Total numbers of barcoded WT clones that give rise to granulocytes (Gr), B cells, CD4 T cells, and CD8 T cells Data information: Data were collected at month 7 post-transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test)  C-J Number of HSC clones that produce different amounts of Gr, B, CD4 T, and CD8 T cells. We combined the sequencing data with the flow cytometry data to calculate clonal abundance for each clone as follows: Clonal abundance =100%*(Each cell population (Gr, B, CD4T or CD8T cells) % WBCs) * (Donor % Each cell population) * (GFP % Donor cells) * (number of reads for each barcode) / (total reads of all barcodes Data information: Data were collected at month 7 post-transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test)  K-L Production of Gr, B, CD4 T, and CD8 T cells by expanding WT clones that produce more than 0.1% of WBCs in each lineage. Data information: Data were collected at month 7 post-transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test) "}
{"words": ["Figure", "4", "A", "-", "B", "Total", "amount", "of", "progenitors", "as", "a", "percentage", "of", "ckit", "and", "Il7rα", "enriched", "bone", "marrow", "(", "BM", ")", "cells", ".", "Shown", "are", "hematopoietic", "stem", "cells", "(", "HSCs", ")", ",", "Flk2", "-", "and", "Flk2", "+", "multipotent", "progenitors", "(", "MPP", ")", ",", "common", "lymphoid", "progenitors", "(", "CLP", ")", ",", "common", "myeloid", "progenitors", "(", "CMP", ")", ",", "megakaryocyte", "-", "erythroid", "progenitors", "(", "MEP", ")", ",", "and", "granulocyte", "-", "monocyte", "progenitors", "(", "GMP", ")", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")", "C", "-", "D", "WT", "donor", "derived", "progenitors", "as", "a", "percentage", "of", "ckit", "and", "Il7rα", "enriched", "BM", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "at", "month", "7", "post", "transplantation", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "month", "8", "post", "-", "transplantation", "for", "the", "NSG", "group", ",", "and", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "7", "mice", "for", "the", "uMT", "-", "/", "-", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "the", "NSG", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "two", "-", "tailed", "and", "two", "-", "sample", "equal", "variance", "Student", "\"", "s", "t", "-", "test", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A-B Total amount of progenitors as a percentage of ckit and Il7rα enriched bone marrow (BM) cells. Shown are hematopoietic stem cells (HSCs), Flk2- and Flk2+ multipotent progenitors (MPP), common lymphoid progenitors (CLP), common myeloid progenitors (CMP), megakaryocyte-erythroid progenitors (MEP), and granulocyte-monocyte progenitors (GMP) Data information: Data were collected at month 7 post transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05 and **p< 0.01 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test)  C-D WT donor derived progenitors as a percentage of ckit and Il7rα enriched BM cells. Data information: Data were collected at month 7 post transplantation for the uMT-/- group and month 8 post-transplantation for the NSG group, and presented as mean ± SEM. n=7 mice for the uMT-/- group and n=6 for the NSG group. *p<0.05 and **p< 0.01 (two-tailed and two-sample equal variance Student\"s t-test) "}
{"words": ["f1a", ",", "Immunoprecipitation", "of", "Flag", "-", "beclin", "1", "constructs", "with", "Nef", "-", "HA", "in", "HeLa", "cells", "24", "h", "post", "-", "transfection", ".", "b", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "dots", "(", "autophagosomes", ")", "in", "MCF7", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "and", "Flag", "-", "beclin", "1", "constructs", "grown", "in", "either", "normal", "medium", "or", "starved", "in", "EBSS", "for", "2", "h", ".", "d", ",", "Biochemical", "assessment", "of", "autophagy", "(", "p62", "and", "LC3", "immunoblots", ")", "in", "peptide", "-", "treated", "HeLa", "cells", "(", "3", "h", ")", ".", "e", ",", "f", ",", "Representative", "images", "(", "e", ")", "and", "quantification", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "dots", "(", "f", ")", "in", "peptide", "-", "treated", "HeLa", "/", "GFP", "-", "LC3", "cells", "(", "30", " ", "µM", ",", "3", " ", "h", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "g", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "siRNA", "-", "transfected", "peptide", "-", "treated", "HeLa", "/", "GFP", "-", "LC3", "cells", "(", "30", " ", "µM", ",", "3", " ", "h", ")", ".", "h", ",", "Model", "of", "Tat", "-", "beclin", "1", "peptide", "(", "left", ")", "based", "on", "corresponding", "elements", "of", "the", "beclin", "1", "evolutionarily", "conserved", "domain", "(", "ECD", ")", "structure", "(", "centre", ")", ".", "Essential", "phenylalanine", "side", "chains", ",", "magenta", ";", "positions", "of", "solubility", "mutations", ",", "pink", ";", "lipid", "interaction", "site", ",", "yellow", ".", "ECD", "surface", "representation", "(", "right", ")", "illustrates", "exposure", "of", "corresponding", "peptide", "(", "cyan", ")", ".", "i", ",", "p62", "and", "LC3", "immunoblots", "in", "peptide", "-", "treated", "HeLa", "cells", "(", "3", "h", ")", ".", "In", "b", ",", "f", ",", "g", ",", "bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", "(", "50", "-", "100", "cells", "per", "sample", ")", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "t", "-", "test", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, Immunoprecipitation of Flag-beclin 1 constructs with Nef-HA in HeLa cells 24 h post-transfection.b, GFP-LC3-positive dots (autophagosomes) in MCF7 cells expressing GFP-LC3 and Flag-beclin 1 constructs grown in either normal medium or starved in EBSS for 2 h.d, Biochemical assessment of autophagy (p62 and LC3 immunoblots) in peptide-treated HeLa cells (3 h).e, f, Representative images (e) and quantification of GFP-LC3-positive dots (f) in peptide-treated HeLa/GFP-LC3 cells (30 µM, 3 h). Scale bars, 20 µm.g, GFP-LC3-positive dots in siRNA-transfected peptide-treated HeLa/GFP-LC3 cells (30 µM, 3 h).h, Model of Tat-beclin 1 peptide (left) based on corresponding elements of the beclin 1 evolutionarily conserved domain (ECD) structure (centre). Essential phenylalanine side chains, magenta; positions of solubility mutations, pink; lipid interaction site, yellow. ECD surface representation (right) illustrates exposure of corresponding peptide (cyan).i, p62 and LC3 immunoblots in peptide-treated HeLa cells (3 h). In b, f, g, bars represent mean ± s.e.m. of triplicate samples (50-100 cells per sample). Similar results were observed in three independent experiments. *P 0.05, **P 0.01; t-test."}
{"words": ["f2a", ",", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "biotin", "-", "conjugated", "peptides", "(", "30", "μM", ",", "3", "h", ")", "and", "proteins", "bound", "to", "peptides", "were", "analysed", "by", "immunoblot", "with", "anti", "-", "GAPR", "-", "1", ".", "b", "-", "T", "-", "B", ",", "biotin", "-", "Tat", "-", "beclin", "1", ";", "b", "-", "T", "-", "S", ",", "biotin", "-", "Tat", "-", "scrambled", ".", "b", ",", "Immunoprecipitation", "of", "Flag", "-", "beclin", "1", "with", "GAPR", "-", "1", "-", "Myc", "in", "HeLa", "cells", "24", "h", "post", "-", "transfection", ".", "c", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "GAPR", "-", "1", "siRNA", "-", "transfected", "peptide", "-", "treated", "HeLa", "/", "GFP", "-", "LC3", "cells", "(", "20", "&", "amp", ";", "amp", ";", "mgr", ";", "M", ",", "3", "h", ")", "with", "or", "without", "100", "nM", "bafilomycin", "A1", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", "(", "50", "-", "100", "cells", "per", "sample", ")", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "NC", ",", "non", "-", "silencing", "control", ".", "d", ",", "Localization", "of", "beclin", "1", "and", "GM130", "(", "a", "Golgi", "marker", ")", "in", "HeLa", "cells", "stably", "transduced", "with", "empty", "vector", "(", "left", "panel", ")", "or", "GAPR", "-", "1", "-", "Myc", "(", "middle", "panel", ")", "or", "transfected", "with", "GAPR", "-", "1", "siRNA", "(", "right", "panel", ")", "and", "treated", "with", "peptide", "(", "20", "μM", ",", "1", "h", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "e", ",", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", "in", "post", "-", "nuclear", "supernatant", "(", "PNS", ")", "and", "Golgi", "-", "enriched", "fractions", "in", "HeLa", "cells", "stably", "transduced", "with", "empty", "vector", "or", "GAPR", "-", "1", "-", "Myc", "after", "peptide", "treatment", "(", "20", "μM", ",", "2", "h", ")", ".", "f", ",", "WIPI2", "dots", "in", "cells", "in", "the", "experimental", "conditions", "shown", "in", "d", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "100", "-", "150", "cells", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "t", "-", "test", ".", "†", "†", "†", "P", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "for", "comparison", "of", "magnitude", "of", "changes", "between", "groups", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, HeLa cells were treated with biotin-conjugated peptides (30 μM, 3 h) and proteins bound to peptides were analysed by immunoblot with anti-GAPR-1. b-T-B, biotin-Tat-beclin 1; b-T-S, biotin-Tat-scrambled.b, Immunoprecipitation of Flag-beclin 1 with GAPR-1-Myc in HeLa cells 24 h post-transfection.c, GFP-LC3-positive dots in GAPR-1 siRNA-transfected peptide-treated HeLa/GFP-LC3 cells (20 &amp;amp;mgr;M, 3 h) with or without 100 nM bafilomycin A1. Bars represent mean ± s.e.m. of triplicate samples (50-100 cells per sample). Similar results were observed in three independent experiments. NC, non-silencing control.d, Localization of beclin 1 and GM130 (a Golgi marker) in HeLa cells stably transduced with empty vector (left panel) or GAPR-1-Myc (middle panel) or transfected with GAPR-1 siRNA (right panel) and treated with peptide (20 μM, 1 h). Scale bar, 20 μm.e, Immunoblot of beclin 1 in post-nuclear supernatant (PNS) and Golgi-enriched fractions in HeLa cells stably transduced with empty vector or GAPR-1-Myc after peptide treatment (20 μM, 2 h).f, WIPI2 dots in cells in the experimental conditions shown in d. Bars represent mean ± s.e.m. for 100-150 cells. *P 0.05, ***P 0.001; t-test. †††P 0.001; two-way ANOVA for comparison of magnitude of changes between groups."}
{"words": ["f3a", ",", "Percentage", "of", "cells", "with", "small", "htt103Q", "aggregates", "(", "left", ")", "and", "number", "of", "aggregates", "per", "cell", "(", "right", ")", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "doxycycline", "(", "Dox", ")", "-", "repressible", "CFP", "-", "htt103Q", "after", "daily", "treatment", "with", "doxycycline", "or", "peptide", "(", "20", "μM", ",", "4", "h", "per", "day", ")", "for", "2", "days", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", "(", "60", "-", "120", "cells", "per", "sample", ")", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "b", ",", "Filter", "trap", "assays", "for", "htt103Q", "large", "and", "small", "aggregates", "in", "HeLa", "/", "htt103Q", "cells", ".", "c", ",", "Viral", "titres", "in", "HeLa", "cells", "infected", "with", "0", ".", "1", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "p", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "per", "cell", "of", "SINV", ",", "CHIKV", "or", "WNV", "(", "strain", "TX02", ")", "and", "treated", "with", "peptide", "(", "10", "μM", ",", "4", "-", "8", "h", "post", "-", "infection", ")", ".", "Values", "represent", "geometric", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "triplicate", "samples", "of", "supernatants", "collected", "18", "h", "post", "-", "infection", "(", "SINV", ")", "or", "24", "h", "post", "-", "infection", "(", "CHIKV", "and", "WNV", ")", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "d", ",", "Bacteriacolony", "-", "forming", "units", "(", "c", ".", "f", ".", "u", ".", ")", "in", "primary", "BMDMs", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "ΔactA", "mutant", "strain", "DPL", "-", "4029", "for", "30", " ", "min", "and", "treated", "with", "peptide", "(", "10", " ", "µM", "from", "0", "to", "2", " ", "h", "post", "-", "infection", ")", ".", "Bars", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "e", ",", "HIV", "-", "1", "p24", "antigen", "release", "in", "primary", "human", "MDMs", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "24", "h", "after", "initiation", "of", "daily", "peptide", "treatment", ".", "Values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "MDMs", "from", "three", "independent", "donors", ".", "f", ",", "HIV", "-", "1p24", "antigen", "release", "in", "MDMs", "transduced", "with", "nonspecific", "scrambled", "shRNA", "(", "shNS", ")", "or", "ATG5", "shRNA", "(", "shATG5", ")", "and", "treated", "daily", "with", "peptide", "(", "5", " ", "µM", ")", ".", "Values", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "wells", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "MDMs", "from", "two", "independent", "donors", ".", "g", ",", "LC3", "immunoblot", "of", "MDMs", "transduced", "with", "the", "indicated", "shRNA", "at", "day", "0", "and", "day", "10", "after", "HIV", "-", "1", "infection", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "001", ";", "t", "-", "test", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Percentage of cells with small htt103Q aggregates (left) and number of aggregates per cell (right) in HeLa cells expressing doxycycline (Dox)-repressible CFP-htt103Q after daily treatment with doxycycline or peptide (20 μM, 4 h per day) for 2 days. Bars represent mean ± s.e.m. of triplicate samples (60-120 cells per sample). Similar results were observed in three independent experiments.b, Filter trap assays for htt103Q large and small aggregates in HeLa/htt103Q cells.c, Viral titres in HeLa cells infected with 0.1 plaque-forming units (p.f.u.) per cell of SINV, CHIKV or WNV (strain TX02) and treated with peptide (10 μM, 4-8 h post-infection). Values represent geometric mean ± s.e.m. for triplicate samples of supernatants collected 18 h post-infection (SINV) or 24 h post-infection (CHIKV and WNV). Similar results were observed in three independent experiments.d, Bacteriacolony-forming units (c.f.u.) in primary BMDMs infected with L. monocytogenes ΔactA mutant strain DPL-4029 for 30 min and treated with peptide (10 µM from 0 to 2 h post-infection). Bars represent mean ± s.e.m. of triplicate samples. Similar results were observed in three independent experiments.e, HIV-1 p24 antigen release in primary human MDMs infected with HIV-1 24 h after initiation of daily peptide treatment. Values represent mean ± s.e.m. of triplicate samples. Similar results were observed in MDMs from three independent donors.f, HIV-1p24 antigen release in MDMs transduced with nonspecific scrambled shRNA (shNS) or ATG5 shRNA (shATG5) and treated daily with peptide (5 µM). Values represent mean ± s.e.m. of triplicate wells. Similar results were observed in MDMs from two independent donors.g, LC3 immunoblot of MDMs transduced with the indicated shRNA at day 0 and day 10 after HIV-1 infection. *P  0.05; **P  0.01; ***P  0.001; t-test."}
{"words": ["f4a", ",", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "tissues", "of", "6", "-", "week", "-", "old", "GFP", "-", "LC3", "mice", "treated", "with", "the", "indicated", "peptide", "(", "20", "mg", "kg", "−", "1", "i", ".", "p", ".", ",", "6", "h", ")", ".", "A", "minimum", "of", "ten", "fields", "was", "counted", "per", "tissue", "section", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "three", "mice", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "b", ",", "p62", "immunoblot", "of", "brains", "of", "5", "-", "day", "-", "old", "GFP", "-", "LC3", "mice", "treated", "with", "the", "indicated", "peptide", "(", "20", "mg", "kg", "−", "1", "i", ".", "p", ".", ",", "6", "h", ")", ".", "c", ",", "Survival", "curves", "of", "5", "-", "day", "-", "old", "C57BL", "/", "6J", "mice", "infected", "with", "CHIKV", "(", "106", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "s", ".", "c", ".", ")", "and", "treated", "daily", "with", "peptide", "(", "15", "mg", "kg", "−", "1", "i", ".", "p", ".", "beginning", "1", "day", "post", "-", "infection", ")", ".", "d", "-", "f", ",", "Representative", "images", "of", "WNV", "envelope", "antigen", "and", "TdT", "-", "mediated", "dUTP", "nick", "end", "labelling", "(", "TUNEL", ")", "staining", "(", "d", ")", "(", "T", ",", "Tat", "alone", ")", ",", "quantification", "of", "cell", "death", "in", "brain", "(", "e", ")", "and", "survival", "curves", "(", "f", ")", "for", "5", "-", "day", "-", "oldC57BL", "/", "6Jmice", "infected", "with", "WNV", "(", "Egypt", "strain", "101", ",", "1", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "intracerebral", "(", "i", ".", "c", ".", ")", ")", "and", "treated", "daily", "with", "peptide", "(", "D", "-", "amino", "acid", "forms", ",", "20mgkg", "−", "1", "i", ".", "p", ".", "beginning", "1day", "post", "-", "infection", ")", ".", "Images", "in", "d", "are", "from", "cerebral", "cortex", "day", "6", "post", "-", "infection", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "all", "regions", "of", "the", "brain", "for", "three", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "20μm", ".", "Bars", "in", "e", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "TUNEL", "-", "positive", "cells", "per", "unit", "area", "of", "brain", "for", "three", "mice", ".", "gd", "-", "f", ",", "Representative", "images", "of", "WNV", "envelope", "antigen", "and", "TdT", "-", "mediated", "dUTP", "nick", "end", "labelling", "(", "TUNEL", ")", "staining", "(", "d", ")", "(", "T", ",", "Tat", "alone", ")", ",", "quantification", "of", "cell", "death", "in", "brain", "(", "e", ")", ",", "and", "survival", "curves", "(", "f", ")", "for", "5", "-", "day", "-", "oldC57BL", "/", "6Jmice", "infected", "with", "WNV", "(", "Egypt", "strain", "101", ",", "1", "p", ".", "f", ".", "u", ".", "intracerebral", "(", "i", ".", "c", ".", ")", ")", "and", "treated", "daily", "with", "peptide", "(", "D", "-", "amino", "acid", "forms", ",", "20mgkg", "−", "1", "i", ".", "p", ".", "beginning", "1day", "post", "-", "infection", ")", ".", "Images", "in", "d", "are", "from", "cerebral", "cortex", "day", "6", "post", "-", "infection", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "all", "regions", "of", "the", "brain", "for", "three", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ",", "20μm", ".", "Bars", "in", "e", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "TUNEL", "-", "positive", "cells", "per", "unit", "area", "of", "brain", "for", "three", "mice", ".", "gg", ",", "Geometric", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "viral", "titres", "of", "WNV", "-", "infected", "mousebrains", "day", "6", "post", "-", "infection", ".", "Values", "represent", "combined", "data", "for", "12", "-", "20", "mice", "per", "treatment", "group", "from", "10", "to", "12", "litters", ".", "Data", "in", "c", "and", "f", "represent", "combined", "survival", "probabilities", "for", "three", "and", "four", "independent", "litters", ",", "respectively", ",", "in", "each", "group", ".", "Similar", "results", "were", "observed", "in", "each", "independent", "experiment", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "t", "-", "test", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, GFP-LC3-positive dots in tissues of 6-week-old GFP-LC3 mice treated with the indicated peptide (20 mg kg−1 i.p., 6 h). A minimum of ten fields was counted per tissue section. Bars represent mean ± s.e.m. for three mice. Similar results were observed in three independent experiments.b, p62 immunoblot of brains of 5-day-old GFP-LC3 mice treated with the indicated peptide (20 mg kg−1 i.p., 6 h).c, Survival curves of 5-day-old C57BL/6J mice infected with CHIKV (106 p.f.u. s.c.) and treated daily with peptide (15 mg kg−1 i.p. beginning 1 day post-infection).d-f, Representative images of WNV envelope antigen and TdT-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) staining (d) (T, Tat alone), quantification of cell death in brain (e) and survival curves (f) for 5-day-oldC57BL/6Jmice infected with WNV (Egypt strain 101, 1 p.f.u. intracerebral (i.c.)) and treated daily with peptide (D-amino acid forms, 20mgkg−1 i.p. beginning 1day post-infection). Images in d are from cerebral cortex day 6 post-infection. Similar results were observed in all regions of the brain for three mice per group. Scale bar, 20μm. Bars in e represent mean±s.e.m. TUNEL-positive cells per unit area of brain for three mice. gd-f, Representative images of WNV envelope antigen and TdT-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) staining (d) (T, Tat alone), quantification of cell death in brain (e), and survival curves (f) for 5-day-oldC57BL/6Jmice infected with WNV (Egypt strain 101, 1 p.f.u. intracerebral (i.c.)) and treated daily with peptide (D-amino acid forms, 20mgkg−1 i.p. beginning 1day post-infection). Images in d are from cerebral cortex day 6 post-infection. Similar results were observed in all regions of the brain for three mice per group. Scale bar, 20μm. Bars in e represent mean±s.e.m. TUNEL-positive cells per unit area of brain for three mice. gg, Geometric mean + s.e.m. viral titres of WNV-infected mousebrains day 6 post-infection. Values represent combined data for 12-20 mice per treatment group from 10 to 12 litters. Data in c and f represent combined survival probabilities for three and four independent litters, respectively, in each group. Similar results were observed in each independent experiment. *P 0.05; **P 0.01; ***P 0.001; NS, not significant; t-test."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "B", "Clearance", "of", "a", "target", "with", "a", "consensus", "PAM", "by", "direct", "interference", ".", "Overlay", "of", "fluorescent", "and", "phase", "contrast", "time", "-", "lapse", "images", ".", "Presence", "of", "the", "target", "plasmid", "is", "tracked", "by", "its", "YFP", "production", "(", "A", ")", ".", "Reconstructed", "lineage", "traces", "of", "the", "imaged", "population", "(", "A", ")", "from", "induction", "of", "the", "CRISPR", "-", "Cas", "system", "over", "time", "(", "grey", ")", "lineages", "show", "some", "variation", "in", "plasmid", "clearance", "times", "(", "coloured", ")", "(", "B", ")", ".", "E", "-", "F", "Clearance", "of", "a", "matching", "target", "with", "a", "mutated", "PAM", "via", "priming", ".", "Overlay", "of", "fluorescent", "and", "phase", "contrast", "time", "-", "lapse", "images", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Reconstructed", "lineage", "traces", "of", "the", "imaged", "population", "(", "E", ")", "(", "grey", ")", ".", "Lineages", "show", "large", "variations", "in", "the", "time", "taken", "to", "clear", "the", "plasmid", "(", "coloured", ")", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-B Clearance of a target with a consensus PAM by direct interference. Overlay of fluorescent and phase contrast time-lapse images. Presence of the target plasmid is tracked by its YFP production (A). Reconstructed lineage traces of the imaged population (A) from induction of the CRISPR-Cas system over time (grey) lineages show some variation in plasmid clearance times (coloured) (B).E-F Clearance of a matching target with a mutated PAM via priming. Overlay of fluorescent and phase contrast time-lapse images as in (A). Reconstructed lineage traces of the imaged population (E) (grey). Lineages show large variations in the time taken to clear the plasmid (coloured) (F)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Timelapse", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "across", "the", "wing", "pouch", "after", "addition", "of", "10", "μM", "antimycin", "A", "(", "ant", ".", "A", ")", ".", "(", "D", ",", "F", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "measured", "over", "time", "in", "the", "(", "D", ")", "AP", "boundary", "(", "APB", ")", "or", "(", "F", ")", "DV", "boundary", "(", "DVB", ")", "and", "non", "-", "organizer", "regions", "(", "NO", ")", ".", "Shaded", "regions", "indicate", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ";", "dots", "indicate", "mean", "per", "timepoint", ",", "and", "solid", "lines", "indicate", "the", "fit", "to", "the", "mean", ".", "Black", "arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "drug", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Timelapse of ATP sensor FRET efficiency across the wing pouch after addition of 10 μM antimycin A (ant.A).(D, F) Mean FRET efficiency measured over time in the (D) AP boundary (APB) or (F) DV boundary (DVB) and non-organizer regions (NO). Shaded regions indicate standard deviation (SD); dots indicate mean per timepoint, and solid lines indicate the fit to the mean. Black arrows indicate the addition of the drug."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Timelapse", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "after", "combined", "addition", "of", "10", "μM", "antimycin", "A", "(", "ant", ".", "A", ")", ",", "100", "μM", "3", "-", "Bromopyruvate", "(", "3BP", ")", ",", "and", "50", "mM", "2", "-", "deoxy", "-", "D", "-", "glucose", "(", "2DG", ")", ".", "(", "B", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "of", "organizer", "(", "ORG", ")", "regions", "and", "non", "-", "organizer", "(", "NO", ")", "regions", "analyzed", "over", "time", ".", "Shaded", "regions", "indicate", "SD", ";", "dots", "indicate", "mean", "per", "timepoint", ",", "and", "solid", "lines", "indicate", "the", "fit", "to", "the", "mean", ".", "(", "C", ")", "Fit", "parameters", "of", "individual", "time", "traces", "for", "organizer", "and", "non", "-", "organizer", "regions", ".", "Each", "dot", "represents", "data", "from", "one", "disc", ",", "and", "lines", "connect", "the", "corresponding", "regions", "of", "the", "same", "disc", ".", "Box", "plots", "summarize", "the", "data", ":", "boxes", "encompass", "the", "2nd", "-", "3rd", "quartiles", ",", "with", "whiskers", "indicating", "the", "1st", "and", "4th", "quartiles", "and", "the", "red", "line", "indicating", "the", "median", ".", "*", "=", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", "p", "-", "value", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "n", "=", "26", "discs", ")", ".", "(", "D", ")", "Time", "lapse", "montage", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "in", "the", "wing", "pouch", "after", "2DG", "addition", ".", "(", "E", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "time", "trace", "of", "the", "entire", "wing", "pouch", ";", "shaded", "region", "indicates", "SD", ";", "black", "arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "drugs", ".", "Brackets", "indicate", "the", "mean", "FRET", "values", "before", "and", "2h", "after", "2DG", "addition", "(", "1", "-", "10", "min", "and", "121", "-", "130", "min", ",", "respectively", ")", ".", "The", "distribution", "of", "mean", "values", "within", "these", "brackets", "are", "shown", "as", "violin", "plots", "in", "(", "F", ")", "(", "solid", "line", "indicates", "median", ",", "dotted", "indicate", "quartiles", ")", ".", "These", "were", "compared", "using", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "ns", "=", "not", "significant", "p", "-", "value", ",", "n", "=", "17", "discs", ")", "including", "(", "G", ")", "Welch", "'", "s", "correction", "and", "estimation", "plot", "(", "n", "=", "17", "discs", "for", "each", "group", ")", ".", "In", "(", "G", ")", ",", "horizontal", "dotted", "lines", "run", "through", "the", "mean", "values", "for", "the", "two", "samples", "(", "before", "2DG", "and", "2hr", "after", "2DG", ")", ";", "on", "the", "right", ",", "the", "difference", "between", "the", "two", "means", "is", "plotted", "on", "a", "separate", "axis", "(", "right", ")", ",", "where", "the", "bars", "indicate", "the", "upper", "and", "lower", "95", "%", "confidence", "intervals", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Timelapse of ATP sensor FRET efficiency after combined addition of 10 μM antimycin A (ant.A), 100 μM 3-Bromopyruvate (3BP), and 50 mM 2-deoxy-D-glucose (2DG). (B) Mean FRET efficiency of organizer (ORG) regions and non-organizer (NO) regions analyzed over time. Shaded regions indicate SD; dots indicate mean per timepoint, and solid lines indicate the fit to the mean. (C) Fit parameters of individual time traces for organizer and non-organizer regions. Each dot represents data from one disc, and lines connect the corresponding regions of the same disc. Box plots summarize the data: boxes encompass the 2nd-3rd quartiles, with whiskers indicating the 1st and 4th quartiles and the red line indicating the median. * = p-value < 0.05, ns = not significant p-value using a Kruskal-Wallis test (n=26 discs).(D) Time lapse montage of ATP sensor FRET efficiency in the wing pouch after 2DG addition. (E) Mean FRET efficiency time trace of the entire wing pouch; shaded region indicates SD; black arrows indicate the addition of the drugs. Brackets indicate the mean FRET values before and 2h after 2DG addition (1-10 min and 121-130 min, respectively). The distribution of mean values within these brackets are shown as violin plots in (F) (solid line indicates median, dotted indicate quartiles). These were compared using an unpaired t-test (ns = not significant p-value, n = 17 discs) including (G) Welch's correction and estimation plot (n=17 discs for each group). In (G), horizontal dotted lines run through the mean values for the two samples (before 2DG and 2hr after 2DG); on the right, the difference between the two means is plotted on a separate axis (right), where the bars indicate the upper and lower 95% confidence intervals."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Timelapse", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "in", "the", "apGalts", ">", "PtcRNAi", "wing", "pouch", "after", "10", "μM", "antimycin", "A", "(", "ant", ".", "A", ")", "addition", ".", "Red", "dashed", "line", "indicates", "the", "position", "of", "the", "AP", "boundary", ".", "(", "D", ",", "F", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "analyzed", "over", "time", "in", "the", "(", "D", ")", "dorsal", "anterior", "(", "DA", ")", "and", "ventral", "anterior", "(", "VA", ")", "sub", "-", "compartments", "or", "the", "(", "F", ")", "dorsal", "anterior", "(", "DA", ")", "and", "dorsal", "posterior", "(", "DP", ")", "sub", "-", "compartments", "of", "apGalts", ">", "PtcRNAi", "wing", "discs", ".", "Shaded", "regions", "indicate", "SD", ";", "dots", "represent", "the", "mean", "per", "timepoint", ";", "solid", "lines", "illustrate", "a", "fit", "of", "the", "mean", "data", ".", "(", "I", ")", "Timelapse", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "in", "apGalts", ">", "CiDN", "wing", "discs", "after", "10", "μM", "antimycin", "A", "addition", ".", "(", "J", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "measured", "over", "time", "in", "the", "dorsal", "and", "ventral", "compartments", "in", "apGalts", ">", "CiDN", "wings", ".", "Shaded", "regions", "indicate", "SD", ";", "dots", "represent", "the", "average", "per", "timepoint", ";", "solid", "lines", "illustrate", "a", "fit", "of", "the", "mean", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Timelapse of ATP sensor FRET efficiency in the apGalts>PtcRNAi wing pouch after 10 μM antimycin A (ant.A) addition. Red dashed line indicates the position of the AP boundary.(D, F) Mean FRET efficiency analyzed over time in the (D) dorsal anterior (DA) and ventral anterior (VA) sub-compartments or the (F) dorsal anterior (DA) and dorsal posterior (DP) sub-compartments of apGalts>PtcRNAi wing discs. Shaded regions indicate SD; dots represent the mean per timepoint; solid lines illustrate a fit of the mean data.(I) Timelapse of ATP sensor FRET efficiency in apGalts > CiDN wing discs after 10 μM antimycin A addition.(J) Mean FRET efficiency measured over time in the dorsal and ventral compartments in apGalts > CiDN wings. Shaded regions indicate SD; dots represent the average per timepoint; solid lines illustrate a fit of the mean data."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Timelapse", "montage", "of", "ATP", "sensor", "FRET", "efficiency", "upon", "induction", "of", "hypoxia", "in", "wing", "disc", "explants", ".", "To", "highlight", "the", "variability", "in", "this", "experiment", ",", "we", "show", "example", "discs", "from", "two", "separate", "experiments", ".", "(", "B", ",", "D", ")", "Mean", "FRET", "efficiency", "measured", "over", "time", "in", "non", "-", "organizers", "compared", "to", "(", "B", ")", "Anterior", "-", "Posterior", "boundary", "(", "APB", ")", "or", "(", "D", ")", "all", "organizer", "regions", ".", "Shaded", "regions", "indicate", "SD", ";", "dots", "are", "the", "means", "per", "each", "timepoint", ",", "and", "the", "solid", "lines", "indicate", "the", "fit", "to", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Timelapse montage of ATP sensor FRET efficiency upon induction of hypoxia in wing disc explants. To highlight the variability in this experiment, we show example discs from two separate experiments.(B, D) Mean FRET efficiency measured over time in non-organizers compared to (B) Anterior-Posterior boundary (APB) or (D) all organizer regions. Shaded regions indicate SD; dots are the means per each timepoint, and the solid lines indicate the fit to the mean."}
{"words": ["Figure", "1C", "DNA", "breaks", "were", "measured", "using", "alkaline", "comet", "assay", "in", "BRCA2", "-", "proficient", "(", "+", "BRCA2", ")", "or", "-", "deficient", "(", "-", "BRCA2", ")", "human", "DLD1", "cells", "treated", "with", "2", "µM", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "for", "16", "hours", "and", "released", "into", "fresh", "medium", "without", "pyridostatin", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "µm", ".", "D", "Quantification", "of", "DNA", "breaks", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Graph", "and", "error", "bars", "represent", "the", "mean", "and", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "A", "minimum", "of", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "P", ">", "0", ".", "5", ".", "E", "Quantification", "of", "γH2AX", "foci", "visualised", "using", "immunofluorescence", "staining", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "A", "minimum", "of", "200", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "Graph", "and", "error", "bars", "represent", "the", "mean", "and", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "001", ";", "NS", ",", "P", ">", "0", ".", "5", ".", "F", "BRCA2", "-", "deficient", "(", "-", "BRCA2", ")", "human", "DLD1", "cells", "were", "treated", "with", "2", "µM", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "for", "24", "hours", ".", "Next", ",", "pyridostatin", "was", "removed", "and", "cells", "were", "released", "in", "a", "medium", "containing", "250", "nM", "NU", "-", "7441", "(", "NU", ")", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "were", "prepared", "at", "the", "indicated", "timepoints", "after", "release", "and", "immunoblotted", "as", "shown", ".", "SMC1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "KAP1", "phosphorylation", "site", "is", "indicated", "in", "red", ".", "G", "Dose", "-", "dependent", "viability", "assays", "of", "BRCA2", "-", "proficient", "(", "+", "BRCA2", ")", "or", "-", "deficient", "(", "-", "BRCA2", ")", "human", "DLD1", "cells", "treated", "with", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "and", "NU", "-", "7441", "at", "the", "indicated", "concentrations", "for", "six", "days", ".", "Graphs", "represent", "average", "values", "obtained", "from", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "technical", "triplicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C DNA breaks were measured using alkaline comet assay in BRCA2-proficient (+BRCA2) or -deficient (-BRCA2) human DLD1 cells treated with 2 µM pyridostatin (PDS) for 16 hours and released into fresh medium without pyridostatin. Representative images are shown. Scale bar represents 100 µm. D Quantification of DNA breaks shown in (C). Graph and error bars represent the mean and SEM of n = 3 independent experiments. A minimum of 50 cells were analysed per condition per experiment. P values were calculated using an unpaired two-tailed t-test. *, P ≤ 0.05; NS, P > 0.5. E Quantification of γH2AX foci visualised using immunofluorescence staining in cells treated as in (C). A minimum of 200 cells were analysed per condition per experiment. Graph and error bars represent the mean and SEM of n = 3 independent experiments. P values were calculated using an unpaired two-tailed t-test. ***, P ≤ 0.001; NS, P > 0.5.F BRCA2-deficient (-BRCA2) human DLD1 cells were treated with 2 µM pyridostatin (PDS) for 24 hours. Next, pyridostatin was removed and cells were released in a medium containing 250 nM NU-7441 (NU). Whole-cell extracts were prepared at the indicated timepoints after release and immunoblotted as shown. SMC1 was used as a loading control. KAP1 phosphorylation site is indicated in red.G Dose-dependent viability assays of BRCA2-proficient (+BRCA2) or -deficient (-BRCA2) human DLD1 cells treated with pyridostatin (PDS) and NU-7441 at the indicated concentrations for six days. Graphs represent average values obtained from of n = 3 independent experiments, each performed in technical triplicates."}
{"words": ["Figure", "2Quantitative", "RT", "-", "PCR", "of", "cells", "grown", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "treated", "with", "10", "µM", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "for", "3", "days", "was", "performed", "using", "primers", "specific", "for", "the", "indicated", "genes", ".", "mRNA", "levels", "are", "expressed", "relative", "to", "GAPDH", "and", "to", "-", "DOX", "(", "+", "BRCA2", ")", "cells", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "technical", "triplicate", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "BRCA2", "+", "/", "+", "and", "BRCA2", "-", "/", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "for", "2", "days", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "were", "immunoblotted", "as", "indicated", ".", "KAP1", ",", "IRF3", "and", "STAT1", "phosphorylation", "sites", "are", "shown", "in", "red", ".", "Tubulin", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "H1299", "+", "shBRCA2DOX", "cells", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "fixed", "and", "prepared", "for", "immunofluorescence", "with", "antibody", "against", "cGAS", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "µm", ".", "Quantification", "of", "cGAS", "-", "positive", "micronuclei", "per", "cells", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "Graph", "and", "error", "bars", "represent", "the", "mean", "and", "SEM", "of", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "A", "minimum", "of", "250", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", "per", "experiment", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "P", ">", "0", ".", "5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Quantitative RT-PCR of cells grown as in (A) and treated with 10 µM pyridostatin (PDS) for 3 days was performed using primers specific for the indicated genes. mRNA levels are expressed relative to GAPDH and to -DOX (+BRCA2) cells. Error bars represent the SEM of n = 3 independent experiments, each performed in technical triplicate. P values were calculated using an unpaired two-tailed t-test. *, P ≤ 0.05; ***, P ≤ 0.001.BRCA2+/+ and BRCA2-/- RPE-1 cells were treated with 10 μM pyridostatin (PDS) for 2 days. Whole-cell extracts were immunoblotted as indicated. KAP1, IRF3 and STAT1 phosphorylation sites are shown in red. Tubulin and GAPDH were used as loading controls.H1299+shBRCA2DOX cells treated as in (B) were fixed and prepared for immunofluorescence with antibody against cGAS. DNA was counterstained with DAPI. Scale bar represents 20 µm. Quantification of cGAS-positive micronuclei per cells shown in (E). Graph and error bars represent the mean and SEM of of n = 3 independent experiments. A minimum of 250 cells were analysed per condition per experiment. P values were calculated using an unpaired two-tailed t-test. *, P ≤ 0.05; **, P ≤ 0.01; NS, P > 0.5."}
{"words": ["Figure", "3FVB", "female", "mice", "were", "injected", "intramuscularly", "with", "(", "A", ")", "BRCA1", "-", "proficient", "KP3", ".", "33", "(", "Brca1", "+", "/", "+", ")", "or", "(", "B", ")", "BRCA1", "/", "53BP1", "-", "deficient", "KB1PM5", "(", "Brca1", "-", "/", "-", ",", "Tp53bp1", "-", "/", "-", ")", "mouse", "mammary", "tumour", "cells", ".", "Pyridostatin", "(", "PDS", ")", "was", "administered", "intravenously", "(", "i", ".", "v", ".", ";", "7", ".", "5", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", "and", "talazoparib", "was", "administered", "orally", "(", "p", ".", "o", ".", ";", "0", ".", "33", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "over", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ".", "Vertical", "dotted", "line", "indicates", "end", "of", "treatment", ".", "Tumour", "volume", "was", "measured", "at", "the", "timepoints", "shown", "on", "the", "graph", "and", "expressed", "relative", "to", "tumour", "volume", "at", "the", "beginning", "of", "treatment", ".", "Each", "experimental", "group", "included", "n", "=", "5", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "P", "values", "were", "calculated", "between", "treated", "and", "untreated", "tumours", "at", "day", "16", ",", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "0001", ";", "NS", ",", "P", ">", "0", ".", "5", ".", "BRCA1", "+", "/", "+", ",", "BRCA1", "-", "/", "-", "and", "BRCA1", "-", "/", "-", "/", "TP53BP1", "-", "/", "-", "RPE", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "pyridostatin", "(", "PDS", ")", "or", "2", "μM", "olaparib", "for", "2", "days", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "were", "immunoblotted", "as", "indicated", ".", "KAP1", ",", "IRF3", "and", "STAT1", "phosphorylation", "sites", "are", "shown", "in", "red", ".", "SMC1", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "loading", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3FVB female mice were injected intramuscularly with (A) BRCA1-proficient KP3.33 (Brca1+/+) or (B) BRCA1/53BP1-deficient KB1PM5 (Brca1-/-, Tp53bp1-/-) mouse mammary tumour cells. Pyridostatin (PDS) was administered intravenously (i.v.; 7.5 mg/kg/day) and talazoparib was administered orally (p.o.; 0.33 mg/kg/day), over the indicated periods of time. Vertical dotted line indicates end of treatment. Tumour volume was measured at the timepoints shown on the graph and expressed relative to tumour volume at the beginning of treatment. Each experimental group included n = 5 mice. Error bars represent SEM. P values were calculated between treated and untreated tumours at day 16, using an unpaired two-tailed t-test. ****, P ≤ 0.0001; NS, P > 0.5.BRCA1+/+, BRCA1-/- and BRCA1-/-/TP53BP1-/- RPE-1 cells were treated with 10 μM pyridostatin (PDS) or 2 μM olaparib for 2 days. Whole-cell extracts were immunoblotted as indicated. KAP1, IRF3 and STAT1 phosphorylation sites are shown in red. SMC1 and GAPDH were used as loading controls."}
{"words": ["Figure", "4B", "VHIO179", "PDTXs", "were", "grafted", "into", "CB17", "-", "SCID", "female", "mice", ".", "Pyridostatin", "was", "administered", "intravenously", "(", "7", ".", "5", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", "over", "the", "indicated", "periods", "of", "time", ".", "Vertical", "dotted", "line", "indicates", "end", "of", "treatment", ".", "Tumour", "volume", "was", "measured", "at", "the", "timepoints", "shown", "on", "the", "graph", "and", "expressed", "relative", "to", "tumour", "volume", "at", "the", "beginning", "of", "treatment", ".", "Each", "experimental", "group", "included", "n", "=", "7", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "P", "values", "were", "calculated", "between", "treated", "and", "untreated", "tumours", "at", "day", "24", ",", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B VHIO179 PDTXs were grafted into CB17-SCID female mice. Pyridostatin was administered intravenously (7.5 mg/kg/day) over the indicated periods of time. Vertical dotted line indicates end of treatment. Tumour volume was measured at the timepoints shown on the graph and expressed relative to tumour volume at the beginning of treatment. Each experimental group included n = 7 mice. Error bars represent SEM. P values were calculated between treated and untreated tumours at day 24, using an unpaired two-tailed t-test. ****, P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "for", "mice", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "with", "each", "treatment", "group", "containing", "n", "=", "5", "mice", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Log", "-", "rank", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Kaplan-Meier survival curve for mice treated as in (C), with each treatment group containing n = 5 mice. Statistical significance was assessed by Log-rank test (****P <0.0001)."}
{"words": ["Figure", "6Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "for", "mice", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "with", "each", "treatment", "group", "containing", "n", "=", "6", "mice", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Log", "-", "rank", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Kaplan-Meier survival curve for mice treated as in (C), with each treatment group containing n = 6 mice. Statistical significance was assessed by Log-rank test (****P <0.0001)."}
{"words": ["Figure", "4BN", "-", "PAGE", "of", "20", "µg", "solubilized", "BHM", "with", "several", "of", "the", "distinct", "complexes", "annotated", ".", "The", "dashed", "box", "indicates", "the", "monomeric", "ATP", "synthase", "(", "complex", "V", ")", "band", "subjected", "to", "IGX", "-", "MS", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4BN-PAGE of 20 µg solubilized BHM with several of the distinct complexes annotated. The dashed box indicates the monomeric ATP synthase (complex V) band subjected to IGX-MS."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Manually", "segmented", "rosettes", "on", "3D", "reconstructions", "from", "Z", "-", "stacks", "of", "25", "μm", "of", "an", "E5", ".", "75", "embryo", "imaged", "using", "lightsheet", "microscopy", ".", "AVE", "cells", "are", "in", "green", ",", "and", "all", "cell", "membranes", "are", "labelled", "in", "grey", ".", "Left", ":", "anterior", "view", ";", "Middle", ":", "lateral", "view", "(", "anterior", "to", "the", "left", ")", ";", "Right", ":", "posterior", "view", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "a", "'", ")", "Mouse", "line", "strategy", "used", "to", "perform", "live", "imaging", ".", "(", "a", "\"", ")", "Left", ":", "Number", "of", "rosettes", "normalized", "by", "the", "total", "number", "of", "cells", "in", "the", "epiblast", "region", "in", "focus", "expressed", "in", "percentage", ".", "Right", ":", "Frequency", "of", "rosettes", ",", "normalized", "by", "the", "area", "in", "mm2", "of", "the", "epiblast", "region", "in", "focus", "and", "the", "time", "of", "observation", "in", "minutes", ".", "Data", "information", ":", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "41", "frames", "from", "3", "embryos", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Rosettes", "outlines", "on", "optical", "slices", "from", "E5", ".", "75", "(", "b", ")", "and", "E6", ".", "25", "(", "c", ")", "embryos", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "AVE", "cells", "are", "in", "green", ",", "and", "all", "cell", "membranes", "are", "labelled", "in", "grey", ".", "Left", ":", "anterior", "view", ";", "Middle", ":", "lateral", "view", "(", "anterior", "to", "the", "left", ")", ";", "Right", ":", "posterior", "view", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "b", "'", ")", "Mouse", "lines", "strategy", "used", "to", "perform", "live", "imaging", ".", "(", "b", "'", "'", ",", "c", "'", ")", "Left", ":", "Number", "of", "rosettes", "normalized", "by", "the", "total", "number", "of", "cells", "expressed", "in", "percentage", ".", "Right", ":", "Density", "of", "rosettes", ",", "normalized", "by", "the", "area", "in", "mm2", "of", "the", "epiblast", "region", "in", "focus", ".", "The", "posterior", "region", "includes", "the", "PS", "region", ",", "as", "it", "could", "not", "be", "precisely", "discriminated", ".", "Data", "information", ":", "Mean", "±", "SEM", ".", "E5", ".", "75", ":", "n", "anterior", "=", "19", "frames", "from", "3", "embryos", ",", "n", "lateral", "=", "23", "frames", "from", "5", "embryos", ",", "n", "posterior", "=", "20", "frames", "from", "3", "embryos", ".", "E6", ".", "25", ":", "n", "anterior", "=", "16", "frames", "from", "2", "embryos", ",", "n", "lateral", "=", "12", "frames", "from", "1", "embryo", "and", "n", "posterior", "=", "16", "frames", "from", "2", "embryos", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Manually segmented rosettes on 3D reconstructions from Z-stacks of 25 μm of an E5.75 embryo imaged using lightsheet microscopy. AVE cells are in green, and all cell membranes are labelled in grey. Left: anterior view; Middle: lateral view (anterior to the left); Right: posterior view. Scale bars: 20 μm. (a') Mouse line strategy used to perform live imaging. (a\") Left: Number of rosettes normalized by the total number of cells in the epiblast region in focus expressed in percentage. Right: Frequency of rosettes, normalized by the area in mm2 of the epiblast region in focus and the time of observation in minutes. Data information: Mean ± SEM, n=41 frames from 3 embryos. (b, c) Rosettes outlines on optical slices from E5.75 (b) and E6.25 (c) embryos imaged by confocal microscopy. AVE cells are in green, and all cell membranes are labelled in grey. Left: anterior view; Middle: lateral view (anterior to the left); Right: posterior view. Scale bars: 20 μm. (b') Mouse lines strategy used to perform live imaging. (b'', c') Left: Number of rosettes normalized by the total number of cells expressed in percentage. Right: Density of rosettes, normalized by the area in mm2 of the epiblast region in focus. The posterior region includes the PS region, as it could not be precisely discriminated. Data information: Mean ± SEM. E5.75: n anterior=19 frames from 3 embryos, n lateral=23 frames from 5 embryos, n posterior=20 frames from 3 embryos. E6.25: n anterior=16 frames from 2 embryos, n lateral=12 frames from 1 embryo and n posterior=16 frames from 2 embryos."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "Z", "-", "projection", "of", "an", "E7", ".", "25", "embryo", "mosaically", "labelled", "through", "OH", "-", "tamoxifen", "injection", ",", "imaged", "by", "two", "-", "photon", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Data", "information", ":", "n", "embryos", "=", "54", ".", "(", "a", "'", ")", "Mouse", "line", "strategy", "used", "to", "produce", "embryos", "ubiquitous", "for", "membrane", "tdTomato", "(", "grey", ")", "and", "mosaic", "for", "membrane", "GFP", "(", "mGFP", ",", "green", ")", "in", "the", "epiblast", ".", "(", "b", ")", "Z", "-", "projections", "of", "stills", "from", "live", "imaging", "recording", "of", "a", "bottle", "-", "shaped", "cell", "(", "indicated", "by", "a", "white", "arrow", ")", "that", "delaminates", "through", "the", "basal", "membrane", "at", "time", "0min", ",", "25", "min", ",", "50", "min", ",", "1h15min", "and", "1h40min", ".", "(", "b", "'", ")", "Top", ":", "Bottle", "shape", "events", ":", "GFP", "+", "bottle", "shape", "cells", "over", "total", "GFP", "+", "cells", ",", "expressed", "in", "percentage", ",", "in", "anterior", "versus", "posterior", "region", "of", "the", "epiblast", ".", "The", "posterior", "region", "includes", "the", "PS", "region", ",", "as", "it", "could", "not", "be", "precisely", "discriminated", ".", "Percentage", "of", "bottle", "shape", "cells", "exiting", "the", "epiblast", "among", "total", "number", "of", "GFP", "+", "bottle", "shape", "cells", ",", "in", "anterior", "versus", "posterior", "epiblast", ".", "white", "dotted", "lines", "outline", "basal", "(", "top", ")", "and", "apical", "(", "bottom", ")", "borders", "of", "the", "epiblast", ".", "(", "c", ")", "Z", "projection", "(", "c", ")", "and", "3D", "reconstruction", "(", "c", "'", ")", "of", "stills", "from", "live", "imaging", "recording", "showing", "an", "apical", "division", "without", "basal", "contact", ",", "followed", "by", "daughter", "cells", "dispersion", "at", "0min", ",", "25", "min", ",", "50", "min", ",", "1h15min", "and", "1h40min", ".", "white", "dotted", "lines", "outline", "basal", "(", "top", ")", "and", "apical", "(", "bottom", ")", "borders", "of", "the", "epiblast", ".", "(", "c", "\"", ")", "Left", ":", "Frequency", "of", "apical", "division", "(", "GFP", "+", "apical", "division", "over", "total", "GFP", "+", "cells", ",", "expressed", "in", "percentage", ")", "in", "anterior", "and", "posterior", "epiblast", ".", "Middle", ":", "Apical", "division", "with", "or", "without", "persistence", "of", "contact", "with", "the", "epiblast", "basal", "pole", ",", "normalized", "by", "the", "total", "number", "of", "GFP", "+", "apical", "division", ",", "in", "anterior", "versus", "posterior", "epiblast", ".", "Right", ":", "Cell", "dispersion", "(", "defined", "as", "loss", "of", "basolateral", "contact", "between", "daughter", "cells", "after", "reinsertion", "in", "the", "epiblast", "layer", ")", "after", "apical", "division", "in", "anterior", "and", "posterior", "epiblast", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) Z-projection of an E7.25 embryo mosaically labelled through OH-tamoxifen injection, imaged by two-photon microscopy. Scale bar: 50 μm. Data information: n embryos=54. (a') Mouse line strategy used to produce embryos ubiquitous for membrane tdTomato (grey) and mosaic for membrane GFP (mGFP, green) in the epiblast. (b) Z-projections of stills from live imaging recording of a bottle-shaped cell (indicated by a white arrow) that delaminates through the basal membrane at time 0min, 25 min, 50 min, 1h15min and 1h40min. (b') Top: Bottle shape events: GFP+ bottle shape cells over total GFP+ cells, expressed in percentage, in anterior versus posterior region of the epiblast. The posterior region includes the PS region, as it could not be precisely discriminated. Percentage of bottle shape cells exiting the epiblast among total number of GFP+ bottle shape cells, in anterior versus posterior epiblast. white dotted lines outline basal (top) and apical (bottom) borders of the epiblast.(c) Z projection (c) and 3D reconstruction (c') of stills from live imaging recording showing an apical division without basal contact, followed by daughter cells dispersion at 0min, 25 min, 50 min, 1h15min and 1h40min. white dotted lines outline basal (top) and apical (bottom) borders of the epiblast. (c\") Left: Frequency of apical division (GFP+ apical division over total GFP+ cells, expressed in percentage) in anterior and posterior epiblast. Middle: Apical division with or without persistence of contact with the epiblast basal pole, normalized by the total number of GFP+ apical division, in anterior versus posterior epiblast. Right: Cell dispersion (defined as loss of basolateral contact between daughter cells after reinsertion in the epiblast layer) after apical division in anterior and posterior epiblast."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "a", ")", "Z", "-", "projection", "(", "a", ")", "and", "3D", "cell", "reconstruction", "(", "a", "'", ")", "of", "stills", "from", "two", "-", "photon", "live", "imaging", "of", "an", "E7", ".", "25", "embryo", "mosaically", "labelled", "for", "epiblast", "cells", "showing", "a", "division", "giving", "rise", "to", "an", "epiblast", "and", "a", "mesoderm", "cell", "that", "will", "exit", "from", "the", "epiblast", "layer", ".", "White", "dotted", "lines", "outline", "basal", "(", "top", ")", "and", "apical", "(", "bottom", ")", "borders", "of", "the", "epiblast", "at", "0min", ",", "25", "min", ",", "50min", ",", "1h15min", "and", "1h40min", ".", "(", "b", ")", "(", "c", ")", "Z", "projection", "of", "stills", "from", "two", "-", "photon", "live", "imaging", "of", "an", "E7", ".", "25", "embryo", "mosaically", "labelled", "for", "epiblast", "cells", ".", "Non", "-", "apical", "division", "can", "be", "observed", "in", "the", "posterior", "epiblast", "only", ",", "without", "(", "b", ")", "or", "with", "(", "c", ")", "attachment", "to", "the", "apical", "side", ".", "Stills", "were", "taken", "at", "0min", ",", "25", "min", ",", "50min", ",", "1h15min", "and", "1h40min", "for", "(", "b", ")", "and", "50min", ",", "1h15min", ",", "1h40min", ",", "2h05min", "and", "2h30min", "for", "(", "c", ")", ".", "White", "dotted", "lines", "outline", "basal", "(", "top", ")", "and", "apical", "(", "bottom", ")", "borders", "of", "the", "epiblast", ".", "(", "d", ")", "Mitotic", "Index", "(", "GFP", "+", "dividing", "cells", "over", "total", "number", "of", "GFP", "+", "cells", ")", "in", "the", "anterior", "and", "posterior", "region", ",", "as", "well", "as", "among", "cells", "exiting", "the", "epiblast", "at", "the", "PS", ".", "The", "posterior", "region", "includes", "the", "PS", "region", ",", "as", "it", "could", "not", "be", "precisely", "discriminated", ".", "(", "e", ")", "Ratio", "of", "non", "-", "apical", "rounding", "(", "non", "-", "apical", "GFP", "+", "rounding", "divided", "by", "the", "total", "GFP", "+", "rounding", ")", "and", "expressed", "in", "percentage", "for", "the", "anterior", "and", "posterior", "regions", ".", "(", "f", ")", "Ratio", "of", "non", "-", "apical", "division", "(", "non", "-", "apical", "GFP", "+", "division", "over", "total", "GFP", "+", "division", ")", "and", "expressed", "in", "percentage", "for", "the", "anterior", "and", "posterior", "region", "of", "the", "embryo", ".", "(", "g", ")", "Quantification", "of", "posterior", "cell", "division", "outcome", "for", "apical", "and", "non", "-", "apical", "divisions", ".", "Outcomes", "are", "2", "epiblast", "daughter", "cells", "(", "epi", "/", "epi", ")", ",", "one", "epiblast", "and", "one", "mesoderm", "daughter", "cells", "(", "epi", "/", "meso", ")", "or", "2", "mesoderm", "daughter", "cells", "(", "meso", "/", "meso", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(a) Z-projection (a) and 3D cell reconstruction (a') of stills from two-photon live imaging of an E7.25 embryo mosaically labelled for epiblast cells showing a division giving rise to an epiblast and a mesoderm cell that will exit from the epiblast layer. White dotted lines outline basal (top) and apical (bottom) borders of the epiblast at 0min, 25 min, 50min, 1h15min and 1h40min. (b) (c) Z projection of stills from two-photon live imaging of an E7.25 embryo mosaically labelled for epiblast cells. Non-apical division can be observed in the posterior epiblast only, without (b) or with (c) attachment to the apical side. Stills were taken at 0min, 25 min, 50min, 1h15min and 1h40min for (b) and 50min, 1h15min, 1h40min, 2h05min and 2h30min for (c). White dotted lines outline basal (top) and apical (bottom) borders of the epiblast.(d) Mitotic Index (GFP+ dividing cells over total number of GFP+ cells) in the anterior and posterior region, as well as among cells exiting the epiblast at the PS. The posterior region includes the PS region, as it could not be precisely discriminated.(e) Ratio of non-apical rounding (non-apical GFP+ rounding divided by the total GFP+ rounding) and expressed in percentage for the anterior and posterior regions.(f) Ratio of non-apical division (non-apical GFP+ division over total GFP+ division) and expressed in percentage for the anterior and posterior region of the embryo.(g) Quantification of posterior cell division outcome for apical and non-apical divisions. Outcomes are 2 epiblast daughter cells (epi/epi), one epiblast and one mesoderm daughter cells (epi/meso) or 2 mesoderm daughter cells (meso/meso)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "c", ")", "Z", "-", "projections", "of", "transverse", "sections", "from", "E6", ".", "5", "(", "top", ")", ",", "E6", ".", "75", "(", "mid", ")", "and", "E7", "(", "bottom", ")", "embryos", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "grey", ")", "and", "mitosis", "(", "Phh3", ",", "magenta", ")", "on", "the", "left", "and", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "cyan", ")", "and", "basement", "membrane", "(", "collagen", "IV", ",", "yellow", ")", "on", "the", "right", ".", "Yellow", "arrowheads", "show", "non", "-", "apical", "mitosis", ".", "White", "arrows", "delimitate", "borders", "of", "the", "basement", "membrane", "degradation", "region", ".", "A", ":", "anterior", ",", "P", ":", "posterior", ".", "(", "d", ")", "Mitotic", "Index", "(", "Phh3", "/", "DAPI", ")", "in", "percentage", "at", "the", "anterior", ",", "posterior", ",", "and", "PS", "regions", "of", "E6", ".", "5", "(", "top", ")", ",", "E6", ".", "75", "(", "mid", ")", "and", "E7", "(", "bottom", ")", "embryos", ".", "The", "posterior", "region", "quantification", "excludes", "counts", "from", "the", "PS", "region", ".", "(", "e", ")", "Ratio", "of", "non", "-", "apical", "mitosis", "(", "non", "-", "apical", "Phh3", "/", "Phh3", ",", "normalized", "by", "number", "of", "nuclei", ")", "in", "percentage", "at", "the", "anterior", ",", "posterior", ",", "and", "PS", "regions", "of", "E6", ".", "5", "(", "top", ")", ",", "E6", ".", "75", "(", "mid", ")", "and", "E7", "(", "bottom", ")", "embryos", ".", "(", "f", ")", "Violin", "plots", "representing", "the", "distribution", "of", "cells", "in", "G2", "/", "M", "phase", "in", "cells", "with", "high", ",", "compared", "to", "low", ",", "Brachyury", "expression", ",", "among", "cells", "annotated", "as", "primitive", "streak", "and", "mesoderm", "harvested", "from", "E6", ".", "5", ",", "E7", ",", "and", "E7", ".", "25", "embryos", ".", "Violin", "plots", "are", "overlaid", "with", "white", "box", "plots", "marking", "25th", "percentile", ",", "median", "and", "75th", "percentile", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(c) Z-projections of transverse sections from E6.5 (top), E6.75 (mid) and E7 (bottom) embryos. Samples were stained for F-actin (Phalloidin, grey) and mitosis (Phh3, magenta) on the left and nuclei (DAPI, cyan) and basement membrane (collagen IV, yellow) on the right. Yellow arrowheads show non-apical mitosis. White arrows delimitate borders of the basement membrane degradation region. A: anterior, P: posterior.(d) Mitotic Index (Phh3/DAPI) in percentage at the anterior, posterior, and PS regions of E6.5 (top), E6.75 (mid) and E7 (bottom) embryos. The posterior region quantification excludes counts from the PS region.(e) Ratio of non-apical mitosis (non-apical Phh3/ Phh3, normalized by number of nuclei) in percentage at the anterior, posterior, and PS regions of E6.5 (top), E6.75 (mid) and E7 (bottom) embryos.(f) Violin plots representing the distribution of cells in G2/M phase in cells with high, compared to low, Brachyury expression, among cells annotated as primitive streak and mesoderm harvested from E6.5, E7, and E7.25 embryos. Violin plots are overlaid with white box plots marking 25th percentile, median and 75th percentile."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "a", ")", "3D", "reconstruction", "from", "wholemount", "lightsheet", "imaging", "of", "an", "E5", ".", "75", "Hex", "-", "GFP", "(", "green", ",", "anterior", "marker", ")", "embryo", ",", "stained", "for", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "grey", ")", "on", "the", "left", ",", "mitosis", "(", "Phh3", ",", "magenta", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "grey", ")", "on", "the", "right", ".", "(", "b", ")", "Z", "-", "slice", "(", "left", ")", "and", "3D", "reconstruction", "(", "right", ")", "from", "wholemount", "lightsheet", "imaging", "of", "an", "E6", ".", "25", "embryo", "stained", "for", "a", "posterior", "marker", "(", "Eomesodermin", ",", "cyan", ")", ",", "mitosis", "(", "Phh3", ",", "magenta", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "grey", ")", ".", "(", "a", "'", ",", "b", "'", ")", "Mitotic", "Index", "(", "Phh3", "/", "DAPI", ")", "in", "percentage", "at", "the", "anterior", "and", "posterior", "regions", "of", "E5", ".", "75", "(", "a", "'", ")", "and", "(", "b", "'", ")", "E6", ".", "25", "embryos", ".", "Posterior", "region", "includes", "the", "PS", "region", ",", "as", "it", "could", "not", "be", "precisely", "discriminated", ".", "(", "a", "\"", ",", "b", "\"", ")", "Ratio", "of", "non", "-", "apical", "mitosis", "(", "non", "-", "apical", "Phh3", "over", "total", "Phh3", ",", "normalized", "by", "number", "of", "nuclei", ")", "in", "percentage", "in", "the", "anterior", "and", "posterior", "region", "of", "E5", ".", "75", "(", "a", "\"", ")", "and", "E6", ".", "25", "(", "b", "\"", ")", "embryos", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(a) 3D reconstruction from wholemount lightsheet imaging of an E5.75 Hex-GFP (green, anterior marker) embryo, stained for nuclei (DAPI, grey) on the left, mitosis (Phh3, magenta) and F-actin (Phalloidin, grey) on the right. (b) Z-slice (left) and 3D reconstruction (right) from wholemount lightsheet imaging of an E6.25 embryo stained for a posterior marker (Eomesodermin, cyan), mitosis (Phh3, magenta) and F-actin (Phalloidin, grey). (a', b') Mitotic Index (Phh3/DAPI) in percentage at the anterior and posterior regions of E5.75 (a') and (b') E6.25 embryos. Posterior region includes the PS region, as it could not be precisely discriminated. (a\", b\") Ratio of non-apical mitosis (non-apical Phh3 over total Phh3, normalized by number of nuclei) in percentage in the anterior and posterior region of E5.75 (a\") and E6.25 (b\") embryos."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "b", ",", "c", ")", "3D", "reconstruction", "(", "b", ")", "and", "confocal", "Z", "-", "slice", "(", "c", ")", "of", "E6", ".", "25", "WT", "(", "left", ")", "and", "RhoAVE", "-", "deleted", "(", "right", ")", "embryos", "stained", "for", "an", "AVE", "marker", "(", "Cerberus", "1", ",", "yellow", ")", ",", "F", "-", "actin", "(", "Phalloidin", ",", "grey", ")", "and", "mitosis", "(", "Phh3", ",", "magenta", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "Blue", "dotted", "line", "delimitates", "the", "pro", "-", "amniotic", "cavity", "(", "apical", "side", "of", "the", "epiblast", ")", ".", "Red", "arrowheads", "point", "to", "non", "-", "apical", "mitosis", ".", "White", "lines", "delimitates", "the", "boundary", "between", "extraembryonic", "(", "up", ")", "and", "embryonic", "(", "down", ")", "regions", "of", "the", "embryo", ".", "(", "d", ")", "Percentage", "of", "AVE", "migration", "in", "WT", "and", "RhoAVE", "-", "deleted", "mutants", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "shown", "as", "Mean", "±", "SEM", ".", "WT", ":", "n", "=", "31", "embryos", ";", "RhoAVE", "-", "deleted", ":", "n", "=", "17", "embryos", ".", "(", "e", ")", "Ratio", "of", "non", "-", "apical", "mitosis", "(", "non", "-", "apical", "Phh3", "over", "total", "Phh3", ",", "normalised", "by", "the", "volume", "in", "μm3", ")", "in", "percentage", ",", "in", "AVE", "-", "adjacent", "and", "AVE", "-", "opposed", "regions", "from", "WT", "and", "RhoAVE", "-", "deleted", "embryos", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(b, c) 3D reconstruction (b) and confocal Z-slice (c) of E6.25 WT (left) and RhoAVE-deleted (right) embryos stained for an AVE marker (Cerberus 1, yellow), F-actin (Phalloidin, grey) and mitosis (Phh3, magenta). Scale bar: 25 μm. Blue dotted line delimitates the pro-amniotic cavity (apical side of the epiblast). Red arrowheads point to non-apical mitosis. White lines delimitates the boundary between extraembryonic (up) and embryonic (down) regions of the embryo.(d) Percentage of AVE migration in WT and RhoAVE-deleted mutants. Data information: Values are shown as Mean ± SEM. WT: n=31 embryos; RhoAVE-deleted: n=17 embryos.(e) Ratio of non-apical mitosis (non-apical Phh3 over total Phh3, normalised by the volume in μm3) in percentage, in AVE-adjacent and AVE-opposed regions from WT and RhoAVE-deleted embryos."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "T2", "-", "weighted", "MR", "images", "in", "coronal", "plane", "show", "abscess", "formation", "in", "the", "left", "lower", "pulmonary", "lobe", "(", "upper", "panel", ")", "and", "in", "spleen", "and", "left", "axilla", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "D", ")", "Histological", "sections", "of", "patient", "biopsies", "stained", "with", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "left", "panel", ")", "or", "with", "an", "actin", "antibody", "(", "right", "panel", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "skin", ":", "left", "1000µm", ",", "right", "100µm", ";", "lung", ":", "left", "500µm", ",", "right", "250µm", ";", "spleen", ":", "left", "1000µm", ",", "right", "75µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) T2-weighted MR images in coronal plane show abscess formation in the left lower pulmonary lobe (upper panel) and in spleen and left axilla (lower panel).(D) Histological sections of patient biopsies stained with hematoxylin and eosin (left panel) or with an actin antibody (right panel). Scale bars: skin: left 1000µm, right 100µm; lung: left 500µm, right 250µm; spleen: left 1000µm, right 75µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Expression", "of", "indicated", "proteins", "was", "determined", "by", "western", "blot", "in", "patient", "-", "derived", "and", "control", "fibroblasts", "and", "B", "cells", "and", "A549", "OTULIN", "WT", "and", "KO", "cells", ".", "One", "representative", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "FLAG", "-", "tagged", "tandem", "ubiquitin", "binding", "entity", "(", "TUBE", ")", "assay", "was", "performed", "to", "pull", "down", "linear", "ubiquitin", "linkages", "in", "patient", "-", "derived", "and", "control", "fibroblasts", "and", "B", "cells", ".", "One", "representative", "out", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Expression of indicated proteins was determined by western blot in patient-derived and control fibroblasts and B cells and A549 OTULIN WT and KO cells. One representative out of three independent experiments is shown.(B) FLAG-tagged tandem ubiquitin binding entity (TUBE) assay was performed to pull down linear ubiquitin linkages in patient-derived and control fibroblasts and B cells. One representative out of three independent experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "4Biochemical", "characterization", "of", "recombinant", "OTULIN", "variants", "by", "means", "of", "differential", "scanning", "fluorimetry", "(", "DSF", ")", "A", ")", "DSF", "measurements", "with", "OTULINWT", ",", "OTULINM86I", "or", "OTULINW167S", ".", "Melting", "temperatures", "(", "Tm", ")", "are", "calculated", "from", "five", "independent", "experiments", "with", "standard", "deviations", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "011", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "=", "6", ".", "64x10", "-", "18", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Biochemical", "characterization", "of", "recombinant", "OTULIN", "variants", "by", "means", "of", "surface", "plasmon", "resonance", "(", "SPR", ")", "measurements", "(", "B", ")", "SPR", "measurements", "and", "steady", "-", "state", "binding", "curves", "with", "calculated", "dissociation", "constants", "(", "Kd", ")", "after", "injection", "of", "a", "concentration", "series", "of", "OTULINC129A", ",", "OTULINC129A", "/", "M86I", "or", "OTULINC129A", "/", "W167S", "to", "CM5", "-", "immobilized", "di", "-", "ubiquitin", "chains", ".", "(", "C", ")", "Linear", "ubiquitin", "linkages", "isolated", "from", "A549", "OTULIN", "KO", "cells", "by", "M1", "TUBE", "assay", "were", "incubated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "recombinant", "OTULINWT", ",", "OTULINM86I", "and", "OTULINW167S", "or", "catalytically", "inactive", "OTULINC129A", "as", "control", "for", "1", "hour", ".", "Afterwards", ",", "samples", "were", "subjected", "to", "analysis", "by", "western", "blot", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Biochemical characterization of recombinant OTULIN variants by means of differential scanning fluorimetry (DSF) A) DSF measurements with OTULINWT, OTULINM86I or OTULINW167S. Melting temperatures (Tm) are calculated from five independent experiments with standard deviations. *, P = 0.011; ****, P = 6.64x10-18, unpaired t-test.Biochemical characterization of recombinant OTULIN variants by means of surface plasmon resonance (SPR) measurements (B) SPR measurements and steady-state binding curves with calculated dissociation constants (Kd) after injection of a concentration series of OTULINC129A, OTULINC129A/M86I or OTULINC129A/W167S to CM5-immobilized di-ubiquitin chains.(C) Linear ubiquitin linkages isolated from A549 OTULIN KO cells by M1 TUBE assay were incubated with increasing concentrations of recombinant OTULINWT, OTULINM86I and OTULINW167S or catalytically inactive OTULINC129A as control for 1 hour. Afterwards, samples were subjected to analysis by western blot for the indicated proteins. Images are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "A549", "OTULIN", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "or", "different", "OTULIN", "constructs", "as", "indicated", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "(", "D", ")", "FLAG", "-", "tagged", "tandem", "ubiquitin", "binding", "entity", "(", "TUBE", ")", "assay", "was", "performed", "in", "B", "cells", "from", "control", ",", "patient", ",", "mother", "and", "father", "to", "pull", "down", "linear", "ubiquitin", "linkages", ".", "One", "representative", "(", "A", "-", "D", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A - C) A549 OTULIN KO cells were transfected with empty vector or different OTULIN constructs as indicated and analyzed by western blot. (D) FLAG-tagged tandem ubiquitin binding entity (TUBE) assay was performed in B cells from control, patient, mother and father to pull down linear ubiquitin linkages. One representative (A - D) of three independent experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "6Patient", "-", "derived", "and", "control", "fibroblasts", "were", "used", ".", "(", "A", ")", "FLAG", "-", "tagged", "tandem", "ubiquitin", "binding", "entity", "(", "TUBE", ")", "assay", "was", "performed", "to", "pull", "down", "linear", "ubiquitin", "linkages", "upon", "stimulation", "with", "500ng", "/", "ml", "TNF", ".", "(", "B", ")", "The", "TNFR1", "-", "SC", "was", "isolated", "using", "500ng", "/", "ml", "TAP", "-", "TNF", ".", "(", "C", ")", "Cells", "were", "stimulated", "with", "100ng", "/", "ml", "TNF", "for", "the", "indicated", "times", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "One", "representative", "(", "A", "-", "C", ")", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "E", ")", "B", "cells", "were", "incubated", "with", "50µg", "/", "ml", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "subjected", "to", "analysis", "by", "western", "blot", ".", "One", "representative", "(", "left", "panel", ")", "out", "of", "4", "individual", "experiments", "analyzed", "by", "densitometry", "(", "right", "panel", ")", "is", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Fibroblasts", "were", "incubated", "with", "50µg", "/", "ml", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "or", "DMSO", "and", "stimulated", "with", "TNF", "as", "indicated", ".", "Viability", "was", "measured", "after", "24", "hours", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "5", "individual", "experiments", "performed", "in", "three", "technical", "replicates", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "0008", ",", "mixed", "-", "effects", "analysis", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Patient-derived and control fibroblasts were used. (A) FLAG-tagged tandem ubiquitin binding entity (TUBE) assay was performed to pull down linear ubiquitin linkages upon stimulation with 500ng/ml TNF. (B) The TNFR1-SC was isolated using 500ng/ml TAP-TNF. (C) Cells were stimulated with 100ng/ml TNF for the indicated times and analyzed by western blot. One representative (A - C) of three independent experiments is shown.(E) B cells were incubated with 50µg/ml cycloheximide (CHX) for the indicated times and subjected to analysis by western blot. One representative (left panel) out of 4 individual experiments analyzed by densitometry (right panel) is shown. Data are presented as mean ± SD. *, P = 0.02, unpaired t-test.(G) Fibroblasts were incubated with 50µg/ml cycloheximide (CHX) or DMSO and stimulated with TNF as indicated. Viability was measured after 24 hours. Data are presented as mean ± SD of 5 individual experiments performed in three technical replicates; ***, P = 0.0008, mixed-effects analysis with Tukey's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ".", "Representative", "images", "of", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "-", "(", "A", ")", "and", "PAS", "-", "(", "B", ")", "stained", "colon", "sections", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "100μm", ".", "C", ",", "D", ".", "Representative", "images", "of", "colon", "crypts", "as", "assessed", "by", "Ki", "-", "67", "(", "C", ")", "and", "pH3", "(", "D", ")", "staining", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "E", ".", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "proliferation", "and", "ISC", "markers", "in", "isolated", "crypts", "from", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "based", "on", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "F", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "isolated", "colon", "crypts", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", ".", "HSC70", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "Numbers", "below", "panels", "represent", "normalized", "expression", "of", "proteins", ".", "G", ".", "IHC", "for", "expression", "of", "active", "β", "-", "catenin", "in", "colon", "or", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B. Representative images of H&amp;amp;E- (A) and PAS- (B) stained colon sections from wild-type and Angptl2-/- mice. Scale bar = 100μm.C, D. Representative images of colon crypts as assessed by Ki-67 (C) and pH3 (D) staining. Scale bar = 100 μm.E. mRNA levels of indicated proliferation and ISC markers in isolated crypts from wild-type (n=4) and Angptl2-/- (n=4) mice based on qRT-PCR analysis.F. Western blotting analysis of isolated colon crypts from wild-type and Angptl2-/- mice. HSC70 served as an internal control. Numbers below panels represent normalized expression of proteins.G. IHC for expression of active β-catenin in colon or wild-type and Angptl2-/- mice. Scale bar = 50 μm."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Survival", "rates", "of", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "33", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "33", ")", "mice", "supplied", "with", "drinking", "water", "containing", "2", ".", "5", "%", "DSS", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", ",", "from", "two", "different", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "by", "log", "-", "rank", "test", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "colons", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "at", "days", "12", ")", ".", "C", ".", "Colon", "length", "of", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "at", "days", "12", ")", ".", "D", ",", "E", ",", "F", ".", "Representative", "images", "of", "colon", "crypts", "as", "assessed", "by", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "(", "D", ")", ",", "Ki", "-", "67", "(", "E", ")", ",", "and", "pH3", "(", "F", ")", "staining", "in", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "at", "days", "12", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "G", ",", "H", ".", "The", "number", "of", "regenerating", "crypts", "as", "quantified", "using", "Ki", "-", "67", "(", "G", ")", "and", "pH3", "(", "H", ")", "staining", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "number", "of", "Ki", "-", "67", "-", "positive", "viable", "crypts", "or", "the", "number", "of", "pH3", "-", "positive", "cells", "in", "a", "single", "field", "of", "view", ".", "Multiple", "areas", "in", "at", "least", "6", "mice", "per", "genotype", "were", "quantified", ".", "Numbers", "below", "panels", "represent", "the", "average", ".", "I", ".", "IHC", "for", "expression", "of", "active", "β", "-", "catenin", "in", "colon", "or", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "at", "days", "12", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "J", ".", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "genes", "in", "isolated", "crypts", "from", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "at", "days", "12", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Survival rates of wild-type (n=33) and Angptl2-/- (n=33) mice supplied with drinking water containing 2.5 % DSS for 6 days and then untreated water for 6 more days, from two different experiments. ***p < 0.001, by log-rank test.B. Representative images of colons from wild-type and Angptl2-/- mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (at days 12).C. Colon length of wild-type (n=7) and Angptl2-/- (n=6) mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (at days 12).D, E, F. Representative images of colon crypts as assessed by H&amp;amp;E (D), Ki-67 (E), and pH3 (F) staining in wild-type and Angptl2-/- mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (at days 12). Scale bar = 100 μm.G, H. The number of regenerating crypts as quantified using Ki-67 (G) and pH3 (H) staining. Each data point represents the number of Ki-67-positive viable crypts or the number of pH3-positive cells in a single field of view. Multiple areas in at least 6 mice per genotype were quantified. Numbers below panels represent the average.I. IHC for expression of active β-catenin in colon or wild-type and Angptl2-/- mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (at days 12). Scale bar = 50 μm.J. mRNA levels of indicated genes in isolated crypts from wild-type (n=4) and Angptl2-/-(n=4) mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (at days 12)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Weight", "loss", "of", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "in", "days", "following", "12", "Gy", "irradiation", ".", "B", ".", "Small", "intestine", "and", "colon", "length", "from", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "5", "days", "after", "12", "Gy", "irradiation", ".", "C", ",", "D", ".", "Representative", "images", "of", "crypts", "of", "small", "intestine", "as", "assessed", "by", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "(", "C", ")", "and", "Ki", "-", "67", "(", "D", ")", "staining", "in", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "5", "days", "after", "12", "Gy", "irradiation", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "E", ".", "The", "number", "of", "regenerating", "crypts", "in", "small", "intestine", "as", "quantified", "by", "Ki", "-", "67", "(", "D", ")", "staining", "at", "days", "3", "and", "5", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "number", "of", "Ki", "-", "67", "-", "positive", "viable", "crypts", "in", "a", "single", "field", "of", "view", ".", "Multiple", "areas", "in", "at", "least", "3", "mice", "per", "genotype", "were", "quantified", ".", "Numbers", "below", "panels", "represent", "average", ".", "F", ",", "G", ".", "Representative", "images", "of", "colon", "crypts", "as", "assessed", "by", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "(", "F", ")", "or", "Ki", "-", "67", "(", "G", ")", "staining", "in", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "5", "days", "after", "12", "Gy", "irradiation", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "H", ".", "The", "number", "of", "regenerating", "colon", "crypts", "as", "quantified", "by", "using", "Ki", "-", "67", "(", "G", ")", "staining", "at", "days", "3", "and", "5", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "number", "of", "Ki", "-", "67", "-", "positive", "viable", "crypts", "in", "a", "single", "field", "of", "view", ".", "Multiple", "areas", "in", "at", "least", "3", "mice", "per", "genotype", "were", "quantified", ".", "Numbers", "below", "panels", "represent", "average", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Weight loss of wild-type (n=4) and Angptl2-/- (n=5) mice in days following 12 Gy irradiation.B. Small intestine and colon length from wild-type (n=4) and Angptl2-/- (n=5) mice 5 days after 12 Gy irradiation.C, D. Representative images of crypts of small intestine as assessed by H&amp;amp;E (C) and Ki-67 (D) staining in wild-type and Angptl2-/- mice 5 days after 12 Gy irradiation. Scale bar = 100 μm.E. The number of regenerating crypts in small intestine as quantified by Ki-67 (D) staining at days 3 and 5. Each data point represents the number of Ki-67-positive viable crypts in a single field of view. Multiple areas in at least 3 mice per genotype were quantified. Numbers below panels represent average.F, G. Representative images of colon crypts as assessed by H&amp;amp;E (F) or Ki-67 (G) staining in wild-type and Angptl2-/- mice 5 days after 12 Gy irradiation. Scale bar = 100 μm.H. The number of regenerating colon crypts as quantified by using Ki-67 (G) staining at days 3 and 5. Each data point represents the number of Ki-67-positive viable crypts in a single field of view. Multiple areas in at least 3 mice per genotype were quantified. Numbers below panels represent average."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Angptl2", "mRNA", "levels", "in", "small", "intestine", "(", "proximal", ",", "mid", "and", "distal", ")", ",", "cecum", "and", "colon", "(", "proximal", "and", "distal", ")", "of", "wild", "-", "type", "mice", "based", "on", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "n", "=", "5", ".", "B", ".", "ANGPTL2", "IHC", "in", "colon", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", ".", "The", "Angptl2", "-", "/", "-", "colon", "image", "serves", "as", "a", "negative", "control", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "C", ".", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "genes", "in", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "based", "on", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "D", ".", "Representative", "IF", "images", "of", "distal", "colon", "from", "wild", "-", "type", "mice", "as", "assessed", "with", "anti", "-", "ANGPTL2", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "α", "-", "SMA", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Angptl2 mRNA levels in small intestine (proximal, mid and distal), cecum and colon (proximal and distal) of wild-type mice based on qRT-PCR analysis. n=5.B. ANGPTL2 IHC in colon from wild-type and Angptl2-/- mice. The Angptl2-/- colon image serves as a negative control. Scale bar = 50 μm.C. mRNA levels of indicated genes in wild-type (n=4) mice based on qRT-PCR analysis.D. Representative IF images of distal colon from wild-type mice as assessed with anti-ANGPTL2 (red) and anti-α-SMA (green). Nuclei are counterstained with DAPI (blue). Scale bar = 100 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", ",", "C", ".", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "genes", "in", "ISEMFs", "from", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", "based", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "D", ".", "Representative", "staining", "for", "P", "-", "Smad1", "/", "5", "in", "crypts", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "DSS", ")", "or", "untreated", "water", "for", "12", "days", "(", "Untreated", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "half", "of", "the", "crypt", "and", "arrowheads", "show", "P", "-", "Smad1", "/", "5", "-", "positive", "cells", "in", "lower", "halves", "of", "crypts", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "E", ".", "The", "number", "of", "P", "-", "Smad1", "/", "5", "-", "positive", "cells", "in", "the", "crypt", "base", "(", "n", "=", "60", ")", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", "following", "DSS", "treatment", "for", "6", "days", "and", "then", "untreated", "water", "for", "6", "more", "days", "(", "DSS", ")", "or", "untreated", "water", "for", "12", "days", "(", "Untreated", ")", ".", "Multiple", "areas", "in", "3", "mice", "per", "genotype", "were", "quantified", ".", "F", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "isolated", "colon", "crypts", "from", "wild", "-", "type", "and", "Angptl2", "-", "/", "-", "mice", ".", "HSC70", "serves", "as", "an", "internal", "control", ".", "Numbers", "below", "panels", "represent", "normalized", "protein", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B, C. mRNA levels of indicated genes in ISEMFs from wild-type (n=4) and Angptl2-/- (n=3) mice based qRT-PCR analysis.D. Representative staining for P-Smad1/5 in crypts from wild-type and Angptl2-/- mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (DSS) or untreated water for 12 days (Untreated). Dashed lines indicate half of the crypt and arrowheads show P-Smad1/5-positive cells in lower halves of crypts. Scale bar = 50 μm.E. The number of P-Smad1/5-positive cells in the crypt base (n=60) from wild-type and Angptl2-/- mice following DSS treatment for 6 days and then untreated water for 6 more days (DSS) or untreated water for 12 days (Untreated). Multiple areas in 3 mice per genotype were quantified.F. Western blotting analysis of isolated colon crypts from wild-type and Angptl2-/- mice. HSC70 serves as an internal control. Numbers below panels represent normalized protein expression."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "mRNA", "levels", "of", "indicated", "genes", "in", "colon", "and", "cultured", "ISEMFs", "from", "wild", "-", "type", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "based", "on", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "Inta5", ",", "Integrin", "α5", ";", "Intb1", ",", "Integrin", "β1", ".", "B", ".", "Representative", "IHC", "of", "integrin", "α5", "and", "β1", "in", "colon", "from", "wild", "-", "type", "mouse", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "C", ",", "D", ".", "mRNA", "levels", "of", "Bmp2", "and", "Bmp7", "in", "ISEMFs", "from", "wild", "-", "type", "mice", "24", "h", "after", "treatment", "with", "integrinα5β1", "antibody", "or", "various", "signaling", "pathway", "inhibitors", ".", "n", "=", "3", ".", "U0126", ",", "ERK", "inhibitor", ";", "LY294002", ",", "PI3K", "inhibitor", ";", "BAY11", "-", "7085", ",", "NF", "-", "κB", "inhibitor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. mRNA levels of indicated genes in colon and cultured ISEMFs from wild-type mice (n=4) based on qRT-PCR analysis. Inta5, Integrin α5; Intb1, Integrin β1.B. Representative IHC of integrin α5 and β1 in colon from wild-type mouse. Scale bar = 50 μm.C, D. mRNA levels of Bmp2 and Bmp7 in ISEMFs from wild-type mice 24 h after treatment with integrinα5β1 antibody or various signaling pathway inhibitors. n=3. U0126, ERK inhibitor; LY294002, PI3K inhibitor; BAY11-7085, NF-κB inhibitor."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Colon", "organoid", "cultures", "treated", "with", "vehicle", "or", "rANGPTL2", "protein", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "μm", ".", "B", ".", "Organoid", "growth", "efficiency", "and", "size", "following", "treatment", "with", "vehicle", "or", "rANGPTL2", ".", "rA2", ",", "recombinant", "ANGPTL2", ".", "n", "=", "4", ".", "Data", "from", "vehicle", "/", "Wnt", "(", "+", ")", "was", "set", "at", "1", ".", "D", ".", "Colon", "organoid", "cultures", "in", "presence", "of", "ISEMFs", "with", "or", "without", "Noggin", "(", "Nog", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μmE", ".", "Organoid", "growth", "efficiency", "and", "size", "in", "presence", "of", "ISEMFs", "with", "or", "without", "Noggin", "(", "Nog", ")", ".", "n", "=", "4", ".", "Data", "from", "Wild", "-", "type", "organoids", "/", "Wild", "-", "type", "ISEMFs", "/", "Nog", "(", "+", ")", "was", "set", "at", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Colon organoid cultures treated with vehicle or rANGPTL2 protein. Scale bar = 200 μm.B. Organoid growth efficiency and size following treatment with vehicle or rANGPTL2. rA2, recombinant ANGPTL2. n=4. Data from vehicle/Wnt (+) was set at 1.D. Colon organoid cultures in presence of ISEMFs with or without Noggin (Nog). Scale bar = 50 μmE. Organoid growth efficiency and size in presence of ISEMFs with or without Noggin (Nog). n=4. Data from Wild-type organoids/Wild-type ISEMFs/Nog (+) was set at 1."}
{"words": ["Figure", "1THP", "-", "1", "cells", "were", "stimulated", "with", "(", "50", "000", "particles", "/", "cell", ")", "AdV", "-", "GFP", "and", "infection", "after", "24", "h", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Cells", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "AdV", "-", "GFP", "or", "AdV", "-", "GFP", "complexed", "with", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "20", "mg", "/", "ml", "human", "IVIg", ".", "Cell", "supernatants", "were", "harvested", "at", "indicated", "time", "-", "points", "and", "cytokines", "measured", "by", "ELISA", "(", "B", ")", "Cells", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "AdV", "-", "GFP", "or", "AdV", "-", "GFP", "complexed", "with", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "20", "mg", "/", "ml", "human", "IVIg", ".", "pro", "-", "and", "cleaved", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "in", "whole", "cell", "lysates", "or", "in", "supernatants", "by", "western", "blot", "(", "C", ")", ".", "HMDM", "were", "primed", "with", "10", "μg", "/", "ml", "pI", ":", "C", "for", "2h", ",", "then", "stimulated", "for", "16h", "with", "virus", "+", "/", "-", "antibody", ".", "Cytokines", "in", "the", "supernatants", "were", "measured", "by", "ELISA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1THP-1 cells were stimulated with (50 000 particles/cell) AdV-GFP and infection after 24 h measured by flow cytometry.Cells were stimulated as in (A) with AdV-GFP or AdV-GFP complexed with 20 μg/ml h9C12 or 20 mg/ml human IVIg. Cell supernatants were harvested at indicated time-points and cytokines measured by ELISA (B)Cells were stimulated as in (A) with AdV-GFP or AdV-GFP complexed with 20 μg/ml h9C12 or 20 mg/ml human IVIg. pro- and cleaved IL-1β was measured in whole cell lysates or in supernatants by western blot (C).HMDM were primed with 10 μg/ml pI:C for 2h, then stimulated for 16h with virus +/- antibody. Cytokines in the supernatants were measured by ELISA."}
{"words": ["Figure", "2AdV", "-", "GFP", "was", "incubated", "with", "20", "ug", "/", "ml", "h9C12", "antibody", "or", "20", "mg", "/", "ml", "IVIg", "in", "PBS", ".", "These", "AdV", "-", "Ab", "complexes", "were", "then", "diluted", "1", ":", "2", "to", "give", "final", "doses", "of", "viral", "particles", "being", "added", "to", "WT", "THP", "-", "1", "cells", "(", "with", "antibody", "complexed", ")", "as", "indicated", ".", "A", "single", "experiment", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "THP", "-", "1s", "were", "stimulated", "with", "a", "constant", "dose", "of", "AdV", "-", "GFP", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", ",", "and", "complexed", "with", "decreasing", "antibody", "concentrations", "as", "indicated", ".", "A", "single", "experiment", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "directly", "(", "TNF", ")", "or", "primed", "(", "IL", "-", "1β", ",", "LDH", ")", "with", "AdV", "-", "Ab", "complexes", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "for", "each", "individual", "donor", "(", "2", "total", ")", "is", "shown", ".", "THP", "-", "1", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "complexed", "with", "h9C12", "(", "20", "ug", "/", "ml", ")", "or", "IVIg", "(", "20", "or", "0", ".", "8", "mg", "/", "ml", ")", "for", "16h", "and", "cell", "death", "was", "measured", "by", "LDH", "releaseTHP", "-", "1", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "complexed", "with", "h9C12", "(", "20", "ug", "/", "ml", ")", "or", "IVIg", "(", "20", "or", "0", ".", "8", "mg", "/", "ml", ")", "for", "16h", "and", "cell", "viability", "measured", "by", "PrestoBlue", "assayHMDM", "were", "primed", ",", "or", "not", ",", "and", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "complexed", "with", "h9C12", "(", "20", "ug", "/", "ml", ")", "or", "IVIg", "(", "20", "or", "0", ".", "8", "mg", "/", "ml", ")", "for", "16h", "and", "cell", "death", "was", "measured", "by", "LDH", "releaseHMDM", "were", "primed", ",", "or", "not", ",", "and", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "complexed", "with", "h9C12", "(", "20", "ug", "/", "ml", ")", "or", "IVIg", "(", "20", "or", "0", ".", "8", "mg", "/", "ml", ")", "for", "16h", "and", "cell", "viability", "measured", "by", "PrestoBlue"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2AdV-GFP was incubated with 20 ug/ml h9C12 antibody or 20 mg/ml IVIg in PBS. These AdV-Ab complexes were then diluted 1:2 to give final doses of viral particles being added to WT THP-1 cells (with antibody complexed) as indicated. A single experiment representative of 3 independent experiments is shown.THP-1s were stimulated with a constant dose of AdV-GFP (50 000 pp/cell), and complexed with decreasing antibody concentrations as indicated. A single experiment representative of 2 independent experiments is shown.HMDM were stimulated directly (TNF) or primed (IL-1β, LDH) with AdV-Ab complexes as in (B). Data for each individual donor (2 total) is shown.THP-1 were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) complexed with h9C12 (20 ug/ml) or IVIg (20 or 0.8 mg/ml) for 16h and cell death was measured by LDH releaseTHP-1 were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) complexed with h9C12 (20 ug/ml) or IVIg (20 or 0.8 mg/ml) for 16h and cell viability measured by PrestoBlue assayHMDM were primed, or not, and stimulated with AdV (50 000 pp/cell) complexed with h9C12 (20 ug/ml) or IVIg (20 or 0.8 mg/ml) for 16h and cell death was measured by LDH releaseHMDM were primed, or not, and stimulated with AdV (50 000 pp/cell) complexed with h9C12 (20 ug/ml) or IVIg (20 or 0.8 mg/ml) for 16h and cell viability measured by PrestoBlue assay"}
{"words": ["Figure", "3HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "complexed", "with", "antibody", "at", "indicated", "doses", "for", "2h", "and", "viral", "genomes", "were", "measured", "by", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", "AdV", "-", "mCherry", "was", "added", "to", "AdV", "-", "GFP", "at", "a", "ratio", "of", "1", ":", "200", "and", "50", "000", "pp", "/", "cell", "of", "this", "mix", "was", "complexed", "with", "h9C12", "and", "IVIg", "and", "indicated", "doses", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "with", "these", "complexes", "for", "16h", "and", "infection", "measured", "as", "mCherry", "fluorescence", "by", "flow", "cytometry", ".", "In", "virus", "alone", "the", "percentage", "of", "mCherry", "positive", "cells", "was", "~", "20", "%", ",", "the", "relative", "infection", "with", "antibodies", "was", "normalised", "to", "virus", "alone", "as", "100", "%", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "for", "3", "h", "with", "AdV", "-", "Ab", "complexes", "as", "in", "(", "A", ",", "B", ")", "or", "with", "LeuLeu", "at", "10μM", ",", "and", "lysosomal", "damage", "measured", "by", "loss", "of", "acridine", "orange", "red", "fluorescence", "using", "flow", "cytometry", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "C", ")", "and", "cell", "death", "was", "assessed", "by", "an", "increase", "in", "e780", "fluorescence", ".", "The", "mean", "of", "3", "independent", "donors", "is", "shown", ".", "(", "E", ")", "The", "MFI", "of", "the", "AO", "-", "red", "channel", "(", "685nM", ")", "for", "the", "populations", "determined", "as", "e780", "positive", "(", "dying", ")", "or", "e780", "negative", "(", "live", ")", "for", "the", "condition", "of", "AdV", "+", "IVIg", "20", "was", "measured", "and", "plotted", "as", "mean", "+", "SEM", "of", "the", "three", "donors", "shown", "in", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3HMDM were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) complexed with antibody at indicated doses for 2h and viral genomes were measured by qPCR. (n = 4, mean ± s.e.m)AdV-mCherry was added to AdV-GFP at a ratio of 1:200 and 50 000 pp/cell of this mix was complexed with h9C12 and IVIg and indicated doses. HMDM were stimulated with these complexes for 16h and infection measured as mCherry fluorescence by flow cytometry. In virus alone the percentage of mCherry positive cells was ~ 20%, the relative infection with antibodies was normalised to virus alone as 100%.HMDM were stimulated for 3 h with AdV-Ab complexes as in (A,B) or with LeuLeu at 10μM, and lysosomal damage measured by loss of acridine orange red fluorescence using flow cytometry.HMDM were stimulated as in (C) and cell death was assessed by an increase in e780 fluorescence. The mean of 3 independent donors is shown.(E)The MFI of the AO- red channel (685nM) for the populations determined as e780 positive (dying) or e780 negative (live) for the condition of AdV + IVIg 20 was measured and plotted as mean + SEM of the three donors shown in (D)."}
{"words": ["Figure", "4Primed", "or", "(", "C", ")", "un", "-", "primed", "HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "+", "/", "-", "h9C12", "(", "20", "μg", "/", "ml", ")", "for", "16h", ".", "Ctrl", "or", "Trim21", "-", "deficient", "THP", "-", "1s", "were", "stimulated", "for", "4", "h", "with", "1000", "U", "/", "ml", "IFNα", "and", "TRIM21", "expression", "measured", "by", "immunoblot", ".", "WT", "or", "TRIM21", "-", "deficient", "THP", "-", "1s", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "20", "mg", "/", "ml", "IVIg", "or", "with", "200", "ng", "/", "well", "HT", "-", "DNA", "or", "10", "μM", "Nigericin", "for", "16h", ",", "and", "IL", "-", "1β", "measured", "in", "the", "supernatant", "by", "ELISA", ".", "WT", "or", "TRIM21", "-", "deficient", "THP", "-", "1s", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "20", "mg", "/", "ml", "IVIg", "or", "with", "200", "ng", "/", "well", "HT", "-", "DNA", "or", "10", "μM", "Nigericin", "for", "16h", ",", "and", "TNF", "measured", "in", "the", "supernatant", "by", "ELISA", ".", "WT", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2", ".", "5ug", "WT", "or", "H433A", "h9C12", "antibody", ",", "then", "the", "next", "day", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2", ".", "5", "x", "1011", "pp", "AdV", "-", "GFP", ".", "4h", "later", "spleens", "were", "harvested", "and", "neutrophil", "influx", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "-", "GFP", "(", "250", "pp", "/", "cell", ")", "in", "the", "presence", "of", "h9C12", "antibodies", "at", "indicated", "doses", ".", "Infection", "was", "measured", "after", "24h", "by", "flow", "cytometry", ".", "Infection", "relative", "to", "AdV", "alone", "is", "shown", "graphed", "on", "the", "left", "(", "n", "=", "4", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "Representative", "plots", "and", "a", "comparison", "of", "the", "different", "h9C12", "mutants", "at", "0", ".", "2", "ug", "/", "ml", "are", "also", "shown", "in", "the", "graph", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Primed or (C) un- primed HMDM were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) +/- h9C12 (20 μg/ml) for 16h.Ctrl or Trim21- deficient THP-1s were stimulated for 4 h with 1000 U/ml IFNα and TRIM21 expression measured by immunoblot.WT or TRIM21- deficient THP-1s were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) and 20 μg/ml h9C12 or 20 mg/ml IVIg or with 200 ng/well HT-DNA or 10 μM Nigericin for 16h, and IL-1β measured in the supernatant by ELISA.WT or TRIM21- deficient THP-1s were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) and 20 μg/ml h9C12 or 20 mg/ml IVIg or with 200 ng/well HT-DNA or 10 μM Nigericin for 16h, and TNF measured in the supernatant by ELISA.WT mice were injected i.v. with 2.5ug WT or H433A h9C12 antibody, then the next day injected i.v. with 2.5 x 1011 pp AdV-GFP. 4h later spleens were harvested and neutrophil influx measured by flow cytometry.HMDM were stimulated with AdV-GFP (250 pp/cell) in the presence of h9C12 antibodies at indicated doses. Infection was measured after 24h by flow cytometry. Infection relative to AdV alone is shown graphed on the left (n = 4 mean ± s.e.m). Representative plots and a comparison of the different h9C12 mutants at 0.2 ug/ml are also shown in the graph on the right(n = 4,mean ± s.e.m.)."}
{"words": ["Figure", "5HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "antibody", "(", "h9C12", ";", "20", "ug", "/", "ml", ",", "IVIg", ":", "20", "mg", "/", "ml", ")", "or", "10", "μg", "/", "ml", "pI", ":", "C", "for", "3h", "and", "gene", "expression", "was", "measured", "by", "qPCR", "(", "n", "=", "4", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "or", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "for", "6", "h", "and", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "the", "cytosol", "measured", "by", "western", "blot", ".", "Blot", "is", "representative", "of", "three", "independent", "donors", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "or", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "for", "3", "h", "and", "NLRP3", "mRNA", "expression", "measured", "by", "qPCR", ".", "Data", "shows", "average", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "2", "independent", "donorsHMDM", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "NLRP3", "levels", "in", "the", "cytosol", "measured", "by", "western", "blot", ".", "Blot", "is", "representative", "of", "two", "independent", "donors", ".", "TLR9", "mRNA", "levels", "from", "PBMCs", ",", "CD19", "+", "ve", "B", "cells", ",", "CD14", "+", "ve", "monocytes", "or", "HMDM", "derived", "from", "CD14", "+", "ve", "monocytes", "were", "assessed", "by", "qPCR", "and", "copy", "number", "was", "determined", "relative", "to", "actin", "copy", "number", "(", "n", "=", "5", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "THP", "-", "1s", "expressing", "ASC", "-", "GFP", "were", "stimulated", "for", "6", "h", "with", "virus", "and", "antibody", "or", "200", "ng", "/", "well", "HT", "-", "DNA", "or", "10", "μM", "Nigericin", ",", "in", "the", "presence", "of", "the", "pan", "-", "caspase", "inhibitor", "zVAD", "-", "fmk", ".", "A", "representative", "image", "(", "scale", "bar", "100", "μm", ")", "and", "quantification", "of", "number", "of", "cells", "with", "ASC", "specks", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ",", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5HMDM were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) and antibody (h9C12; 20 ug/ml, IVIg: 20 mg/ml) or 10 μg/ml pI:C for 3h and gene expression was measured by qPCR (n = 4 mean ± s.e.m).HMDM were stimulated as in (A), or with 10 ng/ml LPS for 6 h and pro-IL-1β levels in the cytosol measured by western blot. Blot is representative of three independent donors.HMDM were stimulated as in (A), or with 10 ng/ml LPS for 3 h and NLRP3 mRNA expression measured by qPCR. Data shows average ± s.d. of 2 independent donorsHMDM were stimulated as in (B) and NLRP3 levels in the cytosol measured by western blot. Blot is representative of two independent donors.TLR9 mRNA levels from PBMCs, CD19+ve B cells, CD14+ve monocytes or HMDM derived from CD14+ve monocytes were assessed by qPCR and copy number was determined relative to actin copy number (n = 5 mean ± s.e.m).THP-1s expressing ASC-GFP were stimulated for 6 h with virus and antibody or 200 ng/well HT-DNA or 10 μM Nigericin, in the presence of the pan-caspase inhibitor zVAD-fmk. A representative image (scale bar 100 μm) and quantification of number of cells with ASC specks from three independent experiments (mean ± s.e.m, *P-value ≤ 0.05, paired, two-tailed t-test) is shown."}
{"words": ["Figure", "6Primed", "HMDM", "were", "treated", "with", "MCC950", "(", "1", "μM", ")", "for", "30", "mins", "before", "stimulation", "overnight", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "h9C12", "(", "20", "μg", "/", "ml", ")", "or", "IVIg", "(", "20", "mg", "/", "ml", ")", "or", "10", "μM", "Nigericin", ".", "IL", "-", "1β", "(", "A", ")", "or", "TNF", "(", "B", ")", "or", "LDH", "release", "(", "C", ")", "were", "measured", "in", "cell", "supernatants", ".", "Data", "shows", "average", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "two", "independent", "donors", "and", "is", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "WT", ",", "NLRP3", ",", "ASC", "or", "Caspase", "-", "1", "-", "deficient", "THP", "-", "1s", "were", "stimulated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "IL", "-", "1β", "in", "the", "supernatant", "measured", "by", "ELISA", ".", "Data", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "HMDM", "were", "primed", "with", "10", "ug", "/", "ml", "pI", ":", "C", "for", "2h", ",", "treated", "with", "100", "μM", "VX", "-", "765", "for", "30", "mins", "before", "stimulation", "for", "16", "h", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "IL", "-", "1β", "or", "LDH", "release", "was", "measured", "in", "cell", "supernatants", ".", "Data", "shows", "average", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "two", "independent", "donorsPrimed", "HMDM", "were", "treated", "with", "KCl", "as", "indicated", "for", "1h", ",", "before", "being", "stimulated", "for", "a", "further", "6h", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "IL", "-", "1β", "and", "TNF", "were", "measured", "in", "cell", "supernatants", "by", "ELISA", ".", "Data", "is", "representative", "of", "three", "independent", "donors", ".", "Primed", "HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "and", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "10", "μM", "Nigericin", "for", "3h", ",", "and", "then", "immunostained", "for", "ASC", "or", "intracellular", "antibody", ".", "Co", "-", "localisation", "was", "assessed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Data", "is", "representative", "of", "two", "independent", "donors", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Primed HMDM were treated with MCC950 (1 μM) for 30 mins before stimulation overnight with AdV (50 000 pp/cell) and h9C12 (20 μg/ml) or IVIg (20 mg/ml) or 10 μM Nigericin. IL-1β (A) or TNF (B) or LDH release (C) were measured in cell supernatants. Data shows average ± s.d. of two independent donors and is representative of three independent experiments.WT, NLRP3, ASC or Caspase-1 - deficient THP-1s were stimulated as in (A) and IL-1β in the supernatant measured by ELISA. Data is representative of two independent experiments.HMDM were primed with 10 ug/ml pI:C for 2h, treated with 100 μM VX-765 for 30 mins before stimulation for 16 h as in (A). IL-1β or LDH release was measured in cell supernatants. Data shows average ± s.d. of two independent donorsPrimed HMDM were treated with KCl as indicated for 1h, before being stimulated for a further 6h as in (A). IL-1β and TNF were measured in cell supernatants by ELISA. Data is representative of three independent donors.Primed HMDM were stimulated with AdV and 20 μg/ml h9C12 or 10 μM Nigericin for 3h, and then immunostained for ASC or intracellular antibody. Co-localisation was assessed by confocal microscopy. Data is representative of two independent donors."}
{"words": ["Figure", "7AIM2", "mRNA", "levels", "from", "PBMCs", ",", "CD19", "+", "ve", "B", "cells", ",", "CD14", "+", "ve", "Monocytes", "or", "HMDM", "derived", "from", "CD14", "+", "ve", "monocytes", ".", "were", "assessed", "by", "qPCR", "and", "copy", "number", "was", "determined", "relative", "to", "Actin", "copy", "number", "(", "n", "=", "5", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "HMDM", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "for", "1h", ",", "washed", "2x", "with", "SFM", ",", "then", "whole", "cell", "lysates", "harvested", "after", "a", "further", "5h", ".", "Viral", "hexon", "and", "transgene", "(", "GFP", ")", "expression", "in", "the", "cytosol", "was", "assessed", "by", "western", "blot", ".", "Data", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "THP", "-", "1s", "expressing", "either", "a", "control", "guide", "RNA", "or", "targeting", "cGAS", "and", "STING", "were", "generated", "and", "stimulated", "with", "1000", "U", "/", "ml", "IFNα", "for", "4", "h", "and", "protein", "levels", "assessed", "by", "western", "blot", ".", "THP", "-", "1s", "deficient", "in", "cGAS", "and", "STING", "were", "stimulated", "with", "AdV", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "and", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", ",", "200", "ng", "/", "well", "HT", "-", "DNA", ",", "10", "μM", "Nigericin", "or", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "for", "16", "h", ".", "Data", "shows", "combined", "data", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", "of", "3", "experiments", "with", "absolute", "protein", "values", "(", "upper", "panel", ")", "or", "as", "%", "cytokine", "output", "of", "KO", "cells", "relative", "to", "Ctrl", "treated", "cells", "(", "lower", "panel", ")", ",", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "WT", "THP", "-", "1s", "were", "treated", "with", "5", "μM", "H151", "for", "30", "mins", "before", "stimulation", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "in", "upper", "panel", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "in", "lower", "panel", "shows", "combined", "data", "of", "these", "3", "experiments", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", "showing", "H151", "treated", "cells", "relative", "to", "media", "treated", "cells", "(", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "ASC", "-", "GFP", "THP", "-", "1s", "were", "treated", "with", "5", "μM", "H151", "for", "30", "mins", "before", "stimulation", "with", "AdV", "-", "mCherry", "(", "50", "000", "pp", "/", "cell", ")", "+", "20", "μg", "/", "ml", "h9C12", "or", "20", "mg", "/", "ml", "IVIg", "or", "200", "ng", "/", "well", "HT", "-", "DNA", "for", "8h", ".", "A", "representative", "image", "(", "scale", "bar", "50", "μm", ")", "and", "quantification", "of", "number", "of", "cells", "with", "ASC", "specks", "from", "one", "representative", "experiment", "of", "three", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7AIM2 mRNA levels from PBMCs, CD19+ve B cells, CD14+ve Monocytes or HMDM derived from CD14+ve monocytes. were assessed by qPCR and copy number was determined relative to Actin copy number (n = 5 mean ± s.e.m).HMDM were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) and 20 μg/ml h9C12 for 1h, washed 2x with SFM, then whole cell lysates harvested after a further 5h. Viral hexon and transgene (GFP) expression in the cytosol was assessed by western blot. Data is representative of two independent experiments.THP-1s expressing either a control guide RNA or targeting cGAS and STING were generated and stimulated with 1000 U/ml IFNα for 4 h and protein levels assessed by western blot.THP-1s deficient in cGAS and STING were stimulated with AdV (50 000 pp/cell) and 20 μg/ml h9C12, 200 ng/ well HT-DNA, 10 μM Nigericin or 10 ng/ml LPS for 16 h. Data shows combined data (mean ± s.e.m) of 3 experiments with absolute protein values (upper panel) or as % cytokine output of KO cells relative to Ctrl treated cells (lower panel), *P-value ≤ 0.05, ***P-value ≤ 0.001 unpaired, two-tailed t-test).WT THP-1s were treated with 5 μM H151 for 30 mins before stimulation as in (D). Data in upper panel is representative of 3 independent experiments. Data in lower panel shows combined data of these 3 experiments (mean ± s.e.m) showing H151 treated cells relative to media treated cells (*P-value ≤ 0.05, ***P-value ≤ 0.001 unpaired, two-tailed t-test).ASC-GFP THP-1s were treated with 5 μM H151 for 30 mins before stimulation with AdV-mCherry (50 000 pp/cell) + 20 μg/ml h9C12 or 20 mg/ml IVIg or 200 ng/ well HT-DNA for 8h. A representative image (scale bar 50 μm) and quantification of number of cells with ASC specks from one representative experiment of three is shown."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", "Five", "-", "day", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "A", ")", "body", "weight", "and", "(", "B", ",", "C", ")", "body", "composition", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C Five-day treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (A) body weight and (B, C) body composition. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "G", "Five", "-", "day", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "A", ",", "B", ")", "energy", "expenditure", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "G", "Five", "-", "day", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "C", ")", "respiratory", "exchange", "ratio", "(", "RER", ")", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "G", "Five", "-", "day", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "D", ")", "locomotor", "activity", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "G", "Five", "-", "day", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "E", ")", "cumulative", "food", "intake", ",", "(", "F", ")", "meal", "number", "and", "(", "G", ")", "meal", "size", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-G Five-day treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (A, B) energy expenditure. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-G Five-day treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (C) respiratory exchange ratio (RER). Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-G Five-day treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (D) locomotor activity. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-G Five-day treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (E) cumulative food intake, (F) meal number and (G) meal size. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Treatment", "-", "induced", "changes", "in", "hypothalamic", "gene", "expression", "in", "DIO", "mice", "treated", "for", "2", "(", "A", ")", "or", "5", "(", "B", ")", "days", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ",", "and", "the", "last", "injection", "was", "provided", "2", "h", "prior", "to", "tissues", "sampling", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "§", "P", "<", "0", ",", "001", ",", "comparison", "between", "treatment", "and", "vehicle", "control", ".", "#", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "comparison", "to", "liraglutide", ".", "+", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "comparison", "to", "RM", "-", "493", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B Treatment-induced changes in hypothalamic gene expression in DIO mice treated for 2 (A) or 5 (B) days with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Compounds were administered by daily subcutaneous injections, and the last injection was provided 2 h prior to tissues sampling. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, §P < 0,001, comparison between treatment and vehicle control. #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, comparison to liraglutide. +P < 0.05, comparison to RM-493."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "A", ")", "Fasted", "blood", "glucose", "levels", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "glucose", "tolerance", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "D", ")", "fasted", "insulin", "levels", ",", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "glucose", "-", "induced", "insulin", "secretion", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "G", ")", "HOMA", "-", "IR", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "H", ")", "insulin", "sensitivity", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "I", "Glucose", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "I", ")", "hepatic", "phosphorylation", "of", "AKT", "(", "p", "-", "AKTSer473", ")", "were", "analyzed", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "To", "assess", "insulin", "-", "stimulated", "p", "-", "AKTSer473", ",", "insulin", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "saline", "(", "n", "=", "3", ")", "was", "injected", "10", "min", "prior", "to", "liver", "sampling", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "in", "(", "A", "-", "H", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (A) Fasted blood glucose levels. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered).(B, C) glucose tolerance. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (D) fasted insulin levels,. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (E, F) glucose-induced insulin secretion. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (G) HOMA-IR. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (H) insulin sensitivity. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-I Glucose metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (I) hepatic phosphorylation of AKT (p-AKTSer473) were analyzed. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. To assess insulin-stimulated p-AKTSer473, insulin (n = 5) or saline (n = 3) was injected 10 min prior to liver sampling. Data represent means ± SEM;n = 8 in (A-H); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "Cholesterol", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "A", ")", "Plasma", "lipoprotein", "fractions", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "D", "Cholesterol", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "B", ")", "liver", "cholesterol", "levels", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "D", "Cholesterol", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "C", ")", "expression", "of", "genes", "implicated", "in", "hepatic", "cholesterol", "and", "lipoprotein", "uptake", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "D", "Cholesterol", "metabolic", "parameters", "were", "assessed", "following", "5", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "(", "D", ")", "expression", "of", "genes", "implicated", "in", "cholesterol", "and", "bile", "acid", "metabolism", "and", "excretion", "were", "analyzed", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D Cholesterol metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (A) Plasma lipoprotein fractions. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-D Cholesterol metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (B) liver cholesterol levels. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-D Cholesterol metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (C) expression of genes implicated in hepatic cholesterol and lipoprotein uptake. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-D Cholesterol metabolic parameters were assessed following 5 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). (D) expression of genes implicated in cholesterol and bile acid metabolism and excretion were analyzed. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "F", "22", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "A", ")", "body", "weight", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "F", "22", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "B", ")", "cumulative", "food", "intake", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "F", "22", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "C", ",", "D", ")", "body", "composition", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "A", "-", "F", "22", "days", "of", "treatment", "of", "DIO", "male", "mice", "with", "vehicle", "(", "white", ")", ",", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "(", "gray", ")", ",", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "black", ")", ",", "or", "liraglutide", "(", "10", "nmol", "/", "kg", ")", "and", "RM", "-", "493", "(", "3", ".", "6", "μmol", "/", "kg", ")", "(", "checkered", ")", ".", "Effects", "on", "(", "E", ",", "F", ")", "glucose", "tolerance", ".", "Compounds", "were", "administered", "by", "daily", "subcutaneous", "injections", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-F 22 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (A) body weight. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-F 22 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (B) cumulative food intake. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-F 22 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (C, D) body composition. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.A-F 22 days of treatment of DIO male mice with vehicle (white), liraglutide (10 nmol/kg) (gray), RM-493 (3.6 μmol/kg) (black), or liraglutide (10 nmol/kg) and RM-493 (3.6 μmol/kg) (checkered). Effects on (E, F) glucose tolerance. Compounds were administered by daily subcutaneous injections. Data represent means ± SEM;n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Bar", "chart", "showing", "the", "relative", "abundance", "(", "signal", "intensity", ")", "of", "the", "phosphorylated", "tau", "species", "identified", "using", "an", "exploratory", "IP", "-", "MS", "approach", "using", "HT7", "antibody", "on", "TBS", "-", "soluble", "control", "and", "Alzheimer", "'", "s", "disease", "(", "AD", ")", "pools", ".", "Blue", "dashed", "line", "indicates", "the", "two", "phosphorylated", "tau", "peptides", "that", "underwent", "targeted", "IP", "-", "MS", ":", "mono", "-", "phosphorylated", "p", "-", "tau231", "and", "double", "phosphorylated", "p", "-", "tau", "(", "231", "+", "235", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Bar chart showing the relative abundance (signal intensity) of the phosphorylated tau species identified using an exploratory IP-MS approach using HT7 antibody on TBS-soluble control and Alzheimer's disease (AD) pools. Blue dashed line indicates the two phosphorylated tau peptides that underwent targeted IP-MS: mono-phosphorylated p-tau231 and double phosphorylated p-tau(231+235)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Box", "-", "and", "-", "whiskers", "plot", "showing", "the", "levels", "of", "CSF", "p", "-", "tau235", "in", "neurological", "controls", "(", "n", "=", "21", ")", "and", "biologically", "defined", "Alzheimer", "'", "s", "disease", "(", "AD", ")", "cases", "(", "n", "=", "19", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Box-and-whiskers plot showing the levels of CSF p-tau235 in neurological controls (n=21) and biologically defined Alzheimer's disease (AD) cases (n=19)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Box", "-", "and", "-", "whiskers", "plot", "showing", "CSF", "p", "-", "tau235", "concentrations", "in", "the", "different", "groups", ":", "amyloid", "-", "negative", "cognitively", "unimpaired", "(", "CU", "-", ")", "participants", "(", "n", "=", "50", ")", ",", "participants", "across", "the", "Alzheimer", "'", "s", "disease", "(", "AD", ")", "continuum", "(", "amyloid", "-", "positive", "cognitively", "unimpaired", "(", "CU", "+", ",", "n", "=", "32", ")", ";", "amyloid", "-", "positive", "mild", "cognitive", "impairment", "(", "MCI", "+", ",", "n", "=", "20", ")", ";", "AD", "(", "n", "=", "20", ")", "and", "non", "-", "AD", "cases", "(", "n", "=", "19", ")", ".", "CSF", "p", "-", "tau235", "is", "highly", "specific", "for", "AD", "pathology", ".", "Cut", "-", "off", "value", "for", "CSF", "p", "-", "tau235", "positivity", "is", "displayed", "with", "black", "dashed", "line", "(", "19", ".", "92", "pg", "/", "mL", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Box-and-whiskers plot showing CSF p-tau235 concentrations in the different groups: amyloid-negative cognitively unimpaired (CU-) participants (n=50), participants across the Alzheimer's disease (AD) continuum (amyloid-positive cognitively unimpaired (CU+, n=32); amyloid-positive mild cognitive impairment (MCI+, n=20); AD (n=20) and non-AD cases (n=19). CSF p-tau235 is highly specific for AD pathology. Cut-off value for CSF p-tau235 positivity is displayed with black dashed line (19.92 pg/mL)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Box", "-", "and", "-", "whiskers", "plot", "showing", "CSF", "p", "-", "tau235", "concentrations", "in", "A", "-", "T", "-", "participants", "and", "across", "preclinical", "Alzheimer", "'", "s", "disease", "(", "AD", ",", "dichotomised", "as", "A", "+", "T", "-", "and", "A", "+", "T", "+", ")", ".", "CSF", "p", "-", "tau235", "was", "increased", "already", "in", "A", "+", "T", "-", ",", "which", "represents", "the", "early", "cases", "within", "preclinical", "AD", ".", "A", "prominent", "increase", "was", "observed", "from", "A", "+", "T", "-", "to", "A", "+", "T", "+", "cases", ",", "the", "latter", "representing", "late", "preclinical", "AD", "cases", ".", "Cut", "-", "off", "value", "for", "CSF", "p", "-", "tau235", "positivity", "is", "displayed", "with", "black", "dashed", "line", "(", "19", ".", "92", "pg", "/", "mL", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Box-and-whiskers plot showing CSF p-tau235 concentrations in A-T- participants and across preclinical Alzheimer's disease (AD, dichotomised as A+T- and A+T+). CSF p-tau235 was increased already in A+T-, which represents the early cases within preclinical AD. A prominent increase was observed from A+T- to A+T+ cases, the latter representing late preclinical AD cases. Cut-off value for CSF p-tau235 positivity is displayed with black dashed line (19.92 pg/mL)."}
{"words": ["Figure", "5Trajectories", "of", "the", "different", "tau", "biomarkers", "in", "preclinical", "AD", "using", "a", "local", "weighted", "regression", "method", "(", "Loess", "curve", ")", ".", "Changes", "on", "biomarkers", "levels", "in", "CSF", "are", "represented", "as", "z", "-", "scores", "using", "Aβ", "PET", "in", "centiloid", "scale", "(", "CL", ")", "as", "a", "proxy", "of", "disease", "progression", ".", "Abnormal", "biomarker", "levels", "were", "determined", "as", "two", "standard", "deviations", "(", "SD", ")", "above", "the", "mean", ".", "Incipient", "Aβ", "pathology", "positivity", "was", "determined", "as", "Aβ", "PET", "higher", "than", "CL", "12", "(", "Mila", "-", "Aloma", "et", "al", ".", ",", "2020", ")", ".", "All", "samples", "were", "run", "in", "singlicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Trajectories of the different tau biomarkers in preclinical AD using a local weighted regression method (Loess curve). Changes on biomarkers levels in CSF are represented as z-scores using Aβ PET in centiloid scale (CL) as a proxy of disease progression. Abnormal biomarker levels were determined as two standard deviations (SD) above the mean. Incipient Aβ pathology positivity was determined as Aβ PET higher than CL 12 (Mila-Aloma et al., 2020). All samples were run in singlicates."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Stacked", "bar", "chart", "depicting", "the", "percentages", "of", "[", "231", "+", "/", "235", "+", "]", ",", "[", "231", "+", "/", "235", "-", "]", ",", "[", "231", "-", "/", "235", "-", "]", "and", "[", "231", "-", "/", "235", "+", "]", "cases", "in", "each", "preclinical", "group", ".", "Table", "below", "indicates", "the", "exact", "percentages", "of", "participants", "in", "each", "group", "(", "exact", "number", "of", "participants", "in", "parenthesis", ")", ".", "Discordant", "cases", "with", "the", "sequential", "phosphorylation", "hypothesis", "[", "231", "-", "/", "+", "235", "]", "shown", "in", "grey", ".", "(", "B", ")", "Correlation", "between", "CSF", "p", "-", "tau235", "and", "p", "-", "tau231", "in", "the", "whole", "ALFA", "+", "cohort", "(", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", ":", "rS", "=", "0", ".", "80", ",", "P", "˂", "0", ".", "0001", ")", ".", "Assay", "cut", "-", "offs", "were", "determined", "as", "the", "mean", "+", "2", "SD", "of", "the", "A", "-", "T", "-", "group", "(", "defining", "p", "-", "tau231", "and", "p", "-", "tau235", "positivity", "or", "negativity", "in", "each", "participant", ")", ".", "Cut", "-", "off", "values", "are", "indicated", "in", "red", "(", "19", ".", "92", "and", "9", ".", "59", "pg", "/", "mL", "for", "CSF", "p", "-", "tau235", "and", "p", "-", "tau231", "respectively", ")", "and", "displayed", "with", "black", "dashed", "lines", ",", "resulting", "in", "four", "quadrants", ",", "each", "of", "them", "representing", "the", "four", "different", "positive", "or", "negatively", "status", "for", "each", "biomarker", ".", "Discordant", "cases", "with", "the", "sequential", "phosphorylation", "hypothesis", "(", "[", "231", "-", "/", "+", "235", "]", ")", "showed", "on", "the", "lower", "right", "quadrant", "(", "2", ".", "35", "%", "of", "the", "total", ",", "9", "participants", "out", "383", ")", ".", "All", "samples", "were", "run", "in", "singlicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Stacked bar chart depicting the percentages of [231+/235+], [231+/235-], [231-/235-] and [231-/235+] cases in each preclinical group. Table below indicates the exact percentages of participants in each group (exact number of participants in parenthesis). Discordant cases with the sequential phosphorylation hypothesis [231-/+235] shown in grey.(B) Correlation between CSF p-tau235 and p-tau231 in the whole ALFA+ cohort (Spearman's rank correlation: rS = 0.80, P˂0.0001). Assay cut-offs were determined as the mean + 2 SD of the A-T- group (defining p-tau231 and p-tau235 positivity or negativity in each participant). Cut-off values are indicated in red (19.92 and 9.59 pg/mL for CSF p-tau235 and p-tau231 respectively) and displayed with black dashed lines, resulting in four quadrants, each of them representing the four different positive or negatively status for each biomarker. Discordant cases with the sequential phosphorylation hypothesis ([231-/+235]) showed on the lower right quadrant (2.35% of the total, 9 participants out 383). All samples were run in singlicates."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "MDCK", "cells", "were", "cultured", "on", "cell", "culture", "inserts", "for", "4", "days", ".", "On", "the", "last", "day", ",", "the", "culture", "medium", "was", "replaced", "with", "EV", "-", "depleted", "medium", ".", "EVs", "released", "from", "the", "apical", "and", "basolateral", "sides", "of", "MDCK", "cells", "were", "purified", "by", "PEG", "precipitation", ".", "Cell", "lysates", "and", "EV", "proteins", "in", "PEG", "pellets", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Note", "that", "the", "PEG", "pellets", "did", "not", "contain", "mitochondrial", "protein", "TOMM20", ",", "suggesting", "that", "the", "PEG", "pellets", "were", "not", "contaminated", "by", "intracellular", "organelles", ".", "B", ".", "PEG", "pellets", "were", "subjected", "to", "OptiPrep", "flotation", "analysis", ".", "C", ".", "MDCK", "cells", "stably", "expressing", "human", "CD63", "were", "cultured", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD63", "antibody", ".", "D", ".", "sEVs", "were", "eluted", "from", "the", "beads", "with", "a", "glycine", "buffer", "and", "analyzed", "by", "nanoparticle", "tracking", "analysis", "(", "NTA", ")", ".", "Representative", "NTA", "traces", "were", "shown", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "the", "NTA", "data", "obtained", "in", "five", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "MDCK", "cells", "were", "cultured", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD9", "antibody", ".", "G", ".", "sEVs", "were", "eluted", "from", "the", "beads", "with", "a", "glycine", "buffer", "and", "analyzed", "by", "NTA", ".", "Representative", "NTA", "traces", "were", "shown", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "the", "NTA", "data", "obtained", "in", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. MDCK cells were cultured on cell culture inserts for 4 days. On the last day, the culture medium was replaced with EV-depleted medium. EVs released from the apical and basolateral sides of MDCK cells were purified by PEG precipitation. Cell lysates and EV proteins in PEG pellets were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated. Note that the PEG pellets did not contain mitochondrial protein TOMM20, suggesting that the PEG pellets were not contaminated by intracellular organelles.B. PEG pellets were subjected to OptiPrep flotation analysis.C. MDCK cells stably expressing human CD63 were cultured sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD63 antibody.D. sEVs were eluted from the beads with a glycine buffer and analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA). Representative NTA traces were shown. E. Quantification of the NTA data obtained in five independent experiments.F. MDCK cells were cultured sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD9 antibody.G. sEVs were eluted from the beads with a glycine buffer and analyzed by NTA. Representative NTA traces were shown. H. Quantification of the NTA data obtained in five independent experiments. "}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "MDCK", "cells", "were", "cultured", "on", "cell", "culture", "inserts", "for", "4", "days", ".", "On", "the", "last", "day", ",", "the", "culture", "medium", "was", "replaced", "with", "serum", "-", "free", "medium", ".", "sEVs", "released", "from", "the", "apical", "and", "basolateral", "sides", "of", "MDCK", "cells", "were", "purified", "by", "ultracentrifugation", ".", "Apical", "and", "basolateral", "sEVs", "(", "P100", ")", "were", "analyzed", "by", "silver", "staining", ".", "C", ".", "MDCK", "cells", "were", "cultured", "on", "cell", "culture", "inserts", "for", "4", "days", ".", "On", "the", "last", "day", ",", "the", "culture", "medium", "was", "replaced", "with", "EV", "-", "depleted", "medium", ".", "sEVs", "released", "from", "the", "apical", "and", "basolateral", "sides", "of", "MDCK", "cells", "were", "purified", "by", "PEG", "precipitation", ".", "Cell", "lysates", "and", "sEV", "proteins", "in", "PEG", "pellets", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "GPRC5C", "was", "detected", "only", "in", "the", "apical", "sEV", "samplesD", ".", "PEG", "pellets", "were", "subjected", "to", "OptiPrep", "flotation", "analysis", ".", "GPRC5C", "was", "detected", "only", "in", "the", "apical", "sEV", "samplesE", ".", "MDCK", "cells", "were", "cultured", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD9", "antibody", ".", "GPRC5C", "was", "detected", "only", "in", "the", "apical", "sEV", "samplesF", ".", "MDCK", "cells", "stably", "expressing", "human", "CD63", "were", "cultured", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD63", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. MDCK cells were cultured on cell culture inserts for 4 days. On the last day, the culture medium was replaced with serum-free medium. sEVs released from the apical and basolateral sides of MDCK cells were purified by ultracentrifugation. Apical and basolateral sEVs (P100) were analyzed by silver staining.C. MDCK cells were cultured on cell culture inserts for 4 days. On the last day, the culture medium was replaced with EV-depleted medium. sEVs released from the apical and basolateral sides of MDCK cells were purified by PEG precipitation. Cell lysates and sEV proteins in PEG pellets were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated. GPRC5C was detected only in the apical sEV samplesD. PEG pellets were subjected to OptiPrep flotation analysis. GPRC5C was detected only in the apical sEV samplesE. MDCK cells were cultured sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD9 antibody. GPRC5C was detected only in the apical sEV samplesF. MDCK cells stably expressing human CD63 were cultured sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD63 antibody."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "MDCK", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "the", "siRNAs", "indicated", ",", "and", "the", "cells", "were", "transferred", "to", "cell", "culture", "inserts", "and", "cultured", "for", "4", "days", ".", "On", "the", "last", "day", ",", "the", "culture", "medium", "was", "replaced", "with", "EV", "-", "depleted", "medium", ".", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD9", "antibody", ".", "Cell", "lysates", "and", "sEV", "samples", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "B", ".", "The", "intensity", "of", "the", "bands", "was", "measured", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "sEVs", "were", "eluted", "from", "the", "beads", "with", "a", "glycine", "buffer", "and", "analyzed", "by", "NTA", ".", "Representative", "NTA", "traces", "were", "shown", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "NTA", "data", "obtained", "in", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. MDCK cells were transfected with siControl or the siRNAs indicated, and the cells were transferred to cell culture inserts and cultured for 4 days. On the last day, the culture medium was replaced with EV-depleted medium. sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD9 antibody. Cell lysates and sEV samples were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated.B. The intensity of the bands was measured in three independent experiments.C. sEVs were eluted from the beads with a glycine buffer and analyzed by NTA. Representative NTA traces were shown.D. Quantification of the NTA data obtained in five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "MDCK", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siALIX", ",", "and", "the", "cells", "were", "transferred", "to", "cell", "culture", "inserts", "and", "cultured", "for", "4", "days", ".", "On", "the", "last", "day", ",", "the", "culture", "medium", "was", "replaced", "with", "EV", "-", "depleted", "medium", "with", "or", "without", "10", "nM", "GW4869", ".", "sEVs", "were", "isolated", "from", "the", "pre", "-", "cleared", "medium", "by", "direct", "immunoaffinity", "capture", "using", "anti", "-", "CD9", "antibody", ".", "Cell", "lysates", "and", "sEV", "samples", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "B", ".", "The", "intensity", "of", "the", "bands", "was", "measured", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "sEVs", "were", "eluted", "from", "the", "beads", "with", "a", "glycine", "buffer", "and", "analyzed", "by", "NTA", ".", "Representative", "NTA", "traces", "were", "shown", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "NTA", "data", "obtained", "in", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. MDCK cells were transfected with siControl or siALIX, and the cells were transferred to cell culture inserts and cultured for 4 days. On the last day, the culture medium was replaced with EV-depleted medium with or without 10 nM GW4869. sEVs were isolated from the pre-cleared medium by direct immunoaffinity capture using anti-CD9 antibody. Cell lysates and sEV samples were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated.B. The intensity of the bands was measured in three independent experiments.C. sEVs were eluted from the beads with a glycine buffer and analyzed by NTA. Representative NTA traces were shown.D. Quantification of the NTA data obtained in five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1Analyses", "of", "protein", "expression", "in", "lysates", "of", "various", "cell", "lines", "by", "western", "blotting", "against", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Fluorescence", "analyses", "of", "GFP", "-", "ATG5", "or", "ATG16L1", "-", "GFP", "stably", "expressed", "in", "ATG5", "-", "/", "-", "or", "ATG16L1", "-", "/", "-", ".", "Cells", "were", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", "prior", "to", "fixation", "and", "imaging", "of", "the", "GFP", "fluorescence", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Assessment", "of", "ATG16L1", "levels", "in", "the", "cytosolic", "(", "C", ")", "and", "membrane", "(", "M", ")", "fractions", "in", "lysates", "of", "the", "indicated", "cell", "lines", "using", "western", "blot", "analyses", "and", "antibodies", "against", "ATG16L1", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "and", "ATG5", "-", "/", "-", "stably", "expressed", "ATG16L1", "-", "GFP", "while", "ATG3", "-", "/", "-", "stably", "expressed", "Flag", "-", "S", "-", "ATG16L1", ".", "Antibodies", "against", "α", "-", "tubulin", "and", "integrin", "β1", "were", "used", "as", "controls", "for", "fractionation", ".", "Exogenous", "(", "exo", ")", "ATG16L1", "was", "detected", "using", "antibodies", "against", "ATG16L1", ".", "Lack", "of", "WIPI2", "expression", "is", "confirmed", "by", "western", "blot", "analyses", "in", "wild", "type", "MEFs", "(", "WIPI2", "+", "/", "+", ")", "and", "WIPI2", "-", "/", "-", "cells", ".", "Immunofluorescence", "analyses", "of", "ATG16L1", "-", "/", "-", "and", "WIPI2", "-", "/", "-", "stably", "expressing", "Flag", "-", "S", "-", "ATG16L1", ".", "Cells", "were", "amino", "acid", "starved", "(", "AA", "starve", ")", "for", "2", "hr", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "'", "MA", "(", "and", "additional", "pretreatment", "for", "30", "min", ")", "followed", "by", "fixation", "and", "immuno", "-", "staining", "using", "antibodies", "against", "Flag", "tag", "to", "detect", "ATG16L1", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Analyses of protein expression in lysates of various cell lines by western blotting against the indicated antibodies.Fluorescence analyses of GFP-ATG5 or ATG16L1-GFP stably expressed in ATG5-/- or ATG16L1-/-. Cells were amino acid starved for 2 hr prior to fixation and imaging of the GFP fluorescence. Scale bar: 10 μm.Assessment of ATG16L1 levels in the cytosolic (C) and membrane (M) fractions in lysates of the indicated cell lines using western blot analyses and antibodies against ATG16L1. ATG16L1-/- and ATG5-/- stably expressed ATG16L1-GFP while ATG3-/- stably expressed Flag-S-ATG16L1. Antibodies against α-tubulin and integrin β1 were used as controls for fractionation. Exogenous (exo) ATG16L1 was detected using antibodies against ATG16L1.Lack of WIPI2 expression is confirmed by western blot analyses in wild type MEFs (WIPI2+/+) and WIPI2-/- cells.Immunofluorescence analyses of ATG16L1-/- and WIPI2-/- stably expressing Flag-S-ATG16L1. Cells were amino acid starved (AA starve) for 2 hr in the presence or absence of 3'MA (and additional pretreatment for 30 min) followed by fixation and immuno-staining using antibodies against Flag tag to detect ATG16L1. Scale bar: 9 μm."}
{"words": ["Figure", "2Fragments", "depicted", "in", "(", "A", ")", "were", "expressed", "in", "U2OS", "cells", "and", "amino", "acid", "starved", "for", "5", "hr", "followed", "by", "fixation", "and", "immunostaining", "against", "S", "tag", "to", "detect", "S", "-", "ATG16L1", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "expressing", "Flag", "-", "ATG16L1", "∆", "2", "or", "Flag", "-", "ATG16L1", "∆", "2", "∆", "182", "-", "205", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "stained", "using", "antibodies", "against", "Flag", "tag", "(", "to", "detect", "ATG16L1", ",", "green", ")", "and", "FIP200", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Protein", "-", "protein", "interaction", "assay", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "tagged", "ATG16L1", "constructs", ".", "S", "tag", "pull", "down", "was", "performed", "and", "protein", "complexes", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Homodimerisation", "assay", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ATG16L1", "-", "GFP", "and", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "tagged", "ATG16L1", "constructs", ".", "S", "tag", "pull", "down", "was", "performed", "and", "protein", "complexes", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Homodimerisation", "assay", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ATG16L1", "-", "GFP", "and", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "tagged", "ATG16L1", "constructs", ".", "S", "tag", "pull", "down", "was", "performed", "and", "protein", "complexes", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Flag", "-", "ATG16L1WT", "or", "Flag", "-", "ATG16L1", "∆", "182", "-", "205", "were", "stably", "expressed", "in", "ATG5", "-", "/", "-", "cells", "and", "analysed", "by", "immunofluorescence", "using", "antibodies", "against", "Flag", "tag", "to", "detect", "ATG16L1", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Fragments depicted in (A) were expressed in U2OS cells and amino acid starved for 5 hr followed by fixation and immunostaining against S tag to detect S-ATG16L1. Scale bar: 10 μm.U2OS cells expressing Flag-ATG16L1∆2 or Flag-ATG16L1∆2∆182-205 were treated as in (B) and stained using antibodies against Flag tag (to detect ATG16L1, green) and FIP200 (red). Scale bar: 10 μm.Protein-protein interaction assay in 293T cells transiently transfected with the indicated Flag-S-tagged ATG16L1 constructs. S tag pull down was performed and protein complexes were analysed by immunoblotting using the indicated antibodies.Homodimerisation assay in 293T cells transiently transfected with ATG16L1-GFP and the indicated Flag-S-tagged ATG16L1 constructs. S tag pull down was performed and protein complexes were analysed by immunoblotting using the indicated antibodies.Homodimerisation assay in 293T cells transiently transfected with ATG16L1-GFP and the indicated Flag-S-tagged ATG16L1 constructs. S tag pull down was performed and protein complexes were analysed by immunoblotting using the indicated antibodies.Flag-ATG16L1WT or Flag-ATG16L1∆182-205 were stably expressed in ATG5-/- cells and analysed by immunofluorescence using antibodies against Flag tag to detect ATG16L1. Scale bar: 9 μm."}
{"words": ["Figure", "3Microscopy", "-", "based", "protein", "-", "liposome", "binding", "assay", ".", "ATG16L1", "-", "GFP", "immobilised", "on", "beads", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "rhodamine", "-", "labelled", "liposome", "preparations", "containing", "the", "indicated", "phosphoinositides", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Quantification", "of", "relative", "liposome", "bindingMicroscopy", "-", "based", "protein", "-", "liposome", "binding", "assay", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "ATG16L1WT", "-", "and", "ATG16L1LD", "-", "GFP", "immobilised", "on", "beads", "were", "incubated", "with", "rhodamine", "-", "labelled", ",", "PI3P", "-", "positive", "liposome", "preparations", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Right", "panel", "shows", "quantification", "of", "liposome", "binding", "relative", "to", "ATG16L1WT", "from", "3", "independent", "experiments", "including", "SEM", "values", ".", "Protein", "-", "protein", "interaction", "assay", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "the", "indicated", "S", "-", "tagged", "ATG16L1", "constructs", ".", "S", "tag", "pull", "down", "was", "performed", "and", "protein", "complexes", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Dimerisation", "assay", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "ATG16L1", "-", "GFP", "and", "the", "indicated", "S", "-", "tagged", "ATG16L1", "constructs", "and"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Microscopy-based protein-liposome binding assay. ATG16L1-GFP immobilised on beads incubated in the presence of rhodamine-labelled liposome preparations containing the indicated phosphoinositides. Scale bar: 50 μm.Quantification of relative liposome bindingMicroscopy-based protein-liposome binding assay as in (B). ATG16L1WT- and ATG16L1LD-GFP immobilised on beads were incubated with rhodamine-labelled, PI3P-positive liposome preparations. Scale bar: 50 μm. Right panel shows quantification of liposome binding relative to ATG16L1WT from 3 independent experiments including SEM values.Protein-protein interaction assay in 293T cells transiently transfected with the indicated S-tagged ATG16L1 constructs. S tag pull down was performed and protein complexes were analysed by immunoblotting using the indicated antibodies.by immunoblotting using the indicated antibodies. Dimerisation assay in 293T cells transiently transfected with ATG16L1-GFP and the indicated S-tagged ATG16L1 constructs and analysed"}
{"words": ["Figure", "4ATG16L1", "-", "/", "-", "stably", "expressing", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "ATG16L1", "constructs", "were", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", "prior", "to", "immunofluorescence", "analyses", "using", "antibodies", "against", "Flag", "tag", "(", "green", ")", "and", "ATG5", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", ".", "Right", "panels", "show", "quantifications", "of", "average", "number", "of", "Flag", "-", "and", "ATG5", "-", "positive", "dots", "per", "cell", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "stably", "expressing", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "ATG16L1", "constructs", "were", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", "prior", "to", "immunofluorescence", "analyses", "using", "antibodies", "against", "S", "tag", "(", "to", "detect", "ATG16L1", ",", "red", ")", "and", "WIPI2", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", ".", "Lower", "panel", "shows", "quantification", "of", "average", "number", "of", "WIPI2", "positive", "dots", "per", "cell", ".", "Average", "intensities", "of", "individual", "Flag", "-", "ATG16L1", "dots", "in", "(", "A", ")", ".", "Underlying", "grey", "circles", "represent", "individual", "data", "points", ".", "Dots", "were", "quantified", "(", "n", "=", "1225", "for", "ATG16L1WT", ";", "n", "=", "334", "for", "ATG16L1LD", ")", ".", "WIPI2", "-", "/", "-", "cells", "reconstituted", "with", "the", "indicated", "Flag", "-", "S", "-", "ATG16L1", "constructs", "were", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", "prior", "to", "immunofluorescence", "analyses", "using", "antibodies", "against", "Flag", "tag", "(", "green", ")", "and", "FIP200", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", ".", "Lower", "panel", "shows", "quantification", "of", "average", "number", "of", "Flag", "positive", "dots", "per", "puncta", "-", "positive", "cell", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4ATG16L1-/- stably expressing the indicated Flag-S-ATG16L1 constructs were amino acid starved for 2 hr prior to immunofluorescence analyses using antibodies against Flag tag (green) and ATG5 (red). Scale bar: 9 μm. Right panels show quantifications of average number of Flag- and ATG5-positive dots per cell.ATG16L1-/- stably expressing the indicated Flag-S-ATG16L1 constructs were amino acid starved for 2 hr prior to immunofluorescence analyses using antibodies against S tag (to detect ATG16L1, red) and WIPI2 (green). Scale bar: 9 μm. Lower panel shows quantification of average number of WIPI2 positive dots per cell.Average intensities of individual Flag-ATG16L1 dots in (A). Underlying grey circles represent individual data points. Dots were quantified (n=1225 for ATG16L1WT; n=334 for ATG16L1LD).WIPI2-/- cells reconstituted with the indicated Flag-S-ATG16L1 constructs were amino acid starved for 2 hr prior to immunofluorescence analyses using antibodies against Flag tag (green) and FIP200 (red). Scale bar: 9 μm. Lower panel shows quantification of average number of Flag positive dots per puncta-positive cell."}
{"words": ["Figure", "5ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LD", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "treatment", "with", "various", "stimuli", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Cells", "were", "amino", "acid", "starved", "(", "AA", "starved", ")", "to", "induce", "mTORC1", "-", "dependent", "autophagy", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BafA1", "for", "2", "hr", "prior", "to", "lysis", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LD", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "treatment", "with", "various", "stimuli", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Mitophagy", "was", "induced", "by", "CCCP", "(", "10", "μM", ")", "treatment", "for", "6", "hr", "prior", "to", "lysis", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LD", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "treatment", "with", "various", "stimuli", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Glucose", "starvation", "(", "Glu", "starved", ")", "for", "20", "hr", "was", "used", "to", "induce", "mTORC1", "-", "independent", "autophagy", ".", "BafA1", "was", "added", "to", "all", "conditions", "2", "hr", "prior", "to", "lysis", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LD", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "treatment", "with", "various", "stimuli", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "LC3", "-", "associated", "phagocytosis", "(", "LAP", ")", "-", "like", "LC3", "lipidation", "was", "induced", "by", "treating", "cells", "with", "CCCP", "(", "100", "μM", ")", "for", "2", "hr", "prior", "to", "lysis", ".", "Right", "panel", "shows", "quantification", "of", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", ".", "ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LD", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "treatment", "with", "various", "stimuli", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "LAP", "-", "like", "LC3", "lipidation", "induced", "by", "monensin", "or", "ammonium", "chloride", "(", "NH4Cl", ")", "for", "2", "hr", "prior", "to", "lysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LD-expression constructs and autophagy assessed during treatment with various stimuli followed by immunoblotting using the indicated antibodies. Cells were amino acid starved (AA starved) to induce mTORC1-dependent autophagy in the presence or absence of BafA1 for 2 hr prior to lysis.ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LD-expression constructs and autophagy assessed during treatment with various stimuli followed by immunoblotting using the indicated antibodies. Mitophagy was induced by CCCP (10 μM) treatment for 6 hr prior to lysis.ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LD-expression constructs and autophagy assessed during treatment with various stimuli followed by immunoblotting using the indicated antibodies. Glucose starvation (Glu starved) for 20 hr was used to induce mTORC1-independent autophagy. BafA1 was added to all conditions 2 hr prior to lysis.ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LD-expression constructs and autophagy assessed during treatment with various stimuli followed by immunoblotting using the indicated antibodies. LC3-associated phagocytosis (LAP)-like LC3 lipidation was induced by treating cells with CCCP (100 μM) for 2 hr prior to lysis. Right panel shows quantification of LC3-II/LC3-I ratio.ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LD-expression constructs and autophagy assessed during treatment with various stimuli followed by immunoblotting using the indicated antibodies. LAP-like LC3 lipidation induced by monensin or ammonium chloride (NH4Cl) for 2 hr prior to lysis."}
{"words": ["Figure", "6Coomassie", "gel", "of", "recombinant", "ATG16L172", "-", "307", "wild", "type", "and", "mutants", ".", "*", "indicates", "bacterial", "proteinLiposome", "co", "-", "sedimentation", "assay", "using", "recombinant", "ATG16L1", "protein", "and", "sonicated", "liposomes", ".", "Supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "against", "T7", "tag", "to", "detect", "ATG16L1", ".", "Quantification", "of", "percentage", "protein", "in", "the", "pellet", "fraction", "was", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "right", "panel", ")", ".", "Liposome", "co", "-", "sedimentation", "assay", ",", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "using", "ATG16L172", "-", "307LE", "and", "sonicated", "liposomes", "that", "contain", "or", "lack", "PI3P", ".", "Quantification", "of", "percentage", "protein", "in", "the", "pellet", "fraction", "was", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "right", "panel", ")", "with", "error", "bars", "depicting", "SEM", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Coomassie gel of recombinant ATG16L172-307 wild type and mutants. * indicates bacterial proteinLiposome co-sedimentation assay using recombinant ATG16L1 protein and sonicated liposomes. Supernatant (S) and pellet (P) were analysed by immunoblotting against T7 tag to detect ATG16L1. Quantification of percentage protein in the pellet fraction was calculated from 3 independent experiments (right panel).Liposome co-sedimentation assay, as in (C), using ATG16L172-307LE and sonicated liposomes that contain or lack PI3P. Quantification of percentage protein in the pellet fraction was calculated from 3 independent experiments (right panel) with error bars depicting SEM values."}
{"words": ["Figure", "7ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "were", "reconstituted", "with", "ATG16L1WT", "-", "or", "ATG16L1LE", "-", "expression", "constructs", "and", "autophagy", "assessed", "during", "amino", "acid", "starvation", "(", "AA", "starve", ")", "followed", "by", "immunoblotting", "or", "immunofluorescence", "analyses", ".", "Immunofluorescence", "analyses", "of", "amino", "acid", "starved", "cells", "(", "2", "hr", ")", "using", "antibodies", "against", "WIPI2", "(", "red", ")", "or", "ATG16L1", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", ".", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "the", "addition", "of", "3", "'", "MA", "(", "and", "pretreatment", "with", "the", "drug", "for", "30", "min", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "9", "μm", ".", "Quantification", "of", "percentage", "of", "cells", "positive", "for", "ATG16L1", "punctaCells", "were", "left", "untreated", ",", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", ",", "or", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", "followed", "by", "refeeding", "with", "full", "growth", "media", "for", "1", "hr", ".", "Puncta", "formation", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", "staining", "using", "antibodies", "against", "S", "tag", "to", "detect", "ATG16L1", ".", "­", "­", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunoblot", "analyses", "of", "amino", "acid", "starved", "cells", "in", "the", "presence", "of", "BafA1", "for", "2", "hr", ".", "Cell", "lysates", "were", "analysed", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "WIPI2", "-", "/", "-", "cells", "reconstituted", "with", "the", "indicated", "ATG16L1", "constructs", "were", "amino", "acid", "starved", "for", "2", "hr", ".", "BafA1", "treatment", "was", "included", "in", "all", "conditions", "for", "2", "hr", "prior", "to", "lysis", ".", "Cell", "lysates", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "on", "the", "right", "panel", ".", "Ferroptosis", "assay", "in", "ATG16L1", "-", "/", "-", "cells", "stably", "expressing", "ATG16L1WT", ",", "ATG16L1LD", "or", "ATG16L1LE", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "amino", "acid", "free", "media", "(", "AA", "starve", ")", "in", "the", "presence", "of", "10", "%", "FBS", "or", "10", "%", "dialysed", "FBS", "(", "diFBS", ")", "for", "24", "hr", ".", "Quantification", "of", "percentage", "of", "PI", "-", "positive", "cells", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7ATG16L1-/- cells were reconstituted with ATG16L1WT- or ATG16L1LE-expression constructs and autophagy assessed during amino acid starvation (AA starve) followed by immunoblotting or immunofluorescence analyses. Immunofluorescence analyses of amino acid starved cells (2 hr) using antibodies against WIPI2 (red) or ATG16L1 (green). Scale bar: 9 μm. Cells as in (A) with the addition of 3'MA (and pretreatment with the drug for 30 min). Scale bar: 9 μm.Quantification of percentage of cells positive for ATG16L1 punctaCells were left untreated, amino acid starved for 2 hr, or amino acid starved for 2 hr followed by refeeding with full growth media for 1 hr. Puncta formation was assessed by immunofluorescence staining using antibodies against S tag to detect ATG16L1.­­ Scale bar: 10 μm.Immunoblot analyses of amino acid starved cells in the presence of BafA1 for 2 hr. Cell lysates were analysed using the indicated antibodies.WIPI2-/- cells reconstituted with the indicated ATG16L1 constructs were amino acid starved for 2 hr. BafA1 treatment was included in all conditions for 2 hr prior to lysis. Cell lysates were analysed by immunoblotting using the indicated antibodies. Quantification of LC3-II/LC3-I ratio of three independent experiments is shown on the right panel.Ferroptosis assay in ATG16L1-/- cells stably expressing ATG16L1WT, ATG16L1LD or ATG16L1LE. Cells were cultured in amino acid free media (AA starve) in the presence of 10% FBS or 10% dialysed FBS (diFBS) for 24 hr. Quantification of percentage of PI-positive cells from at least three independent experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "of", "cohorts", "of", "induced", "Vil", "Apc", ",", "Vil", "Apc", "Huwe1het", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", ".", "Deletion", "of", "Huwe1", "led", "to", "a", "significant", "reduction", "in", "survival", "of", "these", "animals", "(", "Vil", "Apc", "vs", "Vil", "Apc", "Huwe1het", "/", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", ",", "Log", "Rank", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "≥", "10", ")", ".", "(", "b", ")", "Wholemount", "isolation", "of", "small", "intestines", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", "culled", "at", "clinical", "endpoint", ".", "Note", "the", "huge", "numbers", "of", "tiny", "macroscopic", "adenomas", "visible", "in", "the", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "intestine", "(", "red", "arrows", ")", ".", "(", "c", ")", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "intestinal", "cross", "sections", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", "demonstrating", "the", "increased", "adenoma", "burden", "following", "Huwe1", "deletion", ".", "Black", "arrows", "indicate", "individual", "adenomas", ".", "Scale", "bars", "=", "200", "µm", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "total", "tumour", "numbers", "per", "gut", "in", "sacrificed", "Vil", "Apc", ",", "Vil", "Apc", "Huwe1het", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", ".", "Deletion", "of", "Huwe1", "led", "to", "a", "significant", "increase", "in", "the", "number", "of", "tumours", "per", "gut", "(", "Mann", "Whitney", ",", "n", "≥", "5", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Kaplan-Meier survival plot of cohorts of induced Vil Apc, Vil Apc Huwe1het and Vil Apc Huwe1hom mice. Deletion of Huwe1 led to a significant reduction in survival of these animals (Vil Apc vs Vil Apc Huwe1het / Vil Apc Huwe1hom, Log Rank, p < 0.001, n ≥ 10).(b) Wholemount isolation of small intestines from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom mice culled at clinical endpoint. Note the huge numbers of tiny macroscopic adenomas visible in the Vil Apc Huwe1hom intestine (red arrows).(c) H&amp;amp;E staining of intestinal cross sections from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom mice demonstrating the increased adenoma burden following Huwe1 deletion. Black arrows indicate individual adenomas. Scale bars = 200 µm.(d) Quantification of total tumour numbers per gut in sacrificed Vil Apc, Vil Apc Huwe1het and Vil Apc Huwe1hom mice. Deletion of Huwe1 led to a significant increase in the number of tumours per gut (Mann Whitney, n ≥ 5)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "control", "and", "Huwe1", "deleted", "intestinal", "epithelium", ".", "Shortened", "villi", "in", "Huwe1", "deficient", "tissue", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "(", "b", ")", "BrdU", "IHC", "of", "control", "and", "Huwe1", "deleted", "intestinal", "epithelium", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "(", "c", ")", "PAS", "staining", "identifying", "Goblet", "cells", ".", "No", "gross", "changes", "were", "observed", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "(", "d", ")", "Lysozyme", "staining", "(", "Paneth", "cell", "marker", ")", "of", "control", "and", "Huwe1", "deleted", "small", "intestine", ".", "Note", "the", "occurrence", "of", "lysozyme", "positive", "cells", "away", "from", "the", "crypt", "base", "(", "black", "arrows", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "(", "e", ")", "Dual", "Periodic", "acid", "-", "Schiff", "/", "Alcian", "blue", "staining", "to", "identify", "Paneth", "cell", "secretory", "vesicles", "(", "light", "blue", "/", "pink", "-", "marked", "with", "black", "arrows", ")", "and", "goblet", "cells", "(", "dark", "blue", "/", "purple", "-", "marked", "with", "red", "arrows", ")", ".", "Note", "Paneth", "cell", "secretory", "vesicles", "are", "restricted", "to", "crypt", "base", "in", "both", "control", "and", "Huwe1", "deficient", "small", "intestines", "(", "inset", "-", "black", "arrows", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "100µm", ".", "(", "f", ")", "MMP7", "staining", "of", "control", "and", "Huwe1", "deleted", "small", "intestine", ".", "Note", "MMP7", "staining", "is", "restricted", "to", "crypt", "base", "in", "Huwe1", "deficient", "intestines", ".", "Scale", "bars", "=", "100µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) H&amp;amp;E staining of control and Huwe1 deleted intestinal epithelium. Shortened villi in Huwe1 deficient tissue are indicated. Scale bars = 100 µm. (b) BrdU IHC of control and Huwe1 deleted intestinal epithelium. Scale bars = 100 µm. (c) PAS staining identifying Goblet cells. No gross changes were observed. Scale bars = 100 µm. (d) Lysozyme staining (Paneth cell marker) of control and Huwe1 deleted small intestine. Note the occurrence of lysozyme positive cells away from the crypt base (black arrows). Scale bars = 100 µm.(e) Dual Periodic acid-Schiff / Alcian blue staining to identify Paneth cell secretory vesicles (light blue / pink - marked with black arrows) and goblet cells (dark blue / purple - marked with red arrows). Note Paneth cell secretory vesicles are restricted to crypt base in both control and Huwe1 deficient small intestines (inset - black arrows). Scale bars = 100µm.(f) MMP7 staining of control and Huwe1 deleted small intestine. Note MMP7 staining is restricted to crypt base in Huwe1 deficient intestines. Scale bars = 100µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "a", ")", "HUWE1", "and", "MYC", "Western", "blot", "analysis", "of", "epithelial", "cell", "extractions", "from", "control", "and", "Huwe1", "deficient", "intestines", ".", "Levels", "of", "MYC", "protein", "are", "significantly", "increased", "in", "normal", "intestines", "lacking", "HUWE1", "(", "Mann", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "QRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Myc", "expression", "in", "control", "and", "Huwe1", "deficient", "intestines", ".", "(", "c", ")", "MYC", "IHC", "in", "tumours", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "(", "d", ")", "MYC", "Western", "blot", "in", "protein", "extracts", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "tumours", ".", "Levels", "of", "MYC", "protein", "are", "significantly", "increased", "in", "tumours", "lacking", "HUWE1", "(", "Mann", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "QRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Myc", "expression", "in", "tumours", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(a) HUWE1 and MYC Western blot analysis of epithelial cell extractions from control and Huwe1 deficient intestines. Levels of MYC protein are significantly increased in normal intestines lacking HUWE1 (Mann Whitney, p = 0.04, n = 3).(b) QRT-PCR analysis of Myc expression in control and Huwe1 deficient intestines.(c) MYC IHC in tumours from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom mice. Scale bars = 50 µm.(d) MYC Western blot in protein extracts from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom tumours. Levels of MYC protein are significantly increased in tumours lacking HUWE1 (Mann Whitney, p = 0.04, n = 3).(e) QRT-PCR analysis of Myc expression in tumours from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom mice."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "of", "cohorts", "of", "induced", "Vil", "Apc", "Pten", ",", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", ",", "Vil", "Apc", "Pten", "Myc", "and", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "Myc", "mice", ".", "Heterozygous", "deletion", "of", "Myc", "led", "to", "a", "specific", "and", "significant", "increase", "in", "survival", "of", "Huwe1", "deleted", "animals", "(", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "vs", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "Myc", ",", "Log", "Rank", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "≥", "16", ")", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "total", "tumour", "numbers", "per", "gut", "in", "sacrificed", "Vil", "Apc", "Pten", ",", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", ",", "Vil", "Apc", "Pten", "Myc", "and", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "Myc", "mice", ".", "Heterozygous", "deletion", "of", "Myc", "did", "not", "reduce", "the", "number", "of", "tumours", "in", "Huwe1", "deleted", "mice", "(", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "vs", "Vil", "Apc", "Pten", "Huwe1", "Myc", ".", "Mann", "Whitney", ",", "n", "≥", "10", ")", ".", "(", "c", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "of", "cohorts", "of", "induced", "AhCre", "-", "ERT", "Apc", "Pten", "and", "AhCre", "-", "ERT", "Apc", "Pten", "MycT58A", "mice", ".", "Overexpression", "of", "proteolytically", "stabilised", "MYC", "led", "to", "a", "significant", "reduction", "in", "survival", "(", "Log", "Rank", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "14", "vs", "21", ")", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "total", "tumour", "numbers", "per", "gut", "in", "sacrificed", "Apc", "Pten", "and", "Apc", "Pten", "MycT58A", "mice", ".", "Overexpression", "of", "proteolytically", "stabilised", "MYC", "did", "not", "increase", "the", "number", "of", "tumours", "in", "Apc", "Pten", "mice", "(", "Mann", "Whitney", ",", "n", "=", "9", "vs", "19", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Kaplan-Meier survival plot of cohorts of induced Vil Apc Pten, Vil Apc Pten Huwe1, Vil Apc Pten Myc and Vil Apc Pten Huwe1 Myc mice. Heterozygous deletion of Myc led to a specific and significant increase in survival of Huwe1 deleted animals (Vil Apc Pten Huwe1 vs Vil Apc Pten Huwe1 Myc, Log Rank, p < 0.001, n ≥ 16).(b) Quantification of total tumour numbers per gut in sacrificed Vil Apc Pten, Vil Apc Pten Huwe1, Vil Apc Pten Myc and Vil Apc Pten Huwe1 Myc mice. Heterozygous deletion of Myc did not reduce the number of tumours in Huwe1 deleted mice (Vil Apc Pten Huwe1 vs Vil Apc Pten Huwe1 Myc. Mann Whitney, n ≥ 10).(c) Kaplan-Meier survival plot of cohorts of induced AhCre-ERT Apc Pten and AhCre-ERT Apc Pten MycT58A mice. Overexpression of proteolytically stabilised MYC led to a significant reduction in survival (Log Rank, p < 0.001, n = 14 vs 21).(d) Quantification of total tumour numbers per gut in sacrificed Apc Pten and Apc Pten MycT58A mice. Overexpression of proteolytically stabilised MYC did not increase the number of tumours in Apc Pten mice (Mann Whitney, n = 9 vs 19)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "a", ")", "H2AX", "Western", "blot", "in", "protein", "extracts", "from", "control", "and", "Huwe1", "deficient", "intestinal", "epithelial", "cells", ".", "Band", "intensity", "relative", "to", "βactin", "displayed", "under", "each", "lane", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "3", "vs", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "γ", "-", "H2AX", "IHC", "showing", "increased", "positivity", "in", "Huwe1", "deleted", "intestinal", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "(", "c", ")", "γ", "-", "H2AX", "Western", "blot", "in", "protein", "extracts", "from", "control", "and", "Huwe1", "deficient", "intestinal", "epithelial", "cells", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "3", "vs", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "γ", "-", "H2AX", "IHC", "of", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "tumours", ",", "note", "increased", "positivity", "in", "Huwe1", "deficient", "tumours", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(a) H2AX Western blot in protein extracts from control and Huwe1 deficient intestinal epithelial cells. Band intensity relative to βactin displayed under each lane (Mann-Whitney, p = 0.04, n = 3 vs 3).(b) γ-H2AX IHC showing increased positivity in Huwe1 deleted intestinal cells. Scale bars = 50 µm.(c) γ-H2AX Western blot in protein extracts from control and Huwe1 deficient intestinal epithelial cells (Mann-Whitney, p = 0.04, n = 3 vs 3).(d) γ-H2AX IHC of Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom tumours, note increased positivity in Huwe1 deficient tumours. Scale bars = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "a", ")", "Caspase", "3", "IHC", "of", "tumours", "from", "Lgr5", "Apc", "and", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "mice", "either", "untreated", "or", "6h", "post", "treatment", "with", "7", ".", "5mg", "/", "kg", "cisplatin", ".", "Arrows", "identify", "caspase", "3", "positive", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "cisplatin", "treatment", "showing", "a", "significant", "increase", "in", "apoptosis", "in", "Huwe1", "deficient", "tumour", "cells", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "n", "=", "3", "vs", "5", ")", ".", "(", "c", ")", "Comparison", "of", "somatic", "mutation", "rate", "(", "mutations", "/", "Mb", ")", "between", "human", "tumours", "carrying", "HUWE1", "mutations", "or", "not", ".", "Note", "the", "significant", "increase", "in", "mutational", "burden", "in", "HUWE1", "mutated", "tumours", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", ",", "n", "≥", "15", ")", ".", "(", "d", ")", "Comparison", "of", "somatic", "mutation", "rate", "(", "mutations", "/", "Mb", ")", "between", "human", "tumours", "carrying", "HUWE1", "mutations", "or", "not", "grouped", "according", "to", "MLH1", "status", ".", "Note", "that", "the", "increased", "mutation", "rate", "is", "found", "primarily", "in", "tumours", "where", "MLH1", "is", "not", "silenced", "indicating", "increased", "mutation", "rate", "(", "and", "HUWE1", "mutation", "itself", ")", "is", "not", "due", "to", "silencing", "of", "MLH1", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "0007", ",", "n", "≥", "11", ")", ".", "(", "e", ")", "Survival", "analysis", "of", "colorectal", "cancer", "patients", "treated", "with", "adjuvant", "chemotherapy", "divided", "by", "HUWE1", "expression", "levels", ".", "Note", "the", "lowest", "HUWE1", "expressing", "quartile", "of", "patients", "respond", "significantly", "better", "to", "chemotherapy", ".", "(", "f", ")", "Survival", "analysis", "of", "colorectal", "cancer", "patients", "not", "treated", "with", "adjuvant", "chemotherapy", "divided", "by", "HUWE1", "expression", "levels", ".", "Note", "the", "lowest", "HUWE1", "expressing", "quartile", "of", "patients", "do", "not", "survive", "significantly", "longer", "than", "those", "expressing", "higher", "levels", "of", "HUWE1", "if", "not", "treated", "with", "chemotherapy", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(a) Caspase 3 IHC of tumours from Lgr5 Apc and Lgr5 Apc Huwe1 mice either untreated or 6h post treatment with 7.5mg/kg cisplatin. Arrows identify caspase 3 positive cells. Scale bars = 50 µm. (b) Quantification of cisplatin treatment showing a significant increase in apoptosis in Huwe1 deficient tumour cells (Mann-Whitney, n = 3 vs 5).(c) Comparison of somatic mutation rate (mutations / Mb) between human tumours carrying HUWE1 mutations or not. Note the significant increase in mutational burden in HUWE1 mutated tumours (Mann-Whitney, p = 0.0002, n ≥ 15).(d) Comparison of somatic mutation rate (mutations / Mb) between human tumours carrying HUWE1 mutations or not grouped according to MLH1 status. Note that the increased mutation rate is found primarily in tumours where MLH1 is not silenced indicating increased mutation rate (and HUWE1 mutation itself) is not due to silencing of MLH1 (Mann-Whitney, p = 0.0007, n ≥ 11).(e) Survival analysis of colorectal cancer patients treated with adjuvant chemotherapy divided by HUWE1 expression levels. Note the lowest HUWE1 expressing quartile of patients respond significantly better to chemotherapy. (f) Survival analysis of colorectal cancer patients not treated with adjuvant chemotherapy divided by HUWE1 expression levels. Note the lowest HUWE1 expressing quartile of patients do not survive significantly longer than those expressing higher levels of HUWE1 if not treated with chemotherapy."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "b", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "of", "cohorts", "of", "induced", "Lgr5", "Apc", "and", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "mice", ".", "Deletion", "of", "Huwe1", "led", "to", "a", "significant", "reduction", "in", "survival", "of", "these", "animals", "(", "Log", "Rank", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "≥", "15", ")", ".", "(", "c", ")", "Lysozyme", "IHC", "demonstrating", "increased", "lysozyme", "positive", "cell", "numbers", "in", "tumours", "from", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "mice", ".", "Scale", "bars", "=", "200", "µm", "(", "low", "magnification", ")", ",", "100", "µm", "(", "high", "magnification", "inset", ")", ".", "(", "d", ")", "OLFM4", "IHC", "demonstrating", "expanded", "stem", "cell", "population", "in", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "tumours", ".", "Scale", "bars", "=", "200", "µm", "(", "low", "magnification", ")", ",", "100", "µm", "(", "high", "magnification", "inset", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(b) Kaplan-Meier survival plot of cohorts of induced Lgr5 Apc and Lgr5 Apc Huwe1 mice. Deletion of Huwe1 led to a significant reduction in survival of these animals (Log Rank, p < 0.001, n ≥ 15).(c) Lysozyme IHC demonstrating increased lysozyme positive cell numbers in tumours from Lgr5 Apc Huwe1 mice. Scale bars = 200 µm (low magnification), 100 µm (high magnification inset). (d) OLFM4 IHC demonstrating expanded stem cell population in Lgr5 Apc Huwe1 tumours. Scale bars = 200 µm (low magnification), 100 µm (high magnification inset)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "a", ")", "MCL1", "Western", "blot", "in", "protein", "extracts", "from", "Vil", "Apc", "and", "Vil", "Apc", "Huwe1hom", "tumours", ".", "Levels", "of", "MCL1", "protein", "are", "significantly", "increased", "in", "tumours", "lacking", "HUWE1", "(", "Mann", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "of", "cohorts", "of", "induced", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "and", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "Mcl1", "mice", ".", "Deletion", "of", "one", "copy", "of", "Mcl1", "led", "to", "a", "significant", "increase", "in", "survival", "of", "these", "animals", "(", "Log", "Rank", ",", "p", "=", "0", ".", "0052", ",", "n", "=", "9", "vs", "10", ")", ".", "(", "c", ")", "Ratio", "of", "adenoma", "/", "indolent", "lesions", "observed", "in", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "and", "Lgr5", "Apc", "Huwe1", "Mcl1het", "mice", ".", "Note", "the", "decreased", "ration", "of", "adenoma", "/", "indolent", "lesions", "observed", "upon", "Mcl1", "deletion", "(", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "0281", ",", "n", "=", "8", "v", "8", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(a) MCL1 Western blot in protein extracts from Vil Apc and Vil Apc Huwe1hom tumours. Levels of MCL1 protein are significantly increased in tumours lacking HUWE1 (Mann Whitney, p = 0.04, n = 3).(b) Kaplan-Meier survival plot of cohorts of induced Lgr5 Apc Huwe1 and Lgr5 Apc Huwe1 Mcl1 mice. Deletion of one copy of Mcl1 led to a significant increase in survival of these animals (Log Rank, p = 0.0052, n = 9 vs 10).(c) Ratio of adenoma / indolent lesions observed in Lgr5 Apc Huwe1 and Lgr5 Apc Huwe1 Mcl1het mice. Note the decreased ration of adenoma / indolent lesions observed upon Mcl1 deletion (Mann-Whitney, p=0.0281, n = 8 v 8)."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "GST", "pulldown", "used", "to", "analyse", "TBC1D14", "interactors", ".", "Recombinant", "GST", "or", "GST", "-", "TBC1D14", "was", "incubated", "with", "or", "without", "HEK", "293A", "lysate", ".", "Bound", "proteins", "were", "eluted", "from", "the", "beads", "using", "Laemmli", "sample", "buffer", "and", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ",", "with", "visible", "bands", "being", "excised", "from", "the", "gel", "and", "analysed", "by", "mass", "spectrometry", ".", "B", ")", "Lysates", "of", "HEK293A", "cells", "expressing", "either", "GFP", "or", "GFP", "-", "TBC1D14", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "GFP", "-", "Trap", ",", "and", "then", "immunoblotted", "for", "GFP", ",", "TRAPPC12", "and", "TRAPPC4", ".", "C", ")", "Lysates", "of", "cells", "expressing", "GFP", "or", "GFP", "-", "TRAPPC3", "were", "subjected", "to", "IP", "with", "GFP", "-", "Trap", ",", "and", "then", "immunoblotted", "for", "TRAPPC4", ",", "GFP", "and", "TBC1D14", ".", "D", ")", "Cells", "expressing", "GFP", "-", "TBC1D14", ",", "generating", "a", "tubulated", "endosomal", "compartment", ",", "were", "fed", "Alexa647", "labelled", "Transferrin", "(", "white", ",", "blue", "in", "merge", ")", "for", "15", "minutes", "in", "full", "medium", ",", "fixed", ",", "stained", "for", "endogenous", "TRAPPC4", "(", "red", ")", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "transfected", "cells", ",", "yellow", "arrowheads", "depict", "regions", "of", "colocalisation", "in", "inset", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "E", ")", "Cells", "treated", "as", "in", "D", "were", "stained", "for", "endogenous", "TRAPPC12", "(", "red", ")", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μmF", ")", "Cells", "in", "complete", "medium", "were", "fixed", ",", "stained", "for", "endogenous", "TBC1D14", "(", "green", ")", ",", "RAB1B", "(", "red", ")", "and", "TRAPPC4", "(", "white", ",", "blue", "in", "merge", ")", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Inset", "shows", "protein", "localisation", "in", "juxtanuclear", "area", ".", "Yellow", "arrowheads", "show", "regions", "of", "colocalisation", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) GST pulldown used to analyse TBC1D14 interactors. Recombinant GST or GST-TBC1D14 was incubated with or without HEK 293A lysate. Bound proteins were eluted from the beads using Laemmli sample buffer and subjected to SDS-PAGE, with visible bands being excised from the gel and analysed by mass spectrometry.B) Lysates of HEK293A cells expressing either GFP or GFP-TBC1D14 were subjected to immunoprecipitation (IP) with GFP-Trap, and then immunoblotted for GFP, TRAPPC12 and TRAPPC4.C) Lysates of cells expressing GFP or GFP-TRAPPC3 were subjected to IP with GFP-Trap, and then immunoblotted for TRAPPC4, GFP and TBC1D14.D) Cells expressing GFP-TBC1D14, generating a tubulated endosomal compartment, were fed Alexa647 labelled Transferrin (white, blue in merge) for 15 minutes in full medium, fixed, stained for endogenous TRAPPC4 (red) and analysed by confocal microscopy. White arrowheads indicate transfected cells, yellow arrowheads depict regions of colocalisation in inset. Scale bars = 10 μm.E) Cells treated as in D were stained for endogenous TRAPPC12 (red) and analysed by confocal microscopy. Scale bars = 10 μmF) Cells in complete medium were fixed, stained for endogenous TBC1D14 (green), RAB1B (red) and TRAPPC4 (white, blue in merge) and analysed by confocal microscopy. Inset shows protein localisation in juxtanuclear area. Yellow arrowheads show regions of colocalisation Scale bars = 10 μm. Data shown are representative from 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "HEK293A", "cells", "transfected", "with", "GFP", "(", "upper", "panels", ")", "or", "GFP", "-", "TBC1D14", "(", "lower", "panels", ")", "(", "green", ")", "were", "labelled", "with", "anti", "-", "RAB11A", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "RAB1B", "(", "white", ",", "blue", "in", "merge", ")", "antibodies", ".", "Arrows", "depict", "transfected", "cells", ".", "Inset", ":", "GFP", "-", "TBC1D14", "transfected", "cell", "showing", "triple", "co", "-", "localisation", "between", "GFP", "-", "TBC1D14", ",", "RAB11A", "and", "RAB1B", "(", "white", "arrows", ")", "and", "double", "co", "-", "localisation", "between", "GFP", "-", "TBC1D14", "and", "RAB11A", "(", "yellow", "arrows", ")", ".", "B", ")", "Co", "-", "localisation", "of", "GFP", "-", "TBC1D14", ",", "TRAPPC4", "(", "red", ")", "and", "RAB11A", "(", "white", ",", "blue", "in", "merge", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "regions", "of", "triple", "co", "-", "localisation", ".", "C", ")", "Co", "-", "localisation", "of", "GFP", "-", "TBC1D14", ",", "TRAPPC4", "(", "red", ")", "and", "RAB1B", "(", "white", ",", "blue", "in", "merge", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "regions", "of", "triple", "co", "-", "localisation", ",", "yellow", "arrowheads", "regions", "of", "double", "co", "-", "localisation", "between", "GFP", "-", "TBC1D14", "and", "TRAPPC4", ".", "All", "scale", "bars", "=", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) HEK293A cells transfected with GFP (upper panels) or GFP-TBC1D14 (lower panels) (green) were labelled with anti-RAB11A (red) and anti-RAB1B (white, blue in merge) antibodies. Arrows depict transfected cells. Inset: GFP-TBC1D14 transfected cell showing triple co-localisation between GFP-TBC1D14, RAB11A and RAB1B (white arrows) and double co-localisation between GFP-TBC1D14 and RAB11A (yellow arrows).B) Co-localisation of GFP-TBC1D14, TRAPPC4 (red) and RAB11A (white, blue in merge). White arrowheads indicate regions of triple co-localisation.C) Co-localisation of GFP-TBC1D14, TRAPPC4 (red) and RAB1B (white, blue in merge). White arrowheads indicate regions of triple co-localisation, yellow arrowheads regions of double co-localisation between GFP-TBC1D14 and TRAPPC4. All scale bars = 20 μm."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "HEK", "293A", "cell", "lysates", "(", "from", "approximately", "8", "×", "106", "cells", "per", "construct", ")", "expressing", "the", "indicated", "GFP", "fusions", "were", "subjected", "to", "IP", "and", "immunoblotting", "for", "GFP", ",", "TRAPPC12", "and", "TRAPPC4", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) HEK 293A cell lysates (from approximately 8 × 106 cells per construct) expressing the indicated GFP fusions were subjected to IP and immunoblotting for GFP, TRAPPC12 and TRAPPC4. Data are representative of 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Cells", "expressing", "the", "indicated", "GFP", "-", "fusions", "(", "green", ")", "were", "loaded", "with", "Alexa647", "-", "Transferrin", "(", "red", ";", "arrowheads", "indicate", "transfected", "cells", ")", "for", "15", "minutes", ",", "fixed", "and", "the", "morphology", "of", "the", "transferrin", "positive", "recycling", "endosomes", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "Arrows", "in", "inset", "indicate", "the", "juxtanuclear", "ERCB", ")", "Cells", "transfected", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "loaded", "with", "Alexa", "-", "647", "transferrin", "for", "15", "minutes", "and", "the", "fluorescent", "transferrin", "chased", "out", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "At", "the", "end", "of", "the", "timecourse", "the", "cells", "were", "fixed", "and", "the", "transferrin", "content", "of", "GFP", "positive", "cells", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "Tfn", "fluorescence", "at", "t", "=", "0", "and", "are", "the", "mean", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "C", ")", "Cells", "transfected", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "stained", "for", "the", "cis", "-", "Golgi", "marker", "GM130", ".", "Arrowheads", "depict", "transfected", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "Bar", "chart", "is", "quantification", "of", "fragmented", "Golgi", "complex", "(", ">", "100", "cells", "per", "condition", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "one", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "post", "-", "test", ")", ".", "D", ")", "HeLa", "C1", "cells", "transfected", "with", "CFP", "or", "CFP", "-", "TBR", "were", "treated", "with", "D", "/", "D", "solubiliser", "(", "Clontech", ")", "or", "D", "/", "D", "solubiliser", "plus", "2", ".", "5", "μg", "/", "ml", "Brefeldin", "A", "(", "BFA", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ",", "trypsinised", ",", "fixed", "and", "their", "GFP", "content", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "GFP", "levels", "at", "t", "=", "0", ",", "and", "the", "mean", "of", "3", "independent", "experiments", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Cells expressing the indicated GFP-fusions (green) were loaded with Alexa647-Transferrin (red; arrowheads indicate transfected cells) for 15 minutes, fixed and the morphology of the transferrin positive recycling endosomes analysed by confocal microscopy. Scale bars = 10 μm. Arrows in inset indicate the juxtanuclear ERCB) Cells transfected as in (A) were loaded with Alexa-647 transferrin for 15 minutes and the fluorescent transferrin chased out for the indicated time periods. At the end of the timecourse the cells were fixed and the transferrin content of GFP positive cells analysed by flow cytometry. Results are expressed as a percentage of Tfn fluorescence at t=0 and are the mean of 3 independent experiments, ± s.e.m.C) Cells transfected as in (A) were stained for the cis-Golgi marker GM130. Arrowheads depict transfected cells. Scale bars = 10 μm. Bar chart is quantification of fragmented Golgi complex (> 100 cells per condition from three independent experiments, ± s.e.m. ** p < 0.01, one way ANOVA with Sidak's post-test).D) HeLa C1 cells transfected with CFP or CFP-TBR were treated with D/D solubiliser (Clontech) or D/D solubiliser plus 2.5 μg/ml Brefeldin A (BFA) for the indicated time periods, trypsinised, fixed and their GFP content analysed by flow cytometry. Results are expressed as a percentage of GFP levels at t=0, and the mean of 3 independent experiments ± s.e.m."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "HEK293A", "cells", "expressing", "GFP", ",", "GFP", "-", "TBC1D14", "224", "-", "669", "or", "GFP", "-", "TBR", "were", "treated", "in", "duplicate", "with", "EBSS", ",", "EBSS", "plus", "100", "nM", "BafA1", "or", "not", "for", "two", "hours", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "for", "LC3B", ",", "tubulin", "and", "GFP", ".", "The", "amount", "of", "LC3B", "/", "tubulin", "for", "each", "condition", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "on", "the", "bar", "graph", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "one", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "B", ")", "HEK293A", "GFP", "-", "LC3B", "(", "2GL9", ")", "cells", "were", "transfected", "with", "mCherry", "or", "mCherry", "-", "TBR", ",", "treated", "with", "EBSS", "for", "two", "hours", ",", "fixed", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "C", ")", "HEK293A", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "fixed", ",", "stained", "for", "WIPI2", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "D", ")", "HEK293A", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "DFCP1", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "fixed", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "For", "quantification", "of", "(", "B", ")", ",", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", ",", "10", "fields", "of", "view", "containing", "transfected", "cells", "were", "imaged", "for", "each", "of", "three", "experiments", ",", "and", "the", "number", "of", "GFP", "-", "LC3B", ",", "WIPI2", "or", "GFP", "-", "DFCP1", "puncta", "per", "cell", "enumerated", "using", "Imaris", "software", "(", "Bitplane", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) HEK293A cells expressing GFP, GFP-TBC1D14 224-669 or GFP-TBR were treated in duplicate with EBSS, EBSS plus 100 nM BafA1 or not for two hours, lysed and subjected to immunoblotting for LC3B, tubulin and GFP. The amount of LC3B/tubulin for each condition from three independent experiments is shown on the bar graph, ±s.e.m. * p<0.05, ** p<0.01, one way ANOVA with Sidak's multiple comparison test.B) HEK293A GFP-LC3B (2GL9) cells were transfected with mCherry or mCherry-TBR, treated with EBSS for two hours, fixed and analysed by confocal microscopy.C) HEK293A cells were treated as in (B), fixed, stained for WIPI2 and analysed by confocal microscopy.D) HEK293A cells stably expressing GFP-DFCP1 were treated as in (B), fixed and analysed by confocal microscopy. Scale bars = 20 μm. For quantification of (B), (C) and (D), 10 fields of view containing transfected cells were imaged for each of three experiments, and the number of GFP-LC3B, WIPI2 or GFP-DFCP1 puncta per cell enumerated using Imaris software (Bitplane)."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Samples", "prepared", "according", "to", "(", "A", ")", "(", "8", "×", "107", "HEK293A", "cells", "per", "transfection", ")", "were", "lysed", "in", "TNTE", ",", "split", "equally", "and", "denatured", "with", "1", "%", "SDS", "(", "D", ")", "or", "not", "(", "ND", ")", "and", "subjected", "to", "1", "hour", "streptavidin", "resin", "pulldown", "at", "room", "temperature", ".", "The", "bound", "proteins", "were", "eluted", "in", "2x", "Laemmli", "sample", "buffer", "plus", "3", "mM", "Biotin", "and", "immunoblotted", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "C", ")", "siRNA", "transfected", "control", "cells", "(", "RISC", "Free", ")", "or", "TRAPPC8", "knockdown", "(", "TRAPPC8", ")", "(", "1x10cm", "plate", "per", "condition", ")", "were", "lysed", "in", "TNTE", "and", "used", "in", "pulldown", "assays", "with", "immobilised", "recombinant", "GST", "or", "GST", "-", "TBR", ".", "Bound", "proteins", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "using", "TRAPPC8", ",", "TRAPPC4", "and", "tubulin", "antibodies", ".", "Ponceau", "staining", "was", "used", "to", "verify", "loading", "of", "the", "GST", "fusion", "proteins", "(", "GST", "-", "TBR", "indicated", "with", "arrowhead", ")", ".", "The", "bar", "chart", "expresses", "the", "relative", "amount", "of", "TRAPPC4", "isolated", "from", "siTRAPPC8", "compared", "to", "siRISC", "Free", "control", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "are", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "T", "-", "testD", ")", "HEK293T", "cells", "stably", "depleted", "of", "TRAPPC8", "(", "shC8", ")", "or", "not", "(", "shCtrl", ")", "were", "transfected", "with", "constructs", "encoding", "GFP", "or", "GFP", "-", "TRAPPC3", "and", "subjected", "to", "GFP", "Trap", "IP", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "immunoblotted", "for", "GFP", ",", "TRAPPC4", "and", "TRAPPC8", ".", "Bar", "chart", ":", "the", "amount", "of", "TRAPPC4", "isolated", "was", "normalised", "to", "the", "amount", "of", "GFP", "-", "TRAPPC3", "precipitated", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "plotted", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "ns", "=", "non", "-", "significant", ",", "unpaired", "T", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Samples prepared according to (A) (8 × 107 HEK293A cells per transfection) were lysed in TNTE, split equally and denatured with 1% SDS (D) or not (ND) and subjected to 1 hour streptavidin resin pulldown at room temperature. The bound proteins were eluted in 2x Laemmli sample buffer plus 3 mM Biotin and immunoblotted for the indicated proteins.C) siRNA transfected control cells (RISC Free) or TRAPPC8 knockdown (TRAPPC8) (1x10cm plate per condition) were lysed in TNTE and used in pulldown assays with immobilised recombinant GST or GST-TBR. Bound proteins were subjected to immunoblot analysis using TRAPPC8, TRAPPC4 and tubulin antibodies. Ponceau staining was used to verify loading of the GST fusion proteins (GST-TBR indicated with arrowhead). The bar chart expresses the relative amount of TRAPPC4 isolated from siTRAPPC8 compared to siRISC Free control cells from three independent experiments, error bars are ± s.e.m. ** p<0.01, unpaired T-testD) HEK293T cells stably depleted of TRAPPC8 (shC8) or not (shCtrl) were transfected with constructs encoding GFP or GFP-TRAPPC3 and subjected to GFP Trap IP. Precipitated proteins were immunoblotted for GFP, TRAPPC4 and TRAPPC8. Bar chart: the amount of TRAPPC4 isolated was normalised to the amount of GFP-TRAPPC3 precipitated from three independent experiments and plotted ± s.e.m., ns = non-significant, unpaired T-test."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "HEK293A", "cells", "treated", "with", "transiently", "transfected", "with", "RISC", "free", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "duplexes", "directed", "against", "TRAPPC8", "and", "RAB11A", "and", "B", "(", "knockdown", "confirmed", "by", "immunoblot", "analysis", ")", "were", "fed", "with", "Alexa", "-", "647", "Transferrin", "for", "15", "minutes", "in", "full", "medium", ",", "and", "the", "fluorescent", "transferrin", "chased", "out", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "At", "the", "end", "of", "the", "time", "course", ",", "cells", "were", "trypsinised", ",", "fixed", "and", "the", "Alexa", "-", "647", "fluorescence", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Results", "are", "plotted", "as", "percentage", "of", "transferrin", "fluorescence", "at", "t", "=", "0", "for", "the", "RISC", "free", "control", "cells", ",", "expressed", "as", "the", "mean", "of", "three", "independent", "experiments", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "B", ")", "Cells", "transiently", "transfected", "with", "RISC", "Free", "control", "siRNA", ",", "or", "siRNA", "duplexes", "directed", "against", "TRAPPC8", "or", "RAB1A", "and", "B", "were", "stained", "for", "the", "cis", "-", "Golgi", "markers", "GM130", "or", "RAB1B", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", "in", "main", "panels", ",", "10", "μm", "in", "inset", "panels", ".", "Bar", "graph", ":", ">", "100", "cells", "per", "siRNA", "were", "scored", "for", "fragmented", "or", "normal", "juxtanuclear", "Golgi", "stacks", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "one", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "C", ")", "HeLa", "C1", "cells", "transiently", "transfected", "with", "RISC", "free", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "duplexes", "directed", "against", "TRAPPC8", "or", "RAB1A", "and", "B", "(", "knockdown", "confirmed", "by", "immunoblot", "analysis", ")", ",", "were", "treated", "with", "D", "/", "D", "solubiliser", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ",", "trypsinised", ",", "fixed", "and", "their", "GFP", "content", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "line", "graph", "shows", "the", "GFP", "fluorescence", "as", "a", "percentage", "of", "t", "=", "0", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) HEK293A cells treated with transiently transfected with RISC free control siRNA or siRNA duplexes directed against TRAPPC8 and RAB11A and B (knockdown confirmed by immunoblot analysis) were fed with Alexa-647 Transferrin for 15 minutes in full medium, and the fluorescent transferrin chased out for the indicated time periods. At the end of the time course, cells were trypsinised, fixed and the Alexa-647 fluorescence analysed by flow cytometry. Results are plotted as percentage of transferrin fluorescence at t=0 for the RISC free control cells, expressed as the mean of three independent experiments ± s.e.m.B) Cells transiently transfected with RISC Free control siRNA, or siRNA duplexes directed against TRAPPC8 or RAB1A and B were stained for the cis-Golgi markers GM130 or RAB1B and analysed by confocal microscopy. Scale bars = 20 μm in main panels, 10 μm in inset panels. Bar graph: > 100 cells per siRNA were scored for fragmented or normal juxtanuclear Golgi stacks from three independent experiments. Error bars ± s.e.m., * p<0.05, ** p<0.01, one way ANOVA with Sidak's multiple comparison test.C) HeLa C1 cells transiently transfected with RISC free control siRNA or siRNA duplexes directed against TRAPPC8 or RAB1A and B (knockdown confirmed by immunoblot analysis), were treated with D/D solubiliser for the indicated time periods, trypsinised, fixed and their GFP content analysed by flow cytometry. The line graph shows the GFP fluorescence as a percentage of t=0, ± s.e.m. from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "ATG9", "positive", "membranes", "were", "immunoisolated", "from", "approximately", "2", "×", "107", "fed", "(", "F", ")", "or", "starved", "(", "S", ")", "HEK293A", "cells", "using", "a", "monoclonal", "hamster", "anti", "-", "ATG9", "(", "ATG9", ")", "or", "control", "hamster", "IgM", "and", "immunoblotted", "for", "ATG9", "using", "a", "rabbit", "polyclonal", "antibody", ",", "TRAPPC8", ",", "TRAPPC4", "and", "actin", ".", "B", ")", "HEK293A", "cells", "transfected", "with", "GFP", "or", "GFP", "-", "TBR", "(", "green", ")", "were", "stained", "for", "ATG9", "using", "hamster", "anti", "-", "ATG9", "(", "red", ")", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μmC", ")", "HEK293A", "cells", "transiently", "transfected", "with", "RISC", "Free", "siRNA", "or", "siRNA", "against", "TRAPPC8", "were", "stained", "for", "RAB1B", "(", "green", ")", "and", "ATG9", "using", "hamster", "anti", "-", "ATG9", "(", "red", ")", "and", "imaged", "using", "confocal", "microscopy", ".", "D", ")", "Stills", "at", "t", "=", "30", "minutes", "from", "time", "lapse", "imaging", "of", "9B9", "cells", "(", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "and", "mRFP", "-", "ATG9", ")", "expressing", "either", "CFP", "or", "CFP", "-", "TBR", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "Inset", "panels", "show", "mRFP", "-", "ATG9", "and", "GFP", "-", "LC3", "contact", "events", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Bar", "chart", "shows", "number", "of", "times", "a", "GFP", "-", "LC3", "spot", "was", "within", "1", "μm", "of", "an", "mRFP", "-", "ATG9", "spot", "(", "a", "contact", "event", ")", ",", "expressed", "as", "total", "mRFP", "-", "ATG9", "contacts", "per", "GFP", "-", "LC3", "spot", ",", "n", "=", "18", "cells", "per", "condition", "pooled", "from", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) ATG9 positive membranes were immunoisolated from approximately 2 × 107 fed (F) or starved (S) HEK293A cells using a monoclonal hamster anti-ATG9 (ATG9) or control hamster IgM and immunoblotted for ATG9 using a rabbit polyclonal antibody, TRAPPC8, TRAPPC4 and actin.B) HEK293A cells transfected with GFP or GFP-TBR (green) were stained for ATG9 using hamster anti-ATG9 (red) and analysed by confocal microscopy. Scale bar = 20 μmC) HEK293A cells transiently transfected with RISC Free siRNA or siRNA against TRAPPC8 were stained for RAB1B (green) and ATG9 using hamster anti-ATG9 (red) and imaged using confocal microscopy.D) Stills at t = 30 minutes from time lapse imaging of 9B9 cells (stably expressing GFP-LC3 and mRFP-ATG9) expressing either CFP or CFP-TBR (blue). Scale bars = 20 μm. Inset panels show mRFP-ATG9 and GFP-LC3 contact events at the indicated time points. Bar chart shows number of times a GFP-LC3 spot was within 1 μm of an mRFP-ATG9 spot (a contact event), expressed as total mRFP-ATG9 contacts per GFP-LC3 spot, n = 18 cells per condition pooled from 4 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "9A", ")", "Cells", "depleted", "of", "ULK1", "(", "siULK1", ")", "or", "not", "(", "RISC", "Free", ")", "were", "transfected", "with", "GFP", "or", "GFP", "-", "TBR", "(", "green", ")", ",", "starved", "(", "EBSS", ")", "or", "not", "(", "-", "EBSS", ")", "and", "stained", "for", "ATG9", "using", "hamster", "anti", "-", "ATG9", "(", "red", ")", ".", "Arrows", "indicate", "transfected", "cells", ".", "Western", "blot", "indicates", "ULK1", "knockdown", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "B", ")", "Cells", "depleted", "of", "ULK1", "(", "siULK1", ")", "or", "not", "(", "RISC", "Free", ")", "were", "transfected", "with", "myc", "-", "RAB1B", "or", "myc", "-", "RAB1B", "(", "S22N", ")", "(", "green", ")", ",", "starved", "(", "EBSS", ")", "or", "not", "(", "-", "EBSS", ")", "and", "stained", "for", "ATG9", "using", "hamster", "anti", "-", "ATG9", "(", "red", ")", "Arrows", "indicate", "transfected", "cells", ".", "Western", "blot", "indicates", "ULK1", "knockdown", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A) Cells depleted of ULK1 (siULK1) or not (RISC Free) were transfected with GFP or GFP-TBR (green), starved (EBSS) or not (-EBSS) and stained for ATG9 using hamster anti-ATG9 (red). Arrows indicate transfected cells. Western blot indicates ULK1 knockdown. Scale bars = 20 μm.B) Cells depleted of ULK1 (siULK1) or not (RISC Free) were transfected with myc-RAB1B or myc-RAB1B (S22N) (green), starved (EBSS) or not (-EBSS) and stained for ATG9 using hamster anti-ATG9 (red) Arrows indicate transfected cells. Western blot indicates ULK1 knockdown. Scale bars = 20 μm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "ParB", "clusters", "on", "F", "plasmid", "in", "vivo", ".", "Typical", "E", ".", "coli", "cells", "(", "DLT3594", ")", "displays", "foci", "of", "ParBF", "-", "mVenus", "protein", "(", "top", ")", "expressed", "from", "the", "endogenous", "genetic", "locus", "of", "the", "F", "plasmid", "(", "F1", "-", "10B", "-", "mVenus", ")", ".", "The", "nucleoid", "is", "labelled", "with", "Hu", "-", "mCherry", "(", "central", ")", ".", "The", "overlay", "(", "bottom", ")", "combines", "the", "two", "fluorescent", "channels", ".", "Over", "99", "%", "of", "cells", "harbor", "ParBF", "foci", ".", "White", "bars", ":", "1", "µm", "(", "C", ")", "ParBF", "binding", "outside", "parSF", "on", "the", "F", "plasmid", "is", "compatible", "with", "a", "power", "-", "law", "decay", ".", "High", "resolution", "ChIP", "-", "seq", "performed", "on", "DLT3586", "carrying", "the", "F", "plasmid", "(", "F1", "-", "10B", ")", ".", "The", "ParB", "density", ",", "normalized", "to", "1", "at", "the", "first", "bp", "downstream", "the", "last", "parSF", "binding", "repeat", "after", "background", "subtraction", ",", "is", "displayed", "over", "14", "-", "Kbp", "on", "the", "right", "side", "of", "parSF", ".", "Monte", "Carlo", "simulations", "and", "analytic", "formula", "are", "represented", "in", "red", "and", "dotted", "black", "lines", ",", "respectively", ".", "MC", "simulations", "were", "performed", "with", "a", "Freely", "-", "Jointed", "Chain", "of", "linear", "length", "L", "=", "15", "-", "Kbp", "and", "a", "cluster", "radius", "σ", "=", "75nm", ".", "The", "two", "other", "parameters", ",", "the", "Kuhn", "length", "a", "=", "10", "-", "bp", "and", "the", "total", "number", "of", "proteins", "on", "the", "F", "plasmid", "Nt", "=", "360", "(", "related", "to", "the", "normalization", "constant", "of", "the", "protein", "concentration", "κ", "=", "0", ".", "41", ")", "were", "fitted", "from", "the", "ChIP", "-", "seq", "data", "(", "see", "text", "and", "Fig", ".", "EV2", ")", ".", "As", "a", "benchmark", "for", "simulations", ",", "the", "analytics", "are", "obtained", "from", "Eq", ".", "(", "1", ")", "with", "the", "same", "parameters", ".", "Inset", ";", "The", "ParBF", "binding", "profile", "(", "black", "line", ")", "is", "represented", "as", "the", "number", "of", "nucleotide", "reads", "over", "80", "-", "Kbp", "centered", "at", "parS", ".", "The", "number", "of", "reads", "in", "the", "Input", "sample", "(", "grey", "line", ")", "is", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "reads", "in", "the", "IP", "sampleTypical", "E", ".", "coli", "cell", "displays", "foc", "expressed", "from", "the", "endogenous", "genetic", "locus", "of", "the", "F", "plasmid", "(", "F1", "-", "10B", "-", "mVenus", ")", ".", "The", "nucleoid", "is", "labelled", "with", "Hu", "-", "mCherry", "(", "central", ")", ".", "The", "overlay", "(", "bottom", ")", "combines", "the", "two", "fluorescent", "channels", "parSF", "inserted", "at", "the", "xylE", "locus", "on", "E", ".", "coli", "chromosome", "from", "DLT358ParBF", "binding", "outside", "parSF", "on", "the", "F", "plasmid", "is", "compatible", "with", "a", "power", "-", "law", "decay", ".", "High", "resolution", "ChIP", "-", "seq", "performed", "on", "DLT3586", "carrying", "the", "F", "plasmid", "(", "F1", "-", "10B", ")", ".", "The", "ParB", "density", ",", "normalized", "to", "1", "at", "the", "first", "bp", "downstream", "the", "last", "parSF", "binding", "repeat", "after", "background", "subtraction", ",", "is", "displayed", "over", "14", "-", "Kbp", "on", "the", "right", "side", "of", "parSF", ".", "Monte", "Carlo", "simulations", "and", "analytic", "formula", "are", "represented", "in", "red", "and", "dotted", "black", "lines", ",", "respectively", ".", "MC", "simulations", "were", "performed", "with", "a", "Freely", "-", "Jointed", "Chain", "of", "linear", "length", "L", "=", "15", "-", "Kbp", "and", "a", "cluster", "radius", "σ", "=", "75nm", ".", "The", "two", "other", "parameters", ",", "the", "Kuhn", "length", "a", "=", "10", "-", "bp", "and", "the", "total", "number", "of", "proteins", "on", "the", "F", "plasmid", "Nt", "=", "360", "(", "related", "to", "the", "normalization", "constant", "of", "the", "protein", "concentration", "κ", "=", "0", ".", "41", ")", "were", "fitted", "from", "the", "ChIP", "-", "seq", "dat", "parSF", "inserted", "at", "the", "xylE", "locus", "on", "E", ".", "coli", "chromosome", "fro"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) ParB clusters on F plasmid in vivo. Typical E. coli cells (DLT3594) displays foci of ParBF-mVenus protein (top) expressed from the endogenous genetic locus of the F plasmid (F1-10B-mVenus). The nucleoid is labelled with Hu-mCherry (central). The overlay (bottom) combines the two fluorescent channels. Over 99 % of cells harbor ParBF foci. White bars: 1 µm(C) ParBF binding outside parSF on the F plasmid is compatible with a power-law decay. High resolution ChIP-seq performed on DLT3586 carrying the F plasmid (F1-10B). The ParB density, normalized to 1 at the first bp downstream the last parSF binding repeat after background subtraction, is displayed over 14-Kbp on the right side of parSF. Monte Carlo simulations and analytic formula are represented in red and dotted black lines, respectively. MC simulations were performed with a Freely-Jointed Chain of linear length L=15-Kbp and a cluster radius σ=75nm. The two other parameters, the Kuhn length a=10-bp and the total number of proteins on the F plasmid Nt=360 (related to the normalization constant of the protein concentration κ=0.41) were fitted from the ChIP-seq data (see text and Fig. EV2). As a benchmark for simulations, the analytics are obtained from Eq.(1) with the same parameters. Inset; The ParBF binding profile (black line) is represented as the number of nucleotide reads over 80-Kbp centered at parS. The number of reads in the Input sample (grey line) is normalized to the total number of reads in the IP sampleTypical E. coli cell displays foc expressed from the endogenous genetic locus of the F plasmid (F1-10B-mVenus). The nucleoid is labelled with Hu-mCherry (central). The overlay (bottom) combines the two fluorescent channels parSF inserted at the xylE locus on E. coli chromosome from DLT358ParBF binding outside parSF on the F plasmid is compatible with a power-law decay. High resolution ChIP-seq performed on DLT3586 carrying the F plasmid (F1-10B). The ParB density, normalized to 1 at the first bp downstream the last parSF binding repeat after background subtraction, is displayed over 14-Kbp on the right side of parSF. Monte Carlo simulations and analytic formula are represented in red and dotted black lines, respectively. MC simulations were performed with a Freely-Jointed Chain of linear length L=15-Kbp and a cluster radius σ=75nm. The two other parameters, the Kuhn length a=10-bp and the total number of proteins on the F plasmid Nt=360 (related to the normalization constant of the protein concentration κ=0.41) were fitted from the ChIP-seq dat parSF inserted at the xylE locus on E. coli chromosome fro DLT207"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Normalized", "and", "rescaled", "ParBF", "binding", "profiles", "at", "different", "ParBF", "/", "parSF", "ratio", ".", "ChIP", "-", "seq", "density", "on", "the", "right", "side", "of", "parSF", "inserted", "at", "xylE", "were", "measured", "in", "DLT2075", "induced", "(", "16", ",", "28", ")", "or", "not", "(", "0", ".", "4", ")", "with", "IPTG", "(", "100", "and", "500", "µM", ")", ",", "or", "carrying", "HCN", "plasmids", "pZC302", "(", "0", ".", "04", ")", "or", "pJYB57", "(", "0", ".", "016", ")", ",", "normalized", "as", "in", "Fig", ".", "1C", ",", "E", "with", "the", "amplitudes", "of", "the", "curves", "rescaled", "by", "the", "indicated", "factors", "(", "1", ".", "2", ",", "10", "or", "50", ")", "to", "overlap", "with", "the", "curves", "of", "highest", "amplitude", ".", "The", "ParB", "/", "parS", "ratio", "is", "calculated", "relative", "to", "the", "one", "of", "F", "plasmid", "as", "determined", "from", "Western", "blot", "analyses", "(", "Appendix", "Fig", ".", "S2B", ")", ".", "Monte", "Carlo", "simulations", "and", "analytical", "formula", "are", "plotted", "with", "the", "same", "parameters", "as", "in", "Fig", ".", "1E", ".", "Note", "(", "i", ")", "that", "the", "dips", "at", "~", "9", "-", "kbp", "are", "not", "visible", "for", "the", "low", "levels", "of", "available", "ParB", "since", "the", "signal", "is", "close", "to", "the", "basal", "level", "and", "(", "ii", ")", "that", "the", "ChIP", "-", "seq", "data", "at", "100", "µM", "IPTG", "induction", "(", "16", ")", "are", "the", "same", "as", "in", "Fig", ".", "1E", ".", "Inset", ";", "Same", "as", "in", "the", "main", "to", "display", "the", "density", "without", "rescaling", ".", "(", "B", ")", "ParBF", "are", "dispersed", "in", "the", "cell", "upon", "titration", "by", "HCN", "plasmids", ".", "ParBF", "-", "mVenus", "expressed", "from", "pJYB294", "were", "imaged", "as", "in", "Fig", ".", "1D", "in", "DLT3577", "(", "left", ")", "and", "DLT3576", "(", "right", ")", "carrying", "pZC302", "and", "pJYB57", ",", "respectively", ".", "The", "number", "of", "extra", "parSF", "per", "cell", ",", "indicated", "on", "top", "of", "each", "raw", ",", "are", "estimated", "from", "the", "copy", "number", "per", "cell", "of", "HCN", "plasmids", "carrying", "10", "specific", "binding", "sites", ".", "White", "bars", ":", "1", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "size", "of", "ParBF", "clusters", "is", "independent", "of", "the", "intracellular", "ParBF", "concentration", ".", "We", "considered", "two", "possible", "evolutions", "of", "the", "cluster", "size", "upon", "variations", "of", "ParB", "amount", "in", "the", "framework", "of", "\"", "Nucleation", "&", "caging", "\"", "with", "corresponding", "schematics", "drawn", "on", "the", "right", ".", "For", "direct", "comparison", "with", "(", "A", ")", ",", "all", "curves", "are", "displayed", "with", "a", "rescaling", "of", "the", "amplitude", "corresponding", "to", "the", "WT", "expression", "level", ".", "Top", ":", "constant", "ParB", "concentration", ";", "supposing", "that", "clusters", "are", "compact", ",", "the", "cluster", "radius", "σ", "would", "depend", "on", "the", "number", "m", "of", "ParB", "like", "$", "\\", "\\", "sigma", "=", "m", "^", "{", "\\", "frac", "{", "1", "}", "{", "3", "}", "}", "$", ".", "Predictions", "profiles", ",", "plotted", "at", "different", "ratio", "of", "ParB", "/", "parS", ",", "vary", "within", "the", "range", "of", "the", "experimental", "levels", "tested", ".", "Bottom", ":", "constant", "cluster", "size", ";", "ParB", "concentrations", "vary", "but", "the", "range", "of", "exploration", "remains", "the", "same", "resulting", "in"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Normalized and rescaled ParBF binding profiles at different ParBF/parSF ratio. ChIP-seq density on the right side of parSF inserted at xylE were measured in DLT2075 induced (16, 28) or not (0.4) with IPTG (100 and 500 µM), or carrying HCN plasmids pZC302 (0.04) or pJYB57 (0.016), normalized as in Fig. 1C, E with the amplitudes of the curves rescaled by the indicated factors (1.2, 10 or 50) to overlap with the curves of highest amplitude. The ParB/parS ratio is calculated relative to the one of F plasmid as determined from Western blot analyses (Appendix Fig. S2B). Monte Carlo simulations and analytical formula are plotted with the same parameters as in Fig. 1E. Note (i) that the dips at ~9-kbp are not visible for the low levels of available ParB since the signal is close to the basal level and (ii) that the ChIP-seq data at 100 µM IPTG induction (16) are the same as in Fig. 1E. Inset; Same as in the main to display the density without rescaling. (B) ParBF are dispersed in the cell upon titration by HCN plasmids. ParBF-mVenus expressed from pJYB294 were imaged as in Fig. 1D in DLT3577 (left) and DLT3576 (right) carrying pZC302 and pJYB57, respectively. The number of extra parSF per cell, indicated on top of each raw, are estimated from the copy number per cell of HCN plasmids carrying 10 specific binding sites. White bars: 1 µm. (C) The size of ParBF clusters is independent of the intracellular ParBF concentration. We considered two possible evolutions of the cluster size upon variations of ParB amount in the framework of \"Nucleation & caging\" with corresponding schematics drawn on the right. For direct comparison with (A), all curves are displayed with a rescaling of the amplitude corresponding to the WT expression level. Top: constant ParB concentration; supposing that clusters are compact, the cluster radius σ would depend on the number m of ParB like$\\ \\sigma = m^{\\frac{1}{3}}$. Predictions profiles, plotted at different ratio of ParB/parS, vary within the range of the experimental levels tested. Bottom: constant cluster size; ParB concentrations vary but the range of exploration remains the same resulting in overlappin"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "The", "formation", "of", "secondary", "ParBF", "-", "DNA", "complexes", "requires", "the", "box", "II", "motif", ".", "EMSA", "were", "performed", "with", "a", "144", "-", "bp", "32P", "-", "labelled", "DNA", "fragments", "(", "C144", ")", "carrying", "a", "single", "16", "-", "bp", "parS", "binding", "motif", ".", "Reaction", "mixtures", "containing", "100", "µg", ".", "ml", "-", "1", "sonicated", "salmon", "sperm", "DNA", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "the", "presence", "of", "increasing", "concentrations", "(", "grey", "triangle", ";", "10", ",", "30", ",", "100", ",", "300", ",", "and", "1000", "nM", ")", "of", "ParBF", "or", "ParBF", "-", "3R", "*", ".", "Positions", "of", "free", "and", "bound", "probes", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "B1", "represents", "complexes", "involving", "the", "specific", "interaction", "on", "the", "16", "-", "bp", "binding", "site", ",", "while", "B", "\"", "2", "and", "B", "\"", "3", "complexes", "represent", "secondary", "complexes", "involving", "the", "parSF", "site", "with", "one", "or", "two", "additional", "nsDNA", "-", "binding", "interactions", ",", "respectively", "(", "Sanchez", "et", "al", ",", "(", "B", ")", "ParBF", "cluster", "formation", "requires", "the", "box", "II", "motif", ".", "Epifluorescence", "microscopy", "of", "ParBF", "-", "3R", "*", "-", "mVenus", "from", "DLT3566", "is", "displayed", "as", "in", "Fig", ".", "1D", ".", "White", "bars", ":", "1", "µm", "(", "C", ")", "ParBF", "in", "vivo", "DNA", "binding", "in", "the", "vicinity", "of", "parSF", "sites", "requires", "the", "box", "II", "motif", ".", "ChIP", "-", "seq", "was", "performed", "on", "DLT3726", "carrying", "parSF", "in", "the", "xylE", "chromosomal", "locus", "and", "expressing", "ParBF", "-", "3R", "*", "variant", ".", "ParBF", "-", "3R", "*", "DNA", "binding", "profile", "displayed", "the", "number", "of", "nucleotide", "reads", "as", "a", "function", "of", "the", "E", ".", "coli", "genomic", "coordinates", ".", "The", "peak", "at", "parSF", "covered", "approximately", "950", "-", "bp", ",", "which", "corresponds", "to", "the", "402", "-", "bp", "between", "the", "1st", "and", "10th", "specific", "binding", "sites", "and", "~", "280", "-", "bp", "on", "each", "sides", "(", "representing", "the", "average", "size", "of", "the", "DNA", "library", ";", "see", "Appendix", "Fig", ".", "S3E", ")", ".", "No", "ParBF", "-", "3R", "*", "enrichment", "was", "found", "on", "parSF", "-", "flanking", "DNA", "and", "elsewhere", "on", "the", "chromosome", ".", "Inset", ",", "zoom", "in", "on", "the", "right", "side", "of", "parSF", "over", "5", "-", "Kbp", "with", "the", "ParB", "density", ",", "normalized", "to", "1", "at", "the", "first", "bp", "after", "the", "last", "parS", "binding", "repeat", ",", "plotted", "as", "a", "function", "of", "the", "distance", "from", "parSF", ".", "Note", "that", "a", "highly", "similar", "DNA", "binding", "pattern", "is", "obtained", "with", "ParBF", "-", "3R", "*", "-", "mVenus", "(", "strain", "DLT3566", ";", "Appendix", "Fig", ".", "S3C", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) The formation of secondary ParBF-DNA complexes requires the box II motif. EMSA were performed with a 144-bp 32P-labelled DNA fragments (C144) carrying a single 16-bp parS binding motif. Reaction mixtures containing 100 µg.ml-1 sonicated salmon sperm DNA were incubated in the absence (-) or the presence of increasing concentrations (grey triangle; 10, 30, 100, 300, and 1000 nM) of ParBF or ParBF-3R*. Positions of free and bound probes are indicated on the left. B1 represents complexes involving the specific interaction on the 16-bp binding site, while B\"2 and B\"3 complexes represent secondary complexes involving the parSF site with one or two additional nsDNA-binding interactions, respectively (Sanchez et al,(B) ParBF cluster formation requires the box II motif. Epifluorescence microscopy of ParBF-3R*-mVenus from DLT3566 is displayed as in Fig. 1D. White bars: 1 µm(C) ParBF in vivo DNA binding in the vicinity of parSF sites requires the box II motif. ChIP-seq was performed on DLT3726 carrying parSF in the xylE chromosomal locus and expressing ParBF-3R* variant. ParBF-3R* DNA binding profile displayed the number of nucleotide reads as a function of the E. coli genomic coordinates. The peak at parSF covered approximately 950-bp, which corresponds to the 402-bp between the 1st and 10th specific binding sites and ~280-bp on each sides (representing the average size of the DNA library; see Appendix Fig. S3E). No ParBF-3R* enrichment was found on parSF-flanking DNA and elsewhere on the chromosome. Inset, zoom in on the right side of parSF over 5-Kbp with the ParB density, normalized to 1 at the first bp after the last parS binding repeat, plotted as a function of the distance from parSF. Note that a highly similar DNA binding pattern is obtained with ParBF -3R*-mVenus (strain DLT3566; Appendix Fig. S3C)"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Schematic", "representation", "of", "the", "genomic", "locus", "of", "the", "chromosome", "1", "of", "V", ".", "cholerae", "with", "the", "three", "parS", "sites", ",", "named", "parS1", "-", "3", ".", "The", "rRNA", "operon", "(", "blue", "rectangle", ")", "spans", "the", "genomic", "coordinates", "53823", "to", "59123", "(", "B", ")", "ChIP", "-", "seq", "performed", "on", "strain", "N16961", "is", "displayed", "as", "the", "number", "of", "nucleotide", "reads", "in", "function", "of", "the", "genomic", "coordinates", ".", "Correspondence", "to", "the", "parS1", "-", "3", "location", "represented", "in", "(", "A", ")", "is", "indicated", "by", "grey", "dotted", "lines", ".", "The", "number", "of", "reads", "in", "the", "Input", "sample", "(", "grey", "line", ")", "is", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "reads", "in", "the", "IP", "sample", ".", "(", "C", ")", "We", "modeled", "the", "ChIP", "-", "Seq", "data", "as", "in", "Fig", ".", "1C", "-", "E", "by", "means", "of", "MC", "simulations", "with", "a", "Freely", "jointed", "chain", "of", "size", "N", "=", "2000", "monomers", "of", "size", "a", "=", "16", "-", "bp", ".", "Data", "are", "normalized", "after", "background", "subtraction", "to", "the", "read", "value", "at", "parS1", "(", "genomic", "coordinate", "62438", ")", ".", "The", "best", "fit", "was", "achieved", "with", "σ", "=", "25nm", "and", "an", "amplitude", "κ", "=", "0", ".", "15", "leading", "to", "Nt", "~", "50", "ParB", "on", "the", "chromosome", ".", "In", "the", "MC", "simulation", ",", "we", "accounted", "for", "the", "finite", "width", "of", "the", "distribution", "around", "parS", "sites", "by", "including", "the", "average", "fragment", "size", "of", "the", "DNA"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Schematic representation of the genomic locus of the chromosome 1 of V. cholerae with the three parS sites, named parS1-3. The rRNA operon (blue rectangle) spans the genomic coordinates 53823 to 59123 (B) ChIP-seq performed on strain N16961 is displayed as the number of nucleotide reads in function of the genomic coordinates. Correspondence to the parS1-3 location represented in (A) is indicated by grey dotted lines. The number of reads in the Input sample (grey line) is normalized to the total number of reads in the IP sample. (C) We modeled the ChIP-Seq data as in Fig.1C-E by means of MC simulations with a Freely jointed chain of size N=2000 monomers of size a=16-bp. Data are normalized after background subtraction to the read value at parS1 (genomic coordinate 62438). The best fit was achieved with σ=25nm and an amplitude κ=0.15 leading to Nt~50 ParB on the chromosome. In the MC simulation, we accounted for the finite width of the distribution around parS sites by including the average fragment size of the DNA librar"}
{"words": ["Figure", "5ChIP", "-", "sequencing", "assays", "were", "performed", "on", "DLT2075", "(", "xylE", ":", ":", "parSF", ")", "expressing", "ParBF", "grown", "in", "exponential", "(", "expo", ")", "or", "stationary", "(", "stat", ")", "phases", "with", "addition", "of", "rifampicin", "when", "indicated", "(", "+", "Rif", ")", ".", "The", "assays", "have", "been", "performed", "in", "duplicate", "for", "the", "+", "Rif", "and", "once", "for", "the", "stationary", "phase", "experiments", ".", "(", "A", ")", "ParBF", "DNA", "binding", "around", "parSF", "is", "independent", "of", "active", "transcription", ".", "The", "color", "-", "coded", "ParBF", "profiles", "are", "represented", "over", "50", "-", "Kbp", "as", "the", "relative", "ParB", "density", "normalized", "to", "1", "at", "the", "first", "bp", "after", "the", "last", "parSF", "binding", "site", ".", "Loci", "A", ",", "C", ",", "E", "and", "F", "are", "defined", "in", "Appendix", "Fig", ".", "S1A", ".", "(", "B", ")", "The", "dips", "and", "peaks", "are", "highly", "similar", "in", "the", "three", "indicated", "conditions", ".", "Same", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "zoom", "in", "on", "the", "right", "side", "of", "parSF", "up", "to", "9", "-", "Kpb", "and", "normalization", "to", "1", "at", "genomic", "coordinate", "230", ".", "The", "dotted", "line", "corresponds", "to", "the", "analytics", "description", "of", "\"", "Nucleation", "and", "caging", "\"", "(", "see", "details", "in", "Fig", ".", "1C", "-", "E", ")", ".", "(", "C", ")", "ParBF", "binding", "profile", "upstream", "of", "the", "locus", "A", ".", "Same", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "zoom", "in", "from", "-", "6", ".", "5", "to", "-", "16", ".", "5", "-", "Kbp", "by", "normalization", "to", "1", "at", "genomic", "coordinate", "-", "6", ".", "5", "-", "Kbp", "(", "upstream", "of", "the", "dip", "at", "the", "locus", "A", ")", ".", "The", "ParBF", "DNA", "binding", "profile", "remains", "compatible", "to", "a", "power", "-", "law", ",", "represented", "by", "the", "analytics", "description", "(", "dotted", "line", ")", ",", "upstream", "of", "the", "locus", "A", "in", "stationary", "phase", "(", "black", ")", "and", "in", "exponential", "phase", "(", "blue", ")", ".", "Also", ",", "the", "dips", "and", "peaks", "are", "highly", "similar", "in", "both", "conditions", ".", "These", "data", "are", "not", "in", "favor", "of", "the", "\"", "1D", "-", "spreading", "\"", "or", "the", "\"", "Spreading", "and", "bridging", "\"", "models", "that", "predicts", "a", "basal", "uniform", "distribution", "or", "a", "linear", "decrease", "after", "a", "barrier", ",", "respectively", "(", "Broedersz", "et", "al", ",", "2014", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "promoter", "region", "at", "locus", "A", "prevents", "ParBF", "DNA", "binding", ".", "Chip", "-", "seq", "assays", "were", "performed", "in", "isogenic", "xylE", ":", ":", "parSF", "strains", "(", "DLT2075", ";", "black", "curve", ")", "in", "which", "the", "locus", "A", "is", "replaced", "by", "a", "kanamycin", "gene", "(", "DLT3651", ";", "red", "curve", ")", ".", "The", "assay", "in", "the", "∆", "(", "locus", "A", ")", "genomic", "context", "has", "been", "performed", "once", ".", "The", "relative", "ParB", "density", "as", "a", "function", "of", "the", "distance", "from", "parSF"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5ChIP-sequencing assays were performed on DLT2075 (xylE::parSF) expressing ParBF grown in exponential (expo) or stationary (stat) phases with addition of rifampicin when indicated (+Rif). The assays have been performed in duplicate for the +Rif and once for the stationary phase experiments. (A) ParBF DNA binding around parSF is independent of active transcription. The color-coded ParBF profiles are represented over 50-Kbp as the relative ParB density normalized to 1 at the first bp after the last parSF binding site. Loci A, C, E and F are defined in Appendix Fig. S1A. (B) The dips and peaks are highly similar in the three indicated conditions. Same as in (A) with zoom in on the right side of parSF up to 9-Kpb and normalization to 1 at genomic coordinate 230. The dotted line corresponds to the analytics description of \"Nucleation and caging\" (see details in Fig. 1C-E). (C) ParBF binding profile upstream of the locus A. Same as in (A) with zoom in from -6.5 to -16.5-Kbp by normalization to 1 at genomic coordinate -6.5-Kbp (upstream of the dip at the locus A). The ParBF DNA binding profile remains compatible to a power-law, represented by the analytics description (dotted line), upstream of the locus A in stationary phase (black) and in exponential phase (blue). Also, the dips and peaks are highly similar in both conditions. These data are not in favor of the \"1D-spreading\" or the \"Spreading and bridging\" models that predicts a basal uniform distribution or a linear decrease after a barrier, respectively (Broedersz et al, 2014). (D) The promoter region at locus A prevents ParBF DNA binding. Chip-seq assays were performed in isogenic xylE::parSF strains (DLT2075; black curve) in which the locus A is replaced by a kanamycin gene (DLT3651; red curve). The assay in the ∆(locus A) genomic context has been performed once. The relative ParB density as a function of the distance from parSF is"}
{"words": ["Figure", "6ParBF", "exchange", "between", "foci", "was", "measured", "by", "FRAP", "an", "from", "two", "-", "foci", "cell", "of", "DLT1215", "carrying", "pJYB234", "A", "-", "Representative", "images", "of", "a", "photobleached", "cell", "during", "a", "FRAP", "experiment", ".", "The", "488", "nm", "laser", "was", "pulsed", "(", "Bleach", ")", "on", "one", "of", "the", "two", "foci", "at", "~", "2", ".", "4", "sec", "(", "black", "arrow", ")", ".", "Red", "and", "blue", "arrows", "correspond", "to", "the", "bleached", "and", "unbleached", "focus", ",", "respectively", ".", "Time", "is", "indicated", "in", "second", "(", "upper", "right", ")", ".", "The", "cell", "outline", "is", "drawn", "in", "red", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "μmParBF", "exchange", "between", "foci", "was", "measured", "by", "FRAP", "and", "FLIM", "(", "fluorescence", "lifetime", "imaging", "microscopy", ")", "from", "two", "-", "foci", "cell", "of", "DLT1215", "carrying", "pJYB234", "B", "-", "Quantification", "of", "ParBF", "-", "mVenus", "fluorescence", "intensity", "over", "time", ".", "The", "dynamics", "of", "fluorescence", "intensity", "is", "shown", "from", "averaging", "18", "independent", "measurements", "of", "the", "bleached", "(", "FRAP", ",", "red", "line", ")", "and", "unbleached", "(", "FLIM", ",", "blue", "line", ")", "foci", ".", "Foci", "fluorescence", "intensity", "in", "each", "experiment", "was", "normalized", "to", "the", "average", "intensity", "of", "each", "focus", "before"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6ParBF exchange between foci was measured by FRAP an from two-foci cell of DLT1215 carrying pJYB234 A- Representative images of a photobleached cell during a FRAP experiment. The 488 nm laser was pulsed (Bleach) on one of the two foci at ~2.4 sec (black arrow). Red and blue arrows correspond to the bleached and unbleached focus, respectively. Time is indicated in second (upper right). The cell outline is drawn in red. Scale bar: 1 μmParBF exchange between foci was measured by FRAP and FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) from two-foci cell of DLT1215 carrying pJYB234 B- Quantification of ParBF-mVenus fluorescence intensity over time. The dynamics of fluorescence intensity is shown from averaging 18 independent measurements of the bleached (FRAP, red line) and unbleached (FLIM, blue line) foci. Foci fluorescence intensity in each experiment was normalized to the average intensity of each focus before photobleaching"}
{"words": ["Figure", "1Human", "DCs", "were", "incubated", "with", "a", "non", "-", "cytolytic", "dose", "(", "0", ".", "2", "μg", "/", "ml", ")", "of", "purified", "PLY", "for", "45", "min", ".", "Immunofluorescence", "staining", "shows", "that", "PLY", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "MRC", "-", "1", "in", "DCs", "and", "EEA", "-", "1", "(", "purple", ",", "early", "endosomes", ")", ".", "All", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Human", "DCs", "were", "incubated", "with", "a", "non", "-", "cytolytic", "dose", "(", "0", ".", "2", "μg", "/", "ml", ")", "of", "purified", "LLO", "for", "45", "min", ".", "Immunofluorescence", "staining", "shows", "that", "LLO", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "MRC", "-", "1", "(", "red", ")", "in", "DCs", "and", "EEA", "-", "1", "(", "purple", ",", "early", "endosomes", ")", ".", "All", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Human", "DCs", "were", "incubated", "with", "a", "non", "-", "cytolytic", "dose", "(", "0", ".", "2", "μg", "/", "ml", ")", "of", "purified", "SLO", "for", "45", "min", ".", "Immunofluorescence", "staining", "shows", "that", "SLO", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "MRC", "-", "1", "(", "red", ")", "in", "DCs", "and", "EEA", "-", "1", "(", "purple", ",", "early", "endosomes", ")", ".", "All", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Human DCs were incubated with a non-cytolytic dose (0.2 μg/ml) of purified PLY for 45 min. Immunofluorescence staining shows that PLY (green) co-localize with MRC-1 in DCs and EEA-1 (purple, early endosomes). All scale bars, 5 μm. Images are representative of three independent experiments.Human DCs were incubated with a non-cytolytic dose (0.2 μg/ml) of purified LLO for 45 min. Immunofluorescence staining shows that LLO (green) co-localize with MRC-1 (red) in DCs and EEA-1 (purple, early endosomes). All scale bars, 5 μm. Images are representative of three independent experiments.Human DCs were incubated with a non-cytolytic dose (0.2 μg/ml) of purified SLO for 45 min. Immunofluorescence staining shows that SLO (green) co-localize with MRC-1 (red) in DCs and EEA-1 (purple, early endosomes). All scale bars, 5 μm. Images are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "ELISA", "showing", "the", "dose", "-", "dependent", "binding", "of", "plate", "-", "bound", "MRC", "-", "1", "peptides", "P2", ",", "P3", ",", "and", "the", "control", "peptides", "CP1", "and", "CP2", "to", "PLY", "(", "0", "-", "0", ".", "5", "μM", ")", ".", "BSA", "was", "used", "as", "negative", "control", "to", "show", "the", "binding", "specificity", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "each", "containing", "three", "replicates", "per", "condition", ".", "(", "B", ")", "Hemolysis", "assay", "(", "n", "=", "4", ")", "of", "1", "μg", "/", "ml", "purified", "PLY", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "concentrations", "of", "MRC", "-", "1", "peptides", ",", "P2", ",", "scrambled", "P2", ",", "P3", "and", "control", "peptide", "CP2", "(", "1", "-", "1000", "μM", ")", ".", "Data", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "C", ")", "LDH", "cytotoxicity", "assay", "in", "human", "THP", "-", "1", "macrophages", "stimulated", "with", "purified", "PLY", ",", "LLO", "or", "SLO", "(", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "peptides", "P2", ",", "scrambled", "P2", ",", "P3", "or", "control", "peptide", "CP2", "for", "18", "h", ".", "Cholesterol", "(", "100", "μM", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", "to", "inhibit", "hemolysis", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "D", ")", "Binding", "of", "FITC", "-", "labelled", "peptides", "P2", "and", "CP2", "to", "wild", "-", "type", "pneumococci", ",", "TIGR4", "(", "T4", ")", "and", "isogenic", "PLY", "mutant", "(", "T4Δply", ")", "was", "visualized", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "In", "magnified", "images", ",", "scale", "bars", ",", "1", "μm", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "The", "hemolytic", "activity", "of", "wild", "-", "type", "pneumococci", ",", "TIGR4", "(", "T4", ")", "and", "PLY", "mutant", ",", "T4Δply", "in", "the", "presence", "of", "100", "μM", "peptide", "P2", "and", "CP2", ".", "Data", "are", "the", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) ELISA showing the dose-dependent binding of plate-bound MRC-1 peptides P2, P3, and the control peptides CP1 and CP2 to PLY (0-0.5 μM). BSA was used as negative control to show the binding specificity. Data are mean ± s.e.m. of two independent experiments, each containing three replicates per condition.(B) Hemolysis assay (n=4) of 1 μg/ml purified PLY in the presence of increasing concentrations of MRC-1 peptides, P2, scrambled P2, P3 and control peptide CP2(1-1000 μM). Data represent mean ± s.e.m. * denotes P < 0.05 by one-way ANOVA with Dunnett's post hoc test for multiple comparisons. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(C) LDH cytotoxicity assay in human THP-1 macrophages stimulated with purified PLY, LLO or SLO (0.5 μg/ml) in the presence or absence of 100 μM peptides P2, scrambled P2, P3 or control peptide CP2 for 18 h. Cholesterol (100 μM) was used as positive control to inhibit hemolysis. Data are mean ± s.e.m from 4 independent experiments. **** denotes P< 0.0001 by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(D) Binding of FITC-labelled peptides P2 and CP2 to wild-type pneumococci, TIGR4 (T4) and isogenic PLY mutant (T4Δply) was visualized by fluorescence microscopy. Scale bars, 10 μm. In magnified images, scale bars, 1 μm. Images are representative of three independent experiments.(E) The hemolytic activity of wild-type pneumococci, TIGR4 (T4) and PLY mutant, T4Δply in the presence of 100 μM peptide P2 and CP2. Data are the mean ± s.e.m. of three independent experiments. *** denotes P < 0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "IL", "-", "8", "released", "by", "human", "THP", "-", "1", "macrophages", "stimulated", "with", "purified", "PLY", ",", "LLO", "or", "SLO", "(", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "peptides", "P2", ",", "P3", "or", "control", "peptide", "CP2", "for", "18", "h", ".", "Cholesterol", "(", "100", "μM", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", "to", "inhibit", "hemolysis", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "C", ")", "3D", "volume", "images", "of", "the", "GFP", "-", "lung", "epithelial", "models", "at", "1", "h", "and", "3", "h", "post", "stimulation", "with", "1", "μg", "/", "ml", "PLY", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "peptide", "P2", "or", "the", "control", "peptide", "CP2", ".", "Images", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "with", "n", "=", "3", "models", "/", "condition", ".", "(", "D", ")", "Invasion", "of", "wild", "-", "type", "pneumococci", "T4", "(", "TIGR4", ")", "or", "its", "isogenic", "PLY", "mutant", "T4Δply", "into", "the", "lung", "epithelial", "models", "(", "n", "=", "3", "/", "condition", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "peptide", "P2", "or", "the", "control", "peptide", "CP2", "at", "2h", "post", "infection", "was", "measured", "using", "CFU", "viability", "assay", "following", "gentamicin", "killing", "of", "extracellular", "bacteria", ".", "Anti", "-", "PLY", "was", "used", "as", "control", "to", "test", "the", "effect", "of", "blocking", "PLY", ".", "Data", "in", "d", "and", "e", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "n", "=", "3", "models", "/", "condition", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "%", "bacterial", "entry", "=", "(", "bacteria", "uptaken", "/", "input", ")", "x100", ".", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "E", ")", "Human", "DCs", "were", "infected", "with", "type", "4", "and", "type", "2", "pneumococci", ",", "T4", "and", "D39", ",", "respectively", ",", "at", "MOI", "of", "10", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "peptides", ",", "P2", "or", "CP2", ",", "and", "intracellular", "bacteria", "were", "counted", "at", "3", "h", "post", "infection", "following", "gentamicin", "killing", "of", "extracellular", "bacteria", ".", "Cytochalasin", "D", "(", "0", ".", "5", "mM", ")", "was", "used", "as", "negative", "control", "to", "inhibit", "phagocytosis", ".", "Anti", "-", "PLY", "was", "used", "as", "control", "to", "test", "the", "effect", "of", "blocking", "PLY", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "F", ")", "DCs", "were", "infected", "with", "the", "unencapsulated", "pneumococcal", "strain", "T4R", "in", "the", "presence", "of", "100", "μM", "peptides", ",", "P2", "or", "CP2", "at", "MOI", "of", "10", "for", "2", "h", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "images", "show", "that", "in", "DCs", "treated", "with", "peptide", "P2", "(", "but", "not", "the", "control", "peptide", "CP2", ")", ",", "intracellular", "T4R", "(", "green", ")", "do", "not", "co", "-", "localize", "with", "MRC", "-", "1", "(", "red", ")", ",", "but", "with", "the", "autophagy", "protein", "LC3B", "(", "cyan", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "In", "magnified", "images", ",", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Arrows", "indicate", "regions", "of", "co", "-", "localization", "of", "intracellular", "T4R", "with", "MRC", "-", "1", "and", "LC3B", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "intracellular", "S", ".", "pneumoniae", "(", "n", "=", "50", ")", "in", "infected", "DCs", "that", "co", "-", "localize", "with", "MRC", "-", "1", "and", "LC3B", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) IL-8 released by human THP-1 macrophages stimulated with purified PLY, LLO or SLO (0.5 μg/ml) in the presence or absence of 100 μM peptides P2, P3 or control peptide CP2 for 18 h. Cholesterol (100 μM) was used as positive control to inhibit hemolysis. Data are mean ± s.e.m from three independent experiments. **** denotes P< 0.0001 by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(C) 3D volume images of the GFP-lung epithelial models at 1 h and 3 h post stimulation with 1 μg/ml PLY in the presence or absence of 100 μM peptide P2 or the control peptide CP2. Images are representative of two independent experiments with n=3 models/condition.(D) Invasion of wild-type pneumococci T4 (TIGR4) or its isogenic PLY mutant T4Δply into the lung epithelial models (n=3/condition) in the presence or absence of 100 μM peptide P2 or the control peptide CP2 at 2h post infection was measured using CFU viability assay following gentamicin killing of extracellular bacteria. Anti-PLY was used as control to test the effect of blocking PLY. Data in d and e are mean ± s.e.m. of n=3 models/condition from two independent experiments. % bacterial entry = (bacteria uptaken/input) x100. ** denotes P < 0.01 by one-way ANOVA with Dunnett's post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(E) Human DCs were infected with type 4 and type 2 pneumococci, T4 and D39, respectively, at MOI of 10 in the presence or absence of 100 μM peptides, P2 or CP2, and intracellular bacteria were counted at 3 h post infection following gentamicin killing of extracellular bacteria. Cytochalasin D (0.5 mM) was used as negative control to inhibit phagocytosis. Anti-PLY was used as control to test the effect of blocking PLY. Data are mean ± s.e.m. of three independent experiments. **** denotes P < 0.0001 by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(F) DCs were infected with the unencapsulated pneumococcal strain T4R in the presence of 100 μM peptides, P2 or CP2 at MOI of 10 for 2 h. Immunofluorescence microscopy images show that in DCs treated with peptide P2 (but not the control peptide CP2), intracellular T4R (green) do not co-localize with MRC-1 (red), but with the autophagy protein LC3B (cyan). Images are representative of three independent experiments. Scale bars, 10 μm. In magnified images, scale bars, 5 μm. Arrows indicate regions of co-localization of intracellular T4R with MRC-1 and LC3B. (G) Quantification of percentage of intracellular S. pneumoniae (n=50) in infected DCs that co-localize with MRC-1 and LC3B. Data are mean±s.e.m from two independent experiments. **** denotes P <0.0001 by two-way ANOVA with Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. P values are shown in Appendix Table S4. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Survival", "percentage", "of", "3", "-", "4", "dpf", "zebrafish", "embryos", "(", "n", "≥", "156", ")", "upon", "infection", "with", "S", ".", "pneumoniae", "T4", "alone", "or", "its", "isogenic", "PLY", "mutant", ",", "T4Δply", ".", "Injection", "with", "E3", "growth", "medium", "served", "as", "mock", "control", ".", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0005", "and", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Mantel", "Cox", "test", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "B", ")", "Zebrafish", "survival", "percentage", "upon", "infection", "with", "T4", "alone", "or", "together", "with", "peptide", "P2", "or", "CP2", "or", "P2", "-", "conjugated", "CaP", "NPs", "(", "P2", "-", "NPs", ")", ".", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0005", "and", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Mantel", "Cox", "test", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "(", "C", ")", "Survival", "of", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "upon", "intranasal", "infection", "with", "2x106", "CFU", "of", "S", ".", "pneumoniae", "T4", "together", "with", "peptide", "P2", "or", "CP2", "or", "P2", "-", "NPs", "over", "3", "days", "post", "infection", ".", "Infected", "mice", "were", "checked", "twice", "daily", "in", "the", "morning", "at", "9", "am", "(", "early", "check", ")", "and", "in", "evening", "at", "7", "pm", "(", "late", "check", ")", "for", "clinical", "symptoms", ".", "Unloaded", "NPs", "and", "the", "isogenic", "PLY", "mutant", "strain", "(", "T4Δply", ")", "served", "as", "negative", "controls", ".", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "005", "by", "Mantel", "Cox", "test", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "Bacterial", "load", "in", "the", "lungs", "of", "infected", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "were", "measured", "post", "sacrifice", ".", "Data", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "levels", "of", "pro", "-", "inflammatory", "cytokines", "TNF", "-", "α", "in", "the", "lungs", "of", "infected", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "were", "measured", "post", "sacrifice", ".", "Data", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", ".", "levels", "of", "pro", "-", "inflammatory", "cytokines", "IL", "-", "12", "in", "the", "lungs", "of", "infected", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", "were", "measured", "post", "sacrifice", ".", "Data", "represent", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", "denotes", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Survival percentage of 3-4 dpf zebrafish embryos (n ≥156) upon infection with S. pneumoniae T4 alone or its isogenic PLY mutant, T4Δply. Injection with E3 growth medium served as mock control. *** denotes P < 0.0005 and **** denotes P < 0.0001 by Mantel Cox test. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(B) Zebrafish survival percentage upon infection with T4 alone or together with peptide P2 or CP2 or P2-conjugated CaP NPs (P2-NPs). *** denotes P < 0.0005 and **** denotes P < 0.0001 by Mantel Cox test. Exact P values are shown in Appendix Table S4.(C) Survival of mice (n=10) upon intranasal infection with 2x106 CFU of S. pneumoniae T4 together with peptide P2 or CP2 or P2-NPs over 3 days post infection. Infected mice were checked twice daily in the morning at 9 am (early check) and in evening at 7 pm (late check) for clinical symptoms. Unloaded NPs and the isogenic PLY mutant strain (T4Δply) served as negative controls. * denotes P < 0.05 and ** denotes P < 0.005 by Mantel Cox test. Exact P values are shown in Appendix Table S4.Bacterial load in the lungs of infected mice (n=10) were measured post sacrifice. Data represent mean ± s.e.m. * denotes P < 0.05, ** denotes P < 0.01 and **** denotes P <0.0001 by one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α in the lungs of infected mice (n=10) were measured post sacrifice. Data represent mean ± s.e.m. * denotes P < 0.05, ** denotes P < 0.01 and **** denotes P <0.0001 by one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4.levels of pro-inflammatory cytokines IL-12 in the lungs of infected mice (n=10) were measured post sacrifice. Data represent mean ± s.e.m. * denotes P < 0.05, ** denotes P < 0.01 and **** denotes P <0.0001 by one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test for multiple comparisons. n.s. denotes not significant. Exact P values are shown in Appendix Table S4."}
{"words": ["Figure", "1C", "-", "E", ".", "Luciferase", "reporter", "assay", "in", "HeLa", "cells", "using", "the", "synthetic", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", "in", "combination", "with", "the", "wild", "type", "(", "C", ")", "or", "the", "mutant", "3", "'", "UTR", "of", "TRF2", "construct", "(", "D", ")", "or", "the", "wild", "type", "3", "'", "UTR", "of", "TRF1", "(", "E", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "F", ",", "G", ".", "Western", "blotting", "for", "TRF2", "expression", "in", "Telomerase", "Positive", "(", "HeLa", ",", "HCT116", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "231", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "436", ")", "and", "ALT", "positive", "(", "U2", "-", "OS", ",", "Saos", "-", "2", ")", "cells", "transiently", "transfected", "with", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "Upper", "panel", "shows", "the", "quantification", "of", "TRF2", "expression", ".", "Bottom", "panel", ",", "representative", "images", "are", "shown", ",", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "H", ".", "U2", "-", "OS", "cells", "transiently", "transfected", "with", "the", "miR", "-", "Control", ",", "miR", "-", "182", "-", "3p", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", "inhibitor", "were", "assayed", "by", "quantitative", "immunofluorescence", "for", "TRF2", "three", "days", "post", "-", "transfection", ".", "Left", "panel", ",", "representative", "images", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "TRF2", "fluorescence", "intensity", ".", "a", ".", "f", ".", "u", ".", "arbitrary", "fluorescence", "units", ".", "N", "=", "number", "of", "analysed", "nuclei", ".", "Red", "bar", "indicates", "mean", "value", ".", "Data", "information", ":", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "for", "(", "H", ")", "I", ".", "U2", "-", "OS", "cells", "transfected", "as", "described", "in", "(", "H", ")", "were", "assayed", "by", "immuno", "-", "fluorescence", "combined", "with", "telomeric", "FISH", ".", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "co", "-", "localizations", "between", "TRF2", "and", "telomeres", "(", "white", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Right", "panel", ",", "co", "-", "localizations", "were", "analysed", "using", "imageJ", "software", ".", "N", "=", "number", "of", "analysed", "nuclei", ".", "Data", "information", ":", "For", "I", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C-E. Luciferase reporter assay in HeLa cells using the synthetic miR-Control or miR-182-3p in combination with the wild type (C) or the mutant 3'UTR of TRF2 construct (D) or the wild type 3'UTR of TRF1 (E). Data information: data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by Mann-Whitney test.F,G. Western blotting for TRF2 expression in Telomerase Positive (HeLa, HCT116, MDA-MB-231, MDA-MB-436) and ALT positive (U2-OS, Saos-2) cells transiently transfected with miR-Control or miR-182-3p. Upper panel shows the quantification of TRF2 expression. Bottom panel, representative images are shown, actin was used as loading control. Data information: data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by Mann-Whitney test.H. U2-OS cells transiently transfected with the miR-Control, miR-182-3p or miR-182-3p inhibitor were assayed by quantitative immunofluorescence for TRF2 three days post-transfection. Left panel, representative images. Scale bar: 10µm. Right panel, quantification of TRF2 fluorescence intensity. a.f.u. arbitrary fluorescence units. N=number of analysed nuclei. Red bar indicates mean value. Data information: Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by Student's t-test; for (H)I. U2-OS cells transfected as described in (H) were assayed by immuno-fluorescence combined with telomeric FISH. Left panel, representative images of co-localizations between TRF2 and telomeres (white arrowheads). Scale bar: 10µm. Right panel, co-localizations were analysed using imageJ software. N=number of analysed nuclei. Data information: For I, data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "γH2AX", "combined", "with", "telomeric", "FISH", "(", "TIFs", ")", "was", "performed", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "miRNAs", "or", "siRNAs", ".", "The", "mean", "number", "of", "TIFs", "per", "nucleus", "was", "analysed", ".", "B", ".", "Representative", "images", "and", "enlargements", "of", "co", "-", "localizations", "(", "white", "arrowheads", ")", "relative", "to", "the", "experiment", "described", "in", "A", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Data", "information", ":", "For", "A", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "At", "least", "60", "nuclei", "were", "analysed", "for", "each", "experimental", "condition", ".", "All", "the", "experiments", "were", "performed", "three", "days", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated", "miRNAs", "or", "siRNAs", ".", "C", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "γH2AX", "combined", "with", "a", "SatIII", "FISH", "probe", "(", "PIFs", ")", "was", "performed", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "miRNAs", "or", "siRNAs", ".", "The", "γH2AX", "positive", "cells", "with", "≥", "1", "PIFs", "per", "nucleus", "were", "analysed", ".", "D", ".", "Representative", "images", "of", "co", "-", "localizations", "(", "white", "arrowheads", ")", "relative", "to", "the", "experiment", "described", "in", "C", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Data", "information", ":", "For", "C", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "At", "least", "60", "nuclei", "were", "analysed", "for", "each", "experimental", "condition", ".", "All", "the", "experiments", "were", "performed", "three", "days", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated", "miRNAs", "or", "siRNAs", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "TIFs", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "over", "-", "expressing", "TRF2", "or", "an", "empty", "vector", "(", "pBabe", ")", ",", "transfected", "with", "indicated", "miRNAs", ".", "The", "mean", "number", "of", "TIFs", "per", "nucleus", "was", "quantified", ".", "F", ".", "Representative", "images", "and", "enlargements", "relative", "to", "the", "experiment", "described", "in", "E", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "co", "-", "localizations", "events", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "At", "least", "60", "nuclei", "were", "analysed", "for", "each", "experimental", "condition", ".", "All", "the", "experiments", "were", "performed", "three", "days", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated", "miRNAsG", ".", "Quantification", "of", "PIFs", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "over", "-", "expressing", "TRF2", "or", "an", "empty", "vector", "(", "pBabe", ")", ",", "transfected", "with", "indicated", "miRNAs", ".", "The", "γH2AX", "positive", "cells", "with", "≥", "1", "PIFs", "per", "nucleus", "were", "analysed", ".", "H", ".", "Representative", "images", "relative", "to", "the", "experiment", "described", "in", "G", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "co", "-", "localizations", "events", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "Data", "information", ":", "For", "G", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "At", "least", "60", "nuclei", "were", "analysed", "for", "each", "experimental", "condition", ".", "All", "the", "experiments", "were", "performed", "three", "days", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunofluorescence analysis of γH2AX combined with telomeric FISH (TIFs) was performed in MDA-MB-231 cells transfected with the indicated miRNAs or siRNAs. The mean number of TIFs per nucleus was analysed. B. Representative images and enlargements of co-localizations (white arrowheads) relative to the experiment described in A. Scale bar: 10µm. Data information: For A data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test. At least 60 nuclei were analysed for each experimental condition. All the experiments were performed three days post-transfection with the indicated miRNAs or siRNAs.C. Immunofluorescence analysis of γH2AX combined with a SatIII FISH probe (PIFs) was performed in MDA-MB-231 cells transfected with the indicated miRNAs or siRNAs. The γH2AX positive cells with ≥1 PIFs per nucleus were analysed. D. Representative images of co-localizations (white arrowheads) relative to the experiment described in C. Scale bar: 10µm. Data information: For C, data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test. At least 60 nuclei were analysed for each experimental condition. All the experiments were performed three days post-transfection with the indicated miRNAs or siRNAs.E. Quantification of TIFs in MDA-MB-231 cells over-expressing TRF2 or an empty vector (pBabe), transfected with indicated miRNAs. The mean number of TIFs per nucleus was quantified. F. Representative images and enlargements relative to the experiment described in E. White arrowheads indicate co-localizations events. Scale bar: 10µm. Data information: data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test. At least 60 nuclei were analysed for each experimental condition. All the experiments were performed three days post-transfection with the indicated miRNAsG. Quantification of PIFs in MDA-MB-231 cells over-expressing TRF2 or an empty vector (pBabe), transfected with indicated miRNAs. The γH2AX positive cells with ≥1 PIFs per nucleus were analysed. H. Representative images relative to the experiment described in G. White arrowheads indicate co-localizations events. Scale bar: 10µm. Data information: For G data are shown as mean ± SD. Three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test. At least 60 nuclei were analysed for each experimental condition. All the experiments were performed three days post-transfection with the indicated miRNAs"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", "underwent", "two", "rounds", "of", "transfection", "with", "miR", "-", "Control", ",", "miR", "-", "182", "-", "3p", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", "inhibitor", ".", "Starting", "from", "the", "day", "of", "the", "second", "transfection", ",", "cell", "confluence", "was", "monitored", "by", "Incucyte", "every", "24h", "up", "to", "a", "maximum", "of", "3", "days", ".", "The", "percentage", "of", "cell", "confluence", "was", "analysed", ".", "Data", "information", ":", "For", "A", ",", "B", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "C", ",", "D", ".", "Cell", "number", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "(", "C", ")", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "(", "D", ")", "cells", "and", "TRF2", "expression", "were", "analysed", "by", "automatic", "cell", "count", "and", "by", "western", "blotting", "at", "the", "end", "of", "the", "experiment", "described", "in", "A", "and", "B", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "For", "C", ",", "D", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "E", ".", "Two", "-", "dimensional", "scatter", "plots", "of", "Annexin", "V", "analysis", "performed", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "at", "the", "end", "of", "the", "second", "cycle", "of", "transfection", "with", "miR", "-", "Control", ",", "miR", "-", "182", "-", "3p", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", "inhibitor", ".", "Red", "boxes", "indicate", "early", "and", "late", "apoptotic", "cells", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "Annexin", "V", "positive", "cells", "(", "%", ")", "of", "experiment", "described", "in", "E", ".", "G", ".", "Two", "-", "dimensional", "scatter", "plots", "of", "Annexin", "V", "analysis", "performed", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "as", "described", "in", "E", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "Annexin", "V", "positive", "cells", "(", "%", ")", "of", "experiment", "described", "in", "G", ".", "Data", "information", ":", "For", "F", ",", "H", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "For", "F", ",", "H", "two", "different", "biological", "replicates", "were", "performed", ".", "I", ",", "J", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "over", "-", "expressing", "TRF2", "or", "an", "empty", "vector", "(", "pBabe", ")", "were", "transiently", "transfected", "with", "indicated", "miRNAs", "and", "cell", "count", "(", "I", ")", "or", "apoptosis", "(", "J", ")", "analysis", "was", "performed", "72h", "post", "-", "transfection", ".", "Data", "information", ":", "For", ",", "I", ",", "J", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "For", "I", ",", "three", "independent", "experiments", "were", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ".", "For", "J", ",", "two", "different", "biological", "replicates", "were", "performed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,B. MDA-MB-436 and MDA-MB-231 cells underwent two rounds of transfection with miR-Control, miR-182-3p or miR-182-3p inhibitor. Starting from the day of the second transfection, cell confluence was monitored by Incucyte every 24h up to a maximum of 3 days. The percentage of cell confluence was analysed. Data information: For A,B data are shown as mean ± SEM. three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test.C,D. Cell number of MDA-MB-436 (C) and MDA-MB-231 (D) cells and TRF2 expression were analysed by automatic cell count and by western blotting at the end of the experiment described in A and B. Actin was used as loading control. Data information: For C,D data are shown as mean ± SD. three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test.E. Two-dimensional scatter plots of Annexin V analysis performed in MDA-MB-436 at the end of the second cycle of transfection with miR-Control, miR-182-3p or miR-182-3p inhibitor. Red boxes indicate early and late apoptotic cells. F. Quantification of Annexin V positive cells (%) of experiment described in E. G. Two-dimensional scatter plots of Annexin V analysis performed in MDA-MB-231 as described in E. H. Quantification of Annexin V positive cells (%) of experiment described in G. Data information: For F,H data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t test. For F, H two different biological replicates were performed.I,J. MDA-MB-436 cells over-expressing TRF2 or an empty vector (pBabe) were transiently transfected with indicated miRNAs and cell count (I) or apoptosis (J) analysis was performed 72h post-transfection. Data information: For ,I,J, data are shown as mean ± SD. For I, three independent experiments were performed (n=3). P values are determined by unpaired two-tailed t test. For J, two different biological replicates were performed."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Western", "blotting", "for", "TRF2", "expression", "in", "BJ", "cells", "transiently", "transfected", "with", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "The", "graph", "represents", "the", "quantification", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ",", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Unspecific", "bands", "are", "indicated", "with", "(", "*", ")", ".", "B", ",", "C", ".", "Mean", "of", "γH2AX", "foci", "per", "nucleus", "was", "analysed", "in", "BJ", "cells", "72h", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated", "miRNAs", ".", "Representative", "images", "of", "γH2AX", "foci", "are", "shown", "in", "C", ".", "Data", "information", ":", "student", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "Scale", "bars", "(", "10µm", ")", ".", "P", "values", "are", "indicated", ".", "D", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "γH2AX", "combined", "with", "a", "telomeric", "FISH", "probe", "(", "TIFs", ")", "was", "performed", "in", "BJ", "cells", "72h", "post", "-", "transfection", "with", "the", "indicated", "miRNAs", ".", "Left", "panel", ":", "the", "mean", "number", "of", "TIFs", "per", "nucleus", "was", "analysed", ".", "Right", "panel", ":", "representative", "images", "and", "enlargements", "of", "co", "-", "localizations", ".", "Data", "information", ":", "a", "student", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "Scale", "bars", "(", "10µm", ")", ".", "P", "values", "are", "indicated", ".", "E", ".", "Cells", "number", "of", "BJ", "cells", "was", "analysed", "by", "automatic", "cell", "count", "at", "the", "end", "of", "the", "second", "round", "of", "transfection", "with", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "Data", "information", ":", "a", "student", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "P", "values", "are", "indicated", ".", "F", ".", "FACS", "analysis", "to", "evaluate", "cell", "cycle", "progression", "by", "Propidium", "Iodide", "(", "PI", ")", "staining", "in", "BJ", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "E", ".", "G", ".", "β", "-", "Galactosidase", "assay", "in", "BJ", "cells", "after", "two", "rounds", "of", "transfection", "with", "mimic", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "Left", "panel", ":", "analysis", "of", "β", "-", "Galactosidase", "positive", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "representative", "images", ".", "Data", "information", ":", "a", "student", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "P", "values", "are", "indicated", ".", "H", "-", "J", ".", "IL", "-", "6", "(", "H", ")", ",", "CXCL1", "(", "I", ")", ",", "IL", "-", "8", "(", "J", ")", "factors", "were", "analysed", "by", "ELISA", "to", "evaluated", "the", "Senescence", "-", "associated", "secretory", "phenotype", "(", "SASP", ")", "in", "BJ", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "G", ".", "Data", "information", ":", "a", "student", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "P", "values", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Western blotting for TRF2 expression in BJ cells transiently transfected with miR-Control or miR-182-3p. The graph represents the quantification of three independent experiments. Representative images are shown, actin was used as loading control. Unspecific bands are indicated with (*).B, C. Mean of γH2AX foci per nucleus was analysed in BJ cells 72h post-transfection with the indicated miRNAs. Representative images of γH2AX foci are shown in C. Data information: student t test was used to calculate statistical significance. Scale bars (10µm). P values are indicated.D. Immunofluorescence analysis of γH2AX combined with a telomeric FISH probe (TIFs) was performed in BJ cells 72h post-transfection with the indicated miRNAs. Left panel: the mean number of TIFs per nucleus was analysed. Right panel: representative images and enlargements of co-localizations. Data information: a student t test was used to calculate statistical significance. Scale bars (10µm). P values are indicated.E. Cells number of BJ cells was analysed by automatic cell count at the end of the second round of transfection with miR-Control or miR-182-3p. Data information: a student t test was used to calculate statistical significance. P values are indicated.F. FACS analysis to evaluate cell cycle progression by Propidium Iodide (PI) staining in BJ cells treated as indicated in E.G. β-Galactosidase assay in BJ cells after two rounds of transfection with mimic miR-Control or miR-182-3p. Left panel: analysis of β-Galactosidase positive cells. Right panel: representative images. Data information: a student t test was used to calculate statistical significance. P values are indicated.H-J. IL-6 (H), CXCL1 (I), IL-8 (J) factors were analysed by ELISA to evaluated the Senescence-associated secretory phenotype (SASP) in BJ cells treated as indicated in G. Data information: a student t test was used to calculate statistical significance. P values are indicated."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "(", "A", ")", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "(", "B", ")", "tumor", "xenografts", "were", "treated", "with", "LNPs", "-", "empty", ",", "LNPs", "-", "miR", "-", "Control", "or", "by", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "when", "the", "tumors", "became", "palpable", ".", "Mice", "were", "treated", "6", "times", "by", "intravenous", "tail", "vein", "injections", "with", "20µg", "of", "LNPs", "-", "miR", "-", "Control", ",", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "or", "equivalent", "volume", "of", "LNPs", "-", "empty", "as", "indicated", "in", "the", "scheduling", ".", "The", "mean", "of", "tumor", "volumes", "(", "n", "=", "5", "per", "group", ")", "is", "shown", ".", "Data", "information", ":", "For", "A", ",", "B", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "testC", ",", "D", ".", "Tumors", "from", "mice", "treated", "in", "A", "and", "B", "were", "processed", "to", "measure", "miR", "-", "182", "-", "3p", "expression", "by", "TaqMan", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "For", "C", ",", "D", "the", "line", "in", "the", "middle", "of", "the", "box", "plot", "denote", "a", "median", "value", ",", "the", "limits", "of", "box", "represent", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentiles", ")", ",", "while", ",", "the", "whiskers", "denote", "the", "minimum", "to", "maximum", "values", ".", ",", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ";", "E", ".", "Representative", "images", "of", "IHC", "analysis", "of", "the", "indicated", "markers", "on", "tumor", "samples", "from", "mice", "bearing", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "human", "breast", "cancer", "xenografts", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "F", ".", "The", "histograms", "show", ":", "the", "expression", "of", "TRF2", ",", "calculated", "as", "immunoreactivity", "score", "(", "IRS", ")", "by", "IHC", ",", "and", "the", "count", "of", "positive", "cells", "to", "γH2AX", ",", "Tunel", "or", "CD31", "staining", ".", "The", "analyses", "were", "performed", "on", "3", "mice", "per", "group", ",", "the", "points", "represent", "the", "number", "of", "field", "analysed", "for", "each", "condition", ".", "Data", "information", ":", "For", "F", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "F", ")", ",", "P", "values", "are", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "G", ",", "H", ".", "Luminescent", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "injected", "into", "the", "brain", "and", "monitored", "by", "IVIS", "imaging", "system", ".", "After", "one", "week", "from", "implant", ",", "treatment", "with", "LNPs", "-", "miR", "-", "Control", "and", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "A", "and", "B", ".", "Representative", "images", "from", "in", "vivo", "(", "upper", "panel", ")", "or", "ex", "-", "vivo", "(", "bottom", "panel", ")", "brain", "tumors", "are", "shown", "in", "G", ".", "Boxplots", "(", "H", ")", "show", "the", "measurement", "of", "photons", "for", "each", "brain", "tumor", "(", "n", "=", "5", "per", "group", ")", "acquired", "at", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "information", ":", "For", "H", ",", "the", "line", "in", "the", "middle", "of", "the", "box", "plot", "denote", "a", "median", "value", ",", "the", "limits", "of", "box", "represent", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentiles", ")", ",", "while", ",", "the", "whiskers", "denote", "the", "minimum", "to", "maximum", "values", ".", "For", "H", ",", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ";"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A,B. MDA-MB-231 (A) and MDA-MB-436 (B) tumor xenografts were treated with LNPs-empty, LNPs-miR-Control or by LNPs-miR-182-3p when the tumors became palpable. Mice were treated 6 times by intravenous tail vein injections with 20µg of LNPs-miR-Control, LNPs-miR-182-3p or equivalent volume of LNPs-empty as indicated in the scheduling. The mean of tumor volumes (n=5 per group) is shown. Data information: For A, B data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t testC,D. Tumors from mice treated in A and B were processed to measure miR-182-3p expression by TaqMan qPCR. Data information: For C, D the line in the middle of the box plot denote a median value, the limits of box represent the interquartile range (25th to 75th percentiles), while, the whiskers denote the minimum to maximum values. , P values are determined by unpaired two-tailed t test;E. Representative images of IHC analysis of the indicated markers on tumor samples from mice bearing MDA-MB-231 human breast cancer xenografts. Scale bar: 50μm. F. The histograms show: the expression of TRF2, calculated as immunoreactivity score (IRS) by IHC, and the count of positive cells to γH2AX, Tunel or CD31 staining. The analyses were performed on 3 mice per group, the points represent the number of field analysed for each condition. Data information: For F, data are shown as mean ± SD. (F), P values are determined by Mann-Whitney test.G, H. Luminescent MDA-MB-436 cells were injected into the brain and monitored by IVIS imaging system. After one week from implant, treatment with LNPs-miR-Control and LNPs-miR-182-3p was performed as indicated in A and B. Representative images from in vivo (upper panel) or ex-vivo (bottom panel) brain tumors are shown in G. Boxplots (H) show the measurement of photons for each brain tumor (n=5 per group) acquired at the indicated times. Data information: For H, the line in the middle of the box plot denote a median value, the limits of box represent the interquartile range (25th to 75th percentiles), while, the whiskers denote the minimum to maximum values. For H, P values are determined by unpaired two-tailed t test;"}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", ".", "PDTCs", "#", "1", "and", "#", "2", "underwent", "two", "rounds", "of", "transfection", "with", "miR", "-", "Control", "or", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "Three", "days", "after", "the", "second", "transfection", ",", "miR", "-", "182", "-", "3p", "and", "TRF2", "expression", "were", "analysed", "by", "TaqMan", "qPCR", "and", "western", "blotting", ",", "respectively", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", "For", "the", "experiments", "showed", "in", "A", ",", "B", "two", "or", "three", "biological", "replicates", "were", "performed", ",", "respectively", ".", "C", ",", "D", ".", "Left", "panel", ",", "area", "of", "each", "PDTCs", "was", "measured", "by", "ImageJ", ".", "Right", "panel", ",", "representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "At", "least", "85", "3D", "cells", "were", "analysed", "for", "each", "experimental", "condition", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", "For", "the", "experiments", "showed", "in", "C", ",", "D", "two", "or", "three", "biological", "replicates", "were", "performed", ",", "respectively", ".", "E", ".", "NSG", "mice", "implanted", "with", "breast", "PDTX", "(", "#", "2", ")", "were", "treated", "with", "LNPs", "-", "empty", ",", "LNPs", "-", "miR", "-", "Control", "or", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "as", "indicated", "in", "the", "scheduling", ".", "Caliper", "measurement", "of", "tumors", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "days", ".", "The", "mean", "of", "tumor", "volumes", "(", "n", "=", "5", "per", "group", ")", "is", "shown", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "test", ";", "F", ".", "miR", "-", "182", "-", "3p", "expression", "of", "tumors", "from", "mice", "treated", "in", "(", "E", ")", "was", "assayed", "by", "TaqMan", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "are", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "testG", ".", "Representative", "images", "of", "IHC", "analysis", "of", "the", "indicated", "markers", "from", "tumors", "of", "the", "experiment", "showed", "in", "E", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "H", ".", "The", "histograms", "show", ":", "the", "expression", "levels", "of", "TRF2", "measured", "as", "immunoreactivity", "score", "(", "IRS", ")", ",", "the", "percentage", "of", "positive", "cells", "to", "γH2AX", "and", "Tunel", ".", "The", "analysis", "was", "performed", "on", "3", "mice", "per", "group", ",", "the", "points", "represent", "the", "number", "of", "field", "analysed", "for", "each", "condition", ".", "Data", "information", ":", "For", "H", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "For", "(", "H", ")", ",", "P", "values", "are", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A,B. PDTCs #1 and #2 underwent two rounds of transfection with miR-Control or miR-182-3p. Three days after the second transfection, miR-182-3p and TRF2 expression were analysed by TaqMan qPCR and western blotting, respectively. Actin was used as loading control. Data information: data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t test For the experiments showed in A, B two or three biological replicates were performed, respectively.C,D. Left panel, area of each PDTCs was measured by ImageJ. Right panel, representative images are shown. Scale bar: 50μm. At least 85 3D cells were analysed for each experimental condition. Data information: data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t test For the experiments showed in C, D two or three biological replicates were performed, respectively.E. NSG mice implanted with breast PDTX (#2) were treated with LNPs-empty, LNPs-miR-Control or LNPs-miR-182-3p as indicated in the scheduling. Caliper measurement of tumors were taken at the indicated days. The mean of tumor volumes (n=5 per group) is shown. Data information: data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t test;F. miR-182-3p expression of tumors from mice treated in (E) was assayed by TaqMan qPCR. Data information: data are shown as mean ± SD. P values are determined by unpaired two-tailed t testG. Representative images of IHC analysis of the indicated markers from tumors of the experiment showed in E. Scale bar: 50μm. H. The histograms show: the expression levels of TRF2 measured as immunoreactivity score (IRS), the percentage of positive cells to γH2AX and Tunel. The analysis was performed on 3 mice per group, the points represent the number of field analysed for each condition. Data information: For H, data are shown as mean ± SD. For (H), P values are determined by Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Representative", "images", "of", "intestine", "sections", "from", "mice", "previously", "treated", "with", "LNPs", "-", "Empty", "or", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", ".", "H", "&", "E", "staining", "(", "scale", "bar", ":", "200μm", ")", "and", "IHC", "analysis", "with", "TRF2", "or", "γH2AX", "antibodies", "are", "shown", "(", "scale", "bar", ":", "50μm", ")", ".", "B", ",", "C", ".", "Quantification", "of", "TRF2", "expression", "as", "immunoreactivity", "score", "(", "IRS", ")", "(", "B", ")", "and", "of", "γH2AX", "positive", "cells", "(", "%", ")", "(", "C", ")", "on", "intestine", "samples", ".", "D", ".", "Representative", "H", "&", "E", "(", "scale", "bar", ":", "200μm", ")", ",", "TRF2", "and", "γH2AX", "images", "of", "skin", "samples", "corresponding", "to", "LNPs", "-", "Empty", "or", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "treated", "animals", "(", "scale", "bar", ":", "50μm", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "Quantification", "of", "TRF2", "expression", "as", "immunoreactivity", "score", "(", "IRS", ")", "(", "E", ")", "and", "of", "γH2AX", "positive", "cells", "(", "%", ")", "(", "F", ")", "on", "skin", "samples", ".", "G", ".", "Representative", "H", "&", "E", "(", "scale", "bar", ":", "200μm", ")", ",", "TRF2", "and", "γH2AX", "images", "of", "bone", "marrow", "samples", "corresponding", "to", "LNPs", "-", "Empty", "or", "LNPs", "-", "miR", "-", "182", "-", "3p", "treated", "animals", "(", "scale", "bar", ":", "50μm", ")", ".", "H", ",", "I", ".", "Quantification", "of", "TRF2", "expression", "as", "immunoreactivity", "score", "(", "IRS", ")", "(", "H", ")", "and", "of", "γH2AX", "positive", "cells", "(", "%", ")", "(", "I", ")", "on", "bone", "marrow", "samples", ".", "Data", "information", ":", "For", "B", ",", "C", ",", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", ",", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "A", "Mann", "-", "Whitney", "test", "t", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "Four", "mice", "per", "group", "were", "analysed", "the", "points", "represent", "the", "number", "of", "field", "analysed", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Representative images of intestine sections from mice previously treated with LNPs-Empty or LNPs-miR-182-3p. H&E staining (scale bar: 200μm) and IHC analysis with TRF2 or γH2AX antibodies are shown (scale bar: 50μm). B,C. Quantification of TRF2 expression as immunoreactivity score (IRS) (B) and of γH2AX positive cells (%) (C) on intestine samples. D. Representative H&E (scale bar: 200μm), TRF2 and γH2AX images of skin samples corresponding to LNPs-Empty or LNPs-miR-182-3p treated animals (scale bar: 50μm). E,F. Quantification of TRF2 expression as immunoreactivity score (IRS) (E) and of γH2AX positive cells (%) (F) on skin samples. G. Representative H&E (scale bar: 200μm), TRF2 and γH2AX images of bone marrow samples corresponding to LNPs-Empty or LNPs-miR-182-3p treated animals (scale bar: 50μm). H,I. Quantification of TRF2 expression as immunoreactivity score (IRS) (H) and of γH2AX positive cells (%) (I) on bone marrow samples. Data information: For B,C,E,F,H,I, data are shown as mean ± SD. A Mann-Whitney test t test was used to calculate statistical significance. Four mice per group were analysed the points represent the number of field analysed for each condition."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "A", "fragment", "encompassing", "amino", "acids", "432", "-", "520", "of", "Atg13", "(", "wt", ")", "or", "the", "corresponding", "FV", "mutant", "(", "FV", ")", "was", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "and", "incubated", "in", "excess", "with", "an", "immobilized", "GST", "‐", "tagged", "fragment", "of", "Atg1", "(", "amino", "acids", "501", "-", "897", ")", "purified", "from", "E", ".", "coli", "(", "GST", "‐", "Atg1", ")", ".", "Input", "(", "5", ".", "5", "%", ")", "and", "bound", "proteins", "were", "analysed", "by", "coomassie", "blue", "staining", ",", "which", "stains", "proteins", "proportional", "to", "their", "size", ".", "The", "size", "of", "marker", "proteins", "(", "in", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "left", ".", "(", "C", ")", "ATG1", "‐", "TAP", "atg13Δ", "cells", "containing", "endogenously", "GFP", "‐", "tagged", "Atg17", ",", "Atg29", "or", "Vac8", "and", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", "or", "the", "Atg13", "FV", "‐", "mutant", "(", "F468A", ";", "V469A", ")", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", ".", "Atg1", "was", "immunoprecipitated", "and", "its", "association", "with", "Atg13", "and", "the", "GFP", "‐", "tagged", "proteins", "was", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "Extract", "inputs", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "S1B", ".", "(", "D", ")", "atg1Δ", "and", "atg1Δatg13Δ", "cells", "expressing", "HA", "‐", "tagged", "Atg1", "and", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", "cells", "containing", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "(", "rich", ")", ",", "and", "then", "treated", "with", "rapamycin", "(", "rapa", ")", "or", "starved", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", "medium", "(", "starv", ")", ".", "Atg1", "was", "immunoprecipitated", "and", "its", "association", "with", "Atg13", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "Note", "that", "phosphorylated", "Atg13", "isolated", "from", "cells", "grown", "in", "rich", "medium", "migrates", "slightly", "slower", "on", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "the", "extent", "corresponds", "to", "the", "shift", "typically", "observed", "under", "our", "gel", "conditions", ".", "(", "E", ")", "Yeast", "cells", "containing", "endogenously", "tagged", "Atg1", "‐", "TAP", "with", "and", "without", "endogenously", "tagged", "Atg13", "‐", "GFP", ",", "or", "conversely", "cells", "containing", "endogenously", "tagged", "Atg13", "‐", "TAP", "and", "Atg1", "‐", "GFP", "expressed", "from", "a", "centromeric", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "(", "rich", ")", "and", "treated", "with", "rapamycin", "(", "rapa", ")", "or", "starved", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", "medium", "(", "starv", ")", ".", "Atg1", "‐", "TAP", "and", "Atg13", "‐", "TAP", "were", "affinity", "purified", "and", "their", "association", "with", "GFP", "‐", "tagged", "proteins", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "(", "F", ")", "Histone3", "‐", "HA", "tagged", "Atg1", "was", "expressed", "together", "with", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", "or", "the", "Atg13", "‐", "FV", "mutant", "fused", "to", "Suv", "methylase", "(", "Suv", ")", "in", "atg1Δatg13Δ", "cells", ",", "or", "for", "control", "together", "with", "Pbs2", "‐", "Suv", "in", "atg1Δ", "cells", ".", "Logarithmically", "growing", "cultures", "were", "treated", "with", "rapamycin", "(", "rapa", ")", "for", "0", "or", "120", "min", ",", "and", "methylation", "was", "monitored", "by", "preparing", "cell", "extracts", "and", "western", "blotting", "with", "an", "anti", "‐", "trimethylation", "‐", "specific", "antibody", ".", "Note", "that", "Suv", "‐", ",", "GFP", "‐", "or", "TAP", "‐", "tagged", "Atg13", "are", "fully", "functional", ",", "however", ",", "do", "not", "show", "the", "characteristic", "phosphorylation", "‐", "induced", "reduced", "mobility", "observed", "with", "the", "untagged", "protein", "under", "our", "gel", "conditions", ".", "(", "G", ")", "atg1Δatg13Δ", "cells", "containing", "TAP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "Atg1", "(", "wt", ")", "or", "the", "Atg1", "kinase", "‐", "dead", "(", "kd", ")", "K54A", "mutant", "and", "wild", "‐", "type", "Atg13", ",", "the", "Atg13", "‐", "FV", "mutant", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", ".", "Atg1", "was", "immunoprecipitated", "and", "its", "autophosphorylation", "activity", "was", "measured", "by", "autoradiography", "in", "vitro", ".", "(", "H", ")", "pho8Δ60pho13Δatg13Δ", "cells", "expressing", "wild", "‐", "type", "Atg13", "(", "wt", ")", ",", "the", "Atg13", "‐", "FV", "mutant", "(", "FV", ")", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "and", "starved", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", "medium", ".", "Pho8Δ60", "‐", "specific", "alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", "activity", "(", "nmol", "/", "min", "/", "mg", ")", "was", "measured", "in", "three", "independent", "experiments", "as", "described", "in", "'", "Materials", "and", "methods", "'", ",", "and", "plotted", "as", "relative", "ALP", "activity", "with", "standard", "deviation", "(", "s", ".", "d", ".", ")", "compared", "to", "the", "wild", "‐", "type", "controls", ".", "(", "I", ")", "atg13", "cells", "expressing", "GFP", "‐", "Atg8", "and", "containing", "wild", "‐", "type", "Atg13", ",", "the", "Atg13", "‐", "FV", "mutant", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "with", "and", "without", "starvation", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", ".", "Processing", "of", "endogenous", "Ape1", "and", "cleavage", "of", "GFP", "‐", "Atg8", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ",", "and", "quantified", "by", "calculating", "the", "ratio", "of", "cleaved", "versus", "uncleaved", "Ape1", "or", "GFP", "‐", "Atg8", ",", "respectively", ".", "The", "asterisk", "marks", "a", "non", "‐", "specific", "band", "detected", "by", "the", "Atg13", "antibody", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) A fragment encompassing amino acids 432-520 of Atg13 (wt) or the corresponding FV mutant (FV) was expressed in E. coli and incubated in excess with an immobilized GST‐tagged fragment of Atg1 (amino acids 501-897) purified from E. coli (GST‐Atg1). Input (5.5%) and bound proteins were analysed by coomassie blue staining, which stains proteins proportional to their size. The size of marker proteins (in kDa) is indicated on the left.(C) ATG1‐TAP atg13Δ cells containing endogenously GFP‐tagged Atg17, Atg29 or Vac8 and wild‐type (wt) or the Atg13 FV‐mutant (F468A; V469A) were grown to mid log phase. Atg1 was immunoprecipitated and its association with Atg13 and the GFP‐tagged proteins was analysed by immunoblotting. Extract inputs are shown in Supplementary Figure S1B.(D) atg1Δ and atg1Δatg13Δ cells expressing HA‐tagged Atg1 and wild‐type (wt) cells containing an empty plasmid were grown to mid log phase (rich), and then treated with rapamycin (rapa) or starved for 4 h in SD‐N medium (starv). Atg1 was immunoprecipitated and its association with Atg13 analysed by immunoblotting. Note that phosphorylated Atg13 isolated from cells grown in rich medium migrates slightly slower on SDS-PAGE, and the extent corresponds to the shift typically observed under our gel conditions.(E) Yeast cells containing endogenously tagged Atg1‐TAP with and without endogenously tagged Atg13‐GFP, or conversely cells containing endogenously tagged Atg13‐TAP and Atg1‐GFP expressed from a centromeric plasmid were grown to mid log phase (rich) and treated with rapamycin (rapa) or starved for 4 h in SD‐N medium (starv). Atg1‐TAP and Atg13‐TAP were affinity purified and their association with GFP‐tagged proteins was analysed by western blotting.(F) Histone3‐HA tagged Atg1 was expressed together with wild‐type (wt) or the Atg13‐FV mutant fused to Suv methylase (Suv) in atg1Δatg13Δ cells, or for control together with Pbs2‐Suv in atg1Δ cells. Logarithmically growing cultures were treated with rapamycin (rapa) for 0 or 120 min, and methylation was monitored by preparing cell extracts and western blotting with an anti‐trimethylation‐specific antibody. Note that Suv‐, GFP‐ or TAP‐tagged Atg13 are fully functional, however, do not show the characteristic phosphorylation‐induced reduced mobility observed with the untagged protein under our gel conditions.(G) atg1Δatg13Δ cells containing TAP‐tagged wild‐type Atg1 (wt) or the Atg1 kinase‐dead (kd) K54A mutant and wild‐type Atg13, the Atg13‐FV mutant or an empty plasmid were grown to mid log phase. Atg1 was immunoprecipitated and its autophosphorylation activity was measured by autoradiography in vitro.(H) pho8Δ60pho13Δatg13Δ cells expressing wild‐type Atg13 (wt), the Atg13‐FV mutant (FV) or an empty plasmid were grown to mid log phase and starved for 4 h in SD‐N medium. Pho8Δ60‐specific alkaline phosphatase (ALP) activity (nmol/min/mg) was measured in three independent experiments as described in 'Materials and methods', and plotted as relative ALP activity with standard deviation (s.d.) compared to the wild‐type controls.(I) atg13 cells expressing GFP‐Atg8 and containing wild‐type Atg13, the Atg13‐FV mutant or an empty plasmid were grown to mid log phase with and without starvation for 4 h in SD‐N. Processing of endogenous Ape1 and cleavage of GFP‐Atg8 was analysed by western blotting, and quantified by calculating the ratio of cleaved versus uncleaved Ape1 or GFP‐Atg8, respectively. The asterisk marks a non‐specific band detected by the Atg13 antibody. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "GST", "‐", "Atg8", "or", "GST", "‐", "Ubiquitin", "(", "Ub", ")", "was", "purified", "from", "E", ".", "coli", "and", "bound", "to", "GSH", "beads", ".", "Wild", "‐", "type", "Atg1", "‐", "TAP", "or", "the", "VE", "and", "EYE", "mutants", "were", "purified", "from", "yeast", ",", "incubated", "with", "the", "immobilized", "GST", "proteins", "and", "bound", "proteins", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "(", "C", ")", "(", "C", ")", "GST", "‐", "Atg8", "and", "GST", "‐", "Ubiquitin", "were", "immobilized", "as", "described", "in", "(", "B", ")", ",", "and", "probed", "for", "their", "ability", "to", "bind", "Atg1", "‐", "TAP", "isolated", "from", "wild", "‐", "type", "or", "atg13Δ", "cells", ".", "(", "D", ")", "atg1Δatg13Δ", "cells", "expressing", "as", "indicated", "wild", "‐", "type", "Atg1", "‐", "TAP", "or", "the", "VE", "or", "EYE", "mutants", ",", "and", "wild", "‐", "type", "Atg13", "or", "the", "Atg13", "‐", "FV", "mutant", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", ".", "Atg1", "was", "immunoprecipitated", "and", "its", "association", "with", "Atg13", "was", "determined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "E", ")", "GST", ",", "GST", "‐", "LC3B", ",", "GST", "‐", "GATE16", "and", "GST", "‐", "GABARAP", "were", "purified", "from", "E", ".", "coli", "and", "bound", "to", "beads", ".", "HEK293", "cell", "lysates", "prepared", "from", "cells", "expressing", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", "HA", "‐", "ULK1", "or", "the", "DFP", "mutant", "were", "incubated", "with", "the", "beads", ",", "and", "bound", "proteins", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "(", "F", ")", "HEK293", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "GFP", "or", "GFP", "‐", "GABARAP", "along", "with", "either", "wild", "‐", "type", "HA", "‐", "ULK1", "or", "the", "DFP", "mutant", ".", "GFP", "and", "GFP", "‐", "GABARAP", "were", "immobilized", "on", "GFP", "‐", "Trap", "resin", "and", "HA", "‐", "ULK1", "binding", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) GST‐Atg8 or GST‐Ubiquitin (Ub) was purified from E. coli and bound to GSH beads. Wild‐type Atg1‐TAP or the VE and EYE mutants were purified from yeast, incubated with the immobilized GST proteins and bound proteins analysed by western blotting.(C) (C) GST‐Atg8 and GST‐Ubiquitin were immobilized as described in (B), and probed for their ability to bind Atg1‐TAP isolated from wild‐type or atg13Δ cells.(D) atg1Δatg13Δ cells expressing as indicated wild‐type Atg1‐TAP or the VE or EYE mutants, and wild‐type Atg13 or the Atg13‐FV mutant were grown to mid log phase. Atg1 was immunoprecipitated and its association with Atg13 was determined by western blotting.(E) GST, GST‐LC3B, GST‐GATE16 and GST‐GABARAP were purified from E. coli and bound to beads. HEK293 cell lysates prepared from cells expressing wild‐type (wt) HA‐ULK1 or the DFP mutant were incubated with the beads, and bound proteins analysed by western blotting.(F) HEK293 cells were co‐transfected with GFP or GFP‐GABARAP along with either wild‐type HA‐ULK1 or the DFP mutant. GFP and GFP‐GABARAP were immobilized on GFP‐Trap resin and HA‐ULK1 binding was analysed by western blotting. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "atg1Δatg13Δ", "cells", "containing", "an", "empty", "control", "plasmid", ",", "wild", "‐", "type", "or", "the", "indicated", "Atg1", "mutants", ",", "and", "Atg13", "wild", "‐", "type", ",", "the", "Atg13", "‐", "FVmutant", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", ".", "Processing", "of", "endogenous", "Ape1", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ",", "and", "quantified", "as", "described", "in", "the", "legend", "of", "Figure", "1I", ".", "Expression", "of", "the", "different", "proteins", "was", "controlled", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "Atg1", "or", "Atg13", ".", "The", "asterisk", "marks", "a", "non", "‐", "specific", "band", "detected", "by", "the", "Atg13", "antibody", ".", "(", "B", ")", "pho8Δ60pho13Δatg1Δ", "cells", "expressing", "wild", "‐", "type", "(", "wt", ")", ",", "kinase", "‐", "dead", "(", "kd", ")", ",", "Atg1", "‐", "VE", "(", "VE", ")", "or", "‐", "EYE", "(", "EYE", ")", "mutants", "or", "an", "empty", "plasmid", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "and", "starved", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", "medium", ".", "Pho8Δ60", "‐", "specific", "alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", "activity", "(", "nmol", "/", "min", "/", "mg", ")", "was", "measured", "in", "three", "independent", "experiments", "as", "described", "in", "'", "Materials", "and", "methods", "'", ",", "and", "plotted", "as", "relative", "ALP", "activity", "with", "standard", "deviation", "(", "s", ".", "d", ".", ")", "compared", "to", "the", "wild", "‐", "type", "controls", ".", "(", "C", ")", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "expressing", "GFP", "‐", "Atg8", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "with", "starvation", "for", "4", "h", "in", "SD", "‐", "N", "medium", ".", "The", "processing", "of", "GFP", "‐", "Atg8", "was", "analysed", "and", "quantified", "as", "in", "Figure", "1I", ".", "(", "D", ")", "Exponentially", "growing", "atg1Δ", "and", "atg1Δatg8Δ", "strains", "expressing", "the", "PAS", "marker", "Ape1", "‐", "RFP", "and", "either", "GFP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "Atg1", "‐", "VE", "mutant", "were", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "E", ")", "atg1Δ", "cells", "containing", "TAP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "or", "the", "indicated", "Atg1", "‐", "mutants", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", ".", "Atg1", "was", "immunoprecipitated", "and", "its", "in", "vitro", "autophosphorylation", "activity", "was", "measured", "by", "autoradiography", ".", "The", "kinase", "‐", "dead", "(", "kd", ")", "Atg1", "‐", "mutant", "K54A", "serves", "as", "a", "negative", "control", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) atg1Δatg13Δ cells containing an empty control plasmid, wild‐type or the indicated Atg1 mutants, and Atg13 wild‐type, the Atg13‐FVmutant or an empty plasmid were grown to mid log phase. Processing of endogenous Ape1 was analysed by western blotting, and quantified as described in the legend of Figure 1I. Expression of the different proteins was controlled by immunoblotting with antibodies against Atg1 or Atg13. The asterisk marks a non‐specific band detected by the Atg13 antibody.(B) pho8Δ60pho13Δatg1Δ cells expressing wild‐type (wt), kinase‐dead (kd), Atg1‐VE (VE) or ‐EYE (EYE) mutants or an empty plasmid were grown to mid log phase and starved for 4 h in SD‐N medium. Pho8Δ60‐specific alkaline phosphatase (ALP) activity (nmol/min/mg) was measured in three independent experiments as described in 'Materials and methods', and plotted as relative ALP activity with standard deviation (s.d.) compared to the wild‐type controls.(C) Cells as in (A) expressing GFP‐Atg8 were grown to mid log phase with starvation for 4 h in SD‐N medium. The processing of GFP‐Atg8 was analysed and quantified as in Figure 1I.(D) Exponentially growing atg1Δ and atg1Δatg8Δ strains expressing the PAS marker Ape1‐RFP and either GFP‐tagged wild‐type Atg1 or the Atg1‐VE mutant were examined by fluorescence microscopy. Bar=5 μm.(E) atg1Δ cells containing TAP‐tagged wild‐type or the indicated Atg1‐mutants were grown to mid log phase. Atg1 was immunoprecipitated and its in vitro autophosphorylation activity was measured by autoradiography. The kinase‐dead (kd) Atg1‐mutant K54A serves as a negative control. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Exponentially", "growing", "ypt7Δ", "cells", "were", "starved", "in", "SD", "‐", "N", "medium", "for", "4", "h", ",", "lysed", "and", "the", "extract", "separated", "into", "a", "cytoplasmic", "(", "S", ")", "and", "a", "5000", "g", "membrane", "pellet", "fraction", ".", "The", "pellet", "was", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "−", ")", "TX", "‐", "100", ",", "centrifuged", "and", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "‐", "Atg1", ",", "anti", "‐", "Pep12", "and", "anti", "‐", "Pgk1", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Exponentially", "growing", "ypt7Δatg1Δ", "cells", "expressing", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "Atg1", "‐", "VE", "mutant", "protein", "were", "starved", "in", "SD", "‐", "N", "for", "4", "h", ",", "lysed", "and", "the", "extract", "separated", "into", "cytoplasmic", "(", "S", ")", "and", "membrane", "(", "P", ")", "fractions", ".", "The", "fractions", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "‐", "Atg1", ",", "anti", "‐", "Pgk1", "and", "anti", "‐", "Ape1", "antibodies", ",", "and", "the", "ratio", "of", "Atg1", "to", "Ape1", "in", "the", "pellet", "fractions", "was", "quantified", "and", "indicated", "as", "a", "ratio", "compared", "to", "wild", "‐", "type", "cells", ".", "(", "C", ")", "HEK293", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "GFP", "‐", "GABARAP", "and", "HA", "‐", "ULK1", ",", "starved", "for", "2", "h", ",", "and", "subsequently", "immunostained", "for", "HA", "(", "red", ")", "and", "WIPI2", "(", "white", ")", ".", "The", "arrows", "mark", "putative", "autophagosomes", "that", "stain", "positive", "for", "all", "three", "markers", ".", "Bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "‐", "LC3", "were", "transfected", "with", "wild", "‐", "type", "HA", "‐", "ULK1", "or", "the", "DFP", "mutant", ",", "and", "immunostained", "for", "HA", "and", "WIPI2", "after", "2", "h", "starvation", ".", "HA", "‐", "ULK1", "and", "WIPI2", "spot", "numbers", "were", "counted", "using", "Imaris", "software", "in", "over", "70", "cells", "(", "from", "one", "out", "of", "two", "experiments", ")", "and", "plotted", "as", "the", "ratio", "of", "ULK1", "to", "WIPI2", "puncta", ".", "*", "*", "*", "Indicates", "a", "statistically", "significant", "P", "‐", "value", "of", "0", ".", "0001", ".", "One", "of", "the", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "HA", "‐", "ULK1", "and", "WIPI2", "spot", "numbers", "in", "HEK293", "cells", "expressing", "wild", "‐", "type", "HA", "‐", "ULK1", "or", "the", "DFP", "mutant", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "above", ",", "and", "the", "spot", "number", "counted", "using", "Imaris", "software", ".", "A", "representative", "immunofluorescence", "image", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "S3F", ".", "*", "*", "*", "and", "*", "indicate", "P", "‐", "values", "of", "0", ".", "0001", "or", "0", ".", "0158", ",", "respectively", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Exponentially growing ypt7Δ cells were starved in SD‐N medium for 4 h, lysed and the extract separated into a cytoplasmic (S) and a 5000 g membrane pellet fraction. The pellet was treated with (+) or without (−) TX‐100, centrifuged and the supernatant (S) and pellet (P) fractions analysed by western blotting with anti‐Atg1, anti‐Pep12 and anti‐Pgk1 antibodies.(B) Exponentially growing ypt7Δatg1Δ cells expressing wild‐type Atg1 or the Atg1‐VE mutant protein were starved in SD‐N for 4 h, lysed and the extract separated into cytoplasmic (S) and membrane (P) fractions. The fractions were analysed by western blotting with anti‐Atg1, anti‐Pgk1 and anti‐Ape1 antibodies, and the ratio of Atg1 to Ape1 in the pellet fractions was quantified and indicated as a ratio compared to wild‐type cells.(C) HEK293 cells were co‐transfected with GFP‐GABARAP and HA‐ULK1, starved for 2 h, and subsequently immunostained for HA (red) and WIPI2 (white). The arrows mark putative autophagosomes that stain positive for all three markers. Bar=10 μm.(D) HEK293 cells stably expressing GFP‐LC3 were transfected with wild‐type HA‐ULK1 or the DFP mutant, and immunostained for HA and WIPI2 after 2 h starvation. HA‐ULK1 and WIPI2 spot numbers were counted using Imaris software in over 70 cells (from one out of two experiments) and plotted as the ratio of ULK1 to WIPI2 puncta. ***Indicates a statistically significant P‐value of 0.0001. One of the two independent experiments is shown.(E) Quantification of HA‐ULK1 and WIPI2 spot numbers in HEK293 cells expressing wild‐type HA‐ULK1 or the DFP mutant. Cells were treated as above, and the spot number counted using Imaris software. A representative immunofluorescence image is shown in Supplementary Figure S3F. *** and * indicate P‐values of 0.0001 or 0.0158, respectively. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "atg1Δ", "cells", "containing", "either", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "kinase", "‐", "dead", "Atg1", "‐", "T226A", "mutant", "tagged", "with", "GFP", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "followed", "by", "starvation", "for", "24", "h", "in", "SD", "‐", "N", ".", "Samples", "were", "taken", "at", "indicated", "time", "points", "and", "GFP", "cleavage", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "Processing", "of", "endogenous", "Ape1", "under", "starvation", "conditions", "monitors", "the", "autophagic", "flux", ".", "(", "B", ")", "atg1Δ", "cells", "containing", "either", "GFP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "Atg1", "‐", "VE", "mutant", "were", "grown", "and", "analysed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "C", ")", "atg1Δpep4Δ", "cells", "containing", "YFP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "Atg1", "‐", "VE", "mutant", "were", "grown", "to", "log", "phase", "and", "starved", "in", "SD", "‐", "N", ".", "Cells", "were", "monitored", "by", "time", "‐", "lapse", "microscopy", "and", "the", "vacuolar", "accumulation", "of", "Atg1", "was", "quantified", "as", "described", "in", "'", "Materials", "and", "methods", "'", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "from", "at", "least", "90", "quantified", "cells", ".", "Additional", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figure", "S3H", ".", "Bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "atg1Δatg13Δ", "cells", "expressing", "GFP", "‐", "tagged", "wild", "‐", "type", "Atg13", ",", "and", "either", "wild", "‐", "type", "Atg1", "or", "the", "Atg1", "‐", "VE", "mutant", "(", "left", "panel", ")", "and", "wild", "‐", "type", "cells", "containing", "Atg13", "‐", "GFP", "and", "either", "wild", "‐", "type", "Atg13", "or", "Atg13", "‐", "FV", "were", "grown", "to", "mid", "log", "phase", "followed", "by", "starvation", "for", "6", "h", "in", "SD", "‐", "N", "media", ".", "GFP", "cleavage", "was", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "Figure", "source", "data", "can", "be", "found", "with", "the", "Supplementary", "data", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) atg1Δ cells containing either wild‐type Atg1 or the kinase‐dead Atg1‐T226A mutant tagged with GFP were grown to mid log phase followed by starvation for 24 h in SD‐N. Samples were taken at indicated time points and GFP cleavage was analysed by western blotting. Processing of endogenous Ape1 under starvation conditions monitors the autophagic flux.(B) atg1Δ cells containing either GFP‐tagged wild‐type Atg1 or the Atg1‐VE mutant were grown and analysed as in (A).(C) atg1Δpep4Δ cells containing YFP‐tagged wild‐type Atg1 or the Atg1‐VE mutant were grown to log phase and starved in SD‐N. Cells were monitored by time‐lapse microscopy and the vacuolar accumulation of Atg1 was quantified as described in 'Materials and methods'. Data are plotted as the mean±s.e.m. from at least 90 quantified cells. Additional images are shown in Supplementary Figure S3H. Bar=5 μm.(D) atg1Δatg13Δ cells expressing GFP‐tagged wild‐type Atg13, and either wild‐type Atg1 or the Atg1‐VE mutant (left panel) and wild‐type cells containing Atg13‐GFP and either wild‐type Atg13 or Atg13‐FV were grown to mid log phase followed by starvation for 6 h in SD‐N media. GFP cleavage was analysed by western blotting. Figure source data can be found with the Supplementary data."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "Representative", "images", "of", "OG", "immunohistochemistry", "on", "paraffin", "-", "embedded", "colon", "sections", "from", "control", ",", "UC", "and", "CD", " ", "patients", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Intensities", "of", "staining", "were", "scored", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "OGT", ":", "Healthy", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "Healthy", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "003", ";", "O", "-", "GlcNAc", ":", "Healthy", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "0365", ",", "Healthy", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "0125", " ", "A", ",", "B", "Representative", "images", "o", " ", "O", "-", "GlcNAc", "(", "B", ")", "immunohistochemistry", "on", "paraffin", "-", "embedded", "colon", "sections", "from", "control", ",", "UC", "and", "CD", " ", "patients", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Intensities", "of", "staining", "were", "scored", "on", "the", "right", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "OGT", ":", "Healthy", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "Healthy", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "003", ";", "O", "-", "GlcNAc", ":", "Healthy", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "0365", ",", "Healthy", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "0125", " ", "C", "Levels", "of", "intestinal", " ", "epithelial", " ", "OGT", "and", "O", "-", "GlcNAcylation", "in", "a", "second", "cohort", "of", "control", ",", "UC", ",", "and", "CD", " ", "patients", ".", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "OGT", ":", "Control", "n", "=", "10", ",", "UC", "n", "=", "9", ",", "CD", "n", "=", "6", ";", "Control", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "035", ",", "Control", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "003", ";", "O", "-", "GlcNAc", ":", "Control", "n", "=", "10", ",", "UC", "n", "=", "8", ",", "CD", "n", "=", "8", ";", "Control", "vs", "UC", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "Control", "vs", "CD", "P", "=", "0", ".", "008", " ", "D", ",", "E", "Regression", "plots", "of", "average", "immune", "-", "staining", "scores", "of", "OGT", "and", "O", "-", "GlcNAcylation", "against", "histological", "scores", "in", "UC", "(", "D", ")", "and", "CD", "(", "E", ")", "(", "D", ":", "OGT", "n", "=", "19", ",", "O", "-", "GlcNAc", "n", "=", "18", ";", "E", ":", "OGT", "n", "=", "15", ",", "O", "-", "GlcNAc", "n", "=", "16", ")", " "], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B Representative images of OG immunohistochemistry on paraffin-embedded colon sections from control, UC and CD patients (n = 4). Intensities of staining were scored on the right. Scale bars = 50 μm. (one-way ANOVA, OGT: Healthy vs UC P=0.0002, Healthy vs CD P=0.003; O-GlcNAc: Healthy vs UC P=0.0365, Healthy vs CD P=0.0125 A, B Representative images o O-GlcNAc (B) immunohistochemistry on paraffin-embedded colon sections from control, UC and CD patients (n = 4). Intensities of staining were scored on the right. Scale bars = 50 μm. (one-way ANOVA, OGT: Healthy vs UC P=0.0002, Healthy vs CD P=0.003; O-GlcNAc: Healthy vs UC P=0.0365, Healthy vs CD P=0.0125 C Levels of intestinal epithelial OGT and O-GlcNAcylation in a second cohort of control, UC, and CD patients. (one-way ANOVA, OGT: Control n=10, UC n=9, CD n=6; Control vs UC P=0.035, Control vs CD P=0.003; O-GlcNAc: Control n=10, UC n=8, CD n=8; Control vs UC P=0.0027, Control vs CD P=0.008 D, E Regression plots of average immune-staining scores of OGT and O-GlcNAcylation against histological scores in UC (D) and CD (E) (D: OGT n=19, O-GlcNAc n=18; E: OGT n=15, O-GlcNAc n=16) "}
{"words": ["Figure", "2A", "Body", "weight", "of", "male", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "at", "6", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", ",", "P", "=", "0", ".", "000015", ")", " ", "B", "Incidence", "of", "rectal", " ", "prolapse", "in", "male", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "WT", "n", "=", "17", ",", "KO", "n", "=", "9", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", " ", " ", "C", "Representative", "colonoscopy", "images", "of", "male", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", " ", " ", "D", "Body", "weight", "of", "female", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "at", "9", "weeks", "of", "age", "(", "WT", "n", "=", "11", ",", "heterozygous", "KO", "n", "=", "4", ",", "homozygous", "KO", "n", "=", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", " ", "E", "Incidence", "of", "rectal", "prolapse", "in", "female", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "WT", "n", "=", "9", ",", "heterozygous", "KO", "n", "=", "8", ",", "homozygous", "KO", "n", "=", "6", ",", "P", "=", "0", ".", "0439", ")", " ", "F", "H", "&", "E", "staining", "of", "duodenum", ",", "jejunum", ",", "ileum", ",", "colon", ",", "and", "rectum", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", " "], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Body weight of male wildtype and Vil-Ogt KO mice at 6 weeks of age (n = 6, P = 0.000015) B Incidence of rectal prolapse in male wildtype and Vil-Ogt KO mice (WT n = 17, KO n = 9, P < 0.0001)  C Representative colonoscopy images of male wildtype and Vil-Ogt KO mice  D Body weight of female wildtype and Vil-Ogt KO mice at 9 weeks of age (WT n = 11, heterozygous KO n = 4, homozygous KO n = 5, P < 0.0001)  E Incidence of rectal prolapse in female wildtype and Vil-Ogt KO mice (WT n = 9, heterozygous KO n = 8, homozygous KO n = 6, P = 0.0439) F H&E staining of duodenum, jejunum, ileum, colon, and rectum of 10-week-old male wildtype and Vil-Ogt KO mice. Scale bars = 100 μm "}
{"words": ["Figure", "6", " ", "A", "Numbers", "of", "Paneth", "cells", "in", "the", "ileum", "of", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "n", "=", "6", ",", "P", "=", "0", ".", "0048", ")", " ", " ", "B", "Representative", "electron", "microscopic", " ", "images", "of", "Paneth", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "1", "μm", " ", " ", "C", "Expression", "of", "AMP", "genes", "in", "ileum", "tissues", "of", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "n", "=", "6", ",", "Pan", "Defesin", "P", "=", "0", ".", "031", ",", "Defa3", "P", "=", "0", ".", "049", ",", "Defa4", "P", "=", "0", ".", "013", ",", "Defa5", "P", "=", "0", ".", "023", ",", "Defa6", "P", "=", "0", ".", "034", ",", "Ang4", "P", "=", "0", ".", "031", ")", " ", " ", "D", "Immunoblotting", "of", "LC3", "in", "IEC", "cells", "isolated", "from", "WT", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", " ", " ", "E", "Representative", "images", "of", "O", "-", "GlcNAc", " ", "staining", "in", "Paneth", "cells", "of", "male", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "mice", ".", "Stars", "indicate", "lysozyme", "-", "positive", "Paneth", "cells", " ", " ", "F", "Morphology", "and", "numbers", "of", "Paneth", "cells", "in", "the", "ileum", "of", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", ",", "P", "=", "0", ".", "024", ")", ".", "Arrow", "indicate", "Paneth", "cell", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", " ", " ", "G", "Expression", "of", "AMP", "genes", "in", "the", "ileum", "of", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "Pan", "Defesin", "P", "=", "0", ".", "0291", ",", "Defa3", "P", "=", "0", ".", "0462", ")", " ", " ", "H", "Representative", "images", "of", "cultured", "organoid", "on", "Day", "3", " ", " ", "I", "Expression", "of", "inflammatory", "markers", "in", "the", "ileum", "of", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", " ", " ", "J", "-", "L", "Antibiotic", "-", "treated", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "male", " ", "mice", "were", "transplanted", "with", "fecal", " ", "microbiota", "from", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "and", "then", "induced", "with", "DSS", "for", "colitis", ".", "Daily", "changes", "in", "body", "weight", "(", "J", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "(", "L", ":", "P", "=", "0", ".", "049", " ", "J", "-", "L", "Antibiotic", "-", "treated", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "male", " ", "mice", "were", "transplanted", "with", "fecal", " ", "microbiota", "from", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "and", "then", "induced", "with", "DSS", "for", "colitis", ".", "Daily", "changes", "i", "colitis", "scores", "(", "K", "are", "shown", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "(", "L", ":", "P", "=", "0", ".", "049", " ", "J", "-", "L", "Antibiotic", "-", "treated", "wildtype", "and", "Defa6", "-", "Ogt", "KO", "male", "mice", "were", "transplanted", "with", "fecal", " ", "microbiota", "from", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "and", "then", "induced", "with", "DSS", "for", "colitis", " ", "RT", "-", "qPCR", "of", "inflammatory", "genes", "in", "the", "ileum", "(", "L", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "(", "L", ":", "P", "=", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A Numbers of Paneth cells in the ileum of wildtype and Vil-Ogt KO mice (n = 6, P = 0.0048)  B Representative electron microscopic images of Paneth cells. Scale bars = 1 μm  C Expression of AMP genes in ileum tissues of wildtype and Vil-Ogt KO mice (n = 6, Pan Defesin P = 0.031, Defa3 P = 0.049, Defa4 P = 0.013, Defa5 P = 0.023, Defa6 P = 0.034, Ang4 P = 0.031)  D Immunoblotting of LC3 in IEC cells isolated from WT and Vil-Ogt KO mice  E Representative images of O-GlcNAc staining in Paneth cells of male wildtype and Defa6-Ogt KO mice. Stars indicate lysozyme-positive Paneth cells  F Morphology and numbers of Paneth cells in the ileum of wildtype and Defa6-Ogt KO mice (n = 5, P = 0.024). Arrow indicate Paneth cell. Scale bars = 10 μm  G Expression of AMP genes in the ileum of wildtype and Defa6-Ogt KO mice (n = 5 Pan Defesin P = 0.0291, Defa3 P = 0.0462)  H Representative images of cultured organoid on Day 3  I Expression of inflammatory markers in the ileum of wildtype and Defa6-Ogt KO mice (n = 5)  J-L Antibiotic-treated wildtype and Defa6-Ogt KO male mice were transplanted with fecal microbiota from Vil-Ogt KO mice and then induced with DSS for colitis. Daily changes in body weight (J) are shown (n = 4-5). (L: P = 0.049 J-L Antibiotic-treated wildtype and Defa6-Ogt KO male mice were transplanted with fecal microbiota from Vil-Ogt KO mice and then induced with DSS for colitis. Daily changes i colitis scores (K are shown (n = 4-5). (L: P = 0.049 J-L Antibiotic-treated wildtype and Defa6-Ogt KO male mice were transplanted with fecal microbiota from Vil-Ogt KO mice and then induced with DSS for colitis RT-qPCR of inflammatory genes in the ileum (L) are shown (n = 4-5). (L: P = 0.049"}
{"words": ["Figure", "7", "A", "Expression", "of", "phosphorylated", "and", "total", "STAT3", "and", "NF", "-", "κB", "p65", "in", "the", "colon", "of", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "B", "Ileum", "and", "colon", "IECs", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "wildtype", "and", "Vil", "-", "Ogt", "KO", "mice", "were", "isolated", "for", "RNA", "-", "sequencing", "analyses", ".", "The", "heatmaps", "of", "the", "sample", "-", "to", "-", "sample", "distances", "are", "shown", "C", "Volcano", "plots", "of", "gene", "expression", "changes", ".", "The", "x", "-", "axis", "specifies", "the", "fold", "-", "changes", "(", "FC", ")", "and", "the", "y", "-", "axis", "specifies", "the", "negative", "logarithm", "to", "the", "base", "10", "of", "the", "p", "-", "values", "adjusted", "for", "multiple", "testing", "with", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "procedure", ".", "FC", ">", "2", "and", "p", "<", "0", ".", "05", "genes", "are", "shown", "in", "solid", "dots", " ", "F", "Levels", "of", "STAT1", " ", "protein", "in", "IECs", "determined", "by", "immunoblotting", "and", "O", "-", "GlcNAc", "modification", "of", "STAT1", "determined", "by", "immunoprecipitation", "using", "the", "O", "-", "GlcNAc", "antibody", "followed", "by", "Immunoblotting", " ", " ", "G", ",", "H", "Caco", "-", "2", "cells", "were", "treated", "with", "100", "uM", "Ac45S", "-", "GlcNAc", "for", "24", "hours", ",", "levels", "of", "STAT1", "and", "global", "O", "-", "GlcNAcylatio", "were", "determined", " ", "G", ",", "H", "Caco", "-", "2", "cells", "were", "treated", "with", "100", "uM", "Ac45S", "-", "GlcNAc", "for", "24", "hours", ",", "levels", "of", "STAT1", "an", " ", "STAT1", " ", "O", "-", "GlcNAcylation", "(", "H", ")", "were", "determined", " ", "I", "siRNAs", "against", "scrambled", "sequence", "or", "human", " ", "OGT", "were", "transfected", "in", "293T", "cells", "and", "STAT1", "levels", "were", "determined", "48", "hours", "later", " ", " ", "J", "The", "pGAS", "-", "luc", "Cis", "-", "Reporter", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "siRNAs", "in", "293T", "cells", "for", "luciferase", "assay", "to", "determine", "the", "transcriptional", "activity", "of", "STAT1", "(", "n", "=", "4", ",", "P", "=", "0", ".", "0003", ")", " "], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 A Expression of phosphorylated and total STAT3 and NF-κB p65 in the colon of wildtype and Vil-Ogt KO mice  B Ileum and colon IECs from 10-week-old wildtype and Vil-Ogt KO mice were isolated for RNA-sequencing analyses. The heatmaps of the sample-to-sample distances are shown  C Volcano plots of gene expression changes. The x-axis specifies the fold-changes (FC) and the y-axis specifies the negative logarithm to the base 10 of the p-values adjusted for multiple testing with the Benjamini-Hochberg procedure. FC > 2 and p < 0.05 genes are shown in solid dots  F Levels of STAT1 protein in IECs determined by immunoblotting and O-GlcNAc modification of STAT1 determined by immunoprecipitation using the O-GlcNAc antibody followed by Immunoblotting  G, H Caco-2 cells were treated with 100 uM Ac45S-GlcNAc for 24 hours, levels of STAT1 and global O-GlcNAcylatio were determined G, H Caco-2 cells were treated with 100 uM Ac45S-GlcNAc for 24 hours, levels of STAT1 an STAT1 O-GlcNAcylation (H) were determined I siRNAs against scrambled sequence or human OGT were transfected in 293T cells and STAT1 levels were determined 48 hours later  J The pGAS-luc Cis-Reporter plasmid was co-transfected with siRNAs in 293T cells for luciferase assay to determine the transcriptional activity of STAT1 (n = 4, P=0.0003) "}
{"words": ["Figure", "8", " ", "A", ",", "B", "Wildtype", "mice", "were", "treated", "with", "H2O", "or", "TMG", "for", "2", "weeks", "before", "the", "induction", "of", "colitis", "by", "DSS", ".", "Daily", "changes", "in", "body", "weight", "(", "A", ")", "and", "colitis", "score", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "B", ":", "day6", "P", "=", "0", ".", "0171", ",", "day7", "P", "=", "0", ".", "0445", " ", " ", "C", "Intestinal", "barrier", "functional", "assays", "measuring", "serum", " ", "FITC", "-", "dextran", "before", "DSS", "treatment", "(", "n", "=", "5", ",", "P", "=", "0", ".", "0117", ")", " ", "D", "-", "G", "Albumin", "levels", "in", "feces", "(", "D", "on", "day", "4", "of", "recovery", "(", "n", "=", "5", ")", "colon", " ", "length", "(", "E", ")", "on", "day", "4", "of", "recovery", "(", "n", "=", "5", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "colon", "tissues", "(", "F", "on", "day", "4", "of", "recovery", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μmRT", "-", "qPCR", "of", "inflammatory", "genes", "in", "the", "colon", "(", "G", ")", "on", "day", "4", "of", "recovery", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", ".", "(", "E", ":", "P", "=", "0", ".", "0474", ";", "G", ":", "Tnfa", "P", "=", "0", ".", "0190", ",", "Il1b", "P", "=", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 A, B Wildtype mice were treated with H2O or TMG for 2 weeks before the induction of colitis by DSS. Daily changes in body weight (A) and colitis score (B) (n= 5). (B: day6 P = 0.0171, day7 P= 0.0445  C Intestinal barrier functional assays measuring serum FITC-dextran before DSS treatment (n = 5, P = 0.0117) D-G Albumin levels in feces (D on day 4 of recovery (n = 5)colon length (E) on day 4 of recovery (n = 5)H&E staining of colon tissues (F on day 4 of recovery (n = 5). Scale bars = 100 μmRT-qPCR of inflammatory genes in the colon (G) on day 4 of recovery (n = 5). Scale bars = 100 μm. (E: P = 0.0474; G: Tnfa P = 0.0190, Il1b P = 0.0301"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "M", ".", "tb", "RNA", "in", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "BMMs", ".", "ND", ",", "not", "detected", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μM", ".", "Data", "shown", "in", "(", "A", ")", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "for", "IFN", "-", "β", "mRNA", "(", "B", ")", "levels", "in", "wild", "type", "BMMs", "5", "and", "24", "hr", "post", "-", "treatment", "with", "EVs", "respectively", "(", "1", "μg", "/", "ml", "equals", "approximately", "3", "x", "108", "vesicles", "/", "ml", ")", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "IFN", "-", "β", "protein", "(", "C", ")", "levels", "in", "wild", "type", "BMMs", "5", "and", "24", "hr", "post", "-", "treatment", "with", "EVs", "respectively", "(", "1", "μg", "/", "ml", "equals", "approximately", "3", "x", "108", "vesicles", "/", "ml", ")", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "D", ")", "IFN", "-", "β", "mRNA", "level", "was", "quantified", "in", "wild", "type", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "at", "a", "concentration", "of", "10μg", "/", "ml", "for", "the", "times", "indicated", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "for", "IFN", "-", "β", "mRNA", "(", "E", ")", "levels", "in", "either", "WT", ",", "MAVS", "-", "and", "/", "or", "RIG", "-", "I", "-", "knockdown", "BMMs", "treated", "for", "4", "hr", "(", "E", ")", "with", "10µg", "/", "ml", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", ".", "(", "Control", ")", "negative", "control", "siRNA", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "IFN", "-", "β", "protein", "(", "F", ")", "levels", "in", "either", "WT", ",", "MAVS", "-", "and", "/", "or", "RIG", "-", "I", "-", "knockdown", "BMMs", "treated", "for", "24", "hr", "(", "F", ")", "with", "10µg", "/", "ml", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", ".", "(", "Control", ")", "negative", "control", "siRNA", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "G", ")", "Similar", "to", "above", "except", "using", "WT", "and", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "H", ")", "Similar", "to", "above", "except", "using", "WT", "and", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μM", ".", "Data", "shown", "in", "(", "H", ")", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "J", ")", "Top", "chamber", ":", "WT", "BMMs", ";", "Bottom", "chamber", ":", "WT", "or", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "Data", "shown", "in", "(", "J", ")", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "K", ")", "Western", "blot", "analysis", "for", "phospho", "-", "TBK1", "(", "Ser172", ")", "in", "WT", "and", "MAVS", "-", "knockdown", "BMMs", "treated", "for", "4", "hr", "with", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "of", "the", "western", "blots", "for", "(", "K", ")", "are", "shown", ".", "(", "L", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "IRF3", "under", "the", "conditions", "described", "above", "for", "TBK1", ".", "Histone", "H3", "(", "H3", ")", "and", "β", "-", "actin", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "nuclear", "fraction", "and", "whole", "-", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", "respectively", ".", "Densitometry", "of", "the", "western", "blots", "are", "shown", ".", "(", "M", ")", "Fluorescence", "microscopy", "analysis", "for", "nuclear", "translocation", "of", "IRF3", "in", "wild", "type", "BMMs", "untreated", "(", "Mock", ")", "or", "treated", "with", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μM", ".", "(", "N", ")", "IRF3", "nuclear", "translocation", "was", "analyzed", "in", "RIG", "-", "I", "-", "or", "MAVS", "-", "knockdown", "BMMs", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Quantitative RT-PCR analysis of M.tb RNA in EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) BMMs. ND, not detected. Scale bar, 20 μM. Data shown in (A) are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates).Quantitative RT-PCR analysis for IFN-β mRNA (B) levels in wild type BMMs 5 and 24 hr post-treatment with EVs respectively (1 μg/ml equals approximately 3 x 108 vesicles/ml). Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).IFN-β protein (C) levels in wild type BMMs 5 and 24 hr post-treatment with EVs respectively (1 μg/ml equals approximately 3 x 108 vesicles/ml). Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(D) IFN-β mRNA level was quantified in wild type BMMs treated with EVs at a concentration of 10μg/ml for the times indicated. Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).Quantitative RT-PCR analysis for IFN-β mRNA (E) levels in either WT, MAVS- and/or RIG-I-knockdown BMMs treated for 4 hr (E) with 10µg/ml EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages. (Control) negative control siRNA. Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).IFN-β protein (F) levels in either WT, MAVS- and/or RIG-I-knockdown BMMs treated for 24 hr (F) with 10µg/ml EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages. (Control) negative control siRNA. Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(G) Similar to above except using WT and Mavs -/- BMMs. Data shown are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(H) Similar to above except using WT and Mavs -/- BMMs. Scale bar, 20 μM. Data shown in (H) are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(J) Top chamber: WT BMMs; Bottom chamber: WT or Mavs -/- BMMs. Data shown in (J) are the mean ± SD (n = 3 wells per group) and all data shown are representative of three independent experiments (biological replicates). * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(K) Western blot analysis for phospho-TBK1 (Ser172) in WT and MAVS-knockdown BMMs treated for 4 hr with EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages. β-actin served as a loading control. Densitometry of the western blots for (K) are shown.(L) Western blot analysis of IRF3 under the conditions described above for TBK1. Histone H3 (H3) and β-actin were used as loading controls for nuclear fraction and whole-cell lysate (WCL) respectively. Densitometry of the western blots are shown.(M) Fluorescence microscopy analysis for nuclear translocation of IRF3 in wild type BMMs untreated (Mock) or treated with EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages. Scale bar, 20 μM.(N) IRF3 nuclear translocation was analyzed in RIG-I- or MAVS-knockdown BMMs. Scale bar, 20 μM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Yield", "of", "purified", "EVs", "from", "BMMs", "infected", "with", "various", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", "based", "on", "Nanosight", "analysis", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "EVs", "from", "cells", "infected", "with", "WT", ",", "∆", "esxA", "or", "esxA", "-", "complemented", "(", "∆", "esxA", "-", "C", ")", "M", ".", "tb", "Erdman", "strains", ".", "(", "C", ")", "Yield", "of", "purified", "EVs", "from", "BMMs", "infected", "with", "various", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", "based", "on", "Nanosight", "analysis", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "EVs", "from", "cells", "infected", "with", "WT", ",", "∆", "esxA", "or", "esxA", "-", "complemented", "(", "∆", "esxA", "-", "C", ")", "M", ".", "tb", "Erdman", "strains", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "for", "M", ".", "tb", "RNA", "in", "EVs", "from", "BMMs", "infected", "with", "various", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", "(", "E", ")", "ND", ",", "not", "detected", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "for", "M", ".", "tb", "RNA", "in", "EVs", "from", "BMMs", "infected", "with", "various", "M", ".", "tb", "Erdman", "strains", "(", "F", ")", ".", "ND", ",", "not", "detected", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "for", "IFN", "-", "β", "mRNA", "(", "G", ")", "in", "WT", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "for", "4", "hr", "and", "24", "hr", "respectively", ".", "The", "EVs", "were", "isolated", "from", "BMMs", "that", "were", "infected", "with", "the", "different", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "IFN", "-", "β", "protein", "(", "H", ")", "levels", "in", "WT", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "for", "4", "hr", "and", "24", "hr", "respectively", ".", "The", "EVs", "were", "isolated", "from", "BMMs", "that", "were", "infected", "with", "the", "different", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "I", ")", "ELISA", "analysis", "for", "IFN", "-", "β", "secreted", "by", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "plus", "liposomes", "containing", "M", ".", "tb", "RNA", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "for", "IFN", "-", "β", "mRNA", "(", "J", ")", "in", "WT", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "for", "4", "and", "24", "hr", "respectively", ".", "The", "EVs", "were", "isolated", "from", "BMMs", "that", "were", "infected", "with", "the", "different", "M", ".", "tb", "Erdman", "strains", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "IFN", "-", "β", "protein", "(", "K", ")", "levels", "in", "WT", "BMMs", "treated", "with", "EVs", "for", "4", "and", "24", "hr", "respectively", ".", "The", "EVs", "were", "isolated", "from", "BMMs", "that", "were", "infected", "with", "the", "different", "M", ".", "tb", "Erdman", "strains", ".", "Data", "shown", "in", "K", ")", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Yield of purified EVs from BMMs infected with various M.tb CDC 1551 strains based on Nanosight analysis. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments.(B) EVs from cells infected with WT, ∆esxA or esxA-complemented (∆esxA-C) M.tb Erdman strains.(C) Yield of purified EVs from BMMs infected with various M.tb CDC 1551 strains based on Nanosight analysis. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments.(D) EVs from cells infected with WT, ∆esxA or esxA-complemented (∆esxA-C) M.tb Erdman strains. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments.qRT-PCR analysis for M.tb RNA in EVs from BMMs infected with various M.tb CDC 1551 strains (E) ND, not detected. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).qRT-PCR analysis for M.tb RNA in EVs from BMMs infected with various M.tb Erdman strains (F). ND, not detected. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).qRT-PCR analysis for IFN-β mRNA (G) in WT BMMs treated with EVs for 4 hr and 24 hr respectively. The EVs were isolated from BMMs that were infected with the different M.tb CDC 1551 strains. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).IFN-β protein (H) levels in WT BMMs treated with EVs for 4 hr and 24 hr respectively. The EVs were isolated from BMMs that were infected with the different M.tb CDC 1551 strains. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(I) ELISA analysis for IFN-β secreted by BMMs treated with EVs plus liposomes containing M.tb RNA. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments.qRT-PCR analysis for IFN-β mRNA (J) in WT BMMs treated with EVs for 4 and 24 hr respectively. The EVs were isolated from BMMs that were infected with the different M.tb Erdman strains. Data shown are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments.IFN-β protein (K) levels in WT BMMs treated with EVs for 4 and 24 hr respectively. The EVs were isolated from BMMs that were infected with the different M.tb Erdman strains. Data shown in K) are the mean ± SD (n = 3 per group) and all data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3M", ".", "tb", "CFU", "in", "WT", "mouse", "BMMs", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "minus", "co", "-", "treatment", "with", "IFN", "-", "ɣ", ".", "BMMs", "were", "treated", "with", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "cells", "for", "0", ",", "24", ",", "48", "and", "72", "hr", "following", "a", "1", "hr", "M", ".", "tb", "infection", ".", "Mock", ",", "no", "EV", "treatment", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "M", ".", "tb", "CFU", "in", "WT", "mouse", "BMMs", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "plus", "(", "B", ")", "co", "-", "treatment", "with", "IFN", "-", "ɣ", ".", "BMMs", "were", "treated", "with", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "cells", "for", "0", ",", "24", ",", "48", "and", "72", "hr", "following", "a", "1", "hr", "M", ".", "tb", "infection", ".", "Mock", ",", "no", "EV", "treatment", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "(", "GFP", ")", "with", "lysosome", "marker", "Lamp", "-", "1", "in", "WT", "mouse", "BMMs", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "5", "hr", "with", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", "plus", "IFN", "-", "γ", ",", "and", "then", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "M", ".", "tb", "for", "24", "hr", "prior", "to", "immunostaining", ".", "quantitative", "analysis", "of", "M", ".", "tb", "colocalization", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "WT", "mouse", "BMMs", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "(", "GFP", ")", "with", "lysosome", "marker", "Lamp", "-", "1", "in", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "E", "and", "F", ")", "mouse", "BMMs", ".", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "5", "hr", "with", "EVs", "from", "uninfected", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "macrophages", "plus", "IFN", "-", "γ", ",", "and", "then", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "M", ".", "tb", "for", "24", "hr", "prior", "to", "immunostaining", ".", "quantitative", "analysis", "of", "M", ".", "tb", "colocalization", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "Mavs", "-", "/", "-", "mouse", "BMMs", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "as", "described", "above", "except", "using", "control", "siRNA", "-", "treated", "(", "G", "and", "H", ")", "BMMs", ".", "quantitative", "analysis", "of", "M", ".", "tb", "colocalization", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "control", "siRNA", "-", "treated", "mouse", "BMMs", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "as", "described", "above", "except", "using", "RIG", "-", "I", "siRNA", "-", "treated", "(", "I", "and", "J", ")", "BMMs", ".", "quantitative", "analysis", "of", "M", ".", "tb", "colocalization", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "RIG", "-", "I", "siRNA", "-", "treated", "mouse", "BMMs", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "M", ".", "tb", "CFU", "in", "infected", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "K", ")", "mouse", "BMMs", "pre", "-", "treated", "with", "IFN", "-", "ɣ", "plus", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "BMMs", ".", "CFU", "was", "determined", "immediately", "after", "the", "1", "hr", "infection", "or", "24", "and", "72", "hr", "post", "-", "infection", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "M", ".", "tb", "CFU", "in", "control", "siRNA", "-", "treated", "(", "L", ")", "or", "RIG", "-", "I", "siRNA", "-", "treated", "(", "M", ")", "mouse", "BMMs", "pre", "-", "treated", "with", "IFN", "-", "ɣ", "plus", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "BMMs", ".", "CFU", "was", "determined", "immediately", "after", "the", "1", "hr", "infection", "or", "24", "and", "72", "hr", "post", "-", "infection", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3M.tb CFU in WT mouse BMMs pre-treated with EVs minus co-treatment with IFN-ɣ. BMMs were treated with EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) cells for 0, 24, 48 and 72 hr following a 1 hr M.tb infection. Mock, no EV treatment. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. ; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.M.tb CFU in WT mouse BMMs pre-treated with EVs plus (B) co-treatment with IFN-ɣ. BMMs were treated with EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) cells for 0, 24, 48 and 72 hr following a 1 hr M.tb infection. Mock, no EV treatment. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. ; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy analysis for colocalization of M.tb (GFP) with lysosome marker Lamp-1 in WT mouse BMMs. Cells were pre-treated for 5 hr with EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages plus IFN-γ, and then infected with GFP-expressing M.tb for 24 hr prior to immunostaining. quantitative analysis of M.tb colocalization with Lamp-1 in WT mouse BMMs Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy analysis for colocalization of M.tb (GFP) with lysosome marker Lamp-1 in Mavs-/- (E and F) mouse BMMs. Cells were pre-treated for 5 hr with EVs from uninfected or M.tb-infected macrophages plus IFN-γ, and then infected with GFP-expressing M.tb for 24 hr prior to immunostaining. quantitative analysis of M.tb colocalization with Lamp-1 in Mavs-/- mouse BMMs Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy as described above except using control siRNA-treated (G and H) BMMs. quantitative analysis of M.tb colocalization with Lamp-1 in control siRNA-treated mouse BMMs Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy as described above except using RIG-I siRNA-treated (I and J) BMMs. quantitative analysis of M.tb colocalization with Lamp-1 in RIG-I siRNA-treated mouse BMMs Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.M.tb CFU in infected Mavs-/- (K) mouse BMMs pre-treated with IFN-ɣ plus EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) BMMs. CFU was determined immediately after the 1 hr infection or 24 and 72 hr post-infection. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. ; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.M.tb CFU in control siRNA-treated (L) or RIG-I siRNA-treated (M) mouse BMMs pre-treated with IFN-ɣ plus EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) BMMs. CFU was determined immediately after the 1 hr infection or 24 and 72 hr post-infection. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "WT", "BMMs", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "from", "macrophages", "infected", "with", "WT", ",", "∆", "secA2", "or", "secA2", "-", "complemented", "(", "∆", "secA2", "-", "C", ")", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", ".", "The", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "supplemented", "with", "recombinant", "mouse", "IFN", "-", "γ", "for", "5", "hr", "and", "subsequently", "infected", "for", "24", "hr", "with", "GFP", "-", "expressing", "M", ".", "tb", ".", "(", "B", ")", "quantitative", "analysis", "for", "the", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "Lamp", "-", "1", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "M", ".", "tb", "CFU", "in", "WT", "BMMs", "pre", "-", "pretreated", "with", "recombinant", "mouse", "IFN", "-", "γ", "and", "EVs", "from", "macrophages", "infected", "with", "WT", ",", "∆", "secA2", "or", "secA2", "-", "complemented", "(", "∆", "secA2", "-", "C", ")", "M", ".", "tb", "CDC", "1551", "strains", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", "liposomes", "containing", "RNA", "isolated", "from", "EVs", "released", "from", "BMMs", "infected", "with", "WT", "M", ".", "tb", "were", "also", "added", "to", "cells", "5", "hr", "prior", "to", "infection", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "F", ")", "liposome", "-", "encapsulated", "RNA", "isolated", "from", "EVs", "released", "from", "BMMs", "infected", "with", "WT", "M", ".", "tb", "was", "included", "during", "EV", "and", "IFN", "-", "γ", "pre", "-", "treatment", ".", "Data", "shown", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Immunofluorescence microscopy analysis for colocalization of M.tb with Lamp-1 in WT BMMs pre-treated with EVs from macrophages infected with WT, ∆secA2 or secA2-complemented (∆secA2-C) M.tb CDC 1551 strains. The cells were pre-treated with EVs supplemented with recombinant mouse IFN-γ for 5 hr and subsequently infected for 24 hr with GFP-expressing M.tb. (B) quantitative analysis for the colocalization of M.tb with Lamp-1. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM ; * p < 0.05 and ** p < 0.01 by two-tailed Student's t-test.(C) M.tb CFU in WT BMMs pre-pretreated with recombinant mouse IFN-γ and EVs from macrophages infected with WT, ∆secA2 or secA2-complemented (∆secA2-C) M.tb CDC 1551 strains. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05 and ** p < 0.01 by two-tailed Student's t-test.(D) and (E) liposomes containing RNA isolated from EVs released from BMMs infected with WT M.tb were also added to cells 5 hr prior to infection. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM n.s., not significant(F) liposome-encapsulated RNA isolated from EVs released from BMMs infected with WT M.tb was included during EV and IFN-γ pre-treatment. Data shown are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05 and ** p < 0.01 by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5Immunofluorescence", "microscopy", "and", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "autophagosome", "marker", "LC3", "in", "control", "siRNA", "-", "treated", "BMMs", "that", "were", "untreated", "or", "pre", "-", "treated", "for", "5", "hr", "with", "recombinant", "mouse", "IFN", "-", "γ", "and", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "macrophages", "followed", "by", "a", "24", "hr", "infection", "with", "GFP", "-", "expressing", "M", ".", "tb", ".", "Mock", ",", "untreated", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "and", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "autophagosome", "marker", "LC3", "(", "C", "and", "D", ")", "in", "RIG", "-", "I", "siRNA", "-", "treated", "BMMs", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "and", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "markers", "LC3", "in", "WT", "BMMs", "that", "were", "left", "untreated", "or", "pre", "-", "treated", "for", "5", "hr", "with", "recombinant", "mouse", "IFN", "-", "γ", "and", "EVs", "from", "uninfected", "(", "EVs", "_", "Control", ")", "or", "M", ".", "tb", "-", "infected", "(", "EVs", "_", "M", ".", "tb", ")", "macrophages", ",", "followed", "by", "a", "24", "hr", "infection", "with", "GFP", "-", "expressing", "M", ".", "tb", ".", "Mock", ",", "untreated", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "and", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "markers", "LC3", "in", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "NOX2", "(", "I", "and", "J", ")", "as", "described", "above", "in", "WT", "BMMs", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "p47phox", "(", "K", "and", "L", ")", "as", "described", "above", "in", "WT", "BMMs", ".", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "similar", "to", "(", "I", "-", "L", ")", ",", "but", "using", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "NOX2", "(", "M", "and", "N", ")", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "quantitative", "analysis", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "similar", "to", "(", "I", "-", "L", ")", ",", "but", "using", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", ".", "p47phox", "(", "O", "and", "P", ")", "Quantitative", "data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "infections", "and", "all", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunofluorescence microscopy and quantitative analysis for colocalization of M.tb with autophagosome marker LC3 in control siRNA -treated BMMs that were untreated or pre-treated for 5 hr with recombinant mouse IFN-γ and EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) macrophages followed by a 24 hr infection with GFP-expressing M.tb. Mock, untreated. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy and quantitative analysis for colocalization of M.tb with autophagosome marker LC3 (C and D) in RIG-I siRNA-treated BMMs. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.(E and F) Immunofluorescence microscopy and quantitative analysis for colocalization of M.tb with markers LC3 in WT BMMs that were left untreated or pre-treated for 5 hr with recombinant mouse IFN-γ and EVs from uninfected (EVs_Control) or M.tb-infected (EVs_M.tb) macrophages, followed by a 24 hr infection with GFP-expressing M.tb. Mock, untreated. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy and quantitative analysis for colocalization of M.tb with markers LC3 in Mavs -/- BMMs. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy quantitative analysis for colocalization of M.tb with NOX2 (I and J) as described above in WT BMMs. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy quantitative analysis for colocalization of M.tb with p47phox (K and L) as described above in WT BMMs. Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy quantitative analysis for colocalization of M.tb similar to ( I -L), but using Mavs -/- BMMs. NOX2 (M and N) Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test.Immunofluorescence microscopy quantitative analysis for colocalization of M.tb similar to ( I -L), but using Mavs -/- BMMs. p47phox (O and P) Quantitative data are the mean ± SD of three independent infections and all data shown are representative of at least three independent experiments. Scale bar, 5 μM. n.s., not significant; * p < 0.05 , ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "and", "B", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "for", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "Lamp", "-", "1", "in", "WT", "(", "A", ")", "and", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "B", ")", "BMMs", "infected", "with", "M", ".", "tb", "for", "24", "hr", "and", "then", "treated", "for", "an", "additional", "24", "hr", "with", "moxifloxacin", "(", "MFX", ")", "and", "/", "or", "EVs", "from", "M", ".", "tb", "-", "infected", "BMMs", "(", "EVs", "+", "MFX", ")", "in", "the", "presence", "of", "recombinant", "mouse", "IFN", "-", "ɣ", ".", "Mock", ",", "no", "EVs", "or", "moxifloxacin", "treatment", ";", "EVs", "_", "Control", ",", "EVs", "from", "uninfected", "BMMs", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "LC3", "(", "C", ")", ",", "colocalization", "with", "M", ".", "tb", "were", "analyzed", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "NOX2", "(", "D", ")", "colocalization", "with", "M", ".", "tb", "were", "analyzed", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "p47phox", "(", "E", ")", "colocalization", "with", "M", ".", "tb", "were", "analyzed", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", "were", "used", "and", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "LC3", "(", "F", ")", "were", "quantified", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", "were", "used", "and", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "NOX2", "(", "G", ")", "were", "quantified", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "Mavs", "-", "/", "-", "BMMs", "were", "used", "and", "colocalization", "of", "M", ".", "tb", "with", "p47phox", "(", "H", ")", "were", "quantified", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "M", ".", "tb", "CFU", "analysis", "in", "WT", "(", "I", ")", "and", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "J", ")", "BMMs", "infected", "with", "M", ".", "tb", "for", "24", "hr", "followed", "by", "treatment", "with", "EVs", ",", "moxifloxacin", "or", "combination", "in", "the", "presence", "of", "IFN", "-", "ɣ", "for", "24", "and", "72", "hr", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "infections", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A and B) Quantitative analysis of immunofluorescence microscopy images for colocalization of M.tb with Lamp-1 in WT (A) and Mavs -/- (B) BMMs infected with M.tb for 24 hr and then treated for an additional 24 hr with moxifloxacin (MFX) and/or EVs from M.tb-infected BMMs (EVs+MFX) in the presence of recombinant mouse IFN-ɣ. Mock, no EVs or moxifloxacin treatment; EVs_Control, EVs from uninfected BMMs. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).LC3 (C), colocalization with M.tb were analyzed. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).NOX2 (D) colocalization with M.tb were analyzed. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).p47phox (E) colocalization with M.tb were analyzed. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).Mavs -/- BMMs were used and colocalization of M.tb with LC3 (F) were quantified. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).Mavs -/- BMMs were used and colocalization of M.tb with NOX2 (G) were quantified. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).Mavs -/- BMMs were used and colocalization of M.tb with p47phox (H) were quantified. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).(I and J) M.tb CFU analysis in WT (I) and Mavs -/- (J) BMMs infected with M.tb for 24 hr followed by treatment with EVs, moxifloxacin or combination in the presence of IFN-ɣ for 24 and 72 hr. Data shown are representative of three independent infections. The results are the mean ± SD of three independent experiments. n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed)."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "histopathological", "analysis", "for", "lung", "sections", "of", "WT", "(", "B", ")", "mice", "that", "were", "infected", "with", "M", ".", "tb", "and", "subsequent", "left", "untreated", "(", "Mock", ")", "or", "treated", "with", "EVs", "from", "uninfected", "BMMs", "(", "EVs", "_", "Control", ")", ",", "EVs", "from", "M", ".", "tb", "-", "infected", "BMMs", "(", "EVs", ")", ",", "moxifloxacin", "(", "MXF", ")", ",", "or", "combination", "of", "EVs", "and", "MXF", "(", "EVs", "+", "MXF", ")", ".", "Data", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μMM", ".", "tb", "CFU", "in", "the", "lung", "and", "spleen", "of", "WT", "(", "C", ")", "mice", "treated", "with", "EVs", ",", "MXF", "or", "combination", "of", "both", ".", "Data", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "Representative", "histopathological", "analysis", "for", "lung", "sections", "of", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "D", ")", "mice", "that", "were", "infected", "with", "M", ".", "tb", "and", "subsequent", "left", "untreated", "(", "Mock", ")", "or", "treated", "with", "EVs", "from", "uninfected", "BMMs", "(", "EVs", "_", "Control", ")", ",", "EVs", "from", "M", ".", "tb", "-", "infected", "BMMs", "(", "EVs", ")", ",", "moxifloxacin", "(", "MXF", ")", ",", "or", "combination", "of", "EVs", "and", "MXF", "(", "EVs", "+", "MXF", ")", ".", "Data", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μMM", ".", "tb", "CFU", "in", "the", "lung", "and", "spleen", "of", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "E", ")", "mice", "treated", "with", "EVs", ",", "MXF", "or", "combination", "of", "both", ".", "Data", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", ".", "ELISA", "analysis", "for", ",", "IFN", "-", "β", ",", "TNF", "-", "α", ",", "IL", "-", "1β", "and", "IFN", "-", "γ", "protein", "level", "in", "serum", "isolate", "from", "M", ".", "tb", "-", "infected", "WT", "(", "F", ")", "or", "Mavs", "-", "/", "-", "(", "G", ")", "mice", "treated", "with", "EVs", ",", "MXF", "or", "a", "combination", "of", "both", ".", "Data", "shown", "is", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "results", "are", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "tailed", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative histopathological analysis for lung sections of WT (B) mice that were infected with M.tb and subsequent left untreated (Mock) or treated with EVs from uninfected BMMs (EVs_Control), EVs from M.tb-infected BMMs (EVs), moxifloxacin (MXF), or combination of EVs and MXF (EVs+MXF). Data shown is representative of two independent experiments. The results are the mean ± SD (n = 4 mice per group). Scale bar, 100 μMM.tb CFU in the lung and spleen of WT (C) mice treated with EVs, MXF or combination of both. Data shown is representative of two independent experiments. The results are the mean ± SD (n = 4 mice per group). n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).Representative histopathological analysis for lung sections of Mavs -/- (D) mice that were infected with M.tb and subsequent left untreated (Mock) or treated with EVs from uninfected BMMs (EVs_Control), EVs from M.tb-infected BMMs (EVs), moxifloxacin (MXF), or combination of EVs and MXF (EVs+MXF). Data shown is representative of two independent experiments. The results are the mean ± SD (n = 4 mice per group). Scale bar, 100 μMM.tb CFU in the lung and spleen of Mavs -/- (E) mice treated with EVs, MXF or combination of both. Data shown is representative of two independent experiments. The results are the mean ± SD (n = 4 mice per group). n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed).ELISA analysis for, IFN-β, TNF-α, IL-1β and IFN-γ protein level in serum isolate from M.tb-infected WT (F) or Mavs -/- (G) mice treated with EVs, MXF or a combination of both. Data shown is representative of two independent experiments. The results are the mean ± SD (n = 4 mice per group). n.s., not significant; * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 by Student's t-test (two tailed)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "images", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "-", "stained", "testicular", "sections", "from", "the", "patient", "(", "V", ":", "3", ")", "and", "a", "man", "diagnosed", "with", "obstructive", "azoospermia", ",", "serving", "as", "the", "control", ".", "The", "magnified", "view", "of", "the", "boxed", "area", "is", "shown", "in", "the", "lower", "left", "corner", "of", "the", "image", "from", "the", "patient", ".", "The", "blue", "arrow", "indicates", "unaligned", "chromosomes", "in", "the", "representative", "metaphase", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "testicular", "sections", "from", "control", "and", "patient", "V", ":", "3", "with", "antibodies", "against", "H3S10p", "(", "red", ")", ",", "a", "marker", "of", "metaphase", "cells", ".", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "The", "magnified", "view", "of", "the", "red", "box", "is", "shown", "in", "the", "lower", "left", "corner", "of", "the", "image", "from", "the", "patient", ".", "Sanger", "sequencing", "chromatograms", "showing", "the", "homozygous", "M1AP", "splicing", "mutation", "in", "patients", "and", "heterozygous", "mutation", "in", "their", "fertile", "brother", ".", "The", "arrowhead", "indicates", "the", "position", "of", "the", "mutation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative images of hematoxylin and eosin-stained testicular sections from the patient (V:3) and a man diagnosed with obstructive azoospermia, serving as the control. The magnified view of the boxed area is shown in the lower left corner of the image from the patient. The blue arrow indicates unaligned chromosomes in the representative metaphase cells. Scale bars, 50 μm.Immunofluorescence staining of testicular sections from control and patient V:3 with antibodies against H3S10p (red), a marker of metaphase cells. The nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue). The magnified view of the red box is shown in the lower left corner of the image from the patient.Sanger sequencing chromatograms showing the homozygous M1AP splicing mutation in patients and heterozygous mutation in their fertile brother. The arrowhead indicates the position of the mutation."}
{"words": ["Figure", "2Western", "blot", "analysis", "of", "M1AP", "expression", "in", "various", "tissues", "from", "adult", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "mice", ".", "GAPDH", "served", "as", "the", "loading", "control", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "M1AP", "expression", "in", "testes", "from", "mice", "at", "different", "days", "postpartum", "(", "dpp", ")", ".", "GAPDH", "served", "as", "the", "loading", "control", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "M1AP", "(", "green", ")", "and", "SYCP3", "(", "red", ")", "on", "spermatocyte", "spreads", "of", "WT", "or", "Spo11", "-", "/", "-", "mice", ".", "Quantification", "of", "M1AP", "foci", "in", "WT", "spermatocytes", "at", "the", "indicated", "stages", ".", "L", ",", "leptotene", ";", "E", "/", "MZ", ",", "early", "/", "mid", "zygotene", ";", "LZ", ",", "late", "zygotene", ";", "EP", ",", "early", "pachytene", ";", "M", "/", "LP", ",", "mid", "/", "late", "pachytene", ";", "Z", "-", "like", ",", "zygotene", "-", "like", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blot analysis of M1AP expression in various tissues from adult wild-type (WT) mice. GAPDH served as the loading control.Western blot analysis of M1AP expression in testes from mice at different days postpartum (dpp). GAPDH served as the loading control.Immunofluorescence staining of M1AP (green) and SYCP3 (red) on spermatocyte spreads of WT or Spo11-/- mice.Quantification of M1AP foci in WT spermatocytes at the indicated stages. L, leptotene; E/MZ, early/mid zygotene; LZ, late zygotene; EP, early pachytene; M/LP, mid/late pachytene; Z-like, zygotene-like."}
{"words": ["Figure", "3Testicular", "histology", "from", "8", "-", "week", "-", "old", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "mice", ".", "The", "magnified", "view", "of", "the", "boxed", "area", "is", "shown", "in", "the", "lower", "left", "corner", "of", "the", "image", "of", "M1apKI", "/", "KI", "mice", ".", "The", "blue", "arrow", "indicates", "unaligned", "chromosomes", "in", "the", "representative", "metaphase", "cells", ".", "Meiotic", "metaphase", "I", "(", "MMI", ")", "spermatocytes", "stained", "with", "Giemsa", ".", "The", "arrows", "indicate", "univalent", "chromosomes", ".", "Number", "of", "bivalents", "per", "nucleus", ".", "Frequencies", "of", "nuclei", "with", "univalents", ".", "Frequencies", "of", "nuclei", "with", "only", "XY", "univalents", ",", "only", "autosome", "univalents", ",", "or", "both", "XY", "and", "autosome", "univalents", ".", "Representative", "spread", "spermatocytes", "stained", "for", "SYCP3", "(", "green", ")", "and", "MLH1", "(", "red", ")", ".", "Number", "of", "MLH1", "foci", "per", "nucleus", ".", "Frequencies", "of", "autosomal", "chromosomes", "with", "0", ",", "1", ",", "and", "2", "or", "3", "MLH1", "foci", ".", "Frequencies", "of", "nuclei", "with", "an", "MLH1", "focus", "at", "the", "pseudoautosomal", "region", "(", "PAR", ")", "of", "XY", "chromosomes", ".", "Representative", "spread", "spermatocytes", "stained", "for", "the", "lateral", "element", "(", "SYCP3", ",", "green", ")", "and", "the", "central", "element", "(", "SIX6OS1", ",", "red", ")", "in", "early", "and", "mid", "/", "late", "pachynema", ".", "Miniaturized", "H1t", "staining", "(", "white", ")", "images", "are", "shown", "in", "the", "left", "lower", "corner", "of", "the", "overlay", "images", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "untouching", "XY", "chromosomes", ".", "Quantification", "of", "nuclei", "with", "XY", "untouching", "in", "early", "and", "mid", "/", "late", "pachynema", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Testicular histology from 8-week-old control and M1apKI/KI mice. The magnified view of the boxed area is shown in the lower left corner of the image of M1apKI/KI mice. The blue arrow indicates unaligned chromosomes in the representative metaphase cells.Meiotic metaphase I (MMI) spermatocytes stained with Giemsa. The arrows indicate univalent chromosomes.Number of bivalents per nucleus.Frequencies of nuclei with univalents.Frequencies of nuclei with only XY univalents, only autosome univalents, or both XY and autosome univalents.Representative spread spermatocytes stained for SYCP3 (green) and MLH1 (red).Number of MLH1 foci per nucleus.Frequencies of autosomal chromosomes with 0, 1, and 2 or 3 MLH1 foci.Frequencies of nuclei with an MLH1 focus at the pseudoautosomal region (PAR) of XY chromosomes.Representative spread spermatocytes stained for the lateral element (SYCP3, green) and the central element (SIX6OS1, red) in early and mid/late pachynema. Miniaturized H1t staining (white) images are shown in the left lower corner of the overlay images. The arrows indicate the untouching XY chromosomes.Quantification of nuclei with XY untouching in early and mid/late pachynema."}
{"words": ["Figure", "4Immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "SYCP3", "(", "red", ")", "and", "MSH4", "(", "green", ")", "on", "spermatocyte", "spreads", ".", "The", "mean", "number", "of", "MSH4", "foci", "per", "nucleus", "in", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "spermatocytes", "at", "the", "indicated", "stages", ".", "Immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "SYCP3", "(", "red", ")", "and", "RAD51", "(", "green", ")", "on", "spermatocyte", "spreads", ".", "The", "mean", "number", "of", "RAD51", "foci", "per", "nucleus", "in", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "spermatocytes", "at", "the", "indicated", "stages", ".", "Immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "SYCP3", "(", "red", ")", "and", "DMC1", "(", "green", ")", "on", "spermatocyte", "spreads", ".", "The", "mean", "number", "of", "DMC1", "foci", "per", "nucleus", "in", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "spermatocytes", "at", "the", "indicated", "stages", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunofluorescence staining with antibodies against SYCP3 (red) and MSH4 (green) on spermatocyte spreads.The mean number of MSH4 foci per nucleus in control and M1apKI/KI spermatocytes at the indicated stages.Immunofluorescence staining with antibodies against SYCP3 (red) and RAD51 (green) on spermatocyte spreads.The mean number of RAD51 foci per nucleus in control and M1apKI/KI spermatocytes at the indicated stages.Immunofluorescence staining with antibodies against SYCP3 (red) and DMC1 (green) on spermatocyte spreads.The mean number of DMC1 foci per nucleus in control and M1apKI/KI spermatocytes at the indicated stages."}
{"words": ["Figure", "5Western", "blot", "analysis", "of", "M1AP", "and", "TEX11", "expression", "in", "fetal", "ovaries", "(", "16", ".", "5", "days", "postcoitum", "(", "dpc", ")", ")", "and", "testes", "(", "14", "dpp", ")", "from", "WT", "mice", ".", "GAPDH", "served", "as", "the", "loading", "control", ".", "Immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "SYCP3", "(", "red", ")", "and", "MLH3", "(", "green", ")", "on", "oocyte", "spreads", "from", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "embryos", "(", "18", ".", "5", "dpc", ")", ".", "Number", "of", "MLH3", "foci", "per", "cell", "in", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "oocytes", ".", "Representative", "haemotoxylin", "-", "stained", "ovarian", "sections", "of", "5", "-", "dpp", "-", "old", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "mice", ".", "Follicle", "counts", "and", "total", "oocyte", "counts", "per", "ovary", "at", "5", "dpp", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Western blot analysis of M1AP and TEX11 expression in fetal ovaries (16.5 days postcoitum (dpc)) and testes (14 dpp) from WT mice. GAPDH served as the loading control.Immunofluorescence staining with antibodies against SYCP3 (red) and MLH3 (green) on oocyte spreads from control and M1apKI/KI embryos (18.5 dpc). Number of MLH3 foci per cell in control and M1apKI/KI oocytes.Representative haemotoxylin-stained ovarian sections of 5-dpp-old control and M1apKI/KI mice. Follicle counts and total oocyte counts per ovary at 5 dpp."}
{"words": ["Figure", "6Co", "-", "IP", "using", "anti", "-", "M1AP", "antibody", "with", "whole", "-", "testis", "lysates", "of", "WT", "mice", "and", "M1ap", "-", "/", "-", "mice", ",", "followed", "by", "western", "blot", "analyses", "of", "M1AP", ",", "SHOC1", ",", "and", "TEX11", ".", "Co", "-", "IP", "detecting", "the", "interaction", "between", "M1AP", "(", "fused", "with", "an", "N", "-", "terminal", "MYC", "tag", ")", "and", "each", "of", "the", "ZZS", "complex", "components", "(", "fused", "with", "an", "N", "-", "terminal", "GFP", "tag", ")", "exogenously", "expressed", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Co-IP using anti-M1AP antibody with whole-testis lysates of WT mice and M1ap-/- mice, followed by western blot analyses of M1AP, SHOC1, and TEX11.Co-IP detecting the interaction between M1AP (fused with an N-terminal MYC tag) and each of the ZZS complex components (fused with an N-terminal GFP tag) exogenously expressed in HEK-293T cells."}
{"words": ["Figure", "7Immunofluorescence", "staining", "of", "M1AP", "(", "green", ")", "and", "TEX11", "(", "red", ")", "on", "the", "spermatocyte", "spreads", "of", "WT", "mice", ".", "Ratios", "of", "M1AP", "-", "TEX11", "co", "-", "localizing", "foci", "to", "the", "M1AP", "total", "foci", "or", "TEX11", "total", "foci", "at", "the", "indicated", "meiotic", "prophase", "substages", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "ratio", "calculated", "from", "one", "nucleus", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "M1AP", "(", "green", ")", "and", "DMC1", "(", "red", ")", "on", "the", "spermatocyte", "spreads", "of", "WT", "mice", ".", "Ratios", "of", "M1AP", "-", "DMC1", "co", "-", "localizing", "foci", "to", "the", "M1AP", "total", "foci", "or", "DMC1", "total", "foci", "at", "the", "indicated", "meiotic", "prophase", "substages", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "ratio", "calculated", "from", "one", "nucleus", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "M1AP", "(", "green", ")", "and", "RPA2", "(", "red", ")", "on", "the", "spermatocyte", "spreads", "of", "WT", "mice", ".", "Ratios", "of", "M1AP", "-", "RPA2", "co", "-", "localizing", "foci", "to", "the", "M1AP", "total", "foci", "or", "RPA2", "total", "foci", "at", "the", "indicated", "meiotic", "prophase", "substages", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "ratio", "calculated", "from", "one", "nucleus", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "TEX11", "(", "green", ")", "and", "SYCP3", "(", "red", ")", "on", "the", "spermatocyte", "spreads", "of", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "testes", ".", "The", "mean", "number", "of", "TEX11", "foci", "per", "cell", "in", "control", "and", "M1apKI", "/", "KI", "spermatocytes", ".", "Frequencies", "of", "nuclei", "with", "TEX11", "foci", "detected", "at", "the", "PAR", "in", "spread", "early", "pachytene", "spermatocytes", "with", "touching", "XY", "chromosomes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Immunofluorescence staining of M1AP (green) and TEX11 (red) on the spermatocyte spreads of WT mice.   Ratios of M1AP-TEX11 co-localizing foci to the M1AP total foci or TEX11 total foci at the indicated meiotic prophase substages. Each dot represents the ratio calculated from one nucleus.  Immunofluorescence staining of M1AP (green) and DMC1 (red) on the spermatocyte spreads of WT mice.   Ratios of M1AP-DMC1 co-localizing foci to the M1AP total foci or DMC1 total foci at the indicated meiotic prophase substages. Each dot represents the ratio calculated from one nucleus. Immunofluorescence staining of M1AP (green) and RPA2 (red) on the spermatocyte spreads of WT mice.   Ratios of M1AP-RPA2 co-localizing foci to the M1AP total foci or RPA2 total foci at the indicated meiotic prophase substages. Each dot represents the ratio calculated from one nucleus.  Immunofluorescence staining of TEX11 (green) and SYCP3 (red) on the spermatocyte spreads of control and M1apKI/KI testes.   The mean number of TEX11 foci per cell in control and M1apKI/KI spermatocytes.   Frequencies of nuclei with TEX11 foci detected at the PAR in spread early pachytene spermatocytes with touching XY chromosomes.  "}
{"words": ["Figure", "1A", "Speed", "of", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "penetration", "into", "fibroblasts", "during", "60", "min", "of", "fixation", "with", "either", "4", "%", "PFA", "or", "3", "%", "glyoxal", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Glyoxal", "fixation", "enables", "PI", "to", "penetrate", "far", "more", "rapidly", "into", "the", "cells", ".", "B", "Speed", "of", "FM", "1", "-", "43", "penetration", "in", "similar", "experiments", ".", "The", "arrowhead", "points", "to", "one", "example", "of", "ongoing", "endocytosis", "during", "PFA", "fixation", ".", "N", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ".", "The", "general", "pattern", "of", "FM", "1", "-", "43", "entry", "was", "similar", "to", "that", "of", "propidium", "iodide", ".", "Only", "the", "first", "10", "minutes", "are", "shown", ",", "to", "enable", "an", "optimal", "observation", "of", "the", "kinetics", "of", "the", "first", "stages", "of", "FM", "1", "-", "43", "entry", ".", "The", "results", "parallel", "those", "obtained", "with", "PI", ":", "faster", "penetration", "during", "glyoxal", "fixation", ".", "Scale", "bar", "=", "40", "µm", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Speed of propidium iodide (PI) penetration into fibroblasts during 60 min of fixation with either 4 % PFA or 3 % glyoxal. N = 3 independent experiments. Glyoxal fixation enables PI to penetrate far more rapidly into the cells.B Speed of FM 1-43 penetration in similar experiments. The arrowhead points to one example of ongoing endocytosis during PFA fixation. N = 3-4 independent experiments. The general pattern of FM 1-43 entry was similar to that of propidium iodide. Only the first 10 minutes are shown, to enable an optimal observation of the kinetics of the first stages of FM 1-43 entry. The results parallel those obtained with PI: faster penetration during glyoxal fixation. Scale bar = 40 µm, * p < 0.05, ** p < 0.01"}
{"words": ["Figure", "2", "Figure", "2", "A", "comparison", "of", "morphological", "changes", "taking", "place", "during", "fixation", "with", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "The", "changes", "were", "visualized", "by", "DIC", "images", "taken", "at", "5", "minute", "intervals", "during", "fixation", ".", "The", "graph", "shows", "the", "correlation", "of", "each", "image", "to", "the", "first", "frame", ".", "N", "=", "50", "(", "PFA", ")", "and", "54", "(", "glyoxal", ")", "cellular", "regions", "analyzed", ",", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "higher", "correlation", "value", "indicates", "that", "glyoxal", "preserves", "the", "initial", "cell", "morphology", "with", "higher", "accuracy", "than", "PFA", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Figure 2 A comparison of morphological changes taking place during fixation with PFA or glyoxal. The changes were visualized by DIC images taken at 5 minute intervals during fixation. The graph shows the correlation of each image to the first frame. N = 50 (PFA) and 54 (glyoxal) cellular regions analyzed, from 3 independent experiments. The higher correlation value indicates that glyoxal preserves the initial cell morphology with higher accuracy than PFA. Scale bar = 20 µm, * p < 0.05, ** p < 0.01 "}
{"words": ["Figure", "3A", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "showing", "rat", "brain", "cytoplasm", "incubated", "for", "60", "min", "with", "different", "fixatives", ".", "The", "graph", "shows", "the", "summed", "intensity", "of", "the", "bands", "in", "each", "lane", ".", "Fixed", "proteins", "either", "no", "longer", "run", "into", "the", "gel", "or", "form", "only", "smears", ".", "To", "compare", "the", "efficiency", "of", "fixation", ",", "the", "bands", "that", "survive", "fixation", "were", "summed", "and", "were", "expressed", "as", "%", "of", "an", "unfixed", "control", ".", "The", "intensity", "of", "PFA", "-", "fixed", "samples", "was", "significantly", "higher", "than", "that", "of", "glyoxal", "-", "fixed", "samples", "(", "N", "=", "5", "independent", "experiments", ")", ".", "Glut", "=", "0", ".", "2", "%", "glutaraldehyde", ".", "B", "Staining", "of", "nucleic", "acids", "after", "fixation", ".", "The", "propidium", "iodide", "signal", "in", "fibroblasts", "was", "significantly", "higher", "for", "samples", "fixed", "with", "glyoxal", "pH", "4", "(", "N", "=", "6", "-", "8", ")", ".", "To", "test", "whether", "the", "fixed", "nucleic", "acids", "were", "still", "available", "for", "specific", "detection", ",", "we", "performed", "FISH", "for", "GAPDH", "in", "cultured", "neurons", ",", "using", "a", "standard", "protocol", "provided", "by", "the", "company", "Affymetrix", ".", "The", "fluorescence", "signal", "of", "the", "samples", "fixed", "with", "glyoxal", "(", "pH", "4", ")", "was", "significantly", "higher", "than", "for", "PFA", "-", "fixed", "samples", "(", "N", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A SDS-PAGE gel showing rat brain cytoplasm incubated for 60 min with different fixatives. The graph shows the summed intensity of the bands in each lane. Fixed proteins either no longer run into the gel or form only smears. To compare the efficiency of fixation, the bands that survive fixation were summed and were expressed as % of an unfixed control. The intensity of PFA-fixed samples was significantly higher than that of glyoxal-fixed samples (N = 5 independent experiments). Glut = 0.2% glutaraldehyde.B Staining of nucleic acids after fixation. The propidium iodide signal in fibroblasts was significantly higher for samples fixed with glyoxal pH 4 (N = 6-8). To test whether the fixed nucleic acids were still available for specific detection, we performed FISH for GAPDH in cultured neurons, using a standard protocol provided by the company Affymetrix. The fluorescence signal of the samples fixed with glyoxal (pH 4) was significantly higher than for PFA-fixed samples (N = 5-6). Scale bar = 10 µm, * p < 0.05, ** p < 0.01"}
{"words": ["Figure", "4", "Figure", "4", "STED", "imaging", "of", "primary", "hippocampal", "neurons", "fixed", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Strong", "differences", "in", "labeling", "patterns", "can", "be", "observed", ".", "The", "images", "are", "brighter", "and", "less", "\"", "spotty", "\"", "for", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "samples", ".", "Structures", "such", "as", "filaments", "or", "organelles", "are", "more", "easily", "detected", ".", "Quantification", "of", "the", "fluorescence", "signal", "(", "fold", "over", "background", ")", "shows", "that", "16", "out", "of", "20", "stainings", "are", "significantly", "brighter", "in", "glyoxal", "fixed", "samples", "compared", "to", "the", "PFA", "fixed", "samples", ".", "N", "=", "35", "-", "132", "objects", ".", "Scale", "bar", "=", "6", "µm", "for", "β", "-", "actin", "and", "α", "-", "tubulin", ",", "and", "3", "µm", "for", "the", "other", "proteins", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Figure 4 STED imaging of primary hippocampal neurons fixed with either PFA or glyoxal. Strong differences in labeling patterns can be observed. The images are brighter and less \"spotty\" for the glyoxal-fixed samples. Structures such as filaments or organelles are more easily detected. Quantification of the fluorescence signal (fold over background) shows that 16 out of 20 stainings are significantly brighter in glyoxal fixed samples compared to the PFA fixed samples. N = 35 - 132 objects. Scale bar = 6 µm for β-actin and α-tubulin, and 3 µm for the other proteins. ** p < 0.01, *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "5", "Figure", "5", "Comparison", "of", "immunostaining", "NUP160", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "HeLa", "cells", "were", "stained", "for", "the", "nucleoporin", "complex", "protein", "NUP160", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", ",", "glyoxal", "pH", "4", "or", "glyoxal", "pH", "5", ".", "Fluorescence", "intensities", "(", "fold", "over", "background", ")", "were", "compared", "and", "are", "shown", "in", "the", "graph", ".", "The", "quantification", "of", "fluorescence", "signals", "shows", "that", "glyoxal", "pH", "4", "fixation", "allows", "for", "significantly", "brighter", "stainings", ".", "N", "=", "73", "-", "156", "cells", "per", "condition", "analyzed", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 Figure 5 Comparison of immunostaining NUP160 after fixation with either PFA or glyoxal. HeLa cells were stained for the nucleoporin complex protein NUP160 after fixation with either PFA, glyoxal pH 4 or glyoxal pH 5. Fluorescence intensities (fold over background) were compared and are shown in the graph. The quantification of fluorescence signals shows that glyoxal pH 4 fixation allows for significantly brighter stainings. N = 73 - 156 cells per condition analyzed. Scale bar = 10 µm. *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "6", "Figure", "6", "Comparison", "of", "immunostained", "AtT20", "cells", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "AtT20", "cells", "stained", "for", "the", "SNARE", "proteins", "syntaxin1", "and", "SNAP25", "and", "the", "autophagy", "marker", "LC3B", ",", "were", "compared", "with", "regard", "to", "the", "fluorescence", "intensity", "(", "fold", "over", "background", ")", "of", "the", "stainings", ".", "Quantification", "of", "the", "intensity", "shows", "that", "glyoxal", "fixation", "allows", "for", "significantly", "brighter", "stainings", "of", "the", "membrane", "SNARE", "proteins", ".", "LC3B", "staining", "is", "brighter", "in", "PFA", "fixed", "cells", ".", "N", "=", "9", "-", "20", "cells", "per", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Figure 6 Comparison of immunostained AtT20 cells after fixation with either PFA or glyoxal. AtT20 cells stained for the SNARE proteins syntaxin1 and SNAP25 and the autophagy marker LC3B, were compared with regard to the fluorescence intensity (fold over background) of the stainings. Quantification of the intensity shows that glyoxal fixation allows for significantly brighter stainings of the membrane SNARE proteins. LC3B staining is brighter in PFA fixed cells. N = 9 - 20 cells per condition. Scale bar = 5 µm. * p < 0.05, *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "7A", "Primary", "hippocampal", "neurons", "were", "stained", "for", "Actin", "and", "Ankyrin", "G", ".", "A", "comparison", "between", "PFA", "-", "and", "glyoxal", "-", "fixed", "samples", "shows", "that", "actin", "staining", "with", "phalloidin", "works", "as", "least", "as", "well", "in", "both", ",", "showing", "the", "prominent", "actin", "rings", ".", "Ankyrin", "G", "staining", "is", "brighter", "in", "PFA", "-", "fixed", "cells", ".", "B", "Primary", "hippocampal", "neurons", "were", "stained", "for", "pan", "-", "Nav", "and", "Kv7", ".", "2", ".", "Both", "stainings", "seem", "to", "work", "at", "least", "as", "well", "for", "glyoxal", "fixed", "neurons", "as", "for", "PFA", "fixed", "neurons", ".", "Staining", "of", "K", "-", "channels", "shows", "a", "slightly", "more", "regular", "pattern", "in", "glyoxal", "fixed", "neurons", ".", "C", "Primary", "hippocampal", "neurons", "were", "stained", "for", "Neurofilament", "L", "and", "betaII", "spectrin", ".", "While", "the", "spectrin", "staining", "seems", "to", "be", "equally", "well", "in", "both", "fixation", "conditions", ",", "neurofilament", "staining", "is", "brighter", "in", "glyoxal", "fixed", "cells", ".", "D", "Growth", "cones", "of", "hippocampal", "neurons", "were", "stained", "for", "actin", "and", "βIII", "-", "tubulin", "after", "either", "glyoxal", "or", "PFA", "+", "glutaraldehyde", "fixation", ".", "The", "latter", "is", "a", "standard", "fixation", "used", "for", "the", "co", "-", "labeling", "of", "tubulin", "and", "actin", ",", "and", "is", "a", "stronger", "fixation", "than", "normal", "PFA", "fixation", ",", "which", "is", "incompatible", "with", "many", "organelle", "immunostainings", "(", "unlike", "glyoxal", "fixation", ")", ".", "The", "filopodia", "and", "lamellipodia", "of", "the", "growth", "cones", "seem", "to", "be", "well", "stained", "for", "the", "samples", "fixed", "with", "glyoxal", ",", "whereas", "the", "samples", "fixed", "with", "PFA", "and", "glutaraldehyde", "seem", "to", "have", "lost", "some", "of", "the", "finer", "actin", "structures", ".", "Tubulin", "seems", "to", "be", "a", "bit", "better", "stained", "in", "samples", "fixed", "with", "PFA", "and", "glutaraldehyde", ".", "Scale", "bars", "=", "1", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Primary hippocampal neurons were stained for Actin and Ankyrin G. A comparison between PFA- and glyoxal-fixed samples shows that actin staining with phalloidin works as least as well in both, showing the prominent actin rings. Ankyrin G staining is brighter in PFA-fixed cells.B Primary hippocampal neurons were stained for pan-Nav and Kv7.2. Both stainings seem to work at least as well for glyoxal fixed neurons as for PFA fixed neurons. Staining of K-channels shows a slightly more regular pattern in glyoxal fixed neurons.C Primary hippocampal neurons were stained for Neurofilament L and betaII spectrin. While the spectrin staining seems to be equally well in both fixation conditions, neurofilament staining is brighter in glyoxal fixed cells.D Growth cones of hippocampal neurons were stained for actin and βIII-tubulin after either glyoxal or PFA + glutaraldehyde fixation. The latter is a standard fixation used for the co-labeling of tubulin and actin, and is a stronger fixation than normal PFA fixation, which is incompatible with many organelle immunostainings (unlike glyoxal fixation). The filopodia and lamellipodia of the growth cones seem to be well stained for the samples fixed with glyoxal, whereas the samples fixed with PFA and glutaraldehyde seem to have lost some of the finer actin structures. Tubulin seems to be a bit better stained in samples fixed with PFA and glutaraldehyde. Scale bars = 1 µm."}
{"words": ["Figure", "8", "Figure", "8", "Comparison", "of", "immunostained", "sepia", "fin", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Sepia", "fin", "was", "fixed", "with", "the", "respective", "fixative", "and", "stained", "for", "the", "neuropeptide", "FMRFamide", ".", "A", "clear", "change", "in", "morphology", "can", "be", "observed", "between", "samples", "fixed", "with", "PFA", "and", "samples", "fixed", "with", "glyoxal", ".", "The", "former", "appear", "broken", "and", "swollen", ",", "while", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "ones", "appear", "complete", ".", "The", "effect", "is", "presumably", "due", "to", "the", "different", "speed", "of", "penetration", "into", "tissue", "and", "/", "or", "fixation", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 Figure 8 Comparison of immunostained sepia fin after fixation with either PFA or glyoxal. Sepia fin was fixed with the respective fixative and stained for the neuropeptide FMRFamide. A clear change in morphology can be observed between samples fixed with PFA and samples fixed with glyoxal. The former appear broken and swollen, while the glyoxal-fixed ones appear complete. The effect is presumably due to the different speed of penetration into tissue and/or fixation. Scale bar = 5 µm. "}
{"words": ["Figure", "9", "Figure", "9", "Comparison", "of", "immunostained", "ventricular", "myocytes", "fixed", "10", "min", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Freshly", "isolated", "murine", "ventricular", "myocytes", "were", "either", "fixed", "with", "4", "%", "PFA", "or", "3", "%", "glyoxal", "and", "immunostained", "for", "caveolin", "-", "3", "or", "ryanodine", "receptor", "type", "2", ".", "Quantification", "of", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "stainings", "show", "significantly", "brighter", "stainings", "for", "glyoxal", "fixed", "myocytes", ".", "The", "graph", "shows", "mean", "values", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "N", "=", "10", "(", "RyR2", ")", "and", "12", "(", "Cav3", ")", "myocytes", "per", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "µm", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9 Figure 9 Comparison of immunostained ventricular myocytes fixed 10 min with either PFA or glyoxal. Freshly isolated murine ventricular myocytes were either fixed with 4% PFA or 3% glyoxal and immunostained for caveolin-3 or ryanodine receptor type 2. Quantification of the fluorescence intensity of the stainings show significantly brighter stainings for glyoxal fixed myocytes. The graph shows mean values and error bars represent standard deviations. N = 10 (RyR2) and 12 (Cav3) myocytes per condition. Scale bar = 2 µm. *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "10", "Figure", "10", "Comparison", "of", "immunostained", "mouse", "inner", "hair", "cells", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Acutely", "dissected", "organs", "of", "corti", "were", "fixed", "in", "the", "respective", "fixative", "and", "immunostained", "for", "inner", "hair", "cell", "proteins", "and", "synaptic", "proteins", ".", "The", "quantification", "of", "fluorescence", "intensity", "for", "each", "staining", "shows", "a", "significant", "increase", "in", "signal", "to", "noise", "ratio", "for", "three", "target", "proteins", "(", "CtBP2", ",", "Calretinin", "and", "Homer1", ")", "fixed", "with", "glyoxal", ".", "None", "of", "the", "stained", "proteins", "shows", "a", "significant", "decrease", "in", "fluorescence", "after", "glyoxal", "fixation", ".", "Representative", "images", "show", "maximum", "intensity", "projections", "from", "z", "-", "stacks", "of", "inner", "hair", "cell", "ribbon", "synapses", ".", "N", "=", "5", "independent", "stainings", "from", "two", "animals", "per", "condition", "(", "PSD95", ",", "CtBP2", ",", "Otoferlin", ",", "Calretinin", ")", "and", "10", "-", "15", "images", "per", "condition", "(", "CaV1", ".", "3", "and", "Homer1", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "µm", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10 Figure 10 Comparison of immunostained mouse inner hair cells after fixation with either PFA or glyoxal. Acutely dissected organs of corti were fixed in the respective fixative and immunostained for inner hair cell proteins and synaptic proteins. The quantification of fluorescence intensity for each staining shows a significant increase in signal to noise ratio for three target proteins (CtBP2, Calretinin and Homer1) fixed with glyoxal. None of the stained proteins shows a significant decrease in fluorescence after glyoxal fixation. Representative images show maximum intensity projections from z-stacks of inner hair cell ribbon synapses. N = 5 independent stainings from two animals per condition (PSD95, CtBP2, Otoferlin, Calretinin) and 10 - 15 images per condition (CaV1.3 and Homer1). Scale bar = 2 µm. ** p < 0.01, *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "11", "Figure", "11", "Comparison", "of", "stained", "vimentin", "and", "α", "-", "synuclein", "in", "human", "neuroglioma", "cells", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Cells", "were", "fixed", "with", "PFA", "or", "glyoxal", "for", "10", "minutes", ",", "and", "were", "stained", "for", "endogenous", "vimentin", ",", "or", "for", "expressed", "alpha", "-", "synuclein", ".", "A", "quantification", "of", "the", "staining", "intensities", "indicates", "that", "glyoxal", "fixation", "allows", "for", "significantly", "brighter", "stainings", "for", "alpha", "-", "synuclein", ",", "but", "that", "PFA", "was", "superior", "for", "endogenous", "vimentin", "(", "leftmost", "graph", ")", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "vimentin", "expressed", "with", "an", "mOrange2", "tag", "was", "also", "analyzed", "after", "fixation", "with", "PFA", "or", "with", "glyoxal", ";", "the", "latter", "allowed", "more", "mOrange2", "fluorescence", "to", "be", "detected", "(", "rightmost", "graph", ")", ".", "N", "=", "29", "-", "81", "cell", "regions", "per", "condition", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 11 Figure 11 Comparison of stained vimentin and α-synuclein in human neuroglioma cells after fixation with either PFA or glyoxal. Cells were fixed with PFA or glyoxal for 10 minutes, and were stained for endogenous vimentin, or for expressed alpha-synuclein. A quantification of the staining intensities indicates that glyoxal fixation allows for significantly brighter stainings for alpha-synuclein, but that PFA was superior for endogenous vimentin (leftmost graph). The fluorescence intensity of vimentin expressed with an mOrange2 tag was also analyzed after fixation with PFA or with glyoxal; the latter allowed more mOrange2 fluorescence to be detected (rightmost graph). N = 29 - 81 cell regions per condition. * p < 0.05, *** p < 0.001 Scale bar: 10 µm. "}
{"words": ["Figure", "12", "Figure", "12", "Comparison", "of", "immunostainings", "for", "mitochondrial", "proteins", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "MitoTracker", "Orange", "prior", "to", "fixation", "with", "the", "respective", "fixative", "and", "immunostained", "for", "the", "mitochondrial", "proteins", "ATP5B", ",", "COA6", ",", "NDUFA9", "and", "TIM23", ".", "Quantification", "of", "the", "staining", "intensity", "shows", "a", "significant", "increase", "of", "fluorescence", "(", "signal", "over", "background", ")", "for", "2", "markers", "(", "ATP5B", "and", "Mitotracker", ")", "after", "fixation", "with", "glyoxal", ",", "whereas", "for", "the", "remaining", "3", "proteins", "immunostainings", "seem", "to", "be", "more", "efficient", "after", "fixation", "with", "PFA", ",", "albeit", "the", "differences", "are", "small", ".", "N", "=", "18", "-", "128", "cells", "per", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 12 Figure 12 Comparison of immunostainings for mitochondrial proteins after fixation with either PFA or glyoxal. Cells were stained with MitoTracker Orange prior to fixation with the respective fixative and immunostained for the mitochondrial proteins ATP5B, COA6, NDUFA9 and TIM23. Quantification of the staining intensity shows a significant increase of fluorescence (signal over background) for 2 markers (ATP5B and Mitotracker) after fixation with glyoxal, whereas for the remaining 3 proteins immunostainings seem to be more efficient after fixation with PFA, albeit the differences are small. N = 18 - 128 cells per condition. Scale bar = 5 µm. *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "13", "Figure", "13", "Comparison", "of", "immunostained", "HeLa", "cells", "after", "fixation", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "a", "variety", "of", "proteins", "was", "compared", "between", "cells", "fixed", "with", "PFA", "or", "glyoxal", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "percentage", "of", "signal", "derived", "from", "PFA", "fixed", "cells", ".", "8", "out", "of", "the", "18", "target", "proteins", "which", "were", "stained", "show", "significantly", "brighter", "signal", "when", "fixed", "with", "glyoxal", ".", "Only", "4", "proteins", "show", "significantly", "reduced", "staining", "intensity", ".", "For", "LC3B", "the", "intensity", "of", "less", "than", "5", "cells", "was", "quantified", ",", "therefore", "single", "data", "points", "were", "plotted", "in", "addition", "to", "the", "bars", ".", "N", "=", "3", "-", "44", "cells", "per", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 13 Figure 13 Comparison of immunostained HeLa cells after fixation with either PFA or glyoxal. The fluorescence intensity of a variety of proteins was compared between cells fixed with PFA or glyoxal. Quantification is shown as percentage of signal derived from PFA fixed cells. 8 out of the 18 target proteins which were stained show significantly brighter signal when fixed with glyoxal. Only 4 proteins show significantly reduced staining intensity. For LC3B the intensity of less than 5 cells was quantified, therefore single data points were plotted in addition to the bars. N = 3 - 44 cells per condition. Scale bar = 10 µm. ** p < 0.01, *** p < 0.001 "}
{"words": ["Figure", "14", "Figure", "14", "Comparison", "of", "immunostained", "U2OS", "cells", "and", "primary", "hippocampal", "neurons", "after", "either", "PFA", "or", "glyoxal", "fixation", ".", "Immunostaining", "of", "the", "Na", "/", "K", "ATPase", "in", "primary", "hippocampal", "neurons", "shows", "a", "different", "distribution", "of", "the", "protein", "between", "PFA", "fixed", "and", "nucleus", "fixed", "samples", ".", "While", "in", "PFA", "-", "fixed", "neurons", "the", "antibody", "falsely", "stains", "the", "glyoxal", "as", "well", "as", "the", "cytoplasm", "(", "100", "%", "of", "the", "82", "cells", "we", "analyzed", ")", ",", "in", "nucleus", "-", "fixed", "neurons", "the", "U2OS", "is", "devoid", "of", "signal", ",", "and", "the", "membrane", "appears", "to", "be", "correctly", "labeled", "(", "arrowheads", ";", "100", "%", "of", "the", "60", "cells", "we", "analyzed", ")", ".", "mitochondria", "cells", "were", "immunostained", "for", "KDEL", "(", "Tom20", ")", "and", "ER", "(", "EGFP", "-", "KDEL", ")", ".", "The", "fixation", "and", "/", "or", "staining", "of", "mitochondria", "seems", "to", "be", "comparable", "in", "glyoxal", "and", "in", "PFA", "fixed", "cells", ".", "The", "staining", "of", "the", "ER", "shows", "an", "improved", "signal", "to", "noise", "ratio", ".", "The", "signal", "appears", "de", "-", "localized", "from", "the", "ER", "for", "multiple", "PFA", "-", "stained", "cells", "(", "25", "%", "of", "36", "analyzed", "cells", ",", "see", "arrows", ")", ",", "while", "this", "is", "rare", "for", "the", "glyoxal", "-", "stained", "cells", "(", "3", ".", "4", "%", "of", "58", "analyzed", "cells", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 14 Figure 14 Comparison of immunostained U2OS cells and primary hippocampal neurons after either PFA or glyoxal fixation. Immunostaining of the Na/K ATPase in primary hippocampal neurons shows a different distribution of the protein between PFA fixed and nucleus fixed samples. While in PFA-fixed neurons the antibody falsely stains the glyoxal as well as the cytoplasm (100% of the 82 cells we analyzed), in nucleus-fixed neurons the U2OS is devoid of signal, and the membrane appears to be correctly labeled (arrowheads; 100% of the 60 cells we analyzed). mitochondria cells were immunostained for KDEL (Tom20) and ER (EGFP-KDEL). The fixation and/or staining of mitochondria seems to be comparable in glyoxal and in PFA fixed cells. The staining of the ER shows an improved signal to noise ratio. The signal appears de-localized from the ER for multiple PFA-stained cells (25% of 36 analyzed cells, see arrows), while this is rare for the glyoxal-stained cells (3.4% of 58 analyzed cells). Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "15A", "-", "B", "Confocal", "images", "showing", "staining", "of", "Olfactory", "Marker", "Protein", "(", "OMP", ")", "and", "ß3", "-", "tubulin", "along", "the", "dorsal", "aspect", "of", "the", "mouse", "olfactory", "epithelium", ".", "While", "sections", "from", "both", "types", "of", "fixative", "show", "OMP", "signal", "in", "the", "olfactory", "sensory", "neuron", "somata", ",", "their", "dendrites", ",", "and", "axons", ",", "the", "axon", "bundles", "(", "green", "arrow", ")", "located", "above", "the", "olfactory", "epithelium", "exemplify", "the", "clear", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratio", "benefits", "of", "glyoxal", "fixation", "versus", "that", "of", "the", "PFA", "-", "fixative", ".", "Immunostaining", "with", "the", "ß3", "-", "tubulin", "antibody", "stains", "the", "dendrites", "and", "axons", "in", "both", "PFA", "and", "glyoxal", "-", "fixed", "tissue", ",", "but", "strong", "staining", "of", "the", "cilia", "can", "only", "be", "observed", "in", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "sections", "(", "B", ")", ".", "C", "-", "D", "Confocal", "images", "depicting", "bundles", "of", "axons", "belonging", "to", "olfactory", "sensory", "neurons", "on", "the", "path", "toward", "the", "olfactory", "bulb", ".", "Identities", "of", "the", "axons", "are", "in", "part", "defined", "by", "the", "neuropilin", "-", "1", "(", "Nrp1", ")", "and", "neuropilin", "-", "2", "(", "Nrp2", ")", "expression", "levels", ",", "visualized", "here", "with", "antibodies", "raised", "against", "the", "two", "proteins", ".", "While", "complementary", "expression", "of", "the", "two", "molecules", "can", "be", "seen", "in", "the", "PFA", "-", "fixed", "sections", "(", "C", ")", ",", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "sections", "(", "D", ")", "exhibit", "profoundly", "improved", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratios", "for", "Nrp", "-", "1", "(", "red", "arrows", ")", ",", "and", "in", "the", "case", "of", "Nrp", "-", "2", ",", "also", "the", "segmentation", "of", "the", "axon", "bundle", "into", "varying", "levels", "of", "Nrp", "-", "2", "(", "green", "arrows", ")", ".", "E", "-", "F", "Confocal", "images", "of", "olfactory", "sensory", "neuron", " ", "axons", "coalescing", "into", "glomeruli", "where", "they", "synapse", "with", "dendrites", "of", "olfactory", "bulb", " ", "neurons", ".", "The", "axons", "of", "olfactory", "sensory", "neurons", "can", "be", "readily", "visualized", "with", "PFA", "staining", "(", "green", ")", "in", "the", "superficial", "olfactory", "nerve", "layer", "and", "terminating", "in", "glomeruli", "located", "below", "(", "green", "arrows", ")", ".", "While", "sections", "fixed", "with", "either", "PFA", "or", "glyoxal", "display", "adequate", "staining", "levels", ",", "the", "signal", "distribution", "of", "the", "Immunostaining", "-", "fixed", "tissue", "appears", "more", "irregular", "(", "E", ")", ",", "seemingly", "lacking", "the", "neurofilimentary", "morphology", "that", "appears", "preserved", "in", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "sections", "(", "F", ")", ".", "The", "glomeruli", "themselves", "are", "neuropil", "structures", "comprised", "primarily", "of", "olfactory", "sensory", "neurons", "forming", "synapses", "with", "dendrites", "of", "mitral", "/", "tufted", "cells", "as", "well", "as", "PFA", "of", "periglomerular", "neurons", ".", "Immunostaining", "with", "Vesicular", "Glutamate", "Transporter", "2", "(", "VGLUT2", ")", "allows", "visualization", "of", "these", "structures", "and", "is", "easily", "seen", "in", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "section", "(", "F", ")", ",", "while", "it", "appears", "the", "antigen", "was", "masked", "by", "PFA", "fixation", "as", "no", "signal", "above", "background", "can", "be", "seen", "in", "the", "PFA", "-", "fixed", "panel", "(", "red", "arrows", "in", "E", ")", ".", "Note", "that", "a", "different", "polyclonal", "antibody", "for", "VGLUT2", "from", "the", "same", "provider", "does", "provide", "signal", "with", "glyoxal", ",", "albeit", "weaker", "versus", "Glyoxal", "(", "inset", ")", ".", "Staining", "with", "ß3", "-", "tubulin", "touts", "the", "benefits", "of", "glyoxal", "both", "due", "to", "the", "signal", "improvements", "in", "the", "case", "of", "the", "mild", "staining", "in", "the", "axons", "of", "the", "olfactory", "nerve", "layer", "that", "is", "only", "visible", "in", "the", "glyoxal", "-", "fixed", "tissue", ",", "but", "also", "in", "preserving", "tissue", "morphology", "as", "demonstrated", "by", "the", "dendritic", "processes", "inside", "glomeruli", "(", "blue", "arrows", ")", "and", "in", "the", "external", "plexiform", "layer", "located", "below", "the", "glomeruli", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 15A - B Confocal images showing staining of Olfactory Marker Protein (OMP) and ß3-tubulin along the dorsal aspect of the mouse olfactory epithelium. While sections from both types of fixative show OMP signal in the olfactory sensory neuron somata, their dendrites, and axons, the axon bundles (green arrow) located above the olfactory epithelium exemplify the clear signal-to-noise ratio benefits of glyoxal fixation versus that of the PFA-fixative. Immunostaining with the ß3-tubulin antibody stains the dendrites and axons in both PFA and glyoxal-fixed tissue, but strong staining of the cilia can only be observed in the glyoxal-fixed sections (B).C - D Confocal images depicting bundles of axons belonging to olfactory sensory neurons on the path toward the olfactory bulb. Identities of the axons are in part defined by the neuropilin-1 (Nrp1) and neuropilin-2 (Nrp2) expression levels, visualized here with antibodies raised against the two proteins. While complementary expression of the two molecules can be seen in the PFA-fixed sections (C), the glyoxal-fixed sections (D) exhibit profoundly improved signal-to-noise ratios for Nrp-1 (red arrows), and in the case of Nrp-2, also the segmentation of the axon bundle into varying levels of Nrp-2 (green arrows).E - F Confocal images of olfactory sensory neuron axons coalescing into glomeruli where they synapse with dendrites of olfactory bulb neurons. The axons of olfactory sensory neurons can be readily visualized with PFA staining (green) in the superficial olfactory nerve layer and terminating in glomeruli located below (green arrows). While sections fixed with either PFA or glyoxal display adequate staining levels, the signal distribution of the Immunostaining-fixed tissue appears more irregular (E), seemingly lacking the neurofilimentary morphology that appears preserved in the glyoxal-fixed sections (F). The glomeruli themselves are neuropil structures comprised primarily of olfactory sensory neurons forming synapses with dendrites of mitral/tufted cells as well as PFA of periglomerular neurons. Immunostaining with Vesicular Glutamate Transporter 2 (VGLUT2) allows visualization of these structures and is easily seen in the glyoxal-fixed section (F), while it appears the antigen was masked by PFA fixation as no signal above background can be seen in the PFA-fixed panel (red arrows in E). Note that a different polyclonal antibody for VGLUT2 from the same provider does provide signal with glyoxal, albeit weaker versus Glyoxal (inset). Staining with ß3-tubulin touts the benefits of glyoxal both due to the signal improvements in the case of the mild staining in the axons of the olfactory nerve layer that is only visible in the glyoxal-fixed tissue, but also in preserving tissue morphology as demonstrated by the dendritic processes inside glomeruli (blue arrows) and in the external plexiform layer located below the glomeruli."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "The", "developing", "tumor", "vasculature", "was", "imaged", "over", "time", "in", "an", "abdominal", "window", "chamber", "model", "with", "two", "-", "photon", "microscopy", "with", "(", "A", ")", "GFP", "-", "labeled", "tumor", "cells", ",", "(", "B", ")", "TdTomato", "labeled", "TECs", "in", "cyan", "and", "(", "C", ")", "perfusion", ".", "(", "D", ")", "Top", ":", "a", "representative", "image", "of", "MC38", "tumor", "vasculature", ",", "bottom", ":", "segmentation", "with", "skeletonization", ".", "(", "E", "-", "N", ")", "The", "following", "parameters", "were", "quantified", "from", "the", "segmented", "image", "each", "day", ":", "(", "E", ")", "vessel", "tortuosity", ",", "(", "F", ")", "directional", "coherence", ",", "(", "G", ")", "perfusion", ",", "(", "H", ")", "number", "of", "sprouts", ",", "(", "I", ")", "fraction", "of", "branches", "<", "80", "µm", ",", "(", "J", ")", "fraction", "of", "branches", ">", "400", "µm", ",", "(", "K", ")", "length", "to", "diameter", "ratio", ",", "(", "L", ")", "nodes", "per", "mm2", ",", "(", "M", ")", "vessel", "length", ",", "and", "(", "N", ")", "vessel", "diameter", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) The developing tumor vasculature was imaged over time in an abdominal window chamber model with two-photon microscopy with (A) GFP-labeled tumor cells, (B) TdTomato labeled TECs in cyan and (C) perfusion. (D) Top: a representative image of MC38 tumor vasculature, bottom: segmentation with skeletonization. (E-N) The following parameters were quantified from the segmented image each day: (E) vessel tortuosity, (F) directional coherence, (G) perfusion, (H) number of sprouts,(I) fraction of branches <80 µm, (J) fraction of branches >400 µm, (K) length to diameter ratio, (L) nodes per mm2, (M) vessel length, and (N) vessel diameter."}
{"words": ["Figure", "3The", "developing", "MC38", "tumor", "vasculature", "was", "imaged", "in", "an", "abdominal", "window", "chamber", "model", "with", "two", "-", "photon", "microscopy", "after", "IR", "at", "the", "indicated", "times", ".", "(", "A", ")", "(", "top", ")", "Representative", "two", "-", "photon", "images", "of", "a", "control", "MC38", "tumor", "vasculature", "(", "cyan", ")", "and", "perfusion", "(", "red", ")", "at", "day", "2", "and", "4", ".", "(", "Bottom", ")", "zoom", "of", "the", "same", "tumor", "region", "from", "day", "0", "to", "day", "4", "of", "the", "tumor", "vasculature", "(", "cyan", ")", "and", "perfusion", "(", "red", ")", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Single", "dose", "15", "Gy", "IR", "(", "B", ")", "and", "5", "×", "3", "Gy", "(", "C", ")", "fractionated", "IR", "treated", "MC38", "tumor", "vasculature", "(", "top", ")", "at", "day", "2", "and", "day", "4", ".", "(", "Bottom", ")", "zoom", "of", "the", "same", "tumor", "region", "from", "day", "0", "to", "day", "4", "of", "the", "tumor", "vasculature", "(", "cyan", ")", "and", "perfusion", "(", "red", ")", ".", "(", "E", "-", "L", ")", "Quantified", "vascular", "parameters", ",", "for", "each", "day", "of", "imaging", "the", "following", "parameters", "were", "quantified", "from", "segmented", "images", "and", "normalized", "to", "day", "one", "if", "indicated", ":", "(", "E", ")", "normalized", "node", "density", ",", "(", "F", ")", "normalized", "tortuosity", ",", "(", "G", ")", "normalized", "branch", "length", "<", "80μm", ",", "(", "H", ")", "normalized", "branch", "length", ">", "400μm", ",", "(", "I", ")", "vessel", "branch", "length", ",", "(", "J", ")", "vessel", "diameter", ",", "(", "K", ")", "normalized", "length", "to", "diameter", "ratio", ",", "(", "L", ")", "normalized", "perfused", "vessels", ".", "(", "M", "-", "N", ")", "Subcutaneous", "tumor", "growth", "measurements", "of", "MC38", "(", "M", ")", "and", "B16F10", "(", "N", ")", "tumors", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3The developing MC38 tumor vasculature was imaged in an abdominal window chamber model with two-photon microscopy after IR at the indicated times. (A) (top) Representative two-photon images of a control MC38 tumor vasculature (cyan) and perfusion (red) at day 2 and 4. (Bottom) zoom of the same tumor region from day 0 to day 4 of the tumor vasculature (cyan) and perfusion (red). (B-C) Single dose 15 Gy IR (B) and 5×3 Gy (C) fractionated IR treated MC38 tumor vasculature (top) at day 2 and day 4. (Bottom) zoom of the same tumor region from day 0 to day 4 of the tumor vasculature (cyan) and perfusion (red).(E-L) Quantified vascular parameters, for each day of imaging the following parameters were quantified from segmented images and normalized to day one if indicated: (E) normalized node density , (F) normalized tortuosity, (G) normalized branch length < 80μm, (H) normalized branch length > 400μm, (I) vessel branch length, (J) vessel diameter, (K) normalized length to diameter ratio, (L) normalized perfused vessels.(M-N) Subcutaneous tumor growth measurements of MC38 (M) and B16F10 (N) tumors."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "immunofluorescent", "micrographs", "of", "control", "and", "treated", "tumor", "vasculature", "from", "MC38", "tumors", ".", "Tumor", "vessels", "(", "anti", "-", "CD31", ")", "and", "apoptosis", "(", "anti", "-", "cleaved", "caspase", "3", ")", "in", "(", "A", ")", "control", "and", "(", "B", ")", "48", "hours", "after", "15", "Gy", "IR", ".", "Arrows", "indicate", "apoptotic", "TEC", ".", "(", "C", ")", "quantification", "of", "apoptotic", "vessels", "after", "single", "dose", "15", "Gy", "IR", "from", "immunofluorescent", "images", "of", "whole", "MC38", "tumor", "section", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "apoptotic", "vessels", "after", "fractionated", "5", "×", "3", "Gy", "IR", "from", "immunofluorescent", "images", "of", "whole", "MC38", "tumor", "sections", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "apoptosis", "in", "TECs", "from", "B16F10", "tumor", "sections", "(", "n", "=", "4", "-", "6", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "apoptotic", "vessels", "according", "to", "size", "on", "thin", "whole", "MC38", "tumor", "sections", "(", "Ctrl", "n", "=", "4", "and", "treatment", "n", "=", "7", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "apoptotic", "vessels", "according", "to", "size", "in", "B16F10", "tumor", "sections", "(", "Ctrl", "n", "=", "4", "and", "treatment", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Area", "(", "H", ")", "and", "diameter", "(", "I", ")", "of", "apoptotic", "tumor", "vessels", "vs", "all", "tumor", "vessels", "from", "segmented", "thick", "80", "μm", "MC38", "tumor", "sections", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "Representative", "immunofluorescence", "image", "of", "control", "(", "J", ")", "and", "15", "Gy", "IR", "treated", "(", "K", ")", "MC38", "and", "B16F10", "tumors", "stained", "for", "proliferation", "(", "EdU", ")", ",", "EC", "nuclei", "(", "anti", "-", "ERG", ")", "and", "tumor", "vessels", "(", "anti", "-", "CD31", ")", ".", "(", "L", "-", "M", ")", "Quantification", "of", "proliferating", "cells", "(", "L", ")", "and", "proliferating", "TECs", "(", "M", ")", "in", "MC38", "tumors", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "N", "-", "O", ")", "Quantification", "of", "proliferating", "cells", "(", "N", ")", "and", "proliferating", "TECs", "(", "O", ")", "in", "B16F10", "tumors", "(", "n", "=", "4", "to", "9", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "P", "-", "Q", ")", "Quantification", "of", "proliferating", "cells", "(", "P", ")", "and", "TECs", "(", "Q", ")", "in", "MC38", "tumors", "after", "fractionated", "IR", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "R", "-", "S", ")", "Quantification", "of", "proliferating", "cells", "(", "R", ")", "and", "TECs", "(", "S", ")", "in", "B16F10", "tumors", "after", "fractionated", "IR", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "biological", "replicates", "per", "group", ")", ".", "(", "T", "-", "U", ")", "Measurement", "of", "proliferating", "TECs", "in", "(", "T", ")", "MC38", "tumors", "(", "n", "=", "9", "biological", "replicates", ")", "and", "(", "U", ")", "B16F10", "tumors", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "in", "small", "(", "area", "<", "250", "µm2", ")", "and", "large", "(", "area", "<", "250", "µm2", ")", "tumor", "blood", "vessels", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-B) Representative immunofluorescent micrographs of control and treated tumor vasculature from MC38 tumors. Tumor vessels (anti-CD31) and apoptosis (anti-cleaved caspase 3) in (A) control and (B) 48 hours after 15 Gy IR. Arrows indicate apoptotic TEC. (C) quantification of apoptotic vessels after single dose 15 Gy IR from immunofluorescent images of whole MC38 tumor section (n= 6-8 biological replicates per group). (D) Quantification of apoptotic vessels after fractionated 5×3 Gy IR from immunofluorescent images of whole MC38 tumor sections (n= 6-8 biological replicates per group). (E) Quantification of apoptosis in TECs from B16F10 tumor sections (n= 4-6 biological replicates per group). (F) Quantification of apoptotic vessels according to size on thin whole MC38 tumor sections (Ctrl n=4 and treatment n=7 biological replicates). (G) Quantification of apoptotic vessels according to size in B16F10 tumor sections (Ctrl n=4 and treatment n= 10 biological replicates). (H-I) Area (H) and diameter (I) of apoptotic tumor vessels vs all tumor vessels from segmented thick 80 μm MC38 tumor sections (n=4 biological replicates).(J-K) Representative immunofluorescence image of control (J) and 15 Gy IR treated (K) MC38 and B16F10 tumors stained for proliferation (EdU), EC nuclei (anti-ERG) and tumor vessels (anti-CD31). (L-M) Quantification of proliferating cells (L) and proliferating TECs (M) in MC38 tumors (n= 8 biological replicates per group). (N-O) Quantification of proliferating cells (N) and proliferating TECs (O) in B16F10 tumors (n= 4 to 9 biological replicates per group). (P-Q) Quantification of proliferating cells (P) and TECs (Q) in MC38 tumors after fractionated IR (n=5-7 biological replicates per group). (R-S) Quantification of proliferating cells (R) and TECs (S) in B16F10 tumors after fractionated IR (n= 5-7 biological replicates per group). (T-U) Measurement of proliferating TECs in (T) MC38 tumors (n= 9 biological replicates) and (U) B16F10 tumors (n= 5 biological replicates) in small (area <250 µm2) and large (area <250 µm2) tumor blood vessels."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "The", "expression", "of", "EP", "subtypes", "in", "bone", "marrow", "myeloid", "cells", "and", "colon", "tumor", "myeloid", "cells", ".", "The", "short", "black", "lines", "indicate", "individual", "expressions", ",", "the", "blue", "and", "yellow", "lines", "indicate", "the", "average", "expression", "level", "in", "each", "condition", ".", "The", "grey", "dotted", "lines", "represent", "the", "overall", "average", "between", "Ptger1", "and", "Ptger3", "or", "Ptger2", "and", "Ptger4", ".", "B", ".", "The", "expression", "of", "EP", "subtypes", "in", "CD11b", "+", "cells", "isolated", "from", "tumor", "tissues", "and", "spleen", "of", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "mice", "by", "magnetic", "bead", "separation", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "revealing", "the", "effects", "of", "prostaglandin", "E2", "(", "PGE2", ")", "and", "EP1", "-", "4", "antagonists", "on", "mouse", "bone", "marrow", "monocyte", "dendritic", "cell", "(", "DC", ")", "/", "macrophage", "differentiation", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ".", "The", "frequencies", "of", "F4", "/", "80", "+", "CD11C", "−", "macrophages", "and", "F4", "/", "80", "−", "CD11C", "+", "DCs", "under", "varying", "treatments", "as", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "revealing", "the", "effects", "of", "PGE2", "and", "EP1", "-", "4", "antagonists", "on", "mouse", "bone", "marrow", "derived", "-", "MDSC", "differentiation", ".", "Upper", "subpanel", ":", "vehicle", "group", "and", "PGE2", "group", ".", "Lower", "subpanel", ":", "ONO", "-", "8711", "(", "EP1", "antagonist", ")", "group", ",", "PF", "-", "04418948", "(", "EP2", "antagonist", ")", "group", ",", "L", "-", "798106", "(", "EP3", "antagonist", ")", "group", ",", "and", "E7046", "(", "EP4", "antagonist", ")", "group", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "H", ".", "The", "frequencies", "of", "Ly6C", "+", "Ly6G", "−", "mMDSC", "and", "Ly6CmidLy6G", "+", "PMN", "-", "MDSCs", "under", "varied", "treatments", "as", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. The expression of EP subtypes in bone marrow myeloid cells and colon tumor myeloid cells. The short black lines indicate individual expressions, the blue and yellow lines indicate the average expression level in each condition. The grey dotted lines represent the overall average between Ptger1 and Ptger3 or Ptger2 and Ptger4.B. The expression of EP subtypes in CD11b+ cells isolated from tumor tissues and spleen of CT26 tumor-bearing mice by magnetic bead separation (n=3).D. Representative flow cytometry plots revealing the effects of prostaglandin E2 (PGE2) and EP1-4 antagonists on mouse bone marrow monocyte dendritic cell (DC)/macrophage differentiation (n = 3). E. The frequencies of F4/80+CD11C− macrophages and F4/80−CD11C+ DCs under varying treatments as analyzed by flow cytometry analysis (n = 3). G. Representative flow cytometry plots revealing the effects of PGE2 and EP1-4 antagonists on mouse bone marrow derived-MDSC differentiation. Upper subpanel: vehicle group and PGE2 group. Lower subpanel: ONO-8711 (EP1 antagonist) group, PF-04418948 (EP2 antagonist) group, L-798106 (EP3 antagonist) group, and E7046 (EP4 antagonist) group. (n = 3). H. The frequencies of Ly6C+Ly6G− mMDSC and Ly6CmidLy6G+ PMN-MDSCs under varied treatments as analyzed by flow cytometry analysis (n = 3). "}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Dose", "-", "effect", "curve", "of", "TP", "-", "16", "in", "GloSensor", "™", "cAMP", "assay", "in", "EP4", "-", "expressing", "293", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", ".", "Dose", "-", "effect", "curves", "of", "TP", "-", "16", "in", "PGE2", "-", "induced", "calcium", "flux", "assay", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "The", "Schild", "plot", "of", "PGE2", "in", "the", "presence", "of", "varying", "concentrations", "of", "TP", "-", "16", ".", "TP", "-", "16", "shifted", "the", "dose", "-", "response", "curve", "of", "PGE2", "-", "induced", "intracellular", "cAMP", "levels", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ".", "The", "pA2", "value", "and", "slope", "of", "the", "Schild", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Dose-effect curve of TP-16 in GloSensor™ cAMP assay in EP4- expressing 293 cells (n=3).C. Dose-effect curves of TP-16 in PGE2-induced calcium flux assay (n=3).D. The Schild plot of PGE2 in the presence of varying concentrations of TP-16. TP-16 shifted the dose-response curve of PGE2-induced intracellular cAMP levels in a dose-dependent manner (n=3). E. The pA2 value and slope of the Schild plot. "}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "The", "antitumor", "activities", "of", "E7046", "(", "150", "mg", "/", "kg", ")", "and", "TP", "-", "16", "(", "37", ".", "5", ",", "75", ",", "and150", "mg", "/", "kg", ")", "in", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "BALB", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "11", "per", "group", ")", ".", "Tumor", "growth", "curves", "in", "the", "CT26", "model", "(", "left", "panel", ")", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "individual", "changes", "in", "tumor", "growth", "relative", "to", "after", "and", "before", "drug", "administration", "(", "right", "panel", ")", ".", "Tumor", "volumes", "reached", "100", "-", "200", "mm3", "on", "day", "7", ".", "C", ".", "Representative", "graph", "showing", "that", "the", "antitumor", "activity", "of", "TP", "-", "16", "is", "lost", "in", "CT26", "tumors", "engrafted", "into", "BALB", "/", "c", "nude", "mice", "(", "left", "panel", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "individual", "changes", "in", "tumor", "growth", "relative", "to", "after", "and", "before", "drug", "administration", "(", "right", "panel", ")", ".", "Tumor", "volumes", "reached", "100", "-", "200", "mm3", "on", "day", "7", ".", "D", ".", "Single", "-", "cell", "suspensions", "of", "tumor", "tissues", "from", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "BALB", "/", "c", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "TP", "-", "16", "for", "2", "weeks", "were", "analyzed", "for", "immune", "cell", "infiltration", "by", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "and", "dot", "plots", "of", "intratumoral", "frequencies", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "E", ".", "Growth", "curves", "(", "left", "panel", ")", "and", "relative", "change", "after", "18", "days", "treatment", "(", "right", "panel", ")", "in", "colon", "cancer", "(", "MC38", ")", "xenograft", "tumors", "in", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Tumor", "volumes", "reached", "100", "-", "200", "mm3", "on", "day", "7", ".", "F", ".", "Single", "-", "cell", "suspensions", "of", "tumor", "tissues", "from", "MC38", "tumor", "-", "bearing", "C57BL", "/", "6", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "TP", "-", "16", "for", "2", "weeks", "were", "analyzed", "for", "immune", "cell", "infiltration", "by", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "and", "dot", "plots", "of", "intratumoral", "frequencies", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "G", ".", "The", "representative", "bioluminescence", "images", "(", "left", "panel", ")", "and", "quantitative", "growth", "curves", "(", "right", "panel", ")", "of", "an", "orthotopic", "colorectal", "cancer", "mouse", "model", ",", "CT26", "-", "Luc", "model", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. The antitumor activities of E7046 (150 mg/kg) and TP-16 (37.5, 75, and150 mg/kg) in CT26 tumor-bearing BALB/c mice (n = 11 per group). Tumor growth curves in the CT26 model (left panel). Bar graphs show the individual changes in tumor growth relative to after and before drug administration (right panel). Tumor volumes reached 100-200 mm3 on day 7.C. Representative graph showing that the antitumor activity of TP-16 is lost in CT26 tumors engrafted into BALB/c nude mice (left panel) (n = 8). Bar graphs show the individual changes in tumor growth relative to after and before drug administration (right panel). Tumor volumes reached 100-200 mm3 on day 7.D. Single-cell suspensions of tumor tissues from CT26 tumor-bearing BALB/c mice treated with vehicle or TP-16 for 2 weeks were analyzed for immune cell infiltration by flow cytometry analysis. Representative flow cytometry and dot plots of intratumoral frequencies of CD8+ T cells (n = 5).E. Growth curves (left panel) and relative change after 18 days treatment (right panel) in colon cancer (MC38) xenograft tumors in C57BL/6 mice (n = 7). Tumor volumes reached 100-200 mm3 on day 7.F. Single-cell suspensions of tumor tissues from MC38 tumor-bearing C57BL/6 mice treated with vehicle or TP-16 for 2 weeks were analyzed for immune cell infiltration by flow cytometry analysis. Representative flow cytometry and dot plots of intratumoral frequencies of CD8+ T cells (n = 5).G. The representative bioluminescence images (left panel) and quantitative growth curves (right panel) of an orthotopic colorectal cancer mouse model, CT26-Luc model (n = 4)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", ".", "Tumors", "from", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "BALB", "/", "c", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "TP", "-", "16", "for", "2", "weeks", "were", "harvested", ",", "and", "tumor", "single", "-", "cell", "suspensions", "were", "analyzed", "for", "tumor", "-", "associated", "myeloid", "cells", "by", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "Representative", "graphs", "and", "quantification", "of", "F4", "/", "80", "+", "MHC", "-", "II", "+", "immunosuppressive", "myeloid", "cells", "(", "IMCs", ")", "-", "M1", "macrophages", "(", "A", ")", "and", "F4", "/", "80", "+", "CD206", "+", "IMCs", "-", "M2", "macrophages", "(", "B", ")", "gated", "on", "CD45", "+", "CD11b", "+", "myeloid", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "C", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "analysis", "and", "quantification", "of", "Ly6C", "+", "Ly6G", "-", "IMCs", "-", "monocytic", "myeloid", "-", "derived", "suppressor", "cell", "(", "mMDSC", ")", "and", "Ly6CmidLy6G", "+", "IMCs", "-", "PMN", "-", "MDSC", "frequencies", "gated", "on", "CD45", "+", "CD11b", "+", "myeloid", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "selected", "M1", ",", "M2", "markers", "on", "flow", "-", "sorted", "M1", "macrophages", "(", "D", ")", ",", "M2", "macrophages", "(", "E", ")", "from", "CT26", "tumors", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "levels", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "selected", "MDSC", "markers", "on", "flow", "-", "sorted", "mMDSCs", "(", "F", ")", ",", "and", "PMN", "-", "MDSCs", "(", "G", ")", "from", "CT26", "tumors", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "levels", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "H", "-", "K", ".", "Representative", "flow", "analysis", "and", "quantification", "of", "CD8", "+", "T", "cell", "activation", "markers", ":", "Granzyme", "B", "(", "H", ")", ",", "IFN", "-", "γ", "(", "I", ")", ",", "TNF", "-", "α", "(", "J", ")", ",", "and", "PD", "-", "1", "(", "K", ")", "(", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B. Tumors from CT26 tumor-bearing BALB/c mice treated with vehicle or TP-16 for 2 weeks were harvested, and tumor single-cell suspensions were analyzed for tumor-associated myeloid cells by flow cytometry analysis. Representative graphs and quantification of F4/80+MHC-II+ immunosuppressive myeloid cells (IMCs)-M1 macrophages (A) and F4/80+CD206+ IMCs-M2 macrophages (B) gated on CD45+CD11b+ myeloid cells (n = 5).C. Representative flow cytometry analysis and quantification of Ly6C+Ly6G- IMCs-monocytic myeloid-derived suppressor cell (mMDSC) and Ly6CmidLy6G+ IMCs-PMN-MDSC frequencies gated on CD45+CD11b+ myeloid cells (n = 5).Relative expression of selected M1, M2 markers on flow-sorted M1 macrophages (D), M2 macrophages (E) from CT26 tumors. Data are normalized to β-actin expression levels (n = 5).Relative expression of selected MDSC markers on flow-sorted mMDSCs (F), and PMN-MDSCs (G) from CT26 tumors. Data are normalized to β-actin expression levels (n = 5).H-K. Representative flow analysis and quantification of CD8+ T cell activation markers: Granzyme B (H), IFN-γ (I), TNF-α (J), and PD-1 (K) (n = 5)."}
{"words": ["Figure", "5M", "-", "CSF", "induced", "mouse", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMMs", ")", "were", "stimulated", "with", "50", "ng", "/", "mL", "mouse", "recombinant", "IFN", "-", "γ", "(", "A", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "PGE2", "±", "varying", "concentrations", "of", "TP", "-", "16", "for", "12", "hr", ".", "The", "mRNA", "levels", "of", "selected", "M1", "markers", "(", "Cxcl10", "and", "Tnfa", ")", "were", "measured", "by", "q", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "levels", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "B", ".", "M", "-", "CSF", "induced", "mouse", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMMs", ")", "were", "stimulated", "with", "20", "ng", "/", "mL", "mouse", "recombinant", "IL", "-", "4", "(", "B", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "PGE2", "±", "varying", "concentrations", "of", "TP", "-", "16", "for", "12", "hr", ".", "The", "mRNA", "levels", "of", "selected", "M2", "markers", "(", "Arg", "-", "1", "and", "Ym", "-", "1", ")", "were", "measured", "by", "q", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "levels", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", ".", "Bone", "marrow", "cells", "were", "cultured", "with", "40", "ng", "/", "mL", "GM", "-", "CSF", "/", "IL", "-", "6", "or", "co", "-", "stimulated", "with", "PGE2", "±", "varying", "concentrations", "of", "TP", "-", "16", "for", "6", "days", ".", "Representative", "quantification", "of", "Ly6C", "+", "Ly6G", "−", "monocytic", "myeloid", "-", "derived", "suppressor", "cells", "(", "mMDSCs", ")", "and", "Ly6CmidLy6G", "+", "PMN", "-", "MDSCs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "Bone", "marrow", "cells", "were", "treated", "with", "GM", "-", "CSF", "/", "IL", "-", "6", "for", "6", "days", "to", "induce", "MDSCs", "and", "thereafter", ",", "with", "PGE2", "±", "varying", "concentrations", "of", "TP", "-", "16", "for", "12", "hr", ".", "The", "mRNA", "levels", "of", "selected", "MDSC", "markers", "(", "Arg", "-", "1", ",", "Ptgs2", ",", "Il", "-", "4", ",", "and", "Il", "-", "10", ")", "were", "measured", "by", "qPCR", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "levels", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "In", "vitro", "T", "cell", "suppression", "activity", "of", "CT26", "-", "tumor", "infiltrating", "CD11b", "+", "myeloid", "cells", "collected", "at", "2", "weeks", "post", "-", "treatment", "with", "vehicle", "or", "75", "mg", "/", "kg", "TP", "-", "16", ".", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "labeled", "with", "CFSE", "and", "then", "stimulated", "with", "CD3", "/", "CD28", "antibodies", "for", "3", "days", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "tumor", "-", "infiltrating", "CD11b", "+", "myeloid", "cells", "from", "vehicle", "-", "or", "75", "mg", "/", "kg", "TP", "-", "16", "-", "treated", "CT26", "tumors", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "histograms", "(", "E", ")", "and", "percentages", "(", "F", ")", "of", "proliferating", "CD8", "+", "T", "cells", "when", "plated", "in", "a", "ratio", "of", "2", ":", "1", ",", "1", ":", "1", ",", "and", "1", ":", "2", "CD8", "+", "T", "cells", "to", "CD11b", "+", "myeloid", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5M-CSF induced mouse bone marrow derived macrophages (BMMs) were stimulated with 50 ng/mL mouse recombinant IFN-γ (A) in the absence or presence of PGE2 ± varying concentrations of TP-16 for 12 hr. The mRNA levels of selected M1 markers (Cxcl10 and Tnfa) were measured by q-PCR. Data are normalized to β-actin expression levels (n=3).B. M-CSF induced mouse bone marrow derived macrophages (BMMs) were stimulated with 20 ng/mL mouse recombinant IL-4 (B) in the absence or presence of PGE2 ± varying concentrations of TP-16 for 12 hr. The mRNA levels of selected M2 markers (Arg-1 and Ym-1) were measured by q-PCR. Data are normalized to β-actin expression levels (n=3).C. Bone marrow cells were cultured with 40 ng/mL GM-CSF/IL-6 or co-stimulated with PGE2 ± varying concentrations of TP-16 for 6 days. Representative quantification of Ly6C+Ly6G− monocytic myeloid-derived suppressor cells (mMDSCs) and Ly6CmidLy6G+ PMN-MDSCs (n = 3).D. Bone marrow cells were treated with GM-CSF/IL-6 for 6 days to induce MDSCs and thereafter, with PGE2 ± varying concentrations of TP-16 for 12 hr. The mRNA levels of selected MDSC markers (Arg-1, Ptgs2, Il-4, and Il-10) were measured by qPCR. Data are normalized to β-actin expression levels (n=3).E, F. In vitro T cell suppression activity of CT26-tumor infiltrating CD11b+ myeloid cells collected at 2 weeks post-treatment with vehicle or 75 mg/kg TP-16. CD8+ T cells were labeled with CFSE and then stimulated with CD3/CD28 antibodies for 3 days in the absence or presence of tumor-infiltrating CD11b+ myeloid cells from vehicle- or 75 mg/kg TP-16-treated CT26 tumors. Representative flow cytometry histograms (E) and percentages (F) of proliferating CD8+ T cells when plated in a ratio of 2:1, 1:1, and 1:2 CD8+ T cells to CD11b+ myeloid cells (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "The", "growth", "of", "CT26", "tumor", "volume", "when", "treated", "with", "vehicle", ",", "TP", "-", "16", "(", "75", "mg", "/", "kg", ",", "p", ".", "o", ".", ",", "daily", ")", ",", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "(", "50", "μg", ",", "i", ".", "p", ".", ",", "twice", "weekly", ")", "or", "their", "combination", "(", "left", ")", "and", "percent", "change", "in", "tumor", "volumes", "between", "days", "0", "and", "20", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "B", ".", "BALB", "/", "c", "mice", "with", "subcutaneous", "CT26", "tumors", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "TP", "-", "16", "(", "75", "mg", "/", "kg", ",", "p", ".", "o", ".", ",", "daily", ")", ",", "PD", "-", "1", "antibody", "(", "50", "μg", ",", "i", ".", "p", ".", ",", "twice", "weekly", ")", "or", "combined", "therapies", "for", "2", "weeks", ".", "Animal", "survival", "(", "time", "to", "tumor", "burden", "reaching", "2000", "mm3", ")", "was", "analyzed", "by", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "using", "GraphPad", "Prism", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "the", "Log", "-", "rank", "test", ".", "C", ".", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "images", "of", "tumor", "sections", "from", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "mice", "stained", "for", "CD8", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "D", ".", "Representative", "immunostaining", "images", "of", "tumor", "sections", "from", "CT26", "tumor", "-", "bearing", "mice", "stained", "for", "p", "-", "STAT3", ",", "p", "-", "AKT", "and", "PD", "-", "L1", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "F", ".", "The", "heatmap", "of", "T", "cell", "activation", "biomarkers", "for", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "The", "unit", "of", "heatmap", "scale", "is", "expression", "value", "after", "centering", "and", "scaling", "by", "genes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. The growth of CT26 tumor volume when treated with vehicle, TP-16 (75 mg/kg, p.o., daily), anti-PD-1 antibody (50 μg, i.p., twice weekly) or their combination (left) and percent change in tumor volumes between days 0 and 20 (right) (n=12).B. BALB/c mice with subcutaneous CT26 tumors were treated with vehicle, TP-16 (75 mg/kg, p.o., daily), PD-1 antibody (50 μg, i.p., twice weekly) or combined therapies for 2 weeks. Animal survival (time to tumor burden reaching 2000 mm3) was analyzed by the Kaplan-Meier method using GraphPad Prism (n=10). P values were calculated using the Log-rank test.C. Representative immunofluorescence staining images of tumor sections from CT26 tumor-bearing mice stained for CD8 and DAPI. Scale bars, 50 μm. D. Representative immunostaining images of tumor sections from CT26 tumor-bearing mice stained for p-STAT3, p-AKT and PD-L1. Scale bars, 100 μm. F. The heatmap of T cell activation biomarkers for RNA-seq analysis. The unit of heatmap scale is expression value after centering and scaling by genes."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "resected", "colons", "(", "B", ")", "after", "5", "weeks", "of", "indicated", "treatment", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "total", "number", "of", "colon", "tumors", "per", "mouse", "(", "C", ",", "left", ")", "and", "tumor", "size", "distribution", "(", "C", ",", "right", ")", ",", "and", "colon", "length", "(", "D", ")", "after", "5", "weeks", "of", "indicated", "treatment", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "E", ".", "Representative", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "and", "immunostaining", "for", "CD8", ",", "p", "-", "STAT3", ",", "p", "-", "AKT", ",", "and", "ARG", "-", "1", "of", "tumors", "treated", "with", "vehicle", ",", "TP", "-", "16", ",", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", ",", "or", "TP", "-", "16", "and", "anti", "-", "PD", "-", "1", "combined", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "μm", "(", "left", "images", ")", ",", "50", "μm", "(", "right", "images", ")", ".", "F", ".", "Quantitative", "polymerase", "chain", "reaction", "(", "q", "-", "PCR", ")", "analysis", "of", "the", "mRNA", "level", "of", "genes", "associated", "with", "immunosuppression", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative resected colons (B) after 5 weeks of indicated treatment (n=7).total number of colon tumors per mouse (C, left) and tumor size distribution (C, right), and colon length (D) after 5 weeks of indicated treatment (n=7).E. Representative hematoxylin and eosin (H&E) staining and immunostaining for CD8, p-STAT3, p-AKT, and ARG-1 of tumors treated with vehicle, TP-16, anti-PD-1 antibody, or TP-16 and anti-PD-1 combined. Scale bars, 500 μm (left images), 50 μm (right images).F. Quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis of the mRNA level of genes associated with immunosuppression (n = 6)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Detection", "of", "Fstl1", "protein", "in", "ischemic", "myocardium", "of", "WT", "mice", ".", "After", "MI", "induction", ",", "the", "heart", "was", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "points", ",", "and", "separated", "to", "ischemic", "and", "remote", "(", "non", "-", "ischemic", ")", "areas", ".", "Fstl1", "protein", "was", "detected", "by", "western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ",", "each", "time", "point", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "ordinary", "one", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Dunnett", "test", ".", "(", "B", ")", "Serum", "Fstl1", "was", "detected", "by", "western", "blotting", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Ponceau", "S", "staining", "of", "serum", "reveals", "equivalent", "amount", "of", "loaded", "protein", "(", "n", "=", "4", ",", "each", "time", "point", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "ordinary", "one", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Dunnett", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Detection of Fstl1 protein in ischemic myocardium of WT mice. After MI induction, the heart was harvested at the indicated time points, and separated to ischemic and remote (non-ischemic) areas. Fstl1 protein was detected by western blotting (n=3, each time point). Statistical analysis was performed by ordinary one way ANOVA. Post Hoc test was performed by Dunnett test.(B) Serum Fstl1 was detected by western blotting at the indicated time points. Ponceau S staining of serum reveals equivalent amount of loaded protein (n=4, each time point). Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by ordinary one way ANOVA. Post Hoc test was performed by Dunnett test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "DABimmunohistochemistry", "staining", "of", "Fstl1", "with", "ischemic", "heart", "at", "day", "3", "after", "LAD", "ligation", ".", "Arrows", "indicate", "a", "subset", "of", "Fstl1", "positive", "cells", ".", "Counter", "staining", "was", "performed", "with", "hematoxylin", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50μm", ".", "(", "B", ")", "Immunofluorescent", "microscopy", "staining", "of", "Fstl1", "(", "green", ")", "and", "sarcomeric", "actin", "(", "red", ")", ".", "Fstl1", "protein", "was", "detected", "in", "interstitial", "areas", "of", "the", "ischemic", "and", "border", "zone", "but", "not", "in", "cardiomyocytes", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescent", "microscopy", "staining", "of", "Fstl1", "(", "green", ")", "and", "S100a4", "(", "red", ")", "in", "the", "ischemic", "area", ".", "Arrows", "indicate", "Fstl1", "and", "S100a4", "double", "positive", "cells", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20μm", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescent", "microscopy", "staining", "of", "Fstl1", "(", "green", ")", "and", "α", "-", "smooth", "muscle", "actin", "(", "red", ")", ".", "Arrows", "indicate", "Fstl1", "and", "α", "-", "SMA", "double", "positive", "cells", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20μm", ".", "Nuclei", "were", "stained", "by", "DAPI", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) DABimmunohistochemistry staining of Fstl1 with ischemic heart at day 3 after LAD ligation. Arrows indicate a subset of Fstl1 positive cells. Counter staining was performed with hematoxylin. Scale bar indicates 50μm.(B) Immunofluorescent microscopy staining of Fstl1 (green) and sarcomeric actin (red). Fstl1 protein was detected in interstitial areas of the ischemic and border zone but not in cardiomyocytes. Scale bar indicates 100μm.(C) Immunofluorescent microscopy staining of Fstl1 (green) and S100a4 (red) in the ischemic area. Arrows indicate Fstl1 and S100a4 double positive cells. Scale bar indicates 20μm.(D) Immunofluorescent microscopy staining of Fstl1 (green) and α-smooth muscle actin (red). Arrows indicate Fstl1 and α-SMA double positive cells. Scale bar indicates 20μm. Nuclei were stained by DAPI."}
{"words": ["Figure", "3Genotypes", "are", "indicated", "as", "WT", "for", "S100a4cre", "-", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", "mice", "and", "cfKO", "for", "S100a4cre", "+", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", ".", "(", "A", ")", "S100a4", "expression", "is", "induced", "in", "the", "ischemic", "area", "(", "IA", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "mRNA", "expression", "of", "S100a4", "in", "ischemic", "heart", "and", "sham", "operated", "heart", "of", "WT", "mice", "and", "cfKO", "mice", ".", "Heart", "samples", "were", "harvested", "at", "7", "days", "after", "the", "surgery", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Tukey", "test", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "16", "and", "15", "for", "WT", "and", "cfKO", "sham", "group", ",", "n", "=", "15", "and", "14", "for", "WT", "and", "cfKO", "MI", "group", ",", "respectively", ")", ".", "Genotypes", "are", "indicated", "as", "WT", "for", "S100a4cre", "-", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", "mice", "and", "cfKO", "for", "S100a4cre", "+", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", ".", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "mRNA", "expression", "of", "Fstl1", "and", "Tgfβ1", "in", "sham", "and", "post", "-", "MI", "heart", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "16", "and", "15", "for", "WT", "and", "cfKO", "sham", "group", ",", "n", "=", "15", "and", "14", "for", "WT", "and", "cfKO", "MI", "group", ",", "respectively", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Tukey", "test", ".", "Genotypes", "are", "indicated", "as", "WT", "for", "S100a4cre", "-", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", "mice", "and", "cfKO", "for", "S100a4cre", "+", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "Fstl1", "protein", "expression", "in", "ischemic", "and", "sham", "-", "operated", "hearts", "at", "day", "7", "after", "the", "surgery", ".", "Quantified", "values", "of", "Fstl1", "protein", "in", "WT", "and", "cfKO", "mouse", "hearts", "normalized", "by", "GAPDH", "band", "intensity", "are", "shown", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Tukey", "test", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "sham", "group", "and", "n", "=", "6", "for", "each", "MI", "group", ")", ".", "Genotypes", "are", "indicated", "as", "WT", "for", "S100a4cre", "-", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", "mice", "and", "cfKO", "for", "S100a4cre", "+", "/", "-", "x", "Fstl1flox", "+", "/", "flox", "+", ".", "(", "D", ")", "Fstl1", "protein", "expression", "in", "isolated", "cardiac", "fibroblasts", "from", "cfKO", "and", "littermate", "WT", "neonatal", "mice", ".", "Cell", "lysate", "and", "its", "media", "from", "cells", "cultured", "for", "24", "hours", "without", "FBS", "were", "assessed", "by", "western", "blotting", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "twice", "independently", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Genotypes are indicated as WT for S100a4cre-/- x Fstl1flox+/flox+ mice and cfKO for S100a4cre+/- x Fstl1flox+/flox+. (A) S100a4 expression is induced in the ischemic area (IA). qPCR analysis of mRNA expression of S100a4 in ischemic heart and sham operated heart of WT mice and cfKO mice. Heart samples were harvested at 7 days after the surgery. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. Post Hoc test was performed by Tukey test. Error bars represent mean ± SEM (n=16 and 15 for WT and cfKO sham group, n=15 and 14 for WT and cfKO MI group, respectively).Genotypes are indicated as WT for S100a4cre-/- x Fstl1flox+/flox+ mice and cfKO for S100a4cre+/- x Fstl1flox+/flox+. (B) qPCR analysis of mRNA expression of Fstl1 and Tgfβ1 in sham and post-MI heart. Error bars represent mean ± SEM (n=16 and 15 for WT and cfKO sham group, n=15 and 14 for WT and cfKO MI group, respectively). Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. Post Hoc test was performed by Tukey test.Genotypes are indicated as WT for S100a4cre-/- x Fstl1flox+/flox+ mice and cfKO for S100a4cre+/- x Fstl1flox+/flox+. (C) Western blot analysis of Fstl1 protein expression in ischemic and sham-operated hearts at day 7 after the surgery. Quantified values of Fstl1 protein in WT and cfKO mouse hearts normalized by GAPDH band intensity are shown. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. Post Hoc test was performed by Tukey test. Error bars represent mean ± SEM (n=5 for each sham group and n=6 for each MI group).Genotypes are indicated as WT for S100a4cre-/- x Fstl1flox+/flox+ mice and cfKO for S100a4cre+/- x Fstl1flox+/flox+. (D) Fstl1 protein expression in isolated cardiac fibroblasts from cfKO and littermate WT neonatal mice. Cell lysate and its media from cells cultured for 24 hours without FBS were assessed by western blotting. Error bars represent mean ± SEM (n=3 per group). Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed). The experiments were performed twice independently."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Mouse", "survival", "curve", "after", "MI", "and", "sham", "surgery", ".", "The", "mortality", "of", "the", "WT", "and", "Fstl1", "-", "cfKO", "mice", "after", "MI", "surgery", "was", "27", ".", "1", "%", "and", "46", ".", "7", "%", ",", "respectively", ".", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "n", "=", "16", "for", "WT", "sham", ",", "n", "=", "15", "for", "Fstl1", "-", "cfKO", "sham", ",", "n", "=", "59", "for", "WT", "MI", "and", "n", "=", "30", "for", "Fstl1", "-", "cfKO", "MI", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "macroscopic", "images", "of", "cardiac", "rupture", ".", "Left", ";", "impending", "LV", "rupture", "found", "in", "a", "cfKO", "mouse", "post", "-", "MI", "when", "sampling", ".", "Right", ";", "evidence", "of", "hemothorax", "that", "was", "diagnosed", "as", "cardiac", "rupture", "in", "deceased", "mice", ".", "(", "C", ")", "Representative", "microscopic", "images", "of", "ruptured", "heart", "stained", "by", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ".", "Penetrating", "hematoma", "due", "to", "a", "tear", "from", "the", "LV", "endocardium", "to", "the", "epicardium", ".", "Left", ";", "an", "image", "obtained", "with", "a", "low", "magnification", "lens", ".", "Scale", "bar", "indicates", "200μm", ".", "Right", ";", "higher", "magnification", "image", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", ".", "Arrow", "indicates", "the", "tear", "site", ".", "H", "indicates", "hematoma", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Mouse survival curve after MI and sham surgery. The mortality of the WT and Fstl1-cfKO mice after MI surgery was 27.1% and 46.7%, respectively. Log-rank (Mantel-Cox) test was used for statistical analysis (n=16 for WT sham, n=15 for Fstl1-cfKO sham, n=59 for WT MI and n=30 for Fstl1-cfKO MI).(B) Representative macroscopic images of cardiac rupture. Left; impending LV rupture found in a cfKO mouse post-MI when sampling. Right; evidence of hemothorax that was diagnosed as cardiac rupture in deceased mice.(C) Representative microscopic images of ruptured heart stained by H&amp;amp;E. Penetrating hematoma due to a tear from the LV endocardium to the epicardium. Left; an image obtained with a low magnification lens. Scale bar indicates 200μm. Right; higher magnification image. Scale bar indicates 100μm. Arrow indicates the tear site. H indicates hematoma."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Transcript", "mRNA", "expression", "of", "Col1a1", "and", "Fn1", "in", "sham", "and", "post", "-", "MI", "hearts", ".", "Hearts", "were", "obtained", "at", "day", "7", "after", "surgery", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "13", "-", "16", "for", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Post", "Hoc", "test", "was", "performed", "by", "Tukey", "test", ".", "(", "B", ")", "Protein", "expression", "of", "collagen", "I", ",", "fibronectin", "and", "αSMA", "in", "the", "infarcted", "and", "sham", "hearts", "at", "day", "7", "after", "surgery", ",", "as", "assessed", "by", "western", "blotting", ".", "Quantified", "values", "of", "proteins", "of", "interest", "were", "normalized", "relative", "to", "the", "tubulin", "band", "intensity", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "for", "fibronectin", "and", "αSMA", "and", "non", "-", "parametric", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "for", "collagen", "I", "(", "fibronectin", "and", "collagen", "I", ":", "n", "=", "5", "per", "group", ",", "αSMA", ":", "n", "=", "3", "and", "4", "for", "WT", "-", "IA", "and", "cfKO", "-", "IA", ",", "respectively", ")", ".", "(", "C", ")", "α", "-", "smooth", "muscle", "actin", "-", "positive", "myofibroblasts", "(", "red", ")", "were", "stained", "in", "histology", "sections", "from", "infarcted", "hearts", "of", "WT", "and", "cfKO", "mice", ".", "Samples", "were", "harvested", "at", "day", "7", "after", "MI", ".", "Counter", "staining", "was", "performed", "by", "hematoxylin", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", "for", "top", "and", "middle", "images", ",", "50µm", "for", "bottom", "images", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "n", "=", "16", "for", "WT", "and", "n", "=", "14", "for", "cfKO", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "Picro", "Sirius", "Red", "staining", "of", "infarcted", "heart", "at", "7", "days", "after", "MI", "surgery", ".", "Images", "were", "taken", "by", "standard", "light", "(", "top", ")", "and", "polarized", "light", "(", "bottom", ")", "microscopes", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100μm", ".", "Polarized", "collagen", "fibers", "were", "sorted", "to", "orange", "-", "red", "(", "middle", ")", "and", "green", "-", "yellow", "(", "bottom", ")", "fibers", "by", "Image", "J", "software", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "(", "n", "=", "11", "for", "WT", "and", "n", "=", "13", "for", "cfKO", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Transcript mRNA expression of Col1a1 and Fn1 in sham and post-MI hearts. Hearts were obtained at day 7 after surgery. Error bars represent mean ± SEM (n=13-16 for each group). Statistical analysis was performed by two-way ANOVA. Post Hoc test was performed by Tukey test.(B) Protein expression of collagen I, fibronectin and αSMA in the infarcted and sham hearts at day 7 after surgery, as assessed by western blotting. Quantified values of proteins of interest were normalized relative to the tubulin band intensity. Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed) for fibronectin and αSMA and non-parametric t-test (2-tailed) for collagen I (fibronectin and collagen I: n=5 per group, αSMA: n=3 and 4 for WT-IA and cfKO-IA, respectively).(C) α-smooth muscle actin-positive myofibroblasts (red) were stained in histology sections from infarcted hearts of WT and cfKO mice. Samples were harvested at day 7 after MI. Counter staining was performed by hematoxylin. Scale bar indicates 100μm for top and middle images, 50µm for bottom images. Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test (n=16 for WT and n=14 for cfKO). (D) Representative images of Picro Sirius Red staining of infarcted heart at 7 days after MI surgery. Images were taken by standard light (top) and polarized light (bottom) microscopes. Scale bar indicates 100μm. Polarized collagen fibers were sorted to orange-red (middle) and green-yellow (bottom) fibers by Image J software. Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed) (n=11 for WT and n=13 for cfKO)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "staining", "of", "Fst1", "(", "green", ")", "and", "α", "-", "SMA", "(", "red", ")", "in", "NRCFbs", "at", "24", "hours", "after", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "(", "10ng", "/", "ml", ")", "stimulation", ".", "Nuclei", "were", "stained", "by", "DAPI", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50μm", ".", "(", "B", ")", "Time", "course", "changes", "of", "Fstl1", "protein", "expression", "in", "NRCFbs", "after", "stimulation", "of", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "(", "10ng", "/", "ml", ")", ".", "Protein", "expression", "of", "Fstl1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "C", ")", "Transcript", "level", "of", "Fstl1", ",", "S100a4", "and", "Acta2", "mRNA", "in", "NRCFbs", "was", "determined", "by", "qPCR", "analysis", ".", "The", "samples", "were", "harvested", "at", "24", "hours", "after", "stimulation", "with", "recombinant", "TGF", "-", "β1", "(", "10ng", "/", "ml", ")", "or", "control", "vehicle", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "Fstl1", "and", "S100a4", ":", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ",", "Acta2", ":", "n", "=", "3", "for", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "for", "Fstl1", "and", "S100a4", ",", "and", "non", "-", "parametric", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "for", "Acta2", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunofluorescence microscopy staining of Fst1 (green) and α-SMA (red) in NRCFbs at 24 hours after recombinant TGF-β1 (10ng/ml) stimulation. Nuclei were stained by DAPI. Scale bar indicates 50μm.(B) Time course changes of Fstl1 protein expression in NRCFbs after stimulation of recombinant TGF-β1 (10ng/ml). Protein expression of Fstl1 was detected by immunoblotting. Tubulin was used as a loading control (n=3 for each time point). Two independent experiments were performed.(C) Transcript level of Fstl1, S100a4 and Acta2 mRNA in NRCFbs was determined by qPCR analysis. The samples were harvested at 24 hours after stimulation with recombinant TGF-β1 (10ng/ml) or control vehicle. Error bars represent mean ± SEM (Fstl1 and S100a4: n=6 for each group, Acta2: n=3 for each group). Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed) for Fstl1 and S100a4, and non-parametric unpaired t-test (2-tailed) for Acta2. Two independent experiments were performed."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "NRCFbs", "at", "passage", "1", "were", "stimulated", "with", "recombinant", "Fstl1", "(", "50ng", "/", "ml", ")", "or", "vehicle", "after", "cultured", "in", "serum", "-", "reduced", "conditions", "(", "FBS", "0", ".", "5", "%", ")", "for", "24", "hours", ".", "The", "samples", "were", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "stimulation", ".", "The", "expression", "of", "ERK1", "/", "2", "and", "tubulin", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "multi", "comparison", "test", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "B", ")", "Fstl1", "induced", "phosphorylation", "of", "ERK1", "/", "2", "was", "ablated", "by", "pretreatment", "with", "MEK", "inhibitor", "PD98059", ".", "NRCFbs", "were", "treated", "by", "PD98059", "(", "5nM", ")", "for", "30min", "and", "then", "stimulated", "with", "recombinant", "Fstl1", "protein", "(", "50ng", "/", "ml", ")", "for", "15min", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "multi", "comparison", "test", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "NRCFbs", "scratch", "assay", "(", "left", ")", "and", "quantified", "cell", "migration", "(", "right", ")", ".", "NRCFbs", "were", "transfected", "by", "Fstl1", "siRNA", "or", "siRNA", "non", "-", "targeting", "negative", "control", "for", "12", "hours", "followed", "by", "culturing", "in", "0", ".", "5", "%", "FBS", "media", "for", "24", "hours", ".", "The", "confluent", "cell", "sheet", "was", "scratched", "and", "cell", "migration", "was", "assessed", "at", "6", "hours", "after", "the", "scratch", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100µm", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "D", ")", "Fstl1", "-", "stimulation", "of", "cell", "migration", "was", "reversed", "by", "PD98059", ".", "Endogenous", "Fstl1", "in", "NRCFbs", "was", "ablated", "by", "Fstl1", "siRNA", ".", "Serum", "-", "deprived", "NRCFbs", "were", "treated", "with", "PD98059", "(", "5nM", ")", "for", "30", "min", "and", "then", "stimulated", "by", "Fstl1", "(", "50ng", "/", "ml", ")", "or", "vehicle", ".", "Cell", "migration", "was", "assessed", "at", "6", "hours", "after", "Fstl1", "stimulation", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "7", "-", "9", "for", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunnett", "'", "s", "T3", "test", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "E", ")", "Morphological", "changes", "of", "NRCFbs", "after", "recombinant", "Fstl1stimulation", "was", "assessed", "by", "immunocytochemistry", ".", "24", "hours", "serum", "starved", "NRCFbs", "was", "stimulated", "by", "Fstl1", "(", "50ng", "/", "ml", ")", "or", "vehicle", "for", "3", "hours", ".", "PD98059", "(", "5nM", ")", "or", "DMSO", "was", "added", "30min", "prior", "to", "Fstl1", "stimulation", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "phalloidin", "antibody", "and", "nuclei", "were", "stained", "by", "DAPI", ".", "Arrow", "shows", "lamellipodium", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) NRCFbs at passage 1 were stimulated with recombinant Fstl1 (50ng/ml) or vehicle after cultured in serum-reduced conditions (FBS 0.5%) for 24 hours. The samples were harvested at the indicated time points after stimulation. The expression of ERK1/2 and tubulin were detected by immunoblotting. Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Tukey multi comparison test (n=3 for each time point). Three independent experiments were performed.(B) Fstl1 induced phosphorylation of ERK1/2 was ablated by pretreatment with MEK inhibitor PD98059. NRCFbs were treated by PD98059 (5nM) for 30min and then stimulated with recombinant Fstl1 protein (50ng/ml) for 15min. Error bars represent mean ± SEM. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Tukey multi comparison test (n=3 for each time point). Two independent experiments were performed.(C) Representative images of NRCFbs scratch assay (left) and quantified cell migration (right). NRCFbs were transfected by Fstl1 siRNA or siRNA non-targeting negative control for 12 hours followed by culturing in 0.5% FBS media for 24 hours. The confluent cell sheet was scratched and cell migration was assessed at 6 hours after the scratch. Scale bar indicates 100µm. Error bars represent mean ± SEM (n=10 for each group). Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed). Two independent experiments were performed.(D) Fstl1-stimulation of cell migration was reversed by PD98059. Endogenous Fstl1 in NRCFbs was ablated by Fstl1 siRNA. Serum-deprived NRCFbs were treated with PD98059 (5nM) for 30 min and then stimulated by Fstl1 (50ng/ml) or vehicle. Cell migration was assessed at 6 hours after Fstl1 stimulation. Error bars represent mean ± SEM (n=7-9 for each group). Statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test and Dunnett's T3 test. Two independent experiments were performed.(E) Morphological changes of NRCFbs after recombinant Fstl1stimulation was assessed by immunocytochemistry. 24 hours serum starved NRCFbs was stimulated by Fstl1 (50ng/ml) or vehicle for 3 hours. PD98059 (5nM) or DMSO was added 30min prior to Fstl1 stimulation. Cells were stained with Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin antibody and nuclei were stained by DAPI. Arrow shows lamellipodium of the cell. Scale bar indicates 50μm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ",", "B", ")", "Fibroblast", "proliferation", "was", "assessed", "by", "Edu", "incorporation", "assay", ".", "Endogenous", "Fstl1", "was", "ablated", "by", "siRNA", ".", "NRCFbs", "were", "cultured", "in", "0", ".", "5", "%", "FBS", "condition", "for", "48", "hours", "to", "synchronize", "the", "cell", "cycle", ".", "EdU", "(", "10μM", "as", "the", "final", "concentration", ")", "was", "added", "into", "media", "at", "4", "hours", "before", "harvest", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ",", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "B", ")", "Effect", "of", "exogenous", "Fstl1", "on", "cardiac", "fibroblast", "proliferation", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "FBS", "0", ".", "5", "%", "media", "for", "24", "hours", ".", "Recombinant", "Fstl1", "(", "50ng", "/", "ml", ")", "or", "vehicle", "were", "added", "to", "2", "%", "FBS", "-", "containing", "media", "and", "cultured", "for", "48", "hours", ".", "EdU", "was", "added", "into", "media", "at", "4", "hours", "before", "harvest", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "7", ",", "each", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "(", "C", ")", "Fstl1", "promoted", "fibroblasts", "proliferation", "was", "diminished", "by", "PD98059", ".", "PD98059", "(", "5nM", ")", "was", "added", "30", "min", "prior", "to", "recombinant", "Fstl1", "stimulation", "(", "50ng", "/", "ml", ")", ".", "The", "cells", "were", "cultured", "for", "48", "hours", ",", "and", "EdU", "was", "added", "into", "media", "at", "4", "hours", "before", "harvest", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "4", "-", "10", ",", "per", "treatment", "group", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "multi", "comparison", "test", ".", "Two", "independent", "experiments", "were", "performed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A, B) Fibroblast proliferation was assessed by Edu incorporation assay. Endogenous Fstl1 was ablated by siRNA. NRCFbs were cultured in 0.5% FBS condition for 48 hours to synchronize the cell cycle. EdU (10μM as the final concentration) was added into media at 4 hours before harvest. Error bars represent mean ± SEM (n=5, each group). Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed). Two independent experiments were performed. (B) Effect of exogenous Fstl1 on cardiac fibroblast proliferation. Cells were cultured in FBS 0.5% media for 24 hours. Recombinant Fstl1 (50ng/ml) or vehicle were added to 2% FBS-containing media and cultured for 48 hours. EdU was added into media at 4 hours before harvest. Error bars represent mean ± SEM (n=7, each group). Statistical analysis was performed by unpaired t-test (2-tailed). Two independent experiments were performed.(C) Fstl1 promoted fibroblasts proliferation was diminished by PD98059. PD98059 (5nM) was added 30 min prior to recombinant Fstl1 stimulation (50ng/ml). The cells were cultured for 48 hours, and EdU was added into media at 4 hours before harvest. Error bars represent mean ± SEM (n=4-10, per treatment group). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Tukey multi comparison test. Two independent experiments were performed."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Western", "blots", "showing", "absence", "of", "mitochondrial", "proteins", "from", "the", "different", "mitochondrial", "complexes", ":", "NDUFB8", "(", "complex", "I", ")", ",", "SDHA", "(", "complex", "II", ")", ",", "UQCRC2", "(", "complex", "III", ")", "and", "MTCO", "-", "1", "(", "complex", "IV", ")", ",", "in", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Control", "and", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "is", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "C", ")", "Cellular", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "in", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Control", "and", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "were", "obtained", "using", "Seahorse", "XF24", "analyzer", "and", "shows", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", "n", "=", "4", "technical", "repeats", "(", "representative", "of", "2", "independent", "experiments", ")", ";", "D", ")", "Representative", "3D", "EM", "pictures", "of", "senescent", "(", "20", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", "with", "or", "without", "CCCP", ".", "Mitochondria", "are", "in", "red", ",", "the", "nucleus", "in", "blue", ";", "E", ")", "Representative", "images", "of", "cell", "size", ",", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "activity", "(", "blue", "cytoplasmic", "staining", ")", ",", "macro", "-", "H2A", "foci", "and", "SDHA", "immunofluorescence", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ";", "F", ")", "Quantification", "of", "ROS", "levels", "(", "DHE", "fluorescence", ")", ",", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "positive", "cells", "and", "Senescence", "-", "associated", "heterochromatin", "foci", "(", "SAHF", ")", "observed", "by", "DAPI", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Control", "and", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "G", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "p21", "and", "p16", "expression", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Control", "and", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "H", ")", "Secreted", "protein", "measured", "in", "a", "cytokine", "array", "(", "RayBiotech", ")", "of", "a", "variety", "of", "inflammatory", "proteins", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "Parkin", "-", "expressing", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Western blots showing absence of mitochondrial proteins from the different mitochondrial complexes: NDUFB8 (complex I), SDHA (complex II), UQCRC2 (complex III) and MTCO-1 (complex IV), in senescent (10 days after 20Gy X-ray) Control and Parkin-expressing MRC5 fibroblasts. Data is representative of 3 independent experiments;C) Cellular oxygen consumption rates (OCR) in senescent (10 days after 20Gy X-ray) Control and Parkin-expressing MRC5 fibroblasts. Data were obtained using Seahorse XF24 analyzer and shows mean±S.D. n=4 technical repeats (representative of 2 independent experiments);D) Representative 3D EM pictures of senescent (20 days after 20Gy X-ray) Parkin-expressing MRC5 fibroblasts with or without CCCP. Mitochondria are in red, the nucleus in blue;E) Representative images of cell size, Sen-β-Gal activity (blue cytoplasmic staining), macro-H2A foci and SDHA immunofluorescence in proliferating and senescent (10 days after 20Gy X-ray) Parkin- expressing MRC5 fibroblasts;F) Quantification of ROS levels (DHE fluorescence), Sen-β-Gal positive cells and Senescence-associated heterochromatin foci (SAHF) observed by DAPI in proliferating and senescent (10 days after 20Gy X-ray) Control and Parkin-expressing MRC5 fibroblasts. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.G) Representative western blots showing p21 and p16 expression in proliferating and senescent (10 days after 20Gy X-ray) Control and Parkin-expressing MRC5 fibroblasts. Data are representative of 3 independent experiments;H) Secreted protein measured in a cytokine array (RayBiotech) of a variety of inflammatory proteins in proliferating and senescent (10 days after 20Gy X-ray) Parkin-expressing MRC5 fibroblasts. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments. Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Representative", "images", "of", "colony", "assays", "of", "wild", "-", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", "grown", "at", "3", "%", "or", "21", "%", "O2", "(", "10", "days", "after", "seeding", "5", ",", "000", "cells", "/", "well", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "B", ")", "Effect", "of", "3", "%", "or", "21", "%", "O2", "and", "X", "-", "ray", "irradiation", "(", "at", "3", "%", "O2", ")", "on", "the", "percentage", "of", "Ki67", "(", "at", "day", "6", ")", "and", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "positive", "cells", "(", "at", "day", "10", ")", "and", "number", "(", "N", ")", "of", "53BP1", "foci", "(", "at", "day", "6", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "C", ")", "Representative", "images", "of", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "activity", "(", "blue", "cytoplasmatic", "staining", ")", ",", "Ki", "-", "67", "and", "53BP1", "foci", "in", "proliferating", "and", "senescent", "wild", "-", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", "(", "scale", "bar", "=", "10µm", ")", ";", "D", ")", "mRNA", "expression", "of", "PGC", "-", "1β", "CXCL", "-", "1", "and", "p16", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "10Gy", "X", "-", "ray", ")", "wild", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", ")", "Effects", "of", "overexpression", "of", "PGC", "-", "1β", "on", "the", "percentage", "of", "Ki67", "and", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "positive", "cells", ",", "number", "(", "N", ")", "of", "53BP1", "foci", "and", "percentage", "change", "of", "mitochondrial", "mass", "(", "NAO", "intensity", ")", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "2", "days", "after", "10Gy", "X", "-", "ray", ")", "MEFs", "cultured", "at", "3", "%", "O2", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Representative images of colony assays of wild-type and PGC-1β -/- MEFs grown at 3% or 21% O2 (10 days after seeding 5,000 cells/well). Data are representative of 3 independent experiments;B) Effect of 3% or 21% O2 and X-ray irradiation (at 3% O2) on the percentage of Ki67 (at day 6) and Sen-β-Gal positive cells (at day 10) and number (N) of 53BP1 foci (at day 6) in wild-type and PGC-1β -/- MEFs. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.C) Representative images of Sen-β-Gal activity (blue cytoplasmatic staining), Ki-67 and 53BP1 foci in proliferating and senescent wild-type and PGC-1β-/- MEFs (scale bar=10µm);D) mRNA expression of PGC-1β CXCL-1 and p16 in proliferating and senescent (10 days after 10Gy X-ray) wild type and PGC-1β-/- MEFs. Data are mean±S.E.M. of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.E) Effects of overexpression of PGC-1β on the percentage of Ki67 and Sen-β-Gal positive cells, number (N) of 53BP1 foci and percentage change of mitochondrial mass (NAO intensity) in proliferating and senescent (2 days after 10Gy X-ray) MEFs cultured at 3% O2. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments. Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "mTORC1", "activity", "measured", "by", "phosphorylated", "p70S6K", "(", "T389", ")", "from", "6", "to", "72", "hours", "after", "20Gy", "in", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "B", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "the", "mitochondrialproteins", "TOMM20", ",", "NDUFB8", "(", "complex", "I", ")", ",", "SDHA", "(", "complex", "II", ")", ",", "UQCRC2", "(", "complex", "III", ")", "and", "MT", "-", "CO1", "(", "complex", "IV", ")", "following", "20Gy", "irradiation", "with", "or", "without", "100nM", "Rapamycin", "treatment", "in", "MRC5fibroblasts", ".", "Data", "are", "representative", "of", "4", "independent", "experiments", ";", "C", ")", "Effect", "of", "100nM", "rapamycin", "on", "mitochondrial", "mass", "(", "measured", "by", "NAO", "fluorescence", ")", "2", "-", "4", "days", "following", "replication", "exhaustion", "(", "RS", ")", "or", "genotoxic", "stress", "(", "generated", "by", "X", "-", "ray", "irradiation", ",", "Etoposide", ",", "Neocarcinostatin", "(", "NCS", ")", ",", "H2O2", "or", "telomere", "dysfunction", "(", "TRF2ΔBΔM", ")", ")", "in", "a", "variety", "of", "cell", "lines", ".", "Data", "are", "mean", "from", "3", "independent", "experiments", "per", "cell", "line", "or", "treatment", ";", "D", ")", "(", "top", ")", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "T", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "micrographs", "of", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", "treated", "with", "or", "without", "100nM", "rapamycin", ".", "Mitochondria", "are", "labeled", "in", "pink", ".", "Scale", "bar", "=", "2µm", ";", "(", "bottom", "left", "and", "middle", ")", "Quantification", "of", "mitochondrial", "volume", "fraction", "(", "%", "Vv", ")", "and", "mitochondrial", "number", "per", "cross", "section", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", "treated", "with", "or", "without", "100nM", "rapamycin", ".", "T", ".", "E", ".", "M", ".", "mitochondrial", "analysis", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "24", "electron", "micrographs", "per", "condition", ";", "(", "bottom", "right", ")", "mtDNA", "copy", "number", "analysis", "by", "q", "-", "PCR", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", "treated", "with", "or", "without", "100nM", "Rapamycin", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "expression", "of", "phosphorylated", "p70S6K", "(", "T389", ")", "and", "AKT", "(", "S473", ")", ",", "the", "mitochondrial", "protein", "NDUFB8", "and", "the", "DDR", "downstream", "target", "p21", "in", "MRC5", "fibroblasts", "treated", "with", "or", "without", "10µM", "of", "the", "ATM", "inhibitor", "KU55933", "and", "in", "fibroblasts", "from", "a", "patient", "with", "Ataxia", "Telangiectasis", "(", "AT", ")", "at", "different", "time", "points", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", "(", "ATM", "inhibitor", ")", "and", "1", "experiment", "(", "AT", "patient", ")", ";", "F", ")", "Western", "blots", "showing", "the", "effect", "of", "the", "ATM", "inhibitor", "KU55933", "on", "γH2A", ".", "X", ",", "AKT", "phosphorylation", "and", "p21", "expression", "in", "MRC5fibroblasts", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ".", "Data", "is", "from", "one", "experiment", ";", "G", ")", "Effect", "of", "rapamycin", "and", "/", "or", "ATM", "inhibitor", "(", "KU55933", ")", "on", "mitochondrial", "mass", "(", "NAO", "intensity", ")", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Representative western blot of mTORC1 activity measured by phosphorylated p70S6K (T389) from 6 to 72 hours after 20Gy in MRC5 fibroblasts. Data are representative of 3 independent experiments;B) Representative western blots of the mitochondrialproteins TOMM20, NDUFB8 (complex I), SDHA (complex II), UQCRC2 (complex III) and MT-CO1 (complex IV) following 20Gy irradiation with or without 100nM Rapamycin treatment in MRC5fibroblasts. Data are representative of 4 independent experiments;C) Effect of 100nM rapamycin on mitochondrial mass (measured by NAO fluorescence) 2-4 days following replication exhaustion (RS) or genotoxic stress (generated by X-ray irradiation, Etoposide, Neocarcinostatin (NCS), H2O2 or telomere dysfunction (TRF2ΔBΔM)) in a variety of cell lines. Data are mean from 3 independent experiments per cell line or treatment;D) (top) Representative transmission electron microscopy (T.E.M.) micrographs of proliferating and senescent (3 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts treated with or without 100nM rapamycin. Mitochondria are labeled in pink. Scale bar=2µm; (bottom left and middle) Quantification of mitochondrial volume fraction (%Vv) and mitochondrial number per cross section in proliferating and senescent (3 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts treated with or without 100nM rapamycin. T.E.M. mitochondrial analysis are mean±S.E.M of 24 electron micrographs per condition; (bottom right) mtDNA copy number analysis by q-PCR in proliferating and senescent (3 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts treated with or without 100nM Rapamycin. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.E) Representative western blots showing expression of phosphorylated p70S6K (T389) and AKT (S473), the mitochondrial protein NDUFB8 and the DDR downstream target p21 in MRC5 fibroblasts treated with or without 10µM of the ATM inhibitor KU55933 and in fibroblasts from a patient with Ataxia Telangiectasis (AT) at different time points after 20Gy X-ray. Data are representative of 3 independent experiments (ATM inhibitor) and 1 experiment (AT patient);F) Western blots showing the effect of the ATM inhibitor KU55933 on γH2A.X, AKT phosphorylation and p21 expression in MRC5fibroblasts after 20Gy X-ray. Data is from one experiment;G) Effect of rapamycin and/or ATM inhibitor (KU55933) on mitochondrial mass (NAO intensity) in proliferating and senescent (3 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments. Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "ROS", "levels", "(", "DHE", "intensity", ")", "and", "mean", "number", "(", "N", ")", "of", "yH2A", ".", "X", "foci", "after", "mTOR", "knockdown", "(", "72", "hours", ")", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "2", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "B", ")", "ROS", "levels", "(", "DHE", "intensity", ")", "and", "mean", "number", "(", "N", ")", "of", "yH2A", ".", "X", "foci", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5", "fibroblasts", "treated", "with", "or", "without", "100nM", "Rapamycin", "and", "/", "or", "2", ".", "5mM", "of", "the", "antioxidant", "NAC", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "C", ")", "(", "top", ")", "Scheme", "illustrating", "the", "experimental", "design", ":", "human", "MRC5", "fibroblasts", "were", "irradiated", "with", "20Gy", "X", "-", "ray", "and", "treated", "at", "day", "3", "after", "IR", "with", "10µM", "of", "the", "ATM", "inhibitor", "(", "ATMi", ")", "KU55933", "and", "/", "or", "100nM", "Rapamycin", "(", "Rap", ")", ";", "(", "bottom", ")", "Effect", "of", "single", "or", "combined", "inhibition", "of", "ATM", "and", "mTORC1", "on", "the", "mean", "number", "(", "N", ")", "of", "γH2A", ".", "X", "foci", ",", "Sen", "-", "β", "-", "Gal", "activity", "and", "p21", "expression", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "10", "days", "after", "20Gy", "X", "-", "ray", ")", "MRC5fibroblasts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "D", ")", "ROS", "levels", "(", "DHE", "intensity", ")", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "10Gy", "X", "-", "ray", ")", "wild", "-", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", "(", "top", ")", "and", "PGC", "-", "1β", "overexpressing", "MEFs", "(", "bottom", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", ")", "(", "top", ")", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "immunofluorescence", "staining", "against", "FLAG", "-", "PGC", "-", "1β", "(", "red", ")", "and", "53BP1", "(", "green", ")", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "2", "days", "after", "10Gy", "X", "-", "ray", ")", "PGC", "-", "1β", "overexpressing", "MEFs", "cultured", "at", "3", "%", "O2", ",", "with", "or", "without", "250µM", "of", "the", "antioxidant", "Trolox", "(", "scale", "bar", "=", "10µm", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "F", ")", "(", "top", ")", "Effect", "of", "overexpression", "of", "mutated", "Rheb", "(", "N153T", ")", "and", "(", "bottom", ")", "effect", "of", "100nM", "rapamycin", "on", "the", "mean", "number", "(", "N", ")", "of", "53BP1", "foci", "in", "proliferating", "and", "senescent", "(", "3", "days", "after", "10Gy", "X", "-", "ray", ")", "wild", "-", "type", "and", "PGC", "-", "1β", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "(", "at", "least", "125", "cells", "were", "analyzed", "per", "condition", ")", ".", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "One", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) ROS levels (DHE intensity) and mean number (N) of yH2A.X foci after mTOR knockdown (72 hours) in proliferating and senescent (2 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.B) ROS levels (DHE intensity) and mean number (N) of yH2A.X foci in proliferating and senescent (3 days after 20Gy X-ray) MRC5 fibroblasts treated with or without 100nM Rapamycin and/or 2.5mM of the antioxidant NAC. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.C) (top) Scheme illustrating the experimental design: human MRC5 fibroblasts were irradiated with 20Gy X-ray and treated at day 3 after IR with 10µM of the ATM inhibitor (ATMi) KU55933 and/or 100nM Rapamycin (Rap); (bottom) Effect of single or combined inhibition of ATM and mTORC1 on the mean number (N) of γH2A.X foci, Sen-β-Gal activity and p21 expression in proliferating and senescent (10 days after 20Gy X-ray) MRC5fibroblasts. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments. Western blots are representative of 3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.D) ROS levels (DHE intensity) in proliferating and senescent (3 days after 10Gy X-ray) wild-type and PGC-1β-/- MEFs (top) and PGC-1β overexpressing MEFs (bottom). Data are mean±S.E.M. of n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.E) (top) Representative images and quantification of immunofluorescence staining against FLAG-PGC-1β (red) and 53BP1 (green) in proliferating and senescent (2 days after 10Gy X-ray) PGC-1β overexpressing MEFs cultured at 3% O2, with or without 250µM of the antioxidant Trolox (scale bar=10µm). Data are mean±S.E.M, n=3 independent experiments; Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA.F) (top) Effect of overexpression of mutated Rheb (N153T) and (bottom) effect of 100nM rapamycin on the mean number (N) of 53BP1 foci in proliferating and senescent (3 days after 10Gy X-ray) wild-type and PGC-1β -/- MEFs. Data are mean±S.E.M of n=3 independent experiments (at least 125 cells were analyzed per condition). Asterisks denote statistical significant P<0.05 One-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "(", "top", ")", "Representative", "image", "of", "immunofluorescence", "double", "staining", "for", "the", "mitochondrial", "protein", "MT", "-", "CO1", "and", "the", "DDR", "marker", "yH2A", ".", "X", "(", "scale", "bar", "=", "5µm", ")", "and", "(", "bottom", ")", "quantification", "of", "MT", "-", "CO1", "intensity", "vs", "number", "of", "yH2A", ".", "X", "foci", "in", "hepatocytes", "from", "12", "months", "old", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "mice", "(", "at", "least", "30", "cells", "were", "analyzed", "per", "mouse", ")", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "B", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "pS6", ",", "S6", ",", "p21", ",", "PGC", "-", "1β", ",", "MT", "-", "CO1", "and", "NDUFB8", "protein", "expression", "in", "mouse", "liver", "tissue", "at", "3", "and", "12", "months", "of", "age", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ";", "C", ")", "Effect", "of", "4", "months", "of", "rapamycin", "supplemented", "diet", "on", "PGC", "-", "1β", "expression", "in", "liver", "tissue", "of", "16", "months", "old", "mice", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ";", "D", ")", "(", "top", ")", "Quantification", "of", "mitochondrial", "number", "per", "cross", "section", "and", "mitochondrial", "volume", "fraction", "(", "%", "Vv", ")", "in", "hepatocytes", "from", "16", "months", "old", "mice", "with", "or", "without", "4", "months", "rapamycin", "diet", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "(", "at", "least", "20", "cells", "were", "analyzed", "per", "mouse", ")", ";", "(", "bottom", ")", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "hepatocytes", "from", "16", "months", "old", "mice", "with", "or", "without", "4", "months", "rapamycin", "diet", ",", "(", "mitochondria", "are", "labelled", "in", "pink", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ";", "E", ")", "mtDNA", "copy", "number", "(", "measured", "by", "q", "-", "PCR", ")", "in", "mice", "liver", "tissue", "at", "3", ",", "12", ",", "16", "months", "and", "at", "16", "months", "after", "4", "months", "rapamycin", "diet", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "group", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "F", ")", "Oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "in", "isolated", "liver", "mitochondria", "from", "16", "months", "old", "mice", "fed", "with", "or", "without", "rapamycin", "for", "4", "months", ",", "in", "the", "presence", "of", "pyruvate", "/", "malate", ".", "State", "III", "was", "induced", "by", "injection", "of", "ADP", ".", "State", "IV", "was", "induced", "by", "inhibition", "of", "the", "ATP", "synthase", "with", "oligomycin", "and", "uncoupled", "respiration", "rates", "were", "determined", "by", "injection", "of", "FCCP", ".", "Antimycin", "A", "(", "AA", ")", "was", "used", "to", "determine", "background", ",", "non", "-", "mitochondrial", "OXPHOS", ",", "OCR", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ";", "G", ")", "(", "top", ")", "Representative", "immuno", "-", "TeloFISH", "images", "of", "hepatocytes", "from", "3", "and", "15", "months", "old", "mice", "with", "or", "without", "rapamycin", "(", "12", "months", "diet", ")", ".", "Co", "-", "localizing", "foci", "are", "amplified", "in", "the", "right", "panel", "(", "amplified", "images", "are", "from", "single", "Z", "-", "planes", "where", "co", "-", "localization", "was", "found", ")", ";", "(", "bottom", ")", "Dot", "plot", "graph", "of", "Telomere", "-", "associated", "foci", "(", "TAF", ")", "in", "3", ",", "15", "and", "16", "months", "old", "mice", "(", "15", "and", "16", "months", "old", "mice", "were", "fed", "with", "rapamycin", "for", "12", "and", "4", "months", "respectively", ")", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "-", "9", "mice", "per", "group", "(", "at", "least", "50", "cells", "were", "analyzed", "per", "mice", ")", ";", "H", ")", "(", "top", ")", "4", "months", "old", "and", "15", "months", "old", "micelivers", "[", "control", "(", "-", ")", "or", "rapamycin", "(", "+", ")", "]", "stained", "with", "Sen", "-", "-", "β", "-", "Gal", "solution", "(", "Sen", "-", "-", "β", "-", "Gal", "activity", "is", "evidenced", "by", "blue", "staining", ")", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ";", "(", "bottom", ")", "Representative", "image", "showing", "Sen", "-", "-", "β", "-", "Gal", "staining", "(", "Sen", "-", "-", "β", "-", "Gal", "activity", "is", "evidenced", "by", "blue", "staining", ")", "in", "hepatocytes", "and", "corresponding", "immuno", "-", "TeloFISH", "(", "arrows", "represent", "co", "-", "localizing", "foci", ")", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "I", ")", "Representative", "western", "blot", "showing", "the", "effect", "of", "4", "months", "rapamycin", "feeding", "on", "p21", "expression", "in", "16", "months", "old", "mice", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ";", "j", ")", "Effect", "of", "4", "months", "rapamycin", "feeding", "on", "mRNA", "expression", "of", "the", "SASP", "components", "CXCL1", ",", "CXCL5", "and", "Inhibin", "A", "in", "liver", "tissue", "of", "16", "months", "old", "mice", "with", "or", "without", "4", "months", "rapamycin", "treatment", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "5", "mice", "per", "condition", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "K", ")", "Mean", "number", "of", "TAF", "in", "hepatocytes", "of", "wild", "type", "and", "PGC", "-", "1", "-", "β", "-", "/", "-", "mice", "with", "18", "months", "of", "age", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ";", "Asterisks", "denote", "statistical", "significant", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) (top) Representative image of immunofluorescence double staining for the mitochondrial protein MT-CO1 and the DDR marker yH2A.X (scale bar=5µm) and (bottom) quantification of MT-CO1 intensity vs number of yH2A.X foci in hepatocytes from 12 months old mice. Data are mean±S.E.M of n=3 mice (at least 30 cells were analyzed per mouse); Asterisks denote statistical significant P<0.05 using Two-tailed t-test.B) Representative western blots of pS6, S6, p21, PGC-1β, MT-CO1 and NDUFB8 protein expression in mouse liver tissue at 3 and 12 months of age. Data are from n=3 mice per group;C) Effect of 4 months of rapamycin supplemented diet on PGC-1β expression in liver tissue of 16 months old mice. Data are from n=3 mice per group;D) (top) Quantification of mitochondrial number per cross section and mitochondrial volume fraction (%Vv) in hepatocytes from 16 months old mice with or without 4 months rapamycin diet. Data are mean±S.E.M of n=3 mice per group (at least 20 cells were analyzed per mouse); (bottom) Representative electron micrographs of hepatocytes from 16 months old mice with or without 4 months rapamycin diet, (mitochondria are labelled in pink). Scale bar=5µm;E) mtDNA copy number (measured by q-PCR) in mice liver tissue at 3, 12, 16 months and at 16 months after 4 months rapamycin diet. Data are mean±S.E.M of n=3-4 mice per group; Asterisks denote statistical significant P<0.05 using One-way ANOVA.F) Oxygen consumption rates (OCR) in isolated liver mitochondria from 16 months old mice fed with or without rapamycin for 4 months, in the presence of pyruvate/malate. State III was induced by injection of ADP. State IV was induced by inhibition of the ATP synthase with oligomycin and uncoupled respiration rates were determined by injection of FCCP. Antimycin A (AA) was used to determine background, non-mitochondrial OXPHOS, OCR. Data are mean±S.E.M of n=5 mice per group;G) (top) Representative immuno-TeloFISH images of hepatocytes from 3 and 15 months old mice with or without rapamycin (12 months diet). Co-localizing foci are amplified in the right panel (amplified images are from single Z-planes where co-localization was found); (bottom) Dot plot graph of Telomere-associated foci (TAF) in 3, 15 and 16 months old mice (15 and 16 months old mice were fed with rapamycin for 12 and 4 months respectively). Data are from n=3-9 mice per group (at least 50 cells were analyzed per mice);H) (top) 4 months old and 15 months old micelivers [control (-) or rapamycin (+)] stained with Sen--β-Gal solution (Sen--β-Gal activity is evidenced by blue staining). Data are from n=3 mice per group; (bottom) Representative image showing Sen--β-Gal staining (Sen--β-Gal activity is evidenced by blue staining) in hepatocytes and corresponding immuno-TeloFISH (arrows represent co-localizing foci); Asterisks denote statistical significant P<0.05 using One-way ANOVA.I) Representative western blot showing the effect of 4 months rapamycin feeding on p21 expression in 16 months old mice. Data are from n=3 mice per group;j) Effect of 4 months rapamycin feeding on mRNA expression of the SASP components CXCL1, CXCL5 and Inhibin A in liver tissue of 16 months old mice with or without 4 months rapamycin treatment. Data are from n=5 mice per condition; Asterisks denote statistical significant P<0.05 using Two-tailed t-test.K) Mean number of TAF in hepatocytes of wild type and PGC-1-β-/- mice with 18 months of age. Data are mean±S.E.M of n=4 mice per group; Asterisks denote statistical significant P<0.05 using Two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "NSCLC", "expressing", "single", "site", "mutants", "of", "EGFR", ",", "PC9", "(", "3X106", ")", "or", "H3255", "(", "8X106", ")", ",", "were", "seeded", "in", "10", "-", "cm", "dishes", ".", "On", "the", "next", "day", ",", "complete", "media", "were", "replaced", "with", "media", "containing", "serum", "(", "1", "%", ")", "and", "the", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hours", "with", "different", "EGFR", "-", "specific", "TKIs", "(", "erlotinib", ",", "50", "nM", ";", "osimertinib", ",", "50", "nM", ",", "or", "afatinib", ",", "10", "nM", ")", ",", "either", "alone", "or", "in", "combination", "with", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "and", "trastuzumab", ",", "5", "μg", "/", "ml", "each", ")", ".", "Thereafter", ",", "cells", "were", "washed", "with", "cold", "saline", "and", "extracted", ".", "Proteins", "were", "separated", "using", "gel", "electrophoresis", "and", "transferred", "onto", "nitrocellulose", "membranes", ".", "After", "blocking", ",", "membranes", "were", "incubated", "overnight", "with", "the", "indicated", "primary", "antibodies", ",", "followed", "by", "incubation", "with", "horseradish", "peroxidase", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", "(", "60", "minutes", ")", ",", "and", "treatment", "with", "Clarity", "™", "Western", "ECL", "Blotting", "Substrates", "(", "Bio", "-", "Rad", ")", ".", "ECL", "signals", "were", "detected", "using", "the", "ChemiDoc", "™", "Imaging", "System", "(", "Bio", "-", "Rad", ")", "and", "images", "were", "acquired", "using", "the", "ImageLab", "software", ".", "Signals", "(", "relative", "to", "Control", ")", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "the", "signals", "of", "GAPDH", "(", "numbers", "shown", "below", "each", "lane", ")", ".", "with", "different", "EGFR", "-", "specific", "TKIs", "(", "erlotinib", ",", "50", "nM", ";", "osimertinib", ",", "50", "nM", ",", "or", "afatinib", ",", "10", "nM", ")", ",", "either", "alone", "or", "in", "combination", "with", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "and", "trastuzumab", ",", "5", "μg", "/", "ml", "each", ")", ".", "(", "C", ")", "PC9", "cells", "were", "seeded", "on", "coverslips", "and", "treated", "for", "24", "hours", "Cells", "were", "washed", "in", "acidic", "buffer", ",", "fixed", "in", "paraformaldehyde", "(", "4", "%", ")", "and", "incubated", "with", "specific", "primary", "antibodies", ",", "followed", "by", "an", "Alexa", "Fluor", "555", "-", "conjugated", "secondary", "antibody", "(", "pseudo", "colored", "in", "green", ")", ".", "DAPI", "(", "blue", ")", "was", "used", "to", "stain", "nuclei", ".", "Images", "were", "captured", "using", "a", "confocal", "microscope", "(", "40X", "magnification", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) NSCLC expressing single site mutants of EGFR, PC9 (3X106) or H3255 (8X106), were seeded in 10-cm dishes. On the next day, complete media were replaced with media containing serum (1%) and the cells were treated for 24 hours with different EGFR-specific TKIs (erlotinib, 50 nM; osimertinib, 50 nM, or afatinib, 10 nM), either alone or in combination with 2XmAbs (cetuximab and trastuzumab, 5 μg/ml each). Thereafter, cells were washed with cold saline and extracted. Proteins were separated using gel electrophoresis and transferred onto nitrocellulose membranes. After blocking, membranes were incubated overnight with the indicated primary antibodies, followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (60 minutes), and treatment with Clarity™ Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad). ECL signals were detected using the ChemiDoc™ Imaging System (Bio-Rad) and images were acquired using the ImageLab software. Signals (relative to Control) were quantified and normalized to the signals of GAPDH (numbers shown below each lane).with different EGFR-specific TKIs (erlotinib, 50 nM; osimertinib, 50 nM, or afatinib, 10 nM), either alone or in combination with 2XmAbs (cetuximab and trastuzumab, 5 μg/ml each). (C) PC9 cells were seeded on coverslips and treated for 24 hours Cells were washed in acidic buffer, fixed in paraformaldehyde (4%) and incubated with specific primary antibodies, followed by an Alexa Fluor 555-conjugated secondary antibody (pseudo colored in green). DAPI (blue) was used to stain nuclei. Images were captured using a confocal microscope (40X magnification)."}
{"words": ["Figure", "2PC9", "cells", "(", "3X106", "/", "mouse", ")", "were", "subcutaneously", "implanted", "in", "the", "flanks", "of", "CD1", "-", "nu", "/", "nu", "mice", ".", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "mice", "were", "randomized", "in", "groups", "of", "5", "-", "9", "animals", "and", "treated", "for", "90", "days", "(", "grey", "areas", ")", "with", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "plus", "trastuzumab", ",", "0", ".", "2", "mg", "/", "mouse", "/", "injection", ")", ",", "once", "every", "three", "days", ",", "or", "with", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ",", "once", "per", "day", ".", "Alternatively", ",", "mice", "were", "treated", "with", "combinations", "of", "erlotinib", "(", "50", ",", "20", ",", "10", ",", "5", "or", "1", "mg", "/", "kg", ")", "and", "the", "two", "monoclonal", "antibodies", ".", "Following", "60", "days", "of", "treatment", "reduced", "the", "frequency", "of", "erlotinib", "administration", "to", "once", "every", "other", "day", "(", "underneath", "dotted", "line", ")", ".", "animal", "survival", "(", "B", ")", "are", "shown", ".", "Mice", "were", "euthanized", "when", "tumor", "size", "reached", "1", ",", "500", "mm3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2PC9 cells (3X106/mouse) were subcutaneously implanted in the flanks of CD1-nu/nu mice. When tumors became palpable, mice were randomized in groups of 5-9 animals and treated for 90 days (grey areas) with 2XmAbs (cetuximab plus trastuzumab, 0.2 mg/mouse/injection), once every three days, or with erlotinib (50 mg/kg/day), once per day. Alternatively, mice were treated with combinations of erlotinib (50, 20, 10, 5 or 1 mg/kg) and the two monoclonal antibodies. Following 60 days of treatment reduced the frequency of erlotinib administration to once every other day (underneath dotted line). animal survival (B) are shown. Mice were euthanized when tumor size reached 1,500 mm3."}
{"words": ["Figure", "3PC9", "cells", "(", "exon", "19", "deletion", ")", "were", "subcutaneously", "implanted", "in", "the", "flank", "of", "CD1", "-", "nu", "/", "nu", "mice", "(", "3X106", "/", "mouse", ")", ".", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "mice", "were", "randomized", "in", "groups", "of", "5", "-", "9", "animals", "and", "treated", "for", "90", "days", "(", "grey", "areas", ")", "with", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "plus", "trastuzumab", ",", "each", "at", "0", ".", "1", "mg", "/", "mouse", "/", "injection", ")", "once", "every", "three", "days", ",", "or", "daily", "with", "different", "TKIs", ":", "osimertinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ")", ",", "afatinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ")", "or", "imatinib", "(", "100", "mg", "/", "kg", ")", ",", "either", "alone", "or", "in", "combination", "with", "the", "two", "antibodies", ".", "Following", "60", "days", "of", "treatment", ",", "the", "frequency", "of", "TKI", "administration", "was", "reduced", "to", "once", "every", "other", "day", "(", "underneath", "dotted", "lines", ")", ",", "while", "mAb", "treatment", "remained", "unaltered", ".", "animal", "survival", "(", "B", ")", "are", "shown", ".", "Mice", "were", "euthanized", "when", "tumor", "size", "reached", "1", ",", "500", "mm3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3PC9 cells (exon 19 deletion) were subcutaneously implanted in the flank of CD1-nu/nu mice (3X106/mouse). When tumors became palpable, mice were randomized in groups of 5-9 animals and treated for 90 days (grey areas) with 2XmAbs (cetuximab plus trastuzumab, each at 0.1 mg/mouse/injection) once every three days, or daily with different TKIs: osimertinib (5 mg/kg), afatinib (5 mg/kg) or imatinib (100 mg/kg), either alone or in combination with the two antibodies. Following 60 days of treatment, the frequency of TKI administration was reduced to once every other day (underneath dotted lines), while mAb treatment remained unaltered. animal survival (B) are shown. Mice were euthanized when tumor size reached 1,500 mm3."}
{"words": ["Figure", "4CD1", "-", "nu", "/", "nu", "mice", "carrying", "PC9", "xenografts", "were", "divided", "in", "groups", "(", "2", "-", "3", "mice", "/", "group", ")", "and", "treated", "for", "seven", "days", "with", "different", "TKIs", ":", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", "or", "20", "mg", "/", "kg", ")", ",", "osimertinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ")", "or", "afatinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ")", ",", "either", "alone", "or", "in", "combination", "with", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "and", "trastuzumab", ",", "each", "at", "0", ".", "1", "mg", "/", "mouse", "/", "injection", ")", ".", "when", "singly", "applied", "used", "erlotinib", "at", "50", "mg", "/", "kg", ".", "(", "B", ")", "After", "treatment", ",", "all", "mice", "were", "sacrificed", "and", "tumors", "extracted", ".", "Protein", "extracts", "were", "resolved", "by", "means", "of", "electrophoresis", "and", "transfer", "to", "nitrocellulose", "membranes", ",", "which", "were", "later", "incubated", "overnight", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "This", "was", "followed", "by", "incubation", "with", "peroxidase", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "Signals", "were", "detected", "using", "ChemidocTM", "(", "from", "Bio", "-", "Rad", ")", ",", "quantified", "and", "normalized", "to", "the", "signals", "of", "GAPDH", "or", "tubulin", "(", "numbers", "shown", "below", "each", "lane", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4CD1-nu/nu mice carrying PC9 xenografts were divided in groups (2-3 mice/group) and treated for seven days with different TKIs: erlotinib (50 mg/kg or 20 mg/kg), osimertinib (5 mg/kg) or afatinib (5 mg/kg), either alone or in combination with 2XmAbs (cetuximab and trastuzumab, each at 0.1 mg/mouse/injection). when singly applied used erlotinib at 50 mg/kg. (B) After treatment, all mice were sacrificed and tumors extracted. Protein extracts were resolved by means of electrophoresis and transfer to nitrocellulose membranes, which were later incubated overnight with the indicated antibodies. This was followed by incubation with peroxidase-conjugated secondary antibodies. Signals were detected using ChemidocTM (from Bio-Rad), quantified and normalized to the signals of GAPDH or tubulin (numbers shown below each lane)."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "PC9", "cells", "(", "3X106", "/", "mouse", ")", "were", "subcutaneously", "injected", "in", "the", "flanks", "of", "CD1", "-", "nu", "/", "nu", "mice", ".", "When", "tumors", "reached", "a", "volume", "of", "approximately", "500", "mm3", ",", "mice", "were", "treated", "daily", "with", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", ",", "blue", "area", ";", "panel", "A", ")", "or", "with", "osimertinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ",", "grey", "area", ";", "panel", "B", ")", "using", "oral", "gavage", ".", "Initially", ",", "all", "tumors", "displayed", "stable", "disease", "or", "they", "regressed", ",", "but", "eventually", "all", "started", "relapsing", ".", "Once", "relapsing", "tumors", "reached", "800", "mm3", ",", "while", "under", "erlotinib", "or", "osimertinib", "treatment", ",", "we", "supplemented", "the", "treatment", "with", "a", "combination", "of", "2XmAbs", "(", "cetuximab", "and", "trastuzumab", ",", "each", "at", "0", ".", "1", "mg", "/", "mouse", "/", "injection", ";", "twice", "a", "week", ")", "plus", "either", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", ";", "A", ",", "red", "area", ")", "or", "osimertinib", "(", "5", "mg", "/", "kg", ";", "B", ",", "orange", "area", ")", ".", "Tumor", "volumes", "of", "individual", "mice", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B PC9 cells (3X106/mouse) were subcutaneously injected in the flanks of CD1-nu/nu mice. When tumors reached a volume of approximately 500 mm3, mice were treated daily with erlotinib (50 mg/kg, blue area; panel A) or with osimertinib (5 mg/kg, grey area; panel B) using oral gavage. Initially, all tumors displayed stable disease or they regressed, but eventually all started relapsing. Once relapsing tumors reached 800 mm3, while under erlotinib or osimertinib treatment, we supplemented the treatment with a combination of 2XmAbs (cetuximab and trastuzumab, each at 0.1 mg/mouse/injection; twice a week) plus either erlotinib (50 mg/kg; A, red area) or osimertinib (5 mg/kg; B, orange area). Tumor volumes of individual mice are shown."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "NSG", "mice", "were", "pre", "-", "implanted", "with", "tumor", "fragments", "derived", "from", "two", "different", "PDX", "models", ":", "(", "A", ")", "TM00199", "(", "L858R", "-", "EGFR", ";", "from", "The", "Jackson", "Laboratory", ")", "or", "(", "B", ")", "TM00193", "(", "E746", "_", "A750", "del", "-", "EGFR", ";", "from", "The", "Jackson", "Laboratory", ")", ".", "Once", "tumors", "reached", "approximately", "300", "mm3", ",", "mice", "were", "treated", "with", "monoclonal", "antibodies", "(", "2XmAbs", ",", "cetuximab", "plus", "trastuzumab", ",", "200μg", "/", "injection", ")", "twice", "a", "week", ",", "or", "with", "EGFR", "TKIs", ",", "erlotinib", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "or", "osimertinib", "(", "10mg", "/", "kg", ")", "daily", ".", "Alternatively", ",", "mice", "were", "treated", "with", "a", "combination", "of", "2XmAbs", "and", "either", "erlotinib", "or", "osimertinib", ",", "for", "either", "32", "days", "(", "A", ")", "or", "42", "days", "(", "B", ")", ".", "Tumor", "growth", "was", "monitored", "twice", "a", "week", ".", "the", "antibodies", "were", "injected", "into", "the", "peritoneum", "and", "the", "TKIs", "were", "delivered", "orally", ".", "The", "figure", "shows", "tumor", "volumes", "of", "individual", "mice", "and", "the", "respective", "survival", "curves", "(", "right", "hand", "panels", ")", ".", "The", "grey", "areas", "mark", "time", "windows", "of", "animal", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B NSG mice were pre-implanted with tumor fragments derived from two different PDX models: (A) TM00199 (L858R-EGFR; from The Jackson Laboratory) or (B) TM00193 (E746_A750 del-EGFR; from The Jackson Laboratory). Once tumors reached approximately 300 mm3, mice were treated with monoclonal antibodies (2XmAbs, cetuximab plus trastuzumab, 200μg/injection) twice a week, or with EGFR TKIs, erlotinib (50mg/kg) or osimertinib (10mg/kg) daily. Alternatively, mice were treated with a combination of 2XmAbs and either erlotinib or osimertinib, for either 32 days (A) or 42 days (B). Tumor growth was monitored twice a week. the antibodies were injected into the peritoneum and the TKIs were delivered orally. The figure shows tumor volumes of individual mice and the respective survival curves (right hand panels). The grey areas mark time windows of animal treatment."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "For", "RNAseq", "analyses", ",", "PC9", "cells", "(", "3X106", "/", "mouse", ")", "were", "subcutaneously", "injected", "in", "the", "flanks", "of", "13", "CD1", "-", "nu", "/", "nu", "mice", ".", "When", "tumors", "reached", "500", "mm3", ",", "mice", "were", "treated", "daily", "with", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", ")", ".", "Once", "tumors", "that", "initially", "responded", "to", "erlotinib", "monotherapy", "started", "relapsing", "and", "reached", "800", "mm3", ",", "we", "switched", "to", "a", "combination", "of", "2XmAbs", "plus", "erlotinib", "(", "50", "mg", "/", "kg", ")", ".", "The", "respective", "tumor", "volumes", "were", "sacrificed", "when", "tumor", "volumes", "reached", "approximately", "500", "mm3", "Mice", "responding", "to", "erlotinib", "(", "N", "=", "3", ")", "were", "sacrificed", "after", "one", "week", "of", "treatment", "Mice", "resistant", "to", "erlotinib", "(", "N", "=", "3", ")", "were", "sacrificed", "when", "tumor", "volumes", "reached", "800", "mm3", "whereas", "mice", "responding", "to", "erlotinib", "+", "2XmAbs", "(", "N", "=", "2", ")", "were", "sacrificed", "after", "one", "week", "of", "treatment", "RNA", "was", "extracted", "from", "all", "13", "tumors", "and", "utilized", "for", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "Differentially", "expressed", "(", "DE", ")", "genes", "in", "the", "Erlotinib", "(", "Er", ")", "+", "2XmAbs", "arm", "compared", "to", "the", "Control", "group", "are", "presented", "in", "the", "heatmap", ".", "(", "C", ")", "Protein", "extracts", "were", "prepared", "from", "all", "tumors", "and", "analyzed", "using", "immunoblotting", ",", "as", "indicated", ".", "Signals", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "the", "signals", "of", "GAPDH", "(", "numbers", "shown", "below", "each", "lane", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) For RNAseq analyses, PC9 cells (3X106/mouse) were subcutaneously injected in the flanks of 13 CD1-nu/nu mice. When tumors reached 500 mm3, mice were treated daily with erlotinib (50 mg/kg). Once tumors that initially responded to erlotinib monotherapy started relapsing and reached 800 mm3, we switched to a combination of 2XmAbs plus erlotinib (50 mg/kg). The respective tumor volumes were sacrificed when tumor volumes reached approximately 500 mm3 Mice responding to erlotinib (N=3) were sacrificed after one week of treatment Mice resistant to erlotinib (N=3) were sacrificed when tumor volumes reached 800 mm3 whereas mice responding to erlotinib+2XmAbs (N=2) were sacrificed after one week of treatment RNA was extracted from all 13 tumors and utilized for RNA-seq analysis. Differentially expressed (DE) genes in the Erlotinib (Er)+2XmAbs arm compared to the Control group are presented in the heatmap.(C) Protein extracts were prepared from all tumors and analyzed using immunoblotting, as indicated. Signals were quantified and normalized to the signals of GAPDH (numbers shown below each lane)."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "(", "A", ")", "and", "-", "ULK2", "(", "B", ")", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "30", "min", ".", "They", "were", "then", "cultured", "in", "fresh", "complete", "medium", "for", "an", "additional", "30", "min", "(", "starvation", "→", "complete", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "(", "C", ")", "and", "-", "ULK2", "(", "D", ")", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "-", "Atg16L1", "antibody", "and", "Alexa", "Fluor", "660", "-", "conjugated", "secondary", "antibody", ".", "More", "than", "90", "%", "of", "GFP", "-", "ULKs", "dots", "were", "positive", "for", "Atg16L1", ".", "(", "E", "-", "H", ")", "Wild", "-", "type", "(", "E", "and", "G", ")", "and", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "F", "and", "H", ")", "MEFs", "were", "transfected", "with", "retroviral", "vectors", "encoding", "GFP", "-", "ULK1", "and", "-", "ULK2", ".", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "(", "E", "and", "F", ")", "and", "-", "ULK2", "(", "G", "and", "H", ")", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.(A and B) NIH3T3 cells stably expressing GFP-ULK1 (A) and -ULK2 (B) were cultured in complete or starvation medium for 30 min. They were then cultured in fresh complete medium for an additional 30 min (starvation→complete).(C and D) NIH3T3 cells stably expressing GFP-ULK1 (C) and -ULK2 (D) were cultured in starvation medium for 120 min. The cells were fixed, permeabilized, and subjected to immunofluorescence microscopy using anti-Atg16L1 antibody and Alexa Fluor 660-conjugated secondary antibody. More than 90% of GFP-ULKs dots were positive for Atg16L1.(E-H) Wild-type (E and G) and Atg5−/− (F and H) MEFs were transfected with retroviral vectors encoding GFP-ULK1 and -ULK2. MEFs stably expressing GFP-ULK1 (E and F) and -ULK2 (G and H) were cultured in complete or starvation medium for 120 min. The cells were fixed and examined by fluorescence microscopy. Bars, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "(", "A", ")", "In", "vitro", "kinase", "assay", "of", "endogenous", "ULK1", ".", "MEFs", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "60", "min", ".", "ULK1", "kinase", "activity", "was", "determined", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "Relative", "kinase", "activity", "is", "shown", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "NIH3T3", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "HA", "-", "ULK1", ",", "HA", "-", "ULK2", ",", "or", "their", "kinase", "-", "dead", "mutants", "and", "subjected", "to", "immunofluoresence", "microscopy", "using", "monoclonal", "anti", "-", "HA", "and", "polyclonal", "anti", "-", "Atg16L1", "antibodies", "for", "primary", "staining", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "goat", "anti", "-", "mouse", "IgG", "and", "Alexa", "Fluor", "568", "-", "conjugated", "goat", "anti", "-", "rabbit", "IgG", "antibodies", "for", "secondary", "antibodies", ".", "Transfected", "cells", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "D", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1K46N", "and", "GFP", "-", "ULK2K39T", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "-", "Atg16L1", "antibody", ".", "Bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "NIH3T3", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "retroviral", "vectors", "encoding", "HA", "-", "ULK1K46N", "or", "with", "the", "corresponding", "empty", "retrovirus", "(", "mock", ")", ".", "They", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "Cell", "lysates", "were", "then", "analyzed", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.(A) In vitro kinase assay of endogenous ULK1. MEFs were cultured in complete or starvation medium for 60 min. ULK1 kinase activity was determined as described in Materials and methods. Relative kinase activity is shown. Data are the mean ± SE of five independent experiments.(B and C) NIH3T3 cells were transiently transfected with HA-ULK1, HA-ULK2, or their kinase-dead mutants and subjected to immunofluoresence microscopy using monoclonal anti-HA and polyclonal anti-Atg16L1 antibodies for primary staining and Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG antibodies for secondary antibodies. Transfected cells are indicated by arrows. Bars, 20 μm. (D) NIH3T3 cells stably expressing GFP-ULK1K46N and GFP-ULK2K39T were cultured in starvation medium for 120 min. The cells were subjected to immunofluorescence microscopy using anti-Atg16L1 antibody. Bar, 20 μm.(E) NIH3T3 cells were transfected with the retroviral vectors encoding HA-ULK1K46N or with the corresponding empty retrovirus (mock). They were cultured in complete or starvation medium for 120 min. Cell lysates were then analyzed by immunoblot analysis with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "(", "A", ")", "HEK293T", "cells", "were", "cotransfected", "with", "FLAG", "-", "FIP200", "and", "HA", "-", "ULKs", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "using", "antibodies", "against", "FLAG", ".", "The", "resulting", "precipitates", "were", "examined", "by", "immunoblot", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "asterisk", "indicates", "nonspecific", "band", ".", "(", "B", ")", "Lysates", "of", "MEFs", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "ULK1", "or", "anti", "-", "FIP200", "antibody", "or", "preimmune", "rabbit", "serum", ",", "and", "the", "resulting", "precipitates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "antibodies", "against", "ULK1", "and", "FIP200", ".", "(", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "cotransfected", "with", "FLAG", "-", "FIP200", "and", "various", "ULK1", "mutants", "and", "analyzed", "as", "in", "A", "using", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "(", "left", ")", "and", "GFP", "-", "ULK1ΔC", "(", "right", ")", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "Bar", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.(A) HEK293T cells were cotransfected with FLAG-FIP200 and HA-ULKs. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP) using antibodies against FLAG. The resulting precipitates were examined by immunoblot (IB) analysis with the indicated antibodies. The asterisk indicates nonspecific band.(B) Lysates of MEFs were immunoprecipitated with anti-ULK1 or anti-FIP200 antibody or preimmune rabbit serum, and the resulting precipitates were subjected to immunoblot analysis with antibodies against ULK1 and FIP200.(D) HEK293T cells were cotransfected with FLAG-FIP200 and various ULK1 mutants and analyzed as in A using anti-HA and anti-FLAG antibodies.(E) NIH3T3 cells stably expressing GFP-ULK1 (left) and GFP-ULK1ΔC (right) were cultured in starvation medium for 120 min. Bar, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "(", "A", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "FIP200", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "120", "min", "and", "the", "GFP", "signal", "was", "observed", ".", "(", "B", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "FIP200", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "for", "120", "min", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "-", "Atg16L1", "antibody", "and", "Alexa", "Fluor", "568", "-", "conjugated", "secondary", "antibody", ".", "Bars", ",", "20", "μm", ".", "More", "than", "90", "%", "of", "GFP", "-", "FIP200", "dots", "were", "positive", "for", "Atg16L1", ".", "(", "C", ")", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "were", "starved", "for", "120", "min", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "-", "FIP200", "antibody", "and", "Alexa", "Fluor", "568", "-", "conjugated", "secondary", "antibody", ".", "Black", "squares", "indicate", "the", "enlarged", "areas", "shown", "in", "insets", ".", "Bar", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.(A) NIH3T3 cells stably expressing GFP-FIP200 were cultured in complete or starvation medium for 120 min and the GFP signal was observed.(B) NIH3T3 cells stably expressing GFP-FIP200 were cultured in starvation medium for 120 min and then subjected to immunofluorescence microscopy using anti-Atg16L1 antibody and Alexa Fluor 568-conjugated secondary antibody. Bars, 20 μm. More than 90% of GFP-FIP200 dots were positive for Atg16L1.(C) NIH3T3 cells stably expressing GFP-ULK1 were starved for 120 min and then subjected to immunofluorescence microscopy using anti-FIP200 antibody and Alexa Fluor 568-conjugated secondary antibody. Black squares indicate the enlarged areas shown in insets. Bar, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "(", "A", ")", "FIP200", "+", "/", "+", ",", "FIP200", "−", "/", "−", ",", "Atg5", "+", "/", "+", ",", "and", "Atg5", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "60", "min", ".", "In", "the", "recovery", "experiments", ",", "starved", "MEFs", "were", "cultured", "in", "fresh", "complete", "medium", "for", "an", "additional", "60", "min", "(", "replenishment", ")", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "cultured", "in", "the", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "indicated", "time", "with", "or", "without", "100", "nM", "bafilomycin", "A1", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Wild", "-", "type", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "transfected", "with", "retroviral", "vectors", "encoding", "GFP", "-", "Atg5", "or", "GFP", "-", "LC3", ".", "Resulting", "cells", "were", "cultured", "in", "the", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "Wild", "-", "type", "(", "D", "and", "E", ")", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "(", "F", "and", "G", ")", "MEFs", "were", "cultured", "in", "complete", "(", "D", "and", "F", ")", "or", "starvation", "(", "E", "and", "G", ")", "medium", "for", "120", "min", "and", "then", "fixed", "and", "subjected", "to", "EM", "analysis", ".", "Autophagosome", "-", "like", "structures", "(", "open", "arrowheads", ")", ",", "and", "autolysosomes", "(", "closed", "arrowheads", ")", "are", "indicated", ".", "Bar", ",", "1", "μm", ".", "(", "H", ")", "The", "ratio", "of", "total", "area", "of", "autophagosomes", "(", "AP", ")", "and", "autolysosomes", "(", "AL", ")", "to", "total", "cytoplasmic", "area", "in", "D", "-", "G", "was", "determined", "by", "morphometric", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.(A) FIP200+/+, FIP200−/−, Atg5+/+, and Atg5−/− MEFs were cultured in complete or starvation medium for 60 min. In the recovery experiments, starved MEFs were cultured in fresh complete medium for an additional 60 min (replenishment). The cell lysates were subjected to immunoblot analysis with the indicated antibodies.(B) Wild-type and FIP200−/− MEFs were cultured in the complete or starvation medium for indicated time with or without 100 nM bafilomycin A1. The cell lysates were subjected to immunoblot analysis with anti-LC3 antibody.(C) Wild-type and FIP200−/− MEFs were transfected with retroviral vectors encoding GFP-Atg5 or GFP-LC3. Resulting cells were cultured in the starvation medium for 120 min. The cells were fixed and examined by fluorescence microscopy. Bar, 20 μm.(D-G) Wild-type (D and E) and FIP200−/− (F and G) MEFs were cultured in complete (D and F) or starvation (E and G) medium for 120 min and then fixed and subjected to EM analysis. Autophagosome-like structures (open arrowheads), and autolysosomes (closed arrowheads) are indicated. Bar, 1 μm. (H) The ratio of total area of autophagosomes (AP) and autolysosomes (AL) to total cytoplasmic area in D-G was determined by morphometric analysis."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "(", "A", ")", "FAK", "+", "/", "−", "and", "FAK", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "cultured", "in", "the", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "the", "indicated", "times", "with", "or", "without", "100", "nM", "bafilomycin", "A1", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "FAK", "+", "/", "−", "and", "FAK", "−", "/", "−", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "C", ")", "Wild", "-", "type", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "FAK", "were", "cultured", "in", "complete", "or", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "-", "Atg16", "antibody", ".", "Black", "squares", "indicate", "the", "enlarged", "areas", "shown", "in", "insets", ".", "Bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.(A) FAK+/− and FAK−/− MEFs were cultured in the complete or starvation medium for the indicated times with or without 100 nM bafilomycin A1. The cell lysates were subjected to immunoblot analysis with the indicated antibodies.(B) FAK+/− and FAK−/− MEFs stably expressing GFP-LC3 were cultured in complete or starvation medium for 120 min. The cells were fixed and examined by fluorescence microscopy.(C) Wild-type MEFs stably expressing GFP-FAK were cultured in complete or starvation medium for 120 min. The cells were fixed and subjected to immunofluorescence microscopy using anti-Atg16 antibody. Black squares indicate the enlarged areas shown in insets. Bars, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "7", ".", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "rapamycin", "(", "rapa", ")", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "for", "120", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "nM", "bafilomycin", "A1", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "Atg5", "or", "GFP", "-", "LC3", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "100", "ng", "/", "ml", "rapamycin", "for", "120", "min", ".", "The", "formation", "of", "GFP", "-", "Atg5", "(", "top", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "bottom", ")", "puncta", "was", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "C", ")", "Wild", "-", "type", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "10", "mM", "lithium", "chloride", "for", "24", "h", "or", "100", "μM", "C2", "-", "ceramide", "for", "2", "h", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7.(A) Wild-type and FIP200−/− MEFs were treated with 100 ng/ml rapamycin (rapa) or vehicle (DMSO) for 120 min in the presence or absence of 100 nM bafilomycin A1. The cell lysates were subjected to immunoblot analysis with anti-LC3 antibody.(B) Wild-type and FIP200−/− MEFs stably expressing GFP-Atg5 or GFP-LC3 were cultured in the presence of 100 ng/ml rapamycin for 120 min. The formation of GFP-Atg5 (top) and GFP-LC3 (bottom) puncta was examined by fluorescence microscopy. Bar, 20 μm.(C) Wild-type and FIP200−/− MEFs were treated with 10 mM lithium chloride for 24 h or 100 μM C2-ceramide for 2 h."}
{"words": ["Figure", "8", ".", "(", "A", ")", "FIP200", "+", "/", "−", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "or", "-", "ULK2", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "for", "120", "min", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "FIP200", "+", "/", "+", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "cultured", "in", "complete", "medium", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "antibodies", "against", "ULK1", "or", "HSP90", "(", "loading", "control", ")", ".", "(", "C", ")", "Phosphatase", "sensitivity", "of", "ULK1", ".", "FIP200", "+", "/", "+", "and", "FIP200", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "cultured", "in", "complete", "medium", ".", "ULK1", "was", "immunoprecipitated", "from", "cell", "lysates", "and", "treated", "with", "λ", "phosphatase", "for", "30", "min", "at", "30", "°", "C", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "phosphatase", "inhibitors", "(", "1", "mM", "Na2VO4", ",", "50", "mM", "KF", ",", "15", "mM", "Na4P2O7", ",", "and", "1", "mM", "EGTA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8.(A) FIP200+/− and FIP200−/− MEFs stably expressing GFP-ULK1 or -ULK2 were cultured in starvation medium for 120 min. The cells were fixed and examined by fluorescence microscopy. Bar, 20 μm.(B) FIP200+/+ and FIP200−/− MEFs were cultured in complete medium. The cell lysates were subjected to immunoblot analysis with antibodies against ULK1 or HSP90 (loading control).(C) Phosphatase sensitivity of ULK1. FIP200+/+ and FIP200−/− MEFs were cultured in complete medium. ULK1 was immunoprecipitated from cell lysates and treated with λ phosphatase for 30 min at 30°C in the absence or presence of phosphatase inhibitors (1 mM Na2VO4, 50 mM KF, 15 mM Na4P2O7, and 1 mM EGTA)."}
{"words": ["Figure", "1b", ",", "Representative", "phase", "images", "of", "the", "morphology", "of", "WT", "and", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", "before", "mRNA", "isolation", ".", "c", ",", "Heat", "map", "illustrating", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "encoding", "heat", "shock", "proteins", "between", "WT", "and", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", ".", "d", ",", "Volcano", "plot", "of", "DEGs", "between", "normal", "mouse", "intestinal", "tissue", "and", "adenomas", "(", "GSE65461", ")", ".", "e", ",", "f", ",", "Relative", "gene", "expression", "of", "Hspb1", "(", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ",", "n", "=", "6", ")", "(", "e", ")", "and", "protein", "expression", "of", "HSP25", "(", "f", ")", "in", "unrecombined", "versus", "recombined", "murine", "organoids", ".", "g", ",", "Gene", "expression", "of", "Hspb1", "in", "normal", "(", "N", ")", "versus", "adenoma", "(", "A", ")", "tissue", "(", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "H", ",", "RNA", "-", "ISH", "for", "Hspb1", "in", "murine", "intestinal", "adenoma", ".", "Scalebar", ",", "100", "μm", ".", "Zoom", "panel", ",", "25", "μmi", ",", "Relative", "gene", "expression", "of", "human", "HSPB1", "in", "paired", "sets", "of", "normal", "versus", "adenoma", "tissue", ",", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "59", "pairs", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b, Representative phase images of the morphology of WT and Apc-/- organoids before mRNA isolation.c, Heat map illustrating differentially expressed genes (DEGs) encoding heat shock proteins between WT and Apc-/- organoids.d, Volcano plot of DEGs between normal mouse intestinal tissue and adenomas (GSE65461).e, f, Relative gene expression of Hspb1 (***P=0.0004, n=6)(e) and protein expression of HSP25 (f) in unrecombined versus recombined murine organoids.g, Gene expression of Hspb1 in normal (N) versus adenoma (A) tissue (***P=0.0002, n=4).H, RNA-ISH for Hspb1 in murine intestinal adenoma. Scalebar, 100 μm. Zoom panel, 25 μmi, Relative gene expression of human HSPB1 in paired sets of normal versus adenoma tissue, (****P<0.0001, paired t-test, n=59 pairs)."}
{"words": ["Figure", "2Relative", "gene", "expression", "of", "AXIN2", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0129", ")", ",", "P21", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0103", ")", ",", "and", "HSPB1", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0236", ")", "(", "b", ")", "in", "Ls174t", "-", "dnTCF4", "cells", "the", "presence", "or", "absence", "of", "doxycycline", ".", "protein", "expression", "of", "HSP27", "(", "c", ")", "in", "Ls174t", "-", "dnTCF4", "cells", "the", "presence", "or", "absence", "of", "doxycycline", ".", "Relative", "gene", "expression", "of", "Hspb1", "in", "murine", "WT", "organoids", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "CHIR", "-", "99021", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0016", ",", "one", "way", "ANOVA", ",", "n", "=", "4", ")", "(", "d", ")", "protein", "expression", "of", "HSP25", "in", "WT", "and", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", "(", "e", ")", ".", "g", ",", "h", ",", "Representative", "images", "of", "single", "cell", "Hspb1", "KO", "clones", "passaged", "after", "loss", "of", "Apc", "(", "g", ")", ",", "and", "quantification", "of", "their", "clonogenic", "potential", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0147", "(", "#", "1", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0035", "(", "#", "2", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0032", "(", "#", "3", ")", ")", "(", "h", ")", ".", "i", ",", "j", ",", "Representative", "images", "of", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", "cultured", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "60", "μM", "BVDU", "(", "i", ")", ",", "and", "quantification", "of", "their", "clonogenic", "potential", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0039", ")", "(", "j", ")", ".", "k", ",", "l", ",", "Relative", "gene", "expression", "of", "Wnt", "target", "genes", "Axin2", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0080", ")", "and", "Lgr5", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0142", ")", "in", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", "cultured", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "60", "μM", "BVDU", ".", "m", ",", "RNA", "-", "ISH", "for", "Lgr5", "in", "control", "or", "BVDU", "-", "treated", "Apc", "-", "/", "-", "organoids", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ",", "zoom", "panel", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Relative gene expression of AXIN2 (*P=0.0129), P21(*P=0.0103), and HSPB1(*P=0.0236) (b) in Ls174t-dnTCF4 cells the presence or absence of doxycycline.protein expression of HSP27 (c) in Ls174t-dnTCF4 cells the presence or absence of doxycycline.Relative gene expression of Hspb1 in murine WT organoids treated with different concentrations of CHIR-99021 (**P=0.0016, one way ANOVA, n=4) (d)protein expression of HSP25 in WT and Apc-/- organoids (e).g, h, Representative images of single cell Hspb1 KO clones passaged after loss of Apc (g), and quantification of their clonogenic potential (*P=0.0147(#1), **P=0.0035(#2), **P=0.0032(#3)) (h).i, j, Representative images of Apc-/- organoids cultured in the absence or presence of 60 μM BVDU (i), and quantification of their clonogenic potential (**P=0.0039) (j).k, l, Relative gene expression of Wnt target genes Axin2 (**P=0.0080) and Lgr5 (*P=0.0142) in Apc-/- organoids cultured in the absence or presence of 60 μM BVDU.m, RNA-ISH for Lgr5 in control or BVDU-treated Apc-/- organoids. Scale bar, 50 μm, zoom panel 20 μm."}
{"words": ["Figure", "3b", ",", "c", ",", "Visualization", "of", "proliferating", "cells", "in", "tissues", "incubated", "with", "EdU", "for", "2", "-", "hours", "(", "b", ")", ",", "and", "quantification", "of", "the", "hyperproliferative", "zone", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0057", ",", "n", "=", "3", "mice", ")", "(", "c", ")", ".", "e", ",", "f", ",", "RNA", "-", "ISH", "for", "Notum", "reveals", "Apc", "-", "mutant", "clones", "in", "crypt", "bottoms", "of", "control", "or", "BVDU", "-", "treated", "mice", "(", "e", ")", ",", "and", "quantification", "of", "the", "abundance", "of", "mutant", "crypts", "(", "n", "=", "2", "mice", "per", "condition", ",", "n", "=", "5", "technical", "replicates", "per", "mouse", ")", "(", "f", ")", ".", "g", ",", "h", ",", "Clone", "size", "distributions", "of", "Notum", "+", "crypts", "in", "control", "(", "n", "=", "265", "crypts", ")", "or", "BVDU", "-", "treated", "(", "n", "=", "260", "crypts", ")", "mice", ",", "the", "average", "clone", "size", "and", "number", "of", "fixed", "clones", "are", "included", "in", "the", "figure", ".", "Survival", "curves", "for", "control", "and", "BVDU", "-", "treated", "mice", "(", "P", "=", "0", ".", "0351", ",", "Mantel", "-", "Cox", "test", ")", "(", "j", ")", "macroscopic", "images", "of", "adenoma", "development", "in", "the", "distal", "small", "intestine", "(", "k", ")", "boxplots", "for", "the", "number", "of", "adenomas", "per", "intestinal", "region", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0013", ")", "(", "l", ")", ",", "n", "=", "8", "control", ",", "n", "=", "11", "treated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3b, c, Visualization of proliferating cells in tissues incubated with EdU for 2-hours (b), and quantification of the hyperproliferative zone (**P=0.0057, n=3 mice) (c).e, f, RNA-ISH for Notum reveals Apc-mutant clones in crypt bottoms of control or BVDU-treated mice (e), and quantification of the abundance of mutant crypts (n=2 mice per condition, n=5 technical replicates per mouse) (f).g, h, Clone size distributions of Notum+ crypts in control (n=265 crypts) or BVDU-treated (n=260 crypts) mice, the average clone size and number of fixed clones are included in the figure.Survival curves for control and BVDU-treated mice (P=0.0351, Mantel-Cox test) (j)macroscopic images of adenoma development in the distal small intestine (k)boxplots for the number of adenomas per intestinal region(**P=0.0013) (l), n=8 control, n=11 treated."}
{"words": ["figf1The", "upper", "panel", "shows", "strength", "of", "association", "of", "Affymetrix", "500K", "SNPs", "in", "the", "region", ",", "with", "combined", "P", "values", "shown", "in", "red", "for", "replicated", "SNPs", ".", "The", "lower", "panel", "is", "a", "recombination", "map", "showing", "how", "the", "signals", "are", "clearly", "demarcated", "by", "recombination", "hotspots", ".", "Nearby", "genes", "are", "shown", "in", "yellow", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1The upper panel shows strength of association of Affymetrix 500K SNPs in the region, with combined P values shown in red for replicated SNPs. The lower panel is a recombination map showing how the signals are clearly demarcated by recombination hotspots. Nearby genes are shown in yellow."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Four", "full", "-", "thickness", "excisional", "wounds", "were", "produced", "on", "each", "of", "CD18", "-", "/", "-", "or", "WT", "mice", "by", "6", "mm", "biopsy", "punches", ".", "Each", "wound", "received", "intradermal", "injection", "of", "2", ".", "5x105", "AT", "-", "MSCs", "or", "PBS", "control", ".", "Each", "wound", "region", "was", "digitally", "photographed", "at", "the", "indicated", "time", "points", ",", "and", "wound", "areas", "were", "analyzed", "using", "Adobe", "Photoshop", ".", "Depicted", "are", "representative", "macroscopic", "pictures", "of", "PBS", "injected", "or", "AT", "-", "MSCs", "injected", "WT", "or", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", ",", "7", "and", "9", "post", "-", "wounding", ".", "B", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "20", "wound", "areas", "per", "group", ",", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "initial", "wound", "size", "at", "day", "0", ".", "The", "line", "in", "each", "group", "represents", "the", "mean", "value", "of", "20", "wounds", "from", "5", "mice", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Four full-thickness excisional wounds were produced on each of CD18-/- or WT mice by 6 mm biopsy punches. Each wound received intradermal injection of 2.5x105 AT-MSCs or PBS control. Each wound region was digitally photographed at the indicated time points, and wound areas were analyzed using Adobe Photoshop. Depicted are representative macroscopic pictures of PBS injected or AT-MSCs injected WT or CD18-/- wounds at days 0, 3, 5, 7 and 9 post-wounding. B. Quantitative analysis of 20 wound areas per group, expressed as percentage of the initial wound size at day 0. The line in each group represents the mean value of 20 wounds from 5 mice. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 by Student's t-test with Welch's correction. "}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "AT", "-", "MSCs", "or", "PBS", "were", "intradermally", "injected", "to", "WT", "or", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "and", "the", "wound", "tissues", "were", "harvested", "at", "days", "2", ",", "5", ",", "7", "post", "-", "wounding", ".", "Depicted", "are", "representative", "photographs", "of", "wound", "cryosections", "at", "days", "2", "and", "5", "post", "-", "wounding", "stained", "for", "human", "-", "specific", "β2M", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "B", ".", "Genomic", "DNA", "was", "isolated", "from", "the", "wound", "tissues", ",", "and", "the", "amount", "of", "human", "-", "specific", "Alu", "DNA", "was", "quantified", "by", "real", "time", "PCR", ",", "and", "then", "converted", "to", "the", "number", "of", "AT", "-", "MSCs", "based", "on", "a", "standard", "curve", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "at", "each", "time", "point", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "Total", "TGF", "-", "β1", "concentrations", "in", "wound", "lysates", "were", "measured", "by", "TGF", "-", "β1", "specific", "ELISA", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "at", "each", "time", "pointD", ".", "The", "expression", "of", "human", "TGF", "-", "β1", "in", "cultured", "AT", "-", "MSCs", "and", "wound", "tissues", "of", "WT", "or", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "received", "AT", "-", "MSCs", "injection", "was", "quantified", "by", "qPCR", "with", "primers", "specifically", "amplify", "human", "TGF", "-", "β1", ",", "and", "normalized", "on", "the", "numbers", "of", "MSCs", "in", "each", "condition", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", "wounds", "(", "2", "wounds", "x", "4", "mice", ")", "per", "time"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. AT-MSCs or PBS were intradermally injected to WT or CD18-/- wounds and the wound tissues were harvested at days 2, 5, 7 post-wounding. Depicted are representative photographs of wound cryosections at days 2 and 5 post-wounding stained for human-specific β2M (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bars: 100 µm.B. Genomic DNA was isolated from the wound tissues, and the amount of human-specific Alu DNA was quantified by real time PCR, and then converted to the number of AT-MSCs based on a standard curve. Data are expressed as mean ± SEM, n = 3 at each time point, *p<0.05 by two-tailed unpaired t-test.C. Total TGF-β1 concentrations in wound lysates were measured by TGF-β1 specific ELISA. Results are expressed as mean ± SEM, n = 3 at each time pointD. The expression of human TGF-β1 in cultured AT-MSCs and wound tissues of WT or CD18-/- wounds received AT-MSCs injection was quantified by qPCR with primers specifically amplify human TGF-β1, and normalized on the numbers of MSCs in each condition Data are expressed as mean ± SEM, n = 8 wounds (2 wounds x 4 mice) per time point"}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Cryosections", "of", "PBS", "or", "AT", "-", "MSCs", "injected", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "at", "days", "5", "and", "7", "post", "-", "wounding", "were", "immunostained", "for", "α", "-", "SMA", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "dashed", "lines", "separate", "epidermis", "and", "wound", "bed", ".", "e", ",", "epidermis", ";", "wb", ",", "wound", "bed", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "α", "-", "SMA", "immunofluorescence", "shown", "in", "(", "A", ")", "C", ".", "Cryosections", "of", "AT", "-", "MSCs", "injected", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "at", "day", "5", "post", "-", "wounding", "were", "co", "-", "immunostained", "for", "human", "β2M", "(", "green", ")", "and", "TGF", "-", "β1", "(", "red", ",", "upper", "panel", ")", "or", "α", "-", "SMA", "(", "red", ",", "lower", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Cryosections of PBS or AT-MSCs injected CD18-/- wounds at days 5 and 7 post-wounding were immunostained for α-SMA (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The dashed lines separate epidermis and wound bed. e, epidermis; wb, wound bed. Scale bars: 100 µm. B. Quantification of α-SMA immunofluorescence shown in (A) C. Cryosections of AT-MSCs injected CD18-/- wounds at day 5 post-wounding were co-immunostained for human β2M (green) and TGF-β1 (red, upper panel) or α-SMA (red, lower panel)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "F", ".", "Representative", "photographs", "of", "immunofluorescent", "staining", "for", "α", "-", "SMA", "(", "red", ")", "and", "human", "β2M", "(", "green", ")", "on", "cultured", "human", "AT", "-", "MSCs", "(", "A", ")", ",", "murine", "primary", "dermal", "fibroblasts", "(", "mFB", ")", "(", "B", ")", ",", "mFB", "treated", "with", "2", "ng", "/", "ml", "recombinant", "human", "TGF", "-", "β1", "(", "C", ")", ",", "and", "co", "-", "cultures", "of", "mFB", "with", "AT", "-", "MSCs", "(", "D", ")", "or", "TGF", "-", "β1", "siRNA", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "(", "E", ")", "or", "control", "siRNA", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "(", "F", ")", "after", "48", "h", "culture", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "α", "-", "SMA", "immunofluorescence", "shown", "in", "(", "A", "-", "F", ")", "H", ".", "Four", "full", "-", "thickness", "excisional", "wounds", "were", "produced", "on", "each", "of", "CD18", "-", "/", "-", "mouse", "by", "6", "mm", "biopsy", "punches", ".", "Each", "wound", "received", "intradermal", "injection", "of", "2", ".", "5x105", "AT", "-", "MSCs", "or", "human", "dermal", "fibroblasts", "(", "HDF", ")", "or", "TGF", "-", "β1", "siRNA", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "or", "control", "siRNA", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "or", "PBS", ".", "Each", "wound", "region", "was", "digitally", "photographed", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", ",", "7", "and", "10", "post", "-", "wounding", ",", "and", "wound", "areas", "were", "analyzed", "using", "Adobe", "Photoshop", ".", "The", "depicted", "result", "is", "the", "quantitative", "analysis", "of", "all", "wound", "areas", "per", "group", ",", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "initial", "wound", "size", "at", "day", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-F. Representative photographs of immunofluorescent staining for α-SMA (red) and human β2M (green) on cultured human AT-MSCs (A), murine primary dermal fibroblasts (mFB) (B), mFB treated with 2 ng/ml recombinant human TGF-β1 (C), and co-cultures of mFB with AT-MSCs (D) or TGF-β1 siRNA transfected AT-MSCs (E) or control siRNA transfected AT-MSCs (F) after 48 h culture. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). G. Quantification of α-SMA immunofluorescence shown in (A-F)H. Four full-thickness excisional wounds were produced on each of CD18-/- mouse by 6 mm biopsy punches. Each wound received intradermal injection of 2.5x105 AT-MSCs or human dermal fibroblasts (HDF) or TGF-β1 siRNA transfected AT-MSCs or control siRNA transfected AT-MSCs or PBS. Each wound region was digitally photographed at days 0, 3, 5, 7 and 10 post-wounding, and wound areas were analyzed using Adobe Photoshop. The depicted result is the quantitative analysis of all wound areas per group, expressed as percentage of the initial wound size at day 0."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", ".", "2", ".", "5x105", "of", "TGF", "-", "β1", "siRNA", "or", "control", "siRNA", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "were", "intradermally", "injected", "around", "each", "of", "CD18", "-", "/", "-", "murine", "wound", ".", "PBS", "mock", "injection", "served", "as", "negative", "control", ".", "Wound", "tissue", "were", "harvested", "at", "day", "2", ",", "5", ",", "and", "7", "post", "-", "wounding", "for", "quantification", "of", "human", "TGF", "-", "β1", "mRNA", "(", "A", ")", "at", "day", "2", "by", "qPCR", ",", "total", "TGF", "-", "β1", "(", "B", ")", "and", "active", "TGF", "-", "β1", "(", "C", ")", "protein", "at", "day", "5", "by", "ELISA", ".", "Expression", "of", "α", "-", "SMA", "(", "D", ",", "E", ")", "at", "day", "5", "and", "7", "by", "immunostaining", "on", "tissue", "sections", ".", "The", "dashed", "lines", "indicate", "the", "border", "of", "the", "wound", "bed", "and", "epidermis", "or", "eschar", ".", "e", ",", "epidermis", ";", "es", ",", "eschar", ";", "wb", ",", "wound", "bed", ".", "Quantification", "data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "wounds", "per", "groupExpression", "of", "CD31", "(", "F", ",", "G", ")", "at", "day", "5", "and", "7", "by", "immunostaining", "on", "tissue", "sections", ".", "The", "dashed", "lines", "indicate", "the", "border", "of", "the", "wound", "bed", "and", "epidermis", "or", "eschar", ".", "e", ",", "epidermis", ";", "es", ",", "eschar", ";", "wb", ",", "wound", "bed", ".", "Quantification", "data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "wounds", "per"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C. 2.5x105 of TGF-β1 siRNA or control siRNA transfected AT-MSCs were intradermally injected around each of CD18-/- murine wound. PBS mock injection served as negative control. Wound tissue were harvested at day 2, 5, and 7 post-wounding for quantification of human TGF-β1 mRNA (A) at day 2 by qPCR, total TGF-β1 (B) and active TGF-β1 (C) protein at day 5 by ELISA.Expression of α-SMA (D, E) at day 5 and 7 by immunostaining on tissue sections. The dashed lines indicate the border of the wound bed and epidermis or eschar. e, epidermis; es, eschar; wb, wound bed. Quantification data are expressed as mean ± SEM, n = 3 wounds per groupExpression of CD31 (F, G) at day 5 and 7 by immunostaining on tissue sections. The dashed lines indicate the border of the wound bed and epidermis or eschar. e, epidermis; es, eschar; wb, wound bed. Quantification data are expressed as mean ± SEM, n = 3 wounds per group"}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "AT", "-", "MSCs", "were", "cultured", "in", "the", "labelling", "media", "containing", "[", "35S", "]", "-", "Met", "/", "Cys", "and", "increasing", "concentrations", "of", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "at", "0", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "3", ",", "1", ",", "3", "and", "10", "ng", "/", "ml", "for", "overnight", ".", "Supernatants", "were", "harvested", "and", "incubated", "with", "TGF", "-", "β1", "capture", "antibody", ".", "After", "washing", "the", "captured", "TGF", "-", "β1", "was", "transferred", "to", "glass", "filter", "membrane", ",", "and", "the", "radioactivity", "was", "counted", "with", "a", "scintillation", "counter", "(", "black", "bars", ")", ".", "The", "supernatants", "were", "incubated", "with", "new", "TGF", "-", "β1", "capture", "antibody", ",", "and", "the", "radioactivity", "of", "captured", "TGF", "-", "β1", "was", "counted", "again", "(", "white", "bars", ")", ".", "The", "data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SD", "of", "5", "repeated", "measurements", ".", "CPM", ",", "count", "per", "minute", ".", "AT", "-", "MSCs", "(", "B", ")", "were", "cultured", "in", "media", "containing", "increasing", "concentrations", "of", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "at", "0", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "3", ",", "1", ",", "3", "and", "10", "ng", "/", "ml", "for", "24", "h", ",", "before", "protein", "lysates", "or", "total", "RNAs", "were", "harvested", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Smad7", "was", "performed", "with", "protein", "lysates", "and", "semi", "-", "quantitatively", "analyzed", "with", "densitometry", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "loading", "control", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "blots", ".", "HDFs", "(", "C", ")", "were", "cultured", "in", "media", "containing", "increasing", "concentrations", "of", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "at", "0", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "3", ",", "1", ",", "3", "and", "10", "ng", "/", "ml", "for", "24", "h", ",", "before", "protein", "lysates", "or", "total", "RNAs", "were", "harvested", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Smad7", "was", "performed", "with", "protein", "lysates", "and", "semi", "-", "quantitatively", "analyzed", "with", "densitometry", ".", "β", "-", "actin", "served", "as", "loading", "control", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "blots", ".", "*", "D", ".", "From", "total", "RNA", ",", "the", "mature", "miR", "-", "21", "and", "endogenous", "control", "RNU6B", "were", "converted", "to", "cDNA", ",", "and", "quantified", "by", "qPCR", "based", "TaqMan", "microRNA", "assays", ".", "The", "expression", "of", "miR", "-", "21", "was", "normalized", "on", "RNU6B", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. AT-MSCs were cultured in the labelling media containing [35S]-Met/Cys and increasing concentrations of r.h. TGF-β1 at 0, 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 ng/ml for overnight. Supernatants were harvested and incubated with TGF-β1 capture antibody. After washing the captured TGF-β1 was transferred to glass filter membrane, and the radioactivity was counted with a scintillation counter (black bars). The supernatants were incubated with new TGF-β1 capture antibody, and the radioactivity of captured TGF-β1 was counted again (white bars). The data is given as mean ± SD of 5 repeated measurements. CPM, count per minute.AT-MSCs (B) were cultured in media containing increasing concentrations of r.h. TGF-β1 at 0, 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 ng/ml for 24 h, before protein lysates or total RNAs were harvested. Western blot analysis of Smad7 was performed with protein lysates and semi-quantitatively analyzed with densitometry. β-actin served as loading control. Data is given as mean ± SEM of three independent blots.HDFs (C) were cultured in media containing increasing concentrations of r.h. TGF-β1 at 0, 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 ng/ml for 24 h, before protein lysates or total RNAs were harvested. Western blot analysis of Smad7 was performed with protein lysates and semi-quantitatively analyzed with densitometry. β-actin served as loading control. Data is given as mean ± SEM of three independent blots. *D. From total RNA, the mature miR-21 and endogenous control RNU6B were converted to cDNA, and quantified by qPCR based TaqMan microRNA assays. The expression of miR-21 was normalized on RNU6B. Data is given as mean ± SEM of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "AT", "-", "MSCs", "were", "pretreated", "with", "a", "TGFβRI", "inhibitor", "SB431542", "at", "10", "µM", ",", "or", "control", "DMSO", "for", "1", "h", ",", "and", "subsequently", "exposed", "to", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "at", "indicated", "concentrations", ".", "The", "cells", "were", "cultured", "for", "another", "24", "h", "and", "harvested", "for", "miR", "-", "21", "assay", ".", "The", "expression", "of", "miR", "-", "21", "was", "normalized", "on", "RNU6B", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "-", "D", ".", "AT", "-", "MSCs", "were", "transfected", "with", "30", "nM", "Smad7", "-", "siRNAs", "or", "control", "siRNA", ".", "Untransfected", "AT", "-", "MSCs", "served", "as", "control", ".", "RNA", "and", "protein", "were", "isolated", "2", "days", "after", "transfection", "for", "Smad7", "expression", "by", "qPCR", "(", "B", ")", "and", "western", "blot", "(", "C", ")", ".", "The", "remaining", "cells", "were", "treated", "with", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "at", "indicated", "concentrations", "for", "another", "24", "h", ".", "The", "expression", "of", "human", "TGF", "-", "β1", "was", "analyzed", "by", "qPCR", "and", "normalized", "on", "human", "GAPDH", "(", "D", ")", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "-", "G", ".", "AT", "-", "MSCs", "were", "transfected", "with", "5", "nM", "miR", "-", "21", "mimic", "or", "control", "mimic", ",", "and", "were", "exposed", "to", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "2", "days", "after", "transfection", "at", "indicated", "concentrations", "for", "another", "24", "h", ".", "The", "expression", "miR", "-", "21", "was", "analyzed", "by", "qPCR", "-", "based", "miR", "-", "21", "assay", "normalized", "on", "RNU6B", "(", "E", ")", ",", "Samd7", "protein", "level", "was", "shown", "by", "western", "blot", "(", "F", ")", ",", "and", "human", "TGF", "-", "β1", "expression", "was", "monitored", "by", "qPCR", "normalized", "on", "human", "GAPDH", "(", "G", ")", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "H", "-", "J", ".", "AT", "-", "MSCs", "were", "transfected", "with", "50", "nM", "miR", "-", "21", "inhibitor", "or", "control", "inhibitor", ",", "and", "were", "exposed", "to", "r", ".", "h", ".", "TGF", "-", "β1", "2", "days", "after", "transfection", "at", "indicated", "concentrations", "for", "another", "24", "h", ",", "and", "subsequently", "subjected", "to", "the", "analysis", "of", "expression", "of", "miR", "-", "21", "(", "H", ")", ",", "Smad7", "protein", "(", "I", ")", "and", "human", "TGF", "-", "β1", "mRNA", "(", "J", ")", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "K", "-", "L", ".", "Full", "-", "thickness", "excisional", "wounds", "were", "produced", "on", "CD18", "-", "/", "-", "mice", "by", "6", "mm", "biopsy", "punches", ".", "One", "day", "after", "wounding", ",", "each", "wound", "received", "intradermal", "injection", "of", "2", ".", "5x105", "AT", "-", "MSCs", "that", "had", "been", "transfected", "with", "50", "nM", "miR", "-", "21", "inhibitor", "or", "control", "inhibitor", "2", "days", "after", "transfection", ".", "CD18", "-", "/", "-", "wounds", "received", "mock", "injection", "with", "PBS", "served", "as", "control", ".", "Each", "wound", "region", "was", "digitally", "photographed", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "and", "6", "post", "-", "wounding", ",", "and", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "initial", "wound", "size", "at", "day", "0", "(", "K", ")", ".", "Wound", "tissues", "were", "harvested", "on", "day", "6", "post", "-", "wounding", "for", "quantification", "of", "total", "TGF", "-", "β1", "protein", "by", "ELISA", "(", "L", ")", ".", "Data", "is", "given", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", "wounds", "per", "group", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "MSC", "_", "miR", "-", "21", "-", "IN", ",", "miR", "-", "21", "inhibitor", "transfected", "AT", "-", "MSCs", ";", "MSC", "_", "ctrl", "-", "IN", ",", "control", "inhibitor", "transfected", "AT", "-", "MSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. AT-MSCs were pretreated with a TGFβRI inhibitor SB431542 at 10 µM, or control DMSO for 1 h, and subsequently exposed to r.h. TGF-β1 at indicated concentrations. The cells were cultured for another 24 h and harvested for miR-21 assay. The expression of miR-21 was normalized on RNU6B. Data is given as mean ± SEM of three independent experiments.B-D. AT-MSCs were transfected with 30 nM Smad7-siRNAs or control siRNA. Untransfected AT-MSCs served as control. RNA and protein were isolated 2 days after transfection for Smad7 expression by qPCR (B) and western blot (C). The remaining cells were treated with r.h. TGF-β1 at indicated concentrations for another 24 h. The expression of human TGF-β1 was analyzed by qPCR and normalized on human GAPDH (D). Data is given as mean ± SEM of three independent experiments.E-G. AT-MSCs were transfected with 5 nM miR-21 mimic or control mimic, and were exposed to r.h. TGF-β1 2 days after transfection at indicated concentrations for another 24 h. The expression miR-21 was analyzed by qPCR-based miR-21 assay normalized on RNU6B (E), Samd7 protein level was shown by western blot (F), and human TGF-β1 expression was monitored by qPCR normalized on human GAPDH (G). Data is given as mean ± SEM of three independent experiments.H-J. AT-MSCs were transfected with 50 nM miR-21 inhibitor or control inhibitor, and were exposed to r.h. TGF-β1 2 days after transfection at indicated concentrations for another 24 h, and subsequently subjected to the analysis of expression of miR-21 (H), Smad7 protein (I) and human TGF-β1 mRNA (J). Data is given as mean ± SEM of three independent experiments.K-L. Full-thickness excisional wounds were produced on CD18-/- mice by 6 mm biopsy punches. One day after wounding, each wound received intradermal injection of 2.5x105 AT-MSCs that had been transfected with 50 nM miR-21 inhibitor or control inhibitor 2 days after transfection. CD18-/- wounds received mock injection with PBS served as control. Each wound region was digitally photographed at days 0, 3, and 6 post-wounding, and expressed as percentage of the initial wound size at day 0 (K). Wound tissues were harvested on day 6 post-wounding for quantification of total TGF-β1 protein by ELISA (L). Data is given as mean ± SEM; n = 5 wounds per group; *, p<0.05; **, p<0.01, by one-way ANOVA with Tukey's test. MSC_miR-21-IN, miR-21 inhibitor transfected AT-MSCs; MSC_ctrl-IN, control inhibitor transfected AT-MSCs."}
{"words": ["f1a", ",", "b", ",", "THP1", "cells", "were", "stimulated", "with", "rotenone", "(", "10", " ", "µM", ")", ",", "TTFA", "(", "10", " ", "µM", ")", "or", "antimycin", "(", "40", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", ")", "for", "6", " ", "h", "and", "then", "stained", "with", "Mitotracker", "green", "and", "Mitotracker", "deep", "red", "(", "a", ")", "or", "MitoSOX", "(", "b", ")", "for", "30", " ", "min", "and", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "c", ",", "THP1", "cells", "were", "stimulated", "for", "6", " ", "h", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "rotenone", ",", "TTFA", "or", "antimycin", ".", "Supernatants", "(", "SN", ")", "and", "cell", "extracts", "(", "input", ")", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "as", "indicated", ".", "d", ",", "LPS", "-", "primed", "bone", "-", "marrow", "-", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "Nlrp3", "or", "Ipaf", "deficient", "mice", "were", "stimulated", "for", "6", " ", "h", "with", "MSU", "(", "150", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", ")", ",", "rotenone", "(", "10", " ", "µM", "for", "THP1", "cells", "and", "40", " ", "µM", "for", "BMDMs", ")", "or", "antimycin", "(", "40", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", "for", "THP1", "cells", "and", "10", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", "for", "BMDMs", ")", ".", "The", "release", "of", "caspase", "-", "1", "(", "western", "blot", ")", "was", "then", "determined", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, b, THP1 cells were stimulated with rotenone (10 µM), TTFA (10 µM) or antimycin (40 µg ml−1) for 6 h and then stained with Mitotracker green and Mitotracker deep red (a) or MitoSOX (b) for 30 min and analysed by flow cytometry.c, THP1 cells were stimulated for 6 h with the indicated amounts of rotenone, TTFA or antimycin. Supernatants (SN) and cell extracts (input) were analysed by western blotting as indicated.d, LPS-primed bone-marrow-derived macrophages (BMDMs) from wild-type (WT), Nlrp3 or Ipaf deficient mice were stimulated for 6 h with MSU (150 µg ml−1), rotenone (10 µM for THP1 cells and 40 µM for BMDMs) or antimycin (40 µg ml−1 for THP1 cells and 10 µg ml−1 for BMDMs). The release of caspase-1 (western blot) was then determined. Data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["f2a", ",", "BMDMs", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "stimulated", "with", "rotenone", "(", "40", "µM", ")", "for", "3", "h", "and", "the", "co", "-", "localization", "of", "mitochondria", "and", "GFP", "-", "LC3", "dots", "were", "analysed", "using", "confocal", "microscopy", ".", "b", ",", "THP1", "cells", "stimulated", "with", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ",", "10", "mM", ")", "for", "24", "h", "or", "THP1", "cells", "stably", "expressing", "shRNA", "against", "beclin", "1", "or", "ATG5", "were", "stained", "with", "Mitotracker", "green", "and", "Mitotracker", "deep", "red", "for", "30", "min", ",", "and", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "c", ",", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "from", "wild", "-", "type", ",", "Nlrp3", "−", "/", "−", ",", "Asc", "−", "/", "−", "or", "Ipaf", "−", "/", "−", "knockout", "mice", "were", "stimulated", "with", "MSU", "(", "150", " ", "µg", " ", "ml", "−", "1", ")", "or", "3", "-", "MA", "(", "10", " ", "mM", ")", "for", "6", " ", "h", "and", "the", "release", "of", "active", "caspase", "-", "1", "and", "IL", "-", "1b", "was", "determined", ".", "d", ",", "THP1", "cells", "stably", "expressing", "shRNA", "against", "beclin", "1", "or", "ATG5", "were", "incubated", "for", "24", " ", "h", "and", "media", "supernatants", "(", "SN", ")", "and", "inputs", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "e", ",", "THP1", "cells", "stably", "expressing", "shRNA", "against", "beclin", "1", "or", "ATG5", "were", "stimulated", "with", "MSU", "or", "nigericin", "for", "6", "h", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, BMDMs expressing GFP-LC3 were stimulated with rotenone (40 µM) for 3 h and the co-localization of mitochondria and GFP-LC3 dots were analysed using confocal microscopy.b, THP1 cells stimulated with 3-methyladenine (3-MA, 10 mM) for 24 h or THP1 cells stably expressing shRNA against beclin 1 or ATG5 were stained with Mitotracker green and Mitotracker deep red for 30 min, and analysed by flow cytometry.c, LPS-primed BMDMs from wild-type, Nlrp3−/−, Asc−/− or Ipaf −/− knockout mice were stimulated with MSU (150 µg ml−1) or 3-MA (10 mM) for 6 h and the release of active caspase-1 and IL-1b was determined.d, THP1 cells stably expressing shRNA against beclin 1 or ATG5 were incubated for 24 h and media supernatants (SN) and inputs were analysed by western blotting.e, THP1 cells stably expressing shRNA against beclin 1 or ATG5 were stimulated with MSU or nigericin for 6 h. Data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["f3a", "-", "d", ",", "THP1", "cells", "expressing", "Flag", "-", "NLRP3", "(", "a", ",", "b", ")", "or", "Flag", "-", "ASC", "(", "c", ",", "d", ")", "were", "analysed", "for", "the", "co", "-", "localization", "of", "Flag", "-", "NLRP3", "with", "the", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "marker", "calreticulin", "or", "mitochondria", "(", "Mitotracker", ")", "using", "confocal", "microscopy", ".", "b", ",", "THP1", "cells", "expressing", "Flag", "-", "NLRP3", "were", "analysed", "for", "the", "co", "-", "localization", "of", "Flag", "-", "NLRP3", "with", "the", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ")", "marker", "calreticulin", "using", "confocal", "microscopy", ".", "e", ",", "THP1", "cells", "were", "stimulated", "with", "MSU", "or", "nigericin", "and", "then", "fractionated", ".", "The", "cytosolic", ",", "ER", ",", "MAM", "and", "mitochondrial", "fractions", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "as", "indicated", "in", "the", "text", ".", "f", ",", "THP1", "cells", "stably", "expressing", "shRNA", "against", "NLRP3", "were", "stimulated", "with", "nigericin", "and", "subcellular", "fractions", "analysed", "as", "in", "e", ".", "g", ",", "TXNIP", "associates", "with", "mitochondria", "after", "NLRP3", "inflammasome", "activation", "in", "a", "ROS", "-", "dependent", "manner", ".", "THP1", "cells", "were", "stimulated", "with", "MSU", "and", "nigericin", ",", "and", "TXNIP", "localization", "was", "investigated", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "antioxidant", "APDC", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "two", "or", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bars", ":", "a", "-", "g", ",", "20", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a-d, THP1 cells expressing Flag-NLRP3 (a, b) or Flag-ASC (c, d) were analysed for the co-localization of Flag-NLRP3 with the endoplasmic reticulum (ER) marker calreticulin or mitochondria (Mitotracker) using confocal microscopy.b, THP1 cells expressing Flag-NLRP3 were analysed for the co-localization of Flag-NLRP3 with the endoplasmic reticulum (ER) marker calreticulin using confocal microscopy.e, THP1 cells were stimulated with MSU or nigericin and then fractionated. The cytosolic, ER, MAM and mitochondrial fractions were analysed by western blotting as indicated in the text.f, THP1 cells stably expressing shRNA against NLRP3 were stimulated with nigericin and subcellular fractions analysed as in e.g, TXNIP associates with mitochondria after NLRP3 inflammasome activation in a ROS-dependent manner. THP1 cells were stimulated with MSU and nigericin, and TXNIP localization was investigated in the presence or absence of the antioxidant APDC. Data shown are representative of two or three independent experiments. Scale bars: a-g, 20 µm."}
{"words": ["f4a", ",", "THP1", "cells", "stably", "expressing", "shVDAC1", "were", "stimulated", "with", "various", "NLRP", "inflammasome", "activators", "and", "then", "analysed", "for", "caspase", "-", "1", "activation", "and", "IL", "-", "1b", "secretion", ".", "b", ",", "THP1", "cells", "expressing", "shRNA", "against", "VDAC2", "were", "stimulated", "with", "MSU", ",", "R837", ",", "silica", ",", "alum", "or", "nigericin", "and", "analysed", "for", "IL", "-", "1b", "secretion", ".", "c", ",", "THP1", "cells", "expressing", "shRNA", "against", "VDAC1", "were", "stimulated", "with", "MSU", "and", "nigericin", ",", "and", "NLRP3", "localization", "was", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ":", "20", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, THP1 cells stably expressing shVDAC1 were stimulated with various NLRP inflammasome activators and then analysed for caspase-1 activation and IL-1b secretion.b, THP1 cells expressing shRNA against VDAC2 were stimulated with MSU, R837, silica, alum or nigericin and analysed for IL-1b secretion.c, THP1 cells expressing shRNA against VDAC1 were stimulated with MSU and nigericin, and NLRP3 localization was analysed by confocal microscopy. Scale bars: 20 µm."}
{"words": ["Figure", "1B", "PCR", "performed", "on", "genomic", "DNA", "with", "indicated", "primers", "as", "shown", ":", "o1", ":", "oPAP8", "_", "rtpF", ",", "o2", ":", "oPAP8", "_", "E3R", ",", "o3", ":", "oPAP8", "_", "rtpR", ",", "oLB", ":", "oLBb1", ".", "3", ",", "EF1α", ":", "ELONGATION", "FACTOR", "1α", ",", "WT", ":", "wild", "type", ",", "pap8", "-", "1", ":", "Homozygous", "albino", "plant", ",", "Ht", ":", "Heterozygous", "green", "plant", ";", "T", ":", "T", "-", "DNA", ",", "arrowhead", ":", "670", "-", "bp", "contaminant", "amplification", "product", "used", "as", "loading", "control", ".", "C", "RT", "-", "PCR", "on", "wild", "type", "and", "pap8", "-", "1", "homozygous", "plants", "grown", "in", "the", "dark", "for", "3", "days", "followed", "with", "72", "-", "h", "growth", "under", "white", "light", "to", "allow", "greening", "of", "the", "wild", "type", ";", "EF1α", "used", "as", "control", ".", "E", "Half", "-", "open", "siliques", "of", "a", "heterozygous", "plant", "showing", "the", "embryo", "greening", ";", "scale", "bar", "equals", "250", "µm", ".", "The", "given", "number", "is", "the", "position", "rank", "of", "the", "silique", "from", "top", "to", "bottom", "of", "the", "inflorescence", "presenting", "the", "segregation", "of", "homozygous", "and", "heterozygous", "seeds", "based", "on", "their", "ability", "to", "transiently", "develop", "chloroplasts", ".", "F", "Mutant", "Rescue", ":", "WT", "and", "two", "representative", "pap8", "-", "1", "plants", "were", "grown", "in", "vitro", "using", "sucrose", "and", "low", "white", "light", "intensity", "(", "of", "10", "µmol", ".", "m", "-", "2", ".", "s", "-", "1", ")", ";", "scale", "bar", "equals", "20", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B PCR performed on genomic DNA with indicated primers as shown: o1: oPAP8_rtpF, o2: oPAP8_E3R, o3: oPAP8_rtpR, oLB: oLBb1.3, EF1α: ELONGATION FACTOR 1α, WT: wild type, pap8-1: Homozygous albino plant, Ht: Heterozygous green plant; T: T-DNA, arrowhead: 670-bp contaminant amplification product used as loading control.C RT-PCR on wild type and pap8-1 homozygous plants grown in the dark for 3 days followed with 72-h growth under white light to allow greening of the wild type; EF1α used as control.E Half-open siliques of a heterozygous plant showing the embryo greening; scale bar equals 250 µm. The given number is the position rank of the silique from top to bottom of the inflorescence presenting the segregation of homozygous and heterozygous seeds based on their ability to transiently develop chloroplasts.F Mutant Rescue: WT and two representative pap8-1 plants were grown in vitro using sucrose and low white light intensity (of 10 µmol.m-2.s-1); scale bar equals 20 mm."}
{"words": ["Figure", "2B", "Two", "or", "six", "(", "-", "97m3", ")", "representative", "primary", "transformants", "expressing", "GUS", "under", "the", "given", "PAP8", "promoter", "version", ";", "FC", "+", ",", "the", "corresponding", "promoters", "were", "tested", "positive", "in", "functional", "complementation", "of", "the", "mutant", "pap8", "-", "1", ".", "Scale", "bar", "equals", "3", "mm", ".", "D", "Dual", "luciferase", "reporter", "assay", ";", "Renilla", "luciferase", "(", "Rluc", ")", "used", "as", "internal", "control", "and", "GFPer", "used", "as", "control", "for", "the", "transfected", "area", ";", "the", "promoters", "driving", "Firefly", "luciferase", "(", "Fluc", ")", "were", "transfected", "in", "onion", "epidermis", "cells", "without", "or", "with", "constitutively", "expressed", "HY5", ".", "The", "Fluc", "/", "Rluc", "activity", "was", "set", "to", "1", "for", "the", "minus", "-", "HY5", "control", ";", "mean", "±", "standard", "error", "corresponding", "to", "3", "replicates", ";", "photon", "counts", "are", "given", "in", "source", "data", ".", "*", ",", "ε", "-", "test", "=", "3", ",", "43", ">", "1", ".", "96", "corresponding", "to", "p", "-", "value", "<", "0", ",", "001", ".", "E", "Electro", "-", "mobility", "shift", "assay", "of", "a", "probe", "corresponding", "to", "the", "near", "palindromic", "PAP8", "element", "(", "GAcGCTC", ")", "with", "recombinant", "HY5", "protein", ";", "a", "probe", "containing", "a", "canonical", "G", "-", "box", "element", "(", "CACGTG", ")", "recognized", "by", "HY5", "was", "used", "as", "cold", "competitor", ".", "F", "Integrative", "genomics", "viewer", "(", "IGV", ")", "images", "of", "the", "Chromatin", "immunoprecipitation", "(", "ChIP", ")", "sequencing", "data30", "at", "the", "PAP8", "locus", ";", "TAIR10", ",", "annotation", "according", "to", "the", "Arabidopsis", "thaliana", "information", "resource", "orange", "box", "indicates", "the", "PAP8", "locus", ".", "ChIP", "on", "hy5", "-", "ks50", ";", "35S", ":", "HY5", "-", "YFP", "exposed", "to", "blue", "light", "or", "red", "light", "using", "GFP", "antibody", "and", "compared", "to", "mock", "corresponding", "to", "ChIP", "control", "experiment", "done", "without", "antibody", ".", "Each", "treatment", "is", "presented", "as", "track", "overlay", "of", "triplicates", ":", "the", "read", "count", "is", "given", "within", "the", "\"", "group", "autoscale", "\"", "range", "in", "brackets", ".", "Close", "up", "on", "the", "5", "'", "-", "UTR", "region", "centred", "on", "the", "-", "95", "-", "promoter", "element", "in", "yellow", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Two or six (-97m3) representative primary transformants expressing GUS under the given PAP8 promoter version; FC+, the corresponding promoters were tested positive in functional complementation of the mutant pap8-1. Scale bar equals 3 mm.D Dual luciferase reporter assay; Renilla luciferase (Rluc) used as internal control and GFPer used as control for the transfected area; the promoters driving Firefly luciferase (Fluc) were transfected in onion epidermis cells without or with constitutively expressed HY5. The Fluc/Rluc activity was set to 1 for the minus-HY5 control; mean ± standard error corresponding to 3 replicates; photon counts are given in source data. *, ε-test = 3,43 > 1.96 corresponding to p-value < 0,001.E Electro-mobility shift assay of a probe corresponding to the near palindromic PAP8 element (GAcGCTC) with recombinant HY5 protein; a probe containing a canonical G-box element (CACGTG) recognized by HY5 was used as cold competitor.F Integrative genomics viewer (IGV) images of the Chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing data30 at the PAP8 locus; TAIR10, annotation according to the Arabidopsis thaliana information resource orange box indicates the PAP8 locus. ChIP on hy5-ks50; 35S:HY5-YFP exposed to blue light or red light using GFP antibody and compared to mock corresponding to ChIP control experiment done without antibody. Each treatment is presented as track overlay of triplicates: the read count is given within the \"group autoscale\" range in brackets. Close up on the 5'-UTR region centred on the -95-promoter element in yellow."}
{"words": ["Figure", "3B", "Transiently", "expressed", "PAP8FL", "-", "GFP", "(", "full", "-", "length", "coding", "sequence", "of", "PAP8", "fused", "to", "GFP", ")", "in", "onion", "epidermal", "cells", "displays", "a", "dual", "localization", "in", "the", "nucleus", "(", "white", "arrowhead", ")", "and", "in", "plastids", "(", "yellow", "arrowheads", ")", ".", "C", "Immuno", "-", "blots", "for", "the", "detection", "of", "PAP8", "in", "total", "protein", "extracts", "(", "Col", "-", "0", "Tot", ")", "the", "nuclear", "fraction", "(", "N", ")", "and", "the", "plastidic", "fractions", "(", "EP", ",", "etioplast", ";", "CP", ",", "chloroplast", ")", "of", "etiolated", "(", "Dark", ")", "or", "photomorphogenic", "(", "Light", ")", "Arabidopsis", "seedlings", "by", "immuno", "-", "Western", "blotting", "using", "a", "PAP8", "antiserum", "(", "PAP8", ")", ".", "As", "control", ",", "a", "mixture", "of", "antisera", "raised", "against", "Histone", "3", "(", "H3", ")", "and", "the", "large", "subunit", "of", "ribulose", "1", ",", "5", "-", "bisphosphate", "carboxylase", "/", "oxygenase", "(", "RbcL", ")", "was", "used", "to", "evaluate", "reciprocal", "contaminations", ".", "The", "lanes", "are", "extracted", "from", "the", "same", "blots", "provided", "in", "the", "Source", "Data", "file", ".", "D", "-", "G", "Co", "-", "expression", "analysis", "of", "PAP8FL", "-", "GFP", "(", "D", ")", "with", "PAP8ΔcTP", "-", "RFP", "(", "E", ")", "in", "onion", "epidermal", "cells", ";", "(", "F", ")", "green", "and", "red", "channels", "merged", ";", "yellow", "arrowheads", "show", "plastids", ";", "white", "arrowheads", "show", "nuclei", "as", "observed", "with", "DIC", ",", "differential", "interference", "contrast", "in", "(", "G", ")", ";", "FL", ",", "PAP8", "full", "length", "ORF", ";", "ΔcTP", ",", "deletion", "of", "the", "cTP", ";", "scale", "bars", "equal", "20", "µm", ".", "H", "Confocal", "imaging", "on", "Arabidopsis", "cotyledons", "expressing", "PAP8ΔcTP", "-", "GFP", ",", "details", "of", "a", "few", "palisade", "cells", "(", "see", "Fig", ".", "S7B", "for", "a", "view", "in", "a", "cross", "section", "between", "the", "two", "cotyledons", ")", ";", "magenta", ",", "auto", "-", "fluorescence", "of", "the", "chloroplast", ";", "the", "white", "arrowhead", "shows", "a", "nucleus", ";", "scale", "bar", "equals", "5", "µm", ".", "I", ",", "J", "Confocal", "imaging", "on", "Arabidopsis", "cotyledons", "stably", "expressing", "pP8", ":", ":", "PAP8ΔNLS", "-", "GFP", ";", "ΔNLS", ",", "deletion", "of", "the", "NLS", "(", "I", ")", "during", "skotomorphogenesis", "and", "(", "J", ")", "after", "24h", "light", ";", "Yellow", "arrowheads", "show", "the", "GFP", "signal", ";", "the", "picture", "is", "a", "merge", "of", "different", "channels", ":", "GFP", "in", "green", ",", "Pchl", ",", ":", "protochlorophyllide", ",", "or", "Chl", ":", "chlorophyll", "in", "magenta", "marked", "with", "arrowheads", ",", "and", "propidium", "iodide", ",", "showing", "the", "waxy", "cuticle", "in", "red", ",", "the", "empty", "space", "correspond", "to", "the", "layer", "of", "highly", "vacuolated", "epidermal", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Transiently expressed PAP8FL-GFP (full-length coding sequence of PAP8 fused to GFP) in onion epidermal cells displays a dual localization in the nucleus (white arrowhead) and in plastids (yellow arrowheads).C Immuno-blots for the detection of PAP8 in total protein extracts (Col-0 Tot) the nuclear fraction (N) and the plastidic fractions (EP, etioplast; CP, chloroplast) of etiolated (Dark) or photomorphogenic (Light) Arabidopsis seedlings by immuno-Western blotting using a PAP8 antiserum (PAP8). As control, a mixture of antisera raised against Histone 3 (H3) and the large subunit of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RbcL) was used to evaluate reciprocal contaminations. The lanes are extracted from the same blots provided in the Source Data file.D-G Co-expression analysis of PAP8FL-GFP (D) with PAP8ΔcTP-RFP (E) in onion epidermal cells; (F) green and red channels merged; yellow arrowheads show plastids; white arrowheads show nuclei as observed with DIC, differential interference contrast in (G); FL, PAP8 full length ORF; ΔcTP, deletion of the cTP; scale bars equal 20 µm.H Confocal imaging on Arabidopsis cotyledons expressing PAP8ΔcTP-GFP, details of a few palisade cells (see Fig. S7B for a view in a cross section between the two cotyledons); magenta, auto-fluorescence of the chloroplast; the white arrowhead shows a nucleus; scale bar equals 5 µm.I,J Confocal imaging on Arabidopsis cotyledons stably expressing pP8::PAP8ΔNLS-GFP; ΔNLS, deletion of the NLS (I) during skotomorphogenesis and (J) after 24h light; Yellow arrowheads show the GFP signal; the picture is a merge of different channels: GFP in green, Pchl,: protochlorophyllide, or Chl: chlorophyll in magenta marked with arrowheads, and propidium iodide, showing the waxy cuticle in red, the empty space correspond to the layer of highly vacuolated epidermal cells."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "(", "A", ")", "Transient", "expression", "of", "PAP8NLSm5", "-", "GFP", "mutated", "in", "the", "NLS", "as", "described", "in", "Fig", ".", "EV4A", ".", "The", "circle", "marks", "the", "position", "of", "the", "nucleus", "(", "N", ")", "as", "observed", "with", "DIC", "in", "(", "B", ")", ";", "yellow", "arrowheads", "show", "stromules", "(", "str", ")", ".", "Scale", "bars", "equal", "20", "µm", ".", "C", "-", "G", "Pictures", "of", "representative", "genotypes", "obtained", "in", "the", "functional", "complementation", "test", "of", "pap8", "-", "1", "using", "pP8", ":", ":", "PAP8", "-", "NLSm5", "(", "C", ",", "F", ")", "or", "pP8", ":", ":", "PAP8ΔcTP", "(", "G", ")", "both", "constructions", "without", "GFP", "tags", ";", "⌀", "indicates", "pap8", "-", "1", "without", "any", "PAP8", "transgene", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "Pictures", "using", "Keyence", "technology", "of", "plants", "with", "genotypes", "as", "labelled", ";", "transgenes", "expressed", "using", "the", "1", ".", "1", "-", "kb", "PAP8", "promoter", ".", "Scale", "bars", "equal", "1", "mm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A,B) (A) Transient expression of PAP8NLSm5-GFP mutated in the NLS as described in Fig. EV4A. The circle marks the position of the nucleus (N) as observed with DIC in (B); yellow arrowheads show stromules (str). Scale bars equal 20 µm.C-G Pictures of representative genotypes obtained in the functional complementation test of pap8-1 using pP8::PAP8-NLSm5 (C, F) or pP8::PAP8ΔcTP (G) both constructions without GFP tags; ⌀ indicates pap8-1 without any PAP8 transgene. (D-G) Pictures using Keyence technology of plants with genotypes as labelled; transgenes expressed using the 1.1-kb PAP8 promoter. Scale bars equal 1 mm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Phenotypes", "of", "given", "genotypes", "subjected", "to", "5", "days", "of", "illumination", "at", "8", "µmol", ".", "m", "-", "2", ".", "s", "-", "1", "660", "-", "nm", "red", "light", ".", "PBG", ",", "pCaMV35S", ":", ":", "PHYB", "-", "GFP", "transformed", "in", "pap8", "-", "1", "/", "+", "(", "among", "25", "lines", "selected", "for", "GFP", "expression", "see", "data", "source", ";", "2", "doubly", "heterozygous", "pap8", "-", "1", "/", "+", ";", "PBG", "/", "-", "lines", "#", "6", "and", "#", "7", "segregated", "the", "photobodies", "alteration", "with", "the", "albinism", ")", ".", "B", "Hypocotyl", "length", ",", "given", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "of", "plants", "grown", "as", "in", "(", "A", ")", "(", "R8", ",", "grey", "bars", ")", "or", "at", "30", "µmol", ".", "m", "-", "2", ".", "s", "-", "1", "660", "-", "nm", "red", "light", "(", "R30", ",", "pink", "bars", ")", "showing", "partial", "insensitivity", "of", "pap8", "-", "1", "to", "the", "PBG", "overexpression", ".", "Measurements", "are", "given", "in", "source", "data", ";", "in", "the", "order", "of", "the", "graph", "n", "equals", "(", "50", ",", "133", ",", "58", ",", "43", ",", "36", ",", "112", ",", "25", ",", "60", ")", "δ", "-", "test", "(", "comparison", "of", "the", "mean", ")", "R8", ":", "δPBG", "/", "PBGp8", "-", "1", "=", "20", ".", "38", "corresponding", "to", "p", "-", "value", "<", "10", "-", "31", "δwt", "/", "p8", "-", "1", "=", "0", ".", "5", "<", "1", ".", "96", "not", "significant", "at", "α", "set", "to", "0", ".", "05", ")", ".", "Nuclear", "accumulation", "of", "PBG", "observed", "under", "GFP", "excitation", "in", "the", "given", "genotypes", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Epi", "-", "fluorescence", "microscopy", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Confocal", "microscopy", "showing", "the", "size", "of", "the", "nuclear", "bodies", ".", "Scale", "bars", "equal", "5", "µm", ".", "(", "G", ")", "Box", "plot", "(", "Min", ",", "1st", "quartile", ",", "median", "as", "the", "central", "band", ",", "3rd", "quartile", ",", "max", ")", "on", "the", "diameter", "of", "the", "nuclear", "bodies", "(", "NBs", ")", ";", "n", "equals", "the", "number", "of", "records", ".", "H", "Immuno", "-", "blots", "using", "a", "GFP", "antibody", "or", "a", "PAP8", "antibody", "showing", "respectively", "the", "levels", "of", "PHYB", "-", "GFP", "and", "PAP8", "in", "the", "given", "genotypes", "grown", "in", "the", "dark", "for", "3", "days", "or", "in", "light", ";", "n", ".", "a", ".", ",", "not", "applicable", "as", "the", "pap8", "-", "1", "mutant", "can", "only", "be", "visually", "distinguished", "from", "wild", "type", "after", "light", "exposure", ";", "2", "lines", "(", "L", "#", "06", "and", "L", "#", "07", ")", "for", "PBG", "/", "pap8", "-", "1", "were", "tested", ".", "Coomassie", "blue", "staining", "presented", "as", "loading", ";", "signals", "were", "quantified", "using", "ImageJ", ".", "I", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "on", "wild", "type", ",", "pap8", "-", "1", ",", "PBG", "and", "PBG", "pap8", "-", "1", ".", "Seedlings", "were", "grown", "in", "the", "dark", "(", "D", ")", "or", "under", "white", "light", "(", "L", ",", "30", "µmol", ".", "m", "-", "2", ".", "s", "-", "1", ")", ";", "levels", "of", "transcripts", "are", "given", "relative", "to", "EF1α", ";", "error", "bars", "correspond", "to", "standard", "errors", "on", "technical", "triplicates", "and", "the", "dark", "sample", "is", "the", "wild", "-", "type", "PBG", "line", ".", "δ", "-", "test", "(", "comparison", "of", "the", "mean", ")", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "10", "-", "72", ".", "J", "Immuno", "-", "blots", "showing", "the", "levels", "of", "PIF1", ",", "PIF3", ",", "HY5", "in", "given", "genotypes", "grown", "in", "the", "Dark", "or", "Light", "condition", "as", "noted", ":", "p5", "/", "+", ",", "mix", "of", "an", "heterozygous", "pap5", "-", "2", "siblings", "progeny", "undistinguishable", "from", "wild", "type", ";", "p5", "-", "2", ",", "pap5", "-", "2", "and", "pifq", ",", "quadruple", "pif1", "-", "1", "pif3", "-", "3", "pif4", "-", "2", "pif5", "-", "3", "mutant", ";", "Histone", "H3", "(", "H3", ")", ",", "RbcL", "and", "PAP8", "were", "used", "as", "controls", ";", "n", ".", "a", ".", ",", "not", "applicable", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Phenotypes of given genotypes subjected to 5 days of illumination at 8 µmol.m-2.s-1 660-nm red light. PBG, pCaMV35S::PHYB-GFP transformed in pap8-1/+ (among 25 lines selected for GFP expression see data source; 2 doubly heterozygous pap8-1/+; PBG/- lines #6 and #7 segregated the photobodies alteration with the albinism).B Hypocotyl length, given as the mean ± SD, of plants grown as in (A) (R8, grey bars) or at 30 µmol.m-2.s-1 660-nm red light (R30, pink bars) showing partial insensitivity of pap8-1 to the PBG overexpression. Measurements are given in source data; in the order of the graph n equals (50, 133, 58, 43, 36, 112, 25, 60) δ-test (comparison of the mean) R8: δPBG/PBGp8-1= 20.38 corresponding to p-value < 10-31 δwt/p8-1= 0.5 < 1.96 not significant at α set to 0.05).Nuclear accumulation of PBG observed under GFP excitation in the given genotypes. (C,D) Epi-fluorescence microscopy. (E,F) Confocal microscopy showing the size of the nuclear bodies. Scale bars equal 5 µm.(G) Box plot (Min, 1st quartile, median as the central band, 3rd quartile, max) on the diameter of the nuclear bodies (NBs); n equals the number of records.H Immuno-blots using a GFP antibody or a PAP8 antibody showing respectively the levels of PHYB-GFP and PAP8 in the given genotypes grown in the dark for 3 days or in light; n.a., not applicable as the pap8-1 mutant can only be visually distinguished from wild type after light exposure; 2 lines (L#06 and L#07) for PBG/pap8-1 were tested. Coomassie blue staining presented as loading; signals were quantified using ImageJ.I RT-qPCR analysis on wild type, pap8-1, PBG and PBG pap8-1. Seedlings were grown in the dark (D) or under white light (L, 30 µmol.m-2.s-1); levels of transcripts are given relative to EF1α; error bars correspond to standard errors on technical triplicates and the dark sample is the wild-type PBG line. δ-test (comparison of the mean) ***, P < 10-72.J Immuno-blots showing the levels of PIF1, PIF3, HY5 in given genotypes grown in the Dark or Light condition as noted: p5/+, mix of an heterozygous pap5-2 siblings progeny undistinguishable from wild type; p5-2, pap5-2 and pifq, quadruple pif1-1 pif3-3 pif4-2 pif5-3 mutant; Histone H3 (H3), RbcL and PAP8 were used as controls; n.a., not applicable."}
{"words": ["Figure", "6A", "Bimolecular", "fluorescence", "complementation", "tests", "using", "in", "combination", "PAP8ΔcTP", "-", "NY", "(", "P8Δc", "-", "NY", ")", "with", "PAP5ΔcTP", "-", "YC", "(", "P5Δc", "-", "YC", ")", "or", "PAP8ΔcTP", "-", "YC", "(", "P8Δc", "-", "YC", ")", "with", "PAP5ΔcTP", "-", "NY", "(", "P5Δc", "-", "NY", ")", ";", "PAP10", "-", "RFP", "(", "P10", "-", "RFP", ")", "was", "used", "as", "internal", "positive", "control", "for", "transfection", ";", "the", "ratio", "in", "grey", "depicts", "the", "number", "of", "green", "-", "fluorescent", "cells", "over", "red", "-", "fluorescent", "cells", ".", "Arrowheads", "indicate", "nuclei", ".", "See", "Appendix", "Fig", ".", "S6", "for", "control", "experiments", ";", "transgenes", "expressed", "under", "CaMV35S", "promoter", ".", "B", "Overlay", "of", "1H", "-", "15N", "correlation", "2D", "NMR", "spectra", "of", "free", "15N", "-", "labelled", "PAP8", "alone", "(", "blue", ")", "or", "in", "complex", "with", "PAP5", "(", "red", ")", ".", "Grey", "areas", "depict", "changes", "of", "signals", "in", "the", "PAP8", "spectrum", ".", "C", "15N", "-", "Filtered", "Diffusion", "Ordered", "Spectroscopy", "-", "NMR", "measurements", "to", "PAP8", ".", "Exponential", "decay", "curves", "of", "PAP8", "in", "absence", "or", "in", "presence", "of", "MBP", "-", "PAP5", "are", "shown", "in", "red", "and", "black", "respectively", ".", "The", "units", "on", "the", "y", "-", "axis", "are", "normalized", "values", "of", "the", "integrals", "of", "the", "signal", "measured", "in", "the", "amide", "proton", "region", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Bimolecular fluorescence complementation tests using in combination PAP8ΔcTP-NY (P8Δc-NY) with PAP5ΔcTP-YC (P5Δc-YC) or PAP8ΔcTP-YC (P8Δc-YC) with PAP5ΔcTP-NY (P5Δc-NY); PAP10-RFP (P10-RFP) was used as internal positive control for transfection; the ratio in grey depicts the number of green-fluorescent cells over red-fluorescent cells. Arrowheads indicate nuclei. See Appendix Fig. S6 for control experiments; transgenes expressed under CaMV35S promoter.B Overlay of 1H-15N correlation 2D NMR spectra of free 15N-labelled PAP8 alone (blue) or in complex with PAP5 (red). Grey areas depict changes of signals in the PAP8 spectrum.C 15N-Filtered Diffusion Ordered Spectroscopy-NMR measurements to PAP8. Exponential decay curves of PAP8 in absence or in presence of MBP-PAP5 are shown in red and black respectively. The units on the y-axis are normalized values of the integrals of the signal measured in the amide proton region."}
{"words": ["Figure", "7A", "Immuno", "-", "blots", "showing", "the", "levels", "of", "PAP8", ",", "PAP5", ",", "Histone", "H3", "(", "H3", ")", ",", "Rubisco", "(", "RbcL", ")", ",", "and", "HY5", ";", "D", ",", "Dark", ";", "Ph", ",", "photomorphogenic", "growth", "conditions", "from", "germination", "on", ".", "*", ",", "HY5", "is", "detected", "as", "a", "modified", "form", "(", "+", "6", "kDa", ")", ";", "the", "arrows", "indicate", "the", "two", "different", "post", "-", "translational", "modified", "forms", "of", "HY5", "for", "which", "accumulation", "occurs", "upon", "light", "exposure", ".", "B", "Relative", "protein", "contents", "normalized", "to", "histone", "H3", "during", "the", "transition", "from", "skotomorphogenesis", "to", "photomorphogenesis", ",", "we", "propose", "a", "phase", "of", "photo", "-", "initiation", "corresponding", "to", "the", "5", "minutes", "of", "light", "allowing", "PAP8", "and", "PAP5", "to", "rise", "to", "nearly", "100", "%", "of", "their", "maximum", ".", "The", "first", "macroscopic", "signs", "of", "greening", "are", "indicated", "around", "3", "hours", "while", "the", "photosynthetic", "apparatus", "bursts", "at", "8", "hours", "to", "be", "fully", "accumulated", "at", "48", "hours", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Immuno-blots showing the levels of PAP8, PAP5, Histone H3 (H3), Rubisco (RbcL), and HY5 ; D, Dark; Ph, photomorphogenic growth conditions from germination on. *, HY5 is detected as a modified form (+ 6 kDa); the arrows indicate the two different post-translational modified forms of HY5 for which accumulation occurs upon light exposure.B Relative protein contents normalized to histone H3 during the transition from skotomorphogenesis to photomorphogenesis, we propose a phase of photo-initiation corresponding to the 5 minutes of light allowing PAP8 and PAP5 to rise to nearly 100% of their maximum. The first macroscopic signs of greening are indicated around 3 hours while the photosynthetic apparatus bursts at 8 hours to be fully accumulated at 48 hours."}
{"words": ["Figure", "6", "Spot", "assay", "of", "designed", "TAD", "constructs", ".", "The", "spot", "assay", "was", "performed", "at", "30ºC", "(", "left", ")", "and", "during", "heat", "shock", "at", "37ºC", "(", "right", "panel", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Spot assay of designed TAD constructs . The spot assay was performed at 30ºC (left) and during heat shock at 37ºC (right panel) "}
{"words": ["Figure", "1scRNA", "-", "Seq", "of", "the", "expression", "of", "the", "entire", "glycolytic", "pathway", "or", "of", "glucose", "phosphate", "isomerase", "only", "(", "GPI", ")", "in", "primary", "CD4", "+", "T", "-", "cells", "infected", "in", "vitro", "(", "D", ",", "E", ")", "or", "CD4", "+", "T", "-", "cells", "of", "PLWH", "(", "F", ")", ".", "In", "panels", "(", "D", ",", "E", ")", ",", "cells", "were", "infected", "with", "VSVG", "-", "HIV", "-", "1", "-", "GFP", "and", "sorted", "for", "viral", "expression", "as", "detailed", "in", "(", "Golumbeanu", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "Following", "latency", "establishment", ",", "cells", "were", "left", "untreated", "or", "HIV", "-", "1", "expression", "was", "reactivated", "through", "suberoyl", "anilide", "hydroxamic", "acid", "(", "SAHA", ")", "or", "α", "-", "CD3", "-", "CD28", "engagement", ".", "Clusters", "1", "and", "2", "were", "identified", "by", "principal", "component", "analysis", "as", "described", "in", "(", "Golumbeanu", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "In", "panel", "(", "F", ")", ",", "CD4", "+", "T", "-", "cells", "were", "isolated", "from", "total", "blood", "of", "PLWH", "under", "ART", "as", "described", "in", "(", "Cohn", "et", "al", ",", "2018", ")", ".", "Viral", "expression", "was", "reactivated", "by", "treatment", "with", "phytohemagglutinin", "(", "PHA", ")", "and", "cells", "were", "sorted", "using", "antibodies", "against", "Env", "and", "Gag", ".", "Sorted", "cells", "were", "then", "subjected", "to", "scRNA", "-", "Seq", "analysis", ".", "The", "expression", "level", "of", "the", "HUMAN", "-", "GLYCOLYSIS", "pathway", "in", "(", "D", ")", "was", "calculated", "as", "the", "average", "expression", "of", "genes", "comprising", "the", "gene", "list", ";", "expression", "levels", "in", "cluster", "1", "and", "2", "were", "compared", "using", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ".", "For", "panels", "(", "E", ",", "F", ")", ",", "significance", "of", "GPI", "differential", "expression", "level", "between", "clusters", "(", "E", ")", "or", "between", "control", "and", "Env", "+", "Gag", "+", "conditions", "(", "F", ")", "was", "assessed", "by", "the", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", "encoded", "in", "FindMarkers", "Seurat", "R", "function", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "For", "panels", "(", "D", ",", "E", ")", "n", "=", "1", "donor", ",", "43", "cells", "(", "untreated", ")", ",", "90", "cells", "(", "SAHA", ")", ",", "91", "cells", "(", "TCR", ")", ",", "for", "panel", "(", "F", ")", "n", "=", "3", "donors", ",", "109", "cells", "(", "control", ")", "and", "85", "cells", "(", "Gag", "+", "Env", "+", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1scRNA-Seq of the expression of the entire glycolytic pathway or of glucose phosphate isomerase only (GPI) in primary CD4+ T-cells infected in vitro (D,E) or CD4+ T-cells of PLWH (F). In panels (D, E), cells were infected with VSVG-HIV-1-GFP and sorted for viral expression as detailed in (Golumbeanu et al, 2018). Following latency establishment, cells were left untreated or HIV-1 expression was reactivated through suberoyl anilide hydroxamic acid (SAHA) or α-CD3-CD28 engagement. Clusters 1 and 2 were identified by principal component analysis as described in (Golumbeanu et al, 2018). In panel (F), CD4+ T-cells were isolated from total blood of PLWH under ART as described in (Cohn et al, 2018). Viral expression was reactivated by treatment with phytohemagglutinin (PHA) and cells were sorted using antibodies against Env and Gag. Sorted cells were then subjected to scRNA-Seq analysis. The expression level of the HUMAN-GLYCOLYSIS pathway in (D) was calculated as the average expression of genes comprising the gene list; expression levels in cluster 1 and 2 were compared using Wilcoxon rank sum test. For panels (E, F), significance of GPI differential expression level between clusters (E) or between control and Env+ Gag+ conditions (F) was assessed by the Wilcoxon rank sum test encoded in FindMarkers Seurat R function. ** p< 0.01, *** p< 0.001; *** p< 0.0001. For panels (D,E) n = 1 donor, 43 cells (untreated), 90 cells (SAHA ), 91 cells (TCR), for panel (F) n = 3 donors, 109 cells (control) and 85 cells (Gag+ Env+)."}
{"words": ["Figure", "2Relative", "ratios", "of", "NADH", "/", "NAD", "+", "(", "D", ")", "and", "ATP", "/", "ADP", "(", "E", ")", "in", "latently", "infected", "and", "reactivated", "cells", ".", "Data", "were", "normalized", "using", "the", "matching", "uninfected", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Relative ratios of NADH/NAD+ (D) and ATP/ADP (E) in latently infected and reactivated cells. Data were normalized using the matching uninfected control."}
{"words": ["Figure", "4Relative", "expression", "of", "HIV", "-", "1", "gag", "in", "cells", "infected", "with", "Tat", "-", "deficient", "HIV", "-", "1pNL4", "-", "3", "as", "compared", "to", "cells", "infected", "with", "wild", "type", "HIV", "-", "1", "pNL4", "-", "3", ".", "relative", "expression", "of", "the", "limiting", "rate", "enzyme", "of", "the", "pentose", "phosphate", "pathway", ",", "i", ".", "e", ".", "G6PD", "(", "B", ")", "in", "HIV", "-", "1", "infected", "as", "compared", "to", "mock", "infected", "cells", ".", "relative", "expression", "of", "genes", "regulating", "the", "thioredoxin", "and", "glutathione", "antioxidant", "pathways", ",", "i", ".", "e", ".", "TrxR1", "(", "C", ")", "and", "GCLC", "(", "D", ")", ",", "in", "HIV", "-", "1", "infected", "as", "compared", "to", "mock", "infected", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Relative expression of HIV-1 gag in cells infected with Tat-deficient HIV-1pNL4-3 as compared to cells infected with wild type HIV-1 pNL4-3.relative expression of the limiting rate enzyme of the pentose phosphate pathway, i.e. G6PD (B) in HIV-1 infected as compared to mock infected cells.relative expression of genes regulating the thioredoxin and glutathione antioxidant pathways, i.e. TrxR1 (C) and GCLC (D), in HIV-1 infected as compared to mock infected cells."}
{"words": ["Figure", "5Reactivation", "from", "HIV", "-", "1", "latency", "(", "A", ")", "and", "relative", "cell", "viability", "(", "B", ")", "in", "primary", "Th17", "cells", "following", "24", "h", "treatment", "with", "the", "Trx", "inhibitor", "auranofin", "(", "AF", ";", "500", "nM", ")", ",", "the", "GSH", "inhibitor", "buthionine", "sulfoximine", "(", "BSO", ";", "250", "μM", ")", ",", "or", "a", "combination", "of", "the", "two", ".", "GFP", "-", "HIV", "-", "1", "expression", "was", "determined", "by", "FACS", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "replicates", "and", "were", "analyzed", "by", "One", "-", "Way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", "(", "A", ")", "or", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "´", "s", "post", "-", "test", "(", "B", ")", ".", "Solid", "lines", "represent", "the", "means", ".", "Levels", "of", "integrated", "HIV", "-", "1", "DNA", "following", "treatment", "for", "48", "h", "with", "AF", "and", "/", "or", "BSO", "in", "CD4", "+", "T", "-", "cells", "derived", "from", "PLWH", "under", "suppressive", "antiretroviral", "therapy", ".", "Live", "cells", "were", "sorted", "after", "treatment", ",", "and", "integrated", "DNA", "was", "measured", "by", "Alu", "-", "PCR", ".", "The", "latency", "reactivating", "agent", "SAHA", "was", "used", "as", "a", "reference", "compound", "(", "Archin", "et", "al", ",", "2012", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "non", "-", "parametric", "Friedman", "´", "s", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "post", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Reactivation from HIV-1 latency (A) and relative cell viability (B) in primary Th17 cells following 24 h treatment with the Trx inhibitor auranofin (AF; 500 nM), the GSH inhibitor buthionine sulfoximine (BSO; 250 μM), or a combination of the two. GFP-HIV-1 expression was determined by FACS. Data are expressed as mean ± SD of three replicates and were analyzed by One-Way ANOVA followed by Tukey's post-test (A) or Two-Way ANOVA followed by Sidak´s post-test (B). Solid lines represent the means.Levels of integrated HIV-1 DNA following treatment for 48 h with AF and/or BSO in CD4+ T-cells derived from PLWH under suppressive antiretroviral therapy. Live cells were sorted after treatment, and integrated DNA was measured by Alu-PCR. The latency reactivating agent SAHA was used as a reference compound (Archin et al, 2012). Data were analyzed by non-parametric Friedman´s test followed by Dunn's post-test."}
{"words": ["Figure", "2A", "HT", "-", "29", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siRIPK1", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "TNF", "-", "α", "(", "T", ")", "or", "T", "+", "S", "+", "Z", "for", "an", "additional", "6", "h", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "p", "-", "RIPK1", ",", "RIPK1", ",", "p", "-", "RIPK3", ",", "RIPK3", ",", "p", "-", "MLKL", ",", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", ".", "B", "Western", "blotting", "analysis", "of", "RIPK1", ",", "RIPK3", ",", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "levels", "in", "HT", "-", "29", "cells", "that", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siRIPK1", ",", "siRIPK3", ",", "MLKL", "siRNA", "oliogs", "(", "siMLKL", ")", ",", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "C", "HT", "-", "29", "cells", "were", "harvested", "48", "h", "after", "transfection", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "MLKL", "expression", "was", "analyzed", "by", "qPCR", "(", "upper", ")", "or", "RT", "-", "PCR", "(", "lower", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "D", ",", "E", "MKN45", "(", "D", ")", "and", "174T", "(", "E", ")", "cells", "were", "harvested", "48", "h", "after", "transfection", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", "(", "upper", ")", "and", "western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "(", "lower", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "F", "HT", "-", "29", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "or", "anti", "-", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "T", "+", "S", "+", "Z", "for", "an", "additional", "24", "h", ".", "Cell", "survival", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "G", "Western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "in", "HT", "-", "29", "cells", "that", "were", "harvested", "48", "h", "after", "transfection", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "or", "an", "anti", "-", "miR", "-", "324", "-", "5p", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A HT-29 cells were transfected with NC, siRIPK1 or miR-324-5p. After 48 h, cells were treated with TNF-α (T) or T+S+Z for an additional 6 h. Western blotting analysis of p-RIPK1, RIPK1, p-RIPK3, RIPK3, p-MLKL, MLKL and β-actin.B Western blotting analysis of RIPK1, RIPK3, MLKL and β-actin levels in HT-29 cells that were transfected with NC, siRIPK1, siRIPK3, MLKL siRNA oliogs ( siMLKL), and miR-324-5p.C HT-29 cells were harvested 48 h after transfection with NC, siMLKL, and miR-324-5p. MLKL expression was analyzed by qPCR (upper) or RT-PCR (lower). Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.D, E MKN45 (D) and 174T (E) cells were harvested 48 h after transfection with NC, siMLKL, and miR-324-5p. qPCR analysis for the expression of MLKL (upper) and western blotting analysis of MLKL and β-actin (lower). Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.F HT-29 cells were transfected with NC, siMLKL, miR-324-5p, or anti-miR-324-5p. After 48 h, cells were treated with DMSO or T+S+Z for an additional 24 h. Cell survival was determined by measuring ATP levels. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.G Western blotting analysis of MLKL and β-actin in HT-29 cells that were harvested 48 h after transfection with NC, siMLKL, miR-324-5p, or an anti-miR-324-5p."}
{"words": ["Figure", "3B", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "MLKL", "siRNA", "oligos", "targeting", "the", "3", "'", "UTR", "of", "MLKL", "(", "siMLKL", "-", "3", "'", "UTR", ")", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "together", "with", "pmirGLO", "-", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", "or", "the", "mutated", "form", "of", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", "shown", "in", "A", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "analysis", "of", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", ".", "Data", "are", "presented", "as", "firefly", "luciferase", "activity", "/", "renilla", "luciferase", "activity", "±", "SD", ".", "In", "B", ",", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "C", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "or", "the", "mutated", "form", "of", "miR", "-", "324", "-", "5p", "together", "with", "pmirGLO", "-", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "analysis", "of", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", ".", "Data", "are", "presented", "as", "firefly", "luciferase", "activity", "/", "renilla", "luciferase", "activity", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "D", "Western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "in", "HeLa", "-", "endogenous", "MLKL", "cells", "(", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "human", "RIPK3", ")", "and", "HeLa", "-", "exogenous", "MLKL", "cells", "(", "Mlkl", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "human", "RIPK3", "and", "the", "coding", "sequence", "(", "CDS", ")", "of", "MLKL", ")", "that", "were", "harvested", "48", "h", "after", "transfection", "with", "NC", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "or", "MLKL", "siRNA", "oligos", "targeting", "the", "CDS", "region", "of", "MLKL", "(", "siMLKL", "-", "CDS", ")", ".", "E", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", "in", "HeLa", "-", "exogenous", "MLKL", "cells", "that", "were", "harvested", "48", "h", "after", "transfection", "with", "NC", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "siMLKL", "-", "3", "'", "UTR", ",", "or", "siMLKL", "-", "CDS", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "F", ",", "G", "HeLa", "-", "endogenous", "MLKL", "cells", "(", "F", ")", "and", "HeLa", "-", "exogenous", "MLKL", "(", "G", ")", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "siMLKL", "-", "3", "'", "UTR", ",", "or", "siMLKL", "-", "CDS", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "T", "+", "S", "+", "Z", "for", "24", "h", ".", "Cell", "survival", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "The", "number", "of", "surviving", "cells", "was", "normalized", "to", "the", "number", "of", "surviving", "control", "cells", ",", "which", "were", "treated", "with", "DMSO", ".", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "H", "HeLa", "cells", "expressing", "MLKL", "(", "1", "-", "190", "aa", ")", "fused", "to", "DmrB", "(", "HeLa", "-", "MLKL", "(", "1", "-", "190", ")", "-", "Dmir", "cells", ")", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "siMLKL", "-", "3", "'", "UTR", ",", "or", "siMLKL", "-", "CDS", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "the", "dimerization", "agent", "AP20187", "(", "60", "nM", ")", "for", "24", "h", ".", "Cell", "survival", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "The", "number", "of", "surviving", "cells", "was", "normalized", "to", "the", "number", "of", "surviving", "control", "cells", ",", "which", "were", "treated", "with", "DMSO", ".", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B HEK293T cells were transfected with NC, MLKL siRNA oligos targeting the 3'UTR of MLKL (siMLKL-3'UTR), or miR-324-5p, together with pmirGLO-MLKL-3'UTR or the mutated form of MLKL-3'UTR shown in A. Relative luciferase activity analysis of MLKL-3'UTR. Data are presented as firefly luciferase activity/renilla luciferase activity ± SD. In B, data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.C HEK293T cells were transfected with NC, miR-324-5p, or the mutated form of miR-324-5p together with pmirGLO-MLKL-3'UTR. Relative luciferase activity analysis of MLKL-3'UTR. Data are presented as firefly luciferase activity/renilla luciferase activity ± SD (n=5, biological replicates).D Western blotting analysis of MLKL and β-actin in HeLa-endogenous MLKL cells (HeLa cells stably expressing human RIPK3) and HeLa-exogenous MLKL cells (Mlkl-/- HeLa cells stably expressing human RIPK3 and the coding sequence (CDS) of MLKL) that were harvested 48 h after transfection with NC, miR-324-5p, or MLKL siRNA oligos targeting the CDS region of MLKL (siMLKL-CDS).E qPCR analysis for the expression of MLKL in HeLa-exogenous MLKL cells that were harvested 48 h after transfection with NC, miR-324-5p, siMLKL-3'UTR, or siMLKL-CDS. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.F, G HeLa-endogenous MLKL cells (F) and HeLa-exogenous MLKL (G) were transfected with NC, miR-324-5p, siMLKL-3'UTR, or siMLKL-CDS. After 48 h, cells were treated with T+S+Z for 24 h. Cell survival was determined by measuring ATP levels. Data information: The number of surviving cells was normalized to the number of surviving control cells, which were treated with DMSO. data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.H HeLa cells expressing MLKL(1-190 aa) fused to DmrB (HeLa-MLKL(1-190)-Dmir cells) were transfected with NC, miR-324-5p, siMLKL-3'UTR, or siMLKL-CDS. After 48 h, cells were treated with DMSO or the dimerization agent AP20187 (60 nM) for 24 h. Cell survival was determined by measuring ATP levels. Data information: The number of surviving cells was normalized to the number of surviving control cells, which were treated with DMSO. data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown."}
{"words": ["Figure", "4C", "African", "green", "monkey", "kidney", "epithelial", "(", "Vero", ")", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", "for", "48", "h", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "D", "MEFs", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", "for", "48", "h", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", "and", "western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "β", "-", "actin", "serves", "as", "an", "internal", "control", "(", "D", ")", ".", "E", "MEFs", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "T", "+", "S", "+", "Z", "for", "24", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "F", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ",", "together", "with", "pmirGLO", "-", "mouse", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", "or", "the", "mutated", "form", "of", "mouse", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "analysis", "of", "MLKL", "-", "3", "'", "UTR", ".", "Data", "are", "presented", "as", "firefly", "luciferase", "activity", "/", "renilla", "luciferase", "activity", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ",", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C African green monkey kidney epithelial (Vero) cells were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p for 48 h. qPCR analysis for the expression of MLKL. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.D MEFs were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p for 48 h. qPCR analysis for the expression of MLKL and western blotting analysis of MLKL and β-actin. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown. β-actin serves as an internal control (D).E MEFs were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p. After 48 h, cells were treated with DMSO or T+S+Z for 24 h. Cell viability was determined by measuring ATP levels. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.F HEK293T cells were transfected with NC or miR-324-5p, together with pmirGLO-mouse MLKL-3'UTR or the mutated form of mouse MLKL-3'UTR. Relative luciferase activity analysis of MLKL-3'UTR. Data are presented as firefly luciferase activity/renilla luciferase activity ± SD (n = 5, biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "5A", "U937", "cells", "were", "treated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "IFN", "-", "α", ",", "100", "ng", "/", "ml", "IFN", "-", "β", ",", "100", "ng", "/", "ml", "IFN", "-", "γ", ",", "100", "ng", "/", "ml", "LPS", ",", "or", "25", "μg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", ".", "Identical", "concentrations", "were", "used", "in", "later", "experiments", "unless", "otherwise", "stated", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", ".", "C", "U937", "cells", "were", "treated", "with", "PBS", ",", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "LPS", ",", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "B", "U937", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "LPS", ",", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "24", "h", ".", "and", "western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "(", "left", ")", ".", "Quantification", "of", "MLKL", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "levels", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "D", ",", "E", "U937", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "β", "(", "D", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "E", ")", "for", "24", "h", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", ".", "F", ",", "G", "U937", "cells", "were", "incubated", "with", "300", "nM", "ruxolitinib", "for", "2", "h", "prior", "to", "IFN", "-", "β", "(", "F", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "G", ")", "treatment", ".", "After", "24", "h", ",", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "western", "blotting", "analysis", "of", "p", "-", "STAT1", ",", "STAT1", ",", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "H", ",", "I", "U937", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "or", "STAT1", "siRNA", "oliogs", "(", "siSTAT1", ")", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "β", "(", "Η", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "Ι", ")", ".", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "Western", "blotting", "analysis", "of", "STAT1", ",", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "J", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "for", "24", "h", ".", "The", "cell", "lysate", "was", "collected", "for", "ChIP", "analysis", ".", "STAT1", "binding", "to", "miR", "-", "324", "-", "5p", "promoter", "DNA", "region", "was", "determined", "by", "Chip", "-", "qPCR", ".", "The", "amount", "of", "precipitated", "DNA", "was", "calculated", "as", "percent", "input", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A U937 cells were treated with 100 ng/ml IFN-α, 100 ng/ml IFN-β, 100 ng/ml IFN-γ, 100 ng/ml LPS, or 25 μg/ml poly(I:C) for 24 h. Identical concentrations were used in later experiments unless otherwise stated. qPCR analysis for the expression of MLKL. C U937 cells were treated with PBS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, LPS, or poly(I:C) for 24 h. qPCR analysis for the expression of miR-324-5p. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.B U937 cells were treated with IFN-α, IFN-β, IFN-γ, LPS, or poly(I:C) for 24 h. and western blotting analysis of MLKL and β-actin (left). Quantification of MLKL normalized to β-actin levels (right). Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.D, E U937 cells were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p. After 48 h, cells were treated with IFN-β (D) or IFN-γ (E) for 24 h. Western blotting analysis of MLKL and β-actin.F, G U937 cells were incubated with 300 nM ruxolitinib for 2 h prior to IFN-β (F) or IFN-γ (G) treatment. After 24 h, qPCR analysis for the expression of miR-324-5p. After 48 h, western blotting analysis of p-STAT1, STAT1, MLKL and β-actin. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.H, I U937 cells were transfected with NC, or STAT1 siRNA oliogs (siSTAT1). After 48 h, cells were treated with IFN-β (Η) or IFN-γ (Ι). qPCR analysis for the expression of miR-324-5p. Western blotting analysis of STAT1, MLKL and β-actin. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.J HT-29 cells were treated with IFN-γ for 24 h. The cell lysate was collected for ChIP analysis. STAT1 binding to miR-324-5p promoter DNA region was determined by Chip-qPCR. The amount of precipitated DNA was calculated as percent input. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown."}
{"words": ["Figure", "6A", "U937", "cells", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", "-", "3", "'", "UTR", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "exposed", "to", "100", "ng", "/", "ml", "IFN", "-", "γ", "plus", "20", "μM", "z", "-", "VAD", "for", "24", "h", ".", "Identical", "concentrations", "were", "used", "in", "later", "experiments", "unless", "otherwise", "stated", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "B", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", "(", "left", ")", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", "(", "middle", ")", "in", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "that", "were", "treated", "with", "PBS", "or", "IFN", "-", "γ", "for", "24", "h", ".", "The", "corresponding", "western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "C", ",", "D", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "(", "C", ")", "and", "HT", "-", "29", "cells", "(", "D", ")", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "exposed", "to", "S", "+", "Z", "or", "IFN", "-", "γ", "+", "S", "+", "Z", "for", "24", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", "(", "left", ")", ".", "The", "corresponding", "western", "blotting", "analysis", "of", "MLKL", "and", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "E", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "miR", "-", "324", "-", "5p", "in", "miR", "-", "324", "-", "5p", "knockout", "HT", "-", "29", "cells", "(", "miR", "-", "324", "-", "5p", "-", "/", "-", "cells", ")", ".", "Altered", "miR", "-", "324", "-", "5p", "DNA", "sequences", "were", "shown", "in", "miR", "-", "324", "-", "5p", "-", "/", "-", "clone", "19", "#", "and", "36", "#", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "F", "MiR", "-", "324", "-", "5p", "+", "/", "+", "HT", "-", "29", ",", "miR", "-", "324", "-", "5p", "-", "/", "-", "-", "19", "#", ",", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", "-", "/", "-", "-", "36", "#", "cells", "were", "treated", "with", "T", "+", "S", "+", "Z", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "G", ",", "H", "MiR", "-", "324", "-", "5p", "+", "/", "+", "HT", "-", "29", ",", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", "-", "/", "-", "HT", "-", "29", "cells", "were", "treated", "with", "IFN", "-", "β", "(", "G", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "H", ")", "plus", "20", "μM", "z", "-", "VAD", "for", "24", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A U937 cells were transfected with NC, siMLKL-3'UTR, or miR-324-5p. After 48 h, cells were exposed to 100 ng/ml IFN-γ plus 20 μM z-VAD for 24 h. Identical concentrations were used in later experiments unless otherwise stated. Cell viability was determined by measuring ATP levels. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.B qPCR analysis for the expression of MLKL (left) and miR-324-5p (middle) in PBMC-derived macrophages that were treated with PBS or IFN-γ for 24 h. The corresponding western blotting analysis of MLKL and β-actin (right). Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.C, D PBMC-derived macrophages (C) and HT-29 cells (D) were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p. After 48 h, cells were exposed to S+Z or IFN-γ+S+Z for 24 h. Cell viability was determined by measuring ATP levels (left). The corresponding western blotting analysis of MLKL and β-actin (right). Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.E qPCR analysis for the expression of miR-324-5p in miR-324-5p knockout HT-29 cells (miR-324-5p-/- cells) . Altered miR-324-5p DNA sequences were shown in miR-324-5p-/- clone 19# and 36#. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.F MiR-324-5p+/+ HT-29, miR-324-5p-/- -19# , and miR-324-5p-/- -36# cells were treated with T+S+Z for the indicated times. Cell viability was determined by measuring ATP levels. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.G, H MiR-324-5p+/+ HT-29, and miR-324-5p-/- HT-29 cells were treated with IFN-β (G) or IFN-γ (H) plus 20 μM z-VAD for 24 h. Cell viability was determined by measuring ATP levels. Data information: Data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown."}
{"words": ["Figure", "7A", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "IFN", "-", "β", "(", "left", ")", "and", "IFN", "-", "γ", "(", "right", ")", "in", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "that", "were", "infected", "with", "IAV", "(", "H1N1", "strain", "PR8", ")", "at", "an", "multiplicity", "of", "infection", "(", "MOI", ")", "of", "0", ".", "2", "for", "24", "h", ".", "B", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "MLKL", "(", "left", ")", "and", "miR", "-", "324", "-", "5p", "(", "right", ")", "in", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "that", "were", "treated", "with", "the", "300nM", "ruxolitinib", "for", "2", "h", "prior", "to", "the", "infection", "with", "IAV", "(", "MOI", "=", "0", ".", "2", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "C", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", ",", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", ".", "After", "48h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "S", "+", "Z", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "IAV", "(", "MOI", "=", "0", ".", "2", ")", "for", "24", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "measuring", "ATP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", ".", "D", "qPCR", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "M", "gene", "of", "IAV", "in", "PBMC", "-", "derived", "macrophages", "that", "were", "transfected", "with", "NC", ",", "siMLKL", "or", "miR", "-", "324", "-", "5p", "for", "48h", ",", "followed", "by", "the", "infection", "with", "IAV", "(", "MOI", "=", "0", ".", "2", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "represented", "as", "the", "means", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "at", "least", "three", "times", ",", "and", "representative", "data", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A qPCR analysis for the expression of IFN-β (left) and IFN-γ (right) in PBMC-derived macrophages that were infected with IAV (H1N1 strain PR8) at an multiplicity of infection (MOI) of 0.2 for 24 h. B qPCR analysis for the expression of MLKL (left) and miR-324-5p (right) in PBMC-derived macrophages that were treated with the 300nM ruxolitinib for 2 h prior to the infection with IAV (MOI=0.2) for 24 h. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.C PBMC-derived macrophages were transfected with NC, siMLKL, or miR-324-5p. After 48h, cells were treated with S+Z in the presence or absence of IAV (MOI=0.2) for 24 h. Cell viability was determined by measuring ATP levels. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown.D qPCR analysis for the expression of M gene of IAV in PBMC-derived macrophages that were transfected with NC, siMLKL or miR-324-5p for 48h, followed by the infection with IAV (MOI=0.2) for 24 h. Data information: data are represented as the means ± SD of three biological replicates. Statistical analyses were performed using unpaired Student's t-test. All experiments were performed at least three times, and representative data are shown."}
{"words": ["Figure", "1A", "Freeze", "-", "fracture", "electron", "micrograph", "of", "wild", "-", "type", "yeast", "treated", "with", "DTT", "for", "3", "h", ".", "The", "left", "panel", "shows", "two", "spherical", "structures", ",", "one", "in", "a", "vacuole", "membrane", "invagination", "and", "one", "inside", "the", "vacuole", ".", "The", "middle", "panel", "shows", "the", "boxed", "area", "of", "the", "left", "panel", "at", "higher", "magnification", ".", "Arrows", "indicate", "membrane", "layers", "that", "are", "free", "of", "intramembrane", "particles", ".", "The", "right", "panel", "shows", "the", "protoplasmic", "fracture", "face", "(", "P", "face", ")", "of", "cortical", "ER", "with", "a", "high", "density", "of", "intramembrane", "particles", ".", "Cy", ",", "cytosol", ";", "N", ",", "nucleus", ";", "V", ",", "vacuole", ".", "B", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "GPD", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", "and", "the", "ER", "marker", "Sec63", "-", "mCherry", "and", "stained", "with", "CMAC", "to", "label", "the", "vacuole", ".", "The", "upper", "and", "lower", "panel", "show", "vacuole", "-", "associated", "and", "perinuclear", "GFP", "-", "Pho8", "stretches", "and", "an", "intravacuolar", "GFP", "-", "Pho8", "ring", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", ".", "C", "Correlative", "light", "and", "electron", "microscopy", "of", "cells", "expressing", "GPD", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", "and", "Sec63", "-", "mCherry", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "boxed", "area", "in", "the", "electron", "micrograph", "at", "higher", "magnification", ".", "The", "ER", "ring", "corresponds", "to", "a", "vacuolar", "whorl", "and", "the", "ER", "stretch", "to", "a", "perinuclear", "stack", ".", "D", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Hmg2", "-", "GFP", "and", "either", "additionally", "expressing", "Sec63", "-", "mCherry", "or", "stained", "with", "CMAC", ".", "The", "upper", "and", "lower", "panel", "show", "cytosolic", "and", "vacuolar", "Hmg2", "-", "GFP", "rings", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Freeze-fracture electron micrograph of wild-type yeast treated with DTT for 3 h. The left panel shows two spherical structures, one in a vacuole membrane invagination and one inside the vacuole. The middle panel shows the boxed area of the left panel at higher magnification. Arrows indicate membrane layers that are free of intramembrane particles. The right panel shows the protoplasmic fracture face (P face) of cortical ER with a high density of intramembrane particles. Cy, cytosol; N, nucleus; V, vacuole.B Fluorescence images of cells expressing GPD promoter-driven GFP-Pho8 and the ER marker Sec63-mCherry and stained with CMAC to label the vacuole. The upper and lower panel show vacuole-associated and perinuclear GFP-Pho8 stretches and an intravacuolar GFP-Pho8 ring, respectively. Scale bars: 2 µm.C Correlative light and electron microscopy of cells expressing GPD promoter-driven GFP-Pho8 and Sec63-mCherry. The lower panel shows the boxed area in the electron micrograph at higher magnification. The ER ring corresponds to a vacuolar whorl and the ER stretch to a perinuclear stack.D Fluorescence images of cells expressing Hmg2-GFP and either additionally expressing Sec63-mCherry or stained with CMAC. The upper and lower panel show cytosolic and vacuolar Hmg2-GFP rings, respectively. Scale bars: 2 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Individual", "frames", "from", "time", "-", "lapse", "imaging", "of", "a", "cell", "expressing", "GAL", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", "and", "stained", "with", "the", "vacuole", "membrane", "dye", "FM4", "-", "64", ".", "Numbers", "indicate", "the", "time", "in", "minutes", "after", "the", "start", "of", "the", "image", "sequence", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "B", "Electron", "micrograph", "of", "a", "cell", "expressing", "GPD", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", ".", "Arrows", "indicate", "the", "edges", "of", "ER", "cisternae", "that", "are", "part", "of", "a", "bent", "stack", "in", "a", "vacuole", "membrane", "invagination", ".", "Black", "arrowheads", "point", "to", "vacuole", "membrane", "that", "encases", "the", "bent", "stack", "and", "the", "whorl", ".", "C", "Fraction", "of", "uptake", "intermediates", "that", "were", "converted", "into", "vacuolar", "whorls", "or", "stacks", ".", "n", "=", "43", ".", "The", "image", "sequence", "shows", "formation", "of", "a", "vacuolar", "whorl", "that", "becomes", "a", "cytosolic", "whorl", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Individual frames from time-lapse imaging of a cell expressing GAL promoter-driven GFP-Pho8 and stained with the vacuole membrane dye FM4-64. Numbers indicate the time in minutes after the start of the image sequence. Scale bar: 2 µm.B Electron micrograph of a cell expressing GPD promoter-driven GFP-Pho8. Arrows indicate the edges of ER cisternae that are part of a bent stack in a vacuole membrane invagination. Black arrowheads point to vacuole membrane that encases the bent stack and the whorl.C Fraction of uptake intermediates that were converted into vacuolar whorls or stacks. n = 43.The image sequence shows formation of a vacuolar whorl that becomes a cytosolic whorl. Scale bar: 2 µm."}
{"words": ["Figure", "3Fluorescence", "images", "of", "∆", "atg7", "and", "∆", "atg8", "cells", "(", "A", ")", "expressing", "GAL", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", "and", "the", "ER", "marker", "Sec63", "-", "mCherry", "and", "stained", "with", "CMAC", "to", "label", "the", "vacuole", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "Fluorescence", "images", "of", "∆", "snf7", "and", "∆", "vps4", "cells", "(", "B", ")", "expressing", "GAL", "promoter", "-", "driven", "GFP", "-", "Pho8", "and", "the", "ER", "marker", "Sec63", "-", "mCherry", "and", "stained", "with", "CMAC", "to", "label", "the", "vacuole", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "C", "Relative", "activity", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "Yop1", "-", "Pho8", "∆", "60", "in", "tunicamycin", "-", "treated", "cells", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "activity", "in", "∆", "atg7", "cells", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "≥", "3", ".", "D", ",", "E", "Relative", "activity", "of", "endogenous", "Pho8", "in", "untreated", "cells", "(", "D", ")", "or", "after", "tunicamycin", "treatment", "(", "E", ")", ".", "Background", "activity", "determined", "in", "∆", "pho8", "mutants", "was", "subtracted", "from", "the", "activity", "in", "all", "other", "strains", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "=", "3", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ".", "F", "Western", "blot", "of", "GFP", "from", "cells", "expressing", "Sec63", "-", "GFP", "and", "treated", "with", "tunicamycin", "(", "Tm", ")", "where", "indicated", ".", "The", "two", "Atg7", "-", "independent", "cleavage", "products", "of", "around", "55", "kDa", "were", "used", "as", "readout", "for", "micro", "-", "ER", "-", "phagy", ".", "Pgk1", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "G", "Quantification", "of", "Sec63", "-", "GFP", "cleavage", "normalized", "to", "the", "WT", "from", "western", "blots", "as", "shown", "in", "panel", "(", "F", ")", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "=", "4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Fluorescence images of ∆atg7 and ∆atg8 cells (A) expressing GAL promoter-driven GFP-Pho8 and the ER marker Sec63-mCherry and stained with CMAC to label the vacuole. Scale bar: 2 µm.Fluorescence images of ∆snf7 and ∆vps4 cells (B) expressing GAL promoter-driven GFP-Pho8 and the ER marker Sec63-mCherry and stained with CMAC to label the vacuole. Scale bar: 2 µm.C Relative activity of the ER-phagy reporter Yop1-Pho8∆60 in tunicamycin-treated cells. The dotted line indicates the activity in ∆atg7 cells. Mean + SEM, n ≥ 3.D, E Relative activity of endogenous Pho8 in untreated cells (D) or after tunicamycin treatment (E). Background activity determined in ∆pho8 mutants was subtracted from the activity in all other strains. Mean + SEM, n = 3. WT, wild-type.F Western blot of GFP from cells expressing Sec63-GFP and treated with tunicamycin (Tm) where indicated. The two Atg7-independent cleavage products of around 55 kDa were used as readout for micro-ER-phagy. Pgk1 served as a loading control. G Quantification of Sec63-GFP cleavage normalized to the WT from western blots as shown in panel (F). Mean + SEM, n = 4. "}
{"words": ["Figure", "4A", "Electron", "micrograph", "of", "wild", "-", "type", "yeast", "treated", "with", "DTT", "for", "3", "h", ".", "Inset", "1", "shows", "an", "ER", "whorl", "and", "inset", "2", "shows", "ER", "fragments", "in", "macroautophagic", "bodies", "(", "white", "arrows", ")", ".", "Cy", ",", "cytosol", ";", "V", ",", "vacuole", ".", "B", "Relative", "activity", "of", "cyto", "-", "Pho8", "∆", "60", "after", "nitrogen", "starvation", ",", "which", "reports", "on", "non", "-", "selective", "macroautophagy", "of", "cytosol", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "≥", "3", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ".", "Relative", "activity", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "Yop1", "-", "Pho8", "∆", "60", "after", "nitrogen", "starvation", "(", "C", ")", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "≥", "3", ".", "Relative", "activity", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "Yop1", "-", "Pho8", "∆", "60", "after", "tunicamycin", "treatment", "(", "D", ",", "E", ")", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "≥", "3", ".", "F", ",", "G", "Growth", "assays", "of", "untreated", "and", "tunicamycin", "-", "treated", "WT", ",", "∆", "atg39", "/", "40", ",", "∆", "snf7", "and", "∆", "snf7", "∆", "atg39", "/", "40", "cells", ".", "Numbers", "indicate", "growth", "relative", "to", "WT", "cells", "based", "on", "the", "areas", "under", "the", "curves", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Electron micrograph of wild-type yeast treated with DTT for 3 h. Inset 1 shows an ER whorl and inset 2 shows ER fragments in macroautophagic bodies (white arrows). Cy, cytosol; V, vacuole.B Relative activity of cyto-Pho8∆60 after nitrogen starvation, which reports on non-selective macroautophagy of cytosol. Mean + SEM, n ≥ 3. WT, wild-type.Relative activity of the ER-phagy reporter Yop1-Pho8∆60 after nitrogen starvation (C) Mean + SEM, n ≥ 3.Relative activity of the ER-phagy reporter Yop1-Pho8∆60 after tunicamycin treatment (D, E). Mean + SEM, n ≥ 3.F, G Growth assays of untreated and tunicamycin-treated WT, ∆atg39/40, ∆snf7 and ∆snf7 ∆atg39/40 cells. Numbers indicate growth relative to WT cells based on the areas under the curves. Mean ± SEM, n = 3."}
{"words": ["Figure", "5A", "Fraction", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "∆", "vps23", ",", "∆", "snf7", "and", "∆", "vps4", "cells", "with", "GFP", "-", "Pho8", "structures", ".", "Mean", "+", "SEM", ",", "n", "≥", "3", ".", "B", "Fraction", "of", "GFP", "-", "Pho8", "structures", "classified", "as", "stacks", ",", "cytosolic", "whorls", ",", "uptake", "intermediates", "or", "vacuolar", "whorls", ".", "The", "number", "of", "GFP", "-", "Pho8", "structures", "in", "WT", ",", "∆", "vps23", ",", "∆", "snf7", "and", "∆", "vps4", "cells", "was", "562", ",", "345", ",", "367", "and", "449", ",", "respectively", ".", "The", "table", "shows", "the", "results", "of", "Chi", "-", "Square", "tests", "for", "independence", "for", "all", "pairs", "of", "strains", ".", "*", "*", "*", ",", "highly", "significant", "(", "P", "<", "0", ".", "00001", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "C", "Fraction", "of", "stacks", "classified", "as", "peripheral", ",", "perinuclear", "or", "vacuole", "-", "associated", ".", "The", "number", "of", "stacks", "in", "WT", "and", "∆", "snf7", "cells", "was", "252", "and", "351", ",", "respectively", ".", "The", "observed", "distributions", "in", "the", "two", "strains", "were", "analyzed", "with", "a", "Chi", "-", "Square", "test", "for", "independence", ".", "*", "*", "*", ",", "highly", "significant", "(", "P", "<", "0", ".", "00001", ")", ".", "Fluorescence", "images", "of", "a", "cell", "expressing", "non", "-", "fluorescent", "GFP", "(", "Y66F", ")", "-", "Pho8", ",", "Snf7", "-", "mNeonGreen", "and", "the", "ER", "marker", "mCherry", "-", "Ubc6", ",", "and", "stained", "with", "the", "vacuole", "dye", "CMAC", ".", "Numbers", "indicate", "the", "time", "in", "minutes", "after", "the", "start", "of", "the", "image", "sequence", ".", "White", "arrows", "indicate", "a", "Snf7", "-", "mNeonGreen", "punctum", "adjacent", "to", "an", "ER", "whorl", ".", "Black", "arrow", "point", "to", "a", "vacuole", "membrane", "invagination", ".", "In", "this", "series", ",", "mNeonGreen", "fluorescence", "was", "adjusted", "differently", "for", "different", "time", "points", "to", "compensate", "signal", "decay", "over", "time", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "Fluorescence", "images", "of", "a", "cell", "expressing", "non", "-", "fluorescent", "GFP", "(", "Y66F", ")", "-", "Pho8", ",", "Snf7", "-", "mNeonGreen", "and", "the", "ER", "marker", "mCherry", "-", "Ubc6", ",", "and", "stained", "with", "the", "vacuole", "dye", "CMAC", ".", "Numbers", "indicate", "the", "time", "in", "minutes", "after", "the", "start", "of", "the", "image", "sequence", ".", "White", "arrows", "indicate", "a", "Snf7", "-", "mNeonGreen", "punctum", "adjacent", "to", "an", "ER", "whorl", ".", "Black", "arrow", "point", "to", "a", "vacuole", "membrane", "invagination", ".", "Panel", "(", "E", ")", "illustrates", "transient", "appearance", "of", "Snf7", "at", "an", "ER", "whorl", ".", "Panel", "(", "F", ")", "illustrates", "orientation", "of", "a", "Snf7", "punctum", "towards", "the", "neck", "of", "a", "vacuole", "membrane", "invagination", ".", "In", "this", "series", ",", "mNeonGreen", "fluorescence", "was", "adjusted", "differently", "for", "different", "time", "points", "to", "compensate", "signal", "decay", "over", "time", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Fraction of wild-type (WT), ∆vps23, ∆snf7 and ∆vps4 cells with GFP-Pho8 structures. Mean + SEM, n ≥ 3.B Fraction of GFP-Pho8 structures classified as stacks, cytosolic whorls, uptake intermediates or vacuolar whorls. The number of GFP-Pho8 structures in WT, ∆vps23, ∆snf7 and ∆vps4 cells was 562, 345, 367 and 449, respectively. The table shows the results of Chi-Square tests for independence for all pairs of strains. ***, highly significant (P < 0.00001); ns, not significant (P > 0.05).C Fraction of stacks classified as peripheral, perinuclear or vacuole-associated. The number of stacks in WT and ∆snf7 cells was 252 and 351, respectively. The observed distributions in the two strains were analyzed with a Chi-Square test for independence. ***, highly significant (P < 0.00001).Fluorescence images of a cell expressing non-fluorescent GFP(Y66F)-Pho8, Snf7-mNeonGreen and the ER marker mCherry-Ubc6, and stained with the vacuole dye CMAC. Numbers indicate the time in minutes after the start of the image sequence. White arrows indicate a Snf7-mNeonGreen punctum adjacent to an ER whorl. Black arrow point to a vacuole membrane invagination. In this series, mNeonGreen fluorescence was adjusted differently for different time points to compensate signal decay over time. Scale bar: 2 µm.Fluorescence images of a cell expressing non-fluorescent GFP(Y66F)-Pho8, Snf7-mNeonGreen and the ER marker mCherry-Ubc6, and stained with the vacuole dye CMAC. Numbers indicate the time in minutes after the start of the image sequence. White arrows indicate a Snf7-mNeonGreen punctum adjacent to an ER whorl. Black arrow point to a vacuole membrane invagination. Panel (E) illustrates transient appearance of Snf7 at an ER whorl. Panel (F) illustrates orientation of a Snf7 punctum towards the neck of a vacuole membrane invagination. In this series, mNeonGreen fluorescence was adjusted differently for different time points to compensate signal decay over time. Scale bar: 2 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", "Electron", "micrographs", "of", "wild", "-", "type", "and", "∆", "snf7", "cells", "treated", "with", "DTT", "for", "3", "h", ".", "Cy", ",", "cytosol", ";", "V", ",", "vacuole", ".", "Scale", "bars", ":", "300", "nm", ".", "B", "Quantification", "of", "vacuolar", "whorls", "for", "which", "the", "uptake", "process", "was", "complete", "or", "incomplete", ".", "The", "observed", "distributions", "in", "the", "two", "strains", "were", "analyzed", "with", "a", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "C", ",", "D", "Electron", "micrographs", "of", "serial", "thin", "sections", "of", "a", "∆", "snf7", "cell", "(", "C", ")", "or", "a", "wild", "-", "type", "cell", "(", "D", ")", "treated", "with", "DTT", "for", "3", "h", ".", "Note", "that", "the", "whorl", "appears", "separated", "from", "the", "cytosol", "in", "some", "sections", "(", "e", ".", "g", ".", "section", "300", "nm", ")", "but", "is", "still", "in", "contact", "with", "the", "cytosol", "(", "see", "sections", "600", "nm", "and", "700", "nm", ")", ".", "In", "the", "wild", "-", "type", "cell", "(", "D", ")", ",", "the", "vacuolar", "whorl", "is", "completely", "separated", "from", "the", "cytosol", ".", "Scale", "bar", ":", "300", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Electron micrographs of wild-type and ∆snf7 cells treated with DTT for 3 h. Cy, cytosol; V, vacuole. Scale bars: 300 nm.B Quantification of vacuolar whorls for which the uptake process was complete or incomplete. The observed distributions in the two strains were analyzed with a Fisher's exact test.C, D Electron micrographs of serial thin sections of a ∆snf7 cell (C) or a wild-type cell (D) treated with DTT for 3 h. Note that the whorl appears separated from the cytosol in some sections (e.g. section 300 nm) but is still in contact with the cytosol (see sections 600 nm and 700 nm). In the wild-type cell (D), the vacuolar whorl is completely separated from the cytosol. Scale bar: 300 nm."}
{"words": ["Figure", "1Callus", ",", "de", "novo", "shoot", ",", "and", "root", "formation", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ";", "Col", ")", ",", "hag1", "-", "6", ",", "hag1", "-", "7", ",", "and", "35S", ":", ":", "FLAG", ":", "HAG1", "hag1", "-", "7", "root", "explants", ".", "Root", "explants", "were", "transferred", "onto", "CIM", "for", "1", "week", "(", "w", ")", "and", "then", "transferred", "onto", "fresh", "CIM", ",", "SIM", ",", "or", "RIM", "for", "callus", ",", "de", "novo", "shoot", ",", "or", "root", "induction", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Graph", "on", "the", "right", "shows", "the", "percentage", "of", "explants", "with", "shoots", "formed", "as", "scored", "at", "18", "days", "(", "d", ")", "on", "SIM", ".", "36", "explants", "of", "each", "genotype", "were", "used", "for", "scoring", ".", "Shoot", "regeneration", "assay", "using", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "root", "explants", "on", "media", "with", "different", "cytokinin", "(", "2IP", ")", "to", "auxin", "(", "IAA", ")", "ratios", ".", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "root", "explants", "derived", "from", "20", "seedlings", "were", "first", "incubated", "on", "CIM", "for", "2", "weeks", "and", "then", "transferred", "onto", "150", "mg", "/", "ml", "IAA", "-", "containing", "media", "supplemented", "with", "0", ",", "500", ",", "or", "5", ",", "000", "mg", "/", "ml", "2IP", ".", "Pictures", "were", "taken", "at", "27", "d", "after", "transfer", "onto", "each", "media", "using", "representative", "explants", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "mm", ".", "Root", "explant", "-", "derived", "calli", "of", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "at", "4", "w", "on", "CIM", "(", "left", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "4", "-", "w", "-", "old", "calli", "derived", "from", "30", "seedling", "roots", "of", "each", "genotype", "were", "collected", "to", "measure", "callus", "fresh", "weight", "(", "right", ")", ".", "Histochemical", "GUS", "staining", "of", "CYCB1", ";", "1", ":", "GUS", "in", "Col", "(", "left", ")", "and", "CYCB1", ";", "1", ":", "GUS", "in", "hag1", "-", "6", ".", "Shown", "are", "root", "explants", "at", "4", "d", "on", "CIM", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "Statistic", "chart", "of", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "roots", "(", "R", ")", ",", "4", "d", "CIM", "-", "incubated", "root", "explants", "(", "C", ")", ",", "4", "d", "CIM", "-", "incubated", "+", "2", "d", "SIM", "-", "incubated", "root", "explants", "(", "S", ")", ",", "and", "4", "d", "CIM", "-", "incubated", "+", "2", "w", "SIM", "-", "incubated", "root", "explants", "(", "S2W", ")", ".", "Green", ":", "up", "-", "regulated", "genes", ",", "log2", "ratio", "≥", "1", ";", "red", ":", "down", "-", "regulated", "genes", ",", "log2", "ratio", "≤", "-", "1", ";", "FDR", "<", "0", ".", "01", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "HAG1", ":", "HA", "protein", ".", "Samples", "are", "as", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "1", "w", "CIM", "-", "incubated", "Col", "root", "explants", "(", "Col", ")", "were", "used", "as", "negative", "control", ".", "Ponceau", "staining", "was", "performed", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Callus, de novo shoot, and root formation in wild-type (WT; Col), hag1-6, hag1-7, and 35S::FLAG:HAG1 hag1-7 root explants. Root explants were transferred onto CIM for 1 week (w) and then transferred onto fresh CIM, SIM, or RIM for callus, de novo shoot, or root induction, respectively. Scale bar: 1 cm. Graph on the right shows the percentage of explants with shoots formed as scored at 18 days (d) on SIM. 36 explants of each genotype were used for scoring.Shoot regeneration assay using Col and hag1-6 root explants on media with different cytokinin (2IP) to auxin (IAA) ratios. Col and hag1-6 root explants derived from 20 seedlings were first incubated on CIM for 2 weeks and then transferred onto 150 mg/ml IAA-containing media supplemented with 0, 500, or 5,000 mg/ml 2IP. Pictures were taken at 27 d after transfer onto each media using representative explants. Scale bar: 2 mm.Root explant-derived calli of Col and hag1-6 at 4 w on CIM (left). Scale bar: 1 mm. 4-w-old calli derived from 30 seedling roots of each genotype were collected to measure callus fresh weight (right).Histochemical GUS staining of CYCB1;1:GUS in Col (left) and CYCB1;1:GUS in hag1-6. Shown are root explants at 4 d on CIM. Scale bar: 1 mm.Statistic chart of differentially expressed genes (DEGs) in Col and hag1-6 roots (R), 4 d CIM-incubated root explants (C), 4 d CIM-incubated + 2 d SIM-incubated root explants (S), and 4 d CIM-incubated + 2 w SIM-incubated root explants (S2W). Green: up-regulated genes, log2 ratio ≥ 1; red: down-regulated genes, log2 ratio ≤ -1; FDR < 0.01.Immunoblot analysis of HAG1:HA protein. Samples are as described in (E). 1 w CIM-incubated Col root explants (Col) were used as negative control. Ponceau staining was performed as loading control."}
{"words": ["Figure", "2pWOX5", ":", ":", "GFP", "-", "ER", "expression", "in", "Col", "(", "WT", ")", "and", "hag1", "-", "6", "explants", "on", "CIM", "and", "SIM", ".", "Time", "points", "selected", "for", "observation", "are", "indicated", ".", "Cellular", "outlines", "were", "visualized", "with", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", "(", "red", ")", ".", "pSCR", ":", ":", "GFP", "-", "ER", "expression", "in", "Col", "(", "WT", ")", "and", "hag1", "-", "6", "explants", "on", "CIM", "and", "SIM", ".", "Time", "points", "selected", "for", "observation", "are", "indicated", ".", "Cellular", "outlines", "were", "visualized", "with", "PI", "staining", "(", "red", ")", ".", "pSCR", ":", ":", "GFP", "-", "ER", "expression", "in", "Col", "(", "WT", ")", "and", "hag1", "-", "6", "root", "tips", "at", "various", "time", "points", "on", "CIM", ".", "Time", "points", "selected", "for", "observation", "are", "indicated", ".", "Cellular", "outlines", "were", "visualized", "with", "PI", "staining", "(", "red", ")", ".", "WOX5", "transcript", "levels", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "hypocotyl", "(", "D", ")", "and", "cotyledon", "(", "E", ")", "explants", "at", "indicated", "days", "on", "CIM", ".", "SCR", "transcript", "levels", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "hypocotyl", "(", "F", ")", "and", "cotyledon", "(", "G", ")", "explants", "at", "indicated", "days", "on", "CIM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2pWOX5::GFP-ER expression in Col (WT) and hag1-6 explants on CIM and SIM. Time points selected for observation are indicated. Cellular outlines were visualized with propidium iodide (PI) staining (red).pSCR::GFP-ER expression in Col (WT) and hag1-6 explants on CIM and SIM. Time points selected for observation are indicated. Cellular outlines were visualized with PI staining (red).pSCR::GFP-ER expression in Col (WT) and hag1-6 root tips at various time points on CIM. Time points selected for observation are indicated. Cellular outlines were visualized with PI staining (red).WOX5 transcript levels in Col and hag1-6 hypocotyl (D) and cotyledon (E) explants at indicated days on CIM.SCR transcript levels in Col and hag1-6 hypocotyl (F) and cotyledon (G) explants at indicated days on CIM."}
{"words": ["Figure", "3H3Ac", "enrichment", "at", "the", "WOX5", "(", "A", ")", ",", "SCR", "(", "B", ")", ",", "PLT1", "(", "C", ")", ",", "and", "PLT2", "(", "D", ")", "loci", "in", "Col", "(", "upper", "black", "diagram", ")", "and", "hag1", "-", "6", "(", "lower", "red", "diagram", ")", "calli", "(", "1", "w", "CIM", ")", "as", "determined", "by", "ChIP", "seq", ".", "p", "-", "value", "cutoff", "for", "peak", "detection", "using", "MACS2", "was", "5e", "-", "2", "for", "WOX5", "(", "A", ")", "and", "1e", "-", "5", "for", "SCR", "(", "B", ")", ",", "PLT1", "(", "C", ")", ",", "and", "PLT2", "(", "D", ")", ".", "ChIP", "-", "seq", "data", "were", "visualized", "using", "Integrated", "Genome", "Browser", "(", "IGB", ";", "http", ":", "/", "/", "bioviz", ".", "org", "/", "igb", "/", "index", ".", "html", ")", ".", "The", "X", "and", "Y", "axis", "represent", "the", "genomic", "position", "of", "the", "corresponding", "gene", "and", "the", "number", "of", "overlapping", "reads", "per", "base", "pair", "position", ",", "respectively", ".", "Schematic", "representation", "of", "each", "locus", "is", "depicted", "at", "the", "bottom", ".", "Exons", "are", "indicated", "as", "boxes", "whereas", "intergenic", "sequences", "and", "introns", "are", "marked", "with", "lines", ".", "5", "'", "and", "3", "'", "UTRs", "are", "represented", "as", "gray", "boxes", ".", "Transcription", "start", "sites", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "H3Ac", "levels", "at", "the", "WOX5", "(", "E", ")", ",", "SCR", "(", "F", ")", ",", "PLT1", "(", "G", ")", ",", "and", "PLT2", "(", "H", ")", "loci", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", ".", "Root", "(", "R", ")", ",", "1", "w", "CIM", "(", "C", ")", ",", "and", "1", "w", "CIM", "+", "2", "w", "SIM", "(", "S", ")", "samples", "were", "used", "for", "assays", ".", "Direct", "targeting", "of", "HAG1", ":", "HA", "protein", "to", "WOX5", "(", "I", ")", ",", "SCR", "(", "J", ")", ",", "PLT1", "(", "K", ")", ",", "and", "PLT2", "(", "L", ")", "chromatin", "as", "determined", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3H3Ac enrichment at the WOX5 (A), SCR (B), PLT1 (C), and PLT2 (D) loci in Col (upper black diagram) and hag1-6 (lower red diagram) calli (1 w CIM) as determined by ChIP seq. p-value cutoff for peak detection using MACS2 was 5e-2 for WOX5 (A) and 1e-5 for SCR (B), PLT1 (C), and PLT2 (D). ChIP-seq data were visualized using Integrated Genome Browser (IGB; http://bioviz.org/igb/index.html). The X and Y axis represent the genomic position of the corresponding gene and the number of overlapping reads per base pair position, respectively. Schematic representation of each locus is depicted at the bottom. Exons are indicated as boxes whereas intergenic sequences and introns are marked with lines. 5' and 3' UTRs are represented as gray boxes. Transcription start sites are indicated with arrows.ChIP-qPCR analysis of H3Ac levels at the WOX5 (E), SCR (F), PLT1 (G), and PLT2 (H) loci in Col and hag1-6. Root (R), 1 w CIM (C), and 1 w CIM + 2 w SIM (S) samples were used for assays.Direct targeting of HAG1:HA protein to WOX5 (I), SCR (J), PLT1 (K), and PLT2 (L) chromatin as determined by ChIP-qPCR."}
{"words": ["Figure", "4Transcript", "levels", "of", "WOX7", "(", "A", ")", "and", "WOX14", "(", "B", ")", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "roots", "(", "R", ")", ",", "4", "d", "CIM", "explants", "(", "C", ")", ",", "4", "d", "CIM", "+", "2", "d", "SIM", "explants", "(", "S", ")", ",", "and", "4", "d", "CIM", "+", "2", "w", "SIM", "explants", "(", "S2W", ")", ".", "Levels", "of", "Col", "R", "were", "set", "to", "1", "after", "normalization", "with", "UBQ10", ".", "De", "novo", "shoot", "regeneration", "of", "Col", ",", "Nossen", "(", "No", ")", ",", "wox5", "-", "3", ",", "wox7", "-", "1", ",", "wox14", "-", "1", ",", "and", "wox5", "-", "3", "wox7", "-", "1", "wox14", "-", "1", "root", "explants", ".", "Col", "is", "the", "WT", "control", "for", "wox5", "-", "3", "and", "wox7", "-", "1", ",", "whereas", "No", "is", "the", "WT", "control", "for", "wox14", "-", "1", ".", "The", "picture", "was", "taken", "at", "3", "w", "on", "SIM", "using", "representative", "explants", "of", "each", "genotype", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Percentage", "of", "explants", "with", "shoots", "was", "scored", "at", "indicated", "weeks", "on", "SIM", "(", "D", ")", ".", "H3Ac", "enrichment", "at", "the", "WOX14", "locus", "in", "Col", "(", "upper", "black", "diagram", ")", "or", "hag1", "-", "6", "(", "lower", "red", "diagram", ")", "calli", "as", "determined", "by", "ChIP", "seq", ".", "p", "-", "value", "cutoff", "for", "peak", "detection", "using", "MACS2", "was", "1e", "-", "5", ".", "See", "Figs", "3A", "-", "D", "for", "schematic", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "H3Ac", "levels", "at", "the", "WOX14", "locus", "of", "Col", "and", "hag1", "-", "6", ".", "Regions", "tested", "are", "indicated", "in", "the", "schematic", "in", "(", "E", ")", ".", "Sample", "preparation", "and", "data", "presentation", "were", "performed", "as", "described", "in", "Figs", "3E", "-", "H", ".", "Direct", "targeting", "of", "HAG1", ":", "HA", "protein", "to", "WOX14", "chromatin", "as", "determined", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Transcript levels of WOX7 (A) and WOX14 (B) in Col and hag1-6 roots (R), 4 d CIM explants (C), 4 d CIM + 2 d SIM explants (S), and 4 d CIM + 2 w SIM explants (S2W). Levels of Col R were set to 1 after normalization with UBQ10.De novo shoot regeneration of Col, Nossen (No), wox5-3, wox7-1, wox14-1, and wox5-3 wox7-1 wox14-1 root explants. Col is the WT control for wox5-3 and wox7-1, whereas No is the WT control for wox14-1. The picture was taken at 3 w on SIM using representative explants of each genotype. Scale bar: 1 cm. Percentage of explants with shoots was scored at indicated weeks on SIM (D).H3Ac enrichment at the WOX14 locus in Col (upper black diagram) or hag1-6 (lower red diagram) calli as determined by ChIP seq. p-value cutoff for peak detection using MACS2 was 1e-5. See Figs 3A-D for schematic.ChIP-qPCR analysis of H3Ac levels at the WOX14 locus of Col and hag1-6. Regions tested are indicated in the schematic in (E). Sample preparation and data presentation were performed as described in Figs 3E-H.Direct targeting of HAG1:HA protein to WOX14 chromatin as determined by ChIP-qPCR."}
{"words": ["Figure", "5De", "novo", "shoot", "regeneration", "using", "Col", "and", "scr", "mutants", ";", "scr", "-", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "and", "scr", "-", "6", "(", "A", "and", "C", ")", ".", "Explants", "with", "shoots", "were", "scored", "at", "indicated", "days", "on", "SIM", "using", "Col", "and", "scr", "-", "3", "root", "explants", "that", "had", "been", "pre", "-", "incubated", "on", "CIM", "for", "2", "w", "(", "B", ")", "or", "Col", "and", "scr", "-", "6", "hypocotyl", "explants", "that", "had", "been", "pre", "-", "incubated", "on", "CIM", "for", "1", "w", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "De", "novo", "shoot", "regeneration", "of", "Col", ",", "wox5", "-", "3", ",", "scr", "-", "3", ",", "and", "wox5", "-", "3", "scr", "-", "3", ".", "The", "percentage", "of", "root", "explants", "with", "shoots", "(", "E", ")", "and", "the", "number", "of", "shoots", "per", "root", "explant", "(", "F", ")", "were", "scored", "at", "15", "d", "on", "SIM", ".", "The", "explants", "had", "been", "pre", "-", "incubated", "on", "CIM", "for", "2", "w", "before", "transfer", "onto", "SIM", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "cm", ".", "Transcript", "levels", "of", "PLT1", "(", "G", ")", "and", "PLT2", "(", "H", ")", "in", "Col", ",", "wox5", "-", "3", ",", "scr", "-", "3", ",", "and", "wox5", "-", "3", "scr", "-", "3", "roots", "(", "R", ")", ",", "1", "w", "CIM", "explants", "(", "C", ")", ",", "and", "1", "w", "CIM", "+", "2", "w", "SIM", "explants", "(", "S2W", ")", "as", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Levels", "of", "Col", "R", "were", "set", "to", "1", "after", "normalization", "with", "UBQ10", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5De novo shoot regeneration using Col and scr mutants; scr-3 (A and B) and scr-6 (A and C). Explants with shoots were scored at indicated days on SIM using Col and scr-3 root explants that had been pre-incubated on CIM for 2 w (B) or Col and scr-6 hypocotyl explants that had been pre-incubated on CIM for 1 w (C). Scale bar: 1 mm.De novo shoot regeneration of Col, wox5-3, scr-3, and wox5-3 scr-3. The percentage of root explants with shoots (E) and the number of shoots per root explant (F) were scored at 15 d on SIM. The explants had been pre-incubated on CIM for 2 w before transfer onto SIM. Scale bar: 1 cm.Transcript levels of PLT1 (G) and PLT2 (H) in Col, wox5-3, scr-3, and wox5-3 scr-3 roots (R), 1 w CIM explants (C), and 1 w CIM + 2 w SIM explants (S2W) as determined by RT-qPCR. Levels of Col R were set to 1 after normalization with UBQ10."}
{"words": ["Figure", "6Activation", "of", "WOX5", "by", "DEX", "treatment", "of", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", ".", "Root", "explants", "of", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "and", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "hag1", "-", "6", "were", "transferred", "onto", "the", "indicated", "combinations", "of", "CIM", "and", "SIM", "supplemented", "with", "or", "without", "20", "μM", "DEX", ".", "DEX", "was", "treated", "for", "3", "-", "d", "-", "pulse", "period", "on", "CIM", "or", "/", "and", "SIM", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", "for", "details", "and", "Appendix", "Fig", "S11A", "for", "schematics", "of", "the", "experimental", "procedure", ")", ".", "Morphology", "of", "shoots", "regenerated", "from", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "and", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "hag1", "-", "6", "root", "explants", "(", "A", ")", ".", "Explants", "with", "shoots", "were", "scored", "at", "3", "w", "after", "transfer", "onto", "SIM", "with", "or", "without", "DEX", "(", "B", ")", ".", "Activation", "of", "SCR", "by", "DEX", "treatment", "of", "UBI", ":", ":", "mCHERRY", "-", "GR", "-", "SCR", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", ".", "Activation", "of", "WOX5", "and", "SCR", "by", "DEX", "treatment", "of", "35S", ":", ":", "GVG", "-", "WOX5", "UBI", ":", ":", "mCHERRY", "-", "GR", "-", "SCR", "in", "Col", "and", "hag1", "-", "6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Activation of WOX5 by DEX treatment of 35S::GVG-WOX5 in Col and hag1-6. Root explants of 35S::GVG-WOX5 and 35S::GVG-WOX5 hag1-6 were transferred onto the indicated combinations of CIM and SIM supplemented with or without 20 μM DEX. DEX was treated for 3-d-pulse period on CIM or/and SIM (see Materials and Methods for details and Appendix Fig S11A for schematics of the experimental procedure). Morphology of shoots regenerated from 35S::GVG-WOX5 and 35S::GVG-WOX5 hag1-6 root explants (A). Explants with shoots were scored at 3 w after transfer onto SIM with or without DEX (B).Activation of SCR by DEX treatment of UBI::mCHERRY-GR-SCR in Col and hag1-6.Activation of WOX5 and SCR by DEX treatment of 35S::GVG-WOX5 UBI::mCHERRY-GR-SCR in Col and hag1-6."}
{"words": ["Figure", "1A", "The", "mRNA", "expression", "of", "FAM189A2", "/", "ENTREP", "in", "the", "primary", "human", "mammary", "epithelium", "HMEC", "and", "human", "breast", "cancer", "cell", "lines", ".", "In", "qRT", "-", "PCR", "analyses", ",", "the", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "immortalized", "normal", "human", "mammary", "epithelium", "HMEC4tertshp16", ".", "Relative", "expression", "ratios", "shown", "as", "mean", "+", "SD", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "B", "Relative", "expression", "of", "FAM189A2", "/", "ENTREP", "in", "the", "normal", "(", "white", ")", "and", "cancer", "(", "green", ")", "tissues", "of", "breast", "(", "Curtis", "Breast", ")", ",", "lung", "(", "Okayama", "Lung", ")", ",", "colorectal", "(", "TCGA", "Colorectal", ")", "and", "head", "and", "neck", "(", "Estilo", "Head", "-", "Neck", ")", ".", "Data", "were", "downloaded", "from", "the", "Oncomine", "database", "P", "-", "values", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "the", "number", "of", "cases", "are", "listed", "on", "the", "top", "and", "bottom", "of", "figures", ",", "respectively", ".", "P", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "Box", "-", "whisker", "plot", "represents", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "as", "a", "box", "and", "the", "median", "as", "a", "line", ".", "The", "maximn", "and", "minimun", "values", "within", "1", ".", "5", "x", "interquartile", "range", "are", "shown", "as", "whiskers", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "as", "dots", ".", "C", "Relative", "expression", "of", "FAM189A2", "/", "ENTREP", "in", "the", "primary", "(", "green", ")", "and", "the", "metastatic", "sites", "(", "blue", ")", "including", "lymph", "node", ",", "bone", ",", "liver", ",", "lung", ",", "soft", "tissues", "of", "prostatic", "cancer", "(", "Grasso", "Prostate", ")", "(", "left", ")", "and", "in", "the", "normal", "(", "white", ")", ",", "primary", "(", "green", ")", "and", "metastatic", "sites", "(", "three", "cases", "of", "sentinel", "lymph", "node", ")", "(", "blue", ")", "of", "breast", "cancer", "(", "TCGA", "Breast", ")", "(", "right", ")", ".", "Note", "that", "only", "three", "cases", "of", "the", "metastatic", "breast", "cancer", "were", "available", "in", "the", "dataset", ".", "Data", "were", "downloaded", "from", "the", "Oncomine", "database", "P", "-", "values", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "the", "number", "of", "cases", "are", "listed", "on", "the", "top", "and", "bottom", "of", "figures", ",", "respectively", ".", "P", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "Box", "-", "whisker", "plot", "represents", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "as", "a", "box", "and", "the", "median", "as", "a", "line", ".", "The", "maximn", "and", "minimun", "values", "within", "1", ".", "5", "x", "interquartile", "range", "are", "shown", "as", "whiskers", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "as", "dots", ".", "D", "-", "F", "Relapse", "-", "free", "survival", "(", "RFS", ")", "of", "breast", "cancer", "patients", ".", "Data", "were", "downloaded", "from", "the", "Kaplan", "-", "Meier"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A The mRNA expression of FAM189A2/ENTREP in the primary human mammary epithelium HMEC and human breast cancer cell lines. In qRT-PCR analyses, the expression was normalized to the immortalized normal human mammary epithelium HMEC4tertshp16. Relative expression ratios shown as mean + SD from three biological replicates.B Relative expression of FAM189A2/ENTREP in the normal (white) and cancer (green) tissues of breast (Curtis Breast), lung (Okayama Lung), colorectal (TCGA Colorectal) and head and neck (Estilo Head-Neck). Data were downloaded from the Oncomine database P-values obtained by Student's t-tests and the number of cases are listed on the top and bottom of figures, respectively. P < 0.05 was considered as statistically significant. Box-whisker plot represents the interquartile range (25th and 75th percentiles) as a box and the median as a line. The maximn and minimun values within 1.5 x interquartile range are shown as whiskers. Outlier data are plotted as dots. C Relative expression of FAM189A2/ENTREP in the primary (green) and the metastatic sites (blue) including lymph node, bone, liver, lung, soft tissues of prostatic cancer (Grasso Prostate) (left) and in the normal (white), primary (green) and metastatic sites (three cases of sentinel lymph node) (blue) of breast cancer (TCGA Breast) (right). Note that only three cases of the metastatic breast cancer were available in the dataset. Data were downloaded from the Oncomine database P-values obtained by Student's t-tests and the number of cases are listed on the top and bottom of figures, respectively. P < 0.05 was considered as statistically significant. Box-whisker plot represents the interquartile range (25th and 75th percentiles) as a box and the median as a line. The maximn and minimun values within 1.5 x interquartile range are shown as whiskers. Outlier data are plotted as dots.D-F Relapse-free survival (RFS) of breast cancer patients. Data were downloaded from the Kaplan-Meier plotter"}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "C", "The", "immunoprecipitation", "analysis", ".", "Co", "-", "precipitation", "was", "impaired", "by", "either", "the", "WW", "domain", "deletion", "of", "ITCH", "or", "the", "mutation", "in", "the", "PPxY", "motifs", "of", "ENTREP", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "IB", ",", "immunoblot", ".", "E", "Representative", "images", "of", "the", "proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "using", "Cos7", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", ".", "PLA", "signals", ",", "granular", "dots", "of", "green", "color", ",", "were", "presented", "with", "DAPI", "images", ".", "Arrowheads", ",", "the", "plasma", "membrane", ".", "Scale", "bar", ",", "10mm", ".", "F", "The", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "presentation", "of", "the", "PLA", ".", "A", "minimum", "of", "10", "cells", "per", "condition", "were", "counted", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "P", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Box", "-", "whisker", "plot", "represents", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "as", "a", "box", "and", "the", "median", "as", "a", "line", ".", "The", "maximn", "and", "minimun", "values", "within", "1", ".", "5", "x", "interquartile", "range", "are", "shown", "as", "whiskers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, C The immunoprecipitation analysis. Co-precipitation was impaired by either the WW domain deletion of ITCH or the mutation in the PPxY motifs of ENTREP. Data shown are representative of at least two independent experiments. IP, immunoprecipitation; IB, immunoblot.E Representative images of the proximity ligation assay (PLA) using Cos7 cells transfected with indicated vectors. PLA signals, granular dots of green color, were presented with DAPI images. Arrowheads, the plasma membrane. Scale bar, 10mm. F The box-and-whisker plot presentation of the PLA. A minimum of 10 cells per condition were counted from two independent experiments. P-values obtained by Student's t-tests and P < 0.05 was considered as statistically significant. * P < 0.05. Box-whisker plot represents the interquartile range (25th and 75th percentiles) as a box and the median as a line. The maximn and minimun values within 1.5 x interquartile range are shown as whiskers."}
{"words": ["Figure", "3A", "The", "nickel", "-", "pull", "down", "assay", "using", "myc", "/", "HIS", "-", "tagged", "ENTREP", "along", "with", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", ".", "Arrows", "indicate", "HA", "-", "ubiquitin", "-", "incorporating", "ENTREP", ".", "Arrowhead", "indicates", "ENTREP", "without", "ubiquitination", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A The nickel-pull down assay using myc/HIS-tagged ENTREP along with HA-tagged ubiquitin. Arrows indicate HA-ubiquitin-incorporating ENTREP. Arrowhead indicates ENTREP without ubiquitination. Data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", "The", "immunoprecipitation", "analysis", ".", "The", "cytoplasmic", "ENTREP", "(", "wild", "or", "mut1", "+", "2", "mutant", ")", "co", "-", "precipitated", "with", "EPN1myc", "in", "the", "presence", "of", "ITCH", "wild", "or", "C830A", ".", "The", "blot", "bands", "were", "semi", "-", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "ENTREP", "ratio", "was", "caluculated", "as", "a", "ratio", "of", "ENTREP", "in", "the", "myc", "-", "coprecipitaed", "sample", "to", "that", "of", "the", "total", "lysate", ".", "The", "ratios", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "P", "-", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "P", "<", "0", ".", "005", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "No", "significant", "difference", "was", "observed", ".", "B", "Representative", "images", "of", "the", "proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "using", "Cos7", "cells", "transfected", "with", "indicated", "vectors", ".", "PLA", "signals", ",", "granular", "dots", "of", "green", "color", ",", "were", "presented", "with", "DAPI", "images", ".", "Scale", "bar", ",", "10mm", ".", "C", "The", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "presentation", "of", "the", "PLA", ".", "A", "minimum", "of", "10", "cells", "per", "condition", "were", "counted", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "P", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Box", "-", "whisker", "plot", "represents", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "as", "a", "box", "and", "the", "median", "as", "a", "line", ".", "The", "maximn", "and", "minimun", "values", "within", "1", ".", "5", "x", "interquartile", "range", "are", "shown", "as", "whiskers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A The immunoprecipitation analysis. The cytoplasmic ENTREP (wild or mut1+2 mutant) co-precipitated with EPN1myc in the presence of ITCH wild or C830A. The blot bands were semi-quantified using ImageJ software. ENTREP ratio was caluculated as a ratio of ENTREP in the myc-coprecipitaed sample to that of the total lysate. The ratios shown as mean ± SD from three biological replicates. P-values were obtained by Student's t-tests and P < 0.005 was considered as statistically significant. No significant difference was observed.B Representative images of the proximity ligation assay (PLA) using Cos7 cells transfected with indicated vectors. PLA signals, granular dots of green color, were presented with DAPI images. Scale bar, 10mm. C The box-and-whisker plot presentation of the PLA. A minimum of 10 cells per condition were counted from two independent experiments. P-values obtained by Student's t-tests and P < 0.05 was considered as statistically significant. * P < 0.05. Box-whisker plot represents the interquartile range (25th and 75th percentiles) as a box and the median as a line. The maximn and minimun values within 1.5 x interquartile range are shown as whiskers."}
{"words": ["Figure", "5B", "The", "immunoprecipitation", "analysis", ".", "Cytoplasmic", "ENTREP", "co", "-", "precipitated", "with", "either", "ITCH", "C830A", ",", "delWW12", "or", "delWW34", "but", "not", "with", "delWW14", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "C", "The", "immunoprecipitation", "analysis", ".", "HA", "-", "CXCR4SS", "-", "DsRed", "hardly", "co", "-", "precipitated", "with", "either", "ITCHC830A", "or", "delWW", "mutants", ".", "HA", "-", "CXCR4DD", "-", "DsRed", "co", "-", "precipitated", "with", "ITCH", "C830A", "and", "delWW12", "but", "not", "with", "delWW14", "and", "delWW34", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "F", "The", "nickel", "-", "pull", "down", "assay", "using", "indicated", "vectors", "along", "with", "HISx6", "-", "tagged", "wild", "type", "ubiquitin", "vector", ".", "HA", "-", "tagged", "DsRed", "was", "used", "as", "a", "control", "for", "HA", "-", "CXCR4DD", "-", "DsRed", ".", "Arrowhead", ",", "FLAG", "-", "tagged", "ITCH", "(", "wild", "or", "C830A", ")", ";", "arrow", ",", "FLAG", "-", "ENTREP", "wild", "cyt", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "G", "Co", "-", "localization", "of", "ENTREP", "and", "CXCR4", "in", "the", "endosome", ".", "Cos7", "cells", "were", "transfected", "with", "ENTREP", "-", "FLAG", ",", "CXCR4", "-", "DsRed", "and", "Halo", "-", "ITCH", "wild", "vectors", "and", "treated", "with", "CXCL12", ".", "ENTREP", "-", "FLAG", "and", "CXCR4", "-", "DsRed", "co", "-", "localized", "in", "the", "RAB7", "-", "positive", "endosome", ".", "Inserts", ",", "the", "high", "-", "magnification", "images", "of", "the", "marked", "area", "indicating", "the", "colocalizaion", "of", "ENTREP", "-", "FLAG", ",", "CXCR4", "-", "DsRed", "and", "RAB7", ".", "Scale", "bar", "10mm", ".", "The", "image", "is", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B The immunoprecipitation analysis. Cytoplasmic ENTREP co-precipitated with either ITCH C830A, delWW12 or delWW34 but not with delWW14. Data shown are representative of at least two independent experiments. C The immunoprecipitation analysis. HA-CXCR4SS-DsRed hardly co-precipitated with either ITCHC830A or delWW mutants. HA-CXCR4DD-DsRed co-precipitated with ITCH C830A and delWW12 but not with delWW14 and delWW34. Data shown are representative of at least two independent experiments.F The nickel-pull down assay using indicated vectors along with HISx6-tagged wild type ubiquitin vector. HA-tagged DsRed was used as a control for HA-CXCR4DD-DsRed. Arrowhead, FLAG-tagged ITCH (wild or C830A); arrow, FLAG-ENTREP wild cyt. Data shown are representative of at least two independent experiments. G Co-localization of ENTREP and CXCR4 in the endosome. Cos7 cells were transfected with ENTREP-FLAG, CXCR4-DsRed and Halo-ITCH wild vectors and treated with CXCL12. ENTREP-FLAG and CXCR4-DsRed co-localized in the RAB7-positive endosome. Inserts, the high-magnification images of the marked area indicating the colocalizaion of ENTREP-FLAG, CXCR4-DsRed and RAB7. Scale bar 10mm. The image is representative of at least two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6C", "The", "expression", "of", "endogenous", "CXCR4", "in", "lentivirally", "-", "transduced", "MCF", "-", "7", "ENTREP", "-", "KO", "cells", ".", "CXCL12", "(", "+", ")", "and", "(", "-", ")", "indicate", "the", "presence", "and", "absence", "of", "CXCL12", "treatment", ".", "In", "CXCL12", "-", "treated", "ENTREP", "-", "EGFP", "expressing", "cells", ",", "a", "non", "-", "negligible", "amount", "of", "CXCR4", "was", "observed", "in", "the", "cytoplasm", ",", "in", "which", "CXCR4", "was", "overlapped", "with", "ENTREP", "-", "EGFP", ".", "CXCR4", "expression", "on", "the", "cell", "surface", "still", "remained", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", "10", "mm", ".", "The", "images", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independet", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C The expression of endogenous CXCR4 in lentivirally-transduced MCF-7 ENTREP-KO cells. CXCL12 (+) and (-) indicate the presence and absence of CXCL12 treatment. In CXCL12-treated ENTREP-EGFP expressing cells, a non-negligible amount of CXCR4 was observed in the cytoplasm, in which CXCR4 was overlapped with ENTREP-EGFP. CXCR4 expression on the cell surface still remained (arrows). Scale bar 10 mm. The images are representative of at least three independet experiments."}
{"words": ["Figure", "7A", "Dot", "plot", "presentation", "of", "the", "chemotaxis", "analyses", "using", "the", "Boyden", "chamber", ".", "CXCL12", "(", "+", ")", "and", "(", "-", ")", "indicate", "the", "presence", "and", "absence", "of", "CXCL12", "as", "an", "attractant", "in", "the", "bottom", "chambers", ".", "ENTREP", "-", "knockout", "enhanced", "the", "chemotaxis", "toward", "CXCL12", ",", "which", "was", "blocked", "by", "pre", "-", "treatment", "with", "AMD3100", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "doxycyclin", "(", "DOX", ")", "-", "induced", "ENTREP", "expression", "suppressed", "the", "chemotaxis", "of", "mouse", "4T1", "-", "Luc", "cells", "toward", "CXCL12", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Ratio", "of", "migrated", "cells", "into", "the", "bottom", "chamber", "against", "the", "applied", "cells", "on", "the", "top", "chambers", "was", "normalized", "by", "the", "results", "of", "non", "-", "treated", "cells", "(", "n", "=", "7", ",", "upper", "panel", ",", "and", "n", "=", "9", ",", "lower", "panel", ",", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ",", "respectively", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "obtained", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "and", "P", "<", "0", ".", "005", "was", "considered", "as", "statistically", "significant", ".", "Insert", ",", "the", "immunoblot", "analysis", "of", "the", "DOX", "-", "induced", "ENTREP", "expression", "in", "4T1", "-", "Luc", "cells", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "B", "Dot", "plot", "presentation", "of", "mammosphere", "assay", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "images", "of", "mammosphere", "(", "right", "panel", ")", ".", "Each", "mark", "in", "dot", "plot", "presentation", "indicates", "the", "number", "of", "mammosphere", "from", "3", ",", "000", "cells", "per", "well", "in", "an", "ultra", "-", "low", "attachment", "plate", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "To", "estimate", "the", "effect", "of", "CXCL12", "/", "CXCR4", "pathway", ",", "100", "ng", "/", "ml", "of", "CXCL12", "and", "12", "μM", "of", "AMD3100", "were", "applied", "as", "indicated", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "variance", "was", "assessed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "and", "significance", "was", "calculated", "using", "Tukey", "post", "hoc", "test", "correcting", "for", "multiple", "comparison", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bar", "in", "the", "images", "of", "mammosphere", "100", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Dot plot presentation of the chemotaxis analyses using the Boyden chamber. CXCL12 (+) and (-) indicate the presence and absence of CXCL12 as an attractant in the bottom chambers. ENTREP-knockout enhanced the chemotaxis toward CXCL12, which was blocked by pre-treatment with AMD3100 (upper panel). The doxycyclin (DOX)-induced ENTREP expression suppressed the chemotaxis of mouse 4T1-Luc cells toward CXCL12 (lower panel). Ratio of migrated cells into the bottom chamber against the applied cells on the top chambers was normalized by the results of non-treated cells (n=7, upper panel, and n=9, lower panel, from at least two independent experiments, respectively). P-values were obtained by Student's t-tests and P < 0.005 was considered as statistically significant. Insert, the immunoblot analysis of the DOX-induced ENTREP expression in 4T1-Luc cells. NS, not significant.B Dot plot presentation of mammosphere assay (left panel) and the images of mammosphere (right panel). Each mark in dot plot presentation indicates the number of mammosphere from 3,000 cells per well in an ultra-low attachment plate from two independent experiments. To estimate the effect of CXCL12/CXCR4 pathway, 100 ng/ml of CXCL12 and 12 μM of AMD3100 were applied as indicated. For statistical analysis, variance was assessed using two-way ANOVA and significance was calculated using Tukey post hoc test correcting for multiple comparison. NS, not significant. Scale bar in the images of mammosphere 100 mm."}
{"words": ["Figure", "1C", "Co", "-", "crystal", "structure", "of", "gephyrin", "E", "-", "domain", "(", "blue", ")", "and", "bound", "GlyR", "ß", "-", "loop", "(", "red", "-", "PDB", "code", "2FTS", "(", "Kim", "et", "al", ".", ",", "2006", ")", ")", ".", "The", "mutated", "gephyrin", "Gly375", "residue", "is", "shown", "in", "orange", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Co-crystal structure of gephyrin E-domain (blue) and bound GlyR ß-loop (red - PDB code 2FTS (Kim et al., 2006)). The mutated gephyrin Gly375 residue is shown in orange."}
{"words": ["Figure", "2A", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "gephyrin", "and", "GFP", "-", "G375D", ",", "expressed", "in", "hippocampal", "neurons", "at", "9", "+", "4", "days", "in", "vitro", ".", "Inset", "shows", "higher", "magnification", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ".", "B", "Relative", "distribution", "of", "cluster", "density", "of", "gephyrin", "variants", "on", "dendrites", "from", "transfected", "neurons", ".", "Number", "of", "gephyrin", "clusters", "in", "each", "dendrite", "is", "normalized", "to", "20", "µm", "segments", ".", "C", "Representative", "segments", "of", "dendrites", "expressing", "GFP", "-", "gephyrin", "or", "GFP", "-", "G375D", "and", "immunostained", "with", "the", "presynaptic", "marker", "VGAT", ".", "Arrowheads", "show", "co", "-", "localization", "of", "gephyrin", "and", "VGAT", "clusters", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "D", "Quantification", "of", "co", "-", "localization", "between", "gephyrin", "and", "VGAT", "clusters", "(", "gephyrin", "-", "VGAT", "77", ".", "4", "±", "2", ".", "9", "%", ",", "G375D", "-", "VGAT", "30", "±", "4", ".", "4", "%", ")", ".", "31", "GFP", "-", "gephyrin", "and", "30", "GFP", "-", "G375D", "neurons", "from", "three", "independent", "cultures", "were", "used", "for", "quantifications", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Representative images of GFP-gephyrin and GFP-G375D, expressed in hippocampal neurons at 9 + 4 days in vitro. Inset shows higher magnification. Scale bar = 20 µm.B Relative distribution of cluster density of gephyrin variants on dendrites from transfected neurons. Number of gephyrin clusters in each dendrite is normalized to 20 µm segments.C Representative segments of dendrites expressing GFP-gephyrin or GFP-G375D and immunostained with the presynaptic marker VGAT. Arrowheads show co-localization of gephyrin and VGAT clusters. Scale bar = 10 µm.D Quantification of co-localization between gephyrin and VGAT clusters (gephyrin-VGAT 77.4±2.9 %, G375D-VGAT 30±4.4 %). 31 GFP-gephyrin and 30 GFP-G375D neurons from three independent cultures were used for quantifications. Results are expressed as mean ± SEM"}
{"words": ["Figure", "3A", "Representative", "dendritic", "segment", "of", "a", "neuron", "expressing", "GFP", "-", "G375D", "and", "3B11", "-", "immunostained", "endogenous", "gephyrin", "(", "red", ")", ".", "B", "Quantification", "of", "density", "and", "(", "C", ")", "size", "of", "endogenous", "gephyrin", "clusters", "in", "neurons", "expressing", "GFP", ",", "GFP", "-", "G375D", "or", "non", "-", "transfected", "neighboring", "neurons", ".", "20", "GFP", "-", "G375", "and", "non", "-", "transfected", "neurons", "and", "15", "GFP", "-", "expressing", "neurons", "from", "three", "independent", "cultures", "were", "used", "for", "quantifications", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "data", "were", "analyzed", "by", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Representative dendritic segment of a neuron expressing GFP-G375D and 3B11-immunostained endogenous gephyrin (red).B Quantification of density and (C) size of endogenous gephyrin clusters in neurons expressing GFP, GFP-G375D or non-transfected neighboring neurons. 20 GFP-G375 and non-transfected neurons and 15 GFP-expressing neurons from three independent cultures were used for quantifications. Results are expressed as mean ± SEM and data were analyzed by t-test."}
{"words": ["Figure", "4A", "Representative", "neurons", "expressing", "myc", "-", "tagged", "gephyrin", "or", "G375D", "and", "pHluorin", "-", "tagged", "GABAAR", "γ2", ".", "Surface", "-", "expressed", "γ2", "-", "subunits", "were", "immunolabelled", "with", "GFP", "-", "antibodies", "in", "red", ",", "and", "the", "pHluorin", "-", "fluorescence", "(", "total", "γ2", "levels", ")", "are", "shown", "in", "green", ".", "B", "Size", "and", "C", "fluorescence", "(", "fl", ".", ")", "intensity", "of", "surface", "-", "expressed", "γ2", "clusters", "in", "myc", "-", "gephyrin", "and", "myc", "-", "G375D", "-", "expressing", "dendrites", "(", "n", "=", "20", "myc", "-", "gephyrin", "and", "21", "myc", "-", "G375D", "neurons", "in", "B", "and", "18", "myc", "-", "gephyrin", "and", "myc", "-", "G375D", "neurons", "in", "C", ")", "D", "Mean", "γ2", "-", "pHluorin", "fluorescence", "in", "myc", "-", "gephyrin", "and", "myc", "-", "G375D", "-", "expressing", "dendrites", "(", "n", "=", "20", "and", "18", "myc", "-", "gephyrin", "and", "myc", "-", "G375D", "expressing", "neurons", ")", ".", "E", "Number", "of", "surface", "γ2", "clusters", "on", "dendrites", "normalized", "to", "20", "µm", "segments", "(", "n", "=", "18", "myc", "-", "gephyrin", "and", "myc", "-", "G375D", "expressing", "neurons", ")", ".", "At", "least", "three", "independent", "cultures", "were", "used", "for", "each", "experiment", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "Data", "were", "analyzed", "by", "t", "-", "test", ".", "F", "Representative", "traces", "of", "miniature", "recordings", "on", "cultured", "hippocampal", "neurons", "transfected", "either", "with", "GFP", "-", "gephyrin", "or", "GFP", "-", "G375D", ".", "G", "mIPSC", "amplitudes", "from", "neurons", "expressing", "GFP", "-", "gephyrin", "or", "GFP", "-", "G375D", ".", "Numbers", "show", "analyzed", "cell", "-", "numbers", ".", "Data", "were", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "post", "-", "hoc", "Tukey", "test", ".", "H", "Frequency", "of", "the", "mIPSCs", "from", "neurons", "expressing", "GFP", "-", "gephyrin", "or", "GFP", "-", "G375D", ".", "The", "horizontal", "line", "within", "the", "boxes", "indicates", "the", "median", "frequency", "for", "the", "represented", "condition", "(", "bottom", "/", "top", "boundary", "indicates", "the", "25th", "/", "75th", "percentile", ")", ".", "Top", "and", "bottom", "error", "bars", "indicate", "the", "90th", "and", "10th", "percentiles", ",", "respectively", ".", "Analysis", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Representative neurons expressing myc-tagged gephyrin or G375D and pHluorin-tagged GABAAR γ2. Surface-expressed γ2-subunits were immunolabelled with GFP-antibodies in red, and the pHluorin-fluorescence (total γ2 levels) are shown in green.B Size and C fluorescence (fl.) intensity of surface-expressed γ2 clusters in myc-gephyrin and myc-G375D-expressing dendrites (n = 20 myc-gephyrin and 21 myc-G375D neurons in B and 18 myc-gephyrin and myc-G375D neurons in C)D Mean γ2-pHluorin fluorescence in myc-gephyrin and myc-G375D-expressing dendrites (n = 20 and 18 myc-gephyrin and myc-G375D expressing neurons).E Number of surface γ2 clusters on dendrites normalized to 20 µm segments (n = 18 myc-gephyrin and myc-G375D expressing neurons). At least three independent cultures were used for each experiment. Results are expressed as mean ± SEM; Data were analyzed by t-test.F Representative traces of miniature recordings on cultured hippocampal neurons transfected either with GFP-gephyrin or GFP-G375D.G mIPSC amplitudes from neurons expressing GFP-gephyrin or GFP-G375D. Numbers show analyzed cell-numbers. Data were analyzed by one-way ANOVA and post-hoc Tukey test.H Frequency of the mIPSCs from neurons expressing GFP-gephyrin or GFP-G375D. The horizontal line within the boxes indicates the median frequency for the represented condition (bottom/top boundary indicates the 25th /75th percentile). Top and bottom error bars indicate the 90th and 10th percentiles, respectively. Analysis by Kruskal-Wallis test followed by post-hoc Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "5A", "Western", "blot", "of", "HEK293", "cells", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "gephyrin", "or", "G375D", "using", "GFP", "-", "specific", "and", "polyclonal", "gephyrin", "antibodies", ".", "Note", "that", "both", "gephyrin", "variants", "are", "stably", "expressed", "and", "show", "no", "degradation", "in", "the", "cells", ".", "Asterisk", "in", "the", "poly", "-", "gephyrin", "blot", "shows", "endogenous", "gephyrin", ".", "B", "SDS", "-", "PAGE", "of", "E", ".", "coli", "expressed", "and", "purified", "6His", "-", "gephyrins", "and", "CD", "spectra", ".", "Mean", "residue", "ellipticity", "of", "gephyrin", "and", "G375D", "show", "profiles", "with", "minima", "at", "208", "nm", "and", "222", "nm", ".", "C", "Size", "-", "exclusion", "chromatography", "of", "purified", "6His", "-", "gephyrin", "and", "isolated", "E", "-", "domain", "variants", ".", "Full", "-", "length", "gephyrins", "and", "isolated", "E", "-", "domains", "were", "loaded", "onto", "a", "Superose", "6", "gel", "filtration", "column", "and", "elution", "of", "the", "protein", "was", "monitored", "by", "measuring", "absorbance", "at", "280", "nm", "(", "mAU", ",", "milliabsorbance", "units", ")", ".", "D", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "HEK293", "cell", "lysates", "expressing", "myc", "-", "tagged", "gephyrin", "together", "with", "GFP", "-", "tagged", "gephyrin", "or", "G375D", "using", "myc", "-", "specific", "antibodies", ".", "Control", "IgG", "were", "used", "to", "show", "specificity", "of", "the", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Western blot of HEK293 cells expressing GFP-tagged gephyrin or G375D using GFP-specific and polyclonal gephyrin antibodies. Note that both gephyrin variants are stably expressed and show no degradation in the cells. Asterisk in the poly-gephyrin blot shows endogenous gephyrin.B SDS-PAGE of E. coli expressed and purified 6His-gephyrins and CD spectra. Mean residue ellipticity of gephyrin and G375D show profiles with minima at 208 nm and 222 nm.C Size-exclusion chromatography of purified 6His-gephyrin and isolated E-domain variants. Full-length gephyrins and isolated E-domains were loaded onto a Superose 6 gel filtration column and elution of the protein was monitored by measuring absorbance at 280 nm (mAU, milliabsorbance units).D Co-immunoprecipitation of HEK293 cell lysates expressing myc-tagged gephyrin together with GFP-tagged gephyrin or G375D using myc-specific antibodies. Control IgG were used to show specificity of the assay."}
{"words": ["Figure", "6B", "Representative", "pulldown", "-", "experiment", "and", "quantification", "of", "6His", "-", "tagged", "gephyrin", "and", "G375D", "using", "immobilized", "α3", "-", "peptide", ".", "6His", "-", "tagged", "gephyrin", "variants", "were", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "cells", ",", "purified", "to", "homogeneity", "and", "incubated", "with", "α3", "-", "peptides", "immobilized", "to", "NeutrAvidin", "beads", ".", "n", "=", "3", ",", "normalized", "to", "6His", "-", "gephyrin", ".", "38", ".", "9", "±", "1", ".", "5", "%", "G375D", "were", "pulled", "down", ".", "C", "Representative", "SPR", "sensograms", "of", "6His", "-", "gephyrin", "and", "6His", "-", "G375D", "binding", "to", "immobilized", "GABAAR", "α3", "-", "peptide", ".", "Response", "units", "are", "plotted", "against", "time", ".", "Injected", "gephyrin", "concentrations", "were", "0", ".", "5", ",", "2", ",", "10", ",", "25", ",", "40", "µM", ".", "D", "SPR", "binding", "isotherms", "of", "a", "representative", "experiment", "as", "in", "C", ".", "Calculated", "KD", "values", "of", "3", ".", "2", "and", "10", "µM", "for", "gephyrin", "and", "G375D", ",", "respectively", ",", "are", "indicated", "by", "vertical", "lines", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "two", "independently", "purified", "protein", "batches", "and", "two", "sensor", "chips", ".", "E", "Representative", "ITC", "binding", "isotherms", "of", "the", "cytoplasmic", "loop", "of", "the", "GlyR", "ß", "-", "subunit", "(", "GlyR", "-", "ßL", ",", "residue", "378", "-", "426", ")", "and", "6His", "-", "tagged", "gephyrin", "or", "G375D", ".", "The", "GlyR", "-", "ßL", "-", "gephyrin", "binding", "data", "(", "black", ")", "were", "fitted", "in", "a", "two", "-", "side", "model", ",", "whereas", "G375D", "binding", "could", "only", "be", "fitted", "to", "a", "single", "binding", "site", ".", "Dissociation", "constants", "KD", "and", "stoichiometry", "(", "N", "=", "number", "of", "binding", "sites", ")", "are", "given", "for", "each", "binding", "component", ".", "n", "=", "5", "from", "two", "independently", "purified", "protein", "batches", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Representative pulldown-experiment and quantification of 6His-tagged gephyrin and G375D using immobilized α3-peptide. 6His-tagged gephyrin variants were expressed in E. coli cells, purified to homogeneity and incubated with α3-peptides immobilized to NeutrAvidin beads. n = 3, normalized to 6His-gephyrin. 38.9±1.5% G375D were pulled down.C Representative SPR sensograms of 6His-gephyrin and 6His-G375D binding to immobilized GABAAR α3-peptide. Response units are plotted against time. Injected gephyrin concentrations were 0.5, 2, 10, 25, 40 µM.D SPR binding isotherms of a representative experiment as in C. Calculated KD values of 3.2 and 10 µM for gephyrin and G375D, respectively, are indicated by vertical lines. The experiment was repeated three times with two independently purified protein batches and two sensor chips.E Representative ITC binding isotherms of the cytoplasmic loop of the GlyR ß-subunit (GlyR-ßL, residue 378-426) and 6His-tagged gephyrin or G375D. The GlyR-ßL-gephyrin binding data (black) were fitted in a two-side model, whereas G375D binding could only be fitted to a single binding site. Dissociation constants KD and stoichiometry (N = number of binding sites) are given for each binding component. n = 5 from two independently purified protein batches. Results are expressed as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "7A", "Biosynthesis", "pathway", "of", "Moco", "with", "all", "stable", "intermediates", ".", "Gephyrin", "G", "-", "and", "E", "-", "domain", "catalyze", "the", "last", "two", "steps", "as", "depicted", ".", "B", "In", "vitro", "Moco", "-", "synthesis", "assay", "using", "150", "pmol", "purified", "6His", "-", "tagged", "gephyrins", ".", "D580A", "is", "an", "activity", "-", "deficient", "gephyrin", "mutation", "previously", "identified", "in", "Moco", "-", "deficient", "patients", "(", "Reiss", "et", "al", ".", ",", "2011", ")", ".", "Assays", "without", "the", "addition", "of", "gephyrin", "(", "-", "gephyrin", ")", "or", "molybdenum", "(", "-", "Mo", ")", "served", "as", "internal", "controls", "of", "the", "assay", "(", "see", "also", "(", "Belaidi", "Schwarz", ",", "2013", ")", ")", ".", "C", "Experiment", "as", "in", "B", "but", "with", "pre", "-", "incubation", "of", "6His", "-", "gephyrin", "/", "G375D", "in", "a", "1", ":", "1", "ratio", "to", "simulate", "the", "heterozygous", "mutation", ".", "n", "=", "at", "least", "3", "with", "two", "independently", "purified", "protein", "batches", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Biosynthesis pathway of Moco with all stable intermediates. Gephyrin G- and E-domain catalyze the last two steps as depicted.B In vitro Moco-synthesis assay using 150 pmol purified 6His-tagged gephyrins. D580A is an activity-deficient gephyrin mutation previously identified in Moco-deficient patients (Reiss et al., 2011). Assays without the addition of gephyrin (-gephyrin) or molybdenum (-Mo) served as internal controls of the assay (see also (Belaidi Schwarz, 2013)).C Experiment as in B but with pre-incubation of 6His-gephyrin/G375D in a 1:1 ratio to simulate the heterozygous mutation. n = at least 3 with two independently purified protein batches. Results are expressed as mean ± SEM."}
{"words": ["figf1", "(", "b", ")", "Parkin", "is", "recruited", "selectively", "to", "depolarized", "mitochondria", "and", "directs", "mitophagy", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "Parkin", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Mitochondria", "were", "stained", "by", "anti", "-", "TOM20", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "and", "a", "ΔΨm", "dependent", "MitoTracker", "(", "red", ")", ".", "Parkin", "was", "stained", "with", "anti", "-", "HA", "(", "green", ")", ".", "Without", "treatment", ",", "mitochondria", "are", "intact", "and", "stained", "by", "both", "mitochondrial", "markers", ",", "whereas", "Parkin", "is", "equally", "distributed", "in", "the", "cytoplasm", ".", "After", "2", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "mitochondria", "are", "depolarized", "as", "shown", "by", "the", "loss", "of", "MitoTracker", "staining", ".", "Parkin", "completely", "translocates", "to", "mitochondria", "clustering", "at", "perinuclear", "regions", ".", "After", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "massive", "loss", "of", "mitochondria", "is", "observed", "as", "shown", "by", "the", "disappearance", "of", "the", "mitochondrial", "marker", ".", "Only", "Parkin", "-", "positive", "cells", "show", "mitochondrial", "clustering", "and", "clearance", ",", "in", "contrast", "to", "adjacent", "untransfected", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "c", ")", "Pathogenic", "Parkin", "mutations", "abrogate", "mitochondrial", "translocation", "and", "/", "or", "clearance", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "pathogenic", "mutants", "were", "treated", "with", "CCCP", "and", "stained", "with", "anti", "-", "Flag", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "TOM20", "(", "red", ")", "and", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Representative", "merged", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Immunostaining", "of", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "functional", "cysteine", "mutants", "and", "functional", "Parkin", "variants", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S1a", "and", "S1b", ",", "respectively", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Based", "on", "the", "mitochondrial", "effects", ",", "Parkin", "mutants", "can", "be", "classified", "into", "functional", "and", "non", "-", "functional", "classes", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "Parkin", "translocation", "to", "damaged", "mitochondria", "after", "2", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "as", "defined", "by", "complete", "colocalization", "of", "Parkin", "with", "the", "mitochondrial", "marker", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "cells", "with", "uncleared", "mitochondria", "after", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "as", "shown", "by", "complete", "loss", "of", "mitochondrial", "staining", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "compared", "with", "wild", "-", "type", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(b) Parkin is recruited selectively to depolarized mitochondria and directs mitophagy. HeLa cells transfected with HA-Parkin were treated with CCCP for the indicated times. Mitochondria were stained by anti-TOM20 (pseudo coloured; blue) and a ΔΨm dependent MitoTracker (red). Parkin was stained with anti-HA (green). Without treatment, mitochondria are intact and stained by both mitochondrial markers, whereas Parkin is equally distributed in the cytoplasm. After 2 h of CCCP treatment, mitochondria are depolarized as shown by the loss of MitoTracker staining. Parkin completely translocates to mitochondria clustering at perinuclear regions. After 24 h of CCCP treatment, massive loss of mitochondria is observed as shown by the disappearance of the mitochondrial marker. Only Parkin-positive cells show mitochondrial clustering and clearance, in contrast to adjacent untransfected cells. Scale bars, 10 μm.(c) Pathogenic Parkin mutations abrogate mitochondrial translocation and/or clearance. HeLa cells transfected with Flag-Parkin wild-type or pathogenic mutants were treated with CCCP and stained with anti-Flag (green), anti-TOM20 (red) and Hoechst33342 (blue). Representative merged images are shown. Scale bars, 10 μm. Immunostaining of cells transfected with non-functional cysteine mutants and functional Parkin variants is shown in Supplementary Information, Fig. S1a and S1b, respectively.(d, e) Based on the mitochondrial effects, Parkin mutants can be classified into functional and non-functional classes. (d) Quantification of Parkin translocation to damaged mitochondria after 2 h of CCCP treatment, as defined by complete colocalization of Parkin with the mitochondrial marker (n = 3). (e) Quantification of cells with uncleared mitochondria after 24 h of CCCP treatment, as shown by complete loss of mitochondrial staining (n = 3). Data represent the mean ± s.d., *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.005, ***P ≤ 0.0005 compared with wild-type. WT, wild-type."}
{"words": ["figf2Stable", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "pathogenic", "mutants", "expressing", "SH", "-", "SY5Y", "cell", "lines", "were", "induced", "with", "doxycycline", "(", "DOX", ")", "for", "72", "h", "and", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Parkin", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "TOM20", "(", "red", ")", "and", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "(", "a", "-", "b", ")", "CCCP", "treatment", "of", "stable", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "for", "0", "h", ".", "Unstimulated", "control", "cells", "(", "-", "DOX", ")", "show", "relatively", "low", "levels", "of", "endogenous", "Parkin", ",", "compared", "to", "cells", "with", "induced", "expression", "of", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "K161N", ",", "R275W", "and", "G430D", "mutants", "(", "+", "DOX", ")", ".", "Immunostaining", "(", "a", ")", "and", "western", "blot", "analysis", "(", "b", ")", "of", "the", "induced", "cells", "demonstrate", "comparable", "levels", "of", "Parkin", "expression", "in", "the", "selected", "clones", ".", "β", "-", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "After", "2", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "massive", "colocalization", "of", "wild", "-", "type", "Parkin", "and", "mitochondrial", "clusters", "can", "be", "observed", "in", "the", "induced", "cells", "when", "compared", "with", "unstimulated", "controls", ".", "Similarly", ",", "Parkin", "K161N", "and", "R275W", "mutants", "translocate", "to", "mitochondria", ",", "whereas", "G430D", "does", "not", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "After", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "induced", "wild", "-", "type", "Parkin", "-", "expressing", "cells", "show", "full", "clearance", "of", "damaged", "mitochondria", ".", "In", "contrast", ",", "the", "pathogenic", "mutants", "analysed", "fail", "to", "execute", "mitophagy", "and", ",", "therefore", ",", "damaged", "mitochondria", "remain", "uncleared", ".", "Representative", "images", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "(", "a", ",", "c", "and", "e", ")", ".", "(", "d", ",", "f", ")", "Quantifications", "of", "the", "observed", "mitochondrial", "effects", "in", "Parkin", "-", "expressing", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "compared", "with", "induced", "wild", "-", "type", "Parkin", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2Stable Parkin wild-type or pathogenic mutants expressing SH-SY5Y cell lines were induced with doxycycline (DOX) for 72 h and treated with CCCP for the indicated times. Cells were stained with anti-Parkin (green), anti-TOM20 (red) and Hoechst33342 (blue). (a-b) CCCP treatment of stable SH-SY5Y cells for 0 h. Unstimulated control cells (- DOX) show relatively low levels of endogenous Parkin, compared to cells with induced expression of Parkin wild-type or K161N, R275W and G430D mutants (+ DOX). Immunostaining (a) and western blot analysis (b) of the induced cells demonstrate comparable levels of Parkin expression in the selected clones. β-Actin served as a loading control.(c, d) After 2 h of CCCP treatment, massive colocalization of wild-type Parkin and mitochondrial clusters can be observed in the induced cells when compared with unstimulated controls. Similarly, Parkin K161N and R275W mutants translocate to mitochondria, whereas G430D does not.(e, f) After 24 h of CCCP treatment, induced wild-type Parkin-expressing cells show full clearance of damaged mitochondria. In contrast, the pathogenic mutants analysed fail to execute mitophagy and, therefore, damaged mitochondria remain uncleared. Representative images of three independent experiments are shown. Scale bars, 10 μm (a, c and e). (d, f) Quantifications of the observed mitochondrial effects in Parkin-expressing SH-SY5Y cells (n = 3). Data represent the mean ± s.d., ***P ≤ 0.0005 compared with induced wild-type Parkin. WT, wild-type."}
{"words": ["figf3", "(", "b", ")", "Co", "-", "immunoprecipitations", "of", "Parkin", "and", "PINK1", "after", "mitochondrial", "depolarization", ".", "Endogenous", "Parkin", "and", "PINK1", "were", "co", "-", "immunoprecipitated", "from", "neuronal", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "after", "CCCP", "treatment", "with", "specific", "antibodies", ".", "(", "c", ")", "Western", "blot", "of", "PINK1", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "used", "in", "d", "-", "h", "demonstrates", "the", "knockdown", "efficiency", "and", "specificity", "of", "PINK1", "silencing", ".", "d", "-", "h", ")", "PINK1", "-", "specific", "siRNA", "abrogates", "Parkin", "translocation", "to", "mitochondria", "after", "2", "h", ",", "and", "mitochondrial", "clearance", "after", "24", "h", ",", "of", "CCCP", "treatment", ".", "This", "can", "be", "rescued", "by", "re", "-", "transfection", "with", "wild", "-", "type", "PINK1", ",", "but", "not", "with", "a", "kinase", "-", "dead", "mutant", "or", "a", "PINK1", "variant", "lacking", "the", "MTS", ".", "Control", "siRNA", "-", "or", "PINK1", "siRNA", "-", "silenced", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "and", "PINK1", "-", "V5", "wild", "-", "type", ",", "3", "×", "KD", "or", "ΔMTS", "mutants", ".", "Use", "of", "appropriate", "empty", "vector", "controls", "is", "depicted", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "and", "stained", "with", "anti", "-", "TOM20", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "and", "anti", "-", "V5", "(", "red", ")", "to", "visualize", "mitochondrial", "morphology", "and", "re", "-", "transfected", "PINK1", ",", "respectively", ".", "Wild", "-", "type", "Parkin", "was", "visualized", "by", "EGFP", "epifluorescence", "(", "green", ")", ".", "Parkin", "-", "positive", "cells", "are", "surrounded", "by", "a", "line", ".", "Representative", "images", "of", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "e", ")", "Wild", "-", "type", "Parkin", "colocalization", "with", "impaired", "mitochondria", "after", "2", "h", "of", "CCCP", "treatment", "was", "analysed", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "g", ")", "Quantification", "of", "results", "from", "cells", "in", "e", ".", "(", "f", ")", "Uncleared", "mitochondria", "were", "analysed", "after", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "h", ")", "Quantification", "of", "results", "from", "cells", "in", "f", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "compared", "with", "control", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "Immunostaining", "of", "control", "siRNA", "-", "transfected", "cells", "at", "all", "analysed", "time", "points", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S2", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(b) Co-immunoprecipitations of Parkin and PINK1 after mitochondrial depolarization. Endogenous Parkin and PINK1 were co-immunoprecipitated from neuronal SH-SY5Y cells after CCCP treatment with specific antibodies.(c) Western blot of PINK1 siRNA-transfected HeLa cells used in d-h demonstrates the knockdown efficiency and specificity of PINK1 silencing.d-h) PINK1-specific siRNA abrogates Parkin translocation to mitochondria after 2 h, and mitochondrial clearance after 24 h, of CCCP treatment. This can be rescued by re-transfection with wild-type PINK1, but not with a kinase-dead mutant or a PINK1 variant lacking the MTS. Control siRNA- or PINK1 siRNA-silenced HeLa cells were transfected with EGFP-Parkin wild-type and PINK1-V5 wild-type, 3×KD or ΔMTS mutants. Use of appropriate empty vector controls is depicted. Cells were treated with CCCP and stained with anti-TOM20 (pseudo coloured; blue) and anti-V5 (red) to visualize mitochondrial morphology and re-transfected PINK1, respectively. Wild-type Parkin was visualized by EGFP epifluorescence (green). Parkin-positive cells are surrounded by a line. Representative images of four independent experiments are shown. Scale bars, 10 μm.(e) Wild-type Parkin colocalization with impaired mitochondria after 2 h of CCCP treatment was analysed (n = 4). (g) Quantification of results from cells in e.(f) Uncleared mitochondria were analysed after 24 h of CCCP treatment (n = 4). (h) Quantification of results from cells in f. Data represent the mean ± s.d., **P ≤ 0.005, ***P ≤ 0.0005 compared with control siRNA-transfected cells. Immunostaining of control siRNA-transfected cells at all analysed time points is shown in Supplementary Information, Fig. S2. WT, wild-type."}
{"words": ["figf4a", ",", "b", ")", "Stable", "Mito", "-", "DsRed", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "-", "expressing", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "pathogenic", "mutants", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "before", "immunostaining", "of", "Parkin", "with", "anti", "-", "Flag", "(", "green", ")", "and", "endogenous", "poly", "-", "ubiquitin", "with", "a", "specific", "antibody", "FK1", "(", "red", ")", ".", "(", "a", ")", "In", "contrast", "to", "pathogenic", "mutations", ",", "wild", "-", "type", "Parkin", "shows", "colocalization", "with", "poly", "-", "ubiquitin", "after", "6", "h", "of", "CCCP", "treatment", "at", "the", "site", "of", "condensed", "mitochondria", ".", "(", "b", ")", "After", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "K161N", "and", "R275W", "Parkin", "mutants", "colocalize", "with", "both", "poly", "-", "ubiquitin", "and", "mitochondria", ".", "In", "contrast", ",", "translocation", "-", "deficient", "Parkin", "mutants", "K211N", ",", "T240R", "and", "G430D", "lack", "the", "mitochondria", "-", "associated", "poly", "-", "ubiquitin", "signal", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Complementary", "Parkin", "of", "untreated", "cells", "and", "quantification", "of", "colocalization", "of", "Parkin", ",", "mitochondria", "and", "poly", "-", "ubiquitin", "upon", "CCCP", "treatment", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S3a", ",", "b", "and", "c", ",", "respectively", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Parkin", "-", "directed", "mitophagy", "specifically", "involves", "linkage", "of", "ubiquitin", "through", "lysines", "27", "and", "63", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "and", "ubiquitin", "lysine", "variants", "and", "treated", "with", "CCCP", "before", "immunostaining", "with", "anti", "-", "HtrA2", "/", "Omi", ",", "as", "a", "mitochondrial", "marker", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "and", "anti", "-", "His", "(", "red", ")", "to", "detect", "ectopic", "ubiquitin", ".", "Parkin", "was", "visualized", "by", "its", "fusion", "to", "EGFP", "(", "green", ")", ".", "(", "c", ")", "Note", "that", "only", "wild", "-", "type", ",", "K27", "and", "K63", "6", "×", "His", "-", "tagged", "ubiquitin", "variants", "are", "colocalized", "with", "condensed", "mitochondria", "and", "EGFP", "-", "Parkin", "after", "6", "h", "of", "CCCP", "treatment", ".", "All", "other", "ubiquitin", "mutants", "interfere", "with", "Parkin", "translocation", "to", "mitochondria", ".", "(", "d", ")", "Only", "co", "-", "expression", "of", "K27", "or", "K63", "ubiquitin", "recapitulates", "mitochondrial", "clearance", "similarly", "to", "6", "×", "His", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "ubiquitin", "after", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Immunostaining", "of", "untreated", "cells", "and", "all", "other", "ubiquitin", "variant", "combinations", "tested", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S4a", "and", "b", ",", "c", ",", "respectively", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ";", "PolyUb", ",", "poly", "-", "ubiquitin", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, b) Stable Mito-DsRed (pseudo coloured; blue)-expressing HeLa cells were transfected with Flag-Parkin wild-type or pathogenic mutants. Cells were treated with CCCP before immunostaining of Parkin with anti-Flag (green) and endogenous poly-ubiquitin with a specific antibody FK1 (red). (a) In contrast to pathogenic mutations, wild-type Parkin shows colocalization with poly-ubiquitin after 6 h of CCCP treatment at the site of condensed mitochondria. (b) After 24 h of CCCP treatment, K161N and R275W Parkin mutants colocalize with both poly-ubiquitin and mitochondria. In contrast, translocation-deficient Parkin mutants K211N, T240R and G430D lack the mitochondria-associated poly-ubiquitin signal. Representative images are shown. Scale bars, 10 μm. Complementary Parkin of untreated cells and quantification of colocalization of Parkin, mitochondria and poly-ubiquitin upon CCCP treatment are shown in Supplementary Information, Fig. S3a, b and c, respectively.(c, d) Parkin-directed mitophagy specifically involves linkage of ubiquitin through lysines 27 and 63. HeLa cells were transfected with EGFP-Parkin wild-type and ubiquitin lysine variants and treated with CCCP before immunostaining with anti-HtrA2/Omi, as a mitochondrial marker (pseudo coloured; blue) and anti-His (red) to detect ectopic ubiquitin. Parkin was visualized by its fusion to EGFP (green). (c) Note that only wild-type, K27 and K63 6×His-tagged ubiquitin variants are colocalized with condensed mitochondria and EGFP-Parkin after 6 h of CCCP treatment. All other ubiquitin mutants interfere with Parkin translocation to mitochondria. (d) Only co-expression of K27 or K63 ubiquitin recapitulates mitochondrial clearance similarly to 6×His-tagged wild-type ubiquitin after 24 h of CCCP treatment. Representative images are shown. Scale bars, 10 μm. Immunostaining of untreated cells and all other ubiquitin variant combinations tested are shown in Supplementary Information, Fig. S4a and b, c, respectively. WT, wild-type; PolyUb, poly-ubiquitin."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ",", "b", ")", "Stable", "Mito", "-", "DsRed", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "-", "expressing", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "pathogenic", "mutants", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", "before", "immunostaining", "with", "anti", "-", "Flag", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "p62", "(", "red", ")", ".", "(", "a", ")", "In", "contrast", "to", "the", "pathogenic", "mutants", ",", "wild", "-", "type", "Parkin", "colocalizes", "with", "p62", "at", "the", "site", "of", "clustered", "mitochondria", ",", "after", "6", "h", "of", "CCCP", "treatment", ".", "(", "b", ")", "After", "24", "h", "of", "CCCP", "treatment", ",", "wild", "-", "type", "Parkin", "-", "transfected", "cells", "show", "complete", "loss", "of", "mitochondria", ",", "whereas", "K161N", "and", "R275W", "Parkin", "mutants", "colocalize", "with", "both", "p62", "and", "mitochondria", ".", "In", "contrast", ",", "translocation", "-", "compromised", "mutants", "K211N", ",", "T240R", "and", "G430D", ",", "lacking", "the", "mitochondria", "-", "associated", "poly", "-", "ubiquitin", "signal", "(", "Fig", ".", "4b", ")", ",", "did", "not", "colocalize", "with", "p62", ".", "Representative", "images", "of", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Data", "from", "untreated", "control", "cells", "and", "quantification", "of", "colocalization", "of", "Parkin", ",", "mitochondria", "and", "p62", "upon", "CCCP", "treatment", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "5a", "and", "b", ",", "c", ",", "respectively", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Control", "siRNA", "-", "or", "p62", "siRNA", "-", "silenced", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", "and", "stained", "with", "anti", "-", "TOM20", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "to", "visualize", "mitochondrial", "morphology", "and", "anti", "-", "p62", "(", "red", ")", "to", "monitor", "silencing", "efficiency", ".", "Parkin", "wild", "-", "type", "was", "visualized", "by", "EGFP", "epifluorescence", "(", "green", ")", ".", "Parkin", "-", "positive", "cells", "with", "cleared", "mitochondria", "are", "surrounded", "by", "a", "line", ".", "(", "(", "c", "-", "f", ")", "Knockdown", "of", "p62", "has", "no", "influence", "on", "Parkin", "translocation", "to", "mitochondria", "after", "6", "h", "of", "CCCP", "treatment", "(", "c", "-", "e", ")", ",", "but", "completely", "blocks", "final", "clearance", "after", "24", "h", "(", "c", ",", "d", ",", "f", ")", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Relative", "parkin", "translocation", "(", "e", ")", "and", "mitochondrial", "clearance", "(", "f", ")", "after", "p62", "knockdown", "and", "CCCP", "treatment", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "compared", "with", "control", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "Representative", "images", "of", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Immunostainings", "of", "control", "cells", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S5d", ",", "e", ".", "(", "g", ")", "Western", "blot", "of", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "used", "in", "c", "-", "f", "demonstrates", "the", "efficiency", "of", "p62", "silencing", ".", "β", "-", "Actin", "probing", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a, b) Stable Mito-DsRed (pseudo coloured; blue)-expressing HeLa cells were transfected with Flag-Parkin wild-type or pathogenic mutants. Cells were treated with CCCP for the indicated times before immunostaining with anti-Flag (green) and anti-p62 (red). (a) In contrast to the pathogenic mutants, wild-type Parkin colocalizes with p62 at the site of clustered mitochondria, after 6 h of CCCP treatment. (b) After 24 h of CCCP treatment, wild-type Parkin-transfected cells show complete loss of mitochondria, whereas K161N and R275W Parkin mutants colocalize with both p62 and mitochondria. In contrast, translocation-compromised mutants K211N, T240R and G430D, lacking the mitochondria-associated poly-ubiquitin signal (Fig. 4b), did not colocalize with p62. Representative images of four independent experiments are shown. Data from untreated control cells and quantification of colocalization of Parkin, mitochondria and p62 upon CCCP treatment are shown in Supplementary Information, Fig. 5a and b, c, respectively.(c, d) Control siRNA- or p62 siRNA-silenced HeLa cells were transfected with EGFP-Parkin wild-type. Cells were treated with CCCP for the indicated times and stained with anti-TOM20 (pseudo coloured; blue) to visualize mitochondrial morphology and anti-p62 (red) to monitor silencing efficiency. Parkin wild-type was visualized by EGFP epifluorescence (green). Parkin-positive cells with cleared mitochondria are surrounded by a line. ((c-f) Knockdown of p62 has no influence on Parkin translocation to mitochondria after 6 h of CCCP treatment (c-e), but completely blocks final clearance after 24 h (c, d, f). (e, f) Relative parkin translocation (e) and mitochondrial clearance (f) after p62 knockdown and CCCP treatment (n = 4). Data represent the mean ± s.d., ***P ≤ 0.0005 compared with control siRNA-transfected cells. Representative images of four independent experiments are shown. Scale bars, 10 μm. Immunostainings of control cells are shown in Supplementary Information, Fig. S5d, e.(g) Western blot of siRNA-transfected HeLa cells used in c-f demonstrates the efficiency of p62 silencing. β-Actin probing served as a loading control. WT, wild-type."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Time", "-", "course", "experiment", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "and", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "periods", ".", "Total", "lysates", "were", "prepared", ",", "and", "western", "blots", "were", "probed", "with", "specific", "anti", "-", "Parkin", ",", "anti", "-", "PINK1", ",", "anti", "-", "TOM20", "and", "anti", "-", "VDAC1", "antibodies", ".", "β", "-", "Actin", "probing", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "All", "of", "the", "proteins", "detected", "are", "endogenously", "expressed", ",", "except", "Flag", "-", "Parkin", ".", "(", "b", ")", "Pathogenic", "Parkin", "mutants", "fail", "to", "poly", "-", "ubiquitylate", "endogenous", "VDAC1", "in", "response", "to", "CCCP", "treatment", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "-", ")", ",", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "or", "pathogenic", "mutants", "along", "with", "6", "×", "His", "-", "tagged", "ubiquitin", "wild", "-", "type", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "6", "h", "and", "subsequently", "protein", "lysates", "were", "prepared", "in", "urea", "buffer", ".", "Denaturing", "conditions", "of", "Ni", "-", "NTA", "affinity", "purifications", "were", "used", "to", "specifically", "pulldown", "only", "proteins", "covalently", "modified", "with", "6xHis", "-", "tagged", "ubiquitin", ".", "Western", "blots", "of", "protein", "lysates", "and", "purified", "Ni", "-", "NTA", "agarose", "elutions", "were", "probed", "with", "anti", "-", "VDAC1", ",", "anti", "-", "TOM20", "and", "anti", "-", "Parkin", "antibodies", ".", "Modification", "of", "VDAC1", "was", "observed", "in", "cells", "expressing", "Parkin", "wild", "-", "type", "and", "the", "functional", "mutant", "G328E", ",", "whereas", "non", "-", "functional", "mutants", "did", "not", "have", "this", "effect", ".", "(", "(", "c", ")", "In", "response", "to", "CCCP", "treatment", ",", "Parkin", "catalyses", "predominantly", "K27", "-", "linked", "poly", "-", "ubiquitin", "chains", "on", "endogenous", "VDAC1", "and", "is", "itself", "strongly", "poly", "-", "ubiquitylated", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", "(", "-", ")", "or", "Flag", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", "along", "with", "6", "×", "His", "-", "tagged", "ubiquitin", "variants", "for", "24", "h", ".", "Treatment", "of", "cells", ",", "preparation", "of", "lysates", "and", "Ni", "-", "NTA", "purification", "were", "performed", "as", "described", "in", "c", "and", "probed", "for", "Parkin", ",", "VDAC1", "and", "β", "-", "actin", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ";", "Ub", ",", "ubiquitin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Time-course experiment of HeLa cells transfected with Flag-Parkin wild-type and treated with CCCP for the indicated periods. Total lysates were prepared, and western blots were probed with specific anti-Parkin, anti-PINK1, anti-TOM20 and anti-VDAC1 antibodies. β-Actin probing served as a loading control. All of the proteins detected are endogenously expressed, except Flag-Parkin.(b) Pathogenic Parkin mutants fail to poly-ubiquitylate endogenous VDAC1 in response to CCCP treatment. HeLa cells were transfected with empty vector (-), Flag-Parkin wild-type or pathogenic mutants along with 6×His-tagged ubiquitin wild-type for 24 h. Cells were treated with CCCP for 6 h and subsequently protein lysates were prepared in urea buffer. Denaturing conditions of Ni-NTA affinity purifications were used to specifically pulldown only proteins covalently modified with 6xHis-tagged ubiquitin. Western blots of protein lysates and purified Ni-NTA agarose elutions were probed with anti-VDAC1, anti-TOM20 and anti-Parkin antibodies. Modification of VDAC1 was observed in cells expressing Parkin wild-type and the functional mutant G328E, whereas non-functional mutants did not have this effect. ((c) In response to CCCP treatment, Parkin catalyses predominantly K27-linked poly-ubiquitin chains on endogenous VDAC1 and is itself strongly poly-ubiquitylated. HeLa cells were transfected with an empty vector (-) or Flag-Parkin wild-type along with 6×His-tagged ubiquitin variants for 24 h. Treatment of cells, preparation of lysates and Ni-NTA purification were performed as described in c and probed for Parkin, VDAC1 and β-actin. WT, wild-type; Ub, ubiquitin."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "parental", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "treated", "with", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Time", "-", "course", "experiments", "of", "CCCP", "-", "treated", "neuronal", "cells", "reveal", "increasing", "modifications", "of", "VDAC1", "over", "time", ".", "Total", "lysates", "were", "prepared", ",", "and", "western", "blots", "were", "probed", "with", "specific", "anti", "-", "Parkin", ",", "anti", "-", "PINK1", ",", "anti", "-", "TOM20", "and", "anti", "-", "VDAC1", "antibodies", ".", "All", "proteins", "represent", "endogenous", "levels", ".", "(", "b", ")", "Immunoprecipitations", "of", "Parkin", "and", "VDAC1", "from", "parental", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "confirm", "ubiquitylation", "of", "both", "proteins", ".", "CCCP", "treatment", "of", "neuronal", "cells", "increases", "ubiquitylated", "species", "of", "endogenous", "Parkin", "and", "VDAC1", "over", "time", ".", "Using", "specific", "antibodies", ",", "Parkin", "and", "VDAC1", "were", "immunoprecipitated", "from", "lysates", "of", "parental", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "at", "different", "time", "points", ",", "western", "blotted", "and", "probed", "with", "anti", "-", "ubiquitin", ",", "anti", "-", "Parkin", "and", "anti", "-", "VDAC1", "antibodies", ".", "(", "c", ")", "Pathogenic", "Parkin", "mutations", "fail", "to", "poly", "-", "ubiquitylate", "endogenous", "VDAC1", "in", "response", "to", "CCCP", "treatment", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "a", "time", "-", "course", "experiment", "with", "inducible", "Parkin", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "after", "CCCP", "treatment", ".", "Total", "lysates", "were", "prepared", ",", "and", "western", "blots", "were", "probed", "with", "specific", "anti", "-", "Parkin", "and", "anti", "-", "VDAC1", "antibodies", ".", "β", "-", "Actin", "probing", "served", "as", "a", "loading", "control", "in", "a", "-", "c", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ";", "Ub", ",", "ubiquitin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Western blot analysis of parental SH-SY5Y cells treated with CCCP for the indicated times. Time-course experiments of CCCP-treated neuronal cells reveal increasing modifications of VDAC1 over time. Total lysates were prepared, and western blots were probed with specific anti-Parkin, anti-PINK1, anti-TOM20 and anti-VDAC1 antibodies. All proteins represent endogenous levels.(b) Immunoprecipitations of Parkin and VDAC1 from parental SH-SY5Y cells confirm ubiquitylation of both proteins. CCCP treatment of neuronal cells increases ubiquitylated species of endogenous Parkin and VDAC1 over time. Using specific antibodies, Parkin and VDAC1 were immunoprecipitated from lysates of parental SH-SY5Y cells at different time points, western blotted and probed with anti-ubiquitin, anti-Parkin and anti-VDAC1 antibodies.(c) Pathogenic Parkin mutations fail to poly-ubiquitylate endogenous VDAC1 in response to CCCP treatment. Western blot analysis of a time-course experiment with inducible Parkin SH-SY5Y cells after CCCP treatment. Total lysates were prepared, and western blots were probed with specific anti-Parkin and anti-VDAC1 antibodies. β-Actin probing served as a loading control in a-c. WT, wild-type; Ub, ubiquitin."}
{"words": ["figf8VDAC1", "-", "specific", "siRNA", "abrogates", "Parkin", "translocation", "to", "mitochondria", "after", "2", "h", ",", "and", "mitochondrial", "clearance", "after", "24", "h", ",", "of", "CCCP", "treatment", ".", "Both", "effects", "can", "be", "rescued", "by", "re", "-", "transfection", "with", "wild", "-", "type", "VDAC1", ".", "(", "a", ")", "Immunofluorescence", "and", "(", "b", ")", "western", "blot", "of", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "used", "in", "c", "-", "g", "demonstrate", "partial", "silencing", "of", "endogenous", "VDAC1", ".", "(", "a", ")", "Silenced", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "HtrA2", "/", "Omi", ",", "a", "mitochondrial", "marker", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", ",", "and", "anti", "-", "VDAC1", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "(", "b", ")", "Lysates", "from", "silenced", "cells", "were", "subjected", "to", "western", "blot", "analysis", "and", "probed", "with", "an", "anti", "-", "VDAC1", "antibody", ",", "while", "TOM20", "and", "β", "-", "actin", "probing", "served", "as", "loading", "controls", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Control", "siRNA", "-", "or", "VDAC1", "siRNA", "-", "silenced", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "EGFP", "-", "Parkin", "wild", "-", "type", ",", "VDAC1", "-", "Flag", "wild", "-", "type", "or", "appropriate", "empty", "vector", "controls", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "2", "h", "and", "24", "h", "and", "stained", "with", "anti", "-", "HtrA2", "/", "Omi", "(", "pseudo", "coloured", ";", "blue", ")", "and", "anti", "-", "Flag", "(", "red", ")", "to", "visualize", "mitochondrial", "morphology", "and", "re", "-", "transfected", "VDAC1", ",", "respectively", ".", "Wild", "-", "type", "Parkin", "was", "visualized", "by", "EGFP", "epifluorescence", "(", "green", ")", ".", "Parkin", "-", "positive", "cells", "are", "surrounded", "by", "a", "line", ".", "Representative", "pictures", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Quantification", "of", "d", "(", "f", ")", "and", "e", "(", "g", ")", ".", "Parkin", "wild", "-", "type", "colocalization", "with", "impaired", "mitochondria", "after", "2", "h", "(", "f", ")", "and", "uncleared", "mitochondria", "after", "24", "h", "(", "g", ")", "of", "CCCP", "treatment", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "compared", "with", "control", "siRNA", "-", "transfected", "or", "with", "VDAC1", "-", "Flag", "wild", "-", "type", "-", "transfected", "cells", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8VDAC1-specific siRNA abrogates Parkin translocation to mitochondria after 2 h, and mitochondrial clearance after 24 h, of CCCP treatment. Both effects can be rescued by re-transfection with wild-type VDAC1. (a) Immunofluorescence and (b) western blot of siRNA-transfected HeLa cells used in c-g demonstrate partial silencing of endogenous VDAC1. (a) Silenced cells were stained with anti-HtrA2/Omi, a mitochondrial marker (pseudo coloured; blue), and anti-VDAC1 (red) antibodies. (b) Lysates from silenced cells were subjected to western blot analysis and probed with an anti-VDAC1 antibody, while TOM20 and β-actin probing served as loading controls.(c-e) Control siRNA- or VDAC1 siRNA-silenced HeLa cells were transfected with the indicated combinations of EGFP-Parkin wild-type, VDAC1-Flag wild-type or appropriate empty vector controls. Cells were treated with CCCP for 2 h and 24 h and stained with anti-HtrA2/Omi (pseudo coloured; blue) and anti-Flag (red) to visualize mitochondrial morphology and re-transfected VDAC1, respectively. Wild-type Parkin was visualized by EGFP epifluorescence (green). Parkin-positive cells are surrounded by a line. Representative pictures of three independent experiments are shown. Scale bars, 10 μm.(f, g) Quantification of d (f) and e (g). Parkin wild-type colocalization with impaired mitochondria after 2 h (f) and uncleared mitochondria after 24 h (g) of CCCP treatment (n = 3). Data represent the mean ± s.d., *P ≤ 0.05 compared with control siRNA-transfected or with VDAC1-Flag wild-type-transfected cells."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Acyl", "-", "RAC", "assay", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "EtOH", ":", "ethanol", ";", "HAM", ":", "hydroxylamine", ";", "2", "-", "BP", ":", "2", "-", "bromopalmitate", "(", "B", ")", "Acyl", "-", "RAC", "assay", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "FL", ":", "full", "length", ";", "N", ":", "N", "-", "terminal", "domain", ";", "C", ":", "C", "-", "terminal", "domain", "(", "C", ")", "Click", "chemistry", "was", "applied", "to", "detect", "endogenous", "cGAS", "palmitoylation", "in", "RAW264", ".", "7", "cells", ".", "Data", "information", ":", "PA", ":", "palmitic", "acid", ";", "17", "-", "ODYA", ":", "17", "-", "octadecanoic", "acid", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "In", "vitro", "palmitoylation", "assay", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "NBD", "-", "Palm", "-", "CoA", ":", "(", "N", "-", "[", "(", "7", "-", "nitro", "-", "2", "-", "1", ",", "3", "-", "benzoxadiazol", "-", "4", "-", "yl", ")", "-", "methyl", "]", "amino", ")", "palmitoyl", "-", "CoA", ".", "The", "recombinant", "cGAS", "protein", "used", "in", "the", "assay", "was", "indicated", "by", "Coomassie", "blue", "staining", ".", "(", "F", ")", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "of", "palmitoylated", "peptides", "of", "cGAS", ".", "(", "G", ")", "Acyl", "-", "RAC", "assay", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "HAM", ":", "hydroxylamine", "(", "H", "-", "I", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "2", "-", "BP", "(", "50", "μM", ")", "(", "H", ")", "or", "palmitic", "acid", "(", "100", "μM", ")", "(", "I", ")", "for", "12", "h", ".", "Six", "hours", "after", "transfection", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", ",", "cGAMP", "was", "extracted", "and", "quantified", "by", "cGAMP", "ELISA", ".", "Data", "information", ":", "2", "-", "BP", ":", "2", "-", "bromopalmitate", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "J", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "palmitic", "acid", "(", "0", ",", "50", "μM", ",", "or", "100", "μM", ")", "for", "12", "h", "before", "a", "cGAMP", "bioassay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001BMDMs", "were", "treated", "with", "palmitic", "acid", "(", "0", ",", "100", "μM", ",", "or", "200", "μM", ")", "for", "12", "h", "and", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "6", "h", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Ifna4", "(", "K", ")", ",", "IFNb1", "(", "L", ")", "expression", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001BMDMs", "were", "treated", "with", "palmitic", "acid", "(", "0", ",", "100", "μM", ",", "or", "200", "μM", ")", "for", "12", "h", "and", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "6", "h", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", ",", "Cxcl10", "(", "M", ")", "and", "Rantes", "(", "N", ")", "expression", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "O", ")", "L929", "cells", "were", "treated", "with", "BSA", "and", "palmitic", "acid", "(", "100", "μM", ")", "and", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "immunoblotting", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Acyl-RAC assay of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 24 h. Data information: EtOH: ethanol; HAM: hydroxylamine; 2-BP: 2-bromopalmitate(B) Acyl-RAC assay of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 24 h. Data information: FL: full length; N: N-terminal domain; C: C-terminal domain(C) Click chemistry was applied to detect endogenous cGAS palmitoylation in RAW264.7 cells. Data information: PA: palmitic acid; 17-ODYA: 17-octadecanoic acid.(D and E) In vitro palmitoylation assay for the indicated proteins. NBD-Palm-CoA: (N-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)-methyl] amino) palmitoyl-CoA. The recombinant cGAS protein used in the assay was indicated by Coomassie blue staining.(F) LC-MS/MS analysis of palmitoylated peptides of cGAS.(G) Acyl-RAC assay of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 24 h. Data information: HAM: hydroxylamine(H-I) THP-1 cells were treated with DMSO or 2-BP (50 μM) (H) or palmitic acid (100 μM) (I) for 12 h. Six hours after transfection with HT-DNA (2 μg/mL), cGAMP was extracted and quantified by cGAMP ELISA. Data information: 2-BP: 2-bromopalmitate Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.005; ***, P˂0.001(J) THP-1 cells were treated with palmitic acid (0, 50 μM, or 100 μM) for 12 h before a cGAMP bioassay. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.005; ***, P˂0.001BMDMs were treated with palmitic acid (0, 100 μM, or 200 μM) for 12 h and transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for 6 h before RT-qPCR analysis of Ifna4 (K), IFNb1 (L) expression. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.005; ***, P˂0.001BMDMs were treated with palmitic acid (0, 100 μM, or 200 μM) for 12 h and transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for 6 h before RT-qPCR analysis of , Cxcl10 (M) and Rantes (N) expression. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.005; ***, P˂0.001(O) L929 cells were treated with BSA and palmitic acid (100 μM) and transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for the indicated times before immunoblotting analysis with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Acyl", "-", "RAC", "assay", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "cGAS", "24", "h", "after", "transfection", "with", "the", "indicated", "shRNA", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "palmitoylation", "levels", "of", "Flag", "-", "cGAS", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "C", ")", "Acyl", "-", "RAC", "assay", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "HAM", ":", "hydroxylamine", ".", "(", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "cGAS", "(", "WT", "or", "C474S", "mutant", ")", "(", "200", "ng", ")", ",", "Flag", "-", "STING", "(", "200", "ng", ")", "and", "Myc", "-", "ZDHHC18", "(", "200", "ng", ")", "expression", "plasmids", "for", "24", "h", "before", "luciferase", "reporter", "assays", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "D", "(", "E", "and", "F", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", ";", "FL", ":", "full", "length", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "HA", "-", "cGAS", "and", "Flag", "-", "ZDHHC18", "truncations", "or", "GFP", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", ";", "FL", ":", "full", "length", "(", "J", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "HA", "-", "ZDHHC18", "and", "Flag", "-", "cGAS", "truncates", "or", "GFP", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", "(", "K", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "HA", "-", "cGAS", "(", "green", ")", "and", "Flag", "-", "ZDHHC18", "(", "red", ")", "in", "HT", "-", "DNA", "-", "stimulated", "(", "or", "not", ")", "HeLa", "cells", ".", "Scale", "bars", ":", "7", "μm", ".", "(", "L", ")", "Colocalization", "(", "merged", "volume", "of", "total", "cGAS", "signal", ")", "of", "cGAS", "and", "ZDHHC18", "in", "(", "K", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "L", ")", ".", "(", "M", "-", "N", ")", "Comparison", "of", "the", "binding", "free", "energy", "(", "M", ")", "and", "binding", "energy", "decomposition", "of", "a", "per", "-", "residue", "to", "the", "binding", "affinity", "between", "ZDHHC18", "and", "cGAS", "(", "N", ")", "in", "different", "complexes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Acyl-RAC assay of HEK293T cells transfected with Flag-cGAS 24 h after transfection with the indicated shRNA. (B) Quantification of palmitoylation levels of Flag-cGAS in (A). Data information:(C) Acyl-RAC assay of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 24 h. HAM: hydroxylamine.(D) HEK293T cells were transfected with HA-cGAS (WT or C474S mutant) (200 ng), Flag-STING (200 ng) and Myc-ZDHHC18 (200 ng) expression plasmids for 24 h before luciferase reporter assays. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; **, P˂0.005; ***, P˂0.001 (D(E and F) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids for 24 h. Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation; FL: full length(H) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding HA-cGAS and Flag-ZDHHC18 truncations or GFP for 24 h. Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation; FL: full length(J) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding HA-ZDHHC18 and Flag-cGAS truncates or GFP for 24 h. Data information: WCL: whole-cell lysate(K) Immunofluorescence analysis of HA-cGAS (green) and Flag-ZDHHC18 (red) in HT-DNA-stimulated (or not) HeLa cells. Scale bars: 7 μm. (L) Colocalization (merged volume of total cGAS signal) of cGAS and ZDHHC18 in (K). Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; **, P˂0.005; ***, P˂0.001 L).(M-N) Comparison of the binding free energy (M) and binding energy decomposition of a per-residue to the binding affinity between ZDHHC18 and cGAS (N) in different complexes."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "GFP", "-", "cGAS", ",", "the", "nucleus", "(", "DAPI", ")", ",", "the", "ER", "(", "calnexin", ")", ",", "the", "Golgi", "apparatus", "(", "GM130", ")", ",", "and", "early", "endosomes", "(", "EEA1", ")", "in", "HeLa", "cells", ".", "2", "-", "BP", ":", "2", "-", "bromopalmitate", ";", "ISD", ":", "IFN", "-", "stimulatory", "DNA", ".", "Arrows", "indicate", "cGAS", "puncta", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "(", "F", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Biotin", "-", "conjugated", "ISD", "was", "transfected", "into", "cells", "6", "h", "before", "harvesting", ".", "Lysates", "were", "coprecipitated", "with", "streptavidin", "beads", "and", "then", "assessed", "by", "immunoblot", "analysis", "as", "shown", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "G", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Biotin", "-", "conjugated", "ISD", "was", "transfected", "into", "cells", "6", "h", "before", "harvesting", ".", "Lysates", "were", "coprecipitated", "with", "streptavidin", "beads", "and", "then", "assessed", "by", "immunoblot", "analysis", "as", "shown", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "BMDMs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "−", "/", "−", ")", "transfected", "with", "FITC", "-", "conjugated", "ISD", "for", "6", "h", "(", "left", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunofluorescence analysis of GFP-cGAS, the nucleus (DAPI), the ER (calnexin), the Golgi apparatus (GM130), and early endosomes (EEA1) in HeLa cells. 2-BP: 2-bromopalmitate; ISD: IFN-stimulatory DNA. Arrows indicate cGAS puncta. Scale bars: 10 μm.(F HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids. Biotin-conjugated ISD was transfected into cells 6 h before harvesting. Lysates were coprecipitated with streptavidin beads and then assessed by immunoblot analysis as shown. Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation. Data are representative of at least two independent experiments.G) HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids. Biotin-conjugated ISD was transfected into cells 6 h before harvesting. Lysates were coprecipitated with streptavidin beads and then assessed by immunoblot analysis as shown. Data information: WCL: whole-cell lysate; Data are representative of at least two independent experiments.(H) Confocal microscopy of BMDMs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18−/−) transfected with FITC-conjugated ISD for 6 h (left). Scale bar: 20 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Cross", "-", "correlated", "motions", "of", "the", "Cα", "atoms", "of", "the", "WT", "and", "palmitoylated", "cGAS", "proteins", ".", "(", "D", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "cGAS", ",", "HA", "-", "cGAS", ",", "and", "Myc", "-", "ZDHHC18", "(", "WT", "or", "CS", "mutant", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", ";", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "followed", "by", "the", "addition", "of", "DMSO", ",", "2", "-", "BP", "(", "50", "μM", ")", "or", "palmitic", "acid", "(", "100", "μM", ")", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", ";", "2", "-", "BP", ":", "2", "-", "bromopalmitate", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "FRET", "assay", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "with", "the", "addition", "of", "DMSO", ",", "2", "-", "BP", "(", "50", "μM", ")", "or", "palmitic", "acid", "(", "100", "μM", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "8", "μm", ".", "(", "G", ")", "FRET", "efficiency", "of", "cGAS", "-", "GFP", "and", "cGAS", "-", "mCherry", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "2", "-", "BP", ":", "2", "-", "bromopalmitate", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "G", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "(", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ")", "and", "immunoblot", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "cGAS", "and", "HA", "-", "cGAS", "(", "WT", ",", "C405S", ",", "C409S", "and", "C474S", ")", "expression", "plasmids", ".", "Data", "information", ":", "WCL", ":", "whole", "-", "cell", "lysate", ";", "IP", ":", "immunoprecipitation", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "FRET", "assay", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Scale", "bar", ":", "8", "μm", ".", "(", "J", ")", "FRET", "efficiency", "of", "cGAS", "-", "GFP", "and", "cGAS", "-", "mCherry", "in", "(", "I", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "J", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Cross-correlated motions of the Cα atoms of the WT and palmitoylated cGAS proteins.(D) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding Flag-cGAS, HA-cGAS, and Myc-ZDHHC18 (WT or CS mutant) for 24 h. Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation; Data are representative of at least two independent experiments.(E) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with the indicated plasmids followed by the addition of DMSO, 2-BP (50 μM) or palmitic acid (100 μM). Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation; 2-BP: 2-bromopalmitate. Data are representative of at least two independent experiments.(F) FRET assay of HeLa cells transfected with the indicated plasmids with the addition of DMSO, 2-BP (50 μM) or palmitic acid (100 μM). Scale bar: 8 μm. (G) FRET efficiency of cGAS-GFP and cGAS-mCherry in (F). Data information: 2-BP: 2-bromopalmitate. Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; *, P˂0.01. ***, P˂0.001 (G(H) Immunoprecipitation (with an anti-Flag antibody) and immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with Flag-cGAS and HA-cGAS (WT, C405S, C409S and C474S) expression plasmids. Data information: WCL: whole-cell lysate; IP: immunoprecipitation Data are representative of at least two independent experiments.(I) FRET assay of HeLa cells transfected with the indicated plasmids. Scale bar: 8 μm. (J) FRET efficiency of cGAS-GFP and cGAS-mCherry in (I). Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; *, P˂0.01. ***, P˂0.001 J)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HEK293T", "cells", "(", "5", "×", "105", ")", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "cGAS", "(", "200", "ng", ")", ",", "Flag", "-", "STING", "(", "200", "ng", ")", "and", "Myc", "-", "ZDHHC18", "(", "WT", "or", "CS", "mutant", ")", "expression", "plasmids", "(", "0", ",", "50", ",", "100", ",", "or", "200", "ng", ")", "for", "24", "h", "before", "luciferase", "reporter", "assays", "were", "conducted", ".", "Data", "information", ":", "ZDHHC18", "(", "CS", ")", ":", "a", "catalytic", "mutant", "with", "a", "cysteine", "-", "to", "-", "serine", "substitution", "in", "the", "DHHC", "motif", "of", "ZDHHC18", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "A", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "(", "1", "×", "106", ")", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "cGAS", "(", "500", "ng", ")", ",", "Flag", "-", "STING", "(", "500", "ng", ")", "and", "Myc", "-", "ZDHHC18", "(", "500", "ng", ")", "expression", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "TBK1", "phosphorylation", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "information", ":", "ZDHHC18", "(", "CS", ")", ":", "a", "catalytic", "mutant", "with", "a", "cysteine", "-", "to", "-", "serine", "substitution", "in", "the", "DHHC", "motif", "of", "ZDHHC18", "(", "C", "and", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ",", "and", "the", "amount", "of", "cGAMP", "in", "the", "lysates", "was", "quantified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ".", "Data", "information", ":", "ZDHHC18", "(", "CS", ")", ":", "a", "catalytic", "mutant", "with", "a", "cysteine", "-", "to", "-", "serine", "substitution", "in", "the", "DHHC", "motif", "of", "ZDHHC18", ";", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ":", "liquid", "chromatography", "-", "tandem", "mass", "spectrometry", ";", "L929", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "ZDHHC18", "shRNA", "The", "knockdown", "efficiency", "of", "ZDHHC18", "is", "shown", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "E", ")", "results", ".", "Data", "information", ":", "NC", ":", "negative", "control", ".", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001L929", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "ZDHHC18", "shRNA", "efficiency", "of", "ZDHHC18", "is", "shown", "by", "western", "blotting", "(", "F", ")", "results", ".", "Data", "information", ":", "NC", ":", "negative", "control", ".", "L929", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "ZDHHC18", "shRNA", "were", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Ifna4", "(", "G", ")", ",", "expression", ".", "Data", "information", ":", "HT", "-", "DNA", ":", "herring", "testis", "DNA", ";", "NC", ":", "negative", "control", ".", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001L929", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "ZDHHC18", "shRNA", "were", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "IFNb1", "(", "H", ")", ",", "and", "Cxcl10", "(", "I", ")", "expression", ".", "Data", "information", ":", "HT", "-", "DNA", ":", "herring", "testis", "DNA", ";", "NC", ":", "negative", "control", ".", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "ns", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", "(", "J", ")", "L929", "cells", "stably", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "ZDHHC18", "shRNA", "were", "transfected", "with", "HT", "-", "DNA", "(", "2", "μg", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "immunoblotting", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "HT", "-", "DNA", ":", "herring", "testis", "DNA", ";", "NC", ":", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HEK293T cells (5×105) were transfected with HA-cGAS (200 ng), Flag-STING (200 ng) and Myc-ZDHHC18 (WT or CS mutant) expression plasmids (0, 50, 100, or 200 ng) for 24 h before luciferase reporter assays were conducted. Data information: ZDHHC18(CS): a catalytic mutant with a cysteine-to-serine substitution in the DHHC motif of ZDHHC18 All data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.01; ***, P˂0.001 (A(B) HEK293T cells (1×106) were transfected with HA-cGAS (500 ng), Flag-STING (500 ng) and Myc-ZDHHC18 (500 ng) expression plasmids for 24 h. TBK1 phosphorylation was detected by immunoblotting. Data information: ZDHHC18(CS): a catalytic mutant with a cysteine-to-serine substitution in the DHHC motif of ZDHHC18(C and D) HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids, and the amount of cGAMP in the lysates was quantified by LC-MS/MS. Data information: ZDHHC18(CS): a catalytic mutant with a cysteine-to-serine substitution in the DHHC motif of ZDHHC18; LC-MS/MS: liquid chromatography-tandem mass spectrometry;L929 cells stably transfected with control shRNA or ZDHHC18 shRNA The knockdown efficiency of ZDHHC18 is shown by RT-qPCR (E) results. Data information: NC: negative control. All data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.01; ***, P˂0.001L929 cells stably transfected with control shRNA or ZDHHC18 shRNA efficiency of ZDHHC18 is shown by western blotting (F) results. Data information: NC: negative control.L929 cells stably transfected with control shRNA or ZDHHC18 shRNA were transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for the indicated times before RT-qPCR analysis of Ifna4 (G), expression. Data information: HT-DNA: herring testis DNA; NC: negative control. All data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.01; ***, P˂0.001L929 cells stably transfected with control shRNA or ZDHHC18 shRNA were transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for the indicated times before RT-qPCR analysis of IFNb1 (H), and Cxcl10 (I) expression. Data information: HT-DNA: herring testis DNA; NC: negative control. All data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; ns, not significant; **, P˂0.01; ***, P˂0.001(J) L929 cells stably transfected with control shRNA or ZDHHC18 shRNA were transfected with HT-DNA (2 μg/mL) for the indicated times before immunoblotting analysis with the indicated antibodies. Data information: HT-DNA: herring testis DNA; NC: negative control."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Survival", "analysis", "of", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "and", "Zdhhc18", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "8", "each", ",", "6", "-", "8", "weeks", "old", ")", "intranasally", "injected", "with", "VACV", "(", "5", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", "and", "monitored", "daily", "for", "survival", "for", "13", "days", "using", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "and", "a", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Representative", "photomicrographs", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "liver", "and", "kidney", "tissue", "sections", "from", "mice", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "intravenously", "injected", "with", "HSV", "-", "1", "-", "FS", "(", "5", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", "or", "not", "after", "2", "days", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", "(", "liver", ")", ",", "200", "μm", "(", "kidney", ")", ".", "Data", "information", ":", "PFU", ":", "plaque", "-", "forming", "units", ";", "H", "&", "E", ":", "hematoxylin", "-", "eosin", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "C", "BMDMs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "(", "MOI", "=", "2", ")", "for", "8", "h", ",", "and", "viral", "titers", "in", "the", "supernatants", "were", "quantified", "by", "plaque", "assay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "D", ")", "BMDMs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "(", "MOI", "=", "2", ")", "for", "8", "h", ",", "and", "viral", "titers", "in", "the", "supernatants", "were", "quantified", "by", "plaque", "assay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "Ns", ":", "no", "significance", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "0001", "(", "D", "(", "E", "Frequency", "of", "GFP", "+", "cells", "among", "infected", "cells", "(", "E", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "Ns", ":", "no", "significance", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "0001F", ")", "Microscopy", "of", "BMDMs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "GFP", "-", "HSV", "-", "1", "(", "MOI", "=", "1", ")", "for", "10", "h", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "MEFs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "VACV", "(", "1", ":", "200", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "MEFs", "(", "Zdhhc18", "+", "/", "+", "or", "Zdhhc18", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "VACV", "(", "1", ":", "200", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Cxcl10", "(", "H", ")", "and", "Ifnb1", "(", "I", ")", "expression", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "Ns", ":", "no", "significance", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "0001", "(", "J", ")", "PBMCs", "from", "healthy", "people", "were", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "or", "ZDHHC18", "siRNA", "(", "cocktail", ")", "for", "48", "h", "and", "then", "infected", "with", "VACV", "(", "1", ":", "200", ")", "for", "the", "indicated", "times", "before", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "IFNB1", "expression", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "triplicates", "of", "technical", "replicates", ",", "unpaired", "t", "test", ";", "Ns", ":", "no", "significance", ";", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "˂", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Survival analysis of Zdhhc18+/+ and Zdhhc18-/- mice (n = 8 each, 6-8 weeks old) intranasally injected with VACV (5 × 107 PFU per mouse) and monitored daily for survival for 13 days using Kaplan-Meier curves and a log-rank (Mantel-Cox) test. ***, P˂0.001.(B) Representative photomicrographs of H&E-stained liver and kidney tissue sections from mice (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) intravenously injected with HSV-1-FS (5 × 107 PFU per mouse) or not after 2 days. Scale bars: 100 μm (liver), 200 μm (kidney). Data information: PFU: plaque-forming units; H&E: hematoxylin-eosin. Data are representative of at least two independent experiments.(C BMDMs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) were infected with HSV-1 (MOI=2) for 8 h, and viral titers in the supernatants were quantified by plaque assay. Data information: Data are representative of at least two independent experiments.D) BMDMs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) were infected with HSV-1 (MOI=2) for 8 h, and viral titers in the supernatants were quantified by plaque assay. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; Ns: no significance; *, P˂0.05; **, P˂0.01; ****, P˂0.0001 (D(E Frequency of GFP+ cells among infected cells (E). Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; Ns: no significance; *, P˂0.05; **, P˂0.01; ****, P˂0.0001F) Microscopy of BMDMs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) infected with GFP-HSV-1 (MOI=1) for 10 h. Scale bar: 200 μm. Data information: Data are representative of at least two independent experiments.(G) MEFs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) were infected with VACV (1:200) for the indicated times before immunoblot analysis.(H and I) MEFs (Zdhhc18+/+ or Zdhhc18-/-) were infected with VACV (1:200) for the indicated times before RT-qPCR analysis of Cxcl10 (H) and Ifnb1 (I) expression. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; Ns: no significance; *, P˂0.05; **, P˂0.01; ****, P˂0.0001(J) PBMCs from healthy people were transfected with scrambled siRNA or ZDHHC18 siRNA (cocktail) for 48 h and then infected with VACV (1:200) for the indicated times before RT-qPCR analysis of IFNB1 expression. Data information: Data are representative of at least two independent experiments. Mean ± SEM from triplicates of technical replicates, unpaired t test; Ns: no significance; *, P˂0.05; **, P˂0.01; ****, P˂0.0001"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "analysis", "showing", "head", "enrichment", "of", "dEsyt", ";", "the", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "wild", "type", "tissues", "from", "which", "RNA", "was", "isolated", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "dEsyt", "transcript", "level", "expression", "normalized", "to", "the", "loading", "control", "(", "RP49", "-", "Ribosomal", "protein", "49", ")", ",", "n", "=", "3", "replicates", "(", "biological", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "analysis", "showing", "dEsyt", "transcript", "level", "expression", "in", "head", "RNA", "samples", "from", "wild", "type", "and", "sOD", ".", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "dEsyt", "transcript", "level", "expression", "normalized", "to", "the", "loading", "control", "(", "RP49", "-", "Ribosomal", "protein", "49", ")", ",", "n", "=", "3", "replicates", "(", "biological", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Quantitative real time PCR analysis showing head enrichment of dEsyt; the X-axis indicates the wild type tissues from which RNA was isolated and Y-axis indicates the dEsyt transcript level expression normalized to the loading control (RP49- Ribosomal protein 49), n=3 replicates (biological).(D) Quantitative real time PCR analysis showing dEsyt transcript level expression in head RNA samples from wild type and sOD. Y-axis indicates the dEsyt transcript level expression normalized to the loading control (RP49- Ribosomal protein 49), n=3 replicates (biological)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "ERG", "trace", "from", "dark", "reared", "0", "-", "1", "day", "old", "flies", "of", "the", "indicated", "genotype", "stimulated", "by", "2s", "flash", "of", "green", "light", ".", "The", "duration", "of", "the", "stimulating", "light", "is", "shown", ".", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "amplitude", "of", "the", "ERG", "response", ".", "X", "-", "axis", "shows", "the", "duration", "of", "the", "recording", ".", "(", "B", ")", "Graph", "showing", "ERG", "amplitude", "normalized", "to", "body", "weight", ".", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "ratio", "of", "ERG", "amplitude", "of", "individual", "flies", "to", "their", "body", "weight", ".", "X", "-", "axis", "indicates", "genotypes", ".", "Each", "data", "point", "represents", "an", "individual", "fly", "tested", ".", "Error", "bar", "represents", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "deep", "pseudopupil", "formed", "by", "the", "PIP2", "probe", "PH", "-", "GFP", "in", "the", "one", "day", "old", "flies", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "(", "D", ")", "Deep", "pseudopupil", "imaging", "of", "PIP2", "levels", "in", "the", "microvillar", "membrane", "of", "photoreceptors", ".", "The", "fluorescence", "of", "the", "PH", "-", "GFP", "probe", "is", "depicted", ".", "The", "protocol", "used", "is", "shown", "with", "red", "light", "illumination", "periods", "shown", "as", "red", "bars", "and", "flashes", "of", "blue", "light", "(", "a", "-", "f", ")", "used", "for", "image", "capture", "depicted", ".", "Representative", "deep", "pseudopupil", "images", "acquired", "at", "specified", "time", "points", "are", "depicted", ".", "Genotypes", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "Graph", "quantifying", "the", "recovery", "kinetics", "of", "the", "fluorescent", "pseudopupil", "with", "time", ",", "X", "-", "axis", "represents", "the", "genotypes", ",", "Y", "-", "axis", "represent", "intensity", "normalised", "to", "the", "intensity", "of", "the", "first", "image", ".", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "time", "course", "of", "retinal", "degeneration", ".", "10", "ommatidia", "from", "5", "separate", "flies", "of", "each", "genotype", "were", "scored", "and", "plotted", ".", "Y", "-", "axis", "is", "the", "number", "of", "intact", "rhabdomeres", "/", "ommatidium", ".", "The", "maximum", "value", "possible", "is", "7", ".", "X", "-", "axis", "is", "the", "age", "of", "the", "flies", "post", "eclosion", ".", "(", "G", ")", "Representative", "optical", "neutralization", "images", "showing", "rhabdomere", "integrity", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Rearing", "conditions", "and", "the", "age", "of", "the", "flies", "are", "indicated", "on", "top", ".", "(", "*", "CL", "-", "Constant", "Light", ")", "(", "H", ")", "Representative", "ON", "images", "showing", "the", "rescue", "of", "rhabdomere", "structural", "integrity", "in", "dEsytKO", "mutants", "on", "expressing", "the", "dEsyt", ":", ":", "mCherry", "transgene", ".", "Genotypes", "of", "the", "flies", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "Rearing", "conditions", "and", "the", "age", "of", "the", "flies", "are", "indicated", "on", "top", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative ERG trace from dark reared 0-1 day old flies of the indicated genotype stimulated by 2s flash of green light. The duration of the stimulating light is shown. Y-axis shows the amplitude of the ERG response. X-axis shows the duration of the recording.(B) Graph showing ERG amplitude normalized to body weight. Y-axis shows the ratio of ERG amplitude of individual flies to their body weight. X-axis indicates genotypes. Each data point represents an individual fly tested. Error bar represents s.e.m.(C) Quantification of the mean fluorescence intensity of the deep pseudopupil formed by the PIP2 probe PH-GFP in the one day old flies of the indicated genotypes (n=10).(D) Deep pseudopupil imaging of PIP2 levels in the microvillar membrane of photoreceptors. The fluorescence of the PH-GFP probe is depicted. The protocol used is shown with red light illumination periods shown as red bars and flashes of blue light (a-f) used for image capture depicted. Representative deep pseudopupil images acquired at specified time points are depicted. Genotypes as indicated.(E) Graph quantifying the recovery kinetics of the fluorescent pseudopupil with time, X-axis represents the genotypes, Y-axis represent intensity normalised to the intensity of the first image. (n=10 biological replicates). Error bars represent s.e.m.(F) Quantification of the time course of retinal degeneration. 10 ommatidia from 5 separate flies of each genotype were scored and plotted. Y-axis is the number of intact rhabdomeres/ommatidium. The maximum value possible is 7. X-axis is the age of the flies post eclosion.(G) Representative optical neutralization images showing rhabdomere integrity of the indicated genotypes. Rearing conditions and the age of the flies are indicated on top. (*CL- Constant Light)(H) Representative ON images showing the rescue of rhabdomere structural integrity in dEsytKO mutants on expressing the dEsyt::mCherry transgene. Genotypes of the flies are indicated on the left. Rearing conditions and the age of the flies are indicated on top."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "(", "i", ")", "Representative", "optical", "neutralization", "(", "ON", ")", "images", "showing", "rhabdomere", "structure", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Rearing", "conditions", "and", "the", "age", "of", "the", "flies", "are", "indicated", "on", "top", ".", "(", "*", "CD", "-", "Constant", "Dark", ")", ".", "(", "ii", ")", "TEM", "images", "showing", "a", "single", "ommatidium", "from", "the", "photoreceptors", "of", "rdgB9", "and", "rdgB9", ";", "dEsytKO", "mutants", "reared", "in", "12", "hr", "L", "/", "D", "cycle", "(", "/", ")", "for", "2", "days", ".", "Scale", "bar", ":", "1µm", "(", "asterisk", "indicates", "degenerated", "rhabdomere", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "time", "course", "taken", "for", "retinal", "degeneration", ".", "10", "ommatidia", "were", "scored", "from", "5", "flies", "of", "each", "genotype", "and", "plotted", ".", "(", "C", ")", "Representative", "ERG", "traces", "showing", "the", "duration", "of", "light", "pulse", ",", "X", "-", "axis", "indicates", "time", "in", "msec", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "average", "ERG", "amplitude", "in", "mV", ".", "(", "D", ")", "Graph", "showing", "ERG", "amplitude", "of", "rdgB9", "and", "rdgB9", ";", "dEsytKO", "normalized", "to", "body", "weight", ".", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "ratio", "of", "ERG", "amplitude", "of", "individual", "flies", "to", "their", "body", "weight", ".", "X", "-", "axis", "indicates", "genotypes", ".", "Each", "data", "point", "represents", "an", "individual", "fly", "tested", ".", "Error", "bar", "represents", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "E", ")", "Deep", "pseudopupil", "imaging", "of", "PIP2", "levels", "in", "the", "microvillar", "membrane", "of", "photoreceptors", ".", "The", "fluorescence", "of", "the", "PH", "-", "GFP", "probe", "is", "depicted", ".", "The", "protocol", "used", "is", "shown", "with", "red", "light", "illumination", "periods", "shown", "as", "red", "bars", "and", "flashes", "of", "blue", "light", "(", "a", "-", "f", ")", "used", "for", "image", "capture", "depicted", ".", "Representative", "deep", "pseudopupil", "images", "acquired", "at", "specified", "time", "points", "are", "depicted", ".", "Genotypes", "as", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "PIP2", "probe", "PH", "-", "GFP", "from", "the", "deep", "pseudopupil", "formed", "by", "one", "day", "old", "flies", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", ".", "(", "G", ")", "Graph", "quantifying", "the", "recovery", "kinetics", "of", "the", "fluorescent", "pseudopupil", "with", "time", ",", "X", "-", "axis", "represents", "the", "genotypes", ",", "Y", "-", "axis", "represent", "intensity", "normalized", "to", "the", "intensity", "of", "the", "first", "image", ".", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) (i) Representative optical neutralization (ON) images showing rhabdomere structure of the indicated genotypes. Rearing conditions and the age of the flies are indicated on top. (*CD- Constant Dark). (ii) TEM images showing a single ommatidium from the photoreceptors of rdgB9 and rdgB9;dEsytKO mutants reared in 12 hr L/D cycle ( / ) for 2 days. Scale bar: 1µm (asterisk indicates degenerated rhabdomere).(B) Quantification of the time course taken for retinal degeneration. 10 ommatidia were scored from 5 flies of each genotype and plotted.(C) Representative ERG traces showing the duration of light pulse, X-axis indicates time in msec and Y-axis indicates the average ERG amplitude in mV.(D) Graph showing ERG amplitude of rdgB9 and rdgB9;dEsytKO normalized to body weight. Y-axis shows the ratio of ERG amplitude of individual flies to their body weight. X-axis indicates genotypes. Each data point represents an individual fly tested. Error bar represents s.e.m.(E) Deep pseudopupil imaging of PIP2 levels in the microvillar membrane of photoreceptors. The fluorescence of the PH-GFP probe is depicted. The protocol used is shown with red light illumination periods shown as red bars and flashes of blue light (a-f) used for image capture depicted. Representative deep pseudopupil images acquired at specified time points are depicted. Genotypes as indicated.(F) Quantification of the mean fluorescence intensity of the PIP2 probe PH-GFP from the deep pseudopupil formed by one day old flies of the indicated genotypes (n=10 biological replicates).(G) Graph quantifying the recovery kinetics of the fluorescent pseudopupil with time, X-axis represents the genotypes, Y-axis represent intensity normalized to the intensity of the first image. (n=10 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "showing", "the", "localization", "of", "endogenous", "dEsyt", "protein", "in", "photoreceptors", "of", "one", "day", "old", "dark", "reared", "flies", "probed", "with", "antibody", "against", "dEsyt", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "dEsytKO", "shows", "no", "staining", "when", "probed", "with", "dEsyt", "antibody", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "showing", "the", "localization", "of", "exogenously", "expressed", "dEsyt", ":", ":", "mCherry", "protein", "expressed", "using", "the", "eye", "specific", "Rh1", "-", "Gal4", "in", "one", "day", "old", "dark", "reared", "flies", ".", "Rh1", "-", "Gal4", "is", "shown", "as", "a", "control", ".", "A", "single", "ommatidium", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "Phalloidin", "marks", "F", "-", "actin", "staining", "and", "highlights", "rhabdomeres", "R1", "-", "R7", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "from", "the", "head", "extracts", "of", "wild", "type", "and", "dEsytKO", "probed", "with", "the", "antibody", "against", "RDGB", ".", "Rearing", "conditions", ",", "age", "of", "the", "flies", "and", "genotype", "is", "indicated", "on", "top", "of", "the", "blot", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Confocal", "images", "showing", "the", "localization", "of", "RDGB", "in", "wild", "type", "and", "dEsytKO", "photoreceptors", "of", "flies", "which", "are", "(", "D", ")", "1", "day", "old", "-", "dark", "reared", "and", "(", "E", ")", "6", "days", "old", "-", "exposed", "to", "constant", "illumination", ".", "For", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", "RDGB", "visualized", "using", "an", "antibody", "against", "the", "endogenous", "protein", ".", "Rhabdomeres", "are", "outlined", "using", "phalloidin", "which", "marks", "F", "-", "actin", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Confocal images showing the localization of endogenous dEsyt protein in photoreceptors of one day old dark reared flies probed with antibody against dEsyt. Scale bar: 5µm. dEsytKO shows no staining when probed with dEsyt antibody.(B) Confocal images showing the localization of exogenously expressed dEsyt::mCherry protein expressed using the eye specific Rh1-Gal4 in one day old dark reared flies. Rh1-Gal4 is shown as a control. A single ommatidium is shown. Scale bar: 5 µm. Phalloidin marks F-actin staining and highlights rhabdomeres R1-R7.(C) Western blot from the head extracts of wild type and dEsytKO probed with the antibody against RDGB. Rearing conditions, age of the flies and genotype is indicated on top of the blot. Tubulin was used as the loading control.(D, E) Confocal images showing the localization of RDGB in wild type and dEsytKO photoreceptors of flies which are (D) 1 day old-dark reared and (E) 6 days old- exposed to constant illumination. For (D) and (E) RDGB visualized using an antibody against the endogenous protein. Rhabdomeres are outlined using phalloidin which marks F-actin. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "wild", "type", "photoreceptors", "of", "flies", "reared", "in", "dark", "(", "i", ")", "day", "1", "(", "D1", ")", "and", "(", "iii", ")", "day", "14", "(", "D14", ")", ",", "scale", "bar", ":", "1µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", ".", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "same", "ommatidium", "(", "ii", ")", "day", "1", "(", "iv", ")", "day", "14", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "Origin", "boxes", "for", "magnification", "shown", ".", "Arrow", "in", "(", "Aiv", ")", "indicates", "the", "SMC", "forming", "an", "MCS", "with", "the", "microvillar", "PM", ".", "M", "-", "Microvillar", "plasma", "membrane", ",", "S", "-", "Sub", "microvillar", "cisternae", ",", "MCS", "-", "Membrane", "Contact", "Site", ",", "P", "-", "Pigment", "granules", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCS", "per", "wild", "type", "photoreceptor", "of", "day", "1", "and", "day", "14", "old", "flies", "reared", "in", "dark", "(", "from", "figure", "6A", ")", ",", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "MCS", "/", "photoreceptor", ".", "n", "=", "30", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R1", "-", "R6", ")", "for", "(", "i", ")", ".", "n", "=", "9", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R7", ")", "in", "(", "ii", ")", ".", "(", "C", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "norpAP24", "photoreceptors", "of", "flies", "reared", "in", "dark", "(", "i", ")", "day", "1", "and", "(", "iii", ")", "day", "14", ",", "scale", "bar", ":", "1µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", ".", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "same", "ommatidium", "(", "ii", ")", "day1", "(", "iv", ")", "day", "14", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "Arrows", "indicate", "the", "SMC", "forming", "an", "MCS", "with", "the", "microvillar", "PM", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCSs", "per", "photoreceptor", "(", "from", "figure", "6C", ")", ",", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "genotype", "and", "age", "of", "the", "flies", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "MCS", "/", "photoreceptor", "(", "i", ")", "n", "=", "30", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R1", "-", "R6", ")", "(", "ii", ")", "n", "=", "9", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R7", ")", "(", "E", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "(", "i", ")", "wild", "type", "and", "(", "iii", ")", "dEsytKO", "photoreceptors", "of", "0", "-", "1", "day", "old", "flies", "reared", "in", "dark", ",", "scale", "bar", ":", "1µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", "(", "ii", ",", "iv", ")", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "ommatidium", "image", "shown", "on", "the", "left", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "Arrows", "indicate", "the", "SMC", "forming", "an", "MCS", "with", "the", "microvillar", "PM", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCS", "per", "photoreceptor", "of", "wild", "type", "day", "1", "v", "/", "s", "dEsytKO", "day", "1", "old", "flies", "reared", "in", "dark", ",", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "genotype", "and", "age", "of", "the", "flies", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "MCS", "/", "photoreceptor", "(", "i", ")", "n", "=", "30", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R1", "-", "R6", ")", "(", "ii", ")", "n", "=", "9", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "(", "R7", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) TEM images of a single ommatidium from wild type photoreceptors of flies reared in dark (i) day 1 (D1) and (iii) day 14 (D14), scale bar: 1µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor). Magnified image showing a single photoreceptor from the same ommatidium (ii) day 1 (iv) day 14. Scale bar: 200 nm. Origin boxes for magnification shown. Arrow in (Aiv) indicates the SMC forming an MCS with the microvillar PM. M- Microvillar plasma membrane, S- Sub microvillar cisternae, MCS- Membrane Contact Site, P- Pigment granules. (B) Quantification of the number of MCS per wild type photoreceptor of day 1 and day 14 old flies reared in dark (from figure 6A), Y-axis indicates the number of MCS/photoreceptor. n=30 photoreceptors from 3 separate flies (R1-R6) for (i). n=9 photoreceptors from 3 separate flies (R7) in (ii). (C) TEM images of a single ommatidium from norpAP24 photoreceptors of flies reared in dark (i) day 1 and (iii) day 14, scale bar: 1µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor). Magnified image showing a single photoreceptor from the same ommatidium (ii) day1 (iv) day 14. Scale bar: 200 nm. Arrows indicate the SMC forming an MCS with the microvillar PM. (D) Quantification of the number of MCSs per photoreceptor (from figure 6C), X-axis indicates the genotype and age of the flies and Y-axis indicates the number of MCS/photoreceptor (i) n=30 photoreceptors from 3 separate flies (R1-R6) (ii) n=9 photoreceptors from 3 separate flies (R7) (E) TEM images of a single ommatidium from (i) wild type and (iii) dEsytKO photoreceptors of 0-1 day old flies reared in dark, scale bar: 1µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor) (ii, iv) Magnified image showing a single photoreceptor from the ommatidium image shown on the left. Scale bar: 200 nm. Arrows indicate the SMC forming an MCS with the microvillar PM. (F) Quantification of the number of MCS per photoreceptor of wild type day 1 v/s dEsytKO day 1 old flies reared in dark, X-axis indicates the genotype and age of the flies and Y-axis indicates the number of MCS/photoreceptor (i) n=30 photoreceptors from 3 separate flies (R1-R6) (ii) n=9 photoreceptors from 3 separate flies (R7)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "photoreceptors", "of", "(", "i", ")", "dEsytKO", "-", "day", "1", "(", "iii", ")", "dEsytKO", "-", "day", "14", "flies", "reared", "in", "dark", ",", "scale", "bar", ":", "1", "µm", "except", "for", "(", "Ai", ")", ":", "2", "µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", ".", "(", "A", "-", "ii", ",", "iv", ")", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "ommatidium", "image", "shown", "on", "the", "left", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "Boxes", "represent", "the", "origin", "boxes", "for", "magnification", ".", "M", "-", "Microvillar", "plasma", "membrane", ",", "S", "-", "Sub", "microvillar", "cisternae", ",", "MCS", "-", "Membrane", "Contact", "Site", ",", "P", "-", "Pigment", "granules", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCS", "per", "photoreceptor", ",", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "genotype", "and", "age", "of", "the", "flies", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "MCS", "/", "photoreceptor", ".", "n", "=", "9", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "for", "R7", ".", "(", "C", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "photoreceptors", "of", "(", "i", ")", "norpAP24", ";", "dEsytKO", "-", "day", "1", "(", "iii", ")", "norpAP24", ";", "dEsytKO", "-", "day", "14", "flies", "reared", "in", "dark", ",", "scale", "bar", ":", "1", "µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", ".", "(", "C", "-", "ii", ",", "iv", ")", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "ommatidium", "image", "shown", "on", "the", "left", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "Arrows", "indicate", "the", "SMC", "forming", "an", "MCS", "with", "the", "microvillar", "PM", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCS", "per", "photoreceptor", ",", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "genotype", "and", "age", "of", "the", "flies", "and", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "number", "of", "MCS", "/", "photoreceptor", ".", "(", "i", ")", "n", "=", "30", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "for", "R1", "-", "R6", ".", "(", "ii", ")", "n", "=", "9", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "for", "R7", ".", "(", "E", ")", "TEM", "images", "of", "a", "single", "ommatidium", "from", "photoreceptors", "of", "(", "i", ")", "rdgB9", "-", "day1", "and", "(", "iii", ")", "rdgB9", ";", "dEsytKO", "-", "day", "1", "flies", "reared", "in", "dark", ",", "scale", "bar", ":", "1", "µm", "(", "red", "asterisk", "indicates", "R7", "photoreceptor", ")", ".", "(", "E", "-", "ii", ",", "iv", ")", "Magnified", "image", "showing", "a", "single", "photoreceptor", "from", "the", "ommatidium", "image", "shown", "on", "the", "left", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "MCS", "per", "photoreceptor", "for", "R1", "-", "R6", "in", "1", "day", "old", "dark", "reared", "wild", "type", "(", "from", "Figure", "5B", "i", ")", ",", "rdgB9", "and", "rdgB9", ";", "dEsytKO", "flies", ".", "n", "=", "30", "photoreceptors", "from", "3", "separate", "flies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) TEM images of a single ommatidium from photoreceptors of (i) dEsytKO- day 1 (iii) dEsytKO- day 14 flies reared in dark, scale bar: 1 µm except for (Ai): 2 µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor). (A-ii, iv) Magnified image showing a single photoreceptor from the ommatidium image shown on the left. Scale bar: 200 nm. Boxes represent the origin boxes for magnification. M- Microvillar plasma membrane, S- Sub microvillar cisternae, MCS- Membrane Contact Site, P- Pigment granules. (B) Quantification of the number of MCS per photoreceptor, X-axis indicates the genotype and age of the flies and Y-axis indicates the number of MCS/photoreceptor. n=9 photoreceptors from 3 separate flies for R7. (C) TEM images of a single ommatidium from photoreceptors of (i) norpAP24;dEsytKO- day 1 (iii) norpAP24;dEsytKO- day 14 flies reared in dark, scale bar: 1 µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor). (C-ii, iv) Magnified image showing a single photoreceptor from the ommatidium image shown on the left. Scale bar: 200 nm. Arrows indicate the SMC forming an MCS with the microvillar PM. (D) Quantification of the number of MCS per photoreceptor, X-axis indicates the genotype and age of the flies and Y-axis indicates the number of MCS/photoreceptor. (i) n=30 photoreceptors from 3 separate flies for R1-R6. (ii) n=9 photoreceptors from 3 separate flies for R7. (E) TEM images of a single ommatidium from photoreceptors of (i) rdgB9-day1 and (iii) rdgB9;dEsytKO - day 1 flies reared in dark, scale bar: 1 µm (red asterisk indicates R7 photoreceptor). (E-ii, iv) Magnified image showing a single photoreceptor from the ommatidium image shown on the left. Scale bar: 200 nm. (F) Quantification of the number of MCS per photoreceptor for R1-R6 in 1 day old dark reared wild type (from Figure 5B i), rdgB9 and rdgB9;dEsytKO flies. n=30 photoreceptors from 3 separate flies. "}
{"words": ["Figure", "1Example", "of", "a", "384", "-", "well", "plate", "treated", "with", "compounds", ".", "The", "panel", "shows", "the", "staining", "with", "filipin", "(", "free", "cholesterol", "in", "green", "pseudo", "-", "colour", ")", "and", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", "(", "red", ")", ".", "The", "leftmost", "column", "shows", "control", "wells", "treated", "with", "DMSO", "only", ",", "and", "the", "right", "penultimate", "column", "shows", "wells", "treated", "with", "U18666A", ".", "Effects", "of", "U18666A", ",", "thioperamide", "and", "trimeprazine", ",", "compared", "with", "controls", ".", "Cells", "treated", "with", "the", "indicated", "compounds", "or", "with", "DMSO", "alone", "for", "18h", "at", "37", "°", "C", ",", "were", "processed", "for", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Low", "magnification", "views", "are", "shown", "after", "staining", "with", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", "(", "red", ")", ",", "filipin", "(", "green", "pseudo", "-", "color", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "scale", "bar", "is", "20", "µm", ".", "Screen", "data", "plot", ".", "The", "plot", "shows", "the", "integrated", "intensity", "of", "LBPA", "vs", ".", "filipin", "(", "cholesterol", ")", "staining", "in", "all", "HeLa", "cells", "of", "each", "well", "analyzed", "in", "the", "screen", "(", "each", "dot", "is", "the", "average", "of", "replicates", "in", "the", "duplicate", "plates", ",", "and", "≥", "600", "cells", "were", "analysed", "per", "compound", ")", ".", "Only", "compounds", "that", "showed", "less", "than", "20", "%", "toxicity", "are", "plotted", ".", "The", "cells", "treated", "with", "U18666A", ",", "thioperamide", "maleate", "and", "trimeprazine", "tartrate", "are", "indicated", ",", "as", "well", "as", "the", "DMSO", "controls", ".", "Integrated", "intensity", "of", "cholesterol", "and", "LBPA", "staining", ".", "The", "integrated", "intensity", "of", "cholesterol", "(", "filipin", "in", "green", ")", "and", "LBPA", "(", "red", ")", "staining", "in", "all", "cells", "of", "the", "indicated", "samples", "is", "quantified", "after", "normalization", "to", "the", "DMSO", "controls", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "64", "images", "analysed", "per", "experiments", ",", "error", "bars", "=", "SD", ",", "two", "ways", "ANOVA", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Example of a 384-well plate treated with compounds. The panel shows the staining with filipin (free cholesterol in green pseudo-colour) and anti-LBPA antibodies (red). The leftmost column shows control wells treated with DMSO only, and the right penultimate column shows wells treated with U18666A.Effects of U18666A, thioperamide and trimeprazine, compared with controls. Cells treated with the indicated compounds or with DMSO alone for 18h at 37°C, were processed for immunofluorescence microscopy. Low magnification views are shown after staining with anti-LBPA antibodies (red), filipin (green pseudo-color) and DAPI (blue). The scale bar is 20 µm.Screen data plot. The plot shows the integrated intensity of LBPA vs. filipin (cholesterol) staining in all HeLa cells of each well analyzed in the screen (each dot is the average of replicates in the duplicate plates, and ≥600 cells were analysed per compound). Only compounds that showed less than 20% toxicity are plotted. The cells treated with U18666A, thioperamide maleate and trimeprazine tartrate are indicated, as well as the DMSO controls.Integrated intensity of cholesterol and LBPA staining. The integrated intensity of cholesterol (filipin in green) and LBPA (red) staining in all cells of the indicated samples is quantified after normalization to the DMSO controls. (n=3 independent experiments, 64 images analysed per experiments, error bars = SD, two ways ANOVA; **=p<0.01; ***=p<0.005)."}
{"words": ["Figure", "2Thioperamide", "treatment", "of", "tissue", "culture", "cells", ".", "BHK", ",", "CHO", "and", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "thioperamide", "and", "processed", "as", "in", "Fig", "1C", ".", "Low", "magnification", "views", "are", "shown", "after", "staining", "with", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", ">", "200", "images", "acquired", "and", "analysed", "automatically", ".", "Cholesterol", "quantification", "by", "mass", "spectrometry", ".", "A431", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "alone", ",", "pitolisant", "10µM", "(", "Pito", ")", ",", "thioperamide", "10µM", "(", "thio", ")", "or", "U18666A", "10µM", "(", "U18", ")", "for", "18h", "at", "37", "°", "C", ".", "After", "extraction", ",", "free", "cholesterol", ",", "cholesteryl", "esters", "and", "total", "cholesterol", "were", "quantified", "by", "mass", "spectrometry", ",", "and", "normalized", "to", "the", "DMSO", "controls", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "=", "SD", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001Screen", "data", "plot", "of", "the", "cholesterol", "content", "of", "LBPA", "-", "endosomes", ".", "Automated", "unbiased", "quantification", "of", "the", "filipin", "integrated", "fluorescence", "signal", "(", "cholesterol", "content", ")", "in", "LBPA", "-", "containing", "endosomes", ",", "after", "treatment", "with", "each", "compound", "of", "the", "Prestwick", "library", ".", "As", "in", "Fig", "1D", ",", "each", "dot", "is", "the", "average", "of", "replicates", "in", "the", "duplicate", "plates", ",", "and", "≥", "600", "cells", "were", "analysed", "per", "compound", "-", "only", "compounds", "that", "showed", "less", "than", "20", "%", "toxicity", "are", "plotted", ".", "The", "fluorescence", "signal", "of", "LBPA", "-", "endosomes", "was", "used", "to", "segment", "the", "imaged", "and", "generate", "a", "mask", ",", "which", "was", "then", "applied", "on", "the", "micrographs", "to", "quantify", "the", "integrated", "intensity", "of", "filipin", "staining", ".", "The", "samples", "treated", "with", "thioperamide", "(", "pink", ")", ",", "trimeprazine", "(", "light", "blue", ")", ",", "DMSO", "(", "red", ")", "and", "U18666A", "(", "green", ")", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Thioperamide treatment of tissue culture cells. BHK, CHO and HeLa cells were treated with thioperamide and processed as in Fig 1C. Low magnification views are shown after staining with anti-LBPA antibodies (green) and DAPI (blue). n=3 independent experiments with > 200 images acquired and analysed automatically.Cholesterol quantification by mass spectrometry. A431 cells were treated with DMSO alone, pitolisant 10µM (Pito), thioperamide 10µM (thio) or U18666A 10µM (U18) for 18h at 37°C. After extraction, free cholesterol, cholesteryl esters and total cholesterol were quantified by mass spectrometry, and normalized to the DMSO controls. (n=3 independent experiments, error bars = SD, one-way ANOVA, ****=p<0.0001Screen data plot of the cholesterol content of LBPA-endosomes. Automated unbiased quantification of the filipin integrated fluorescence signal (cholesterol content) in LBPA-containing endosomes, after treatment with each compound of the Prestwick library. As in Fig 1D, each dot is the average of replicates in the duplicate plates, and ≥600 cells were analysed per compound - only compounds that showed less than 20% toxicity are plotted. The fluorescence signal of LBPA-endosomes was used to segment the imaged and generate a mask, which was then applied on the micrographs to quantify the integrated intensity of filipin staining. The samples treated with thioperamide (pink), trimeprazine (light blue), DMSO (red) and U18666A (green) are indicated."}
{"words": ["Figure", "3Immunogold", "labelling", "with", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", ".", "HeLa", "MZ", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "thioperamide", "for", "18h", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", ".", "Cryosections", "were", "labelled", "with", "antibodies", "against", "the", "late", "endosomal", "lipid", "LBPA", "followed", "by", "5nm", "protein", "A", "-", "gold", ".", "Multivesicular", "endosomes", "are", "pseudocoloured", "(", "see", "Fig", "EV1", "for", "uncoloured", "images", ")", ".", "Bars", ",", "200nm", ".", "The", "data", "in", "(", "A", ")", "were", "quantified", "in", "a", "double", "-", "blind", "analysis", "of", "two", "sets", "of", "16", "micrographs", "for", "each", "condition", ";", "the", "number", "of", "gold", "particles", "per", "endosome", "is", "shown", "in", "a", "scatter", "plot", "(", "B", ")", "for", "each", "endosome", "identified", "without", "any", "bias", "in", "each", "micrograph", "of", "the", "two", "control", "(", "DMSO", ")", "and", "thioperamide", "-", "treated", "(", "THIO", ")", "samples", ".", "Distribution", "of", "LBPA", "-", "containing", "endosomes", "in", "the", "perinuclear", "region", ".", "Automated", "unbiased", "quantification", "of", "LBPA", "fluorescence", "in", "the", "perinuclear", "region", "of", "the", "cells", ",", "after", "treatment", "with", "each", "compound", "of", "the", "Prestwick", "library", "as", "in", "Fig", "2C", ".", "As", "in", "Fig", "1D", ",", "each", "dot", "is", "the", "average", "of", "replicates", "in", "the", "duplicate", "plates", ",", "and", "≥", "600", "cells", "were", "analysed", "per", "compound", "-", "only", "compounds", "that", "showed", "less", "than", "20", "%", "toxicity", "are", "plotted", ".", "The", "integrated", "intensity", "of", "the", "LBPA", "fluorescence", "signal", "was", "measured", "within", "a", "mask", "of", "the", "perinuclear", "region", "in", "each", "cell", ",", "calculated", "from", "the", "nuclei", "DAPI", "-", "staining", ".", "The", "samples", "treated", "with", "thioperamide", "(", "pink", ")", ",", "trimeprazine", "(", "light", "blue", ")", ",", "DMSO", "(", "red", ")", "and", "U18666A", "(", "green", ")", "are", "indicated", ".", "Number", "of", "perinuclear", "LBPA", "endosomes", ".", "The", "number", "of", "individual", "LBPA", "-", "positive", "structures", "was", "measured", "in", "the", "perinuclear", "region", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "z", "-", "factors", "are", "shown", "to", "evaluate", "the", "distribution", "of", "endosomes", "containing", "LBPA", ";", "color", "code", "as", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunogold labelling with anti-LBPA antibodies. HeLa MZ cells were treated or not with thioperamide for 18h and processed for electron microscopy. Cryosections were labelled with antibodies against the late endosomal lipid LBPA followed by 5nm protein A-gold. Multivesicular endosomes are pseudocoloured (see Fig EV1 for uncoloured images). Bars, 200nm. The data in (A) were quantified in a double-blind analysis of two sets of 16 micrographs for each condition; the number of gold particles per endosome is shown in a scatter plot (B) for each endosome identified without any bias in each micrograph of the two control (DMSO) and thioperamide-treated (THIO) samples.Distribution of LBPA-containing endosomes in the perinuclear region. Automated unbiased quantification of LBPA fluorescence in the perinuclear region of the cells, after treatment with each compound of the Prestwick library as in Fig 2C. As in Fig 1D, each dot is the average of replicates in the duplicate plates, and ≥600 cells were analysed per compound - only compounds that showed less than 20% toxicity are plotted. The integrated intensity of the LBPA fluorescence signal was measured within a mask of the perinuclear region in each cell, calculated from the nuclei DAPI-staining. The samples treated with thioperamide (pink), trimeprazine (light blue), DMSO (red) and U18666A (green) are indicated. Number of perinuclear LBPA endosomes. The number of individual LBPA-positive structures was measured in the perinuclear region as in (C). The z-factors are shown to evaluate the distribution of endosomes containing LBPA; color code as in (C)."}
{"words": ["Figure", "4Effect", "of", "Pitolisant", "on", "LBPA", ".", "HeLa", "MZ", "cells", "treated", "or", "not", "with", "pitolisant", "10µM", "for", "18h", "at", "37", "°", "C", "were", "labeled", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "quantification", "in", "fig", "EV3A", ")", ".", "LBPA", "intensity", "in", "a", "mixed", "population", "of", "cells", "expressing", "HRH3", "-", "GFP", ".", "After", "transfection", "with", "HRH3", "-", "GFP", ",", "uncloned", "stably", "expressing", "cells", "(", "C", ")", "were", "labelled", "with", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", "and", "analysed", "by", "automated", "microscopy", "(", "C", ")", ".", "Unbiased", "quantification", "(", "D", ")", "shows", "the", "inverse", "correlation", "between", "HRH3", "-", "GFP", "expression", "(", "high", "expressing", "cells", "in", "green", ")", "and", "the", "endosome", "integrated", "intensity", "of", "LBPA", "staining", "(", "high", "LBPA", "labelling", "in", "red", ")", ".", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", "with", "500", ",", "000", "cells", "analysed", "automatically", ",", "error", "bars", "=", "SD", ")", ".", "LBPA", "intensity", "in", "cells", "expressing", "or", "not", "HRH3", "-", "GFP", ".", "HeLa", "MZ", "cells", "stably", "expressing", "HRH3", "-", "GFP", "grown", "in", "96", "-", "well", "plates", "were", "separately", "treated", ",", "with", "4", "different", "siRNAs", "that", "target", "HRH3", "(", "siHRH3", "#", "1", ";", "siHRH3", "#", "2", ";", "siHRH3", "#", "3", ";", "siHRH3", "#", "4", ")", "or", "with", "control", "non", "-", "target", "(", "siNT", ")", "siRNA", "(", "E", ")", ".", "HRH3", "-", "GFP", "was", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", "in", "4", "rows", "of", "cells", "per", "condition", ";", "micrographs", "are", "stitched", "together", "in", "the", "montage", ".", "Panel", "F", "shows", "an", "example", "of", "cells", "treated", "with", "siHRH3", "#", "2", "or", "siNT", ",", "and", "then", "labelled", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "against", "LBPA", ".", "Cells", "treated", "as", "in", "(", "E", ")", "and", "labelled", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "against", "LBPA", "as", "in", "(", "F", ")", ",", "were", "analysed", "by", "automated", "microscopy", "and", "the", "integrated", "intensities", "of", "LBPA", "(", "left", "panel", ")", "and", "HRH3", "-", "GFP", "(", "right", "panel", ")", "signals", "are", "compared", "(", "G", ")", ".", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", "with", "192", "images", "acquired", "and", "analysed", "automatically", ",", "error", "bars", "=", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Effect of Pitolisant on LBPA. HeLa MZ cells treated or not with pitolisant 10µM for 18h at 37°C were labeled with DAPI and anti-LBPA antibodies and analysed by fluorescence microscopy (quantification in fig EV3A).LBPA intensity in a mixed population of cells expressing HRH3-GFP. After transfection with HRH3-GFP, uncloned stably expressing cells (C) were labelled with anti-LBPA antibodies and analysed by automated microscopy (C). Unbiased quantification (D) shows the inverse correlation between HRH3-GFP expression (high expressing cells in green) and the endosome integrated intensity of LBPA staining (high LBPA labelling in red). (n=2 independent experiments with 500,000 cells analysed automatically, error bars = SD).LBPA intensity in cells expressing or not HRH3-GFP. HeLa MZ cells stably expressing HRH3-GFP grown in 96-well plates were separately treated, with 4 different siRNAs that target HRH3 (siHRH3#1; siHRH3#2; siHRH3#3; siHRH3#4) or with control non-target (siNT) siRNA (E). HRH3-GFP was analysed by fluorescence microscopy in 4 rows of cells per condition; micrographs are stitched together in the montage. Panel F shows an example of cells treated with siHRH3#2 or siNT, and then labelled with DAPI and antibodies against LBPA. Cells treated as in (E) and labelled with DAPI and antibodies against LBPA as in (F), were analysed by automated microscopy and the integrated intensities of LBPA (left panel) and HRH3-GFP (right panel) signals are compared (G). (n=2 independent experiments with 192 images acquired and analysed automatically, error bars = SD)."}
{"words": ["Figure", "5Treatment", "of", "NPC", "fibroblasts", "and", "NPC", "null", "mice", "with", "thioperamide", ".", "Fibroblast", "lines", "obtained", "from", "patients", "with", "well", "-", "established", "heterozygote", "mutations", "in", "the", "NPC1", "(", "GM17912", "line", ":", "NPC1", "P1007A", "/", "T1036M", ";", "GM17911", "line", ":", "NPC1", "I1061T", "/", "T1036M", ")", "or", "with", "a", "homozygote", "mutation", "in", "the", "NPC2", "gene", "(", "GM17910", "line", ":", "C93F", "/", "C93F", ")", "were", "treated", "or", "not", "for", "72h", "with", "thioperamide", "10µM", ",", "stained", "with", "filipin", "(", "cholesterol", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "automated", "microscopy", ".", "Quantification", "of", "cholesterol", "and", "LBPA", "staining", "in", "NPC", "fibroblasts", ".", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "treated", "or", "not", "with", "thioperamide", "for", "48h", "or", "72h", ",", "labelled", "with", "filipin", "(", "cholesterol", ")", "and", "anti", "-", "LBPA", "antibodies", ",", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "automated", "microscopy", ".", "The", "panels", "show", "the", "integrated", "intensity", "of", "the", "filipin", "(", "left", ")", "and", "LBPA", "(", "right", ")", "signals", "were", "quantified", "after", "48", "(", "top", ")", "and", "72h", "(", "bottom", ")", ".", "The", "colour", "code", "of", "each", "fibroblast", "cell", "line", "is", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "144", "images", "acquired", "and", "analysed", "automatically", ",", ">", "2000", "cells", "per", "experiment", ",", "error", "bars", "=", "SD", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Quantification", "of", "cholesterol", "in", "NPC", "fibroblasts", "by", "mass", "spectrometry", ".", "NPC", "cell", "lines", "(", "A", ")", "were", "treated", "or", "not", "with", "thioperamide", "or", "0", ".", "1", "%", "(", "2", "-", "Hydroxypropyl", ")", "-", "ß", "-", "cyclodextrin", "for", "72h", ".", "After", "extraction", ",", "lipids", "were", "analysed", "and", "quantified", "by", "mass", "spectrometry", ".", "(", "n", "=", "3", ";", "error", "bars", "=", "SD", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "Quantification", "of", "cell", "counts", "in", "the", "3", "NPC", "cell", "lines", "treated", "with", "thioperamide", ".", "The", "experiment", "was", "as", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "except", "that", "nuclei", "were", "labelled", "with", "DAPI", "and", "quantified", "by", "automated", "microscopy", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "DMSO", "control", "(", "n", "=", "2", "independent", "experiments", ",", "75", "images", "per", "experiments", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Treatment of NPC fibroblasts and NPC null mice with thioperamide. Fibroblast lines obtained from patients with well-established heterozygote mutations in the NPC1 (GM17912 line: NPC1 P1007A / T1036M; GM17911 line: NPC1 I1061T / T1036M) or with a homozygote mutation in the NPC2 gene (GM17910 line: C93F / C93F) were treated or not for 72h with thioperamide 10µM, stained with filipin (cholesterol) and analysed by fluorescence automated microscopy.Quantification of cholesterol and LBPA staining in NPC fibroblasts. Cells as in (A) were treated or not with thioperamide for 48h or 72h, labelled with filipin (cholesterol) and anti-LBPA antibodies, and analysed by fluorescence automated microscopy. The panels show the integrated intensity of the filipin (left) and LBPA (right) signals were quantified after 48 (top) and 72h (bottom). The colour code of each fibroblast cell line is as in (A). (n=3 independent experiments with 144 images acquired and analysed automatically, >2000 cells per experiment, error bars = SD, one-way ANOVA, *=p<0.05; **=p<0.005;***=p<0.001).Quantification of cholesterol in NPC fibroblasts by mass spectrometry. NPC cell lines (A) were treated or not with thioperamide or 0.1% (2-Hydroxypropyl)-ß-cyclodextrin for 72h. After extraction, lipids were analysed and quantified by mass spectrometry. (n=3; error bars = SD, one-way ANOVA, *=p<0.05; **=p<0.005;***=p<0.001)Quantification of cell counts in the 3 NPC cell lines treated with thioperamide. The experiment was as in (A-C) except that nuclei were labelled with DAPI and quantified by automated microscopy. Data are normalized to DMSO control (n=2 independent experiments, 75 images per experiments)"}
{"words": ["Figure", "6Effects", "of", "thioperamide", "on", "cholesterol", "-", "dependent", "transcriptional", "regulation", ".", "The", "parental", "HeLa", "MZ", "cells", ",", "NPC1", "KO", "cells", "or", "NPC2", "KO", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "thioperamide", "10", "μM", "for", "18h", ".", "Total", "mRNA", "was", "extracted", "and", "both", "LDLR", "mRNA", "and", "HMG", "CoA", "reductase", "mRNA", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "=", "SD", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "005", ")", "Quantification", "of", "cholesterol", "in", "NPC", "null", "mice", "by", "enzymatic", "analysis", ".", "WT", "or", "NPC1", "null", "mice", "were", "treated", "or", "not", "with", "thioperamide", "for", "6", "weeks", "after", "weaning", "and", "sacrificed", ".", "The", "total", "content", "of", "unesterified", "cholesterol", "in", "the", "corresponding", "liver", "extracts", "was", "then", "quantified", "using", "an", "enzymatic", "assay", "and", "is", "expressed", "in", "nmol", "per", "mg", "tissue", ".", "The", "total", "content", "of", "LBPA", "in", "the", "same", "liver", "extracts", "was", "quantified", "by", "mass", "spectrometry", "(", "see", "Appendix", "Figure", "S1", ")", ",", "and", "is", "therefore", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "total", "phospholipids", ".", "The", "total", "LBPA", "content", "of", "WT", "mice", "was", "only", "marginally", "increased", "by", "the", "drug", ",", "either", "because", "the", "doses", "were", "low", ",", "or", "because", "the", "contribution", "from", "tissue", "material", "unaffected", "by", "the", "drug", "obscured", "selective", "changes", "at", "the", "cellular", "level", "(", "despite", "much", "effort", ",", "we", "were", "unable", "to", "visualize", "LBPA", "in", "liver", "samples", "by", "immunocytochemistry", ")", ".", "The", "relative", "ratio", "of", "LBPA", "vs", ".", "cholesterol", "values", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Effects of thioperamide on cholesterol-dependent transcriptional regulation. The parental HeLa MZ cells, NPC1 KO cells or NPC2 KO cells were treated or not with thioperamide 10 μM for 18h. Total mRNA was extracted and both LDLR mRNA and HMG CoA reductase mRNA were quantified by RT-PCR. (n=3 independent experiments, error bars = SD, one-way ANOVA, *=p<0.05; **=p<0.005)Quantification of cholesterol in NPC null mice by enzymatic analysis. WT or NPC1 null mice were treated or not with thioperamide for 6 weeks after weaning and sacrificed. The total content of unesterified cholesterol in the corresponding liver extracts was then quantified using an enzymatic assay and is expressed in nmol per mg tissue. The total content of LBPA in the same liver extracts was quantified by mass spectrometry (see Appendix Figure S1), and is therefore expressed as a percentage of total phospholipids. The total LBPA content of WT mice was only marginally increased by the drug, either because the doses were low, or because the contribution from tissue material unaffected by the drug obscured selective changes at the cellular level (despite much effort, we were unable to visualize LBPA in liver samples by immunocytochemistry). The relative ratio of LBPA vs. cholesterol values is shown."}
{"words": ["Figure", "1Silver", "staining", "of", "protein", "components", "in", "the", "Ago3", "complex", "immunoisolated", "from", "BmN4", "cells", ".", "P150", "and", "P130", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "Ago3", ".", "n", ".", "i", ".", ":", "non", "-", "immune", "IgG", ".", "Western", "blots", "showing", "the", "presence", "of", "Vret", "-", "L", "(", "P150", ")", "and", "Vret", "-", "S", "(", "P130", ")", "in", "the", "Ago3", "complex", "in", "A", ".", "n", ".", "i", ".", ":", "non", "-", "immune", "IgG", ".", "Top", ":", "western", "blot", "showing", "Vret", "-", "L", "and", "Vret", "-", "S", "immunoprecipitated", "from", "BmN4", "cells", "upon", "UV", "irradiation", ".", "Bottom", ":", "CLIP", "signals", "showing", "that", "Vret", "-", "L", ",", "but", "not", "Vret", "-", "S", ",", "binds", "RNAs", "in", "vivo", ".", "Five", "upper", "panels", ":", "Northern", "blots", "showing", "the", "levels", "of", "RT3", "-", "piRNA", ",", "Bmmar6", "-", "piRNA", ",", "R2Bm", "-", "piRNA", ",", "and", "R1Bm", "-", "piRNA", "in", "normal", "(", "Control", ")", ",", "Vret", "-", "L", "/", "S", "-", "depleted", "(", "Vret", "KD", ")", ",", "Vret", "-", "L", "-", "depleted", "(", "Vret", "-", "L", "KD", ")", ",", "and", "Vret", "-", "S", "-", "depleted", "(", "Vret", "-", "S", "KD", ")", "cells", ".", "Bantam", "(", "miRNA", ")", "was", "detected", "as", "a", "loading", "control", ".", "Two", "lower", "panels", ":", "western", "blots", "showing", "the", "efficiency", "of", "the", "Vret", "knockdown", ".", "β", "-", "Tub", "was", "detected", "as", "a", "loading", "control", ".", "Two", "upper", "panels", ":", "western", "blots", "showing", "the", "abundances", "of", "Flag", "-", "Vret", "-", "L", "and", "Ago3", "in", "both", "samples", ".", "Note", "that", "Flag", "-", "Vret", "-", "L", "is", "present", "only", "in", "the", "Vret", "-", "L", "complex", "but", "not", "with", "Ago3", "isolated", "from", "total", "cell", "lysates", "(", "Fig", "EV1F", ")", ".", "Bottom", "panel", ":", "Northern", "blot", "showing", "the", "level", "of", "PiggyBac", "-", "piRNA", "associated", "with", "Ago3", "in", "total", "lysate", "(", "Ago3", "-", "IP", ")", "and", "in", "the", "Vret", "-", "L", "complex", "(", "Flag", "-", "Vret", "-", "IP", ")", ".", "The", "ratio", "of", "the", "piRNA", "signal", "intensity", "in", "the", "two", "samples", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", ".", "Two", "upper", "panels", ":", "western", "blots", "showing", "the", "abundances", "of", "Flag", "-", "Vret", "-", "L", "and", "Siwi", "in", "both", "samples", ".", "Bottom", "panel", ":", "Northern", "blot", "showing", "the", "level", "of", "RT3", "-", "piRNA", "associated", "with", "Siwi", "in", "the", "total", "lysate", "(", "Siwi", "-", "IP", ")", "and", "in", "the", "Vret", "-", "L", "complex", "(", "Flag", "-", "Vret", "-", "IP", ")", ".", "Boxplot", "showing", "log2", "fold", "-", "change", "of", "Vret", "-", "KD", "(", "RPM", ")", "/", "Control", "(", "RPM", ")", "values", "of", "piRNAs", "in", "increased", ",", "unchanged", "and", "decreased", "groups", "defined", "by", "Ago3", "-", "KD", "(", "RPM", ")", "/", "Control", "(", "RPM", ")", "values", "shown", "in", "Fig", "EV1I", ".", "Boxplot", "represents", "median", ",", "first", "and", "third", "quartile", ",", "and", "maximum", "and", "minimum", "values", "of", "the", "log2", "fold", "-", "change", "of", "piRNAs", "(", "N", "=", "2", ")", ".", "Outliers", "are", "represented", "as", "open", "circles", ".", "Flag", "-", "EGFP", "and", "-", "Vret", "-", "L", "WT", "and", "mutants", "were", "immunoprecipitated", "using", "the", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "then", "western", "blotting", "was", "performed", "using", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "Siwi", ",", "anti", "-", "Ago3", "and", "anti", "-", "Vret", "antibodies", ".", "The", "domain", "structures", "of", "Tud1mut", "(", "Y753A", "/", "Y757A", "/", "N759A", ")", "and", "Tud2mut", "(", "Y973A", "/", "Y976A", "/", "N978A", ")", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Silver staining of protein components in the Ago3 complex immunoisolated from BmN4 cells. P150 and P130 co-immunoprecipitated with Ago3. n.i.: non-immune IgG.Western blots showing the presence of Vret-L (P150) and Vret-S (P130) in the Ago3 complex in A. n.i.: non-immune IgG.Top: western blot showing Vret-L and Vret-S immunoprecipitated from BmN4 cells upon UV irradiation. Bottom: CLIP signals showing that Vret-L, but not Vret-S, binds RNAs in vivo.Five upper panels: Northern blots showing the levels of RT3-piRNA, Bmmar6-piRNA, R2Bm-piRNA, and R1Bm-piRNA in normal (Control), Vret-L/S-depleted (Vret KD), Vret-L-depleted (Vret-L KD), and Vret-S-depleted (Vret-S KD) cells. Bantam (miRNA) was detected as a loading control. Two lower panels: western blots showing the efficiency of the Vret knockdown. β-Tub was detected as a loading control.Two upper panels: western blots showing the abundances of Flag-Vret-L and Ago3 in both samples. Note that Flag-Vret-L is present only in the Vret-L complex but not with Ago3 isolated from total cell lysates (Fig EV1F). Bottom panel: Northern blot showing the level of PiggyBac-piRNA associated with Ago3 in total lysate (Ago3-IP) and in the Vret-L complex (Flag-Vret-IP). The ratio of the piRNA signal intensity in the two samples is indicated at the bottom.Two upper panels: western blots showing the abundances of Flag-Vret-L and Siwi in both samples. Bottom panel: Northern blot showing the level of RT3-piRNA associated with Siwi in the total lysate (Siwi-IP) and in the Vret-L complex (Flag-Vret-IP).Boxplot showing log2 fold-change of Vret-KD (RPM)/Control (RPM) values of piRNAs in increased, unchanged and decreased groups defined by Ago3-KD (RPM)/Control (RPM) values shown in Fig EV1I. Boxplot represents median, first and third quartile, and maximum and minimum values of the log2 fold-change of piRNAs (N = 2). Outliers are represented as open circles.Flag-EGFP and -Vret-L WT and mutants were immunoprecipitated using the anti-Flag antibody and then western blotting was performed using anti-Flag, anti-Siwi, anti-Ago3 and anti-Vret antibodies. The domain structures of Tud1mut (Y753A/Y757A/N759A) and Tud2mut (Y973A/ Y976A/N978A) are shown."}
{"words": ["Figure", "2Immunofluorescence", "shows", "that", "the", "Vret", "signals", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "the", "Ago3", "signals", "(", "red", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "The", "three", "panels", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", "show", "high", "magnification", "images", "of", "the", "part", "indicated", "by", "the", "white", "dashed", "line", "box", "in", "the", "image", "on", "the", "left", "-", "hand", "side", ".", "This", "panel", "arrangement", "applies", "also", "for", "panels", "B", "−", "H", ".", "The", "bar", "chart", "shows", "the", "percentage", "of", "Vret", "-", "positive", "nuage", "in", "Ago3", "-", "positive", "nuage", ".", "Immunofluorescence", "shows", "that", "the", "Vret", "signals", "(", "green", ")", "partially", "co", "-", "localize", "with", "the", "Siwi", "signals", "(", "red", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "The", "bar", "chart", "shows", "the", "percentage", "of", "Vret", "-", "positive", "nuage", "in", "Siwi", "-", "positive", "nuage", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Ago3", "signals", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "Vret", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Vret", "KD", ")", ".", "Vret", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Siwi", "signals", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "Vret", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Vret", "KD", ")", ".", "Vret", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Vret", "signals", "(", "red", ")", "in", "control", "and", "Ago3", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Ago3", "KD", ")", ".", "Ago3", "is", "shown", "in", "green", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Siwi", "signals", "(", "red", ")", "in", "control", "and", "Ago3", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Ago3", "KD", ")", ".", "Ago3", "is", "shown", "in", "green", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "Flag", "-", "Ago3", "WT", ",", "KA", "mutant", "and", "DDH", "mutant", "signals", "(", "green", ")", "expressed", "in", "naïve", "BmN4", "cells", "(", "Control", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "Flag", "-", "Ago3", "WT", ",", "KA", "mutant", "and", "DDH", "mutant", "signals", "(", "green", ")", "in", "Ago3", "-", "depleted", "cells", "(", "Ago3", "KD", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunofluorescence shows that the Vret signals (green) co-localize with the Ago3 signals (red). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. The three panels on the right-hand side show high magnification images of the part indicated by the white dashed line box in the image on the left-hand side. This panel arrangement applies also for panels B−H. The bar chart shows the percentage of Vret-positive nuage in Ago3-positive nuage. Immunofluorescence shows that the Vret signals (green) partially co-localize with the Siwi signals (red). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. The bar chart shows the percentage of Vret-positive nuage in Siwi-positive nuage.Immunofluorescence showing the Ago3 signals (green) in control and Vret-depleted BmN4 cells (Vret KD). Vret is shown in red. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. Immunofluorescence showing the Siwi signals (green) in control and Vret-depleted BmN4 cells (Vret KD). Vret is shown in red. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm.Immunofluorescence showing the Vret signals (red) in control and Ago3-depleted BmN4 cells (Ago3 KD). Ago3 is shown in green. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. Immunofluorescence showing the Siwi signals (red) in control and Ago3-depleted BmN4 cells (Ago3 KD). Ago3 is shown in green. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm.Immunofluorescence showing Flag-Ago3 WT, KA mutant and DDH mutant signals (green) expressed in naïve BmN4 cells (Control). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. Immunofluorescence showing Flag-Ago3 WT, KA mutant and DDH mutant signals (green) in Ago3-depleted cells (Ago3 KD). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3Immunofluorescence", "showing", "the", "Ago3", "signals", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "Siwi", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "The", "three", "panels", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", "show", "high", "magnification", "images", "of", "the", "part", "indicated", "by", "the", "white", "dashed", "line", "box", "in", "the", "images", "on", "the", "left", "-", "hand", "side", ".", "This", "panel", "arrangement", "applies", "also", "for", "panels", "B", ",", "H", "and", "I", ".", "Bar", "chart", "indicates", "dot", "sizes", "of", ">", "100", "Ago3", "particles", "in", "each", "case", "(", "Large", ":", "IntDen", "value", ">", "106", ";", "Small", ":", "IntDen", "value", "<", "106", ")", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Vret", "signals", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "Siwi", "is", "shown", "in", "red", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Bar", "chart", "indicates", "dot", "sizes", "of", ">", "100", "Ago3", "particles", "in", "each", "case", "(", "Large", ":", "IntDen", "value", ">", "105", ";", "Small", ":", "IntDen", "value", "<", "105", ")", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "before", "and", "after", "Siwi", "KD", "using", "the", "anti", "-", "Ago3", "antibody", ".", "Total", "BmN4", "lysate", "(", "Total", ")", ",", "supernatant", "(", "Sup", ")", "and", "pellet", "(", "Pellet", ")", "fractions", "upon", "centrifugation", "were", "used", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "using", "the", "anti", "-", "Ago3", "antibody", "on", "Ago3", "immunoisolated", "from", "Siwi", "-", "depleted", "cells", ".", "Ago3", "immunoprecipitated", "was", "untreated", "(", "−", ")", "or", "treated", "with", "phosphatase", "(", "+", ")", "prior", "to", "western", "botting", ".", "Western", "blot", "showing", "the", "degree", "of", "phosphorylation", "of", "Flag", "-", "Ago3", "WT", "and", "the", "8SA", "mutant", "in", "Siwi", "-", "depleted", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "Western", "blots", "showing", "the", "degree", "of", "phosphorylation", "of", "Flag", "-", "Ago3", "WT", "and", "its", "DDH", "and", "KA", "mutants", "in", "Siwi", "-", "depleted", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "The", "second", "panel", "from", "the", "top", "corresponds", "to", "the", "top", "panel", "with", "a", "longer", "exposure", "time", ".", "Siwi", "and", "β", "-", "Tub", "as", "a", "loading", "control", "were", "also", "detected", "also", "by", "western", "blotting", ".", "Western", "blotting", "was", "performed", "using", "anti", "-", "Ago3", ",", "anti", "-", "Vret", "and", "anti", "-", "Siwi", "antibodies", "on", "lysates", "of", "BmN4", "cells", "before", "(", "Control", ")", "and", "after", "Siwi", "(", "Siwi", "KD", ")", "and", "Siwi", "/", "Vret", "(", "Siwi", "/", "Vret", "KD", ")", "depletion", ".", "β", "-", "Tub", "was", "detected", "as", "a", "loading", "control", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Flag", "-", "Ago3", "signals", "(", "red", ")", "in", "normal", "(", "Control", ")", "and", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Flag", "-", "Ago3", "8SA", "and", "8SE", "mutant", "signals", "(", "red", ")", "in", "normal", "(", "Control", ")", "and", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunofluorescence showing the Ago3 signals (green) in control and Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD). Siwi is shown in red. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. The three panels on the right-hand side show high magnification images of the part indicated by the white dashed line box in the images on the left-hand side. This panel arrangement applies also for panels B, H and I. Bar chart indicates dot sizes of > 100 Ago3 particles in each case (Large: IntDen value > 106; Small: IntDen value < 106). Immunofluorescence showing the Vret signals (green) in control and Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD). Siwi is shown in red. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. Bar chart indicates dot sizes of > 100 Ago3 particles in each case (Large: IntDen value > 105; Small: IntDen value < 105).Western blotting was performed before and after Siwi KD using the anti-Ago3 antibody. Total BmN4 lysate (Total), supernatant (Sup) and pellet (Pellet) fractions upon centrifugation were used.Western blotting was performed using the anti-Ago3 antibody on Ago3 immunoisolated from Siwi-depleted cells. Ago3 immunoprecipitated was untreated (−) or treated with phosphatase (+) prior to western botting.Western blot showing the degree of phosphorylation of Flag-Ago3 WT and the 8SA mutant in Siwi-depleted cells (Siwi KD).Western blots showing the degree of phosphorylation of Flag-Ago3 WT and its DDH and KA mutants in Siwi-depleted cells (Siwi KD). The second panel from the top corresponds to the top panel with a longer exposure time. Siwi and β-Tub as a loading control were also detected also by western blotting.Western blotting was performed using anti-Ago3, anti-Vret and anti-Siwi antibodies on lysates of BmN4 cells before (Control) and after Siwi (Siwi KD) and Siwi/Vret (Siwi/Vret KD) depletion. β-Tub was detected as a loading control.Immunofluorescence showing the Flag-Ago3 signals (red) in normal (Control) and Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm.Immunofluorescence showing the Flag-Ago3 8SA and 8SE mutant signals (red) in normal (Control) and Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD). DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "showing", "Ago3", "immunopurified", "from", "BmN4", "cells", "before", "(", "Control", ")", "and", "after", "Siwi", "knockdown", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "32P", "-", "labeling", "of", "RNAs", "isolated", "from", "Ago3", "(", "a", "mixture", "of", "unphosphorylated", "and", "phosphorylated", ")", "immunopurified", "from", "Siwi", "-", "depleted", "cells", ".", "15", "-", "20", "-", "nt", "RNAs", "(", "indicated", "by", "a", "black", "line", ")", "were", "isolated", "and", "sequenced", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "(", "15", "-", "20", "-", "nt", "RNAs", "in", "A", ")", "and", "the", "5", "′", "-", "ends", "of", "Ago3", "-", "bound", "piRNAs", ".", "32P", "-", "labeling", "of", "RNAs", "isolated", "from", "Ago3", ".", "Target", "-", "Ss", "are", "isolated", "from", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "but", "are", "not", "isolated", "from", "Siwi", "/", "Vret", "double", "knockdown", "cells", ".", "Western", "blot", "showing", "Ago3", "immunopurified", "from", "BmN4", "cells", "before", "(", "Control", ")", "and", "after", "Siwi", "knockdown", "(", "Siwi", "KD", ")", ".", "Northern", "blot", "showing", "Bmmar6", "-", "piRNA", "precursors", "in", "the", "Ago3", "complex", ".", "50", "-", "100", "-", "nt", "RNAs", "(", "indicated", "by", "a", "black", "line", ")", "were", "isolated", "and", "sequenced", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "and", "the", "5", "′", "-", "ends", "of", "Ago3", "-", "bound", "piRNAs", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "5", "′", "-", "and", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "fragments", "on", "the", "same", "genomic", "strand", ".", "Heat", "map", "displays", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "in", "a", "window", "around", "the", "most", "abundant", "1", ",", "000", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "5", "′", "-", "ends", "and", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "fragments", "on", "the", "same", "genomic", "strand", ".", "The", "heat", "map", "displays", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "in", "a", "window", "around", "the", "most", "abundant", "1", ",", "000", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "and", "the", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "on", "the", "same", "genomic", "strand", ".", "The", "heat", "map", "displays", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "in", "a", "window", "around", "the", "most", "abundant", "1", ",", "000", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", ".", "The", "measurement", "of", "distances", "between", "the", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "and", "the", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "on", "the", "same", "genomic", "strand", ".", "The", "heat", "map", "displays", "5", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "S", "in", "a", "window", "around", "the", "most", "abundant", "1", ",", "000", "3", "′", "-", "ends", "of", "Target", "-", "L", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot showing Ago3 immunopurified from BmN4 cells before (Control) and after Siwi knockdown (Siwi KD). 32P-labeling of RNAs isolated from Ago3 (a mixture of unphosphorylated and phosphorylated) immunopurified from Siwi-depleted cells. 15-20-nt RNAs (indicated by a black line) were isolated and sequenced.The measurement of distances between the 3′-ends of Target-S (15-20-nt RNAs in A) and the 5′-ends of Ago3-bound piRNAs.32P-labeling of RNAs isolated from Ago3. Target-Ss are isolated from Siwi-depleted BmN4 cells but are not isolated from Siwi/Vret double knockdown cells.Western blot showing Ago3 immunopurified from BmN4 cells before (Control) and after Siwi knockdown (Siwi KD). Northern blot showing Bmmar6-piRNA precursors in the Ago3 complex. 50-100-nt RNAs (indicated by a black line) were isolated and sequenced.The measurement of distances between the 5′-ends of Target-L and the 5′-ends of Ago3-bound piRNAs.The measurement of distances between the 5′- and 3′-ends of Target-L fragments on the same genomic strand. Heat map displays 5′-ends of Target-L in a window around the most abundant 1,000 3′-ends of Target-L. The measurement of distances between the 5′-ends and 3′-ends of Target-S fragments on the same genomic strand. The heat map displays 5′-ends of Target-S in a window around the most abundant 1,000 3′-ends of Target-S. The measurement of distances between the 5′-ends of Target-L and the 3′-ends of Target-S on the same genomic strand. The heat map displays 5′-ends of Target-L in a window around the most abundant 1,000 3′-ends of Target-S. The measurement of distances between the 5′-ends of Target-S and the 3′-ends of Target-L on the same genomic strand. The heat map displays 5′-ends of Target-S in a window around the most abundant 1,000 3′-ends of Target-L."}
{"words": ["Figure", "5Immunofluorescence", "showing", "the", "Ago3", "signals", "(", "green", ")", "in", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", "and", "Siwi", "KD", "cells", "where", "Flag", "-", "Siwi", "(", "red", ")", "was", "expressed", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "The", "panels", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", "show", "high", "magnification", "images", "of", "the", "part", "indicated", "by", "the", "white", "dashed", "line", "box", "in", "the", "images", "on", "the", "left", "-", "hand", "side", ".", "This", "arrangement", "applies", "also", "for", "panel", "C", ".", "Bar", "chart", "indicates", "dot", "sizes", "of", ">", "100", "Ago3", "particles", "in", "each", "case", "(", "Large", ":", "IntDen", "value", ">", "105", ";", "Small", ":", "IntDen", "value", "<", "105", ")", ".", "A", "significant", "difference", "was", "found", "plus", "/", "minus", "Flag", "-", "Siwi", "expression", "by", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Western", "blots", "show", "that", "the", "degree", "of", "Ago3", "phosphorylation", "was", "reduced", "upon", "Siwi", "KA", "mutant", "as", "well", "as", "Siwi", "WT", "and", "DDH", "mutant", "expression", ".", "Immunofluorescence", "showing", "the", "Ago3", "signals", "(", "green", ")", "in", "Siwi", "-", "depleted", "BmN4", "cells", "(", "Siwi", "KD", ")", "and", "Siwi", "KD", "cells", "where", "Flag", "-", "Siwi", "KA", "mutant", "(", "red", ")", "was", "expressed", ".", "DAPI", "shows", "the", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Bar", "chart", "indicates", "dot", "sizes", "of", ">", "100", "Ago3", "particles", "in", "each", "case", "(", "Large", ":", "IntDen", "value", ">", "105", ";", "Small", ":", "IntDen", "value", "<", "105", ")", ".", "A", "significant", "difference", "was", "found", "plus", "/", "minus", "Flag", "-", "Siwi", "expression", "by", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunofluorescence showing the Ago3 signals (green) in Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD) and Siwi KD cells where Flag-Siwi (red) was expressed. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. The panels on the right-hand side show high magnification images of the part indicated by the white dashed line box in the images on the left-hand side. This arrangement applies also for panel C. Bar chart indicates dot sizes of > 100 Ago3 particles in each case (Large: IntDen value > 105; Small: IntDen value < 105). A significant difference was found plus/minus Flag-Siwi expression by the Fisher's exact test (P < 0.05).Western blots show that the degree of Ago3 phosphorylation was reduced upon Siwi KA mutant as well as Siwi WT and DDH mutant expression.Immunofluorescence showing the Ago3 signals (green) in Siwi-depleted BmN4 cells (Siwi KD) and Siwi KD cells where Flag-Siwi KA mutant (red) was expressed. DAPI shows the nuclei (blue). Scale bar: 10 μm. Bar chart indicates dot sizes of > 100 Ago3 particles in each case (Large: IntDen value > 105; Small: IntDen value < 105). A significant difference was found plus/minus Flag-Siwi expression by the Fisher's exact test (P < 0.05)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ",", "D", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "centrioles", "from", "RPE", "-", "1", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "SFI1", "(", "green", ")", ".", "Right", "panels", "show", "top", "view", "images", "across", "the", "centriolar", "length", "confirming", "the", "distal", "localization", "of", "SFI1", "at", "centrioles", ".", "The", "white", "arrowhead", "indicates", "SFI1", "distal", "dot", "at", "centrioles", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "and", "100", "nm", "(", "right", "panels", ")", ".", "Average", "position", "of", "SFI1", "alongside", "the", "centriole", "is", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "centrioles", "from", "RPE", "-", "1", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "Centrin", "2", "/", "3", "(", "Cetn2", "/", "3", ",", "grey", ")", ".", "Right", "panels", "show", "top", "view", "images", "across", "the", "centriolar", "length", "confirming", "the", "distal", "localization", "of", "Centrin2", "/", "3", "at", "centrioles", ".", "The", "white", "arrowhead", "indicates", "Centrin2", "/", "3", "distal", "dot", "at", "centrioles", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "and", "100", "nm", "(", "right", "panels", ")", ".", "Average", "position", "of", "Centrin2", "/", "3", "alongside", "the", "centriole", "is", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "centrioles", "from", "RPE", "-", "1", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "Centrin", "3", "(", "Cetn3", ",", "cyan", ")", ".", "Right", "panels", "show", "top", "view", "images", "across", "the", "centriolar", "length", "confirming", "the", "distal", "localization", "of", "Centrin", "3", "at", "centrioles", ".", "The", "white", "arrowhead", "indicates", "Centrin", "3", "distal", "dot", "at", "centrioles", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "and", "100", "nm", "(", "right", "panels", ")", ".", "Average", "position", "of", "Centrin", "3", "alongside", "the", "centriole", "is", "shown", "in", "(", "H", ")", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "centrioles", "from", "RPE", "-", "1", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ",", "SFI1", "(", "green", ")", "and", "Centrin", "2", "/", "3", "(", "Cetn3", ",", "grey", ")", ".", "Right", "panels", "show", "top", "view", "images", "confirming", "the", "distal", "localization", "of", "SFI1", "and", "Centrin", "2", "/", "3", "at", "centrioles", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "and", "100", "nm", "(", "right", "panels", ")", ".", "Average", "position", "of", "SFI1", "and", "Centrin2", "/", "3", "alongside", "the", "centriole", "is", "shown", "in", "(", "J", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C, D) Representative confocal images of expanded centrioles from RPE-1 cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and SFI1 (green). Right panels show top view images across the centriolar length confirming the distal localization of SFI1 at centrioles. The white arrowhead indicates SFI1 distal dot at centrioles. Scale bars: 200 nm and 100 nm (right panels). Average position of SFI1 alongside the centriole is shown in (D).(E, F) Representative confocal images of expanded centrioles from RPE-1 cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and Centrin 2/3 (Cetn2/3, grey). Right panels show top view images across the centriolar length confirming the distal localization of Centrin2/3 at centrioles. The white arrowhead indicates Centrin2/3 distal dot at centrioles. Scale bars: 200 nm and 100 nm (right panels). Average position of Centrin2/3 alongside the centriole is shown in (F).(G, H) Representative confocal images of expanded centrioles from RPE-1 cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and Centrin 3 (Cetn3, cyan). Right panels show top view images across the centriolar length confirming the distal localization of Centrin 3 at centrioles. The white arrowhead indicates Centrin 3 distal dot at centrioles. Scale bars: 200 nm and 100 nm (right panels). Average position of Centrin 3 alongside the centriole is shown in (H).(I, J) Representative confocal images of expanded centrioles from RPE-1 cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta), SFI1 (green) and Centrin 2/3 (Cetn3, grey). Right panels show top view images confirming the distal localization of SFI1 and Centrin 2/3 at centrioles. Scale bars: 200 nm and 100 nm (right panels). Average position of SFI1 and Centrin2/3 alongside the centriole is shown in (J)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "U2OS", "centrioles", "treated", "with", "siCT", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "siSFI1", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "siPOC5", "(", "C", ",", "F", ")", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "SFI1", "(", "A", "-", "C", ",", "green", ")", "or", "Centrin2", "/", "3", "(", "D", "-", "F", ",", "grey", ")", ".", "Insets", "show", "top", "views", "of", "expanded", "centrioles", "at", "different", "positions", "along", "the", "centriole", "(", "P", "=", "proximal", ",", "C", "=", "central", "and", "D", "=", "distal", ")", ".", "Note", "that", "in", "the", "absence", "of", "SFI1", "and", "Centrin", "staining", "at", "the", "distal", "tip", ",", "orientation", "of", "the", "centriole", "was", "decided", "based", "on", "the", "larger", "diameter", "of", "the", "proximal", "region", "compared", "to", "the", "distal", "one", ",", "as", "previously", "observed", "in", "cryo", "-", "tomography", "(", "Greenan", "et", "al", ",", "2020", ")", ".", "White", "arrowheads", "points", "to", "the", "distal", "dot", "of", "SFI1", "and", "Centrin", "that", "disappear", "in", "SFI1", "-", "depleted", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "but", "not", "in", "POC5", "-", "depleted", "centrioles", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "and", "100", "nm", "(", "inset", ")", ".", "Longitudinal", "and", "radial", "localization", "of", "SFI1", "and", "Centrin2", "/", "3", "in", "siCT", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "siSFI1", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "siPOC5", "(", "C", ",", "F", ")", "are", "presented", "below", "the", "corresponding", "image", ".", "N", "=", "25", ",", "40", "and", "60", "centrioles", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "N", "=", "29", ",", "34", ",", "34", "centrioles", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "K", "-", "N", ")", "Representative", "images", "of", "expanded", "U2OS", "cells", "expressing", "GFP", "alone", "or", "GFP", "+", "SFI1", "-", "RR", "and", "treated", "with", "siCT", "or", "siSFI1", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "SFI1", "(", "K", ",", "green", ")", "or", "Centrin2", "/", "3", "(", "M", ",", "grey", ")", ".", "Yellow", "asterisk", "indicates", "the", "centriole", "lacking", "SFI1", "and", "Centrin", "distal", "dots", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "nm", ".", "Expression", "of", "GFP", "+", "SFI1", "-", "RR", "in", "siSFI1", "treated", "cell", "rescues", "the", "presence", "of", "SFI1", "and", "Centrin", "at", "the", "distal", "tip", "of", "the", "centriole", ".", "(", "O", ",", "P", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "Cetn2", "WT", ",", "Cetn", "KO", "or", "Cetn2", "rescue", "RPE", "-", "1", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "Centrin2", "(", "O", ",", "grey", ")", "or", "SFI1", "(", "P", ",", "green", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "presence", "(", "white", ")", "or", "the", "absence", "(", "yellow", ")", "of", "Centrin2", "and", "SFI1", ".", "Scale", "bar", ":", "200nm", ".", "Quantification", "shows", "the", "total", "absence", "of", "Centrin2", "in", "the", "KO", "cells", "correlating", "with", "the", "absence", "of", "SFI1", ".", "Both", "Centrin2", "and", "SFI1", "localization", "are", "rescued", "when", "Centrin2", "is", "re", "-", "expressed", "in", "KO", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-F) Representative confocal images of expanded U2OS centrioles treated with siCT (A, D), siSFI1 (B, E) and siPOC5 (C, F) stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and SFI1 (A-C, green) or Centrin2/3 (D-F, grey). Insets show top views of expanded centrioles at different positions along the centriole (P= proximal, C= central and D= distal). Note that in the absence of SFI1 and Centrin staining at the distal tip, orientation of the centriole was decided based on the larger diameter of the proximal region compared to the distal one, as previously observed in cryo-tomography (Greenan et al, 2020). White arrowheads points to the distal dot of SFI1 and Centrin that disappear in SFI1-depleted (yellow arrowheads) but not in POC5-depleted centrioles. Scale bars: 200 nm and 100 nm (inset). Longitudinal and radial localization of SFI1 and Centrin2/3 in siCT (A, D), siSFI1 (B, E) and siPOC5 (C, F) are presented below the corresponding image. N=25, 40 and 60 centrioles from 3 independent experiments. N=29, 34, 34 centrioles from 3 independent experiments.(K-N) Representative images of expanded U2OS cells expressing GFP alone or GFP+SFI1-RR and treated with siCT or siSFI1. Cells were stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and SFI1 (K, green) or Centrin2/3 (M, grey). Yellow asterisk indicates the centriole lacking SFI1 and Centrin distal dots. Scale bar: 250 nm. Expression of GFP+SFI1-RR in siSFI1 treated cell rescues the presence of SFI1 and Centrin at the distal tip of the centriole.(O, P) Representative confocal images of expanded Cetn2 WT, Cetn KO or Cetn2 rescue RPE-1. Cells were stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and Centrin2 (O, grey) or SFI1 (P, green). Arrowheads indicate the presence (white) or the absence (yellow) of Centrin2 and SFI1. Scale bar: 200nm. Quantification shows the total absence of Centrin2 in the KO cells correlating with the absence of SFI1. Both Centrin2 and SFI1 localization are rescued when Centrin2 is re-expressed in KO cells."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "duplicating", "centrioles", "from", "siCT", "-", "and", "siSFI1", "-", "treated", "U2OS", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "SFI1", "(", "green", ")", "and", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "Inset", "shows", "a", "distal", "position", "of", "the", "mother", "centriole", "where", "SFI1", "signal", "is", "visible", ".", "White", "arrowhead", "indicates", "the", "position", "of", "SFI1", "distal", "dot", "in", "the", "procentriole", "of", "control", "cell", ",", "which", "is", "lost", "in", "SFI1", "-", "depleted", "cells", "(", "yellow", "arrowhead", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "SFI1", "-", "negative", "procentrioles", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "duplicating", "centrioles", ".", "(", "D", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "expanded", "duplicating", "centrioles", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "U2OS", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "HsSAS", "-", "6", "(", "yellow", ")", "and", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "Quantification", "shows", "no", "difference", "in", "the", "percentage", "of", "HsSAS", "-", "6", "-", "positive", "centrioles", "in", "siSFI1", "-", "depleted", "cells", "compared", "to", "control", "cells", ".", "(", "E", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "expanded", "duplicating", "centrioles", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "U2OS", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "STIL", "(", "yellow", ")", "and", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "Quantification", "shows", "no", "difference", "in", "the", "percentage", "of", "STIL", "-", "positive", "centrioles", "in", "siSFI1", "compared", "to", "control", "cells", ".", "(", "F", ")", "Top", "views", "of", "expanded", "U2OS", "centrioles", "treated", "with", "siCT", "or", "siSFI1", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", ".", "(", "G", ")", "Roundness", "index", "of", "centrioles", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "-", "treated", "cells", ".", "(", "H", ")", "Length", "(", "circle", ")", "and", "diameter", "(", "square", ")", "of", "expanded", "centrioles", "in", "siCT", "or", "siSFI1", "-", "treated", "cells", ".", "(", "I", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "U2OS", "centrioles", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "-", "treated", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "White", "stars", "point", "to", "broken", "microtubule", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", ".", "(", "J", ")", "Percentage", "of", "abnormal", "centrioles", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "K", ")", "Top", "views", "of", "expanded", "procentrioles", "from", "U2OS", "cells", "treated", "with", "siCT", "or", "siSFI1", "and", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", ".", "(", "L", ")", "Roundness", "index", "of", "procentrioles", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "-", "treated", "cells", ".", "(", "M", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "expanded", "U2OS", "centrioles", "from", "siCT", "-", "and", "siSFI1", "-", "treated", "cells", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "Centrin", "(", "Cetn2", "/", "3", ",", "grey", ")", ".", "White", "dashed", "lines", "delimitate", "the", "proximal", ",", "central", "and", "distal", "regions", ".", "White", "star", "points", "to", "the", "broken", "microtubule", "wall", ".", "(", "N", ")", "Centrin", "coverage", "(", "%", "of", "the", "total", "tubulin", "length", ")", "along", "the", "centriole", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "O", ")", "Representative", "images", "of", "expanded", "U2OS", "expressing", "GFP", "alone", "or", "GFP", "+", "SFI1", "-", "RR", "and", "treated", "with", "siCT", "or", "siSFI1", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "SFI1", "(", "green", ")", "or", "Centrin2", "/", "3", "(", "grey", ")", ".", "Red", "arrowhead", "indicates", "abnormal", "centriole", ".", "(", "P", ")", "Percentage", "of", "abnormal", "centrioles", "in", "the", "indicated", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative confocal images of expanded duplicating centrioles from siCT- and siSFI1- treated U2OS cells. Cells were stained for SFI1 (green) and α/β-tubulin (αβTub, magenta). Inset shows a distal position of the mother centriole where SFI1 signal is visible. White arrowhead indicates the position of SFI1 distal dot in the procentriole of control cell, which is lost in SFI1-depleted cells (yellow arrowhead). Scale bars: 200 nm. (B) Quantification of the percentage of SFI1-negative procentrioles. (C) Quantification of the percentage of duplicating centrioles.(D) Representative confocal image of expanded duplicating centrioles from siCT and siSFI1 U2OS treated cells. Cells were stained for HsSAS-6 (yellow) and α/β-tubulin (αβTub, magenta). Quantification shows no difference in the percentage of HsSAS-6-positive centrioles in siSFI1-depleted cells compared to control cells. (E) Representative confocal image of expanded duplicating centrioles from siCT and siSFI1 U2OS treated cells. Cells were stained for STIL (yellow) and α/β-tubulin (αβTub, magenta). Quantification shows no difference in the percentage of STIL-positive centrioles in siSFI1 compared to control cells.(F) Top views of expanded U2OS centrioles treated with siCT or siSFI1 stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta). Scale bars: 200 nm. (G) Roundness index of centrioles from siCT and siSFI1-treated cells. (H) Length (circle) and diameter (square) of expanded centrioles in siCT or siSFI1-treated cells.(I) Representative confocal images of expanded U2OS centrioles from siCT and siSFI1-treated cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta). White stars point to broken microtubule wall. Scale bars: 200 nm. (J) Percentage of abnormal centrioles in the indicated conditions.(K) Top views of expanded procentrioles from U2OS cells treated with siCT or siSFI1 and stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta). (L) Roundness index of procentrioles from siCT and siSFI1-treated cells.(M) Representative confocal images of expanded U2OS centrioles from siCT- and siSFI1-treated cells stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and Centrin (Cetn2/3, grey). White dashed lines delimitate the proximal, central and distal regions. White star points to the broken microtubule wall. (N) Centrin coverage (% of the total tubulin length) along the centriole in the indicated conditions.(O) Representative images of expanded U2OS expressing GFP alone or GFP+SFI1-RR and treated with siCT or siSFI1. Cells were stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and SFI1 (green) or Centrin2/3 (grey). Red arrowhead indicates abnormal centriole. (P) Percentage of abnormal centrioles in the indicated conditions."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "F", ")", "Representative", "widefield", "images", "of", "expanded", "centrioles", "during", "ciliogenesis", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "RPE", "-", "1", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "magenta", ")", "and", "SFI1", "(", "green", ")", ".", "Yellow", "asterisks", "indicate", "the", "absence", "of", "SFI1", "at", "the", "distal", "tip", "of", "the", "centrioles", ".", "Red", "arrowhead", "indicates", "abnormal", "centriole", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "nm", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "RPE", "-", "1", "cells", "with", "centrioles", "SFI1", "-", "positive", "(", "intact", "SFI1", ")", ",", "partially", "depleted", "(", "partial", "SFI1", ")", "or", "totally", "missing", "SFI1", "(", "no", "SFI1", ")", "at", "the", "distal", "dot", "in", "siSFI", "-", "treated", "cells", ".", "(", "H", ")", "Percentage", "of", "abnormal", "centrioles", "in", "RPE", "-", "1", "cells", "treated", "with", "siSFI1", ".", "(", "I", ")", "Representative", "widefield", "images", "of", "expanded", "centrioles", "during", "ciliogenesis", "from", "siCT", "and", "siSFI1", "RPE", "-", "1", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "magenta", ")", "and", "CP110", "(", "yellow", ")", ".", "(", "J", ")", "Percentage", "of", "ciliated", "cells", "observed", "in", "U", "-", "ExM", "under", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "K", ")", "Percentage", "of", "CP110", "capped", "/", "uncapped", "centrioles", "under", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "L", ")", "Representative", "widefield", "images", "of", "expanded", "RPE", "-", "1", "during", "ciliogenesis", ",", "expressing", "GFP", "alone", "or", "GFP", "+", "SFI1", "-", "RR", "and", "treated", "with", "siCT", "or", "siSFI1", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "αβTub", ",", "magenta", ")", "and", "CP110", "(", "yellow", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "a", "cilium", ".", "(", "M", ")", "Percentage", "of", "ciliated", "cells", "observed", "in", "U", "-", "ExM", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "N", ")", "Percentage", "of", "CP110", "capped", "/", "uncapped", "centrioles", "in", "the", "indicated", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(F) Representative widefield images of expanded centrioles during ciliogenesis from siCT and siSFI1 RPE-1 treated cells. Cells were stained for α/β-tubulin (magenta) and SFI1 (green). Yellow asterisks indicate the absence of SFI1 at the distal tip of the centrioles. Red arrowhead indicates abnormal centriole. Scale bar: 250 nm. (G) Percentage of RPE-1 cells with centrioles SFI1-positive (intact SFI1), partially depleted (partial SFI1) or totally missing SFI1 (no SFI1) at the distal dot in siSFI-treated cells. (H) Percentage of abnormal centrioles in RPE-1 cells treated with siSFI1.(I) Representative widefield images of expanded centrioles during ciliogenesis from siCT and siSFI1 RPE-1 treated cells. Cells were stained for α/β-tubulin (magenta) and CP110 (yellow). (J) Percentage of ciliated cells observed in U-ExM under the indicated conditions. (K) Percentage of CP110 capped/uncapped centrioles under the indicated conditions.(L) Representative widefield images of expanded RPE-1 during ciliogenesis, expressing GFP alone or GFP+SFI1-RR and treated with siCT or siSFI1. Cells were stained for α/β-tubulin (αβTub, magenta) and CP110 (yellow). Arrowheads indicate a cilium. (M) Percentage of ciliated cells observed in U-ExM in the indicated conditions. (N) Percentage of CP110 capped/uncapped centrioles in the indicated conditions."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "D", ")", "Representative", "widefield", "images", "of", "expanded", "centrioles", "during", "ciliogenesis", "from", "siCT", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "siSFI1", "(", "C", ",", "D", ")", "RPE", "-", "1", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "magenta", ")", "and", "CEP164", "(", "red", "hot", ")", ".", "Note", "the", "abnormal", "organization", "of", "the", "distal", "appendage", "protein", "CEP164", "in", "siSFI1", "-", "treated", "cells", ".", "(", "E", "-", "H", ")", "Representative", "widefield", "images", "of", "expanded", "centrioles", "during", "ciliogenesis", "from", "siCT", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "siSFI1", "(", "G", ",", "H", ")", "RPE", "-", "1", "treated", "cells", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "α", "/", "β", "-", "tubulin", "(", "magenta", ")", "and", "CEP90", "(", "cyan", ")", ".", "(", "I", ")", "Frequency", "distribution", "of", "the", "number", "of", "dots", "per", "centriole", "formed", "by", "CEP164", "in", "indicated", "conditions", ".", "(", "J", ")", "Frequency", "distribution", "of", "the", "number", "of", "dots", "per", "centriole", "formed", "by", "CEP90", "under", "the", "indicated", "conditions", ".", "(", "K", ")", "Percentage", "of", "cells", "presenting", "abnormal", "CEP164", "and", "CEP90", "under", "the", "indicated", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A- D) Representative widefield images of expanded centrioles during ciliogenesis from siCT (A, B) and siSFI1 (C, D) RPE-1 treated cells. Cells were stained for α/β-tubulin (magenta) and CEP164 (red hot). Note the abnormal organization of the distal appendage protein CEP164 in siSFI1-treated cells. (E-H) Representative widefield images of expanded centrioles during ciliogenesis from siCT (E, F) and siSFI1 (G, H) RPE-1 treated cells. Cells were stained for α/β-tubulin (magenta) and CEP90 (cyan). (I) Frequency distribution of the number of dots per centriole formed by CEP164 in indicated conditions. (J) Frequency distribution of the number of dots per centriole formed by CEP90 under the indicated conditions. (K) Percentage of cells presenting abnormal CEP164 and CEP90 under the indicated conditions."}
{"words": ["Figure", "1Characterization", "of", "OAS1", "-", "3", "expression", "in", "parental", "and", "OAS", "knockout", "PC3", "cells", ",", "obtained", "using", "CRISPR", "-", "Cas9", "technology", ".", "Left", ":", "Western", "blot", "(", "WB", ")", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "OAS1", ",", "2", ",", "and", "3", "in", "clones", "of", "OAS", "single", "-", ",", "double", "-", "or", "triple", "-", "knockout", "PC3", "cells", "(", "KO", ",", "DKO", ",", "TKO", ")", ",", "treated", "with", "IFNβ", "(", "500", "IU", "/", "ml", ")", "for", "24", "h", ",", "to", "increase", "OAS", "expression", ".", "sgOAS1", "-", "3", "-", "single", "guide", "RNA", "for", "OAS1", "-", "3", ".", "β", "-", "actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", ":", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "OAS1", ",", "2", ",", "and", "3", "in", "PC3", "DKO", "cells", "with", "increased", "expression", "of", "the", "remaining", "OAS", ",", "without", "IFNβ", "treatment", ".", "OAS1", "expression", "in", "DKO2", "/", "3", "cells", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "due", "to", "insufficient", "sensitivity", "of", "anti", "-", "OAS1", "(", "see", "Fig", "EV1A", ")", ",", "OAS2", "and", "3", "expression", "was", "detected", "by", "WB", ".", "The", "gene", "expression", "data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "SD", "of", "triplicates", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "in", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Characterization", "of", "OAS1", "-", "3", "expression", "in", "parental", "and", "OAS", "knockout", "HME", "cells", ",", "obtained", "using", "CRISPR", "-", "Cas9", "technology", ".", "Left", ":", "WB", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "OAS1", ",", "2", ",", "and", "3", "in", "selected", "clones", "of", "HME", "cells", "in", "which", "OAS1", "-", "3", "were", "knocked", "out", ",", "to", "produce", "OAS", "single", "-", ",", "double", "-", "or", "triple", "-", "knockout", "cells", "(", "KO", ",", "DKO", ",", "TKO", ")", ",", "treated", "with", "100", "IU", "/", "ml", "IFNβ", "for", "24", "h", "to", "increase", "the", "levels", "of", "OAS", "expression", ".", "sgOAS1", "-", "3", "-", "single", "guide", "RNA", "for", "OAS1", "-", "3", ".", "β", "-", "actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", ":", "The", "expression", "of", "OAS1", ",", "2", ",", "and", "3", "in", "HME", "DKO", "cells", "with", "increased", "expression", "of", "the", "remaining", "OAS", ",", "without", "IFNβ", "treatment", ".", "The", "expression", "of", "OAS2", "or", "3", "was", "determined", "by", "WB", "analysis", "(", "asterisk", ",", "non", "-", "specific", "band", ")", ".", "OAS1", "expression", "in", "DKO2", "/", "3", "cells", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "due", "to", "insufficient", "sensitivity", "of", "anti", "-", "OAS1", ".", "The", "gene", "expression", "data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "SD", "of", "triplicates", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "in", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "OAS", "expression", "was", "assessed", "by", "WB", "with", "anti", "OAS1", "-", "3", "in", "HME", "cells", "expressing", "ectopic", "OAS1", "-", "3", "(", "OAS2hi", ",", "OAS3hi", ",", "OAS1hi", ")", "cells", "without", "IFNβ", "treatment", "or", "control", "HME", "cells", "(", "vec", ")", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "IFNβ", "for", "2", "days", "(", "to", "compare", "the", "levels", "of", "induced", "and", "ectopically", "expressed", "OASs", ")", ".", "β", "-", "actin", "and", "Ponceau", "stain", "are", "shown", "as", "loading", "controls", "(", "#", "-", "transfer", "artifact", ")", ";", "ns", ",", "non", "-", "specific", "band", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Characterization of OAS1-3 expression in parental and OAS knockout PC3 cells, obtained using CRISPR-Cas9 technology. Left: Western blot (WB) analyses of the expression of OAS1, 2, and 3 in clones of OAS single-, double- or triple-knockout PC3 cells (KO, DKO, TKO), treated with IFNβ (500 IU/ml) for 24 h, to increase OAS expression. sgOAS1-3 - single guide RNA for OAS1-3. β-actin is shown as a loading control. Right: analysis of the expression of OAS1, 2, and 3 in PC3 DKO cells with increased expression of the remaining OAS, without IFNβ treatment. OAS1 expression in DKO2/3 cells was measured by qRT-PCR due to insufficient sensitivity of anti-OAS1 (see Fig EV1A), OAS2 and 3 expression was detected by WB. The gene expression data are presented as mean + SD of triplicates.**, p<0.001 in Student's t-test.Characterization of OAS1-3 expression in parental and OAS knockout HME cells, obtained using CRISPR-Cas9 technology. Left: WB analyses of the expression of OAS1, 2, and 3 in selected clones of HME cells in which OAS1-3 were knocked out, to produce OAS single-, double- or triple-knockout cells (KO, DKO, TKO), treated with 100 IU/ml IFNβ for 24 h to increase the levels of OAS expression. sgOAS1-3 - single guide RNA for OAS1-3. β-actin is shown as a loading control. Right: The expression of OAS1, 2, and 3 in HME DKO cells with increased expression of the remaining OAS, without IFNβ treatment. The expression of OAS2 or 3 was determined by WB analysis (asterisk, non-specific band). OAS1 expression in DKO2/3 cells was measured by qRT-PCR due to insufficient sensitivity of anti-OAS1. The gene expression data are presented as mean + SD of triplicates. **, p<0.001 in Student's t-test.OAS expression was assessed by WB with anti OAS1-3 in HME cells expressing ectopic OAS1-3 (OAS2hi, OAS3hi, OAS1hi) cells without IFNβ treatment or control HME cells (vec) treated with the indicated concentrations of IFNβ for 2 days (to compare the levels of induced and ectopically expressed OASs). β-actin and Ponceau stain are shown as loading controls (# - transfer artifact); ns, non-specific band."}
{"words": ["Figure", "2Analysis", "of", "the", "percentages", "of", "dead", "PC3", "DKO", "cells", "or", "PC3", "DKO", "cells", "with", "high", "expression", "of", "the", "remaining", "OAS", ",", "treated", "with", "75", "µM", "H2O2", ",", "40", "μM", "p", "-", "Benzoquinone", "(", "pBQ", ")", "or", "2", "mM", "methyl", "methane", "sulfonate", "(", "MMS", ")", ".", "The", "number", "of", "dead", "cells", "(", "Cytotox", "Green", "-", "permeable", ")", "was", "monitored", "every", "3", "h", "using", "an", "IncuCyte", "ZOOM", "instrument", ".", "Means", "of", "triplicates", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "no", "significance", "in", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "data", ",", "which", "were", "reproduced", "more", "than", "3", "times", ",", "are", "shown", ".", "Analysis", "of", "the", "percentages", "of", "dead", "HME", "DKO", "cells", "and", "HME", "DKO", "cells", "with", "high", "expression", "of", "the", "remaining", "OAS", ",", "treated", "with", "500", "μM", "H2O2", ",", "and", "KO1", "-", "3", "and", "OAS1", "-", "3hi", "cells", "treated", "with", "750", "μM", "H2O2", ".", "Data", "were", "obtained", "and", "presented", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Means", "of", "triplicates", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ns", ",", "no", "significance", "in", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "data", ",", "which", "were", "reproduced", "more", "than", "3", "times", ",", "are", "shown", ".", "Survival", "of", "HME", "cells", ",", "measured", "by", "the", "MTT", "cell", "survival", "assay", ".", "Left", ":", "control", "(", "vec", ")", "and", "KO1", "-", "3", "cells", "were", "treated", "with", "250", ",", "500", "or", "750", "μM", "of", "H2O2", "and", "analyzed", "after", "24", "h", ";", "Right", ":", "control", ",", "OAS1hi", "and", "OAS", "KO", "were", "treated", "with", "500", "μM", "of", "H2O2", "and", "analyzed", "after", "72", "h", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "mean", "+", "SD", "of", "triplicates", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Analysis of the percentages of dead PC3 DKO cells or PC3 DKO cells with high expression of the remaining OAS, treated with 75 µM H2O2, 40 μM p-Benzoquinone (pBQ) or 2 mM methyl methane sulfonate (MMS). The number of dead cells (Cytotox Green-permeable) was monitored every 3 h using an IncuCyte ZOOM instrument. Means of triplicates ± SD. ***, p<0.001; *, p<0.05; ns, no significance in two-way ANOVA. Representative data, which were reproduced more than 3 times, are shown.Analysis of the percentages of dead HME DKO cells and HME DKO cells with high expression of the remaining OAS, treated with 500 μM H2O2, and KO1-3 and OAS1-3hi cells treated with 750 μM H2O2. Data were obtained and presented as in (A). Means of triplicates ± SD. ***, p<0.001; **, p<0.01; ns, no significance in two-way ANOVA. Representative data, which were reproduced more than 3 times, are shown.Survival of HME cells, measured by the MTT cell survival assay. Left: control (vec) and KO1-3 cells were treated with 250, 500 or 750 μM of H2O2 and analyzed after 24 h; Right: control, OAS1hi and OAS KO were treated with 500 μM of H2O2 and analyzed after 72 h . The data are presented as mean + SD of triplicates. ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05 in Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3An", "autoradiograph", "showing", "radiolabeled", "PAR2", "-", "5A", "bands", "that", "were", "formed", "in", "reactions", "of", "OAS1", "with", "the", "activator", "(", "pIC", ")", "and", "the", "acceptor", "PAR", "(", "lanes", "11", "-", "14", ")", ".", "Lanes", "1", "-", "2", "OAS1", "only", ",", "lanes", "3", "-", "6", "OAS1", "with", "activator", "pIC", ";", "lanes", "7", "-", "10", "OAS1", "with", "substrate", "PAR", ";", "lane", "15", "negative", "control", "without", "OAS1", ".", "32P", "-", "α", "-", "ATP", "was", "added", "to", "all", "reactions", ".", "Top", ":", "specificity", "of", "anti", "-", "2", "'", ",", "5", "'", "A", ",", "as", "shown", "by", "ELISA", ".", "Synthetic", "2", "'", ",", "5", "'", "-", "p3A3", ",", "PAR2", "-", "5A", "#", "1", ",", "PAR2", "-", "5A", "#", "2", "(", "2", "different", "preparations", "of", "PAR2", "-", "5A", ")", ".", "PAR", "and", "3", "'", ",", "5", "'", "-", "pA3", "were", "used", "as", "competitors", ".", "Bottom", ":", "Dot", "-", "blot", "of", "synthetic", "PAR", "and", "2", "-", "5A", "-", "PAR", ".", "In", "vitro", "synthesized", "PAR", "and", "PAR", "-", "2", "-", "5", "-", "A", "were", "applied", "in", "1", ":", "2", "dilutions", "(", "left", "to", "right", ")", "to", "nylon", "membrane", "and", "probed", "with", "anti", "-", "2", "-", "5A", "or", "anti", "-", "PAR", ".", "Immunostaining", "of", "PAR", "-", "2", "-", "5A", "synthesized", "in", "vitro", ".", "Reaction", "mixtures", "were", "resolved", "by", "electrophoresis", "in", "a", "polyacrylamide", "-", "8", "M", "urea", "denaturing", "gel", ",", "transferred", "to", "a", "charged", "nylon", "membrane", ",", "and", "probed", "with", "mouse", "anti", "-", "PAR", "10H", "(", "left", "panel", ")", "or", "rabbit", "anti", "-", "2", "-", "5A", "after", "stripping", "(", "right", "panel", ")", ".", "XC", ":", "Xylene", "Cyanol", "(", "apparent", "size", "150", "nucleotides", ")", ",", "BPB", ":", "Bromophenol", "Blue", "(", "apparent", "size", "35", "nucleotides", ")", ".", "Lane", "1", ",", "purified", "PARP1", "alone", ";", "lane", "2", ",", "PAR", "reaction", ":", "PARP1", ",", "activated", "DNA", ",", "NAD", "+", ",", "and", "histone", ";", "lane", "3", ",", "2", "-", "5A", "reaction", ":", "OAS1", ",", "pIC", ",", "ATP", ";", "lane", "4", ",", "2", "-", "5A", "and", "PAR", "reactions", ":", "OAS1", ",", "pIC", ",", "ATP", "and", "PARP1", ",", "activated", "DNA", ",", "NAD", ",", "histone", ".", "After", "incubation", "at", "37oC", "for", "60", "min", ",", "the", "proteins", "were", "removed", "by", "digestion", "with", "proteinase", "K", ".", "Western", "analysis", "of", "PARP1", "auto", "-", "modified", "with", "PAR", "in", "vitro", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "OAS1", ".", "Reaction", "mixtures", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "transferred", "to", "a", "charged", "nylon", "membrane", ",", "and", "probed", "with", "mouse", "anti", "-", "PARP1", ".", "Reactions", "were", "set", "up", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "but", "without", "proteinase", "K", "digestion", ".", "Lane", "1", ",", "PARP1", "alone", ";", "lane", "2", ",", "PAR", "reaction", ":", "PARP1", ",", "activated", "DNA", "and", "NAD", ";", "lane", "3", ",", "2", "-", "5A", "reaction", ":", "OAS1", ",", "pIC", ",", "and", "ATP", ";", "lane", "4", ",", "2", "-", "5A", "and", "PAR", "reactions", ":", "OAS1", ",", "pIC", ",", "and", "ATP", "with", "PARP1", ",", "activated", "DNA", ",", "NAD", "and", "histone", ";", "lane", "5", ",", "2", "-", "5A", "and", "PAR", "reactions", "without", "ATP", ".", "The", "large", "smeary", "signals", "are", "due", "to", "PAR", "chains", "attached", "to", "PARP1", "and", "the", "smaller", "sharp", "bands", "are", "free", "PARP1", ".", "The", "same", "blot", "was", "probed", "with", "anti", "-", "PAR", ",", "anti", "-", "2", "-", "5A", "and", "anti", "-", "OAS1", ".", "Western", "analysis", "of", "2", "-", "5A", "precipitated", "with", "anti", "-", "PAR", "antibodies", "from", "lysates", "of", "H2O2", "-", "treated", "HME", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "500", "M", "H2O2", "for", "12", "min", ",", "and", "lysates", "were", "incubated", "with", "control", "(", "mouse", "IgG3", ")", "or", "mouse", "anti", "-", "PAR", ".", "Samples", "were", "probed", "with", "anti", "-", "PAR", ",", "anti", "-", "2", "-", "5A", "or", "anti", "-", "PARP1", "antibodies", ".", "Flow", "-", "thr", ".", ":", "flow", "-", "through", ",", "WCL", ":", "whole", "cell", "lysate", ",", "IP", ":", "immuno", "-", "precipitate", ".", "Right", "panels", "(", "IP", ")", "show", "exposures", "for", "10", "x", "longer", "than", "left", "panels", "(", "WCL", ",", "flow", "-", "thr", ")", ".", "Apparent", "MW", "(", "kDa", ")", "is", "indicated", "on", "the", "right", ".", "Experiments", "were", "repeated", "two", "times", "with", "similar", "results", ".", "Western", "analysis", "of", "2", "-", "5A", "precipitated", "with", "anti", "-", "PAR", "antibodies", "from", "lysates", "of", "HME", "control", ",", "KO1", "and", "TKO", "cells", ",", "and", "control", "cells", "pre", "-", "incubated", "with", "olaparib", ",", "treated", "with", "H2O2", "for", "12", "min", ".", "Samples", "were", "probed", "with", "anti", "-", "PAR", "or", "anti", "-", "2", "-", "5A", "antibodies", ".", "Ponceau", "staining", "of", "the", "membrane", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "Experiments", "were", "repeated", "four", "times", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3An autoradiograph showing radiolabeled PAR2-5A bands that were formed in reactions of OAS1 with the activator (pIC) and the acceptor PAR (lanes 11-14). Lanes 1-2 OAS1 only, lanes 3-6 OAS1 with activator pIC; lanes 7-10 OAS1 with substrate PAR; lane 15 negative control without OAS1. 32P-α-ATP was added to all reactions.Top: specificity of anti-2',5'A, as shown by ELISA. Synthetic 2',5'-p3A3, PAR2-5A #1, PAR2-5A #2 (2 different preparations of PAR2-5A). PAR and 3',5'-pA3 were used as competitors. Bottom: Dot-blot of synthetic PAR and 2-5A-PAR. In vitro synthesized PAR and PAR-2-5-A were applied in 1:2 dilutions (left to right) to nylon membrane and probed with anti-2-5A or anti-PAR.Immunostaining of PAR-2-5A synthesized in vitro. Reaction mixtures were resolved by electrophoresis in a polyacrylamide-8 M urea denaturing gel, transferred to a charged nylon membrane, and probed with mouse anti-PAR 10H (left panel) or rabbit anti-2-5A after stripping (right panel). XC: Xylene Cyanol (apparent size 150 nucleotides), BPB: Bromophenol Blue (apparent size 35 nucleotides). Lane 1, purified PARP1 alone; lane 2, PAR reaction: PARP1, activated DNA, NAD+, and histone; lane 3, 2-5A reaction: OAS1, pIC, ATP; lane 4, 2-5A and PAR reactions: OAS1, pIC, ATP and PARP1, activated DNA, NAD, histone. After incubation at 37oC for 60 min, the proteins were removed by digestion with proteinase K.Western analysis of PARP1 auto-modified with PAR in vitro in the absence or presence of OAS1. Reaction mixtures were resolved by SDS-PAGE, transferred to a charged nylon membrane, and probed with mouse anti-PARP1. Reactions were set up as in (C), but without proteinase K digestion. Lane 1, PARP1 alone; lane 2, PAR reaction: PARP1, activated DNA and NAD; lane 3, 2-5A reaction: OAS1, pIC, and ATP; lane 4, 2-5A and PAR reactions: OAS1, pIC, and ATP with PARP1, activated DNA, NAD and histone; lane 5, 2-5A and PAR reactions without ATP. The large smeary signals are due to PAR chains attached to PARP1 and the smaller sharp bands are free PARP1. The same blot was probed with anti-PAR, anti-2-5A and anti-OAS1.Western analysis of 2-5A precipitated with anti-PAR antibodies from lysates of H2O2-treated HME cells. Cells were treated with 500 M H2O2 for 12 min, and lysates were incubated with control (mouse IgG3) or mouse anti-PAR. Samples were probed with anti-PAR, anti-2-5A or anti-PARP1 antibodies. Flow-thr.: flow-through, WCL: whole cell lysate, IP: immuno-precipitate. Right panels (IP) show exposures for 10 x longer than left panels (WCL, flow-thr). Apparent MW (kDa) is indicated on the right. Experiments were repeated two times with similar results.Western analysis of 2-5A precipitated with anti-PAR antibodies from lysates of HME control, KO1 and TKO cells, and control cells pre-incubated with olaparib, treated with H2O2 for 12 min. Samples were probed with anti-PAR or anti-2-5A antibodies. Ponceau staining of the membrane is shown as loading control. Experiments were repeated four times with similar results."}
{"words": ["Figure", "4HME", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "the", "indicated", "times", "and", "stained", "with", "anti", "-", "PAR", "and", "anti", "-", "2", "-", "5A", ".", "Nuclei", "were", "visualized", "with", "DAPI", ".", "The", "densities", "of", "the", "2", "-", "5A", "and", "PAR", "fluorescence", "signals", "in", "the", "nuclei", "are", "plotted", ".", "Signals", "in", "40", "+", "cells", "per", "sample", "were", "measured", ".", "Data", "are", "presented", "as", "distribution", "plot", "with", "mean", "value", "+", "/", "-", "SD", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "5", ";", "ns", ",", "non", "-", "significant", ";", "as", "determined", "by", "unpaired", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "control", "(", "vector", ")", "and", "TKO", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "12", "min", ",", "incubated", "on", "ice", "for", "7", "min", "with", "PBS", "or", "detergent", "-", "containing", "Buffer", "1", ",", "to", "extract", "unbound", "proteins", ",", "fixed", "with", "methanol", "/", "acetone", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "2", "-", "5A", "and", "anti", "-", "PAR", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "vector", "control", "(", "vec", ")", ",", "DKO", ",", "and", "TKO", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "12", "min", ".", "In", "untreated", "cells", ",", "no", "PAR", "staining", "was", "detected", ".", "The", "densities", "of", "fluorescence", "signals", "in", "the", "nuclei", "relative", "to", "the", "untreated", "vector", "control", "are", "plotted", ".", "Signals", "in", "40", "or", "more", "cells", "per", "sample", "were", "measured", ".", "Data", "are", "presented", "as", "distribution", "plot", "with", "mean", "value", "+", "/", "-", "SD", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "5", ";", "ns", ",", "non", "-", "significant", "as", "determined", "by", "unpaired", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "control", "(", "vector", ")", "and", "KO1", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "the", "indicated", "times", "and", "stained", "with", "anti", "-", "2", "-", "5A", "and", "anti", "-", "PAR", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Accumulation", "of", "2", "-", "5A", "and", "PAR", "in", "HME", "cells", "pre", "-", "incubated", "with", "10", "or", "100", "nM", "olaparib", "for", "30", "min", "before", "treatment", "with", "H2O2", "for", "12", "min", ",", "as", "visualized", "by", "immunostaining", "with", "anti", "-", "2", "-", "5A", "and", "anti", "-", "PAR", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HME cells were treated with H2O2 for the indicated times and stained with anti-PAR and anti-2-5A. Nuclei were visualized with DAPI. The densities of the 2-5A and PAR fluorescence signals in the nuclei are plotted. Signals in 40+ cells per sample were measured. Data are presented as distribution plot with mean value +/- SD; ***, p<0.001; *, p<0.5; ns, non-significant; as determined by unpaired Kolmogorov-Smirnov t-test. Scale bar, 10μm.HME control (vector) and TKO cells were treated with H2O2 for 12 min, incubated on ice for 7 min with PBS or detergent-containing Buffer 1, to extract unbound proteins, fixed with methanol/acetone, and stained with anti-2-5A and anti-PAR. Scale bar, 10μm.HME vector control (vec), DKO, and TKO cells were treated with H2O2 for 12 min. In untreated cells, no PAR staining was detected. The densities of fluorescence signals in the nuclei relative to the untreated vector control are plotted. Signals in 40 or more cells per sample were measured. Data are presented as distribution plot with mean value +/- SD; ***, p<0.001; *, p<0.5; ns, non-significant as determined by unpaired Kolmogorov-Smirnov t-test. Scale bar, 10μm.HME control (vector) and KO1 cells were treated with H2O2 for the indicated times and stained with anti-2-5A and anti-PAR. Scale bar, 10μm.Accumulation of 2-5A and PAR in HME cells pre-incubated with 10 or 100 nM olaparib for 30 min before treatment with H2O2 for 12 min, as visualized by immunostaining with anti-2-5A and anti-PAR. Scale bar, 10μm."}
{"words": ["Figure", "5HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "OAS", "single", "knockout", "cells", "(", "KO1", "-", "3", ")", ",", "pre", "-", "treated", "with", "IFNβ", "for", "2", "days", "to", "induce", "OAS", "expression", ",", "fixed", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "OAS1", ",", "2", ",", "or", "3", ".", "Staining", "with", "secondary", "antibodies", "is", "shown", "as", "a", "negative", "control", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "control", "cells", "were", "treated", "with", "IFNβ", "for", "2", "days", "to", "induce", "OAS", "expression", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "OAS1", ",", "2", ",", "or", "3", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "OAS1", ",", "2", ",", "or", "3", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "Flag", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Untreated", "HME", "(", "left", ")", "or", "PC3", "(", "right", ")", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "OAS1", "-", "3", "and", "the", "nuclei", "were", "visualized", "by", "staining", "with", "DAPI", ".", "The", "intensities", "of", "OAS1", "-", "3", "fluorescence", "signals", "in", "the", "nuclei", "are", "plotted", ".", "Nuclear", "and", "cytoplasmic", "masks", "were", "made", "based", "on", "DAPI", "and", "phalloidin", "staining", ",", "respectively", ".", "Experiments", "were", "repeated", "at", "least", "two", "times", ";", "at", "least", "40", "cells", "per", "condition", "were", "counted", ".", "Data", "are", "presented", "as", "distribution", "plot", "with", "mean", "value", "+", "/", "-", "SD", ";", "statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "KO1", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "IFNβ", "for", "2", "days", ",", "followed", "by", "a", "10", "-", "min", "treatment", "with", "H2O2", ".", "Cytoplasmic", ",", "membrane", "-", "bound", "and", "soluble", "nuclear", "fractions", "of", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "the", "Western", "method", ";", "staining", "with", "anti", "-", "AIF", "and", "anti", "-", "HDAC2", "staining", "was", "used", "to", "characterize", "membrane", "and", "nuclear", "fractions", ",", "respectively", ".", "Anti", "-", "PAR", "detects", "all", "PAR", "-", "modified", "proteins", ",", "which", "appear", "as", "smears", ".", "HME", "control", "(", "v", ")", ",", "KO1", "and", "OAS1hi", "(", "O1hi", ")", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "IFNβ", "for", "48", "h", ".", "Cytoplasmic", ",", "membrane", "-", "bound", "and", "soluble", "nuclear", "fractions", "of", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "the", "Western", "method", ".", "Anti", "-", "AIF", "and", "anti", "-", "HDAC2", "were", "used", "to", "characterize", "membrane", "and", "nuclear", "fractions", ",", "respectively", ";", "*", "indicates", "lanes", "where", "specific", "signals", "are", "detected", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5HME control (vec) and OAS single knockout cells (KO1-3), pre-treated with IFNβ for 2 days to induce OAS expression, fixed, and stained with anti-OAS1, 2, or 3. Staining with secondary antibodies is shown as a negative control. Scale bar, 10μm.HME control cells were treated with IFNβ for 2 days to induce OAS expression, fixed and stained with anti-OAS1, 2, or 3. Scale bar, 10μm.HME cells expressing Flag-tagged OAS1, 2, or 3 were fixed and stained with anti-Flag. Scale bar, 10μm.Untreated HME (left) or PC3 (right) cells were stained with anti-OAS1-3 and the nuclei were visualized by staining with DAPI. The intensities of OAS1-3 fluorescence signals in the nuclei are plotted. Nuclear and cytoplasmic masks were made based on DAPI and phalloidin staining, respectively. Experiments were repeated at least two times; at least 40 cells per condition were counted. Data are presented as distribution plot with mean value +/- SD; statistical significance was determined by unpaired Kolmogorov-Smirnov t-test. Scale bar, 10μm.HME control (vec) and KO1 cells were pre-treated with IFNβ for 2 days, followed by a 10-min treatment with H2O2. Cytoplasmic, membrane-bound and soluble nuclear fractions of cell lysates were analyzed by the Western method; staining with anti-AIF and anti-HDAC2 staining was used to characterize membrane and nuclear fractions, respectively. Anti-PAR detects all PAR-modified proteins, which appear as smears.HME control (v), KO1 and OAS1hi (O1hi) cells were pre-treated with IFNβ for 48 h. Cytoplasmic, membrane-bound and soluble nuclear fractions of cell lysates were analyzed by the Western method. Anti-AIF and anti-HDAC2 were used to characterize membrane and nuclear fractions, respectively; * indicates lanes where specific signals are detected."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "images", "and", "analysis", "of", "Western", "blots", "for", "PAR", ",", "performed", "with", "lysates", "of", "HME", "control", "(", "vec", ")", "OAS", "single", "KO", "cells", "(", "KO1", "-", "3", ")", ",", "treated", "with", "H2O2", "for", "15", "or", "40", "min", ".", "β", "-", "actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Signal", "intensity", "was", "measured", "using", "ImageJ", "software", ".", "Average", "lane", "densities", ",", "normalized", "to", "vector", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "are", "plotted", "below", "as", "mean", "+", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "as", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Same", "as", "(", "A", ")", ",", "with", "lysates", "of", "HME", "control", "(", "vec", ")", "cells", "and", "cells", "expressing", "ectopic", "OAS1", ",", "OAS2", "or", "OAS3", "(", "OAS1", "-", "3hi", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Average", "lane", "densities", "normalized", "to", "vector", "are", "plotted", "below", "below", "as", "mean", "+", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "as", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "HME", "cells", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "IFNβ", "for", "2", "days", "to", "increase", "OAS", "abundance", ",", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "0", "-", "60", "min", "at", "37oC", ".", "Western", "blots", "of", "PAR", "accumulation", "(", "top", ")", ",", "shift", "in", "the", "position", "of", "PARylated", "PARP1", "(", "middle", ")", ",", "OAS2", "induction", "by", "IFNβ", ",", "and", "β", "-", "actin", "as", "a", "loading", "control", "are", "shown", ".", "Experiments", "were", "repeated", "twice", ".", "HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "KO1", "cells", "were", "pretreated", "with", "0", "-", "500", "IU", "/", "ml", "IFNβ", "for", "2", "days", ",", "and", "then", "treated", "with", "500", "μM", "H2O2", "for", "10", "or", "30", "min", ".", "Western", "blots", "of", "PAR", "accumulation", "(", "top", ",", "high", "and", "medium", "exposure", ";", "middle", ",", "low", "exposure", ")", ",", "OAS1", "-", "3", "induction", "by", "IFNβ", ",", "and", "β", "-", "actin", "as", "a", "loading", "control", "are", "shown", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "four", "times", ";", "ns", ",", "non", "-", "specific", "band", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative images and analysis of Western blots for PAR, performed with lysates of HME control (vec) OAS single KO cells (KO1-3), treated with H2O2 for 15 or 40 min. β-actin is shown as a loading control. Signal intensity was measured using ImageJ software. Average lane densities, normalized to vector from three independent experiments, are plotted below as mean + SD, * p < 0.05 as assessed by Student's t-test.Same as (A), with lysates of HME control (vec) cells and cells expressing ectopic OAS1, OAS2 or OAS3 (OAS1-3hi). Experiments were repeated at least three times. Average lane densities normalized to vector are plotted below below as mean + SD, * p < 0.05 as assessed by Student's t-test.HME cells, pre-incubated with IFNβ for 2 days to increase OAS abundance, were treated with H2O2 for 0-60 min at 37oC. Western blots of PAR accumulation (top), shift in the position of PARylated PARP1 (middle), OAS2 induction by IFNβ, and β-actin as a loading control are shown. Experiments were repeated twice.HME control (vec) and KO1 cells were pretreated with 0-500 IU/ml IFNβ for 2 days, and then treated with 500 μM H2O2 for 10 or 30 min. Western blots of PAR accumulation (top, high and medium exposure; middle, low exposure), OAS1-3 induction by IFNβ, and β-actin as a loading control are shown. The experiment was repeated four times; ns, non-specific band."}
{"words": ["Figure", "7HME", "cells", "were", "treated", "with", "750", "μM", "of", "H2O2", ",", "with", "and", "without", "pre", "-", "treatment", "with", "olaparib", ".", "The", "accumulation", "of", "dead", "cells", "was", "measured", "with", "an", "IncuCyte", "ZOOM", "instrument", ".", "Means", "of", "triplicates", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "in", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "The", "data", "represent", "the", "results", "of", "three", "experiments", ".", "HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "KO1", "-", "3", "cells", "were", "incubated", "with", "olaparib", "for", "30", "min", "followed", "by", "treatment", "with", "500", "μM", "H2O2", "for", "15", "min", ".", "PAR", "accumulation", "was", "assessed", "by", "the", "Western", "method", ",", "with", "anti", "-", "PAR", ".", "β", "-", "actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "HME", "vec", ",", "KO1", "and", "OAS1hi", "cells", "were", "incubated", "with", "olaparib", "for", "30", "min", ",", "then", "treated", "with", "500", "or", "1000", "μM", "of", "H2O2", "and", "allowed", "to", "grow", "for", "72", "h", ".", "Bars", "represent", "means", "of", "triplicates", "±", "SD", "from", "three", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "relative", "to", "H2O2", "-", "treated", "vec", "cells", ")", "in", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "KO1", "cells", "transfected", "with", "vector", "(", "KO1", "-", "vec", ")", ",", "wild", "-", "type", "OAS1", "(", "KO1", "-", "OAS1", "wt", ")", ",", "or", "mutant", "OAS1", "(", "D75A", "/", "D77A", ",", "KO1", "-", "OAS1", "mut", ")", "were", "treated", "with", "500", "μM", "of", "H2O2", "for", "the", "indicated", "times", "and", "analyzed", "by", "the", "Western", "method", ".", "Loading", "controls", ":", "β", "-", "actin", "and", "overall", "protein", "levels", "were", "visualized", "by", "stain", "-", "free", "technology", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ";", "a", "representative", "image", "is", "shown", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "abundance", "of", "PAR", "in", "(", "D", ")", ".", "Images", "obtained", "in", "three", "independent", "experiments", "were", "analyzed", ";", "the", "data", "are", "plotted", "as", "mean", "+", "SD", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "KO1", "cells", "transfected", "with", "vector", ",", "wild", "-", "type", "OAS1", "(", "OAS1", "wt", ")", ",", "or", "mutant", "OAS1", "(", "D75A", "/", "D77A", ",", "OAS1", "mut", ")", "were", "treated", "with", "500", "μM", "of", "H2O2", ".", "The", "accumulation", "of", "dead", "cells", "was", "measured", "with", "an", "IncuCyte", "ZOOM", "instrument", ".", "Means", "of", "triplicates", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "in", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "The", "data", "represent", "the", "results", "of", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7HME cells were treated with 750 μM of H2O2, with and without pre-treatment with olaparib. The accumulation of dead cells was measured with an IncuCyte ZOOM instrument. Means of triplicates ± SD. ***, p<0.01 in two-way ANOVA. The data represent the results of three experiments.HME control (vec) and KO1-3 cells were incubated with olaparib for 30 min followed by treatment with 500 μM H2O2 for 15 min. PAR accumulation was assessed by the Western method, with anti-PAR. β-actin is shown as a loading control.HME vec, KO1 and OAS1hi cells were incubated with olaparib for 30 min, then treated with 500 or 1000 μM of H2O2 and allowed to grow for 72 h. Bars represent means of triplicates ± SD from three experiments. * p<0.05; ** p<0.01 (relative to H2O2-treated vec cells) in Student's t-test.KO1 cells transfected with vector (KO1-vec), wild-type OAS1 (KO1-OAS1 wt), or mutant OAS1 (D75A/D77A, KO1-OAS1 mut) were treated with 500 μM of H2O2 for the indicated times and analyzed by the Western method. Loading controls: β-actin and overall protein levels were visualized by stain-free technology. The experiment was repeated three times; a representative image is shown.Quantification of the relative abundance of PAR in (D). Images obtained in three independent experiments were analyzed; the data are plotted as mean + SD *, p<0.05 by Student's t-test.KO1 cells transfected with vector, wild-type OAS1 (OAS1 wt), or mutant OAS1 (D75A/D77A, OAS1 mut) were treated with 500 μM of H2O2. The accumulation of dead cells was measured with an IncuCyte ZOOM instrument. Means of triplicates ± SD. ****, p<0.001 in two-way ANOVA. The data represent the results of three experiments."}
{"words": ["Figure", "8A", ",", "B", ".", "Representative", "images", "and", "analysis", "of", "AIF", "accumulation", "in", "the", "nuclei", "of", "HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "OAS", "single", "-", "knockout", "cells", "(", "KO", ")", ",", "and", "HME", "control", "(", "vec", ")", "and", "OAS", "double", "-", "and", "triple", "-", "knockout", "cells", "(", "DKOs", "and", "TKO", ")", ",", "24", "h", "after", "treatment", "with", "1000", "μM", "H2O2", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Arrowheads", ":", "AIF", "translocated", "to", "nuclei", ".", "Untreated", "control", "cells", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "Right", "panels", ",", "AIF", "-", "positive", "nuclei", "were", "counted", "from", "pictures", "taken", "from", "three", "independent", "fields", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "Means", "±", "SD", "are", "plotted", ".", "HME", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "H2O2", "-", "treated", "control", "(", "vec", ")", "cells", ";", "C", ".", "Representative", "images", "and", "analysis", "of", "AIF", "accumulation", "in", "the", "nuclei", "of", "PC3", "DKO2", "/", "3", "and", "PC3", "DKO2", "/", "3", "+", "1", "cells", ",", "24", "h", "after", "treatment", "with", "100", ",", "200", "or", "400", "μM", "H2O2", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Arrowheads", ":", "AIF", "translocated", "to", "nuclei", ".", "Untreated", "control", "cells", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "Right", "panels", ",", "AIF", "-", "positive", "nuclei", "were", "counted", "from", "pictures", "taken", "from", "three", "independent", "fields", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "Means", "±", "SD", "are", "plotted", ".", "PC3", ":", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "to", "untreated", "cells", "of", "each", "genotype", "as", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A, B. Representative images and analysis of AIF accumulation in the nuclei of HME control (vec) and OAS single-knockout cells (KO), and HME control (vec) and OAS double- and triple-knockout cells (DKOs and TKO), 24 h after treatment with 1000 μM H2O2. Data information: Nuclei were visualized by DAPI staining. Arrowheads: AIF translocated to nuclei. Untreated control cells are shown on the left. Right panels, AIF-positive nuclei were counted from pictures taken from three independent fields in two independent experiments. Means ±SD are plotted. HME: * p<0.005; ** p<0.001 compared to H2O2-treated control (vec) cells;C. Representative images and analysis of AIF accumulation in the nuclei of PC3 DKO2/3 and PC3 DKO2/3+1 cells, 24 h after treatment with 100, 200 or 400 μM H2O2. Data information: Nuclei were visualized by DAPI staining. Arrowheads: AIF translocated to nuclei. Untreated control cells are shown on the left. Right panels, AIF-positive nuclei were counted from pictures taken from three independent fields in two independent experiments. Means ±SD are plotted. PC3: *** p<0.0001 compared to untreated cells of each genotype as assessed by Student's t-test. Scale bars, 10μm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Overexpression", "of", "wildtype", "full", "-", "length", "human", "tau", "(", "hTau", ",", "also", "termed", "tau441", "or", "tau40", "or", "tau2N4R", ")", "induced", "significant", "alterations", "of", "9", "transcription", "factors", "screened", "by", "using", "Transcription", "Factors", "Activation", "Profiling", "Plate", "Array", "II", ",", "in", "which", "96", "transcription", "factors", "(", "Appendix", "Table", "S1", "and", "S2", ")", "were", "monitored", ".", "The", "empty", "vector", "was", "transfected", "as", "a", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Expression", "of", "hTau", "(", "probed", "by", "HT7", ")", "increased", "total", "and", "the", "phosphorylated", "STAT1", "at", "Tyr701", "(", "pY", "-", "STAT1", ")", "in", "cell", "whole", "extracts", "(", "C", ",", "D", ")", "and", "the", "nuclear", "fraction", "(", "E", ",", "F", ")", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ".", "(", "G", ")", "The", "representative", "immunofluorescent", "images", "and", "quantitative", "analysis", "show", "significantly", "increased", "STAT1", "signal", "in", "the", "nuclear", "fraction", "of", "HEK293", "cells", "with", "overexpression", "of", "hTau", "compared", "with", "the", "empty", "vector", "control", "(", "eGFP", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "Ctrl", ".", "(", "H", ")", "Overexpression", "of", "hTau", "most", "significantly", "increased", "STAT1", "monomer", "and", "dimer", "formation", "in", "nuclear", "fraction", "(", "Nu", ")", "measured", "by", "Western", "blotting", ".", "(", "I", ")", "Overexpression", "of", "hTau", "increased", "STAT1", "activity", "in", "HEK293", "cells", "detected", "by", "luciferase", "assay", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ".", "(", "J", ")", "Overexpression", "of", "hTau", "increased", "STAT1", "-", "DNA", "binding", "activity", "in", "HEK293", "cells", "measured", "by", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "(", "EMSA", ")", ".", "*", ",", "indicates", "STAT1", "/", "DNA", "complex", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Overexpression of wildtype full-length human tau (hTau, also termed tau441 or tau40 or tau2N4R) induced significant alterations of 9 transcription factors screened by using Transcription Factors Activation Profiling Plate Array II, in which 96 transcription factors (Appendix Table S1 and S2) were monitored. The empty vector was transfected as a control (Ctrl).(C-F) Expression of hTau (probed by HT7) increased total and the phosphorylated STAT1 at Tyr701 (pY-STAT1) in cell whole extracts (C, D) and the nuclear fraction (E, F) measured by Western blotting (n=4). Data information: Data were presented as mean ± SD (Mann-Whitney test). *, p<0.05 vs Ctrl.(G) The representative immunofluorescent images and quantitative analysis show significantly increased STAT1 signal in the nuclear fraction of HEK293 cells with overexpression of hTau compared with the empty vector control (eGFP) (n=5). Scale bar, 10 μm. Data information: Data were presented as mean ± SD (Mann-Whitney test). , **, p<0.01 vs Ctrl.(H) Overexpression of hTau most significantly increased STAT1 monomer and dimer formation in nuclear fraction (Nu) measured by Western blotting.(I) Overexpression of hTau increased STAT1 activity in HEK293 cells detected by luciferase assay (n=4). Data information: Data were presented as mean ± SD (Mann-Whitney test). *, p<0.05 , ***, p<0.001 vs Ctrl.(J) Overexpression of hTau increased STAT1-DNA binding activity in HEK293 cells measured by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). *, indicates STAT1/DNA complex."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "AAV", "-", "hTau", "-", "eGFP", "(", "AAV", "-", "hTau", ")", "or", "the", "empty", "vector", "AAV", "-", "eGFP", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "was", "stereotaxically", "injected", "into", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "C57", "mice", ".", "After", "one", "month", ",", "the", "increased", "levels", "of", "STAT1", "and", "pY", "-", "STAT1", "in", "hippocampal", "total", "extracts", "and", "the", "nuclear", "fraction", "were", "detected", "in", "hTau", "group", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "6", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ",", "wt", "or", "Ctrl", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "The", "increased", "STAT1", "and", "pY", "-", "STAT1", "in", "hippocampal", "total", "extracts", "and", "the", "nuclear", "fraction", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "hTau", "transgenic", "mice", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "4", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ",", "wt", "or", "Ctrl", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "The", "representative", "images", "of", "STAT1", "and", "pY", "-", "STAT1", "in", "the", "brain", "of", "AD", "patients", "probed", "by", "co", "-", "immunohistochemical", "staining", "and", "quantitative", "analysis", "(", "hematoxylin", "stains", "nuclei", ",", "purple", ";", "DAB", "stains", "the", "target", "proteins", ",", "brown", ";", "n", "=", "5", "-", "6", "slices", ")", ".", "Arrowheads", "indicated", "typical", "nuclear", "staining", "of", "STAT1", "/", "pY", "-", "STAT1", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ",", "wt", "or", "Ctrl", ".", "(", "G", ")", "The", "increased", "AT8", "(", "pS202", "/", "pT205", ")", ",", "STAT1", "and", "pY", "-", "STAT1", "in", "cortex", "total", "extracts", "of", "AD", "patients", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ",", "wt", "or", "Ctrl", ".", "(", "H", ")", "STAT1", "mRNA", "was", "analyzed", "by", "qPCR", "in", "AAV", "-", "hTau", "or", "AAV", "-", "eGFP", "infected", "hippocampal", "tissues", "(", "n", "=", "6", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ",", "wt", "or", "Ctrl", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) AAV-hTau-eGFP (AAV-hTau) or the empty vector AAV-eGFP (1.13×1013 v.g./ml) was stereotaxically injected into hippocampal CA3 of 3-month-old C57 mice. After one month, the increased levels of STAT1 and pY-STAT1 in hippocampal total extracts and the nuclear fraction were detected in hTau group by Western blotting (n=6, Mann-Whitney test). Data information: Data were presented as mean ± SD. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP, wt or Ctrl.(C, D) The increased STAT1 and pY-STAT1 in hippocampal total extracts and the nuclear fraction of 12-month-old hTau transgenic mice measured by Western blotting (n=4, Mann-Whitney test). Data information: Data were presented as mean ± SD. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP, wt or Ctrl.(E, F) The representative images of STAT1 and pY-STAT1 in the brain of AD patients probed by co-immunohistochemical staining and quantitative analysis (hematoxylin stains nuclei, purple; DAB stains the target proteins, brown; n=5-6 slices). Arrowheads indicated typical nuclear staining of STAT1/pY-STAT1. Data information: Data were presented as mean ± SD. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP, wt or Ctrl.(G) The increased AT8 (pS202/pT205), STAT1 and pY-STAT1 in cortex total extracts of AD patients measured by Western blotting (n=3, Student's t test). Data information: Data were presented as mean ± SD. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP, wt or Ctrl.(H) STAT1 mRNA was analyzed by qPCR in AAV-hTau or AAV-eGFP infected hippocampal tissues (n=6, Mann-Whitney test). Data information: Data were presented as mean ± SD. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP, wt or Ctrl."}
{"words": ["Figure", "3AAV", "-", "Cre", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "mixed", "with", "AAV", "-", "hTau", "or", "AAV", "-", "eGFP", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "were", "stereotaxically", "injected", "into", "the", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "STAT1flox", "/", "flox", "mice", ".", "One", "month", "later", ",", "downregulation", "of", "STAT1", "was", "confirmed", "by", "immunohistochemical", "staining", ".", "AAV", "-", "Cre", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "mixed", "with", "AAV", "-", "hTau", "or", "AAV", "-", "eGFP", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "were", "stereotaxically", "injected", "into", "the", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "STAT1flox", "/", "flox", "mice", ".", "One", "month", "later", ",", "downregulation", "of", "STAT1", "was", "confirmed", "by", "Western", "blotting", "(", "C", ")", "Downregulation", "of", "STAT1", "ameliorated", "hTau", "-", "induced", "spatial", "learning", "deficit", "shown", "by", "the", "decreased", "escape", "latency", "during", "5", "consecutive", "days", "training", "in", "Morris", "water", "maze", "(", "MWM", ")", "test", "(", "n", "=", "9", "-", "11", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "two", "-", "way", "repeated", "measures", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "C", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "hTau", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "Downregulation", "of", "STAT1", "ameliorated", "hTau", "-", "induced", "spatial", "memory", "deficit", "shown", "by", "the", "decreased", "latency", "to", "reach", "the", "platform", "quadrant", "(", "D", ")", ",", "the", "increased", "crossing", "time", "in", "the", "platform", "site", "(", "E", ")", "and", "time", "spent", "in", "the", "target", "quadrant", "(", "F", ")", "measured", "at", "day", "6", "by", "removed", "the", "platform", "in", "MWM", "test", ";", "no", "motor", "dysfunction", "was", "seen", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "9", "-", "11", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "others", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "hTau", ".", "(", "H", ")", "Downregulation", "of", "STAT1", "ameliorated", "hTau", "-", "induced", "contextual", "memory", "deficits", "measured", "at", "24", "h", "during", "contextual", "fear", "conditioning", "test", "(", "n", "=", "8", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "hTau", ".", "(", "I", "-", "L", ")", "One", "month", "after", "the", "virus", "infection", ",", "paired", "-", "pulse", "ratio", "(", "PPR", ")", "was", "recorded", "in", "hippocampal", "CA3", "of", "hTau", "or", "STAT1", "knockdown", "mice", "(", "I", ")", ".", "The", "IO", "curve", "of", "fEPSP", "recorded", "on", "acute", "hippocampal", "slices", "(", "J", ")", ".", "The", "slope", "of", "fEPSP", "after", "HFS", "recorded", "on", "hippocampal", "slices", "of", "hTau", "or", "STAT1", "knockdown", "mice", "(", "K", ")", ".", "LTP", "magnitude", "was", "calculated", "as", "the", "average", "(", "normalized", "to", "baseline", ")", "of", "the", "responses", "recorded", "40", "-", "60", "min", "after", "conditioning", "stimulation", ".", "(", "L", ")", ".", "(", "n", "=", "5", "slices", "from", "4", "mice", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "I", "-", "K", ",", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "others", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "hTau", ".", "(", "M", "-", "P", ")", "One", "month", "after", "the", "virus", "infection", ",", "whole", "cell", "patch", "clamp", "was", "used", "to", "measure", "the", "function", "of", "NMDA", "(", "at", "+", "40", "mV", ")", "and", "AMPA", "(", "at", "-", "70", "mV", ")", "receptors", "on", "acute", "brain", "slices", "(", "400", "μm", ")", ".", "The", "insets", "show", "representative", "sample", "traces", "of", "EPSCs", "in", "virus", "infected", "neurons", "(", "M", ")", ".", "The", "reduced", "NMDA", "and", "unchanged", "AMPA", "currents", "with", "a", "reduced", "NMDA", "/", "AMPA", "ratio", "were", "seen", "in", "hTau", "infected", "neurons", ",", "while", "knockdown", "of", "STAT1", "restored", "the", "hTau", "-", "induced", "NMDA", "currents", "(", "N", "-", "P", ")", ".", "(", "n", "=", "12", "neurons", "from", "4", "animals", "for", "eGFP", "group", ";", "n", "=", "11", "neurons", "from", "4", "animals", "for", "hTau", "group", ";", "n", "=", "13", "neurons", "from", "4", "animals", "for", "hTau", "+", "CRE", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "for", "others", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "hTau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3AAV-Cre (5×1012 v.g./ml) mixed with AAV-hTau or AAV-eGFP (1.13×1013 v.g./ml) were stereotaxically injected into the hippocampal CA3 of 3-month-old STAT1flox/flox mice. One month later, downregulation of STAT1 was confirmed by immunohistochemical staining.AAV-Cre (5×1012 v.g./ml) mixed with AAV-hTau or AAV-eGFP (1.13×1013 v.g./ml) were stereotaxically injected into the hippocampal CA3 of 3-month-old STAT1flox/flox mice. One month later, downregulation of STAT1 was confirmed by Western blotting(C) Downregulation of STAT1 ameliorated hTau-induced spatial learning deficit shown by the decreased escape latency during 5 consecutive days training in Morris water maze (MWM) test (n=9-11 for each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m. (two-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test for C *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP; #, p<0.05, ###, p<0.001 vs hTau.(D-G) Downregulation of STAT1 ameliorated hTau-induced spatial memory deficit shown by the decreased latency to reach the platform quadrant (D), the increased crossing time in the platform site (E) and time spent in the target quadrant (F) measured at day 6 by removed the platform in MWM test; no motor dysfunction was seen (G) (n=9-11 for each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m. , one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test for others). *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP; #, p<0.05, ###, p<0.001 vs hTau.(H) Downregulation of STAT1 ameliorated hTau-induced contextual memory deficits measured at 24 h during contextual fear conditioning test (n=8 each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m. *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP; #, p<0.05, ###, p<0.001 vs hTau.(I-L) One month after the virus infection, paired-pulse ratio (PPR) was recorded in hippocampal CA3 of hTau or STAT1 knockdown mice (I). The IO curve of fEPSP recorded on acute hippocampal slices (J). The slope of fEPSP after HFS recorded on hippocampal slices of hTau or STAT1 knockdown mice (K). LTP magnitude was calculated as the average (normalized to baseline) of the responses recorded 40-60 min after conditioning stimulation. (L). (n=5 slices from 4 mice for each group). Data information: Data were presented as mean ± SD two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test for I-K, one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test for others). *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP; #, p<0.05, ###, p<0.001 vs hTau.(M-P) One month after the virus infection, whole cell patch clamp was used to measure the function of NMDA (at +40 mV) and AMPA (at -70 mV) receptors on acute brain slices (400 μm). The insets show representative sample traces of EPSCs in virus infected neurons (M). The reduced NMDA and unchanged AMPA currents with a reduced NMDA/AMPA ratio were seen in hTau infected neurons, while knockdown of STAT1 restored the hTau-induced NMDA currents (N-P). (n=12 neurons from 4 animals for eGFP group; n=11 neurons from 4 animals for hTau group; n=13 neurons from 4 animals for hTau+CRE group). Data information: Data were presented as mean ± SD one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test for others). *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP; #, p<0.05, ###, p<0.001 vs hTau."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Overexpression", "of", "AAV", "-", "hTau", "decreased", "the", "protein", "levels", "of", "GluN1", ",", "GluN2A", "and", "GluN2B", "detected", "by", "Western", "blotting", "in", "the", "hippocampal", "CA3", "of", "C57", "mice", ",", "compared", "with", "the", "AAV", "-", "eGFP", "vector", "control", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Simultaneous", "downregulation", "of", "STAT1", "by", "infusing", "AAV", "-", "Cre", "in", "hippocampal", "CA3", "of", "STAT1flox", "/", "flox", "mice", "abolished", "the", "hTau", "-", "induced", "inhibition", "in", "expression", "of", "NMDARs", "protein", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Overexpression", "of", "AAV", "-", "hTau", "or", "simultaneous", "downregulation", "of", "STAT1", "changed", "the", "mRNA", "levels", "of", "GluN1", ",", "GluN2A", "and", "GluN2B", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "the", "hippocampal", "CA3", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) Overexpression of AAV-hTau decreased the protein levels of GluN1, GluN2A and GluN2B detected by Western blotting in the hippocampal CA3 of C57 mice, compared with the AAV-eGFP vector control. (C, D) Simultaneous downregulation of STAT1 by infusing AAV-Cre in hippocampal CA3 of STAT1flox/flox mice abolished the hTau-induced inhibition in expression of NMDARs protein. Data information: Data were presented as mean ± SD (n=4; Mann-Whitney test). *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau.(E, F) Overexpression of AAV-hTau or simultaneous downregulation of STAT1 changed the mRNA levels of GluN1, GluN2A and GluN2B detected by qRT-PCR in the hippocampal CA3. Data information: Data were presented as mean ± SD (n=4; Mann-Whitney test). *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Overexpression", "of", "AAV", "-", "hTau", "increased", "binding", "of", "STAT1", "to", "the", "promoter", "regions", "of", "GluN1", ",", "GluN2A", "and", "GluN2B", "gene", "in", "hippocampal", "CA3", "extracts", "measured", "by", "chromatin", "immunoprecipitation", "assay", "(", "ChIP", ")", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ";", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "wildtype", "reporters", ".", "(", "B", ")", "Overexpression", "of", "hTau", "or", "wildtype", "STAT1", "(", "WT", "-", "STAT1", ")", "inhibits", "the", "transcription", "activity", "of", "NMDARs", "compared", "with", "the", "empty", "vector", "control", "(", "Ctrl", ")", "measured", "by", "luciferase", "activity", "assay", "in", "HEK293", "cells", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ";", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "wildtype", "reporters", ".", "Diagrams", "show", "the", "predicted", "GAS", "promoter", "element", "(", "GASs", ")", "for", "STAT1", "in", "the", "promoter", "(", "-", "2000", "-", "+", "299bp", ")", "of", "GluN1", "(", "C", ")", "The", "GASs", "or", "the", "mutant", "(", "MUT", ")", "plasmids", "were", "co", "-", "transfected", "respectively", "with", "WT", "-", "STAT1", "or", "its", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", "into", "HEK293", "cells", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "the", "luciferase", "activity", "was", "measured", "(", "right", "panels", ")", ".", "N", "=", "4", "for", "each", "group", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ";", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "wildtype", "reporters", ".", "Diagrams", "show", "the", "predicted", "GAS", "promoter", "element", "(", "GASs", ")", "for", "STAT1", "in", "the", "promoter", "(", "-", "2000", "-", "+", "299bp", ")", "of", "GluN2B", "(", "E", ")", "The", "GASs", "or", "the", "mutant", "(", "MUT", ")", "plasmids", "were", "co", "-", "transfected", "respectively", "with", "WT", "-", "STAT1", "or", "its", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", "into", "HEK293", "cells", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "the", "luciferase", "activity", "was", "measured", "(", "right", "panels", ")", ".", "N", "=", "4", "for", "each", "group", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ";", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "wildtype", "reporters", ".", "Diagrams", "show", "the", "predicted", "GAS", "promoter", "element", "(", "GASs", ")", "for", "STAT1", "in", "the", "promoter", "(", "-", "2000", "-", "+", "299bp", ")", "of", "GluN2A", "(", "G", ",", "I", ")", ".", "The", "GASs", "or", "the", "mutant", "(", "MUT", ")", "plasmids", "were", "co", "-", "transfected", "respectively", "with", "WT", "-", "STAT1", "or", "its", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", "into", "HEK293", "cells", "for", "24", "h", ",", "and", "then", "the", "luciferase", "activity", "was", "measured", "(", "right", "panels", ")", ".", "N", "=", "4", "for", "each", "group", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "Ctrl", ";", "#", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "wildtype", "reporters", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Overexpression of AAV-hTau increased binding of STAT1 to the promoter regions of GluN1, GluN2A and GluN2B gene in hippocampal CA3 extracts measured by chromatin immunoprecipitation assay (ChIP) (n=3 from three independent experiments). Data information: Data were presented as mean ± SD (two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs Ctrl; ###, p<0.001 vs wildtype reporters.(B) Overexpression of hTau or wildtype STAT1 (WT-STAT1) inhibits the transcription activity of NMDARs compared with the empty vector control (Ctrl) measured by luciferase activity assay in HEK293 cells (n=3 from three independent experiments). Data information: Data were presented as mean ± SD (two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs Ctrl; ###, p<0.001 vs wildtype reporters.Diagrams show the predicted GAS promoter element (GASs) for STAT1 in the promoter (-2000-+299bp) of GluN1 (C) The GASs or the mutant (MUT) plasmids were co-transfected respectively with WT-STAT1 or its empty vector (Ctrl) into HEK293 cells for 24 h, and then the luciferase activity was measured (right panels). N=4 for each group. Data information: Data were presented as mean ± SD (two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs Ctrl; ###, p<0.001 vs wildtype reporters.Diagrams show the predicted GAS promoter element (GASs) for STAT1 in the promoter (-2000-+299bp) of GluN2B (E) The GASs or the mutant (MUT) plasmids were co-transfected respectively with WT-STAT1 or its empty vector (Ctrl) into HEK293 cells for 24 h, and then the luciferase activity was measured (right panels). N=4 for each group. Data information: Data were presented as mean ± SD (two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs Ctrl; ###, p<0.001 vs wildtype reporters.Diagrams show the predicted GAS promoter element (GASs) for STAT1 in the promoter (-2000-+299bp) of GluN2A (G, I). The GASs or the mutant (MUT) plasmids were co-transfected respectively with WT-STAT1 or its empty vector (Ctrl) into HEK293 cells for 24 h, and then the luciferase activity was measured (right panels). N=4 for each group. Data information: Data were presented as mean ± SD (two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs Ctrl; ###, p<0.001 vs wildtype reporters."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "Overexpression", "of", "hTau", "in", "HEK293", "cells", "for", "48", "h", "increased", "the", "activity", "-", "dependent", "phosphorylation", "of", "JAK2", ",", "JNK1", "and", "ERK1", "compared", "with", "the", "empty", "vector", "control", "(", "Ctrl", ")", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ",", "student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", ".", "Pharmacological", "inhibition", "of", "ERK1", "(", "C", ",", "D", ")", "for", "24", "h", "did", "not", "significantly", "affect", "the", "hTau", "-", "induced", "STAT1", "phosphorylation", "at", "pY", "-", "STAT1", "(", "Tyr701", ")", "in", "total", "extracts", "(", "C", "and", "the", "nuclear", "fraction", "(", "D", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", ".", "Pharmacological", "inhibition", "of", "JNK1", "(", "E", ",", "F", ")", "for", "24", "h", "did", "not", "significantly", "affect", "the", "hTau", "-", "induced", "STAT1", "phosphorylation", "at", "pY", "-", "STAT1", "(", "Tyr701", ")", "in", "total", "extracts", "E", ")", "and", "the", "nuclear", "fraction", "F", ")", "measured", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "alteration", "of", "pS", "-", "STAT1", "(", "Ser727", ")", "confirms", "the", "efficacy", "of", "JNK1", "inhibitors", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", ".", "Pharmacological", "inhibition", "of", "JAK2", "(", "G", ",", "H", ")", "abolished", "hTau", "-", "induced", "STAT1", "phosphorylation", "at", "Tyr701", "in", "total", "extracts", "(", "G", "and", "the", "nuclear", "fraction", "(", "H", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", ".", "knockdown", "JAK2", "by", "siRNA", "(", "I", ",", "J", ")", "abolished", "hTau", "-", "induced", "STAT1", "phosphorylation", "at", "Tyr701", "in", "total", "extracts", "I", ")", "and", "the", "nuclear", "fraction", "J", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "The", "phosphorylated", "JAK2", "level", "increased", "in", "the", "hippocampus", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "hTau", "transgenic", "mice", "(", "K", ")", ",", "and", "the", "hippocampus", "of", "C57", "mice", "infected", "with", "AAV", "-", "hTau", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "(", "L", ")", "(", "n", "=", "4", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "Ctrl", ",", "eGFP", "or", "WT", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) Overexpression of hTau in HEK293 cells for 48 h increased the activity-dependent phosphorylation of JAK2, JNK1 and ERK1 compared with the empty vector control (Ctrl) measured by Western blotting (n=3, student's t test). Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT.Pharmacological inhibition of ERK1 (C, D) for 24 h did not significantly affect the hTau-induced STAT1 phosphorylation at pY-STAT1 (Tyr701) in total extracts (C and the nuclear fraction (D measured by Western blotting (n=3). Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT.Pharmacological inhibition of JNK1 (E, F) for 24 h did not significantly affect the hTau-induced STAT1 phosphorylation at pY-STAT1 (Tyr701) in total extracts E) and the nuclear fraction F) measured by Western blotting (n=3). The alteration of pS-STAT1 (Ser727) confirms the efficacy of JNK1 inhibitors. Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT.Pharmacological inhibition of JAK2 (G, H) abolished hTau-induced STAT1 phosphorylation at Tyr701 in total extracts (G and the nuclear fraction (H (n=3). Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT.knockdown JAK2 by siRNA (I, J) abolished hTau-induced STAT1 phosphorylation at Tyr701 in total extracts I) and the nuclear fraction J) (n=3). Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT.(K, L) The phosphorylated JAK2 level increased in the hippocampus of 12-month-old hTau transgenic mice (K), and the hippocampus of C57 mice infected with AAV-hTau (1.13×1013 v.g./ml) (L) (n=4, Mann-Whitney test). Data information: Data were presented as mean ± SD, *, p<0.05 vs Ctrl, eGFP or WT."}
{"words": ["Figure", "7AAV", "-", "eGFP", "(", "eGFP", ")", "or", "AAV", "-", "hTau", "-", "eGFP", "(", "hTau", ")", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "plus", "hTau", "was", "stereotaxically", "injected", "into", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "C57", "mice", ".", "After", "one", "month", ",", "learning", "and", "memory", "were", "detected", "by", "MWM", "test", ".", "(", "A", ")", "The", "representative", "fluorescence", "image", "confirms", "expression", "of", "AAV", "-", "hTau", "and", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ",", "or", "100", "μm", "for", "the", "enlarged", ".", "AAV", "-", "eGFP", "(", "eGFP", ")", "or", "AAV", "-", "hTau", "-", "eGFP", "(", "hTau", ")", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "plus", "hTau", "was", "stereotaxically", "injected", "into", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "C57", "mice", ".", "After", "one", "month", ",", "learning", "and", "memory", "were", "detected", "by", "MWM", "test", ".", "(", "B", ")", "Overexpression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "mitigated", "hTau", "-", "induced", "spatial", "learning", "deficits", "shown", "by", "the", "decreased", "escape", "latency", "during", "water", "maze", "training", "(", "n", "=", "7", "-", "10", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "(", "two", "-", "way", "repeated", "measures", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", ".", "AAV", "-", "eGFP", "(", "eGFP", ")", "or", "AAV", "-", "hTau", "-", "eGFP", "(", "hTau", ")", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "plus", "hTau", "was", "stereotaxically", "injected", "into", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "C57", "mice", ".", "After", "one", "month", ",", "learning", "and", "memory", "were", "detected", "by", "MWM", "test", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "Overexpression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "mitigated", "hTau", "-", "induced", "spatial", "memory", "impairment", "shown", "by", "the", "decreased", "latency", "to", "reach", "the", "platform", "(", "C", ")", ",", "the", "increased", "crossing", "time", "in", "the", "platform", "site", "(", "D", ")", "and", "time", "spent", "in", "the", "target", "quadrant", "(", "E", ")", "measured", "at", "day", "6", "by", "removed", "the", "platform", "(", "n", "=", "7", "-", "10", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ",", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", ".", "AAV", "-", "eGFP", "(", "eGFP", ")", "or", "AAV", "-", "hTau", "-", "eGFP", "(", "hTau", ")", "(", "1", ".", "13", "×", "1013", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "or", "AAV", "-", "Y701F", "-", "STAT1", "(", "5", "×", "1012", "v", ".", "g", ".", "/", "ml", ")", "plus", "hTau", "was", "stereotaxically", "injected", "into", "hippocampal", "CA3", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "C57", "mice", ".", "After", "one", "month", ",", "learning", "and", "memory", "were", "detected", "by", "MWM", "test", ".", "(", "F", ")", "Expression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "did", "not", "change", "the", "swimming", "speed", "of", "the", "mice", "in", "water", "maze", "task", "(", "n", "=", "7", "-", "10", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Simultaneous", "expression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "did", "not", "induced", "any", "further", "change", "on", "basal", "synaptic", "transmission", "(", "I", "/", "O", "curve", ")", "compared", "with", "expression", "of", "hTau", "alone", ",", "recorded", "in", "hippocampal", "CA3", "(", "G", ")", ".", "LTP", "magnitude", "was", "calculated", "as", "the", "average", "(", "normalized", "to", "baseline", ")", "of", "the", "responses", "recorded", "40", "-", "60", "min", "after", "conditioning", "stimulation", ".", "(", "I", ")", ".", "(", "n", "=", "5", "slices", "from", "4", "mice", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", ".", "Simultaneous", "expression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "rescued", "the", "hTau", "-", "induced", "suppression", "of", "NMDARs", "protein", "expression", "measured", "by", "Western", "blotting", "in", "hippocampal", "CA3", "of", "C57", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Simultaneous", "expression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "rescued", "the", "hTau", "-", "induced", "suppression", "of", "NMDARs", "protein", "(", "K", ")", "expression", "measured", "by", "Western", "blotting", "in", "hippocampal", "CA3", "of", "C57", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", ".", "Simultaneous", "expression", "of", "Y701F", "-", "STAT1", "rescued", "the", "hTau", "-", "induced", "suppression", "of", "NMDARs", "mRNA", "expression", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "hippocampal", "CA3", "of", "C57", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "vs", "eGFP", "or", "hTau", ";", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", "hTau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7AAV-eGFP (eGFP) or AAV-hTau-eGFP (hTau) (1.13×1013 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) plus hTau was stereotaxically injected into hippocampal CA3 of 3-month-old C57 mice. After one month, learning and memory were detected by MWM test. (A) The representative fluorescence image confirms expression of AAV-hTau and AAV-Y701F-STAT1. Scale bar, 200 μm, or 100 μm for the enlarged.AAV-eGFP (eGFP) or AAV-hTau-eGFP (hTau) (1.13×1013 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) plus hTau was stereotaxically injected into hippocampal CA3 of 3-month-old C57 mice. After one month, learning and memory were detected by MWM test. (B) Overexpression of Y701F-STAT1 mitigated hTau-induced spatial learning deficits shown by the decreased escape latency during water maze training (n=7-10 each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m (two-way repeated measures analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau.AAV-eGFP (eGFP) or AAV-hTau-eGFP (hTau) (1.13×1013 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) plus hTau was stereotaxically injected into hippocampal CA3 of 3-month-old C57 mice. After one month, learning and memory were detected by MWM test. (C-E) Overexpression of Y701F-STAT1 mitigated hTau-induced spatial memory impairment shown by the decreased latency to reach the platform (C), the increased crossing time in the platform site (D) and time spent in the target quadrant (E) measured at day 6 by removed the platform (n=7-10 each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m , two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau.AAV-eGFP (eGFP) or AAV-hTau-eGFP (hTau) (1.13×1013 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) or AAV-Y701F-STAT1 (5×1012 v.g./ml) plus hTau was stereotaxically injected into hippocampal CA3 of 3-month-old C57 mice. After one month, learning and memory were detected by MWM test. (F) Expression of Y701F-STAT1 did not change the swimming speed of the mice in water maze task (n=7-10 each group). Data information: Data were presented as mean ± s.e.m two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau.(G-I) Simultaneous expression of Y701F-STAT1 did not induced any further change on basal synaptic transmission (I/O curve) compared with expression of hTau alone, recorded in hippocampal CA3 (G). LTP magnitude was calculated as the average (normalized to baseline) of the responses recorded 40-60 min after conditioning stimulation. (I). (n=5 slices from 4 mice for each group). Data information: Data were presented as mean ± SD , two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau.Simultaneous expression of Y701F-STAT1 rescued the hTau-induced suppression of NMDARs protein expression measured by Western blotting in hippocampal CA3 of C57 mice (n=4).Simultaneous expression of Y701F-STAT1 rescued the hTau-induced suppression of NMDARs protein (K) expression measured by Western blotting in hippocampal CA3 of C57 mice (n=4). Data information: Data were presented as mean ± SD two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau.Simultaneous expression of Y701F-STAT1 rescued the hTau-induced suppression of NMDARs mRNA expression measured by qRT-PCR in hippocampal CA3 of C57 mice (n=4). Data information: Data were presented as mean ± SD , two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni' s post hoc test *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001 vs eGFP or hTau; #, p<0.05, ##, p<0.01 vs hTau."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", "-", "F", ")", "Serum", "levels", "of", "T", "(", "E", ")", "and", "LH", "(", "F", ")", "in", "WT", "males", ",", "ARLmon", "/", "Y", "and", "AR", "-", "/", "Y", "mice", "at", "the", "age", "of", "13", "weeks", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E-F) Serum levels of T (E) and LH (F) in WT males, ARLmon/Y and AR-/Y mice at the age of 13 weeks."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCR", "analyses", "of", "Rhox5", "and", "Insl3", "of", "testes", "from", "13", "-", "week", "old", "WT", "males", ",", "ARLmon", "/", "Y", "and", "AR", "-", "/", "Y", ".", "Expression", "levels", "are", "normalized", "to", "WT", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) RT-qPCR analyses of Rhox5 and Insl3 of testes from 13-week old WT males, ARLmon/Y and AR-/Y. Expression levels are normalized to WT."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Expression", "levels", "of", "genes", "involved", "in", "steroidogenesis", "normalized", "to", "WT", ".", "The", "bar", "graphs", "show", "means", "±", "SEM", "(", "data", "derived", "from", "RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "testes", ",", "biological", "replicates", ",", "n", "=", "5", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "(", "B", ")", "Serum", "levels", "of", "A", "-", "dione", "in", "WT", "males", ",", "ARLmon", "/", "Y", "and", "AR", "-", "/", "Y", "mice", "at", "the", "age", "of", "13", "weeks", ".", "(", "D", ")", "Reporter", "gene", "assays", "in", "Hela", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "the", "mouse", "Insl3", "promotor", "together", "with", "the", "WT", "or", "mutant", "mouse", "AR", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Expression levels of genes involved in steroidogenesis normalized to WT. The bar graphs show means ± SEM (data derived from RNA-seq analysis of testes, biological replicates, n = 5, one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = not significant).(B) Serum levels of A-dione in WT males, ARLmon/Y and AR-/Y mice at the age of 13 weeks.(D) Reporter gene assays in Hela cells co-transfected with the mouse Insl3 promotor together with the WT or mutant mouse AR."}
{"words": ["Figure", "4mRNA", "expression", "levels", "extracted", "from", "RNA", "-", "seq", "data", "for", "Fkbp5", "(", "D", ")", "in", "kidneys", "used", "for", "RNA", "-", "seq", ".", "Expression", "levels", "are", "normalized", "to", "WT", "ORX", ".", "mRNA", "expression", "levels", "extracted", "from", "RNA", "-", "seq", "data", "for", ",", "Odc1", "(", "E", ")", "and", "Kap", "(", "F", ")", "in", "kidneys", "used", "for", "RNA", "-", "seq", ".", "Expression", "levels", "are", "normalized", "to", "WT", "ORX", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4mRNA expression levels extracted from RNA-seq data for Fkbp5 (D) in kidneys used for RNA-seq. Expression levels are normalized to WT ORX.mRNA expression levels extracted from RNA-seq data for , Odc1 (E) and Kap (F) in kidneys used for RNA-seq. Expression levels are normalized to WT ORX."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Specific", "ligand", "binding", "assay", "in", "COS", "cells", "with", "overload", "of", "cold", "ligand", "and", "increasing", "concentrations", "of", "radioactive", "labeled", "DHT", ".", "Values", "are", "normalized", "to", "protein", "expression", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "on", "cytoplasmic", ",", "nuclear", "and", "whole", "cell", "extracts", "derived", "from", "Hela", "cells", "transfected", "with", "human", "WT", "or", "W752R", "AR", "followed", "by", "stimulation", "with", "increasing", "concentrations", "of", "DHT", ".", "Both", "panels", "represent", "the", "same", "blot", ".", "The", "blot", "was", "cut", "in", "two", "parts", "and", "antibodies", "against", "HSP90", "and", "Lamin", "A", "/", "C", "were", "used", "to", "confirm", "cellular", "fractionation", "of", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "proteins", ".", "For", "AR", "visualization", "(", "upper", "panel", ")", ",", "longer", "exposure", "time", "was", "used", ".", "#", "=", "residual", "AR", "expression", "(", "lower", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Specific ligand binding assay in COS cells with overload of cold ligand and increasing concentrations of radioactive labeled DHT. Values are normalized to protein expression.(C) Western blot on cytoplasmic, nuclear and whole cell extracts derived from Hela cells transfected with human WT or W752R AR followed by stimulation with increasing concentrations of DHT. Both panels represent the same blot. The blot was cut in two parts and antibodies against HSP90 and Lamin A/C were used to confirm cellular fractionation of cytoplasmic and nuclear proteins. For AR visualization (upper panel), longer exposure time was used. # = residual AR expression (lower panel)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "AR", "occupancy", "(", "blue", ")", "and", "levels", "of", "the", "histone", "marks", "H3K27ac", "(", "green", ")", "and", "H3K27me3", "(", "red", ")", "at", "ARBS", "within", "the", "regulatory", "regions", "of", "Fkbp5", ",", "Kap", "(", "both", "androgen", "-", "regulated", "in", "kidney", ")", "and", "Tox3", "(", "androgen", "-", "regulated", "in", "prostate", "but", "not", "in", "kidney", "and", "hence", "used", "as", "a", "negative", "control", ")", "were", "assessed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "in", "kidneys", "from", "13", "-", "week", "-", "old", "ARLmon", "/", "Y", "mice", "and", "WT", "males", ".", "(", "C", ")", "Representative", "pictures", "of", "immunofluorescence", "AR", "staining", "(", "green", ")", "in", "kidneys", "of", "castrated", "WT", "males", "and", "ARLmon", "/", "Y", "mice", "supplemented", "with", "vehicle", "or", "T", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) AR occupancy (blue) and levels of the histone marks H3K27ac (green) and H3K27me3 (red) at ARBS within the regulatory regions of Fkbp5, Kap (both androgen-regulated in kidney) and Tox3 (androgen-regulated in prostate but not in kidney and hence used as a negative control) were assessed by ChIP-qPCR in kidneys from 13-week-old ARLmon/Y mice and WT males.(C) Representative pictures of immunofluorescence AR staining (green) in kidneys of castrated WT males and ARLmon/Y mice supplemented with vehicle or T. Nuclei are shown in blue."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Double", "hybrid", "assay", "in", "COS", "cells", "transfected", "with", "WT", "LBD", ",", "W752R", "LBD", "or", "empty", "vector", "(", "negative", "control", ")", "in", "the", "presence", "of", "the", "LxxLL", "fragment", "of", "SRC1", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "AR", "-", "WT", "-", "BirA", "*", "and", "AR", "W752R", "-", "BirA", "*", "expressing", "HEK293", "cells", "treated", "in", "the", "presence", "of", "50", "µM", "biotin", "with", "100", "nM", "DHT", "or", "vehicle", "(", "ethanol", ")", "and", "with", "or", "without", "0", ".", "03", "µg", "/", "ml", "TET", "as", "indicated", ".", "AR", "-", "BirA", "*", "s", "were", "detected", "with", "anti", "-", "AR", "(", "red", ")", "and", "biotinylated", "proteins", "with", "fluorescently", "labeled", "streptavidin", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "visualized", "using", "DAPI", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Double hybrid assay in COS cells transfected with WT LBD, W752R LBD or empty vector (negative control) in the presence of the LxxLL fragment of SRC1.(B) Confocal fluorescence microscopy images of AR-WT-BirA* and AR W752R-BirA*expressing HEK293 cells treated in the presence of 50 µM biotin with 100 nM DHT or vehicle (ethanol) and with or without 0.03 µg/ml TET as indicated. AR-BirA*s were detected with anti-AR (red) and biotinylated proteins with fluorescently labeled streptavidin (green). Nuclei were visualized using DAPI."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "upon", "inhibition", "of", "protein", "synthesis", "with", "cycloheximide", "(", "chx", ")", ".", "A", "plasmid", "-", "borne", "3HA", "-", "Pgc1", "expressed", "from", "the", "endogenous", "promoter", "was", "used", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "detected", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Kar2", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Kar2", "antibodies", ".", "The", "graph", "on", "the", "right", "shows", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "The", "ubiquitination", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "and", "expressing", "myc", "-", "tagged", "ubiquitin", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", "and", "polyubiquitin", "-", "conjugated", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "detected", "using", "anti", "-", "myc", "antibody", ".", "Input", "fraction", "corresponds", "to", "2", "%", "of", "the", "total", "amount", "used", "for", "IP", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "cells", "bearing", "the", "CDC48", "temperature", "-", "sensitive", "allele", "cdc48", "-", "6", ".", "Cells", "were", "grown", "2", ",", "5", "hours", "at", "37C", "prior", "addition", "of", "cycloheximide", ".", "Inactivation", "of", "Cdc48", "mutant", "protein", "was", "confirmed", "by", "stabilization", "of", "the", "ERAD", "substrate", "Erg1", "in", "the", "same", "cells", ".", "(", "D", ")", "Membrane", "association", "of", "ubiquitinated", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "by", "density", "gradient", "centrifugation", "followed", "by", "immunoprecipitation", ".", "Cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "and", "expressing", "myc", "-", "tagged", "ubiquitin", "were", "grown", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Lysates", "were", "subjected", "to", "centrifugation", "on", "an", "optiprep", "density", "gradient", ".", "Collected", "fractions", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "before", "and", "after", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Dpm1", "and", "Pgk1", "were", "used", "as", "markers", "for", "membrane", "bound", "and", "soluble", "fractions", "respectively", ".", "Input", "fraction", "corresponds", "to", "10", "%", "of", "the", "total", "amount", "used", "for", "IP", ".", "\"", "Top", "\"", ",", "\"", "mid", "\"", ",", "\"", "bottom", "\"", "indicate", "the", "fractions", "from", "the", "gradient", ".", "Asterisk", "marks", "a", "faster", "migrating", "unspecific", "band", "in", "the", "input", "bottom", "fraction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype upon inhibition of protein synthesis with cycloheximide (chx). A plasmid-borne 3HA-Pgc1 expressed from the endogenous promoter was used. 3HA-Pgc1 was detected with anti-HA antibodies. Kar2 was used as a loading control and detected with anti-Kar2 antibodies. The graph on the right shows the average of four independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) The ubiquitination of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype and expressing myc-tagged ubiquitin. 3HA-Pgc1 was immunoprecipitated using anti-HA and polyubiquitin-conjugated 3HA-Pgc1 was detected using anti-myc antibody. Input fraction corresponds to 2% of the total amount used for IP.(C) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed as in (A) in cells bearing the CDC48 temperature-sensitive allele cdc48-6. Cells were grown 2,5 hours at 37C prior addition of cycloheximide. Inactivation of Cdc48 mutant protein was confirmed by stabilization of the ERAD substrate Erg1 in the same cells.(D) Membrane association of ubiquitinated 3HA-Pgc1 was analyzed by density gradient centrifugation followed by immunoprecipitation. Cells of the indicated genotype and expressing myc-tagged ubiquitin were grown as in (C). Lysates were subjected to centrifugation on an optiprep density gradient. Collected fractions were analyzed by western blotting before and after immunoprecipitation with anti-HA antibodies. Dpm1 and Pgk1 were used as markers for membrane bound and soluble fractions respectively. Input fraction corresponds to 10% of the total amount used for IP. \"Top\", \"mid\", \"bottom\" indicate the fractions from the gradient. Asterisk marks a faster migrating unspecific band in the input bottom fraction."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Localization", "of", "chromosomally", "expressed", "GFP", "-", "Pgc1", "from", "the", "constitutive", "ADH1", "promoter", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", ".", "Arrowheads", "indicate", "GFP", "-", "Pgc1", "labeling", "at", "the", "ER", ",", "which", "is", "stained", "by", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "the", "neutral", "lipid", "dye", "MDH", ".", "On", "the", "bottom", ",", "box", "plot", "with", "quantitation", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "fluorescence", "intensity", "at", "the", "nuclear", "envelope", "in", "wt", "and", "doa10Δ", ".", "GFP", "-", "Pgc1", "measurements", "were", "performed", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", "section", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Crude", "membranes", "from", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "expressing", "3HA", "-", "Pgc1", "were", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "and", "subsequently", "fractionated", "into", "membrane", "pellet", "(", "P", ")", "and", "supernatant", "(", "S", ")", ".", "(", "D", ")", "Crude", "membranes", "from", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "expressing", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "were", "analyzed", "as", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Localization of chromosomally expressed GFP-Pgc1 from the constitutive ADH1 promoter in wt and doa10Δ cells. Arrowheads indicate GFP-Pgc1 labeling at the ER, which is stained by Sec63-Cherry. LDs were visualized upon staining with the neutral lipid dye MDH. On the bottom, box plot with quantitation of GFP-Pgc1 fluorescence intensity at the nuclear envelope in wt and doa10Δ. GFP-Pgc1 measurements were performed as described in the Materials and Methods section. Scale bar: 5 µm.(C) Crude membranes from wt and doa10Δ cells expressing 3HA-Pgc1 were subjected to the indicated treatments and subsequently fractionated into membrane pellet (P) and supernatant (S).(D) Crude membranes from wt and doa10Δ cells expressing 3HA-GFP-Pgc1275-321 were analyzed as in (C)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "in", "are1Δ", "are2Δ", "lro1Δ", "dga1Δ", "cells", "in", "presence", "(", "no", "LDs", ")", "or", "absence", "of", "DOA10", "(", "no", "LDs", "doa10Δ", ")", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "GFP", "-", "Pgc1", "was", "expressed", "under", "the", "ADH1", "promoter", ";", "LD", "formation", "was", "stimulated", "by", "galactose", "-", "induced", "expression", "of", "DGA1", "in", "are1Δare2Δlro1Δ", ".", "Fluorescence", "microscopy", "was", "used", "to", "follow", "GFP", "-", "Pgc1", "localization", "over", "time", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "the", "neutral", "lipid", "dye", "MDH", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Photo", "-", "conversion", "of", "tdEOS", "-", "Pgc1", "expressed", "under", "the", "ADH1", "promoter", ";", "LD", "formation", "was", "stimulated", "by", "galactose", "-", "induced", "expression", "of", "DGA1", "in", "are1Δare2Δlro1Δdoa10Δ", "cells", ".", "The", "red", "square", "marks", "the", "photo", "-", "converted", "region", ".", "The", "time", "(", "in", "minutes", ")", "after", "photoconversion", "is", "indicated", ".", "Arrowheads", "point", "LDs", "containing", "photoconverted", "tdEOS", "-", "Pgc1", ".", "Scale", "bar", "5µm", ".", "(", "D", ")", "FRAP", "experiment", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "in", "wt", "and", "doa10Δcells", ".", "Representative", "examples", "are", "shown", ".", "The", "bleached", "areas", "are", "marked", "by", "red", "squares", "and", "include", "a", "LD", "adjacent", "to", "ER", ".", "The", "time", "(", "in", "seconds", ")", "after", "photobleaching", "is", "indicated", ".", "Each", "graph", "shows", "average", "fluorescence", "intensities", "for", "10", "cells", "normalized", "to", "pre", "-", "bleached", "plotted", "over", "time", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Localization of GFP-Pgc1 in are1Δ are2Δ lro1Δ dga1Δ cells in presence (no LDs) or absence of DOA10 (no LDs doa10Δ). The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm.(B) GFP-Pgc1 was expressed under the ADH1 promoter; LD formation was stimulated by galactose-induced expression of DGA1 in are1Δare2Δlro1Δ. Fluorescence microscopy was used to follow GFP-Pgc1 localization over time. LDs were visualized upon staining with the neutral lipid dye MDH. Scale bar: 5 µm.(C) Photo-conversion of tdEOS-Pgc1 expressed under the ADH1 promoter; LD formation was stimulated by galactose-induced expression of DGA1 in are1Δare2Δlro1Δdoa10Δ cells. The red square marks the photo-converted region. The time (in minutes) after photoconversion is indicated. Arrowheads point LDs containing photoconverted tdEOS-Pgc1. Scale bar 5µm.(D) FRAP experiment of GFP-Pgc1 in wt and doa10Δcells. Representative examples are shown. The bleached areas are marked by red squares and include a LD adjacent to ER. The time (in seconds) after photobleaching is indicated. Each graph shows average fluorescence intensities for 10 cells normalized to pre-bleached plotted over time. Error bars indicate standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "The", "degradation", "of", "the", "Doa10", "substrates", "3HA", "-", "Pgc1", "and", "3HA", "-", "Vma12", "-", "Ndc10C", "'", "was", "analyzed", "in", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "treated", "with", "oleic", "acid", ".", "3HA", "-", "Pgc1", "and", "3HA", "-", "Vma12", "-", "Ndc10C", "'", "were", "detected", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Dpm1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Dpm1", "antibodies", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The degradation of 3HA-Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) The degradation of the Doa10 substrates 3HA-Pgc1 and 3HA-Vma12-Ndc10C' was analyzed in cells of the indicated genotypes treated with oleic acid. 3HA-Pgc1 and 3HA-Vma12-Ndc10C' were detected with anti-HA antibodies. Dpm1 was used as a loading control and detected with anti-Dpm1 antibodies. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "tagged", "Pgc1", "derivatives", "in", "which", "the", "hydrophobic", "hairpin", "(", "aa275", "-", "321", ")", "was", "replaced", "by", "membrane", "anchor", "of", "Scs2", "(", "Pgc1Scs2MA", ")", "or", "Bos1", "(", "Pgc1Bos1MA", ")", ".", "ER", "and", "LDs", "were", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", "and", "MDH", "staining", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "or", "the", "indicated", "chimeras", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "blot", "is", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "in", "wt", "and", "doa10Δ", "cells", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "four", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "3HA", "-", "GFP", "-", "Pgc1275", "-", "321", "in", "doa10Δ", "cells", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Localization of GFP-tagged Pgc1 derivatives in which the hydrophobic hairpin (aa275-321) was replaced by membrane anchor of Scs2 (Pgc1Scs2MA) or Bos1 (Pgc1Bos1MA). ER and LDs were visualized by expression of Sec63-Cherry and MDH staining, respectively. Scale bar: 5 µm.(B) The degradation of 3HA-Pgc1 or the indicated chimeras in wt and doa10Δ cells was analyzed as in Fig. 1A. The blot is representative of at least three independent experiments.(C) The degradation of 3HA-GFP-Pgc1275-321 in wt and doa10Δ cells was analyzed as in Fig. 1A. The graph shows the average of four independent experiments; error bars represent the standard deviation.(D) Localization of 3HA-GFP-Pgc1275-321 in doa10Δ cells. The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", ",", "containing", "GPAT4", "hydrophobic", "hairpin", "(", "aa160", "-", "216", ")", "replacing", "the", "one", "of", "Pgc1", "was", "analyzed", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "B", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT4160", "-", "216", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", ".", "Arrowheads", "indicate", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT4160", "-", "216", "labeling", "at", "the", "ER", ",", "marked", "with", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "LDs", "were", "visualized", "upon", "staining", "with", "MDH", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "degradation", "of", "3HA", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", "in", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "was", "analyzed", "as", "in", "Fig", ".", "1A", ".", "The", "graph", "shows", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "GFP", "-", "Pgc1", "-", "GPAT160", "-", "216", "in", "are1Δ", "are2Δ", "lro1Δ", "dga1Δ", "doa10Δ", "mutant", "(", "no", "LDs", "doa10Δ", ")", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "by", "expression", "of", "Sec63", "-", "Cherry", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The degradation of 3HA-Pgc1-GPAT160-216, containing GPAT4 hydrophobic hairpin (aa160-216) replacing the one of Pgc1 was analyzed in cells with the indicated genotype as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(B) Localization of GFP-Pgc1-GPAT4160-216 in cells with the indicated genotype. Arrowheads indicate GFP-Pgc1-GPAT4160-216 labeling at the ER, marked with Sec63-Cherry. LDs were visualized upon staining with MDH. Scale bar: 5 µm.(C) The degradation of 3HA-Pgc1-GPAT160-216 in cells with the indicated genotype was analyzed as in Fig. 1A. The graph shows the average of three independent experiments; error bars represent the standard deviation.(D) Localization of GFP-Pgc1-GPAT160-216 in are1Δ are2Δ lro1Δ dga1Δ doa10Δ mutant (no LDs doa10Δ). The ER was visualized by expression of Sec63-Cherry. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "1B", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "from", "young", "(", "2", "months", ")", "and", "old", "(", "22", "months", ")", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "200", "µm", ".", "C", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lung", "parenchyma", "of", "young", "(", "20", "-", "35", "years", "old", ")", "and", "old", "(", "60", "-", "80", "years", "old", ")", "humans", "(", "n", "=", "4", "-", "7", "individuals", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "D", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "from", "young", "and", "old", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "E", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "TTF1", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "from", "young", "and", "old", "humans", "(", "n", "=", "4", "-", "7", "individuals", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs from young (2 months) and old (22 months) mice (n = 3 mice per group). Scale bar 200 µm.C Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lung parenchyma of young (20-35 years old) and old (60-80 years old) humans (n = 4-7 individuals per group). Scale bar, 200 µm.D Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive and CD31-positive endothelia in lungs from young and old mice (n = 3-6 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units.E Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic TTF1-positive and CD31-positive endothelia in lungs from young and old humans (n = 4-7 individuals per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "2C", "Representative", "images", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "D", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "and", "CD31", "-", "positive", "endothelia", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Representative images and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice (n = 3-4 mice per group). Scale bar, 200 µm.D Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive and CD31-positive endothelia in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice (n = 3-4 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "3A", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "4OHT", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockout", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "treated", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "HeLa", "shTRF2", "cells", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "doxycycline", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockdown", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "ACE2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "HeLa", "shTRF2", "cells", "treated", "as", "in", "C", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", ".", "E", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "53BP1", "staining", "in", "liver", "from", "Trf2F", "/", "F", "mice", "treated", "with", "tamoxifen", "(", "to", "induce", "TRF2", "loss", "and", "telomere", "uncapping", ")", "or", "vehicle", ".", "The", "animals", "as", "been", "injected", "also", "with", "PBS", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "F", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "livers", "of", "mice", "treated", "as", "in", "E", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in MEFs Trf2F/F at the indicated time points following 4OHT treatment and consequent TRF2 knockout. Scale bar, 25 µm. B RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in MEFs Trf2F/F treated as in A (n = 3 independent experiments).C Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in HeLa shTRF2 cells at the indicated time points following doxycycline treatment and consequent TRF2 knockdown. Scale bar, 25 µm. D RT-qPCR detection of ACE2 mRNA expression levels in HeLa shTRF2 cells treated as in C (n = 6 independent experiments).E Representative immunofluorescence images of 53BP1 staining in liver from Trf2F/F mice treated with tamoxifen (to induce TRF2 loss and telomere uncapping) or vehicle. The animals as been injected also with PBS. Scale bar, 10 µm. F RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in livers of mice treated as in E (n = 5-7 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "4B", "Relative", "luciferase", "activity", "in", "HeLa", "shTRF2", "following", "ionizing", "radiation", "(", "5", "Gy", ")", "or", "TRF2", "knockdown", "upon", "doxycycline", "-", "induced", "shTRF2", "expression", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "way", "paired", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Relative luciferase activity in HeLa shTRF2 following ionizing radiation (5 Gy) or TRF2 knockdown upon doxycycline-induced shTRF2 expression (n=3 independent experiments). Error bars represent the s.e.m. *P<0.05. Two-way paired ANOVA."}
{"words": ["Figure", "5A", "Immunofluorescence", "showing", "gammaH2AX", "foci", "in", "Trf2F", "/", "F", "MEFs", "at", "the", "indicated", "time", "points", "following", "4OHT", "treatment", "and", "consequent", "TRF2", "knockout", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "ATMi", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "B", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "MEFs", "Trf2F", "/", "F", "treated", "as", "in", "A", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "53BP1", "staining", "in", "liver", "from", "Trf2F", "/", "F", "mice", "treated", "with", "tamoxifen", "(", "to", "induce", "telomere", "uncapping", ")", "or", "vehicle", "and", "injected", "with", "the", "indicated", "ASOs", "or", "PBS", "as", "control", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ace2", "mRNA", "levels", "in", "livers", "of", "mice", "treated", "as", "in", "C", "(", "n", "=", "5", "-", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "E", "Representative", "microphotographs", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "immunohistochemical", "staining", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", ",", "treated", "with", "the", "indicated", "ASOs", "(", "n", "=", "4", "-", "9", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "F", "Double", "-", "marker", "immunofluorescence", "and", "quantitative", "analyses", "of", "ACE2", "intensity", "level", "in", "type", "II", "pneumocytic", "pro", "-", "SP", "-", "C", "-", "positive", "cells", "in", "lungs", "of", "age", "-", "matched", "wild", "type", "and", "G3", "Terc", "-", "/", "-", "mice", ",", "treated", "with", "the", "indicated", "ASOs", "(", "n", "=", "4", "-", "9", "mice", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Immunofluorescence showing gammaH2AX foci in Trf2F/F MEFs at the indicated time points following 4OHT treatment and consequent TRF2 knockout and treated with DMSO or ATMi. Scale bar, 25 µm. B RT-qPCR detection of Ace2 mRNA expression levels in MEFs Trf2F/F treated as in A (n = 3 independent experiments).C Representative immunofluorescence images of 53BP1 staining in liver from Trf2F/F mice treated with tamoxifen (to induce telomere uncapping) or vehicle and injected with the indicated ASOs or PBS as control. Scale bar, 10 µm. D RT-qPCR detection of Ace2 mRNA levels in livers of mice treated as in C (n = 5-8 mice per group).E Representative microphotographs and quantitative analyses of ACE2 immunohistochemical staining in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice, treated with the indicated ASOs (n = 4-9 mice per group). Scale bar, 200 µm.F Double-marker immunofluorescence and quantitative analyses of ACE2 intensity level in type II pneumocytic pro-SP-C-positive cells in lungs of age-matched wild type and G3 Terc-/- mice, treated with the indicated ASOs (n = 4-9 mice per group). Scale bar, 100 µm. a.u. = arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Profile", "of", "transcript", "levels", "of", "autophagy", "-", "related", "genes", "in", "iBAT", "which", "are", "significantly", "modified", "in", "cold", "exposed", "mice", "(", "4ºC", ",", "24h", ")", ",", "compared", "with", "mice", "maintained", "at", "thermoneutral", "temperature", "(", "29ºC", ")", ".", "(", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "corrected", "by", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Heatmap", "represents", "log", "-", "fold", "change", "of", "RPKM", "values", "of", "cold", "versus", "thermoneutral", "(", "TN", ")", "sample", "data", "obtained", "from", "RNAseq", "analysis", ".", "Each", "square", "represents", "replicates", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "most", "repressed", "genes", "are", "shown", "on", "the", "bottom", "of", "the", "heatmap", ".", "Parkin", "expression", "in", "iBAT", "from", "mice", "exposed", "to", "cold", "(", "4ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "21", "days", "(", "21d", ")", "compared", "with", "control", "mice", "(", "ctl", ")", "maintained", "at", "22ºC", ".", "Left", ":", "Relative", "transcript", "levels", ".", "Right", ":", "representative", "immunoblot", "and", "Parkin", "protein", "quantification", ".", "Ponceau", "staining", "(", "PS", ")", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "n", "=", "6", ";", "transcript", "levels", ")", "(", "n", "=", "3", ";", "protein", "levels", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "cold", "vs", ".", "control", "and", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "1d", "vs", ".", "21d", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "in", "sWAT", "and", "eWAT", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "cold", "vs", ".", "control", "and", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "1d", "vs", ".", "21d", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Parkin", "in", "iBAT", ",", "sWAT", "and", "eWAT", "of", "mice", "injected", "with", "the", "β3", "-", "AR", "agonist", "CL316", ",", "243", ",", "every", "day", "for", "1", "week", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "CL316", ",", "243", "treatment", "vs", ".", "saline", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A)Profile of transcript levels of autophagy-related genes in iBAT which are significantly modified in cold exposed mice (4ºC, 24h), compared with mice maintained at thermoneutral temperature (29ºC). (Fisher's exact test corrected by the Benjamini-Hochberg method, p< 0.05). Heatmap represents log-fold change of RPKM values of cold versus thermoneutral (TN) sample data obtained from RNAseq analysis. Each square represents replicates (n=4). The most repressed genes are shown on the bottom of the heatmap.Parkin expression in iBAT from mice exposed to cold (4ºC) for 1 day (1d) or 21 days (21d) compared with control mice (ctl) maintained at 22ºC. Left: Relative transcript levels. Right: representative immunoblot and Parkin protein quantification. Ponceau staining (PS) was used as loading control. (n=6; transcript levels) (n=3; protein levels). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, cold vs. control and ##p<0.01, 1d vs. 21d. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test.Relative transcript levels of Park2 in sWAT and eWAT. (n= 6). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, cold vs. control and ###p<0.001, 1d vs. 21d. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test.Relative transcript levels of Parkin in iBAT, sWAT and eWAT of mice injected with the β3-AR agonist CL316,243, every day for 1 week. (n=6). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, ***p<0.001, CL316,243 treatment vs. saline. Two-tailed unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "in", "mature", "brown", "adipocytes", "compared", "with", "the", "stromal", "vascular", "fraction", "(", "SVF", ")", "in", "iBAT", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "mRNA", "expression", "profiles", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "during", "differentiation", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "day", "(", "d", ")", "4", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "in", "brown", "adipocytes", "in", "culture", "with", "fetal", "bovine", "serum", "(", "FBS", ",", "to", "trigger", "in", "vitro", "differentiation", ")", "or", "charcoal", "-", "stripped", "serum", "(", "CSS", ",", "non", "-", "permissive", "for", "differentiation", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "in", "brown", "adipocytes", "in", "culture", "treated", "with", "norepinephrine", "(", "NE", ")", "or", "cAMP", "for", "indicated", "times", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "non", "-", "treated", "cells", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Parkin", "protein", "levels", "in", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "NE", "or", "cAMP", "for", "the", "indicated", "times", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ")", ".", "Top", ":", "Representative", "immunoblots", ".", "p62", "and", "LC3BII", "proteins", "are", "shown", "as", "positive", "controls", "of", "3", "-", "MA", "treatment", ".", "β", "-", "actin", "was", "use", "as", "loading", "control", ".", "Bottom", ":", "Parkin", "protein", "quantification", "(", "performed", "using", "3", "immunoblots", "processed", "in", "parallel", "due", "to", "sample", "size", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "NE", "/", "cAMP", "non", "-", "treated", "cells", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "in", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "NE", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "Parkin", "in", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "NE", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "actinomycin", "D", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "comparing", "treatments", ".", "Park2", "gene", "promoter", "activity", "in", "HIB", "-", "1B", "cells", "transfected", "with", "a", "pGL4", "-", "Park2", "-", "Luc", "reporter", "construct", "treated", "with", "or", "without", "NE", "or", "cAMP", ".", "Data", "was", "normalized", "using", "Renilla", "luciferase", "activity", "and", "are", "expressed", "as", "the", "relative", "firefly", "luciferase", "activity", "compared", "to", "that", "in", "untreated", "cells", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "non", "-", "treated", "cells", ".", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "testRelative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "in", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "cAMP", "(", "12", "h", ")", "plus", "H89", "(", "a", "PKA", "inhibitor", ")", "or", "SB202190", "(", "a", "p38", "MAPK", "inhibitor", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "with", "vs", ".", "without", "inhibitor", "and", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "and", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "with", "vs", ".", "without", "cAMP", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Relative transcript levels of Park2 and Ucp1 in mature brown adipocytes compared with the stromal vascular fraction (SVF) in iBAT. (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. **p<0.01, ***p<0.001. Two-tailed unpaired Student's t-test.mRNA expression profiles of Park2 and Ucp1 during differentiation. (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared to day (d) 4. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative transcript levels of Park2 and Ucp1 in brown adipocytes in culture with fetal bovine serum (FBS, to trigger in vitro differentiation) or charcoal-stripped serum (CSS, non-permissive for differentiation). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. **p<0.01, ***p<0.001. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative transcript levels of Park2 and Ucp1 in brown adipocytes in culture treated with norepinephrine (NE) or cAMP for indicated times. (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared to non-treated cells. One-way ANOVA with Dunnett's post hoc test.Parkin protein levels in brown adipocytes treated with NE or cAMP for the indicated times in the presence or absence of 3-methyladenine (3-MA). Top: Representative immunoblots. p62 and LC3BII proteins are shown as positive controls of 3-MA treatment. β-actin was use as loading control. Bottom: Parkin protein quantification (performed using 3 immunoblots processed in parallel due to sample size). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01 compared to NE/cAMP non-treated cells. One-way ANOVA with Dunnett's post hoc test.Relative transcript levels of Park2 in brown adipocytes treated with NE in the presence or absence of cycloheximide (CHX). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative mRNA expression levels of Parkin in brown adipocytes treated with NE in the presence or absence of actinomycin D (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. One-way ANOVA with Tukey's post hoc test comparing treatments.Park2 gene promoter activity in HIB-1B cells transfected with a pGL4-Park2-Luc reporter construct treated with or without NE or cAMP. Data was normalized using Renilla luciferase activity and are expressed as the relative firefly luciferase activity compared to that in untreated cells. (n=6). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05 compared to non-treated cells. ANOVA with Dunnett's post hoc testRelative transcript levels of Park2 and Ucp1 in brown adipocytes treated with cAMP (12 h) plus H89 (a PKA inhibitor) or SB202190 (a p38 MAPK inhibitor). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01 with vs. without inhibitor and #p<0.05, and ##p<0.01, ###p<0.001 with vs. without cAMP. Two-tailed unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", ",", "and", "concentration", "of", "glycerol", "in", "the", "culture", "medium", "of", "brown", "adipocytes", "treated", "with", "cAMP", "(", "24h", ")", "plus", "Atglistatin", "(", "an", "adipose", "triglyceride", "lipase", "inhibitor", ")", "or", "CAY10499", "(", "a", "hormone", "sensitive", "lipase", "inhibitor", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "with", "vs", ".", "without", "inhibitor", "and", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "and", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "with", "vs", ".", "without", "cAMP", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "and", "Ucp1", "in", "brown", "adipocytes", "treated", "for", "24h", "with", "a", "PPARα", "activator", "(", "GW7647", ")", ",", "a", "PPARα", "inhibitor", "(", "GW6471", ")", "with", "or", "without", "norepinephrine", "(", "NE", ")", ",", "or", "all", "-", "trans", "-", "retinoic", "acid", "(", "RA", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "in", "wild", "-", "type", "and", "PPARα", "-", "KO", "brown", "adipocytes", "treated", "for", "24h", "with", "NE", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Park2", "gene", "promoter", "activity", "in", "HIB", "-", "1B", "cells", "transfected", "with", "a", "pGL4", "-", "Park2", "-", "Luc", "reporter", "construct", "and", ",", "when", "indicated", ",", "with", "a", "pSG5", "-", "Ppara", "expression", "vector", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "PPARα", "activator", "GW7647", "or", "NE", ".", "Data", "was", "normalized", "using", "Renilla", "luciferase", "activity", "and", "are", "expressed", "as", "the", "relative", "firefly", "luciferase", "activity", "compared", "to", "that", "only", "transfected", "with", "the", "pGL4", "-", "Park2", "-", "Luc", "construct", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "to", "non", "-", "treated", "cells", ".", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Relative transcript levels of Park2, and concentration of glycerol in the culture medium of brown adipocytes treated with cAMP (24h) plus Atglistatin (an adipose triglyceride lipase inhibitor) or CAY10499 (a hormone sensitive lipase inhibitor). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001 with vs. without inhibitor and #p<0.05, and ##p<0.01, ###p<0.001 with vs. without cAMP. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative transcript levels of Park2 and Ucp1 in brown adipocytes treated for 24h with a PPARα activator (GW7647), a PPARα inhibitor (GW6471) with or without norepinephrine (NE), or all-trans-retinoic acid (RA). (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01 ***p<0.001. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative transcript levels of Park2 in wild-type and PPARα-KO brown adipocytes treated for 24h with NE (n=3). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05. ANOVA with Tukey's post hoc test.Park2 gene promoter activity in HIB-1B cells transfected with a pGL4-Park2-Luc reporter construct and, when indicated, with a pSG5-Ppara expression vector. Cells were treated with the PPARα activator GW7647 or NE. Data was normalized using Renilla luciferase activity and are expressed as the relative firefly luciferase activity compared to that only transfected with the pGL4-Park2-Luc construct (n=6). Data are presented as means ± s.e.m. *p<0.05 compared to non-treated cells. ANOVA with Dunnett's post hoc test."}
{"words": ["Figure", "4Left", ":", "Representative", "optical", "microscopic", "images", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "iBAT", "(", "scale", "bars", ",", "110µm", ")", "and", "electron", "microscopic", "images", "of", "iBAT", "(", "scale", "bars", ",", "20µm", ")", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", ".", "Right", ":", "Quantification", "of", "lipid", "droplet", "area", "from", "electron", "microscopic", "images", "(", "10", "images", "per", "condition", "were", "used", ",", "n", "=", "3", "WT", ",", "n", "=", "3", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Representative", "thermal", "images", "(", "left", ")", "and", "quantification", "of", "surface", "temperature", "(", "right", ")", "for", "the", "interscapular", "region", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "UCP1", "protein", "and", "the", "loading", "control", "(", "Ponceau", "staining", ",", "PS", ")", "in", "iBAT", "samples", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "thermogenesis", "-", "related", "genes", "of", "iBAT", "from", "WT", "and", "Parkin", "-", "KO", "mice", "exposed", "to", "acute", "cold", "(", "4ºC", ",", "24h", ")", "compared", "to", "those", "maintained", "at", "the", "control", "temperature", "(", "22ºC", ")", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "CTL", "vs", ".", "cold", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "WT", "vs", ".", "Parkin", "-", "KO", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Weight", "gain", "from", "WT", "and", "Parkin", "-", "KO", "mice", "fed", "with", "chow", "(", "CD", ")", "or", "high", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", ",", "blood", "glucose", "levels", "and", "plasma", "insulin", "levels", "from", "WT", "and", "Parkin", "-", "KO", "mice", "fed", "with", "chow", "(", "CD", ")", "or", "high", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "insulin", "tolerance", "test", "(", "ITT", ")", "from", "WT", "and", "Parkin", "-", "KO", "mice", "fed", "with", "chow", "(", "CD", ")", "or", "high", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "thermogenesis", "-", "related", "genes", "in", "iBAT", "from", "WT", "and", "Parkin", "-", "KO", "mice", "given", "HFD", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "Park2", "in", "iBAT", "from", "WT", "mice", "fed", "CD", "or", "HFD", ".", "(", "n", "=", "8", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "6", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Left: Representative optical microscopic images of H&E-stained iBAT (scale bars, 110µm) and electron microscopic images of iBAT (scale bars, 20µm) from wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice. Right: Quantification of lipid droplet area from electron microscopic images (10 images per condition were used, n =3 WT, n=3 Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05. Two-tailed unpaired Student's t-test.Representative thermal images (left) and quantification of surface temperature (right) for the interscapular region. (n=6). Data are presented as means ±s.e.m. ***p<0.001. Two-tailed unpaired Student's t-test.Representative immunoblot of UCP1 protein and the loading control (Ponceau staining, PS) in iBAT samples.Relative transcript levels of thermogenesis-related genes of iBAT from WT and Parkin-KO mice exposed to acute cold (4ºC, 24h) compared to those maintained at the control temperature (22ºC). (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, CTL vs. cold; #p<0.05, WT vs. Parkin-KO. ANOVA with Tukey's post hoc test.Weight gain from WT and Parkin-KO mice fed with chow (CD) or high fat diet (HFD). (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO)., blood glucose levels and plasma insulin levels from WT and Parkin-KO mice fed with chow (CD) or high fat diet (HFD). (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO).insulin tolerance test (ITT) from WT and Parkin-KO mice fed with chow (CD) or high fat diet (HFD). (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO).Relative transcript levels of thermogenesis-related genes in iBAT from WT and Parkin-KO mice given HFD. (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. #p<0.05. Two-tailed unpaired Student's t-test.Relative transcript levels of Park2 in iBAT from WT mice fed CD or HFD. (n=8; WT) (n=6; Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. Two-tailed unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5WT", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "21d", ",", "4ºC", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "7", "days", "(", "7d", ")", ".", "Top", ":", "Total", "protein", "content", "in", "iBAT", "during", "cold", "deaclimation", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "compared", "to", "21d", ".", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Bottom", ":", "Representative", "optical", "microscopic", "images", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "iBAT", "(", "scale", "bars", ",", "100µm", ")", "and", "electron", "microscopic", "images", "of", "iBAT", "(", "scale", "bars", ",", "10µm", ")", ".", "WT", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "21d", ",", "4ºC", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "7", "days", "(", "7d", ")", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "thermogenesis", "-", "related", "genes", "and", "Park2", "in", "iBAT", ".", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "21d", ".", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "WT", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "21d", ",", "4ºC", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "7", "days", "(", "7d", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "the", "indicated", "thermogenic", "and", "autophagic", "proteins", "in", "iBAT", "during", "cold", "acclimation", "and", "deacclimation", ".", "PS", ":", "Ponceau", "staining", ".", "WT", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "21d", ",", "4ºC", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "7", "days", "(", "7d", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "Parkin", "phosphoSer65", "and", "total", "Parkin", "in", "whole", "lysates", "of", "iBAT", "and", "after", "Parkin", "immunoprecipitation", ".", "Arrowheads", "indicate", "Parkin", "52kDa", "band", "and", "asterisk", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "WT", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "21d", ",", "4ºC", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "1d", ")", "or", "7", "days", "(", "7d", ")", ".", "Representative", "electron", "microscopic", "images", "of", "autophagic", "and", "mitophagic", "events", "in", "iBAT", "after", "1", "day", "of", "cold", "deacclimation", ".", "Yellow", "arrowheads", "indicate", "mitochondrial", "cristae", ",", "blue", "arrowheads", "indicate", "double", "-", "membrane", "autophagosomes", ",", "and", "red", "arrowheads", "indicate", "structures", "compatible", "with", "mitochondria", "-", "derived", "vesicles", ".", "LD", ":", "lipid", "droplet", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5WT mice were acclimated to cold for 21 days (21d, 4ºC) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (1d) or 7 days (7d). Top: Total protein content in iBAT during cold deaclimation. (n=6). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01 compared to 21d. ANOVA with Dunnett's post hoc test. Bottom: Representative optical microscopic images of H&E-stained iBAT (scale bars, 100µm) and electron microscopic images of iBAT (scale bars, 10µm).WT mice were acclimated to cold for 21 days (21d, 4ºC) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (1d) or 7 days (7d). Relative transcript levels of thermogenesis-related genes and Park2 in iBAT. (n=6). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared to 21d. ANOVA with Dunnett's post hoc test.WT mice were acclimated to cold for 21 days (21d, 4ºC) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (1d) or 7 days (7d). Representative immunoblot of the indicated thermogenic and autophagic proteins in iBAT during cold acclimation and deacclimation. PS: Ponceau staining.WT mice were acclimated to cold for 21 days (21d, 4ºC) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (1d) or 7 days (7d). Representative immunoblot of Parkin phosphoSer65 and total Parkin in whole lysates of iBAT and after Parkin immunoprecipitation. Arrowheads indicate Parkin 52kDa band and asterisk indicates a non-specific band.WT mice were acclimated to cold for 21 days (21d, 4ºC) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (1d) or 7 days (7d). Representative electron microscopic images of autophagic and mitophagic events in iBAT after 1 day of cold deacclimation. Yellow arrowheads indicate mitochondrial cristae, blue arrowheads indicate double-membrane autophagosomes, and red arrowheads indicate structures compatible with mitochondria-derived vesicles. LD: lipid droplet. Scale bars, 1 µm."}
{"words": ["Figure", "6Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "LC3B", "in", "iBAT", ",", "and", "the", "loading", "control", "(", "Ponceau", "staining", ",", "PS", ")", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Immunoblot", "for", "p62", "and", "OPTN", "(", "left", ")", "and", "its", "quantification", "(", "right", ")", "in", "iBAT", ".", "PS", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "Arrowhead", "indicates", "p62", "band", "and", "asterisk", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "(", "n", "=", "4", ";", "cold", ")", "(", "n", "=", "3", ";", "deacclimation", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "total", "protein", "amounts", "of", "the", "indicated", "OXPHOS", "protein", "subunits", "and", "UCP1", "in", "iBAT", ".", "(", "n", "=", "4", ";", "cold", ")", "(", "n", "=", "3", ";", "deacclimation", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Citrate", "synthase", "activity", "in", "iBAT", "protein", "extracts", ".", "(", "n", "=", "6", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "8", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Mitochondrial", "DNA", "(", "mtDNA", ")", "content", "in", "iBAT", "relative", "to", "nuclear", "DNA", "(", "nDNA", ")", ".", "(", "n", "=", "6", ";", "WT", ")", "(", "n", "=", "8", ";", "Parkin", "-", "KO", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "Parkin", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "were", "acclimated", "to", "cold", "for", "21", "days", "(", "c", ")", "and", "then", "deacclimated", "at", "thermoneutrality", "(", "29ºC", ")", "for", "1", "day", "(", "d", ")", ".", "Representative", "electron", "microscopic", "images", "of", "mitochondrial", "integrity", "and", "autophagic", "/", "mitophagic", "events", "in", "iBAT", "after", "1", "day", "of", "cold", "-", "deacclimation", ".", "Yellow", "arrowheads", "indicate", "mitochondria", "cristae", "and", "blue", "arrowheads", "indicate", "double", "-", "membrane", "autophagosomes", ".", "Left", "panels", "scale", "bars", ",", "2", "µm", ".", "Right", "panels", "scale", "bars", ",", "1", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Representative immunoblot of LC3B in iBAT, and the loading control (Ponceau staining, PS).Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Immunoblot for p62 and OPTN (left) and its quantification (right) in iBAT. PS was used as the loading control. Arrowhead indicates p62 band and asterisk indicates a non-specific band. (n=4; cold) (n=3; deacclimation). Data are presented as means ±s.e.m. **p<0.01. ANOVA with Tukey's post hoc test.Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Quantification of the total protein amounts of the indicated OXPHOS protein subunits and UCP1 in iBAT. (n=4; cold) (n=3; deacclimation). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05. ANOVA with Tukey's post hoc test.Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Citrate synthase activity in iBAT protein extracts. (n=6; WT) (n=8; Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05. ANOVA with Tukey's post hoc test.Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Mitochondrial DNA (mtDNA) content in iBAT relative to nuclear DNA (nDNA). (n=6; WT) (n=8; Parkin-KO). Data are presented as means ±s.e.m. *p<0.05. ANOVA with Tukey's post hoc test.Wild-type (WT) and Parkin-KO (KO) mice were acclimated to cold for 21 days (c) and then deacclimated at thermoneutrality (29ºC) for 1 day (d). Representative electron microscopic images of mitochondrial integrity and autophagic/mitophagic events in iBAT after 1 day of cold-deacclimation. Yellow arrowheads indicate mitochondria cristae and blue arrowheads indicate double-membrane autophagosomes. Left panels scale bars, 2 µm. Right panels scale bars, 1 µm."}
{"words": ["Figure", "1Sexing", "the", "established", "ESCs", "by", "detecting", "the", "Y", "-", "linked", "Zfy", "gene", "using", "genomic", "DNA", "(", "gDNA", ")", "-", "qPCR", ",", "normalized", "to", "Gapdh", ".", "n", ".", "d", ".", ":", "not", "detected", ".", "Average", "of", "presumed", "males", "was", "set", "to", "1", ".", "DNA", "-", "FISH", "detection", "of", "the", "number", "of", "X", "-", "linked", "Atrx", "gene", "foci", ".", "Representative", "images", "of", "the", "DNA", "-", "FISH", "are", "shown", ".", "Nuclei", "are", "surrounded", "by", "white", "dotted", "lines", ".", "Magenta", ":", "Atrx", "(", "white", "arrowheads", ")", ",", "cyan", ":", "DAPI", ".", "N", ">", "100", ".", "Heatmap", "analysis", "from", "RNA", "-", "seq", ".", "Each", "log10", "(", "FPKM", "+", "1", ")", "value", "was", "used", "for", "clustering", ".", "Genes", "with", "high", "or", "low", "expression", "are", "shown", "in", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "FPKM", ":", "fragments", "per", "kilobases", "per", "million", "reads", ".", "X", "and", "Y", "chromosome", "mapping", ".", "Genes", "with", "high", "expression", "(", "up", ")", "are", "shown", "in", "orange", "and", "low", "expression", "(", "down", ")", "are", "shown", "in", "blue", ".", "The", "defined", "ratio", "of", "up", "or", "down", "genes", "is", ">", "1", ".", "5", "and", "<", "two", "-", "thirds", ",", "respectively", ".", "The", "comparison", "is", "(", "each", "female", "vs", "the", "average", "for", "males", ")", "or", "(", "each", "male", "vs", "the", "average", "for", "females", ")", ".", "The", "location", "controls", "for", "the", "expressed", "genes", "(", "exp", ".", "genes", ")", "on", "the", "X", "-", "chromosome", "and", "Y", "-", "chromosome", "are", "plotted", "(", "red", "squares", ")", "for", "genes", "whose", "FPKM", "averages", "were", "above", "1", "for", "females", "or", "males", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Sexing the established ESCs by detecting the Y-linked Zfy gene using genomic DNA (gDNA)-qPCR, normalized to Gapdh. n.d.: not detected. Average of presumed males was set to 1.DNA-FISH detection of the number of X-linked Atrx gene foci. Representative images of the DNA-FISH are shown. Nuclei are surrounded by white dotted lines. Magenta: Atrx (white arrowheads), cyan: DAPI. N>100.Heatmap analysis from RNA-seq. Each log10(FPKM+1) value was used for clustering. Genes with high or low expression are shown in red and blue, respectively. FPKM: fragments per kilobases per million reads.X and Y chromosome mapping. Genes with high expression (up) are shown in orange and low expression (down) are shown in blue. The defined ratio of up or down genes is > 1.5 and < two-thirds, respectively. The comparison is (each female vs the average for males) or (each male vs the average for females). The location controls for the expressed genes (exp. genes) on the X-chromosome and Y-chromosome are plotted (red squares) for genes whose FPKM averages were above 1 for females or males."}
{"words": ["Figure", "2Clonogenic", "assay", "for", "ESCs", "in", "response", "to", "etoposide", "(", "A", ")", "or", "camptothecin", "(", "B", ")", ".", "Non", "-", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "Nanog", "HR", "assay", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "colonies", "after", "gene", "targeting", "to", "the", "Nanog", "locus", "is", "shown", ".", "The", "results", "for", "each", "cell", "line", "are", "shown", "at", "right", ".", "Nanog", "expression", "confirmed", "by", "RNA", "-", "seq", ".", "Detection", "of", "the", "number", "of", "X", "-", "linked", "Atrx", "gene", "foci", "by", "DNA", "-", "FISH", "in", "GFP", "-", "positive", "subclones", "of", "the", "Nanog", "-", "targeting", "assay", "(", "nine", "independent", "clones", ",", "N", ">", "100", "each", ")", ",", "performed", "as", "described", "in", "Figure", "1C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Clonogenic assay for ESCs in response to etoposide (A) or camptothecin (B). Non-treated cells were set to 1.Nanog HR assay. The percentage of GFP-positive colonies after gene targeting to the Nanog locus is shown. The results for each cell line are shown at right.Nanog expression confirmed by RNA-seq.Detection of the number of X-linked Atrx gene foci by DNA-FISH in GFP-positive subclones of the Nanog-targeting assay (nine independent clones, N> 100 each), performed as described in Figure 1C."}
{"words": ["Figure", "3Sexing", "of", "established", "ESCs", "(", "gDNA", "-", "qPCR", ",", "Zfy", "/", "Gapdh", ")", ",", "performed", "as", "described", "in", "Figure", "1B", ".", "Detection", "of", "the", "number", "of", "X", "-", "linked", "Atrx", "gene", "foci", "by", "DNA", "-", "FISH", "with", "or", "without", "dox", "addition", "for", "96", "h", "(", "N", ">", "100", ")", ",", "performed", "as", "described", "in", "Figure", "1C", ".", "Detection", "of", "the", "Xist", "cloud", "in", "#", "B3", "by", "RNA", "-", "FISH", ",", "with", "or", "without", "dox", "addition", "for", "96", "h", "(", "N", ">", "200", "each", ")", ".", "A", "representative", "image", "is", "shown", "[", "magenta", ":", "Xist", "(", "white", "arrowhead", ")", ",", "cyan", ":", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "]", ".", "Allele", "-", "distinguishable", "RT", "-", "PCR", "for", "detecting", "Hprt", ",", "G6pdx", ",", "and", "Rnf12", "X", "-", "linked", "genes", ".", "Bands", "with", "the", "anticipated", "sizes", "expressed", "from", "XJF1", "or", "XTX", "alleles", "are", "shown", ".", "Nanog", "HR", "assay", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "colonies", "after", "gene", "targeting", "to", "the", "Nanog", "locus", "is", "shown", "as", "described", "in", "Figure", "2C", ".", "#", "B2", "or", "#", "B3", "were", "cultured", "with", "or", "without", "dox", "addition", "for", "96", "h", ".", "The", "combined", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "and", "total", "colonies", "from", "all", "experiments", "are", "listed", "and", "summarized", "at", "right", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Sexing of established ESCs (gDNA-qPCR, Zfy/Gapdh), performed as described in Figure 1B.Detection of the number of X-linked Atrx gene foci by DNA-FISH with or without dox addition for 96 h (N >100), performed as described in Figure 1C.Detection of the Xist cloud in #B3 by RNA-FISH, with or without dox addition for 96 h ( N >200 each). A representative image is shown [magenta: Xist (white arrowhead), cyan: DAPI. Scale bar: 10 μm].Allele-distinguishable RT-PCR for detecting Hprt, G6pdx, and Rnf12 X-linked genes. Bands with the anticipated sizes expressed from XJF1 or XTX alleles are shown.Nanog HR assay. The percentage of GFP-positive colonies after gene targeting to the Nanog locus is shown as described in Figure 2C. #B2 or #B3 were cultured with or without dox addition for 96 h. The combined number of GFP-positive cells and total colonies from all experiments are listed and summarized at right."}
{"words": ["Figure", "4Detection", "of", "the", "Xist", "foci", "by", "RNA", "-", "FISH", ",", "with", "or", "without", "dox", "addition", "for", "96", "h", "(", "N", ">", "200", "each", ")", ".", "A", "representative", "image", "with", "percentage", "of", "Xist", "-", "positive", "cells", "is", "shown", "[", "magenta", ":", "Xist", ",", "cyan", ":", "DAPI", ".", "]", ".", "Detection", "of", "the", "number", "of", "X", "-", "linked", "Atrx", "gene", "foci", "by", "DNA", "-", "FISH", ",", "with", "or", "without", "dox", "addition", "for", "96", "h", "(", "N", ">", "100", "each", ")", ",", "performed", "as", "described", "in", "Figure", "1C", ".", "Estimated", "repair", "events", ".", "The", "flow", "cytometry", "plots", "are", "shown", "in", "Figure", "EV4", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "TX", "-", "DRGFP", "#", "11", "and", "TX", "-", "EJ5GFP", "#", "23", "was", "normalized", "to", "the", "transfection", "efficiency", "detected", "by", "the", "VENUS", "expression", "vector", ".", "Dox", "(", "-", ")", "was", "set", "to", "1", "and", "the", "ratio", "of", "relative", "GFP", "-", "positive", "cells", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Detection of the Xist foci by RNA-FISH, with or without dox addition for 96 h (N >200 each). A representative image with percentage of Xist-positive cells is shown [magenta: Xist, cyan: DAPI.].Detection of the number of X-linked Atrx gene foci by DNA-FISH, with or without dox addition for 96 h (N >100 each), performed as described in Figure 1C.Estimated repair events. The flow cytometry plots are shown in Figure EV4. The percentage of GFP-positive cells in TX-DRGFP#11 and TX-EJ5GFP#23 was normalized to the transfection efficiency detected by the VENUS expression vector. Dox (-) was set to 1 and the ratio of relative GFP-positive cells is shown (n=3)."}
{"words": ["Figure", "5Volcano", "plot", "of", "DEGs", "in", "female", "ESCs", "(", "#", "A4", ",", "#", "A10", ",", "#", "A11", ")", "versus", "males", "(", "#", "A6", ",", "#", "A13", ",", "#", "A17", ")", ".", "The", "definition", "of", "up", "(", "red", "dots", ")", "or", "down", "(", "blue", "dots", ")", "genes", "is", "as", "follows", ":", "the", "ratio", "of", "up", "or", "down", "genes", "is", ">", "1", ".", "5", "and", "<", "two", "-", "thirds", ",", "respectively", ",", "with", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Volcano plot of DEGs in female ESCs (#A4, #A10, #A11) versus males (#A6, #A13, #A17). The definition of up (red dots) or down (blue dots) genes is as follows: the ratio of up or down genes is > 1.5 and < two-thirds, respectively, with q-value< 0.05."}
{"words": ["Figure", "6Brcc3", "expression", "confirmed", "by", "RNA", "-", "seq", "[", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "three", "different", "cell", "lines", "(", "male", ":", "#", "A6", ",", "#", "A13", ",", "#", "A17", ";", "female", ":", "#", "A4", ",", "#", "A10", ",", "#", "A11", ")", "]", ".", "Brcc3", "expression", "confirmed", "by", "RT", "-", "qPCR", "[", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "three", "different", "cell", "lines", "(", "male", ":", "#", "A6", ",", "#", "A13", ",", "#", "A17", ";", "female", ":", "#", "A4", ",", "#", "A10", ",", "#", "A11", ")", "]", ".", "Brcc3", "expression", "confirmed", "by", "western", "blotting", "[", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "three", "different", "cell", "lines", "(", "male", ":", "#", "A6", ",", "#", "A13", ",", "#", "A17", ";", "female", ":", "#", "A4", ",", "#", "A10", ",", "#", "A11", ")", "]", ".", "Confirmation", "of", "Brcc3", "expression", "from", "knockdown", "samples", "in", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "technical", "duplicates", ")", "Confirmation", "of", "Brcc3", "expression", "from", "knockdown", "samples", "in", "western", "blottingNanog", "HR", "assay", "with", "Brcc3", "knockdown", "(", "three", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "colonies", "after", "gene", "targeting", "to", "the", "Nanog", "locus", "is", "shown", ",", "as", "shown", "in", "Figure", "2C", ".", "The", "combined", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "and", "total", "number", "of", "colonies", "are", "shown", "(", "please", "note", "that", "total", "cell", "number", "of", "#", "A13", "for", "drug", "screening", "was", "3", ".", "67", "×", "107", "because", "of", "contamination", "of", "1", "out", "of", "12", "dishes", ",", "compared", "with", "the", "other", "colonies", "for", "which", "4", "×", "107", "cells", "were", "used", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Brcc3 expression confirmed by RNA-seq [biological replicates (n=3) with three different cell lines (male: #A6, #A13, #A17; female: #A4, #A10, #A11)].Brcc3 expression confirmed by RT-qPCR [biological replicates (n=3) with three different cell lines (male: #A6, #A13, #A17; female: #A4, #A10, #A11)].Brcc3 expression confirmed by western blotting [biological replicates (n=3) with three different cell lines (male: #A6, #A13, #A17; female: #A4, #A10, #A11)].Confirmation of Brcc3 expression from knockdown samples in by RT-qPCR (technical duplicates)Confirmation of Brcc3 expression from knockdown samples in western blottingNanog HR assay with Brcc3 knockdown (three biological replicates). The percentage of GFP-positive colonies after gene targeting to the Nanog locus is shown, as shown in Figure 2C. The combined number of GFP-positive cells and total number of colonies are shown (please note that total cell number of #A13 for drug screening was 3.67×107 because of contamination of 1 out of 12 dishes, compared with the other colonies for which 4×107 cells were used)."}
{"words": ["Figure", "7Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "the", "overall", "survival", "of", "breast", "cancer", "patients", "based", "on", "BRCC3", "(", "A", ")", ",", "XIST", "(", "B", ")", ",", "and", "BRCC3", "/", "XIST", "(", "C", ")", "expression", "levels", ".", "HR", ":", "hazard", "ratio", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Kaplan-Meier curves for the overall survival of breast cancer patients based on BRCC3 (A), XIST (B), and BRCC3/XIST(C) expression levels. HR: hazard ratio."}
{"words": ["Figure", "1IHC", "images", "for", "collagen", "The", "inserts", "in", "panel", "B", "represent", "the", "hematoxylin", "(", "nucleus", ")", "&", "eosin", "(", "cytoplasm", ")", "staining", "for", "the", "same", "tissue", "area", "of", "the", "collagen", "staining", "In", "all", "cases", "n", "=", "4", "control", "mice", ",", "and", "≥", "3", "mice", "for", "2mg", "and", "5", "mg", ")", "The", "quantification", "for", "each", "staining", "is", "shown", "in", "the", "histogram", "in", "the", "right", "sideIHC", "images", "fo", "aSMA", ",", "CD68", ",", "and", "CD204", "For", "aSMA", ",", "CD68", ",", "and", "CD204", "the", "percentage", "of", "positive", "cells", "is", "relative", "to", "the", "control", "condition", ".", "In", "all", "cases", "n", "=", "4", "control", "mice", ",", "and", "≥", "3", "mice", "for", "2mg", "and", "5", "mg", ")", "Scale", "bar", ":", "100", "mm", ".", "The", "quantification", "for", "each", "staining", "is", "shown", "in", "the", "histogram", "in", "the", "right"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IHC images for collagen The inserts in panel B represent the hematoxylin (nucleus) & eosin (cytoplasm) staining for the same tissue area of the collagen staining In all cases n=4 control mice, and ≥3 mice for 2mg and 5 mg) The quantification for each staining is shown in the histogram in the right sideIHC images fo aSMA, CD68, and CD204 For aSMA, CD68, and CD204 the percentage of positive cells is relative to the control condition. In all cases n=4 control mice, and ≥3 mice for 2mg and 5 mg) Scale bar: 100 mm. The quantification for each staining is shown in the histogram in the right side"}
{"words": ["Figure", "2Representative", "traces", "tracking", "bead", "displacements", "Histogram", "shows", "relative", "bead", "displacement", "for", "the", "first", "and", "last", "pulse", ",", "n", "=", "27", "control", "and", "n", "=", "37", "tamoxifenQuantification", "of", "PSCs", "stiffnessHistogram", "shows", "percentage", "of", "gel", "contraction", ",", "n", ">", "10", "gels", "per", "conditionRepresentative", "mechanosensing", "trace", "of", "PSC", "treated", "with", "tamoxifen", "and", "Estrogen", "receptor", "(", "ER", "antagonists", "Histogram", "shows", "relative", "bead", "displacement", "for", "the", "first", "and", "last", "pulse", ",", "n", ">", "20", "for", "all", "conditionsRepresentative", "mechanosensing", "trace", "of", "PSC", "treated", "with", "tamoxifen", "an", "G", "coupled", "-", "protein", "estrogen", "receptor", "(", "GPER", ")", "antagonists", "Histogram", "shows", "relative", "bead", "displacement", "for", "the", "first", "and", "last", "pulse", ",", "n", ">", "20", "for", "all", "conditionsHistogram", "shows", "percentage", "of", "gel", "contraction", "by", "PSCs", "treated", "with", "tamoxifen", "in", "the", "presence", "of", "indicated", "antagonistHistogram", "shows", "percentage", "of", "gel", "contraction", "after", "treatment", "with", "indicated", "agonist", ",", "n", ">", "10", "gels", "per"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative traces tracking bead displacements Histogram shows relative bead displacement for the first and last pulse, n=27 control and n=37 tamoxifenQuantification of PSCs stiffnessHistogram shows percentage of gel contraction, n>10 gels per conditionRepresentative mechanosensing trace of PSC treated with tamoxifen and Estrogen receptor (ER antagonists Histogram shows relative bead displacement for the first and last pulse, n>20 for all conditionsRepresentative mechanosensing trace of PSC treated with tamoxifen an G coupled-protein estrogen receptor (GPER) antagonists Histogram shows relative bead displacement for the first and last pulse, n>20 for all conditionsHistogram shows percentage of gel contraction by PSCs treated with tamoxifen in the presence of indicated antagonistHistogram shows percentage of gel contraction after treatment with indicated agonist, n>10 gels per conditio"}
{"words": ["Figure", "3Young", "\"", "s", "modulus", "for", "matrices", "previously", "remodeled", "by", "PSCs", ";", "control", "n", "=", "126", "and", "tamoxifen", "n", "=", "145", ".", "Lines", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Four", "experimental", "replRepresentative", "images", "of", "H", "&", "E", "staining", "showing", "AsPC1", "cancer", "cell", "invasions", "in", "matrices", "previously", "remodeled", "by", "control", "PSCs", "(", "top", ")", "or", "tamoxifen", "treated", "PSCs", "(", "bottom", ")", ",", "scale", "bar", "50", "μm", "AsPC1", "invasion", "quantification", ",", "the", "central", "box", "represents", "values", "from", "the", "lower", "to", "upper", "quartile", ".", "The", "middle", "line", "represents", "the", "mean", ".", "The", "vertical", "line", "extends", "from", "the", "minimum", "to", "the", "maximum", "value", ",", "n", "=", "30", "control", "and", "n", "=", "40"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Young\"s modulus for matrices previously remodeled by PSCs; control n=126 and tamoxifen n=145. Lines and error bars indicate mean±s.e.m. Four experimental replRepresentative images of H&E staining showing AsPC1 cancer cell invasions in matrices previously remodeled by control PSCs (top) or tamoxifen treated PSCs (bottom), scale bar 50 μm AsPC1 invasion quantification, the central box represents values from the lower to upper quartile. The middle line represents the mean. The vertical line extends from the minimum to the maximum value, n=30 control and n=40 tamoxifen"}
{"words": ["Figure", "4Immunofluorescence", "images", "of", "PSCs", "stained", "for", "YAPQuantification", "of", "the", "nuclear", "/", "cytoplasm", "YAP", "in", "PSCs", "(", "four", "experimental", "replicates", ")", "qPCR", "mRNA", "levels", "for", "YAP", "target", "genes", "connective", "tissue", "grow", "factor", "(", "CTGF", ")", "and", "Ankyrin", "Repeat", "Domain", "1", "(", "ANRKD1", ")", ",", "(", "three", "experimental", "replicates", ")", "Western", "blot", "bands", "for", "YAP", ",", "pS127", "YAP", "and", "total", "protein", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "YAP", "and", "pYAP", "Ser127", "normalised", "to", "total", "protein", ",", "expressed", "relative", "to", "unstimulated", "control", "(", "n", "=", "8", ")", "IHC", "images", "for", "YAP", "staining", "in", "KPC", "mice", "pancreatic", "tissues", "(", "control", "and", "treated", "with", "2", "and", "5", "mg", "tamoxifen", ")", ",", "YAP", "staining", "is", "brown", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μmQuantification", "of", "YAP", "positive", "nucleus", ".", "n", "=", "5", "control", "mice", ",", "and", "≥", "3", "mice", "for", "2mg", "and", "5"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunofluorescence images of PSCs stained for YAPQuantification of the nuclear/cytoplasm YAP in PSCs (four experimental replicates)qPCR mRNA levels for YAP target genes connective tissue grow factor (CTGF) and Ankyrin Repeat Domain 1 (ANRKD1), (three experimental replicates)Western blot bands for YAP, pS127 YAP and total protein. (E) Quantification of YAP and pYAP Ser127 normalised to total protein, expressed relative to unstimulated control (n=8)IHC images for YAP staining in KPC mice pancreatic tissues (control and treated with 2 and 5 mg tamoxifen), YAP staining is brown. Scale bar: 100 μmQuantification of YAP positive nucleus. n=5 control mice, and ≥3 mice for 2mg and 5 mg"}
{"words": ["Figure", "5IF", "images", "for", "total", "(", "MLC", "-", "2", ")", "and", "phosphorylated", "(", "pMLC", "-", "2", ")", "in", "PSCs", ",", "scale", "bar", "is", "20", "μmQuantification", "of", "staining", "in", "A", ".", "Each", "data", "point", "represents", "a", "cell", "Western", "blot", "for", "total", "and", "phosphorylated", "mlc", "-", "2Quantification", "of", "total", "and", "active", "RhoA", ",", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "total", "RhoA", "in", "the", "control", "conditionIHC", "images", "for", "phosphorylated", "mlc", "-", "2", "in", "mice", "pancreatic", "tissues", "(", "n", "=", "5", "control", ",", "n", "=", "5", "2mg", ",", "and", "n", "=", "3", "5mg", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", "Quantification", "of", "staining", "in"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5IF images for total (MLC-2) and phosphorylated (pMLC-2) in PSCs, scale bar is 20 μmQuantification of staining in A. Each data point represents a cell Western blot for total and phosphorylated mlc-2Quantification of total and active RhoA, expressed as percentage of the total RhoA in the control conditionIHC images for phosphorylated mlc-2 in mice pancreatic tissues (n=5 control, n=5 2mg, and n=3 5mg). Scale bar: 100 μm Quantification of staining in E"}
{"words": ["Figure", "2D", "Immunofluorescence", "of", "DNA", "-", "damage", "-", "associated", "nuclear", "protein", "PARP", ".", "Images", "show", "adjacent", "normal", "and", "tumor", "crypts", "of", "tissue", "P009T", ",", "marked", "by", "N", "and", "T", ",", "respectively", ",", "and", "tumor", "tissue", "of", "patients", "P008", "and", "P009", ",", "as", "indicated", ".", "Scale", "bar", "100µm", ".", "Significance", "was", "assessed", "by", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "after", "blinded", "analysis", "of", "10", "random", "images", "per", "tumor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D Immunofluorescence of DNA-damage-associated nuclear protein PARP. Images show adjacent normal and tumor crypts of tissue P009T, marked by N and T, respectively, and tumor tissue of patients P008 and P009, as indicated. Scale bar 100µm. Significance was assessed by an unpaired t-test, after blinded analysis of 10 random images per tumor."}
{"words": ["Figure", "3E", "Activities", "of", "Wnt", "/", "β", "-", "catenin", "and", "MAPK", "target", "genes", "in", "organoid", "single", "cell", "transcriptomes", ",", "ordered", "along", "latent", "time", ".", "F", "Activities", "of", "TFF3", ",", "FABP1", ",", "MKI67", "and", "MMP7", "in", "organoid", "single", "cell", "transcriptomes", ",", "ordered", "along", "latent", "time", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3E Activities of Wnt/β-catenin and MAPK target genes in organoid single cell transcriptomes, ordered along latent time.F Activities of TFF3, FABP1, MKI67 and MMP7 in organoid single cell transcriptomes, ordered along latent time."}
{"words": ["Figure", "4A", "Gene", "expression", "of", "LGR5", "and", "EPHB2", ",", "along", "activity", "gradients", "of", "LGR5", "-", "ISC", "or", "MAPK", "target", "gene", "signatures", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Gene expression of LGR5 and EPHB2, along activity gradients of LGR5-ISC or MAPK target gene signatures."}
{"words": ["Figure", "5C", "Heatmap", "of", "key", "CyTOF", "data", ".", "Average", "activities", "of", "selected", "analytes", "are", "given", "as", "log", "fold", "-", "change", "after", "normalization", "to", "DMSO", "control", "condition", ".", "Range", "of", "color", "scale", "was", "adjusted", "for", "each", "analyte", ".", "For", "relative", "changes", "between", "all", "analytes", ",", "see", "Appendix", "Fig", ".", "S7", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C Heatmap of key CyTOF data. Average activities of selected analytes are given as log fold-change after normalization to DMSO control condition. Range of color scale was adjusted for each analyte. For relative changes between all analytes, see Appendix Fig. S7)."}
{"words": ["Figure", "6F", "Scaled", "signature", "expression", "and", "single", "gene", "expression", "moments", "per", "cell", ",", "under", "control", "(", "grey", ")", "and", "preferred", "treatment", "(", "color", ")", "conditions", ",", "as", "indicated", ".", "10", "%", "of", "cells", "populating", "the", "end", "of", "latent", "time", "are", "displayed", "in", "bold", ".", "It", "is", "of", "note", "that", "latent", "time", "is", "linear", "and", "thus", "cannot", "capture", "multiple", "populations", "located", "at", "developmental", "end", "points", ".", "Densities", "at", "the", "side", "lines", "display", "expression", "in", "all", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6F Scaled signature expression and single gene expression moments per cell, under control (grey) and preferred treatment (color) conditions, as indicated. 10% of cells populating the end of latent time are displayed in bold. It is of note that latent time is linear and thus cannot capture multiple populations located at developmental end points. Densities at the side lines display expression in all cells."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Graph", "showing", "log10", "CFU", "/", "gland", "at", "4", "days", "post", "-", "inoculation", "with", "the", "indicated", "strains", "(", "n", "≥", "5", ")", ".", "Each", "circle", "represents", "the", "values", "obtained", "in", "individual", "animals", ",", "whereas", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "is", "represented", "with", "lines", "inside", "each", "group", ".", "No", "statistical", "differences", "were", "found", "between", "infection", "groups", "using", "a", "one", "-", "sided", "ANOVA", "followed", "by", "the", "post", "-", "hoc", "Fisher", "'", "s", "PLSD", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Graph showing log10 CFU/gland at 4 days post-inoculation with the indicated strains (n≥5). Each circle represents the values obtained in individual animals, whereas mean ± s.d. is represented with lines inside each group. No statistical differences were found between infection groups using a one-sided ANOVA followed by the post-hoc Fisher's PLSD test."}
{"words": ["Figure", "2Plots", "showing", "the", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "conducted", "to", "quantify", "relative", "expression", "of", "the", "indicated", "interleukins", "coding", "genes", "in", "the", "mammary", "glands", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", "(", "n", "=", "10", "for", "PBS", ",", "n", "=", "5", "for", "WT", "and", "n", "=", "4", "for", "CV2", ")", "of", "the", "2", "-", "ΔΔCt", "relative", "expression", "values", "of", "the", "indicated", "interleukins", ";", "the", "value", "from", "each", "individual", "animal", "was", "calculated", "from", "three", "technical", "replicates", ".", "The", "values", "obtained", "in", "the", "PBS", "group", "were", "used", "as", "control", "for", "normalization", "of", "gene", "expression", "(", "=", "1", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "a", "one", "-", "sided", "ANOVA", "followed", "by", "the", "post", "-", "hoc", "Fisher", "'", "s", "PLSD", "test", ":", "(", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Plots showing the RT-qPCR analysis conducted to quantify relative expression of the indicated interleukins coding genes in the mammary glands. Results are expressed as the mean ± s.d (n=10 for PBS, n=5 for WT and n=4 for CV2) of the 2-ΔΔCt relative expression values of the indicated interleukins; the value from each individual animal was calculated from three technical replicates. The values obtained in the PBS group were used as control for normalization of gene expression (=1). Statistical analysis was performed using a one-sided ANOVA followed by the post-hoc Fisher's PLSD test: (*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.005)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "the", "turbidimetric", "assay", "results", "obtained", "with", "mpn142", "and", "mpn142Opt", "secretion", "signals", ".", "Culture", "supernatants", "(", "n", "=", "1", ")", "were", "collected", "at", "0", "h", ",", "5", "h", "or", "24", "h", "post", "-", "inoculation", "as", "indicated", ".", "WT", "strain", "and", "medium", "(", "Hayflick", ")", "were", "added", "as", "controls", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Comparison of the turbidimetric assay results obtained with mpn142 and mpn142Opt secretion signals. Culture supernatants (n=1) were collected at 0 h, 5 h or 24 h post-inoculation as indicated. WT strain and medium (Hayflick) were added as controls."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Mature", "S", ".", "aureus", "biofilms", "were", "allowed", "to", "develop", "for", "24", "h", "in", "polystyrene", "plates", "and", "then", "treated", "for", "the", "indicated", "time", "intervals", "with", "cell", "suspensions", ",", "or", "culture", "supernatants", "of", "the", "CV2", "or", "the", "CV2", "-", "DispB", "strains", "(", "A", ")", "or", "the", "WT", "or", "the", "WT", "-", "DispB", "strain", "(", "B", ")", ".", "Biofilm", "presence", "was", "assessed", "by", "crystal", "violet", "staining", "and", "included", "a", "negative", "staining", "control", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "crystal", "violet", "without", "biofilm", ")", ".", "The", "results", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "OD", "595", "nm", "absorbance", "values", "obtained", "from", "three", "different", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "statistically", "compared", "by", "one", "-", "sided", "ANOVA", "followed", "by", "the", "post", "-", "hoc", "Fisher", "'", "s", "PLSD", "test", ":", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) Mature S. aureus biofilms were allowed to develop for 24 h in polystyrene plates and then treated for the indicated time intervals with cell suspensions, or culture supernatants of the CV2 or the CV2-DispB strains (A) or the WT or the WT-DispB strain (B). Biofilm presence was assessed by crystal violet staining and included a negative staining control (i.e., crystal violet without biofilm). The results are expressed as mean ± s.d. of OD 595 nm absorbance values obtained from three different biological replicates (n=3) and statistically compared by one-sided ANOVA followed by the post-hoc Fisher's PLSD test: *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.005; ***P ≤ 0.0005; ****P ≤ 0.00005"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ",", "D", ")", "Plots", "showing", "results", "obtained", "from", "the", "in", "vitro", "or", "ex", "vivo", "dispersion", "assays", "with", "the", "indicated", "strains", "and", "from", "the", "staining", "control", ".", "Each", "circle", "represents", "the", "OD", "595", "nm", "values", "obtained", "for", "individual", "catheters", "(", "n", "≥", "4", ")", ",", "whereas", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "is", "represented", "with", "lines", "inside", "each", "group", ".", "Results", "from", "one", "-", "sided", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "PLSD", "test", "are", "shown", "for", "treatments", "statistically", "different", "from", "those", "based", "on", "strains", "not", "secreting", "dispersin", "B", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "the", "WT", "or", "CV2", "strains", ")", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C, D) Plots showing results obtained from the in vitro or ex vivo dispersion assays with the indicated strains and from the staining control. Each circle represents the OD 595 nm values obtained for individual catheters (n≥4), whereas mean ± s.d. is represented with lines inside each group. Results from one-sided ANOVA followed by Fisher's PLSD test are shown for treatments statistically different from those based on strains not secreting dispersin B (i.e., the WT or CV2 strains). *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.005; ***P ≤ 0.0005."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ",", "D", ")", "Plots", "showing", "the", "SUV60", "variation", "(", "%", ")", "between", "day", "1", "and", "day", "4", "of", "the", "different", "treatments", ".", "Each", "circle", "represents", "the", "SUV60", "variation", "obtained", "for", "individual", "animals", "(", "n", "≥", "4", ")", ",", "whereas", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "is", "represented", "with", "lines", "inside", "each", "group", ".", "Data", "below", "the", "dotted", "lines", "indicate", "that", "the", "SUV", "60", "values", "decreased", "at", "D4", "post", "-", "treatment", ".", "Results", "from", "one", "-", "sided", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "PLSD", "test", "are", "shown", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C, D) Plots showing the SUV60 variation (%) between day 1 and day 4 of the different treatments. Each circle represents the SUV60 variation obtained for individual animals (n≥4), whereas mean ± s.d. is represented with lines inside each group. Data below the dotted lines indicate that the SUV 60 values decreased at D4 post-treatment. Results from one-sided ANOVA followed by Fisher's PLSD test are shown. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.005; ***P ≤ 0.0005."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "G", ")", "Baf", "A1", "sensitivity", "assay", "for", "NDST3", "KO", "cells", "after", "the", "NDST3", "restoration", ".", "The", "NDST3", "KO", "cells", "with", "stable", "expression", "of", "Flag", "-", "NDST3", "or", "Flag", "-", "EGFP", "(", "control", ")", "were", "treated", "with", "25", "nM", "Baf", "A1", "for", "72", "h", ",", "and", "cell", "survival", "was", "measured", "using", "calcein", "AM", "staining", ".", "The", "cell", "survival", "was", "calculated", "as", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "treated", "cells", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", "(", "n", "=", "4", "independent", "cultures", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(G) Baf A1 sensitivity assay for NDST3 KO cells after the NDST3 restoration. The NDST3 KO cells with stable expression of Flag-NDST3 or Flag-EGFP (control) were treated with 25 nM Baf A1 for 72 h, and cell survival was measured using calcein AM staining. The cell survival was calculated as the fluorescence intensity of the treated cells relative to the untreated cells (n = 4 independent cultures, ****P < 0.0001). Data information: Error bars represent ± standard deviation. Scale bar, 200 μm. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Lysosomal", "pH", "values", "in", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "calculated", "from", "the", "fluorescence", "ratio", "of", "LysoSensor", "Yellow", "/", "Blue", "dextran", "staining", "against", "the", "pH", "calibration", "curve", "in", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0242", ")", ".", "(", "D", ")", "Lysosomal", "pH", "values", "measured", "for", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "after", "the", "treatment", "with", "Baf", "A1", "(", "100", "nM", ",", "1h", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0305", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "F", ")", "Magic", "Red", "assay", "for", "Cat", "B", "proteolytic", "activity", ".", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "(", "VEH", ")", "or", "Baf", "A1", "(", "100", "nM", ",", "1", "h", ")", "and", "then", "stained", "with", "MR", "-", "(", "RR", ")", "2", "to", "measure", "the", "Cathepsin", "B", "activity", "(", "n", "=", "48", "cells", "in", "the", "VEH", "-", "treated", "WT", "group", ",", "n", "=", "37", "cells", "in", "the", "VEH", "-", "treated", "NDST3", "KO", "group", ",", "n", "=", "64", "cells", "in", "the", "Baf", "A1", "-", "treated", "WT", "group", ",", "n", "=", "42", "cells", "in", "the", "Baf", "A1", "-", "treated", "NDST3", "KO", "group", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "G", ")", "Alexa", "Fluor", "(", "AF", ")", "488", "-", "dextran", "degradation", "assay", ".", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "were", "loaded", "with", "AF488", "-", "dextran", "in", "culture", "medium", "and", "observed", "for", "fluorescence", ".", "The", "AF488", "fluorescence", "signals", "without", "a", "chase", "period", ",", "with", "a", "4", "-", "h", "chase", "period", ",", "and", "with", "the", "4", "-", "h", "chase", "period", "in", "the", "presence", "of", "Baf", "A1", "(", "100", "nM", ",", "1h", ")", "were", "recorded", "as", "fluorescence", "of", "uptake", ",", "chase", ",", "and", "chase", "with", "Baf", "A1", ",", "respectively", ".", "The", "AF488", "intensity", "per", "cell", "was", "quantified", "and", "calculated", "into", "degradation", "percentage", "according", "to", "the", "equation", "in", "Materials", "and", "Methods", "(", "n", "=", "62", "cells", "in", "the", "VEH", "-", "treated", "WT", "group", ",", "n", "=", "36", "cells", "in", "the", "VEH", "-", "treated", "NDST3", "KO", "group", ",", "n", "=", "65", "cells", "in", "the", "Baf", "A1", "-", "treated", "WT", "group", ",", "n", "=", "78", "cells", "in", "the", "Baf", "A1", "-", "treated", "NDST3", "KO", "group", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "J", ")", "The", "LC3", "turnover", "assay", "after", "a", "48", "-", "h", "Baf", "A1", "treatment", ".", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "were", "cultured", "with", "25", "nM", "Baf", "A1", "for", "48", "h", "and", "analyzed", "for", "the", "LC3B", "-", "II", "fold", "change", "as", "in", "(", "I", ")", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0014", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Lysosomal pH values in WT and NDST3 KO RPE1 cells calculated from the fluorescence ratio of LysoSensor Yellow/Blue dextran staining against the pH calibration curve in (B) (n = 3 independent cultures, *P = 0.0242). (D) Lysosomal pH values measured for WT and NDST3 KO RPE1 cells after the treatment with Baf A1 (100 nM, 1h) (n = 3 independent cultures, *P = 0.0305). Data information: Error bars represent ± standard deviation. Scale bar, 10 μm.(F) Magic Red assay for Cat B proteolytic activity. WT and NDST3 KO RPE1 cells were treated with vehicle (VEH) or Baf A1 (100 nM, 1 h) and then stained with MR-(RR)2 to measure the Cathepsin B activity (n = 48 cells in the VEH-treated WT group, n = 37 cells in the VEH-treated NDST3 KO group, n = 64 cells in the Baf A1-treated WT group, n = 42 cells in the Baf A1-treated NDST3 KO group, ****P < 0.0001).(G) Alexa Fluor (AF) 488-dextran degradation assay. WT and NDST3 KO RPE1 cells were loaded with AF488-dextran in culture medium and observed for fluorescence. The AF488 fluorescence signals without a chase period, with a 4-h chase period, and with the 4-h chase period in the presence of Baf A1 (100 nM, 1h) were recorded as fluorescence of uptake, chase, and chase with Baf A1, respectively. The AF488 intensity per cell was quantified and calculated into degradation percentage according to the equation in Materials and Methods (n = 62 cells in the VEH-treated WT group, n = 36 cells in the VEH-treated NDST3 KO group, n = 65 cells in the Baf A1-treated WT group, n = 78 cells in the Baf A1-treated NDST3 KO group, ****P < 0.0001).(J) The LC3 turnover assay after a 48-h Baf A1 treatment. WT and NDST3 KO RPE1 cells were cultured with 25 nM Baf A1 for 48 h and analyzed for the LC3B-II fold change as in (I) (n = 6 independent experiments, **P = 0.0014). Data information: Error bars represent ± standard deviation. Scale bar, 10 μm. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "To", "examine", "the", "levels", "of", "the", "V", "-", "ATPase", "V1", "-", "V0", "holoenzyme", "in", "WT", "and", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", ",", "cytosolic", "and", "membrane", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "antibodies", "against", "the", "V", "-", "ATPase", "subunits", "V1A", "(", "ATP6V1A", ")", ",", "V1C1", "(", "ATP6V1C1", ")", ",", "and", "V0D", "(", "ATP6V0D", ")", ".", "LAMP1", "and", "vinculin", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "membrane", "proteins", "and", "cytosolic", "proteins", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "ATP6V0D", "relative", "to", "LAMP1", "in", "the", "membrane", "fraction", "from", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "P", "=", "0", ".", "7786", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) To examine the levels of the V-ATPase V1-V0 holoenzyme in WT and NDST3 KO RPE1 cells, cytosolic and membrane fractions were analyzed by immunoblotting using antibodies against the V-ATPase subunits V1A (ATP6V1A), V1C1 (ATP6V1C1), and V0D (ATP6V0D). LAMP1 and vinculin were used as loading controls for membrane proteins and cytosolic proteins, respectively. (B) Quantification of the levels of ATP6V0D relative to LAMP1 in the membrane fraction from (A) (n = 3 independent experiments, P = 0.7786). Data information: Error bars represent ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Perinuclear", "enrichment", "and", "colocalization", "of", "acetylated", "microtubules", ",", "lysosomes", ",", "and", "V", "-", "ATPase", "V1", "subunits", ".", "RPE1", "cells", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "GFP", "were", "treated", "with", "vehicle", "(", "VEH", ")", "or", "10", "μg", "/", "mL", "nocodazole", "(", "Noco", ")", "for", "6", "h", "before", "being", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "ATP6V1C1", "and", "acetylated", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", ")", ".", "The", "nucleus", "was", "stained", "with", "DAPI", ".", "Representative", "images", "of", "LAMP1", "-", "GFP", ",", "ATP6V1C1", ",", "and", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", "immunostaining", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Representative", "distribution", "profiles", "of", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", ",", "LAMP1", "-", "GFP", "and", "ATP6V1C1", "were", "plotted", "by", "Fiji", "software", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "assembly", "of", "V", "-", "ATPase", "V1", "-", "V0", "holoenzymes", "in", "WT", "RPE1", "cells", "over", "-", "expressing", "the", "α", "-", "tubulin", "deacetylase", "HDAC6", "or", "EGFP", "as", "a", "control", ".", "Representative", "immunoblots", "for", "ATP6V0D", ",", "ATP6V1A", ",", "ATP6V1C1", ",", "LAMP1", "and", "GAPDH", "are", "shown", "in", "(", "H", ")", ".", "(", "M", "-", "O", ")", "Loss", "of", "NDST3", "enhances", "microtubule", "acetylation", "and", "the", "colocalization", "of", "the", "lysosomes", "with", "V", "-", "ATPase", "V1", "subunits", ".", "WT", "and", "NDST3", "KO", "PRE1", "cells", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "GFP", "were", "fixed", "and", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "staining", "with", "antibodies", "against", "ATP6V1C1", "and", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", ".", "The", "relative", "levels", "of", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "N", ")", "(", "n", "=", "75", "cells", "in", "the", "WT", "group", ",", "n", "=", "79", "cells", "in", "the", "NDST3", "KO", "group", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "the", "colocalization", "of", "LAMP1", "-", "GFP", "with", "ATP6V1C1", "(", "O", ")", "(", "n", "=", "75", "cells", "in", "the", "WT", "group", ",", "n", "=", "79", "cells", "in", "the", "NDST3", "KO", "group", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "are", "quantified", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) Perinuclear enrichment and colocalization of acetylated microtubules, lysosomes, and V-ATPase V1 subunits. RPE1 cells stably expressing LAMP1-GFP were treated with vehicle (VEH) or 10 μg/mL nocodazole (Noco) for 6 h before being fixed and subjected to immunofluorescence staining with antibodies against ATP6V1C1 and acetylated-α-tubulin (Ac-α-tubulin). The nucleus was stained with DAPI. Representative images of LAMP1-GFP, ATP6V1C1, and Ac-α-tubulin immunostaining are shown in (A). Representative distribution profiles of Ac-α-tubulin, LAMP1-GFP and ATP6V1C1 were plotted by Fiji software in (B).The assembly of V-ATPase V1-V0 holoenzymes in WT RPE1 cells over-expressing the α-tubulin deacetylase HDAC6 or EGFP as a control. Representative immunoblots for ATP6V0D, ATP6V1A, ATP6V1C1, LAMP1 and GAPDH are shown in (H).(M-O) Loss of NDST3 enhances microtubule acetylation and the colocalization of the lysosomes with V-ATPase V1 subunits. WT and NDST3 KO PRE1 cells stably expressing LAMP1-GFP were fixed and analyzed by immunofluorescence staining with antibodies against ATP6V1C1 and Ac-α-tubulin. The relative levels of Ac-α-tubulin (N) (n = 75 cells in the WT group, n = 79 cells in the NDST3 KO group, ****P < 0.0001) and the colocalization of LAMP1-GFP with ATP6V1C1 (O) (n = 75 cells in the WT group, n = 79 cells in the NDST3 KO group, ****P < 0.0001) are quantified."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "In", "vitro", "enzymatic", "assay", "quantitating", "the", "effect", "of", "NDST3", "on", "α", "-", "tubulin", "acetylation", ".", "Flag", "-", "NDST3", "was", "expressed", "in", "HEK", "293", "cells", "and", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "Flag", "beads", ".", "Flag", "-", "EGFP", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "The", "immunoprecipitated", "protein", "was", "incubated", "with", "purified", "tubulin", "heterodimers", "in", "vitro", ",", "with", "or", "without", "1", "mM", "NAD", "+", ",", "400", "nM", "TSA", ",", "or", "5", "mM", "nicotinamide", "(", "NAM", ")", "for", "2", "h", "at", "room", "temperature", ".", "The", "reaction", "products", "were", "examined", "by", "immunoblotting", "against", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", "or", "total", "α", "-", "tubulin", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0185", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "same", "in", "vitro", "enzymatic", "assay", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "except", "that", "the", "purified", "tubulin", "was", "polymerized", "in", "the", "presence", "of", "20", "μM", "Taxol", "and", "1", "mM", "GTP", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "ns", "means", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) In vitro enzymatic assay quantitating the effect of NDST3 on α-tubulin acetylation. Flag-NDST3 was expressed in HEK 293 cells and immunoprecipitated by anti-Flag beads. Flag-EGFP was used as a control. The immunoprecipitated protein was incubated with purified tubulin heterodimers in vitro, with or without 1 mM NAD+, 400 nM TSA, or 5 mM nicotinamide (NAM) for 2 h at room temperature. The reaction products were examined by immunoblotting against Ac-α-tubulin or total α-tubulin (n = 3 independent experiments, *P = 0.0185, **P < 0.01, ****P < 0.0001). (D) The same in vitro enzymatic assay as in (C), except that the purified tubulin was polymerized in the presence of 20 μM Taxol and 1 mM GTP (n = 3 independent experiments, **P < 0.01, ***P = 0.0001). Data information: Error bars represent ± standard deviation. ns means non-significant. "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "NDST3", "protein", "levels", "relative", "to", "β", "-", "tubulin", "in", "B", "lymphocytes", "derived", "from", "healthy", "controls", "and", "C9orf72", "-", "linked", "ALS", "patients", ",", "as", "examined", "by", "immunoblotting", "(", "n", "=", "3", "biologically", "independent", "samples", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0026", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "The", "protein", "levels", "of", "NDST3", "relative", "to", "GAPDH", "(", "D", ")", "(", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0013", ")", ",", "Ac", "-", "α", "-", "tubulin", "relative", "to", "total", "α", "-", "tubulin", "(", "E", ")", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0379", ")", ",", "and", "total", "α", "-", "tubulin", "relative", "to", "GAPDH", "(", "F", ")", "(", "P", "=", "0", ".", "5700", ")", ",", "as", "examined", "by", "immunoblotting", ",", "in", "spinal", "cord", "tissues", "from", "healthy", "controls", "and", "C9orf72", "-", "linked", "ALS", "patients", "(", "n", "=", "4", "biologically", "independent", "samples", "in", "the", "control", "group", "and", "n", "=", "5", "biologically", "independent", "samples", "in", "the", "ALS", "patient", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Immunoblotting", "assays", "showing", "down", "-", "regulation", "of", "NDST3", "in", "C9orf72", "shRNA", "(", "shC9orf72", ")", "-", "treated", "RPE1", "cells", ",", "as", "compared", "to", "control", "shRNA", "(", "shCTRL", ")", "-", "treated", "cells", ".", "Quantification", "of", "C9orf72", "and", "NDST3", "expression", "relative", "to", "GAPDH", "is", "shown", "in", "(", "H", ")", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0004", ")", "and", "(", "I", ")", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", ")", ",", "respectively", ".", "(", "J", "-", "L", ")", "Immunoblotting", "assays", "showing", "up", "-", "regulation", "of", "NDST3", "in", "RPE1", "cells", "over", "-", "expressing", "Flag", "-", "C9orf72", "compared", "to", "those", "expressing", "Flag", "-", "EGFP", "as", "control", ".", "Quantification", "of", "C9orf72", "and", "NDST3", "expression", "relative", "to", "GAPDH", "is", "shown", "in", "(", "K", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", ")", "and", "(", "L", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0033", ")", ",", "respectively", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", ".", "(", "M", ",", "N", ")", "Baf", "A1", "sensitivity", "assay", "for", "WT", ",", "NDST3", "KO", ",", "and", "Noco", "-", "treated", "NDST3", "KO", "RPE1", "cells", "expressing", "proline", "-", "arginine", "poly", "-", "dipeptide", "(", "PR82", ")", ".", "24", "h", "after", "the", "transfection", "of", "PR82", ",", "WT", "and", "NDST3", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "10", "μg", "/", "mL", "Noco", "overnight", ".", "The", "cell", "survival", "measured", "using", "calcein", "AM", "staining", "at", "48", "h", "post", "-", "transfection", "was", "quantified", "as", "the", "percentage", "of", "the", "fluorescence", "intensity", "for", "treated", "cells", "relative", "to", "that", "of", "untreated", "cells", "(", "n", "=", "3", "independent", "cultures", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0369", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) NDST3 protein levels relative to β-tubulin in B lymphocytes derived from healthy controls and C9orf72-linked ALS patients, as examined by immunoblotting (n = 3 biologically independent samples, **P = 0.0026). Data information: Error bars represent ± standard deviation.(C-F) The protein levels of NDST3 relative to GAPDH (D) (**P = 0.0013), Ac-α-tubulin relative to total α-tubulin (E) (*P = 0.0379), and total α-tubulin relative to GAPDH (F) (P = 0.5700), as examined by immunoblotting, in spinal cord tissues from healthy controls and C9orf72-linked ALS patients (n = 4 biologically independent samples in the control group and n = 5 biologically independent samples in the ALS patient group). Data information: Error bars represent ± standard deviation.(G-I) Immunoblotting assays showing down-regulation of NDST3 in C9orf72 shRNA (shC9orf72)-treated RPE1 cells, as compared to control shRNA (shCTRL)-treated cells. Quantification of C9orf72 and NDST3 expression relative to GAPDH is shown in (H) (n = 4 independent experiments, ***P = 0.0004) and (I) (n = 4 independent experiments, ***P = 0.0001), respectively. (J-L) Immunoblotting assays showing up-regulation of NDST3 in RPE1 cells over-expressing Flag-C9orf72 compared to those expressing Flag-EGFP as control. Quantification of C9orf72 and NDST3 expression relative to GAPDH is shown in (K) (n = 3 independent experiments, **P = 0.0011) and (L) (n = 3 independent experiments, **P = 0.0033), respectively. Data information: Error bars represent ± standard deviation.(M, N) Baf A1 sensitivity assay for WT, NDST3 KO, and Noco-treated NDST3 KO RPE1 cells expressing proline-arginine poly-dipeptide (PR82). 24 h after the transfection of PR82, WT and NDST3 KO cells were treated with vehicle or 10 μg/mL Noco overnight. The cell survival measured using calcein AM staining at 48 h post-transfection was quantified as the percentage of the fluorescence intensity for treated cells relative to that of untreated cells (n = 3 independent cultures, *P = 0.0369, ***P = 0.0007). Scale bar, 200 μm. Data information: Error bars represent ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "of", "Ki67", "and", "TDP", "-", "43", "in", "the", "regions", "of", "frontal", "cortices", "from", "6", "-", "mon", "-", "old", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "4", "'", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ";", "upper", "panel", "in", "blue", ")", "or", "neural", "marker", "NeuN", "(", "lower", "panel", "in", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "circled", "area", "is", "emphasized", "for", "showing", "the", "distribution", "of", "immunoreactivity", "in", "cell", "subregions", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Quantification", "of", "cells", "or", "neurons", "with", "Ki67", "immunoreactivity", "and", "TDP", "-", "43", "mislocalization", "from", "each", "view", "of", "microscope", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", "by", "t", "-", "test", ".", "Representative", "data", "of", "reverse", "-", "transcription", "PCR", "(", "left", "panel", ")", "or", "Western", "blot", "(", "right", "panel", ")", "for", "cell", "cycle", "-", "related", "genes", "and", "semi", "-", "quantification", "of", "the", "expression", "levels", "in", "the", "frontal", "cortices", "and", "hippocampus", "from", "the", "6", "-", "mon", "-", "old", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "statistical", "analysis", "by", "multiple", "t", "-", "test", "with", "FDR", "correction", ",", "Q", "=", "1", "%", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative immunofluorescence (IF) staining of Ki67 and TDP-43 in the regions of frontal cortices from 6-mon-old WT and FTLD-TDP Tg mice. Nuclei were stained with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; upper panel in blue) or neural marker NeuN (lower panel in green). Scale bar: 50 μm. The circled area is emphasized for showing the distribution of immunoreactivity in cell subregions. Scale bar: 15 μm.Quantification of cells or neurons with Ki67 immunoreactivity and TDP-43 mislocalization from each view of microscope. n = 9 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM, ***p = 0.0007 by t-test.Representative data of reverse-transcription PCR (left panel) or Western blot (right panel) for cell cycle-related genes and semi-quantification of the expression levels in the frontal cortices and hippocampus from the 6-mon-old WT and FTLD-TDP Tg mice. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), statistical analysis by multiple t-test with FDR correction, Q = 1%. *P < 0.05, **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001 and ****P ≤ 0.0001"}
{"words": ["Figure", "2Representative", "image", "of", "comet", "assay", "for", "DNA", "fragmentation", "and", "the", "quantification", "of", "cells", "with", "comet", "tails", "in", "the", "regions", "of", "frontal", "cortices", "from", "6", "-", "mon", "-", "old", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0114", "by", "t", "-", "test", ".", "Representative", "IF", "staining", "of", "γH2AX", "and", "TDP", "-", "43", "in", "the", "regions", "of", "frontal", "cortices", "from", "6", "-", "mon", "-", "old", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "panel", "in", "blue", ")", "or", "NeuN", "(", "middle", "panel", "in", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "circled", "area", "is", "emphasized", "for", "showing", "the", "distribution", "of", "immunoreactivity", "in", "cell", "subregions", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "cells", "or", "neurons", "with", "γH2AX", "immunoreactivity", "and", "TDP", "-", "43", "proteinopathies", "from", "each", "view", "of", "microscope", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0008", "by", "t", "-", "test", ".", "Representative", "IF", "staining", "of", "γH2AX", "and", "Ki67", "in", "the", "regions", "of", "frontal", "cortices", "from", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "upper", "panel", ")", "or", "NeuN", "(", "middle", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Subregions", ",", "scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "cells", "or", "neurons", "with", "γH2AX", "and", "Ki67", "immunoreactivity", "from", "each", "view", "of", "microscope", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0004", "by", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative image of comet assay for DNA fragmentation and the quantification of cells with comet tails in the regions of frontal cortices from 6-mon-old WT and FTLD-TDP Tg mice. Scale bar: 50 μm. n = 9 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM, *p = 0.0114 by t-test.Representative IF staining of γH2AX and TDP-43 in the regions of frontal cortices from 6-mon-old WT and FTLD-TDP Tg mice. Nuclei were stained with DAPI (upper panel in blue) or NeuN (middle panel in green). Scale bar: 50 μm. The circled area is emphasized for showing the distribution of immunoreactivity in cell subregions. Scale bar: 15 μm. Lower panel: quantification of cells or neurons with γH2AX immunoreactivity and TDP-43 proteinopathies from each view of microscope. n = 9 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM, ***p = 0.0008 by t-test.Representative IF staining of γH2AX and Ki67 in the regions of frontal cortices from WT and FTLD-TDP Tg mice. Nuclei were stained with DAPI (upper panel) or NeuN (middle panel). Scale bar: 50 μm. Subregions, scale bar: 15 μm. Lower panel: quantification of cells or neurons with γH2AX and Ki67 immunoreactivity from each view of microscope. n = 9 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM, ***p = 0.0004 by t-test."}
{"words": ["Figure", "3Top", ",", "representative", "western", "blot", "data", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "extracts", "obtained", "following", "RIPA", "fractional", "extraction", "in", "the", "frontal", "cortices", "and", "hippocampus", "from", "6", "-", "mon", "-", "old", "of", "FTLD", "-", "TDP", "or", "WT", "mice", ".", "Bottom", ",", "semi", "-", "quantification", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "expression", "levels", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "t", "-", "tests", ".", "Top", ",", "representative", "western", "blot", "data", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "the", "cytosolic", "and", "nuclear", "extracts", ".", "Bottom", ",", "quantification", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "levels", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0005", "(", "TDP", "-", "43", ")", "or", "0", ".", "0004", "(", "HDAC1", ")", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "t", "-", "tests", ".", "IF", "staining", "of", "HDAC1", "and", "SMI", "-", "32", "in", "the", "regions", "of", "frontal", "cortices", "from", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Scale", "bar", ":", "150", "μm", ".", "Blocked", "area", "in", "left", "bottom", "picture", "is", "showed", "in", "a", "magnified", "view", "in", "the", "right", "bottom", "picture", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Nuclear", "HDAC1", "activity", "assay", "from", "frontal", "cortices", "and", "hippocampus", "in", "6", "-", "mon", "-", "old", "of", "FTLD", "-", "TDP", "and", "WT", "mice", ".", "TSA", ":", "nuclear", "extracts", "that", "were", "treated", "with", "Trichostatin", "A", "(", "TSA", ",", "an", "HDAC", "inhibitor", ")", "as", "a", "negative", "control", "for", "HDAC1", "-", "transferred", "fluorescent", "activity", "during", "the", "HDAC1", "activity", "assay", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0415", "by", "t", "-", "test", ".", "Left", ",", "representative", "western", "blot", "data", "of", "nuclear", "acetylated", "-", "histone", "H3", "(", "Lys", "9", "/", "14", ")", "and", "total", "-", "histone", "H3", "in", "6", "-", "mon", "-", "old", "of", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "nuclear", "acetylated", "-", "histone", "H3", "/", "total", "-", "histone", "H3", "ratio", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0147", "by", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Top, representative western blot data of HDAC1 and TDP-43 in extracts obtained following RIPA fractional extraction in the frontal cortices and hippocampus from 6-mon-old of FTLD-TDP or WT mice. Bottom, semi-quantification of HDAC1 and TDP-43 expression levels. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), **** p < 0.0001 by multiple t-tests.Top, representative western blot data of HDAC1 and TDP-43 in the cytosolic and nuclear extracts. Bottom, quantification of HDAC1 and TDP-43 levels. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), *** p = 0.0005 (TDP-43) or 0.0004 (HDAC1); **** p < 0.0001 by multiple t-tests.IF staining of HDAC1 and SMI-32 in the regions of frontal cortices from WT and FTLD-TDP Tg mice. Scale bar: 150 μm. Blocked area in left bottom picture is showed in a magnified view in the right bottom picture. Scale bar: 50 μm.Nuclear HDAC1 activity assay from frontal cortices and hippocampus in 6-mon-old of FTLD-TDP and WT mice. TSA: nuclear extracts that were treated with Trichostatin A (TSA, an HDAC inhibitor) as a negative control for HDAC1-transferred fluorescent activity during the HDAC1 activity assay. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), *p = 0.0415 by t-test.Left, representative western blot data of nuclear acetylated-histone H3 (Lys 9/14) and total-histone H3 in 6-mon-old of WT and FTLD-TDP Tg mice. Right, quantification of nuclear acetylated-histone H3/total-histone H3 ratio. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), * p = 0.0147 by t-test."}
{"words": ["Figure", "4Left", "graph", ":", "IF", "staining", "of", "TDP", "-", "43", "and", "HDAC1", "during", "progression", "of", "TDP", "-", "43", "proteinopathies", "in", "the", "frontal", "cortices", "from", "the", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "and", "WT", "mice", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "circled", "area", "is", "emphasized", "for", "showing", "the", "distribution", "of", "immunoreactivity", "in", "cell", "subregions", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Right", "histogram", ":", "Quantification", "of", "co", "-", "localized", "TDP", "-", "43", "and", "HDAC1", "immunoreactivity", "in", "the", "cytosol", "or", "nucleus", "in", "the", "WT", "or", "1", "-", ",", "6", "-", ",", "and", "12", "-", "month", "-", "old", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "Nucleus", ":", "Tg", "1m", "vs", ".", "Tg", "6m", "or", "12m", ";", "#", "Cytosol", ":", "Tg", "1m", "vs", ".", "Tg", "6m", "or", "12m", ";", "@", "Tg", "6m", "vs", "Tg", "12m", ".", "*", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "#", "/", "@", "@", "@", "@", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", ".", "Left", "graph", ":", "IF", "staining", "of", "γH2AX", "and", "HDAC1", "in", "the", "frontal", "cortices", "from", "the", "12", "-", "month", "-", "old", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "and", "WT", "mice", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", ".", "Arrow", "head", ":", "γH2AX", "+", "nucleus", ";", "arrow", ":", "mislocalized", "HDAC1", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Right", "histogram", ":", "Quantification", "of", "γH2AX", "+", "and", "HDAC1", "mislocalized", "cells", "in", "the", "WT", "or", "1", "-", ",", "6", "-", ",", "and", "12", "-", "month", "-", "old", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "n", "=", "4", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0079", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Left graph: IF staining of TDP-43 and HDAC1 during progression of TDP-43 proteinopathies in the frontal cortices from the FTLD-TDP Tg and WT mice. Nuclei were stained with DAPI (in blue). Scale bar: 50 μm. The circled area is emphasized for showing the distribution of immunoreactivity in cell subregions. Scale bar: 15 μm. Right histogram: Quantification of co-localized TDP-43 and HDAC1 immunoreactivity in the cytosol or nucleus in the WT or 1-, 6-, and 12-month-old FTLD-TDP Tg mice. n = 9 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM. *Nucleus: Tg 1m vs. Tg 6m or 12m; #Cytosol: Tg 1m vs. Tg 6m or 12m; @ Tg 6m vs Tg 12m. ****/####/@@@@ p < 0.0001 by multiple comparison.Left graph: IF staining of γH2AX and HDAC1 in the frontal cortices from the 12-month-old FTLD-TDP Tg and WT mice. Nuclei were stained with DAPI (in blue). Arrow head: γH2AX+ nucleus; arrow: mislocalized HDAC1. Scale bar: 50 μm. Right histogram: Quantification of γH2AX+ and HDAC1 mislocalized cells in the WT or 1-, 6-, and 12-month-old FTLD-TDP Tg mice. n = 4 sections per mouse, N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM. ** p = 0.0079, **** p < 0.0001 by multiple comparison."}
{"words": ["Figure", "5Left", "panel", ":", "flag", "-", "tagged", "full", "-", "length", "HDAC1", "was", "overexpressed", "with", "myc", "-", "tagged", "TDP", "-", "43", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", ";", "the", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "for", "flag", "and", "immunoblotted", "for", "TDP", "-", "43", "and", "flag", ".", "Right", "panel", ":", "myc", "-", "tagged", "TDP", "-", "43", "was", "overexpressed", "with", "flag", "-", "tagged", "full", "-", "length", "HDAC1", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", ";", "the", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "for", "myc", "and", "immunoblotted", "for", "flag", "and", "TDP", "-", "43", ".", "Upper", "left", ":", "flag", "-", "tagged", "full", "-", "length", "HDAC1", "(", "b", ".", "Ⅰ", ")", "or", "various", "truncation", "mutations", "(", "b", ".", "Ⅱ", "-", "Ⅳ", ")", "were", "overexpressed", "with", "myc", "-", "tagged", "TDP", "-", "43", ";", "the", "catalytic", "domain", "is", "indicated", "in", "red", ".", "Lower", "panel", ":", "the", "western", "blotting", "of", "cell", "lysates", "immunoprecipitated", "for", "flag", "and", "immunoblotted", "for", "TDP", "-", "43", ".", "Upper", "panel", ":", "Immunoprecipitation", "of", "cytosolic", "HDAC1", "and", "immunoblotting", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "WT", "and", "FTLD", "-", "TDP", "Tg", "mice", ".", "Lower", "histogram", ":", "Quantification", "of", "immunoprecipitation", "results", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "WT", "and", "Tg", "mice", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0149", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0003", "by", "t", "-", "test", ".", "Western", "-", "blot", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "urea", "-", "soluble", "fractions", ".", "N", "=", "5", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Left panel: flag-tagged full-length HDAC1 was overexpressed with myc-tagged TDP-43 in HEK-293T cells; the cell lysates were immunoprecipitated for flag and immunoblotted for TDP-43 and flag. Right panel: myc-tagged TDP-43 was overexpressed with flag-tagged full-length HDAC1 in HEK-293T cells; the cell lysates were immunoprecipitated for myc and immunoblotted for flag and TDP-43.Upper left: flag-tagged full-length HDAC1 (b.Ⅰ) or various truncation mutations (b.Ⅱ-Ⅳ) were overexpressed with myc-tagged TDP-43; the catalytic domain is indicated in red. Lower panel: the western blotting of cell lysates immunoprecipitated for flag and immunoblotted for TDP-43.Upper panel: Immunoprecipitation of cytosolic HDAC1 and immunoblotting of HDAC1 and TDP-43 in WT and FTLD-TDP Tg mice. Lower histogram: Quantification of immunoprecipitation results of HDAC1 and TDP-43 in WT and Tg mice. N = 5 mice per group, data are presented as mean ± SEM (%), * p =0.0149, *** p =0.0003 by t-test.Western-blot of HDAC1 and TDP-43 in urea-soluble fractions. N = 5 mice per group."}
{"words": ["Figure", "6Escape", "latency", "of", "mice", "in", "Morris", "water", "maze", "task", ".", "*", "WT", "+", "Vehicle", "mice", "vs", ".", "Tg", "+", "Vehicle", "mice", ",", "#", "Tg", "+", "5104434", "mice", "vs", ".", "Tg", "+", "Vehicle", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ".", "#", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "#", "P", "≤", "0", ".", "0001", "Data", "information", ":", "N", "=", "12", "mice", "per", "group", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", ".", "The", "representative", "searching", "path", "of", "mice", "in", "the", "probe", "test", ".", "Scores", "of", "mice", "with", "respect", "to", "the", "number", "of", "times", "they", "crossed", "the", "hidden", "platform", ",", "time", "spent", "searching", "in", "the", "target", "quadrant", ",", "and", "the", "velocity", "of", "swimming", "in", "the", "probe", "test", "at", "24", "h", "after", "escape", "training", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "009", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "N", "=", "12", "mice", "per", "group", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", ".", "Scores", "of", "the", "discrimination", "index", "in", "the", "novel", "object", "recognition", "test", ".", "Scores", "of", "mice", "in", "the", "rotarod", "test", ".", "Data", "information", ":", "N", "=", "12", "mice", "per", "group", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Escape latency of mice in Morris water maze task. *WT+Vehicle mice vs. Tg+Vehicle mice, #Tg+5104434 mice vs. Tg+Vehicle mice. Statistical analysis by two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons. #P < 0.05, ***P ≤ 0.001 and ****/####P ≤ 0.0001 Data information: N = 12 mice per group All data are presented as mean ± SEM, **** p < 0.0001 by multiple comparison.The representative searching path of mice in the probe test.Scores of mice with respect to the number of times they crossed the hidden platform, time spent searching in the target quadrant, and the velocity of swimming in the probe test at 24 h after escape training. ** p = 0.009, *** p = 0.0002 by multiple comparison. Data information: N = 12 mice per group All data are presented as mean ± SEM, **** p < 0.0001 by multiple comparison.Scores of the discrimination index in the novel object recognition test.   Scores of mice in the rotarod test.   Data information: N = 12 mice per group All data are presented as mean ± SEM, **** p < 0.0001 by multiple comparison."}
{"words": ["Figure", "7Nuclear", "HDAC1", "activity", "in", "mice", "after", "2", "months", "of", "compound", "5104434", "treatment", ".", "The", "nuclear", "extracts", "of", "the", "frontal", "cortices", "and", "hippocampus", "from", "8", "-", "mon", "-", "old", "of", "mice", "were", "separated", "from", "total", "tissue", "lysates", "and", "were", "immunoprecipitated", "for", "HDAC1", ",", "and", "were", "then", "conducted", "to", "HDAC1", "activity", "assay", ".", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "TSA", ":", "nuclear", "extracts", "that", "were", "treated", "with", "Trichostatin", "A", "(", "TSA", ",", "an", "HDAC", "inhibitor", ")", "as", "a", "negative", "control", "for", "HDAC1", "-", "transferred", "fluorescent", "activity", "during", "the", "HDAC1", "activity", "assay", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0203", "(", "WT", "vs", "Tg", "-", "Veh", ")", "or", "0", ".", "0408", "(", "Tg", "-", "Veh", "vs", "Tg", "+", "5104434", ")", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", "Representative", "data", "of", "western", "blot", "for", "nuclear", "acetylated", "-", "histone", "3", "(", "Lys", "9", "/", "14", ")", ",", "total", "histone", "H3", ",", "and", "quantification", "of", "protein", "levels", ".", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0105", "or", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0008", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", "Representative", "data", "of", "western", "blot", "for", "nuclear", "HDAC1", "levels", "and", "semi", "-", "quantification", "of", "the", "expression", "levels", ".", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0022", "(", "Tg", ")", "/", "0", ".", "0012", "(", "Tg", "+", "5104434", ")", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "data", "of", "western", "blot", "for", "cell", "cycle", "-", "and", "DNA", "damage", "-", "related", "proteins", ".", "Right", "histogram", ":", "semi", "-", "quantification", "of", "protein", "levels", ".", "N", "=", "6", "per", "group", ".", "*", "WT", "+", "Vehicle", "mice", "vs", ".", "Tg", "+", "Vehicle", "mice", ",", "#", "Tg", "+", "5104434", "mice", "vs", ".", "Tg", "+", "Vehicle", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "by", "multiple", "t", "-", "test", "with", "FDR", "correction", ",", "Q", "=", "1", "%", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "#", "#", "#", "P", "≤", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "#", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", "IF", "staining", "of", "γH2AX", "in", "the", "frontal", "cortices", "and", "quantification", "of", "the", "immunoreactive", "cells", "from", "8", "-", "mon", "-", "old", "of", "WT", "+", "Vehicle", ",", "Tg", "+", "Vehicle", ",", "Tg", "+", "5104434", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0421", "or", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "number", "of", "cells", "in", "each", "view", "is", "presented", ".", "Immunohistochemistry", "of", "NeuN", "and", "the", "quantification", "of", "the", "immunoreactive", "cells", "in", "the", "hippocampus", "of", "three", "groups", "of", "mice", ",", "8", "-", "mon", "-", "old", "WT", "+", "Vehicle", ",", "Tg", "+", "Vehicle", "and", "Tg", "+", "5104434", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0414", "or", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0006", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "%", ")", "IF", "staining", "of", "GFAP", "and", "the", "quantification", "of", "the", "immunoreactive", "cells", "in", "the", "hippocampus", "of", "three", "groups", "of", "mice", ",", "12", "-", "month", "-", "old", "WT", "+", "Vehicle", ",", "Tg", "+", "Vehicle", "and", "Tg", "+", "5104434", ".", "n", "=", "9", "sections", "per", "mouse", ",", "N", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "002", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "multiple", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "where", "number", "of", "cells", "in", "each", "view", "is", "presented", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Nuclear HDAC1 activity in mice after 2 months of compound 5104434 treatment. The nuclear extracts of the frontal cortices and hippocampus from 8-mon-old of mice were separated from total tissue lysates and were immunoprecipitated for HDAC1, and were then conducted to HDAC1 activity assay. N = 6 mice per group. TSA: nuclear extracts that were treated with Trichostatin A (TSA, an HDAC inhibitor) as a negative control for HDAC1-transferred fluorescent activity during the HDAC1 activity assay. * p = 0.0203 (WT vs Tg-Veh) or 0.0408 (Tg-Veh vs Tg+5104434) by multiple comparison. Data information: All data are presented as mean ± SEM (%Representative data of western blot for nuclear acetylated-histone 3 (Lys 9/14), total histone H3, and quantification of protein levels. N = 6 mice per group. * p = 0.0105 or *** p = 0.0008 by multiple comparison. Data information: All data are presented as mean ± SEM (%)Representative data of western blot for nuclear HDAC1 levels and semi-quantification of the expression levels. N = 6 mice per group. ** p = 0.0022 (Tg)/ 0.0012 (Tg+5104434) by multiple comparison. Data information: All data are presented as mean ± SEM (%)Left panel: representative data of western blot for cell cycle- and DNA damage-related proteins. Right histogram: semi-quantification of protein levels. N = 6 per group. *WT+Vehicle mice vs. Tg+Vehicle mice, #Tg+5104434 mice vs. Tg+Vehicle mice. Statistical analysis by multiple t-test with FDR correction, Q = 1%. **P ≤ 0.01; ###P ≤ 0.001 and ****/####P ≤ 0.0001. Data information: All data are presented as mean ± SEM (%)IF staining of γH2AX in the frontal cortices and quantification of the immunoreactive cells from 8-mon-old of WT+Vehicle, Tg+Vehicle, Tg+5104434. n = 9 sections per mouse, N = 6 mice per group. Scale bar: 50 μm. * p = 0.0421 or **** p < 0.0001 by multiple comparison. Data information: number of cells in each view is presented.Immunohistochemistry of NeuN and the quantification of the immunoreactive cells in the hippocampus of three groups of mice, 8-mon-old WT+Vehicle, Tg+Vehicle and Tg+5104434. n = 9 sections per mouse, N = 6 mice per group. Scale bar: 50 μm.* p = 0.0414 or *** p = 0.0006 by multiple comparison. Data information: All data are presented as mean ± SEM (%)IF staining of GFAP and the quantification of the immunoreactive cells in the hippocampus of three groups of mice, 12-month-old WT+Vehicle, Tg+Vehicle and Tg+5104434. n = 9 sections per mouse, N = 6 mice per group. Scale bar: 50 μm. ** p = 0.002 and **** p < 0.0001 by multiple comparison. Data information: where number of cells in each view is presented."}
{"words": ["Figure", "8Representative", "IF", "staining", "of", "TDP", "-", "43", "and", "HDAC1", "in", "the", "frontal", "cortices", "from", "normal", "individuals", "and", "patients", "with", "FTLD", "-", "TDP", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "circled", "area", "is", "emphasized", "for", "showing", "the", "distribution", "of", "immunoreactivity", "in", "cell", "subregions", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Quantification", "of", "cells", "with", "co", "-", "mislocalized", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "from", "each", "view", "of", "microscope", ".", "N", "=", "5", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "t", "-", "test", ".", "Linear", "regression", "analysis", "of", "cells", "with", "HDAC1", "mislocalization", "and", "TDP", "-", "43", "proteinopathies", ".", "Total", "cell", "counts", ":", "3000", "per", "samples", ".", "P", "=", "0", ".", "0001", "by", "Pearson", "correlation", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "t", "-", "test", ".", "Representative", "IF", "staining", "of", "γH2AX", "and", "Ki67", "in", "the", "frontal", "cortices", "from", "normal", "individuals", "and", "patients", "with", "FTLD", "-", "TDP", "from", "each", "view", "of", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "circled", "area", "is", "emphasized", "for", "showing", "the", "distribution", "of", "immunoreactivity", "in", "cell", "subregions", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Quantification", "of", "cells", "with", "γH2AX", "and", "Ki67", "immunoreactivity", ".", "N", "=", "5", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "t", "-", "test", ".", "Linear", "regression", "analysis", "of", "cells", "with", "DNA", "damage", "and", "aberrant", "cell", "cycle", "activity", ".", "Cell", "counts", ":", "40", "-", "113", "(", "normal", ")", "and", "418", "-", "887", "(", "FTLD", ")", "per", "samples", ".", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Pearson", "correlation", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "t", "-", "test", ".", "Dot", "-", "blot", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "in", "urea", "-", "soluble", "fractions", "from", "the", "frontal", "cortex", "of", "normal", "individuals", "and", "patients", "with", "FTLD", "-", "TDP", ".", "Quantification", "of", "HDAC1", "and", "TDP", "-", "43", "expression", "levels", "in", "urea", "-", "soluble", "fractions", ".", "N", "=", "5", "per", "group", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Representative IF staining of TDP-43 and HDAC1 in the frontal cortices from normal individuals and patients with FTLD-TDP. Scale bar: 50 μm. The circled area is emphasized for showing the distribution of immunoreactivity in cell subregions. Scale bar: 15 μm.Quantification of cells with co-mislocalized HDAC1 and TDP-43 from each view of microscope. N = 5 per group. Data information: All data represent mean ± SEM, **** p < 0.0001 by t-test.Linear regression analysis of cells with HDAC1 mislocalization and TDP-43 proteinopathies. Total cell counts: 3000 per samples. P = 0.0001 by Pearson correlation analysis. Data information: All data represent mean ± SEM, **** p < 0.0001 by t-test.Representative IF staining of γH2AX and Ki67 in the frontal cortices from normal individuals and patients with FTLD-TDP from each view of microscope. Scale bar: 50 μm. The circled area is emphasized for showing the distribution of immunoreactivity in cell subregions. Scale bar: 15 μm.Quantification of cells with γH2AX and Ki67 immunoreactivity. N = 5 per group. Data information: All data represent mean ± SEM, **** p < 0.0001 by t-test.Linear regression analysis of cells with DNA damage and aberrant cell cycle activity. Cell counts: 40 -113 (normal) and 418-887 (FTLD) per samples. p < 0.0001 by Pearson correlation analysis. Data information: All data represent mean ± SEM, **** p < 0.0001 by t-test.Dot-blot of HDAC1 and TDP-43 in urea-soluble fractions from the frontal cortex of normal individuals and patients with FTLD-TDP.Quantification of HDAC1 and TDP-43 expression levels in urea-soluble fractions. N = 5 per group. Data information: All data represent mean ± SEM, **** p < 0.0001 by t-test."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Changes", "in", "the", "expression", "of", "cytokines", "in", "THP1", "macrophages", "(", "left", ")", "and", "PBMCs", "(", "right", ")", "upon", "treatment", "with", "full", "-", "length", "S1", "subunit", "at", "1", "µg", "/", "ml", "for", "24", "hr", ".", "Data", "information", ",", "E", ".", "Effect", "of", "an", "anti", "-", "RBD", "antibody", "on", "S1", "subunit", "stimulated", "changes", "in", "the", "expression", "of", "cytokines", "in", "PBMCs", ".", "Left", ",", "a", "schematic", "showing", "the", "domain", "structure", "of", "S1", "spike", "protein", "and", "anti", "-", "RBD", "antibody", ".", "Right", ",", "changes", "in", "cytokine", "gene", "expression", "in", "response", "to", "S1", "spike", "protein", "in", "the", "presence", "or", "abscene", "of", "anti", "-", "RBD", "antibody", ".", "Gene", "expression", "was", "measured", "by", "qPCR", ".", "Cytokine", "release", "in", "the", "conditioned", "media", "was", "measured", "by", "Luminex", ".", "Full", "-", "length", "S1", "and", "S1", "subunits", "are", "purified", "from", "HEK293", "cells", ".", "Data", "information", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ";", "in", "(", "D", ")", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "20", "individual", "donors", ".", "Error", "bars", "denote", "SEM", ".", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Multiple", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Changes in the expression of cytokines in THP1 macrophages (left) and PBMCs (right) upon treatment with full-length S1 subunit at 1 µg/ml for 24 hr. Data information,E. Effect of an anti-RBD antibody on S1 subunit stimulated changes in the expression of cytokines in PBMCs. Left, a schematic showing the domain structure of S1 spike protein and anti-RBD antibody. Right, changes in cytokine gene expression in response to S1 spike protein in the presence or abscene of anti-RBD antibody. Gene expression was measured by qPCR. Cytokine release in the conditioned media was measured by Luminex. Full-length S1 and S1 subunits are purified from HEK293 cells. Data information, data are shown as the mean of three technical replicates; in (D), data are shown as the mean of 20 individual donors. Error bars denote SEM. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, Multiple t-test."}
{"words": ["Figure", "2C", ".", "Validation", "of", "predicted", "kinases", "as", "drivers", "of", "cytokine", "release", "by", "siRNAs", "in", "THP1", "cells", ".", "Cytokine", "release", "was", "measured", "by", "Luminex", "and", "normalized", "to", "scrambled", "siRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C. Validation of predicted kinases as drivers of cytokine release by siRNAs in THP1 cells. Cytokine release was measured by Luminex and normalized to scrambled siRNA."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Comparison", "of", "kinase", "inhibition", "profile", "of", "Ponatinib", "and", "Baricitinib", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Comparison of kinase inhibition profile of Ponatinib and Baricitinib."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Dose", "-", "response", "curves", "of", "ponatinib", "treatment", "on", "SARS", "-", "Cov2", "NTD", "(", "Wuhan", ")", "-", "mediated", "cytokine", "release", "in", "PBMCs", ".", "Right", ",", "a", "table", "showing", "EC50", "(", "nM", ")", "values", "of", "ponatinib", "-", "mediated", "inhibition", "of", "cytokine", "release", "in", "response", "to", "indicated", "SARS", "-", "Cov2", "variant", "NTD", "treatments", "in", "PBMCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Dose-response curves of ponatinib treatment on SARS-Cov2 NTD (Wuhan)-mediated cytokine release in PBMCs. Right, a table showing EC50 (nM) values of ponatinib-mediated inhibition of cytokine release in response to indicated SARS-Cov2 variant NTD treatments in PBMCs."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Comparison", "of", "LPS", "and", "full", "length", "S1", "spike", "protein", "-", "mediated", "changes", "in", "cytokines", "in", "THP1", "macrophages", ".", "Data", "information", ",", ",", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "Error", "bars", "denote", "SEM", ".", "D", ".", "Representative", "H", "&", "E", "images", "showing", "Ponatinib", "alleviates", "LPS", "-", "induced", "inflammatory", "cell", "infiltration", ",", "septal", "thickening", ",", "alveolar", "edema", "in", "mouse", "lungs", ".", "Scale", "bars", "100", "µm", "(", "upper", ")", "and", "50", "µm", "(", "lower", ")", ".", "E", ".", "Plots", "showing", "pre", "-", "treatment", "(", "60", "min", ")", "with", "Ponatinib", "(", "35", "mg", "/", "Kg", ")", "inhibits", "LPS", "-", "induced", "cytokine", "release", "in", "BALF", ".", "Cytokine", "levels", "were", "measured", "using", "Luminex", ".", "Data", "information", ",", "data", "are", "mean", "of", "five", "biological", "replicates", "from", "two", "independent", "studies", ",", "error", "bars", "denote", "SEM", ".", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Comparison of LPS and full length S1 spike protein-mediated changes in cytokines in THP1 macrophages. Data information, , data are shown as the mean of three technical replicates. Error bars denote SEM.D. Representative H&E images showing Ponatinib alleviates LPS-induced inflammatory cell infiltration, septal thickening, alveolar edema in mouse lungs. Scale bars 100 µm (upper) and 50 µm (lower).E. Plots showing pre-treatment (60 min) with Ponatinib (35 mg/Kg) inhibits LPS-induced cytokine release in BALF. Cytokine levels were measured using Luminex. Data information, data are mean of five biological replicates from two independent studies, error bars denote SEM. ∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01, Welch's t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "CP20", "and", "OVCAR4", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "non", "-", "target", "miRNA", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", ",", "miR", "-", "15a", ",", "or", "miR", "-", "195", ".", "72h", "following", "transfection", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "immunoblotted", "for", "detection", "of", "MICU1", ",", "BMI1", ",", "BCL2", ",", "and", "MFN2", ".", "GAPDH", "and", "VDAC", "were", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "miR", "-", "195", "expression", "in", "FTE188", "and", "ovarian", "cell", "lines", "as", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", "normalized", "with", "U6", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ",", "n", "=", "3", "(", "Biological", "repeats", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Expression", "of", "MICU1", "in", "FTE188", "and", "various", "ovarian", "cell", "lines", "as", "determined", "by", "immunoblotting", ".", "Actin", "is", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "(", "D", ")", "Anti", "-", "miR", "-", "195", "was", "transfected", "in", "the", "FTE188", "cell", "line", ",", "level", "of", "miR", "-", "195", "was", "measured", "using", "RT", "-", "qPCR", "(", "left", ")", "and", "MICU1", "levels", "were", "measured", "using", "immunoblotting", "(", "right", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", ",", "n", "=", "3", "(", "Biological", "repeats", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) CP20 and OVCAR4 cells were transfected with either non-target miRNA control (miR-CTL), miR-15a, or miR-195. 72h following transfection, cells were lysed and immunoblotted for detection of MICU1, BMI1, BCL2, and MFN2. GAPDH and VDAC were used as loading control.(B) miR-195 expression in FTE188 and ovarian cell lines as determined by RT-qPCR normalized with U6. Data are mean ± S.D., n=3 (Biological repeats). *P<0.05, Student's t-test.(C) Expression of MICU1 in FTE188 and various ovarian cell lines as determined by immunoblotting. Actin is used as the loading control.(D) Anti-miR-195 was transfected in the FTE188 cell line, level of miR-195 was measured using RT-qPCR (left) and MICU1 levels were measured using immunoblotting (right). Data are mean ± S.D., n=3 (Biological repeats). *P<0.05, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "CP20", ",", "OVCAR4", ",", "and", "OVSAHO", "cells", "were", "transfected", "with", "non", "-", "target", "micro", "RNA", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", "or", "miR", "-", "195", ",", "24", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "recounted", "and", "plated", "as", "single", "cells", "for", "anchorage", "-", "dependent", "(", "A", ")", "or", "anchorage", "-", "independent", "(", "B", ")", "clonal", "growth", ".", "After", "10", "(", "CP20", ")", "or", "14", "(", "OVCAR4", "and", "OVSAHO", ")", "days", ",", "colonies", "were", "quantified", "using", "an", "Optronix", "GelCount", "colony", "counter", ".", "The", "left", "panel", "shows", "representative", "images", "of", "the", "colonies", "and", "the", "right", "panel", "depicts", "a", "graphical", "representation", "of", "data", "presented", "as", "percent", "clonal", "growth", "relative", "to", "the", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", ".", "(", "C", ")", "Migration", "of", "miR", "-", "CTL", ",", "miR", "-", "195", ",", "and", "miR", "-", "195", "+", "MICU1", "(", "pLYS1", "-", "MICU1", "-", "Flag", ")", "transfected", "cells", ",", "towards", "serum", "gradient", "was", "examined", "and", "the", "number", "of", "cells", "per", "field", "was", "counted", ".", "The", "left", "panel", "shows", "representative", "images", "and", "the", "right", "panel", "depicts", "a", "graphical", "representation", "of", "relative", "migration", "compared", "to", "the", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", ".", "(", "D", ")", "Invasion", "of", "miR", "-", "CTL", ",", "miR", "-", "195", ",", "and", "miR", "-", "195", "+", "MICU1", "cells", "through", "fibronectin", "-", "coated", "filters", "was", "examined", "using", "Boyden", "chamber", "and", "number", "of", "cells", "per", "field", "was", "counted", ".", "Left", "panel", "shows", "representative", "images", "and", "the", "right", "panel", "depicts", "a", "graphical", "representation", "of", "relative", "invasion", "compared", "to", "the", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) CP20, OVCAR4, and OVSAHO cells were transfected with non-target micro RNA control (miR-CTL) or miR-195, 24 h post-transfection, cells were recounted and plated as single cells for anchorage-dependent (A) or anchorage-independent (B) clonal growth. After 10 (CP20) or 14 (OVCAR4 and OVSAHO) days, colonies were quantified using an Optronix GelCount colony counter. The left panel shows representative images of the colonies and the right panel depicts a graphical representation of data presented as percent clonal growth relative to the control (miR-CTL).(C) Migration of miR-CTL, miR-195, and miR-195+ MICU1 (pLYS1-MICU1-Flag) transfected cells, towards serum gradient was examined and the number of cells per field was counted. The left panel shows representative images and the right panel depicts a graphical representation of relative migration compared to the control (miR-CTL).(D) Invasion of miR-CTL, miR-195, and miR-195 + MICU1 cells through fibronectin-coated filters was examined using Boyden chamber and number of cells per field was counted. Left panel shows representative images and the right panel depicts a graphical representation of relative invasion compared to the control (miR-CTL)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "MICU1", "3", "'", "UTR", "in", "LightSwitch", "™", "3", "′", "UTR", "Reporter", "Vector", "(", "wild", "type", "or", "miR", "-", "195", "binding", "site", "deleted", ")", "was", "co", "-", "transfected", "with", "either", "non", "-", "target", "miR", "control", "(", "miR", "-", "CTL", ")", "or", "different", "concentrations", "of", "miR", "-", "195", ".", "Post", "24h", "transfection", "luciferase", "(", "Renilla", ")", "activity", "was", "measured", ".", "Relative", "light", "units", "(", "RLU", ")", "compared", "to", "miR", "-", "CTL", "were", "plotted", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", "n", "=", "3", "(", "Biological", "repeats", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "CP20", "cells", "were", "transfected", "as", "indicated", ",", "48", "h", "post", "transfection", "4x106", "cells", "were", "permeabilized", ",", "and", "extra", "-", "mitochondrial", "calcium", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "out", ")", "clearance", "was", "measured", ",", "representative", "traces", "of", "[", "Ca2", "+", "]", "out", "‑", "clearance", "in", "miR", "-", "CTL", "and", "miR", "-", "195", "transfected", "cells", ".", "[", "Ca2", "+", "]", "out", "pulses", "and", "FCCP", "were", "delivered", "as", "indicated", ".", "CP20", "cells", "were", "transfected", "as", "indicated", ",", "48", "h", "post", "transfection", "4x106", "cells", "were", "permeabilized", ",", "and", "extra", "-", "mitochondrial", "calcium", "(", "[", "Ca2", "+", "]", "out", ")", "clearance", "was", "measured", ",", "representative", "traces", "of", "[", "Ca2", "+", "]", "out", "‑", "clearance", "in", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "and", "siMICU1", "transfected", "cells", ".", "[", "Ca2", "+", "]", "out", "pulses", "and", "FCCP", "were", "delivered", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "number", "of", "Ca2", "+", "pulses", "handled", "by", "control", "miR", ",", "miR", "-", "195", ",", "siCTL", "and", "siMICU1", "transfected", "cells", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "-", "4", "(", "Biological", "repeats", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Representative", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "m", ")", "traces", "after", "addition", "of", "FCCP", "(", "10", "µM", ")", "in", "permeabilized", "CP20", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "target", "miR", "-", "CTL", "or", "miR", "-", "195", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "resting", "matrix", "[", "Ca2", "+", "]", "(", "m", ")", "after", "addition", "of", "FCCP", ".", "n", "=", "5", "(", "Biological", "repeats", ")", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "(", "H", ")", "Representative", "traces", "of", "mitochondrial", "membrane", "potential", "(", "∆", "Ψμ", ")", "in", "CP20", "cells", "transfected", "with", "miR", "-", "CTL", "or", "miR", "-", "195", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "relative", "∆", "Ψμ", ".", "(", "n", "=", "5", ",", "Biological", "repeats", ")", ".", "(", "J", ")", "Intracellular", "lactate", "was", "measured", "in", "miR", "-", "CTL", ",", "miR", "-", "195", ",", "siCTL", ",", "and", "siMICU1", "expressing", "OVCAR4", ",", "CP20", ",", "and", "OVSAHO", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "biological", "repeats", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "K", "&", "L", ")", "miR", "-", "CTL", ",", "miR", "-", "195", ",", "or", "miR", "-", "195", "+", "pLYS1", "-", "MICU1", "-", "Flag", "transfected", "cells", "were", "stained", "with", "MitoSOX", "Red", ",", "and", "mitochondrial", "ROS", "levels", "were", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "histogram", "shows", "representative", "staining", "and", "bar", "graph", "(", "right", ")", "shows", "results", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", ".", "n", "=", "3", ",", "biological", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "when", "comparing", "with", "miR", "-", "CTL", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "when", "comparing", "with", "miR", "-", "195", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) MICU1 3'UTR in LightSwitch™ 3′UTR Reporter Vector (wild type or miR-195 binding site deleted) was co-transfected with either non- target miR control (miR-CTL) or different concentrations of miR-195. Post 24h transfection luciferase (Renilla) activity was measured. Relative light units (RLU) compared to miR-CTL were plotted. Data are mean ± S.D. n=3 (Biological repeats). *P<0.05, Student's t-test.CP20 cells were transfected as indicated, 48 h post transfection 4x106 cells were permeabilized, and extra-mitochondrial calcium ([Ca2+]out) clearance was measured, representative traces of [Ca2+]out‑ clearance in miR-CTL and miR-195 transfected cells. [Ca2+]out pulses and FCCP were delivered as indicated.CP20 cells were transfected as indicated, 48 h post transfection 4x106 cells were permeabilized, and extra-mitochondrial calcium ([Ca2+]out) clearance was measured, representative traces of [Ca2+]out‑ clearance in control siRNA (siCTL) and siMICU1 transfected cells. [Ca2+]out pulses and FCCP were delivered as indicated.(E) Bar graph illustrating the number of Ca2+ pulses handled by control miR, miR-195, siCTL and siMICU1 transfected cells. Mean ±SEM; n=3-4 (Biological repeats). *P<0.05, Student's t-test.(F) Representative [Ca2+](m) traces after addition of FCCP (10 µM) in permeabilized CP20 cells transfected with non-target miR-CTL or miR-195. (G) Quantification of resting matrix [Ca2+](m) after addition of FCCP. n=5 (Biological repeats) *P<0.05, Student's t-test, (H) Representative traces of mitochondrial membrane potential (∆Ψμ) in CP20 cells transfected with miR-CTL or miR-195. (I) Quantification of relative ∆Ψμ. (n=5, Biological repeats). (J) Intracellular lactate was measured in miR-CTL, miR-195, siCTL, and siMICU1 expressing OVCAR4, CP20, and OVSAHO cells. n=3, biological repeats *P<0.05, Student's t-test.(K&L) miR-CTL, miR-195, or miR-195 + pLYS1-MICU1-Flag transfected cells were stained with MitoSOX Red, and mitochondrial ROS levels were determined by flow cytometry. The histogram shows representative staining and bar graph (right) shows results of three independent experiments. Mean ± SEM; . n=3, biological repeats. *P<0.05 when comparing with miR-CTL, # P<0.05 when comparing with miR-195 by Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "&", "B", ")", "Stable", "cell", "lines", "for", "CP20", "and", "OVCAR4", "expressing", "GFP", "-", "miR", "-", "195", "or", "non", "-", "target", "miR", "-", "GFP", "were", "generated", "using", "lentiviral", "mediated", "transduction", "and", "were", "selected", "using", "puromycin", ";", "representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", ".", "(", "C", ")", "Relative", "miR", "-", "195", "expression", "was", "measured", "using", "RT", "-", "qPCR", "in", "stable", "cell", "lines", ",", "normalized", "with", "U6", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ",", "Biological", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "CP20", "and", "OVCAR4", "stable", "cell", "lines", "were", "transfected", "as", "either", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "pLYS1", "-", "MICU1", "-", "Flag", "(", "MICU1", ")", "and", "relative", "MICU1", "levels", "were", "evaluated", "using", "immunoblotting", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "CP20", "and", "OVCAR4", "stable", "cell", "lines", "transfected", "as", "in", "(", "D", ")", "were", "counted", "and", "re", "-", "plated", "for", "anchorage", "-", "dependent", "(", "E", ")", "and", "independent", "clonal", "growth", "(", "F", ")", ".", "Quantification", "compared", "to", "the", "miR", "-", "CTL", "stable", "cells", "transfected", "with", "EV", "is", "shown", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ",", "Biological", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "when", "comparing", "with", "miR", "-", "CTL", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "when", "comparing", "with", "miR", "-", "195", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A&B) Stable cell lines for CP20 and OVCAR4 expressing GFP-miR-195 or non-target miR-GFP were generated using lentiviral mediated transduction and were selected using puromycin; representative images are shown. Scale bars, 50 µm.(C) Relative miR-195 expression was measured using RT-qPCR in stable cell lines, normalized with U6. Mean ± SEM; n=3, Biological repeats. *P<0.05, Student's t-test.(D) CP20 and OVCAR4 stable cell lines were transfected as either empty vector (EV) or pLYS1-MICU1-Flag (MICU1) and relative MICU1 levels were evaluated using immunoblotting.(E, F) CP20 and OVCAR4 stable cell lines transfected as in (D) were counted and re-plated for anchorage-dependent (E) and independent clonal growth (F). Quantification compared to the miR-CTL stable cells transfected with EV is shown. Mean ± SD; n=3, Biological repeats. *P<0.05 when comparing with miR-CTL, # P<0.05 when comparing with miR-195 by Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Female", "athymic", "mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "either", "CP20", "GFP", "-", "miR", "-", "CTL", "or", "CP20", "-", "GFP", "-", "miR", "-", "195", "cells", ".", "Mice", "injected", "with", "the", "miR", "-", "195", "expressing", "cells", "(", "miR", "-", "195", ")", "had", "significantly", "smaller", "tumor", "volumes", "than", "control", "mice", "(", "miR", "-", "CTL", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "D", ",", "n", "=", "10", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "B", ")", "Tumor", "doubling", "time", "was", "significantly", "longer", "in", "the", "mice", "injected", "with", "miR", "-", "195", "expressing", "cells", "than", "in", "control", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "D", ",", "n", "=", "10", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Percent", "survival", "based", "on", "humane", "endpoint", "criteria", ",", "was", "calculated", "by", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "and", "P", "values", "determined", "by", "Log", "Rank", "Test", ".", "(", "D", ")", "Four", "tumor", "samples", "from", "each", "group", "were", "analyzed", "for", "the", "expression", "of", "MICU1", ",", "pPDH", ",", "PDH", ",", "PARP", ",", "and", "BCL2", "using", "immunoblotting", ".", "α", "tubulin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "Representative", "histology", "images", "of", "tumors", "from", "mice", "xenografts", "of", "CP20", "-", "GPF", "-", "miR", "-", "CTL", "(", "miR", "-", "CTL", ")", "or", "CP20", "-", "GPF", "-", "miR", "-", "195", "(", "miR", "-", "195", ")", "cells", "with", "Ki67", "expression", "(", "Scale", "Bar", "=", "50", " ", "μm", ")", "(", "E", ")", ",", "CD31", "positive", "vessels", "(", "Scale", "Bar", "=", "100", " ", "μm", ")", "and", "TUNEL", "staining", "(", "Scale", "Bar", "=", "50", " ", "μm", ")", "Representative", "histology", "images", "of", "tumors", "from", "mice", "xenografts", "of", "CP20", "-", "GPF", "-", "miR", "-", "CTL", "(", "miR", "-", "CTL", ")", "or", "CP20", "-", "GPF", "-", "miR", "-", "195", "(", "miR", "-", "195", ")", "cells", "with", "Ki67", "expression", "(", "Scale", "Bar", "=", "50", " ", "μm", ")", "(", "F", ")", "graph", "showing", "quantification", "of", "each", "marker", "in", "tumors", "from", "the", "experimental", "mice", ";", "values", "are", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "10", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Female", "athymic", "mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "either", "CP20", "GFP", "-", "miR", "-", "CTL", "or", "CP20", "-", "GFP", "-", "miR", "-", "195", "or", "CP20", "-", "GFP", "-", "miR", "-", "195", "+", "MICU1", "cells", "and", "tumor", "volume", "was", "measured", ",", "values", "are", "mean", "±", "SE", ",", "n", "=", "10", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Female athymic mice were injected subcutaneously with either CP20 GFP-miR-CTL or CP20- GFP-miR-195 cells. Mice injected with the miR-195 expressing cells (miR-195) had significantly smaller tumor volumes than control mice (miR-CTL). Data are mean ± S.D, n=10. *P<0.05, Student's t-test.(B) Tumor doubling time was significantly longer in the mice injected with miR-195 expressing cells than in control mice. Data are mean ± S.D, n=10. *P<0.05, Student's t-test.(C) Percent survival based on humane endpoint criteria, was calculated by the Kaplan-Meier method and P values determined by Log Rank Test.(D) Four tumor samples from each group were analyzed for the expression of MICU1, pPDH, PDH, PARP, and BCL2 using immunoblotting. α tubulin was used as the loading control.Representative histology images of tumors from mice xenografts of CP20-GPF-miR-CTL (miR-CTL) or CP20-GPF-miR-195 (miR-195) cells with Ki67 expression (Scale Bar = 50 μm) (E), CD31 positive vessels (Scale Bar = 100 μm) and TUNEL staining (Scale Bar = 50 μm)Representative histology images of tumors from mice xenografts of CP20-GPF-miR-CTL (miR-CTL) or CP20-GPF-miR-195 (miR-195) cells with Ki67 expression (Scale Bar = 50 μm) (F) graph showing quantification of each marker in tumors from the experimental mice; values are mean ±SD, n=10, *P<0.05, Student's t-test.(G) Female athymic mice were injected subcutaneously with either CP20 GFP-miR-CTL or CP20- GFP-miR-195 or CP20- GFP-miR-195 + MICU1 cells and tumor volume was measured, values are mean ±SE, n=10. *P<0.05, Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "1Percentage", "of", "circulating", "highly", "differentiated", "CD4", "T", "cells", "within", "CD4", "cells", "(", "upper", "graph", ")", "in", "age", "-", "matched", "healthy", "donors", "or", "NSCLC", "patients", "before", "undergoing", "immunotherapies", ".", "G1", "and", "G2", ",", "groups", "of", "patients", "classified", "according", "to", "high", "THD", "cells", "(", "G1", ",", ">", "40", "%", "CD4", "THD", "cells", ")", "and", "low", "THD", "cells", "(", "G2", ",", "<", "40", "%", "CD4", "THD", "cells", ")", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "by", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", ".", "In", "green", ",", "objective", "responders", "(", "OR", ")", ".", "In", "red", ",", "no", "OR", ".", "Below", "the", "graph", ",", "correlation", "of", "objective", "responses", "to", "G1", "and", "G2", "groups", "by", "the", "Fisher", "´", "s", "exact", "test", ".", "Waterfall", "plot", "of", "change", "in", "lesion", "size", "in", "patients", "with", "measurable", "disease", "classified", "as", "having", "a", "G1", "(", "blue", ")", "or", "G2", "(", "red", ")", "profile", ".", "Dotted", "lines", "represents", "the", "limit", "to", "define", "significant", "progression", "(", "upper", "line", ")", "or", "significant", "regression", "(", "lower", "line", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "for", "PFS", "in", "patients", "treated", "with", "immunotherapies", "stratified", "only", "by", "G1", "(", "green", ")", "and", "G2", "(", "red", ")", "CD4", "T", "cell", "profiles", ".", "Patients", "starting", "therapy", "with", "a", "G2", "profile", "had", "an", "overall", "response", "rate", "(", "ORR", ")", "of", "0", "%", "and", "82", "%", "of", "them", "experienced", "progression", "or", "death", "by", "week", "9", ".", "ORR", "was", "44", ".", "8", "%", "for", "G1", "patients", ",", "and", "the", "12", "-", "week", "PFS", "was", "50", ".", "2", "%", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Percentage of circulating highly differentiated CD4 T cells within CD4 cells (upper graph) in age-matched healthy donors or NSCLC patients before undergoing immunotherapies. G1 and G2, groups of patients classified according to high THD cells (G1, >40% CD4 THD cells) and low THD cells (G2, <40% CD4 THD cells). Relevant statistical comparisons are shown by the test of Mann-Whitney. In green, objective responders (OR). In red, no OR. Below the graph, correlation of objective responses to G1 and G2 groups by the Fisher´s exact test.Waterfall plot of change in lesion size in patients with measurable disease classified as having a G1 (blue) or G2 (red) profile. Dotted lines represents the limit to define significant progression (upper line) or significant regression (lower line).Kaplan-Meier plot for PFS in patients treated with immunotherapies stratified only by G1 (green) and G2 (red) CD4 T cell profiles. Patients starting therapy with a G2 profile had an overall response rate (ORR) of 0% and 82% of them experienced progression or death by week 9. ORR was 44.8% for G1 patients, and the 12-week PFS was 50.2%."}
{"words": ["Figure", "2The", "scatter", "plot", "shows", "PD", "-", "1", "expression", "after", "co", "-", "culture", "of", "CD4", "T", "cells", "from", "healthy", "donors", "or", "NSCLC", "patients", ",", "as", "indicated", ",", "with", "A459", "-", "SC3", "lung", "cancer", "cells", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "with", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", "are", "indicated", ".", "Upper", "graphs", ",", "flow", "cytometry", "density", "plots", "of", "PD", "-", "1", "and", "LAG", "-", "3", "co", "-", "expression", "in", "CD4", "T", "cells", "from", "healthy", "donors", ",", "a", "G1", "responder", "(", "G1", "R", ")", ",", "a", "G1", "non", "-", "responder", "(", "G1", "NR", ")", "and", "a", "G2", "non", "-", "responder", "as", "indicated", ",", "following", "stimulation", "with", "A549", "-", "SC3", "cells", ".", "Percentage", "of", "expressing", "cells", "are", "indicated", "within", "each", "quadrant", ".", "Below", ",", "same", "as", "in", "the", "upper", "graphs", "but", "as", "a", "scatter", "plot", "of", "the", "percentage", "of", "CD4", "T", "cells", "that", "simultaneously", "co", "-", "express", "PD", "-", "1", "and", "LAG", "-", "3", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", ".", "Upper", "flow", "cytometry", "histograms", "of", "Ki67", "expression", "in", "CD4", "T", "cells", "from", "the", "representative", "subjects", "as", "indicated", "on", "the", "right", ",", "after", "stimulation", "with", "A549", "-", "SC3", "cells", ".", "Vertical", "dotted", "line", "indicates", "the", "cut", "-", "off", "value", "of", "positive", "vs", "negative", "Ki67", "expression", ".", "The", "percentage", "of", "Ki67", "-", "expressing", "CD4", "T", "cells", "is", "shown", "within", "the", "histograms", ".", "Below", ",", "same", "data", "represented", "as", "a", "scatter", "plot", "from", "a", "sample", "of", "G1", "and", "G2", "donors", "as", "indicated", ",", "with", "relevant", "statistical", "comparisons", "with", "the", "test", "Mann", "-", "Whitney", ".", "Proliferation", "of", "CD4", "T", "cells", "stimulated", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", "from", "the", "indicated", "patient", "groups", ".", "CD28", "expression", "is", "shown", "together", "with", "the", "proliferation", "marker", "ki67", ".", "Percentages", "of", "cells", "within", "each", "quadrant", "are", "shown", ".", "Same", "as", "in", "(", "D", ")", "but", "in", "the", "presence", "of", "an", "isotype", "control", "antibody", "or", "an", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "with", "the", "equivalent", "sequence", "to", "pembrolizumab", ".", "The", "effects", "on", "CD4", "T", "cells", "from", "a", "G1", "and", "a", "G2", "patient", "are", "shown", ",", "divided", "in", "CD28", "high", "or", "low", "/", "negative", "subsets", "as", "indicated", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "paired", "Student", "´", "s", "t", "test", ".", "Top", ",", "flow", "cytometry", "density", "plots", "of", "Ki67", "expression", "in", "CD4", "T", "cells", "from", "representative", "G1", "or", "G2", "patients", "after", "three", "cycles", "of", "therapy", ",", "activated", "by", "incubation", "with", "A549", "-", "SC3", "cells", ".", "Below", ",", "same", "as", "above", "but", "as", "a", "dot", "-", "plot", "graph", ".", "A", "comparison", "between", "proliferating", "CD4", "T", "cells", "before", "and", "after", "therapy", "is", "shown", "in", "unpaired", "patient", "samples", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The scatter plot shows PD-1 expression after co-culture of CD4 T cells from healthy donors or NSCLC patients, as indicated, with A459-SC3 lung cancer cells. Relevant statistical comparisons with the test of Mann-Whitney are indicated.Upper graphs, flow cytometry density plots of PD-1 and LAG-3 co-expression in CD4 T cells from healthy donors, a G1 responder (G1 R), a G1 non-responder (G1 NR) and a G2 non-responder as indicated, following stimulation with A549-SC3 cells. Percentage of expressing cells are indicated within each quadrant. Below, same as in the upper graphs but as a scatter plot of the percentage of CD4 T cells that simultaneously co-express PD-1 and LAG-3. Relevant statistical comparisons are shown with the test of Mann-Whitney.Upper flow cytometry histograms of Ki67 expression in CD4 T cells from the representative subjects as indicated on the right, after stimulation with A549-SC3 cells. Vertical dotted line indicates the cut-off value of positive vs negative Ki67 expression. The percentage of Ki67-expressing CD4 T cells is shown within the histograms. Below, same data represented as a scatter plot from a sample of G1 and G2 donors as indicated, with relevant statistical comparisons with the test Mann-Whitney.Proliferation of CD4 T cells stimulated by A549-SC3 cells from the indicated patient groups. CD28 expression is shown together with the proliferation marker ki67. Percentages of cells within each quadrant are shown.Same as in (D) but in the presence of an isotype control antibody or an anti-PD-1 antibody with the equivalent sequence to pembrolizumab. The effects on CD4 T cells from a G1 and a G2 patient are shown, divided in CD28 high or low/negative subsets as indicated. Relevant statistical comparisons are shown with paired Student´s t test.Top, flow cytometry density plots of Ki67 expression in CD4 T cells from representative G1 or G2 patients after three cycles of therapy, activated by incubation with A549-SC3 cells. Below, same as above but as a dot-plot graph. A comparison between proliferating CD4 T cells before and after therapy is shown in unpaired patient samples."}
{"words": ["Figure", "3Scatter", "plot", "graph", "with", "the", "percentage", "of", "lung", "cancer", "-", "specific", "systemic", "CD4", "T", "cells", "quantified", "by", "an", "autologous", "DC", "-", "based", "antigen", "presentation", "assay", "(", "See", "Materials", "and", "Methods", ")", ",", "in", "a", "sample", "of", "G1", "and", "G2", "patients", "as", "indicated", ".", "Objective", "responses", "(", "OR", ")", "are", "shown", "in", "green", ".", "In", "red", ",", "patients", "with", "no", "OR", ".", "The", "scatter", "plot", "graph", "on", "the", "left", "represents", "the", "percentage", "of", "CD4", "THD", "cells", "within", "lung", "-", "cancer", "specific", "CD4", "T", "cells", "in", "a", "sample", "of", "patients", "from", "the", "indicated", "G1", "/", "G2", "groups", ".", "On", "the", "right", ",", "same", "as", "left", "but", "representing", "the", "percentage", "of", "CD28", "+", "CD4", "T", "cells", "within", "lung", "-", "cancer", "specific", "CD4", "T", "cells", ".", "Objective", "responders", "(", "OR", ")", "are", "shown", "in", "green", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Scatter plot graph with the percentage of lung cancer-specific systemic CD4 T cells quantified by an autologous DC-based antigen presentation assay (See Materials and Methods), in a sample of G1 and G2 patients as indicated. Objective responses (OR) are shown in green. In red, patients with no OR.The scatter plot graph on the left represents the percentage of CD4 THD cells within lung-cancer specific CD4 T cells in a sample of patients from the indicated G1/G2 groups. On the right, same as left but representing the percentage of CD28+ CD4 T cells within lung-cancer specific CD4 T cells. Objective responders (OR) are shown in green."}
{"words": ["Figure", "4Column", "graphs", "representing", "the", "percentage", "of", "CD4", "T", "cells", "from", "NSCLC", "patients", "or", "age", "-", "matched", "healthy", "donors", "as", "represented", "in", "the", "graph", ",", "expressing", "the", "indicated", "cytokines", "after", "T", "cell", "stimulation", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "anti", "-", "CD28", "antibodies", ".", "Data", "on", "total", "CD4", "(", "left", "graph", ")", ",", "CD28", "+", "subsets", "(", "center", "graph", ")", "and", "CD28negative", "subsets", "(", "right", "graph", ")", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", "and", "bars", "represent", "means", "from", "5", "independent", "biological", "replicates", "(", "patients", ")", ".", "representing", "CD4", "T", "cells", "expressing", "only", "one", "cytokinerepresenting", "CD4", "T", "cells", "expressing", "only", "cytokine", ",", "twoCD4", "T", "cells", "expressing", "only", "three", "cytokines"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Column graphs representing the percentage of CD4 T cells from NSCLC patients or age-matched healthy donors as represented in the graph, expressing the indicated cytokines after T cell stimulation with anti-CD3/anti-CD28 antibodies. Data on total CD4 (left graph), CD28+ subsets (center graph) and CD28negative subsets (right graph) are shown. Error bars correspond to standard deviations and bars represent means from 5 independent biological replicates (patients).representing CD4 T cells expressing only one cytokinerepresenting CD4 T cells expressing only cytokine, twoCD4 T cells expressing only three cytokines simultaneously"}
{"words": ["Figure", "5Expression", "of", "the", "proliferation", "marker", "Ki67", "in", "CD8", "T", "cells", "stimulated", "ex", "vivo", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", "from", "the", "indicated", "patient", "groups", ",", "before", "the", "start", "of", "immunotherapy", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", ".", "Dot", "plots", "of", "the", "percentage", "of", "Ki67", "+", "proliferating", "CD8", "T", "cells", "after", "ex", "vivo", "activation", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", ".", "CD8", "T", "cells", "were", "obtained", "from", "samples", "of", "G1", "or", "G2", "patients", "before", "immunotherapy", "and", "after", "three", "cycles", "of", "anti", "-", "PD", "-", "1", "therapy", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", ".", "Green", ",", "objective", "responders", "(", "OR", ")", "and", "red", ",", "no", "ORs", ".", "Expression", "of", "the", "proliferation", "marker", "Ki67", "in", "CD8", "T", "cells", "stimulated", "ex", "vivo", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", "from", "the", "indicated", "patient", "groups", ",", "before", "the", "start", "of", "immunotherapy", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "the", "test", "of", "Mann", "-", "Whitney", ".", "but", "in", "the", "presence", "of", "an", "isotype", "control", "antibody", "or", "an", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "molecularly", "equivalent", "to", "pembrolizumab", ".", "Relevant", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "with", "comparisons", "carried", "out", "with", "paired", "Student", "´", "s", "t", "test", ".", "Change", "in", "CD8", "CD28", "+", "T", "cells", "from", "baseline", "to", "post", "-", "therapy", "in", "G1", "patients", "(", "left", ")", "or", "in", "G2", "patients", "(", "right", ")", ".", "Statistical", "comparisons", "were", "carried", "out", "with", "paired", "Student", "´", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Expression of the proliferation marker Ki67 in CD8 T cells stimulated ex vivo by A549-SC3 cells from the indicated patient groups, before the start of immunotherapy. Relevant statistical comparisons are shown with the test of Mann-Whitney.Dot plots of the percentage of Ki67+ proliferating CD8 T cells after ex vivo activation by A549-SC3 cells. CD8 T cells were obtained from samples of G1 or G2 patients before immunotherapy and after three cycles of anti-PD-1 therapy. Relevant statistical comparisons are shown with the test of Mann-Whitney. Green, objective responders (OR) and red, no ORs.Expression of the proliferation marker Ki67 in CD8 T cells stimulated ex vivo by A549-SC3 cells from the indicated patient groups, before the start of immunotherapy. Relevant statistical comparisons are shown with the test of Mann-Whitney. but in the presence of an isotype control antibody or an anti-PD-1 antibody molecularly equivalent to pembrolizumab. Relevant statistical comparisons are shown with comparisons carried out with paired Student´s t test.Change in CD8 CD28+ T cells from baseline to post-therapy in G1 patients (left) or in G2 patients (right). Statistical comparisons were carried out with paired Student´s t test."}
{"words": ["Figure", "6Scatter", "plots", "of", "PD", "-", "1", "/", "LAG", "-", "3", "-", "expressing", "CD8", "T", "cells", "after", "activation", "by", "A459", "-", "SC3", "cells", "in", "a", "sample", "of", "G1", "and", "G2", "patients", "within", "CD28", "+", "and", "CD28negative", "populations", "as", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "Dot", "-", "plot", "representing", "the", "percentage", "of", "proliferating", "CD4", "T", "cells", "from", "a", "sample", "of", "G2", "patients", "before", "starting", "immunotherapy", ",", "activated", "ex", "vivo", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "antibodies", ".", "\"", "Dual", "\"", "represents", "the", "addition", "of", "both", "anti", "-", "PD", "-", "1", "and", "anti", "-", "LAG", "-", "3", "antibodies", ".", "Appropriate", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "within", "the", "graph", "with", "two", "-", "way", "paired", "ANOVA", ".", "Data", "from", "CD28", "+", "and", "CD28negative", "subsets", "are", "represented", "as", "indicated", ".", "Dot", "-", "plot", "representing", "the", "percentage", "of", "proliferating", "cells", "from", "a", "sample", "of", "G2", "patients", "before", "starting", "immunotherapy", ",", "activated", "ex", "vivo", "by", "A549", "-", "SC3", "cells", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "antibodies", ".", "\"", "Dual", "\"", "represents", "the", "addition", "of", "both", "anti", "-", "PD", "-", "1", "and", "anti", "-", "LAG", "-", "3", "antibodies", ".", "Appropriate", "statistical", "comparisons", "are", "shown", "within", "the", "graph", "with", "two", "-", "way", "paired", "ANOVA", ".", "Data", "from", "CD28", "+", "and", "CD28negative", "subsets", "are", "represented", "as", "indicated", ".", "for", "CD8", "T", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Scatter plots of PD-1/LAG-3-expressing CD8 T cells after activation by A459-SC3 cells in a sample of G1 and G2 patients within CD28+ and CD28negative populations as indicated in the figure.Dot-plot representing the percentage of proliferating CD4 T cells from a sample of G2 patients before starting immunotherapy, activated ex vivo by A549-SC3 cells in the presence of the indicated antibodies. \"Dual\" represents the addition of both anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies. Appropriate statistical comparisons are shown within the graph with two-way paired ANOVA. Data from CD28+ and CD28negative subsets are represented as indicated.Dot-plot representing the percentage of proliferating cells from a sample of G2 patients before starting immunotherapy, activated ex vivo by A549-SC3 cells in the presence of the indicated antibodies. \"Dual\" represents the addition of both anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies. Appropriate statistical comparisons are shown within the graph with two-way paired ANOVA. Data from CD28+ and CD28negative subsets are represented as indicated. for CD8 T cells."}
{"words": ["Figure", "7Kaplan", "-", "Meier", "plot", "for", "PFS", "in", "patients", "undergoing", "immune", "checkpoint", "inhibitor", "therapies", "stratified", "by", "G1", "/", "PD", "-", "L1", "+", "tumors", "(", "blue", ")", "and", "remaining", "patients", "for", "whom", "their", "PD", "-", "L1", "tumor", "status", "is", "known", "(", "red", ")", ".", "Same", "as", "(", "A", ")", "but", "including", "all", "patients", "in", "the", "study", "cohort", ".", "Remaining", "patients", "(", "red", ")", "also", "included", "G1", "patients", "with", "PD", "-", "L1", "low", "/", "negative", "tumors", ",", "G1", "patients", "with", "unknown", "PD", "-", "L1", "tumor", "status", "and", "G2", "patients", "with", "either", "PD", "-", "L1", "+", "or", "PD", "-", "L1", "negative", "tumors", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Kaplan-Meier plot for PFS in patients undergoing immune checkpoint inhibitor therapies stratified by G1 / PD-L1+ tumors (blue) and remaining patients for whom their PD-L1 tumor status is known (red).Same as (A) but including all patients in the study cohort. Remaining patients (red) also included G1 patients with PD-L1 low/negative tumors, G1 patients with unknown PD-L1 tumor status and G2 patients with either PD-L1+ or PD-L1 negative tumors."}
{"words": ["Figure", "1B", "Equilibrium", "titration", "of", "Hsf1", "binding", "to", "Alexa", "Fluor", "®", "488", "-", "labeled", "HSE", "-", "DNA", ".", "Fluorescence", "polarization", "plotted", "versus", "the", "Hsf1", "trimer", "concentration", ".", "KD", "=", "4", ".", "7", "±", "1", ".", "9", "nM", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "C", "Hsf1", "rapidly", "switches", "between", "different", "HSE", "-", "containing", "double", "stranded", "DNA", "oligonucleotides", ".", "Trimeric", "Hsf1", "was", "pre", "-", "incubated", "with", "Alexa", "Fluor", "®", "488", "-", "labeled", "HSE", "-", "DNA", "in", "MgCl2", "-", "free", "buffer", ".", "At", "timepoint", "0", "(", "arrow", ")", "buffer", ",", "4", "mM", "MgCl2", ",", "2", "mM", "ATP", "+", "4", "mM", "MgCl2", ",", "control", "DNA", "(", "DNACtrl", "at", "10", "-", "fold", "molar", "excess", "over", "HSE", "-", "DNA", ")", ",", "and", "HSE", "-", "containing", "DNA", "was", "added", "as", "indicated", "and", "fluorescence", "polarization", "followed", "over", "time", ".", "D", "Trimeric", "Hsf1", "were", "bound", "to", "HSE", "-", "DNA", "and", "the", "indicated", "components", "added", "at", "timepoint", "0", ".", "E", "Hsp70", "dissociates", "Hsf1", "from", "DNA", "with", "similar", "rates", "as", "Hsc70", ".", "Rates", "were", "determinedThe", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "Hsf1", "from", "HSE", "-", "DNA", "depends", "on", "temperature", "(", "for", "25", "°", "C", "n", "=", "6", ",", "for", "37", "°", "C", "n", "=", "5", ",", "T", "-", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "011", ")", "(", "F", ")", "The", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "Hsf1", "from", "HSE", "-", "DNA", "depends", "on", "concentration", "of", "Hsc70", "and", "DnaJB1", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "G", ")", "The", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "Hsf1", "from", "HSE", "-", "DNA", "depends", "on", "concentration", "of", "ATP", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "H", ")", "The", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "Hsf1", "from", "HSE", "-", "DNA", "depends", "on", "concentration", "of", "the", "nucleotide", "exchange", "factor", "Apg2", "(", "HSPA4", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "ANOVA", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "(", "I", ")", ".", "Shown", "are", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Equilibrium titration of Hsf1 binding to Alexa Fluor® 488-labeled HSE-DNA. Fluorescence polarization plotted versus the Hsf1 trimer concentration. KD = 4.7 ± 1.9 nM (n = 4).C Hsf1 rapidly switches between different HSE-containing double stranded DNA oligonucleotides. Trimeric Hsf1 was pre-incubated with Alexa Fluor® 488-labeled HSE-DNA in MgCl2-free buffer. At timepoint 0 (arrow) buffer, 4 mM MgCl2, 2 mM ATP+4 mM MgCl2, control DNA (DNACtrl at 10-fold molar excess over HSE-DNA), and HSE-containing DNA was added as indicated and fluorescence polarization followed over time.D Trimeric Hsf1 were bound to HSE-DNA and the indicated components added at timepoint 0.E Hsp70 dissociates Hsf1 from DNA with similar rates as Hsc70. Rates were determinedThe rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of Hsf1 from HSE-DNA depends on temperature (for 25°C n = 6, for 37°C n = 5, T-test, p = 0.011) (F)The rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of Hsf1 from HSE-DNA depends on concentration of Hsc70 and DnaJB1 (n = 3) (G)The rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of Hsf1 from HSE-DNA depends on concentration of ATP (n = 3) (H)The rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of Hsf1 from HSE-DNA depends on concentration of the nucleotide exchange factor Apg2 (HSPA4) (n = 3, ANOVA, **, p < 0.01; ****, p < 0.0001) (I). Shown are mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Standard", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "reaction", "of", "Hsf1", "from", "Alexa", "Fluor", "®", "488", "-", "labeled", "HSE", "-", "DNA", "monitored", "by", "fluorescence", "polarization", "(", "A", ")", ".", "The", "same", "reaction", "mixture", "was", "incubated", "for", "different", "time", "intervals", "as", "indicated", "by", "the", "arrows", "below", "the", "x", "-", "axis", ",", "the", "reaction", "stopped", "by", "addition", "of", "blue", "-", "native", "loading", "buffer", "and", "stored", "on", "ice", "until", "separation", "by", "blue", "-", "native", "PAGE", ",", "blotted", "onto", "a", "PVDF", "membrane", "and", "detected", "with", "an", "Hsf1", "-", "specific", "antiserum", "(", "B", ")", ".", "Lanes", "1", ",", "purified", "Hsf1", "trimer", "(", "T", ")", ";", "2", ",", "purified", "Hsf1", "monomer", "(", "M", ")", ";", "3", "-", "11", ",", "samples", "from", "the", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "Hsf1", "dissociation", "reaction", "(", "0", "to", "80", "min", ")", ";", "12", "-", "15", ",", "Dissociation", "reaction", "incubated", "for", "80", "min", "missing", "individual", "components", "as", "indicated", ".", "HO", ",", "higher", "order", "oligomers", ";", "T", ",", "trimer", ";", "D", ",", "dimer", ";", "M", ",", "mono", "­", "mer", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "amounts", "of", "Hsf1", "species", "of", "the", "blot", "shown", "in", "(", "B", ")", "and", "five", "similar", "blots", ".", "For", "each", "lane", "the", "intensities", "of", "the", "two", "areas", "indicated", "by", "the", "brackets", "to", "the", "right", "were", "integrated", ";", "upper", "bracket", ",", "DNA", "bound", "timers", "and", "higher", "order", "oligomers", "(", "Hsf1b", ")", ";", "lower", "bracket", ",", "monomers", "and", "Hsf1", "-", "species", "possibly", "bound", "by", "Hsc70", "or", "DnaJB1", "or", "both", "dissociated", "from", "DNA", "(", "Hsf1d", ")", ".", "Shown", "are", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Inset", ",", "deoligomerization", "rate", "as", "determined", "by", "fitting", "an", "exponential", "decay", "function", "to", "the", "data", ".", "Shown", "are", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,B Standard Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation reaction of Hsf1 from Alexa Fluor® 488-labeled HSE-DNA monitored by fluorescence polarization (A). The same reaction mixture was incubated for different time intervals as indicated by the arrows below the x-axis, the reaction stopped by addition of blue-native loading buffer and stored on ice until separation by blue-native PAGE, blotted onto a PVDF membrane and detected with an Hsf1-specific antiserum (B). Lanes 1, purified Hsf1 trimer (T); 2, purified Hsf1 monomer (M); 3-11, samples from the Hsc70/DnaJB1-mediated Hsf1 dissociation reaction (0 to 80 min); 12-15, Dissociation reaction incubated for 80 min missing individual components as indicated. HO, higher order oligomers; T, trimer; D, dimer; M, mono­mer. C Quantification of the amounts of Hsf1 species of the blot shown in (B) and five similar blots. For each lane the intensities of the two areas indicated by the brackets to the right were integrated; upper bracket, DNA bound timers and higher order oligomers (Hsf1b); lower bracket, monomers and Hsf1-species possibly bound by Hsc70 or DnaJB1 or both dissociated from DNA (Hsf1d). Shown are means ± SD (n = 3). Inset, deoligomerization rate as determined by fitting an exponential decay function to the data. Shown are means ± SD (n = 3) "}
{"words": ["Figure", "3C", "Fit", "of", "two", "Gaussian", "distributions", "to", "the", "peak", "intensities", "for", "peptic", "peptides", "159", "-", "168", "(", "left", ")", ",", "169", "-", "175", "(", "middle", ")", ",", "and", "176", "-", "189", "(", "right", ")", ".", "Representative", "plots", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "E", "Relative", "deuteron", "incorporation", "of", "the", "low", "(", "solid", "bars", ")", "and", "high", "(", "open", "bars", ")", "exchanging", "subpopulations", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C Fit of two Gaussian distributions to the peak intensities for peptic peptides 159-168 (left), 169-175 (middle), and 176-189 (right). Representative plots of 3 independent experiments.E Relative deuteron incorporation of the low (solid bars) and high (open bars) exchanging subpopulations."}
{"words": ["Figure", "4B", "KD", "values", "for", "the", "indicated", "peptides", "as", "determined", "by", "fluorescence", "polarization", ".", "Peptides", "N74", "-", "Q86", "-", "C", "(", "NMYGFRKVVHIEQC", ")", ",", "P223", "-", "H235", "-", "C", "(", "PKYSRQFSLEHVHC", ")", "and", "A343", "-", "R352", "-", "C", "(", "ASVTALTDARC", ")", "represent", "the", "most", "hydrophobic", "part", "of", "HX", "protected", "segments", "78", "-", "98", ",", "229", "-", "252", ",", "and", "347", "-", "375", ",", "respectively", ";", "N200", "-", "K208", "-", "C", "(", "NRILGVKRKC", ")", ",", "N200", "-", "K208", "-", "C", "_", "SSS", "(", "NRSSGSKRKC", ")", ",", "G204", "-", "N214", "-", "C", "(", "GVKRKIPLMLNC", ")", ",", "and", "G204", "-", "N214", "-", "C", "_", "SSS", "(", "GVKRKSPSMSNC", ")", "represent", "the", "two", "potential", "Hsc70", "binding", "sites", "in", "segment", "202", "-", "213", "in", "original", "sequence", "or", "with", "hydrophobic", "residues", "replaced", "by", "serine", ";", "S461", "-", "Q471", "-", "C", "(", "SGKQLVHYTAQC", ")", "and", "Y468", "-", "S480", "-", "C", "(", "YTAQPLFLLDPGSC", ")", "represent", "the", "two", "potential", "Hsc70", "binding", "sites", "in", "segment", "442", "-", "474", ".", "C", "Hsf1", "(", "1", "-", "408", ")", "with", "a", "deleted", "TAD", "is", "dissociated", "from", "HSE", "-", "DNA", "by", "Hsc70", ",", "DnaJB1", "and", "ATP", "with", "similar", "rates", "as", "Hsf1wt", ".", "Fluorescence", "polarization", "assays", "containing", "Alexa", "Fluor", "®", "488", "-", "HSE", "-", "DNA", "bound", "Hsf1", "(", "1", "-", "408", ")", "trimers", "and", "the", "indicated", "components", ".", "D", "The", "HR", "-", "B", "proximal", "Hsc70", "binding", "site", "is", "essential", "for", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "HSE", "-", "DNA", "bound", "Hsf1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B KD values for the indicated peptides as determined by fluorescence polarization. Peptides N74-Q86-C (NMYGFRKVVHIEQC), P223-H235-C (PKYSRQFSLEHVHC) and A343-R352-C (ASVTALTDARC) represent the most hydrophobic part of HX protected segments 78-98, 229-252, and 347-375, respectively; N200-K208-C (NRILGVKRKC), N200-K208-C_SSS (NRSSGSKRKC), G204-N214-C (GVKRKIPLMLNC), and G204-N214-C_SSS (GVKRKSPSMSNC) represent the two potential Hsc70 binding sites in segment 202-213 in original sequence or with hydrophobic residues replaced by serine; S461-Q471-C (SGKQLVHYTAQC) and Y468-S480-C (YTAQPLFLLDPGSC) represent the two potential Hsc70 binding sites in segment 442-474.C Hsf1(1-408) with a deleted TAD is dissociated from HSE-DNA by Hsc70, DnaJB1 and ATP with similar rates as Hsf1wt. Fluorescence polarization assays containing Alexa Fluor® 488-HSE-DNA bound Hsf1(1-408) trimers and the indicated components.D The HR-B proximal Hsc70 binding site is essential for Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of HSE-DNA bound Hsf1."}
{"words": ["Figure", "5A", "The", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "HSE", "-", "DNA", "bound", "Hsf1", "depends", "on", "the", "number", "of", "HR", "-", "B", "proximal", "Hsc70", "binding", "sites", "in", "the", "Hsf1", "trimer", ".", "Hsf1wt", "(", "wt", ")", "and", "Hsf1", "∆", "(", "202", "-", "213", ")", "(", "∆", ")", "monomers", "were", "mixed", "in", "the", "indicated", "ratios", "and", "heat", "shocked", "at", "42", "°", "C", "for", "10", "min", "to", "form", "mixtures", "of", "different", "homo", "-", "and", "heterotrimers", "as", "indicated", "with", "the", "cartoons", "(", "the", "red", "line", "and", "the", "arrow", "head", "indicate", "the", "Hsc70", "binding", "site", ")", ".", "Numbers", "indicate", "the", "relative", "fraction", "of", "the", "different", "species", ".", "B", "Moving", "the", "Hsc70", "binding", "site", "away", "from", "the", "trimerization", "domain", "reduces", "the", "rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "HSE", "-", "DNA", "-", "bound", "Hsf1", ".", "Hsf1", "_", "t10", "/", "20", "/", "30", ",", "region", "202", "-", "213", "moved", "by", "10", ",", "20", ",", "or", "30", "residues", "towards", "the", "C", "-", "terminus", ".", "C", "Anti", "-", "FLAG", "antibodies", "are", "not", "able", "to", "dissociate", "HSE", "-", "DNA", "-", "bound", "Hsf1", ".", "Red", "lines", "in", "the", "cartoon", "indicate", "the", "Hsc70", "binding", "site", ";", "blue", "lines", "and", "arrow", "head", "indicate", "the", "inserted", "FLAG", "epitope", "DYKDDDDK", ".", "Hsf1", "_", "i201", "/", "211", "/", "221", ",", "FLAG", "-", "epitope", "inserted", "after", "residue", "201", ",", "211", "or", "221", ".", "Anti", "-", "FLAG", "antibodies", "were", "split", "in", "halfmers", "by", "incubation", "with", "2", "mM", "DTTAnti", "-", "FLAG", "antibody", "halfmers", "bound", "to", "FLAG", "-", "epitope", "containing", "Hsf1", "variants", ".", "Hsf1wt", "and", "FLAG", "-", "insertion", "variants", "were", "analyzed", "by", "blue", "-", "native", "gel", "electrophoresis", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "DTT", "-", "treated", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", "as", "indicated", "and", "Hsf1", "detected", "by", "immunoblotting", ";", "t", "-", "bound", ",", "FLAG", "antibody", "-", "bound", "Hsf1", "trimers", ";", "m", "-", "bound", ",", "FLAG", "antibody", "bound", "Hsf1", "monomer", ".", "F", "Trimer", "-", "to", "-", "monomer", "ratio", "of", "freshly", "purified", "Hsf1wt", "and", "Hsf1", "-", "I190S", ",", "I194S", "in", "the", "absence", "of", "heat", "shock", ",", "determined", "by", "gel", "filtration", "and", "BN", "-", "GelG", "Rate", "of", "Hsc70", "/", "DnaJB1", "-", "mediated", "dissociation", "of", "HSE", "-", "DNA", "bound", "Hsf1wt", "and", "Hsf1", "-", "I190S", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A The rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of HSE-DNA bound Hsf1 depends on the number of HR-B proximal Hsc70 binding sites in the Hsf1 trimer. Hsf1wt (wt) and Hsf1∆(202-213) (∆) monomers were mixed in the indicated ratios and heat shocked at 42°C for 10 min to form mixtures of different homo- and heterotrimers as indicated with the cartoons (the red line and the arrow head indicate the Hsc70 binding site). Numbers indicate the relative fraction of the different species.B Moving the Hsc70 binding site away from the trimerization domain reduces the rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of HSE-DNA-bound Hsf1. Hsf1_t10/20/30, region 202-213 moved by 10, 20, or 30 residues towards the C-terminus.C Anti-FLAG antibodies are not able to dissociate HSE-DNA-bound Hsf1. Red lines in the cartoon indicate the Hsc70 binding site; blue lines and arrow head indicate the inserted FLAG epitope DYKDDDDK. Hsf1_i201/211/221, FLAG-epitope inserted after residue 201, 211 or 221. Anti-FLAG antibodies were split in halfmers by incubation with 2 mM DTTAnti-FLAG antibody halfmers bound to FLAG-epitope containing Hsf1 variants. Hsf1wt and FLAG-insertion variants were analyzed by blue-native gel electrophoresis in the absence or presence of DTT-treated anti-FLAG antibodies as indicated and Hsf1 detected by immunoblotting; t-bound, FLAG antibody-bound Hsf1 trimers; m-bound, FLAG antibody bound Hsf1 monomer.F Trimer-to-monomer ratio of freshly purified Hsf1wt and Hsf1-I190S,I194S in the absence of heat shock, determined by gel filtration and BN-GelG Rate of Hsc70/DnaJB1-mediated dissociation of HSE-DNA bound Hsf1wt and Hsf1-I190S,I194S"}
{"words": ["Figure", "6A", "Schematics", "of", "the", "used", "system", ".", "MEFs", ",", "in", "which", "HSF1", "on", "chromosome", "8", "was", "deleted", ",", "were", "stably", "transfected", "with", "mTag", "-", "BFP", "expressed", "under", "the", "control", "of", "the", "HSPA6", "promoter", "and", "subsequently", "transiently", "transfected", "with", "plasmids", "that", "expressed", "HSF1wt", "or", "mutant", "variants", "in", "an", "artificial", "operon", "with", "hrGFP", ",", "which", "is", "translated", "from", "an", "IRES", "element", ".", "B", "Exemplary", "flow", "cytometry", "data", "plotting", "BFP", "fluorescence", "versus", "GFP", "fluorescence", ",", "indicating", "the", "gates", "used", "for", "analysis", ".", "Numbers", "indicate", "the", "fraction", "(", "%", ")", "of", "cells", "(", "forward", "scatter", "singlets", ")", "in", "each", "gate", ".", "Color", "indicates", "the", "cell", "density", "from", "dark", "blue", "(", "low", ")", "to", "red", "(", "high", ")", ".", "C", "-", "H", "Geometric", "mean", "of", "BFP", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "GFP", "fluorescence", "(", "D", ",", "F", ",", "H", ")", "of", "cells", "grown", "at", "37", "°", "C", "(", "non", "-", "stress", ",", "NS", ")", "or", "incubated", "for", "1", "h", "at", "43", "°", "C", "with", "a", "recovery", "period", "of", "3", "h", "at", "37", "°", "C", "(", "heat", "shocked", ",", "HS", ")", "in", "the", "GFPhigh", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "GFPlow", "(", "E", ",", "F", ")", ",", "and", "GFPlow", "-", "BFPhigh", "(", "H", ")", "gates", ".", "(", "G", ")", "Geometric", "mean", "of", "BFP", "fluorescence", "weighted", "by", "the", "relative", "number", "of", "cells", "in", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh", "gate", "(", "fluorescence", "*", "fraction", "forward", "scatter", "singlets", ")", ".", "Note", "that", "the", "GFPlow", "gate", "also", "comprises", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh", "gate", ".", "Hsf1", "-", "202SSS", ",", "Hsf1", "-", "I202S", ",", "L203S", ",", "V205S", ";", "Hsf1", "-", "209SSS", ",", "Hsf1", "-", "I209S", ",", "L211S", ",", "L213S", ";", "Hsf1", "-", "427SSSS", ",", "Hsf1", "-", "M427S", ",", "L429S", ",", "L432S", ",", "L436S", ";", "Hsf1", "-", "465SSS", ",", "Hsf1", "-", "L465S", ",", "V466S", ",", "Y468S", ";", "Hsf1", "-", "473SSSS", ",", "Hsf1", "-", "L473S", ",", "F474S", ",", "L475S", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Schematics of the used system. MEFs, in which HSF1 on chromosome 8 was deleted, were stably transfected with mTag-BFP expressed under the control of the HSPA6 promoter and subsequently transiently transfected with plasmids that expressed HSF1wt or mutant variants in an artificial operon with hrGFP, which is translated from an IRES element. B Exemplary flow cytometry data plotting BFP fluorescence versus GFP fluorescence, indicating the gates used for analysis. Numbers indicate the fraction (%) of cells (forward scatter singlets) in each gate. Color indicates the cell density from dark blue (low) to red (high).C-H Geometric mean of BFP (C, E) and GFP fluorescence (D, F, H) of cells grown at 37°C (non-stress, NS) or incubated for 1 h at 43°C with a recovery period of 3 h at 37°C (heat shocked, HS) in the GFPhigh (C, D), GFPlow (E, F), and GFPlow-BFPhigh (H) gates. (G) Geometric mean of BFP fluorescence weighted by the relative number of cells in the GFPlow-BFPhigh gate (fluorescence * fraction forward scatter singlets). Note that the GFPlow gate also comprises the GFPlow-BFPhigh gate. Hsf1-202SSS, Hsf1-I202S,L203S,V205S; Hsf1-209SSS, Hsf1-I209S,L211S,L213S; Hsf1-427SSSS, Hsf1-M427S,L429S,L432S,L436S; Hsf1-465SSS, Hsf1-L465S,V466S,Y468S; Hsf1-473SSSS, Hsf1-L473S,F474S,L475S,L476S"}
{"words": ["Figure", "7A", "Schematics", "of", "the", "used", "system", ".", "HeLa", "cells", "were", "stably", "transfected", "with", "mTag", "-", "BFP", "expressed", "under", "the", "control", "of", "the", "HSPA6", "promoter", "and", "subsequently", "transiently", "transfected", "with", "plasmids", "that", "expressed", "HSF1wt", "or", "mutant", "variants", "in", "an", "artificial", "operon", "with", "hrGFP", ",", "which", "is", "translated", "from", "an", "IRES", "element", ".", "Exemplary", "flow", "cytometry", "data", "plotting", "BFP", "fluorescence", "versus", "GFP", "fluorescence", ",", "indicating", "the", "gates", "used", "for", "analysis", ".", "Numbers", "indicate", "the", "fraction", "(", "%", ")", "of", "cells", "(", "forward", "scatter", "singlets", ")", "in", "each", "gate", ".", "Color", "indicates", "the", "cell", "density", "from", "dark", "blue", "(", "low", ")", "to", "red", "(", "high", ")", ".", "NS", ",", "cells", "grown", "at", "37", "°", "C", ";", "HS", ",", "cells", "heat", "shocked", "at", "43", "°", "C", "for", "1", "h", "with", "a", "recovery", "period", "of", "3", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "C", "-", "H", "Geometric", "mean", "of", "BFP", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "GFP", "fluorescence", "(", "D", ",", "F", ",", "H", ")", "in", "the", "GFPhigh", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "GFPlow", "(", "E", ",", "F", ")", ",", "and", "GFPlow", "-", "BFPhigh43", "(", "H", ")", "gates", ".", "Of", "note", ",", "the", "number", "of", "data", "points", "show", "the", "number", "of", "experiments", "in", "which", "a", "significant", "number", "of", "cells", "was", "found", "in", "this", "gate", "and", "missing", "bars", "indicate", "that", "cells", "did", "not", "fall", "within", "this", "gate", "in", "more", "than", "two", "out", "of", "four", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Geometric", "mean", "of", "BFP", "fluorescence", "weighted", "by", "the", "relative", "number", "of", "cells", "in", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh43", "gate", "(", "fluorescence", "*", "fraction", "forward", "scatter", "singlets", ")", ".", "Note", "that", "the", "GFPlow", "gate", "also", "comprises", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh37", "and", "that", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh37", "gate", "also", "comprises", "the", "GFPlow", "-", "BFPhigh43", "gate", ".", "Hsf1", "-", "202SSS", ",", "Hsf1", "-", "I202S", ",", "L203S", ",", "V205S", ";", "Hsf1", "-", "209SSS", ",", "Hsf1", "-", "I209S", ",", "L211S", ",", "L213S", ";", "Hsf1", "-", "427SSSS", ",", "Hsf1", "-", "M427S", ",", "L429S", ",", "L432S", ",", "L436S", ";", "Hsf1", "-", "465SSS", ",", "Hsf1", "-", "L465S", ",", "V466S", ",", "Y468S", ";", "Hsf1", "-", "473SSSS", ",", "Hsf1", "-", "L473S", ",", "F474S", ",", "L475S", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Schematics of the used system. HeLa cells were stably transfected with mTag-BFP expressed under the control of the HSPA6 promoter and subsequently transiently transfected with plasmids that expressed HSF1wt or mutant variants in an artificial operon with hrGFP, which is translated from an IRES element. Exemplary flow cytometry data plotting BFP fluorescence versus GFP fluorescence, indicating the gates used for analysis. Numbers indicate the fraction (%) of cells (forward scatter singlets) in each gate. Color indicates the cell density from dark blue (low) to red (high). NS, cells grown at 37°C; HS, cells heat shocked at 43°C for 1 h with a recovery period of 3 h at 37°C.C-H Geometric mean of BFP (C, E) and GFP fluorescence (D, F, H) in the GFPhigh (C, D), GFPlow (E, F), and GFPlow-BFPhigh43 (H) gates. Of note, the number of data points show the number of experiments in which a significant number of cells was found in this gate and missing bars indicate that cells did not fall within this gate in more than two out of four experiments. (G) Geometric mean of BFP fluorescence weighted by the relative number of cells in the GFPlow-BFPhigh43 gate (fluorescence * fraction forward scatter singlets). Note that the GFPlow gate also comprises the GFPlow-BFPhigh37 and that the GFPlow-BFPhigh37 gate also comprises the GFPlow-BFPhigh43 gate. Hsf1-202SSS, Hsf1-I202S,L203S,V205S; Hsf1-209SSS, Hsf1-I209S,L211S,L213S; Hsf1-427SSSS, Hsf1-M427S,L429S,L432S,L436S; Hsf1-465SSS, Hsf1-L465S,V466S,Y468S; Hsf1-473SSSS, Hsf1-L473S,F474S,L475S,L476S"}
{"words": ["Figure", "1At", "72", "h", "after", "transfection", "with", "siRNA", "duplexes", "for", "BAG6", "or", "control", "siRNA", "(", "10", "nM", "each", ")", ",", "the", "intracellular", "localization", "of", "TfnR", "in", "HeLa", "cells", "was", "examined", "(", "shown", "as", "green", ")", ".", "Nuclear", "DNA", "was", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "shown", "as", "blue", ")", ".", "Control", "knockdown", "(", "left", "panel", ")", ",", "Rab8a", "knockdown", "(", "center", "panel", ")", ",", "and", "BAG6", "knockdown", "(", "right", "panel", ")", ".", "Intracellular", "localization", "of", "Ptc1", "(", "green", ")", "in", "HeLa", "cells", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "shown", "as", "blue", ")", ".", "Knockdown", "of", "Rab8a", "(", "with", "Rab8a", "siRNA", "#", "1", ",", "#", "2", ",", "and", "#", "3", ")", "stimulated", "the", "accumulation", "and", "stabilization", "of", "Ptc1", "protein", "in", "HEK293", "cells", ".", "Knockdown", "of", "BAG6", "(", "with", "BAG6", "siRNA", "#", "1", ")", "stimulated", "the", "accumulation", "and", "stabilization", "of", "Ptc1", "protein", "in", "HEK293", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1At 72 h after transfection with siRNA duplexes for BAG6 or control siRNA (10 nM each), the intracellular localization of TfnR in HeLa cells was examined (shown as green). Nuclear DNA was stained with Hoechst 33342 (shown as blue). Control knockdown (left panel), Rab8a knockdown (center panel), and BAG6 knockdown (right panel).Intracellular localization of Ptc1 (green) in HeLa cells. Nuclei were stained with Hoechst 33342 (shown as blue).Knockdown of Rab8a (with Rab8a siRNA#1, #2, and #3) stimulated the accumulation and stabilization of Ptc1 protein in HEK293 cells.Knockdown of BAG6 (with BAG6 siRNA#1) stimulated the accumulation and stabilization of Ptc1 protein in HEK293 cells."}
{"words": ["Figure", "2BAG6", "protein", "co", "-", "precipitated", "Rab8a", ",", "while", "neither", "Rab7", "nor", "Rab11a", "were", "co", "-", "precipitated", "with", "BAG6", ".", "Flag", "-", "tagged", "Rab8a", ",", "Rab7", ",", "Rab11a", ",", "and", "luciferase", "-", "CL1", "(", "Lc", "-", "CL1", ";", "a", "positive", "control", ")", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "and", "the", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", ".", "Flag", "-", "immunoprecipitates", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "BAG6", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ",", "respectively", ".", "Note", "that", "all", "cells", "used", "were", "treated", "with", "10", "μM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", ".", "S", "-", "tagged", "BAG6", "pull", "-", "down", "efficiently", "co", "-", "precipitated", "Rab8a", "(", "T22N", ")", ",", "a", "GDP", "-", "bound", "mutant", ",", "while", "BAG6", "scarcely", "co", "-", "precipitated", "Rab8a", "(", "Q67L", ")", ",", "a", "constitutively", "active", "mutant", ".", "Co", "-", "precipitation", "of", "Rab8a", "WT", "with", "BAG6", "was", "used", "as", "a", "standard", ".", "MG", "-", "132", "(", "10", "μM", ")", "was", "included", "in", "the", "cell", "culture", "for", "4", "h", ",", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "the", "T22N", "mutant", "protein", "was", "expressed", "at", "lower", "levels", "than", "either", "WT", "or", "Q67L", ",", "and", "that", "this", "was", "partly", "due", "to", "increased", "degradation", ",", "as", "will", "be", "shown", "later", ".", "S", "-", "BAG6", "stands", "for", "N", "-", "terminally", "S", "-", "tagged", "BAG6", "proteinAnti", "-", "Flag", "signals", "in", "(", "C", ")", "were", "quantified", ",", "and", "relative", "signal", "intensities", "are", "presented", ".", "The", "value", "of", "the", "WT", "Rab8a", "signal", "with", "MG", "-", "132", "was", "defined", "as", "1", ".", "0", ".", "Note", "that", "all", "signal", "intensities", "of", "Flag", "-", "tag", "were", "normalized", "by", "that", "of", "the", "Rab8a", "input", "signals", ".", "A", "series", "of", "Flag", "-", "Rab8a", "mutants", "were", "immunoprecipitated", "and", "quantified", "the", "amount", "of", "endogenous", "BAG6", "that", "were", "coprecipitated", "with", "Flag", "-", "Rab8a", ".", "Note", "that", "all", "cells", "used", "were", "treated", "with", "10", "μM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", ".", "Deficiency", "of", "Rabin8", ",", "a", "GEF", "for", "Rab8a", ",", "enhanced", "the", "physical", "interaction", "between", "BAG6", "and", "WT", "Rab8a", "proteins", ".", "Flag", "-", "tagged", "WT", "Rab8a", "was", "expressed", "in", "Rabin8", "siRNA", "-", "treated", "cells", ",", "and", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "probed", "with", "an", "anti", "-", "BAG6", "antibody", ".", "Note", "that", "all", "cells", "used", "were", "treated", "with", "10", "μM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2BAG6 protein co-precipitated Rab8a, while neither Rab7 nor Rab11a were co-precipitated with BAG6. Flag-tagged Rab8a, Rab7, Rab11a, and luciferase-CL1 (Lc-CL1; a positive control) were expressed in HeLa cells and the cells were treated with 10 μM MG-132 for 4 h. Flag-immunoprecipitates were blotted with anti-BAG6 and anti-Flag antibodies, respectively. Note that all cells used were treated with 10 μM MG-132 for 4 h.S-tagged BAG6 pull-down efficiently co-precipitated Rab8a (T22N), a GDP-bound mutant, while BAG6 scarcely co-precipitated Rab8a (Q67L), a constitutively active mutant. Co-precipitation of Rab8a WT with BAG6 was used as a standard. MG-132 (10 μM) was included in the cell culture for 4 h, as indicated. Note that the T22N mutant protein was expressed at lower levels than either WT or Q67L, and that this was partly due to increased degradation, as will be shown later. S-BAG6 stands for N-terminally S-tagged BAG6 proteinAnti-Flag signals in (C) were quantified, and relative signal intensities are presented. The value of the WT Rab8a signal with MG-132 was defined as 1.0. Note that all signal intensities of Flag-tag were normalized by that of the Rab8a input signals.A series of Flag-Rab8a mutants were immunoprecipitated and quantified the amount of endogenous BAG6 that were coprecipitated with Flag-Rab8a. Note that all cells used were treated with 10 μM MG-132 for 4 h.Deficiency of Rabin8, a GEF for Rab8a, enhanced the physical interaction between BAG6 and WT Rab8a proteins. Flag-tagged WT Rab8a was expressed in Rabin8 siRNA-treated cells, and Flag immunoprecipitates were probed with an anti-BAG6 antibody. Note that all cells used were treated with 10 μM MG-132 for 4 h."}
{"words": ["Figure", "3C", "-", "terminal", "geranylgeranylation", "of", "Rab8a", "was", "dispensable", "for", "BAG6", "recognition", ".", "The", "N", "-", "terminal", "GTPase", "domain", "of", "Rab8a", "was", "essential", "for", "BAG6", "recognition", ".", "A", "series", "of", "Flag", "-", "tagged", "truncated", "fragments", "of", "WT", "Rab8a", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "with", "S", "-", "tagged", "BAG6", "and", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "protease", "inhibitors", "for", "4", "h", ".", "Flag", "-", "Rab8a", "substrates", "were", "immunoprecipitated", "and", "probed", "with", "an", "anti", "-", "BAG6", "antibody", ".", "Hydrophobicity", "recognition", "domain", "of", "BAG6", "(", "N465", ")", "was", "critical", "for", "Rab8a", "recognition", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "BAG6", "-", "truncated", "proteins", "used", "in", "this", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "upper", "panel", ".", "Numbers", "denote", "the", "corresponding", "amino", "acids", "of", "mammalian", "BAG6", ".", "Positions", "of", "UBL", ",", "BUILD", ",", "and", "DUF3538", "domains", ",", "which", "are", "all", "linked", "to", "hydrophobicity", "recognition", "by", "BAG6", "[", "37", "]", ",", "are", "indicated", ".", "WT", ",", "wild", "-", "type", ";", "∆", "N465", ",", "N", "-", "terminal", "465", "residues", "-", "deleted", "mutant", ";", "and", "Ν465", ",", "C", "-", "terminal", "689", "residues", "-", "deleted", "mutant", ".", "CHX", "chase", "experiments", "show", "that", "GDP", "-", "bound", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "was", "a", "highly", "labile", "protein", ",", "while", "the", "GTP", "-", "bound", "active", "mutant", "(", "Q67L", ")", "was", "a", "stable", "protein", "(", "E", ")", ".", "Instability", "of", "the", "T22N", "mutant", "was", "not", "perturbed", "by", "the", "C204S", "mutation", "(", "F", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "N", "-", "terminal", "100", "residue", "fragment", "of", "the", "Rab8a", "GTPase", "domain", "was", "sensitive", "to", "the", "proteasome", "inhibitor", ",", "while", "the", "∆", "N100", "fragment", "was", "not", ".", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "was", "polyubiquitinated", "in", "the", "presence", "of", "the", "proteasome", "inhibitor", ".", "Asterisks", "indicate", "non", "-", "specific", "bands", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C-terminal geranylgeranylation of Rab8a was dispensable for BAG6 recognition.The N-terminal GTPase domain of Rab8a was essential for BAG6 recognition. A series of Flag-tagged truncated fragments of WT Rab8a were expressed in HeLa cells with S-tagged BAG6 and treated with (+) or without (-) protease inhibitors for 4 h. Flag-Rab8a substrates were immunoprecipitated and probed with an anti-BAG6 antibody.Hydrophobicity recognition domain of BAG6 (N465) was critical for Rab8a recognition. A schematic representation of the BAG6-truncated proteins used in this experiment is shown in the upper panel. Numbers denote the corresponding amino acids of mammalian BAG6. Positions of UBL, BUILD, and DUF3538 domains, which are all linked to hydrophobicity recognition by BAG6 [37], are indicated. WT, wild-type; ∆N465, N-terminal 465 residues-deleted mutant; and Ν465, C-terminal 689 residues-deleted mutant.CHX chase experiments show that GDP-bound Rab8a (T22N) was a highly labile protein, while the GTP-bound active mutant (Q67L) was a stable protein (E). Instability of the T22N mutant was not perturbed by the C204S mutation (F). Actin was used as a loading control.N-terminal 100 residue fragment of the Rab8a GTPase domain was sensitive to the proteasome inhibitor, while the ∆N100 fragment was not.Rab8a (T22N) was polyubiquitinated in the presence of the proteasome inhibitor. Asterisks indicate non-specific bands."}
{"words": ["Figure", "4Kyte", "-", "Doolittle", "hydrophobicity", "plots", "of", "the", "complete", "amino", "acid", "sequence", "of", "human", "WT", "Rab8a", "and", "T22N", "-", "3IS", "mutant", ".", "The", "hydrophobicity", "peak", "within", "WT", "Switch", "I", "was", "abolished", "in", "the", "3IS", "mutant", "(", "indicated", "within", "the", "red", "box", ")", ".", "The", "numbers", "on", "the", "horizontal", "axis", "denote", "the", "corresponding", "amino", "acid", "positions", "in", "these", "proteins", ".", "Substitution", "of", "the", "hydrophobic", "residues", "of", "Switch", "I", "with", "hydrophilic", "residues", "(", "T22N", "3IS", ")", "abolished", "its", "binding", "to", "BAG6", "protein", ".", "Rab8a", "(", "T22N", "-", "3IS", ")", "mutant", "protein", "was", "highly", "stable", ",", "while", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "protein", "was", "quite", "unstable", "in", "HeLa", "cells", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Rab8a", "(", "T22N", "-", "3IS", ")", "mutant", "was", "not", "subject", "to", "polyubiquitin", "co", "-", "precipitation", ",", "while", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "protein", "was", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Kyte-Doolittle hydrophobicity plots of the complete amino acid sequence of human WT Rab8a and T22N-3IS mutant. The hydrophobicity peak within WT Switch I was abolished in the 3IS mutant (indicated within the red box). The numbers on the horizontal axis denote the corresponding amino acid positions in these proteins.Substitution of the hydrophobic residues of Switch I with hydrophilic residues (T22N 3IS) abolished its binding to BAG6 protein.Rab8a (T22N-3IS) mutant protein was highly stable, while Rab8a (T22N) protein was quite unstable in HeLa cells. Actin was used as a loading control.Rab8a (T22N-3IS) mutant was not subject to polyubiquitin co-precipitation, while Rab8a (T22N) protein was."}
{"words": ["Figure", "5Rab8a", "(", "T22N", ")", "protein", "accumulated", "in", "BAG6", "-", "knockdown", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "duplexes", "for", "BAG6", "or", "control", "siRNA", ".", "At", "48", "h", "after", "siRNA", "transfection", ",", "Flag", "tagged", "-", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "was", "expressed", "in", "the", "cells", ".", "At", "24", "h", "after", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "chased", "with", "50", "μg", "/", "mL", "CHX", "and", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "after", "CHX", "addition", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Anti", "-", "Flag", "blot", "signals", "in", "the", "control", "or", "BAG6", "siRNA", "-", "treated", "cells", "were", "quantified", ",", "and", "relative", "signal", "intensities", "after", "CHX", "addition", "were", "calculated", ".", "The", "value", "of", "the", "Flag", "signal", "at", "0", "h", "was", "defined", "as", "1", ".", "0", ".", "Note", "that", "all", "signal", "intensities", "of", "the", "Flag", "-", "tag", "were", "normalized", "by", "that", "of", "actin", ",", "a", "loading", "control", ",", "in", "each", "sample", ".", "Polyubiquitin", "modification", "of", "Rab8a", "was", "abolished", "in", "BAG6", "-", "knockdown", "cells", ".", "Flag", "-", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "immunoprecipitates", "were", "blotted", "with", "an", "anti", "-", "polyubiquitin", "antibody", "(", "FK2", ",", "left", "panel", ")", ".", "As", "a", "negative", "control", ",", "siRNA", "#", "1scr", "was", "used", ".", "Anti", "-", "polyubiquitin", "signals", "co", "-", "precipitated", "with", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "(", "a", "representative", "example", "is", "shown", "in", "the", "left", "panel", ")", "were", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "Note", "that", "the", "intensities", "of", "the", "co", "-", "precipitated", "polyubiquitin", "signal", "were", "normalized", "both", "by", "the", "input", "ubiquitin", "-", "signal", "and", "bait", "Flag", "-", "signal", ".", "Defective", "distribution", "of", "the", "endosomal", "protein", "TfnR", "in", "HeLa", "cells", "with", "the", "excess", "accumulation", "of", "the", "inactive", "form", "of", "Rab8a", ".", "Right", "panel", "shows", "a", "merged", "image", "of", "TfnR", "staining", "(", "shown", "as", "green", ")", ",", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "staining", "(", "magenta", ")", ",", "and", "Hoechst", "33342", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Rab8a (T22N) protein accumulated in BAG6-knockdown cells. HeLa cells were transfected with siRNA duplexes for BAG6 or control siRNA. At 48 h after siRNA transfection, Flag tagged-Rab8a (T22N) was expressed in the cells. At 24 h after Rab8a (T22N) transfection, the cells were chased with 50 μg/mL CHX and harvested at the indicated time after CHX addition. Actin was used as a loading control.Anti-Flag blot signals in the control or BAG6 siRNA-treated cells were quantified, and relative signal intensities after CHX addition were calculated. The value of the Flag signal at 0 h was defined as 1.0. Note that all signal intensities of the Flag-tag were normalized by that of actin, a loading control, in each sample.Polyubiquitin modification of Rab8a was abolished in BAG6-knockdown cells. Flag-Rab8a (T22N) immunoprecipitates were blotted with an anti-polyubiquitin antibody (FK2, left panel). As a negative control, siRNA#1scr was used. Anti-polyubiquitin signals co-precipitated with Rab8a (T22N) (a representative example is shown in the left panel) were quantified (right panel). Note that the intensities of the co-precipitated polyubiquitin signal were normalized both by the input ubiquitin-signal and bait Flag-signal.Defective distribution of the endosomal protein TfnR in HeLa cells with the excess accumulation of the inactive form of Rab8a. Right panel shows a merged image of TfnR staining (shown as green), Rab8a (T22N) staining (magenta), and Hoechst 33342 nuclear staining (blue)."}
{"words": ["Figure", "6A", "series", "of", "major", "Rab", "family", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "from", "HeLa", "cell", "extracts", "and", "then", "probed", "with", "an", "anti", "-", "BAG6", "antibody", ".", "Co", "-", "precipitation", "of", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "with", "BAG6", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "for", "this", "experiment", ".", "Quantification", "of", "BAG6", "co", "-", "precipitation", "with", "Rab", "family", "proteins", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantities", "of", "BAG6", "protein", "in", "the", "respective", "anti", "-", "Flag", "precipitates", "that", "were", "normalized", "by", "the", "amount", "of", "Flag", "-", "Rab", "bait", "proteins", ".", "The", "value", "of", "BAG6", "co", "-", "precipitation", "with", "Rab8a", "(", "T22N", ")", "was", "defined", "as", "1", ".", "0", ".", "The", "quantities", "of", "the", "respective", "immunosignals", "were", "also", "normalized", "to", "the", "actin", "signal", "of", "each", "sample", ",", "and", "represent", "the", "median", "calculated", "from", "at", "least", "3", "independent", "biological", "replicates", ".", "The", "number", "of", "independent", "biological", "replicates", "was", "as", "follows", ":", "Rab1a", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab1b", ",", "n", "=", "5", ";", "Rab2b", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab3a", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab4", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab5a", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab5b", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab6a", ",", "n", "=", "5", ";", "Rab6b", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab7a", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab8a", ",", "n", "=", "14", ";", "Rab9b", ",", "n", "=", "4", ";", "Rab10", ",", "n", "=", "6", ";", "Rab11a", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab11b", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab12", ",", "n", "=", "2", ";", "Rab13", ",", "n", "=", "6", ";", "Rab14", ",", "n", "=", "3", ";", "Rab15", ",", "n", "=", "5", ";", "Rab35", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A series of major Rab family proteins were immunoprecipitated from HeLa cell extracts and then probed with an anti-BAG6 antibody. Co-precipitation of Rab8a (T22N) with BAG6 was used as a positive control for this experiment.Quantification of BAG6 co-precipitation with Rab family proteins. The graph shows the quantities of BAG6 protein in the respective anti-Flag precipitates that were normalized by the amount of Flag-Rab bait proteins. The value of BAG6 co-precipitation with Rab8a (T22N) was defined as 1.0. The quantities of the respective immunosignals were also normalized to the actin signal of each sample, and represent the median calculated from at least 3 independent biological replicates. The number of independent biological replicates was as follows: Rab1a, n = 4; Rab1b, n = 5; Rab2b, n = 3; Rab3a, n = 4; Rab4, n = 4; Rab5a, n = 3; Rab5b, n = 4; Rab6a, n = 5; Rab6b, n = 4; Rab7a, n = 3; Rab8a, n = 14; Rab9b, n = 4; Rab10, n = 6; Rab11a, n = 3; Rab11b, n = 3; Rab12, n = 2; Rab13, n = 6; Rab14, n = 3; Rab15, n = 5; Rab35, n = 3."}
{"words": ["Figure", "7BAG6", "knockdown", "induced", "the", "abnormal", "distribution", "of", "Golgi", "apparatus", "markers", ".", "Representative", "images", "of", "the", "trans", "-", "Golgi", "membrane", "protein", "Stx6", "(", "green", ")", "in", "BAG6", "-", "suppressed", "CHO", "cells", "with", "a", "Chinese", "hamster", "-", "specific", "siRNA", "(", "cBAG6", "siRNA", "#", "2", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "(", "A", ")", ".", "Fluorescent", "signals", "were", "detected", "using", "a", "laser", "scanning", "confocal", "microscopy", "system", ".", "Nuclei", "were", "stained", "by", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "BAG6", "knockdown", "induced", "the", "abnormal", "distribution", "of", "Golgi", "apparatus", "markers", ".", "Images", "of", "the", "cis", "-", "Golgi", "membrane", "protein", "GS28", "and", "the", "cis", "-", "Golgi", "matrix", "protein", "GM130", "in", "BAG6", "-", "suppressed", "CHO", "cells", "with", "another", "Chinese", "hamster", "-", "specific", "siRNA", "(", "cBAG6", "siRNA", "#", "5", ")", ".", "GS28", "(", "green", ")", "and", "GM130", "(", "red", ")", "are", "indicated", "by", "arrowheads", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", ".", "Fluorescent", "signals", "were", "detected", "using", "a", "laser", "scanning", "confocal", "microscopy", "system", ".", "Nuclei", "were", "stained", "by", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Glycosylation", "of", "the", "IL", "-", "2Rα", "transmembrane", "protein", "was", "not", "reduced", "by", "BAG6", "knockdown", ".", "Flag", "-", "tagged", "WT", "IL", "-", "2Rα", "protein", "was", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "BAG6", "siRNA", ",", "and", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "precipitates", "were", "incubated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "unit", "of", "the", "deglycosylation", "enzyme", "PNGase", "F", ",", "and", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Low", "-", "mobility", "(", "indicated", "as", "glycosylated", ")", "and", "high", "mobility", "(", "indicated", "as", "non", "-", "glycosylated", ")", "signals", "of", "WT", "IL", "-", "2Rα", "are", "indicated", ".", "Defects", "in", "the", "distribution", "of", "cell", "surface", "glycoproteins", "in", "BAG6", "-", "suppressed", "cells", ".", "The", "graph", "quantitatively", "displays", "the", "number", "of", "fluorescence", "counts", "per", "cell", "as", "the", "mean", "±", "S", ".", "D", ".", "calculated", "from", "10", "independent", "biological", "replicates", "(", "E", ")", ".", "Defects", "in", "the", "distribution", "of", "cell", "surface", "glycoproteins", "in", "BAG6", "-", "suppressed", "cells", ".", "Lectin", "GS", "-", "II", "-", "derived", "cell", "surface", "signals", "were", "counted", "using", "ImageJ", "software", ".", "SRP54", "knockdown", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "for", "this", "experiment", "t", "-", "test", ")", ".", "Cell", "surface", "fluorescent", "signals", "were", "detected", "by", "confocal", "microscopy", "without", "plasma", "membrane", "permeabilization", ".", "BAG6", "siRNA", "down", "-", "regulated", "the", "cell", "surface", "expression", "of", "glycoproteins", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7BAG6 knockdown induced the abnormal distribution of Golgi apparatus markers. Representative images of the trans-Golgi membrane protein Stx6 (green) in BAG6-suppressed CHO cells with a Chinese hamster-specific siRNA (cBAG6 siRNA#2). Scale bar: 10 μm (A). Fluorescent signals were detected using a laser scanning confocal microscopy system. Nuclei were stained by Hoechst (blue).BAG6 knockdown induced the abnormal distribution of Golgi apparatus markers. Images of the cis-Golgi membrane protein GS28 and the cis-Golgi matrix protein GM130 in BAG6-suppressed CHO cells with another Chinese hamster-specific siRNA (cBAG6 siRNA#5). GS28 (green) and GM130 (red) are indicated by arrowheads. Scale bar: 10 μm. (B). Fluorescent signals were detected using a laser scanning confocal microscopy system. Nuclei were stained by Hoechst (blue).Glycosylation of the IL-2Rα transmembrane protein was not reduced by BAG6 knockdown. Flag-tagged WT IL-2Rα protein was expressed in HeLa cells with (+) or without (-) BAG6 siRNA, and was immunoprecipitated with an anti-Flag antibody. The precipitates were incubated with (+) or without (-) 10 unit of the deglycosylation enzyme PNGase F, and subjected to Western blot analysis with an anti-Flag antibody. Low-mobility (indicated as glycosylated) and high mobility (indicated as non-glycosylated) signals of WT IL-2Rα are indicated.Defects in the distribution of cell surface glycoproteins in BAG6-suppressed cells. The graph quantitatively displays the number of fluorescence counts per cell as the mean ± S.D. calculated from 10 independent biological replicates (E).Defects in the distribution of cell surface glycoproteins in BAG6-suppressed cells. Lectin GS-II-derived cell surface signals were counted using ImageJ software. SRP54 knockdown was used as a positive control for this experiment t-test). Cell surface fluorescent signals were detected by confocal microscopy without plasma membrane permeabilization. BAG6 siRNA down-regulated the cell surface expression of glycoproteins (F)."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Densitometric", "analysis", "relative", "to", "actin", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "stable", "inducible", "PC12", "cell", "line", "expressing", "A53T", "α", "-", "synuclein", ".", "Transgene", "expression", "was", "induced", "with", "doxycycline", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "switched", "off", "(", "by", "removing", "doxycycline", ")", ",", "with", "drug", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", "treatment", "for", "24", "h", ".", "Control", "condition", "is", "set", "to", "100", "%", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "b", ")", "Densitometric", "analysis", "relative", "to", "actin", "of", "soluble", "EGFP", "-", "HDQ74", "clearance", "in", "stable", "inducible", "PC12", "cell", "line", "expressing", "EGFP", "-", "HDQ74", ".", "Transgene", "expression", "was", "induced", "with", "doxycycline", "for", "8", "h", ",", "and", "then", "switched", "off", "(", "by", "removing", "doxycycline", ")", "with", "drug", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", "treatment", "for", "96", "h", ".", "Control", "condition", "is", "set", "to", "100", "%", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "c", ")", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "construct", "for", "4", "h", "were", "treated", "with", "drugs", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "aggregates", "or", "cell", "death", "were", "expressed", "as", "odds", "ratios", "and", "the", "control", "was", "taken", "as", "1", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "d", ")", "PC12", "cells", "were", "treated", "with", "clonidine", ",", "minoxidil", "and", "verapamil", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", "for", "24", "h", ".", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "with", "anti", "-", "LC3", "antibody", "and", "quantified", "relative", "to", "actin", ".", "Rapamycin", "(", "0", ".", "2", "μM", ")", "was", "positive", "control", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "e", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "in", "wild", "-", "type", "(", "Atg5", "+", "/", "+", ")", "and", "knockout", "(", "Atg5", "−", "/", "−", ")", "Atg5", "MEFs", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "for", "4", "h", "and", "then", "treated", "for", "48", "h", "with", "drugs", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", ".", "(", "a", ")", "Densitometric", "analysis", "relative", "to", "actin", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "stable", "inducible", "PC12", "cell", "line", "expressing", "A53T", "α", "-", "synuclein", ".", "Transgene", "expression", "was", "induced", "with", "doxycycline", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "switched", "off", "(", "by", "removing", "doxycycline", ")", ",", "with", "drug", "(", "all", "1", "μM", ")", "or", "DMSO", "(", "control", ")", "treatment", "for", "24", "h", ".", "Control", "condition", "is", "set", "to", "100", "%", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Densitometric analysis relative to actin of A53T α-synuclein clearance in stable inducible PC12 cell line expressing A53T α-synuclein. Transgene expression was induced with doxycycline for 48 h, and then switched off (by removing doxycycline), with drug (all 1 μM) or DMSO (control) treatment for 24 h. Control condition is set to 100%. Error bars show s.e.m.(b) Densitometric analysis relative to actin of soluble EGFP-HDQ74 clearance in stable inducible PC12 cell line expressing EGFP-HDQ74. Transgene expression was induced with doxycycline for 8 h, and then switched off (by removing doxycycline) with drug (all 1 μM) or DMSO (control) treatment for 96 h. Control condition is set to 100%. Error bars show s.e.m.(c) SK-N-SH cells transfected with EGFP-HDQ74 construct for 4 h were treated with drugs (all 1 μM) or DMSO (control) for 48 h post-transfection. The proportions of EGFP-positive cells with aggregates or cell death were expressed as odds ratios and the control was taken as 1. Error bars show 95% confidence interval.(d) PC12 cells were treated with clonidine, minoxidil and verapamil (all 1 μM) or DMSO (control) for 24 h. Endogenous LC3-II levels were detected with anti-LC3 antibody and quantified relative to actin. Rapamycin (0.2 μM) was positive control. Error bars show s.e.m.(e) The proportions of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates in wild-type (Atg5+/+) and knockout (Atg5−/−) Atg5 MEFs, transfected with EGFP-HDQ74 for 4 h and then treated for 48 h with drugs (all 1 μM) or DMSO (control). Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant.(a) Densitometric analysis relative to actin of A53T α-synuclein clearance in stable inducible PC12 cell line expressing A53T α-synuclein. Transgene expression was induced with doxycycline for 48 h, and then switched off (by removing doxycycline), with drug (all 1 μM) or DMSO (control) treatment for 24 h. Control condition is set to 100%. Error bars show s.e.m."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1a", ",", "treated", "with", "or", "without", "1", "μM", "rilmenidine", ",", "1", "mM", "dibutyl", "-", "cAMP", "(", "db", "-", "cAMP", ")", ",", "24", "μM", "forskolin", "or", "500", "μM", "2", "′", "5", "′", "-", "dideoxyadenosine", "(", "2", "′", "5", "′", "ddA", ")", "for", "24", "h", ".", "Note", "that", "control", "clearance", "levels", "for", "a", "given", "substrate", "may", "vary", "from", "figure", "to", "figure", ",", "due", "to", "different", "exposures", "of", "blots", ",", "which", "aid", "illustration", "of", "agents", "that", "either", "increase", "or", "retard", "clearance", ".", "(", "b", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "in", "SK", "-", "N", "-", "SH", "(", "for", "rilmenidine", ")", "and", "COS", "-", "7", "(", "for", "db", "-", "cAMP", ",", "forskolin", "and", "2", "′", "5", "′", "ddA", ")", "cells", "as", "in", "Figure", "1c", ",", "treated", "with", "concentrations", "used", "in", "a", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "PC12", "cells", "treated", "with", "1", "μM", "rilmenidine", "or", "500", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", "for", "24", "h", ".", "(", "d", ")", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1a", ",", "treated", "with", "or", "without", "8", "-", "CPT", "-", "2Me", "-", "cAMP", "or", "6", "-", "Bnz", "-", "cAMP", "(", "1", "μM", "or", "10", "μM", ")", ".", "(", "e", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "aggregates", "as", "in", "Figure", "1c", ",", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "8", "-", "CPT", "-", "2Me", "-", "cAMP", "or", "6", "-", "Bnz", "-", "cAMP", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "f", ")", "COS", "-", "7", "cells", ",", "transfected", "for", "4", "h", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "along", "with", "empty", "vector", "(", "pcDNA3", ".", "1", ")", ",", "dominant", "-", "negative", "S17N", "Rap2B", "(", "DN", "Rap2B", ")", "or", "wild", "-", "type", "PLC", "-", "ε", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", ",", "were", "assessed", "for", "the", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "aggregates", "after", "48", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "g", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "a", "dominant", "-", "negative", "Rap2B", "(", "DN", "Rap2B", ")", "for", "4", "h", "were", "assessed", "after", "48", "h", "expression", ".", "(", "h", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "aggregates", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "along", "with", "empty", "vector", "(", "pcDNA3", ".", "1", ")", "or", "dominant", "-", "negative", "Rap2B", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", ",", "were", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "8", "-", "CPT", "-", "2Me", "-", "cAMP", "for", "48", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "i", ")", "COS", "-", "7", "cells", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "dsRed2", "or", "cytosolic", "dsRed2", "-", "IP3", "kinase", "A", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", ",", "were", "assessed", "at", "48", "h", "post", "-", "transfection", "for", "aggregation", "and", "cell", "death", "(", "as", "in", "Fig", ".", "1c", ")", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) A53T α-synuclein clearance in stable PC12 cells as in Figure 1a, treated with or without 1 μM rilmenidine, 1 mM dibutyl-cAMP (db-cAMP), 24 μM forskolin or 500 μM 2′5′-dideoxyadenosine (2′5′ddA) for 24 h. Note that control clearance levels for a given substrate may vary from figure to figure, due to different exposures of blots, which aid illustration of agents that either increase or retard clearance.(b) The proportions of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates in SK-N-SH (for rilmenidine) and COS-7 (for db-cAMP, forskolin and 2′5′ddA) cells as in Figure 1c, treated with concentrations used in a for 48 h post-transfection. Error bars show 95% confidence interval.(c) Endogenous LC3-II levels in PC12 cells treated with 1 μM rilmenidine or 500 μM 2′5′ddA for 24 h.(d) A53T α-synuclein clearance in stable PC12 cells as in Figure 1a, treated with or without 8-CPT-2Me-cAMP or 6-Bnz-cAMP (1 μM or 10 μM).(e) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with aggregates as in Figure 1c, treated with or without 10 μM 8-CPT-2Me-cAMP or 6-Bnz-cAMP for 48 h post-transfection. Error bars show 95% confidence interval.(f) COS-7 cells, transfected for 4 h with EGFP-HDQ74 along with empty vector (pcDNA3.1), dominant-negative S17N Rap2B (DN Rap2B) or wild-type PLC-ε (1:3 ratio), were assessed for the proportions of EGFP-positive cells with aggregates after 48 h. Error bars show 95% confidence interval.(g) Endogenous LC3-II levels in COS-7 cells transfected with a dominant-negative Rap2B (DN Rap2B) for 4 h were assessed after 48 h expression.(h) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with aggregates, transfected with EGFP-HDQ74 along with empty vector (pcDNA3.1) or dominant-negative Rap2B (1:3 ratio) for 4 h, were treated with or without 10 μM 8-CPT-2Me-cAMP for 48 h. Error bars show 95% confidence interval.(i) COS-7 cells, transfected with EGFP-HDQ74 and dsRed2 or cytosolic dsRed2-IP3 kinase A (1:3 ratio) for 4 h, were assessed at 48 h post-transfection for aggregation and cell death (as in Fig. 1c). Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "were", "pretreated", "with", "or", "without", "10", ",", "15", "or", "20", "μM", "calpastatin", "for", "15", "min", "followed", "by", "addition", "of", "1", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", "for", "4", "h", ".", "Calpain", "activity", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "calpain", "small", "subunit", "antibody", ".", "Densitometry", "analysis", "is", "relative", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "b", ")", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "for", "4", "h", ",", "then", "pretreated", "with", "or", "without", "10", ",", "15", "or", "20", "μM", "calpastatin", "for", "15", "min", "followed", "by", "addition", "of", "1", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ",", "were", "assessed", "for", "the", "proportion", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "were", "pretreated", "with", "or", "without", "10", ",", "15", "or", "20", "μM", "calpastatin", "for", "15", "min", "followed", "by", "addition", "of", "1", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", "for", "4", "h", ".", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "(", "d", ")", "Comparison", "between", "calpain", "activity", ",", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregation", "and", "autophagosomes", "as", "seen", "in", "a", "-", "c", ".", "The", "control", "condition", "for", "all", "the", "assessments", "was", "set", "at", "100", "%", ".", "Calpastatin", "lowered", "the", "increased", "calpain", "activity", "and", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregation", "caused", "by", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", "with", "a", "simultaneous", "increase", "in", "LC3", "-", "II", "levels", "(", "autophagosomes", ")", ".", "(", "e", ")", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "pcDNA3", ".", "1", ")", "or", "wild", "-", "type", "PLC", "-", "ε", "for", "4", "h", "and", "treated", "with", "or", "without", "50", "μM", "calpeptin", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", "were", "assessed", "for", "the", "proportion", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) SK-N-SH cells were pretreated with or without 10, 15 or 20 μM calpastatin for 15 min followed by addition of 1 μM (±)-Bay K8644 for 4 h. Calpain activity was detected by immunoblotting with anti-calpain small subunit antibody. Densitometry analysis is relative to actin. Error bars show s.e.m.(b) SK-N-SH cells transfected with EGFP-HDQ74 for 4 h, then pretreated with or without 10, 15 or 20 μM calpastatin for 15 min followed by addition of 1 μM (±)-Bay K8644 for 48 h post-transfection, were assessed for the proportion of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates. Error bars show 95% confidence interval.(c) SK-N-SH cells were pretreated with or without 10, 15 or 20 μM calpastatin for 15 min followed by addition of 1 μM (±)-Bay K8644 for 4 h. Endogenous LC3-II levels were detected by immunoblotting with anti-LC3 antibody.(d) Comparison between calpain activity, EGFP-HDQ74 aggregation and autophagosomes as seen in a-c. The control condition for all the assessments was set at 100%. Calpastatin lowered the increased calpain activity and EGFP-HDQ74 aggregation caused by (±)-Bay K8644 in a dose-dependent manner with a simultaneous increase in LC3-II levels (autophagosomes).(e) COS-7 cells transfected with empty vector (pcDNA3.1) or wild-type PLC-ε for 4 h and treated with or without 50 μM calpeptin for 48 h post-transfection were assessed for the proportion of EGFP-positive cells with EGFP-HDQ74 aggregates. Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "or", "cell", "death", "as", "in", "Figure", "1c", ",", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", ",", "50", "μM", "N", "-", "acetyl", "-", "Leu", "-", "Leu", "-", "methional", "(", "ALLM", ")", "or", "50", "μM", "calpeptin", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "DMSO", "was", "control", "for", "ALLM", "and", "calpeptin", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "construct", "along", "with", "siGLO", "(", "control", "siRNA", ")", "in", "presence", "or", "absence", "of", "calpain", "1", "or", "calpain", "2", "siRNA", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "96", "h", ".", "EGFP", "-", "and", "siGLO", "-", "positive", "cells", "were", "assessed", "for", "aggregation", "and", "cell", "death", "as", "in", "Figure", "1c", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "HeLa", "cells", ",", "transfected", "with", "siGLO", "or", "siRNAs", "for", "calpain", "1", "or", "calpain", "2", "for", "96", "h", ",", "were", "analyzed", "with", "anti", "-", "calpain", "1", "or", "anti", "-", "calpain", "2", "domain", "III", "antibodies", ".", "(", "d", ")", "Clearance", "of", "soluble", "EGFP", "-", "HDQ74", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1b", ",", "treated", "with", "drugs", "(", "concentrations", "in", "a", ")", "for", "96", "h", ".", "Densitometry", "is", "relative", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "e", ")", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "undifferentiated", "or", "nonmitotic", "neuronally", "differentiated", "(", "with", "100", "ng", "ml", "-", "1", "nerve", "growth", "factor", "for", "5", "d", ")", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1a", ",", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", "for", "24", "h", ".", "Densitometry", "is", "relative", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "f", ")", "COS", "-", "7", "cells", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "along", "with", "empty", "vector", "(", "pcDNA3", ".", "1", ")", "or", "constitutive", "active", "(", "CA", ")", "m", "-", "calpain", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "48", "h", ",", "were", "assessed", "for", "aggregation", "and", "cell", "death", "as", "in", "Figure", "1c", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "g", ")", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "along", "with", "empty", "vector", "(", "pcDNA3", ".", "1", ")", "or", "constitutive", "active", "m", "-", "calpain", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", ",", "were", "subsequently", "treated", "with", "DMSO", "(", "control", ")", ",", "1", "μM", "verapamil", "or", "1", "μM", "clonidine", "for", "48", "h", ".", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "aggregates", "were", "assessed", "as", "in", "Figure", "1c", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) The proportions of EGFP-positive SK-N-SH cells with EGFP-HDQ74 aggregates or cell death as in Figure 1c, treated with or without 10 μM calpastatin, 50 μM N-acetyl-Leu-Leu-methional (ALLM) or 50 μM calpeptin for 48 h post-transfection. DMSO was control for ALLM and calpeptin. Error bars show 95% confidence interval.(b) HeLa cells were transfected with EGFP-HDQ74 construct along with siGLO (control siRNA) in presence or absence of calpain 1 or calpain 2 siRNA (1:3 ratio) for 96 h. EGFP- and siGLO-positive cells were assessed for aggregation and cell death as in Figure 1c. Error bars show 95% confidence interval.(c) HeLa cells, transfected with siGLO or siRNAs for calpain 1 or calpain 2 for 96 h, were analyzed with anti-calpain 1 or anti-calpain 2 domain III antibodies.(d) Clearance of soluble EGFP-HDQ74 in stable PC12 cells as in Figure 1b, treated with drugs (concentrations in a) for 96 h. Densitometry is relative to actin. Error bars show s.e.m.(e) A53T α-synuclein clearance in undifferentiated or nonmitotic neuronally differentiated (with 100 ng ml-1 nerve growth factor for 5 d) stable PC12 cells as in Figure 1a, treated with or without 10 μM calpastatin for 24 h. Densitometry is relative to actin. Error bars show s.e.m.(f) COS-7 cells, transfected with EGFP-HDQ74 along with empty vector (pcDNA3.1) or constitutive active (CA) m-calpain (1:3 ratio) for 48 h, were assessed for aggregation and cell death as in Figure 1c. Error bars show 95% confidence interval.(g) SK-N-SH cells, transfected with EGFP-HDQ74 along with empty vector (pcDNA3.1) or constitutive active m-calpain (1:3 ratio) for 4 h, were subsequently treated with DMSO (control), 1 μM verapamil or 1 μM clonidine for 48 h. The proportions of EGFP-positive cells with aggregates were assessed as in Figure 1c. Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "MEFs", "with", "aggregates", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "in", "Atg5", "+", "/", "+", "cells", ",", "or", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "pcDNA3", ".", "1", ",", "WT", "Atg5", "or", "K130R", "Atg5", "constructs", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "cells", "for", "4", "h", "(", "1", ":", "3", "ratios", ")", ",", "were", "treated", "for", "next", "48", "h", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", ".", "All", "data", "are", "from", "the", "same", "experiment", ",", "but", "odds", "ratios", "for", "reference", "conditions", "in", "specific", "experiments", "have", "been", "set", "to", "1", ",", "to", "facilitate", "comparisons", ".", "Atg5", "-", "/", "-", "cells", "had", "increased", "EGFP", "-", "HDQ74", "aggregates", "compared", "to", "Atg5", "+", "/", "+", "cells", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "b", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siGLO", "(", "control", ")", "with", "or", "without", "calpain", "1", "siRNA", "or", "calpain", "2", "siRNA", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "96", "h", ",", "followed", "by", "transfection", "with", "EGFP", "-", "LC3", "construct", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "a", "further", "2", "h", ".", "The", "proportions", "of", "transfected", "cells", "with", ">", "5", "EGFP", "-", "LC3", "vesicles", "were", "assessed", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "or", "30", "μM", "calpastatin", "for", "24", "h", ".", "(", "d", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "LC3", "were", "treated", "for", "4", "h", "with", "400", "nM", "bafilomycin", "A1", "in", "presence", "or", "absence", "of", "10", "μM", "calpastatin", ",", "50", "μM", "ALLM", "or", "50", "μM", "calpeptin", ".", "Calpain", "inhibitors", "were", "treated", "for", "24", "h", "before", "bafilomycin", "A1", "addition", ".", "EGFP", "-", "LC3", "-", "II", "was", "detected", "with", "anti", "-", "EGFP", "antibody", ".", "Data", "from", "different", "calpain", "inhibitors", "are", "from", "different", "blots", ".", "(", "e", ")", "COS", "-", "7", "cells", ",", "transfected", "with", "myc", "-", "LC3", "and", "EGFP", "-", "C1", "with", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "or", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "m", "-", "calpain", "(", "1", ":", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", ",", "were", "analyzed", "after", "24", "h", "post", "-", "transfection", "for", "LC3", "-", "II", "levels", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "myc", "antibody", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "f", ")", "COS", "-", "7", "cells", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "LC3", "and", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "or", "CA", "m", "-", "calpain", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "fixed", "24", "h", "post", "-", "transfection", ",", "were", "assessed", "for", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", ">", "5", "EGFP", "-", "LC3", "vesicles", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) The proportions of EGFP-positive MEFs with aggregates, transfected with EGFP-HDQ74 and pcDNA3.1 (empty vector) in Atg5+/+ cells, or transfected with EGFP-HDQ74 and pcDNA3.1, WT Atg5 or K130R Atg5 constructs in Atg5-/- cells for 4 h (1:3 ratios), were treated for next 48 h with or without 10 μM calpastatin. All data are from the same experiment, but odds ratios for reference conditions in specific experiments have been set to 1, to facilitate comparisons. Atg5-/- cells had increased EGFP-HDQ74 aggregates compared to Atg5+/+ cells. Error bars show 95% confidence interval.(b) HeLa cells were transfected with siGLO (control) with or without calpain 1 siRNA or calpain 2 siRNA (1:3 ratio) for 96 h, followed by transfection with EGFP-LC3 construct for 4 h. Cells were fixed after a further 2 h. The proportions of transfected cells with >5 EGFP-LC3 vesicles were assessed. Error bars show 95% confidence interval.(c) Endogenous LC3-II levels in SK-N-SH cells treated with or without 10 μM or 30 μM calpastatin for 24 h.(d) HeLa cells stably expressing EGFP-LC3 were treated for 4 h with 400 nM bafilomycin A1 in presence or absence of 10 μM calpastatin, 50 μM ALLM or 50 μM calpeptin. Calpain inhibitors were treated for 24 h before bafilomycin A1 addition. EGFP-LC3-II was detected with anti-EGFP antibody. Data from different calpain inhibitors are from different blots.(e) COS-7 cells, transfected with myc-LC3 and EGFP-C1 with pcDNA3.1 (empty vector) or constitutively active (CA) m-calpain (1:1:3 ratio) for 4 h, were analyzed after 24 h post-transfection for LC3-II levels by immunoblotting with anti-myc antibody. Error bars show s.e.m.(f) COS-7 cells, transfected with EGFP-LC3 and pcDNA3.1 (empty vector) or CA m-calpain (1:3 ratio) for 4 h and fixed 24 h post-transfection, were assessed for proportions of EGFP-positive cells with >5 EGFP-LC3 vesicles. Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "A53T", "α", "-", "synuclein", "clearance", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1a", ",", "treated", "with", "or", "without", "100", "nM", "PACAP", ",", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", "or", "500", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", "for", "24", "h", ".", "(", "b", ")", "The", "proportion", "of", "EGFP", "-", "positive", "cells", "with", "aggregates", "in", "SK", "-", "N", "-", "SH", "cells", "as", "in", "Figure", "1c", ",", "treated", "for", "48", "h", "with", "1", "μM", "PACAP", "or", "200", "μM", "NF449", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "Aggregation", "in", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "either", "pcDNA3", ":", "1", "(", "empty", "vector", ")", "or", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "m", "-", "calpain", "and", "EGFP", "-", "HDQ74", "(", "3", ":", "1", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "then", "treated", "with", "or", "without", "500", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", "for", "48", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "d", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "Gsα", "siRNA", "for", "72", "h", "were", "analyzed", "for", "Gsα", "levels", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Gsα", "antibody", ".", "Aggregation", "was", "assessed", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "Gsα", "siRNA", "and", "EGFP", "-", "HDQ74", "for", "72", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "e", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "Gsα", "siRNA", "for", "72", "h", ".", "(", "f", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "PC12", "cells", "treated", "with", "or", "without", "200", "μM", "NF449", "for", "24", "h", ".", "(", "g", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "Gsα", "siRNA", "for", "72", "h", "and", "treated", "with", "or", "without", "400", "nM", "bafilomycin", "A1", "for", "the", "last", "4", "h", ".", "Densitometric", "analysis", "is", "relative", "to", "actin", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "h", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "HeLa", "cells", "with", "aggregates", ",", "transfected", "with", "control", "or", "Gsα", "siRNA", "for", "48", "h", ",", "and", "then", "retransfected", "together", "with", "pcDNA", "3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "or", "CA", "m", "-", "calpain", "and", "EGFP", "-", "HDQ74", "(", "3", ":", "1", "ratio", ")", "for", "a", "further", "48", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) A53T α-synuclein clearance in stable PC12 cells as in Figure 1a, treated with or without 100 nM PACAP, with or without 10 μM calpastatin or 500 μM 2′5′ddA for 24 h.(b) The proportion of EGFP-positive cells with aggregates in SK-N-SH cells as in Figure 1c, treated for 48 h with 1 μM PACAP or 200 μM NF449. Error bars show 95% confidence interval.(c) Aggregation in COS-7 cells transfected with either pcDNA3:1 (empty vector) or constitutively active (CA) m-calpain and EGFP-HDQ74 (3:1 ratio) for 4 h and then treated with or without 500 μM 2′5′ddA for 48 h. Error bars show 95% confidence interval.(d) HeLa cells transfected with control or Gsα siRNA for 72 h were analyzed for Gsα levels by immunoblotting with anti-Gsα antibody. Aggregation was assessed in HeLa cells transfected with control or Gsα siRNA and EGFP-HDQ74 for 72 h. Error bars show 95% confidence interval.(e) Endogenous LC3-II levels in HeLa cells transfected with control or Gsα siRNA for 72 h.(f) Endogenous LC3-II levels in PC12 cells treated with or without 200 μM NF449 for 24 h.(g) Endogenous LC3-II levels in HeLa cells transfected with control or Gsα siRNA for 72 h and treated with or without 400 nM bafilomycin A1 for the last 4 h. Densitometric analysis is relative to actin. Error bars show s.e.m.(h) The proportions of EGFP-positive HeLa cells with aggregates, transfected with control or Gsα siRNA for 48 h, and then retransfected together with pcDNA 3.1 (empty vector) or CA m-calpain and EGFP-HDQ74 (3:1 ratio) for a further 48 h. Error bars show 95% confidence interval. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "aggregates", "or", "cell", "death", ",", "after", "transfection", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "rheb", "or", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "treatment", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", "or", "50", "μM", "calpeptin", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "The", "control", "condition", "for", "assessing", "the", "effect", "of", "calpain", "inhibitors", "in", "rheb", "-", "transfected", "cells", "was", "taken", "as", "1", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "b", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", ">", "5", "EGFP", "-", "LC3", "vesicles", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "LC3", "and", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "or", "rheb", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "calpastatin", "or", "50", "μM", "calpeptin", "for", "24", "h", "post", "-", "transfection", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "c", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "aggregates", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "HDQ74", "and", "constitutively", "active", "(", "CA", ")", "m", "-", "calpain", "or", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "treated", "with", "or", "without", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "for", "48", "h", "post", "-", "transfection", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "d", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", ">", "5", "EGFP", "-", "LC3", "vesicles", ",", "transfected", "with", "EGFP", "-", "LC3", "and", "CA", "m", "-", "calpain", "or", "pcDNA3", ".", "1", "(", "empty", "vector", ")", "(", "1", ":", "3", "ratio", ")", "for", "4", "h", "and", "treated", "with", "or", "without", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", "for", "24", "h", "post", "-", "transfection", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "The", "proportions", "of", "EGFP", "-", "positive", "COS", "-", "7", "cells", "with", "aggregates", "(", "e", ")", "and", "cell", "death", "(", "f", ")", "as", "in", "Figure", "1c", ",", "treated", "with", "or", "without", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", ",", "10", "μM", "calpastatin", "or", "both", "for", "48", "h", ".", "Error", "bars", "show", "95", "%", "confidence", "interval", ".", "(", "g", ")", "Clearance", "of", "soluble", "EGFP", "-", "HDQ74", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1b", ",", "treated", "with", "or", "without", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", ",", "10", "μM", "calpastatin", "or", "both", "for", "the", "48", "h", "switch", "-", "off", "period", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "h", ")", "Clearance", "of", "A53T", "α", "-", "synuclein", "in", "stable", "PC12", "cells", "as", "in", "Figure", "1a", ",", "treated", "with", "or", "without", "0", ".", "2", "μM", "rapamycin", ",", "10", "μM", "calpastatin", "or", "both", "for", "the", "8", "h", "switch", "-", "off", "period", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ";", "NS", ",", "nonsignificant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with aggregates or cell death, after transfection with EGFP-HDQ74 and rheb or pcDNA3.1 (empty vector) (1:3 ratio) for 4 h and treatment with or without 10 μM calpastatin or 50 μM calpeptin for 48 h post-transfection. The control condition for assessing the effect of calpain inhibitors in rheb-transfected cells was taken as 1. Error bars show 95% confidence interval.(b) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with >5 EGFP-LC3 vesicles, transfected with EGFP-LC3 and pcDNA3.1 (empty vector) or rheb (1:3 ratio) for 4 h and treated with or without 10 μM calpastatin or 50 μM calpeptin for 24 h post-transfection. Error bars show 95% confidence interval.(c) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with aggregates, transfected with EGFP-HDQ74 and constitutively active (CA) m-calpain or pcDNA3.1 (empty vector) (1:3 ratio) for 4 h and treated with or without 0.2 μM rapamycin for 48 h post-transfection. Error bars show 95% confidence interval.(d) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with >5 EGFP-LC3 vesicles, transfected with EGFP-LC3 and CA m-calpain or pcDNA3.1 (empty vector) (1:3 ratio) for 4 h and treated with or without 0.2 μM rapamycin for 24 h post-transfection. Error bars show 95% confidence interval.(e,f) The proportions of EGFP-positive COS-7 cells with aggregates (e) and cell death (f) as in Figure 1c, treated with or without 0.2 μM rapamycin, 10 μM calpastatin or both for 48 h. Error bars show 95% confidence interval.(g) Clearance of soluble EGFP-HDQ74 in stable PC12 cells as in Figure 1b, treated with or without 0.2 μM rapamycin, 10 μM calpastatin or both for the 48 h switch-off period. Error bars show s.e.m.(h) Clearance of A53T α-synuclein in stable PC12 cells as in Figure 1a, treated with or without 0.2 μM rapamycin, 10 μM calpastatin or both for the 8 h switch-off period. Error bars show s.e.m. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05; NS, nonsignificant."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ")", "Western", "blot", "showing", "EGFP", "-", "HDQ71", "-", "induced", "degeneration", "of", "rod", "photoreceptors", "at", "9", "d", ".", "p", ".", "f", ".", "as", "indicated", "by", "the", "decrease", "in", "the", "abundance", "of", "of", "monomeric", "(", "∼", "36", "kDa", ")", "and", "dimeric", "(", "∼", "72", "kDa", ")", "rhodopsin", ".", "Rhodopsin", "expression", "is", "further", "reduced", "by", "3", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", ",", "and", "recovered", "upon", "treatment", "with", "3", "μM", "verapamil", ",", "100", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", ",", "3", "μM", "clonidine", "and", "1", "μM", "calpastatin", ".", "No", "general", "toxicity", "to", "the", "zebrafish", "at", "these", "concentrations", "was", "observed", ".", "(", "b", ")", "Expression", "of", "EGFP", "-", "HDQ71", "significantly", "reduces", "the", "levels", "of", "rhodopsin", "expression", "when", "compared", "to", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "nontransgenic", "controls", ".", "This", "effect", "is", "further", "abrogated", "by", "3", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", ",", "whereas", "3", "μM", "verapamil", ",", "100", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", ",", "3", "μM", "clonidine", "and", "1", "μM", "calpastatin", "all", "protected", "against", "rod", "photoreceptor", "degeneration", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "c", ")", "Magnified", "bright", "field", "and", "EGFP", "images", "of", "zebrafish", "eye", "sections", ",", "taken", "at", "the", "ventral", "marginal", "zone", "for", "each", "of", "the", "indicated", "treatments", "(", "with", "concentrations", "as", "in", "b", ")", ",", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "(", "d", ")", "The", "total", "number", "of", "aggregates", "across", "8", "×", "12", "μm", "sections", "was", "counted", "and", "compared", "to", "the", "EGFP", "-", "HDQ71", "DMSO", "-", "treated", "control", ".", "3", "μM", "(", "±", ")", "-", "Bay", "K8644", "was", "found", "to", "significantly", "increase", "the", "aggregate", "burden", ",", "whereas", "3", "μM", "verapamil", ",", "1", "μM", "calpastatin", ",", "3", "μM", "clonidine", "and", "100", "μM", "2", "′", "5", "′", "ddA", "decreased", "the", "aggregate", "load", ".", "As", "in", "our", "cell", "models", ",", "these", "aggregates", "were", "insoluble", "in", "4", "%", "triton", "/", "SDS", ".", "Error", "bars", "show", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "*", "P", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a) Western blot showing EGFP-HDQ71-induced degeneration of rod photoreceptors at 9 d.p.f. as indicated by the decrease in the abundance of of monomeric (∼36 kDa) and dimeric (∼72 kDa) rhodopsin. Rhodopsin expression is further reduced by 3 μM (±)-Bay K8644, and recovered upon treatment with 3 μM verapamil, 100 μM 2′5′ddA, 3 μM clonidine and 1 μM calpastatin. No general toxicity to the zebrafish at these concentrations was observed. (b) Expression of EGFP-HDQ71 significantly reduces the levels of rhodopsin expression when compared to wild-type (WT) nontransgenic controls. This effect is further abrogated by 3 μM (±)-Bay K8644, whereas 3 μM verapamil, 100 μM 2′5′ddA, 3 μM clonidine and 1 μM calpastatin all protected against rod photoreceptor degeneration. Error bars show s.e.m.(c) Magnified bright field and EGFP images of zebrafish eye sections, taken at the ventral marginal zone for each of the indicated treatments (with concentrations as in b), are shown. Scale bar, 10 μm. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05. (d) The total number of aggregates across 8 × 12 μm sections was counted and compared to the EGFP-HDQ71 DMSO-treated control. 3 μM (±)-Bay K8644 was found to significantly increase the aggregate burden, whereas 3 μM verapamil, 1 μM calpastatin, 3 μM clonidine and 100 μM 2′5′ddA decreased the aggregate load. As in our cell models, these aggregates were insoluble in 4% triton/SDS. Error bars show s.e.m. ***P 0.001; **P 0.01; *P 0.05."}
{"words": ["Figure", "1B", ":", "CL", "formation", "was", "measured", "in", "the", "presence", "of", "60", "nmol", "MLCL", "(", "18", ":", "2", ")", "3", ",", "40", "nmol", "PC", "(", "18", ":", "2", ")", "2", ",", "4", "µg", "TAZ", ",", "and", "0", ".", "2", "mg", "MBP", "or", "0", ".", "2", "mg", "Alb", ".", "C", ":", "CL", "formation", "was", "measured", "as", "in", "B", "with", "different", "amounts", "of", "MBP", "or", "Alb", ".", "G", ":", "CL", "formation", "was", "measured", "in", "the", "presence", "of", "40", "nmol", "PC", "(", "18", ":", "2", ")", "2", ",", "10", "nmol", "MLCL", "(", "18", ":", "2", ")", "3", ",", "8", "µg", "TAZ", ",", "1250", "nmol", "Triton", "X", "-", "100", "(", "TX", ")", ",", "and", "5", ".", "6", "nmol", "bacteriorhodopsin", "(", "BR", ")", ".", "H", ":", "PC", "formation", "was", "measured", "in", "the", "presence", "of", "180", "nmol", "CL", "(", "18", ":", "2", ")", "4", ",", "20", "nmol", "LPC16", ":", "0", ",", "8", "µg", "TAZ", ",", "20", "mM", "Ca2", "+", ",", "and", "5", ".", "6", "nmol", "BR", ".", "J", ":", "Transacylations", "were", "measured", "as", "in", "I", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "9", "g", "BR", "/", "g", "lipid", ".", "The", "ratio", "of", "total", "linoleoyl", "transfer", "over", "total", "oleoyl", "transfer", "was", "calculated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B: CL formation was measured in the presence of 60 nmol MLCL(18:2)3, 40 nmol PC(18:2)2, 4 µg TAZ, and 0.2 mg MBP or 0.2 mg Alb. C: CL formation was measured as in B with different amounts of MBP or Alb. G: CL formation was measured in the presence of 40 nmol PC(18:2)2, 10 nmol MLCL(18:2)3, 8 µg TAZ, 1250 nmol Triton X-100 (TX), and 5.6 nmol bacteriorhodopsin (BR). H: PC formation was measured in the presence of 180 nmol CL(18:2)4, 20 nmol LPC16:0, 8 µg TAZ, 20 mM Ca2+, and 5.6 nmol BR. J: Transacylations were measured as in I in the presence of 0.9 g BR/ g lipid. The ratio of total linoleoyl transfer over total oleoyl transfer was calculated."}
{"words": ["Figure", "2A", ":", "Inner", "(", "IM", ")", "and", "outer", "(", "OM", ")", "mitochondrial", "membranes", "were", "traced", "in", "randomly", "collected", "electron", "micrographs", "in", "order", "to", "calculate", "the", "IM", "/", "OM", "surface", "area", "ratio", ".", "Multiple", "micrographs", "were", "analyzed", "per", "biological", "replica", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A: Inner (IM) and outer (OM) mitochondrial membranes were traced in randomly collected electron micrographs in order to calculate the IM/OM surface area ratio. Multiple micrographs were analyzed per biological replica."}
{"words": ["Figure", "3A", ":", "Mitochondrial", "membranes", "were", "traced", "in", "electron", "micrographs", "to", "determine", "the", "IM", "/", "OM", "surface", "area", "ratio", ".", "Tracings", "of", "the", "IM", "are", "shown", "in", "yellow", "boxes", ".", "C", ":", "Protein", "abundances", "were", "measured", "in", "adult", "hearts", "by", "quantitative", "Western", "blotting", "with", "fluorescence", "-", "labeled", "secondary", "antibodies", ".", "The", "abundances", "of", "IM", "proteins", "(", "NDUFB6", ",", "UQCR2", ",", "ATP5A1", ")", "are", "expressed", "relative", "to", "the", "abundance", "of", "the", "OM", "protein", "TOM70", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A: Mitochondrial membranes were traced in electron micrographs to determine the IM/OM surface area ratio. Tracings of the IM are shown in yellow boxes.C: Protein abundances were measured in adult hearts by quantitative Western blotting with fluorescence-labeled secondary antibodies. The abundances of IM proteins (NDUFB6, UQCR2, ATP5A1) are expressed relative to the abundance of the OM protein TOM70."}
{"words": ["Figure", "4Tissues", "were", "analyzed", "by", "quantitative", "electron", "microscopy", ".", "Multiple", "micrographs", "were", "analyzed", "per", "biological", "replica", "F", ",", "G", ":", "Tissues", "were", "analyzed", "by", "label", "-", "free", "quantitative", "proteomics", ".", "C", "I", "-", "V", ",", "complex", "I", "-", "V", ";", "CAC", ",", "citric", "acid", "cycle", "enzymes", ";", "MICOS", ",", "contact", "site", "complex", ";", "mt", "TA", ",", "mitochondrial", "transaminases", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "PDH", "pyruvate", "dehydrogenase", ";", "VDAC", ",", "voltage", "-", "dependent", "anion", "channel"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Tissues were analyzed by quantitative electron microscopy. Multiple micrographs were analyzed per biological replica F, G: Tissues were analyzed by label-free quantitative proteomics. C I-V, complex I-V; CAC, citric acid cycle enzymes; MICOS, contact site complex; mt TA, mitochondrial transaminases; NS, not significant; PDH pyruvate dehydrogenase; VDAC, voltage-dependent anion channel "}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunofluorescence", "of", "SATB2", "(", "green", ")", "and", "the", "GSC", "marker", "SOX2", "or", "OLIG2", "(", "red", ")", "on", "frozen", "tissue", "sections", "of", "human", "GBM", "surgical", "specimens", ".", "SATB2", "is", "preferentially", "expressed", "by", "GSCs", "in", "human", "GBMs", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "fraction", "of", "SATB2", "+", "cells", "in", "SOX2", "+", "or", "OLIG2", "+", "cells", "in", "human", "GBMs", ".", "More", "than", "90", "%", "SOX2", "+", "or", "OLIG2", "+", "cells", "showed", "SATB2", "staining", ".", "n", "=", "3", "GBMs", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "and", "matched", "non", "-", "stem", "tumor", "cells", "(", "NSTCs", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", ",", "SOX2", "and", "OLIG2", "expression", "in", "cell", "lysates", "of", "GSCs", "and", "matched", "NSTCs", ".", "E", ".", "Immunofluorescenc", "of", "SATB2", "(", "green", ")", "and", "SOX2", "(", "red", ")", "in", "T3359", "GSCs", "and", "matched", "NSTCs", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "F", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "and", "neural", "progenitor", "cells", "(", "NPCs", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", "and", "SOX2", "expression", "in", "cell", "lysates", "of", "GSCs", "and", "NPCs", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", ",", "GSC", "marker", "SOX2", "and", "differentiation", "marker", "GFAP", "expression", "during", "serum", "-", "induced", "GSC", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunofluorescence of SATB2 (green) and the GSC marker SOX2 or OLIG2 (red) on frozen tissue sections of human GBM surgical specimens. SATB2 is preferentially expressed by GSCs in human GBMs. Scale bar, 25 μm. B. Quantification of the fraction of SATB2+ cells in SOX2+ or OLIG2+ cells in human GBMs. More than 90% SOX2+ or OLIG2+ cells showed SATB2 staining. n=3 GBMs. C. qPCR analysis of SATB2 mRNA expression in GSCs and matched non-stem tumor cells (NSTCs) (n=5).D. Immunoblot analysis of SATB2, SOX2 and OLIG2 expression in cell lysates of GSCs and matched NSTCs.E. Immunofluorescenc of SATB2 (green) and SOX2 (red) in T3359 GSCs and matched NSTCs. Scale bar, 50 μm.F. qPCR analysis of SATB2 mRNA expression in GSCs and neural progenitor cells (NPCs) (n=3).G. Immunoblot analysis of SATB2 and SOX2 expression in cell lysates of GSCs and NPCs.H. Immunoblot analysis of SATB2, GSC marker SOX2 and differentiation marker GFAP expression during serum-induced GSC differentiation."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "SATB2", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "lentiviral", "-", "mediated", "non", "-", "targeting", "shRNA", "(", "shNT", ")", "or", "SATB2", "shRNA", "(", "shSATB2", ")", ".", "B", ".", "Cell", "viability", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "C", ".", "EdU", "incorporation", "assay", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "(", "C", ")", "showing", "the", "percentage", "of", "EdU", "+", "cells", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "E", ".", "Tumorsphere", "images", "of", "GSCs", "transduced", "with", "shNTor", "shSATB2", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "diameter", "of", "tumorspheres", "formed", "by", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "F", ":", "n", "=", "9", ";", "G", ":", "n", "=", "5", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "tumorspheres", "formed", "by", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "F", ":", "n", "=", "9", ";", "G", ":", "n", "=", "5", ")", ".", "H", ".", "In", "vitro", "limiting", "dilution", "analysis", "of", "the", "tumorsphere", "formations", "of", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "Silencing", "SATB2", "attenuated", "the", "self", "-", "renewal", "capacity", "of", "GSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of SATB2 expression in GSCs transduced with lentiviral-mediated non-targeting shRNA (shNT) or SATB2 shRNA (shSATB2).B. Cell viability of GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=5).C. EdU incorporation assay of GSCs transduced with shNT or shSATB2. Scale bar: 50 μm. D. Quantification of (C) showing the percentage of EdU+ cells (n=5). E. Tumorsphere images of GSCs transduced with shNTor shSATB2. Scale bar: 100 μm. Quantification of the diameter of tumorspheres formed by GSCs expressing shNT or shSATB2 (F: n=9; G: n=5).G. Quantification of the number of tumorspheres formed by GSCs expressing shNT or shSATB2 (F: n=9; G: n=5).H. In vitro limiting dilution analysis of the tumorsphere formations of GSCs expressing shNT or shSATB2. Silencing SATB2 attenuated the self-renewal capacity of GSCs."}
{"words": ["Figure", "3", "A", ".", "Bioluminescent", "images", "of", "the", "GBM", "xenografts", "derived", "from", "the", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "expressing", "NT", "or", "SATB2", "shRNA", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "Silencing", "SATB2", "significantly", "delayed", "GBM", "growth", ".", "C", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "intracranially", "implanted", "with", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "7", "mice", ";", "shSATB2", "-", "1", "or", "shSATB2", "-", "2", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "shNT", ",", "28", "days", ";", "shSATB2", "-", "1", ",", "48", "days", ";", "shSATB2", "-", "2", ",", "45", "Days", ".", "Animals", "bearing", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "expressing", "SATB2", "shRNA", "survived", "longer", "than", "the", "control", "animals", ".", "D", ".", "Immunofluorescence", "of", "SATB2", "(", "Green", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "SATB2", "intensity", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", "tumors", "per", "group", ")", ".", "H", ".", "Immunofluorescence", "of", "SOX2", "(", "Red", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "4", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "SOX2", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "4", "tumors", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A. Bioluminescent images of the GBM xenografts derived from the luciferase-labeled T3359 GSCs expressing NT or SATB2 shRNA. Representative images on day 21 posttransplantation are shown (n=5 mice per group). Silencing SATB2 significantly delayed GBM growth . C. Kaplan-Meier survival curves of mice intracranially implanted with T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (shNT: n=7 mice; shSATB2-1 or shSATB2-2: n=5 mice). Median survival: shNT, 28 days; shSATB2-1, 48 days; shSATB2-2, 45 Days. Animals bearing GSC-derived xenografts expressing SATB2 shRNA survived longer than the control animals.  D. Immunofluorescence of SATB2 (Green) in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group). Scale bar: 40 μm. E. Quantification of SATB2 intensity in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group).  F. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in tumor xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group). Scale bar: 40 μm. G. Quantification of Ki67 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=5 tumors per group).  H. Immunofluorescence of SOX2 (Red) in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=4 tumors per group). Scale bar: 40 μm. I. Quantification of SOX2 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2 (n=4 tumors per group). "}
{"words": ["Figure", "4", "A", ".", "Heatmap", "analysis", "of", "differentially", "expressed", "genes", "between", "SATB2", "silencing", "H2S", "GSCs", "(", "shSATB2", ")", "and", "control", "H2S", "GSCs", "(", "shNT", ")", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "had", "a", "1", ".", "8", "-", "fold", "or", "greater", "expression", "difference", ".", "Among", "differentially", "expressed", "genes", ",", "160", "are", "upregulated", "and", "185", "are", "downregulated", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "mRNA", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "E", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "tumor", "xenografts", "-", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "expressing", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "F", ".", "Heatmap", "analysis", "of", "FOXM1", "downstream", "targets", "between", "SATB2", "silencing", "H2S", "GSCs", "(", "shSATB2", ")", "and", "control", "H2S", "GSCs", "(", "shNT", ")", "from", "microarray", "analysis", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "had", "a", "1", ".", "5", "-", "fold", "or", "greater", "expression", "difference", ".", "G", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "downstream", "targets", "in", "H2S", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A. Heatmap analysis of differentially expressed genes between SATB2 silencing H2S GSCs (shSATB2) and control H2S GSCs (shNT). Differentially expressed genes had a 1.8-fold or greater expression difference. Among differentially expressed genes, 160 are upregulated and 185 are downregulated. C. qPCR analysis of FOXM1 and SATB2 mRNA expression in GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3).D. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in GSCs transduced with shNT or shSATB2.E. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in tumor xenografts-derived from T3359 GSCs expressing shNT or shSATB2. F. Heatmap analysis of FOXM1 downstream targets between SATB2 silencing H2S GSCs (shSATB2) and control H2S GSCs (shNT) from microarray analysis. Differentially expressed genes had a 1.5-fold or greater expression difference.  G. qPCR analysis of FOXM1 downstream targets in H2S GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). "}
{"words": ["Figure", "5", "A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "and", "SATB2", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", ".", "B", ".", "Cell", "viability", "assay", "of", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "restored", "the", "cell", "proliferation", "impaired", "by", "SATB2", "silencing", ".", "C", ".", "Tumorsphere", "number", "of", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "restored", "the", "tumorsphere", "formation", "of", "GSCs", "impaired", "by", "SATB2", "silencing", ".", "In", "vivo", "bioluminescent", "images", "of", "the", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "4", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "restored", "GBM", "tumor", "growth", ".", "E", ".", "In", "vivo", "bioluminescent", "images", "or", "quantification", "of", "the", "tumor", "xenografts", "derived", "from", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "4", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "5", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Representative", "images", "on", "day", "21", "posttransplantation", "are", "shown", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "restored", "GBM", "tumor", "growth", ".", "F", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "intracranially", "implanted", "with", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "8", "mice", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "7", "mice", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "mice", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "8", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "shNT", ",", "30", "days", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ",", "28", "days", ";", "shSATB2", ",", "50", ".", "5", "Days", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ",", "34", "days", ".", "Ectopic", "expression", "of", "FOXM1", "in", "GSCs", "expressing", "shSATB2", "markedly", "attenuated", "the", "increased", "survival", "of", "mice", "bearing", "the", "GSC", "-", "derived", "GBMs", ".", "G", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "I", ".", "Immunofluorescence", "of", "SOX2", "(", "Red", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "SOX2", "positive", "cells", "in", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "FOXM1", "or", "vector", "control", "in", "combination", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "shNT", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shNT", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "5", "tumors", ";", "shSATB2", ":", "n", "=", "6", "tumors", ";", "shSATB2", "+", "FOXM1", ":", "n", "=", "6", "tumors", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A. Immunoblot analysis of FOXM1 and SATB2 expression in T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2.  B. Cell viability assay of T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (n=5). Ectopic expression of FOXM1 restored the cell proliferation impaired by SATB2 silencing.  C. Tumorsphere number of T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (n=5). Ectopic expression of FOXM1 restored the tumorsphere formation of GSCs impaired by SATB2 silencing.  In vivo bioluminescent images of the tumor xenografts derived from luciferase-labeled T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=5 mice; shNT+FOXM1: n=4 mice; shSATB2: n=5 mice; shSATB2+ FOXM1: n=5 mice). Representative images on day 21 posttransplantation are shown. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly restored GBM tumor growth.  E. In vivo bioluminescent images or quantification of the tumor xenografts derived from luciferase-labeled T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=5 mice; shNT+FOXM1: n=4 mice; shSATB2: n=5 mice; shSATB2+ FOXM1: n=5 mice). Representative images on day 21 posttransplantation are shown. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly restored GBM tumor growth.  F. Kaplan-Meier survival curves of mice intracranially implanted with T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=8 mice; shNT+FOXM1: n=7 mice; shSATB2: n=6 mice; shSATB2+ FOXM1: n=8 mice). Median survival: shNT, 30 days; shNT+FOXM1, 28 days; shSATB2, 50.5 Days; shSATB2+FOXM1, 34 days. Ectopic expression of FOXM1 in GSCs expressing shSATB2 markedly attenuated the increased survival of mice bearing the GSC-derived GBMs.  G. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). Scale bar: 40 μm. H. Quantification of Ki67 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors).  I. Immunofluorescence of SOX2 (Red) in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). Scale bar: 40 μm. J. Quantification of SOX2 positive cells in xenografts derived from T3359 GSCs transduced with FOXM1 or vector control in combination with shNT or shSATB2 (shNT: n=6 tumors; shNT+FOXM1: n=5 tumors; shSATB2: n=6 tumors; shSATB2+ FOXM1: n=6 tumors). "}
{"words": ["Figure", "6", "B", ".", "ChIP", "assays", "with", "the", "SATB2", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", ",", "NSTCs", "and", "NPCs", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Note", "that", "abundant", "SATB2", "binds", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", "in", "GSCs", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "SATB2", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "decreased", "its", "binding", "amount", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "D", ".", "CoIP", "assays", "of", "endogenous", "protein", "interaction", "in", "GSCs", ".", "Immunoblots", "of", "precipitated", "proteins", "or", "total", "lysates", "were", "performed", "using", "indicated", "antibodies", ".", "Note", "that", "SATB2", "associates", "with", "endogenous", "CBP", "while", "not", "P300", ".", "E", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "CBP", "antibody", "or", "IgG", "using", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "reduced", "the", "binding", "of", "CBP", "to", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "F", ".", "qPCR", "analysis", "of", "ChIP", "assays", "with", "the", "indicated", "antibody", "(", "AcH3K18", ",", "AcH3K27", ",", "AcH4", ")", "using", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shNT", "or", "shSATB2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "PCR", "primers", "amplified", "a", "fragment", "flanking", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "gene", "locus", ".", "Silencing", "SATB2", "reduced", "acetylation", "of", "H3K18", ",", "H3K27", "and", "H4", "levels", "on", "the", "MAR", "of", "FOXM1", "locus", ".", "G", ".", "qPCR", "analysis", "of", "FOXM1", "mRNA", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shSATB2", "or", "shCBP", "or", "both", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "FOXM1", "expression", "in", "T3359", "GSCs", "transduced", "with", "shSATB2", "or", "shCBP", "or", "both", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 B. ChIP assays with the SATB2 antibody or IgG using GSCs, NSTCs and NPCs. PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Note that abundant SATB2 binds to the MAR of FOXM1 gene locus in GSCs.  C. qPCR analysis of ChIP assays with the SATB2 antibody or IgG using GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 decreased its binding amount to the MAR of FOXM1 gene locus. D. CoIP assays of endogenous protein interaction in GSCs. Immunoblots of precipitated proteins or total lysates were performed using indicated antibodies. Note that SATB2 associates with endogenous CBP while not P300. E. qPCR analysis of ChIP assays with the CBP antibody or IgG using GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 reduced the binding of CBP to the MAR of FOXM1 gene locus.  F. qPCR analysis of ChIP assays with the indicated antibody (AcH3K18, AcH3K27, AcH4) using T3359 GSCs transduced with shNT or shSATB2 (n=3). PCR primers amplified a fragment flanking the MAR of FOXM1 gene locus. Silencing SATB2 reduced acetylation of H3K18, H3K27 and H4 levels on the MAR of FOXM1 locus.  G. qPCR analysis of FOXM1 mRNA expression in T3359 GSCs transduced with shSATB2 or shCBP or both (n=3).  H. Immunoblot analysis of FOXM1 expression in T3359 GSCs transduced with shSATB2 or shCBP or both. "}
{"words": ["Figure", "7", "A", ".", "Cell", "viability", "of", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "B", ".", "Tumorsphere", "images", "of", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "for", "6", "days", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "C", ".", "qPCR", "analysis", "of", "SATB2", ",", "FOXM1", "and", "FOXM1", "downstream", "targets", "in", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "indicated", "doses", "of", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "for", "24", "hours", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", ".", "Bioluminescent", "imaging", "of", "tumor", "growth", "in", "mice", "bearing", "xenografts", "derived", "from", "the", "luciferase", "-", "labeled", "T3359", "GSCs", "treated", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "at", "indicated", "days", "after", "GSC", "transplantation", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "tumor", "growth", "from", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "G", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "bearing", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "treated", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "Vehicle", "control", ":", "n", "=", "9", "mice", ";", "C646", ":", "n", "=", "8", "mice", ")", ".", "Median", "survival", ":", "Vehicle", "control", ",", "27", "days", ";", "C646", ",", "33", ".", "5", "days", ".", "H", ".", "Immunofluorescence", "of", "Ki67", "(", "Green", ")", "in", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "from", "mice", "treated", "with", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "6", "tumors", "per", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "40", "μm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "T3359", "GSC", "-", "derived", "xenografts", "from", "mice", "treated", "with", "with", "C646", "or", "the", "vehicle", "control", "(", "n", "=", "6", "tumors", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 A. Cell viability of T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control (n=5).  B. Tumorsphere images of T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control for 6 days. Scale bar: 100 μm.  C. qPCR analysis of SATB2, FOXM1 and FOXM1 downstream targets in T3359 GSCs treated with indicated doses of C646 or the vehicle control for 24 hours (n=3). E. Bioluminescent imaging of tumor growth in mice bearing xenografts derived from the luciferase-labeled T3359 GSCs treated with C646 or the vehicle control at indicated days after GSC transplantation (n=5 mice per group). F. Quantification of tumor growth from (E) (n=5 mice per group). G. Kaplan-Meier survival curves of mice bearing T3359 GSC-derived xenografts treated with C646 or the vehicle control (Vehicle control: n=9 mice; C646: n= 8 mice). Median survival: Vehicle control, 27 days; C646, 33.5 days.  H. Immunofluorescence of Ki67 (Green) in T3359 GSC-derived xenografts from mice treated with with C646 or the vehicle control (n=6 tumors per group). Scale bar: 40 μm. I. Quantification of Ki67 positive cells in T3359 GSC-derived xenografts from mice treated with with C646 or the vehicle control (n=6 tumors per group). "}
{"words": ["Figure", "1A", "Left", ",", "time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "(", "red", ")", "and", "LimE", "(", "green", ")", "in", "waves", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ".", "Right", ",", "intensity", "plot", "across", "the", "blue", "dotted", "arrow", "in", "image", "\"", "30", "sec", "\"", ".", "Various", "biosensors", "in", "excitable", "waves", ".", "snapshots", "of", "biosensors", "(", "top", ")", "and", "intensity", "plots", "(", "bottom", ")", "across", "the", "blue", "dotted", "arrows", ",", "with", "black", "plots", "showing", "the", "corresponding", "biosensors", "in", "images", "above", ",", "red", "(", "B", ")", "showing", "PHcrac", "in", "the", "same", "cell", ",", "Scatter", "plots", "of", "biosensor", "peak", "locations", "relative", "to", "the", "peak", "of", "PHcrac", "(", "C", ")", "across", "propagating", "waves", "(", "blue", "solid", "lines", "indicate", "median", ")", ".", "Positive", "values", "indicate", "that", "the", "peak", "precedes", "that", "of", "PHcrac", "along", "the", "direction", "of", "wave", "propagation", ".", "n", "=", "26", ",", "26", ",", "24", ",", "21", ",", "21", ",", "32", "cells", "for", "RalGDS", ",", "RBD", ",", "PKBA", ",", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "in", "images", "above", "represent", "20", "μm", ".", "Grey", "arrows", "in", "all", "plots", "represent", "the", "direction", "of", "wave", "propagation", ".", "Various", "biosensors", "in", "excitable", "waves", ".", "D", ",", "snapshots", "of", "biosensors", "(", "top", ")", "and", "intensity", "plots", "(", "bottom", ")", "across", "the", "blue", "dotted", "arrows", ",", "with", "black", "plots", "showing", "the", "corresponding", "biosensors", "in", "images", "above", ",", "green", "(", "D", ")", "showing", "LimE", ".", "E", ",", "Scatter", "plots", "of", "biosensor", "peak", "locations", "relative", "to", "the", "peak", "of", "or", "the", "first", "peak", "of", "LimE", "(", "E", ")", "across", "propagating", "waves", "(", "blue", "solid", "lines", "indicate", "median", ")", ".", "Positive", "values", "indicate", "that", "the", "peak", "precedes", "that", "of", "LimE", ")", "along", "the", "direction", "of", "wave", "propagation", ".", "n", "=", "26", ",", "26", ",", "24", ",", "21", ",", "21", ",", "32", "cells", "for", ",", "RacGEF1", ",", "PAK1", "-", "GBD", ",", "and", "Coronin", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "in", "images", "above", "represent", "20", "μm", ".", "Grey", "arrows", "in", "all", "plots", "represent", "the", "direction", "of", "wave", "propagation", ".", "F", "Left", ",", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "(", "red", ")", "and", "PAK1", "-", "GBD", "(", "green", ")", "in", "the", "same", "cells", "treated", "with", "LatA", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "Right", ",", "temporal", "profiles", "of", "normalized", "mean", "cytosolic", "intensities", "of", "PHcrac", "(", "red", ")", "and", "PAK1", "-", "GBD", "(", "green", ")", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "18", "cells", ")", "in", "response", "to", "cAMP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Left, time lapse confocal images of PHcrac (red) and LimE (green) in waves at the basal surface of a giant cell. Right, intensity plot across the blue dotted arrow in image \"30 sec\".Various biosensors in excitable waves. snapshots of biosensors (top) and intensity plots (bottom) across the blue dotted arrows, with black plots showing the corresponding biosensors in images above, red (B) showing PHcrac in the same cell, Scatter plots of biosensor peak locations relative to the peak of PHcrac (C) across propagating waves (blue solid lines indicate median). Positive values indicate that the peak precedes that of PHcrac along the direction of wave propagation. n=26, 26, 24, 21, 21, 32 cells for RalGDS, RBD, PKBA, , respectively. Scale bars in images above represent 20 μm. Grey arrows in all plots represent the direction of wave propagation.Various biosensors in excitable waves. D, snapshots of biosensors (top) and intensity plots (bottom) across the blue dotted arrows, with black plots showing the corresponding biosensors in images above, green (D) showing LimE. E, Scatter plots of biosensor peak locations relative to the peak of or the first peak of LimE (E) across propagating waves (blue solid lines indicate median). Positive values indicate that the peak precedes that of LimE) along the direction of wave propagation. n=26, 26, 24, 21, 21, 32 cells for , RacGEF1, PAK1-GBD, and Coronin, respectively. Scale bars in images above represent 20 μm. Grey arrows in all plots represent the direction of wave propagation.F Left, confocal images of PHcrac (red) and PAK1-GBD (green) in the same cells treated with LatA. Scale bars represent 10 μm. Right, temporal profiles of normalized mean cytosolic intensities of PHcrac (red) and PAK1-GBD (green) (mean±s.e.m., n=18 cells) in response to cAMP."}
{"words": ["Figure", "2A", "Confocal", "image", "of", "LimE", "in", "waves", "(", "scale", "bar", ",", "20", "μm", ")", ".", "B", "Top", ",", "kymograph", "of", "LimE", "in", "a", "fixed", "region", "across", "which", "a", "piece", "of", "wave", "propagates", ",", "with", "white", "arrows", "pointing", "to", "the", "same", "puncta", ".", "Bottom", ",", "box", "plot", "of", "puncta", "'", "s", "lifetime", "(", "n", "=", "100", "puncta", ")", ".", "H", "A", "two", "-", "dimensional", "snapshot", "of", "a", "propagating", "wave", "(", "direction", "of", "propagation", "indicated", "with", "the", "dashed", "arrow", ")", ".", "A", "line", "scan", "corresponding", "to", "the", "STEN", "-", "CEN", "profile", "is", "shown", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Confocal image of LimE in waves (scale bar, 20 μm).B Top, kymograph of LimE in a fixed region across which a piece of wave propagates, with white arrows pointing to the same puncta. Bottom, box plot of puncta's lifetime (n=100 puncta).H A two-dimensional snapshot of a propagating wave (direction of propagation indicated with the dashed arrow). A line scan corresponding to the STEN-CEN profile is shown on the right."}
{"words": ["Figure", "3A", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "(", "top", ")", "and", "LimE", "(", "bottom", ")", "in", "the", "same", "giant", "cell", "(", "scale", "bar", ",", "20", "μm", ")", ".", "White", "arrows", "point", "to", "wave", "breaking", "events", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Time lapse confocal images of PHcrac (top) and LimE (bottom) in the same giant cell (scale bar, 20 μm). White arrows point to wave breaking events."}
{"words": ["Figure", "4E", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "LimE", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ",", "which", "recruits", "Inp54p", "to", "membrane", "induced", "by", "rapamycin", "at", "time", "0", ".", "The", "white", "arrow", "(", "-", "45", "s", ")", "points", "to", "a", "nascent", "wave", "before", "Inp54p", "recruitment", ",", "while", "the", "red", "(", "60", "s", ")", "arrow", "after", ".", "F", "Color", "coded", "overlays", "of", "LimE", "before", "and", "after", "Inp54p", "recruitment", ".", "White", "arrows", "point", "to", "nascent", "waves", "at", "time", "0", ".", "G", "Kymographs", "of", "LimE", "in", "regions", "outlined", "by", "dotted", "line", "boxes", "in", "f", ".", "J", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "at", "the", "bottom", "of", "giant", "cells", "under", "LatA", "treatment", ",", "where", "rapamycin", "is", "added", "at", "time", "0", "to", "induce", "Inp54p", "recruitment", ".", "White", "arrows", "point", "to", "wave", "patches", "right", "before", "rapamycin", "addition", ".", "K", "Confocal", "image", "of", "PI5K", "(", "left", ")", "and", "LimE", "(", "right", ")", "at", "the", "bottom", "of", "the", "same", "cell", ".", "All", "scale", "bars", "in", "images", "represent", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4E Time lapse confocal images of LimE at the basal surface of a giant cell, which recruits Inp54p to membrane induced by rapamycin at time 0. The white arrow (-45 s) points to a nascent wave before Inp54p recruitment, while the red (60 s) arrow after.F Color coded overlays of LimE before and after Inp54p recruitment. White arrows point to nascent waves at time 0. G Kymographs of LimE in regions outlined by dotted line boxes in f.J Time lapse confocal images of PHcrac at the bottom of giant cells under LatA treatment, where rapamycin is added at time 0 to induce Inp54p recruitment. White arrows point to wave patches right before rapamycin addition.K Confocal image of PI5K (left) and LimE (right) at the bottom of the same cell. All scale bars in images represent 20 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "LimE", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ",", "which", "recruits", "PKBA", "to", "membrane", "induced", "by", "rapamycin", "at", "time", "0", ".", "B", "T", "-", "stack", "of", "LimE", "in", "the", "region", "outlined", "by", "the", "colored", "line", "box", "in", "A", ".", "C", "Box", "plots", "of", "mean", "wave", "speed", "(", "left", ")", ",", "mean", "wave", "patch", "area", "(", "middle", ")", ",", "and", "average", "number", "of", "wave", "patches", "per", "frame", "(", "right", ")", "before", "and", "after", "PKBA", "recruitment", "(", "red", "bars", "indicate", "median", ",", "n", "=", "24", "cells", ")", ".", "Error", "bars", "are", "from", "the", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "D", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ",", "which", "recruits", "PKBA", "to", "membrane", "induced", "by", "rapamycin", "at", "time", "0", ".", "E", "Confocal", "images", "of", "PHcrac", "(", "left", ")", "and", "PHcrac", "merged", "with", "LimE", "(", "middle", ",", "PHcrac", "as", "red", ",", "LimE", "as", "green", ")", "in", "a", "giant", "cell", "after", "steady", "PKBA", "recruitment", ".", "Right", ",", "intensity", "plots", "of", "PHcrac", "(", "red", ")", "and", "LimE", "(", "green", ")", "across", "the", "blue", "box", ".", "F", "Kymograph", "of", "PHcrac", "(", "red", ")", "merged", "with", "LimE", "(", "green", ")", "along", "the", "white", "dashed", "line", "from", "E", ".", "G", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "at", "the", "bottom", "of", "a", "giant", "cell", "treated", "with", "LatA", ",", "where", "rapamycin", "is", "added", "at", "time", "0", "to", "induce", "PKBA", "recruitment", ".", "All", "scale", "bars", "above", "represent", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Time lapse confocal images of LimE at the basal surface of a giant cell, which recruits PKBA to membrane induced by rapamycin at time 0.B T-stack of LimE in the region outlined by the colored line box in A.C Box plots of mean wave speed (left), mean wave patch area (middle), and average number of wave patches per frame (right) before and after PKBA recruitment (red bars indicate median, n=24 cells). Error bars are from the student's t-test.D Time lapse confocal images of PHcrac at the basal surface of a giant cell, which recruits PKBA to membrane induced by rapamycin at time 0.E Confocal images of PHcrac (left) and PHcrac merged with LimE (middle, PHcrac as red, LimE as green) in a giant cell after steady PKBA recruitment. Right, intensity plots of PHcrac (red) and LimE (green) across the blue box.F Kymograph of PHcrac (red) merged with LimE (green) along the white dashed line from E.G Time lapse confocal images of PHcrac at the bottom of a giant cell treated with LatA, where rapamycin is added at time 0 to induce PKBA recruitment. All scale bars above represent 20 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", "Left", ",", "time", "lapse", "confocal", "images", "of", "LimE", "in", "single", "cells", "following", "RacGEF1ΔN", "recruitment", ",", "induced", "by", "rapamycin", "addition", "at", "time", "0", ".", "Right", ",", "temporal", "profile", "of", "normalized", "mean", "LimE", "intensity", "at", "cell", "cortex", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "20", "cells", ")", ".", "B", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "LimE", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ",", "which", "recruits", "RacGEF1ΔN", "to", "membrane", "induced", "by", "rapamycin", "at", "time", "0", ".", "C", "T", "-", "stack", "of", "LimE", "in", "the", "region", "outlined", "by", "the", "colored", "line", "box", "in", "B", ".", "D", "Right", ",", "kymographs", "of", "LimE", "along", "a", "line", "across", "giant", "cells", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", ".", "Top", "left", ",", "confocal", "image", "with", "a", "dotted", "line", "as", "an", "example", "used", "to", "make", "kymographs", ".", "White", "arrows", "in", "image", "and", "kymographs", "point", "to", "examples", "of", "actin", "puncta", ".", "Bottom", "left", ",", "box", "plot", "of", "lifetime", "of", "puncta", "(", "red", "bar", "indicates", "median", ",", "n", "=", "100", "puncta", "from", "10", "cells", ")", ".", "All", "scale", "bars", "above", "represent", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Left, time lapse confocal images of LimE in single cells following RacGEF1ΔN recruitment, induced by rapamycin addition at time 0. Right, temporal profile of normalized mean LimE intensity at cell cortex (mean±s.e.m., n=20 cells).B Time lapse confocal images of LimE at the basal surface of a giant cell, which recruits RacGEF1ΔN to membrane induced by rapamycin at time 0.C T-stack of LimE in the region outlined by the colored line box in B.D Right, kymographs of LimE along a line across giant cells after RacGEF1ΔN recruitment. Top left, confocal image with a dotted line as an example used to make kymographs. White arrows in image and kymographs point to examples of actin puncta. Bottom left, box plot of lifetime of puncta (red bar indicates median, n=100 puncta from 10 cells). All scale bars above represent 20 μm."}
{"words": ["Figure", "7A", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ",", "which", "recruits", "RacGEF1ΔN", "to", "membrane", "at", "time", "0", "induced", "by", "rapamycin", ".", "B", "Confocal", "images", "of", "PHcrac", "(", "left", ")", "and", "PHcrac", "merged", "with", "LimE", "(", "right", ",", "PHcrac", "as", "red", ",", "LimE", "as", "green", ")", "in", "a", "giant", "cell", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", ".", "C", "Kymograph", "of", "LimE", "(", "top", ",", "green", ")", "and", "PHcrac", "(", "bottom", ",", "red", ")", "across", "the", "dotted", "line", "in", "B", ".", "D", "Confocal", "image", "of", "RalGDS", "(", "left", ")", "in", "a", "giant", "cell", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", "and", "the", "corresponding", "kymograph", "(", "right", ")", ".", "E", "Time", "lapse", "confocal", "images", "of", "PHcrac", "in", "single", "cells", ",", "which", "recruit", "RacGEF1ΔN", "to", "membrane", "induced", "by", "rapamycin", "at", "time", "0", ".", "White", "arrow", "points", "to", "PHcrac", "patches", "at", "cell", "cortex", ".", "F", "Kymographs", "of", "PHcrac", "at", "cell", "cortex", "before", "and", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", ".", "Red", "dashed", "lines", "in", "F", "indicate", "rapamycin", "addition", "at", "time", "0", ".", "G", "Temporal", "profiles", "of", "normalized", "PHcrac", "intensities", "at", "cell", "cortex", "before", "and", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "20", "cells", ")", ".", "Red", "dashed", "lines", "in", "F", "and", "G", "indicate", "rapamycin", "addition", "at", "time", "0", ".", "H", "Distribution", "of", "different", "sizes", "of", "PHcrac", "patches", "at", "cell", "cortex", "under", "LatA", "treatment", ",", "with", "(", "solid", ")", "or", "without", "(", "hollow", ")", "RacGEF1ΔN", "recruitment", "(", "~", "6000", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "I", "Temporal", "profiles", "of", "normalized", "cytosolic", "intensities", "of", "PHcrac", "in", "response", "to", "1", "nM", "cAMP", "stimulation", "at", "time", "0", ",", "with", "(", "red", ")", "or", "without", "(", "blue", ")", "RacGEF1ΔN", "recruitment", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "25", "cells", "each", ")", ".", "J", "Confocal", "images", "of", "GflB", "(", "top", ")", "and", "RapGAP1", "(", "bottom", ")", "in", "waves", "at", "the", "basal", "surface", "of", "a", "giant", "cell", ".", "K", "Intensity", "plots", "of", "GflB", "(", "blue", ")", "and", "RapGAP1", "(", "orange", ")", "across", "the", "green", "dotted", "arrow", "in", "J", ".", "L", "Scatter", "plots", "of", "first", "peak", "distances", ",", "of", "GflB", "relative", "to", "LimE", ",", "RapGAP1", "relative", "to", "LimE", ",", "and", "RapGAP1", "relative", "to", "GflB", "in", "the", "same", "giant", "cells", "(", "red", "lines", "indicate", "median", ",", "n", "=", "19", "cells", "each", ")", ".", "M", "Confocal", "images", "of", "GflB", "(", "top", ")", "and", "RapGAP1", "(", "bottom", ")", "at", "the", "basal", "surface", "of", "the", "same", "giant", "cell", "after", "RacGEF1ΔN", "recruitment", ".", "N", "kymographs", "of", "GflB", "(", "top", ")", "and", "RapGAP1", "(", "bottom", ")", "across", "the", "green", "dotted", "lines", "in", "m", ".", "All", "scale", "bars", "represent", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Time lapse confocal images of PHcrac at the basal surface of a giant cell, which recruits RacGEF1ΔN to membrane at time 0 induced by rapamycin.B Confocal images of PHcrac (left) and PHcrac merged with LimE (right, PHcrac as red, LimE as green) in a giant cell after RacGEF1ΔN recruitment.C Kymograph of LimE (top, green) and PHcrac (bottom, red) across the dotted line in B.D Confocal image of RalGDS (left) in a giant cell after RacGEF1ΔN recruitment and the corresponding kymograph (right).E Time lapse confocal images of PHcrac in single cells, which recruit RacGEF1ΔN to membrane induced by rapamycin at time 0. White arrow points to PHcrac patches at cell cortex.F Kymographs of PHcrac at cell cortex before and after RacGEF1ΔN recruitment. Red dashed lines in F indicate rapamycin addition at time 0.G Temporal profiles of normalized PHcrac intensities at cell cortex before and after RacGEF1ΔN recruitment (mean±s.e.m., n=20 cells). Red dashed lines in F and G indicate rapamycin addition at time 0.H Distribution of different sizes of PHcrac patches at cell cortex under LatA treatment, with (solid) or without (hollow) RacGEF1ΔN recruitment (~6000 cells from 3 independent experiments).I Temporal profiles of normalized cytosolic intensities of PHcrac in response to 1 nM cAMP stimulation at time 0, with (red) or without (blue) RacGEF1ΔN recruitment (mean±s.e.m., n=25 cells each).J Confocal images of GflB (top) and RapGAP1 (bottom) in waves at the basal surface of a giant cell.K Intensity plots of GflB (blue) and RapGAP1 (orange) across the green dotted arrow in J.L Scatter plots of first peak distances, of GflB relative to LimE, RapGAP1 relative to LimE, and RapGAP1 relative to GflB in the same giant cells (red lines indicate median, n=19 cells each).M Confocal images of GflB (top) and RapGAP1 (bottom) at the basal surface of the same giant cell after RacGEF1ΔN recruitment.N kymographs of GflB (top) and RapGAP1 (bottom) across the green dotted lines in m. All scale bars represent 20 μm."}
{"words": ["Figure", "8A", ",", "B", "Left", ",", "confocal", "images", "of", "LimE", "(", "top", ")", "and", "kymographs", "of", "cortical", "LimE", "(", "bottom", ")", "in", "single", "cells", "with", "PKBA", "(", "A", ")", "or", "RacGEF1ΔN", "(", "B", ")", "steadily", "recruited", "(", "scale", "bars", ",", "10", "μm", ")", ".", "Right", ",", "color", "coded", "overlays", "of", "LimE", "in", "single", "cells", ".", "C", "Box", "plots", "of", "roundness", "(", "left", ")", "and", "cell", "area", "(", "middle", ")", "comparing", "wt", ",", "cells", "with", "RacGEF1ΔN", "recruited", ",", "and", "spreading", "phases", "of", "oscillators", "after", "Inp54p", "recruitment", "(", "n", "=", "100", "cells", "each", ")", ".", "Right", ",", "box", "plots", "of", "coefficient", "of", "variance", "of", "cell", "area", "with", "the", "above", "conditions", "in", "a", "10", "-", "minute", "time", "window", "(", "n", "=", "30", "cells", "each", ")", ".", "Red", "bars", "indicate", "median", ".", "D", "Phalloidin", "staining", "of", "cells", "after", "perturbations", ".", "Maximal", "intensity", "projections", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A, B Left, confocal images of LimE (top) and kymographs of cortical LimE (bottom) in single cells with PKBA (A) or RacGEF1ΔN (B) steadily recruited (scale bars, 10 μm). Right, color coded overlays of LimE in single cells.C Box plots of roundness (left) and cell area (middle) comparing wt, cells with RacGEF1ΔN recruited, and spreading phases of oscillators after Inp54p recruitment (n=100 cells each). Right, box plots of coefficient of variance of cell area with the above conditions in a 10-minute time window (n=30 cells each). Red bars indicate median.D Phalloidin staining of cells after perturbations. Maximal intensity projections are shown."}
{"words": ["Figure", "1B", "The", "expression", "of", "mature", "miR", "-", "200b", "and", "miR", "-", "200a", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "The", "expression", "of", "Ttll10", "(", "the", "host", "gene", "of", "miR", "-", "200b", "/", "a", ")", "mRNA", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "p", "=", "0", ".", "3540", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "The", "locomotor", "activity", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "was", "similar", "to", "that", "of", "the", "NC", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "13", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "knockdown", ":", "n", "=", "15", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "p", "=", "0", ".", "5030", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "The", "odorant", "habituation", "results", "shown", "as", "the", "ratio", "of", "odor", "sniffs", "/", "water", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "were", "significantly", "reduced", "compared", "to", "those", "of", "the", "NC", "mice", ".", "These", "odorants", "included", "male", "urine", "(", "1", ":", "50", ")", ",", "female", "urine", "(", "1", ":", "50", ")", ",", "isopentyl", "acetate", "(", "50", "μM", ")", ",", "citral", "(", "50", "μM", ")", ",", "2", "-", "heptanone", "(", "50", "μM", ")", "and", "propyl", "propionate", "(", "50", "μM", ")", "(", "n", "=", "6", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "The", "resident", "/", "intruder", "experiment", "showed", "that", "the", "attack", "frequency", "(", "F", ")", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "were", "impaired", "compared", "to", "those", "of", "the", "NC", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "11", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "10", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "The", "resident", "/", "intruder", "experiment", "showed", "that", "the", "attack", "duration", "(", "G", ")", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "were", "impaired", "compared", "to", "those", "of", "the", "NC", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "11", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "10", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", ",", "I", "The", "analysis", "of", "male", "-", "female", "mating", "behaviors", "showed", "that", "the", "mating", "frequency", "(", "H", ")", "and", "duration", "(", "I", ")", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "were", "significantly", "reduced", "compared", "to", "those", "of", "the", "NC", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "11", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "10", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B The expression of mature miR-200b and miR-200a in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice, as revealed by qPCR analysis (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01; Student's t-test).C The expression of Ttll10 (the host gene of miR-200b/a) mRNA in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice, as revealed by qPCR analysis (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; p=0.3540; Student's t-test).D The locomotor activity of the miR-200b/a KD mice was similar to that of the NC mice (NC: n=13 mice, miR-200b/a knockdown: n=15 mice; data represent the mean±SEM; p=0.5030; Student's t-test).E The odorant habituation results shown as the ratio of odor sniffs/water of the miR-200b/a KD mice were significantly reduced compared to those of the NC mice. These odorants included male urine (1:50), female urine (1:50), isopentyl acetate (50 μM), citral (50 μM), 2-heptanone (50 μM) and propyl propionate (50 μM) (n=6 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; Student's t-test).The resident/intruder experiment showed that the attack frequency (F) of the miR-200b/a KD mice were impaired compared to those of the NC mice (NC: n=11 mice, miR-200b/a KD: n=10 mice; data represent the mean±SEM; ****p<0.0001; Student's t-test).G The resident/intruder experiment showed that the attack duration (G) of the miR-200b/a KD mice were impaired compared to those of the NC mice (NC: n=11 mice, miR-200b/a KD: n=10 mice; data represent the mean±SEM; ****p<0.0001; Student's t-test).H, I The analysis of male-female mating behaviors showed that the mating frequency (H) and duration (I) of the miR-200b/a KD mice were significantly reduced compared to those of the NC mice (NC: n=11 mice, miR-200b/a KD: n=10 mice; data represent the mean±SEM; **p<0.01, ***p<0.001; Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2B", "Representative", "IF", "staining", "with", "Ki67", "antibody", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "Ki67", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Representative", "IF", "costaining", "with", "both", "EdU", "and", "Ki67", "antibody", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "EdU", "+", "cells", "and", "the", "yellow", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "EdU", "and", "Ki67", ".", "D", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "middle", "and", "right", "images", ")", ".", "D", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "D", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "costained", "Ki67", "+", "and", "EdU", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "The", "proportion", "of", "GBCs", "that", "exited", "the", "cell", "cycle", "was", "significantly", "reduced", "in", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "compared", "with", "their", "NC", "controls", "[", "the", "cell", "cycle", "exit", "index", "was", "calculated", "using", "the", "following", "formula", ":", "(", "EdU", "+", "Ki67", "−", "cells", "/", "total", "EdU", "+", "cells", ")", "×", "100", ";", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "]", ".", "G", "Representative", "IF", "costaining", "with", "both", "EdU", "and", "BrdU", "antibody", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "BrdU", "+", "cells", ",", "and", "the", "yellow", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "BrdU", "and", "EdU", ".", "G", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "middle", "and", "right", "images", ")", ".", "G", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "G", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "H", "The", "S", "phase", "length", "of", "the", "GBCs", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "the", "S", "phase", "length", "was", "calculated", "using", "the", "following", "formula", ":", "3", "h", "×", "BrdU", "+", "/", "BrdU", "+", "EdU", "-", ";", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "I", "Total", "cell", "cycle", "length", "of", "the", "GBCs", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "total", "cell", "cycle", "length", "was", "calculated", "using", "the", "following", "formula", ":", "20", "h", "+", "(", "Ts", "×", "EdU", "+", "BrdU", "-", "/", "Edu", "+", ")", ";", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ";", "p", "=", "0", ".", "9785", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Representative IF staining with Ki67 antibody in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. Scale bars, 20 μm. C Quantification of the numbers of Ki67+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; **p<0.01, ****p<0.0001; Student's t-test). D Representative IF costaining with both EdU and Ki67 antibody in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the EdU+ cells and the yellow arrows indicate the cells positive for both EdU and Ki67. D' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (middle and right images). D: Scale bars, 20 μm; D': Scale bars, 2 μm. E Quantification of the numbers of costained Ki67+ and EdU+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=3 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05; Student's t-test). F The proportion of GBCs that exited the cell cycle was significantly reduced in the miR-200b/a KD mice compared with their NC controls [the cell cycle exit index was calculated using the following formula: (EdU+ Ki67− cells/total EdU+ cells)×100; n=3 mice each group; data represent the mean±SEM; **p<0.01; Student's t-test]. G Representative IF costaining with both EdU and BrdU antibody in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the BrdU+ cells, and the yellow arrows indicate the cells positive for both BrdU and EdU. G' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (middle and right images). G: Scale bars, 20 μm; G': Scale bars, 2 μm.H The S phase length of the GBCs in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (the S phase length was calculated using the following formula: 3 h×BrdU+/BrdU+EdU-; n=3 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05; Student's t-test).I Total cell cycle length of the GBCs in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (total cell cycle length was calculated using the following formula: 20 h+(Ts×EdU+BrdU-/Edu+); n=3 mice each group; p=0.9785; data represent the mean±SEM; Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "3B", "The", "mRNA", "levels", "of", "CK14", ",", "Trp63", ",", "Sox2", "and", "Mash1", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "CK14", ":", "p", "=", "0", ".", "2135", ",", "Trp63", ":", "p", "=", "0", ".", "1930", ",", "Sox2", ":", "p", "=", "0", ".", "5190", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Representative", "IF", "staining", "for", "CK14", ",", "Sox2", ",", "and", "Mash1", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "CK14", "+", ",", "basal", "Sox2", "+", ",", "apical", "Sox2", "+", ",", "and", "Mash1", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "CK14", ":", "p", "=", "0", ".", "8998", ",", "basal", "Sox2", ":", "p", "=", "0", ".", "7056", ",", "apical", "Sox2", ":", "p", "=", "0", ".", "4455", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "Sox2", "and", "Mash1", "protein", "levels", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "2", "mice", "each", "group", ")", ".", "GAPDH", "and", "Tubulin", "served", "as", "loading", "controls", ".", "The", "molecular", "weight", "of", "each", "band", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "F", "Representative", "IF", "costaining", "with", "Sox2", "antibody", "and", "EdU", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "Sox2", "and", "EdU", ".", "F", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "right", "images", ")", ".", "F", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "F", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Sox2", "+", "EdU", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "p", "=", "0", ".", "7988", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", "Representative", "IF", "costaining", "with", "Mash1", "antibody", "and", "EdU", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "Mash1", "and", "EdU", ".", "H", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "right", "images", ")", ".", "H", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "H", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "I", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Mash1", "+", "EdU", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B The mRNA levels of CK14, Trp63, Sox2 and Mash1 in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice, as revealed by qPCR analysis (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; CK14: p=0.2135, Trp63: p=0.1930, Sox2: p=0.5190, *p<0.05; Student's t-test).C Representative IF staining for CK14, Sox2, and Mash1 in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. Scale bars, 20 μm. D Quantification of the number of CK14+, basal Sox2+, apical Sox2+, and Mash1+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; CK14: p=0.8998, basal Sox2: p=0.7056, apical Sox2: p=0.4455, **p<0.01; Student's t-test). E Western Blot analysis of the Sox2 and Mash1 protein levels in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=2 mice each group). GAPDH and Tubulin served as loading controls. The molecular weight of each band is indicated at the right. F Representative IF costaining with Sox2 antibody and EdU in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the cells positive for both Sox2 and EdU. F' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (right images). F: Scale bars, 20 μm; F': Scale bars, 2 μm. G Quantification of the number of Sox2+EdU+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; p=0.7988; Student's t-test). H Representative IF costaining with Mash1 antibody and EdU in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the cells positive for both Mash1 and EdU. H' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (right images). H: Scale bars, 20 μm; H': Scale bars, 2 μm. I Quantification of the number of Mash1+EdU+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05; Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "4A", "Representative", "IF", "staining", "for", "Tuj1", ",", "GAP43", ",", "and", "OMP", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Tuj1", "+", ",", "GAP43", "+", ",", "and", "OMP", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "The", "mRNA", "levels", "of", "Ngn1", ",", "GAP43", "and", "OMP", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Representative", "IF", "costaining", "with", "GAP43", "and", "BrdU", "antibodies", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "injected", "with", "BrdU", "at", "3", "d", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "GAP43", "and", "BrdU", ".", "D", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "middle", "and", "right", "images", ")", ".", "D", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "D", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "the", "number", "of", "BrdU", "+", "GAP43", "+", "cells", "and", "the", "number", "of", "total", "GAP43", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "injected", "with", "BrdU", "at", "3", "d", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Representative", "IF", "staining", "with", "Cas3", "antibody", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Cas3", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Representative IF staining for Tuj1, GAP43, and OMP in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. Scale bars, 20 μm. B Quantification of the number of Tuj1+, GAP43+, and OMP+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; Student's t-test). C The mRNA levels of Ngn1, GAP43 and OMP in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice, as revealed by qPCR analysis (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; *p<0.05; Student's t-test). D Representative IF costaining with GAP43 and BrdU antibodies in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice injected with BrdU at 3 d. The white arrows indicate the cells positive for both GAP43 and BrdU. D' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (middle and right images). D: Scale bars, 20 μm; D': Scale bars, 2 μm. E Quantification of the ratio of the number of BrdU+ GAP43+ cells and the number of total GAP43+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice injected with BrdU at 3 d (n=3 mice each group; data represent the mean±SEM; ****p<0.0001; Student's t-test). F Representative IF staining with Cas3 antibody in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. Scale bars, 20 μm. G Quantification of the number of Cas3+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; ***p<0.001; Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "5A", "The", "number", "of", "differentially", "expressed", "olfrs", "from", "RNA", "sequencing", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "C", "TET", "3", "'", "UTR", "-", "dependent", "expression", "of", "a", "luciferase", "reporter", "gene", "was", "suppressed", "by", "miR", "-", "200a", "overexpression", ".", "Luciferase", "reporter", "gene", "under", "the", "control", "of", "the", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutant", "(", "Mut", ")", "TET3", "3", "'", "UTR", "was", "transfected", "along", "with", "the", "negative", "control", "(", "nc", ")", "RNA", "or", "miR", "-", "200a", "mimic", "duplexes", "into", "HeLa", "cells", "(", "n", "=", "6", "from", "six", "independent", "experiments", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "Mut", "-", "nc", "vs", ".", "Mut", "-", "mimic", ":", "p", "=", "0", ".", "3697", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", ",", "E", "The", "expression", "of", "mature", "miR", "-", "200a", "(", "D", ")", "and", "TET3", "(", "E", ")", "mRNA", "in", "the", "3T3", "-", "L1", "cells", "treated", "with", "miR", "-", "200a", "inhibitor", ",", "miR", "-", "200a", "mimic", "or", "control", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "(", "n", "=", "4", "from", "four", "independent", "experiments", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "D", ":", "F", "=", "66", ".", "37", ",", "E", ":", "F", "=", "16", ".", "39", ",", "NC", "vs", ".", "mimic", ":", "p", "=", "0", ".", "2597", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", ".", "F", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "TET3", "protein", "level", "in", "the", "3T3", "-", "L1", "cells", "treated", "with", "miR", "-", "200a", "inhibitor", ",", "miR", "-", "200a", "mimic", "or", "control", "(", "n", "=", "3", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "molecular", "weight", "of", "each", "band", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "TET3", "protein", "level", "in", "the", "MOE", "of", "the", "mice", "intranasally", "injected", "with", "miR", "-", "200a", "(", "G", ")", "NC", "mimic", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ")", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "molecular", "weight", "of", "each", "band", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "H", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "TET3", "protein", "level", "in", "the", "MOE", "of", "the", "mice", "intranasally", "injected", "with", "miR", "-", "200b", "(", "H", ")", "or", "NC", "mimic", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ")", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "molecular", "weight", "of", "each", "band", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "I", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "TET3", "protein", "level", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ")", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "molecular", "weight", "of", "each", "band", "is", "indicated", "at", "the", "right", ".", "The", "blue", "number", "shows", "the", "ratio", "of", "the", "average", "intensity", "of", "TET3", "/", "Actin", ".", "J", "Representative", "IF", "staining", "of", "TET3", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "K", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TET3", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "L", "Representative", "IF", "staining", "of", "5mC", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "knockdown", "mice", ".", "L", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ".", "L", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "L", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "M", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "5mC", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "N", "Representative", "IF", "staining", "of", "5hmC", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "knockdown", "mice", ".", "N", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ".", "N", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "N", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "5hmC", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A The number of differentially expressed olfrs from RNA sequencing in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice.C TET 3' UTR-dependent expression of a luciferase reporter gene was suppressed by miR-200a overexpression. Luciferase reporter gene under the control of the wild-type (WT) or mutant (Mut) TET3 3' UTR was transfected along with the negative control (nc) RNA or miR-200a mimic duplexes into HeLa cells (n=6 from six independent experiments; data represent the mean±SEM; Mut-nc vs. Mut-mimic: p=0.3697, *p<0.05; Student's t-test).D, E The expression of mature miR-200a (D) and TET3 (E) mRNA in the 3T3-L1 cells treated with miR-200a inhibitor, miR-200a mimic or control, as revealed by qPCR analysis (n=4 from four independent experiments; data represent the mean±SEM; D: F=66.37, E: F=16.39, NC vs. mimic: p=0.2597, *p<0.05, ***p<0.001; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons).F Western Blot analysis of the TET3 protein level in the 3T3-L1 cells treated with miR-200a inhibitor, miR-200a mimic or control (n=3 from three independent experiments). Actin served as a loading control. The molecular weight of each band is indicated at the right.Western Blot analysis of the TET3 protein level in the MOE of the mice intranasally injected with miR-200a (G) NC mimic (n=3 mice each group). Actin served as a loading control. The molecular weight of each band is indicated at the right.H Western Blot analysis of the TET3 protein level in the MOE of the mice intranasally injected with miR-200b (H) or NC mimic (n=3 mice each group). Actin served as a loading control. The molecular weight of each band is indicated at the right.I Western Blot analysis of the TET3 protein level in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=3 mice each group). Actin served as a loading control. The molecular weight of each band is indicated at the right. The blue number shows the ratio of the average intensity of TET3/Actin.J Representative IF staining of TET3 in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. Scale bars: 20 μm.K Quantification of the number of TET3+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; ***p<0.001; Student's t-test).L Representative IF staining of 5mC in the MOE of the NC and miR-200b/a knockdown mice. L' is shown at higher magnification of the boxed region. L: Scale bars, 20 μm; L': Scale bars, 2 μm.M Quantification of the number of 5mC+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; ***p<0.001; Student's t-test).N Representative IF staining of 5hmC in the MOE of the NC and miR-200b/a knockdown mice. N' is shown at higher magnification of the boxed region. N: Scale bars, 20 μm; N': Scale bars, 2 μm.Quantification of the number of 5hmC+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; **p<0.01; Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "IF", "staining", "for", "costaining", "with", "TET3", "and", "Mash1", "antibodies", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "TET3", "and", "Mash1", ".", "A", "'", "is", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "middle", "and", "right", "images", ")", ".", "A", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "A", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "costained", "TET3", "+", "and", "Mash1", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ",", "D", "The", "resident", "/", "intruder", "experiment", "showed", "that", "the", "attack", "frequency", "(", "C", ")", "and", "duration", "(", "D", ")", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", "were", "significantly", "improved", "compared", "with", "those", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "controls", ";", "[", "200", "KD", ":", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ";", "(", "200", "+", "T", ")", "DKD", ":", "(", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", ")", "DKD", ";", "(", "NC", ":", "n", "=", "18", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "14", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", ":", "n", "=", "16", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "C", ":", "F", "=", "17", ".", "84", ",", "D", ":", "F", "=", "12", ".", "06", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", "]", ".", "E", ",", "F", "The", "analysis", "of", "male", "-", "female", "mating", "behaviors", "showed", "that", "the", "frequency", "(", "E", ")", "and", "duration", "(", "F", ")", "of", "mating", "to", "females", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", "were", "significantly", "reduced", "compared", "with", "those", "of", "their", "NC", "controls", "and", "were", "not", "dramatically", "different", "compared", "with", "those", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "18", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "14", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", ":", "n", "=", "16", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "E", ":", "F", "=", "15", ".", "62", ",", "F", ":", "F", "=", "15", ".", "56", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", ".", "G", "Representative", "IF", "staining", "for", "Mash1", ",", "Tuj1", ",", "Cas3", "and", "Ki67", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "H", "-", "K", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "Mash1", "+", "(", "H", ")", ",", "Tuj1", "+", "(", "I", ")", ",", "Cas3", "+", "(", "J", ")", "and", "Ki67", "+", "(", "K", ")", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "Mash1", ":", "F", "=", "41", ".", "45", ",", "Tuj1", ":", "F", "=", "113", ".", "9", ",", "Cas3", ":", "F", "=", "92", ".", "51", ",", "Ki67", ":", "F", "=", "61", ".", "35", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative IF staining for costaining with TET3 and Mash1 antibodies in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the cells positive for both TET3 and Mash1. A' is shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (middle and right images). A: Scale bars, 20 μm; A': Scale bars, 2 μm. B Quantification of the number of costained TET3+ and Mash1+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; ***p<0.001; Student's t-test). C, D The resident/intruder experiment showed that the attack frequency (C) and duration (D) of the miR-200b/a+TET3 DKD mice were significantly improved compared with those of the miR-200b/a KD controls; [200 KD: miR-200b/a KD; (200+T) DKD: (miR-200b/a+TET3) DKD; (NC: n=18 mice, miR-200b/a KD: n=14 mice, miR-200b/a+TET3 DKD: n=16 mice; data represent the mean±SEM; C: F=17.84, D: F=12.06, *p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; One-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons)].E, F The analysis of male-female mating behaviors showed that the frequency (E) and duration (F) of mating to females of the miR-200b/a+TET3 DKD mice were significantly reduced compared with those of their NC controls and were not dramatically different compared with those of the miR-200b/a KD mice (NC: n=18 mice, miR-200b/a KD: n=14 mice, miR-200b/a+TET3 DKD: n=16 mice; data represent the mean ±SEM; E: F=15.62, F: F=15.56, ***p<0.001, ****p<0.0001; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons).G Representative IF staining for Mash1, Tuj1, Cas3 and Ki67 in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a+TET3 DKD mice. Scale bars: 20 μm. H-K Quantification of the numbers of Mash1+(H), Tuj1+(I), Cas3+(J) and Ki67+(K) cells in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a+TET3 DKD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; Mash1: F=41.45, Tuj1: F=113.9, Cas3: F=92.51, Ki67: F=61.35, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons). "}
{"words": ["Figure", "7A", "The", "REST", "mRNA", "expression", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", ",", "as", "revealed", "by", "qPCR", "analysis", "[", "200", "KD", ":", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ";", "(", "200", "+", "T", ")", "DKD", ":", "(", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", ")", "DKD", ";", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "F", "=", "9", ".", "409", ",", "NC", "vs", ".", "200", ":", "p", "=", "0", ".", "1367", ",", "200", "vs", ".", "200", "+", "T", ":", "p", "=", "0", ".", "1896", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisonsB", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "REST", "protein", "level", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", "each", "group", ")", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "C", "Representative", "IF", "staining", "for", "REST", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "and", "TET3", "DKD", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "REST", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "TET3", "DKD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "F", "=", "12", ".", "11", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", ".", "Representative", "IF", "costaining", "with", "REST", "and", "Mash1", "antibodies", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "cells", "positive", "for", "both", "REST", "and", "Mash1", ".", "E", "'", "are", "shown", "at", "higher", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", ",", "as", "three", "channel", "merged", "images", "(", "left", "image", ")", "and", "the", "separated", "channel", "(", "middle", "and", "right", "images", ")", ".", "E", ":", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ";", "E", "'", ":", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "F", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "costained", "REST", "+", "and", "Mash1", "+", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "Mouse", "MOE", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "with", "polyclonal", "antibodies", "against", "TET3", ".", "Input", "protein", "(", "100", "ug", ")", "and", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", "antibodies", "were", "used", "as", "the", "negative", "control", ".", "H", "Mouse", "MOE", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "with", "polyclonal", "antibodies", "against", "REST", ".", "Input", "protein", "(", "100", "ug", ")", "and", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", "antibodies", "were", "used", "as", "the", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A The REST mRNA expression in the MOE of the NC, miR-200b/a KD and miR-200b/a+TET3 DKD mice, as revealed by qPCR analysis [200 KD: miR-200b/a KD; (200+T) DKD: (miR-200b/a+TET3) DKD; n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; F=9.409, NC vs. 200: p=0.1367, 200 vs. 200+T: p=0.1896, **p<0.01; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisonsB Western Blot analysis of the REST protein level in the MOE of the NC, miR-200b/a KD and miR-200b/a+TET3 DKD mice (n=3 mice each group). Actin served as a loading control.C Representative IF staining for REST in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a and TET3 DKD mice. Scale bars: 20 μm.D Quantification of the number of REST+ cells in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a+TET3 DKD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; F=12.11, *p<0.05; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons).Representative IF costaining with REST and Mash1 antibodies in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice. The white arrows indicate the cells positive for both REST and Mash1. E' are shown at higher magnification of the boxed region, as three channel merged images (left image) and the separated channel (middle and right images). E: Scale bars, 20 μm; E': Scale bars, 2 μm.F Quantification of the number of costained REST+ and Mash1+ cells in the MOE of the NC and miR-200b/a KD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; **p<0.01; Student's t-test).G Mouse MOE proteins were immunoprecipitated with polyclonal antibodies against TET3. Input protein (100 ug) and immunoprecipitates were subjected to immunoblot analysis with the indicated antibodies. IgG antibodies were used as the negative control.H Mouse MOE proteins were immunoprecipitated with polyclonal antibodies against REST. Input protein (100 ug) and immunoprecipitates were subjected to immunoblot analysis with the indicated antibodies. IgG antibodies were used as the negative control."}
{"words": ["Figure", "8A", ",", "B", "The", "resident", "/", "intruder", "experiment", "showed", "that", "the", "attack", "frequency", "(", "A", ")", "and", "duration", "(", "B", ")", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", "mice", "were", "dramatically", "improved", "compared", "with", "those", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "[", "200", "KD", ":", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ";", "(", "200", "+", "R", ")", "DKD", ":", "(", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", ")", "DKD", ";", "NC", ":", "n", "=", "10", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "9", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", ":", "n", "=", "13", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "A", ":", "F", "=", "10", ".", "62", ",", "B", ":", "F", "=", "10", ".", "54", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", "]", ".", "C", ",", "D", "The", "analysis", "of", "male", "-", "female", "mating", "behaviors", "showed", "that", "the", "frequency", "(", "C", ")", "and", "duration", "(", "D", ")", "of", "mating", "to", "females", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", "mice", "were", "significantly", "improved", "compared", "with", "those", "of", "the", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", "mice", "(", "NC", ":", "n", "=", "10", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ":", "n", "=", "9", "mice", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", ":", "n", "=", "13", "mice", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "C", ":", "F", "=", "6", ".", "162", ",", "D", ":", "F", "=", "6", ".", "360", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", ".", "Representative", "IF", "staining", "for", "Mash1", ",", "Tuj1", ",", "Cas3", "and", "Ki67", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "F", "-", "I", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Mash1", "+", "(", "F", ")", ",", "Tuj1", "+", "(", "G", ")", ",", "Cas3", "+", "(", "H", ")", "and", "Ki67", "+", "(", "I", ")", "cells", "in", "the", "MOE", "of", "the", "NC", ",", "miR", "-", "200b", "/", "a", "KD", ",", "and", "miR", "-", "200b", "/", "a", "+", "REST", "DKD", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "each", "group", ";", "data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ";", "Mash1", ":", "F", "=", "35", ".", "53", ",", "Tuj1", ":", "F", "=", "62", ".", "28", ",", "Cas3", ":", "F", "=", "115", ".", "7", ",", "Ki67", ":", "F", "=", "77", ".", "43", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "pairwise", "comparisons", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A, B The resident/intruder experiment showed that the attack frequency (A) and duration (B) of the miR-200b/a+REST DKD mice were dramatically improved compared with those of the miR-200b/a KD mice [200 KD: miR-200b/a KD; (200+R) DKD: (miR-200b/a+REST) DKD; NC: n=10 mice, miR-200b/a KD: n=9 mice, miR-200b/a+REST DKD: n=13 mice; data represent the mean±SEM; A: F=10.62, B: F=10.54, ***p<0.001; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons].C, D The analysis of male-female mating behaviors showed that the frequency (C) and duration (D) of mating to females of the miR-200b/a+REST DKD mice were significantly improved compared with those of the miR-200b/a KD mice (NC: n=10 mice, miR-200b/a KD: n=9 mice, miR-200b/a+REST DKD: n=13 mice; data represent the mean±SEM; C: F=6.162, D: F=6.360, *p<0.05, **p<0.01; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons).Representative IF staining for Mash1, Tuj1, Cas3 and Ki67 in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a+REST DKD mice. Scale bars: 20 μm. F-I Quantification of the number of Mash1+(F), Tuj1+(G), Cas3+(H) and Ki67+(I) cells in the MOE of the NC, miR-200b/a KD, and miR-200b/a+REST DKD mice (n=4 mice each group; data represent the mean±SEM; Mash1: F=35.53, Tuj1: F=62.28, Cas3: F=115.7, Ki67: F=77.43, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; one-way ANOVA and Bonferroni pairwise comparisons). "}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "oxLDL", "plasma", "concentration", "in", "ACM", "patients", "and", "HC", "(", "n", "=", "36", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "B", ")", "oxLDL", "plasma", "concentration", "in", "mutated", "ACM", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "NON", "ACM", "relatives", ",", "carriers", "of", "the", "same", "causative", "mutation", "(", "n", "=", "9", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "C", ")", "oxLDL", "plasma", "concentration", "in", "ACM", "patients", "carriers", "of", "a", "PKP2", "mutation", "and", "ACM", "patients", "carriers", "of", "other", "desmosomal", "or", "non", "desmosomal", "mutations", ",", "or", "gene", "elusive", "(", "n", "=", "10", "vs", ".", "n", "=", "26", ";", "One", "-", "Way", "ANOVA", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ")", "Representative", "images", "of", "MDA", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "ACM", "and", "HC", "ventricular", "tissue", "sections", "and", "relative", "quantification", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "E", ")", "Representative", "images", "of", "CD36", "immunostaining", "on", "ACM", "and", "HC", "ventricular", "tissue", "sections", "and", "relative", "quantification", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) oxLDL plasma concentration in ACM patients and HC (n=36; Mann-Whitney test). B) oxLDL plasma concentration in mutated ACM (n=7) and NON ACM relatives, carriers of the same causative mutation (n=9; Mann-Whitney test). C) oxLDL plasma concentration in ACM patients carriers of a PKP2 mutation and ACM patients carriers of other desmosomal or non desmosomal mutations, or gene elusive (n=10 vs. n=26; One-Way ANOVA). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.D) Representative images of MDA immunostaining (green) on ACM and HC ventricular tissue sections and relative quantification (n=4 biological replicates; Two-tailed Student's t-test). Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). E) Representative images of CD36 immunostaining on ACM and HC ventricular tissue sections and relative quantification (n=4 biological replicates; Two-tailed Student's t-test). Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. "}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Left", "panels", ":", "representative", "images", "of", "three", "cases", "of", "ACM", "in", "Steady", "State", "Free", "Procession", "sequences", "at", "cardiac", "MRI", ".", "On", "the", "left", "a", "case", "with", "RV", "dilation", ",", "regional", "bulging", "of", "the", "RV", "wall", "without", "fat", "infiltration", ",", "and", "oxLDL", "levels", "below", "the", "cut", "-", "off", ";", "in", "the", "center", "and", "on", "the", "right", ",", "two", "cases", "with", "fat", "infiltration", "in", "the", "right", "or", "left", "ventricle", "wall", "(", "white", "arrow", ")", ",", "respectively", ",", "and", "oxLDL", "levels", "above", "the", "cut", "-", "off", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "myocardial", "fat", "mass", "of", "the", "two", "ACM", "subpopulations", "(", "above", "or", "below", "the", "cut", "-", "off", ")", "whose", "MRI", "was", "available", "for", "re", "-", "analysis", "(", "n", "=", "14", "oxLDL", "<", "86ng", "/", "ml", ",", "n", "=", "25", "oxLDL", ">", "86ng", "/", "ml", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "actual", "MAE", "free", "survival", "of", "patient", "belonging", "to", "the", "two", "ACM", "cohort", "subgroups", "in", "the", "first", "5", "-", "year", "follow", "-", "up", "(", "n", "=", "26", "oxLDL", "<", "86ng", "/", "ml", "vs", ".", "n", "=", "41oxLDL", ">", "86ng", "/", "ml", ";", "Log", "-", "Rank", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "HR", "=", "0", ".", "223", "[", "0", ".", "116", "-", "0", ".", "428", "]", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Left panels: representative images of three cases of ACM in Steady State Free Procession sequences at cardiac MRI. On the left a case with RV dilation, regional bulging of the RV wall without fat infiltration, and oxLDL levels below the cut-off; in the center and on the right, two cases with fat infiltration in the right or left ventricle wall (white arrow), respectively, and oxLDL levels above the cut-off. Right panel: quantification of the myocardial fat mass of the two ACM subpopulations (above or below the cut-off) whose MRI was available for re-analysis (n=14 oxLDL<86ng/ml, n=25 oxLDL>86ng/ml; Two-tailed Student's t-test).G) Kaplan-Meier analysis of actual MAE free survival of patient belonging to the two ACM cohort subgroups in the first 5-year follow-up (n=26 oxLDL<86ng/ml vs. n=41oxLDL>86ng/ml; Log-Rank p<0.0001; HR=0.223[0.116-0.428])."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Left", "panels", ":", "representative", "images", "of", "MDA", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "in", "GM", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Right", "panel", ":", "image", "quantification", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "ACM", ",", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "HC", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ")", "Top", "panel", ":", "representative", "images", "of", "Western", "Blot", "analysis", "of", "proteins", "extracted", "from", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "cultured", "in", "GM", ",", "hybridized", "with", "anti", "-", "CD36", "and", "anti", "-", "PPARγ", "antibodies", ".", "Immunostaining", "of", "the", "housekeeping", "GAPDH", "is", "shown", "for", "normalization", ".", "Bottom", "panel", ":", "d", ".", "a", ".", "of", "PPARγ", "(", "n", "=", "18", "biological", "replicates", ")", "and", "CD36", "(", "n", "=", "17", "vs", ".", "n", "=", "16", "biological", "replicates", ")", "levels", ",", "normalized", "on", "GAPDH", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "F", ")", "Top", "panels", ":", "representative", "images", "of", "internalization", "of", "oxLDL", "(", "red", ")", "in", "HC", "and", "ACM", "cells", ",", "cultured", "either", "in", "GM", "or", "in", "AM", ",", "and", "subjected", "to", "10μg", "/", "ml", "DiI", "-", "oxLDL", "treatment", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Bottom", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "relative", "mean", "DiI", "fluorescence", "for", "each", "sample", ",", "measured", "by", "FACS", "analysis", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Left panels: representative images of MDA immunostaining (green) on ACM and HC C-MSC in GM. Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Right panel: image quantification (n=4 biological replicates ACM, n=5 biological replicates HC; Two-tailed Student's t-test). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01.D) Top panel: representative images of Western Blot analysis of proteins extracted from ACM and HC C-MSC cultured in GM, hybridized with anti-CD36 and anti-PPARγ antibodies. Immunostaining of the housekeeping GAPDH is shown for normalization. Bottom panel: d.a. of PPARγ (n=18 biological replicates) and CD36 (n=17 vs. n=16 biological replicates) levels, normalized on GAPDH (Mann-Whitney test). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01.F) Top panels: representative images of internalization of oxLDL (red) in HC and ACM cells, cultured either in GM or in AM, and subjected to 10μg/ml DiI-oxLDL treatment. Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Bottom panel: quantification of the relative mean DiI fluorescence for each sample, measured by FACS analysis (n=3 biological replicates; Two-Way Anova). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01. "}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Left", "panels", ":", "representative", "images", "of", "ORO", "staining", "on", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "in", "AM", "supplemented", "or", "not", "with", "150µg", "/", "ml", "oxLDL", ".", "Middle", "panel", ":", "image", "quantification", "(", "n", "=", "11", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Right", "panels", ":", "representative", "images", "of", "Western", "Blot", "of", "CD36", ",", "PPARγ", "and", "GAPDH", "protein", "expression", "of", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "protein", "extracts", "in", "AM", "supplemented", "or", "not", "with", "150µg", "/", "ml", "oxLDL", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "and", "d", ".", "a", ".", "normalized", "on", "the", "house", "-", "keeping", "GAPDH", "(", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "B", ")", "Left", "panels", ":", "representative", "images", "of", "ORO", "staining", "on", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "in", "AM", "supplemented", "or", "not", "with", "20μg", "/", "ml", "13HODE", ",", "5mmol", "/", "L", "NAC", "or", "both", ".", "Right", "panel", ":", "image", "quantification", "(", "n", "=", "13", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "images", "of", "Western", "Blot", "of", "CD36", ",", "PPARγ", "and", "GAPDH", "protein", "expression", "of", "ACM", "and", "HC", "C", "-", "MSC", "protein", "extracts", "in", "AM", "supplemented", "or", "not", "with", "20μg", "/", "ml", "13HODE", ",", "5mmol", "/", "L", "NAC", "or", "both", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", ")", ".", "Right", "panels", ":", "d", ".", "a", ".", "normalized", "on", "the", "house", "-", "keeping", "GAPDH", "(", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Left panels: representative images of ORO staining on ACM and HC C-MSC in AM supplemented or not with 150µg/ml oxLDL. Middle panel: image quantification (n=11 biological replicates; Two-Way Anova). Right panels: representative images of Western Blot of CD36, PPARγ and GAPDH protein expression of ACM and HC C-MSC protein extracts in AM supplemented or not with 150µg/ml oxLDL (n=5 biological replicates) and d.a. normalized on the house-keeping GAPDH (Two-Way Anova). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.B) Left panels: representative images of ORO staining on ACM and HC C-MSC in AM supplemented or not with 20μg/ml 13HODE, 5mmol/L NAC or both. Right panel: image quantification (n=13 biological replicates; Two-Way Anova). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.C) Left panel: representative images of Western Blot of CD36, PPARγ and GAPDH protein expression of ACM and HC C-MSC protein extracts in AM supplemented or not with 20μg/ml 13HODE, 5mmol/L NAC or both (n=8 biological replicates). Right panels: d.a. normalized on the house-keeping GAPDH (Two-Way Anova). Data information: mean ± SEM. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. "}
{"words": ["Figure", "5D", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "images", "of", "internalization", "of", "oxLDL", "(", "red", ")", "in", "ACM", "C", "-", "MSC", "treated", "with", "scramble", "siRNA", "or", "CD36", "siRNA", ",", "cultured", "in", "AM", "and", "subjected", "to", "10μg", "/", "ml", "DiI", "oxLDL", "treatment", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "DiI", "fluorescence", "normalized", "on", "nuclei", "number", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "arbitrary", "units", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "E", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "images", "of", "internalization", "of", "oxLDL", "(", "red", ")", "in", "ACM", "C", "-", "MSC", "cultured", "in", "AM", "or", "AM", "+", "5μM", "GW9662", "and", "subjected", "to", "10μg", "/", "ml", "DiI", "oxLDL", "treatment", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "DiI", "fluorescence", "normalized", "on", "nuclei", "number", "for", "each", "sample", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "arbitrary", "units", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "F", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "images", "of", "Western", "Blot", "of", "CD36", "and", "GAPDH", "expression", "of", "protein", "extracts", "of", "ACM", "C", "-", "MSC", "cultured", "in", "AM", "or", "AM", "+", "5μM", "GW9662", ".", "Right", "panels", ":", "d", ".", "a", ".", "normalized", "on", "the", "house", "-", "keeping", "GAPDH", "(", "n", "=", "7", "biological", "replicates", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D) Left panel: representative images of internalization of oxLDL (red) in ACM C-MSC treated with scramble siRNA or CD36 siRNA, cultured in AM and subjected to 10μg/ml DiI oxLDL treatment. Right panel: quantification of the DiI fluorescence normalized on nuclei number (n=3 biological replicates, arbitrary units; Two-tailed Student's t-test). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01.E) Left panel: representative images of internalization of oxLDL (red) in ACM C-MSC cultured in AM or AM+5μM GW9662 and subjected to 10μg/ml DiI oxLDL treatment. Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Right panel: quantification of the DiI fluorescence normalized on nuclei number for each sample (n=3 biological replicates, arbitrary units; Two-tailed Student's t-test). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01.F) Left panel: representative images of Western Blot of CD36 and GAPDH expression of protein extracts of ACM C-MSC cultured in AM or AM+5μM GW9662. Right panels: d.a. normalized on the house-keeping GAPDH (n=7 biological replicates; Two-tailed Student's t-test). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01. "}
{"words": ["Figure", "6C", ")", "Left", "panels", ":", "representative", "images", "of", "ORO", "staining", "of", "HFD", "-", "fed", "WT", "and", "Pkp2", "+", "/", "-", "cardiac", "sections", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "ORO", "positive", "area", "percentage", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "For", "comparison", ",", "quantification", "of", "ORO", "positive", "area", "of", "cardiac", "sections", "of", "CD", "-", "fed", "WT", "and", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "9", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", "is", "shown", "(", "Appendix", "Figure", "S3", ")", ".", "D", ")", "Representative", "images", "of", "PPARγ", "(", "green", ")", "immunostaining", "on", "HFD", "-", "fed", "WT", "and", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "cardiac", "sections", "(", "n", "=", "10", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "PPARγ", "staining", "in", "HFD", "is", "shown", "relative", "to", "the", "values", "of", "CD", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "E", ")", "Representative", "images", "of", "MDA", "(", "green", ")", "immunostaining", "on", "HFD", "-", "fed", "WT", "and", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "cardiac", "sections", "(", "n", "=", "10", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "MDA", "staining", "in", "HFD", "is", "shown", "relative", "to", "the", "values", "of", "CD", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "F", ")", "Representative", "images", "of", "CD36", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "HFD", "-", "fed", "WT", "and", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "cardiac", "sections", "(", "n", "=", "10", ";", "Two", "-", "Way", "Anova", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "staining", "in", "HFD", "is", "shown", "relative", "to", "the", "values", "of", "CD", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C) Left panels: representative images of ORO staining of HFD-fed WT and Pkp2+/- cardiac sections. Right panel: quantification of ORO positive area percentage (n=10). For comparison, quantification of ORO positive area of cardiac sections of CD-fed WT and Pkp2+/- mice (n=9; Two-Way Anova) is shown (Appendix Figure S3). D) Representative images of PPARγ (green) immunostaining on HFD-fed WT and Pkp2+/- mice cardiac sections (n=10; Two-Way Anova). Quantification of the PPARγ staining in HFD is shown relative to the values of CD (n=9). E) Representative images of MDA (green) immunostaining on HFD-fed WT and Pkp2+/- mice cardiac sections (n=10; Two-Way Anova). Quantification of the MDA staining in HFD is shown relative to the values of CD (n=9). F) Representative images of CD36 immunostaining (green) on HFD-fed WT and Pkp2+/- mice cardiac sections (n=10; Two-Way Anova). Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Quantification of the staining in HFD is shown relative to the values of CD (n=9). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001."}
{"words": ["Figure", "7C", ")", "Left", "panel", ":", "representative", "images", "of", "ORO", "staining", "of", "cardiac", "sections", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", ",", "fed", "a", "3", "-", "month", "HFD", "plus", "atorvastatin", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "ORO", "positive", "area", "(", "n", "=", "9", ")", "is", "compared", "to", "that", "in", "HFD", "(", "as", "in", "Figure", "6C", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", ")", "Representative", "images", "of", "PPARγ", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "cardiac", "sections", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "fed", "a", "3", "-", "month", "HFD", "plus", "atorvastatin", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Quantification", "is", "compared", "to", "the", "values", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "in", "HFD", "and", "relative", "to", "WT", "in", "CD", "(", "as", "in", "Figure", "6D", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ")", "Representative", "images", "of", "MDA", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "cardiac", "sections", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "fed", "a", "3", "-", "month", "HFD", "plus", "atorvastatin", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Quantification", "is", "compared", "to", "the", "values", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "in", "HFD", "and", "relative", "to", "WT", "in", "CD", "(", "as", "in", "Figure", "6E", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ")", "Representative", "images", "of", "CD36", "immunostaining", "(", "green", ")", "on", "cardiac", "sections", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "mice", "fed", "a", "3", "-", "month", "HFD", "plus", "atorvastatin", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Quantification", "is", "compared", "to", "the", "values", "of", "Pkp2", "+", "/", "-", "HFD", "and", "relative", "to", "WT", "in", "CD", "(", "as", "in", "Figure", "6F", ";", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst33342", "(", "blue", ")", ".", "Data", "information", ":", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C) Left panel: representative images of ORO staining of cardiac sections of Pkp2+/- mice, fed a 3-month HFD plus atorvastatin. Right panel: quantification of the percentage of ORO positive area (n=9) is compared to that in HFD (as in Figure 6C; Two-tailed Student's t-test). D) Representative images of PPARγ immunostaining (green) on cardiac sections of Pkp2+/- mice fed a 3-month HFD plus atorvastatin (n=9). Quantification is compared to the values of Pkp2+/- in HFD and relative to WT in CD (as in Figure 6D; Two-tailed Student's t-test). E) Representative images of MDA immunostaining (green) on cardiac sections of Pkp2+/- mice fed a 3-month HFD plus atorvastatin (n=9). Quantification is compared to the values of Pkp2+/- in HFD and relative to WT in CD (as in Figure 6E; Two-tailed Student's t-test). F) Representative images of CD36 immunostaining (green) on cardiac sections of Pkp2+/- mice fed a 3-month HFD plus atorvastatin (n=9). Quantification is compared to the values of Pkp2+/- HFD and relative to WT in CD (as in Figure 6F; Two-tailed Student's t-test). Nuclei are counterstained with Hoechst33342 (blue). Data information: mean ± SEM. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "E7", ".", "0", "whole", "embryo", "and", "transverse", "section", "(", "TSs", ")", "(", "dashed", "lines", ")", "through", "(", "a1", ")", "extra", "-", "embryonic", "tissue", "showing", "expression", "in", "a", "ring", "of", "extra", "-", "embryonic", "ectoderm", "(", "ee", ")", "and", "extraembryonic", "mesoderm", "(", "em", ")", "and", "absence", "of", "transcripts", "in", "the", "allantois", "(", "al", ")", ";", "(", "a2", ")", "revealing", "expression", "in", "epiblast", "(", "ep", ")", "and", "in", "mesendoderm", "(", "me", ")", "emerging", "from", "the", "primitive", "streak", "(", "ps", ")", ",", "dashed", "box", "(", "a2", "'", ")", "defines", "higher", "magnification", "region", "shown", "in", "a2", ".", "(", "B", ")", "E8", ".", "5", "whole", "embryo", "dorsal", "view", "and", "TSs", "(", "dashed", "lines", ")", "showing", "expression", "in", ":", "(", "b1", ",", "b2", ",", "b3", ")", "the", "open", "anterior", "neural", "plate", "(", "future", "fore", ",", "mid", "and", "hindbrain", ")", "including", "(", "b3", ")", "neural", "crest", "(", "nc", ")", "emerging", "from", "hindbrain", ";", "(", "b4", ")", "in", "the", "dorsal", "neural", "tube", "(", "prospective", "neural", "crest", ")", "and", "dorsal", "somites", "(", "s", ")", ";", "(", "b5", ")", "in", "closing", "preneural", "tube", "neural", "(", "pnt", ")", "and", "epithelising", "somites", ";", "(", "b6", ")", "in", "caudal", "lateral", "epiblast", "(", "cle", ")", "adjacent", "to", "the", "node", "(", "n", ")", "at", "the", "anterior", "tip", "of", "the", "primitive", "streak", ",", "but", "not", "in", "presomitic", "mesoderm", "(", "psm", ")", ".", "White", "arrows", "indicate", "open", "anterior", "and", "posterior", "neural", "plate", ".", "(", "C", ")", "E9", ".", "5", "whole", "embryo", "side", "view", "and", "TSs", "(", "white", "dashed", "lines", ")", "showing", "expression", "in", ":", "(", "c1", ")", "forebrain", "(", "fb", ")", "and", "hindbrain", ",", "including", "optic", "vesicles", "(", "opv", ")", ",", "(", "c1", "'", ")", "seen", "at", "high", "magnification", "(", "and", "indicated", "by", "box", "grey", "dashed", "line", ")", "and", "otic", "vesicles", "(", "ov", ")", "(", "c1", "'", "'", ")", "seen", "at", "high", "magnification", "(", "box", "grey", "dashed", "line", ")", ";", "(", "c2", ")", "high", "expression", "in", "dorsal", "hindbrain", "(", "hb", ")", "and", "(", "c3", ")", "spinal", "cord", "(", "sc", ")", "and", "dermamyotome", "(", "dm", ")", "of", "the", "differentiating", "somite", ";", "(", "c5", ")", "throughout", "open", "posterior", "neural", "plate", ".", "(", "D", ")", "High", "magnification", "of", "E9", ".", "5", "whole", "embryo", "showing", "expression", "in", "first", "branchial", "arch", "(", "ba", ")", "and", "forming", "cranial", "ganglia", ",", "which", "are", "just", "becoming", "apparent", ",", "(", "V", ")", ",", "(", "VII", ")", ",", "(", "VIII", ")", "(", "IX", ")", "and", "(", "X", ")", ".", "OV", ",", "otic", "vesicle", ".", "(", "E", ")", "Expression", "in", "mesenchyme", "cells", "underlying", "the", "apical", "ectodermal", "ridge", "(", "aer", ")", "in", "the", "progress", "zone", "(", "pz", ")", "and", "in", "the", "zone", "of", "polarising", "activity", "(", "zpa", ")", "of", "the", "forelimb", "(", "fl", ")", ".", "Data", "information", ":", "Images", "representative", "of", "n", "≥", "4", "embryos", "for", "each", "stage", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "except", "sections", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) E7.0 whole embryo and transverse section (TSs) (dashed lines) through (a1) extra-embryonic tissue showing expression in a ring of extra-embryonic ectoderm (ee) and extraembryonic mesoderm (em) and absence of transcripts in the allantois (al); (a2) revealing expression in epiblast (ep) and in mesendoderm (me) emerging from the primitive streak (ps), dashed box (a2') defines higher magnification region shown in a2. (B) E8.5 whole embryo dorsal view and TSs (dashed lines) showing expression in: (b1,b2,b3) the open anterior neural plate (future fore, mid and hindbrain) including (b3) neural crest (nc) emerging from hindbrain; (b4) in the dorsal neural tube (prospective neural crest) and dorsal somites (s); (b5) in closing preneural tube neural (pnt) and epithelising somites; (b6) in caudal lateral epiblast (cle) adjacent to the node (n) at the anterior tip of the primitive streak, but not in presomitic mesoderm (psm). White arrows indicate open anterior and posterior neural plate . (C) E9.5 whole embryo side view and TSs (white dashed lines) showing expression in: (c1) forebrain (fb) and hindbrain , including optic vesicles (opv), (c1') seen at high magnification (and indicated by box grey dashed line) and otic vesicles (ov) (c1'') seen at high magnification (box grey dashed line); (c2) high expression in dorsal hindbrain (hb) and (c3) spinal cord (sc) and dermamyotome (dm) of the differentiating somite; (c5) throughout open posterior neural plate. (D) High magnification of E9.5 whole embryo showing expression in first branchial arch (ba) and forming cranial ganglia, which are just becoming apparent, (V), (VII), (VIII) (IX) and (X). OV, otic vesicle. (E) Expression in mesenchyme cells underlying the apical ectodermal ridge (aer) in the progress zone (pz) and in the zone of polarising activity (zpa) of the forelimb (fl). Data information: Images representative of n≥ 4 embryos for each stage. Scale bars 200 µm, except sections 100 µm. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "H", ")", "Live", "wildtype", "littermate", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "imaged", "shortly", "after", "dissection", ".", "(", "A", "-", "D", ")", "Wildtype", "and", "(", "E", "-", "H", ")", "Slc7a5", "-", "null", "E9", ".", "75", "embryos", "from", "lateral", "(", "A", ",", "D", ",", "E", ",", "H", ")", ",", "frontal", "(", "B", ",", "F", ")", "or", "dorsal", "(", "C", ",", "G", ")", "views", ";", "(", "e1", "-", "h1", ")", "higher", "magnification", "images", "of", "the", "Slc7a5", "-", "null", "embryo", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "the", "smaller", "limb", "bud", "(", "compare", "B", "and", "F", ")", ",", "open", "/", "reduced", "forebrain", "(", "compare", "D", "and", "H", ")", ",", "open", "neural", "tube", "at", "posterior", "(", "compare", "C", "and", "E", ",", "e1", ")", "and", "anterior", "(", "compare", "B", "and", "F", ",", "f1", ")", "regions", ".", "Black", "arrowheads", "indicate", "kinked", "neural", "tube", "(", "compare", "C", "and", "G", ",", "g1", ")", "and", "apparently", "missing", "optic", "and", "smaller", "otic", "vesicles", "(", "ov", ")", "(", "compare", "D", "and", "h1", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "200", "µmmRNA", "in", "situ", "hybridization", "and", "immunofluorescence", "in", "E9", ".", "5", "or", "E10", ".", "5", "wildtype", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "for", "key", "marker", "genes", ".", "(", "I", "-", "L", ")", "Fgf8", "mRNA", "transcripts", "were", "detected", "in", "wildtype", "(", "I", "-", "j1", ")", "and", "in", "Slc7a5", "-", "null", "(", "K", "-", "l1", ")", "E10", ".", "5", "embryos", "(", "n", "=", "4", "each", ")", "(", "white", "arrowheads", "indicate", "limb", "buds", "in", "K", "and", "the", "isthmus", "in", "L", ")", "with", "(", "j1", ",", "l1", ")", "sections", "through", "isthmus", "at", "midbrain", "/", "hindbrain", "border", "and", "(", "i1", ",", "k1", ")", "lateral", "views", "of", "forelimb", "buds", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "except", "sections", "100", "µm", ".", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "and", "immunofluorescence", "in", "E9", ".", "5", "or", "E10", ".", "5", "wildtype", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "for", "key", "marker", "genes", ".", "(", "M", "-", "N", ")", "Wholemount", "Tubulin", "-", "β", "-", "III", "(", "Tuj1", ")", "immunofluorescence", "performed", "on", "(", "M", ",", "m1", ")", "wildtype", "and", "(", "N", ",", "n1", ")", "Slc7a5", "-", "null", "E9", ".", "5", "-", "E10", ".", "5", "embryos", "(", "n", "=", "5", "each", "condition", ")", ".", "Dorsal", "root", "ganglia", "(", "DRG", ")", "and", "Sympathetic", "Chain", "Ganglia", "(", "SCG", ")", "are", "indicated", "with", "open", "arrowheads", "together", "with", "cranial", "ganglia", "IX", ",", "X", "and", "XI", ".", "Images", "in", "(", "m1", ",", "n1", ")", "show", "higher", "magnification", "of", "the", "cranial", "ganglia", "V", ",", "VII", "/", "VIII", "(", "open", "arrowheads", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "200", "µmmRNA", "in", "situ", "hybridization", "and", "immunofluorescence", "in", "E9", ".", "5", "or", "E10", ".", "5", "wildtype", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "for", "key", "marker", "genes", ".", "(", "O", "-", "P", ")", "Neurog2", "expression", "in", "wildtype", "(", "O", "-", "o4", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "(", "P", "-", "p4", ")", "(", "n", "=", "5", "and", "n", "=", "6", "each", ")", ",", "showing", "reduced", "expression", "in", "forebrain", "(", "o2", ",", "p2", ")", ",", "cranial", "ganglia", "(", "o1", ",", "o3", ",", "p1", ",", "p3", ",", "arrowheads", ")", "and", "in", "spinal", "cord", "at", "level", "of", "forelimb", "(", "o4", ",", "p4", ",", "arrowheads", "indicate", "position", "of", "neural", "crest", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "except", "sections", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-H) Live wildtype littermate and Slc7a5-null embryos imaged shortly after dissection. (A-D) Wildtype and (E-H) Slc7a5-null E9.75 embryos from lateral (A, D, E, H), frontal (B, F) or dorsal (C, G) views; (e1-h1) higher magnification images of the Slc7a5-null embryo. White arrowheads indicate the smaller limb bud (compare B and F), open/reduced forebrain (compare D and H), open neural tube at posterior (compare C and E, e1) and anterior (compare B and F, f1) regions. Black arrowheads indicate kinked neural tube (compare C and G, g1) and apparently missing optic and smaller otic vesicles (ov) (compare D and h1). Data information: Scale bars 200 µmmRNA in situ hybridization and immunofluorescence in E9.5 or E10.5 wildtype and Slc7a5-null embryos for key marker genes. (I-L) Fgf8 mRNA transcripts were detected in wildtype (I-j1) and in Slc7a5-null (K-l1) E10.5 embryos (n=4 each) (white arrowheads indicate limb buds in K and the isthmus in L) with (j1, l1) sections through isthmus at midbrain/hindbrain border and (i1, k1) lateral views of forelimb buds. Data information: Scale bars 200 µm, except sections 100 µm.mRNA in situ hybridization and immunofluorescence in E9.5 or E10.5 wildtype and Slc7a5-null embryos for key marker genes. (M-N) Wholemount Tubulin-β-III (Tuj1) immunofluorescence performed on (M, m1) wildtype and (N, n1) Slc7a5-null E9.5-E10.5 embryos (n=5 each condition). Dorsal root ganglia (DRG) and Sympathetic Chain Ganglia (SCG) are indicated with open arrowheads together with cranial ganglia IX, X and XI. Images in (m1, n1) show higher magnification of the cranial ganglia V, VII/VIII (open arrowheads). Data information: Scale bars 200 µmmRNA in situ hybridization and immunofluorescence in E9.5 or E10.5 wildtype and Slc7a5-null embryos for key marker genes. (O-P) Neurog2 expression in wildtype (O-o4) and Slc7a5-null embryos (P-p4) (n= 5 and n=6 each), showing reduced expression in forebrain (o2, p2), cranial ganglia (o1, o3, p1, p3, arrowheads) and in spinal cord at level of forelimb (o4, p4, arrowheads indicate position of neural crest). Data information: Scale bars 200 µm, except sections 100 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "Sox10", "in", "situ", "hybridization", "in", "(", "A", ")", "wildtype", "and", "(", "B", ")", "Slc7a5", "-", "null", "E9", ".", "5", "embryos", "(", "n", "=", "4", "each", ")", "with", "TSs", "of", "(", "a1", ",", "b1", ")", "the", "hindbrain", "at", "level", "of", "trigeminal", "ganglion", "V", ",", "(", "a2", ",", "b2", ")", "otic", "vesicles", "and", "the", "neural", "tube", "at", "more", "posterior", "levels", "(", "a3", ",", "a4", ",", "b3", ",", "b4", ")", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", ",", "except", "sections", "a1", "-", "b4", ",", "100", "µm", ".", "Closed", "white", "arrowheads", "in", "(", "a3", ",", "a4", ")", "indicate", "neural", "crest", ",", "open", "white", "arrowheads", "indicate", "depleted", "neural", "crest", "in", "(", "b3", ")", "and", "position", "where", "neural", "crest", "should", "be", "in", "(", "b4", ")", ".", "(", "C", "-", "G", ")", "Immunofluorescence", "on", "TSs", "caudal", "spinal", "cord", "of", "E9", ".", "5", "wildtype", "littermates", "and", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", ";", "Pax3", "and", "FoxA2", "were", "used", "as", "indicators", "for", "dorso", "-", "ventral", "organisation", "in", "(", "C", ",", "F", ")", "wildtype", ",", "n", "=", "2", "(", "for", "FoxA2", ")", "and", "n", "=", "4", "(", "For", "Pax3", ")", "and", "(", "D", ",", "G", ")", "Slc7a5", "-", "null", ",", "n", "=", "3", "(", "for", "FoxA2", ")", "and", "n", "=", "3", "for", "Pax3", ")", "neural", "tube", ".", "Arrowheads", "indicate", "border", "of", "Pax3", "expression", "domain", ".", "Scale", "bars", "50", "µm", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "Pax3", "expressing", "cells", "was", "determined", "by", "counting", "these", "cells", "and", "all", "DAPI", "labelled", "nuclei", "in", "the", "neural", "tube", "and", "comparison", "made", "between", "wildtype", "(", "4", "embryos", ",", "6", "sections", "each", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "3", "embryos", ",", "6", "sections", "each", ")", ",", "each", "dot", "represents", "the", "average", "for", "one", "embryo", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "018", "(", "see", "original", "source", "data", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) Sox10 in situ hybridization in (A) wildtype and (B) Slc7a5-null E9.5 embryos (n=4 each) with TSs of (a1, b1) the hindbrain at level of trigeminal ganglion V, (a2, b2) otic vesicles and the neural tube at more posterior levels (a3, a4, b3, b4). Scale bars 200 µm, except sections a1 - b4, 100 µm. Closed white arrowheads in (a3, a4) indicate neural crest, open white arrowheads indicate depleted neural crest in (b3) and position where neural crest should be in (b4).(C-G) Immunofluorescence on TSs caudal spinal cord of E9.5 wildtype littermates and Slc7a5-null embryos; Pax3 and FoxA2 were used as indicators for dorso-ventral organisation in (C, F) wildtype, n=2 (for FoxA2) and n= 4 (For Pax3) and (D, G) Slc7a5-null, n=3 (for FoxA2 ) and n = 3 for Pax3) neural tube. Arrowheads indicate border of Pax3 expression domain. Scale bars 50 µm. (E) Percentage of Pax3 expressing cells was determined by counting these cells and all DAPI labelled nuclei in the neural tube and comparison made between wildtype (4 embryos, 6 sections each) and Slc7a5-null (3 embryos, 6 sections each), each dot represents the average for one embryo, unpaired t-test, *p = 0.018 (see original source data). Error bars indicate SEM. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "D", ")", "Proliferation", "was", "assessed", "in", "the", "spinal", "cord", "(", "forelimb", "level", ")", "(", "A", ",", "B", ")", "using", "a", "phospho", "-", "Histone3", "(", "phospho", "-", "H3", ")", "antibody", "(", "green", ")", "to", "identify", "mitotic", "cells", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "to", "label", "nuclei", ";", "cells", "were", "counted", "in", "3", "wildtype", "(", "18", "sections", ")", "and", "3", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "(", "18", "sections", ")", "and", "mitotic", "index", "calculated", ";", "(", "C", ",", "D", ")", "Proliferation", "was", "also", "assessed", "in", "the", "forebrain", "in", "3", "wildtype", "embryos", "(", "17", "sections", ")", "and", "3", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "(", "16", "sections", ")", ".", "White", "dashed", "lines", "indicate", "midline", ".", "Data", "information", "All", "scale", "bars", "50", "µm", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Comparison", "of", "mitotic", "index", "in", "wildtype", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "E", ")", "spinal", "cord", ",", "p", "=", "0", ".", "872", ",", "and", "(", "F", ")", "forebrain", "*", "p", "=", "0", ".", "049", ",", "each", "dot", "represents", "the", "average", "for", "one", "embryo", ",", "unpaired", "t", "-", "test", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "G", ",", "H", ")", "mTORC1", "activity", "in", "the", "spinal", "cord", "(", "hindlimb", "level", ")", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", "using", "an", "antibody", "against", "the", "phospho", "-", "ribosomal", "protein", "S6", "(", "phosho", "-", "S6", "Ser", "235", "/", "236", ")", ".", "Data", "information", "All", "scale", "bars", "50", "µm", ".", "(", "I", ")", "Labelling", "intensity", "was", "measured", "and", "plotted", "relative", "to", "DAPI", "intensity", ";", "6", "wildtype", "embryos", "(", "18", "sections", ")", "and", "5", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", "(", "19", "sections", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "average", "for", "one", "embryo", ",", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0457", ")", "unpaired", "t", "-", "test", "with", "Welch", "correction", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "J", ")", "Western", "blot", "of", "individual", "E9", ".", "5", "wildtype", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "n", "=", "4", ")", "embryo", "lysates", "immunoblotted", "using", "an", "antibody", "against", "phospho", "-", "S6K", "(", "Thr389", ")", "and", "total", "P70S6K", "for", "loading", "control", ".", "Band", "intensities", "were", "measured", "with", "FIJI", "and", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "statistical", "analysis", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "K", "-", "L", ")", "(", "K", ")", "Validation", "by", "qPCR", "of", "the", "targets", "identified", "by", "RNAseq", ";", "qPCR", "was", "performed", "on", "individual", "E8", ".", "5", "embryos", "of", "each", "genotype", "(", "wildtype", "n", "=", "5", ",", "heterozygous", "n", "=", "9", "and", "Slc7a5", "-", "null", "n", "=", "7", ")", ".", "(", "L", ")", "qPCR", "was", "performed", "on", "individual", "E9", ".", "5", "embryos", "(", "wildtype", "n", "=", "5", ",", "heterozygous", "n", "=", "3", "and", "Slc7a5", "-", "null", "n", "=", "4", ")", "using", "primers", "specific", "for", "genes", "associated", "with", "the", "integrated", "stress", "response", ".", "A", "one", "-", "way", "Anova", "test", "with", "a", "Turkey", "post", "-", "test", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "Error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-D) Proliferation was assessed in the spinal cord (forelimb level) (A, B) using a phospho-Histone3 (phospho-H3) antibody (green) to identify mitotic cells and DAPI (blue) to label nuclei; cells were counted in 3 wildtype (18 sections) and 3 Slc7a5-null embryos (18 sections) and mitotic index calculated; (C, D) Proliferation was also assessed in the forebrain in 3 wildtype embryos (17 sections) and 3 Slc7a5-null embryos (16 sections). White dashed lines indicate midline. Data information All scale bars 50 µm.(E, F) Comparison of mitotic index in wildtype and Slc7a5-null (E) spinal cord, p = 0.872 ,and (F) forebrain *p = 0.049, each dot represents the average for one embryo, unpaired t-test Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(G, H) mTORC1 activity in the spinal cord (hindlimb level) was assessed by immunofluorescence using an antibody against the phospho-ribosomal protein S6 (phosho-S6 Ser 235/236). Data information All scale bars 50 µm.(I) Labelling intensity was measured and plotted relative to DAPI intensity; 6 wildtype embryos (18 sections) and 5 Slc7a5-null embryos (19 sections). Each dot represents the average for one embryo, (*p = 0.0457) unpaired t-test with Welch correction Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(J) Western blot of individual E9.5 wildtype (n=3) and Slc7a5-null (n=4) embryo lysates immunoblotted using an antibody against phospho-S6K (Thr389) and total P70S6K for loading control. Band intensities were measured with FIJI and an unpaired t-test was performed for statistical analysis Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001(K-L) (K) Validation by qPCR of the targets identified by RNAseq; qPCR was performed on individual E8.5 embryos of each genotype (wildtype n=5, heterozygous n=9 and Slc7a5-null n=7). (L) qPCR was performed on individual E9.5 embryos (wildtype n=5, heterozygous n=3 and Slc7a5-null n=4) using primers specific for genes associated with the integrated stress response. A one-way Anova test with a Turkey post-test was performed. Data information: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 Error bars indicate SEM."}
{"words": ["Figure", "5mRNA", "in", "situ", "hybridization", "was", "performed", "at", "E9", ".", "5", "to", "detect", "Chac1", "in", "(", "A", "-", "a6", ")", "wildtype", "and", "(", "B", "-", "b6", ")", "Slc7a5", "-", "null", "littermate", "embryos", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "condition", ")", ";", "Chac1", "expression", "at", "E10", "in", "emerging", "limb", "buds", "assessed", "in", "(", "C", ")", "wildtype", "and", "(", "D", ")", "Slc7a5", "-", "null", "littermate", "embryos", "(", "n", "=", "2", "for", "each", "condition", ")", "Scale", "bars", "200", "µm", "for", "whole", "embryo", "images", "and", "100", "µm", "for", "sections", ".", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "was", "performed", "at", "E9", ".", "5", "to", "detect", "Trib3", "mRNA", "detected", "in", "(", "E", "-", "e6", ")", "wildtype", "and", "(", "F", "-", "f6", ")", "Slc7a5", "-", "null", "littermate", "embryos", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "condition", ")", "and", "in", "emerging", "limb", "buds", "at", "E10", ".", "5", "assessed", "in", "(", "G", ")", "wildtype", "and", "(", "H", ")", "Slc7a5", "-", "null", "littermate", "embryos", "(", "n", "=", "2", "for", "each", "condition", ")", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", "for", "whole", "embryo", "images", "and", "100", "µm", "for", "sections", ".", "mRNA", "in", "situ", "hybridization", "was", "performed", "at", "E9", ".", "5", "Chac1", "and", "Trib3", "transcripts", "were", "also", "detected", "in", "wildtype", "E9", ".", "5", "embryos", "after", ">", "3", "days", "in", "situ", "hybridisation", "reaction", "(", "n", "=", "3", "and", "n", "=", "6", "respectively", ")", ".", "Lateral", "view", "(", "I", "and", "K", ")", ",", "optic", "vesicles", "(", "white", "arrowheads", ")", ",", "branchial", "arches", "(", "ba", ")", "and", "otic", "vesicles", "(", "ov", ")", ".", "Dorsal", "view", "(", "J", "and", "L", ")", ",", "neural", "tube", "(", "nt", ")", "and", "limb", "buds", "(", "white", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", "for", "whole", "embryo", "images", "and", "100", "µm", "for", "sections", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5mRNA in situ hybridization was performed at E9.5 to detect Chac1 in (A-a6) wildtype and (B-b6) Slc7a5-null littermate embryos (n=3 for each condition); Chac1 expression at E10 in emerging limb buds assessed in (C) wildtype and (D) Slc7a5-null littermate embryos (n=2 for each condition) Scale bars 200 µm for whole embryo images and 100 µm for sections.mRNA in situ hybridization was performed at E9.5 to detect Trib3 mRNA detected in (E-e6) wildtype and (F-f6) Slc7a5-null littermate embryos (n=3 for each condition) and in emerging limb buds at E10.5 assessed in (G) wildtype and (H) Slc7a5-null littermate embryos (n=2 for each condition). Scale bars 200 µm for whole embryo images and 100 µm for sections.mRNA in situ hybridization was performed at E9.5 Chac1 and Trib3 transcripts were also detected in wildtype E9.5 embryos after >3 days in situ hybridisation reaction (n=3 and n=6 respectively). Lateral view (I and K), optic vesicles (white arrowheads), branchial arches (ba) and otic vesicles (ov). Dorsal view (J and L), neural tube (nt) and limb buds (white arrowheads). Scale bars 200 µm for whole embryo images and 100 µm for sections."}
{"words": ["Figure", "6Western", "blot", "of", "individual", "E9", ".", "5", "wildtype", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "n", "=", "4", ")", "embryo", "lysates", "immunoblotted", "using", "an", "antibody", "against", "phospho", "-", "GCN2", "(", "Thr899", ")", "and", "total", "GCN2", "(", "loading", "control", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ";", "band", "intensities", "measured", "with", "FIJI", "and", "analysed", "with", "unpaired", "t", "-", "test", "Data", "information", ":", "All", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "Western", "blot", "of", "individual", "E9", ".", "5", "wildtype", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "n", "=", "4", ")", "embryo", "lysates", "immunoblotted", "using", "an", "antibody", "against", "phospho", "-", "eIF2α", "(", "Ser51", ")", "and", "total", "eIFα", "(", "loading", "control", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0482", ",", "band", "intensities", "measured", "with", "FIJI", "and", "analysed", "with", "unpaired", "t", "-", "test", "Data", "information", ":", "All", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "phosphorylated", "eIFα", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", "in", "E9", ".", "5", "embryos", "in", "the", "forebrain", ",", "wildtype", "(", "C", ",", "c1", ")", "(", "n", "=", "2", "embryos", ",", "0", "/", "14", "sections", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "D", ",", "d1", ")", "(", "n", "=", "2", "embryos", "16", "/", "16", "sections", ")", ",", "and", "in", "hindbrain", "/", "anterior", "spinal", "cord", ",", "wildtype", "(", "E", "-", "e2", ")", "(", "n", "=", "4", "embryos", ",", "0", "/", "62", "sections", ")", "and", "Slc7a5", "-", "null", "(", "F", "-", "f2", ")", "(", "n", "=", "4", "embryos", ",", "54", "/", "54", "sections", ")", "including", "in", "the", "otic", "vesicle", "(", "compare", "e2", ",", "f2", ")", ".", "Scale", "bars", "in", "(", "C", "-", "e1", ",", "D", "-", "f1", ")", "100", "µm", "and", "in", "(", "e2", "and", "f2", ")", "25µm", ".", "Arrowheads", "indicate", "ventral", "midline", ".", "(", "G", ")", "An", "increase", "in", "Trib3", "protein", "was", "detected", "by", "Western", "blot", "in", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", ",", "each", "lane", "represents", "an", "E9", ".", "5", "embryo", "lysate", "(", "wildtype", "n", "=", "3", ",", "Slc7a5", "-", "null", ",", "n", "=", "4", ")", "with", "α", "-", "Tubulin", "loading", "control", ",", "unpaired", "t", "-", "test", "*", "p", "=", "0", ".", "0153", "Data", "information", ":", "All", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "H", "-", "L", ")", "TUNEL", "assay", "to", "detect", "apoptotic", "cells", "in", "wildtype", "(", "n", "=", "3", "embryos", ",", "32", "sections", ")", "or", "Slc7a5", "-", "null", "(", "n", "=", "5", "embryos", ",", "47", "sections", ")", ";", "(", "H", ",", "I", ")", "transverse", "sections", "through", "the", "head", "at", "level", "of", "the", "forebrain", "and", "(", "J", ",", "K", ")", "the", "spinal", "cord", ",", "(", "H", "-", "K", ")", "scale", "bars", "50", "µm", ",", "arrowheads", "indicate", "ventral", "midline", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "TUNEL", "positive", "cells", "within", "spinal", "cord", "sections", "was", "performed", "Each", "dot", "represents", "the", "average", "apoptosis", "cell", "count", "for", "a", "single", "embryo", ",", "Welch", "'", "s", "correction", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "250", ",", "F", "-", "test", "to", "compare", "variances", ",", "p", "=", "0", ".", "0003", "Data", "information", ":", "All", "error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blot of individual E9.5 wildtype (n=4) and Slc7a5-null (n=4) embryo lysates immunoblotted using an antibody against phospho-GCN2 (Thr899) and total GCN2 (loading control), ***p = 0.0001 ; band intensities measured with FIJI and analysed with unpaired t-test Data information: All error bars indicate SEM.Western blot of individual E9.5 wildtype (n=4) and Slc7a5-null (n=4) embryo lysates immunoblotted using an antibody against phospho-eIF2α (Ser51) and total eIFα (loading control), *p = 0.0482, band intensities measured with FIJI and analysed with unpaired t-test Data information: All error bars indicate SEM.(C-F) phosphorylated eIFα was assessed by immunofluorescence in E9.5 embryos in the forebrain, wildtype (C,c1) (n=2 embryos, 0/14 sections) and Slc7a5-null (D, d1) (n=2 embryos 16/16 sections), and in hindbrain/anterior spinal cord, wildtype (E-e2) (n= 4 embryos, 0/62 sections) and Slc7a5-null (F-f2) (n= 4 embryos, 54/54 sections) including in the otic vesicle (compare e2, f2). Scale bars in (C-e1, D-f1) 100 µm and in (e2 and f2) 25µm. Arrowheads indicate ventral midline.(G) An increase in Trib3 protein was detected by Western blot in Slc7a5-null embryos, each lane represents an E9.5 embryo lysate (wildtype n=3, Slc7a5-null, n=4) with α-Tubulin loading control, unpaired t-test *p = 0.0153 Data information: All error bars indicate SEM.(H-L) TUNEL assay to detect apoptotic cells in wildtype (n=3 embryos, 32 sections) or Slc7a5-null (n=5 embryos, 47 sections); (H, I) transverse sections through the head at level of the forebrain and (J, K) the spinal cord, (H-K) scale bars 50 µm, arrowheads indicate ventral midline. (L) Quantification of TUNEL positive cells within spinal cord sections was performed Each dot represents the average apoptosis cell count for a single embryo, Welch's correction unpaired t-test, p = 0.250, F-test to compare variances, p = 0.0003 Data information: All error bars indicate SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "(", "A", ",", "a1", ")", "Wnt", "β", "-", "catenin", "target", "Axin2", "strongly", "expressed", "in", "littermate", ",", "(", "a2", ",", "a3", ")", "in", "TS", ",", "and", "(", "B", ",", "b1", ")", "in", "Scl7a5", "-", "null", "embryos", "(", "b2", ",", "b3", ")", "in", "TS", "(", "n", "=", "2", "littermates", ",", "n", "=", "6", "/", "6", "Slc7a5", "-", "null", "embryos", ")", ".", "Data", "information", ":", "White", "dashed", "lines", "indicate", "position", "of", "sections", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", "(", "C", ",", "d1", ")", "Axin2", "transcripts", "in", "embryo", "trunk", "explant", "exposed", "to", "DMSO", "(", "C", ",", "c1", ",", "n", "=", "12", "/", "12", ")", "were", "reduced", "in", "Wnt", "-", "c59", "exposed", "explants", "(", "D", ",", "d1", ",", "n", "=", "14", "/", "14", ")", ".", "Images", "in", "(", "c1", ",", "d1", ")", "show", "TS", "through", "explants", "(", "data", "from", "3", "independent", "embryo", "explant", "experiments", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Slc7a5", "transcripts", "in", "embryo", "trunk", "explant", "exposed", "to", "DMSO", "(", "E", ",", "e1", ",", "n", "=", "9", "/", "10", ")", "or", "Wnt", "-", "c59", "(", "F", ",", "f1", ",", "n", "=", "15", "/", "15", ")", ".", "Images", "in", "(", "e1", ",", "f1", ")", "show", "TS", "through", "explants", "(", "data", "from", "3", "independent", "embryo", "explant", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", "(", "G", ",", "H", ")", "Slc7a5", "expression", "in", "control", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "heterozygous", "littermate", "embryo", "(", "G", ",", "g1", ")", "and", "in", "TS", "(", "g2", ",", "g3", ")", ",", "and", "in", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "mutant", "embryo", "where", "Slc7a5", "transcripts", "are", "absent", "in", "posterior", "neural", "tube", "(", "the", "region", "of", "T", "-", "cre", "recombination", ",", "indicated", "with", "white", "arrowhead", "in", "H", ")", "and", "shown", "in", "TS", "in", "(", "h2", ",", "h3", ")", "(", "n", "=", "0", "/", "6", "littermate", "and", "n", "=", "6", "/", "6", "mutant", "embryos", ")", ".", "Data", "information", ":", "White", "dashed", "lines", "indicate", "position", "of", "sections", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "µm", "(", "I", ",", "J", ")", "Trib3", "is", "lacking", "in", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "heterozygous", "control", "embryos", "at", "E7", ".", "75", "(", "I", ")", ",", "caudal", "region", "dissected", "from", "the", "same", "embryo", "(", "white", "dashed", "box", "in", "I", ")", "(", "i1", ")", "and", "viewed", "in", "TS", "(", "i2", ")", ";", "Trib3", "detected", "in", "homozygous", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "embryo", "(", "J", ")", ",", "in", "caudal", "region", "dissected", "from", "the", "same", "embryo", "(", "white", "dashed", "box", "in", "J", ")", "(", "j1", ")", "and", "shown", "in", "TS", "in", "caudal", "epiblast", "and", "remnant", "primitive", "streak", "(", "ps", ")", "(", "j2", ")", "(", "n", "=", "3", "/", "3", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "embryos", "and", "14", "littermate", "controls", ")", ".", "Trib3", "was", "also", "detected", "in", "the", "more", "rostral", "forming", "neural", "tube", "at", "this", "early", "stage", "(", "seen", "in", "J", ")", "and", "so", "in", "cells", "not", "directly", "experiencing", "β", "-", "catenin", "loss", ";", "this", "may", "reflect", "the", "failure", "to", "form", "paraxial", "mesoderm", ",", "which", "provides", "signals", "that", "promote", "and", "support", "neurogenesis", ".", "Data", "information", ":", "White", "dashed", "lines", "indicate", "position", "of", "sections", ".", "Scale", "bars", "all", "sections", "50", "µm", ".", "(", "K", "-", "M", ")", "At", "E9", ".", "5", "Trib3", "was", "not", "detected", "in", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "heterozygous", "littermate", "embryos", "(", "K", ",", "k1", ")", "and", "in", "TS", "(", "k2", ",", "k3", ")", ",", "but", "was", "detected", "in", "homozygous", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "mutant", "embryos", "(", "L", "-", "m3", ")", "in", "patches", "of", "cells", "in", "neural", "tube", "(", "nt", ")", "(", "L", "-", "l2", ")", ",", "gut", "(", "g", ")", "(", "l3", ")", "and", "somites", "(", "s", ")", "(", "m2", ",", "arrowheads", ")", "(", "n", "=", "9", "/", "9", "T", "-", "Cre", ";", "Ctnnb1flLOF", "/", "Δ", "embryos", "and", "12", "littermate", "controls", ")", ".", "Data", "information", ":", "White", "dashed", "lines", "indicate", "position", "of", "sections", ".", "Scale", "bars", ",", "all", "sections", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) (A,a1) Wnt β-catenin target Axin2 strongly expressed in littermate, (a2, a3) in TS, and (B, b1) in Scl7a5-null embryos (b2, b3) in TS (n=2 littermates, n=6/6 Slc7a5-null embryos). Data information: White dashed lines indicate position of sections. Scale bars 200 µm(C, d1) Axin2 transcripts in embryo trunk explant exposed to DMSO (C, c1, n=12/12) were reduced in Wnt-c59 exposed explants (D, d1, n=14/14). Images in (c1, d1) show TS through explants (data from 3 independent embryo explant experiments). (E, F) Slc7a5 transcripts in embryo trunk explant exposed to DMSO (E, e1, n=9/10) or Wnt-c59 (F, f1, n=15/15). Images in (e1, f1) show TS through explants (data from 3 independent embryo explant experiments). Data information: Scale bars = 100 µm(G, H) Slc7a5 expression in control T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ heterozygous littermate embryo (G, g1) and in TS (g2, g3), and in T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ mutant embryo where Slc7a5 transcripts are absent in posterior neural tube (the region of T-cre recombination, indicated with white arrowhead in H) and shown in TS in (h2, h3) (n= 0/6 littermate and n=6/6 mutant embryos). Data information: White dashed lines indicate position of sections. Scale bars, 200 µm(I, J) Trib3 is lacking in T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ heterozygous control embryos at E7.75 (I), caudal region dissected from the same embryo (white dashed box in I) (i1) and viewed in TS (i2); Trib3 detected in homozygous T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ embryo (J), in caudal region dissected from the same embryo (white dashed box in J) (j1) and shown in TS in caudal epiblast and remnant primitive streak (ps) (j2) (n= 3/3 T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ embryos and 14 littermate controls). Trib3 was also detected in the more rostral forming neural tube at this early stage (seen in J) and so in cells not directly experiencing β-catenin loss; this may reflect the failure to form paraxial mesoderm, which provides signals that promote and support neurogenesis. Data information: White dashed lines indicate position of sections. Scale bars all sections 50 µm.(K-M) At E9.5 Trib3 was not detected in T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ heterozygous littermate embryos (K, k1) and in TS ( k2, k3), but was detected in homozygous T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ mutant embryos (L-m3) in patches of cells in neural tube (nt) (L - l2), gut (g) (l3) and somites (s) (m2, arrowheads) (n=9/9 T-Cre;Ctnnb1flLOF/Δ embryos and 12 littermate controls). Data information: White dashed lines indicate position of sections. Scale bars, all sections 50 µm."}
{"words": ["Figure", "1Selected", "BioID", "REV7", "results", ",", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "The", "spectral", "counts", "for", "each", "indicated", "prey", "protein", "are", "shown", "as", "AvgSpec", ".", "Proteins", "were", "selected", "based", "on", "and", "iProphet", "probability", "of", ">", "0", ".", "95", ",", "BFDR", "of", "<", "0", ".", "05", "and", "≥", "10", "peptide", "count", ".", "The", "circle", "size", "represents", "the", "relative", "abundance", "of", "preys", "over", "baits", ".", "U2OS", "EJ5", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "At", "24hr", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "SceI", "expression", "plasmid", ",", "and", "the", "GFP", "+", "population", "was", "analyzed", "48", "hr", "post", "-", "plasmid", "transfection", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "determined", "for", "each", "individual", "condition", "and", "subsequently", "normalized", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "(", "siCTRL", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Selected BioID REV7 results, shown as dot plots. The spectral counts for each indicated prey protein are shown as AvgSpec. Proteins were selected based on and iProphet probability of >0.95, BFDR of <0.05 and ≥10 peptide count. The circle size represents the relative abundance of preys over baits.U2OS EJ5-GFP cells were transfected with the indicated siRNAs. At 24hr post-transfection, cells were transfected with the I-SceI expression plasmid, and the GFP+ population was analyzed 48 hr post-plasmid transfection. The percentage of GFP+ cells was determined for each individual condition and subsequently normalized to the non-targeting condition (siCTRL)."}
{"words": ["Figure", "2Quantification", "of", "the", "Neutral", "Comet", "assay", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "shCtrl", ",", "shREV7", "or", "shSHLD2", "were", "exposed", "to", "IR", "(", "10", "Gy", ")", "and", "run", "in", "low", "melting", "agarose", "under", "neutral", "conditions", ".", "Immunofluorescence", "against", "DNA", "stained", "with", "SYBR", "Gold", "was", "performed", "to", "measure", "the", "tail", "moment", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ".", "48h", "post", "-", "transfection", "the", "cells", "were", "treated", "with", "NCS", "to", "induce", "DNA", "damage", "and", "the", "cells", "were", "harvested", "at", "0", ",", "1", ",", "2", ",", "4", "and", "24", "hr", "post", "NCS", "treatment", ".", "Flow", "Cytometry", "analysis", "of", "phosphorylated", "-", "H2AX", "signal", "was", "used", "to", "measure", "γ", "-", "H2AX", "endogenous", "signal", ".", "Sensitivity", "to", "IR", "monitored", "by", "colony", "formation", "assay", ".", "MCF", "-", "7", "cells", "stably", "expressing", "the", "the", "indicated", "shRNAs", "were", "exposed", "to", "increasing", "doses", "of", "IR", ".", "24", "h", "post", "-", "irradiation", ",", "the", "cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "allow", "colony", "formation", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "0", ".", "4", "%", "crystal", "violet", ".", "Shown", "is", "the", "quantification", "of", "colonies", "per", "condition", "which", "possessed", "more", "than", "50", "colonies", ".", "MCF", "-", "7", "cells", "stably", "expressing", "the", "the", "indicated", "shRNAs", "24", "h", "post", "-", "irradiation", ",", "the", "cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "allow", "colony", "formation", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "0", ".", "4", "%", "crystal", "violet", ".", "Shown", "is", "the", "quantification", "of", "colonies", "per", "condition", "which", "possessed", "more", "than", "50", "colonies", ".", "cells", "were", "exposed", "to", "increasing", "doses", "of", "UV", "radiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Quantification of the Neutral Comet assay. U2OS cells stably expressing shCtrl, shREV7 or shSHLD2 were exposed to IR (10 Gy) and run in low melting agarose under neutral conditions. Immunofluorescence against DNA stained with SYBR Gold was performed to measure the tail moment.U2OS cells were transfected with the indicated siRNA. 48h post-transfection the cells were treated with NCS to induce DNA damage and the cells were harvested at 0, 1, 2, 4 and 24 hr post NCS treatment. Flow Cytometry analysis of phosphorylated-H2AX signal was used to measure γ-H2AX endogenous signal.Sensitivity to IR monitored by colony formation assay. MCF-7 cells stably expressing the the indicated shRNAs were exposed to increasing doses of IR. 24 h post-irradiation, the cells were re-seeded to allow colony formation, fixed and stained with 0.4% crystal violet. Shown is the quantification of colonies per condition which possessed more than 50 colonies.MCF-7 cells stably expressing the the indicated shRNAs 24 h post-irradiation, the cells were re-seeded to allow colony formation, fixed and stained with 0.4% crystal violet. Shown is the quantification of colonies per condition which possessed more than 50 colonies. cells were exposed to increasing doses of UV radiation."}
{"words": ["Figure", "3U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "REV7", "(", "Top", ")", "or", "HA", "-", "SHLD2", "(", "Bottom", ")", "were", "pre", "-", "sensitized", "with", "10ug", "/", "mL", "Hoescht", "33342", "before", "exposed", "to", "UV", "micro", "-", "irradiation", ".", "Immunofluorescence", "against", "endogenous", "HA", "and", "γ", "-", "H2AX", "epitope", "was", "subsequently", "performed", "to", "monitor", "REV7", "and", "SHLD2", "accumulation", "at", "sites", "of", "damage", ".", "Shown", "are", "representative", "micrographs", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "U2OS", "LacR", "-", "Fok1", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "or", "GFP", "-", "SHLD2", "and", "24", "h", "later", "DNA", "damage", "was", "induced", "using", "Shield", "-", "1", "and", "4", "-", "OHT", ".", "The", "cells", "were", "then", "processed", "for", "GFP", "and", "mCherry", "immunofluorescence", ".", "Shown", "are", "representative", "micrographs", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", ".", "Quantification", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "At", "least", "100", "cells", "per", "condition", "were", "counted", ".", "Quantification", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Shown", "is", "the", "quantification", "of", "the", "GFP", "signal", "at", "the", "mCherry", "-", "LacR", "-", "Fok1", "focus", ".", "293T", "cell", "lines", "expressing", "ER", "-", "AsiSI", "with", "Flag", "-", "SHLD2", "and", "treated", "with", "1", "µM", "of", "4", "-", "OHT", ".", "6h", "later", "the", "cells", "were", "processed", "and", "immunoprecipitated", "with", "Anti", "-", "FLAG", "Magnetic", "Beads", "and", "anti", "-", "γ", "-", "H2AX", ".", "x", "/", "Protein", "A", "/", "G", "magnetic", "beads", ".", "DNA", "was", "purified", "and", "subjected", "to", "qPCR", "detection", ".", "Shown", "is", "the", "quantification", "of", "IP", "efficiency", "as", "the", "percentage", "of", "DNA", "precipitated", "from", "input", "(", "Bottom", ")", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HA", "-", "SHLD2", "∆", "720", "-", "904", "(", "Left", ")", "or", "HA", "-", "SHLD2", "∆", "1", "-", "680", "(", "Right", ")", "were", "processed", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Immunofluorescence", "against", "endogenous", "HA", "and", "RPA32", "epitope", "was", "subsequently", "performed", "to", "monitor", "RPA32", "and", "SHLD2", "accumulation", "at", "sites", "of", "damage", ".", "Shown", "are", "representative", "micrographs", ".", "Scale", "bar", "=", "5µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3U2OS cells stably expressing HA-REV7 (Top) or HA-SHLD2 (Bottom) were pre-sensitized with 10ug/mL Hoescht 33342 before exposed to UV micro-irradiation. Immunofluorescence against endogenous HA and γ-H2AX epitope was subsequently performed to monitor REV7 and SHLD2 accumulation at sites of damage. Shown are representative micrographs. Scale bar = 5µm.U2OS LacR-Fok1 cells were transfected with GFP or GFP-SHLD2 and 24 h later DNA damage was induced using Shield-1 and 4-OHT. The cells were then processed for GFP and mCherry immunofluorescence. Shown are representative micrographs. Scale bar = 5µm. Quantification of the experiments shown in (C). Data are represented as the mean ± SD (n=3). At least 100 cells per condition were counted.Quantification of the experiments shown in (C). Shown is the quantification of the GFP signal at the mCherry-LacR-Fok1 focus.293T cell lines expressing ER-AsiSI with Flag-SHLD2 and treated with 1 µM of 4-OHT. 6h later the cells were processed and immunoprecipitated with Anti-FLAG Magnetic Beads and anti-γ-H2AX.x/Protein A/G magnetic beads. DNA was purified and subjected to qPCR detection. Shown is the quantification of IP efficiency as the percentage of DNA precipitated from input (Bottom).U2OS cells stably expressing HA-SHLD2∆720-904 (Left) or HA-SHLD2∆1-680 (Right) were processed as in (B). Immunofluorescence against endogenous HA and RPA32 epitope was subsequently performed to monitor RPA32 and SHLD2 accumulation at sites of damage. Shown are representative micrographs. Scale bar = 5µm."}
{"words": ["Figure", "4U2OS", "mCherry", "-", "LacR", "-", "Fok1", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNA", "and", "subsequently", "transfected", "with", "a", "GFP", "-", "SHLD2", "construct", ".", "24", "h", "post", "-", "transfection", "DNA", "damage", "was", "induced", "using", "Shield", "-", "1", "and", "4", "-", "OHT", ".", "The", "cells", "were", "then", "fixed", "and", "analyzed", "for", "the", "intensity", "of", "the", "GFP", "-", "SHLD2", "signal", "at", "mCherry", "-", "LacR", "-", "Fok1", "focus", ".", "Shown", "is", "the", "quantification", "of", "the", "GFP", "-", "SHLD2", "signal", "at", "the", "Fok1", "focus", ".", "Data", "are", "represented", "as", "a", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "where", "the", "whiskers", "represent", "the", "10", "-", "90", "percentile", ".", "At", "least", "75", "cells", "were", "counted", "per", "condition", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "REV7", "and", "GFP", "-", "SHLD2", "expression", "vectors", "as", "indicated", ".", "24h", "post", "-", "transfection", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "with", "10uM", "of", "ATM", "inhibitor", "KU", "-", "60019", "for", "1", "h", "prior", "to", "irradiation", ".", "1h", "post", "-", "irradiation", "(", "10", "Gy", ")", "nuclear", "extracts", "were", "prepared", "and", "REV7", "complexes", "were", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "Resin", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "GFP", ",", "REV7", "and", "p", "-", "Chk1", "antibodies", ".", "U2OS", "EJ5", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "At", "24hr", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "SceI", "expression", "plasmid", ",", "and", "the", "GFP", "+", "population", "was", "analyzed", "48", "hr", "post", "-", "plasmid", "transfection", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "determined", "for", "each", "individual", "condition", "and", "subsequently", "normalized", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "(", "siCTRL", ")", ".", "CH12F3", "-", "2", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "shRNAs", "were", "stimulated", "with", "a", "cocktail", "of", "cytokines", "(", "CIT", ")", "to", "induce", "class", "switching", "to", "IgA", ".", "The", "percentage", "of", "IgA", "+", "cells", "was", "monitored", "24", "and", "48h", "post", "-", "stimulation", "by", "staining", "with", "an", "anti", "-", "IgA", "antibody", "followed", "by", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "U2OS", "DR", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "At", "24hr", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "SceI", "expression", "plasmid", ",", "and", "the", "GFP", "+", "population", "was", "analyzed", "48", "hr", "post", "-", "plasmid", "transfection", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "determined", "for", "each", "individual", "condition", "and", "subsequently", "normalized", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "(", "siCTRL", ")", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "then", "treated", "with", "CldU", ",", "IdU", "and", "NCS", "48h", "post", "-", "transfection", "as", "indicated", ".", "The", "slides", "were", "stained", ",", "dehydrated", ",", "mounted", "and", "visualized", "and", "shown", "is", "the", "quantification", "of", "CldU", "/", "IdU", "tract", "length", "in", "order", "to", "visualize", "DNA", "end", "-", "resection", "(", "Right", ")", ".", "At", "least", "500", "DNA", "tracks", "were", "measured", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4U2OS mCherry-LacR-Fok1 cells were treated with the indicated siRNA and subsequently transfected with a GFP-SHLD2 construct. 24 h post-transfection DNA damage was induced using Shield-1 and 4-OHT. The cells were then fixed and analyzed for the intensity of the GFP-SHLD2 signal at mCherry-LacR-Fok1 focus. Shown is the quantification of the GFP-SHLD2 signal at the Fok1 focus. Data are represented as a box-and-whisker plot where the whiskers represent the 10-90 percentile. At least 75 cells were counted per condition.293T cells were transfected with Flag-REV7 and GFP-SHLD2 expression vectors as indicated. 24h post-transfection cells were treated with DMSO or with 10uM of ATM inhibitor KU-60019 for 1 h prior to irradiation. 1h post-irradiation (10 Gy) nuclear extracts were prepared and REV7 complexes were immunoprecipitated using anti-Flag (M2) Resin and then analyzed by immunoblotting using GFP, REV7 and p-Chk1 antibodies.U2OS EJ5-GFP cells were transfected with the indicated siRNAs. At 24hr post-transfection, cells were transfected with the I-SceI expression plasmid, and the GFP+ population was analyzed 48 hr post-plasmid transfection. The percentage of GFP+ cells was determined for each individual condition and subsequently normalized to the non-targeting condition (siCTRL).CH12F3-2 cells stably expressing the indicated shRNAs were stimulated with a cocktail of cytokines (CIT) to induce class switching to IgA. The percentage of IgA+ cells was monitored 24 and 48h post-stimulation by staining with an anti-IgA antibody followed by flow cytometry analysis.U2OS DR-GFP cells were transfected with the indicated siRNAs. At 24hr post-transfection, cells were transfected with the I-SceI expression plasmid, and the GFP+ population was analyzed 48 hr post-plasmid transfection. The percentage of GFP+ cells was determined for each individual condition and subsequently normalized to the non-targeting condition (siCTRL).U2OS cells were transfected with the indicated siRNAs and then treated with CldU, IdU and NCS 48h post-transfection as indicated. The slides were stained, dehydrated, mounted and visualized and shown is the quantification of CldU/IdU tract length in order to visualize DNA end-resection (Right). At least 500 DNA tracks were measured per condition."}
{"words": ["Figure", "5Genes", "significantly", "enriched", "or", "dropped", "out", "after", "a", "14", "-", "day", "treatment", "with", "Doxorubicin", "were", "identified", "by", "plotting", "as", "a", "Log2", "fold", "change", "compared", "to", "untreated", ".", "Ranking", "was", "determined", "based", "on", "the", "Log2", "fold", "score", "(", "Left", ")", ".", "The", "top", "ten", "Doxorubicin", "sensitizers", "are", "indicated", "on", "the", "right", "with", "their", "respective", "fold", "change", "(", "Fc", ")", "in", "Log2", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "REV7", "and", "GFP", "-", "SHLD1", "(", "Left", ")", "or", "Flag", "-", "SHLD2", "and", "GFP", "-", "SHLD1", "(", "Right", ")", "expression", "vectors", "as", "indicated", ".", "24h", "post", "-", "transfection", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "with", "10uM", "of", "ATM", "inhibitor", "KU", "-", "60019", "for", "1", "h", "prior", "to", "irradiation", ".", "1h", "post", "-", "irradiation", "(", "10", "Gy", ")", "nuclear", "extracts", "were", "prepared", "and", "REV7", "or", "SHLD2", "complexes", "were", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", "Resin", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "GFP", "and", "REV7", "antibodies", ".", "U2OS", "EJ5", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "siCTRL", ",", "siSHLD1", "#", "1", "or", "siSHLD1", "#", "2", ".", "At", "24hr", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "SceI", "expression", "plasmid", ",", "and", "the", "GFP", "+", "population", "was", "analyzed", "48", "hr", "post", "-", "plasmid", "transfection", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "determined", "for", "each", "individual", "condition", "and", "subsequently", "normalized", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "(", "siCTRL", ")", ".", "CH12F3", "-", "2", "cells", "stably", "expressing", "either", "shCTRL", ",", "shSHLD1", "#", "1", "or", "shSHLD1", "#", "2", "were", "stimulated", "with", "a", "cocktail", "of", "cytokines", "(", "CIT", ")", "to", "induce", "class", "switching", "to", "IgA", ".", "The", "percentage", "of", "IgA", "+", "cells", "was", "monitored", "24", "and", "48h", "post", "-", "stimulation", "by", "staining", "with", "an", "anti", "-", "IgA", "antibody", "followed", "by", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "U2OS", "DR", "-", "GFP", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "At", "24hr", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "SceI", "expression", "plasmid", ",", "and", "the", "GFP", "+", "population", "was", "analyzed", "48", "hr", "post", "-", "plasmid", "transfection", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "determined", "for", "each", "individual", "condition", "and", "subsequently", "normalized", "to", "the", "non", "-", "targeting", "condition", "(", "siCTRL", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Genes significantly enriched or dropped out after a 14-day treatment with Doxorubicin were identified by plotting as a Log2 fold change compared to untreated. Ranking was determined based on the Log2 fold score (Left). The top ten Doxorubicin sensitizers are indicated on the right with their respective fold change (Fc) in Log2.293T cells were transfected with Flag-REV7 and GFP-SHLD1 (Left) or Flag-SHLD2 and GFP-SHLD1 (Right) expression vectors as indicated. 24h post-transfection cells were treated with DMSO or with 10uM of ATM inhibitor KU-60019 for 1 h prior to irradiation. 1h post-irradiation (10 Gy) nuclear extracts were prepared and REV7 or SHLD2 complexes were immunoprecipitated using anti-Flag (M2) Resin and then analyzed by immunoblotting using GFP and REV7 antibodies.U2OS EJ5-GFP cells were transfected with either siCTRL, siSHLD1 #1 or siSHLD1 #2. At 24hr post-transfection, cells were transfected with the I-SceI expression plasmid, and the GFP+ population was analyzed 48 hr post-plasmid transfection. The percentage of GFP+ cells was determined for each individual condition and subsequently normalized to the non-targeting condition (siCTRL).CH12F3-2 cells stably expressing either shCTRL, shSHLD1#1 or shSHLD1#2 were stimulated with a cocktail of cytokines (CIT) to induce class switching to IgA. The percentage of IgA+ cells was monitored 24 and 48h post-stimulation by staining with an anti-IgA antibody followed by flow cytometry analysis.U2OS DR-GFP cells were transfected with the indicated siRNAs. At 24hr post-transfection, cells were transfected with the I-SceI expression plasmid, and the GFP+ population was analyzed 48 hr post-plasmid transfection. The percentage of GFP+ cells was determined for each individual condition and subsequently normalized to the non-targeting condition (siCTRL)."}
{"words": ["Figure", "6Survival", "analysis", "of", "low", "and", "high", "expressers", "of", "SHLD2", "in", "a", "cohort", "of", "24", "patients", "affected", "by", "Triple", "Negative", "Breast", "cancer", "(", "TNBC", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "Kaplan", "-", "Meyer", "curves", "with", "expression", "classified", "as", "low", "and", "high", ".", "Relapse", "-", "free", "Survival", "(", "Basal", "Subtype", ")", "of", "low", "and", "high", "expressers", "of", "SHLD2", "obtained", "from", "the", "KM", "-", "plotter", "database", ".", "Data", "are", "represented", "as", "Kaplan", "-", "Meyer", "curves", "with", "expression", "classified", "as", "low", "and", "high", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Survival analysis of low and high expressers of SHLD2 in a cohort of 24 patients affected by Triple Negative Breast cancer (TNBC). Data are represented as Kaplan-Meyer curves with expression classified as low and high.Relapse-free Survival (Basal Subtype) of low and high expressers of SHLD2 obtained from the KM-plotter database. Data are represented as Kaplan-Meyer curves with expression classified as low and high."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblot", "of", "lysates", "prepared", "from", "the", "indicated", "SAMHD1", "-", "proficient", "(", "+", "/", "+", ")", ",", "deficient", "(", "-", "/", "-", ")", "and", "rescue", "(", "WT", ",", "H233A", ")", "cell", "line", "pairs", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "Proliferation", "inhibition", "analysis", "of", "ara", "-", "C", "and", "RNRi", "combination", "treatment", "in", "SAMHD1", "+", "/", "+", "or", "-", "/", "-", "THP", "-", "1", "cells", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "two", "(", "HU", "and", "dF", "-", "dC", ")", "or", "three", "(", "3", "-", "AP", ")", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "duplicate", ".", "Ara", "-", "C", "EC50", "values", "plotted", "as", "a", "function", "of", "RNRi", "concentration", "in", "SAMHD1", "+", "/", "+", ",", "-", "/", "-", "and", "rescue", "(", "WT", ",", "H233A", ")", "THP", "-", "1", "cell", "line", "pairs", ".", "EC50", "values", "in", "the", "absence", "of", "RNRi", "are", "indicated", "by", "the", "black", "and", "red", "dotted", "line", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "two", "(", "HU", "and", "dF", "-", "dC", ")", "or", "three", "(", "3", "-", "AP", ")", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "duplicate", ".", "Drug", "synergy", "plots", "for", "ara", "-", "C", "and", "the", "indicated", "RNRi", "in", "SAMHD1", "+", "/", "+", ",", "-", "/", "-", "and", "rescue", "(", "WT", ",", "H233A", ")", "cell", "line", "pairs", ".", "Each", "data", "point", "indicates", "an", "average", "delta", "score", "from", "a", "single", "dose", "-", "response", "matrix", "experiment", "performed", "in", "duplicate", ".", "Zero", ",", ">", "0", ",", "or", "<", "0", "corresponds", "to", "additive", ",", "synergy", ",", "or", "antagonism", ",", "respectively", ",", "whilst", ">", "5", "indicates", "strong", "synergy", ".", "The", "horizontal", "line", "and", "the", "error", "bars", "indicate", "the", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", ",", "respectively", ",", "statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", "≥", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Spearman", "correlation", "of", "relative", "SAMHD1", "protein", "abundance", "and", "synergy", "delta", "scores", "for", "ara", "-", "C", "versus", "HU", "or", "dF", "-", "dC", "in", "a", "panel", "(", "n", "=", "9", ")", "of", "haematological", "cancer", "cell", "lines", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Each", "data", "point", "corresponds", "to", "SAMHD1", "protein", "levels", "determined", "by", "immunoblot", "analysis", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "cell", "line", ",", "representative", "blot", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S2", ")", "and", "an", "average", "delta", "score", "from", "repeated", "dose", "-", "response", "matrix", "experiments", "each", "performed", "in", "triplicate", ":", "THP", "-", "1", ",", "n", "=", "4", ";", "HuT", "-", "78", ",", "n", "=", "2", ";", "HL", "-", "60", "/", "iva", ",", "n", "=", "1", ";", "KBM", "-", "7", ",", "n", "=", "2", "(", "HU", ")", "and", "3", "(", "dF", "-", "dC", ")", ";", "K562", ",", "n", "=", "3", "(", "HU", ")", "and", "4", "(", "dF", "-", "dC", ")", ";", "CCRF", "-", "CEM", ",", "n", "=", "3", "(", "HU", ")", "and", "4", "(", "dF", "-", "dC", ")", ";", "MV", "-", "4", "-", "11", ",", "n", "=", "2", "(", "HU", ")", "and", "3", "(", "dF", "-", "dC", ")", ";", "Jurkat", ",", "n", "=", "2", "(", "HU", ")", "and", "3", "(", "dF", "-", "dC", ")", ";", "MOLT", "-", "4", ",", "n", "=", "2", "(", "HU", ")", "an", "3", "(", "dF", "-", "dC", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "lysates", "prepared", "from", "SAMHD1", "+", "/", "+", "or", "-", "/", "-", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "for", "24", "h", "with", "ara", "-", "C", "and", "HU", ",", "as", "indicated", ".", "Representative", "of", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblot of lysates prepared from the indicated SAMHD1-proficient (+/+), deficient (-/-) and rescue (WT, H233A) cell line pairs with the indicated antibodies. Representative of 2 independent experiments.Proliferation inhibition analysis of ara-C and RNRi combination treatment in SAMHD1+/+ or -/- THP-1 cells. Error bars indicate s.e.m. of two (HU and dF-dC) or three (3-AP) independent experiments, each performed in duplicate.Ara-C EC50 values plotted as a function of RNRi concentration in SAMHD1+/+, -/- and rescue (WT, H233A) THP-1 cell line pairs. EC50 values in the absence of RNRi are indicated by the black and red dotted line. Error bars indicate s.e.m. of two (HU and dF-dC) or three (3-AP) independent experiments, each performed in duplicate.Drug synergy plots for ara-C and the indicated RNRi in SAMHD1+/+, -/- and rescue (WT, H233A) cell line pairs. Each data point indicates an average delta score from a single dose-response matrix experiment performed in duplicate. Zero, >0, or <0 corresponds to additive, synergy, or antagonism, respectively, whilst >5 indicates strong synergy. The horizontal line and the error bars indicate the mean and s.d., respectively, statistical significance was determined using a two-tailed unpaired t-test: ns, not significant, P ≥ 0.05; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.Spearman correlation of relative SAMHD1 protein abundance and synergy delta scores for ara-C versus HU or dF-dC in a panel (n = 9) of haematological cancer cell lines. Error bars indicate s.e.m. Each data point corresponds to SAMHD1 protein levels determined by immunoblot analysis (n = 4 for each cell line, representative blot shown in Appendix Fig S2) and an average delta score from repeated dose-response matrix experiments each performed in triplicate: THP-1, n =4; HuT-78, n = 2; HL-60/iva, n = 1; KBM-7, n = 2 (HU) and 3 (dF-dC); K562, n = 3 (HU) and 4 (dF-dC); CCRF-CEM, n =3 (HU) and 4 (dF-dC); MV-4-11, n = 2 (HU) and 3 (dF-dC); Jurkat, n = 2 (HU) and 3 (dF-dC); MOLT-4, n = 2 (HU) an 3 (dF-dC).Immunoblot analysis of lysates prepared from SAMHD1+/+ or -/- THP-1 cells treated for 24 h with ara-C and HU, as indicated. Representative of 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "NOD", "/", "SCID", "mice", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "luciferase", "-", "expressing", "SAMHD1", "+", "/", "+", "or", "-", "/", "-", "THP", "-", "1", "cell", "clones", "(", "day", "0", ")", "and", "treated", "with", "ara", "-", "C", "and", "/", "or", "HU", "as", "indicated", "(", "day", "6", ")", ".", "n", "=", "6", "per", "treatment", "group", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "NOD", "/", "SCID", "mice", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "luciferase", "-", "expressing", "SAMHD1", "+", "/", "+", "or", "-", "/", "-", "HL", "-", "60", "/", "iva", "cell", "clones", "(", "day", "0", ")", "and", "treated", "with", "ara", "-", "C", "and", "/", "or", "HU", "as", "indicated", "(", "day", "6", ")", ".", "n", "=", "6", "per", "treatment", "group", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "NOD", "/", "SCID", "mice", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "luciferase", "-", "expressing", "SAMHD1", "+", "/", "+", "THP", "-", "1", "cell", "clone", "(", "day", "0", ")", "and", "treated", "with", "ara", "-", "C", "and", "/", "or", "dF", "-", "dC", "as", "indicated", "(", "day", "6", ")", ".", "n", "=", "7", "per", "treatment", "group", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "of", "CD45", ".", "2", "C57BL", "/", "6J", "mice", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "murine", "MLL", "-", "AF9", "-", "transformed", "AML", "blasts", "(", "day", "0", ")", "and", "treated", "with", "ara", "-", "C", "and", "/", "or", "HU", "days", "20", "-", "24", ".", "n", "=", "5", "per", "treatment", "group", ",", "except", "for", "vehicle", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Kaplan-Meier analysis of NOD/SCID mice injected i.v. with luciferase-expressing SAMHD1+/+ or -/- THP-1 cell clones (day 0) and treated with ara-C and/or HU as indicated (day 6). n = 6 per treatment group.Kaplan-Meier analysis of NOD/SCID mice injected i.v. with luciferase-expressing SAMHD1+/+ or -/- HL-60/iva cell clones (day 0) and treated with ara-C and/or HU as indicated (day 6). n = 6 per treatment group.Kaplan-Meier analysis of NOD/SCID mice injected i.v. with luciferase-expressing SAMHD1+/+ THP-1 cell clone (day 0) and treated with ara-C and/or dF-dC as indicated (day 6). n = 7 per treatment group.Kaplan-Meier analysis of CD45.2 C57BL/6J mice injected i.v. with murine MLL-AF9-transformed AML blasts (day 0) and treated with ara-C and/or HU days 20-24. n = 5 per treatment group, except for vehicle (n = 4)."}
{"words": ["Figure", "3Drug", "synergy", "plots", "for", "ara", "-", "C", "and", "HU", "or", "dF", "-", "dC", "in", "primary", "patient", "-", "derived", "AML", "blasts", ".", "Each", "data", "point", "indicates", "an", "average", "delta", "score", "from", "a", "single", "patient", "sample", "subjected", "to", "a", "dose", "-", "response", "matrix", "experiment", "performed", "in", "triplicate", ",", "n", "=", "16", "for", "HU", "and", "n", "=", "9", "for", "dF", "-", "dC", ".", "Zero", ",", ">", "0", ",", "or", "<", "0", "corresponds", "to", "additive", ",", "synergy", ",", "or", "antagonism", ",", "respectively", ",", "whilst", ">", "5", "indicates", "strong", "synergy", ".", "Median", ",", "upper", "and", "lower", "quartiles", ",", "and", "range", "of", "delta", "scores", "are", "indicated", "by", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plots", ".", "Pearson", "correlation", "of", "relative", "SAMHD1", "protein", "abundance", "and", "synergy", "delta", "scores", "for", "ara", "-", "C", "and", "HU", "or", "dF", "-", "dC", "in", "primary", "patient", "-", "derived", "AML", "blasts", "(", "n", "=", "23", ")", ".", "Immunoblot", "of", "primary", "patient", "-", "derived", "AML", "blasts", "treated", "with", "control", "(", "dX", ")", "or", "Vpx", "-", "containing", "(", "X", ")", "virus", "-", "like", "particles", "(", "VLPs", ")", ":", "patient", "A2953", "(", "C", ")", ",", "ALG17", "_", "001", "(", "E", ")", ".", "Accompanying", "proliferation", "inhibition", "analysis", "of", "ara", "-", "C", "and", "indicated", "RNRi", "combination", "in", "these", "samples", ":", "patient", "A2953", "(", "D", ")", ",", "ALG17", "_", "001", "(", "D", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "of", "single", "experiment", "performed", "in", "triplicate", ".", "Paired", "drug", "synergy", "plot", "for", "ara", "-", "C", "and", "RNRi", "(", "HU", ",", "n", "=", "7", ";", "dF", "-", "dC", ",", "n", "=", "5", ")", "in", "primary", "patient", "-", "derived", "AML", "blasts", "pre", "-", "treated", "with", "control", "(", "dX", ")", "or", "Vpx", "-", "containing", "(", "X", ")", "VLPs", ".", "Zero", ",", ">", "0", ",", "or", "<", "0", "corresponds", "to", "additive", ",", "synergy", ",", "or", "antagonism", ",", "respectively", ",", "whilst", ">", "5", "indicates", "strong", "synergy", "and", "<", "5", "indicates", "strong", "antagonism", ".", "Each", "data", "point", "indicates", "an", "average", "delta", "score", "from", "a", "single", "patient", "sample", "subjected", "to", "a", "dose", "-", "response", "matrix", "experiment", "performed", "in", "triplicate", ".", "Statistical", "testing", "was", "performed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Drug synergy plots for ara-C and HU or dF-dC in primary patient-derived AML blasts. Each data point indicates an average delta score from a single patient sample subjected to a dose-response matrix experiment performed in triplicate, n = 16 for HU and n = 9 for dF-dC. Zero, >0, or <0 corresponds to additive, synergy, or antagonism, respectively, whilst >5 indicates strong synergy. Median, upper and lower quartiles, and range of delta scores are indicated by box-and-whisker plots.Pearson correlation of relative SAMHD1 protein abundance and synergy delta scores for ara-C and HU or dF-dC in primary patient-derived AML blasts (n = 23).Immunoblot of primary patient-derived AML blasts treated with control (dX) or Vpx-containing (X) virus-like particles (VLPs): patient A2953 (C), ALG17_001 (E). Accompanying proliferation inhibition analysis of ara-C and indicated RNRi combination in these samples: patient A2953 (D), ALG17_001 (D). Error bars indicate s.d. of single experiment performed in triplicate.Paired drug synergy plot for ara-C and RNRi (HU, n = 7; dF-dC, n = 5) in primary patient-derived AML blasts pre-treated with control (dX) or Vpx-containing (X) VLPs. Zero, >0, or <0 corresponds to additive, synergy, or antagonism, respectively, whilst >5 indicates strong synergy and <5 indicates strong antagonism. Each data point indicates an average delta score from a single patient sample subjected to a dose-response matrix experiment performed in triplicate. Statistical testing was performed using two-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4Intracellular", "dNTP", "measurements", "using", "a", "primer", "-", "extension", "assay", "in", "SAMHD1", "+", "/", "+", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "for", "4", "or", "24", "h", "with", "either", "50", "µM", "HU", "(", "middle", "panel", ")", "or", "2", ".", "5", "nM", "3", "-", "AP", "(", "right", "panel", ")", ",", "ratios", "of", "dCTP", "-", "to", "-", "dATP", "were", "calculated", ".", "Bars", "indicate", "mean", "values", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Statistical", "analyses", "were", "done", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "tests", ":", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Intracellular", "ara", "-", "CTP", "(", "upper", "panel", ")", "and", "dCTP", ":", "dATP", "ratio", "(", "lower", "panel", ")", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", "following", "the", "indicated", "treatment", "determined", "using", "HPLC", "-", "MS", "/", "MS", ".", "SAMHD1", "-", "/", "-", "THP", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "500", "nM", "ara", "-", "C", "and", "SAMHD1", "+", "/", "+", "THP", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "either", "solvent", ",", "500", "nM", "ara", "-", "C", "or", "a", "combination", "of", "500", "nM", "ara", "-", "C", "and", "an", "RNRi", "(", "HU", ",", "50", "µM", ";", "dF", "-", "dC", ",", "10", "nM", ";", "3", "-", "AP", ",", "150", "nM", ")", "for", "24", "h", "prior", ".", "Values", "relative", "to", "mean", "ara", "-", "CTP", "amounts", "in", "ara", "-", "C", "treated", "SAMHD1", "+", "/", "+", "THP", "-", "1", "cells", "shown", "(", "indicated", "by", "dashed", "line", ")", ".", "Circles", ",", "columns", "and", "error", "bars", "correspond", "to", "individual", "values", ",", "means", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "at", "least", "three", "experiments", "performed", "independently", ".", "Quantificaiton", "of", "dCK", "phosphorylation", "at", "serine", "-", "74", "(", "S74", ")", "with", "respect", "to", "total", "dCK", "in", "SAMHD1", "+", "/", "+", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "either", "solvent", ",", "500", "nM", "ara", "-", "C", "or", "a", "combination", "of", "500", "nM", "ara", "-", "C", "and", "an", "RNRi", "(", "HU", ",", "50", "µM", ";", "dF", "-", "dC", ",", "10", "nM", ";", "3", "-", "AP", ",", "150", "nM", ")", "for", "24", "h", ".", "Circles", "and", "squares", ",", "columns", "and", "error", "bars", "correspond", "to", "individual", "measurements", ",", "means", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "one", "representative", "out", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicates", ".", "Measurement", "of", "released", "inorganic", "triphosphate", "(", "PPPi", ")", "from", "hydrolysis", "of", "ara", "-", "CTP", "(", "200", "µM", ")", "by", "recombinant", "SAMHD1", "(", "0", ".", "35", "µM", ")", "in", "the", "presence", "of", "GTP", "(", "200", "µM", ")", "and", "a", "titration", "of", "different", "non", "-", "hydrolysable", "dNTP", "analogues", "(", "dNTPαS", ")", "in", "the", "enzyme", "-", "coupled", "malachite", "green", "assay", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "two", "independent", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "and", "quadruplet", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Intracellular dNTP measurements using a primer-extension assay in SAMHD1+/+ THP-1 cells treated for 4 or 24 h with either 50 µM HU (middle panel) or 2.5 nM 3-AP (right panel), ratios of dCTP-to-dATP were calculated. Bars indicate mean values of three independent experiments, error bars indicate s.e.m. Statistical analyses were done using unpaired two-tailed t-tests: **, P < 0.01.Intracellular ara-CTP (upper panel) and dCTP:dATP ratio (lower panel) in the indicated cell lines following the indicated treatment determined using HPLC-MS/MS. SAMHD1-/- THP-1 cells were treated with 500 nM ara-C and SAMHD1+/+ THP-1 cells were treated with either solvent, 500 nM ara-C or a combination of 500 nM ara-C and an RNRi (HU, 50 µM; dF-dC, 10 nM; 3-AP, 150 nM) for 24 h prior. Values relative to mean ara-CTP amounts in ara-C treated SAMHD1+/+ THP-1 cells shown (indicated by dashed line). Circles, columns and error bars correspond to individual values, means and s.e.m. of at least three experiments performed independently.Quantificaiton of dCK phosphorylation at serine-74 (S74) with respect to total dCK in SAMHD1+/+ THP-1 cells treated with either solvent, 500 nM ara-C or a combination of 500 nM ara-C and an RNRi (HU, 50 µM; dF-dC, 10 nM; 3-AP, 150 nM) for 24 h. Circles and squares, columns and error bars correspond to individual measurements, means and s.e.m. of one representative out of two independent experiments performed in triplicates.Measurement of released inorganic triphosphate (PPPi) from hydrolysis of ara-CTP (200 µM) by recombinant SAMHD1 (0.35 µM) in the presence of GTP (200 µM) and a titration of different non-hydrolysable dNTP analogues (dNTPαS) in the enzyme-coupled malachite green assay. Error bars indicate s.e.m. of two independent experiments performed in triplicate and quadruplet."}
{"words": ["Figure", "2In", "vitro", "pull", "-", "down", "assays", ".", "GST", "or", "GST", "-", "PSKR1JK", "fusion", "proteins", "coupled", "with", "glutathione", "beads", "were", "used", "to", "pull", "down", "His", "-", "CPK28", ".", "The", "amount", "of", "fusion", "proteins", "loaded", "on", "the", "gel", "was", "indicated", "by", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "staining", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "specific", "bands", "of", "fusion", "proteins", ".", "Co", "-", "IP", "assays", ".", "PSKR1", "-", "HA", "was", "co", "-", "expressed", "with", "CPK28", "-", "GFP", "or", "GFP", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "PSK", "(", "10", "μM", ")", "or", "H2O", "was", "injected", "2", "hours", "before", "leaves", "sampling", ".", "The", "protein", "was", "precipitated", "using", "GFP", "-", "Trap", ".", "Both", "immunoprecipitated", "and", "input", "samples", "were", "subjected", "to", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "GFP", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2In vitro pull-down assays. GST or GST-PSKR1JK fusion proteins coupled with glutathione beads were used to pull down His-CPK28. The amount of fusion proteins loaded on the gel was indicated by Coomassie brilliant blue (CBB) staining. Asterisks indicate the specific bands of fusion proteins.Co-IP assays. PSKR1-HA was co-expressed with CPK28-GFP or GFP in N. benthamiana leaves. PSK (10 μM) or H2O was injected 2 hours before leaves sampling. The protein was precipitated using GFP-Trap. Both immunoprecipitated and input samples were subjected to western blotting using an anti-HA or anti-GFP antibody."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Co", "-", "IP", "assay", "showing", "that", "PSK", "promotes", "CPK28", "-", "GS2", "interaction", ".", "GS2", "-", "HA", "was", "co", "-", "expressed", "with", "CPK28", "-", "GFP", "or", "GFP", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "PSK", "(", "10", "μM", ")", "or", "H2O", "was", "injected", "2", "hours", "before", "leaves", "sampling", ".", "The", "protein", "was", "precipitated", "by", "GFP", "-", "Trap", ".", "Immunoprecipitated", "and", "input", "samples", "were", "subjected", "to", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", ".", "B", ".", "Co", "-", "IP", "assay", "showing", "that", "CPK28", "-", "GS2", "interaction", "was", "enhanced", "in", "the", "presence", "of", "PSKR1", ".", "GS2", "-", "HA", "and", "CPK28", "-", "GFP", "were", "co", "-", "expressed", "with", "or", "without", "PSKR1", "-", "FLAG", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "The", "protein", "was", "precipitated", "by", "GFP", "-", "Trap", ".", "Immunoprecipitated", "and", "input", "samples", "were", "subjected", "to", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "GFP", "or", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Experiments", "were", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", ".", "C", ".", "In", "vitro", "pull", "-", "down", "assays", "showing", "that", "CPK28", "-", "GS2", "interaction", "was", "enhanced", "in", "the", "presence", "of", "PSKR1", ".", "Fixed", "amounts", "of", "His", "-", "CPK28", "and", "GST", "-", "GS2", "fusion", "proteins", "were", "incubated", "with", "an", "increasing", "amount", "of", "MBP", "-", "PSKR1", "fusion", "protein", "and", "MBP", "protein", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "specific", "bands", "of", "fusion", "proteins", ".", "Data", "information", ":", "Experiments", "were", "repeated", "twice", ",", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Co-IP assay showing that PSK promotes CPK28-GS2 interaction. GS2-HA was co-expressed with CPK28-GFP or GFP in N. benthamiana leaves. PSK (10 μM) or H2O was injected 2 hours before leaves sampling. The protein was precipitated by GFP-Trap. Immunoprecipitated and input samples were subjected to western blotting using an anti-HA and anti-GFP antibody. Data information: Experiments were repeated twice with similar results.B. Co-IP assay showing that CPK28-GS2 interaction was enhanced in the presence of PSKR1. GS2-HA and CPK28-GFP were co-expressed with or without PSKR1-FLAG in N. benthamiana leaves. The protein was precipitated by GFP-Trap. Immunoprecipitated and input samples were subjected to western blotting using an anti-HA, anti-GFP or anti-FLAG antibody. Data information: Experiments were repeated twice with similar results.C. In vitro pull-down assays showing that CPK28-GS2 interaction was enhanced in the presence of PSKR1. Fixed amounts of His-CPK28 and GST-GS2 fusion proteins were incubated with an increasing amount of MBP-PSKR1 fusion protein and MBP protein. Asterisks indicate the specific bands of fusion proteins. Data information: Experiments were repeated twice, with similar results."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "PSK", "induces", "the", "phosphorylation", "of", "GS2", "by", "CPK28", "in", "vivo", ".", "GS2", "-", "GFP", "was", "co", "-", "expressed", "with", "CPK28", "-", "HA", "(", "empty", "vector", "as", "a", "negative", "control", ")", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", ".", "PSK", "(", "10", "μM", ")", "or", "H2O", "was", "injected", "2", "hours", "before", "leaves", "sampling", ".", "The", "phosphorylated", "GS2", "protein", "was", "precipitated", "by", "GFP", "-", "Trap", ",", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "pSer", "/", "pThr", "and", "anti", "-", "pSer", "antibodies", ".", "C", ".", "Site", "-", "directed", "mutation", "of", "S334", "and", "S360", "residues", "in", "GS2", "inhibited", "its", "phosphorylation", "by", "CPK28", ".", "D", ".", "Identification", "of", "OE", "-", "GS2", "transgenic", "lines", "expressing", "phospho", "-", "mutated", "versions", "of", "GS2", "in", "the", "gs2", "background", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "GLN1", "/", "GLN2", "antibody", ".", "Ponceau", "S", "staining", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. PSK induces the phosphorylation of GS2 by CPK28 in vivo. GS2-GFP was co-expressed with CPK28-HA (empty vector as a negative control) in N. benthamiana leaves. PSK (10 μM) or H2O was injected 2 hours before leaves sampling. The phosphorylated GS2 protein was precipitated by GFP-Trap, and then immunoblotted with anti-pSer/pThr and anti-pSer antibodies.C. Site-directed mutation of S334 and S360 residues in GS2 inhibited its phosphorylation by CPK28.D. Identification of OE-GS2 transgenic lines expressing phospho-mutated versions of GS2 in the gs2 background by western blotting using an anti-GLN1/GLN2 antibody. Ponceau S staining was used as the loading control."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "test", "on", "differential", "expression", "between", "WT", "and", "mdx", "mice", ".", "C", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "test", "on", "differential", "expression", "between", "WT", "and", "mdx", "+", "+", "mice", ".", "D", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "test", "on", "differential", "expression", "between", "WT", "and", "mdx", "+", "-", "mice", ".", "E", ",", "F", ")", "Boxplot", "comparing", "the", "distribution", "of", "the", "Dmd", "and", "Prune2", "genes", "in", "the", "WT", ",", "mdx", ",", "mdx", "+", "+", "and", "mdx", "+", "-", "mice", "groups", ".", "The", "central", "band", "of", "the", "boxplot", "denotes", "the", "median", ";", "the", "box", "denotes", "the", "first", "and", "third", "quartile", ";", "the", "whiskers", "are", "computed", "as", "min", "(", "max", "(", "x", ")", ",", "Q3", "+", "1", ".", "5", "IQR", ")", "and", "max", "(", "min", "(", "x", ")", ",", "Q1", "-", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", ",", "where", "min", "(", "x", ")", "and", "max", "(", "x", ")", "denote", "the", "minimum", "and", "maximum", "of", "the", "distribution", ",", "Q1", "and", "Q3", "the", "first", "and", "third", "quartile", ",", "and", "IQR", "the", "interquartile", "range", ".", "G", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "tests", "on", "differential", "expression", "between", "mdx", "+", "+", "and", "mdx", "+", "-", "mice", ".", "Scatter", "plots", "comparing", "the", "estimated", "logFCs", "across", "mice", "groups", ".", "Panel", "H", ":", "mdx", "vs", "mdx", "+", "+", ".", "Scatter", "plots", "comparing", "the", "estimated", "logFCs", "across", "mice", "groups", ".", "+", "+", ".", "Panel", "I", ":", "mdx", "vs", "mdx", "+", "-", ".", "Panel", "J", ":", "mdx", "+", "+", "vs", "mdx", "+", "-", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Volcano plot for the F test on differential expression between WT and mdx mice. C) Volcano plot for the F test on differential expression between WT and mdx++ mice. D) Volcano plot for the F test on differential expression between WT and mdx+- mice.E, F) Boxplot comparing the distribution of the Dmd and Prune2 genes in the WT, mdx, mdx++ and mdx+- mice groups. The central band of the boxplot denotes the median; the box denotes the first and third quartile; the whiskers are computed as min(max(x), Q3 + 1.5 IQR) and max(min(x), Q1 - 1.5 * IQR), where min(x) and max(x) denote the minimum and maximum of the distribution, Q1 and Q3 the first and third quartile, and IQR the interquartile range.G) Volcano plot for the F tests on differential expression between mdx++ and mdx+- mice.Scatter plots comparing the estimated logFCs across mice groups. Panel H: mdx vs mdx++.Scatter plots comparing the estimated logFCs across mice groups. ++. Panel I: mdx vs mdx+-. Panel J: mdx++ vs mdx+-."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Histogram", "of", "the", "likelihood", "ratio", "p", "-", "values", "for", "the", "test", "on", "differences", "between", "WT", "and", "mdx", "at", "any", "time", "point", ".", "B", ")", "Distribution", "of", "the", "estimated", "logFCs", "for", "mdx", "versus", "WT", "mice", "at", "weeks", "6", ",", "12", ",", "18", ",", "24", "and", "30", "for", "the", "1532", "genes", "with", "significant", "differences", "between", "WT", "and", "mdx", ".", "D", ")", "Trajectory", "plots", "comparing", "the", "trajectories", "of", "Chordc1", "and", "Psat1", "in", "WT", "and", "mdx", "mice", ".", "E", ")", "Trajectory", "plots", "comparing", "the", "trajectories", "of", "Cd59a", ",", "Chordc1", ",", "Hpgd", ",", "Ldhb", ",", "Lincred1", ",", "Myo6", ",", "Slc39a11", "and", "Tlr1", "in", "WT", ",", "mdx", "+", "+", "and", "mdx", "+", "-", "mice", ".", "F", ")", "Scatter", "plots", "comparing", "the", "estimated", "logFC", "of", "mdx", "+", "+", "vs", "WT", "(", "x", "axis", ")", "and", "of", "mdx", "+", "-", "vs", "WT", "(", "y", "axis", ")", "at", "weeks", "6", ",", "12", ",", "18", ",", "24", "and", "30", ".", "H", ")", "upstream", "regulator", "analysis", "(", "H", ")", "performed", "by", "Ingenuity", "Pathway", "Analysis", "of", "the", "comparison", "between", "mdx", "and", "wt", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Histogram of the likelihood ratio p-values for the test on differences between WT and mdx at any time point.B) Distribution of the estimated logFCs for mdx versus WT mice at weeks 6, 12, 18, 24 and 30 for the 1532 genes with significant differences between WT and mdx.D) Trajectory plots comparing the trajectories of Chordc1 and Psat1 in WT and mdx mice.E) Trajectory plots comparing the trajectories of Cd59a, Chordc1, Hpgd, Ldhb, Lincred1, Myo6, Slc39a11 and Tlr1 in WT, mdx++ and mdx+- mice.F) Scatter plots comparing the estimated logFC of mdx++ vs WT (x axis) and of mdx+- vs WT (y axis) at weeks 6, 12, 18, 24 and 30.H) upstream regulator analysis (H) performed by Ingenuity Pathway Analysis of the comparison between mdx and wt mice."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Barplot", "showing", "the", "percentage", "of", "significant", "genes", "in", "the", "muscle", "modules", ".", "Next", "to", "each", "module", "name", "we", "report", "the", "total", "number", "of", "genes", "that", "it", "comprises", ".", "B", ")", "Barplot", "showing", "the", "percentage", "of", "significant", "genes", "in", "the", "blood", "modules", ".", "Next", "to", "each", "module", "name", "we", "report", "the", "total", "number", "of", "genes", "that", "it", "comprises", ".", "C", ")", "Matrix", "with", "the", "values", "of", "the", "cross", "-", "correlation", "between", "blood", "and", "muscle", "module", "eigengenes", ".", "To", "enhance", "visibility", ",", "only", "correlations", "with", "absolute", "value", "above", "0", ".", "5", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Barplot showing the percentage of significant genes in the muscle modules. Next to each module name we report the total number of genes that it comprises. B) Barplot showing the percentage of significant genes in the blood modules. Next to each module name we report the total number of genes that it comprises. C) Matrix with the values of the cross-correlation between blood and muscle module eigengenes. To enhance visibility, only correlations with absolute value above 0.5 are shown. "}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "RT", "-", "PCR", "(", "30", "cycles", ")", "showing", "skipping", "of", "exon", "23", "for", "PMO", "and", "PS49", "oligos", ".", "No", "skipping", "was", "visible", "in", "saline", "treated", "mice", ".", "B", ")", "Western", "blot", "showing", "the", "percentage", "of", "restoration", "of", "dystrophin", "protein", "in", "mdx", "mice", "following", "antisense", "oligonucleotides", "administration", ".", "M", "is", "molecular", "ladder", ".", "WT", "gastrocnemius", "represents", "the", "standard", "curve", "using", "protein", "extracts", "from", "gastrocnemius", "muscle", ".", "NT", "is", "saline", "treated", "mdx", "mice", ".", "C", ")", "Barplot", "comparing", "the", "estimated", "logFC", "for", "the", "PS49", "and", "PMO", "treatments", "in", "the", "MoTreat", "dataset", "to", "the", "desired", "drug", "effect", "obtained", "from", "the", "MoLong", "dataset", "(", "logFC", "WT", "vs", "mdx", "at", "week", "12", ")", ".", "D", ",", "E", ")", "Histograms", "comparing", "the", "distribution", "of", "selected", "genes", "across", "different", "mice", "groups", "(", "PMO", ",", "PS49", "and", "saline", "in", "the", "MoTreat", "dataset", ",", "WT", "and", "mdx", "at", "week", "12", "in", "the", "MoLong", "dataset", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) RT-PCR (30 cycles) showing skipping of exon 23 for PMO and PS49 oligos. No skipping was visible in saline treated mice.B) Western blot showing the percentage of restoration of dystrophin protein in mdx mice following antisense oligonucleotides administration. M is molecular ladder. WT gastrocnemius represents the standard curve using protein extracts from gastrocnemius muscle. NT is saline treated mdx mice.C) Barplot comparing the estimated logFC for the PS49 and PMO treatments in the MoTreat dataset to the desired drug effect obtained from the MoLong dataset (logFC WT vs mdx at week 12).D, E) Histograms comparing the distribution of selected genes across different mice groups (PMO, PS49 and saline in the MoTreat dataset, WT and mdx at week 12 in the MoLong dataset)."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "test", "on", "differential", "expression", "between", "healthy", "individuals", "and", "DMD", "patients", ".", "C", ")", "Scatter", "plot", "showing", "the", "group", "effect", "at", "baseline", "(", "x", "-", "axis", ")", "and", "the", "effect", "of", "the", "interaction", "between", "age", "and", "group", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "Black", "dots", "represent", "non", "differentially", "expressed", "genes", ",", "while", "blue", "dots", "represent", "differentially", "expressed", "genes", ".", "E", ")", "Volcano", "plot", "for", "the", "F", "test", "on", "differential", "expression", "between", "treated", "and", "untreated", "DMD", "patients", ".", "F", ")", "Barplot", "comparing", "the", "logFC", "of", "the", "genes", "associated", "with", "steroid", "treatment", "estimated", "in", "this", "study", "to", "the", "estimates", "of", "Liu", "et", "al", ".", "(", "2012", ")", ".", "G", ")", "Scatter", "plot", "showing", "genes", "for", "which", "a", "significant", "effect", "of", "treatment", "with", "steroids", ".", "The", "group", "effects", "at", "baseline", "are", "plotted", "on", "the", "x", "-", "axis", ",", "while", "the", "effects", "of", "steroids", "are", "plotted", "on", "the", "y", "-", "axis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Volcano plot for the F test on differential expression between healthy individuals and DMD patients.C) Scatter plot showing the group effect at baseline (x-axis) and the effect of the interaction between age and group (y-axis). Black dots represent non differentially expressed genes, while blue dots represent differentially expressed genes.E) Volcano plot for the F test on differential expression between treated and untreated DMD patients.F) Barplot comparing the logFC of the genes associated with steroid treatment estimated in this study to the estimates of Liu et al. (2012).G) Scatter plot showing genes for which a significant effect of treatment with steroids. The group effects at baseline are plotted on the x-axis, while the effects of steroids are plotted on the y-axis."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Still", "images", "of", "time", "-", "lapse", "imaging", "of", "H3", ".", "3", "-", "mCherry", "and", "H3", ".", "2", "-", "EGFP", "proteins", "in", "wild", "-", "type", "zygotes", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "(", "B", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "ATRX", "in", "zygotes", "at", "different", "pronuclear", "(", "PN", ")", "stages", "(", "PN0", ",", "n", "=", "8", ";", "PN2", ",", "n", "=", "6", ";", "PN5", ",", "n", "=", "33", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "panels", ":", "images", "of", "paternal", "and", "maternal", "pronuclei", "at", "given", "stage", "/", "condition", "are", "from", "same", "zygote", ".", "(", "C", ")", "Boxplot", "displaying", "signal", "intensity", "of", "DAXX", "at", "pat", "-", "and", "mat", "-", "PCH", "in", "mouse", "zygotes", "at", "PN5", "stage", ",", "relative", "to", "mean", "signal", "at", "pat", "-", "PCH", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "3", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "28", ",", "paired", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "ATRX", "in", "PN5", "zygotes", "upon", "siRNA", "-", "mediated", "knockdown", "of", "Daxx", "(", "n", "=", "14", ")", "or", "with", "control", "siRNAs", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "panels", ":", "images", "of", "paternal", "and", "maternal", "pronuclei", "at", "given", "stage", "/", "condition", "are", "from", "same", "zygote", ".", "Yellow", "dashed", "circles", "represent", "the", "contours", "of", "the", "pronuclei", ".", "All", "scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "E", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "ATRX", "in", "control", "(", "n", "=", "15", ")", "and", "Atrxm", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "14", ")", "PN5", "zygotes", ".", "Data", "information", ":", "All", "panels", ":", "images", "of", "paternal", "and", "maternal", "pronuclei", "at", "given", "stage", "/", "condition", "are", "from", "same", "zygote", ".", "Yellow", "dashed", "circles", "represent", "the", "contours", "of", "the", "pronuclei", ".", "All", "scale", "bars", ",", "10µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Still images of time-lapse imaging of H3.3-mCherry and H3.2-EGFP proteins in wild-type zygotes (n=17).(B) IF of DAXX and ATRX in zygotes at different pronuclear (PN) stages (PN0, n=8; PN2, n=6; PN5, n= 33). Data information: All panels: images of paternal and maternal pronuclei at given stage/condition are from same zygote.(C) Boxplot displaying signal intensity of DAXX at pat- and mat-PCH in mouse zygotes at PN5 stage, relative to mean signal at pat-PCH. In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 3 times. ***P<0.001, n= 28, paired t-test.(D) IF of DAXX and ATRX in PN5 zygotes upon siRNA-mediated knockdown of Daxx (n=14) or with control siRNAs (n=8). Data information: All panels: images of paternal and maternal pronuclei at given stage/condition are from same zygote. Yellow dashed circles represent the contours of the pronuclei. All scale bars, 10µm.(E) IF of DAXX and ATRX in control (n=15) and Atrxm-z+ (n=14) PN5 zygotes. Data information: All panels: images of paternal and maternal pronuclei at given stage/condition are from same zygote. Yellow dashed circles represent the contours of the pronuclei. All scale bars, 10µm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "EZH2", "in", "paternal", "pronuclei", "of", "Ezh1m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Ezh2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "Ezh1m", "-", "z", "+", ";", "Ezh2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "4", ")", "late", "zygotes", ".", "Yellow", "dashed", "circles", "represent", "the", "contours", "of", "the", "pronuclei", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "B", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "RNF2", "in", "PN0", "zygotes", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "C", ")", "IF", "of", "DAXX", "in", "wild", "type", "(", "n", "=", "30", ")", ",", "Ring1m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "12", ")", ",", "Rnf2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "Ring1m", "-", "z", "+", ";", "Rnf2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "12", ")", "paternal", "pronuclei", "of", "PN5", "zygotes", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "D", ")", "Anti", "-", "Flag", "co", "-", "IP", "of", "DAXXMycHis", ",", "RNF2", "and", "H3K27me3", "with", "CBX23", "×", "Flag", "from", "extracts", "of", "HEK293", "cells", "in", "presence", "or", "absence", "of", "benzonase", ",", "followed", "by", "immuno", "-", "blot", "analyses", "for", "indicated", "antigens", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) IF of DAXX and EZH2 in paternal pronuclei of Ezh1m-z+ (n=5), Ezh2m-z+ (n=3) and Ezh1m-z+; Ezh2m-z+ (n=4) late zygotes. Yellow dashed circles represent the contours of the pronuclei. Data information: All scale bars, 10µm.(B) IF of DAXX and RNF2 in PN0 zygotes (n=10). Data information: All scale bars, 10µm.(C) IF of DAXX in wild type (n=30), Ring1m-z+ (n=12), Rnf2m-z+ (n=11) and Ring1m-z+; Rnf2m-z+ (n=12) paternal pronuclei of PN5 zygotes. Data information: All scale bars, 10µm.(D) Anti-Flag co-IP of DAXXMycHis, RNF2 and H3K27me3 with CBX23×Flag from extracts of HEK293 cells in presence or absence of benzonase, followed by immuno-blot analyses for indicated antigens."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Occupancy", "(", "%", "of", "IP", "-", "ed", "DNA", "/", "input", "DNA", ")", "of", "GAL4DBDCBX2", ",", "RNF2", ",", "DAXXMycHis", ",", "H3", ".", "3", ",", "and", "H3", "proteins", "at", "5", "×", "UAS", "site", "as", "measured", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "of", "chromatin", "from", "HEK2935xUAS", "cells", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunoblots", "for", "the", "indicated", "proteins", "in", "HEK2935xUAS", "cells", "(", "E", ")", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "HEK2935xUAS", "cells", "expressing", "full", "length", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "and", "DaxxMycHis", "showing", "CBX2", ".", "1", "dependent", "recruitment", "of", "DAXX", "to", "promoters", "of", "CCND2", "and", "RUNX1", "genes", ".", "(", "F", ")", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "occupancy", "in", "HEK2935xUAS", "cells", "expressing", "DAXXMycHis", "(", "X", "-", "axis", ")", "or", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "and", "DAXXMycHis", "(", "Y", "-", "axis", ")", ",", "showing", "(", "log2", ")", "enrichment", "for", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "at", "many", "TSSs", "(", "±", "1", "kb", ")", "in", "cells", "expressing", "the", "CBX2", ".", "1", "protein", "(", "Y", "-", "axis", ")", ".", "(", "G", ")", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "versus", "DAXXMycHis", "occupancy", "in", "HEK2935xUAS", "cells", "expressing", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "and", "DAXXMycHis", ",", "revealing", "very", "comparable", "enrichment", "levels", "(", "log2", ")", "of", "both", "proteins", "at", "TSSs", ".", "TSSs", "highlighted", "in", "red", "show", "enrichment", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", "independently", "of", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "occupancy", ".", "(", "H", ")", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "DAXXMycHis", "occupancy", "in", "HEK2935xUAS", "cells", "expressing", "DAXXMycHis", "(", "X", "-", "axis", ")", "versus", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "and", "DAXXMycHis", "(", "Y", "-", "axis", ")", "showing", "strong", "enrichment", "(", "log2", ")", "for", "DAXXMycHis", "at", "many", "TSSs", "of", "genes", ",", "but", "only", "when", "both", "proteins", "are", "expressed", "(", "Y", "-", "axis", ")", ",", "indicating", "that", "CBX2", ".", "1", "targets", "DAXX", "to", "chromatin", ".", "TSSs", "highlighted", "in", "red", "show", "enrichment", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", "independently", "of", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "occupancy", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Occupancy (% of IP-ed DNA / input DNA) of GAL4DBDCBX2, RNF2, DAXXMycHis, H3.3, and H3 proteins at 5×UAS site as measured by ChIP-qPCR of chromatin from HEK2935xUAS cells. Data are means ± SEM (n = 3).(D) Immunoblots for the indicated proteins in HEK2935xUAS cells(E) ChIP-seq analysis of HEK2935xUAS cells expressing full length GAL4DBDCBX2.1 and DaxxMycHis showing CBX2.1 dependent recruitment of DAXX to promoters of CCND2 and RUNX1 genes.(F) ChIP-seq analysis of GAL4DBDCBX2.1 occupancy in HEK2935xUAS cells expressing DAXXMycHis (X-axis) or GAL4DBDCBX2.1 and DAXXMycHis (Y-axis), showing (log2) enrichment for GAL4DBDCBX2.1 at many TSSs (± 1 kb) in cells expressing the CBX2.1 protein (Y-axis).(G) ChIP-seq analysis of GAL4DBDCBX2.1 versus DAXXMycHis occupancy in HEK2935xUAS cells expressing GAL4DBDCBX2.1 and DAXXMycHis, revealing very comparable enrichment levels (log2) of both proteins at TSSs. TSSs highlighted in red show enrichment with anti-Myc antibody independently of GAL4DBDCBX2.1 occupancy.(H) ChIP-seq analysis of DAXXMycHis occupancy in HEK2935xUAS cells expressing DAXXMycHis (X-axis) versus GAL4DBDCBX2.1 and DAXXMycHis (Y-axis) showing strong enrichment (log2) for DAXXMycHis at many TSSs of genes, but only when both proteins are expressed (Y-axis), indicating that CBX2.1 targets DAXX to chromatin. TSSs highlighted in red show enrichment with anti-Myc antibody independently of GAL4DBDCBX2.1 occupancy."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "IF", "of", "CBX2", "and", "SUMO2", "/", "3", "in", "PN0", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "PN5", "(", "n", "=", "12", ")", "zygotes", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "B", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "analyses", "of", "HEK2935xUAS", "cells", "co", "-", "expressing", "GAL4DBDCBX2", ".", "1", "either", "with", "DAXXMycHis", "or", "DAXXΔSIM1", "/", "2MycHis", ".", "Data", "are", "means", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "IF", "of", "EGFP", "and", "DAXX", "in", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", "micro", "-", "injected", "with", "Daxx", "-", "EGFP", "or", "DaxxΔSIM1", "/", "2", "-", "EGFP", "mRNA", "(", "100ng", "/", "µl", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "D", ")", "Left", ":", "Boxplot", "displaying", "EGFP", "signal", "intensities", "at", "PCH", "relative", "to", "euchromatin", "in", "Daxxm", "-", "z", "+", "zygotes", "micro", "-", "injected", "with", "Daxx", "-", "EGFP", "or", "DaxxΔSIM1", "/", "2", "-", "EGFP", "mRNA", ".", "Right", ":", "Boxplot", "displaying", "signal", "intensity", "of", "EGFP", "at", "euchromatin", "in", "same", "samples", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "3", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "N", ".", "S", ".", ":", "no", "statistical", "difference", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Ni", "-", "pulldown", "of", "6xHisSUMO1", "/", "2", "/", "3", "-", "conjugated", "proteins", "from", "HEK293", "extracts", "expressing", "6xHis", "-", "tagged", "SUMO1", ",", "SUMO2", "or", "SUMO3", "in", "combination", "with", "CBX2", "-", "EGFP", ".", "CBX2", "and", "SUMO", "-", "conjugated", "CBX2", "were", "detected", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "(", "G", ")", "Ni", "-", "pulldown", "of", "6xHis", "-", "SUMO2", "conjugated", "proteins", "from", "HEK293", "extracts", "transiently", "co", "-", "expressing", "6xHis", "-", "SUMO2", "with", "CBX2", "-", "EGFP", "or", "CBX24KR", "-", "EGFP", ".", "Detection", "of", "CBX2", "(", "H", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "EGFP", "in", "wild", "-", "type", "PN5", "zygotes", ",", "micro", "-", "injected", "with", "Cbx2", "or", "Cbx24KR", "-", "EGFP", "mRNA", "(", "100ng", "/", "µl", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "I", ")", "Left", ":", "Boxplot", "displaying", "signal", "intensity", "of", "DAXX", "at", "PCH", "relative", "to", "mean", "intensity", "at", "pat", "-", "PCH", "in", "wild", "-", "type", "zygotes", "micro", "-", "injected", "with", "Cbx2", "or", "Cbx24KR", "-", "EGFP", "mRNA", ".", "Right", ":", "Absolute", "intensities", "of", "EGFP", "in", "same", "samples", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "2", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) IF of CBX2 and SUMO2/3 in PN0 (n=10) and PN5 (n=12) zygotes. Data information: Scale bars, 10µm.(B) ChIP-qPCR analyses of HEK2935xUAS cells co-expressing GAL4DBDCBX2.1 either with DAXXMycHis or DAXXΔSIM1/2MycHis. Data are means ± SEM (n = 3).(C) IF of EGFP and DAXX in Daxxm-z+ PN5 zygotes micro-injected with Daxx-EGFP or DaxxΔSIM1/2-EGFP mRNA (100ng/µl). Data information: Scale bars, 10µm.(D) Left: Boxplot displaying EGFP signal intensities at PCH relative to euchromatin in Daxxm-z+ zygotes micro-injected with Daxx-EGFP or DaxxΔSIM1/2-EGFP mRNA. Right: Boxplot displaying signal intensity of EGFP at euchromatin in same samples. In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 3 times. ***P<0.001, N.S.: no statistical difference, P>0.05, t-test.(F) Ni-pulldown of 6xHisSUMO1/2/3-conjugated proteins from HEK293 extracts expressing 6xHis-tagged SUMO1, SUMO2 or SUMO3 in combination with CBX2-EGFP. CBX2 and SUMO-conjugated CBX2 were detected with an anti-GFP antibody.(G) Ni-pulldown of 6xHis-SUMO2 conjugated proteins from HEK293 extracts transiently co-expressing 6xHis-SUMO2 with CBX2-EGFP or CBX24KR-EGFP. Detection of CBX2(H) IF of DAXX and EGFP in wild-type PN5 zygotes, micro-injected with Cbx2 or Cbx24KR-EGFP mRNA (100ng/µl). Data information: Scale bars, 10µm.(I) Left: Boxplot displaying signal intensity of DAXX at PCH relative to mean intensity at pat-PCH in wild-type zygotes micro-injected with Cbx2 or Cbx24KR-EGFP mRNA. Right: Absolute intensities of EGFP in same samples. In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 2 times. ***P<0.001, t-test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "IF", "of", "DAXX", "and", "ATRX", "in", "PN5", "stage", "pronuclei", "of", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "Hp1βm", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "Suv39h2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "9", ")", "zygotes", ".", "Data", "information", ":", "Panels", "Paternal", "and", "maternal", "pronuclei", "of", "a", "given", "condition", "originate", "from", "same", "zygotes", ".", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "B", ")", "Boxplots", "displaying", "signal", "intensities", "of", "DAXX", "or", "ATRX", "at", "pat", "-", "and", "mat", "-", "PCH", "in", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Hp1βm", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "10", ")", "mouse", "zygotes", "at", "PN5", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "2", "times", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "IF", "of", "DAXX", "in", "PN5", "stage", "pronuclei", "of", "zygotes", "expressing", "CBX2", "-", "EGFP", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "CBX2F12A", "-", "EGFP", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "mRNAs", "(", "100ng", "/", "µl", ")", "were", "injected", "into", "mouse", "PN2", "stage", "zygotes", ".", "Yellow", "dashed", "circles", "represent", "the", "contours", "of", "the", "pronuclei", ".", ".", "Data", "information", ":", "Panels", "C", ":", "Paternal", "and", "maternal", "pronuclei", "of", "a", "given", "condition", "originate", "from", "same", "zygotes", ".", "All", "scale", "bars", "10µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) IF of DAXX and ATRX in PN5 stage pronuclei of wild-type (n=19), Hp1βm-z+ (n=10) and Suv39h2m-z+ (n=9) zygotes. Data information: Panels Paternal and maternal pronuclei of a given condition originate from same zygotes. All scale bars 10µm.(B) Boxplots displaying signal intensities of DAXX or ATRX at pat- and mat-PCH in wild-type (n=5) and Hp1βm-z+ (n=10) mouse zygotes at PN5. In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 2 times. *P<0.05, **P<0.01, t-test.(C) IF of DAXX in PN5 stage pronuclei of zygotes expressing CBX2-EGFP (n=9) or CBX2F12A-EGFP (n=17). mRNAs (100ng/µl) were injected into mouse PN2 stage zygotes. Yellow dashed circles represent the contours of the pronuclei.. Data information: Panels C: Paternal and maternal pronuclei of a given condition originate from same zygotes. All scale bars 10µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Developmental", "progression", "of", "Daxxm", "+", "z", "+", ",", "Daxxm", "-", "z", "+", "and", "Daxxm", "-", "z", "-", "early", "embryos", ".", "(", "B", ")", "Examples", "of", "morula", "and", "blastocyst", "embryos", "with", "normal", "and", "large", "polyploid", "nuclei", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "C", ")", "Percentages", "of", "embryos", "with", "normal", "or", "polyploid", "nuclei", ".", "(", "D", ")", "Still", "images", "of", "time", "-", "lapse", "imaging", "of", "the", "first", "cleavage", "division", "in", "wild", "-", "type", "and", "maternally", "deficient", "zygotes", "expressing", "H2B", "-", "mCherry", ".", "Time", "points", "represent", "minutes", "after", "prometaphase", ".", "Lagging", "chromosomes", "and", "micronuclei", "are", "indicated", "by", "yellow", "arrowheads", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "zygotes", "with", "lagging", "chromosomes", "during", "1st", "cleavage", "division", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "in", "n", "≥", "3", "replicate", "experiments", ".", "(", "F", ")", "IF", "of", "5", "-", "methyl", "and", "5", "-", "hydroxy", "-", "methyl", "cytosine", "staining", "of", "wild", "-", "type", "(", "n", "=", "42", ")", ",", "Daxxm", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "14", ")", "and", "Ring1m", "-", "z", "+", ";", "Rnf2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "6", ")", "zygotes", "with", "lagging", "chromosomes", ".", "Yellow", "arrowheads", "indicate", "lagging", "chromosomes", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "G", ")", "DNA", "-", "FISH", "for", "major", "(", "green", ")", "and", "minor", "(", "red", ")", "satellites", "on", "cleavage", "chromosomes", "of", "a", "Daxxm", "-", "z", "+", "zygote", "with", "a", "chromosome", "broken", "within", "the", "major", "satellite", "region", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "H", ")", "H3", ".", "3", "-", "EGFP", "live", "-", "imaging", "signal", "in", "pat", "-", "and", "mat", "-", "PCH", "of", "control", "Daxxm", "+", "z", "+", "(", "n", "=", "18", ")", ",", "Daxxm", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "Ring1m", "-", "z", "+", ";", "Rnf2m", "-", "z", "+", "(", "n", "=", "12", ")", "zygotes", ".", "Scale", "bar", "10µm", ".", "(", "I", ")", "Left", ":", "IF", "of", "endogenous", "H3", "and", "ATRX", "at", "pat", "-", "PCH", "in", "control", "and", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", ".", "Right", ":", "Fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "H3", "and", "ATRX", "along", "white", "line", "in", "left", "panel", "at", "pat", "-", "PCH", "of", "zygotes", ".", "Scale", "bars", "5", "µm", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "J", ")", "Boxplot", "displaying", "H3", "signal", "intensity", "at", "pat", "-", "PCH", "of", "Daxxm", "+", "z", "+", "and", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "2", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "12", "for", "both", "groups", ".", "(", "K", ")", "IP", "of", "DAXX", "-", "EGFP", "and", "DAXXR244A", "-", "EGFP", "proteins", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "from", "nuclear", "extract", "of", "HEK293", "cells", ".", "Immuno", "-", "blot", "detection", "was", "performed", "with", "antibodies", "recognizing", "GFP", ",", "histone", "variant", "H3", ".", "3", "and", "CBX2", ".", "(", "L", ")", "Percentage", "of", "Daxxm", "-", "z", "+", "zygotes", "with", "lagging", "chromosomes", "following", "injection", "of", "Tubulin", "-", "EGFP", ",", "Daxx", "-", "EGFP", "or", "DaxxR244A", "-", "EGFP", "mRNAs", "(", "20", "or", "100", "ng", "/", "µl", ")", "at", "PN2", "/", "3", "stage", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "≥", "2", "injection", "experiments", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "High", "Daxx", "-", "EGFP", "versus", "other", "3", "groups", ";", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "on", "pooled", "embryos", ")", ".", "(", "M", ")", "Left", ":", "IF", "of", "EGFP", "and", "endogenous", "H3", "at", "pat", "-", "PCH", "in", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", "expressing", "DAXX", "-", "EGFP", "or", "DAXXR244A", "-", "EGFP", "or", "nothing", "exogenously", ".", "Right", ":", "Fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "H3", "and", "EGFP", "along", "white", "lines", "in", "left", "panels", "at", "pat", "-", "PCH", "of", "zygotes", ".", "Scale", "bars", "5", "µm", ".", "Data", "information", ":", "All", "scale", "bars", "10µm", ".", "(", "N", ")", "Boxplot", "displaying", "3D", "quantification", "of", "H3", "signal", "intensity", "at", "pat", "-", "PCH", "in", "Daxxm", "-", "z", "+", "zygotes", "expressing", "exogenous", "DAXX", "-", "EGFP", "(", "n", "=", "14", ")", "or", "DAXXR244A", "-", "EGFP", "(", "n", "=", "13", ")", ".", "In", "boxplots", ",", "the", "enter", "lines", "show", "the", "medians", ";", "box", "limits", "indicate", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", "as", "determined", "by", "R", "software", ";", "whiskers", "extend", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "from", "the", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "2", "-", "3", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Daxx", "-", "EGFP", "versus", "other", "2", "groups", ";", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Developmental progression of Daxxm+z+, Daxxm-z+ and Daxxm-z- early embryos.(B) Examples of morula and blastocyst embryos with normal and large polyploid nuclei. Data information: All scale bars 10µm.(C) Percentages of embryos with normal or polyploid nuclei.(D) Still images of time-lapse imaging of the first cleavage division in wild-type and maternally deficient zygotes expressing H2B-mCherry. Time points represent minutes after prometaphase. Lagging chromosomes and micronuclei are indicated by yellow arrowheads. Data information: All scale bars 10µm.(E) Percentage of zygotes with lagging chromosomes during 1st cleavage division. Data represent mean ± s.e.m. in n≥3 replicate experiments.(F) IF of 5-methyl and 5-hydroxy-methyl cytosine staining of wild-type (n=42), Daxxm-z+ (n=14) and Ring1m-z+; Rnf2m-z+ (n=6) zygotes with lagging chromosomes. Yellow arrowheads indicate lagging chromosomes. Data information: All scale bars 10µm.(G) DNA-FISH for major (green) and minor (red) satellites on cleavage chromosomes of a Daxxm-z+ zygote with a chromosome broken within the major satellite region. Data information: All scale bars 10µm.(H) H3.3-EGFP live-imaging signal in pat- and mat-PCH of control Daxxm+z+ (n=18), Daxxm-z+ (n=8) and Ring1m-z+; Rnf2m-z+ (n=12) zygotes. Scale bar 10µm.(I) Left: IF of endogenous H3 and ATRX at pat-PCH in control and Daxxm-z+ PN5 zygotes. Right: Fluorescence intensity profiles of H3 and ATRX along white line in left panel at pat-PCH of zygotes. Scale bars 5 µm. Data information: All scale bars 10µm.(J) Boxplot displaying H3 signal intensity at pat-PCH of Daxxm+z+ and Daxxm-z+ PN5 zygotes. In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 2 times. ***P<0.001, t-test, n=12 for both groups.(K) IP of DAXX-EGFP and DAXXR244A-EGFP proteins with an anti-GFP antibody from nuclear extract of HEK293 cells. Immuno-blot detection was performed with antibodies recognizing GFP, histone variant H3.3 and CBX2.(L) Percentage of Daxxm-z+ zygotes with lagging chromosomes following injection of Tubulin-EGFP, Daxx-EGFP or DaxxR244A-EGFP mRNAs (20 or 100 ng/µl) at PN2/3 stage. Data represent mean ± s.e.m. (n ≥2 injection experiments). *** P<0.001 High Daxx-EGFP versus other 3 groups; Fisher's exact test (on pooled embryos).(M) Left: IF of EGFP and endogenous H3 at pat-PCH in Daxxm-z+ PN5 zygotes expressing DAXX-EGFP or DAXXR244A-EGFP or nothing exogenously. Right: Fluorescence intensity profiles of H3 and EGFP along white lines in left panels at pat-PCH of zygotes. Scale bars 5 µm. Data information: All scale bars 10µm.(N) Boxplot displaying 3D quantification of H3 signal intensity at pat-PCH in Daxxm-z+ zygotes expressing exogenous DAXX-EGFP (n=14) or DAXXR244A-EGFP (n=13). In boxplots, the enter lines show the medians; box limits indicate the 25th and 75th percentiles as determined by R software; whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 2-3 times. ***P<0.001 Daxx-EGFP versus other 2 groups; t-test."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "RNA", "FISH", "of", "forward", "and", "reverse", "strand", "major", "satellite", "sequences", "in", "Daxxm", "+", "z", "+", "and", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", ".", "Scale", "bars", ",", "10µm", ".", "(", "B", ")", "Box", "plots", "indicating", "the", "foci", "number", "(", "left", ")", "and", "total", "intensity", "(", "right", ")", "of", "forward", "(", "top", ")", "and", "reverse", "(", "bottom", ")", "transcription", "as", "measured", "by", "RNA", "FISH", "on", "3D", "paternal", "pronuclei", "in", "Daxxm", "+", "z", "+", "and", "Daxxm", "-", "z", "+", "PN5", "zygotes", ".", "Lower", "hinge", ",", "central", "line", "and", "upper", "hinge", "in", "boxplots", "represent", "25th", ",", "50th", "(", "median", ")", "and", "75th", "percentiles", "respectively", ".", "Upper", "/", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "/", "smallest", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5", " ", "*", " ", "IQR", "from", "the", "upper", "/", "lower", "hinge", ",", "where", "IQR", "is", "inter", "-", "quartile", "range", "or", "distance", "between", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Datapoints", "are", "indicated", "by", "circles", ".", "Experiments", "were", "replicated", "3", "times", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "MA", "-", "plots", "showing", "Fold", "Change", "(", "FC", ")", "(", "in", "log2", ")", "in", "gene", "expression", "between", "indicated", "samples", "as", "a", "function", "of", "averaged", "expression", "across", "all", "samples", ".", "Dotted", "lines", "indicated", "log2", "(", "FC", ")", "of", "1", ".", "(", "E", ")", "Histogram", "showing", "classification", "of", "genes", "into", "3", "groups", "according", "to", "distribution", "of", "ChIP", "enrichment", "(", "log2", ")", "of", "H3K27me3", "around", "TSS", "in", "MII", "oocytes", "(", "F", ")", "MA", "-", "plot", "showing", "FC", "(", "in", "log2", ")", "in", "gene", "expression", "between", "indicated", "samples", "as", "a", "function", "of", "averaged", "expression", "across", "all", "samples", ".", "Dotted", "lines", "indicated", "log2", "(", "FC", ")", "of", "1", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Boxplots", "showing", "FC", "(", "log2", ")", "in", "gene", "expression", "between", "indicated", "samples", "for", "3", "groups", "of", "genes", "classified", "according", "to", "H3K27me3", "enrichments", "(", "as", "shown", "in", "E", ")", ".", "Lower", "hinge", ",", "central", "line", "and", "upper", "hinge", "represent", "25th", ",", "50th", "(", "median", ")", "and", "75th", "percentiles", "respectively", ".", "Upper", "/", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "/", "smallest", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5", " ", "*", " ", "IQR", "from", "the", "upper", "/", "lower", "hinge", ",", "where", "IQR", "is", "inter", "-", "quartile", "range", "or", "distance", "between", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "Outliers", "are", "not", "displayed", ".", "The", "notches", "extend", "$", "1", ".", "5", "*", "IQR", "/", "\\", "sqrt", "{", "n", "}", "$", "where", "n", "is", "a", "number", "of", "genes", "in", "each", "H3K27me3", "class", ".", "Number", "of", "genes", "(", "n", ")", "in", "\"", "Low", "\"", ",", "\"", "Medium", "\"", "and", "\"", "High", "\"", "H3K27me3", "class", "used", "for", "boxplots", "are", "9824", ",", "2311", ",", "2647", "respectively", ".", "Expression", "changes", "were", "estimated", "using", "2", "or", "3", "biological", "replicates", "for", "each", "condition", ".", "Statistical", "significance", "was", "estimated", "using", "two", "-", "sided", "t", "-", "tests", ".", "(", "J", ")", "Boxplot", "showing", "FC", "(", "log2", ")", "in", "gene", "expression", "between", "Daxx", "deficient", "and", "control", "MII", "oocytes", "for", "five", "groups", "of", "genes", "classified", "according", "to", "FC", "(", "log2", ")", "in", "gene", "expression", "between", "Ring1", "Rnf2", "deficient", "and", "control", "GV", "oocytes", ".", "Boxplots", "were", "created", "and", "number", "of", "genes", "used", "for", "each", "boxplot", "is", "displayed", "below", ".", "Expression", "changes", "were", "estimated", "using", "3", "biological", "replicates", "for", "each", "condition", ".", "Statistical", "significance", "was", "estimated", "using", "two", "-", "sided", "t", "-", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) RNA FISH of forward and reverse strand major satellite sequences in Daxxm+z+ and Daxxm-z+ PN5 zygotes. Scale bars, 10µm.(B) Box plots indicating the foci number (left) and total intensity (right) of forward (top) and reverse (bottom) transcription as measured by RNA FISH on 3D paternal pronuclei in Daxxm+z+ and Daxxm-z+ PN5 zygotes. Lower hinge, central line and upper hinge in boxplots represent 25th, 50th (median) and 75th percentiles respectively. Upper/lower whiskers extend to the largest/smallest values no further than 1.5 * IQR from the upper/lower hinge, where IQR is inter-quartile range or distance between 25th and 75th percentiles. Datapoints are indicated by circles. Experiments were replicated 3 times. ***P<0.001; t-test.(C, D) MA-plots showing Fold Change (FC) (in log2) in gene expression between indicated samples as a function of averaged expression across all samples. Dotted lines indicated log2(FC) of 1.(E) Histogram showing classification of genes into 3 groups according to distribution of ChIP enrichment (log2) of H3K27me3 around TSS in MII oocytes(F) MA-plot showing FC (in log2) in gene expression between indicated samples as a function of averaged expression across all samples. Dotted lines indicated log2(FC) of 1.(G - I) Boxplots showing FC (log2) in gene expression between indicated samples for 3 groups of genes classified according to H3K27me3 enrichments (as shown in E). Lower hinge, central line and upper hinge represent 25th, 50th (median) and 75th percentiles respectively. Upper/lower whiskers extend to the largest/smallest values no further than 1.5 * IQR from the upper/lower hinge, where IQR is inter-quartile range or distance between 25th and 75th percentiles. Outliers are not displayed. The notches extend $1.5*IQR/\\sqrt{n}$ where n is a number of genes in each H3K27me3 class. Number of genes (n) in \"Low\", \"Medium\" and \"High\" H3K27me3 class used for boxplots are 9824, 2311, 2647 respectively. Expression changes were estimated using 2 or 3 biological replicates for each condition. Statistical significance was estimated using two-sided t-tests.(J) Boxplot showing FC (log2) in gene expression between Daxx deficient and control MII oocytes for five groups of genes classified according to FC (log2) in gene expression between Ring1 Rnf2 deficient and control GV oocytes. Boxplots were created and number of genes used for each boxplot is displayed below. Expression changes were estimated using 3 biological replicates for each condition. Statistical significance was estimated using two-sided t-tests."}
{"words": ["figf1a", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "yeast", "cell", "lysates", "with", "polyclonal", "anti", "-", "flag", "antibody", "to", "detect", "flag", "-", "tagged", "human", "Beclin", "1", "expression", ".", "Two", "-", "hundred", "micrograms", "of", "protein", "per", "lane", "was", "loaded", ".", "SEY6210", ",", "wild", "-", "type", "yeast", ";", "JCY3000", ",", "SEY6210", "disrupted", "in", "apg6", "/", "vps30", ";", "(", "+", ")", "control", ",", "lysates", "of", "mammalian", "cells", "transfected", "with", "flag", "-", "beclin", "1", ".", "b", ",", "Autophagicbody", "formation", "in", "yeast", "deprived", "of", "nitrogen", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "and", "absence", "(", "-", ")", "of", "1", "mM", "PMSF", ".", "Arrows", "denote", "cells", "that", "would", "be", "scored", "as", "positive", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "c", ".", "c", ",", "Quantitative", "effects", "of", "apg6", "/", "vps30", "and", "beclin", "1", "transformation", "on", "autophagicbody", "formation", "in", "apg6", "/", "vps30", "-", "disrupted", "yeast", "in", "the", "presence", "of", "PMSF", ".", "Cells", "with", "one", "or", "more", "autophagic", "bodies", "within", "the", "vacuole", "were", "scored", "as", "positive", "(", "see", "arrows", "in", "b", ")", ".", "A", "minimum", "of", "100", "cells", "was", "counted", "for", "each", "sample", ".", "Results", "represent", "the", "mean", "(", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "percentage", "of", "cells", "with", "autophagic", "bodies", "within", "the", "vacuole", "for", "triplicate", "samples", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "five", "independent", "experiments", ".", "d", ",", "Sorting", "of", "vacuolar", "protein", "carboxypeptidase", "Y", ",", "(", "CPY", ")", ".", "p2CPY", ",", "precursor", "form", ";", "mCPY", ",", "sorted", "mature", "form", ".", "Mr", ",", "relative", "molecular", "mass", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Western blot analysis of yeast cell lysates with polyclonal anti-flag antibody to detect flag-tagged human Beclin 1 expression. Two-hundred micrograms of protein per lane was loaded. SEY6210, wild-type yeast; JCY3000, SEY6210 disrupted in apg6/vps30; (+) control, lysates of mammalian cells transfected with flag-beclin 1.b, Autophagicbody formation in yeast deprived of nitrogen in the presence (+) and absence (-) of 1 mM PMSF. Arrows denote cells that would be scored as positive in the experiment shown in c.c, Quantitative effects of apg6/vps30 and beclin 1 transformation on autophagicbody formation in apg6/vps30-disrupted yeast in the presence of PMSF. Cells with one or more autophagic bodies within the vacuole were scored as positive (see arrows in b). A minimum of 100 cells was counted for each sample. Results represent the mean (±s.e.m.) percentage of cells with autophagic bodies within the vacuole for triplicate samples. Similar results were obtained in five independent experiments.d, Sorting of vacuolar protein carboxypeptidase Y, (CPY). p2CPY, precursor form; mCPY, sorted mature form. Mr, relative molecular mass."}
{"words": ["figf2a", "-", "f", ",", "Electron", "micrographs", "of", "MCF7", ".", "control", "(", "clone", "38", ")", "(", "a", ",", "b", ")", "and", "MCF7", ".", "beclin1", "(", "clone", "17", ")", "cells", "(", "c", "-", "f", ")", "grown", "in", "nutrient", "-", "rich", "media", "(", "a", ",", "c", ")", "or", "subjected", "to", "4", " ", "h", "of", "serum", "and", "amino", "-", "acid", "deprivation", "(", "b", ",", "d", "-", "f", ")", ".", "Asterisks", "in", "e", "and", "f", "denote", "autophagic", "vacuoles", "that", "would", "be", "counted", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "g", ".", "Autophagic", "vacuoles", "were", "defined", "as", "double", "-", "membrane", "vacuolar", "structures", "containing", "recognizable", "cytoplasmic", "contents", ".", "Scale", "bars", ",", "1", " ", "µm", ".", "g", ",", "Quantitative", "effects", "of", "beclin", "1", "on", "basal", "and", "nutrient", "-", "deprivation", "-", "induced", "autophagy", "of", "MCF7", "cells", ".", "Bars", "indicate", "mean", "(", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "number", "of", "autophagic", "vacuoles", "per", "cell", "for", "cells", "growing", "in", "normal", "media", "(", "black", ")", ",", "for", "cells", "subjected", "to", "4", "h", "of", "serum", "and", "amino", "-", "acid", "deprivation", "(", "grey", ")", ",", "and", "for", "cells", "pre", "-", "treated", "for", "30", "min", "with", "10", "mM", "3", "-", "MA", "and", "subjected", "to", "4", "h", "of", "serum", "and", "amino", "-", "acid", "deprivation", "in", "the", "presence", "of", "3", "-", "MA", "(", "open", ")", ".", "Mean", "was", "determined", "by", "counting", "the", "total", "number", "of", "autophagic", "vacuoles", "in", "each", "cell", "for", "100", "cells", "per", "clone", "per", "treatment", ".", "h", ",", "Comparison", "of", "the", "rates", "of", "degradation", "of", "long", "-", "lived", "proteins", "in", "MCF7", ".", "control", "cells", "(", "squares", ",", "clone", "38", ")", ",", "MCF7", ".", "beclin1", "cells", "(", "circles", ",", "clone", "17", ")", "and", "MCF7", ".", "beclin1stop", "cells", "(", "triangles", ",", "clone", "70", ")", ",", "in", "EBSS", "+", "10", "%", "serum", "and", "complete", "amino", "acids", "(", "open", "symbols", ",", "solid", "lines", ")", "in", "EBSS", "alone", "(", "closed", "symbols", ",", "solid", "lines", ")", ",", "and", "in", "EBSS", "+", "10", "mM", "3", "-", "MA", "(", "closed", "symbols", ",", "dotted", "lines", ")", ".", "Results", "are", "mean", "(", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "of", "triplicate", "wells", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "Results", "shown", "with", "these", "clones", "are", "representative", "of", "results", "obtained", "with", "other", "clones", "analysed", "by", "electron", "microscopy", "in", "g", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a-f, Electron micrographs of MCF7.control (clone 38) (a, b) and MCF7.beclin1 (clone 17) cells (c- f) grown in nutrient-rich media (a, c) or subjected to 4 h of serum and amino-acid deprivation (b, d-f). Asterisks in e and f denote autophagic vacuoles that would be counted in the experiment shown in g. Autophagic vacuoles were defined as double-membrane vacuolar structures containing recognizable cytoplasmic contents. Scale bars, 1 µm.g, Quantitative effects of beclin 1 on basal and nutrient-deprivation-induced autophagy of MCF7 cells. Bars indicate mean (±s.e.m.) number of autophagic vacuoles per cell for cells growing in normal media (black), for cells subjected to 4 h of serum and amino-acid deprivation (grey), and for cells pre-treated for 30 min with 10 mM 3-MA and subjected to 4 h of serum and amino-acid deprivation in the presence of 3-MA (open). Mean was determined by counting the total number of autophagic vacuoles in each cell for 100 cells per clone per treatment.h, Comparison of the rates of degradation of long-lived proteins in MCF7.control cells (squares, clone 38), MCF7.beclin1 cells (circles, clone 17) and MCF7.beclin1stop cells (triangles, clone 70), in EBSS + 10% serum and complete amino acids (open symbols, solid lines) in EBSS alone (closed symbols, solid lines), and in EBSS + 10 mM 3-MA (closed symbols, dotted lines). Results are mean (±s.e.m.) of triplicate wells. Similar results were obtained in three independent experiments. Results shown with these clones are representative of results obtained with other clones analysed by electron microscopy in g."}
{"words": ["figf3a", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "flag", "-", "tagged", "beclin", "-", "1", "-", "transfected", "MCF7", "clones", ".", "C", ",", "MCF7", ".", "control", "cells", "(", "clone", "38", ")", ";", "St", ",", "MCF7", ".", "beclin1stop", "cells", "(", "clone", "70", ")", ".", "Mr", ",", "relative", "molecular", "mass", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "flag", "-", "tagged", "beclin1stop", "-", "transfected", "MCF7", "clones", ".", "C", ",", "MCF", ".", "control", "cells", "(", "clone", "38", ")", ";", "B", ",", "MCF7", ".", "beclin1", "cells", "(", "clone", "1", ")", ".", "c", ",", "Photomicrographs", "of", "MCF7", ".", "control", "cells", "(", "left", "panel", ",", "clone", "38", ")", ",", "MCF7", ".", "beclin1", "cells", "(", "middle", "panel", ",", "clone", "17", ")", "and", "MCF7", ".", "beclin1stop", "cells", "(", "right", "panel", ",", "clone", "70", ")", "48", "h", "after", "seeding", "at", "similar", "densities", ".", "d", ",", "Proliferation", "of", "MCF7", ".", "control", "cells", "(", "clones", "37", "and", "38", ";", "closed", "squares", "and", "circles", ",", "respectively", ",", "solid", "lines", ")", ",", "MCF7", ".", "beclin1", "cells", "(", "clones", "1", ",", "6", ",", "17", ";", "open", "squares", ",", "circles", ",", "triangles", ",", "respectively", ",", "solid", "lines", ")", "and", "MCF7", ".", "beclin1stop", "cells", "(", "clone", "70", ",", "closed", "triangles", ",", "dotted", "line", ")", ".", "Results", "represent", "mean", "Absorbance", "(", "A", ")", "(", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "for", "six", "wells", ";", "similar", "results", "were", "obtained", "in", "three", "independent", "experiments", ".", "e", ",", "Cell", "viability", "of", "MCF7", "clones", "determined", "by", "trypan", "blue", "staining", ".", "Symbols", "for", "each", "clone", "are", "as", "in", "df", ",", "Clonigenicity", "in", "semisolid", "medium", "(", "soft", "agar", ")", "of", "MCF7", "clones", ".", "Results", "are", "mean", "(", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "for", "pooled", "triplicate", "wells", "from", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ".", "g", ",", "Tumour", "formation", "in", "NCR", "nude", "mice", "injected", "subcutaneously", "with", "MCF7", "clones", ".", "Numbers", "on", "top", "of", "bar", "indicate", "number", "of", "autopsy", "-", "confirmed", "tumours", "at", "8", "weeks", "per", "number", "of", "mice", "injected", "with", "each", "clone", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Western blot analysis of flag-tagged beclin-1-transfected MCF7 clones. C, MCF7.control cells (clone 38); St, MCF7.beclin1stop cells (clone 70). Mr, relative molecular mass.b, Western blot analysis of flag-tagged beclin1stop-transfected MCF7 clones. C, MCF.control cells (clone 38); B, MCF7.beclin1 cells (clone 1).c, Photomicrographs of MCF7.control cells (left panel, clone 38), MCF7. beclin1 cells (middle panel, clone 17) and MCF7.beclin1stop cells (right panel, clone 70) 48 h after seeding at similar densities.d, Proliferation of MCF7.control cells (clones 37 and 38; closed squares and circles, respectively, solid lines), MCF7.beclin1 cells (clones 1, 6, 17; open squares, circles, triangles, respectively, solid lines) and MCF7.beclin1stop cells (clone 70, closed triangles, dotted line). Results represent mean Absorbance (A) (±s.e.m.) for six wells; similar results were obtained in three independent experiments.e, Cell viability of MCF7 clones determined by trypan blue staining. Symbols for each clone are as in df, Clonigenicity in semisolid medium (soft agar) of MCF7 clones. Results are mean (±s.e.m.) for pooled triplicate wells from 3-4 independent experiments.g, Tumour formation in NCR nude mice injected subcutaneously with MCF7 clones. Numbers on top of bar indicate number of autopsy-confirmed tumours at 8 weeks per number of mice injected with each clone."}
{"words": ["figf4a", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "human", "breast", "carcinoma", "cell", "lines", ".", "Results", "are", "from", "8", "representative", "cell", "lines", "out", "of", "a", "total", "of", "11", "analysed", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "matched", "normal", "breast", "and", "breast", "carcinoma", "tissue", "from", "patients", "with", "sporadic", "invasive", "breast", "carcinoma", ".", "Results", "are", "from", "7", "representative", "cases", "out", "of", "a", "total", "of", "17", "analysed", ".", "N", ",", "normal", "breast", "tissue", ";", "T", ",", "tumour", "tissue", ";", "Mr", ",", "relative", "molecular", "mass", ".", "c", ",", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "paraffin", "-", "embedded", "sections", "of", "breast", "tissue", "from", "patient", "441", "shown", "in", "b", ".", "Adjacent", "sections", "are", "stained", "with", "pre", "-", "immune", "843", "rabbit", "serum", "(", "left", "column", ")", ",", "843", "anti", "-", "Beclin", "1serum", "(", "middle", "column", ")", "and", "anti", "-", "cytokeratin", "(", "right", "column", ")", ".", "Top", "row", "shows", "low", "power", "view", "of", "region", "of", "breast", "containing", "tumour", "(", "T", ")", "and", "normal", "mammary", "epithelial", "duct", "(", "N", ")", ".", "Middle", "row", "shows", "higher", "power", "view", "of", "normal", "mammary", "epithelial", "duct", ".", "Bottom", "row", "shows", "higher", "power", "view", "of", "tumour", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "mm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Western blot analysis of human breast carcinoma cell lines. Results are from 8 representative cell lines out of a total of 11 analysed.b, Western blot analysis of matched normal breast and breast carcinoma tissue from patients with sporadic invasive breast carcinoma. Results are from 7 representative cases out of a total of 17 analysed. N, normal breast tissue; T, tumour tissue; Mr, relative molecular mass.c, Immunohistochemical analysis of paraffin-embedded sections of breast tissue from patient 441 shown in b. Adjacent sections are stained with pre-immune 843 rabbit serum (left column), 843 anti-Beclin 1serum (middle column) and anti-cytokeratin (right column). Top row shows low power view of region of breast containing tumour (T) and normal mammary epithelial duct (N). Middle row shows higher power view of normal mammary epithelial duct. Bottom row shows higher power view of tumour. Scale bars, 1 mm."}
{"words": ["Figure", "1Biological", "replicates", "of", "transcriptional", "profiles", "(", "Tx", ")", "measured", "in", "separately", "prepared", "cell", "free", "lysate", "batches", "of", "E", ".", "coli", ".", "Correlation", "between", "transcriptional", "profiles", "(", "Tx", ")", "for", "regulatory", "sequence", "libraries", "from", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "measurements", "in", "E", ".", "coli", ".", "The", "color", "scale", "indicates", "the", "density", "of", "data", "points", "in", "a", "given", "area", "of", "the", "plot", ".", "Correlation", "between", "primary", "TSS", "calls", "(", "in", "bp", "from", "ATG", "start", "codon", ")", "of", "regulatory", "sequences", "from", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "measurements", "in", "E", ".", "coli", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Biological replicates of transcriptional profiles (Tx) measured in separately prepared cell free lysate batches of E. coli.Correlation between transcriptional profiles (Tx) for regulatory sequence libraries from in vitro and in vivo measurements in E. coli. The color scale indicates the density of data points in a given area of the plot.Correlation between primary TSS calls (in bp from ATG start codon) of regulatory sequences from in vitro and in vivo measurements in E. coli."}
{"words": ["Figure", "2Optimization", "of", "transcriptional", "output", "using", "different", "concentrations", "of", "Mg", "-", "glutamate", "and", "K", "-", "glutamate", "in", "10", "bacterial", "cell", "-", "free", "expression", "systems", "with", "Broccoli", "as", "a", "reporter", "(", "solid", "lines", ",", "optimal", "buffer", "composition", "shown", "in", "red", ")", ".", "No", "DNA", "template", "controls", "are", "shown", "as", "grey", "dashed", "lines", ".", "12", ".", "5", "nM", "of", "DNA", "template", "was", "used", "in", "all", "systems", ",", "except", "L", ".", "lactis", "(", "50", "nM", "used", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Optimization of transcriptional output using different concentrations of Mg-glutamate and K-glutamate in 10 bacterial cell-free expression systems with Broccoli as a reporter (solid lines, optimal buffer composition shown in red). No DNA template controls are shown as grey dashed lines. 12.5 nM of DNA template was used in all systems, except L. lactis (50 nM used)."}
{"words": ["Figure", "3Transcriptional", "activities", "(", "Tx", ")", "of", "421", "regulatory", "sequences", "that", "were", "active", "in", "all", "10", "bacterial", "cell", "-", "free", "expression", "systems", ".", "Pairwise", "comparison", "of", "transcriptional", "profiles", "of", "421", "universally", "-", "active", "regulatory", "sequences", "between", "bacterial", "species", ".", "Example", "scatter", "plots", "with", "relatively", "high", "and", "low", "Pearson", "correlation", "in", "the", "heatmap", "(", "marked", "i", "and", "ii", ")", "are", "shown", "on", "left", ".", "Correlation", "between", "evolutionary", "divergences", "(", "16S", "rRNA", "percent", "identity", ")", "and", "pairwise", "Pearson", "correlation", "of", "transcriptional", "profiles", ".", "Dashed", "line", "represents", "linear", "regression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Transcriptional activities (Tx) of 421 regulatory sequences that were active in all 10 bacterial cell-free expression systems.Pairwise comparison of transcriptional profiles of 421 universally-active regulatory sequences between bacterial species. Example scatter plots with relatively high and low Pearson correlation in the heatmap (marked i and ii) are shown on left.Correlation between evolutionary divergences (16S rRNA percent identity) and pairwise Pearson correlation of transcriptional profiles. Dashed line represents linear regression."}
{"words": ["Figure", "5Pairwise", "correlation", "of", "RS7003", "transcriptional", "profiles", "between", "hybrid", "lysate", "and", "single", "constituent", "species", "lysates", "for", "(", "d", ")", "E", ".", "coli", "+", "B", ".", "subtilisPairwise", "correlation", "of", "RS7003", "transcriptional", "profiles", "between", "hybrid", "lysate", "and", "single", "constituent", "species", "lysates", "for", "(", "e", ")", "E", ".", "coli", "+", "C", ".", "glutamicum", "hybrids", "with", "different", "mixing", "ratios", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Pairwise correlation of RS7003 transcriptional profiles between hybrid lysate and single constituent species lysates for (d) E. coli + B. subtilisPairwise correlation of RS7003 transcriptional profiles between hybrid lysate and single constituent species lysates for (e) E. coli + C. glutamicum hybrids with different mixing ratios."}
{"words": ["Figure", "1A", "Expression", "of", "transcripts", "coding", "for", "PI3K", "subunit", "genes", "in", "pDCs", "(", "n", "=", "12", "biological", "replicates", ")", ".", "In", "the", "boxplot", ",", "the", "middle", ",", "the", "bottom", ",", "and", "the", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "median", ",", "the", "1st", "quantile", "and", "the", "3rd", "quantile", ",", "respectively", ";", "the", "height", "of", "the", "box", "is", "given", "by", "the", "difference", "between", "the", "3rd", "and", "the", "1st", "quantiles", "(", "IQR", ",", "interquartile", "range", ")", ";", "the", "whiskers", "length", "is", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", ".", "Data", "points", "beyond", "the", "whiskers", "represent", "values", "more", "extreme", "than", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", "above", "or", "below", "the", "3rd", "or", "the", "1st", "quantile", ",", "respectively", ".", "C", "Kyn", "levels", "in", "culture", "supernatants", "of", "pDCs", "incubated", "for", "24", "h", "with", "medium", "alone", "(", "Ctrl", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "after", "1", "−", "h", "pretreatment", "with", "PI3K", "inhibitors", ".", "D", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Ido1", "and", "Tgfb1", "transcripts", "in", "pDCs", "stimulated", "for", "18", "h", "with", "TGF", "-", "β", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "(", "Ctrl", ",", "control", ")", "of", "catalytic", "PI3K", "inhibitors", ",", "normalized", "to", "the", "expression", "of", "Gapdh", "and", "presented", "relative", "to", "results", "in", "untreated", "cells", "(", "dotted", "line", ",", "1", "-", "fold", ")", ".", "E", "In", "vivo", "suppression", "of", "the", "activity", "of", "HY", "-", "pulsed", "CD8", "−", "DCs", "in", "combination", "with", "a", "minority", "fraction", "(", "5", "%", ")", "of", "pDCs", "conditioned", "in", "vitro", "with", "TGF", "-", "β", "(", "or", "medium", ")", "for", "24", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "(", "Ctrl", ")", "of", "catalytic", "inhibitors", "as", "in", "C", ".", "Analysis", "of", "skin", "reactivity", "of", "recipient", "mice", "to", "the", "eliciting", "peptide", "at", "15", "days", "is", "presented", "as", "change", "in", "footpad", "weight", "(", "experimental", "versus", "control", "footpads", ")", ".", "F", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Ido1", "and", "Tgfb1", "transcripts", "in", "pDCs", "transfected", "with", "p110α", "-", ",", "β", "-", ",", "δ", "-", "specific", ",", "or", "negative", "control", "(", "nc", ")", "siRNA", "and", "stimulated", "for", "18", "h", "with", "TGF", "-", "β", ",", "normalized", "to", "the", "expression", "of", "Gapdh", "and", "presented", "relative", "to", "results", "in", "unstimulated", "cells", "(", "dotted", "line", ",", "1", "-", "fold", ")", ".", "G", "In", "vivo", "suppression", "of", "the", "activity", "of", "HY", "-", "pulsed", "CD8", "−", "DCs", "in", "combination", "with", "a", "minority", "fraction", "(", "5", "%", ")", "of", "pDCs", "transfected", "with", "siRNA", "as", "in", "(", "F", ")", "and", "conditioned", "in", "vitro", "with", "TGF", "-", "β", "(", "or", "medium", ")", "for", "24", "h", ".", "Analysis", "of", "skin", "reactivity", "of", "recipient", "mice", "to", "the", "eliciting", "peptide", "at", "15", "days", "is", "presented", "as", "change", "in", "footpad", "weight", "(", "experimental", "versus", "control", "footpads", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Expression of transcripts coding for PI3K subunit genes in pDCs (n =12 biological replicates). In the boxplot, the middle, the bottom, and the top of the box represent the median, the 1st quantile and the 3rd quantile, respectively; the height of the box is given by the difference between the 3rd and the 1st quantiles (IQR, interquartile range); the whiskers length is 1.5 times the interquartile range. Data points beyond the whiskers represent values more extreme than 1.5 times the interquartile range above or below the 3rd or the 1st quantile, respectively.C Kyn levels in culture supernatants of pDCs incubated for 24 h with medium alone (Ctrl) or IFN-γ after 1−h pretreatment with PI3K inhibitors. D Real-time PCR analysis of Ido1 and Tgfb1 transcripts in pDCs stimulated for 18 h with TGF-β, in the presence or absence (Ctrl, control) of catalytic PI3K inhibitors, normalized to the expression of Gapdh and presented relative to results in untreated cells (dotted line, 1-fold). E In vivo suppression of the activity of HY-pulsed CD8− DCs in combination with a minority fraction (5%) of pDCs conditioned in vitro with TGF-β (or medium) for 24 h in the presence or absence (Ctrl) of catalytic inhibitors as in C. Analysis of skin reactivity of recipient mice to the eliciting peptide at 15 days is presented as change in footpad weight (experimental versus control footpads).F Real-time PCR analysis of Ido1 and Tgfb1 transcripts in pDCs transfected with p110α-, β-, δ-specific, or negative control (nc) siRNA and stimulated for 18 h with TGF-β, normalized to the expression of Gapdh and presented relative to results in unstimulated cells (dotted line, 1-fold). G In vivo suppression of the activity of HY-pulsed CD8− DCs in combination with a minority fraction (5%) of pDCs transfected with siRNA as in (F) and conditioned in vitro with TGF-β (or medium) for 24 h. Analysis of skin reactivity of recipient mice to the eliciting peptide at 15 days is presented as change in footpad weight (experimental versus control footpads). "}
{"words": ["Figure", "2C", "Pull", "-", "down", "(", "PD", ")", "assay", "of", "lysates", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "with", "unphosphorylated", "(", "YENM", ")", "and", "tyrosine", "-", "phosphorylated", "IDO1", "peptides", "(", "pYENM", ",", "pITIM1", ",", "and", "pITIM2", ")", ",", "analyzed", "by", "sequential", "immunoblotting", "with", "anti", "−", "p85", ",", "−", "SHP", "-", "1", ",", "and", "-", "SHP", "-", "2", "antibodies", ".", "D", "Immunoblotting", "with", "anti", "-", "IDO1", "and", "-", "p85", "antibodies", "of", "IDO1", "immunoprecipitates", "obtained", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "or", "IDO1", ".", "Y149F", ".", "Mock", "-", "transfected", "P1", ".", "HTR", "cells", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "E", "Tyrosine", "phosphatase", "activity", "in", "anti", "-", "IDO1", "immunoprecipitates", "from", "lysates", "of", "P1", ".", "HTR", "transfectants", "as", "in", "D", ".", "F", "Kyn", "release", "over", "24", "h", "by", "P1", ".", "HTR", "transfectants", "as", "in", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C Pull-down (PD) assay of lysates from P1.HTR cells with unphosphorylated (YENM) and tyrosine-phosphorylated IDO1 peptides (pYENM, pITIM1, and pITIM2), analyzed by sequential immunoblotting with anti−p85, −SHP-1, and -SHP-2 antibodies.D Immunoblotting with anti-IDO1 and -p85 antibodies of IDO1 immunoprecipitates obtained from P1.HTR cells transfected with IDO1.WT or IDO1.Y149F. Mock-transfected P1.HTR cells were used as a control.E Tyrosine phosphatase activity in anti-IDO1 immunoprecipitates from lysates of P1.HTR transfectants as in D.F Kyn release over 24 h by P1.HTR transfectants as in D."}
{"words": ["Figure", "3A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "either", "untransfected", "(", "Untr", ")", "or", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "(", "WT", ")", "or", "vector", "alone", "(", "Mock", ")", "and", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", ",", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "markers", "of", "intracellular", "organelles", "and", "structures", "(", "as", "indicated", ";", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Immunoblotting", "analysis", "of", "EE", "purified", "from", "P1", ".", "IDO1", ".", "WT", "cells", ".", "Mock", "-", "transfected", "cells", "as", "in", "A", "were", "used", "as", "control", ".", "D", "Distribution", "of", "the", "IDO1", ".", "WT", "protein", "expressed", "by", "P1", ".", "HTR", "transfected", "cells", "in", "isopycnic", "sucrose", "gradients", ".", "Fractions", "were", "immunoblotted", "using", "antibodies", "specific", "for", "IDO1", "and", "intracellular", "organelles", "or", "structures", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells either untransfected (Untr) or transfected with IDO1.WT (WT) or vector alone (Mock) and stained with antibodies recognizing IDO1 (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 20 µm.B Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT, co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and markers of intracellular organelles and structures (as indicated; red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.C Immunoblotting analysis of EE purified from P1.IDO1.WT cells. Mock-transfected cells as in A were used as control.D Distribution of the IDO1.WT protein expressed by P1.HTR transfected cells in isopycnic sucrose gradients. Fractions were immunoblotted using antibodies specific for IDO1 and intracellular organelles or structures as indicated."}
{"words": ["Figure", "4A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "or", "IDO1", ".", "Y149F", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "B", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "as", "in", "A", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "24", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "C", "Distribution", "of", "IDO1", ".", "WT", "and", "the", "IDO1", ".", "Y149F", "mutants", "in", "homogenates", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "along", "the", "isopycnic", "sucrose", "gradient", "as", "in", "Fig", "3D", ".", "Fractions", "were", "immunoblotted", "using", "antibodies", "specific", "for", "IDO1", ".", "D", "The", "distribution", "of", "IDO1", ".", "WT", "and", "IDO1", ".", "Y149F", "proteins", "along", "the", "isopycnic", "sucrose", "gradient", "is", "shown", "in", "term", "of", "densitometric", "analysis", "in", "each", "fraction", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT or IDO1.Y149F and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.B Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in P1.HTR cells transfected as in A, with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 24 cells from three independent experiments). Statistical analysis was performed using two-tailed unpaired Student's t-test. ***P < 0.001.C Distribution of IDO1.WT and the IDO1.Y149F mutants in homogenates of P1.HTR cells along the isopycnic sucrose gradient as in Fig 3D. Fractions were immunoblotted using antibodies specific for IDO1.D The distribution of IDO1.WT and IDO1.Y149F proteins along the isopycnic sucrose gradient is shown in term of densitometric analysis in each fraction (mean ± SD of three experiments)."}
{"words": ["Figure", "5", "A", "Pull", "-", "down", "assay", "of", "lysates", "from", "untransfected", "P1", ".", "HTR", "cells", "with", "unphosphorylated", "(", "YENM", ")", "and", "tyrosine", "-", "phosphorylated", "(", "pYENM", ")", "IDO1", "peptides", ",", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "p85", ",", "-", "p110α", ",", "-", "p110β", ",", "-", "p110γ", ",", "and", "-", "p110δ", "antibodies", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "used", "as", "control", "of", "lysate", "amount", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "incubated", "with", "class", "IA", "PI3K", "p110", "isoform", "inhibitors", "(", "indicated", ")", "or", "medium", "alone", "(", "Ctrl", ")", "for", "24", "h", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "and", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "20", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "D", "Tyrosine", "phosphatase", "activity", "in", "anti", "-", "IDO1", "immunoprecipitates", "from", "P1", ".", "HTR", "cells", "transfected", "with", "IDO1", ".", "WT", "cells", "and", "treated", "with", "PI3K", "catalytic", "inhibitors", "(", "indicated", ")", "or", "medium", "alone", "(", "ctrl", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A Pull-down assay of lysates from untransfected P1.HTR cells with unphosphorylated (YENM) and tyrosine-phosphorylated (pYENM) IDO1 peptides, analyzed by immunoblotting with anti-p85, -p110α, -p110β, -p110γ, and -p110δ antibodies. Whole cell lysates (WCL) were used as control of lysate amount. B Confocal immunofluorescence microscopy images of P1.HTR cells transfected with IDO1.WT incubated with class IA PI3K p110 isoform inhibitors (indicated) or medium alone (Ctrl) for 24 h and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 10 µm.C Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in P1.HTR cells transfected and treated as in (B), with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 20 cells from two independent experiments).D Tyrosine phosphatase activity in anti-IDO1 immunoprecipitates from P1.HTR cells transfected with IDO1.WT cells and treated with PI3K catalytic inhibitors (indicated) or medium alone (ctrl). Data represent the mean ± SD (n = 3 technical replicates)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "freshly", "purified", "pDCs", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "markers", "of", "intracellular", "organelles", "and", "structures", "(", "indicated", ";", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "imagine", "is", "shown", "for", "all", "stainings", "or", "without", "DAPI", "(", "no", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "B", "Confocal", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "pDCs", "incubated", "for", "24", "h", "with", "TGF", "-", "β", "or", "IFN", "-", "γ", "and", "co", "-", "stained", "with", "antibodies", "recognizing", "IDO1", "(", "green", ")", "and", "EEA1", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "C", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "of", "IDO1", "colocalization", "with", "EEA1", "in", "pDCs", "either", "untreated", "or", "stimulated", "with", "TGF", "-", "β", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "as", "in", "B", ")", ",", "with", "each", "point", "representing", "colocalization", "within", "an", "image", "stack", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "20", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Confocal immunofluorescence microscopy images of freshly purified pDCs co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and markers of intracellular organelles and structures (indicated; red). Nuclei were stained with DAPI (blue). The merge imagine is shown for all stainings or without DAPI (no DAPI). Scale bar, 5 µm.B Confocal immunofluorescence microscopy images of pDCs incubated for 24 h with TGF-β or IFN-γ and co-stained with antibodies recognizing IDO1 (green) and EEA1 (red). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 5 µm. C Pearson's coefficient of IDO1 colocalization with EEA1 in pDCs either untreated or stimulated with TGF-β or IFN-γ (as in B), with each point representing colocalization within an image stack. Data represent mean ± SD (n > 20 cells from three independent experiments). "}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Size", "of", "adult", "(", "9", "-", "14", "week", ")", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", ".", "B", ".", "Body", "weight", "of", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "(", "9", "-", "14", "week", ")", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "5", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "5", "mice", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "In", "(", "B", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "the", "data", ",", "with", "bottom", "and", "top", "represent", "min", "and", "max", "value", "of", "the", "dataset", "respectively", ".", "C", ".", "Brains", "from", "adult", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "(", "9", "-", "14", "week", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "1000", "µm", ".", "D", ".", "Brain", "weight", "of", "9", "-", "14", "-", "week", "-", "old", "mice", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "5", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "5", "mice", ".", "Data", "information", ":", "In", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "In", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "the", "data", ",", "with", "bottom", "and", "top", "represent", "min", "and", "max", "value", "of", "the", "dataset", "respectively", ".", "F", ".", "Adult", "testis", "(", "9", "-", "14", "week", ")", "of", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "1000", "µm", ".", "G", ".", "Adult", "testis", "(", "9", "-", "14", "week", ")", "weight", "of", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "10", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "10", "mice", ".", "Data", "information", ":", "In", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "In", "G", ")", "whiskers", "represent", "the", "range", "of", "the", "data", ",", "with", "bottom", "and", "top", "represent", "min", "and", "max", "value", "of", "the", "dataset", "respectively", ".", "K", ".", "Bright", "-", "field", "image", "of", "live", "epididymal", "sperm", "from", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "(", "9", "-", "14", "week", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "Arrow", "heads", "highlight", "the", "sperm", "heads", ".", "L", ".", "Quantification", "of", "(", "K", ")", ",", "sperm", "number", "per", "mouse", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "Data", "information", ":", "In", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "N", ".", "Immunofluorescence", "for", "GATA4", "(", "green", ")", "with", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "of", "10", "µm", "testis", "cryo", "-", "sections", "from", "adult", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "(", "9", "-", "14", "week", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "Dashed", "lines", "highlight", "the", "STs", ".", "O", ".", "Quantification", "of", "(", "N", ")", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "50", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "See", "Appendix", "Fig", "S2", "for", "ST", "number", "per", "section", "and", "ST", "diameter", ".", "Data", "information", ":", "In", "O", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Size of adult (9-14 week) CEP250+/+ and CEP250-/- mice. B. Body weight of CEP250+/+ and CEP250-/- mice (9-14 week). CEP250+/+ n=5 mice, CEP250-/- n=5 mice. Data information: In (B , data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test). In (B whiskers represent the range of the data, with bottom and top represent min and max value of the dataset respectively.C. Brains from adult CEP250+/+ and CEP250-/- mice (9-14 week). Scale bars: 1000 µm. D. Brain weight of 9-14-week-old mice. CEP250+/+ n=5 mice, CEP250-/- n=5 mice. Data information: In data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test). In whiskers represent the range of the data, with bottom and top represent min and max value of the dataset respectively.F. Adult testis (9-14 week) of CEP250+/+ and CEP250-/- mice. Scale bars: 1000 µm. G. Adult testis (9-14 week) weight of CEP250+/+ and CEP250-/- mice. CEP250+/+ n=10 mice, CEP250-/- n=10 mice. Data information: In data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test). In G) whiskers represent the range of the data, with bottom and top represent min and max value of the dataset respectively.K. Bright-field image of live epididymal sperm from CEP250+/+ and CEP250-/- mice (9-14 week). Scale bars: 10 µm. Arrow heads highlight the sperm heads. L. Quantification of (K), sperm number per mouse. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. Data information: In data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test).N. Immunofluorescence for GATA4 (green) with DAPI staining (blue) of 10 µm testis cryo-sections from adult CEP250+/+ and CEP250-/- mice (9-14 week). Scale bars: 100 µm. Dashed lines highlight the STs. O. Quantification of (N), CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. 50 STs were analyzed for each mouse. See Appendix Fig S2 for ST number per section and ST diameter. Data information: In O), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2D", ".", "Immunofluorescence", "for", "MVH", "(", "green", ")", "with", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "of", "10", "µm", "testis", "cryo", "-", "sections", "from", "neonatal", "mice", "(", "P5", ",", "P10", "and", "P14", ")", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "µm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "Data", "information", ":", "E", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "C", "-", "CASP3", "positive", "cells", "normalized", "to", "total", "cell", "number", "per", "seminiferous", "tubule", "(", "ST", ")", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "F", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "G", ".", "C", "-", "CASP3", "(", "green", ")", "and", "MVH", "(", "magenta", ")", "staining", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "of", "10", "µm", "testis", "cryo", "-", "sections", "from", "neonatal", "mice", "(", "P5", ",", "P10", "and", "P14", ")", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", ",", "scale", "bars", ":", "20", "µm", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "(", "G", ")", ".", "Percentage", "of", "C", "-", "CASP3", "and", "MVH", "double", "positive", "cells", "in", "relation", "to", "total", "C", "-", "CASP3", "positive", "cells", "per", "ST", "from", "P5", ",", "P10", "and", "P14", "mice", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "(", "G", ")", ".", "Percentage", "of", "C", "-", "CASP3", "and", "MVH", "double", "positive", "cells", "in", "relation", "to", "total", "MVH", "positive", "cells", "(", "germ", "cells", ")", "per", "ST", "from", "P5", ",", "P10", "and", "P14", "mice", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", "In", "H", ",", "I", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D. Immunofluorescence for MVH (green) with DAPI staining (blue) of 10 µm testis cryo-sections from neonatal mice (P5, P10 and P14) CEP250+/+ and CEP250-/-. Scale bars: 20 µm.E. Quantification of CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. Data information: E), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, **P < 0.01, ****P < 0.0001 (the unpaired Student's t-test).F. Quantification of C-CASP3 positive cells normalized to total cell number per seminiferous tubule (ST). Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. 30 STs were analyzed for each mouse. Data information: In (F data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, ***P < 0.005 , ****P < 0.0001 (the Mann-Whitney test).G. C-CASP3 (green) and MVH (magenta) staining with DAPI (blue) of 10 µm testis cryo-sections from neonatal mice (P5, P10 and P14) CEP250+/+ and CEP250-/-, scale bars: 20 µm. H. Quantification of (G). Percentage of C-CASP3 and MVH double positive cells in relation to total C-CASP3 positive cells per ST from P5, P10 and P14 mice. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. 30 STs were analyzed for each mouse. I. Quantification of (G). Percentage of C-CASP3 and MVH double positive cells in relation to total MVH positive cells (germ cells) per ST from P5, P10 and P14 mice. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. 30 STs were analyzed for each mouse. Data information In H, I), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, ***P < 0.005 , ****P < 0.0001 (the Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Immunofluorescence", "staining", "for", "PLZF", "(", "red", ")", "with", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "of", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "of", "testes", "from", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "at", "P5", ",", "P10", "and", "P14", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "PLZF", "+", "cells", "per", "seminiferous", "(", "ST", ")", "section", "of", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", ",", "testes", "at", "P5", ",", "P10", "and", "P14", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "(", "P5", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "(", "P5", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "50", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ";", "CEP250", "+", "/", "+", "(", "P10", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "(", "P10", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ";", "CEP250", "+", "/", "+", "(", "P14", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "(", "P14", ")", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "50", "ST", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "C", ".", "Immunofluorescence", "staining", "for", "SCP1", "(", "green", ")", ",", "PLZF", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "of", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "of", "testes", "from", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "mice", "at", "P2", ",", "P3", ",", "P5", "and", "P7", ".", "Arrowheads", "highlight", "PLZF", "-", "SCP1", "+", "(", "green", ")", "cells", ",", "which", "represent", "differentiated", "spermatogonia", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "The", "number", "of", "PLZF", "+", "SCP1", "-", ",", "PLZF", "+", "SCP1", "+", ",", "PLZF", "-", "SCP1", "+", "cells", "normalized", "to", "total", "cell", "number", "per", "ST", "section", "in", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "testes", "at", "P2", ",", "P3", "respectively", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "40", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Quantification", "of", "The", "number", "of", "PLZF", "+", "SCP1", "-", ",", "PLZF", "+", "SCP1", "+", ",", "PLZF", "-", "SCP1", "+", "cells", "normalized", "to", "total", "cell", "number", "per", "ST", "section", "in", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "testes", "at", ",", "P5", "and", "P7", "respectively", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "40", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Immunofluorescence staining for PLZF (red) with DAPI staining (blue) of 10 µm cryo-sections of testes from CEP250+/+ and CEP250-/- mice at P5, P10 and P14. Scale bars: 20 μm.B. Quantification of PLZF+ cells per seminiferous (ST) section of CEP250+/+ and CEP250-/-, testes at P5, P10 and P14. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ (P5) n=3 mice, CEP250-/- (P5) n=3 mice, 50 STs were analyzed for each mouse; CEP250+/+ (P10) n=3 mice, CEP250-/- (P10) n=3 mice, at least 30 STs were analyzed for each mouse; CEP250+/+ (P14) n=3 mice, CEP250-/- (P14) n=3 mice, at least 50 ST were analyzed for each mouse. Data information: In (B data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, ***P < 0.005, ****P < 0.0001 (the Mann-Whitney test).C. Immunofluorescence staining for SCP1 (green), PLZF (red) and DAPI (blue) of 10 µm cryo-sections of testes from CEP250+/+ and CEP250-/- mice at P2, P3, P5 and P7. Arrowheads highlight PLZF- SCP1+ (green) cells, which represent differentiated spermatogonia. Scale bars: 20 μm.Quantification of The number of PLZF+ SCP1-, PLZF+ SCP1+, PLZF- SCP1+ cells normalized to total cell number per ST section in CEP250+/+ and CEP250-/- testes at P2, P3 respectively. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice, at least 40 STs were analyzed for each mouse. Data information: data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, ***P < 0.005, ****P < 0.0001 (the Mann-Whitney test).Quantification of The number of PLZF+ SCP1-, PLZF+ SCP1+, PLZF- SCP1+ cells normalized to total cell number per ST section in CEP250+/+ and CEP250-/- testes at , P5 and P7 respectively. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice, at least 40 STs were analyzed for each mouse. Data information: data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, ***P < 0.005, ****P < 0.0001 (the Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Representative", "images", "of", "mouse", "seminiferous", "tubule", "(", "ST", ")", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "SCP1", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "at", "P4", ",", "P6", "and", "P7", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Arrowheads", "highlight", "PLZF", "-", "SCP1", "+", "(", "green", ")", "cells", "localize", "to", "the", "middle", "of", "the", "ST", "lumen", ",", "which", "represent", "differentiated", "spermatogonia", "that", "translocated", "to", "the", "middle", "of", "the", "ST", "lumen", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "(", "B", ")", ".", "Shown", "is", "the", "number", "of", "PLZF", "-", "SCP1", "+", "cells", "which", "translocated", "inwards", "the", "seminiferous", "tubule", "lumen", "per", "seminiferous", "tubule", "section", ",", "as", "normalized", "to", "the", "total", "cell", "number", "per", "ST", "section", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "(", "B", ")", ".", "Shown", "is", "the", "total", "number", "of", "SCP1", "+", "cells", "which", "translocated", "inwards", "the", "seminiferous", "tubule", "lumen", "per", "ST", "section", ",", "as", "normalized", "to", "the", "total", "cell", "number", "per", "seminiferous", "tubule", "section", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "(", "B", ")", ".", "Shown", "is", "the", "number", "of", "PLZF", "+", "SCP1", "+", "cells", "which", "translocated", "inwards", "the", "seminiferous", "tubule", "lumen", "per", "seminiferous", "tubule", "section", ",", "as", "normalized", "to", "the", "total", "cell", "number", "per", "seminiferous", "tubule", "section", ".", "Dots", "(", "colors", "reflect", "STs", "from", "different", "mice", ")", "represent", "value", "per", "ST", ",", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ",", "at", "least", "30", "STs", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "C", "-", "E", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Representative images of mouse seminiferous tubule (ST) sections stained for PLZF (red), SCP1 (green) and DAPI (blue) at P4, P6 and P7. Scale bars: 20 μm. Arrowheads highlight PLZF- SCP1+ (green) cells localize to the middle of the ST lumen, which represent differentiated spermatogonia that translocated to the middle of the ST lumen. C. Quantification of (B). Shown is the number of PLZF- SCP1+ cells which translocated inwards the seminiferous tubule lumen per seminiferous tubule section, as normalized to the total cell number per ST section. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice, at least 30 STs were analyzed for each mouse. D. Quantification of (B). Shown is the total number of SCP1+ cells which translocated inwards the seminiferous tubule lumen per ST section, as normalized to the total cell number per seminiferous tubule section. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice, at least 30 STs were analyzed for each mouse. E. Quantification of (B). Shown is the number of PLZF+ SCP1+ cells which translocated inwards the seminiferous tubule lumen per seminiferous tubule section, as normalized to the total cell number per seminiferous tubule section. Dots (colors reflect STs from different mice) represent value per ST, CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice, at least 30 STs were analyzed for each mouse. Data information: In (C-E), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 (the Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "images", "of", "P4", "mouse", "seminiferous", "tubule", "(", "ST", ")", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "γ", "-", "Tubulin", "(", "green", ")", ",", "PH3", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Arrowheads", "highlight", "the", "centrosomes", ".", "Dashed", "yellow", "line", "highlights", "the", "basement", "membrane", ".", "Semi", "-", "transparent", "white", "line", ",", "which", "bisects", "both", "spindle", "poles", "was", "used", "to", "determine", "spindle", "angle", "Ø", "orientation", "in", "relation", "to", "the", "basement", "membrane", ".", "Anaphase", "cells", "were", "analyzed", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "µm", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "seminiferous", "tubule", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "γ", "-", "Tubulin", "(", "green", ")", ",", "PH3", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Arrowheads", "highlight", "the", "centrosomes", ".", "Dashed", "yellow", "line", "highlights", "the", "basement", "membrane", ".", "Semi", "-", "transparent", "white", "line", ",", "which", "bisects", "both", "spindle", "poles", "was", "used", "to", "determine", "spindle", "angle", "Ø", "orientation", "in", "relation", "to", "the", "basement", "membrane", ".", "Anaphase", "cells", "were", "analyzed", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", "Quantitation", "of", "spindle", "angle", "of", "anaphase", "GSCs", "in", "P4", "ST", "sections", "(", "from", "A", ")", ".", "Spindle", "angle", "relative", "to", "basement", "membrane", "for", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", ")", ".", "In", "(", "C", ")", ",", "dots", "(", "colors", "reflect", "different", "mice", ")", "represent", "spindle", "angle", "of", "each", "GSC", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "10", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "(", "D", "Quantitation", "of", "spindle", "angle", "of", "anaphase", "GSCs", "in", "P5", "ST", "sections", "(", "from", "B", ")", ".", "for", "P5", ".", "In", "(", "D", ")", ",", "dots", "(", "colors", "reflect", "different", "mice", ")", "represent", "spindle", "angle", "of", "each", "GSC", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "10", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", ".", "E", ")", "Quantitation", "of", "spindle", "angle", "of", "anaphase", "GSCs", "in", "P4", "ST", "sections", "Spindle", "angle", "relative", "to", "basement", "membrane", "for", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", ")", ".", "In", "(", "E", ")", ",", "the", "three", "dots", "represent", "averaged", "spindle", "angle", "per", "mouse", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "10", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "mouse", ".", "F", ")", "Quantitation", "of", "spindle", "angle", "of", "anaphase", "GSCs", "in", "P5", "ST", "sections", "for", "P5", ".", "In", "(", "F", ")", ",", "the", "three", "dots", "represent", "averaged", "spindle", "angle", "per", "mouse", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "10", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "E", ",", "F", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative images of P4 mouse seminiferous tubule (ST) 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), γ-Tubulin (green), PH3 (magenta) and DAPI (blue). Arrowheads highlight the centrosomes. Dashed yellow line highlights the basement membrane. Semi-transparent white line, which bisects both spindle poles was used to determine spindle angle Ø orientation in relation to the basement membrane. Anaphase cells were analyzed. Scale bars: 5 µm. B. Representative images of P5 mouse seminiferous tubule 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), γ-Tubulin (green), PH3 (magenta) and DAPI (blue). Arrowheads highlight the centrosomes. Dashed yellow line highlights the basement membrane. Semi-transparent white line, which bisects both spindle poles was used to determine spindle angle Ø orientation in relation to the basement membrane. Anaphase cells were analyzed. Scale bars: 5 µm. (C Quantitation of spindle angle of anaphase GSCs in P4 ST sections (from A). Spindle angle relative to basement membrane for CEP250+/+ and CEP250-/-). In (C), dots (colors reflect different mice) represent spindle angle of each GSC. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 10 cells were analyzed for each mouse. (D Quantitation of spindle angle of anaphase GSCs in P5 ST sections (from B). for P5. In (D), dots (colors reflect different mice) represent spindle angle of each GSC. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 10 cells were analyzed in each mouse.E) Quantitation of spindle angle of anaphase GSCs in P4 ST sections Spindle angle relative to basement membrane for CEP250+/+ and CEP250-/-). In (E), the three dots represent averaged spindle angle per mouse. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 10 cells were analyzed for each mouse. F) Quantitation of spindle angle of anaphase GSCs in P5 ST sections for P5. In (F), the three dots represent averaged spindle angle per mouse. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 10 cells were analyzed in each mouse. Data information: In (E, F), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, ***P < 0.005 (the unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "ST", ".", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "showing", "GSCs", "in", "interphase", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "(", "B", ")", ".", "Percentage", "of", "GSCs", "displaying", "different", "polarity", "status", "are", "indicated", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "5", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "4", "mice", ".", "At", "least", "100", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", "and", "the", "average", "was", "calculated", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "white", "arrowheads", "highlight", "basement", "membrane", ";", "yellow", "arrowhead", "highlights", "cortical", "enrichment", "of", "E", "-", "cadherin", "towards", "the", "basement", "membrane", ".", "In", "(", "C", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "ST", ".", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "and", "PH3", "(", "magenta", ")", "showing", "GSCs", "in", "prophase", ".", "PH3", "staining", "marks", "the", "mitotic", "chromatin", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "(", "D", ")", ".", "Percentage", "of", "GSCs", "displaying", "different", "polarity", "status", "are", "indicated", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "5", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "4", "mice", ".", "At", "least", "10", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", "and", "the", "average", "was", "calculated", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "white", "arrowheads", "highlight", "basement", "membrane", ";", "yellow", "arrowhead", "highlights", "cortical", "enrichment", "of", "E", "-", "cadherin", "towards", "the", "basement", "membrane", ".", "In", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "ST", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "E", "-", "cadherin", "(", "green", ")", "and", "PH3", "(", "magenta", ")", "showing", "GSCs", "in", "prometaphase", ".", "PH3", "staining", "marks", "the", "mitotic", "chromosome", "condensation", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "(", "F", ")", ",", "percentage", "of", "GSCs", "displaying", "different", "polarity", "status", "are", "indicated", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "5", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "4", "mice", ".", "At", "least", "30", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", "and", "the", "average", "was", "calculated", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "F", ",", "white", "arrowheads", "highlight", "basement", "membrane", ";", "yellow", "arrowhead", "highlights", "cortical", "enrichment", "of", "E", "-", "cadherin", "towards", "the", "basement", "membrane", ".", "In", "G", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Representative images of P5 mouse ST. 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), E-cadherin (green) and DAPI (blue) showing GSCs in interphase. Scale bars: 5 μm. C. Quantification of (B). Percentage of GSCs displaying different polarity status are indicated. CEP250+/+ n=5 mice, CEP250-/- n=4 mice. At least 100 cells were analyzed in each mouse and the average was calculated for each mouse. Data information: In white arrowheads highlight basement membrane; yellow arrowhead highlights cortical enrichment of E-cadherin towards the basement membrane. In (C data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 (the unpaired Student's t-test).D. Representative images of P5 mouse ST. 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), E-cadherin (green) and PH3 (magenta) showing GSCs in prophase. PH3 staining marks the mitotic chromatin. Scale bars: 5 μm. E. Quantification of (D). Percentage of GSCs displaying different polarity status are indicated. CEP250+/+ n=5 mice, CEP250-/- n=4 mice. At least 10 cells were analyzed in each mouse and the average was calculated for each mouse. Data information: In white arrowheads highlight basement membrane; yellow arrowhead highlights cortical enrichment of E-cadherin towards the basement membrane. In data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 (the unpaired Student's t-test).F. Representative images of P5 mouse ST 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), E-cadherin (green) and PH3 (magenta) showing GSCs in prometaphase. PH3 staining marks the mitotic chromosome condensation. Scale bars: 5 μm. G. Quantification of (F), percentage of GSCs displaying different polarity status are indicated. CEP250+/+ n=5 mice, CEP250-/- n=4 mice. At least 30 cells were analyzed in each mouse and the average was calculated for each mouse. Data information: In F, white arrowheads highlight basement membrane; yellow arrowhead highlights cortical enrichment of E-cadherin towards the basement membrane. In G), data are presented as mean ± SEM. n.s., not significant, *P<0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 (the unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "seminiferous", "tubule", "(", "ST", ")", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "ODF2", "(", "green", ")", ",", "NIN", "(", "magenta", ")", "and", "PH3", "(", "blue", ")", "showing", "GSCs", "in", "prophase", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Yellow", "arrowheads", "highlight", "the", "two", "centrosomes", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "Centrosome", "distance", "in", "GSCs", "in", "prophase", "at", "P5", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "50", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", "(", "color", "of", "dot", "indicates", "mouse", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "4", "μm", "as", "the", "threshold", "of", "well", "separated", "centrosomes", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "B", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "the", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "D", ".", "Representative", "images", "of", "P5", "mouse", "seminiferous", "tubule", "10", "µm", "cryo", "-", "sections", "stained", "for", "PLZF", "(", "red", ")", ",", "ODF2", "(", "green", ")", ",", "NIN", "(", "magenta", ")", "and", "PH3", "(", "blue", ")", ",", "focusing", "on", "PLZF", "+", "germ", "stem", "cells", "(", "GSCs", ")", "in", "prometaphase", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "μm", ".", "Yellow", "lines", "highlight", "basement", "membrane", ".", "Yellow", "arrowheads", "highlight", "the", "mother", "centrosomes", "and", "white", "arrowheads", "highlight", "the", "daughter", "centrosomes", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "Percentage", "of", "prometaphase", "GSCs", "which", "preferentially", "position", "their", "mother", "centrosome", "close", "to", "the", "basement", "membrane", "in", "CEP250", "+", "/", "+", "and", "CEP250", "-", "/", "-", "testis", "at", "P5", ".", "CEP250", "+", "/", "+", "n", "=", "3", "mice", ",", "CEP250", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "mice", ".", "At", "least", "50", "cells", "were", "analyzed", "in", "each", "mouse", "and", "the", "average", "was", "calculated", "for", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "In", "(", "E", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "the", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Representative images of P5 mouse seminiferous tubule (ST) 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), ODF2 (green), NIN (magenta) and PH3 (blue) showing GSCs in prophase. Scale bars: 2 μm. Yellow arrowheads highlight the two centrosomes.B. Quantification of Centrosome distance in GSCs in prophase at P5. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 50 cells were analyzed in each mouse (color of dot indicates mouse). Dashed line indicates 4 μm as the threshold of well separated centrosomes. Data information: In (B), data are presented as mean ± SEM. ****P < 0.001 (the Mann-Whitney test).D. Representative images of P5 mouse seminiferous tubule 10 µm cryo-sections stained for PLZF (red), ODF2 (green), NIN (magenta) and PH3 (blue), focusing on PLZF+ germ stem cells (GSCs) in prometaphase. Scale bars: 2 μm. Yellow lines highlight basement membrane. Yellow arrowheads highlight the mother centrosomes and white arrowheads highlight the daughter centrosomes.E. Quantification of Percentage of prometaphase GSCs which preferentially position their mother centrosome close to the basement membrane in CEP250+/+ and CEP250-/- testis at P5. CEP250+/+ n=3 mice, CEP250-/- n=3 mice. At least 50 cells were analyzed in each mouse and the average was calculated for each mouse. Data information: In (E), data are presented as mean ± SEM. ****P < 0.001 (the unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "synchronized", "HeLa", "cells", "stained", "for", "VHR", "(", "green", ")", "and", "BrdU", "(", "red", ")", "to", "indicate", "S", "-", "phase", "entry", ",", "and", "DNA", "(", "DAPI", ";", "blue", ")", ".", "The", "cells", "were", "synchronized", "using", "a", "double", "thymidine", "block", "and", "then", "washed", "and", "placed", "in", "culture", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "cells", "shown", "are", "representative", "of", "the", "majority", "of", "cells", "in", "each", "sample", ".", "b", ")", "Anti", "-", "VHR", ",", "anti", "-", "actin", "and", "anti", "-", "Prc1immunoblots", "of", "lysates", "of", "the", "same", "cells", ".", "(", "c", ")", "DNA", "histograms", "of", "the", "same", "cells", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "d", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "at", "various", "stages", "of", "mitosis", "stained", "for", "tubulin", "(", "green", ")", ",", "VHR", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "DAPI", ";", "blue", ")", ".", "(", "e", ")", "Anti", "-", "VHR", "immunoblot", "of", "synchronized", "cells", "from", "G1", ",", "S", ",", "G2", "and", "M", "phase", "treated", "for", "30", "min", "with", "50", "μg", "ml", "−", "1", "of", "the", "protein", "synthesis", "inhibitor", "cycloheximide", ".", "Note", "that", "only", "cells", "in", "G1", "showed", "a", "rapid", "loss", "of", "VHR", "protein", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "5", "μm", "in", "a", "and", "2", "μm", "in", "b", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Confocal microscopy of synchronized HeLa cells stained for VHR (green) and BrdU (red) to indicate S-phase entry, and DNA (DAPI; blue). The cells were synchronized using a double thymidine block and then washed and placed in culture for the indicated times. The cells shown are representative of the majority of cells in each sample.b) Anti-VHR, anti-actin and anti-Prc1immunoblots of lysates of the same cells.(c) DNA histograms of the same cells at the indicated time points.(d) Confocal microscopy of HeLa cells at various stages of mitosis stained for tubulin (green), VHR (red) and DNA (DAPI; blue).(e) Anti-VHR immunoblot of synchronized cells from G1, S, G2 and M phase treated for 30 min with 50 μg ml−1 of the protein synthesis inhibitor cycloheximide. Note that only cells in G1 showed a rapid loss of VHR protein. The scale bars represent 5 μm in a and 2 μm in b."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Anti", "-", "VHR", "and", "anti", "-", "actin", "immunoblots", "of", "lysates", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "luciferase", "siRNA", "or", "VHR", "siRNA", "and", "cultured", "for", "the", "indicated", "number", "of", "days", ".", "(", "b", ")", "Number", "of", "cells", "at", "the", "start", "of", "the", "experiment", "(", "200", ",", "000", ")", "and", "on", "day", "3", "for", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "luciferase", "siRNA", "(", "black", "bars", ")", "or", "with", "VHR", "siRNA", "(", "white", "bars", ")", ".", "(", "c", ")", "Light", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "luciferase", "siRNA", "or", "VHR", "siRNA", "and", "cultured", "for", "three", "days", ".", "(", "d", ")", "Thymidine", "incorporation", "by", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "luciferase", "siRNA", "or", "with", "VHR", "siRNA", ".", "The", "data", "represent", "the", "mean", "±", "sd", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "luciferase", "siRNA", "or", "VHR", "siRNA", "and", "cultured", "for", "three", "days", ".", "Note", "the", "increased", "number", "of", "blue", "-", "staining", "granules", "in", "many", "cells", ".", "(", "(", "f", ")", "Telomerase", "activity", "of", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "VHR", "siRNA", ".", "Each", "sample", "was", "analysed", "in", "triplicate", ",", "with", "RNAse", "added", "to", "a", "fourth", "sample", ".", "(", "g", ")", "Anti", "-", "VHR", "immunoblot", "of", "the", "same", "cells", "as", "in", "f", ".", "(", "h", ")", "Anti", "-", "actin", "control", "immunoblot", "of", "the", "same", "cells", "as", "in", "f", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", "in", "c", "and", "25", "μm", "in", "e", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Anti-VHR and anti-actin immunoblots of lysates of HeLa cells transfected with a control luciferase siRNA or VHR siRNA and cultured for the indicated number of days.(b) Number of cells at the start of the experiment (200,000) and on day 3 for HeLa cells transfected with a control luciferase siRNA (black bars) or with VHR siRNA (white bars).(c) Light microscopy of HeLa cells transfected with a control luciferase siRNA or VHR siRNA and cultured for three days.(d) Thymidine incorporation by HeLa cells transfected with a control luciferase siRNA or with VHR siRNA. The data represent the mean ± sd. (n = 3).(e) β-galactosidase staining of HeLa cells transfected with a control luciferase siRNA or VHR siRNA and cultured for three days. Note the increased number of blue-staining granules in many cells. ((f) Telomerase activity of cells treated with the indicated concentrations of VHR siRNA. Each sample was analysed in triplicate, with RNAse added to a fourth sample.(g) Anti-VHR immunoblot of the same cells as in f. (h) Anti-actin control immunoblot of the same cells as in f. The scale bars represent 10 μm in c and 25 μm in e."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Cell", "-", "cycle", "distribution", "and", "cell", "number", "count", "of", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "VHR", "siRNA", "and", "observed", "for", "4", "-", "5", "days", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "propidium", "iodide", "for", "DNA", "content", "and", "analysed", "by", "FACS", "after", "the", "indicated", "number", "of", "days", "in", "culture", ".", "(", "b", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "the", "same", "HeLa", "cells", "stained", "for", "VHR", "(", "green", ")", "and", "BrdU", "(", "red", ")", "to", "indicate", "S", "-", "phase", "entry", ",", "and", "DNA", "(", "DAPI", ",", "blue", ")", ".", "Control", "siRNA", "-", "treated", "cells", "and", "cells", "treated", "with", "VHR", "are", "shown", ".", "The", "bottom", "panels", "represent", "merges", "of", "the", "3", "images", "above", "(", "c", ")", "Quantification", "of", "the", "BrdU", "positive", "cells", "in", "b", ".", "The", "indicated", "numbers", "of", "cells", "were", "counted", "and", "the", "data", "are", "given", "as", "percentage", "of", "BrdU", "positive", "cells", "of", "this", "total", "number", ".", "d", ")", "Quantification", "of", "cells", "staining", "for", "phosphoH3", ".", "The", "indicated", "number", "of", "cells", "were", "counted", "and", "the", "data", "are", "given", "as", "percentage", "of", "phosphoH3", "-", "positive", "cells", "of", "this", "total", "number", ".", "(", "e", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "control", "or", "VHR", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "stained", "for", "VHR", "(", "green", ")", "and", "phospho", "H3", "(", "red", ")", "to", "indicate", "M", "-", "phase", "entry", ",", "and", "DNA", "(", "DAPI", ",", "blue", ")", ".", "The", "bottom", "panels", "represent", "merges", "of", "the", "images", "above", ".", "(", "f", ")", "Immunoblots", "of", "total", "lysates", "of", "control", "siRNA", "transfected", "cells", "and", "VHR", "siRNA", "cells", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Note", "that", "VHR", "was", "downregulated", "by", "approximately", "80", "%", ",", "wheras", "actin", "levels", "were", "unchanged", ".", "(", "g", ")", "Immunoblot", "with", "anti", "-", "p21Cip1", "-", "WAF1", "of", "total", "lysates", "of", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "lanes", "1", "-", "2", ")", ",", "two", "different", "VHR", "siRNAs", "cells", "(", "lanes", "3", "-", "6", ")", "or", "another", "control", "siRNA", "(", "lanes", "7", "-", "8", ")", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", "in", "b", "and", "e", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Cell-cycle distribution and cell number count of cells transfected with control or VHR siRNA and observed for 4-5 days. The cells were stained with propidium iodide for DNA content and analysed by FACS after the indicated number of days in culture.(b) Confocal microscopy of the same HeLa cells stained for VHR (green) and BrdU (red) to indicate S-phase entry, and DNA (DAPI, blue). Control siRNA-treated cells and cells treated with VHR are shown. The bottom panels represent merges of the 3 images above(c) Quantification of the BrdU positive cells in b. The indicated numbers of cells were counted and the data are given as percentage of BrdU positive cells of this total number.d) Quantification of cells staining for phosphoH3. The indicated number of cells were counted and the data are given as percentage of phosphoH3-positive cells of this total number.(e) Confocal microscopy of control or VHR siRNA-transfected HeLa cells stained for VHR (green) and phospho H3 (red) to indicate M-phase entry, and DNA (DAPI, blue). The bottom panels represent merges of the images above.(f) Immunoblots of total lysates of control siRNA transfected cells and VHR siRNA cells with the indicated antibodies. Note that VHR was downregulated by approximately 80%, wheras actin levels were unchanged.(g) Immunoblot with anti-p21Cip1-WAF1 of total lysates of cells transfected with control siRNA (lanes 1-2), two different VHR siRNAs cells (lanes 3-6) or another control siRNA (lanes 7-8). The scale bars represent 10 μm in b and e."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Anti", "-", "VHR", "immunoblots", "of", "the", "same", "cell", "lysates", "used", "for", "assessment", "of", "MAP", "kinase", "activation", "in", "b", "-", "e", ".", "The", "cells", "were", "stimulated", "with", "10", "%", "serum", "for", "0", ",", "1", ",", "5", ",", "15", ",", "30", "and", "60", "min", ",", "as", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "figure", ".", "Equal", "amounts", "of", "total", "protein", "were", "loaded", "into", "each", "lane", ".", "(", "b", "-", "e", ")", "Immunoblots", "of", "the", "same", "lysates", "with", "the", "indicated", "antibodies", "for", "assement", "of", "MAP", "kinase", "activation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Anti-VHR immunoblots of the same cell lysates used for assessment of MAP kinase activation in b-e. The cells were stimulated with 10% serum for 0, 1, 5, 15, 30 and 60 min, as indicated at the bottom of the figure. Equal amounts of total protein were loaded into each lane. (b-e) Immunoblots of the same lysates with the indicated antibodies for assement of MAP kinase activation."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Proliferation", "of", "cells", "transfected", "3", "days", "earlier", "with", "a", "combination", "of", "control", "siRNA", "or", "VHR", "siRNA", "together", "with", "Mek", ",", "Jnk", "or", "Mek", "plus", "Jnk", "siRNAs", ".", "The", "data", "are", "calculated", "as", "percentage", "of", "control", "(", "control", "siRNA", "alone", ")", "and", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "starting", "cell", "numbers", "were", "150", ",", "000", "or", "200", ",", "000", "and", "the", "control", "cells", "had", "increased", "by", "5", ".", "3", ",", "5", ".", "0", "and", "13", "-", "fold", "in", "the", "three", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Immunoblots", "of", "the", "same", "cells", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Proliferation of cells transfected 3 days earlier with a combination of control siRNA or VHR siRNA together with Mek, Jnk or Mek plus Jnk siRNAs. The data are calculated as percentage of control (control siRNA alone) and represent the mean ± s.d. from three independent experiments. The starting cell numbers were 150,000 or 200,000 and the control cells had increased by 5.3, 5.0 and 13-fold in the three experiments.(b) Immunoblots of the same cells with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Live", "-", "cell", "imaging", "assay", "to", "detect", "mitotic", "perturbations", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "a", "chromatin", "marker", "(", "H2B", "-", "mCherry", ";", "red", ")", "and", "a", "nuclear", "import", "substrate", "(", "IBB", "-", "eGFP", ";", "green", ")", "were", "imaged", "by", "automated", "live", "-", "cell", "microscopy", "and", "the", "duration", "of", "mitosis", "from", "prometaphase", "to", "anaphase", "onset", "was", "automatically", "determined", "for", "each", "dividing", "cell", "based", "on", "the", "time", "from", "nuclear", "envelope", "breakdown", "(", "mitotic", "entry", ")", "until", "nuclear", "reassembly", "(", "mitotic", "exit", ")", "(", "Schmitz", "et", "al", ".", ",", "2010", ")", ".", "B", ".", "miRNA", "mimic", "screen", "for", "miRNAs", "that", "regulate", "mitosis", "genes", ".", "miRNA", "-", "mimics", "from", "a", "library", "of", "all", "embryonic", "cortically", "expressed", "miRNAs", "were", "transfected", "individually", "into", "HeLa", "cells", "and", "prometaphase", "to", "anaphase", "onset", "duration", "was", "determined", "as", "in", "A", ".", "Individual", "points", "correspond", "to", "the", "mean", "z", "-", "score", "of", "the", "duration", "of", "prometaphase", "to", "anaphase", "onset", "determined", "in", "2", "independent", "experimental", "replicates", "for", "a", "given", "miRNA", "-", "mimic", ".", "C", ".", "Cumulative", "histograms", "of", "mitotic", "progression", "for", "control", "cells", "and", "for", "cells", "transfected", "with", "miRNA", "mimics", ".", "Nuclear", "envelope", "breakdown", "is", "at", "t", "=", "0", "min", ".", "(", "n", "≥", "71", "in", "all", "conditions", ")", ".", "D", ".", "Confocal", "time", "lapse", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "H2B", "-", "mCherry", "(", "red", ")", "and", "a", "microtubule", "marker", "(", "α", "-", "Tub", "-", "eGFP", ";", "green", ")", "48", "h", "after", "transfection", "of", "miR", "-", "449a", "mimic", ",", "or", "non", "-", "targeting", "control", "siRNA", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "spindle", "rotation", "and", "duration", "from", "prometaphase", "to", "anaphase", "onset", "in", "time", "-", "lapse", "movies", "as", "in", "D", ".", "miR", "-", "449a", "mimic", "promotes", "spindle", "rotation", ".", "Duration", "from", "prometaphase", "to", "anaphase", "onset", "was", "defined", "as", "the", "time", "from", "nuclear", "envelope", "breakdown", "to", "anaphase", "onset", ".", "Spindle", "rotation", "during", "metaphase", "was", "measured", "as", "described", "in", "methods", ".", "Individual", "data", "points", "correspond", "to", "single", "cells", "(", "n", "≥", "72", "in", "all", "conditions", ")", ".", "Normality", "was", "tested", "with", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ".", "Variance", "between", "samples", "was", "tested", "using", "F", "test", ".", "Significance", "was", "tested", "by", "Welch", "'", "s", "t", "test", ":", "p", "-", "value", "=", "2", ".", "598e", "-", "06", "comparing", "spindle", "rotation", "of", "negative", "control", "versus", "miR", "-", "449a", "mimic", "-", "transfected", "cells", "(", "all", "data", "points", "are", "compared", ")", ".", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "0005621", "(", "for", "cells", "with", "prometaphase", "-", "anaphase", "onset", "duration", "lower", "than", "60", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Live-cell imaging assay to detect mitotic perturbations. HeLa cells stably expressing a chromatin marker (H2B-mCherry; red) and a nuclear import substrate (IBB-eGFP; green) were imaged by automated live-cell microscopy and the duration of mitosis from prometaphase to anaphase onset was automatically determined for each dividing cell based on the time from nuclear envelope breakdown (mitotic entry) until nuclear reassembly (mitotic exit) (Schmitz et al., 2010).B. miRNA mimic screen for miRNAs that regulate mitosis genes. miRNA-mimics from a library of all embryonic cortically expressed miRNAs were transfected individually into HeLa cells and prometaphase to anaphase onset duration was determined as in A. Individual points correspond to the mean z-score of the duration of prometaphase to anaphase onset determined in 2 independent experimental replicates for a given miRNA-mimic.C. Cumulative histograms of mitotic progression for control cells and for cells transfected with miRNA mimics. Nuclear envelope breakdown is at t = 0 min. (n ≥ 71 in all conditions).D. Confocal time lapse microscopy images of HeLa cells stably expressing H2B-mCherry (red) and a microtubule marker (α-Tub-eGFP; green) 48 h after transfection of miR-449a mimic, or non-targeting control siRNA. Scale bar, 10 μm.E. Quantification of spindle rotation and duration from prometaphase to anaphase onset in time-lapse movies as in D. miR-449a mimic promotes spindle rotation. Duration from prometaphase to anaphase onset was defined as the time from nuclear envelope breakdown to anaphase onset. Spindle rotation during metaphase was measured as described in methods. Individual data points correspond to single cells (n ≥ 72 in all conditions). Normality was tested with Kolmogorov-Smirnov test. Variance between samples was tested using F test. Significance was tested by Welch's t test: p-value = 2.598e-06 comparing spindle rotation of negative control versus miR-449a mimic-transfected cells (all data points are compared). p-value = 0.0005621 (for cells with prometaphase-anaphase onset duration lower than 60 min."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "The", "expression", "levels", "of", "endogenous", "miR", "-", "34", "/", "449", "family", "members", "were", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "in", "ventricular", "zone", "samples", "derived", "by", "laser", "microdissection", "of", "mouse", "cortices", "at", "E14", ".", "The", "levels", "of", "the", "different", "miR", "-", "34", "/", "449", "family", "members", "and", "miR", "-", "7a", "-", "1", ",", "a", "highly", "expressed", "miRNA", "relevant", "in", "cortical", "progenitor", "biology", ",", "were", "determined", ".", "All", "concentrations", "were", "normalized", "(", "norm", ".", ")", "using", "miR", "-", "7a", "-", "1", "concentration", "(", "n", "=", "8", "cortices", ",", "2", "different", "litters", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "error", ".", "B", ",", "C", ".", "Expression", "analysis", "of", "miR", "-", "34", "/", "449", "by", "in", "situ", "hybridization", "using", "locked", "nucleic", "acid", "(", "LNA", ")", "probes", "in", "wild", "type", "cortices", "at", "E14", ".", "Mature", "miR", "-", "449", ",", "miR", "-", "34b", "and", "miR", "-", "34c", "are", "preferentially", "expressed", "in", "the", "subventricular", "(", "SVZ", ")", "and", "ventricular", "(", "VZ", ")", "zones", "of", "the", "neocortex", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "A", ")", ",", "10", "μm", "(", "B", ")", ".", "B", ",", "C", ".", "Expression", "analysis", "of", "miR", "-", "34", "/", "449", "by", "in", "situ", "hybridization", "using", "locked", "nucleic", "acid", "(", "LNA", ")", "probes", "in", "wild", "type", "cortices", "at", "E14", ".", "Mature", "miR", "-", "449", ",", "miR", "-", "34b", "and", "miR", "-", "34c", "are", "preferentially", "expressed", "in", "the", "subventricular", "(", "SVZ", ")", "and", "ventricular", "(", "VZ", ")", "zones", "of", "the", "neocortex", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "B", ")", ",", "10", "μm", "(", "C", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Brains", "of", "adult", "mice", "(", "P23", ")", ",", "and", "quantification", "of", "brain", "weight", ".", "Dots", "indicate", "individual", "brains", ";", "red", "line", "indicates", "median", ".", "Mice", "lacking", "miR", "-", "449abc", "and", "miR", "-", "34bc", "(", "DKO", ")", "or", "miR", "-", "449abc", ",", "miR", "-", "34bc", ",", "and", "miR", "-", "34a", "(", "TKO", ")", "have", "significantly", "smaller", "brains", "compared", "to", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", ".", "Significance", "was", "tested", "by", "Pairwaise", "t", "-", "test", "with", "Bonferroni", "correction", ";", "Het", "(", "n", "=", "6", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "vs", ".", "DKO", "(", "n", "=", "4", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "00215", ";", "Het", "(", "n", "=", "6", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "vs", ".", "TKO", "(", "n", "=", "4", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "00054", ".", "Subfigure", "G", "was", "statistically", "tested", "as", "in", "E", ".", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "F", ",", "G", ".", "Confocal", "images", "of", "coronal", "brain", "sections", "(", "P23", ")", "and", "quantification", "of", "cortex", "width", "from", "miR", "-", "34", "/", "449", "DKO", "and", "TKO", "mice", "and", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "DKO", "or", "TKO", "mice", "have", "significantly", "thinner", "cortices", "compared", "to", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", "in", "adult", "mice", "(", "P23", ")", ".", "(", "n", "=", "6", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "vs", ".", "DKO", "(", "n", "=", "4", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "00084", ",", "Het", "(", "n", "=", "6", "brains", ",", "2", "different", "liters", ")", "vs", ".", "TKO", "(", "n", "=", "4", "brains", ",", "2", "different", "litters", ")", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "00211", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. The expression levels of endogenous miR-34/449 family members were measured by RT-qPCR in ventricular zone samples derived by laser microdissection of mouse cortices at E14. The levels of the different miR-34/449 family members and miR-7a-1, a highly expressed miRNA relevant in cortical progenitor biology, were determined. All concentrations were normalized (norm.) using miR-7a-1 concentration (n = 8 cortices, 2 different litters). Error bars indicate standard error.B, C. Expression analysis of miR-34/449 by in situ hybridization using locked nucleic acid (LNA) probes in wild type cortices at E14. Mature miR-449, miR-34b and miR-34c are preferentially expressed in the subventricular (SVZ) and ventricular (VZ) zones of the neocortex. Scale bar, 50 μm (A), 10 μm (B).B, C. Expression analysis of miR-34/449 by in situ hybridization using locked nucleic acid (LNA) probes in wild type cortices at E14. Mature miR-449, miR-34b and miR-34c are preferentially expressed in the subventricular (SVZ) and ventricular (VZ) zones of the neocortex. Scale bar, 50 μm (B), 10 μm (C).D, E. Brains of adult mice (P23), and quantification of brain weight. Dots indicate individual brains; red line indicates median. Mice lacking miR-449abc and miR-34bc (DKO) or miR-449abc, miR-34bc, and miR-34a (TKO) have significantly smaller brains compared to littermate controls (Het). Significance was tested by Pairwaise t-test with Bonferroni correction; Het (n = 6 brains, 2 different litters) vs. DKO (n = 4 brains, 2 different litters) p-value = 0.00215; Het (n = 6 brains, 2 different litters) vs. TKO (n = 4 brains, 2 different litters) p-value = 0.00054. Subfigure G was statistically tested as in E. * indicates p ≤ 0.05, ** indicates p ≤ 0.01, *** indicates p ≤ 0.001.F, G. Confocal images of coronal brain sections (P23) and quantification of cortex width from miR-34/449 DKO and TKO mice and littermate controls (Het). Sections were stained with DAPI. DKO or TKO mice have significantly thinner cortices compared to littermate controls (Het) in adult mice (P23). (n = 6 brains, 2 different litters) vs. DKO (n = 4 brains, 2 different litters) p-value = 0.00084, Het (n = 6 brains, 2 different liters) vs. TKO (n = 4 brains, 2 different litters) p-value = 0.00211. Scale bar, 500 μm."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Confocal", "images", "of", "coronal", "sections", "from", "E16", "brains", "of", "miR", "-", "34", "/", "449", "KO", "mice", "and", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", ",", "stained", "with", "anti", "-", "Satb2", "-", "antibody", "to", "label", "neurons", "of", "layers", "II", "-", "IV", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "to", "label", "all", "cell", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Satb2", "-", "positive", "cells", "per", "100", "μm", "ventricular", "zone", "surface", ".", "Bars", "indicate", "mean", "±", "SEM", ",", "as", "for", "all", "quantifications", "shown", "in", "this", "figure", ";", "n", "=", "3", "brains", "per", "genotype", "group", ",", "from", "two", "independent", "litters", ".", "Data", "was", "normalized", "(", "norm", ".", ")", "to", "the", "ventricular", "zone", "surface", "analyzed", "(", "100", "µm", ")", "and", "relativized", "to", "the", "heterozygous", "control", "average", "value", ".", "Significance", "was", "tested", "by", "Welch", "'", "s", "t", "test", ":", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "01146", "(", "Het", "vs", ".", "KO", ")", "(", "n", "=", "4", "cortices", "per", "genotype", "group", ",", "2", "independent", "litters", ")", ".", "All", "subfigures", "were", "statistically", "tested", "as", "in", "B", ".", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "C", "-", "J", ".", "Confocal", "images", "and", "cell", "density", "quantifications", "as", "in", "A", "using", "molecular", "markers", "for", "different", "cell", "types", ":", "C", ",", "D", ".", "E16", "brains", "stained", "with", "anti", "-", "Ctip2", "antibody", "to", "label", "layer", "Vneurons", "(", "n", "=", "4", "brains", "per", "genotype", "group", ",", "2", "independent", "litters", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "Images", "in", "C", "were", "taken", "from", "same", "brain", "slices", "as", "shown", "in", "A", ".", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "03224", "(", "Het", "vs", ".", "KO", ")", "(", "immuno", "co", "-", "staining", "of", "Ctip2", "(", "red", ",", "C", ")", ")", ".", "C", "-", "J", ".", "Confocal", "images", "and", "cell", "density", "quantifications", "as", "in", "A", "using", "molecular", "markers", "for", "different", "cell", "types", ":", "E", ",", "F", ".", "E14", "brains", "stained", "with", "anti", "-", "Tbr1", "antibody", "to", "label", "layer", "IVneurons", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "01392", "(", "Het", "vs", ".", "KO", ")", "(", "n", "=", "3", "and", "4", "brains", "per", "genotype", "group", "from", "2", "independent", "litters", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "C", "-", "J", ".", "Confocal", "images", "and", "cell", "density", "quantifications", "as", "in", "A", "using", "molecular", "markers", "for", "different", "cell", "types", ":", "G", ",", "H", ".", "E16", "brains", "stained", "with", "anti", "-", "Tbr2", "antibody", "to", "label", "intermediate", "progenitors", ".", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "01647", "(", "Het", "vs", ".", "KO", ")", "(", "n", "=", "7", "brains", "for", "each", "genotype", "group", ",", "5", "independent", "litters", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "C", "-", "J", ".", "Confocal", "images", "and", "cell", "density", "quantifications", "as", "in", "A", "using", "molecular", "markers", "for", "different", "cell", "types", ":", "I", ",", "J", ".", "E16", "brains", "stained", "with", "anti", "-", "Pax6", "antibody", "to", "label", "radial", "glia", "progenitors", ".", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "002768", "(", "n", "=", "5", "brains", "per", "genotype", "group", ",", "3", "independent", "litters", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "K", ".", "3D", "reconstruction", "of", "a", "dividing", "radial", "glial", "progenitor", "at", "early", "anaphase", ".", "A", "coronal", "section", "of", "an", "E14", "brain", "of", "a", "heterozygous", "control", "mouse", "was", "stained", "with", "anti", "-", "phospho", "-", "Vimentin", "antibody", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "γ", "-", "tubulin", "antibody", "(", "green", "/", "yellow", ")", ",", "phalloidin", "(", "magenta", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "imaged", "by", "3D", "confocal", "microscopy", ".", "\"", "s", "\"", "indicates", "spindle", "axis", ",", "\"", "α", "\"", "indicates", "angle", "relative", "to", "ventricular", "surface", "plane", ",", "which", "was", "determined", "by", "a", "vector", "path", "as", "indicated", "by", "thin", "white", "lines", "located", "on", "the", "left", "side", "of", "the", "image", ".", "Yellow", "dots", "highlight", "the", "centrosomes", "of", "the", "spindle", "poles", "from", "the", "analyzed", "dividing", "cell", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "L", ".", "Quantification", "of", "spindle", "orientation", "in", "radial", "glial", "cells", "as", "in", "K", "for", "E14", "brains", "of", "miR", "-", "34", "/", "449", "KO", "and", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "dividing", "cell", ";", "p", "-", "value", "=", "3", ".", "166e", "-", "05", "(", "Het", "vs", ".", "KO", ")", "(", "n", "=", "131", "vs", ".", "107", "cells", ",", "n", "=", "4", "brains", "per", "genotype", "group", ",", "2", "independent", "litters", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Confocal images of coronal sections from E16 brains of miR-34/449 KO mice and littermate controls (Het), stained with anti-Satb2-antibody to label neurons of layers II-IV (green) and DAPI to label all cell nuclei (blue). Scale bars: 50 μm.B. Quantification of the number of Satb2-positive cells per 100 μm ventricular zone surface. Bars indicate mean ± SEM, as for all quantifications shown in this figure; n = 3 brains per genotype group, from two independent litters. Data was normalized (norm.) to the ventricular zone surface analyzed (100 µm) and relativized to the heterozygous control average value. Significance was tested by Welch's t test: p-value = 0.01146 (Het vs. KO) (n = 4 cortices per genotype group, 2 independent litters). All subfigures were statistically tested as in B. * indicates p ≤ 0.05, ** indicates p ≤ 0.01, *** indicates p ≤ 0.001.C-J. Confocal images and cell density quantifications as in A using molecular markers for different cell types:C, D. E16 brains stained with anti-Ctip2 antibody to label layer Vneurons (n = 4 brains per genotype group, 2 independent litters). Scale bars: 50 μm. Images in C were taken from same brain slices as shown in A. p-value = 0.03224 (Het vs. KO) (immuno co-staining of Ctip2(red, C)).C-J. Confocal images and cell density quantifications as in A using molecular markers for different cell types:E, F. E14 brains stained with anti-Tbr1 antibody to label layer IVneurons p-value = 0.01392 (Het vs. KO) (n = 3 and 4 brains per genotype group from 2 independent litters). Scale bars: 50 μm.C-J. Confocal images and cell density quantifications as in A using molecular markers for different cell types:G, H. E16 brains stained with anti-Tbr2 antibody to label intermediate progenitors. p-value = 0.01647 (Het vs. KO) (n = 7 brains for each genotype group, 5 independent litters). Scale bars: 50 μm.C-J. Confocal images and cell density quantifications as in A using molecular markers for different cell types:I, J. E16 brains stained with anti-Pax6 antibody to label radial glia progenitors. p-value = 0.002768 (n = 5 brains per genotype group, 3 independent litters). Scale bars: 50 μm.K. 3D reconstruction of a dividing radial glial progenitor at early anaphase. A coronal section of an E14 brain of a heterozygous control mouse was stained with anti-phospho-Vimentin antibody (red), anti-γ-tubulin antibody (green/yellow), phalloidin (magenta), and DAPI (blue) and imaged by 3D confocal microscopy. \"s\" indicates spindle axis, \"α\" indicates angle relative to ventricular surface plane, which was determined by a vector path as indicated by thin white lines located on the left side of the image. Yellow dots highlight the centrosomes of the spindle poles from the analyzed dividing cell. Scale bars: 5 μm.L. Quantification of spindle orientation in radial glial cells as in K for E14 brains of miR-34/449 KO and littermate controls (Het). Each dot represents a single dividing cell; p-value = 3.166e-05 (Het vs. KO) (n = 131 vs. 107 cells, n = 4 brains per genotype group, 2 independent litters)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Quantification", "of", "mRNA", "expression", "by", "RT", "-", "qPCR", "of", "candidate", "miR", "-", "34", "/", "449", "targets", "that", "might", "regulate", "spindle", "orientation", "in", "E14", "cortex", "samples", "from", "miR", "-", "34", "/", "449", "KO", "mice", "compared", "with", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", ".", "Expression", "was", "normlaized", "(", "norm", ".", ")", "to", "Phosphoglycerate", "kinase", "(", "PGK", ")", "mRNA", "levels", ".", "Significance", "was", "tested", "by", "Welch", "'", "s", "t", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "009756", "(", "JAM", "-", "A", "(", "Het", ")", "vs", ".", "JAM", "-", "A", "(", "KO", ")", ")", ",", "all", "the", "rest", "Het", "vs", ".", "KO", "comparisons", "p", "=", "n", ".", "s", ".", "(", "n", "=", "4", "cortices", "per", "genotype", "group", ",", "2", "independent", "litters", ")", ".", "All", "subfigures", "were", "statistically", "tested", "as", "in", "A", ".", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "Red", "bar", "indicates", "median", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "JAM", "-", "A", "mRNA", "expression", "in", "HeLa", "cells", "48", "h", "after", "transfection", "of", "miR", "-", "449a", "mimic", "compared", "to", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "negative", "control", "siRNA", ".", "JAM", "-", "A", "mRNA", "Expression", "was", "normalized", "(", "norm", ".", ")", "to", "Glyceraldehyde", "3", "-", "phosphate", "dehydrogenase", "(", "GAPDH", ")", "mRNA", "levels", ".", "p", "=", "0", ".", "0001218", "(", "Neg", ".", "ctrol", ".", "vs", ".", "miR", "-", "449a", "mimic", ")", "(", "n", "=", "9", "measurements", "from", "3", "independent", "replicates", ")", ".", "C", ",", "D", ".", "mouse", "J110", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "miR", "-", "449a", "mimic", "or", "a", "negative", "control", "mimic", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "to", "detect", "endogenous", "JAM", "-", "A", "and", "ACTIN", ".", "ACTIN", "was", "used", "to", "normalize", "JAM", "-", "A", "expression", "(", "norm", ".", ")", "as", "loading", "control", ".", "p", "=", "0", ".", "04454", "(", "Neg", ".", "ctrol", ".", "vs", ".", "miR", "-", "449a", "mimic", ")", "(", "n", "=", "4", "independent", "wells", ",", "2", "independent", "transfections", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "HeLa", "cells", "were", "cotransfected", "with", "either", "miR", "-", "449a", "mimic", "or", "a", "negative", "control", "mimic", ",", "together", "with", "JAM", "-", "A", "-", "GFP", "fusion", "protein", "and", "GFP", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "to", "detect", "GFP", ".", "GFP", "was", "used", "to", "normalize", "(", "norm", ".", ")", "by", "transfection", "efficiency", "as", "loading", "control", ".", "p", "=", "0", ".", "001176", "(", "JAM", "-", "A", "WT", "Neg", ".", "ctrol", ".", "vs", ".", "miR", "-", "449a", "mimic", ")", "(", "n", "=", "9", "independent", "wells", ",", "4", "independent", "transfections", ")", ".", "G", ",", "H", ".", "Confocal", "images", "of", "coronal", "sections", "from", "E14", "brains", "of", "wild", "type", "mice", "stained", "with", "anti", "-", "JAM", "-", "A", "antibody", "(", "green", ")", ",", "phalloidin", "to", "label", "actin", "(", "gray", ")", "and", "DAPI", "to", "label", "cell", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", "(", "G", ")", ",", "5", "μm", "(", "H", ")", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "JAM", "-", "A", "protein", "expression", "in", "the", "ventricular", "zone", "of", "E14", "brain", "coronal", "sections", "from", "miR", "-", "34", "/", "449", "KO", "mice", "compared", "with", "littermate", "controls", "(", "Het", ")", "by", "immunofluorescence", ".", "ACTIN", "(", "phalloidin", "signal", ")", "was", "used", "to", "normalize", "(", "norm", ".", ")", "the", "expresion", "levels", "of", "JAM", "-", "A", ".", "p", "=", "0", ".", "04842", "(", "n", "=", "5", "(", "KO", ")", "or", "7", "(", "het", ")", "cortices", "per", "genotype", "group", ",", "3", "independent", "litters", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Quantification of mRNA expression by RT-qPCR of candidate miR-34/449 targets that might regulate spindle orientation in E14 cortex samples from miR-34/449 KO mice compared with littermate controls (Het). Expression was normlaized (norm.) to Phosphoglycerate kinase (PGK) mRNA levels. Significance was tested by Welch's t test: p = 0.009756 (JAM-A (Het) vs. JAM-A (KO)), all the rest Het vs. KO comparisons p=n.s. (n = 4 cortices per genotype group, 2 independent litters). All subfigures were statistically tested as in A. * indicates p ≤ 0.05, ** indicates p ≤ 0.01, *** indicates p ≤ 0.001. Red bar indicates median.B. RT-qPCR quantification of JAM-A mRNA expression in HeLa cells 48 h after transfection of miR-449a mimic compared to cells transfected with non-targeting negative control siRNA. JAM-A mRNA Expression was normalized (norm.) to Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA levels. p = 0.0001218 (Neg. ctrol. vs. miR-449a mimic) (n = 9 measurements from 3 independent replicates).C, D. mouse J110 cells were transfected with either miR-449a mimic or a negative control mimic. Whole cell extracts were subjected to immunoblot analysis to detect endogenous JAM-A and ACTIN. ACTIN was used to normalize JAM-A expression (norm.) as loading control. p = 0.04454 (Neg. ctrol. vs. miR-449a mimic) (n = 4 independent wells, 2 independent transfections).E, F. HeLa cells were cotransfected with either miR-449a mimic or a negative control mimic, together with JAM-A-GFP fusion protein and GFP. Whole cell extracts were subjected to immunoblot analysis to detect GFP. GFP was used to normalize (norm.) by transfection efficiency as loading control. p = 0.001176 (JAM-A WT Neg. ctrol. vs. miR-449a mimic) (n = 9 independent wells, 4 independent transfections).G, H. Confocal images of coronal sections from E14 brains of wild type mice stained with anti-JAM-A antibody (green), phalloidin to label actin (gray) and DAPI to label cell nuclei (blue). Scale bars: 10 μm (G), 5 μm (H).I. Quantification of JAM-A protein expression in the ventricular zone of E14 brain coronal sections from miR-34/449 KO mice compared with littermate controls (Het) by immunofluorescence. ACTIN (phalloidin signal) was used to normalize (norm.) the expresion levels of JAM-A. p = 0.04842 (n = 5 (KO) or 7 (het) cortices per genotype group, 3 independent litters)."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "D", ".", "Confocal", "time", "lapse", "images", "of", "metaphase", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "a", "centriole", "marker", "(", "Centrin2", "-", "GFP", ";", "green", ")", ",", "the", "microtubule", "marker", "(", "α", "-", "tubulin", "-", "mRFP", ";", "red", ")", "and", "no", "extra", "protein", "(", "A", ")", "or", "mouse", "JAM", "-", "A", "(", "D", ")", ",", "48", "h", "after", "transfection", "of", "miR", "-", "449a", "mimic", ",", "JAM", "-", "A", "siRNA", ",", "or", "non", "-", "targeting", "negative", "control", "siRNA", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", ",", "E", ".", "Quantification", "of", "spindle", "rotation", "for", "cells", "as", "shown", "in", "A", "and", "D", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", ".", "Red", "bar", "indicates", "median", ".", "Significance", "was", "tested", "by", "Pairwise", "t", "-", "test", "with", "Bonferroni", "correction", ".", "p", "-", "value", "=", "2e", "-", "11", "(", "Neg", ".", "control", "versus", "miR449", "mimic", ")", ",", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "01928", "(", "Neg", ".", "control", "versus", "JAM", "-", "A", "siRNA", ")", ",", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "17492", "(", "Neg", ".", "control", "versus", "miR449", "mimic", ",", "under", "JAM", "-", "A", "overexpression", ")", ".", "*", "indicates", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "p", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "for", "all", "panels", ".", "C", ",", "F", ".", "Cumulative", "histograms", "of", "mitotic", "duration", "from", "nuclear", "envelope", "breakdown", "until", "anaphase", "onset", ",", "measured", "for", "cells", "as", "shown", "in", "A", "and", "D", ";", "n", "≥", "20", "cells", "for", "all", "conditions", ",", "2", "independent", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, D. Confocal time lapse images of metaphase HeLa cells stably expressing a centriole marker (Centrin2-GFP; green), the microtubule marker (α-tubulin-mRFP; red) and no extra protein (A) or mouse JAM-A (D), 48 h after transfection of miR-449a mimic, JAM-A siRNA, or non-targeting negative control siRNA. Scale bar, 10 μm.B, E. Quantification of spindle rotation for cells as shown in A and D. Each dot represents a single cell. Red bar indicates median. Significance was tested by Pairwise t-test with Bonferroni correction. p-value = 2e-11 (Neg. control versus miR449 mimic), p-value = 0.01928 (Neg. control versus JAM-A siRNA), p-value = 0.17492 (Neg. control versus miR449 mimic, under JAM-A overexpression). * indicates p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; p*** p ≤ 0.001 for all panels.C, F. Cumulative histograms of mitotic duration from nuclear envelope breakdown until anaphase onset, measured for cells as shown in A and D; n ≥ 20 cells for all conditions, 2 independent replicates."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "DIS3", "expression", "in", "total", "cell", "lysates", "of", "control", "(", "siCTRL", ")", "and", "DIS3", "U2OS", "silenced", "cells", "(", "siDIS3", ")", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", "upon", "rescue", "with", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "DIS3", "expressing", "vector", "(", "DIS3", ")", ".", "Lamin", "B", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "comet", "assays", "performed", "under", "alkaline", "conditions", "in", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "siDIS3", "and", "then", "infected", "with", "a", "vector", "expressing", "DIS3", "(", "DIS3", ")", "or", "an", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "comet", "tail", "lengths", "for", "each", "condition", ".", "Plots", "represent", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "more", "than", "150", "cells", "for", "each", "point", ".", "The", "analysis", "is", "performed", "using", "Casplab", "software", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ".", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "200", "µm", ".", "D", ".", "Immunostaining", "against", "RPA", "in", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "with", "siDIS3", "and", "48", "hours", "later", "infected", "with", "a", "vector", "expressing", "DIS3", "(", "DIS3", ")", "or", "an", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ".", "The", "averages", "of", "foci", "number", "per", "cell", "were", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", "using", "Cell", "Profiler", "software", ".", "At", "least", "150", "cells", "were", "counted", "for", "each", "point", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. DIS3 expression in total cell lysates of control (siCTRL) and DIS3 U2OS silenced cells (siDIS3) was analyzed by Western blot upon rescue with empty vector (EV) or DIS3 expressing vector (DIS3). Lamin B was used as the loading control.C. Representative images of comet assays performed under alkaline conditions in U2OS cells transfected with siCTRL or siDIS3 and then infected with a vector expressing DIS3 (DIS3) or an empty vector (EV). Quantitative analysis of comet tail lengths for each condition. Plots represent three biological replicates, with more than 150 cells for each point. The analysis is performed using Casplab software, error bars indicate s.e.m. (n=3). **** p-value < 0.0001. ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 200 µm.D. Immunostaining against RPA in U2OS cells transfected with siCTRL or with siDIS3 and 48 hours later infected with a vector expressing DIS3 (DIS3) or an empty vector (EV). The averages of foci number per cell were calculated from three independent experiments using Cell Profiler software. At least 150 cells were counted for each point, error bars indicate s.e.m. (n=3). * p-value < 0.05. ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunostaining", "with", "S9", ".", "6", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "U2OS", "cells", ",", "transfected", "for", "48", "hours", "with", "siCTRL", "or", "siDIS3", "and", "then", "mock", "-", "treated", "(", "UNTR", ")", "or", "treated", "with", "RNase", "H", "or", "RNase", "III", "for", "1", "hour", "before", "fixation", ".", "Histograms", "show", "S9", ".", "6", "signal", "intensity", "per", "cell", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "More", "than", "150", "cells", "were", "counted", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "B", ".", "Immunostaining", "with", "J2", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "U2OS", "cells", ",", "as", "in", "panel", "A", ")", ".", "More", "than", "150", "cells", "were", "counted", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "For", "all", "conditions", ",", "differences", "between", "siCTRL", "and", "siDIS3", "were", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "C", ".", "Dot", "blot", "analysis", "of", "DNA", ":", "RNA", "hybrids", "formation", ":", "serial", "dilutions", "(", "750", "ng", ",", "375", "ng", ",", "187", ",", "5", "ng", ",", "93", ",", "75", "ng", ",", "46", ",", "87", "ng", ")", "of", "genomic", "DNA", "extracted", "from", "WT", "or", "DIS3", "silenced", "U2OS", "cells", "and", "pre", "-", "treated", "with", "RNase", "H", ",", "RNase", "III", "or", "mock", "treated", ",", "were", "arrayed", "on", "a", "membrane", "and", "probed", "using", "the", "S9", ".", "6", "antibody", ".", "The", "histogram", "shows", "the", "S9", ".", "6", "signal", "quantification", "in", "3", "biological", "replicates", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "normalized", "on", "SYBR", "®", "-", "Gold", "signal", "(", "Adj", ".", "Vol", ".", ")", ",", "using", "Image", "lab", "software", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "D", ".", "DRIP", "-", "qPCR", "analysis", "at", "four", "different", "R", "-", "loops", "sites", ",", "RPL13A", ",", "ACTB", ",", "ENSA", ",", "and", "TRIM33", "in", "U2OS", "cells", "transduced", "with", "shScr", "or", "shDIS3", "and", "treated", "or", "not", "with", "RNase", "H", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", ".", "Representative", "pictures", "of", "comet", "assays", "performed", "under", "alkaline", "conditions", "in", "U2OS", "cells", "transfected", "for", "48", "hours", "with", "siCTRL", "or", "siDIS3", ",", "untreated", "(", "UNTR", ")", "or", "treated", "with", "RNase", "H", "(", "RNase", "H", ")", ".", "Tail", "moments", "analysis", "was", "performed", "using", "Casplab", "software", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Plots", "represent", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "150", "cells", "for", "each", "cell", "line", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "200", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunostaining with S9.6 (green) and DAPI (blue) in U2OS cells, transfected for 48 hours with siCTRL or siDIS3 and then mock-treated (UNTR) or treated with RNase H or RNase III for 1 hour before fixation. Histograms show S9.6 signal intensity per cell, error bars indicate s.e.m. (n=3, biological replicates). More than 150 cells were counted, and error bars indicate s.e.m. (n=3 biological replicates).). **** = p < 0.0001, *** = p < 0.001, ns = not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 10 µm.B. Immunostaining with J2 (green) and DAPI (blue) in U2OS cells, as in panel A). More than 150 cells were counted, and error bars indicate s.e.m. (n=3 biological replicates). For all conditions, differences between siCTRL and siDIS3 were not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 10 µm.C. Dot blot analysis of DNA:RNA hybrids formation: serial dilutions (750 ng, 375 ng, 187,5 ng, 93,75 ng, 46,87 ng) of genomic DNA extracted from WT or DIS3 silenced U2OS cells and pre-treated with RNase H, RNase III or mock treated, were arrayed on a membrane and probed using the S9.6 antibody. The histogram shows the S9.6 signal quantification in 3 biological replicates, error bars indicate s.e.m., normalized on SYBR®-Gold signal (Adj. Vol.), using Image lab software. *** = p < 0.001, ** = p < 0.01, ns= not statistically significant, two-way ANOVA.D. DRIP-qPCR analysis at four different R-loops sites, RPL13A, ACTB, ENSA, and TRIM33 in U2OS cells transduced with shScr or shDIS3 and treated or not with RNase H. Results are shown as mean + s.e.m of three independent experiments.**** = p < 0.0001, *** = p < 0.001, * = p < 0.05, two-way ANOVA.E. Representative pictures of comet assays performed under alkaline conditions in U2OS cells transfected for 48 hours with siCTRL or siDIS3, untreated (UNTR) or treated with RNase H (RNase H). Tail moments analysis was performed using Casplab software, error bars indicate s.e.m. Plots represent three biological replicates, with 150 cells for each cell line. **** = p < 0.0001, ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 200 µm."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "with", "siDIS3", "and", "48", "hours", "later", "were", "irradiated", "(", "IR", ")", "or", "left", "untreated", "(", "NO", "IR", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", "4", "hours", "after", "IR", "and", "stained", "for", "RAD51", ".", "Histograms", "show", "foci", "number", "per", "cell", ",", "analyzed", "with", "Cell", "Profiler", ".", "The", "average", "number", "of", "foci", "per", "cell", "was", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "were", "counted", "for", "each", "point", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µD", ".", "Representative", "pictures", "of", "alkaline", "comet", "assays", "performed", "in", "U2OS", "silenced", "(", "siDIS3", ")", "or", "not", "(", "siCTRL", ")", "for", "DIS3", ",", "at", "sequential", "time", "points", "after", "exposure", "to", "3", "Gy", "irradiation", ".", "Relative", "comet", "tail", "moments", "were", "plotted", "for", "siCTRL", "(", "black", "circles", ")", "and", "siDIS3", "(", "red", "circles", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "Casplab", "software", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Plots", "represent", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "more", "than", "150", "cells", "for", "each", "siRNA", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "20", "µm", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "HPRT", "negative", "mutants", "in", "HT1080", "cells", "infected", "with", "scramble", "shRNA", "(", "shScr", ")", "or", "shRNA", "against", "DIS3", "(", "shDIS3", ")", ".", "Histograms", "show", "the", "mutation", "frequency", "and", "the", "deletion", "length", "of", "DIS3", "WT", "(", "shScr", ")", "and", "DIS3", "depleted", "cells", "(", "shDIS3", ")", "after", "I", "-", "SceI", "induced", "DSB", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", "Student", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. U2OS cells were transfected with siCTRL or with siDIS3 and 48 hours later were irradiated (IR) or left untreated (NO IR). Cells were fixed 4 hours after IR and stained for RAD51. Histograms show foci number per cell, analyzed with Cell Profiler. The average number of foci per cell was calculated from three independent experiments. At least 200 cells were counted for each point, error bars indicate s.e.m. (n=3). * = p < 0.05, two-way ANOVA, ns= not statistically significant, scale bar is 10 µD. Representative pictures of alkaline comet assays performed in U2OS silenced (siDIS3) or not (siCTRL) for DIS3, at sequential time points after exposure to 3 Gy irradiation. Relative comet tail moments were plotted for siCTRL (black circles) and siDIS3 (red circles). Analysis was performed using Casplab software, error bars indicate s.e.m. Plots represent three biological replicates, with more than 150 cells for each siRNA. **** = p < 0.0001, ** = p < 0.001, ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 20 µm.F. Representative images of HPRT negative mutants in HT1080 cells infected with scramble shRNA (shScr) or shRNA against DIS3 (shDIS3). Histograms show the mutation frequency and the deletion length of DIS3 WT (shScr) and DIS3 depleted cells (shDIS3) after I-SceI induced DSB. Error bars represent s.e.m. (n=3). *** = p < 0.001, ns= not statistically significant Student t-test."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "with", "siDIS3", "and", "48", "hours", "later", "were", "3", "Gy", "irradiated", "(", "IR", ")", "or", "left", "untreated", "(", "NO", "IR", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", "4", "hours", "after", "IR", "and", "stained", "for", "BRCA1", ".", "Histograms", "show", "foci", "number", "per", "cell", ",", "analyzed", "with", "Cell", "Profiler", ".", "The", "average", "number", "of", "foci", "per", "cell", "was", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "At", "least", "200", "cells", "were", "counted", "for", "each", "point", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "BRCA1", "staining", "on", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "with", "siDIS3", ".", "48", "hours", "after", "transfection", "cells", "were", "irradiated", "and", "4", "hours", "later", "were", "treated", "with", "RNase", "H", "or", "left", "untreated", "(", "UNTR", ")", ".", "Histograms", "show", "the", "average", "foci", "number", "per", "cell", "from", "three", "independent", "experiments", "analyzed", "with", "Cell", "Profiler", ".", "At", "least", "200", "cells", "were", "counted", "for", "each", "point", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "D", ".", "Representative", "pictures", "of", "comet", "assays", "performed", "under", "alkaline", "conditions", "in", "U2OS", "cells", ",", "silenced", "(", "siDIS3", ")", "or", "not", "(", "siCTRL", ")", "for", "DIS3", "untreated", "(", "UNTR", ")", "or", "treated", "with", "RNase", "H", "(", "RNase", "H", ")", ".", "Relative", "comet", "tail", "moments", "are", "plotted", "for", "siCTRL", "(", "black", "circles", ")", "and", "siDIS3", "(", "red", "circles", ")", ".", "Analysis", "was", "performed", "using", "Casplab", "software", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Plots", "represent", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "150", "cells", "for", "each", "siRNA", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "20", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. U2OS cells were transfected with siCTRL or with siDIS3 and 48 hours later were 3 Gy irradiated (IR) or left untreated (NO IR). Cells were fixed 4 hours after IR and stained for BRCA1. Histograms show foci number per cell, analyzed with Cell Profiler. The average number of foci per cell was calculated from three independent experiments. At least 200 cells were counted for each point, error bars indicate s.e.m. (n=3 biological replicates). ** = p < 0.01, ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 10 µm.C. Representative images of BRCA1 staining on U2OS cells transfected with siCTRL or with siDIS3. 48 hours after transfection cells were irradiated and 4 hours later were treated with RNase H or left untreated (UNTR). Histograms show the average foci number per cell from three independent experiments analyzed with Cell Profiler. At least 200 cells were counted for each point, error bars indicate s.e.m. (n=3). ** = p < 0.01, ns= not statistically significant, one-way ANOVA, scale bar is 10 µm.D. Representative pictures of comet assays performed under alkaline conditions in U2OS cells, silenced (siDIS3) or not (siCTRL) for DIS3 untreated (UNTR) or treated with RNase H (RNase H). Relative comet tail moments are plotted for siCTRL (black circles) and siDIS3 (red circles). Analysis was performed using Casplab software, error bars indicate s.e.m. Plots represent three biological replicates, with 150 cells for each siRNA. **** = p < 0.0001, one-way ANOVA, scale bar is 20 µm."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "confocal", "images", "upon", "irradiation", "with", "the", "405nm", "laser", ".", "U2OS", "cells", "were", "presensitized", "with", "BrdU", "for", "24", "hours", ",", "micro", "-", "irradiated", ",", "fixed", "after", "10", "minutes", ",", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "γH2AX", "and", "DIS3", "scale", "bar", "is", "10", "µm", ".", "B", ".", "Magnification", "image", "of", "the", "white", "box", "in", "panel", "A", ".", "C", ".", "Intensity", "profiles", "of", "γH2AX", "(", "green", ")", "and", "DIS3", "signals", "through", "the", "yellow", "line", "in", "panel", "B", ".", "Quantification", "is", "performed", "with", "ImageJ", "software", "scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative confocal images upon irradiation with the 405nm laser. U2OS cells were presensitized with BrdU for 24 hours, micro-irradiated, fixed after 10 minutes, and stained with antibodies against γH2AX and DIS3 scale bar is 10 µm. B. Magnification image of the white box in panel A. C. Intensity profiles of γH2AX (green) and DIS3 signals through the yellow line in panel B. Quantification is performed with ImageJ software scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Representative", "pictures", "of", "comet", "assays", "performed", "under", "alkaline", "conditions", "in", "DIS3", "WT", "MM", "cell", "lines", "MM", ".", "1S", "and", "RPMI", "-", "8226", "(", "RPMI", ")", ",", "and", "in", "DIS3", "mutated", "MM", "cell", "lines", "PCM6", "and", "OPM2", ",", "untreated", "(", "UNTR", ")", "or", "treated", "with", "RNase", "H", "(", "RNase", "H", ")", ".", "Tail", "moments", "analysis", "was", "performed", "using", "Casplab", "software", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Plots", "represent", "three", "biological", "replicates", ",", "with", "150", "cells", "for", "each", "cell", "line", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", "ns", "=", "not", "statistically", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "20", "µm", ".", "B", ".", "Immunostaining", "with", "S9", ".", "6", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "MM", ".", "1S", ",", "RPMI", "-", "8226", ",", "PCM6", ",", "and", "OPM2", "cells", ",", "treated", "(", "RNase", "H", ")", "or", "not", "(", "UNTR", ")", "with", "RNase", "H", "for", "1", "hour", ".", "Histograms", "show", "S9", ".", "6", "signal", "intensity", "per", "cell", ".", "More", "than", "150", "cells", "were", "counted", ",", "error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "scale", "bar", "is", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Representative pictures of comet assays performed under alkaline conditions in DIS3 WT MM cell lines MM.1S and RPMI-8226 (RPMI), and in DIS3 mutated MM cell lines PCM6 and OPM2, untreated (UNTR) or treated with RNase H (RNase H). Tail moments analysis was performed using Casplab software, error bars indicate s.e.m. Plots represent three biological replicates, with 150 cells for each cell line. **** = p < 0.0001 ns= not statistically significant, two-way ANOVA, scale bar is 20 µm.B. Immunostaining with S9.6 (green) and DAPI (blue) in MM.1S, RPMI-8226, PCM6, and OPM2 cells, treated (RNase H) or not (UNTR) with RNase H for 1 hour. Histograms show S9.6 signal intensity per cell. More than 150 cells were counted, error bars indicate s.e.m. (n=3 biological replicates). **** = p < 0.0001, one-way ANOVA, scale bar is 10 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Relative", "mRNA", "expression", "level", "of", "interferon", "genes", "IFI6", ",", "ISG15", ",", "IFITM1", ",", "IFIT3", ",", "IFI27", ",", "MCL1", ",", "cGAS", ",", "and", "STING", "in", "OPM2", "cells", "infected", "with", "a", "vector", "expressing", "DIS3", "(", "DIS3", ")", "or", "an", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ".", "Values", "are", "relative", "to", "housekeeping", "gene", "expression", ",", "normalized", "on", "EV", ",", "and", "represent", "SE", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "multiple", "t", "-", "tests", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "between", "mutant", "and", "WT", "samples", ";", "p", "-", "values", "are", "from", "limma", "and", "false", "-", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "is", "calculated", "using", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "procedure", ";", "FDR", "<", "0", ".", "05", "was", "used", "as", "cut", "off", ".", "Functional", "annotation", "analysis", "by", "IPA", "of", "the", "DEGs", "between", "DIS3", "mutant", "and", "WT", "samples", "based", "on", "FDR", "cut", "-", "off", ".", "(", "C", ")", "Volcano", "plot", "of", "DEGs", "between", "mutant", "and", "WT", "samples", ";", "labeled", "genes", "are", "the", "IFN", "-", "related", "genes", "with", "an", "FDR", "<", "0", ".", "05", "(", "red", "horizontal", "line", ")", "and", "absolute", "log", "2", "-", "fold", "change", "above", "or", "below", "0", ".", "5", "(", "red", "vertical", "lines", ")", ",", "respectively", ";", "additional", "representative", "IFN", "-", "related", "genes", "are", "also", "labeled", ".", "(", "F", ")", "Violin", "plot", "of", "the", "number", "of", "non", "-", "synonymous", "(", "NS", ")", "mutation", "load", "comparison", "between", "DIS3", "mutant", "versus", "DIS3", "WT", "performed", "on", "the", "entire", "CoMMpass", "dataset", ",", "including", "853", "MM", "patients", ",", "88", "presenting", "DIS3", "mutations", "(", "all", "samples", ")", "and", "on", "the", "CoMMpass", "dataset", ",", "stratified", "according", "to", "the", "intensity", "of", "the", "IFN", "responsiveness", "(", "clusters", "C1", ",", "C2", ",", "C3", ")", ".", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "test", "was", "used", "for", "comparison", "between", "DIS3", "mutant", "vs", "WT", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Black", "color", "dots", "represent", "the", "median", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Relative mRNA expression level of interferon genes IFI6, ISG15, IFITM1, IFIT3, IFI27, MCL1, cGAS, and STING in OPM2 cells infected with a vector expressing DIS3 (DIS3) or an empty vector (EV). Values are relative to housekeeping gene expression, normalized on EV, and represent SE of three biological replicates. *** = p < 0.001, ** = p < 0.01, multiple t-tests.Differentially expressed genes (DEGs) between mutant and WT samples; p-values are from limma and false-discovery rate (FDR) is calculated using the Benjamini-Hochberg procedure; FDR < 0.05 was used as cut off. Functional annotation analysis by IPA of the DEGs between DIS3 mutant and WT samples based on FDR cut-off. (C) Volcano plot of DEGs between mutant and WT samples; labeled genes are the IFN-related genes with an FDR < 0.05 (red horizontal line) and absolute log 2-fold change above or below 0.5 (red vertical lines), respectively; additional representative IFN-related genes are also labeled.(F) Violin plot of the number of non-synonymous (NS) mutation load comparison between DIS3 mutant versus DIS3 WT performed on the entire CoMMpass dataset, including 853 MM patients, 88 presenting DIS3 mutations (all samples) and on the CoMMpass dataset, stratified according to the intensity of the IFN responsiveness (clusters C1, C2, C3). Wilcoxon rank-sum test was used for comparison between DIS3 mutant vs WT. **** = p <, ** = p < 0.01, * = p < 0.05. Black color dots represent the median in each group."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL6", "expression", "upon", "indicated", "stimulations", "in", "presence", "or", "absence", "of", "NOD1", "(", "A", ")", "or", "NOD2", "(", "B", ")", ".", "HeLa", "inducible", "NOD1", "cells", "(", "A", ")", "or", "NOD2", "cells", "(", "B", ")", "were", "induced", "in", "absence", "or", "presence", "of", "doxycycline", "overnight", "and", "afterwards", "stimulated", "with", "various", "stimuli", "for", "4", "h", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) qRT-PCR analysis of IL6 expression upon indicated stimulations in presence or absence of NOD1 (A) or NOD2 (B). HeLa inducible NOD1 cells (A) or NOD2 cells (B) were induced in absence or presence of doxycycline overnight and afterwards stimulated with various stimuli for 4 h."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Cxcl2", "expression", "upon", "indicated", "stimulations", "in", "WT", ",", "Nod1", "/", "2", "KO", "and", "Rip2", "KO", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) qRT-PCR analysis of Cxcl2 expression upon indicated stimulations in WT, Nod1/2 KO and Rip2 KO bone marrow derived macrophages (BMDMs)."}
{"words": ["Figure", "3ELISA", "analysis", "of", "IL6", "in", "supernatants", "of", "HDFs", "(", "E", ")", "upon", "indicated", "stimulations", "for", "20", "h", "in", "absence", "or", "presence", "of", "the", "inhibitor", "of", "sphingosine", "kinases", ".", "(", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Cxcl2", "expression", "in", "WT", ",", "Sphk1", "KO", "or", "Sphk2", "KO", "BMDMs", "upon", "indicated", "stimulations", "for", "4", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3ELISA analysis of IL6 in supernatants of HDFs (E) upon indicated stimulations for 20 h in absence or presence of the inhibitor of sphingosine kinases.(H) qRT-PCR analysis of Cxcl2 expression in WT, Sphk1 KO or Sphk2 KO BMDMs upon indicated stimulations for 4 h."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "MAPKs", "and", "NF", "-", "κB", "activation", "upon", "S1P", "stimulation", ".", "HeLa", "NOD1", "or", "NOD2", "cells", "were", "treated", "with", "cytosolic", "S1P", "(", "20", "µM", ")", ",", "iE", "-", "DAP", "(", "20", "µM", ")", "or", "MDP", "(", "20", "µM", ")", "for", "indicated", "times", ".", "Multiplex", "analysis", "of", "CXCL2", "(", "I", ")", ",", "CCL5", "(", "J", ")", "and", "IL16", "(", "K", ")", "production", "in", "supernatants", "of", "WT", ",", "Nod1", "/", "2", "and", "Rip2", "KO", "BMDMs", "upon", "S1P", "(", "10", "µM", ")", "or", "MDP", "(", "10", "µM", ")", "stimulations", "together", "with", "digitonin", "(", "2", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "20", "h", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D) Western blot analysis of MAPKs and NF-κB activation upon S1P stimulation. HeLa NOD1 or NOD2 cells were treated with cytosolic S1P (20 µM), iE-DAP (20 µM) or MDP (20 µM) for indicated times.Multiplex analysis of CXCL2 (I), CCL5 (J) and IL16 (K) production in supernatants of WT, Nod1/2 and Rip2 KO BMDMs upon S1P (10 µM) or MDP (10 µM) stimulations together with digitonin (2.5 µg/ml) for 20 h."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Immunoprecipitation", "with", "various", "lipid", "-", "coated", "beads", "using", "HeLa", "NOD1", "-", "GFP", "(", "A", ")", "and", "NOD2", "-", "GFP", "cells", "(", "B", ")", ".", "Cell", "lysates", "of", "HeLa", "NOD1", "or", "HeLa", "NOD2", "cells", "were", "incubated", "with", "lipid", "-", "coated", "beads", "at", "room", "temperature", "for", "2", "h", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Single", "particle", "tracking", "of", "NOD1", "-", "GFP", "(", "E", ")", "or", "NOD2", "-", "GFP", "(", "F", ")", "with", "S1P", "-", "TAMRA", ".", "After", "doxycycline", "induction", "overnight", ",", "HeLa", "NOD1", "or", "NOD2", "cells", "were", "stimulated", "with", "S1P", "-", "TAMRA", "(", "20", "µM", ")", "for", "1", "h", "together", "with", "digitonin", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A, B) Immunoprecipitation with various lipid-coated beads using HeLa NOD1-GFP (A) and NOD2-GFP cells (B). Cell lysates of HeLa NOD1 or HeLa NOD2 cells were incubated with lipid-coated beads at room temperature for 2 h.(E, F) Single particle tracking of NOD1-GFP (E) or NOD2-GFP (F) with S1P-TAMRA. After doxycycline induction overnight, HeLa NOD1 or NOD2 cells were stimulated with S1P-TAMRA (20 µM) for 1 h together with digitonin. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "MST", "analysis", "of", "direct", "binding", "of", "NOD1", "to", "S1P", "and", "iE", "-", "DAP", ".", "(", "E", ")", "MST", "analysis", "of", "direct", "binding", "of", "NOD2", "with", "S1P", "and", "MDP", ".", "(", "F", ")", "ELISA", "analysis", "of", "IL8", "in", "supernatants", "of", "HEK293T", "NOD1", "/", "2", "KO", "cells", "transfected", "with", "indicated", "NOD1", "or", "NOD2", "mutants", ".", "After", "24", "h", "transfection", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "S1P", "(", "20", "µM", ")", ",", "iE", "-", "DAP", "(", "20", "µM", ")", "or", "MDP", "(", "20", "µM", ")", "together", "with", "digitonin", "for", "20", "h", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) MST analysis of direct binding of NOD1 to S1P and iE-DAP. (E) MST analysis of direct binding of NOD2 with S1P and MDP.(F) ELISA analysis of IL8 in supernatants of HEK293T NOD1/2 KO cells transfected with indicated NOD1 or NOD2 mutants. After 24 h transfection, cells were stimulated with S1P (20 µM), iE-DAP (20 µM) or MDP (20 µM) together with digitonin for 20 h."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "MST", "analysis", "of", "direct", "binding", "of", "NOD1", "(", "A", ")", "or", "NOD2", "(", "B", ")", "with", "ADP", "in", "the", "presence", "of", "S1P", "(", "2", "µM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) MST analysis of direct binding of NOD1 (A) or NOD2 (B) with ADP in the presence of S1P (2 µM)."}
{"words": ["Figure", "1Monocyte", "derived", "macrophages", "(", "MDM", ")", "were", "treated", "with", "5μM", "etoposide", "(", "ETO", ")", "for", "18h", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "γH2AX", "and", "53BP1", "nuclear", "foci", ",", "acquired", "and", "analysed", "using", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", ".", "On", "average", "104", "cells", "were", "acquired", "and", "analysed", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", ".", "Monocyte", "derived", "macrophages", "(", "MDM", ")", "were", "treated", "with", "5μM", "etoposide", "(", "ETO", ")", "for", "18h", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "γH2AX", "and", "53BP1", "nuclear", "foci", ",", "acquired", "and", "analysed", "using", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", ".", "On", "average", "104", "cells", "were", "acquired", "and", "analysed", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10μm", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "ETO", "and", "CTH", "for", "66h", ".", "Cells", "were", "stained", "to", "distinguish", "between", "live", "and", "dead", "cells", "using", "LIVE", "/", "DEAD", "fixable", "Dead", "cell", "stain", "protocol", ".", "Percentages", "of", "live", "/", "dead", "cells", "were", "determined", "using", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", ".", "Addition", "of", "20", "%", "ethanol", "for", "10min", "into", "cells", "treated", "with", "ETO", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "-", "G", "pseudotyped", "HIV", "-", "1", "GFP", "viruses", "wild", "type", "(", "wt", ")", "HIV", "-", "1", "capsid", "mutants", "(", "N74D", "or", "P90A", ")", ",", "HIV", "-", "2", ",", "SIV", "sooty", "mangabey", "(", "SIVsm", "E543", ")", ",", "replication", "competent", "Adenovirus", "type", "5", "AdV", "(", "AdV", ")", ",", "Semliki", "Forest", "Virus", "(", "SFV", ")", "and", "HSV", "-", "1", ".", "The", "percentages", "of", "infected", "cells", "were", "determined", "using", "an", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "and", "normalized", "to", "untreated", "control", "~", "100", "%", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "001", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "Cells", "from", "a", "representative", "donor", "were", "used", "for", "immunoblotting", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "-", "G", "pseudotyped", "HIV", "-", "1", "GFP", ".", "104", "cells", "were", "recorded", "and", "analysed", "for", "GFP", "expression", "48h", "post", "-", "infection", "using", "an", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", ".", "(", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "001", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "full", "-", "length", "replication", "competent", "macrophage", "tropic", "HIV", "-", "1", "virus", "BaL", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "intracellular", "p24", "and", "the", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "48", "h", "post", "‐", "infection", "by", "FACS", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "001", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "G", "-", "I", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "DNA", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", ".", "Late", "viral", "RT", "products", ".", "AZT", ":", "MDM", "treated", "with", "20μM", "AZT", ",", "a", "reverse", "-", "transcriptase", "inhibitor", ",", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "G", "-", "I", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "DNA", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", ".", "2LTR", "circles", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "G", "-", "I", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "DNA", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", ".", "Integrated", "copies", "of", "viral", "DNA", ",", "Alu", "-", "Gag", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "001", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "(", "3", ",", "6", ",", "12", "ffu", "/", "cell", ")", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "intracellular", "p24", "and", "the", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "48", "h", "post", "‐", "infection", "by", "FACS", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "001", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", ",", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "(", "3", ",", "6", ",", "12", "ffu", "/", "cell", ")", "and", "DNA", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", ",", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "DNA", "isolated", "4", ",", "6", ",", "and", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Monocyte derived macrophages (MDM) were treated with 5μM etoposide (ETO) for 18h. Cells were stained for γH2AX and 53BP1 nuclear foci, acquired and analysed using the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ. On average 104 cells were acquired and analysed. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05; paired t‐test). Scale bars, 10μm.Monocyte derived macrophages (MDM) were treated with 5μM etoposide (ETO) for 18h. Cells were stained for γH2AX and 53BP1 nuclear foci, acquired and analysed using the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ. On average 104 cells were acquired and analysed. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05; paired t‐test). Scale bars, 10μm.MDM were treated with increasing concentrations of ETO and CTH for 66h. Cells were stained to distinguish between live and dead cells using LIVE/DEAD fixable Dead cell stain protocol. Percentages of live/dead cells were determined using automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ. Addition of 20% ethanol for 10min into cells treated with ETO was used as positive control. (n = 3, mean ± s.e.m).MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with VSV-G pseudotyped HIV-1 GFP viruses wild type (wt) HIV-1 capsid mutants (N74D or P90A), HIV-2, SIV sooty mangabey (SIVsm E543), replication competent Adenovirus type 5 AdV (AdV), Semliki Forest Virus (SFV) and HSV-1. The percentages of infected cells were determined using an automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ and normalized to untreated control ~100%. (n = 3, mean ± s.e.m.; **P‐value ≤ 0.01; ***P‐value ≤ 0.001; (ns) non‐significant, paired t‐test). Cells from a representative donor were used for immunoblotting.MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with VSV-G pseudotyped HIV-1 GFP. 104 cells were recorded and analysed for GFP expression 48h post-infection using an automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ. (n = 4, mean ± s.e.m; ***P‐value ≤ 0.001, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with full-length replication competent macrophage tropic HIV-1 virus BaL. Cells were stained for intracellular p24 and the percentage of infected cells was quantified 48 h post‐infection by FACS (n = 3, mean ± s.e.m; ***P‐value ≤ 0.001, paired t‐test). G-I MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and DNA isolated 18 h post‐infection for qPCR.  Late viral RT products. AZT: MDM treated with 20μM AZT, a reverse-transcriptase inhibitor, were used as control. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant, paired t‐test).  G-I MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and DNA isolated 18 h post‐infection for qPCR.2LTR circles. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05, paired t‐test).G-I MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and DNA isolated 18 h post‐infection for qPCR.Integrated copies of viral DNA, Alu-Gag qPCR. (n = 3, mean ± s.e.m.; ***P‐value ≤ 0.001, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h and infected with HIV-1 BaL (3, 6, 12 ffu/cell). Cells were stained for intracellular p24 and the percentage of infected cells was quantified 48 h post‐infection by FACS (n = 3, mean ± s.e.m; ** P‐value ≤ 0.01; ***P‐value ≤ 0.001, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h, infected with HIV-1 BaL (3, 6, 12 ffu/cell) and DNA isolated 18 h post‐infection for qPCR. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h, infected with HIV-1 BaL and DNA isolated 4, 6, and 18 h post‐infection for qPCR. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant, paired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "2MDM", "were", "transfected", "with", "control", "or", "pool", "of", "SAMHD1", "(", "KD", ")", "siRNA", "and", "3", "days", "later", "treated", "with", "5μM", "ETO", "and", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "‐", "G", "pseudotyped", "HIV", "‐", "1", "GFP", "18h", "later", ".", "Cells", "from", "a", "representative", "donor", "were", "used", "for", "immunoblotting", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "48h", "post", "-", "infection", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "‐", "G", "HIV", "‐", "1", "GFP", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", ")", ".", "Cells", "from", "a", "representative", "donor", "were", "used", "for", "immunoblotting", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "the", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "48h", "post", "-", "infection", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "‐", "G", "HIV", "‐", "1", "GFP", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", ")", "or", "deleted", "for", "Vpx", "(", "SIV", "VLP", "del", "Vpx", ")", "or", "deleted", "for", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", "del", "Vpr", ")", ".", "Cells", "from", "a", "representative", "donor", "were", "used", "for", "immunoblotting", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "48h", "post", "-", "infection", ".", "(", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", ")", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "F", ".", "Late", "RT", "products", ";", "G", ".", "2LTR", "circles", ";", "H", "integrated", "viral", "DNA", ".", "Late", "viral", "RT", "products", ".", "AZT", ":", "MDM", "treated", "with", "20μM", "AZT", ",", "a", "reverse", "-", "transcriptase", "inhibitor", ",", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", ")", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "F", ".", "Late", "RT", "products", ";", "G", ".", "2LTR", "circles", ";", "H", "integrated", "viral", "DNA", ".", "2LTR", "circles", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", ")", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "F", ".", "Late", "RT", "products", ";", "G", ".", "2LTR", "circles", ";", "H", "integrated", "viral", "DNA", ".", "Integrated", "copies", "of", "viral", "DNA", ",", "Alu", "-", "Gag", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "48h", "post", "-", "infection", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2MDM were transfected with control or pool of SAMHD1 (KD) siRNA and 3 days later treated with 5μM ETO and infected in the presence of ETO with VSV‐G pseudotyped HIV‐1 GFP 18h later. Cells from a representative donor were used for immunoblotting. The percentage of infected cells was quantified by the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ 48h post-infection. (n = 3, mean ± s.e.m.; **P‐value ≤ 0.01; (ns) non‐significant, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with VSV‐G HIV‐1 GFP and SIVmac virus‐like particles containing Vpx/Vpr (SIV VLP). Cells from a representative donor were used for immunoblotting. The percentage of infected cells was quantified by the Hermes WiScan and ImageJ 48h post-infection. (n = 3, mean ± s.e.m.; **P‐value ≤ 0.01; (ns) non‐significant, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with VSV‐G HIV‐1 GFP and SIVmac virus‐like particles containing Vpx/Vpr (SIV VLP) or deleted for Vpx (SIV VLP del Vpx) or deleted for Vpr (SIV VLP del Vpr). Cells from a representative donor were used for immunoblotting. The percentage of infected cells was quantified by the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ 48h post-infection. (n = 4, mean ± s.e.m.; **P‐value ≤ 0.01; (ns) non‐significant, paired t‐test).D-F. MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIVmac virus‐like particles containing Vpx/Vpr (SIV VLP). DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of F. Late RT products; G. 2LTR circles; H integrated viral DNA.Late viral RT products. AZT: MDM treated with 20μM AZT, a reverse-transcriptase inhibitor, were used as control. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant, paired t‐test).D-F. MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIVmac virus‐like particles containing Vpx/Vpr (SIV VLP). DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of F. Late RT products; G. 2LTR circles; H integrated viral DNA.2LTR circles. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; *P‐value ≤ 0.05, paired t‐test).D-F. MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIVmac virus‐like particles containing Vpx/Vpr (SIV VLP). DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of F. Late RT products; G. 2LTR circles; H integrated viral DNA.Integrated copies of viral DNA, Alu-Gag qPCR. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test).The percentage of infected cells was quantified by Hermes WiScan and ImageJ 48h post-infection. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "‐", "G", "HIV", "‐", "1", " ", "GFP", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "wild", "type", "(", "WT", ")", "/", "Vpr", "or", "Vpx", "Q76A", "mutant", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", "Q76A", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "differentiated", "and", "cultured", "in", "Human", "serum", "instead", "of", "FCS", ".", "A", "-", "B", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "VSV", "‐", "G", "HIV", "‐", "1", " ", "GFP", "and", "SIVmac", "virus", "‐", "like", "particles", "containing", "Vpx", "wild", "type", "(", "WT", ")", "/", "Vpr", "or", "Vpx", "Q76A", "mutant", "/", "Vpr", "(", "SIV", "VLP", "Q76A", ")", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "differentiated", "and", "cultured", "in", "FCS", ".", "A", "standard", "culture", "condition", "used", "in", "all", "experiments", ".", "See", "Materials", "and", "Methods", ".", " ", "C", "-", "F", ".", "MDM", "we", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIV", "VLP", "Q76A", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "D", ".", "Late", "RT", "products", ";", "E", ".", "2LTR", "circles", ";", "F", ".", "integrated", "viral", "DNA", ".", " ", "The", "percentage", "of", "infected", "cells", "was", "quantified", "by", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", "48h", "post", "-", "infection", ".", "Cells", "from", "a", "representative", "donor", "were", "used", "for", "immunoblotting", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", " ", " ", "C", "-", "F", ".", "MDM", "we", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIV", "VLP", "Q76A", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "D", ".", "Late", "RT", "products", ";", "E", ".", "2LTR", "circles", ";", "F", ".", "integrated", "viral", "DNA", ".", "Late", "viral", "RT", "products", ".", "AZT", ":", "MDM", "treated", "with", "20μM", "AZT", ",", "a", "reverse", "-", "transcriptase", "inhibitor", ",", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "C", "-", "F", ".", "MDM", "we", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIV", "VLP", "Q76A", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "D", ".", "Late", "RT", "products", ";", "E", ".", "2LTR", "circles", ";", "F", ".", "integrated", "viral", "DNA", ".", "2LTR", "circles", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "C", "-", "F", ".", "MDM", "we", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", "and", "co", "‐", "infected", "in", "the", "presence", "of", "ETO", "with", "HIV", "-", "1", "BaL", "and", "SIV", "VLP", "Q76A", ".", "DNA", "was", "isolated", "18", "h", "post", "‐", "infection", "for", "qPCR", "quantification", "of", "D", ".", "Late", "RT", "products", ";", "E", ".", "2LTR", "circles", ";", "F", ".", "integrated", "viral", "DNA", ".", "Integrated", "copies", "of", "viral", "DNA", ",", "Alu", "-", "Gag", "qPCR", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "01", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B. MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with VSV‐G HIV‐1 GFP and SIVmac virus‐like particles containing Vpx wild type (WT)/Vpr or Vpx Q76A mutant/Vpr (SIV VLP Q76A). (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; *P‐value ≤ 0.05; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test).MDM were differentiated and cultured in Human serum instead of FCS.A-B. MDM were treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with VSV‐G HIV‐1 GFP and SIVmac virus‐like particles containing Vpx wild type (WT)/Vpr or Vpx Q76A mutant/Vpr (SIV VLP Q76A). (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; *P‐value ≤ 0.05; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test).MDM were differentiated and cultured in FCS. A standard culture condition used in all experiments. See Materials and Methods. C-F. MDM we treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIV VLP Q76A. DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of D. Late RT products; E. 2LTR circles; F. integrated viral DNA.  The percentage of infected cells was quantified by the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ 48h post-infection. Cells from a representative donor were used for immunoblotting. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test).  C-F. MDM we treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIV VLP Q76A. DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of D. Late RT products; E. 2LTR circles; F. integrated viral DNA.Late viral RT products. AZT: MDM treated with 20μM AZT, a reverse-transcriptase inhibitor, were used as control. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; *P‐value ≤ 0.05, paired t‐test).C-F. MDM we treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIV VLP Q76A. DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of D. Late RT products; E. 2LTR circles; F. integrated viral DNA.2LTR circles. (n = 3, mean ± s.e.m.; (ns) non‐significant; *P‐value ≤ 0.05, paired t‐test).C-F. MDM we treated with 5μM ETO for 18h and co‐infected in the presence of ETO with HIV-1 BaL and SIV VLP Q76A. DNA was isolated 18 h post‐infection for qPCR quantification of D. Late RT products; E. 2LTR circles; F. integrated viral DNA.Integrated copies of viral DNA, Alu-Gag qPCR. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05; **P‐value ≤ 0.01, paired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "4MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "for", "18h", ",", "3μg", "/", "ml", "cGAMP", "and", "10ng", "/", "ml", "IFNβfor", "18h", ".", "RNA", "was", "isolated", "and", "qPCR", "performed", "for", "selected", "genes", "using", "TaqMan", "assays", ".", "Expression", "levels", "of", "target", "genes", "were", "normalised", "to", "GAPDH", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "‐", "value", "≤", "0", ".", "05", ";", "(", "ns", ")", "non", "‐", "significant", ",", "paired", "t", "‐", "test", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "or", "cGAMP", "for", "18h", "or", "100ng", "/", "ml", "LPS", "for", "2h", ".", "Cells", "were", "stained", "and", "analysed", "for", "IRF3", "translocation", "into", "nucleus", ".", "Scale", "bars", ":", "10μm", ".", "Quantification", "of", "nuclei", "positive", "for", "IRF3", "staining", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4MDM were treated with 5μM ETO for 18h, 3μg/ml cGAMP and 10ng/ml IFNβfor 18h. RNA was isolated and qPCR performed for selected genes using TaqMan assays. Expression levels of target genes were normalised to GAPDH. (n = 3, mean ± s.e.m.; *P‐value ≤ 0.05; (ns) non‐significant, paired t‐test).MDM were treated with 5μM ETO or cGAMP for 18h or 100ng/ml LPS for 2h. Cells were stained and analysed for IRF3 translocation into nucleus. Scale bars: 10μm.Quantification of nuclei positive for IRF3 staining. (n = 3, mean ± s.e.m.)."}
{"words": ["Figure", "5MDM", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "ETO", "and", "CTH", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "MCM2", "expression", ",", "acquired", "and", "analysed", "using", "the", "automated", "cell", "‐", "imaging", "system", "Hermes", "WiScan", "and", "ImageJ", ".", "On", "average", "104", "cells", "were", "acquired", ".", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", ",", "lysed", "and", "immunoblotting", "performed", "to", "detect", "cell", "cycle", "/", "cell", "cycle", "arrest", "and", "DNA", "damage", "associated", "proteins", ".", "MDM", "were", "treated", "with", "5μM", "ETO", "or", "0", ".", "01μM", "CTH", "for", "18h", ",", "lysed", "and", "immunoblotting", "performed", "to", "detect", "cell", "cycle", "/", "cell", "cycle", "arrest", "and", "DNA", "damage", "associated", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5MDM were treated with increasing concentrations of ETO and CTH. Cells were stained for MCM2 expression, acquired and analysed using the automated cell‐imaging system Hermes WiScan and ImageJ. On average 104 cells were acquired. (n = 3, mean ± s.e.m.).MDM were treated with 5μM ETO, lysed and immunoblotting performed to detect cell cycle/cell cycle arrest and DNA damage associated proteins.MDM were treated with 5μM ETO or 0.01μM CTH for 18h, lysed and immunoblotting performed to detect cell cycle/cell cycle arrest and DNA damage associated proteins."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "germ", "cells", "immunostained", "for", "SYCP3", "(", "green", ")", ",", "DMC1", "(", "red", ")", ",", "and", "DDX4", "(", "magenta", ")", "at", "each", "meiotic", "sub", "-", "stage", ".", "Nuclear", "DAPI", "staining", "is", "shown", "in", "white", ".", "The", "sub", "-", "stages", "of", "meiosis", "were", "defined", "based", "on", "the", "staining", "patterns", "of", "SYCP3", ",", "DMC1", ",", "and", "DAPI", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "G", ")", "Percentages", "of", "germ", "cells", "at", "each", "meiotic", "sub", "-", "stage", "as", "defined", "in", "Fig", "1F", ".", "The", "average", "percentages", "in", "the", "outer", "or", "inner", "ovarian", "cortex", "on", "each", "meiotic", "sub", "-", "stage", "were", "calculated", "from", "at", "least", "three", "fetal", "ovaries", "[", "8", "wpf", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "10", "/", "12", "/", "14", "/", "16", "/", "18", "wpf", "(", "n", "=", "3", ")", "]", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(F) Representative images of germ cells immunostained for SYCP3 (green), DMC1 (red), and DDX4 (magenta) at each meiotic sub-stage. Nuclear DAPI staining is shown in white. The sub-stages of meiosis were defined based on the staining patterns of SYCP3, DMC1, and DAPI as described in Materials and Methods. (G) Percentages of germ cells at each meiotic sub-stage as defined in Fig 1F. The average percentages in the outer or inner ovarian cortex on each meiotic sub-stage were calculated from at least three fetal ovaries [8 wpf (n=4), 10/12/14/16/18 wpf (n=3)]."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "IF", "for", "oogonia", "(", "POU5F1", ",", "TFAP2C", ")", ",", "meiotic", "(", "SYCP3", ",", "SYCP1", ")", ",", "and", "oogenic", "(", "ZP3", ",", "TP63", ")", "markers", "in", "the", "transplanted", "cy", "rOvaries", ".", "Germ", "cells", "and", "nuclei", "were", "marked", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ",", "respectively", ".", "The", "upper", "-", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "the", "expression", "of", "each", "marker", "(", "green", ")", "co", "-", "stained", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", ".", "The", "lower", "-", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "DDX4", "expression", "(", "magenta", ")", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "The", "numbers", "written", "in", "the", "upper", "-", "left", "corner", "indicate", "weeks", "after", "transplantation", "(", "w", "-", "ptp", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "(", "D", ")", "Percentages", "of", "cells", "positive", "for", "individual", "markers", "among", "DDX4", "+", "germ", "cells", "from", "the", "IF", "of", "cy", "rOvaries", "at", "3", "−", "15", "w", "-", "ptp", "[", "3", "w", "-", "ptp", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "6", "/", "9", "/", "12", "w", "-", "ptp", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "15", "w", "-", "ptp", "(", "n", "=", "6", ")", "]", ".", "The", "average", "values", "with", "SDs", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "transplanted", "cy", "rOvaries", "at", "21", "w", "-", "ptp", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "the", "transplanted", "cy", "rOvaries", "beneath", "the", "kidney", "capsule", "of", "KSN", "/", "Slc", "mice", ".", "K", ",", "mouse", "kidney", ".", "Scale", "bars", "=", "200", "μm", "(", "left", ")", "and", "100", "μm", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) IF for oogonia (POU5F1, TFAP2C), meiotic (SYCP3, SYCP1), and oogenic (ZP3, TP63) markers in the transplanted cy rOvaries. Germ cells and nuclei were marked with DDX4 (magenta) and DAPI (white), respectively. The upper-right magnified images of each panel show the expression of each marker (green) co-stained with DDX4 (magenta). The lower-right magnified images of each panel show DDX4 expression (magenta) co-stained with DAPI (white). The numbers written in the upper-left corner indicate weeks after transplantation (w-ptp). Scale bar = 20 μm. (D) Percentages of cells positive for individual markers among DDX4+ germ cells from the IF of cy rOvaries at 3−15 w-ptp [3 w-ptp (n=3), 6/9/12 w-ptp (n=4), 15 w-ptp (n=6)]. The average values with SDs are shown. (E) H&E staining of transplanted cy rOvaries at 21 w-ptp. Dashed lines indicate the transplanted cy rOvaries beneath the kidney capsule of KSN/Slc mice. K, mouse kidney. Scale bars = 200 μm (left) and 100 μm (right)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "E", ")", "IF", "analyses", "of", "key", "markers", "as", "described", "in", "Fig", "1E", "in", "the", "cultured", "cy", "rOvaries", ".", "Germ", "cells", "and", "nuclei", "were", "marked", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ",", "respectively", ".", "The", "upper", "-", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "the", "expression", "of", "key", "markers", "(", "green", ")", "co", "-", "stained", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", ".", "The", "lower", "-", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "DDX4", "expression", "(", "magenta", ")", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "The", "numbers", "written", "in", "the", "upper", "-", "left", "corner", "indicate", "the", "period", "of", "IVC", "(", "w", "-", "ivc", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "(", "F", ")", "Percentages", "of", "cells", "positive", "for", "individual", "markers", "among", "DDX4", "+", "germ", "cells", "from", "the", "IF", "of", "cy", "rOvaries", "at", "3", "-", "15", "w", "-", "ivc", "[", "3", "/", "6", "/", "9", "/", "12", "w", "-", "ivc", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "15", "w", "-", "ivc", "(", "n", "=", "3", "or", "4", ")", "]", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(E) IF analyses of key markers as described in Fig 1E in the cultured cy rOvaries. Germ cells and nuclei were marked with DDX4 (magenta) and DAPI (white), respectively. The upper-right magnified images of each panel show the expression of key markers (green) co-stained with DDX4 (magenta). The lower-right magnified images of each panel show DDX4 expression (magenta) co-stained with DAPI (white). The numbers written in the upper-left corner indicate the period of IVC (w-ivc). Scale bar = 20 μm. (F) Percentages of cells positive for individual markers among DDX4+ germ cells from the IF of cy rOvaries at 3-15 w-ivc [3/6/9/12 w-ivc (n=3), 15 w-ivc (n=3 or 4)]."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Gross", "appearance", "(", "a", ")", ",", "H", "&", "E", "staining", "(", "b", ")", ",", "and", "IF", "(", "c", ")", "for", "FOXL2", "/", "DDX4", "/", "DAPI", "of", "the", "human", "in", "vivo", "female", "gonads", "(", "11W", ",", "left", "column", ")", "and", "the", "cultured", "rOvaries", "at", "7", "and", "14", "w", "-", "ivc", ".", "FOXL2", ",", "granulosa", "cell", "marker", ";", "DDX4", ",", "germ", "cell", "marker", ";", "DAPI", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bars", "=", "1", "mm", "(", "a", ",", "left", ")", ",", "200", "μm", "(", "a", ",", "middle", "/", "right", ")", ",", "50", "μm", "(", "b", ")", ",", "and", "20", "μm", "(", "c", ")", ".", "g", ".", "a", ".", ",", "gestational", "age", ".", "IF", "for", "oogonia", "(", "POU5F1", ")", ",", "cell", "proliferation", "(", "Ki67", ")", ",", "meiotic", "(", "SYCP3", ",", "DMC1", ",", "γH2AX", ",", "SYCP1", ")", ",", "and", "oogenic", "(", "ZP3", ",", "TP63", ")", "markers", "for", "human", "in", "vivo", "female", "gonad", "(", "11W", ",", "B", ")", "Germ", "cells", "and", "nuclei", "were", "marked", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ",", "respectively", ".", "The", "upper", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "the", "expression", "of", "key", "markers", "(", "green", ")", "co", "-", "stained", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", ".", "The", "lower", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "DDX4", "expression", "(", "magenta", ")", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "IF", "for", "oogonia", "(", "POU5F1", ")", ",", "cell", "proliferation", "(", "Ki67", ")", ",", "meiotic", "(", "SYCP3", ",", "DMC1", ",", "γH2AX", ",", "SYCP1", ")", ",", "and", "oogenic", "(", "ZP3", ",", "TP63", ")", "markers", "human", "in", "vitro", "cultured", "rOvaries", "at", "14", "w", "-", "ivc", "(", "C", ")", ".", "Germ", "cells", "and", "nuclei", "were", "marked", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ",", "respectively", ".", "The", "upper", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "the", "expression", "of", "key", "markers", "(", "green", ")", "co", "-", "stained", "with", "DDX4", "(", "magenta", ")", ".", "The", "lower", "right", "magnified", "images", "of", "each", "panel", "show", "DDX4", "expression", "(", "magenta", ")", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "(", "D", ")", "Percentages", "of", "cells", "positive", "for", "individual", "markers", "among", "DDX4", "+", "germ", "cells", "from", "the", "IF", "of", "human", "in", "vivo", "female", "gonads", "(", "11W", ")", "and", "human", "cultured", "rOvaries", "at", "7", "and", "14", "w", "-", "ivc", ".", "The", "mean", "values", "from", "two", "biological", "replicates", "are", "shown", ".", "Analyses", "for", "human", "germ", "cells", "by", "SC3", "-", "seq", ".", "(", "E", ")", "UHC", "for", "human", "germ", "cells", "in", "vivo", "and", "in", "rOvaries", "with", "all", "expressed", "genes", "(", "20", ",", "048", "genes", ")", "and", "a", "heatmap", "of", "the", "expression", "levels", "of", "selected", "marker", "genes", ".", "Color", "bars", "under", "the", "dendrogram", "show", "the", "in", "vivo", "stage", "(", "1st", "bar", ")", ",", "the", "period", "of", "IVC", "(", "2nd", "bar", ")", ",", "and", "the", "cell", "type", "(", "3rd", "bar", ")", ".", "The", "heatmap", "color", "-", "coding", "is", "as", "indicated", ".", "The", "color", "coding", "in", "bars", "is", "as", "indicated", "in", "Fig", "5F", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Gross appearance (a), H&E staining (b), and IF (c) for FOXL2/DDX4/DAPI of the human in vivo female gonads (11W, left column) and the cultured rOvaries at 7 and 14 w-ivc. FOXL2, granulosa cell marker; DDX4, germ cell marker; DAPI, nucleus. Scale bars = 1 mm (a, left), 200 μm (a, middle/right), 50 μm (b), and 20 μm (c). g.a., gestational age.IF for oogonia (POU5F1), cell proliferation (Ki67), meiotic (SYCP3, DMC1, γH2AX, SYCP1), and oogenic (ZP3, TP63) markers for human in vivo female gonad (11W, B) Germ cells and nuclei were marked with DDX4 (magenta) and DAPI (white), respectively. The upper right magnified images of each panel show the expression of key markers (green) co-stained with DDX4 (magenta). The lower right magnified images of each panel show DDX4 expression (magenta) co-stained with DAPI (white).IF for oogonia (POU5F1), cell proliferation (Ki67), meiotic (SYCP3, DMC1, γH2AX, SYCP1), and oogenic (ZP3, TP63) markers human in vitro cultured rOvaries at 14 w-ivc (C). Germ cells and nuclei were marked with DDX4 (magenta) and DAPI (white), respectively. The upper right magnified images of each panel show the expression of key markers (green) co-stained with DDX4 (magenta). The lower right magnified images of each panel show DDX4 expression (magenta) co-stained with DAPI (white).(D) Percentages of cells positive for individual markers among DDX4+ germ cells from the IF of human in vivo female gonads (11W) and human cultured rOvaries at 7 and 14 w-ivc. The mean values from two biological replicates are shown.Analyses for human germ cells by SC3-seq. (E) UHC for human germ cells in vivo and in rOvaries with all expressed genes (20,048 genes) and a heatmap of the expression levels of selected marker genes. Color bars under the dendrogram show the in vivo stage (1st bar), the period of IVC (2nd bar), and the cell type (3rd bar). The heatmap color-coding is as indicated. The color coding in bars is as indicated in Fig 5F."}
{"words": ["Figure", "6Analyses", "performed", "by", "10X", "scRNA", "-", "seq", ".", "(", "A", ")", "UMAP", "plot", "of", "germ", "cells", "from", "six", "10X", "scRNA", "-", "seq", "datasets", "(", "two", "for", "humans", "[", "this", "study", "and", "(", "Chitiashvili", "et", "al", ".", ",", "2020", ")", "]", ",", "one", "for", "monkeys", "[", "this", "study", "]", ",", "and", "three", "for", "mice", "[", "(", "Ge", "et", "al", ".", ",", "2021", ",", "Niu", "&", "Spradling", ",", "2020", ",", "Zhao", "et", "al", ".", ",", "2020", ")", "]", ")", "integrated", "by", "CCA", ".", "Meiotic", "sub", "-", "stages", "were", "defined", "after", "CCA", "followed", "by", "Louvain", "clustering", ".", "Colors", "indicate", "the", "computationally", "assigned", "meiotic", "sub", "-", "stages", "defined", "by", "the", "expression", "levels", "of", "key", "meiotic", "markers", "conserved", "in", "all", "three", "species", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", ")", ".", "The", "color", "-", "coding", "is", "as", "indicated", ".", "M", ",", "mitotic", ";", "PL", ",", "pre", "-", "leptotene", ";", "L", ",", "leptotene", ";", "Z", ",", "zygotene", ";", "P", ",", "pachytene", ";", "D", ",", "diplotene", ".", "(", "B", ")", "The", "UMAP", "plot", "highlighting", "cells", "from", "each", "dataset", ".", "The", "color", "-", "coding", "for", "each", "developmental", "stage", "is", "as", "indicated", ".", "(", "I", ")", "IF", "analyses", "of", "CLGN", "with", "TP63", "(", "oogenic", "marker", ")", "and", "DDX4", "(", "germ", "cell", "marker", ")", "in", "a", "13", "-", "year", "-", "old", "human", "oocyte", "of", "a", "primordial", "follicle", ".", "Nuclear", "DAPI", "staining", "is", "shown", "in", "white", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Analyses performed by 10X scRNA-seq. (A) UMAP plot of germ cells from six 10X scRNA-seq datasets (two for humans [this study and (Chitiashvili et al., 2020)], one for monkeys [this study], and three for mice [(Ge et al., 2021, Niu & Spradling, 2020, Zhao et al., 2020)]) integrated by CCA. Meiotic sub-stages were defined after CCA followed by Louvain clustering. Colors indicate the computationally assigned meiotic sub-stages defined by the expression levels of key meiotic markers conserved in all three species (see Materials and Methods). The color-coding is as indicated. M, mitotic; PL, pre-leptotene; L, leptotene; Z, zygotene; P, pachytene; D, diplotene. (B) The UMAP plot highlighting cells from each dataset. The color-coding for each developmental stage is as indicated.(I) IF analyses of CLGN with TP63 (oogenic marker) and DDX4 (germ cell marker) in a 13-year-old human oocyte of a primordial follicle. Nuclear DAPI staining is shown in white."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "C", ")", "The", "Chr", ".", "10", ":", "A", "and", "X", ":", "A", "ratios", "(", "top", ")", ",", "and", "XIST", "expression", "(", "bottom", ")", "in", "human", "female", "germ", "cells", "in", "vivo", "and", "in", "cultured", "rOvaries", "analyzed", "by", "SC3", "-", "seq", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(C) The Chr.10:A and X:A ratios (top), and XIST expression (bottom) in human female germ cells in vivo and in cultured rOvaries analyzed by SC3-seq."}
{"words": ["Figure", "1A", "HeLa", "cells", "expressing", "LAMP1", "-", "RFP", "were", "treated", "with", "vehicle", "alone", "(", "control", ")", "or", "LLOMe", "for", "1", "h", "to", "induce", "lysosome", "damage", ".", "Cells", "were", "fixed", "2", "h", "after", "washout", ",", "stained", "with", "p62", "and", "galectin", "-", "3", "(", "Gal3", ")", "antibodies", ",", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "B", "p97", "translocates", "to", "ruptured", "lysosomes", ".", "Cells", "co", "-", "expressing", "LAMP1", "-", "RFP", "and", "GFP", "-", "p97", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "stained", "with", "the", "pan", "-", "ubiquitin", "antibody", "FK2", "(", "Ub", ")", ".", "Percentage", "of", "cells", "showing", "recruitment", "of", "p97", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "C", "Immunodetection", "of", "endogenous", "p97", "after", "LLOMe", "treatment", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Percentage", "of", "cells", "showing", "recruitment", "of", "p97", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "D", "Clearance", "of", "damaged", "lysosomes", "depends", "on", "p97", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "p97", "siRNA", "oligos", ",", "fixed", "at", "indicated", "time", "points", "after", "LLOMe", "washout", "and", "stained", "for", "endogenous", "Gal3", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Gal3", "-", "positive", "vesicles", "per", "cell", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "four", "independent", "experiments", "with", "≥", "30", "cells", "quantified", "per", "condition", "(", "one", "-", "sided", "Welch", "'", "s", "unequal", "variances", "t", "-", "tests", "comparing", "the", "siCtrl", "with", "sip97", ")", ".", "E", "Cells", "were", "chased", "after", "LLOMe", "treatment", "for", "12", "h", "with", "vehicle", "alone", "(", "DMSO", ")", ",", "bortezomib", "(", "Btz", ",", "10", "nM", ")", ",", "NH4Cl", "(", "20", "mM", ")", "or", "the", "p97", "inhibitor", "NMS", "-", "873", "(", "5", "µM", ")", ",", "and", "Gal3", "vesicles", "quantified", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "30", "cells", "quantified", "per", "condition", "(", "one", "-", "sided", "Welch", "'", "s", "t", "-", "tests", ")", ".", "F", "p97", "is", "essential", "for", "cell", "survival", "after", "lysosome", "rupture", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "p97", "or", "SEL1L", "siRNA", "oligos", "and", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "LLOMe", "for", "12", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "using", "the", "MTS", "assay", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "G", "Taufibrils", "are", "endocytosed", "and", "induce", "lysosomal", "damage", ".", "Taufibrils", "were", "generated", "in", "vitro", ",", "fluorescently", "labelled", "by", "Dylight488", "and", "fragmented", "by", "sonication", "(", "488", "-", "labelled", "tau", ")", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "mCherry", "-", "Gal3", "were", "incubated", "with", "300", "nM", "taufibrils", "for", "24", "h", ".", "Arrows", "indicate", "compartments", "that", "contain", "488", "-", "labelled", "tau", "and", "are", "positive", "for", "mCherry", "-", "Gal3", "indicating", "lysosome", "rupture", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", "Gal3", "-", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "H", "Accumulation", "of", "tau", "-", "induced", "lysosomal", "damage", "upon", "p97", "depletion", ".", "Cells", "transfected", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "or", "p97", "siRNA", "oligos", "were", "treated", "as", "in", "(", "G", ")", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", "Gal3", "-", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A HeLa cells expressing LAMP1-RFP were treated with vehicle alone (control) or LLOMe for 1 h to induce lysosome damage. Cells were fixed 2 h after washout, stained with p62 and galectin-3 (Gal3) antibodies, and analyzed by confocal microscopy.B p97 translocates to ruptured lysosomes. Cells co-expressing LAMP1-RFP and GFP-p97 were treated as in (A) and stained with the pan-ubiquitin antibody FK2 (Ub). Percentage of cells showing recruitment of p97 in three independent experiments (mean ± SD).C Immunodetection of endogenous p97 after LLOMe treatment as in (A). Percentage of cells showing recruitment of p97 in three independent experiments (mean ± SD).D Clearance of damaged lysosomes depends on p97. Cells were transfected with control (Ctrl) or p97 siRNA oligos, fixed at indicated time points after LLOMe washout and stained for endogenous Gal3. Quantification of the number of Gal3-positive vesicles per cell. Data represent mean ± SD of four independent experiments with ≥30 cells quantified per condition (one-sided Welch's unequal variances t-tests comparing the siCtrl with sip97).E Cells were chased after LLOMe treatment for 12 h with vehicle alone (DMSO), bortezomib (Btz, 10 nM), NH4Cl (20 mM) or the p97 inhibitor NMS-873 (5 µM), and Gal3 vesicles quantified. Data represent mean ± SEM of three independent experiments with ≥30 cells quantified per condition (one-sided Welch's t-tests).F p97 is essential for cell survival after lysosome rupture. Cells were transfected with control (Ctrl), p97 or SEL1L siRNA oligos and treated with indicated concentrations of LLOMe for 12 h. Cell viability was measured using the MTS assay. Data represent mean ± SD of three independent experiments.G Taufibrils are endocytosed and induce lysosomal damage. Taufibrils were generated in vitro, fluorescently labelled by Dylight488 and fragmented by sonication (488-labelled tau). HeLa cells expressing mCherry-Gal3 were incubated with 300 nM taufibrils for 24 h. Arrows indicate compartments that contain 488-labelled tau and are positive for mCherry-Gal3 indicating lysosome rupture. Percentage of cells with Gal3-positive vesicles was quantified from three independent experiments (mean ± SD).H Accumulation of tau-induced lysosomal damage upon p97 depletion. Cells transfected with control (Ctrl) or p97 siRNA oligos were treated as in (G). Percentage of cells with Gal3-positive vesicles was quantified from three independent experiments (mean ± SD). * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Impaired", "clearance", "of", "damaged", "lysosomes", "in", "cells", "expressing", "a", "p97", "disease", "-", "mutant", ".", "Wild", "-", "type", "and", "p97R155H", "/", "+", "MEFs", "were", "LLOMe", "-", "treated", "for", "1", "h", "and", "released", "for", "indicated", "times", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", "Gal3", "-", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ",", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "B", "Stable", "U2OS", "cell", "lines", "were", "doxycycline", "-", "induced", "to", "express", "myc", "-", "tagged", "p97", "wild", "-", "type", "or", "disease", "-", "mutants", "as", "indicated", ".", "Induced", "parental", "cells", "served", "as", "control", "(", "U2OS", "-", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "LLOMe", "for", "1h", "and", "chased", "for", "indicated", "time", "before", "fixation", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", "Gal3", "-", "positive", "vesicles", "was", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Comparable", "expression", "levels", "were", "verified", "(", "see", "Figure", "EV2A", ")", ".", "C", "Stable", "U2OS", "cell", "lines", "described", "in", "(", "B", ")", "were", "treated", "with", "LLOMe", "for", "1", "h", "and", "chased", "for", "indicated", "time", ".", "LC3", "and", "GAPDH", "levels", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "Quantification", "is", "shown", "in", "Figure", "EV2B", ".", "D", "Accumulation", "of", "damaged", "lysosomes", "in", "affected", "p97", "patient", "skeletal", "muscle", ".", "Patient", "biopsies", "immunostained", "for", "Gal3", "and", "caveolin", "-", "3", "(", "Cav3", ")", ".", "Quantification", "from", "4", "random", "10X", "fields", "for", "each", "biopsy", "and", "means", "for", "controls", "and", "patients", ",", "respectively", ".", "Patients", "carry", "p97", "mutations", "R155H", "(", "#", "1", "-", "3", ")", "or", "R93C", "for", "(", "#", "4", ")", ".", "Patients", "#", "2", "and", "#", "3", "are", "cousins", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Impaired clearance of damaged lysosomes in cells expressing a p97 disease-mutant. Wild-type and p97R155H/+MEFs were LLOMe-treated for 1 h and released for indicated times. Percentage of cells with Gal3-positive vesicles was quantified from three independent experiments (mean ± SD, Student's unpaired t-test). Scale bar, 25 µm.B Stable U2OS cell lines were doxycycline-induced to express myc-tagged p97 wild-type or disease-mutants as indicated. Induced parental cells served as control (U2OS -). Cells were treated with LLOMe for 1h and chased for indicated time before fixation. Percentage of cells with Gal3-positive vesicles was quantified from three independent experiments. Comparable expression levels were verified (see Figure EV2A).C Stable U2OS cell lines described in (B) were treated with LLOMe for 1 h and chased for indicated time. LC3 and GAPDH levels were analyzed by immunoblotting. Quantification is shown in Figure EV2B.D Accumulation of damaged lysosomes in affected p97 patient skeletal muscle. Patient biopsies immunostained for Gal3 and caveolin-3 (Cav3). Quantification from 4 random 10X fields for each biopsy and means for controls and patients, respectively. Patients carry p97 mutations R155H (#1-3) or R93C for (#4). Patients #2 and #3 are cousins. Scale bar, 100 µm."}
{"words": ["Figure", "3A", "Candidate", "screen", "for", "p97", "cofactors", "involved", "in", "autophagy", "of", "damaged", "lysosomes", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNA", "oligos", "and", "LLOMe", "-", "treated", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "chased", "for", "12", "h", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "Gal3", ".", "See", "Figure", "EV3", "for", "depletion", "efficiency", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "more", "than", "three", "Gal3", "vesicles", "per", "cell", "for", "each", "condition", ".", "This", "threshold", "was", "chosen", "so", "that", "less", "than", "1", "%", "of", "untreated", "cells", "were", "considered", "positive", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "≥", "30", "cells", "quantified", "per", "condition", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "sided", "Welch", "'", "s", "t", "-", "tests", ")", ".", "C", "YOD1", ",", "UBXD1", "and", "PLAA", "are", "translocated", "along", "with", "p97", "to", "ruptured", "lysosomes", ".", "Cells", "expressing", "indicated", "tagged", "proteins", "were", "LLOMe", "-", "treated", "for", "1", "h", "or", "with", "vehicle", "alone", "(", "control", ")", ",", "fixed", "2", "h", "after", "washout", ",", "and", "stained", "for", "endogenous", "LAMP1", "and", ",", "in", "the", "case", "of", "PLAA", ",", "with", "Alexa", "-", "488", "conjugated", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "See", "Figure", "EV3B", "for", "quantification", ".", "D", "An", "ATP", "-", "stabilized", "complex", "of", "p97", "containing", "both", "UBXD1", "and", "PLAA", ".", "Stable", "HEK293", "cell", "lines", "were", "doxycycline", "-", "induced", "to", "express", "p97", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", "or", "the", "ATPase", "-", "mutant", "E578Q", "(", "EQ", ")", "at", "near", "endogenous", "level", ".", "Endogenous", "UBXD1", "was", "immunoprecipitated", "and", "associated", "proteins", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Arrowheads", "indicate", "endogenous", "(", "lower", "band", ")", "and", "induced", "p97", "(", "upper", "band", ")", ".", "E", "Stable", "HEK293", "cells", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", "and", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "YOD1", "-", "wt", "or", "the", "YOD1", "-", "C160S", "catalytic", "mutant", "(", "CS", ")", "were", "processed", "for", "co", "-", "immunoprecipitation", "with", "GFP", "nanobodies", ".", "Asterisk", ",", "unspecific", "band", ".", "Note", "that", "the", "YOD1", "-", "CS", "mutant", "stabilized", "p97", "binding", "and", ",", "in", "the", "p97", "-", "EQ", "background", ",", "also", "associated", "with", "UBXD1", "and", "PLAA", ".", "F", "Control", "(", "IgG", ")", "and", "UBXD1co", "-", "immunoprecipitation", "with", "indicated", "associated", "proteins", "from", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "YOD1", "-", "CS", "after", "formaldehyde", "cross", "-", "linking", ".", "Ufd1", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Candidate screen for p97 cofactors involved in autophagy of damaged lysosomes. HeLa cells were transfected with indicated siRNA oligos and LLOMe-treated for 1 h. Cells were chased for 12 h, fixed and stained for Gal3. See Figure EV3 for depletion efficiency.B Quantification of the percentage of cells with more than three Gal3 vesicles per cell for each condition. This threshold was chosen so that less than 1% of untreated cells were considered positive. Data represent mean ± SEM of three independent experiments with ≥30 cells quantified per condition. * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001 (one-sided Welch's t-tests).C YOD1, UBXD1 and PLAA are translocated along with p97 to ruptured lysosomes. Cells expressing indicated tagged proteins were LLOMe-treated for 1 h or with vehicle alone (control), fixed 2 h after washout, and stained for endogenous LAMP1 and, in the case of PLAA, with Alexa-488 conjugated anti-HA antibodies. See Figure EV3B for quantification.D An ATP-stabilized complex of p97 containing both UBXD1 and PLAA. Stable HEK293 cell lines were doxycycline-induced to express p97 wild-type (wt) or the ATPase-mutant E578Q (EQ) at near endogenous level. Endogenous UBXD1 was immunoprecipitated and associated proteins detected by immunoblotting with indicated antibodies. Arrowheads indicate endogenous (lower band) and induced p97 (upper band).E Stable HEK293 cells treated as in (D) and transiently expressing GFP-tagged YOD1-wt or the YOD1-C160S catalytic mutant (CS) were processed for co-immunoprecipitation with GFP nanobodies. Asterisk, unspecific band. Note that the YOD1-CS mutant stabilized p97 binding and, in the p97-EQ background, also associated with UBXD1 and PLAA.F Control (IgG) and UBXD1co-immunoprecipitation with indicated associated proteins from HeLa cells expressing GFP-YOD1-CS after formaldehyde cross-linking. Ufd1 served as a negative control. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "4A", "K63", "-", "and", "K48", "-", "ubiquitination", "of", "damaged", "lysosomes", ".", "Untransfected", "HeLa", "cells", ",", "or", "cells", "expressing", "mCherry", "-", "Gal3", "(", "Ch", "-", "Gal3", ")", "were", "LLOMe", "-", "treated", "for", "1", "h", ".", "2", "h", "after", "washout", ",", "cells", "were", "stained", "with", "antibodies", "specific", "for", "K63", "or", "K48", "chains", ",", "and", "LAMP1", "or", "p62", "as", "indicated", ".", "Percentage", "of", "K63", "-", "or", "K48", "-", "ubiquitinated", "LAMP1", "vesicles", "and", "percentage", "of", "p62", "-", "positive", "K63", "or", "K48", "vesicles", "were", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SD", ",", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "for", "LAMP1", ")", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "B", "Colocalization", "of", "K63", "-", "and", "K48", "-", "linked", "ubiquitin", "conjugates", "on", "individual", "lysosomes", ".", "Cells", "expressing", "GFP", "-", "TAB2", "-", "NZF", "(", "K63", "-", "sensor", ")", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "stained", "for", "K48", "chains", "and", "LAMP1", ".", "Note", "that", "the", "apparent", "nuclear", "localization", "of", "the", "sensor", "is", "a", "consequence", "of", "the", "extraction", "procedure", "(", "van", "Wijk", "et", "al", ".", ",", "2012", ")", ".", "C", "Cells", "expressing", "GFP", "-", "p97", "-", "EQ", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "stained", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "total", "number", "of", "K63", "-", "or", "K48", "-", "ubiquitinated", "vesicles", "per", "cell", ",", "and", "number", "of", "p97", "-", "EQ", "positive", "K63", "-", "or", "K48", "-", "ubiquitinated", "vesicles", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "E", "Percentage", "of", "GFP", "-", "p97", "-", "EQ", "vesicles", "positive", "for", "K63", "or", "K48", "chains", "was", "determined", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "F", "ELDR", "components", "target", "K48", "-", "conjugates", "on", "lysosomes", ".", "Detection", "of", "GFP", "-", "YOD1", "-", "CS", "or", "UBXD1", "-", "GFP", "alone", ",", "or", "co", "-", "transfected", "with", "PLAA", "-", "HA", "and", "GFP", "-", "p97", "-", "EQ", ",", "2", "h", "after", "LLOMe", "washout", "and", "co", "-", "stained", "with", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A K63- and K48-ubiquitination of damaged lysosomes. Untransfected HeLa cells, or cells expressing mCherry-Gal3 (Ch-Gal3) were LLOMe-treated for 1 h. 2 h after washout, cells were stained with antibodies specific for K63 or K48 chains, and LAMP1 or p62 as indicated. Percentage of K63- or K48-ubiquitinated LAMP1 vesicles and percentage of p62-positive K63 or K48 vesicles were quantified from three independent experiments (mean ± SD, Student's unpaired t-test for LAMP1). * = p < 0.05.B Colocalization of K63- and K48-linked ubiquitin conjugates on individual lysosomes. Cells expressing GFP-TAB2-NZF (K63-sensor) were treated as in (A) and stained for K48 chains and LAMP1. Note that the apparent nuclear localization of the sensor is a consequence of the extraction procedure (van Wijk et al., 2012).C Cells expressing GFP-p97-EQ were treated as in (A) and stained with antibodies as indicated.D Quantification of the total number of K63- or K48-ubiquitinated vesicles per cell, and number of p97-EQ positive K63- or K48-ubiquitinated vesicles (mean ± SD).E Percentage of GFP-p97-EQ vesicles positive for K63 or K48 chains was determined (mean ± SD).F ELDR components target K48-conjugates on lysosomes. Detection of GFP-YOD1-CS or UBXD1-GFP alone, or co-transfected with PLAA-HA and GFP-p97-EQ, 2 h after LLOMe washout and co-stained with indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "5A", "Time", "course", "of", "K63", "-", "and", "K48", "-", "ubiquitination", ".", "Control", "-", "depleted", "cells", "were", "fixed", "at", "indicated", "time", "points", "after", "LLOMe", "washout", "and", "stained", "with", "chain", "-", "specific", "antibodies", "and", "LAMP1", ".", "Automated", "quantification", "of", "LAMP1", "vesicles", "positive", "for", "K63", "or", "K48", "chains", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "Depletion", "of", "p97", "or", "YOD1", "results", "in", "increase", "and", "persistence", "of", "K48", "chains", "on", "damaged", "lysosomes", ".", "Experiment", "and", "quantification", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "cells", "treated", "with", "p97", "or", "YOD1", "siRNA", "oligos", ".", "C", "The", "p97", "-", "EQ", "mutant", "stabilizes", "K48", "-", "conjugates", ".", "Lysosome", "damage", "was", "induced", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "tagged", "p97", "-", "wt", "or", "p97", "-", "EQ", ".", "Cells", "were", "chased", "after", "washout", "for", "12", "h", "and", "stained", "for", "K48", "chains", ".", "D", "Quantification", "of", "K48", "-", "positive", "lysosomes", "2", "h", "and", "12", "h", "after", "damage", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "The", "catalytically", "-", "inactive", "mutant", "of", "YOD1", "stabilizes", "K48", "-", "conjugates", ".", "Cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "tagged", "YOD1", "-", "wt", "or", "the", "YOD1", "-", "CS", "were", "treated", "and", "stained", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "F", "Quantification", "as", "in", "(", "D", ")", "of", "cells", "treated", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "ns", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Time course of K63- and K48-ubiquitination. Control-depleted cells were fixed at indicated time points after LLOMe washout and stained with chain-specific antibodies and LAMP1. Automated quantification of LAMP1 vesicles positive for K63 or K48 chains. Data represent mean ± SD of three independent experiments.B Depletion of p97 or YOD1 results in increase and persistence of K48 chains on damaged lysosomes. Experiment and quantification as in (A) in cells treated with p97 or YOD1 siRNA oligos.C The p97-EQ mutant stabilizes K48-conjugates. Lysosome damage was induced as in (A) in cells transfected with GFP-tagged p97-wt or p97-EQ. Cells were chased after washout for 12 h and stained for K48 chains.D Quantification of K48-positive lysosomes 2 h and 12 h after damage in cells treated as in (A). Data represent mean ± SD of three independent experiments.E The catalytically-inactive mutant of YOD1 stabilizes K48-conjugates. Cells transfected with GFP-tagged YOD1-wt or the YOD1-CS were treated and stained as in (C).F Quantification as in (D) of cells treated as in (E). ** = p < 0.01 *** = p < 0.001 (Student's unpaired t-test). ns, not significant. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", "YOD1", "can", "link", "p97", "to", "ubiquitin", ".", "Ubiquitin", "-", "GST", "(", "Ub", "-", "GST", ")", "or", "GST", "alone", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "purified", "proteins", "and", "isolated", ".", "Co", "-", "isolated", "proteins", "(", "pulldown", ")", "were", "detected", "in", "SDS", "-", "gels", ".", "Note", "binding", "of", "p97", "and", "YOD1", "to", "Ub", "-", "GST", "only", "in", "combination", ".", "B", "The", "S2", "site", "of", "YOD1", "is", "critical", "for", "ubiquitin", "binding", ".", "Experiments", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "indicated", "combinations", "of", "p97", "and", "YOD1", "-", "wt", "or", "the", "ubiquitin", "-", "binding", "mutant", ",", "MutS2", ".", "C", "Reconstitution", "of", "a", "complex", "of", "ELDR", "components", "on", "ubiquitin", ".", "Experiments", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "combinations", "of", "p97", "-", "wt", "or", "p97", "-", "EQ", ",", "YOD1", ",", "PLAA", "and", "UBXD1", "as", "indicated", ".", "Note", "that", "PLAA", "associates", "with", "p97", "and", "YOD1", "on", "ubiquitin", "only", "in", "the", "case", "of", "p97", "-", "EQ", ".", "D", "Translocation", "of", "YOD1", "to", "lysosomes", "depends", "on", "ubiquitin", "binding", "by", "the", "S2", "site", ".", "LLOMe", "-", "treated", "cells", "expressing", "GFP", "-", "YOD1", "-", "CS", "or", "the", "double", "mutant", "GFP", "-", "YOD1", "-", "CS", "-", "MutS2", "were", "chased", "for", "2", "h", "and", "stained", "for", "K48", "chains", "and", "LAMP1", ".", "Ratio", "of", "GFP", "signal", "on", "K48", "vesicles", "to", "GFP", "signal", "in", "the", "whole", "cell", "was", "determined", ".", "E", "The", "S2", "site", "is", "essential", "for", "K48", "-", "conjugate", "removal", ".", "GFP", "-", "YOD1", "-", "wt", "or", "GFP", "-", "YOD1", "-", "MutS2", "overexpressing", "cells", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", "were", "stained", "for", "K48", "chains", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "K48", "-", "positive", "vesicles", "per", "cell", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A YOD1 can link p97 to ubiquitin. Ubiquitin-GST (Ub-GST) or GST alone was incubated with the indicated purified proteins and isolated. Co-isolated proteins (pulldown) were detected in SDS-gels. Note binding of p97 and YOD1 to Ub-GST only in combination.B The S2 site of YOD1 is critical for ubiquitin binding. Experiments as in (A) with indicated combinations of p97 and YOD1-wt or the ubiquitin-binding mutant, MutS2.C Reconstitution of a complex of ELDR components on ubiquitin. Experiments as in (A) with combinations of p97-wt or p97-EQ, YOD1, PLAA and UBXD1 as indicated. Note that PLAA associates with p97 and YOD1 on ubiquitin only in the case of p97-EQ.D Translocation of YOD1 to lysosomes depends on ubiquitin binding by the S2 site. LLOMe-treated cells expressing GFP-YOD1-CS or the double mutant GFP-YOD1-CS-MutS2 were chased for 2 h and stained for K48 chains and LAMP1. Ratio of GFP signal on K48 vesicles to GFP signal in the whole cell was determined.E The S2 site is essential for K48-conjugate removal. GFP-YOD1-wt or GFP-YOD1-MutS2 overexpressing cells treated as in (D) were stained for K48 chains. Quantification of the number of K48-positive vesicles per cell. Data represent mean ± SD of three independent experiments. ** = p < 0.01 (Student's unpaired t-test). Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "Largely", "mutually", "exclusive", "localization", "of", "LC3", "and", "K48", "chains", ".", "GFP", "-", "LC3", "expressing", "HeLa", "cells", "were", "fixed", "2", "h", "after", "LLOMe", "washout", "and", "stained", "for", "endogenous", "LAMP1", "and", "K48", "or", "K63", "chains", ".", "Correlation", "coefficients", "were", "calculated", "for", "colocalization", "of", "LC3", "with", "K63", "or", "K48", ".", "The", "whiskers", "represent", "10th", "and", "90th", "percentile", ".", "Points", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "are", "drawn", "as", "individual", "dots", ".", "The", "single", "line", "indicates", "the", "median", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "-", "U", "test", ")", ".", "B", "Lipofectamine", "-", "coated", "latex", "beads", "damage", "lysosomes", "and", "induce", "their", "K48", "-", "ubiquitination", ".", "Cells", "expressing", "mCherry", "-", "Gal3", "were", "incubated", "with", "Lipofectamine", "-", "coated", "latex", "beads", "for", "3", "h", "and", "stained", "with", "K48", "chain", "-", "specific", "antibodies", ".", "C", "YOD1", "association", "and", "dissociation", "precedes", "LC3", "recruitment", ".", "Live", "cell", "video", "microscopy", "stills", "of", "cells", "co", "-", "expressing", "mCherry", "-", "YOD1", "-", "wt", "and", "GFP", "-", "LC3", "after", "treatment", "with", "Lipofectamine", "-", "coated", "latex", "beads", "for", "30", "min", "at", "2", "min", "image", "intervals", ".", "D", "Stabilization", "of", "K48", "-", "conjugates", "on", "lysosomes", "impairs", "recruitment", "of", "LC3", ".", "Cells", "expressing", "GFP", "-", "YOD1", "-", "CS", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "stained", "for", "LAMP1", "and", "p62", "or", "LC3", ".", "Percentage", "of", "GFP", "-", "YOD1", "vesicles", "positive", "for", "p62", "or", "LC3", "was", "determined", "(", "mean", "±", "SD", ")", ".", "E", "Depletion", "of", "ELDR", "components", "impairs", "LC3", "recruitment", "for", "autophagosome", "formation", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "p97", "or", "YOD1", "siRNA", "oligos", ",", "treated", "with", "LLOMe", ",", "fixed", "after", "12", "h", "chase", "and", "stained", "for", "endogenous", "LC3", "and", "K48", "chains", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "K48", "-", "positive", "vesicles", "per", "cell", "and", "number", "of", "LC3", "-", "positive", "K48", "vesicles", "per", "cell", "was", "determined", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Largely mutually exclusive localization of LC3 and K48 chains. GFP-LC3 expressing HeLa cells were fixed 2 h after LLOMe washout and stained for endogenous LAMP1 and K48 or K63 chains. Correlation coefficients were calculated for colocalization of LC3 with K63 or K48. The whiskers represent 10th and 90th percentile. Points below and above the whiskers are drawn as individual dots. The single line indicates the median. *** = p < 0.001 (Mann-Whitney-U test).B Lipofectamine-coated latex beads damage lysosomes and induce their K48-ubiquitination. Cells expressing mCherry-Gal3 were incubated with Lipofectamine-coated latex beads for 3 h and stained with K48 chain-specific antibodies.C YOD1 association and dissociation precedes LC3 recruitment. Live cell video microscopy stills of cells co-expressing mCherry-YOD1-wt and GFP-LC3 after treatment with Lipofectamine-coated latex beads for 30 min at 2 min image intervals.D Stabilization of K48-conjugates on lysosomes impairs recruitment of LC3. Cells expressing GFP-YOD1-CS were treated as in (A) and stained for LAMP1 and p62 or LC3. Percentage of GFP-YOD1 vesicles positive for p62 or LC3 was determined (mean ± SD).E Depletion of ELDR components impairs LC3 recruitment for autophagosome formation. Cells were transfected with control (Ctrl), p97 or YOD1 siRNA oligos, treated with LLOMe, fixed after 12 h chase and stained for endogenous LC3 and K48 chains. Quantification of the number of K48-positive vesicles per cell and number of LC3-positive K48 vesicles per cell was determined. Data represent mean ± SD of three independent experiments. Scale bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "or", "TFEB", "-", "S401A", "-", "FLAG", "treated", "with", "200", "μM", "NaAsO2", "or", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "for", "1", "h", ".", "Two", "different", "rabbit", "polyclonal", "antibodies", "raised", "against", "a", "TFEB", "-", "S401", "phospho", "-", "specific", "peptide", "were", "tested", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", ",", "TFEB", "-", "S3A", "/", "R4A", "-", "FLAG", "or", "TFEB", "-", "R245", "-", "247A", "-", "FLAG", "treated", "with", "200", "μM", "NaAsO2", "for", "1", "h", ".", "Immunoblots", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblot analysis of protein lysates from ARPE-19 cells expressing TFEB-WT-FLAG or TFEB-S401A-FLAG treated with 200 μM NaAsO2 or 250 nM Torin-1 for 1 h. Two different rabbit polyclonal antibodies raised against a TFEB-S401 phospho-specific peptide were tested.Immunoblot analysis of protein lysates from ARPE-19 cells expressing TFEB-WT-FLAG, TFEB-S3A/R4A-FLAG or TFEB-R245-247A-FLAG treated with 200 μM NaAsO2 for 1 h. Immunoblots are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "incubated", "with", "the", "indicated", "kinase", "inhibitors", "for", "1", "h", "prior", "to", "the", "addition", "of", "200", "μM", "NaAsO2", "for", "1", "h", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "ns", ")", "not", "significant", ",", "and", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "incubated", "with", "either", "200", "μM", "NaAsO2", "for", "1", "h", ",", "EBSS", "for", "4", "h", ",", "100", "ng", "/", "ml", "EGF", "for", "the", "indicated", "times", "or", "37", "μM", "Anisomycin", "for", "1", "h", ".", "Before", "the", "addition", "of", "EGF", "or", "Anisomycin", ",", "cells", "were", "serum", "starved", "for", "8", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "exposed", "to", "30J", "/", "m2", "of", "UV", "-", "C", "and", "allowed", "to", "recover", "in", "complete", "medium", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "p38", "MAPK", "inhibitor", "(", "20", "μM", ",", "SB203580", ")", "for", "1", "h", "before", "UV", "-", "C", "irradiation", "and", "allowed", "to", "recover", "for", "30", "min", "in", "the", "presence", "of", "the", "inhibitor", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "depleted", "of", "either", "p38", "MAPK", "(", "α", "+", "β", ")", "or", "JNK1", "or", "JNK2", "or", "JNK", "(", "1", "+", "2", ")", "and", "incubated", "with", "200", "μM", "NaAsO2", "for", "1", "h", ".", "Immunoblots", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "in", "vitro", "p38", "MAPK", "kinase", "assay", "using", "GST", "-", "TFEB", "-", "PRD", "as", "substrate", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "either", "recombinant", "human", "active", "p38α", "MAPK", "or", "ATP", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunoblot analysis of protein lysates from HeLa cells stably expressing TFEB-WT-FLAG incubated with the indicated kinase inhibitors for 1 h prior to the addition of 200 μM NaAsO2 for 1 h. Quantification of immunoblot data shown in (A). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (ns) not significant, and (****)p<0.0001 from three independent experiments. Data information: n = 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate).Immunoblot analysis of protein lysates from HeLa cells stably expressing TFEB-WT-FLAG incubated with either 200 μM NaAsO2 for 1 h, EBSS for 4 h, 100 ng/ml EGF for the indicated times or 37 μM Anisomycin for 1 h. Before the addition of EGF or Anisomycin, cells were serum starved for 8 h.Immunoblot analysis of protein lysates from HeLa cells stably expressing TFEB-WT-FLAG exposed to 30J/m2 of UV-C and allowed to recover in complete medium for the indicated times. Cells were incubated with p38 MAPK inhibitor (20 μM, SB203580) for 1 h before UV-C irradiation and allowed to recover for 30 min in the presence of the inhibitor.Immunoblot analysis of protein lysates from HeLa cells stably expressing TFEB-WT-FLAG depleted of either p38 MAPK (α+β) or JNK1 or JNK2 or JNK(1+2) and incubated with 200 μM NaAsO2 for 1 h. Immunoblots are representative of at least three independent experiments.Immunoblot analysis of in vitro p38 MAPK kinase assay using GST-TFEB-PRD as substrate in the presence or absence of either recombinant human active p38α MAPK or ATP. Quantification of immunoblot data shown in (F). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (*)p<0.05 from three independent experiments. Data information: n = 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate)."}
{"words": ["Figure", "3Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "Raw", "264", ".", "7", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "incubated", "with", "1μg", "/", "ml", "LPS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "Raw", "264", ".", "7", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "WT", "-", "FLAG", "incubated", "with", "either", "20", "μM", "SB203580", "or", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "for", "1", "h", "prior", "to", "the", "addition", "of", "1", "μg", "/", "ml", "LPS", "for", "30", "min", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "ns", ")", "not", "significant", ",", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "THP1", "cells", "incubated", "with", "1", "μg", "/", "ml", "LPS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "THP1", "cells", "incubated", "with", "either", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "20", "μM", "SB203580", "for", "1", "h", "prior", "to", "the", "addition", "of", "1μg", "/", "ml", "LPS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "THP1", "cells", "depleted", "of", "p38", "MAPK", "(", "α", ")", ",", "p38", "MAPK", "(", "β", ")", "or", "p38", "MAPK", "(", "α", "+", "β", ")", "and", "incubated", "with", "1", "μg", "/", "ml", "LPS", "for", "1", "h", ".", "Immunoblots", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblot analysis of protein lysates from Raw 264.7 cells stably expressing TFEB-WT-FLAG incubated with 1μg/ml LPS for the indicated times.Immunoblot analysis of protein lysates from Raw 264.7 cells stably expressing TFEB-WT-FLAG incubated with either 20 μM SB203580 or 250 nM Torin-1 for 1 h prior to the addition of 1 μg/ml LPS for 30 min.Quantification of immunoblot data shown in (B). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (ns) not significant, (*)p<0.05 and (**)p<0.01 from three independent experiments. Data information: n = 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate).Immunoblot analysis of protein lysates from THP1 cells incubated with 1 μg/ml LPS for the indicated times.Immunoblot analysis of protein lysates from THP1 cells incubated with either vehicle (DMSO) or 20 μM SB203580 for 1 h prior to the addition of 1μg/ml LPS for the indicated times.Immunoblot analysis of protein lysates from THP1 cells depleted of p38 MAPK (α), p38 MAPK (β) or p38 MAPK (α+β) and incubated with 1 μg/ml LPS for 1 h. Immunoblots are representative of at least three independent experiments. Quantification of immunoblot data shown in (F). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (*)p<0.05 from three independent experiments. Data information: n = 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate)."}
{"words": ["Figure", "4Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "naïve", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "in", "(", "clone", "M17", ")", "cells", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "PMA", "for", "the", "indicated", "times", ",", "PMA", "-", "differentiated", "THP1", "(", "Rested", ")", "cells", "treated", "without", "or", "with", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "for", "1", "h", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "proteins", "from", "nuclear", "and", "cytosolic", "fractions", "from", "naïve", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "ins", "(", "clones", "I11", "and", "M17", ")", "cells", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "PMA", "for", "the", "indicated", "times", "and", "PMA", "-", "differentiated", "THP1", "(", "Rested", ")", "cells", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "proteins", "from", "nuclear", "and", "cytosolic", "fractions", "from", "naïve", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "in", "(", "clone", "I11", ")", "cells", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "PMA", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "proteins", "from", "nuclear", "fractions", "from", "naïve", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "in", "(", "clone", "I11", ")", "cells", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "PMA", "or", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "for", "1", "h", ".", "Immunoblots", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblot analysis of protein lysates from naïve THP1-WT or TFEB-S401A knock-in (clone M17) cells treated with 50 ng/ml PMA for the indicated times, PMA-differentiated THP1 (Rested) cells treated without or with 250 nM Torin-1 for 1 h.Immunoblot analysis of proteins from nuclear and cytosolic fractions from naïve THP1-WT or TFEB-S401A knock-ins (clones I11 and M17) cells treated with 50 ng/ml PMA for the indicated times and PMA-differentiated THP1 (Rested) cells.Immunoblot analysis of proteins from nuclear and cytosolic fractions from naïve THP1-WT or TFEB-S401A knock-in (clone I11) cells treated with 50 ng/ml PMA for the indicated times.Immunoblot analysis of proteins from nuclear fractions from naïve THP1-WT or TFEB-S401A knock-in (clone I11) cells treated with 50 ng/ml PMA or 250 nM Torin-1 for 1 h. Immunoblots are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5Immunoblot", "analysis", "of", "proteins", "from", "nuclear", "and", "cytosolic", "fractions", "from", "naïve", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "in", "(", "clone", "I11", ")", "cells", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "PMA", "for", "6", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunoblot analysis of proteins from nuclear and cytosolic fractions from naïve THP1-WT or TFEB-S401A knock-in (clone I11) cells treated with 50 ng/ml PMA for 6 h."}
{"words": ["Figure", "6Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "and", "cell", "culture", "medium", "from", "PMA", "-", "differentiated", "(", "Rested", ")", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "ins", "(", "clones", "I11", "and", "M17", ")", "cells", "incubated", "with", "0", ".", "1", "μg", "/", "ml", "LPS", "for", "4", "h", "prior", "to", "the", "addition", "of", "15", "μM", "Nigericin", "for", "45", "min", ".", "C", "-", "F", ".", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "ns", ")", "not", "significant", ",", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "≥", " ", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", ".", "Fluorescence", "confocal", "microscopy", "of", "PMA", "-", "differentiated", "(", "Rested", ")", "THP1", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "S401A", "knock", "-", "ins", "(", "clones", "I11", "and", "M17", ")", "cells", "incubated", "with", "1", "μg", "/", "ml", "LPS", "for", "6", "h", "prior", "to", "the", "detection", "of", "dead", "cells", "with", "LIVE", "/", "DEAD", "fixable", "blue", "dead", "cell", "stain", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "dead", "cells", "shown", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "unpaired", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "(", "ns", ")", "not", "significant", "and", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "as", "compared", "to", "their", "corresponding", "untreated", "(", "Control", ")", "cells", ",", "with", ">", "200", "cells", "counted", "per", "trial", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "n", " ", "≥", " ", "3", "biological", "replicates", "(", "each", "dot", "represents", "a", "biological", "replicate", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immunoblot analysis of protein lysates and cell culture medium from PMA-differentiated (Rested) THP1-WT or TFEB-S401A knock-ins (clones I11 and M17) cells incubated with 0.1 μg/ml LPS for 4 h prior to the addition of 15 μM Nigericin for 45 min. C-F. Quantification of immunoblot data shown in (B). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (ns) not significant, (*)p<0.05, (**)p<0.01, (***)p< 0.001 and (****)p< 0.0001 from three independent experiments. Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate).Fluorescence confocal microscopy of PMA-differentiated (Rested) THP1-WT or TFEB-S401A knock-ins (clones I11 and M17) cells incubated with 1 μg/ml LPS for 6 h prior to the detection of dead cells with LIVE/DEAD fixable blue dead cell stain. Scale bars, 10 μm. Quantification of the percentage of dead cells shown in (G). Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (unpaired) followed by Tukey's multiple comparisons test, (ns) not significant and (****)p< 0.0001 as compared to their corresponding untreated (Control) cells, with >200 cells counted per trial from three independent experiments. Data information: n ≥ 3 biological replicates (each dot represents a biological replicate)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Blood", "-", "stage", "growth", "rate", "of", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", "in", "comparison", "to", "wild", "type", ".", "Data", "points", "represent", "parasites", "growing", "in", "individual", "mice", ",", "n", "indicates", "total", "number", ".", "P", "-", "value", "is", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "B", ".", "Gametocyte", "to", "ookinete", "conversion", "of", "3", "biological", "replicates", ".", "P", "-", "value", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "C", ".", "Average", "speed", "of", "moving", "ookinetes", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "ookinetes", ",", "n", "indicates", "total", "number", "of", "cells", "from", "3", "biological", "replicates", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunns", "multiple", "comparison", ".", "D", ".", "Ookinete", "images", "of", "wild", "type", "and", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", "revealing", "similar", "cell", "shapes", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ".", "E", ".", "Oocyst", "development", "of", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "midguts", "observed", "between", "d12", "-", "17", "post", "infection", "from", "3", "independent", "cage", "feeds", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunns", "multiple", "comparison", ".", "F", ".", "Mosquito", "infections", "resulted", "in", "deformed", "sporozoites", "in", "the", "salivary", "gland", ".", "Shown", "are", "example", "images", "of", "different", "sporozoites", "arranged", "to", "illustrate", "their", "rounding", "up", "over", "time", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "sporozoite", "rounding", "up", "over", "time", "in", "the", "midgut", "(", "MG", ")", "the", "haemolymph", "(", "HL", ")", "and", "salivary", "gland", "(", "SG", ")", "at", "the", "indicated", "days", "post", "infection", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "Sporozoites", "were", "classified", "as", "either", "normal", ",", "deformed", "or", "round", "as", "illustrated", "in", "F", ".", "H", ".", "Average", "speed", "of", "salivary", "gland", "sporozoites", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "sporozoites", ",", "n", "indicates", "total", "number", "from", "3", "biological", "replicates", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "the", "Dunns", "multiple", "comparison", "test", ".", "I", ".", "Selected", "trajectories", "of", "manually", "tracked", "sporozoites", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Blood-stage growth rate of concavin(-) parasites in comparison to wild type. Data points represent parasites growing in individual mice, n indicates total number. P-value is calculated using the Mann Whitney test. Shown is the mean ± SEM.B. Gametocyte to ookinete conversion of 3 biological replicates. P-value calculated using the Mann Whitney test. Shown is the mean ± SEM. C. Average speed of moving ookinetes. Data points represent individual ookinetes, n indicates total number of cells from 3 biological replicates. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by Dunns multiple comparison. D. Ookinete images of wild type and concavin(-) parasites revealing similar cell shapes. Scale bar 5 µm.E. Oocyst development of concavin(-) parasites compared to wild type. Data points represent individual midguts observed between d12-17 post infection from 3 independent cage feeds. Shown is the mean ± SEM. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by Dunns multiple comparison.F. Mosquito infections resulted in deformed sporozoites in the salivary gland. Shown are example images of different sporozoites arranged to illustrate their rounding up over time. G. Quantification of sporozoite rounding up over time in the midgut (MG) the haemolymph (HL) and salivary gland (SG) at the indicated days post infection from three biological replicates. Sporozoites were classified as either normal, deformed or round as illustrated in F.H. Average speed of salivary gland sporozoites. Data points represent individual sporozoites, n indicates total number from 3 biological replicates. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by the Dunns multiple comparison test.I. Selected trajectories of manually tracked sporozoites."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Oocyst", "development", "of", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", "complemented", "with", "either", "the", "P", ".", "berghei", "gene", "or", "the", "P", ".", "falciparum", "orthologue", "fused", "to", "GFP", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "midguts", "observed", "between", "d12", "-", "17", "post", "infection", "of", "3", "independent", "cage", "feeds", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "the", "Dunns", "multiple", "comparison", "test", ".", "B", ".", "Average", "speed", "of", "salivary", "gland", "sporozoites", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "sporozoites", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "the", "Dunns", "multiple", "comparison", "test", ".", "C", ".", "Sum", "table", "of", "mosquito", "infections", "of", "wild", "type", ",", "concavin", "(", "-", ")", "and", "complemented", "lines", "expressing", "either", "P", ".", "berghei", "(", "Pb", ")", "or", "P", ".", "falciparum", "(", "Pf", ")", "concavin", "-", "GFP", ".", "Numbers", "determined", "on", "d17", "post", "mosquito", "infection", ".", "Infection", "rate", "contains", "3", "different", "countings", "of", "at", "least", "20", "mosquitoes", "from", "different", "mosquito", "infections", ".", "Note", "the", "difference", "of", "normally", "shaped", "and", "total", "sporozoites", "for", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", ".", "Images", "show", "infection", "of", "salivary", "glands", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmD", ".", "Pb", "concavin", "-", "GFP", "and", "Pf", "concavin", "-", "GFP", "localization", "in", "blood", "and", "mosquito", "stages", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "E", ".", "Localization", "of", "P", ".", "berghei", "concavin", "-", "GFP", "in", "liver", "stages", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "F", ".", "Immunofluorescence", "images", "of", "permeabilized", "and", "unpermeabilized", "concavin", "-", "GFP", "expressing", "salivary", "gland", "sporozoites", "stained", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "Note", "that", "a", "GFP", "signal", "could", "only", "be", "detected", "after", "permeabilization", ",", "excluding", "concavin", "localization", "on", "the", "parasite", "surface", "as", "illustrated", "in", "the", "model", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Oocyst development of concavin(-) parasites complemented with either the P. berghei gene or the P. falciparum orthologue fused to GFP. Data points represent individual midguts observed between d12-17 post infection of 3 independent cage feeds. Shown is the mean ± SEM. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by the Dunns multiple comparison test.B. Average speed of salivary gland sporozoites. Data points represent individual sporozoites of 3 independent biological replicates. Shown is the mean ± SEM. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by the Dunns multiple comparison test.C. Sum table of mosquito infections of wild type, concavin(-) and complemented lines expressing either P. berghei (Pb) or P. falciparum (Pf) concavin-GFP. Numbers determined on d17 post mosquito infection. Infection rate contains 3 different countings of at least 20 mosquitoes from different mosquito infections. Note the difference of normally shaped and total sporozoites for concavin(-) parasites. Images show infection of salivary glands. Scale bar: 100 µmD. Pb concavin-GFP and Pf concavin-GFP localization in blood and mosquito stages. Nuclei (blue) stained with Hoechst. Scale bar: 5 µm.E. Localization of P. berghei concavin-GFP in liver stages. Nuclei (blue) stained with Hoechst. Scale bar: 5 µm.F. Immunofluorescence images of permeabilized and unpermeabilized concavin-GFP expressing salivary gland sporozoites stained with an anti-GFP antibody. Note that a GFP signal could only be detected after permeabilization, excluding concavin localization on the parasite surface as illustrated in the model. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "Time", "series", "of", "concavin", "-", "GFP", "(", "A", ")", "PhiL1", "-", "GFP", "(", "B", ")", "sporozoites", "before", "and", "after", "bleaching", "and", "quantification", "of", "the", "fluorescence", "signal", "over", "time", "of", "3", "technical", "replicates", ".", "*", "indicates", "time", "of", "bleaching", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SD", ".", "C", ".", "Super", "resolution", "(", "STED", ")", "imaging", "of", "PhiL1", "-", "GFP", "and", "CSP", "as", "well", "as", "concavin", "-", "GFP", "and", "CSP", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "in", "combination", "with", "Atto", "-", "594", "(", "green", ")", "in", "addition", "to", "an", "anti", "-", "CSP", "staining", "in", "combination", "with", "Atto", "-", "647", ".", "Images", "were", "deconvolved", "using", "the", "Richardson", "-", "Lucy", "algorithm", ".", "The", "distance", "between", "the", "2", "signal", "peaks", "was", "measured", "using", "the", "plot", "profile", "of", "the", "respective", "channels", "in", "Fiji", ".", "Data", "points", "represent", "distance", "in", "individual", "sporozoites", "at", "the", "center", "of", "the", "cell", "from", "2", "independent", "biological", "replicates", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "the", "Dunns", "multiple", "comparison", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "µm", ".", "D", ".", "Localization", "of", "PhiL1", "-", "GFP", "(", "green", ")", "in", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ".", "E", ".", "Localization", "of", "SiR", "-", "Tubulin", "(", "red", ")", "in", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ".", "F", ".", "Localization", "of", "CSP", "(", "red", ")", "in", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", ".", "Nuclei", "(", "blue", ")", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "in", "D", "-", "F", "indicate", "apical", "part", "of", "the", "sporozoite", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. Time series of concavin-GFP (A) PhiL1-GFP (B) sporozoites before and after bleaching and quantification of the fluorescence signal over time of 3 technical replicates. * indicates time of bleaching. Shown is the mean ± SD.C. Super resolution (STED) imaging of PhiL1-GFP and CSP as well as concavin-GFP and CSP. Cells were stained with an anti-GFP antibody in combination with Atto-594 (green) in addition to an anti-CSP staining in combination with Atto-647. Images were deconvolved using the Richardson-Lucy algorithm. The distance between the 2 signal peaks was measured using the plot profile of the respective channels in Fiji. Data points represent distance in individual sporozoites at the center of the cell from 2 independent biological replicates. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by the Dunns multiple comparison test. Scale bar: 1 µm.D. Localization of PhiL1-GFP (green) in concavin(-) parasites. Nuclei (blue) stained with Hoechst. Scale bar 5 µm. E. Localization of SiR-Tubulin (red) in concavin(-) parasites. Nuclei (blue) stained with Hoechst. Scale bar 5 µm. F. Localization of CSP (red) in concavin(-) parasites. Nuclei (blue) stained with Hoechst. Scale bar 5 µm. Data information: Asterisks in D-F indicate apical part of the sporozoite."}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Expression", "and", "localization", "of", "concavinC7A", "-", "GFP", "in", "blood", "stage", "parasites", ".", "Scale", "bar", "5", "µm", ".", "C", ".", "Oocysts", "number", "in", "infected", "mosquitoes", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "midguts", "observed", "between", "d12", "-", "17", "post", "infection", "of", "3", "independent", "cage", "feeds", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "value", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "concavinC7A", "-", "GFP", "cell", "shapes", "at", "the", "indicated", "days", "from", "midgut", "(", "MG", ")", "or", "salivary", "gland", "(", "SG", ")", "derived", "sporozoites", ".", "Numbers", "above", "bars", "indicate", "investigated", "sporozoites", ".", "E", ".", "Average", "speed", "of", "salivary", "gland", "sporozoites", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "sporozoites", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Kruskal", "Wallis", "test", "followed", "by", "the", "Dunns", "multiple", "comparison", "test", ".", "F", ".", "Localization", "of", "concavinC7A", "-", "GFP", "in", "normal", "and", "deformed", "sporozoites", "(", "arrowheads", "point", "to", "deformations", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Expression and localization of concavinC7A-GFP in blood stage parasites. Scale bar 5 µm.C. Oocysts number in infected mosquitoes. Data points represent individual midguts observed between d12-17 post infection of 3 independent cage feeds. Shown is the mean ± SEM. P-value calculated using the Mann Whitney test.D. Quantification of concavinC7A-GFP cell shapes at the indicated days from midgut (MG) or salivary gland (SG) derived sporozoites. Numbers above bars indicate investigated sporozoites.E. Average speed of salivary gland sporozoites. Data points represent individual sporozoites from 3 independent biological replicates. Shown is the mean ± SEM. P-values are calculated using the Kruskal Wallis test followed by the Dunns multiple comparison test.F. Localization of concavinC7A-GFP in normal and deformed sporozoites (arrowheads point to deformations). Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Growth", "curve", "of", "blood", "stage", "parasites", "in", "C57BL", "/", "6", "mice", "infected", "by", "the", "bite", "of", "10", "mosquitoes", "(", "left", ")", "or", "10", ".", "000", "sporozoites", "intra", "venously", "(", "right", ")", "at", "two", "different", "times", "post", "mosquito", "infection", "as", "indicated", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mice", "infected", "with", "Concavin", "(", "-", ")", "parasites", "by", "bite", "represent", "2", "independent", "biological", "replicates", "with", "3", "mice", "each", ".", "Wild", "type", "bite", "back", "and", "Concavin", "(", "-", ")", "intra", "venous", "injections", "represent", "one", "biological", "replicate", "using", "3", "or", "4", "mice", "respectively", ".", "C", ".", "Liver", "cell", "invasion", "assay", "of", "concavin", "-", "gfp", "and", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", ".", "Parasites", "are", "positively", "stained", "for", "CSP", "in", "case", "they", "remain", "extracellular", ".", "Both", ",", "normal", "and", "deformed", "parasites", "were", "detected", "intracellularly", ".", "Graph", "shows", "quantification", "of", "CSP", "positive", "(", "red", ",", "hence", "extracellular", ")", "and", "negative", "(", "grey", ",", "hence", "intracellular", ")", "sporozoites", ".", "Small", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "deformed", "and", "normally", "shaped", "intracellular", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", ".", "Data", "points", "represent", "the", "4", "individual", "biological", "replicates", "with", "n", "indicating", "the", "numbers", "of", "sporozoites", "observed", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "D", ".", "Liver", "-", "stage", "development", "of", "concavin", "(", "-", ")", "parasites", "compared", "to", "wildtype", ",", "both", "expressing", "cytoplasmic", "GFP", "(", "white", ")", ".", "Parasite", "size", "was", "measured", "24h", "and", "48h", "post", "infection", ".", "Data", "points", "represent", "individual", "parasites", "from", "4", "independent", "biological", "replicates", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "P", "-", "values", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "E", ".", "Sporozoite", "ejection", "of", "immobilized", "concavin", "(", "-", ")", "infected", "mosquitoes", "on", "glass", "slides", "and", "quantification", "of", "ejected", "sporozoites", "from", "20", "mosquitoes", ".", "*", "indicates", "individual", "sporozoites", "in", "the", "ejected", "saliva", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "F", ",", "G", ".", "Only", "normally", "shaped", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", "released", "by", "salivary", "glands", "move", "on", "helical", "paths", "(", "arrows", ")", "through", "polyacrylamide", "gels", "that", "mimic", "the", "skin", "(", "F", ")", ".", "Quantification", "of", "two", "individual", "experiments", "Scale", "bar", "10", "µm", ".", "(", "G", ")", ":", "only", "normal", "shaped", "sporozoites", "were", "able", "to", "migrate", "through", "the", "gel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Growth curve of blood stage parasites in C57BL/6 mice infected by the bite of 10 mosquitoes (left) or 10.000 sporozoites intra venously (right) at two different times post mosquito infection as indicated. Shown is the mean ± SEM. Mice infected with Concavin(-) parasites by bite represent 2 independent biological replicates with 3 mice each. Wild type bite back and Concavin(-) intra venous injections represent one biological replicate using 3 or 4 mice respectively.C. Liver cell invasion assay of concavin-gfp and concavin(-) parasites. Parasites are positively stained for CSP in case they remain extracellular. Both, normal and deformed parasites were detected intracellularly. Graph shows quantification of CSP positive (red, hence extracellular) and negative (grey, hence intracellular) sporozoites. Small graph shows the percentage of deformed and normally shaped intracellular concavin(-) sporozoites. Data points represent the 4 individual biological replicates with n indicating the numbers of sporozoites observed. Shown is the mean ± SEM. P-values are calculated using the Mann Whitney test. Scale bar: 5 µm.D. Liver-stage development of concavin(-) parasites compared to wildtype, both expressing cytoplasmic GFP (white). Parasite size was measured 24h and 48h post infection. Data points represent individual parasites from 4 independent biological replicates. Shown is the mean ± SEM. P-values calculated using the Mann Whitney test. Scale bar: 5 µm.E. Sporozoite ejection of immobilized concavin(-) infected mosquitoes on glass slides and quantification of ejected sporozoites from 20 mosquitoes. * indicates individual sporozoites in the ejected saliva. Scale bar: 10 µm.F, G. Only normally shaped concavin(-) sporozoites released by salivary glands move on helical paths (arrows) through polyacrylamide gels that mimic the skin (F). Quantification of two individual experiments Scale bar 10 µm. (G): only normal shaped sporozoites were able to migrate through the gel."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Percentage", "of", "mosquitoes", "depositing", "WT", "or", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", "in", "the", "skin", "of", "a", "mouse", "during", "a", "bite", "(", "left", ")", "and", "sporozoites", "deposited", "during", "a", "mosquito", "bite", "(", "right", ")", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Fishers", "exact", "test", "(", "left", ")", "and", "the", "Mann", "Whitney", "test", "(", "right", ")", ".", "Bite", "transmission", "experiments", "were", "repeated", "over", "3", "independent", "mosquito", "infections", "for", "the", "KO", "and", "2", "independent", "mosquito", "infections", "for", "the", "WT", ".", "For", "each", "mosquito", "infection", "2", "-", "3", "mice", "were", "imaged", ",", "for", "a", "total", "of", "3", "-", "5", "ears", ".", "B", ".", "Maximum", "fluorescence", "intensity", "projections", "encoded", "by", "color", "for", "time", "from", "movies", "showing", "migrating", "sporozoites", "after", "mosquito", "-", "bite", "transmission", ".", "Graphs", "and", "camembert", "diagrams", "below", "show", "fraction", "of", "motile", "and", "immotile", "sporozoites", "after", "10", ",", "20", "and", "30", "minutes", "of", "recording", ",", "numbers", "analysed", "as", "well", "as", "sporozoite", "speed", ".", "Pooled", "data", "from", "4", "-", "5", "WT", "or", "5", "-", "8", "concavin", "(", "-", ")", "bite", "sites", "per", "time", "point", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Mann", "Whitney", "test", ".", "C", ".", "Motile", "WT", "or", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", "entering", "blood", "vessels", "during", "the", "first", "hour", "following", "micro", "-", "injection", ".", "Number", "above", "bars", "shows", "numbers", "of", "sporozoites", "observed", ".", "Pooled", "data", "from", "four", "WT", "or", "five", "concavin", "(", "-", ")", "experiments", ".", "P", "-", "values", "are", "calculated", "using", "the", "Fishers", "exact", "test", ".", "D", ",", "E", "(", "D", ")", "Deformation", "and", "(", "E", ")", "disintegration", "of", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", "migrating", "in", "the", "skin", ".", "Individual", "images", "corresponding", "to", "the", "frames", "shown", "on", "the", "right", "are", "indicated", "in", "distinct", "colours", "in", "the", "maximum", "projection", "(", "left", ")", "of", "13", "-", "min", "movies", ".", "Arrowheads", "indicate", "constrictions", "of", "the", "parasites", ".", "Graphs", "below", "time", "-", "lapse", "show", "that", "deformation", "and", "disintegration", "are", "preceded", "by", "a", "decrease", "in", "speed", ".", "Color", "of", "dots", "correspond", "to", "the", "time", "-", "points", "displayed", "in", "the", "time", "-", "lapse", "images", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "F", ".", "Percentage", "of", "deformation", "and", "disintegration", "events", "observed", "in", "54", "WT", "and", "57", "concavin", "(", "-", ")", "sporozoites", "that", "were", "tracked", "for", "at", "least", "10", "min", ".", "Pooled", "data", "from", "5", "WT", "or", "10", "concavin", "(", "-", ")", "bite", "sites", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Percentage of mosquitoes depositing WT or concavin(-) sporozoites in the skin of a mouse during a bite (left) and sporozoites deposited during a mosquito bite (right). P-values are calculated using the Fishers exact test (left) and the Mann Whitney test (right). Bite transmission experiments were repeated over 3 independent mosquito infections for the KO and 2 independent mosquito infections for the WT. For each mosquito infection 2-3 mice were imaged, for a total of 3-5 ears.B. Maximum fluorescence intensity projections encoded by color for time from movies showing migrating sporozoites after mosquito-bite transmission. Graphs and camembert diagrams below show fraction of motile and immotile sporozoites after 10, 20 and 30 minutes of recording, numbers analysed as well as sporozoite speed. Pooled data from 4-5 WT or 5-8 concavin (-) bite sites per time point. Scale bar: 50 µm. P-values are calculated using the Mann Whitney test.C. Motile WT or concavin(-) sporozoites entering blood vessels during the first hour following micro-injection. Number above bars shows numbers of sporozoites observed. Pooled data from four WT or five concavin(-) experiments. P-values are calculated using the Fishers exact test.D, E (D) Deformation and (E) disintegration of concavin(-) sporozoites migrating in the skin. Individual images corresponding to the frames shown on the right are indicated in distinct colours in the maximum projection (left) of 13-min movies. Arrowheads indicate constrictions of the parasites. Graphs below time-lapse show that deformation and disintegration are preceded by a decrease in speed. Color of dots correspond to the time-points displayed in the time-lapse images. Scale bars: 10 µm.F. Percentage of deformation and disintegration events observed in 54 WT and 57 concavin(-) sporozoites that were tracked for at least 10 min. Pooled data from 5 WT or 10 concavin(-) bite sites."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Same", "as", "in", "A", ",", "with", "the", "exception", "that", "cells", "expressing", "flag", "-", "praja2rm", "or", "praja2", "deletion", "mutants", "(", "praja21", "-", "530", ",", "praja21", "-", "630", "and", "praja2Δ530", "-", "630", ")", "were", "included", "in", "the", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Same as in A, with the exception that cells expressing flag-praja2rm or praja2 deletion mutants (praja21-530, praja21-630 and praja2Δ530-630) were included in the analysis."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "MST", "signal", "(", "normalized", "fluorescence", ")", "of", "P1", "(", "red", "curve", ")", ",", "P2", "(", "green", "curve", ")", "and", "P3", "(", "cyan", "curve", ")", "plotted", "against", "TBC1D31", ",", "at", "increasing", "concentrations", "of", "peptides", ".", "The", "threading", "modelled", "structure", "of", "the", "overlapping", "binding", "segment", "of", "praja2", "(", "praja2550", "-", "570", ")", "is", "shown", ".", "F", ".", "MST", "signal", "of", "P1", "plotted", "against", "increasing", "concentrations", "of", "TBC1D31", "peptides", ":", "wild", "-", "type", "(", "red", "curve", ")", ",", "R948A", "-", "R951A", "(", "violet", "curve", ")", "and", "R957", "-", "R959D", "-", "H960A", "(", "orange", "curve", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. MST signal (normalized fluorescence) of P1 (red curve), P2 (green curve) and P3 (cyan curve) plotted against TBC1D31, at increasing concentrations of peptides. The threading modelled structure of the overlapping binding segment of praja2 (praja2550-570) is shown.F. MST signal of P1 plotted against increasing concentrations of TBC1D31 peptides: wild-type (red curve), R948A-R951A (violet curve) and R957-R959D-H960A (orange curve)."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Total", "lysates", "from", "mouse", "brain", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "TBC1D31", "antibodies", "or", "with", "control", "IgG", ".", "The", "precipitates", "and", "an", "aliquot", "of", "lysates", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Total lysates from mouse brain were immunoprecipitated with anti-TBC1D31 antibodies or with control IgG. The precipitates and an aliquot of lysates were immunoblotted with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "4E", ".", "Same", "as", "in", "C", ",", "with", "the", "exception", "that", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "flag", "-", "OFD1", "vector", "and", "with", "control", "siRNA", "(", "siCNT", ")", "or", "siRNA", "targeting", "praja2", ".", "F", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "E", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ".", "G"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4E. Same as in C, with the exception that cells were co-transfected with flag-OFD1 vector and with control siRNA (siCNT) or siRNA targeting praja2. F. Quantitative analysis of the experiments shown in E. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test, *p<0,05. G "}
{"words": ["Figure", "5C", ".", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "siRNAs", "were", "serum", "deprived", ",", "pre", "-", "treated", "with", "cycloheximide", "and", "stimulated", "with", "FSK", "at", "different", "time", "point", ".", "Lysates", "were", "immunoblotted", "for", "endogenous", "praja2", "and", "OFD1", ".", "Hsp90", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "D", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "C", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ";", "*", "*", "<", "0", ",", "01", "versus", "sipraja2", "(", "+", "FSK", ")", "and", "basal", "values", "(", "0", ")", ".", "E", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "E97G", "mutant", "in", "HEK293", "cells", "stimulated", "with", "FSK", "as", "in", "C", ".", "I", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "H", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ",", "05", "versus", "E97G", "mutant", "(", "+", "FSK", ")", "and", "basal", "values", "(", "0", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C. HEK293 cells transfected with siRNAs were serum deprived, pre-treated with cycloheximide and stimulated with FSK at different time point. Lysates were immunoblotted for endogenous praja2 and OFD1. Hsp90 was used as loading control. D. Quantitative analysis of the experiments shown in C. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test * p<0,05; **<0,01 versus sipraja2 (+FSK) and basal values (0). E H. Immunoblot analysis of flag-OFD1 or flag-E97G mutant in HEK293 cells stimulated with FSK as in C. I. Quantitative analysis of the experiments shown in H. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Student's t test, *p<0,05 versus E97G mutant (+FSK) and basal values (0). "}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "siRNA", "transfected", "HEK293", "cells", "were", "serum", "deprived", "and", "stained", "for", "acetylated", "-", "tubulin", ",", "TBC1D31", "and", "DRAQ5", ".", "B", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "A", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "p", "<", "0", ",", "05", ".", "C", "C", ".", "HEK293", "cells", "expressing", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "serum", "deprived", "and", "subjected", "to", "staining", "analysis", "for", "acetylated", "α", "-", "tubulin", ",", "flag", "and", "DRAQ5", ".", "Images", "were", "collected", "by", "super", "-", "resolution", "microscopy", "(", "upper", "panels", ")", ".", "Where", "indicated", ",", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "was", "co", "-", "transfected", "with", "cilia", "-", "APEX", "-", "GFP", "vector", "(", "middle", "panels", ")", ".", "NIH3T3", "expressing", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "stained", "with", "anti", "-", "ARL13B", "and", "anti", "-", "flag", "antibodies", ".", "D", ",", "E", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "D", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "For", "each", "experimental", "group", ",", "a", "minimum", "of", "40", "cilia", "were", "analyzed", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ",", "001", ".", "F", "F", ".", "HEK293", "cells", "transiently", "transfected", "with", "flag", "-", "OFD1", "or", "flag", "-", "S735A", "were", "serum", "deprived", ",", "treated", "with", "FSK", "(", "6", "hours", ")", "and", "stained", "for", "flag", ",", "acetylated", "-", "tubulin", "and", "DRAQ5", ".", "G", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "experiments", "shown", "in", "F", ".", "A", "mean", "value", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Cells", "analysed", "for", "each", "experiment", ":", "300", "for", "NT", ",", "80", "for", "flag", "-", "OFD1", "and", "80", "for", "flag", "-", "S735A", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "p", "*", "<", "0", ",", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ",", "01", ".", "H"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. siRNA transfected HEK293 cells were serum deprived and stained for acetylated-tubulin, TBC1D31 and DRAQ5. B. Quantitative analysis of the experiments shown in A. A mean value ± SD of four independent experiments is shown. Student's t test *p< 0,05. C C. HEK293 cells expressing flag-OFD1 or flag-S735A were serum deprived and subjected to staining analysis for acetylated α-tubulin, flag and DRAQ5. Images were collected by super-resolution microscopy (upper panels). Where indicated, flag-OFD1 or flag-S735A was co-transfected with cilia-APEX-GFP vector (middle panels). NIH3T3 expressing flag-OFD1 or flag-S735A were stained with anti-ARL13B and anti-flag antibodies. D, E. Statistical analysis of the experiments shown in D. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. For each experimental group, a minimum of 40 cilia were analyzed. Student's t test p***<0,001. F F. HEK293 cells transiently transfected with flag-OFD1 or flag-S735A were serum deprived, treated with FSK (6 hours) and stained for flag, acetylated-tubulin and DRAQ5. G. Statistical analysis of the experiments shown in F. A mean value ± SD of three independent experiments is shown. Cells analysed for each experiment: 300 for NT, 80 for flag-OFD1 and 80 for flag-S735A. Student's t test, p*<0,05, p**<0,01. H "}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "Confocal", "images", "of", "cilia", "of", "the", "neural", "tube", "cells", "in", "the", "wild", "-", "type", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hTBC1D31", ",", "wild", "-", "type", "hOFD1", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "wild", "-", "type", "hOFD1", ",", "hOFD1S735A", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735A", ",", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735D", "and", "Ol", "-", "TBC1D31", "KD", "+", "hOFD1S735D", "+", "hpraja2rm", "stained", "with", "anti", "-", "acetylated", "α", "-", "tubulin", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. Confocal images of cilia of the neural tube cells in the wild-type, Ol-TBC1D31 KD, Ol-TBC1D31 KD + hTBC1D31, wild-type hOFD1, Ol-TBC1D31 KD + wild-type hOFD1, hOFD1S735A, Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735A, Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735D and Ol-TBC1D31 KD + hOFD1S735D + hpraja2rm stained with anti-acetylated α-tubulin antibody (green) and DAPI (blue)."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "E", "Echocardiographic", "analysis", "of", "(", "A", ")", "posterior", "wall", "thickness", ",", "(", "B", ")", "septum", "thickness", ",", "(", "C", ")", "left", "ventricle", "end", "diastolic", "diameter", ",", "(", "D", ")", "fractional", "area", "change", "and", "(", "E", ")", "ejection", "fraction", ".", "n", "=", "8", "per", "genotype", ".", "F", "Comparison", "of", "TAZ", "gene", "expression", ",", "normalized", "to", "S12", ",", "in", "heart", ",", "liver", ",", "and", "kidney", ",", "analyzed", "in", "triplicates", "by", "quantitative", "PCR", ".", "n", "=", "5", "per", "genotype", ".", "G", "TAZ", "gene", "expression", "in", "percent", ".", "Wild", "-", "type", "is", "set", "to", "100", "%", ".", "H", ",", "I", "Lipid", "species", "profiles", "of", "cardiolipin", "(", "H", ")", "and", "monolysocardiolipin", "(", "I", ")", "in", "isolated", "cardiac", "mitochondria", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", ".", "n", "=", "4", "per", "genotype", ".", "J", "Comparison", "of", "ratios", "of", "total", "monolysocardiolipin", "and", "cardiolipin", "content", "in", "indicated", "tissues", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-E Echocardiographic analysis of (A) posterior wall thickness, (B) septum thickness, (C) left ventricle end diastolic diameter, (D) fractional area change and (E) ejection fraction. n= 8 per genotype.F Comparison of TAZ gene expression, normalized to S12, in heart, liver, and kidney, analyzed in triplicates by quantitative PCR. n= 5 per genotype.G TAZ gene expression in percent. Wild-type is set to 100%.H, I Lipid species profiles of cardiolipin (H) and monolysocardiolipin (I) in isolated cardiac mitochondria analyzed by mass spectrometry. n= 4 per genotype.J Comparison of ratios of total monolysocardiolipin and cardiolipin content in indicated tissues."}
{"words": ["Figure", "2A", "Periodic", "measurement", "of", "the", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "mitochondria", ",", "isolated", "from", "5", "mice", "per", "genotype", ",", "before", "and", "after", "the", "administration", "of", "the", "indicated", "compounds", "(", "left", ")", ".", "Quantification", "of", "OCR", "in", "independent", "experiments", ",", "n", "=", "8", "per", "genotype", "(", "right", ")", ".", "B", "OCR", "rates", "of", "cardiac", "mitochondria", "after", "administration", "of", "pyruvate", ",", "malate", "and", "ADP", ",", "n", "=", "7", "per", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Periodic measurement of the oxygen consumption rate (OCR) of mitochondria, isolated from 5 mice per genotype, before and after the administration of the indicated compounds (left). Quantification of OCR in independent experiments, n= 8 per genotype (right).B OCR rates of cardiac mitochondria after administration of pyruvate, malate and ADP, n= 7 per genotype."}
{"words": ["Figure", "3A", "Mitochondrial", "membranes", ",", "isolated", "from", "cardiac", "tissue", ",", "were", "solubilized", "in", "1", "%", "digitonin", "and", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "B", "Cardiac", "mitochondria", "were", "prepared", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "analyzed", "on", "a", "large", "pore", "BN", "-", "gel", "for", "better", "resolution", "of", "supercomplexes", ".", "C", "Cardiac", "mitochondria", "were", "solubilized", "in", "0", ".", "4", "%", "DDM", "and", "complexes", "were", "separated", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "D", "Mitochondria", "were", "isolated", "from", "kidney", "and", "liver", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "ROS", "production", "over", "time", "in", "cardiac", "mitochondria", "using", "the", "ROS", "-", "specific", "fluorescence", "-", "based", "sensor", "H2DCFDA", ".", "One", "representative", "measurement", "is", "shown", ".", "Analyses", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "confirmed", "for", "three", "animals", "per", "genotype", ".", "Significance", "was", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "T", "-", "TEST", ".", "sh", ",", "shTAZ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Mitochondrial membranes, isolated from cardiac tissue, were solubilized in 1% digitonin and analyzed by BN-PAGE and Western- blotting with the indicated antibodies.B Cardiac mitochondria were prepared as in (A) and analyzed on a large pore BN-gel for better resolution of supercomplexes.C Cardiac mitochondria were solubilized in 0.4% DDM and complexes were separated by BN-PAGE and analyzed by Western- blotting with the indicated antibodies.D Mitochondria were isolated from kidney and liver and analyzed as in (A).E Quantification of ROS production over time in cardiac mitochondria using the ROS-specific fluorescence-based sensor H2DCFDA. One representative measurement is shown. Analyses were performed in triplicates and confirmed for three animals per genotype. Significance was calculated using Student's T-TEST. sh, shTAZ."}
{"words": ["Figure", "4A", "Enzymatic", "activity", "of", "ubiquinone", "-", "cytochrome", "c", "oxidase", "in", "mitochondria", "isolated", "from", "cardiac", "tissue", ".", "The", "ubiquinone", "analogue", "decylubiquinone", "was", "used", "in", "this", "assay", ".", "Data", "were", "standardized", "to", "malate", "-", "dehydrogenase", "activity", "and", "presented", "as", "percent", "of", "wild", "-", "type", ",", "n", "=", "4", "per", "genotype", ".", "B", "Cytochrome", "c", "reductase", "activity", ",", "standardized", "to", "malate", "-", "dehydrogenase", "activity", "in", "cardiac", "mitochondria", ",", "were", "plotted", "as", "%", "of", "wild", "-", "type", ",", "n", "=", "3", "per", "genotype", ".", "C", "Protein", "levels", "of", "Cox1", "and", "Rieske", "compared", "to", "VDAC3", "in", "three", "different", "dilutions", "of", "isolated", "mitochondria", ",", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "visualized", "by", "Western", "-", "blotting", ".", "D", "Respiratory", "chain", "complexes", "in", "cardiac", "mitochondria", "were", "separated", "on", "BN", "-", "PAGE", "and", "stained", "for", "activity", "of", "complex", "I", ",", "II", ",", "IV", "and", "F1FO", "-", "ATPase", ".", "sh", ",", "shTAZ", ";", "Q", ",", "ubiquinone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Enzymatic activity of ubiquinone-cytochrome c oxidase in mitochondria isolated from cardiac tissue. The ubiquinone analogue decylubiquinone was used in this assay. Data were standardized to malate-dehydrogenase activity and presented as percent of wild-type, n= 4 per genotype.B Cytochrome c reductase activity, standardized to malate-dehydrogenase activity in cardiac mitochondria, were plotted as % of wild-type, n= 3 per genotype.C Protein levels of Cox1 and Rieske compared to VDAC3 in three different dilutions of isolated mitochondria, separated on SDS gel and visualized by Western-blotting.D Respiratory chain complexes in cardiac mitochondria were separated on BN-PAGE and stained for activity of complex I, II, IV and F1FO- ATPase. sh, shTAZ; Q, ubiquinone."}
{"words": ["Figure", "5A", "Enzymatic", "activity", "of", "the", "succinate", "dehydrogenase", "in", "isolated", "cardiac", "mitochondria", "from", "3", "animals", "per", "genotype", ".", "B", "Mitochondrial", "membranes", "were", "solubilized", "in", "1", "%", "digitonin", "and", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "using", "antibodies", "against", "SDH", "components", "SDHA", "and", "SDHB", "(", "upper", "panel", ")", ".", "For", "a", "loading", "control", ",", "samples", "were", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "C", "Steady", "state", "protein", "levels", "analyzed", "by", "SDS", "gel", "separation", "of", "indicated", "amounts", "of", "mitochondrial", "protein", "and", "subsequent", "Western", "-", "blotting", "with", "antibodies", "against", "SDHA", "and", "VDAC3", "or", "visualizing", "of", "Flavin", "fluorescence", "after", "excitation", "with", "488", "nm", ".", "Lower", "panel", ":", "quantification", "of", "signal", "ratio", "SDHA", "/", "VDAC3", "in", "shTAZ", "and", "control", "(", "set", "to", "100", "%", ")", ".", "D", "Analysis", "of", "gene", "expression", "in", "cardiac", "tissue", "analyzed", "in", "(", "C", ")", "by", "qPCR", "using", "primers", "against", "indicated", "mRNA", ".", "Data", "of", "one", "representative", "measurement", ",", "normalized", "to", "b", "-", "actin", "with", "WT", "set", "to", "100", "%", "are", "shown", ".", "Identical", "results", "were", "obtained", "in", "further", "experiments", "with", "two", "different", "pairs", "of", "animals", ".", "E", "Upper", "panel", ":", "SDH", "complex", "of", "cardiac", ",", "liver", "and", "kidney", "were", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "as", "in", "(", "B", ")", ";", "lower", "panel", ":", "the", "same", "samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "gel", "and", "Western", "-", "blotting", ".", "F", ",", "G", "Analysis", "of", "enzymatic", "activity", "of", "the", "succinate", "dehydrogenase", "related", "to", "the", "malate", "dehydrogenase", "activity", "in", "mitochondria", "isolated", "from", "kidney", "(", "F", ")", "and", "liver", "(", "G", ")", ".", "Values", "of", "3", "animals", "per", "genotype", "are", "plotted", "as", "percent", "of", "wild", "-", "type", ".", "sh", ",", "shTAZ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Enzymatic activity of the succinate dehydrogenase in isolated cardiac mitochondria from 3 animals per genotype.B Mitochondrial membranes were solubilized in 1% digitonin and analyzed by BN-PAGE and Western-blotting using antibodies against SDH components SDHA and SDHB (upper panel). For a loading control, samples were separated on SDS gel and analyzed by Western-blotting (lower panel).C Steady state protein levels analyzed by SDS gel separation of indicated amounts of mitochondrial protein and subsequent Western- blotting with antibodies against SDHA and VDAC3 or visualizing of Flavin fluorescence after excitation with 488 nm. Lower panel: quantification of signal ratio SDHA/VDAC3 in shTAZ and control (set to 100%).D Analysis of gene expression in cardiac tissue analyzed in (C) by qPCR using primers against indicated mRNA. Data of one representative measurement, normalized to b-actin with WT set to 100% are shown. Identical results were obtained in further experiments with two different pairs of animals.E Upper panel: SDH complex of cardiac, liver and kidney were analyzed by BN-PAGE as in (B); lower panel: the same samples were analyzed by SDS gel and Western-blotting.F, G Analysis of enzymatic activity of the succinate dehydrogenase related to the malate dehydrogenase activity in mitochondria isolated from kidney (F) and liver (G). Values of 3 animals per genotype are plotted as percent of wild-type. sh, shTAZ."}
{"words": ["Figure", "6A", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "cardiac", "troponinT", "(", "cTNT", ")", "expression", "was", "performed", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", ".", "98", "%", "of", "cTNT", "+", "cardiomyocytes", "(", "CM", ")", "were", "obtained", "after", "metabolic", "selection", ".", "B", "RT", "-", "PCR", "showing", "the", "expression", "of", "indicated", "genes", "in", "undifferentiated", "iPSCs", "and", "differentiated", "iPSC", "-", "CMs", "of", "BTHS", "patient", "TAZ10", "and", "a", "healthy", "control", ".", "C", "Immunostaining", "of", "control", "(", "left", ")", "and", "BTHS", "iPSC", "-", "CMs", "at", "day", "60", "post", "differentiation", "for", "cardiac", "troponin", "T", "(", "cTNT", ")", "and", "Connexin", "43", "(", "Cx43", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50µm", ".", "D", "Quantitation", "of", "sarcomere", "organization", ".", "Left", "panel", ":", "Immunostaining", "of", "cTNT", ",", "MLC2a", "(", "myosin", "light", "chain", ")", "and", "a", "-", "actinin", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", ".", "Right", "panel", ":", "The", "bar", "graphs", "at", "the", "right", "panel", "represent", "the", "sarcomere", "regularity", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "for", "the", "comparison", "between", "control", "and", "BTHS", "patient", "TAZ10", ".", "Significance", "was", "analyzed", "using", "Student", "'", "s", "T", "-", "TEST", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "002", "and", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "E", "Measurement", "of", "cell", "surface", "areas", ".", "Cell", "surface", "area", "was", "measured", "in", "single", "cardiomyocytes", "(", "n", "=", "at", "least", "30", "measurements", "each", "group", "from", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "group", ")", "at", "day", "60", "post", "cardiac", "differentiation", "after", "immunostaining", "of", "sarcomeric", "a", "-", "actinin", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Flow cytometry analysis of cardiac troponinT (cTNT) expression was performed at day 60 post cardiac differentiation. 98% of cTNT+ cardiomyocytes (CM) were obtained after metabolic selection.B RT-PCR showing the expression of indicated genes in undifferentiated iPSCs and differentiated iPSC-CMs of BTHS patient TAZ10 and a healthy control.C Immunostaining of control (left) and BTHS iPSC-CMs at day 60 post differentiation for cardiac troponin T (cTNT) and Connexin 43 (Cx43). Scale bars: 50µm.D Quantitation of sarcomere organization. Left panel: Immunostaining of cTNT, MLC2a (myosin light chain) and a-actinin at day 60 post cardiac differentiation. Right panel: The bar graphs at the right panel represent the sarcomere regularity from 3 independent experiments. Error bars represent standard deviation for the comparison between control and BTHS patient TAZ10. Significance was analyzed using Student's T-TEST **P = 0.002 and ***P = 0.0006. Scale bars: 50 µm.E Measurement of cell surface areas. Cell surface area was measured in single cardiomyocytes (n = at least 30 measurements each group from N = 3 independent experiments each group) at day 60 post cardiac differentiation after immunostaining of sarcomeric a-actinin. Scale bars: 50 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "cardiomyocytes", "from", "patient", "TAZ10", "and", "control", "at", "basal", "conditions", "and", "after", "the", "administration", "of", "the", "indicated", "compounds", ".", "B", "Mitochondrial", "membranes", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "and", "Western", "-", "blotting", "using", "indicated", "antibodies", ".", "For", "a", "loading", "control", "samples", "were", "separated", "on", "SDS", "gel", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "C", "Western", "blot", "analysis", "of", "SDHA", "protein", "levels", "compared", "to", "VDAC3", ".", "Quantification", "of", "SDHA", "relative", "to", "VDAC3", "in", "percent", "with", "control", "set", "to", "100", "%", ".", "Error", "bars", "indicate", "range", "of", "values", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "D", "Analysis", "of", "SDHA", "gene", "expression", "in", "triplicates", "by", "qPCR", "in", "cardiomyocytes", ",", "analyzed", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Oxygen consumption rate (OCR) of cardiomyocytes from patient TAZ10 and control at basal conditions and after the administration of the indicated compounds.B Mitochondrial membranes analyzed by BN-PAGE and Western-blotting using indicated antibodies. For a loading control samples were separated on SDS gel and analyzed by Western-blotting (lower panel).C Western blot analysis of SDHA protein levels compared to VDAC3. Quantification of SDHA relative to VDAC3 in percent with control set to 100%. Error bars indicate range of values of two independent experiments.D Analysis of SDHA gene expression in triplicates by qPCR in cardiomyocytes, analyzed in (C)."}
{"words": ["Figure", "1D", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "MEFs", "48h", "after", "transgene", "induction", "stained", "for", "the", "indicated", "reprogramming", "factors", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "E", ".", "Log", "fluorophore", "expression", "superimposed", "on", "Uniform", "Manifold", "Approximation", "and", "Projection", "(", "UMAP", ")", "embedding", "of", "the", "dataset", ".", "Shown", "are", "fluorophore", "expression", "levels", "(", "gene", "exp", ".", ")", "on", "a", "logarithmic", "(", "ln", ")", "scale", ".", "F", ".", "Log", "transgene", "expression", "superimposed", "on", "a", "UMAP", "embedding", "of", "the", "dataset", ".", "Shown", "are", "transgene", "expression", "levels", "(", "gene", "exp", ".", ")", "on", "an", "a", "logarithmic", "(", "ln", ")", "scale", ".", "G", ".", "UMAP", "embedding", "of", "scRNA", "-", "seq", "dataset", "colored", "by", "technical", "replicate", ".", "Orange", ":", "Replicate", "1", ",", "Blue", ":", "Replicate", "2H", ".", "Cell", "cycle", "score", "superimposed", "on", "UMAP", "embedding", "of", "the", "dataset", ".", "See", "unsupervised", "analysis", "of", "single", "-", "cell", "RNA", "-", "seq", "section", "in", "Methods", "for", "further", "details", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D. Representative immunofluorescence images of MEFs 48h after transgene induction stained for the indicated reprogramming factors. Scale bar represents 50 μm (n = 3 biological replicates).E. Log fluorophore expression superimposed on Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) embedding of the dataset. Shown are fluorophore expression levels (gene exp.) on a logarithmic (ln) scale. F. Log transgene expression superimposed on a UMAP embedding of the dataset. Shown are transgene expression levels (gene exp.) on an a logarithmic (ln) scale.G. UMAP embedding of scRNA-seq dataset colored by technical replicate. Orange: Replicate 1, Blue: Replicate 2H. Cell cycle score superimposed on UMAP embedding of the dataset. See unsupervised analysis of single-cell RNA-seq section in Methods for further details."}
{"words": ["Figure", "5D", ".", "Log", "-", "normalized", "expression", "z", "-", "score", "of", "genes", "up", "-", "(", "top", "panels", ")", "and", "downregulated", "(", "bottom", "panels", ")", "by", "Ascl1", "(", "left", ",", "blue", "violins", ")", "and", "MyoD1", "(", "right", ",", "yellow", "violins", ")", "versus", "their", "scaled", "expression", "levels", "(", "x", "-", "axis", ")", "binned", "into", "10", "%", "intervals", ".", "For", "each", "box", ",", "the", "centerline", "defines", "the", "median", ",", "the", "height", "of", "the", "box", "is", "given", "by", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "the", "whiskers", "are", "given", "by", "1", ".", "5", "*", "IQR", "and", "outliers", "are", "given", "as", "points", "beyond", "the", "minimum", "or", "maximum", "whisker", ".", "E", ".", "Fate", "titration", "plot", "of", "Ascl1", "and", "MyoD1", "double", "positive", "cells", "Shown", "are", "decision", "boundaries", "for", "indicated", "fates", "according", "to", "transcription", "factor", "levels", ".", "MyoD1", "and", "Ascl1", "expression", "shown", "on", "the", "x", "-", "and", "y", "-", "axis", "are", "log", "-", "normalized", "expression", "values", "scaled", "into", "the", "dynamic", "range", "of", "the", "single", "-", "positive", "condition", "Cells", "are", "colored", "according", "to", "their", "lineage", "endpoint", "as", "determined", "by", "CellRank", ".", "F", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "cells", "3", "days", "after", "transgene", "induction", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "the", "fluorescent", "reporter", "present", "on", "the", "PiggyBac", "construct", "of", "the", "reprogramming", "factor", ".", "Arrows", "indicate", "multinucleated", "cells", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "µm", ".", "mutAscl1", "=", "mutant", "Ascl1", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "more", "than", "one", "nucleus", "among", "all", "transfected", "cells", "within", "a", "given", "condition", ".", "Data", "points", "represent", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "For", "each", "box", ",", "the", "centerline", "defines", "the", "median", ",", "the", "height", "of", "the", "box", "is", "given", "by", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "the", "whiskers", "are", "given", "by", "1", ".", "5", "*", "IQR", "and", "outliers", "are", "given", "as", "points", "beyond", "the", "minimum", "or", "maximum", "whisker", ".", "Pairwise", "comparisons", "performed", "with", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "correction", "for", "multiple", "testing", "performed", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "correction", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "MyoD1", "vs", "Ascl1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "MyoD1", "vs", "mutAscl1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "MyoD1", "vs", "Ascl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "MyoD1", "vs", "mutAscl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "Ascl1", "vs", "Ascl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "Ascl1", "vs", "mutAscl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "mutAscl1", "vs", "Ascl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "mutAscl1", "vs", "mutAscl1", "&", "MyoD1", ":", "p", "=", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D. Log-normalized expression z-score of genes up- (top panels) and downregulated (bottom panels) by Ascl1 (left, blue violins) and MyoD1 (right, yellow violins) versus their scaled expression levels (x-axis) binned into 10% intervals. For each box, the centerline defines the median, the height of the box is given by the interquartile range (IQR), the whiskers are given by 1.5 * IQR and outliers are given as points beyond the minimum or maximum whisker.E. Fate titration plot of Ascl1 and MyoD1 double positive cells Shown are decision boundaries for indicated fates according to transcription factor levels. MyoD1 and Ascl1 expression shown on the x- and y-axis are log-normalized expression values scaled into the dynamic range of the single-positive condition Cells are colored according to their lineage endpoint as determined by CellRank.F. Representative immunofluorescence images of cells 3 days after transgene induction. Cells were stained for the fluorescent reporter present on the PiggyBac construct of the reprogramming factor. Arrows indicate multinucleated cells. Scale bar represents 50 µm. mutAscl1 = mutant Ascl1. G. Quantification of the percentage of cells with more than one nucleus among all transfected cells within a given condition. Data points represent biological replicates (n = 4). For each box, the centerline defines the median, the height of the box is given by the interquartile range (IQR), the whiskers are given by 1.5 * IQR and outliers are given as points beyond the minimum or maximum whisker. Pairwise comparisons performed with Mann-Whitney U test, correction for multiple testing performed with Benjamini-Hochberg correction. *: p < 0.05 (MyoD1 vs Ascl1: p = 0.03, MyoD1 vs mutAscl1: p = 0.03, MyoD1 vs Ascl1 & MyoD1: p = 0.03, MyoD1 vs mutAscl1 & MyoD1: p = 0.03, Ascl1 vs Ascl1 & MyoD1: p = 0.03, Ascl1 vs mutAscl1 & MyoD1: p = 0.03, mutAscl1 vs Ascl1 & MyoD1: p = 0.03, mutAscl1 vs mutAscl1 & MyoD1: p = 0.03"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "in", "vitro", "kinase", "assays", "were", "performed", "using", "purified", "recombinant", "kinases", "(", "ULK1", "and", "ULK2", ")", "and", "substrate", "(", "ATG16L1", ")", "in", "the", "presence", "of", "radiolabelled", "ATP", ".", "ULK", "and", "ATG16L1", "inputs", "were", "examined", "by", "western", "blot", "(", "WB", ")", "and", "substrate", "phosphorylation", "was", "analyzed", "by", "autoradiography", "(", "AR", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "(", "B", ")", "Full", "-", "length", "or", "truncated", "versions", "of", "ATG16L1", "were", "subjected", "to", "an", "in", "vitro", "ULK1", "kinase", "assay", ".", "ULK1", "and", "ATG16L1", "inputs", "were", "examined", "by", "western", "blot", "and", "target", "phosphorylation", "by", "autoradiography", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "(", "D", ")", "Full", "-", "length", "or", "mutated", "HA", "-", "ATG16L1", "was", "purified", "from", "mammalian", "cells", "and", "subjected", "to", "an", "in", "vitro", "ULK1", "kinase", "assay", ".", "Inputs", "were", "analysed", "by", "WB", "and", "target", "phosphorylation", "by", "AR", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "(", "E", ")", "HEK293A", "cells", "were", "transfected", "with", "wild", "-", "type", "or", "phospho", "-", "dead", "ATG16L1", "in", "the", "presence", "of", "wild", "-", "type", "or", "kinase", "-", "dead", "ULK1", ".", "Phosphorylation", "of", "ATG16L1", "(", "S278", "or", "S287", ")", "and", "inputs", "were", "examined", "by", "WB", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) in vitro kinase assays were performed using purified recombinant kinases (ULK1 and ULK2) and substrate (ATG16L1) in the presence of radiolabelled ATP. ULK and ATG16L1 inputs were examined by western blot (WB) and substrate phosphorylation was analyzed by autoradiography (AR). Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times.(B) Full-length or truncated versions of ATG16L1 were subjected to an in vitro ULK1 kinase assay. ULK1 and ATG16L1 inputs were examined by western blot and target phosphorylation by autoradiography. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times.(D) Full-length or mutated HA-ATG16L1 was purified from mammalian cells and subjected to an in vitro ULK1 kinase assay. Inputs were analysed by WB and target phosphorylation by AR. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times.(E) HEK293A cells were transfected with wild-type or phospho-dead ATG16L1 in the presence of wild-type or kinase-dead ULK1. Phosphorylation of ATG16L1 (S278 or S287) and inputs were examined by WB. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", ",", "ULK1", "/", "2", "double", "knockout", "(", "dKO", ")", ",", "or", "IKKα", "KO", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "were", "incubated", "with", "either", "complete", "medium", ",", "amino", "acid", "-", "deficient", "DMEM", ",", "or", "HBSS", "for", "1", "hour", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", ",", "ULK1", "/", "2", "dKO", ",", "or", "IKKα", "KO", "MEFs", "were", "infected", "with", "log", "phase", "Salmonella", "for", "2", "hours", ";", "bacteria", "-", "containing", "media", "was", "then", "removed", "and", "cells", "were", "incubated", "with", "gentamycin", "(", "50", "µg", "/", "mL", ")", "-", "containing", "DMEM", "for", "2", "hours", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "C", ")", "Wild", "-", "type", ",", "ULK1", "/", "2", "dKO", ",", "or", "IKKα", "KO", "MEFs", "cells", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "1", "hours", ".", "Autophagic", "capture", "of", "Salmonella", "was", "analyzed", "by", "immunostaining", "for", "LPS", "and", "LC3B", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "scale", "bars", ",", "10", "μm", "and", "3", "μm", ")", ".", "Quantification", "was", "generated", "from", "8", "fields", "of", "view", "from", "a", "representative", "experiment", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "twice", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "D", ")", "Wild", "-", "type", ",", "ULK1", "/", "2", "dKO", "and", "IKKα", "KO", "MEFs", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "1", "hour", ".", "Xenophagy", "rates", "were", "examined", "through", "Colony", "Forming", "Unit", "(", "CFU", ")", "assays", ".", "Quantification", "of", "infection", "rates", "by", "immunofluorescence", "is", "demonstrated", "in", "the", "right", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Wild-type, ULK1/2 double knockout (dKO), or IKKα KO mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were incubated with either complete medium, amino acid-deficient DMEM, or HBSS for 1 hour. Samples were immunoblotted using the indicated antibodies. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(B) Wild-type, ULK1/2 dKO, or IKKα KO MEFs were infected with log phase Salmonella for 2 hours; bacteria-containing media was then removed and cells were incubated with gentamycin (50 µg/mL)-containing DMEM for 2 hours. Samples were immunoblotted using the indicated antibodies. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(C) Wild-type, ULK1/2 dKO, or IKKα KO MEFs cells were infected with Salmonella for 1 hours. Autophagic capture of Salmonella was analyzed by immunostaining for LPS and LC3B. Representative images are shown (scale bars, 10 μm and 3 μm). Quantification was generated from 8 fields of view from a representative experiment. The experiments were repeated twice. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(D) Wild-type, ULK1/2 dKO and IKKα KO MEFs were infected with Salmonella for 1 hour. Xenophagy rates were examined through Colony Forming Unit (CFU) assays. Quantification of infection rates by immunofluorescence is demonstrated in the right panel. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "HEK293A", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "flag", "-", "tagged", "WT", "ATG16L1", "or", "T300A", "ATG16L1", ".", "ULK1", "was", "co", "-", "transfected", "in", "increasing", "amounts", "where", "indicated", ".", "Cleavage", "of", "ATG16L1", "was", "analyzed", "by", "WB", "of", "whole", "cell", "lysates", ".", "Levels", "of", "ATG16L1", "cleavage", "were", "quantified", "from", "3", "biological", "repeats", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "B", ")", "HEK293A", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "tagged", "wild", "-", "type", ",", "T300A", ",", "or", "S278", "/", "T300A", "ATG16L1", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ULK1", ".", "Cleavage", "of", "ATG16L1", "was", "analyzed", "by", "WB", ".", "Levels", "of", "ATG16L1", "cleavage", "were", "measured", "from", "3", "biological", "repeats", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "C", ")", "HEK293A", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "a", "pan", "-", "caspase", "inhibitor", "Z", "-", "VAD", "-", "FMK", "(", "15", "µM", ")", "for", "4", "hours", ".", "Cleavage", "of", "ATG16L1", "was", "analyzed", "by", "WB", "of", "3", "biological", "repeats", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "D", ")", "Wild", "-", "type", "or", "T300A", "-", "expressing", "HEK293A", "were", "treated", "with", "Salmonella", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ULK1", "/", "2", "inhibitor", "(", "16", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Expression", "of", "ATG16L1", "was", "analysed", "by", "WB", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "twice", ".", "(", "E", ")", "ATG16L1", "knock", "-", "out", "HEK293A", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "HA", "GST", "ATG16L1", "plasmids", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "1", "hour", ".", "Xenophagy", "rates", "were", "examined", "through", "CFU", "assays", ".", "Quantification", "of", "infection", "rates", "by", "immunofluorescence", "is", "demonstrated", "in", "the", "right", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) HEK293A cells were transfected with either flag-tagged WT ATG16L1 or T300A ATG16L1. ULK1 was co-transfected in increasing amounts where indicated. Cleavage of ATG16L1 was analyzed by WB of whole cell lysates. Levels of ATG16L1 cleavage were quantified from 3 biological repeats (right panel). Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(B) HEK293A cells were transfected with either tagged wild-type, T300A, or S278/T300A ATG16L1 in the presence or absence of ULK1. Cleavage of ATG16L1 was analyzed by WB. Levels of ATG16L1 cleavage were measured from 3 biological repeats (right panel). Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(C) HEK293A cells were transfected with the indicated plasmids in the presence or absence of a pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK (15 µM) for 4 hours. Cleavage of ATG16L1 was analyzed by WB of 3 biological repeats. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test.(D) Wild-type or T300A-expressing HEK293A were treated with Salmonella in the presence or absence of ULK1/2 inhibitor (16 μM) for the indicated time points. Expression of ATG16L1 was analysed by WB. The experiments were performed twice.(E) ATG16L1 knock-out HEK293A cells transfected with the indicated HA GST ATG16L1 plasmids were infected with Salmonella for 1 hour. Xenophagy rates were examined through CFU assays. Quantification of infection rates by immunofluorescence is demonstrated in the right panel. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed three times. Data are represented as mean ± standard deviation and p values were determined by Student's T-Test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", "MEF", "cells", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "25", "minutes", ".", "Phospho", "-", "ATG16L1", ",", "total", "ATG16L1", ",", "and", "LPS", "were", "stained", "and", "analysed", "by", "immunofluorescence", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "are", "shown", "(", "scale", "bars", ",", "10", "μm", "and", "1", "μm", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "twice", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "B", ")", "Wild", "-", "type", "and", "ULK1", "/", "2", "dKO", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "25", "minutes", ".", "Immunofluorescence", "was", "performed", "using", "antibodies", "against", "LPS", "and", "ATG16L1", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "are", "shown", "on", "the", "left", "panel", "(", "scale", "bars", ",", "10", "μm", "and", "2", "μm", ")", ".", "Quantification", "of", "ATG16L1", "-", "positive", "bacteria", "from", "7", "fields", "of", "view", "from", "a", "representative", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "right", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "twice", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "C", ")", "ATG16L1", "knock", "-", "out", "HCT116", "transfected", "with", "the", "indicated", "GST", "HA", "ATG16L1", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "1", "hour", ".", "Bacteria", "were", "stained", "using", "anti", "-", "LPS", "antibodies", "to", "analyze", "localization", "in", "addition", "to", "ATG16L1", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "ATG16L1", "and", "LPS", "are", "shown", "(", "scale", "bars", ",", "5μm", "and", "1", "μm", ")", ".", "Quantification", "of", "ATG16L1", "localizing", "to", "bacteria", "from", "7", "fields", "of", "view", "from", "a", "representative", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "twice", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", ".", "(", "D", ")", "ATG16L1", "knock", "-", "out", "HCT116", "transfected", "with", "the", "indicated", "GST", "HA", "ATG16L1", "were", "infected", "with", "Salmonella", "for", "1", "hour", ".", "Bacteria", "were", "stained", "using", "anti", "-", "LPS", "antibodies", "to", "analyze", "localization", "in", "addition", "to", "the", "autophagy", "marker", "LC3B", ".", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "LC3B", "and", "LPS", "are", "shown", "(", "scale", "bars", ",", "5μm", "and", "1", "μm", ")", ".", "Quantification", "of", "bacteria", "undergoing", "autophagic", "clearance", "from", "7", "fields", "of", "view", "from", "a", "representative", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Unless", "otherwise", "indicated", "experiments", "were", "performed", "twice", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "and", "p", "values", "were", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "-", "Test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Wild-type MEF cells were infected with Salmonella for 25 minutes. Phospho-ATG16L1, total ATG16L1, and LPS were stained and analysed by immunofluorescence. Representative immunofluorescent images are shown (scale bars, 10 μm and 1 μm). Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed twice. Data are represented as mean and p values were determined by Student's T-Test.(B) Wild-type and ULK1/2 dKO were infected with Salmonella for 25 minutes. Immunofluorescence was performed using antibodies against LPS and ATG16L1. Representative immunofluorescent images are shown on the left panel (scale bars, 10 μm and 2 μm). Quantification of ATG16L1-positive bacteria from 7 fields of view from a representative experiment is shown in the right panel. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed twice. Data are represented as mean and p values were determined by Student's T-Test.(C) ATG16L1 knock-out HCT116 transfected with the indicated GST HA ATG16L1 were infected with Salmonella for 1 hour. Bacteria were stained using anti-LPS antibodies to analyze localization in addition to ATG16L1. Representative immunofluorescent images of ATG16L1 and LPS are shown (scale bars, 5μm and 1 μm). Quantification of ATG16L1 localizing to bacteria from 7 fields of view from a representative experiment is shown in the lower panel. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed twice. Data are represented as mean and p values were determined by Student's T-Test.(D) ATG16L1 knock-out HCT116 transfected with the indicated GST HA ATG16L1 were infected with Salmonella for 1 hour. Bacteria were stained using anti-LPS antibodies to analyze localization in addition to the autophagy marker LC3B. Representative immunofluorescent images of LC3B and LPS are shown (scale bars, 5μm and 1 μm). Quantification of bacteria undergoing autophagic clearance from 7 fields of view from a representative experiment is shown in the lower panel. Data information: Unless otherwise indicated experiments were performed twice. Data are represented as mean and p values were determined by Student's T-Test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "FLAG", "and", "FLAG", "-", "tagged", "TEX264", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Inputs", "(", "20", "%", "of", "the", "lysates", ")", "and", "immunoprecipitates", "(", "from", "80", "%", "of", "the", "lysates", ")", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "mutated", "TEX264", "-", "FLAG", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "or", "its", "mutant", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "1", "µm", "(", "insets", ")", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "48", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "E", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "WT", "and", "TEX264", "-", "KO", "HeLa", "cells", "(", "with", "or", "without", "the", "indicated", "TEX264", "mutants", "with", "a", "C", "-", "terminal", "FLAG", "tag", ")", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "(", "ss", "-", "RFP", "-", "GFP", "-", "KDEL", ")", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "for", "9", "h", "(", "F", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) HEK293T cells transiently expressing FLAG and FLAG-tagged TEX264 were subjected to immunoprecipitation (IP). Inputs (20% of the lysates) and immunoprecipitates (from 80% of the lysates) were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies.(C) HEK293T cells transiently expressing WT or mutated TEX264-FLAG were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with the indicated antibodies.(D and E) MEFs stably expressing TEX264-GFP or its mutant were cultured in starvation media and immunostained with an anti-LC3 antibody. Bars: 10 µm and 1 µm (insets) (D). Quantification of the number of TEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 48 cells for each cell type (E).(F and G) WT and TEX264-KO HeLa cells (with or without the indicated TEX264 mutants with a C-terminal FLAG tag) stably expressing the ER-phagy reporter (ss-RFP-GFP-KDEL) were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, cells were cultured in starvation medium lacking amino acids and serum for 9 h (F). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± standard error of the mean (SEM) of three independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (G)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "with", "or", "without", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "pTEX264", "and", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "1", "µm", "(", "insets", ")", "(", "A", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "pTEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "35", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "250", "nM", "Torin", "1", "and", "Baf", "A1", "for", "16", "h", ",", "and", "cell", "homogenates", "were", "subjected", "to", "an", "OptiPrep", "membrane", "flotation", "analysis", ".", "(", "D", ",", "E", "and", "F", ")", "WT", ",", "ATG3", "-", "KO", ",", "and", "FIP200", "-", "KO", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "with", "or", "without", "Baf", "A1", "for", "1", "or", "5", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", "(", "D", ")", ".", "Relative", "changes", "of", "the", "ratio", "of", "band", "intensities", "of", "phosphorylated", "TEX264", "to", "HSP90", "and", "total", "TEX264", "during", "starvation", "are", "shown", "(", "E", "and", "F", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) MEFs stably expressing TEX264-GFP were cultured in starvation media with or without bafilomycin A1 (Baf A1) and immunostained with anti-pTEX264 and anti-LC3 antibodies. Bars: 10 µm and 1 µm (insets) (A). Quantification of the number of pTEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 35 cells for each cell type (B).(C) HeLa cells were treated with 250 nM Torin 1 and Baf A1 for 16 h, and cell homogenates were subjected to an OptiPrep membrane flotation analysis.(D, E and F) WT, ATG3-KO, and FIP200-KO HeLa cells were cultured in starvation media lacking amino acids and serum with or without Baf A1 for 1 or 5 h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies (D). Relative changes of the ratio of band intensities of phosphorylated TEX264 to HSP90 and total TEX264 during starvation are shown (E and F). Data represent the mean ± SEM of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "cultured", "with", "20", "nM", "CK1", "inhibitor", "(", "D4476", ")", "or", "CK2", "inhibitor", "(", "CX4945", ")", "for", "3", "h", ",", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "inhibitors", ")", "for", "3", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Recombinant", "TEX264", "-", "FLAG", "was", "incubated", "with", "or", "without", "CK2", "and", "the", "CK2", "inhibitor", "(", "CX4945", ")", "in", "the", "presence", "of", "200", "µM", "ATP", "for", "1", "h", ".", "(", "C", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "TEX264", "-", "FLAG", "and", "one", "of", "the", "three", "Halo", "-", "CK2A", "isoforms", "or", "Halo", "-", "CK2B", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "anti", "-", "Halo", "and", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "TEX264", "-", "FLAG", "mutants", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Inputs", "(", "20", "%", "of", "the", "lysates", ")", "and", "immunoprecipitates", "(", "from", "80", "%", "of", "the", "lysates", ")", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", "(", "D", ")", ".", "The", "band", "intensities", "in", "the", "IP", "fractions", "were", "quantified", ",", "and", "the", "phospho", "-", "serine", ":", "FLAG", "ratio", "was", "calculated", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "E", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "were", "cultured", "with", "the", "CK2", "inhibitor", "for", "3", "h", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "CK2", "inhibitor", ")", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "and", "1", "μm", "(", "insets", ")", "(", "F", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TEX264", "puncta", "per", "cell", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "85", "cells", "for", "each", "cell", "type", "(", "G", ")", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "WT", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "cells", "were", "cultured", "with", "20", "nM", "CK2", "inhibitor", "for", "3", "h", "followed", "by", "starvation", "(", "with", "the", "CK2", "inhibitor", ")", "for", "6", "h", "(", "H", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) HeLa cells were cultured with 20 nM CK1 inhibitor (D4476) or CK2 inhibitor (CX4945) for 3 h, followed by starvation (with the inhibitors) for 3 h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies.(B) Recombinant TEX264-FLAG was incubated with or without CK2 and the CK2 inhibitor (CX4945) in the presence of 200 µM ATP for 1 h.(C) HEK293T cells transiently expressing TEX264-FLAG and one of the three Halo-CK2A isoforms or Halo-CK2B were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with anti-Halo and anti-FLAG antibodies.(D and E) HEK293T cells transiently expressing WT or TEX264-FLAG mutants were subjected to immunoprecipitation (IP). Inputs (20% of the lysates) and immunoprecipitates (from 80% of the lysates) were analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies (D). The band intensities in the IP fractions were quantified, and the phospho-serine:FLAG ratio was calculated. Data represent the mean ± SEM of five independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (E).(F and G) MEFs stably expressing TEX264-GFP were cultured with the CK2 inhibitor for 3 h followed by starvation (with the CK2 inhibitor) and immunostained with an anti-LC3 antibody. Scale bars represent 10 μm and 1 μm (insets) (F). Quantification of the number of TEX264 puncta per cell. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by an unpaired two-tailed Student's t-test. Data were collected from 85 cells for each cell type (G).(H and I) WT HeLa cells stably expressing the ER-phagy reporter were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, cells were cultured with 20 nM CK2 inhibitor for 3 h followed by starvation (with the CK2 inhibitor) for 6 h (H). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± SEM of six independent experiments. Differences were statistically analyzed by an unpaired two-tailed Student's t-test (I)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "HEK293T", "cells", "transiently", "expressing", "WT", "or", "mutated", "TEX264", "-", "FLAG", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "TEX264", "-", "GFP", "or", "its", "mutants", "were", "cultured", "in", "starvation", "media", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Bars", ":", "10", "µm", "and", "5", "µm", "(", "insets", ")", "(", "C", ")", ".", "The", "intensity", "of", "the", "GFP", "signal", "under", "starvation", "conditions", "was", "quantified", "at", "TEX264", "-", "GFP", "puncta", "and", "the", "ER", ".", "The", "puncta", ":", "ER", "signal", "ratio", "was", "calculated", ".", "Solid", "bars", "indicate", "the", "medians", ",", "boxes", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "to", "75th", "percentile", ")", ",", "and", "whiskers", "the", "0th", "to", "100th", "percentile", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "were", "collected", "from", "70", "puncta", "for", "each", "cell", "type", "(", "D", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "WT", "and", "TEX264", "-", "KO", "(", "expressing", "WT", "or", "TEX264", "-", "FLAG", "mutants", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "the", "ER", "-", "phagy", "reporter", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "doxycycline", "for", "24", "h", "to", "induce", "the", "reporter", ".", "After", "doxycycline", "was", "removed", ",", "the", "cells", "were", "cultured", "in", "starvation", "medium", "lacking", "amino", "acids", "and", "serum", "for", "9", "h", "(", "E", ")", ".", "The", "band", "intensities", "of", "RFP", "and", "RFP", "-", "GFP", "were", "quantified", "and", "the", "ratio", "of", "RFP", ":", "RFP", "-", "GFP", "(", "normalized", "to", "WT", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "Differences", "were", "statistically", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) HEK293T cells transiently expressing WT or mutated TEX264-FLAG were subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody and detected with the indicated antibodies.(C and D) MEFs stably expressing TEX264-GFP or its mutants were cultured in starvation media and immunostained with an anti-LC3 antibody. Bars: 10 µm and 5 µm (insets) (C). The intensity of the GFP signal under starvation conditions was quantified at TEX264-GFP puncta and the ER. The puncta:ER signal ratio was calculated. Solid bars indicate the medians, boxes the interquartile range (25th to 75th percentile), and whiskers the 0th to 100th percentile. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test. Data were collected from 70 puncta for each cell type (D).(E and F) WT and TEX264-KO (expressing WT or TEX264-FLAG mutants) HeLa cells stably expressing the ER-phagy reporter were cultured in the presence of doxycycline for 24 h to induce the reporter. After doxycycline was removed, the cells were cultured in starvation medium lacking amino acids and serum for 9 h (E). The band intensities of RFP and RFP-GFP were quantified and the ratio of RFP:RFP-GFP (normalized to WT) is shown. Data represent the mean ± SEM of four independent experiments. Differences were statistically analyzed by one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test (F)."}
{"words": ["figf1", "(", "b", ")", "Density", "gradient", "fractions", "of", "NRK", "cells", "starved", "for", "8", " ", "h", "were", "analysed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "upper", "panel", ")", "and", "immunoblotted", "for", "LC3", "or", "LAMP1", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Proteins", "in", "fraction", "1", "were", "identified", "by", "mass", "spectrometry", "analysis", ".", "Three", "replicates", "were", "carried", "out", "from", "three", "independent", "purifications", ".", "Scale", "bar", ",", "2", " ", "μm", ".", "(", "e", ")", "NRK", "cells", "grown", "on", "the", "SAMCell", "were", "transfected", "with", "FAM", "-", "RNAi", "by", "reverse", "transfection", "and", "the", "transfection", "efficiency", "was", "monitored", "by", "microscopy", ".", "Left", "panel", ",", "FAM", "-", "RNAi", "-", "positive", "cells", ";", "right", "panel", ",", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "image", "of", "the", "cells", "in", "the", "left", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(b) Density gradient fractions of NRK cells starved for 8 h were analysed by transmission electron microscopy (upper panel) and immunoblotted for LC3 or LAMP1 (lower panel). Proteins in fraction 1 were identified by mass spectrometry analysis. Three replicates were carried out from three independent purifications. Scale bar, 2 μm.(e) NRK cells grown on the SAMCell were transfected with FAM-RNAi by reverse transfection and the transfection efficiency was monitored by microscopy. Left panel, FAM-RNAi-positive cells; right panel, differential interference contrast (DIC) image of the cells in the left panel."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "Cltc", "(", "clathrin", "heavy", "chain", ")", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "enlarged", "autolysosomes", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Representative", "TEM", "micrographs", "of", "nonspecific", "-", "or", "Cltc", "-", "RNAi", "-", "transfected", "NRK", "cells", "after", "12", "h", "of", "serum", "starvation", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "d", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "starved", "for", "0", "or", "4", " ", "h", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "As", "a", "control", ",", "clathrin", "-", "GFP", "-", "expressing", "cells", "were", "starved", "for", "0", "or", "4", " ", "h", "and", "then", "stained", "with", "MitoTracker", "red", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "The", "insets", "in", "a", ",", "c", "and", "d", "represent", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "(", "e", ")", "Cells", "from", "d", "were", "analysed", "for", "Pearson", "'", "s", "co", "-", "localization", "coefficent", "(", "R", "(", "r", ")", ")", ".", "n", " ", "=", " ", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "f", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "starved", "for", "4", " ", "h", "and", "time", "-", "lapse", "images", "were", "acquired", "by", "spinning", "-", "disc", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "500", " ", "nm", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "a", "clathrin", "punctum", "moving", "along", "a", "LAMP1", "-", "positive", "structure", ".", "(", "g", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "0", ",", "4", "or", "6", "h", "and", "then", "subjected", "to", "cell", "fractionation", ".", "Fractions", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "antibodies", "against", "LAMP2", "and", "clathrin", "heavy", "chain", ".", "1", "is", "the", "top", "fraction", ".", "The", "outline", "indicates", "the", "Lamp2", "-", "positive", "fraction", ".", "(", "h", ")", "Cell", "lines", "stably", "expressing", "clathrin", "-", "GFP", "were", "starved", "for", "4", "h", ",", "stained", "with", "antibodies", "against", "GFP", "and", "LAMP1", ",", "analysed", "by", "3D", "-", "SIM", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "μm", ".", "The", "right", "panels", "show", "enlarged", "regions", "of", "interest", "from", "the", "left", "panel", ":", "T", ",", "top", "view", ";", "L", ",", "lateral", "view", ";", "B", ",", "bottom", "view", ".", "(", "i", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "TEM", "micrographs", "of", "purified", "autolysosomes", "from", "starved", "clathrin", "-", "GFP", "-", "expressing", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "nm", ".", "Right", "panel", ",", "SIM", "image", "of", "purified", "autolysosomes", "stained", "with", "GFP", "and", "LAMP1", "from", "the", "same", "experiment", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "j", ")", "NRK", "or", "stable", "clathrin", "-", "GFP", "-", "expressing", "NRK", "cell", "lines", "were", "analysed", "by", "pre", "-", "embedding", "-", "immuno", "-", "electron", "microscopy", "using", "antibodies", "against", "GFP", ".", "Scale", "bar", ",", "100", " ", "nm", ".", "(", "k", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "gold", "particles", "per", "image", "from", "control", "or", "clathrin", "-", "GFP", "cells", ".", "n", " ", "=", " ", "25", "images", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) NRK cells stably expressing CFP-LC3; LAMP1-YFP were transfected with nonspecific (NS)- or Cltc (clathrin heavy chain)-RNAi and starved for 12 h. Scale bar, 5 μm. (b) Cells from a were assessed for enlarged autolysosomes after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d.(c) Representative TEM micrographs of nonspecific- or Cltc-RNAi-transfected NRK cells after 12 h of serum starvation. Scale bar, 5 μm.(d) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry; clathrin-GFP were starved for 0 or 4 h and observed by confocal microscopy. As a control, clathrin-GFP-expressing cells were starved for 0 or 4 h and then stained with MitoTracker red. Scale bar, 5 μm. The insets in a, c and d represent enlarged regions of interest. (e) Cells from d were analysed for Pearson's co-localization coefficent (R(r)). n = 30 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d.(f) NRK cells stably expressing LAMP1-Cherry; clathrin-GFP were starved for 4 h and time-lapse images were acquired by spinning-disc microscopy. Scale bar, 500 nm. The white arrows indicate a clathrin punctum moving along a LAMP1-positive structure.(g) NRK cells were starved for 0, 4 or 6 h and then subjected to cell fractionation. Fractions were analysed by western blotting with antibodies against LAMP2 and clathrin heavy chain. 1 is the top fraction. The outline indicates the Lamp2-positive fraction.(h) Cell lines stably expressing clathrin-GFP were starved for 4 h, stained with antibodies against GFP and LAMP1, analysed by 3D-SIM. Scale bar, 2.5 μm. The right panels show enlarged regions of interest from the left panel: T, top view; L, lateral view; B, bottom view.(i) Left panel, representative TEM micrographs of purified autolysosomes from starved clathrin-GFP-expressing cells. Scale bar, 250 nm. Right panel, SIM image of purified autolysosomes stained with GFP and LAMP1 from the same experiment. Scale bar, 5 μm.(j) NRK or stable clathrin-GFP-expressing NRK cell lines were analysed by pre-embedding-immuno-electron microscopy using antibodies against GFP. Scale bar, 100 nm. (k) Quantification of the average number of gold particles per image from control or clathrin-GFP cells. n = 25 images from three independent experiments. The error bars indicate the s.d. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "PIP5K1B", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "enlarged", "autolysosomes", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Representative", "TEM", "micrographs", "of", "nonspecific", "-", "or", "PIP5K1B", "-", "RNAi", "-", "transfected", "NRK", "cells", "after", "12", " ", "h", "of", "serum", "starvation", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "d", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "4", "h", ",", "stained", "with", "antibodies", "against", "PIP5K1B", "and", "LAMP1", ",", "and", "then", "analysed", "by", "3D", "-", "SIM", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", " ", "μm", ".", "The", "right", "panels", "show", "enlarged", "regions", "of", "interest", "from", "the", "left", "panel", ":", "T", ",", "top", "view", ";", "L", ",", "lateral", "view", ";", "B", ",", "bottom", "view", ".", "(", "e", ")", "Fractions", "from", "Fig", ".", "2f", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "an", "antibody", "against", "PIP5K1B", ".", "The", "outline", "indicates", "the", "LAMP2", "-", "positive", "fraction", ".", "(", "f", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "4", " ", "h", ",", "autolysosomes", "were", "purified", "by", "density", "fractionation", "and", "the", "quality", "of", "purified", "autolysosomes", "was", "monitored", "by", "TEM", "(", "left", "panel", ")", ".", "Right", "panel", ",", "purified", "autolysosomes", "stained", "with", "antibodies", "against", "PI", "(", "4", ")", "P", "and", "PtdIns", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", ".", "Scale", "bar", ",", "500", " ", "nm", ".", "(", "g", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "0", "or", "4", " ", "h", "and", "stained", "with", "antibody", "against", "PI", "(", "4", ")", "P", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "h", ")", "NRK", "cells", "lines", "stably", "expressing", "OSBP", "-", "PH", "-", "GFP", ";", "LAMP1", "-", "Cherry", "were", "starved", "for", "0", ",", "4", ",", "or", "8", " ", "h", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "i", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "OSBP", "-", "PH", "-", "GFP", ";", "LAMP1", "-", "Cherry", "were", "transfected", "with", "PIP5K1B", "-", "RNAi", ".", "At", "60", " ", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "starved", "for", "12", " ", "h", "and", "analysed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "j", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "-", "or", "PIP5K1B", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ",", "and", "then", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "The", "insets", "in", "a", ",", "h", "-", "j", "represent", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "(", "k", ")", "Cells", "from", "g", "were", "analysed", "for", "Pearson", "'", "s", "co", "-", "localization", "coefficent", "(", "R", "(", "r", ")", ")", "by", "Olympus", "Fluoview", ".", "n", " ", "=", " ", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) NRK cell lines stably expressing CFP-LC3; LAMP1-YFP were transfected with nonspecific (NS)- or PIP5K1B-RNAi and starved for 12 h. Scale bars, 5 μm. (b) Cells from a were assessed for enlarged autolysosomes in a blind fashion after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d.(c) Representative TEM micrographs of nonspecific- or PIP5K1B-RNAi-transfected NRK cells after 12 h of serum starvation. Scale bar, 5 μm.(d) NRK cells were starved for 4 h, stained with antibodies against PIP5K1B and LAMP1, and then analysed by 3D-SIM. Scale bar, 2.5 μm. The right panels show enlarged regions of interest from the left panel: T, top view; L, lateral view; B, bottom view.(e) Fractions from Fig. 2f were analysed by western blotting with an antibody against PIP5K1B. The outline indicates the LAMP2-positive fraction.(f) NRK cells were starved for 4 h, autolysosomes were purified by density fractionation and the quality of purified autolysosomes was monitored by TEM (left panel). Right panel, purified autolysosomes stained with antibodies against PI(4)P and PtdIns(4,5)P2. Scale bar, 500 nm.(g) NRK cells were starved for 0 or 4 h and stained with antibody against PI(4)P. Scale bar, 5 μm.(h) NRK cells lines stably expressing OSBP-PH-GFP;LAMP1-Cherry were starved for 0, 4, or 8 h and observed by confocal microscopy. Scale bars, 5 μm.(i) NRK cell lines stably expressing OSBP-PH-GFP;LAMP1-Cherry were transfected with PIP5K1B-RNAi. At 60 h after transfection, cells were starved for 12 h and analysed by confocal microscopy. Scale bar, 5 μm.(j) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry;clathrin-GFP were transfected with nonspecific- or PIP5K1B-RNAi and starved for 12 h, and then observed by confocal microscopy. Scale bars, 5 μm. The insets in a, h-j represent enlarged regions of interest.(k) Cells from g were analysed for Pearson's co-localization coefficent (R(r)) by Olympus Fluoview. n = 30 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "PIP5K1A", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "10", " ", "h", ".", "The", "insets", "represent", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "the", "presence", "of", "elongated", "reformation", "tubules", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "the", "length", "of", "reformation", "tubules", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "50", "cells", "were", "counted", ".", "The", "average", "tubule", "length", "is", "indicated", "above", "each", "column", ".", "(", "d", ")", "Diagram", "of", "reformation", "tubules", ".", "R", ",", "radius", "of", "main", "body", ";", "L", ",", "length", ".", "(", "e", ")", "Representative", "image", "of", "reformation", "tubules", "in", "nonspecific", "-", "or", "PIP5K1A", "-", "RNAi", "-", "transfected", "cells", ".", "The", "top", "and", "bottom", "panels", "show", "two", "randomly", "selected", "images", "of", "the", "respective", "samples", ".", "(", "f", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "the", "L", "/", "R", "ratio", "of", "reformation", "tubules", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "25", "cells", "were", "counted", ".", "The", "average", "L", "/", "R", "is", "indicated", "above", "each", "column", ".", "(", "g", ")", "Purified", "reformation", "tubules", "were", "monitored", "by", "TEM", ".", "Scale", "bar", ",", "250", " ", "nm", ".", "(", "h", ")", "Purified", "reformation", "tubules", "stained", "with", "antibodies", "against", "PI", "(", "4", ")", "P", ",", "PtdIns", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "and", "PIP5K1A", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "nm", ".", "(", "i", ")", "Fractions", "from", "Fig", ".", "2f", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "an", "antibody", "against", "PIP5K1A", ".", "The", "outline", "indicates", "the", "LAMP2", "-", "positive", "fraction", ".", "(", "j", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "starved", "for", "8", "h", ",", "and", "the", "budding", "of", "proto", "-", "lysosomes", "was", "monitored", "by", "spinning", "-", "disc", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "nm", ".", "(", "k", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "starved", "for", "8", " ", "h", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "right", "panels", "show", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "l", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "-", "or", "PIP5K1A", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "8", " ", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "The", "middle", "panels", "show", "enlarged", "regions", "of", "interest", "from", "the", "upper", "panels", ".", "The", "distance", "between", "clathrin", "dots", "on", "each", "reformation", "tubule", "in", "the", "upper", "panels", "is", "shown", "in", "diagrammatic", "form", "in", "the", "lower", "panels", ".", "Black", "line", ":", "reformation", "tubules", ";", "red", "dot", ":", "clathrin", ".", "(", "m", ")", "The", "distance", "between", "two", "clathrin", "dots", "on", "reformation", "tubules", "(", "RTs", ")", "in", "cells", "from", "l", "was", "accessed", "in", "a", "blind", "fashion", ".", "Twenty", "-", "five", "cells", "were", "counted", ".", "The", "average", "distance", "between", "two", "clathrin", "dots", "is", "indicated", "above", "each", "column", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) NRK cells stably expressing CFP-LC3;LAMP1-YFP were transfected with nonspecific (NS)- or PIP5K1A-RNAi and starved for 10 h. The insets represent enlarged regions of interest. Scale bar, 5 μm. (b) Cells from a were assessed for the presence of elongated reformation tubules in a blind fashion after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d. (c) Cells from a were assessed for the length of reformation tubules in a blind fashion after starvation and quantified. 50 cells were counted. The average tubule length is indicated above each column. (d) Diagram of reformation tubules. R, radius of main body; L, length. (e) Representative image of reformation tubules in nonspecific- or PIP5K1A-RNAi-transfected cells. The top and bottom panels show two randomly selected images of the respective samples.(f) Cells from a were assessed for the L/R ratio of reformation tubules in a blind fashion after starvation and quantified. 25 cells were counted. The average L/R is indicated above each column.(g) Purified reformation tubules were monitored by TEM. Scale bar, 250 nm.(h) Purified reformation tubules stained with antibodies against PI(4)P, PtdIns(4,5)P2 and PIP5K1A. Scale bar, 250 nm.(i) Fractions from Fig. 2f were analysed by western blotting with an antibody against PIP5K1A. The outline indicates the LAMP2-positive fraction.(j) NRK cells stably expressing CFP-LC3;LAMP1-YFP were starved for 8 h, and the budding of proto-lysosomes was monitored by spinning-disc microscopy. Scale bar, 100 nm.(k) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry;clathrin-GFP were starved for 8 h and observed by confocal microscopy. The right panels show enlarged regions of interest. Scale bar, 5 μm.(l) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry;clathrin-GFP were transfected with nonspecific- or PIP5K1A-RNAi and starved for 8 h. Scale bar, 5 μm. The middle panels show enlarged regions of interest from the upper panels. The distance between clathrin dots on each reformation tubule in the upper panels is shown in diagrammatic form in the lower panels. Black line: reformation tubules; red dot: clathrin. (m) The distance between two clathrin dots on reformation tubules (RTs) in cells from l was accessed in a blind fashion. Twenty-five cells were counted. The average distance between two clathrin dots is indicated above each column. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "AP2", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "enlarged", "autolysosomes", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Representative", "TEM", "micrographs", "of", "nonspecific", "-", "or", "AP2", "-", "RNAi", "-", "transfected", "NRK", "cells", "after", "12", " ", "h", "of", "serum", "starvation", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "d", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "4", " ", "h", ",", "stained", "with", "antibodies", "against", "AP2", "and", "LAMP1", ",", "and", "then", "analysed", "by", "3D", "-", "SIM", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "The", "right", "panels", "show", "enlarged", "regions", "of", "interest", "from", "the", "left", "panel", ":", "T", ",", "top", "view", ";", "L", ",", "lateral", "view", ";", "B", ",", "bottom", "view", ".", "(", "e", ")", "Fractions", "from", "Fig", ".", "2f", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "an", "antibody", "against", "AP2α", ".", "The", "outline", "indicates", "the", "LAMP2", "-", "positive", "fraction", ".", "(", "g", ")", "Purified", "autolysosomes", "were", "treated", "with", "trypsin", ",", "incubated", "with", "rat", "brain", "cytosol", ",", "washed", "and", "then", "analysed", "by", "western", "blot", "with", "antibodies", "against", "AP2α", "and", "LAMP2", ".", "(", "h", ")", "Stripped", "autolysosomes", "were", "pretreated", "with", "GFP", "or", "PtdIns", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", "antibody", "and", "then", "incubated", "with", "rat", "brain", "cytosol", ".", "Autolysosomes", "were", "washed", "and", "then", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "antibodies", "against", "AP2α", "and", "LAMP2", ".", "(", "i", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "-", "or", "AP2", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "The", "insets", "in", "a", ",", "c", "and", "i", "represent", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "(", "j", ")", "Cells", "from", "i", "were", "analysed", "for", "the", "Pearson", "'", "s", "co", "-", "localization", "coefficent", "(", "R", "(", "r", ")", ")", "by", "Olympus", "Fluoview", ".", "n", " ", "=", " ", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) NRK cells stably expressing CFP-LC3; LAMP1-YFP were transfected with nonspecific (NS)- or AP2-RNAi and starved for 12 h. Scale bars, 5 μm. (b) Cells from a were assessed for enlarged autolysosomes in a blind fashion after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d.(c) Representative TEM micrographs of nonspecific- or AP2-RNAi-transfected NRK cells after 12 h of serum starvation. Scale bars, 5 μm.(d) NRK cells were starved for 4 h, stained with antibodies against AP2 and LAMP1, and then analysed by 3D-SIM. Scale bar, 5 μm. The right panels show enlarged regions of interest from the left panel: T, top view; L, lateral view; B, bottom view.(e) Fractions from Fig. 2f were analysed by western blotting with an antibody against AP2α. The outline indicates the LAMP2-positive fraction.(g) Purified autolysosomes were treated with trypsin, incubated with rat brain cytosol, washed and then analysed by western blot with antibodies against AP2α and LAMP2.(h) Stripped autolysosomes were pretreated with GFP or PtdIns(4,5)P2 antibody and then incubated with rat brain cytosol. Autolysosomes were washed and then analysed by western blotting with antibodies against AP2α and LAMP2.(i) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry;clathrin-GFP were transfected with nonspecific- or AP2-RNAi and starved for 12 h. Scale bar, 5 μm. The insets in a, c and i represent enlarged regions of interest. (j) Cells from i were analysed for the Pearson's co-localization coefficent (R(r)) by Olympus Fluoview. n = 30 cells from three independent experiments). Error bars indicate the s.d. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "NRK", "cells", "stably", "expressing", "CFP", "-", "LC3", ";", "LAMP1", "-", "YFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "AP4", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "enlarged", "autolysosomes", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Representative", "TEM", "micrographs", "of", "nonspecific", "-", "or", "AP4", "-", "RNAi", "-", "transfected", "NRK", "cells", "after", "12", " ", "h", "of", "serum", "starvation", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "d", ")", "NRK", "cells", "were", "starved", "for", "0", ",", "4", ",", "8", "or", "12", "h", ",", "and", "isolated", "lysosomes", "/", "autolysosome", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "AP4", "or", "LAMP2", ".", "(", "e", ")", "Purified", "reformation", "tubules", "were", "stained", "with", "antibodies", "against", "AP4", "and", "LAMP1", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", ".", "The", "bottom", "row", "shows", "enlarged", "regions", "of", "interest", "from", "the", "top", "panel", ".", "(", "f", ")", "NRK", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "and", "LAMP1", "-", "GFP", ".", "At", "20", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "starved", "for", "0", "or", "8", "h", ",", "and", "then", "collected", "and", "analysed", "by", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "and", "western", "blotting", "(", "WB", ")", "of", "proteins", "as", "indicated", ",", "using", "stably", "expressed", "LAMP1", "-", "GFP", "as", "bait", ".", "TCL", ",", "total", "cell", "lysate", ".", "The", "insets", "in", "a", ",", "c", "and", "g", "represent", "enlarged", "regions", "of", "interest", ".", "(", "g", ")", "NRK", "cell", "lines", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "Cherry", ";", "clathrin", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "-", "or", "AP4", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "h", ")", "Cells", "from", "g", "were", "analysed", "for", "the", "Pearson", "'", "s", "co", "-", "localization", "coefficent", "(", "R", "(", "r", ")", ")", "by", "Olympus", "Fluoview", ".", "n", " ", "=", " ", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) NRK cells stably expressing CFP-LC3; LAMP1-YFP were transfected with nonspecific (NS)- or AP4-RNAi and starved for 12 h. Scale bars, 5 μm. (b) Cells from a were assessed for enlarged autolysosomes in a blind fashion after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d.(c) Representative TEM micrographs of nonspecific- or AP4-RNAi-transfected NRK cells after 12 h of serum starvation. Scale bars, 5 μm.(d) NRK cells were starved for 0, 4, 8 or 12 h, and isolated lysosomes/autolysosome were analysed by western blotting using antibodies against AP4 or LAMP2.(e) Purified reformation tubules were stained with antibodies against AP4 and LAMP1. Scale bar, 2 μm. The bottom row shows enlarged regions of interest from the top panel.(f) NRK cells were transfected with GFP and LAMP1-GFP. At 20 h after transfection, cells were starved for 0 or 8 h, and then collected and analysed by immunoprecipitation (IP) and western blotting (WB) of proteins as indicated, using stably expressed LAMP1-GFP as bait. TCL, total cell lysate.The insets in a, c and g represent enlarged regions of interest. (g) NRK cell lines stably expressing LAMP1-Cherry; clathrin-GFP were transfected with nonspecific- or AP4-RNAi and starved for 12 h. Scale bars, 5 μm. (h) Cells from g were analysed for the Pearson's co-localization coefficent (R(r)) by Olympus Fluoview. n = 30 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Purified", "autolysosomes", "were", "treated", "with", "trypsin", ".", "The", "trypsin", "-", "treated", "(", "stripped", ")", "autolysosomes", "were", "incubated", "with", "rat", "brain", "cytosol", "and", "reaction", "mixture", ",", "and", "then", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "HC", ",", "heavy", "chain", ".", "(", "b", ")", "Scanning", "electron", "micrographs", "of", "purified", "autolysosomes", ",", "rat", "brain", "cytosol", ",", "trypsin", "-", "treated", "purified", "autolysosomes", "and", "trypsin", "-", "treated", "purified", "autolysosomes", "after", "the", "membrane", "budding", "assay", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "nm", ".", "The", "arrows", "indicate", "buds", ".", "(", "c", ")", "Trypsin", "-", "treated", "autolysosomes", "were", "incubated", "with", "rat", "brain", "cytosol", "and", "reaction", "mixture", "in", "the", "presence", "of", "antibodies", "against", "GFP", ",", "clathrin", ",", "AP2", ",", "AP3", ",", "AP4", "and", "PtdIns", "(", "4", ",", "5", ")", "P2", ",", "and", "then", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "(", "d", ")", "Reactions", "from", "c", "were", "visualized", "by", "scanning", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "250", " ", "nm", ".", "Arrow", "indicates", "bud", ".", "(", "e", ")", "Samples", "from", "d", "were", "quantified", "for", "the", "number", "of", "buds", "on", "each", "autolysosome", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "n", " ", "=", " ", "50", "autolysosomes", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S6", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Purified autolysosomes were treated with trypsin. The trypsin-treated (stripped) autolysosomes were incubated with rat brain cytosol and reaction mixture, and then analysed by western blotting. HC, heavy chain.(b) Scanning electron micrographs of purified autolysosomes, rat brain cytosol, trypsin-treated purified autolysosomes and trypsin-treated purified autolysosomes after the membrane budding assay. Scale bar, 250 nm. The arrows indicate buds.(c) Trypsin-treated autolysosomes were incubated with rat brain cytosol and reaction mixture in the presence of antibodies against GFP, clathrin, AP2, AP3, AP4 and PtdIns(4,5)P2, and then analysed by western blotting.(d) Reactions from c were visualized by scanning electron microscopy. Scale bar, 250 nm. Arrow indicates bud. (e) Samples from d were quantified for the number of buds on each autolysosome. Error bars represent s.d. n = 50 autolysosomes from three independent experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S6."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ")", "NRK", "cells", "were", "transfected", "with", "nonspecific", "(", "NS", ")", "-", "or", "Cltc", "(", "clathrin", "heavy", "chain", ")", "-", "RNAi", "and", "starved", "for", "0", ",", "4", ",", "8", "or", "12", " ", "h", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "mm", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "antibodies", "against", "LC3", ".", "(", "b", ")", "Cells", "from", "a", "were", "assessed", "for", "LC3", "puncta", "in", "a", "blind", "fashion", "after", "starvation", "and", "quantified", ".", "n", " ", "=", " ", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "s", ".", "d", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a) NRK cells were transfected with nonspecific (NS)- or Cltc (clathrin heavy chain)-RNAi and starved for 0, 4, 8 or 12 h. Scale bar, 5 mm. Cells were stained with antibodies against LC3. (b) Cells from a were assessed for LC3 puncta in a blind fashion after starvation and quantified. n = 100 cells from three independent experiments. Error bars indicate the s.d."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Diagrams", "of", "the", "deletion", "-", "mutation", "constructs", "of", "Keap1", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "immunoprecipitation", "assays", "(", "right", ")", ".", "Each", "Flag", "-", "tagged", "mouse", "Keap1", "and", "mutant", "was", "expressed", "in", "HEK293T", "cells", ".", "At", "22", "h", "after", "transfection", ",", "lysates", "were", "prepared", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "resulting", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "p62", ",", "anti", "-", "Nrf2", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "individual", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Diagrams", "of", "the", "deletion", "-", "mutation", "constructs", "of", "p62", "(", "left", ")", "and", "the", "corresponding", "input", "(", "upper", "right", ")", "and", "pull", "-", "down", "assay", "(", "lower", "right", ")", ".", "The", "MBP", "-", "tagged", "mouse", "p62", "deletion", "mutants", "conjugated", "to", "amylose", "(", "AM", ")", "resins", "were", "incubated", "with", "purified", "GST", "-", "tagged", "mouse", "Keap1", "-", "DC", ".", "The", "pulled", "-", "down", "complexes", "with", "the", "MBP", "-", "p62", "mutants", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "revealed", "by", "staining", "with", "Coomassie", "brilliant", "blue", ".", "The", "bands", "corresponding", "to", "MBP", "-", "p62", "and", "its", "mutants", "are", "indicated", "by", "black", "dots", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "the", "band", "corresponding", "to", "GST", "-", "Keap1", "-", "DC", ".", "For", "details", "of", "construct", "14", "see", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S3", ".", "(", "d", ")", "Immunoprecipitation", "assays", ".", "Flag", "-", "tagged", "p62", ",", "KIR", "-", "deleted", "p62", "(", "p62", "ΔKIR", ")", "and", "a", "p62", "mutant", "defective", "in", "oligomerization", "(", "p62", "K7AD69A", ")", "were", "expressed", "in", "primary", "mouse", "hepatocytes", "by", "the", "adenovirus", "system", "(", "left", ")", "or", "in", "HEK293T", "cells", "by", "transfection", "(", "right", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "resulting", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "p62", "and", "anti", "-", "Keap1", "antibodies", ".", "The", "bands", "corresponding", "to", "Flag", "-", "p62", ",", "endogenous", "p62", ",", "Keap1", "and", "actin", "are", "indicated", ".", "The", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", ".", "(", "e", ")", "Interaction", "of", "endogenous", "p62", "with", "Keap1", ".", "Lysates", "prepared", "from", "the", "human", "hepatocellular", "carcinoma", "cell", "line", "Huh", "-", "1", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "p62", "antibody", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", "(", "negative", "control", ")", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "p62", "and", "Keap1", ".", "The", "bands", "corresponding", "to", "endogenous", "p62", ",", "Keap1", "and", "IgG", "heavy", "chain", "(", "IgG", "H", ".", "C", ".", ")", "are", "indicated", ".", "The", "data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S11", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Diagrams of the deletion-mutation constructs of Keap1 (left) and the corresponding immunoprecipitation assays (right). Each Flag-tagged mouse Keap1 and mutant was expressed in HEK293T cells. At 22 h after transfection, lysates were prepared and immunoprecipitated with anti-Flag antibody. The resulting immunoprecipitates were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with anti-Flag, anti-p62, anti-Nrf2 and anti-actin antibodies. Data are representative of three individual experiments.(b) Diagrams of the deletion-mutation constructs of p62 (left) and the corresponding input (upper right) and pull-down assay (lower right). The MBP-tagged mouse p62 deletion mutants conjugated to amylose (AM) resins were incubated with purified GST-tagged mouse Keap1-DC. The pulled-down complexes with the MBP-p62 mutants were subjected to SDS-PAGE and revealed by staining with Coomassie brilliant blue. The bands corresponding to MBP-p62 and its mutants are indicated by black dots. Red arrowheads indicate the band corresponding to GST-Keap1-DC. For details of construct 14 see Supplementary Information, Fig. S3.(d) Immunoprecipitation assays. Flag-tagged p62, KIR-deleted p62 (p62 ΔKIR) and a p62 mutant defective in oligomerization (p62 K7AD69A) were expressed in primary mouse hepatocytes by the adenovirus system (left) or in HEK293T cells by transfection (right). Cell lysates were immunoprecipitated with anti-Flag antibody. The resulting immunoprecipitates were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with anti-p62 and anti-Keap1 antibodies. The bands corresponding to Flag-p62, endogenous p62, Keap1 and actin are indicated. The data shown are representative of three separate experiments.(e) Interaction of endogenous p62 with Keap1. Lysates prepared from the human hepatocellular carcinoma cell line Huh-1 were immunoprecipitated with anti-p62 antibody or anti-Flag antibody (negative control) followed by immunoblotting with antibodies against p62 and Keap1. The bands corresponding to endogenous p62, Keap1 and IgG heavy chain (IgG H.C.) are indicated. The data shown are representative of three separate experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S11."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "A", "representative", "ITC", "profile", "of", "the", "titration", "of", "Keap1", "-", "DC", "with", "p62M7", "(", "residues", "168", "-", "391", ")", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "the", "raw", "ITC", "thermograms", "and", "the", "lower", "panel", "shows", "the", "fitted", "binding", "isotherms", ".", "(", "b", ")", "Immunoprecipitation", "assays", ".", "Flag", "-", "tagged", "Keap1", "was", "co", "-", "expressed", "with", "increasing", "concentrations", "of", "green", "fluorescent", "protein", "(", "GFP", ")", "-", "p62", "(", "lanes", "3", "-", "6", ")", "in", "HEK293T", "cells", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "resulting", "immunoprecipitates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "p62", "and", "anti", "-", "Nrf2", "antibodies", ".", "The", "bands", "corresponding", "to", "Flag", "-", "Keap1", ",", "endogenous", "p62", ",", "Nrf2", "and", "actin", "are", "indicated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ")", "The", "competitive", "p62", "activity", "against", "Keap1", "was", "measured", "by", "luciferase", "assay", ".", "The", "expression", "plasmids", "for", "Nrf2", ",", "Keap1", "and", "p62", "wild", "-", "type", "(", "w", ".", "t", ".", ")", "or", "its", "mutants", "were", "transfected", "into", "Hepa1", "cells", "along", "with", "pNqo1", "-", "ARE", "reporter", "plasmid", "and", "pRL", "-", "TK", "as", "an", "internal", "control", ".", "At", "36", "h", "after", "transfection", ",", "the", "luciferase", "activity", "was", "measured", "in", "accordance", "with", "the", "instructions", "provided", "by", "the", "manufacturer", ".", "Assays", "were", "performed", "twice", "in", "triplicate", ".", "Data", "are", "means", "and", "s", ".", "d", ".", "for", "six", "determinations", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "analysis", ".", "Flag", "-", "tagged", "p62", "and", "its", "mutants", "defective", "in", "interacting", "with", "Keap1", "were", "overproduced", "in", "wild", "-", "type", "and", "p62", "−", "/", "−", "primary", "mouse", "hepatocytes", "by", "the", "adenovirus", "system", ".", "At", "48", "h", "after", "infection", ",", "total", "cell", "lysates", "and", "nuclear", "fractions", "were", "prepared", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "with", "the", "antibodies", "specified", ".", "The", "bands", "corresponding", "to", "Flag", "-", "p62", ",", "endogenous", "p62", ",", "Keap1", ",", "Nrf2", ",", "Nqo1", ",", "actin", "and", "Lamin", "B", "are", "shown", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S11", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "mRNA", "levels", "of", "the", "detoxification", "enzymes", "Nqo1", ",", "Gstm1", "and", "Cyp2a5", "in", "hepatocytes", "overexpressing", "Flag", "-", "p62", "and", "its", "mutants", ".", "Total", "RNAs", "were", "prepared", "from", "non", "-", "infected", "or", "infected", "hepatocytes", "and", "reverse", "transcribed", "into", "their", "respective", "cDNAs", ",", "which", "were", "used", "as", "templates", "in", "real", "-", "time", "PCR", "analysis", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "amount", "of", "each", "mRNA", "in", "the", "non", "-", "infected", "hepatocytes", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "three", "times", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) A representative ITC profile of the titration of Keap1-DC with p62M7 (residues 168-391). The upper panel shows the raw ITC thermograms and the lower panel shows the fitted binding isotherms.(b) Immunoprecipitation assays. Flag-tagged Keap1 was co-expressed with increasing concentrations of green fluorescent protein (GFP)-p62 (lanes 3-6) in HEK293T cells. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-Flag antibody. The resulting immunoprecipitates were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with anti-Flag, anti-p62 and anti-Nrf2 antibodies. The bands corresponding to Flag-Keap1, endogenous p62, Nrf2 and actin are indicated. Data are representative of three independent experiments.(c) The competitive p62 activity against Keap1 was measured by luciferase assay. The expression plasmids for Nrf2, Keap1 and p62 wild-type (w.t.) or its mutants were transfected into Hepa1 cells along with pNqo1-ARE reporter plasmid and pRL-TK as an internal control. At 36 h after transfection, the luciferase activity was measured in accordance with the instructions provided by the manufacturer. Assays were performed twice in triplicate. Data are means and s.d. for six determinations.(d) Immunoblot analysis. Flag-tagged p62 and its mutants defective in interacting with Keap1 were overproduced in wild-type and p62−/− primary mouse hepatocytes by the adenovirus system. At 48 h after infection, total cell lysates and nuclear fractions were prepared and subjected to immunoblot analysis with the antibodies specified. The bands corresponding to Flag-p62, endogenous p62, Keap1, Nrf2, Nqo1, actin and Lamin B are shown. Data are representative of three independent experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S11.(e) Quantification of mRNA levels of the detoxification enzymes Nqo1, Gstm1 and Cyp2a5 in hepatocytes overexpressing Flag-p62 and its mutants. Total RNAs were prepared from non-infected or infected hepatocytes and reverse transcribed into their respective cDNAs, which were used as templates in real-time PCR analysis. Values were normalized to the amount of each mRNA in the non-infected hepatocytes. The experiments were performed three times. Data are means ± s.d. for three experiments."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Insolubilization", "of", "Keap1", "in", "Atg7", "-", "deficient", "hepatocytes", ".", "Liver", "homogenates", "from", "Atg7F", "/", "F", ":", "Mx1", "mice", "on", "various", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "separated", "into", "detergent", "-", "soluble", "and", "detergent", "-", "insoluble", "fractions", "with", "0", ".", "5", "%", "Triton", "X", "-", "100", ".", "Each", "fraction", "was", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "data", "displayed", "are", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "Atg7", "-", "deficient", "(", "Atg7F", "/", "F", ":", "Mx1", ";", "Atg7F", "/", "F", "shown", "here", "as", "F", "/", "F", ")", "and", "Atg7", "p62", "-", "deficient", "(", "Atg7F", "/", "F", ":", "Mx1", ":", "p62", "−", "/", "−", ")", "livers", ".", "Liver", "homogenates", "from", "mice", "of", "the", "stated", "genotypes", "at", "12", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "separated", "into", "detergent", "-", "soluble", "and", "detergent", "-", "insoluble", "fractions", ".", "Each", "fraction", "was", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Atg7F", "/", "F", "mice", "in", "which", "Atg7", "is", "efficiently", "expressed", "at", "a", "level", "similar", "to", "that", "in", "the", "wild", "-", "type", "mice", "were", "used", "as", "control", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "separate", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S11", ".", "(", "c", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "analyses", "of", "Nqo1", "and", "Gstm1", "in", "mouse", "livers", ".", "Total", "RNAs", "were", "prepared", "from", "livers", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "12", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "amount", "of", "mRNA", "in", "Atg7F", "/", "F", "liver", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "experiments", ".", "(", "d", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "the", "cellular", "localization", "of", "p62", "and", "Keap1", ".", "Liver", "sections", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "Keap1", "(", "top", ")", "and", "anti", "-", "p62", "(", "middle", ")", "antibodies", ".", "Bottom", ":", "merged", "images", "of", "Keap1", "(", "green", ")", "and", "p62", "(", "red", ")", ".", "Each", "inset", "in", "the", "Atg7", "-", "deficient", "liver", "panels", "is", "a", "magnified", "image", "of", "the", "boxed", "region", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Insolubilization of Keap1 in Atg7-deficient hepatocytes. Liver homogenates from Atg7F/F:Mx1 mice on various days after injection of poly(I)•poly(C) were separated into detergent-soluble and detergent-insoluble fractions with 0.5% Triton X-100. Each fraction was subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with the indicated antibodies. The data displayed are representative of three separate experiments.(b) Immunoblot analysis of Atg7-deficient (Atg7F/F:Mx1; Atg7F/F shown here as F/F) and Atg7 p62-deficient (Atg7F/F:Mx1:p62−/−) livers. Liver homogenates from mice of the stated genotypes at 12 days after injection of poly(I)•poly(C) were separated into detergent-soluble and detergent-insoluble fractions. Each fraction was subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with the indicated antibodies. Atg7F/F mice in which Atg7 is efficiently expressed at a level similar to that in the wild-type mice were used as control. Data shown are representative of three separate experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S11.(c) Quantitative real-time PCR analyses of Nqo1 and Gstm1 in mouse livers. Total RNAs were prepared from livers of the indicated genotypes at 12 days after injection of poly(I)•poly(C). Values were normalized to the amount of mRNA in Atg7F/F liver. Data are means ± s.d. for three experiments.(d) Immunofluorescence analysis of the cellular localization of p62 and Keap1. Liver sections from mice of the indicated genotypes at 28 days after injection of poly(I)•poly(C) were immunostained with anti-Keap1 (top) and anti-p62 (middle) antibodies. Bottom: merged images of Keap1 (green) and p62 (red). Each inset in the Atg7-deficient liver panels is a magnified image of the boxed region. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Immunoblotting", "of", "Atg7", "-", "deficient", "(", "Atg7F", "/", "F", ":", "Mx1", ";", "Atg7F", "/", "F", "shown", "here", "as", "F", "/", "F", ")", "and", "Atg7", "Nrf2", "-", "deficient", "(", "Atg7F", "/", "F", ":", "Mx1", ":", "Nrf2", "−", "/", "−", ")", "livers", ".", "Liver", "homogenates", "from", "mice", "of", "the", "assigned", "genotypes", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "separated", "into", "detergent", "-", "soluble", "and", "detergent", "-", "insoluble", "fractions", ".", "Total", ",", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "top", "section", ")", ".", "Total", "lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "Nqo1", ",", "Gstm1", "and", "actin", "(", "bottom", "left", "section", ")", ".", "Nuclear", "fractions", "were", "prepared", "from", "the", "livers", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", ",", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "Nrf2", "and", "Lamin", "B", "(", "as", "control", ")", "(", "bottom", "right", "section", ")", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S11", ".", "(", "b", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "the", "cellular", "localization", "of", "p62", "and", "Keap1", ".", "Liver", "sections", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "Keap1", "(", "left", ")", "and", "anti", "-", "p62", "(", "middle", ")", "antibodies", ".", "Right", ":", "merged", "images", "of", "Keap1", "(", "green", ")", "and", "p62", "(", "red", ")", ".", "Each", "inset", "in", "the", "Atg7", "-", "deficient", "and", "Atg7", "Nrf2", "-", "deficient", "liver", "panels", "is", "a", "magnified", "image", "of", "the", "boxed", "region", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "c", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "analyses", "of", "Nqo1", ",", "Gstm1", "and", "Cyp2a5", "in", "mouselivers", ".", "Total", "RNAs", "were", "prepared", "from", "livers", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "amount", "of", "mRNA", "in", "the", "Atg7F", "/", "F", "liver", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "experiments", ".", "(", "d", ")", "Liver", "weight", ".", "The", "weights", "of", "the", "mouse", "livers", "of", "the", "different", "genotypes", "shown", "at", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", "were", "measured", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "five", "mice", "from", "each", "group", ".", "Three", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "e", ")", "Histological", "analysis", "of", "the", "mouse", "liver", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "At", "28", "days", "after", "injection", "of", "poly", "(", "I", ")", "•", "poly", "(", "C", ")", ",", "the", "livers", "were", "processed", "for", "haematoxylin", "/", "eosin", "staining", ".", "Higher", "-", "magnification", "views", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "panels", ".", "CV", ",", "central", "vein", ";", "P", ",", "portal", "vein", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "f", ")", "Liver", "function", "tests", "of", "the", "mice", "used", "in", "d", ".", "The", "serum", "levels", "of", "aspartate", "aminotransferase", "(", "AST", ")", ",", "alanine", "aminotransferase", "(", "ALT", ")", "and", "alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", "were", "measured", ".", "(", "IU", "/", "L", ",", "international", "unit", "per", "liter", ")", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "seven", "mice", "from", "each", "group", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", ";", "three", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Immunoblotting of Atg7-deficient (Atg7F/F:Mx1; Atg7F/F shown here as F/F) and Atg7 Nrf2-deficient (Atg7F/F:Mx1:Nrf2−/−) livers. Liver homogenates from mice of the assigned genotypes at 28 days after injection of poly(I)•poly(C) were separated into detergent-soluble and detergent-insoluble fractions. Total, soluble and insoluble fractions were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with the indicated antibodies (top section). Total lysates were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with antibodies against Nqo1, Gstm1 and actin (bottom left section). Nuclear fractions were prepared from the livers of the indicated genotypes at 28 days after injection of poly(I)•poly(C), subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with antibodies against Nrf2 and Lamin B (as control) (bottom right section). Data were obtained from three independent experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S11.(b) Immunofluorescence analysis of the cellular localization of p62 and Keap1. Liver sections from mice of the indicated genotypes at 28 days after injection of poly(I)•poly(C) were immunostained with anti-Keap1 (left) and anti-p62 (middle) antibodies. Right: merged images of Keap1 (green) and p62 (red). Each inset in the Atg7-deficient and Atg7 Nrf2-deficient liver panels is a magnified image of the boxed region. Scale bars, 20 μm.(c) Quantitative real-time PCR analyses of Nqo1, Gstm1 and Cyp2a5 in mouselivers. Total RNAs were prepared from livers of the indicated genotypes at 28 days after injection of poly(I)•poly(C). Values were normalized to the amount of mRNA in the Atg7F/F liver. Data are means ± s.d. for three experiments.(d) Liver weight. The weights of the mouse livers of the different genotypes shown at 28 days after injection of poly(I)•poly(C) were measured. Data are means ± s.d. for five mice from each group. Three asterisks, P 0.001 (Student's t-test).(e) Histological analysis of the mouse liver of the indicated genotypes. At 28 days after injection of poly(I)•poly(C), the livers were processed for haematoxylin/eosin staining. Higher-magnification views are shown in the bottom panels. CV, central vein; P, portal vein. Scale bars, 100 μm.(f) Liver function tests of the mice used in d. The serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) were measured. (IU/L, international unit per liter). Data are means ± s.d. for seven mice from each group. Asterisk, P 0.05; three asterisks, P 0.001."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Immunoblotting", "of", "Keap1", "-", "deficient", "(", "Keap1F", "/", "F", ":", "Alb", ")", "and", "Keap1", "Atg7", "-", "deficient", "(", "Keap1F", "/", "F", ":", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", ")", "livers", ".", "Liver", "homogenates", "from", "8", "-", "week", "-", "old", "mice", "of", "these", "genotypes", "were", "separated", "into", "detergent", "-", "soluble", "and", "detergent", "-", "insoluble", "fractions", ".", "Total", ",", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "top", "section", ")", ".", "Total", "lysates", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "Nqo1", "and", "actin", "(", "bottom", "section", ")", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S11", ".", "(", "b", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "analyses", "of", "Nqo1", ",", "Mrp4", ",", "p62", "and", "Ho", "-", "1", "in", "mouse", "livers", ".", "Total", "RNAs", "were", "prepared", "from", "livers", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "indicated", "genotypes", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "amount", "of", "mRNA", "in", "the", "Atg7F", "/", "F", "liver", "(", "control", ")", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "experiments", ".", "(", "c", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "of", "survival", "of", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "and", "Keap1F", "/", "F", ":", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "mice", ".", "The", "survival", "analysis", "of", "control", "(", "n", "=", "33", ")", ",", "Keap1F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "15", ")", ",", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "Keap1F", "/", "F", ":", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "mice", "(", "n", "=", "14", ")", "was", "based", "on", "a", "16", "-", "week", "follow", "-", "up", "period", ".", "(", "d", ")", "Liver", "weight", "relative", "to", "body", "weight", "was", "measured", "for", "the", "different", "genotypes", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "Atg7F", "/", "F", "(", "control", ")", "(", "n", "=", "24", ")", ",", "Keap1F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "Keap1F", "/", "F", ":", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Two", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "e", ")", "Histological", "analysis", "of", "mouse", "liver", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "The", "livers", "from", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "were", "processed", "for", "haematoxylin", "/", "eosin", "staining", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "left", "bottom", "panel", ")", ";", "20", "μm", "(", "other", "panels", ")", ".", "(", "f", ")", "Liver", "function", "tests", "of", "the", "mice", "used", "in", "d", ".", "The", "serum", "levels", "of", "aspartate", "aminotransferase", "(", "AST", ")", "and", "alanine", "aminotransferase", "(", "ALT", ")", "were", "measured", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "Atg7F", "/", "F", "(", "control", ")", "(", "n", "=", "24", ")", ",", "Keap1F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "Keap1F", "/", "F", ":", "Atg7F", "/", "F", ":", "Alb", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Two", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "01", ".", "(", "g", ")", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "cellular", "localization", "of", "p62", "and", "Keap1", ".", "Paraffin", "sections", "of", "the", "liver", "from", "9", "-", "week", "-", "old", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "immunolabelled", "with", "anti", "-", "p62", "(", "left", ")", "and", "anti", "-", "Keap1", "(", "right", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Immunoblotting of Keap1-deficient (Keap1F/F:Alb) and Keap1 Atg7-deficient (Keap1F/F:Atg7F/F:Alb) livers. Liver homogenates from 8-week-old mice of these genotypes were separated into detergent-soluble and detergent-insoluble fractions. Total, soluble and insoluble fractions were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with the indicated antibodies (top section). Total lysates were subjected to SDS-PAGE and analysed by immunoblotting with antibodies against Nqo1 and actin (bottom section). Data were obtained from three independent experiments. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S11.(b) Quantitative real-time PCR analyses of Nqo1, Mrp4, p62 and Ho-1 in mouse livers. Total RNAs were prepared from livers of 9-week-old indicated genotypes. Values were normalized to the amount of mRNA in the Atg7F/F liver (control). Data are means ± s.d. for three experiments.(c) Kaplan-Meier curves of survival of Atg7F/F:Alb and Keap1F/F:Atg7F/F:Alb mice. The survival analysis of control (n = 33), Keap1F/F:Alb (n = 15), Atg7F/F:Alb (n = 12) and Keap1F/F:Atg7F/F:Alb mice (n = 14) was based on a 16-week follow-up period.(d) Liver weight relative to body weight was measured for the different genotypes. Data are means ± s.d. for Atg7F/F (control) (n = 24), Keap1F/F:Alb (n = 13), Atg7F/F:Alb (n = 9) and Keap1F/F:Atg7F/F:Alb mice (n = 7). Two asterisks, P 0.01 (Student's t-test).(e) Histological analysis of mouse liver of the indicated genotypes. The livers from 9-week-old mice were processed for haematoxylin/eosin staining. Scale bar, 50 μm (left bottom panel); 20 μm (other panels).(f) Liver function tests of the mice used in d. The serum levels of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were measured. Data are means ± s.d. for Atg7F/F (control) (n = 24), Keap1F/F:Alb (n = 13), Atg7F/F:Alb (n = 9) and Keap1F/F:Atg7F/F:Alb mice (n = 7). Two asterisks, P 0.01.(g) Immunohistochemical analysis of cellular localization of p62 and Keap1. Paraffin sections of the liver from 9-week-old mice of the indicated genotypes were immunolabelled with anti-p62 (left) and anti-Keap1 (right) antibodies. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "1E", ")", "Representative", "images", "of", "prometaphase", "chromosomes", "from", "HeLa", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "siRNA", "and", "each", "of", "the", "constructs", "in", "D", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5μm", ".", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "micronuclei", "from", "experiment", "(", "E", ")", ".", "The", "error", "bars", "represent", "the", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "Control", "si", "N", "=", "887", ";", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "si", "N", "=", "1005", ";", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "si", "+", "wt", "N", "=", "760", ";", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "si", "+", "KR", "N", "=", "479", ")", ".", "Data", "sets", "were", "statistically", "analysed", "using", "Chi", "-", "square", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E) Representative images of prometaphase chromosomes from HeLa cells co-transfected with H2A.Z.2 siRNA and each of the constructs in D (green). Scale bar: 5μm. F) Quantification of the percentage of cells with micronuclei from experiment (E). The error bars represent the SD of three biological replicates (Control si N=887; H2A.Z.2 si N=1005; H2A.Z.2 si + wt N=760; H2A.Z.2 si + KR N=479). Data sets were statistically analysed using Chi-square test. "}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Representative", "images", "of", "metaphases", "from", "YFP", ":", "CENP", "-", "A", "(", "green", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "Control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "(", "bottom", ")", "siRNA", ".", "The", "white", "arrowheads", "indicate", "the", "mis", "-", "aligned", "chromosomes", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "C", ")", "Representative", "images", "of", "metaphase", "spreads", "from", "Control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "(", "bottom", ")", "siRNA", "-", "transfected", "HeLa", "cells", "after", "FISH", "with", "a", "Chr17", "centromeric", "probe", "(", "green", ")", ".", "The", "arrowheads", "indicate", "the", "separated", "sister", "chromatids", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "D", ")", "Representative", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "Control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "(", "bottom", ")", "siRNA", ",", "fixed", ",", "and", "stained", "for", "Sgo1", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "Sgo1", "localisation", "in", "pro", "-", "metaphase", "cells", "from", "the", "experiment", "in", "(", "D", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "35", "pro", "-", "metaphase", "cells", "were", "analysed", ".", "J", ")", "Representative", "images", "of", "HeLa", "YFP", ":", "CENP", "-", "A", "(", "green", ")", "mitotic", "cells", "after", "Control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "(", "bottom", ")", "siRNA", "treatment", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "K", ")", "Violin", "plot", "of", "centromeric", "CENP", "-", "A", "intensity", "of", "pro", "-", "metaphase", "/", "metaphase", "cells", "from", "the", "experiments", "in", "J", ".", "(", "Control", "si", "N", "=", "197", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "si", "N", "=", "260", ")", ".", "The", "bar", "represents", "the", "median", ".", "Data", "sets", "were", "statistically", "analysed", "using", "the", "Wilcoxon", "rank", "test", "in", "R", ".", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "L", ")", "Representative", "images", "of", "HeLa", "mitotic", "cells", "stained", "for", "CENP", "-", "C", "after", "Control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "(", "bottom", ")", "siRNA", "treatment", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "M", ")", "Violin", "plot", "of", "centromeric", "CENP", "-", "C", "intensity", "of", "pro", "-", "metaphase", "/", "metaphase", "cells", "from", "the", "experiments", "in", "L", ".", "(", "Control", "si", "N", "=", "1083", "H2A", ".", "Z", ".", "2", "si", "N", "=", "686", ",", "from", "3", "biological", "replicas", ")", ".", "The", "bars", "represent", "the", "median", ".", "Data", "sets", "were", "statistically", "analysed", "using", "the", "Wilcoxon", "rank", "test", "in", "R", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Representative images of metaphases from YFP:CENP-A (green) HeLa cells treated with Control (top) or H2A.Z.2 (bottom) siRNA. The white arrowheads indicate the mis-aligned chromosomes. Scale bar: 10 μm. C) Representative images of metaphase spreads from Control (top) or H2A.Z.2 (bottom) siRNA-transfected HeLa cells after FISH with a Chr17 centromeric probe (green). The arrowheads indicate the separated sister chromatids. Scale bar: 10 μm. D) Representative images of HeLa cells transfected with Control (top) or H2A.Z.2 (bottom) siRNA, fixed, and stained for Sgo1 (green). Scale bar: 10 μm. E) Quantification of Sgo1 localisation in pro-metaphase cells from the experiment in (D). Error bar represents SD of two biological replicates. 35 pro-metaphase cells were analysed. J) Representative images of HeLa YFP:CENP-A (green) mitotic cells after Control (top) or H2A.Z.2 (bottom) siRNA treatment. Scale bar: 5 μm. K) Violin plot of centromeric CENP-A intensity of pro-metaphase/metaphase cells from the experiments in J. (Control si N=197 H2A.Z.2 si N=260). The bar represents the median. Data sets were statistically analysed using the Wilcoxon rank test in R. **=p<0.01. L) Representative images of HeLa mitotic cells stained for CENP-C after Control (top) or H2A.Z.2 (bottom) siRNA treatment. Scale bar: 5 μm. M) Violin plot of centromeric CENP-C intensity of pro-metaphase/metaphase cells from the experiments in L. (Control si N=1083 H2A.Z.2 si N=686, from 3 biological replicas). The bars represent the median. Data sets were statistically analysed using the Wilcoxon rank test in R. ***=p<0.0001. "}
{"words": ["Figure", "3D", ")", "IGV", "analyses", "of", "H2A", ".", "Z", "localisation", "(", "from", "ENCODE", ")", "on", "Aurora", "B", "(", "green", ")", "and", "c", "-", "MYC", "(", "blue", ")", "genes", "showing", "H2A", ".", "Z", "enrichment", "at", "the", "TSS", "and", "at", "the", "upstream", "region", "respectively", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "IGV", "analyses", "of", "ATAC", "seq", "peaks", "for", "Control", "si", "and", "H2A", ".", "Z", ".", "1", "si", "for", "Aurora", "B", "and", "MYC", "genes", ".", "The", "number", "in", "red", "represents", "the", "log2Ratio", "H2AZ", ".", "1", "si", "/", "Control", "si", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D) IGV analyses of H2A.Z localisation (from ENCODE) on Aurora B (green) and c-MYC (blue) genes showing H2A.Z enrichment at the TSS and at the upstream region respectively (bottom panels). IGV analyses of ATAC seq peaks for Control si and H2A.Z.1 si for Aurora B and MYC genes. The number in red represents the log2Ratio H2AZ.1 si/Control si."}
{"words": ["Figure", "4E", ")", "Representative", "images", "of", "Hela", "cell", "stained", "for", "Ki67", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "different", "staining", "patterns", "quantified", ":", "strong", "signal", "(", "grey", "arrow", ")", ",", "weak", "signal", "(", "light", "brown", "arrow", ")", "and", "no", "signal", "(", "dark", "brown", "arrow", "(", "scale", "bar", "10μm", ")", ".", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "experiment", "in", "(", "E", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "standard", "deviation", "from", "3", "biological", "replicates", "Data", "sets", "were", "statistically", "analysed", "using", "a", "Chi", "square", "test", ".", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "G", ")", "Representative", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "(", "top", ")", "or", "H2A", ".", "Z", ".", "1", "(", "bottom", ")", "siRNA", "and", "stained", "for", "Lamin", "A", "/", "C", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4E) Representative images of Hela cell stained for Ki67. The arrows indicate the different staining patterns quantified: strong signal (grey arrow), weak signal (light brown arrow) and no signal (dark brown arrow (scale bar 10μm). F) Quantification of the experiment in (E). Error bars indicate the standard deviation from 3 biological replicates Data sets were statistically analysed using a Chi square test. ***=p<0.001. G) Representative images of HeLa cells transfected with control (top) or H2A.Z.1 (bottom) siRNA and stained for Lamin A/C (green). Scale bar = 10μm."}
{"words": ["Figure", "5C", ")", "Kaplan", "Meier", "survival", "curve", "for", "neuroblastoma", "patients", "with", "low", "(", "red", ")", "or", "high", "(", "blue", ")", "expression", "of", "H2AFZ", "(", "H2A", ".", "Z", ".", "1", ")", "obtained", "from", "R2", "genomics", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C) Kaplan Meier survival curve for neuroblastoma patients with low (red) or high (blue) expression of H2AFZ (H2A.Z.1) obtained from R2 genomics."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "G", "Hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "of", "the", "frontal", "sections", "of", "miniature", "pig", "mandible", "slices", "showing", "morphological", "changes", "during", "the", "permanent", "canine", "(", "PC", ")", "initiation", "stage", "from", "embryonic", "day", "50", "(", "E50", ")", "to", "postnatal", "day", "10", "(", "PN10", ")", ";", "(", "A", "'", "-", "F", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "their", "corresponding", "figure", "panel", ".", "DC", ",", "deciduous", "canine", ";", "PC", ",", "permanent", "canine", ";", "SDL", ",", "successional", "dental", "lamina", ";", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "H", "In", "situ", "hybridization", "(", "ISH", ")", "showing", "the", "expression", "pattern", "of", "Sox2", "in", "the", "initiation", "stage", "from", "E50", "to", "E90", ";", "right", "figure", "panels", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "left", "panels", ".", "Dashed", "lines", "mark", "the", "position", "of", "the", "successional", "dental", "lamina", "(", "SDL", ")", ";", "green", "arrowhead", "indicates", "positive", "staining", "of", "Sox2", "at", "the", "tip", "of", "the", "SDL", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "I", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "of", "Ki67", "at", "the", "SDL", "at", "E60", ",", "E70", ",", "E90", ";", "right", "figure", "panels", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "left", "panels", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "J", "Semi", "-", "quantification", "and", "comparison", "of", "Ki67", "expression", "levels", "during", "E60", ",", "E70", ",", "and", "E90", "stages", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Newman", "-", "Keuls", "post", "-", "hoc", "tests", ")", ".", "K", "TUNEL", "assay", "showing", "the", "apoptosis", "status", "of", "the", "SDL", "at", "E60", ",", "E70", ",", "E90", ";", "right", "figure", "panels", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "left", "panels", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-G Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the frontal sections of miniature pig mandible slices showing morphological changes during the permanent canine (PC) initiation stage from embryonic day 50 (E50) to postnatal day 10 (PN10); (A'-F') are magnifications of boxed regions in their corresponding figure panel. DC, deciduous canine; PC, permanent canine; SDL, successional dental lamina; n = 3. Scale bars = 100 µm.H In situ hybridization (ISH) showing the expression pattern of Sox2 in the initiation stage from E50 to E90; right figure panels are magnifications of boxed regions in left panels. Dashed lines mark the position of the successional dental lamina (SDL); green arrowhead indicates positive staining of Sox2 at the tip of the SDL. n = 3. Scale bars = 100 µm.I Immunofluorescence (IF) of Ki67 at the SDL at E60, E70, E90; right figure panels are magnifications of boxed regions in left panels. n = 3. Scale bars = 100 µm.J Semi-quantification and comparison of Ki67 expression levels during E60, E70, and E90 stages. n = 3. Data information: Data represent the means ± SEM. *P < 0.05 (one-way ANOVA and Newman-Keuls post-hoc tests).K TUNEL assay showing the apoptosis status of the SDL at E60, E70, E90; right figure panels are magnifications of boxed regions in left panels. n = 3. Scale bars = 100 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Three", "-", "dimensional", "reconstruction", "of", "serial", "H", "&", "E", "frontal", "sections", "of", "miniature", "pig", "mandibles", "at", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", ")", "and", "E90", ";", "deciduous", "canine", "(", "DC", ")", "in", "purple", ",", "permanent", "canine", "(", "PC", ")", "in", "yellow", ",", "and", "alveolar", "socket", "in", "green", ".", "The", "red", ",", "blue", ",", "and", "green", "arrows", "indicate", "the", "width", "of", "the", "labial", "alveolar", "socket", ",", "lingual", "alveolar", "socket", ",", "and", "DC", ",", "respectively", ".", "n", "=", "3", ".", "B", "DC", "and", "labial", "and", "lingual", "alveolar", "socket", "widths", "in", "the", "horizontal", "plane", "at", "the", "bottom", "of", "the", "PC", "during", "E60", "and", "E90", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "C", "The", "proportion", "of", "DC", "width", "relative", "to", "the", "total", "alveolar", "socket", "width", "during", "E60", "and", "E90", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "D", "Micro", "-", "CT", "imaging", "of", "the", "whole", "mandible", "at", "E60", ";", "boxed", "region", "is", "magnified", "in", "D", "'", "(", "top", "panel", ")", ".", "(", "D", "'", ")", "Mandible", "slice", "isolated", "with", "Geomagic", "software", ".", "White", "dashed", "lines", "mark", "DC", ".", "E", "3", "-", "D", "color", "map", "(", "left", ")", "after", "alignment", "of", "mandible", "slices", "before", "and", "after", "(", "sham", ")", "surgery", "showing", "a", "comparison", "of", "the", "surface", "points", ".", "Coronal", "sections", "through", "cusp", "tips", "(", "transparent", "squares", ",", "left", ")", "were", "selected", "for", "2", "-", "D", "comparisons", "(", "middle", ")", ";", "right", "panels", "are", "magnifications", "of", "yellow", "-", "boxed", "regions", ".", "The", "solid", "purple", "contour", "and", "dotted", "black", "contour", "indicate", "the", "pre", "-", "and", "post", "-", "surgery", "shapes", ",", "respectively", ".", "The", "distance", "between", "the", "two", "contours", "are", "the", "colored", "line", "segments", "showing", "the", "distance", "and", "direction", "of", "the", "movement", ".", "The", "colored", "ball", "in", "the", "2", "-", "D", "comparison", "marks", "the", "position", "of", "the", "maximum", "displacement", ".", "The", "PC", "position", "is", "indicated", "in", "pink", ".", "n", "=", "3", ".", "F", "Dissected", "mandible", "slice", "with", "a", "\"", "U", "\"", "shape", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Three-dimensional reconstruction of serial H&E frontal sections of miniature pig mandibles at embryonic day 60 (E60) and E90; deciduous canine (DC) in purple, permanent canine (PC) in yellow, and alveolar socket in green. The red, blue, and green arrows indicate the width of the labial alveolar socket, lingual alveolar socket, and DC, respectively. n = 3.B DC and labial and lingual alveolar socket widths in the horizontal plane at the bottom of the PC during E60 and E90. n = 3. Data information: Data represent the means ± SEM. Unpaired t-tests, *P < .05, **P < .01, ***P < .001.C The proportion of DC width relative to the total alveolar socket width during E60 and E90. n = 3. Data information: Data represent the means ± SEM. Unpaired t-tests, *P < .05, **P < .01, ***P < .001.D Micro-CT imaging of the whole mandible at E60; boxed region is magnified in D' (top panel). (D') Mandible slice isolated with Geomagic software. White dashed lines mark DC. E 3-D color map (left) after alignment of mandible slices before and after (sham) surgery showing a comparison of the surface points. Coronal sections through cusp tips (transparent squares, left) were selected for 2-D comparisons (middle); right panels are magnifications of yellow-boxed regions. The solid purple contour and dotted black contour indicate the pre- and post-surgery shapes, respectively. The distance between the two contours are the colored line segments showing the distance and direction of the movement. The colored ball in the 2-D comparison marks the position of the maximum displacement. The PC position is indicated in pink. n = 3. F Dissected mandible slice with a \"U\" shape."}
{"words": ["Figure", "3A", "Diagram", "of", "the", "dissected", "miniature", "pig", "mandible", "slice", "illustrating", "the", "deciduous", "(", "DC", ")", "and", "permanent", "(", "PC", ")", "canine", "and", "application", "of", "compression", "in", "vitro", "using", "Flexcell", "FX", "-", "5000", "Compression", "System", ".", "B", "-", "D", "H", "&", "E", "staining", "of", "canine", "frontal", "sections", "from", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", ")", "(", "B", ")", ",", "after", "culturing", "for", "two", "days", "without", "stress", "(", "0", "kPa", ")", "(", "C", ")", ",", "or", "with", "stress", "(", "3", "kPa", ")", "(", "D", ")", ".", "(", "B", "'", "-", "D", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "their", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "n", "=", "6", "/", "6", "in", "E60", "group", ";", "n", "=", "12", "/", "12", "in", "0", "-", "kPa", "group", ";", "n", "=", "4", "/", "8", "in", "3", "-", "kPa", "group", ".", "F", "RT", "-", "qPCR", "of", "several", "mechanosensitive", "proteins", "(", "TGFB1", ",", "NFKB1", ",", "EGR1", ",", "and", "RUNX2", ")", "and", "of", "four", "mechanoreceptors", "(", "ITGB1", ",", "ITGB3", ",", "ITGAV", "and", "ITGA2", ")", "in", "PC", "and", "surrounding", "soft", "tissue", "at", "E60", "and", "after", "culturing", "for", "two", "days", "with", "(", "3", "kPa", ")", "or", "without", "extra", "mechanical", "stress", "(", "0", "kPa", ")", ".", "n", "=", "3", "for", "each", "group", ".", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "(", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "post", "-", "hoc", "comparisons", "between", "two", "groups", ")", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "="], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Diagram of the dissected miniature pig mandible slice illustrating the deciduous (DC) and permanent (PC) canine and application of compression in vitro using Flexcell FX-5000 Compression System.B-D H&E staining of canine frontal sections from embryonic day 60 (E60) (B), after culturing for two days without stress (0 kPa) (C), or with stress (3 kPa) (D). (B'-D') are magnifications of boxed regions in their corresponding figure panels. Scale bars = 50 µm. n = 6/6 in E60 group; n = 12/12 in 0-kPa group; n = 4/8 in 3-kPa group.F RT-qPCR of several mechanosensitive proteins (TGFB1, NFKB1, EGR1, and RUNX2) and of four mechanoreceptors (ITGB1, ITGB3, ITGAV and ITGA2) in PC and surrounding soft tissue at E60 and after culturing for two days with (3 kPa) or without extra mechanical stress (0 kPa). n = 3 for each group. Data represent the means ± SEM. One-way ANOVA (Newman-Keuls test for post-hoc comparisons between two groups), *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS, not significant. ="}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "L", "IF", "of", "integrin", "β1", ",", "ERK1", ",", "and", "RUNX2", "in", "miniature", "pig", "canine", "frontal", "sections", "at", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", ")", ",", "E90", ",", "and", "E60", "cultured", "under", "3", "kPa", "stress", "for", "two", "days", "and", "E60", "cultured", "under", "0", "kPa", "stress", "for", "two", "days", ";", "(", "A", "'", "-", "L", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "M", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "integrin", "β1", ",", "ERK1", ",", "and", "RUNX2", "during", "E60", ",", "E90", ",", "and", "E60", "cultured", "under", "3", "kPa", "stress", "for", "two", "days", "and", "E60", "cultured", "under", "0", "kPa", "stress", "for", "two", "days", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bars", "=", "25", "µm", "(", "A", "'", ",", "G", "'", ")", "and", "50", "µm", "(", "other", "panels", ")", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "M", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "N", "Morphology", "of", "the", "human", "PC", "at", "weeks", "18", "-", "19", "(", "H", "&", "E", "staining", ")", ";", "(", "N", "'", ")", "is", "magnification", "of", "the", "boxed", "region", "in", "(", "N", ")", ".", "DC", ",", "deciduous", "canine", ";", "PC", ",", "permanent", "canine", ";", "IEE", ",", "inner", "enamel", "epithelium", ";", "OEE", ",", "outer", "enamel", "epithelium", ".", "Mesenchyme", "between", "DC", "and", "PC", "is", "indicated", "with", "a", "green", "arrow", ".", "O", "-", "Q", "ISH", "expression", "patterns", "of", "ITGB1", ",", "ERK1", ",", "and", "RUNX2", "in", "human", "PCs", ".", "Green", "arrows", "indicate", "the", "mesenchyme", "between", "DC", "and", "PC", ".", "R", "IF", "of", "RUNX2", "in", "human", "PC", ".", "Mesenchyme", "between", "DC", "and", "PC", "is", "indicated", "with", "a", "red", "arrow", ".", "Red", "arrow", "indicates", "the", "mesenchyme", "between", "DC", "and", "PC", ".", "S", "PC", "epithelium", "areas", "in", "E60", ",", "E90", ",", "and", "E60", "cultured", "under", "3", "kPa", "stress", "for", "two", "days", "and", "E60", "cultured", "under", "0", "kPa", "stress", "for", "two", "days", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", ".", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "IF", "of", "RUNX2", "and", "phospho", "-", "ERK1", "/", "2", "(", "p", "-", "ERK1", "/", "2", ")", "upon", "force", "loading", "with", "0", "or", "1", ".", "0", "g", "/", "cm2", "for", "2", "h", "or", "after", "force", "was", "removed", "and", "the", "cells", "cultured", "for", "an", "additional", "1", ",", "2", ",", "and", "4", "hours", ".", "V", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "RUNX2", "and", "p", "-", "ERK1", "/", "2", "between", "groups", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "(", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "post", "-", "hoc", "comparisons", "between", "two", "groups", ")", "for", "V", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", ".", "W", "Western", "blots", "of", "p", "-", "ERK1", "/", "2", "and", "RUNX2", "levels", "after", "1", ".", "0", "g", "/", "cm2", "was", "applied", "for", "2", "h", ",", "with", "or", "without", "anti", "-", "integrin", "β1", "antibody", "and", "ERK1", "inhibitor", "(", "U0126", ")", ".", "X", "Relative", "expression", "levels", "of", "p", "-", "ERK1", "/", "2", ",", "RUNX2", ",", "and", "Actin", "in", "(", "W", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "M", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", "(", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "post", "-", "hoc", "comparisons", "between", "two", "groups", ")", "for", "X", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-L IF of integrin β1, ERK1, and RUNX2 in miniature pig canine frontal sections at embryonic day 60 (E60), E90, and E60 cultured under 3 kPa stress for two days and E60 cultured under 0 kPa stress for two days; (A'-L') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. M Relative IF expression levels of integrin β1, ERK1, and RUNX2 during E60, E90, and E60 cultured under 3 kPa stress for two days and E60 cultured under 0 kPa stress for two days. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3. Scale bars = 25 µm (A', G') and 50 µm (other panels). Unpaired t-tests for M , *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS, not significant.N Morphology of the human PC at weeks 18-19 (H&E staining); (N') is magnification of the boxed region in (N). DC, deciduous canine; PC, permanent canine; IEE, inner enamel epithelium; OEE, outer enamel epithelium. Mesenchyme between DC and PC is indicated with a green arrow.O-Q ISH expression patterns of ITGB1, ERK1, and RUNX2 in human PCs. Green arrows indicate the mesenchyme between DC and PC.R IF of RUNX2 in human PC. Mesenchyme between DC and PC is indicated with a red arrow. Red arrow indicates the mesenchyme between DC and PC.S PC epithelium areas in E60, E90, and E60 cultured under 3 kPa stress for two days and E60 cultured under 0 kPa stress for two days. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3. , *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS, not significant.IF of RUNX2 and phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) upon force loading with 0 or 1.0 g/cm2 for 2 h or after force was removed and the cells cultured for an additional 1, 2, and 4 hours.V Relative IF expression levels of RUNX2 and p-ERK1/2 between groups Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3. One-way ANOVA (Newman-Keuls test for post-hoc comparisons between two groups) for V , *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS, not significant.W Western blots of p-ERK1/2 and RUNX2 levels after 1.0 g/cm2 was applied for 2 h, with or without anti-integrin β1 antibody and ERK1 inhibitor (U0126). X Relative expression levels of p-ERK1/2, RUNX2, and Actin in (W). Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3. Unpaired t-tests for M; One-way ANOVA (Newman-Keuls test for post-hoc comparisons between two groups) for X, *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "H", "&", "E", "staining", "of", "miniature", "pig", "canine", "frontal", "sections", "from", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", "group", ")", "(", "A", ")", "and", "after", "the", "mandible", "slices", "were", "infected", "with", "RUNX2", "overexpression", "lentiviral", "vector", "with", "a", "Myc", "tag", "(", "overexpression", "group", ")", "(", "B", ")", "or", "overexpression", "control", "lentiviral", "vector", "with", "a", "Myc", "tag", "(", "O", "-", "control", "group", ")", "(", "C", ")", ";", "(", "A", "'", "-", "C", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µmD", "-", "F", "Immunohistochemical", "(", "IHC", ")", "staining", "of", "Myc", "expression", "in", "mandible", "slices", "from", "the", "E60", ",", "overexpression", ",", "and", "O", "-", "control", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", "(", "D", "-", "F", ")", "G", "-", "I", "IF", "staining", "of", "RUNX2", "expression", "(", "yellow", "arrows", ")", "in", "mandible", "slices", "of", "the", "E60", ",", "overexpression", ",", "and", "O", "-", "control", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µmJ", ",", "K", "Relative", "expression", "levels", "of", "Myc", "and", "RUNX2", "in", "the", "E60", ",", "O", "-", "control", ",", "and", "overexpression", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "(", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "post", "-", "hoc", "comparisons", "between", "two", "groups", ")", "for", "J", ",", "K", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "L", ",", "M", "IF", "staining", "of", "RUNX2", "expression", "after", "infecting", "mandible", "slices", "with", "scrambled", "shRNA", "lentiviral", "vector", "(", "knockdown", "control", ",", "K", "-", "control", ")", "(", "L", ")", "or", "RUNX2", "shRNA", "lentiviral", "vector", "(", "knockdown", ")", "(", "M", ")", ";", "(", "L", "'", "-", "M", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", "(", "other", "panels", ")", ".", "N", "Relative", "RUNX2", "expression", "levels", "between", "K", "-", "control", "and", "knockdown", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "N", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "O", "-", "Q", "H", "&", "E", "staining", "of", "mandible", "slice", "sections", "from", "the", "K", "-", "control", ",", "knockdown", "+", "force", "(", "3", "kPa", ")", ",", "and", "K", "-", "control", "+", "force", "(", "3", "kPa", ")", "groups", ".", "(", "O", "'", "-", "Q", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µmR", "-", "T", "IF", "staining", "of", "RUNX2", "expression", "(", "yellow", "arrows", ")", "of", "mandible", "slice", "sections", "from", "the", "K", "-", "control", ",", "knockdown", "+", "force", "(", "3", "kPa", ")", ",", "and", "K", "-", "control", "+", "force", "(", "3", "kPa", ")", "groups", ".", "(", "R", "'", "-", "T", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Scale", "bars", "=", "25", "µm", "(", "R", "'", "-", "T", "'", ")", "U", "Relative", "RUNX2", "expression", "levels", "among", "the", "three", "groups", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "(", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "post", "-", "hoc", "comparisons", "between", "two", "groups", ")", "for", "U", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "V", "PC", "epithelium", "areas", "in", "the", "overexpression", ",", "O", "-", "control", ",", "knockdown", ",", "knockdown", "+", "force", ",", "K", "-", "control", ",", "and", "K", "-", "control", "+", "force", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "V", ";", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C H&E staining of miniature pig canine frontal sections from embryonic day 60 (E60 group) (A) and after the mandible slices were infected with RUNX2 overexpression lentiviral vector with a Myc tag (overexpression group) (B) or overexpression control lentiviral vector with a Myc tag (O-control group) (C); (A'-C') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 50 µmD-F Immunohistochemical (IHC) staining of Myc expression in mandible slices from the E60, overexpression, and O-control groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 100 µm (D-F)G-I IF staining of RUNX2 expression (yellow arrows) in mandible slices of the E60, overexpression, and O-control groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 50 µmJ, K Relative expression levels of Myc and RUNX2 in the E60, O-control, and overexpression groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. One-way ANOVA (Newman-Keuls test for post-hoc comparisons between two groups) for J, K , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.L, M IF staining of RUNX2 expression after infecting mandible slices with scrambled shRNA lentiviral vector (knockdown control, K-control) (L) or RUNX2 shRNA lentiviral vector (knockdown) (M); (L'-M') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 50 µm (other panels).N Relative RUNX2 expression levels between K-control and knockdown groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests for N , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.O-Q H&E staining of mandible slice sections from the K-control, knockdown + force (3 kPa), and K-control + force (3 kPa) groups. (O'-Q') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 50 µmR-T IF staining of RUNX2 expression (yellow arrows) of mandible slice sections from the K-control, knockdown + force (3 kPa), and K-control + force (3 kPa) groups. (R'-T') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Scale bars = 25 µm (R'-T')U Relative RUNX2 expression levels among the three groups Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. One-way ANOVA (Newman-Keuls test for post-hoc comparisons between two groups) for U, *P < .05, **P < .01, ***P < .001.V PC epithelium areas in the overexpression, O-control, knockdown, knockdown + force, K-control, and K-control + force groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests for V; , *P < .05, **P < .01, ***P < .001."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "ISH", "of", "miniature", "pig", "canine", "frontal", "sections", "showing", "expression", "patterns", "of", "RUNX2", "at", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", ")", "and", "E90", ".", "(", "A", "'", ",", "B", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "C", "Relative", "ISH", "expression", "levels", "of", "RUNX2", "in", "epithelium", "(", "Epi", ".", ")", "and", "mesenchyme", "(", "Mes", ".", ")", "at", "E60", "and", "E90", ".", "Data", "information", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "C", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "D", ",", "E", "ISH", "of", "miniature", "pig", "canine", "frontal", "sections", "showing", "expression", "patterns", "of", "β", "-", "catenin", "at", "E60", "and", "E90", ".", "(", "D", "'", ",", "E", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "F", "Relative", "ISH", "expression", "levels", "of", "β", "-", "catenin", "in", "epithelium", "(", "Epi", ".", ")", "and", "mesenchyme", "(", "Mes", ".", ")", "at", "E60", "and", "E90", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "G", ",", "H", "IF", "of", "Lef1", "at", "E60", "and", "E90", ".", "(", "G", ",", "H", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "I", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "Lef1", "in", "epithelium", "(", "Epi", ".", ")", "and", "mesenchyme", "(", "Mes", ".", ")", "at", "E60", "and", "E90", ".", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "J", "FISH", "of", "β", "-", "catenin", "in", "E60", "and", "E90", "mandible", "slices", "and", "E60", "mandible", "slices", "after", "12", "and", "24", "h", "in", "culture", "via", "RNAscope", ".", "Boxed", "regions", "of", "mesenchyme", "are", "magnified", "in", "the", "right", "panels", ".", "Epithelium", "is", "indicated", "with", "a", "yellow", "arrow", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "K", "Relative", "FISH", "expression", "levels", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "of", "epithelium", "and", "mesenchyme", "at", "E60", ",", "E90", ",", "and", "E60", "cultured", "for", "12", "and", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "for", "K", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "L", ",", "M", "IF", "of", "β", "-", "catenin", "at", "E60", "and", "E90", ";", "The", "yellow", "arrows", "indicate", "the", "localization", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "nucleus", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "N", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "nucleus", "of", "epithelium", "and", "mesenchyme", "at", "E60", "and", "E90", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ".", "O", ",", "P", "FISH", "of", "β", "-", "catenin", "in", "mandible", "slices", "infected", "with", "RUNX2", "shRNA", "lentivirus", "(", "knockdown", ")", "or", "scrambled", "shRNA", "lentivirus", "(", "scramsh", ")", "via", "RNAscope", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "Q", "Relative", "FISH", "expression", "levels", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "of", "epithelium", "and", "mesenchyme", "in", "knockdown", "and", "scramsh", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B ISH of miniature pig canine frontal sections showing expression patterns of RUNX2 at embryonic day 60 (E60) and E90. (A', B') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Scale bars = 50 µm.C Relative ISH expression levels of RUNX2 in epithelium (Epi.) and mesenchyme (Mes.) at E60 and E90. Data information Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests for C , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.D, E ISH of miniature pig canine frontal sections showing expression patterns of β-catenin at E60 and E90. (D', E') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Scale bars = 50 µm.F Relative ISH expression levels of β-catenin in epithelium (Epi.) and mesenchyme (Mes.) at E60 and E90. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.G, H IF of Lef1 at E60 and E90. (G, H') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Data information: Scale bars = 50 µm.I Relative IF expression levels of Lef1 in epithelium (Epi.) and mesenchyme (Mes.) at E60 and E90. Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.J FISH of β-catenin in E60 and E90 mandible slices and E60 mandible slices after 12 and 24 h in culture via RNAscope. Boxed regions of mesenchyme are magnified in the right panels. Epithelium is indicated with a yellow arrow. Data information: Scale bars = 50 µm.K Relative FISH expression levels of β-catenin in the nucleus and cytoplasm of epithelium and mesenchyme at E60, E90, and E60 cultured for 12 and 24 h. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. One-way ANOVA for K, *P < .05, **P < .01, ***P < .001.L, M IF of β-catenin at E60 and E90; The yellow arrows indicate the localization of β-catenin in the nucleus. Data information: Scale bars = 50 µm.N Relative IF expression levels of β-catenin in the nucleus of epithelium and mesenchyme at E60 and E90. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests , *P < .05, **P < .01, ***P < .001.O, P FISH of β-catenin in mandible slices infected with RUNX2 shRNA lentivirus (knockdown) or scrambled shRNA lentivirus (scramsh) via RNAscope. Data information: Scale bars = 50 µm.Q Relative FISH expression levels of β-catenin in the nucleus and cytoplasm of epithelium and mesenchyme in knockdown and scramsh groups. Data information: Data represent the means ± SEM. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests , *P < .05, **P < .01, ***P < .001."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "IF", "of", "Lef1", "in", "mandible", "slices", "at", "embryonic", "day", "60", "(", "E60", ")", "infected", "with", "RUNX2", "overexpression", "lentiviral", "vector", "(", "overexpression", ")", "or", "overexpression", "control", "lentiviral", "vector", "(", "O", "-", "control", ")", ".", "(", "A", "'", "-", "B", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Dashed", "lines", "mark", "the", "epithelium", "of", "PC", ".", "C", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "Lef1", "in", "epithelium", "(", "Epi", ".", ")", "and", "mesenchyme", "(", "Mes", ".", ")", "of", "the", "overexpression", "and", "O", "-", "control", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", "C", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ".", "not", "significant", ".", "D", ",", "E", "IF", "of", "Lef1", "in", "E60", "mandible", "slices", "subjected", "to", "3", "or", "0", "kPa", "stress", "for", "two", "days", ".", "(", "D", "'", ",", "E", "'", ")", "are", "magnifications", "of", "boxed", "regions", "in", "the", "corresponding", "figure", "panels", ".", "Dashed", "lines", "mark", "the", "epithelium", "of", "PC", ".", "F", "Relative", "IF", "expression", "levels", "of", "Lef1", "in", "the", "epithelium", "and", "mesenchyme", "after", "applying", "3", "and", "0", "kPa", "pressure", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "µm", ".", "n", "=", "3", "for", "all", "experiments", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "for", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ".", "not", "significant", ".", "G", "Western", "blots", "of", "Lef1", ",", "non", "-", "phospho", "-", "β", "-", "catenin", ",", "and", "RUNX2", "after", "DFCs", "were", "infected", "with", "control", "lentiviral", "vector", "or", "RUNX2", "overexpression", "lentiviral", "vector", ".", "(", "G", "'", ")", "Relative", "expression", "levels", "between", "control", "vector", "and", "RUNX2", "overexpression", "groups", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "the", "means", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", ",", "*", "P", "<", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", ".", "001", ";", "NS", ".", "not", "significant", ".", "H", "Western", "blots", "of", "Lef1", ",", "non", "-", "phospho", "-", "β", "-", "catenin", ",", "and", "RUNX2", "after", "DFCs", "were", "infected", "with", "scrambled", "shRNA", "(", "scramsh", ")", "or", "RUNX2", "knockdown", "shRNA", "(", "knockdown", ")", "lentiviral", "vectors", ".", "(", "H", "'", ")", "Relative", "expression", "levels", "between", "scramsh", "and", "knockdown", "groups", ".", "I", "Western", "blots", "of", "nuclear", "non", "-", "phospho", "-", "β", "-", "catenin", "and", "Lamin", "B", "in", "DFCs", "of", "RUNX2", "overexpression", "(", "O", ")", ",", "control", "vector", "(", "V", ")", ",", "RUNX2", "knockdown", "(", "K", ")", ",", "scramsh", "(", "S", ")", ",", "compressed", "force", "(", "F", ";", "1", ".", "0", "g", "/", "cm2", ")", ",", "and", "control", "(", "C", ";", "0", "g", "/", "cm2", ")", "groups", ".", "Sample", "were", "loaded", "in", "a", "gradient", "(", "7", ".", "5", ",", "15", ",", "30", ",", "and", "60", "μg", ")", "showing", "a", "linear", "relationship", "for", "each", "group", ".", "J", "Western", "blots", "of", "nuclear", "non", "-", "phospho", "-", "β", "-", "catenin", "and", "Lamin", "B", "in", "DFCs", "treated", "with", "IWR", "-", "1", "-", "endo", ".", "Relative", "expression", "levels", "were", "compared", "between", "force", "and", "no", "force", "groups", "and", "between", "overexpression", "and", "control", "groups", "with", "or", "without", "IWR", "-", "1", "-", "endo", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B IF of Lef1 in mandible slices at embryonic day 60 (E60) infected with RUNX2 overexpression lentiviral vector (overexpression) or overexpression control lentiviral vector (O-control). (A'-B') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Dashed lines mark the epithelium of PC. C Relative IF expression levels of Lef1 in epithelium (Epi.) and mesenchyme (Mes.) of the overexpression and O-control groups. Data information: Data represent the means ± SEM. Scale bars = 100 µm. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests for C , **P < .01, ***P < .001; NS. not significant.D, E IF of Lef1 in E60 mandible slices subjected to 3 or 0 kPa stress for two days. (D', E') are magnifications of boxed regions in the corresponding figure panels. Dashed lines mark the epithelium of PC. F Relative IF expression levels of Lef1 in the epithelium and mesenchyme after applying 3 and 0 kPa pressure. Data information: Data represent the means ± SEM. Scale bars = 100 µm. n = 3 for all experiments. Unpaired t-tests for , *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS. not significant.G Western blots of Lef1, non-phospho-β-catenin, and RUNX2 after DFCs were infected with control lentiviral vector or RUNX2 overexpression lentiviral vector. (G') Relative expression levels between control vector and RUNX2 overexpression groups. Data information: Data represent the means ± SEM. Unpaired t-tests , *P < .05, **P < .01, ***P < .001; NS. not significant.H Western blots of Lef1, non-phospho-β-catenin, and RUNX2 after DFCs were infected with scrambled shRNA (scramsh) or RUNX2 knockdown shRNA (knockdown) lentiviral vectors. (H') Relative expression levels between scramsh and knockdown groups.I Western blots of nuclear non-phospho-β-catenin and Lamin B in DFCs of RUNX2 overexpression (O), control vector (V), RUNX2 knockdown (K), scramsh (S), compressed force (F; 1.0 g/cm2), and control (C; 0 g/cm2) groups. Sample were loaded in a gradient (7.5, 15, 30, and 60 μg) showing a linear relationship for each group.J Western blots of nuclear non-phospho-β-catenin and Lamin B in DFCs treated with IWR-1-endo. Relative expression levels were compared between force and no force groups and between overexpression and control groups with or without IWR-1-endo treatment."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Survival", "curves", "after", "the", "injection", "of", "EL4", "lymphoma", "cells", "(", "n", "=", "6", "/", "group", ")", ".", "(", "H", ")", "Ifng", "protein", "and", "Ifng", "mRNA", "levels", "(", "n", "=", "4", "/", "group", ")", "were", "determined", "by", "ELISA", "and", "quantitative", "PCR", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Survival curves after the injection of EL4 lymphoma cells (n = 6/group).(H) Ifng protein and Ifng mRNA levels (n = 4/group) were determined by ELISA and quantitative PCR."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "m6A", "dot", "blot", "assay", "using", "total", "RNA", "from", "NK92", "-", "siCTRL", "or", "NK92", "-", "siFTO", "cells", ".", "(", "D", ")", "Western", "blotting", "for", "the", "detection", "of", "GZMB", "in", "NK92", "-", "siCTRL", "and", "NK92", "-", "siFTO", "cells", "after", "treatment", "with", "IL", "-", "2", ".", "(", "E", ")", "Levels", "of", "IFNγ", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", "and", "TNFα", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "in", "the", "culture", "media", "24", "hours", "after", "IL", "-", "2", "treatment", "(", "left", ")", "or", "co", "-", "culture", "media", "with", "K562", "cells", "for", "4", "hours", "(", "right", ")", "were", "determined", "by", "ELISA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) m6A dot blot assay using total RNA from NK92-siCTRL or NK92-siFTO cells.(D) Western blotting for the detection of GZMB in NK92-siCTRL and NK92-siFTO cells after treatment with IL-2.(E) Levels of IFNγ (n = 5 biological replicates) and TNFα (n = 3 biological replicates) in the culture media 24 hours after IL-2 treatment (left) or co-culture media with K562 cells for 4 hours (right) were determined by ELISA."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Western", "blotting", "analysis", ".", "NK92", "-", "siCTRL", "or", "NK92", "-", "siFTO", "cells", "were", "incubated", "with", "20", "ng", "/", "ml", "IL", "-", "2", "for", "24", "hours", ",", "washed", ",", "and", "cultured", "without", "IL", "-", "2", "(", "IL", "-", "2", "depletion", ")", "for", "the", "indicated", "times", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "A", "western", "blotting", "analysis", "of", "NK92", "+", "MOCK", "or", "NK92", "+", "FTO", "cells", "incubated", "with", "20", "ng", "/", "ml", "IL", "-", "2", "for", "the", "indicated", "times", "was", "performed", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Western blotting analysis. NK92-siCTRL or NK92-siFTO cells were incubated with 20 ng/ml IL-2 for 24 hours, washed, and cultured without IL-2 (IL-2 depletion) for the indicated times (n = 3). (C) A western blotting analysis of NK92+MOCK or NK92+FTO cells incubated with 20 ng/ml IL-2 for the indicated times was performed (n = 3). D"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "m6A", "methylated", "RNA", "immunoprecipitation", "&", "quantitative", "PCR", "(", "MeRIP", "-", "qPCR", ")", "analysis", "using", "a", "m6A", "antibody", "in", "NK92", "-", "siFTO", "(", "upper", ")", "or", "NK92", "+", "FTO", "(", "lower", ")", "cells", "compared", "to", "NK92", "-", "siCTRL", "or", "NK92", "+", "MOCK", "cells", ".", "(", "D", ")", "SOCS3", "3", "'", "-", "UTR", "reporter", "assay", "using", "the", "AANAT", "reporter", "system", ".", "Plasmid", "information", "for", "the", "AANAT", "reporter", "system", "with", "or", "without", "the", "SOCS3", "3", "'", "-", "UTR", "sequence", "(", "upper", ")", ".", "Levels", "of", "Aanat", "protein", "(", "left", ")", "and", "Aanat", "mRNA", "(", "right", ")", "expression", "in", "HEK", "-", "293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "plasmid", "-", "expressing", "AANAT", "reporter", "containing", "SOCS3", "3", "'", "-", "UTR", "and", "siCTRL", "or", "siFTO", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) m6A methylated RNA immunoprecipitation & quantitative PCR (MeRIP-qPCR) analysis using a m6A antibody in NK92-siFTO (upper) or NK92+FTO (lower) cells compared to NK92-siCTRL or NK92+MOCK cells.(D) SOCS3 3'-UTR reporter assay using the AANAT reporter system. Plasmid information for the AANAT reporter system with or without the SOCS3 3'-UTR sequence (upper). Levels of Aanat protein (left) and Aanat mRNA (right) expression in HEK-293T cells co-transfected with plasmid-expressing AANAT reporter containing SOCS3 3'-UTR and siCTRL or siFTO."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "JAK", "/", "STAT", "target", "genes", ",", "IFNγ", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ")", ",", "GZMB", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "and", "PRF1", "(", "n", "=", "8", "biological", "replicates", ")", "were", "determined", "by", "qPCR", "in", "CD56", "+", "-", "siCTRL", "or", "CD56", "+", "-", "siFTO", "cells", ".", "(", "C", ")", "Western", "blotting", "of", "CD56", "+", "-", "siCTRL", "or", "CD56", "+", "-", "siFTO", "cells", "incubated", "with", "20", "ng", "/", "ml", "IL", "-", "15", "and", "20", "ng", "/", "ml", "IL", "-", "21", "for", "the", "indicated", "times", "was", "performed", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "to", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "(", "n", "=", "2", "~", "3", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "times", "independent", "experiments", "with", "similar", "results", ".", "The", "protein", "levels", "were", "expressed", "as", "the", "relative", "band", "density", "of", "the", "corresponding", "protein", "(", "lower", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Relative mRNA expression levels of JAK/STAT target genes, IFNγ (n = 10 biological replicates), GZMB (n = 6 biological replicates) and PRF1 (n = 8 biological replicates) were determined by qPCR in CD56+-siCTRL or CD56+-siFTO cells.(C) Western blotting of CD56+-siCTRL or CD56+-siFTO cells incubated with 20 ng/ml IL-15 and 20 ng/ml IL-21 for the indicated times was performed. Cells were lysed and analyzed by immunoblotting with antibodies to the indicated phosphorylated (p-) and total proteins (n = 2~3). Data are representative of three times independent experiments with similar results. The protein levels were expressed as the relative band density of the corresponding protein (lower)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "The", "images", "of", "the", "ventral", "bioluminescence", "(", "BLI", ")", "following", "the", "injection", "of", "NK92", "-", "TRC", "or", "NK92", "-", "shFTO", "cells", ".", "(", "G", ")", "The", "survival", "curves", "after", "the", "injection", "of", "K562", "-", "Luc", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) The images of the ventral bioluminescence (BLI) following the injection of NK92-TRC or NK92-shFTO cells.(G) The survival curves after the injection of K562-Luc cells."}
{"words": ["Figure", "1Negative", "stain", "TEM", "image", "of", "B", ".", "cereus", "NVH", "0075", "-", "95", "endospore", ",", "showing", "spore", "body", "(", "SB", ")", ",", "exosporium", "(", "E", ")", ",", "and", "endospore", "appendages", "(", "Ena", ")", ",", "which", "emerge", "from", "the", "endospore", "individually", "or", "as", "fiber", "bundles", ".", "At", "the", "distal", "end", ",", "Enas", "terminate", "in", "a", "single", "or", "multiple", "thin", "ruffles", "(", "R", ")", ".", "cryoEM", "images", "(", "left", ")", "and", "negative", "stain", "2D", "class", "averages", "of", "single", "S", "-", "Ena", "(", "E", ")", "and", "L", "-", "Ena", "(", "F", ")", "fibers", ".", "S", "-", "Ena", "show", "~", "100", "Å", "diameter", "and", "a", "helical", "or", "staggered", "appearance", "with", "a", "~", "37", "Å", "rise", ",", "whereas", "L", "-", "Ena", "have", "a", "~", "80", "Å", "diameter", "and", "appear", "as", "stacked", "disks", "of", "~", "40", "Å", "height", "and", "~", "60", "Å", "translation", "along", "the", "fiber", ".", "L", "-", "and", "S", "-", "Ena", "show", ",", "respectively", ",", "a", "single", "or", "multiple", "ruffle", "(", "s", ")", "(", "black", "arrow", ",", "labeled", "'", "R", "'", ")", "at", "the", "distal", "end", "of", "fiber", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Negative stain TEM image of B. cereus NVH 0075-95 endospore, showing spore body (SB), exosporium (E), and endospore appendages (Ena), which emerge from the endospore individually or as fiber bundles. At the distal end, Enas terminate in a single or multiple thin ruffles (R).cryoEM images (left) and negative stain 2D class averages of single S-Ena (E) and L-Ena (F) fibers. S-Ena show ~100 Å diameter and a helical or staggered appearance with a ~37 Å rise, whereas L-Ena have a ~80 Å diameter and appear as stacked disks of ~40 Å height and ~60 Å translation along the fiber. L- and S-Ena show, respectively, a single or multiple ruffle(s) (black arrow, labeled 'R') at the distal end of fiber."}
{"words": ["Figure", "3SDS", "-", "PAGE", "of", "recEna1B", ",", "treated", "with", "β", "-", "mercaptoethanol", "or", "TEV", "protease", "(", "to", "remove", "N", "-", "terminal", "6xHis", "tag", ")", "as", "indicated", ".", "Bands", "with", "apparent", "MW", "of", "~", "13", "and", "~", "15", "kDa", "correspond", "recEna1B", "monomer", "with", "(", "Ena1B6His", ")", "and", "without", "(", "Ena1BC", ")", "the", "6xHis", "tag", "and", "TEV", "recognition", "site", ",", "respectively", ".", "In", "the", "uncleaved", "sample", ",", "a", "band", "running", "at", "~", "30", "kDa", "(", "labeled", "*", ")", "corresponds", "to", "a", "non", "-", "physiological", "disulfide", "bound", "S", "-", "Ena1B", "dimer", ".", "Lower", "intensity", "in", "the", "cleaved", "recEna1B", "results", "from", "a", "loss", "of", "monomers", "to", "SDS", "-", "resistant", "high", "molecular", "weight", "complexes", "stuck", "in", "the", "stacking", "gel", ".", "Negative", "stain", "TEM", "images", "of", "rec1Ena1B", "oligomers", "formed", "after", "refolding", ",", "but", "prior", "to", "TEV", "removal", "of", "the", "N", "-", "terminal", "6xHis", "tag", ".", "Close", "-", "up", "view", "that", "shows", "recEna1B", "oligomers", "form", "open", "crescents", "similar", "in", "dimensions", "and", "shape", "to", "single", "helical", "turns", "or", "arcs", "found", "in", "the", "S", "-", "Ena", "fiber", "(", "model", "-", "right", ")", ".", "Steric", "hindrance", "by", "the", "6xHis", "is", "thought", "to", "arrest", "recEna1B", "polymerization", "into", "single", "helical", "arcs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3SDS-PAGE of recEna1B, treated with β-mercaptoethanol or TEV protease (to remove N-terminal 6xHis tag) as indicated. Bands with apparent MW of ~13 and ~15 kDa correspond recEna1B monomer with (Ena1B6His) and without (Ena1BC) the 6xHis tag and TEV recognition site, respectively. In the uncleaved sample, a band running at ~ 30 kDa (labeled *) corresponds to a non-physiological disulfide bound S-Ena1B dimer. Lower intensity in the cleaved recEna1B results from a loss of monomers to SDS-resistant high molecular weight complexes stuck in the stacking gel.Negative stain TEM images of rec1Ena1B oligomers formed after refolding, but prior to TEV removal of the N-terminal 6xHis tag. Close-up view that shows recEna1B oligomers form open crescents similar in dimensions and shape to single helical turns or arcs found in the S-Ena fiber (model - right). Steric hindrance by the 6xHis is thought to arrest recEna1B polymerization into single helical arcs."}
{"words": ["Figure", "5Transcription", "level", "of", "ena1A", "(", "x", ")", ",", "ena1B", "(", "▲", ")", ",", "ena1C", "(", "○", ")", "and", "dedA", "(", "♦", ")", "relative", "to", "rpoB", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", "during", "16", " ", "hours", "of", "growth", "of", "B", ".", "cereus", "strain", "NVH", "0075", "-", "95", ".", "The", "dotted", "line", "represents", "the", "bacterial", "growth", "measured", "by", "increase", "in", "OD600", ".", "Of", "note", ",", "the", "transcription", "of", "ena1C", "was", "surprisingly", "higher", "than", "ena1A", "and", "ena1B", ",", "the", "major", "components", "of", "the", "isolated", "S", "-", "Ena", "(", "Fig", "EV2", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Transcription level of ena1A (x), ena1B (▲), ena1C (○) and dedA (♦) relative to rpoB determined by RT-qPCR during 16 hours of growth of B. cereus strain NVH 0075-95. The dotted line represents the bacterial growth measured by increase in OD600. Of note, the transcription of ena1C was surprisingly higher than ena1A and ena1B, the major components of the isolated S-Ena (Fig EV2)."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "negative", "stain", "images", "of", "endospores", "of", "NVH", "0075", "-", "95", "mutants", "lacking", "ena1A", ",", "ena1B", ",", "or", "ena1C", ",", "as", "well", "as", "endospores", "of", "strains", "complemented", "with", "the", "respective", "ena", "subunit", "expressed", "from", "plasmid", "(", "i", ".", "e", ".", "pA", ",", "pAB", "and", "pC", ")", ".", "The", "ena1B", "mutant", "was", "complemented", "with", "a", "plasmid", "carrying", "both", "ena1A", "and", "1B", "(", "pAB", ")", "due", "to", "repeated", "failure", "to", "transform", "with", "a", "plasmid", "holding", "ena1B", "only", ".", "Inset", "are", "2D", "class", "averages", "of", "Enas", "observed", "on", "the", "respective", "mutants", ".", "Knockout", "of", "ena1A", ",", "ena1B", ",", "or", "ena1C", "results", "in", "the", "loss", "of", "S", "-", "Ena", ",", "a", "phenotype", "that", "is", "restored", "by", "plasmid", "-", "based", "complementation", ".", "Number", "(", "top", ")", "and", "length", "(", "bottom", ")", "of", "Enas", "found", "on", "WT", ",", "mutant", "(", "∆", "ena1A", ",", "∆", "ena1B", ",", "or", "∆", "ena1C", ")", "and", "plasmid", "complemented", "(", "∆", "ena1A", ":", "pena1A", ",", "∆", "ena1B", ":", "pena1AB", ",", "or", "∆", "ena1C", ":", "pena1C", ")", "NVH", "0075", "-", "95", "endospores", ".", "Statistics", ":", "pair", "-", "wise", "Mann", "-", "Whitney", "U", "tests", "against", "WT", "(", "n", ":", "≥", "18", "spores", ";", "n", ":", "≥", "50", "Enas", ";", "ns", ":", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "-", "-", "-", ":", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative negative stain images of endospores of NVH 0075-95 mutants lacking ena1A, ena1B, or ena1C, as well as endospores of strains complemented with the respective ena subunit expressed from plasmid (i.e. pA, pAB and pC). The ena1B mutant was complemented with a plasmid carrying both ena1A and 1B (pAB) due to repeated failure to transform with a plasmid holding ena1B only. Inset are 2D class averages of Enas observed on the respective mutants. Knockout of ena1A, ena1B, or ena1C results in the loss of S-Ena, a phenotype that is restored by plasmid-based complementation.Number (top) and length (bottom) of Enas found on WT, mutant (∆ena1A, ∆ena1B, or ∆ena1C) and plasmid complemented (∆ena1A:pena1A, ∆ena1B:pena1AB, or ∆ena1C:pena1C) NVH 0075-95 endospores. Statistics: pair-wise Mann-Whitney U tests against WT (n: ≥18 spores; n: ≥50 Enas; ns: not significant, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 and **** p<0.0001. ---: mean ± s.d.)"}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "decrease", "upon", "EBSS", "treatment", "of", "HeLa", "cells", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Note", "both", "bands", "are", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "C", "Quantitative", "TMT", "proteomics", "of", "A375", "cells", "grown", "in", "complete", "media", "(", "CM", ")", "or", "EBSS", "for", "3", "hrs", ".", "Number", "of", "proteins", "affected", "are", "shown", ".", "Autophagy", "related", "proteins", "are", "indicated", "in", "grey", "and", "MAGE", "-", "A", "proteins", "in", "blue", ".", "D", ",", "E", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "are", "actively", "degraded", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "complete", "media", "(", "DMEM", "+", "10", "%", "FBS", ")", "or", "EBSS", "containing", "100", "µg", "/", "mL", "translation", "inhibitor", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", ".", "Protein", "degradation", "rates", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B MAGE-A3/6 protein levels decrease upon EBSS treatment of HeLa cells for the indicated times. Note both bands are MAGE-A3/6. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown.C Quantitative TMT proteomics of A375 cells grown in complete media (CM) or EBSS for 3 hrs. Number of proteins affected are shown. Autophagy related proteins are indicated in grey and MAGE-A proteins in blue.D, E MAGE-A3/6 protein levels are actively degraded upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated for the indicated times with complete media (DMEM + 10% FBS) or EBSS containing 100 µg/mL translation inhibitor cycloheximide (CHX). Protein degradation rates are shown (E). Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate ** p<0.01. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "2FBS", "(", "10", "%", ")", ",", "but", "not", "non", "-", "essential", "amino", "acids", "(", "NEAA", ";", "10", "mM", ")", "or", "glucose", "(", "4", ".", "5", "g", "/", "L", ")", ",", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "EBSS", "treatment", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "and", "the", "indicated", "supplements", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "FBS", "(", "10", "%", ")", ",", "but", "not", "non", "-", "essential", "amino", "acids", "(", "NEAA", ";", "10", "mM", ")", "or", "glucose", "(", "4", ".", "5", "g", "/", "L", ")", ",", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "EBSS", "treatment", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "and", "the", "indicated", "supplements", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "C", "Removal", "of", "FBS", "from", "normal", "growth", "conditions", "(", "DMEM", "+", "10", "%", "FBS", ")", "results", "in", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "degradation", "in", "HeLa", "cells", ".", "D", ",", "E", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "stability", "is", "controlled", "by", "a", "<", "3", "kDa", ",", "heat", "stable", ",", "lipophilic", "molecule", "present", "in", "FBS", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "alone", ",", "or", "EBSS", "containing", "10", "%", "complete", "FBS", ",", "10", "%", "charcoal", "-", "dextran", "stripped", "FBS", ",", "10", "%", "boiled", "FBS", ",", "10", "%", "dialyzed", ">", "3", "kDa", "FBS", ",", "or", "10", "%", "dialyzed", "<", "3", "kDa", "FBS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "F", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "instability", "upon", "nutrient", "deprivation", "of", "HeLa", "cells", "is", "not", "altered", "by", "EGF", "0", ".", "2", "ng", "/", "mL", ",", "testosterone", ",", "or", "bovine", "pituitary", "extract", "25", "µg", "/", "mL", ".", "Insulin", "partially", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "NEAA", "(", "10", "mM", ")", "or", "insulin", "(", "10", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", ",", "H", "Insulin", "partially", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "insulin", "(", "10", "µg", "/", "mL", ")", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2FBS (10%), but not non-essential amino acids (NEAA; 10 mM) or glucose (4.5 g/L), rescues MAGE-A3/6 protein levels upon EBSS treatment. HeLa cells were treated with EBSS and the indicated supplements for the indicated times. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown.FBS (10%), but not non-essential amino acids (NEAA; 10 mM) or glucose (4.5 g/L), rescues MAGE-A3/6 protein levels upon EBSS treatment. HeLa cells were treated with EBSS and the indicated supplements for the indicated times. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate ** p<0.01; *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA.C Removal of FBS from normal growth conditions (DMEM+10% FBS) results in MAGE-A3/6 protein degradation in HeLa cells.D, E MAGE-A3/6 protein stability is controlled by a <3 kDa, heat stable, lipophilic molecule present in FBS. HeLa cells were treated with EBSS alone, or EBSS containing 10% complete FBS, 10% charcoal-dextran stripped FBS, 10% boiled FBS, 10% dialyzed >3 kDa FBS, or 10% dialyzed <3 kDa FBS for the indicated times. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate ** p<0.01; *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA.F MAGE-A3/6 protein instability upon nutrient deprivation of HeLa cells is not altered by EGF 0.2 ng/mL, testosterone, or bovine pituitary extract 25 µg/mL.Insulin partially rescues MAGE-A3/6 protein levels upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated for the indicated times with EBSS alone or EBSS containing NEAA (10 mM) or insulin (10 µg/mL). Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown., H Insulin partially rescues MAGE-A3/6 protein levels upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated for the indicated times with EBSS alone or EBSS containing insulin (10 µg/mL). Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate ** p<0.01; *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3A", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "mRNA", "levels", "do", "not", "change", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "RNA", "was", "isolated", "from", "HeLa", "cells", "treated", "with", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "RT", "-", "QPCR", "analysis", "was", "performed", "to", "detect", "both", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "with", "a", "common", "primer", "set", ".", "Data", "was", "normalized", "to", "18S", "rRNA", "levels", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "B", ",", "Proteasome", "inhibition", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "in", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "lysosome", "inhibitor", "bafilomycin", "A1", "(", "BafA1", ",", "50", "nM", ")", "or", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "(", "10", "µM", ")", ".", "C", "Proteasome", "inhibition", "rescues", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "for", "the", "indicated", "times", "in", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "lysosome", "inhibitor", "bafilomycin", "A1", "(", "BafA1", ",", "50", "nM", ")", "or", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "(", "10", "µM", ")", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "D", "Nutrient", "deprivation", "increases", "ubiquitination", "of", "endogenous", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "µM", ")", "in", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "6", "hrs", ".", "Cell", "extracts", "were", "incubated", "with", "control", "agarose", "or", "agarose", "-", "TUBE2", "to", "isolate", "ubiquitinated", "proteins", ".", "Input", "and", "pulldown", "samples", "were", "probed", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "E", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "instability", "upon", "nutrient", "deprivation", "is", "not", "rescued", "by", "knockdown", "of", "its", "associated", "E3", "ubiquitin", "ligase", ",", "TRIM28", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "or", "TRIM28", "siRNAs", "for", "6", "days", "before", "incubation", "in", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "F", ",", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "degradation", "upon", "nutrient", "starvation", "is", "dependent", "on", "a", "Cullin", "E3", "ubiquitin", "ligase", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "the", "NAE1", "inhibitor", "MLN4924", "(", "1", "µM", ")", "that", "blocks", "the", "activity", "of", "Cullin", "E3", "ubiquitin", "ligases", "for", "the", "indicated", "times", ".", "G", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "degradation", "upon", "nutrient", "starvation", "is", "dependent", "on", "a", "Cullin", "E3", "ubiquitin", "ligase", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "alone", "or", "EBSS", "containing", "the", "NAE1", "inhibitor", "MLN4924", "(", "1", "µM", ")", "that", "blocks", "the", "activity", "of", "Cullin", "E3", "ubiquitin", "ligases", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Quantitation", "represents", "average", "of", "n", "=", "3", "with", "standard", "deviation", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "H", "Degradation", "of", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "upon", "nutrient", "deprivation", "is", "dependent", "on", "a", "Cul4", "E3", "ubiquitin", "ligase", "complex", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", "control", "or", "the", "indicated", "dominant", "negative", "(", "D", "/", "N", ")", "Cullin", "constructs", "for", "48", "hrs", "before", "harvesting", "cells", "after", "0", "or", "4", "hrs", "EBSS", "treatment", ".", "I", "Degradation", "of", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "upon", "nutrient", "deprivation", "is", "dependent", "on", "Cul4A", "/", "B", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNAs", "or", "siRNAs", "targeting", "both", "Cul4A", "and", "Cul4B", ".", "72", "hrs", "after", "treatment", ",", "cells", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", "with", "EBSS", "before", "harvesting", "and", "immunoblotting", ".", "Note", ",", "time", "0", "samples", "between", "two", "siRNA", "groups", "were", "normalized", "to", "more", "readily", "discern", "differences", "in", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "degradation", "upon", "nutrient", "deprivation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A MAGE-A3/6 mRNA levels do not change upon nutrient deprivation. RNA was isolated from HeLa cells treated with EBSS for the indicated times. RT-QPCR analysis was performed to detect both MAGE-A3/6 with a common primer set. Data was normalized to 18S rRNA levels. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown.B, Proteasome inhibition rescues MAGE-A3/6 protein levels upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated for the indicated times in EBSS alone or EBSS containing lysosome inhibitor bafilomycin A1 (BafA1, 50 nM) or proteasome inhibitor MG132 (10 µM).C Proteasome inhibition rescues MAGE-A3/6 protein levels upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated for the indicated times in EBSS alone or EBSS containing lysosome inhibitor bafilomycin A1 (BafA1, 50 nM) or proteasome inhibitor MG132 (10 µM). Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA.D Nutrient deprivation increases ubiquitination of endogenous MAGE-A3/6. HeLa cells were treated with MG132 (10 µM) in complete media or EBSS for 6 hrs. Cell extracts were incubated with control agarose or agarose-TUBE2 to isolate ubiquitinated proteins. Input and pulldown samples were probed for the indicated proteins.E MAGE-A3/6 protein instability upon nutrient deprivation is not rescued by knockdown of its associated E3 ubiquitin ligase, TRIM28. HeLa cells were treated with control or TRIM28 siRNAs for 6 days before incubation in EBSS for the indicated times.F, MAGE-A3/6 degradation upon nutrient starvation is dependent on a Cullin E3 ubiquitin ligase. HeLa cells were treated with EBSS alone or EBSS containing the NAE1 inhibitor MLN4924 (1 µM) that blocks the activity of Cullin E3 ubiquitin ligases for the indicated times.G MAGE-A3/6 degradation upon nutrient starvation is dependent on a Cullin E3 ubiquitin ligase. HeLa cells were treated with EBSS alone or EBSS containing the NAE1 inhibitor MLN4924 (1 µM) that blocks the activity of Cullin E3 ubiquitin ligases for the indicated times. Quantitation represents average of n=3 with standard deviation shown. Data information: Asterisks indicate *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using 2-way ANOVA.H Degradation of MAGE-A3/6 upon nutrient deprivation is dependent on a Cul4 E3 ubiquitin ligase complex. HeLa cells were transfected with vector control or the indicated dominant negative (D/N) Cullin constructs for 48 hrs before harvesting cells after 0 or 4 hrs EBSS treatment.I Degradation of MAGE-A3/6 upon nutrient deprivation is dependent on Cul4A/B. HeLa cells were transfected with control siRNAs or siRNAs targeting both Cul4A and Cul4B. 72 hrs after treatment, cells were incubated for the indicated times with EBSS before harvesting and immunoblotting. Note, time 0 samples between two siRNA groups were normalized to more readily discern differences in MAGE-A3/6 degradation upon nutrient deprivation."}
{"words": ["Figure", "4A", "Tandem", "affinity", "purification", "of", "MAGE", "-", "A3", "from", "HEK293", "cells", "identified", "DDB1", ",", "DCAF5", ",", "and", "DCAF12", "as", "binding", "partners", ".", "Mascot", "score", ",", "number", "of", "peptides", "identified", ",", "and", "percent", "coverage", "is", "shown", ".", "B", "MAGE", "-", "A3", "interacts", "with", "DCAF12", ",", "but", "not", "DCAF5", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", "(", "Myc", "-", "MAGE", "-", "A3", "and", "HA", "-", "DCAF5", "or", "HA", "-", "DCAF12", ")", ".", "Two", "days", "later", "cells", "were", "treated", "with", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "4", "hrs", ".", "Cells", "were", "treated", "in", "the", "presence", "of", "1", "µM", "MLN4924", "to", "stabilize", "MAGE", "-", "A3", ".", "Cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "Myc", "IP", ".", "C", "Nutrient", "deprivation", "increases", "endogenous", "DCAF12", "binding", "to", "MAGE", "-", "A3", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfect", "with", "Myc", "-", "vector", "or", "Myc", "-", "MAGE", "-", "A3", "for", "48", "hrs", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "10", "µM", "MG132", "in", "complete", "media", ",", "EBSS", ",", "or", "EBSS", "containing", "20", "µg", "/", "mL", "insulin", "for", "6", "hrs", ".", "Cell", "extracts", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "Myc", "IP", ".", "Knockdown", "of", "DCAF12", ",", "but", "not", "DCAF5", ",", "altered", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "and", "partially", "rescued", "its", "instability", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", ",", "DCAF5", "siRNAs", "for", "72", "hrs", "before", "incubation", "in", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", "with", "or", "without", "MLN4924", "(", "1", "µM", ")", ".", "E", "Knockdown", "of", "DCAF12", ",", "but", "not", "DCAF5", ",", "altered", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "protein", "levels", "and", "partially", "rescued", "its", "instability", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "or", "DCAF12", "siRNAs", "for", "72", "hrs", "before", "incubation", "in", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", "with", "or", "without", "MLN4924", "(", "1", "µM", ")", ".", "F", "Knockdown", "of", "DCAF12", "with", "individual", "siRNAs", "blocks", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "degradation", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "72", "hrs", "before", "incubation", "in", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Note", ",", "time", "0", "samples", "between", "siRNA", "groups", "were", "normalized", "to", "more", "readily", "discern", "differences", "in", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "degradation", "upon", "nutrient", "deprivation", ".", "G", "Ubiquitination", "of", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "upon", "nutrient", "deprivation", "is", "dependent", "on", "DCAF12", ".", "A375", "parental", "or", "DCAF12", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "µM", ")", "in", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "6", "hrs", ".", "Cell", "extracts", "were", "incubated", "with", "control", "agarose", "or", "agarose", "-", "TUBE2", "to", "isolate", "ubiquitinated", "proteins", ".", "Input", "and", "pulldown", "samples", "were", "probed", "for", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Tandem affinity purification of MAGE-A3 from HEK293 cells identified DDB1, DCAF5, and DCAF12 as binding partners. Mascot score, number of peptides identified, and percent coverage is shown.B MAGE-A3 interacts with DCAF12, but not DCAF5. HeLa cells were transfected with the indicated constructs (Myc-MAGE-A3 and HA-DCAF5 or HA-DCAF12). Two days later cells were treated with complete media or EBSS for 4 hrs. Cells were treated in the presence of 1 µM MLN4924 to stabilize MAGE-A3. Cell extracts were subjected to anti-Myc IP.C Nutrient deprivation increases endogenous DCAF12 binding to MAGE-A3. HeLa cells were transfect with Myc-vector or Myc-MAGE-A3 for 48 hrs. Cells were then treated with 10 µM MG132 in complete media, EBSS, or EBSS containing 20 µg/mL insulin for 6 hrs. Cell extracts were subjected to anti-Myc IP.Knockdown of DCAF12, but not DCAF5, altered MAGE-A3/6 protein levels and partially rescued its instability upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated with control, DCAF5 siRNAs for 72 hrs before incubation in complete media or EBSS for the indicated times with or without MLN4924 (1 µM).E Knockdown of DCAF12, but not DCAF5, altered MAGE-A3/6 protein levels and partially rescued its instability upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated with control or DCAF12 siRNAs for 72 hrs before incubation in complete media or EBSS for the indicated times with or without MLN4924 (1 µM).F Knockdown of DCAF12 with individual siRNAs blocks MAGE-A3/6 degradation upon nutrient deprivation. HeLa cells were treated with the indicated siRNAs for 72 hrs before incubation in EBSS for the indicated times. Note, time 0 samples between siRNA groups were normalized to more readily discern differences in MAGE-A3/6 degradation upon nutrient deprivation.G Ubiquitination of MAGE-A3/6 upon nutrient deprivation is dependent on DCAF12. A375 parental or DCAF12 KO cells were treated with MG132 (10 µM) in complete media or EBSS for 6 hrs. Cell extracts were incubated with control agarose or agarose-TUBE2 to isolate ubiquitinated proteins. Input and pulldown samples were probed for the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "5A", "Identification", "of", "DCAF12", "substrates", ".", "Control", "(", "WT", ")", "or", "DCAF12", "knockout", "(", "KO", ")", "A375", "cells", "were", "subjected", "to", "quantitative", "TMT", "proteomics", "to", "identify", "potential", "DCAF12", "targets", ".", "MAGE", "-", "A", "proteins", "(", "shown", "in", "blue", ")", "are", "stabilized", "in", "DCAF12", "knockout", "cells", ".", "B", "Knockout", "of", "DCAF12", "rescues", "degradation", "of", "MAGE", "-", "A", "proteins", "in", "A375", "cells", ".", "DCAF12", "KO", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "complete", "media", "or", "EBSS", "before", "quantitative", "TMT", "proteomics", ".", "Note", "MAGE", "-", "A", "genes", "are", "not", "significantly", "altered", "by", "EBSS", "in", "DCAF12", "KO", "cells", ".", "C", "DCAF12", "target", "proteins", "are", "differentially", "affected", "by", "EBSS", "compared", "to", "remainder", "of", "the", "proteome", ".", "DCAF12", "targets", "(", "n", "=", "33", ")", "identified", "show", "significantly", "greater", "decrease", "upon", "EBSS", "treatment", "compared", "to", "non", "-", "DCAF12", "altered", "genes", "(", "n", "=", "8243", ")", ".", "Average", "with", "standard", "deviation", "is", "shown", "with", "statistical", "analysis", "by", "student", "t", "-", "test", ".", "Asterisks", "*", "*", "*", "indicate", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "student", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "Overexpression", "of", "DCAF12", "decreases", "wild", "-", "type", "MAGE", "-", "A3", ",", "but", "not", "MAGE", "-", "A3", "degron", "mutant", ".", "The", "indicated", "constructs", "were", "expressed", "for", "48", "hrs", "in", "HeLa", "cells", "before", "immunoblotting", ".", "The", "MAGE", "-", "A3", "degron", "mutant", "was", "created", "]", ",", "in", "which", "DNYNEPKANQ", "*", "were", "added", "to", "the", "extreme", "C", "-", "term", "to", "obscure", "the", "DCAF12", "degron", "motif", ".", "F", "Analysis", "of", "proteomics", "indicates", "that", "MAGE", "-", "A1", ",", "MAGE", "-", "A4", ",", "MAGE", "-", "A10", ",", "and", "MAGE", "-", "A11", "are", "not", "regulated", "by", "nutrient", "deprivation", "or", "DCAF12", ".", "Average", "(", "n", "=", "3", ")", "with", "standard", "deviation", "is", "shown", "with", "statistical", "analysis", "by", "student", "t", "-", "test", ".", "Asterisks", "*", "*", "*", "indicate", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "student", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "MAGE", "-", "A10", "and", "MAGE", "-", "A11", "are", "not", "altered", "upon", "nutrient", "deprivation", "or", "DCAF12", "deletion", ".", "A375", "parental", "or", "DCAF12", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "EBSS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "lysates", "were", "probed", "for", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Identification of DCAF12 substrates. Control (WT) or DCAF12 knockout (KO) A375 cells were subjected to quantitative TMT proteomics to identify potential DCAF12 targets. MAGE-A proteins (shown in blue) are stabilized in DCAF12 knockout cells.B Knockout of DCAF12 rescues degradation of MAGE-A proteins in A375 cells. DCAF12 KO A375 cells were treated with complete media or EBSS before quantitative TMT proteomics. Note MAGE-A genes are not significantly altered by EBSS in DCAF12 KO cells.C DCAF12 target proteins are differentially affected by EBSS compared to remainder of the proteome. DCAF12 targets (n=33) identified show significantly greater decrease upon EBSS treatment compared to non-DCAF12 altered genes (n=8243). Average with standard deviation is shown with statistical analysis by student t-test. Asterisks *** indicate p<0.001 (student t-test).E Overexpression of DCAF12 decreases wild-type MAGE-A3, but not MAGE-A3 degron mutant. The indicated constructs were expressed for 48 hrs in HeLa cells before immunoblotting. The MAGE-A3 degron mutant was created ], in which DNYNEPKANQ* were added to the extreme C-term to obscure the DCAF12 degron motif.F Analysis of proteomics indicates that MAGE-A1, MAGE-A4, MAGE-A10, and MAGE-A11 are not regulated by nutrient deprivation or DCAF12. Average (n=3) with standard deviation is shown with statistical analysis by student t-test. Asterisks *** indicate p<0.001 (student t-test).G MAGE-A10 and MAGE-A11 are not altered upon nutrient deprivation or DCAF12 deletion. A375 parental or DCAF12 KO cells were treated with EBSS for the indicated times. Cell lysates were probed for the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "B", "U2OS", "GFP", "-", "LC3", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "72", "hrs", "before", "treatment", "with", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "6", "hrs", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "imaged", ",", "and", "the", "number", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "were", "quantitated", "per", "cell", ".", "Representative", "images", "(", "A", ")", "and", "quantitation", "of", ">", "50", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "B", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50", "µm", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "student", "t", "-", "test", ".", "C", "-", "D", "A375", "parental", "or", "DCAF12", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "72", "hrs", "before", "treatment", "with", "complete", "media", "or", "EBSS", "for", "6", "hrs", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", ",", "endogenous", "LC3", "was", "immunostained", ",", "and", "the", "number", "of", "LC3", "puncta", "were", "quantitated", "per", "cell", ".", "Representative", "images", "(", "C", ")", "and", "quantitation", "of", ">", "50", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "D", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "indicates", "20", "µm", ".", "Data", "information", ":", "Asterisks", "indicate", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ns", "indicates", "p", ">", "0", ".", "05", "using", "student", "t", "-", "test", ".", "E", "A375", "parental", "or", "DCAF12", "KO", "cells", "were", "treated", "Cell", "lysates", "were", "collected", "and", "immunoblotted", "for", "the", "indicated", "antibodies", "to", "confirm", "MAGE", "-", "A3", "/", "6", "depletion", "and", "monitor", "the", "autophagy", "adaptor", "/", "substrate", "p62", "/", "SQSTM1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-B U2OS GFP-LC3 cells were transfected with the indicated siRNAs for 72 hrs before treatment with complete media or EBSS for 6 hrs. Cells were then fixed, imaged, and the number of GFP-LC3 puncta were quantitated per cell. Representative images (A) and quantitation of >50 cells from three independent experiments (B) are shown. Scale bar indicates 50 µm. Data information: Asterisks indicate * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using student t-test.C-D A375 parental or DCAF12 KO cells were transfected with the indicated siRNAs for 72 hrs before treatment with complete media or EBSS for 6 hrs. Cells were then fixed, endogenous LC3 was immunostained, and the number of LC3 puncta were quantitated per cell. Representative images (C) and quantitation of >50 cells from three independent experiments (D) are shown. Scale bar indicates 20 µm. Data information: Asterisks indicate * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. ns indicates p>0.05 using student t-test.E A375 parental or DCAF12 KO cells were treated Cell lysates were collected and immunoblotted for the indicated antibodies to confirm MAGE-A3/6 depletion and monitor the autophagy adaptor/substrate p62/SQSTM1."}
{"words": ["Figure", "1a", ",", "Expression", "levels", "of", "ISX", ",", "TWIST1", ",", "Snail1", ",", "Fibronectin", "(", "FN1", ")", ",", "VEGF", ",", "and", "E", "-", "cadherin", "(", "CDH1", ")", "mRNA", "were", "examined", "in", "a", "ISX", "-", "GFP", "inducible", "Tet", "-", "ON", "transformants", "at", "8", "h", "after", "addition", "of", "DOX", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "to", "time", "point", "0h", ";", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "b", ",", "Western", "blotting", "analysis", "of", "the", "protein", "levels", "of", "ISX", ",", "HIF1α", ",", "TWIST1", ",", "Snail1", ",", "Slug", ",", "ZEB1", ",", "Bmi1", ",", "E", "-", "cadherin", "(", "E", "-", "Cad", ".", ")", ",", "Fibronectin", ",", "N", "-", "cadherin", "(", "N", "-", "Cad", ".", ")", ",", "Vimentin", ",", "and", "VEGF", "in", "A549", "and", "H1299", "cells", "with", "DOX", "-", "inducible", "ISX", "expression", "system", "8hs", "after", "DOX", "induction", ".", "ISX", "transcriptionally", "activates", "luciferase", "activity", "driven", "by", "TWIST1", "(", "c", ")", "promoter", "regions", "in", "A549", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "d", ",", "ISX", "transcriptionally", "activates", "luciferase", "activity", "driven", "by", "Snail1", "(", "d", ")", "promoter", "regions", "in", "A549", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "e", ",", "ChIP", "analysis", "of", "ISX", "binding", "to", "the", "TWIST1", "promoter", "region", "in", "A549", "and", "H1299", "cells", "(", "10", "%", "input", "of", "each", "groups", "were", "pull", "down", "and", "applied", "to", "qPCR", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "f", ",", "ISX", "transactivation", "activity", "analyzed", "by", "luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "TWIST1", "promoter", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "g", ",", "ChIP", "analysis", "of", "ISX", "binding", "to", "the", "endogenous", "promoters", "of", "TWIST1", "(", "-", "180", "/", "+", "35", ")", "and", "Snail1", "(", "-", "160", "/", "+", "40", ")", "in", "A549", "and", "cells", "(", "10", "%", "input", "of", "each", "groups", "were", "pull", "down", "and", "applied", "to", "qPCR", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "h", ",", "Effect", "of", "forced", "expression", "and", "knockdown", "of", "ISX", "on", "cell", "migration", "(", "wound", "healing", ")", "measured", "in", "A549", "cells", ".", "ISXi", ",", "ISX", "-", "specific", "shRNAi", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "i", ",", "Effect", "of", "forced", "expression", "and", "knockdown", "of", "ISX", "on", "cell", "invasion", "(", "transwell", ")", "activity", "measured", "in", "A549", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1a, Expression levels of ISX, TWIST1, Snail1, Fibronectin (FN1), VEGF, and E-cadherin (CDH1) mRNA were examined in a ISX-GFP inducible Tet-ON transformants at 8 h after addition of DOX. Data are presented as mean ± SD in graph (p< 0.001 compared to time point 0h; Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.b, Western blotting analysis of the protein levels of ISX, HIF1α, TWIST1, Snail1, Slug, ZEB1, Bmi1, E-cadherin (E-Cad.), Fibronectin, N-cadherin (N-Cad.), Vimentin, and VEGF in A549 and H1299 cells with DOX-inducible ISX expression system 8hs after DOX induction.ISX transcriptionally activates luciferase activity driven by TWIST1 (c) promoter regions in A549 cells. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.d, ISX transcriptionally activates luciferase activity driven by Snail1 (d) promoter regions in A549 cells. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.e, ChIP analysis of ISX binding to the TWIST1 promoter region in A549 and H1299 cells (10% input of each groups were pull down and applied to qPCR). Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.f, ISX transactivation activity analyzed by luciferase activity driven by the TWIST1 promoter. Data are presented as mean ± SD in graph (p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.g, ChIP analysis of ISX binding to the endogenous promoters of TWIST1 (-180/+35) and Snail1(-160/+40) in A549 and cells (10% input of each groups were pull down and applied to qPCR). Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate.h, Effect of forced expression and knockdown of ISX on cell migration (wound healing) measured in A549 cells. ISXi, ISX-specific shRNAi Data are presented as mean ± SD in graph (**, p < 0.01, ***, p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm.i, Effect of forced expression and knockdown of ISX on cell invasion (transwell) activity measured in A549 cells. Data are presented as mean ± SD in bar graph (***, p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm."}
{"words": ["Figure", "2a", ",", "BRD4", "peptide", "(", "291", "-", "314", "a", ".", "a", ")", "obtained", "from", "anti", "-", "ISX", "immunoprecipitates", "of", "A549", "cell", "lysates", "identified", "through", "liquid", "chromatography", "‒", "tandem", "mass", "spectrometry", "(", "LC", "-", "tandem", "-", "MS", ")", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "b", ",", "ISX", "association", "proteins", "(", "PCAF", ",", "BRD4", ",", "CBP", ",", "CREB", ",", "RNA", "Pol", "II", ",", "and", "Histone", "H3", ")", "determined", "by", "Western", "blot", "in", "immunoprecipitation", "of", "A549", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "c", ",", "ISX", "association", "proteins", "(", "PCAF", ",", "BRD4", ",", "CBP", ",", "CREB", ",", "and", "RNA", "Pol", "II", ")", "determined", "by", "Western", "blot", "in", "anti", "-", "ISX", "immunoprecipitates", "of", "tumor", "tissues", "from", "patients", "with", "lung", "cancer", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "d", ",", "Proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "of", "ISX", "and", "BRD4", "(", "PCAF", ")", "interaction", "in", "A549", "cells", ".", "Red", "foci", "indicate", "close", "proximity", "of", "the", "two", "proteins", ".", "NC", ":", "negative", "control", ".", "Blank", "arrows", "indicate", "interactions", "of", "ISX", "with", "BRD4", "(", "PCAF", ")", "in", "the", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "e", ",", "Western", "blotting", "analysis", "of", "the", "protein", "levels", "of", "ISX", ",", "PCAF", ",", "and", "EMT", "markers", "in", "DOX", "-", "inducible", "ISX", "expression", "system", "A549", "cells", "treated", "with", "TH1834", ",", "Garcinol", ",", "C646", ",", "MB", "-", "3", "for", "8", "h", "after", "DOX", "induction", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "f", ",", "Proximity", "ligation", "assay", "of", "ISX", "and", "BRD4", "interaction", "in", "A549", "cells", "treated", "with", "Garcinol", ".", "Red", "foci", "indicate", "close", "proximity", "of", "the", "two", "proteins", ".", "Blank", "arrows", "indicate", "interactions", "of", "ISX", "with", "BRD4", "in", "the", "cells", ".", "NC", ":", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "g", ",", "Western", "blotting", "analysis", "of", "the", "protein", "levels", "of", "ISX", ",", "PCAF", ",", "and", "EMT", "markers", "in", "A549", "cells", "with", "PCAF", "knockdown", "and", "DOX", "-", "inducible", "ISX", "expression", "system", "at", "8", "h", "time", "point", "after", "DOX", "induction", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Cell", "migration", "(", "wound", "healing", ",", "h", ")", "ssay", "of", "A549", "lung", "cancer", "cells", "treated", "with", "Garcinol", ".", "V", ",", "vehicle", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "i", ",", "Cell", "invasion", "(", "transwell", ",", "i", ")", "assay", "of", "A549", "lung", "cancer", "cells", "treated", "with", "Garcinol", ".", "V", ",", "vehicle", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2a, BRD4 peptide (291-314 a.a) obtained from anti-ISX immunoprecipitates of A549 cell lysates identified through liquid chromatography‒tandem mass spectrometry (LC-tandem -MS). Data information: Each experiment was repeated at least three times.b, ISX association proteins (PCAF, BRD4, CBP, CREB, RNA Pol II, and Histone H3) determined by Western blot in immunoprecipitation of A549 cells. Data information: Each experiment was repeated at least three times.c, ISX association proteins (PCAF, BRD4, CBP, CREB, and RNA Pol II) determined by Western blot in anti-ISX immunoprecipitates of tumor tissues from patients with lung cancer. Data information: Each experiment was repeated at least three times.d, Proximity ligation assay (PLA) of ISX and BRD4(PCAF) interaction in A549 cells. Red foci indicate close proximity of the two proteins. NC: negative control. Blank arrows indicate interactions of ISX with BRD4 (PCAF) in the cells. Data information: Each experiment was repeated at least three times.e, Western blotting analysis of the protein levels of ISX, PCAF, and EMT markers in DOX-inducible ISX expression system A549 cells treated with TH1834, Garcinol, C646, MB-3 for 8 h after DOX induction. Data information: Each experiment was repeated at least three times.f, Proximity ligation assay of ISX and BRD4 interaction in A549 cells treated with Garcinol. Red foci indicate close proximity of the two proteins. Blank arrows indicate interactions of ISX with BRD4 in the cells. NC: negative control. Data information: Each experiment was repeated at least three times.g, Western blotting analysis of the protein levels of ISX, PCAF, and EMT markers in A549 cells with PCAF knockdown and DOX-inducible ISX expression system at 8 h time point after DOX induction. Data information: Each experiment was repeated at least three times.Cell migration (wound healing, h) ssay of A549 lung cancer cells treated with Garcinol. V, vehicle. Data are presented as mean ± SD in graph (***, p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm. Data information: Each experiment was repeated at least three times. i, Cell invasion (transwell, i) assay of A549 lung cancer cells treated with Garcinol. V, vehicle. Data are presented as mean ± SD in graph (***, p < 0.001 , Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm. Data information: Each experiment was repeated at least three times."}
{"words": ["Figure", "3c", ",", "Recombinant", "PCAF", "acetylates", "His6", "-", "ISX", "at", "lysine", "residue", "69", "by", "in", "vitro", "acetylation", "assay", ".", "Acetylated", "ISX", "was", "detected", "by", "anti", "-", "acetyl", "Lysine", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "d", "and", "e", ",", "The", "protein", "levels", "of", "GFP", "-", "tagged", "WT", "or", "mutant", "ISX", ",", "PCAF", "and", "BRD4", "were", "determined", "in", "cytosol", ",", "nuclei", ",", "and", "anti", "-", "GFP", "immunoprecipites", "of", "A549", "cells", "by", "Western", "blotting", ".", "Acetylated", "ISX", "was", "detected", "by", "anti", "-", "acetyl", "Lysine", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "f", ",", "The", "protein", "levels", "of", "total", "and", "acetylated", "histone", "H3", "were", "determined", "in", "anti", "-", "histone", "H3", "immunoprecipites", "of", "A549", "cells", "by", "Western", "blotting", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "cell", "migration", "(", "wound", "healing", ",", "g", ")", "activity", "were", "determined", "in", "A549", "cells", "with", "GFP", "-", "tagged", "wild", "or", "ISX", "mutants", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "h", ",", "The", "cell", "invasion", "(", "transwell", ",", "h", ")", "activity", "were", "determined", "in", "A549", "cells", "with", "GFP", "-", "tagged", "wild", "or", "ISX", "mutants", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "graph", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Scale", "bar", ",", "100μm", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "j", ".", "Tumor", "xenografts", "metastasis", "activity", "of", "constitutively", "expressing", "RFP", "A549", "cells", "transfected", "with", "wild", "type", "or", "ISX", "AC3", "mutant", "cDNA", "were", "imaged", "by", "IVIS", "imaging", "system", "at", "fifth", "weeks", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "k", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "analysis", "of", "nude", "mice", "xenograft", "injected", "with", "A549", "cells", "carrying", "GFP", ",", "ISX", "-", "GFP", "and", "ISX", "Ac", "-", "GFP", "(", "AC3", ")", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "p", "=", "0", ".", "0003", ".", "p", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "log", "‐", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "comparing", "the", "two", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3c, Recombinant PCAF acetylates His6-ISX at lysine residue 69 by in vitro acetylation assay. Acetylated ISX was detected by anti-acetyl Lysine antibody. Data information: Each experiment was repeated at least three times.d and e, The protein levels of GFP-tagged WT or mutant ISX, PCAF and BRD4 were determined in cytosol, nuclei, and anti-GFP immunoprecipites of A549 cells by Western blotting. Acetylated ISX was detected by anti-acetyl Lysine antibody. Data information: Each experiment was repeated at least three times.f, The protein levels of total and acetylated histone H3 were determined in anti-histone H3 immunoprecipites of A549 cells by Western blotting. Data information: Each experiment was repeated at least three times.The cell migration (wound healing, g) activity were determined in A549 cells with GFP-tagged wild or ISX mutants. Data are presented as mean ± SD in graph (***, p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm. Data information: Each experiment was repeated at least three times.h, The cell invasion (transwell, h) activity were determined in A549 cells with GFP-tagged wild or ISX mutants. Data are presented as mean ± SD in graph (***, p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Scale bar, 100μm. Data information: Each experiment was repeated at least three times.j. Tumor xenografts metastasis activity of constitutively expressing RFP A549 cells transfected with wild type or ISX AC3 mutant cDNA were imaged by IVIS imaging system at fifth weeks Data information: Each experiment was repeated at least three times.k, Kaplan-Meier survival curve analysis of nude mice xenograft injected with A549 cells carrying GFP, ISX-GFP and ISX Ac-GFP (AC3) (n = 10). p = 0.0003. p‐values were calculated by log‐rank (Mantel-Cox) test comparing the two Kaplan-Meier curves. Data information: Each experiment was repeated at least three times."}
{"words": ["Figure", "4c", ",", "Recombinant", "PCAF", "acetylates", "His6", "-", "BRD4", "at", "lysine", "residue", "332", ".", "Acetylated", "BRD4", "was", "detected", "by", "anti", "-", "acetyl", "Lysine", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "d", ",", "The", "mCherry", "-", "tagged", "WT", "and", "BRD4", "mutants", "were", "detected", "in", "anti", "-", "GFP", "immunoprecipitates", "by", "Western", "blotting", "in", "A549", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "e", "and", "f", ",", "The", "mRNA", "levels", "of", "TWIST1", "(", "e", ")", "and", "Snail1", "(", "f", ")", "were", "verified", "in", "A549", "cells", "co", "-", "expressing", "mCherry", "-", "tagged", "WT", "or", "mutant", "BRD4", "and", "GFP", "-", "tagged", "ISX", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "g", "and", "h", ",", "The", "DNA", "binding", "activity", "of", "TWIST1", "and", "Snail1", "were", "evaluated", "in", "anti", "-", "GFP", "-", "mCherry", "ChIP", "-", "ChIP", "immunoprecipitates", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "A549", "cells", ".", "Red", ",", "Hprt1", "promoter", "(", "-", "190", "/", "+", "40", "bp", ",", "negative", "control", ")", "(", "10", "%", "input", "of", "each", "groups", "were", "pulled", "down", "and", "used", "for", "qPCR", "analysis", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "i", ",", "The", "cell", "invasion", "(", "transwell", ")", "activity", "were", "determined", "in", "A549", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "cDNA", "coding", "for", "GFP", "-", "tagged", "ISX", "and", "mCherry", "-", "tagged", "BRD4", "mutants", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4c, Recombinant PCAF acetylates His6-BRD4 at lysine residue 332. Acetylated BRD4 was detected by anti-acetyl Lysine antibody. Data information: Each experiment was repeated at least three times.d, The mCherry-tagged WT and BRD4 mutants were detected in anti-GFP immunoprecipitates by Western blotting in A549 cells. Data information: Each experiment was repeated at least three times.e and f, The mRNA levels of TWIST1(e) and Snail1(f) were verified in A549 cells co-expressing mCherry-tagged WT or mutant BRD4 and GFP-tagged ISX by RT-PCR. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times.g and h, The DNA binding activity of TWIST1 and Snail1 were evaluated in anti-GFP-mCherry ChIP-ChIP immunoprecipitates by RT-PCR in A549 cells. Red, Hprt1 promoter (-190/+40 bp, negative control) (10% input of each groups were pulled down and used for qPCR analysis). Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times.i, The cell invasion (transwell) activity were determined in A549 cells co-transfected with cDNA coding for GFP-tagged ISX and mCherry-tagged BRD4 mutants. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times."}
{"words": ["Figure", "5a", ",", "Schematic", "depiction", "of", "ISX", "and", "deletion", "constructs", "used", ".", "b", "GFP", "-", "tagged", "truncated", "ISX", "mutant", "proteins", "or", "HA", "-", "tagged", "BRD4", "were", "detected", "in", "anti", "-", "HA", "or", "GFP", "immunoprecipitates", "by", "Western", "blotting", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5a, Schematic depiction of ISX and deletion constructs used. b GFP-tagged truncated ISX mutant proteins or HA-tagged BRD4 were detected in anti-HA or GFP immunoprecipitates by Western blotting analysis. Data information: Each experiment was repeated at least three times."}
{"words": ["Figure", "6a", "mCherry", "-", "tagged", "truncated", "BRD4", "mutant", "proteins", "and", "GFP", "-", "tagged", "ISX", "were", "detected", "in", "anti", "-", "GFP", "immunoprecipitates", "by", "Western", "blot", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "DNA", "binding", "activity", "of", "Snail", "(", "b", ")", "were", "evaluated", "in", "anti", "-", "GFP", "-", "mCherry", "ChIP", "-", "ChIP", "immunoprecipitates", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "A549", "cells", ".", "Red", ",", "Hprt1", "promoter", "(", "-", "190", "-", "+", "40", "bp", ",", "negative", "control", ")", ".", "(", "10", "%", "input", "of", "each", "groups", "were", "pull", "down", "and", "applied", "to", "qPCR", ")", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "c", ",", "The", "DNA", "binding", "activity", "of", "TWIST1", "(", "c", ")", "were", "evaluated", "in", "anti", "-", "GFP", "-", "mCherry", "ChIP", "-", "ChIP", "immunoprecipitates", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "A549", "cells", ".", "Red", ",", "Hprt1", "promoter", "(", "-", "190", "-", "+", "40", "bp", ",", "negative", "control", ")", ".", "(", "10", "%", "input", "of", "each", "groups", "were", "pull", "down", "and", "applied", "to", "qPCR", ")", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "The", "cell", "migration", "(", "wound", "healing", ",", "d", ")", "activity", "were", "determined", "in", "A549", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "cDNAs", "for", "GFP", "-", "tagged", "ISX", "and", "mCherry", "-", "tagged", "BRD4", "mutants", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "e", ",", "The", "cell", "invasion", "(", "transwell", ",", "e", ")", "activity", "were", "determined", "in", "A549", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "cDNAs", "for", "GFP", "-", "tagged", "ISX", "and", "mCherry", "-", "tagged", "BRD4", "mutants", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "in", "bar", "graph", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ")", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "each", "performed", "in", "triplicate", ".", "Data", "information", ":", "Each", "experiment", "was", "repeated", "at", "least", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6a mCherry-tagged truncated BRD4 mutant proteins and GFP-tagged ISX were detected in anti-GFP immunoprecipitates by Western blot. Data information: Each experiment was repeated at least three times.The DNA binding activity of Snail (b) were evaluated in anti-GFP-mCherry ChIP-ChIP immunoprecipitates by RT-PCR in A549 cells. Red, Hprt1 promoter (-190-+40 bp, negative control). (10% input of each groups were pull down and applied to qPCR) Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times.c, The DNA binding activity of TWIST1 (c) were evaluated in anti-GFP-mCherry ChIP-ChIP immunoprecipitates by RT-PCR in A549 cells. Red, Hprt1 promoter (-190-+40 bp, negative control). (10% input of each groups were pull down and applied to qPCR) Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times.The cell migration (wound healing, d) activity were determined in A549 cells co-transfected with cDNAs for GFP-tagged ISX and mCherry-tagged BRD4 mutants. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times.e, The cell invasion (transwell, e) activity were determined in A549 cells co-transfected with cDNAs for GFP-tagged ISX and mCherry-tagged BRD4 mutants. Data are presented as mean ± SD in bar graph (p < 0.001, Student's t‐test) of 3 independent experiments, each performed in triplicate. Data information: Each experiment was repeated at least three times."}
{"words": ["Figure", "7a", ",", "IHC", "staining", "with", "ISX", "(", "brown", ")", "or", "PCAF", "(", "brown", ")", "antibody", "in", "lung", "tumors", "from", "patients", "with", "lung", "cancer", ".", "N", ",", "normal", "tissue", ";", "T", ",", "tumor", "mass", ";", "Nuclei", ",", "hematoxylin", "(", "blue", ")", ";", "Blue", "and", "red", "arrow", ",", "cytosol", "and", "nuclear", "ISX", "(", "PCAF", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "500μm", "(", "400X", ")", ";", "Scale", "bar", ",", "2mm", "(", "100X", ")", ".", "b", ",", "Confocal", "immunofluorescence", "detection", "of", "ISX", "(", "green", ")", "and", "BRD4", "(", "red", ")", "in", "lung", "tumors", "from", "patients", "with", "NSCLC", ".", "Cell", "nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ";", "Yellow", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", ";", "IgG", ",", "negative", "control", ".", "N", ",", "normal", "tissue", ";", "T", ",", "tumor", "mass", ".", "c", ",", "Confocal", "immunofluorescence", "detection", "of", "ISX", "(", "green", ")", "and", "PCAF", "(", "red", ")", "in", "lung", "tumors", "from", "patients", "with", "NSCLC", ".", "Cell", "nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ";", "Yellow", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", ";", "IgG", ",", "negative", "control", ".", "N", ",", "normal", "tissue", ";", "T", ",", "tumor", "mass", ".", "Correlation", "analysis", "of", "mRNA", "expression", "for", ",", "(", "d", ")", "ISX", "and", "BRD4", ",", "in", "157", "lung", "cancer", "samples", ".", "e", ",", "Correlation", "analysis", "of", "mRNA", "expression", "for", ",", "(", "e", ")", "ISX", "and", "PCAF", "in", "157", "lung", "cancer", "samples", ".", "f", ",", "Protein", "expression", "of", "ISX", ",", "ISX", "(", "69Kac", ")", "and", "Vimentin", "in", "tumor", "and", "normal", "parts", "from", "patients", "with", "NSCLC", "by", "western", "blotting", ".", "N", ",", "normal", "tissue", ";", "T", ",", "tumor", "mass", ";", "Arrow", ",", "target", "protein", ";", "*", ",", "unspecific", "band", ".", "The", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "was", "used", "to", "analyze", "survival", "correlation", "between", "patients", "(", "n", "=", "157", ")", "with", "NSCLC", "and", "ISX", "(", "g", ")", "levels", ".", "On", "the", "basis", "of", "the", "cut", "-", "off", "values", "of", "fold", "differences", ",", "the", "study", "population", "was", "dichotomized", "into", "the", "\"", "high", "\"", "and", "\"", "low", "\"", "expression", "group", ".", "p", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "log", "‐", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "comparing", "the", "two", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", ".", "g", "and", "h", ",", "The", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "was", "used", "to", "analyze", "survival", "correlation", "between", "patients", "(", "n", "=", "157", ")", "with", "NSCLC", "and", "PCAF", "(", "h", ")", "levels", ".", "On", "the", "basis", "of", "the", "cut", "-", "off", "values", "of", "fold", "differences", ",", "the", "study", "population", "was", "dichotomized", "into", "the", "\"", "high", "\"", "and", "\"", "low", "\"", "expression", "group", ".", "p", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "log", "‐", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "comparing", "the", "two", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7a, IHC staining with ISX (brown) or PCAF (brown) antibody in lung tumors from patients with lung cancer. N, normal tissue; T, tumor mass; Nuclei, hematoxylin (blue); Blue and red arrow, cytosol and nuclear ISX (PCAF). Scale bar, 500μm (400X); Scale bar, 2mm (100X).b, Confocal immunofluorescence detection of ISX (green) and BRD4 (red) in lung tumors from patients with NSCLC. Cell nuclei were visualized by DAPI (blue); Yellow arrows indicate co-localization; IgG, negative control. N, normal tissue; T, tumor mass.c, Confocal immunofluorescence detection of ISX (green) and PCAF (red) in lung tumors from patients with NSCLC. Cell nuclei were visualized by DAPI (blue); Yellow arrows indicate co-localization; IgG, negative control. N, normal tissue; T, tumor mass.Correlation analysis of mRNA expression for, (d) ISX and BRD4, in 157 lung cancer samples.e, Correlation analysis of mRNA expression for, (e) ISX and PCAF in 157 lung cancer samples.f, Protein expression of ISX, ISX(69Kac) and Vimentin in tumor and normal parts from patients with NSCLC by western blotting. N, normal tissue; T, tumor mass; Arrow, target protein; *, unspecific band.The Kaplan-Meier survival curve was used to analyze survival correlation between patients (n=157) with NSCLC and ISX (g) levels. On the basis of the cut-off values of fold differences, the study population was dichotomized into the \"high\" and \"low\" expression group. p‐values were calculated by log‐rank (Mantel-Cox) test comparing the two Kaplan-Meier curves.g and h, The Kaplan-Meier survival curve was used to analyze survival correlation between patients (n=157) with NSCLC and PCAF (h) levels. On the basis of the cut-off values of fold differences, the study population was dichotomized into the \"high\" and \"low\" expression group. p‐values were calculated by log‐rank (Mantel-Cox) test comparing the two Kaplan-Meier curves."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "ACE2", "expression", "in", "the", "lysate", "of", "human", "lung", "A549", "cells", "overexpressing", "ACE2", "compared", "to", "non", "-", "transduced", "(", "-", ")", "A549", "cells", ".", "Calnexin", "served", "as", "loading", "control", ".", "B", ",", "C", ".", "Illustration", "of", "the", "Incucyte", "readout", ".", "Infection", "of", "A549", "or", "ACE2", "-", "expressing", "A549", "cells", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "encoding", "a", "GFP", "expression", "cassette", ".", "Infection", "of", "cells", "was", "monitored", "microscopically", "as", "green", "fluorescence", "through", "live", "-", "cell", "imaging", "at", "24", "hours", "post", "infection", "(", "hpi", ")", "(", "B", ")", "or", "during", "the", "time", "-", "course", "of", "48", "h", "and", "shown", "as", "the", "mean", "of", "the", "GFP", "-", "positive", "area", "relative", "to", "the", "whole", "area", "covered", "by", "cells", "in", "the", "same", "well", "(", "C", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "means", "±", "SD", "derived", "from", "biological", "triplicates", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "µm", ".", "D", ".", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "for", "6", "hours", "with", "different", "concentrations", "of", "indicated", "inhibitors", "and", "then", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "GFP", ".", "GFP", "-", "fluorescence", "relative", "to", "DMSO", "-", "treated", "control", "cells", "was", "determined", "48", "hpi", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", "for", "every", "indicated", "concentration", "compared", "to", "DMSO", "(", "0", "µM", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "compared", "to", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "for", "30", "min", "with", "PMA", "at", "indicated", "concentrations", "and", "then", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "GFP", ".", "Infection", "of", "cells", "was", "monitored", "as", "in", "C", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "compared", "to", "the", "DMSO", "control", "of", "each", "time", "point", "(", "N", "=", "9", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "F", ",", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "with", "apratastat", ",", "DPC", "-", "333", "at", "indicated", "concentrations", ".", "Experiment", "was", "conducted", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", "for", "every", "indicated", "concentration", "compared", "to", "DMSO", "(", "0", "µM", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "compared", "to", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "G", ".", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "with", "apratastat", ",", "DPC", "-", "333", "or", "BB94", "at", "indicated", "concentrations", ".", "Experiment", "was", "conducted", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", "for", "every", "indicated", "concentration", "compared", "to", "DMSO", "(", "0", "µM", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "compared", "to", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "H", ",", "I", ".", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "for", "1", "h", "with", "indicated", "inhibitors", "(", "10", "µM", ")", "or", "DMSO", "before", "inoculation", "with", "GFP", "-", "encoding", "spike", "pseudoparticles", "(", "VSV", "pseudotyped", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", "(", "VSV", "-", "S", ")", ")", "(", "H", ")", "or", "as", "a", "control", "LCMV", "glycoprotein", "(", "VSV", "-", "GP", ")", "(", "I", ")", ".", "At", "16", "hpi", ",", "infection", "was", "analyzed", "by", "counting", "GFP", "-", "positive", "cells", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "number", "of", "infected", "cells", "in", "virus", "-", "only", "control", "wells", "without", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "5", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ".", "Asterisks", "indicate", "significance", "compared", "to", "DMSO", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunoblot analysis of ACE2 expression in the lysate of human lung A549 cells overexpressing ACE2 compared to non-transduced (-) A549 cells. Calnexin served as loading control.B, C. Illustration of the Incucyte readout. Infection of A549 or ACE2-expressing A549 cells with SARS-CoV-2 encoding a GFP expression cassette. Infection of cells was monitored microscopically as green fluorescence through live-cell imaging at 24 hours post infection (hpi) (B) or during the time-course of 48 h and shown as the mean of the GFP-positive area relative to the whole area covered by cells in the same well (C). Error bars represent means ± SD derived from biological triplicates (N = 3). Scale bar, 500 µm.D. A549-ACE2 cells were treated for 6 hours with different concentrations of indicated inhibitors and then infected with SARS-CoV-2-GFP. GFP-fluorescence relative to DMSO-treated control cells was determined 48 hpi as described in (C). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed for every indicated concentration compared to DMSO (0 µM). Asterisks indicate significance compared to DMSO (N = 3-6). Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.E. A549-ACE2 cells were treated for 30 min with PMA at indicated concentrations and then infected with SARS-CoV-2-GFP. Infection of cells was monitored as in C. Two-way ANOVA with Tukey's post-hoc multiple comparison test. Asterisks indicate significance compared to the DMSO control of each time point (N = 9). Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.F, A549-ACE2 cells were treated with apratastat, DPC-333 at indicated concentrations. Experiment was conducted and analyzed as in (D). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed for every indicated concentration compared to DMSO (0 µM). Asterisks indicate significance compared to DMSO (N = 3-6). Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.G. A549-ACE2 cells were treated with apratastat, DPC-333 or BB94 at indicated concentrations. Experiment was conducted and analyzed as in (D). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed for every indicated concentration compared to DMSO (0 µM). Asterisks indicate significance compared to DMSO (N = 3-6). Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.H, I. A549-ACE2 cells were treated for 1 h with indicated inhibitors (10 µM) or DMSO before inoculation with GFP-encoding spike pseudoparticles (VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 spike protein (VSV-S)) (H) or as a control LCMV glycoprotein (VSV-GP) (I). At 16 hpi, infection was analyzed by counting GFP-positive cells. Data are normalized to the number of infected cells in virus-only control wells without DMSO (N = 3-5). One-way ANOVA with Tukey's post-hoc multiple comparison test. Asterisks indicate significance compared to DMSO. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "viral", "RNA", "(", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "N", "gene", "relative", "to", "RPLP0", ")", "upon", "infection", "of", "A549", "-", "ACE2", "cells", "with", "indicated", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "strains", "at", "24", "hpi", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "BB94", "(", "10", "µM", ")", "or", "DMSO", "for", "6", "h", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "7", ")", ".", "A", "two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "(", "A", ",", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "viral", "RNA", "(", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "N", "gene", "relative", "to", "RPLP0", ")", "upon", "infection", "of", "A549", "-", "ACE2", "cells", "with", "indicated", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "strains", "at", "24", "hpi", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "BB94", "(", "10", "µM", ")", ",", "DPC", "-", "333", "(", "10", "µM", ")", "or", "DMSO", "for", "6", "h", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "DMSO", "(", "N", "=", "3", "-", "7", ")", ".", "A", "two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", ",", "B", ")", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ".", "Normal", "Human", "Bronchial", "Epithelial", "cells", "(", "NHBE", ")", "from", "ten", "donors", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "NHBE", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "camostat", "mesylate", "(", "10µM", ")", ",", "BB94", "(", "1", "µM", "or", "10", "µM", ")", "or", "DMSO", "for", "6", "hours", ".", "RNA", "was", "isolated", "at", "24", "hpi", "and", "levels", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "N", "relative", "to", "RPLP0", "from", "total", "cellular", "RNA", "was", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "DMSO", "control", "(", "N", "=", "5", "-", "10", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "five", "/", "ten", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ",", "NHBE", "cells", "from", "five", "donors", "were", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "Infection", "of", "cells", "was", "monitored", "microscopically", "as", "green", "fluorescence", "through", "live", "-", "cell", "imaging", "at", "72", "hours", "post", "-", "infection", "(", "hpi", ")", "and", "is", "shown", "as", "the", "mean", "of", "the", "GFP", "-", "positive", "area", "relative", "to", "the", "whole", "area", "covered", "by", "cells", "in", "the", "same", "well", ".", "In", "(", "D", ")", "NHBE", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "6", "hours", "before", "infection", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "DMSO", "control", "(", "N", "=", "5", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "five", "/", "ten", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "NHBE", "cells", "from", "five", "donors", "were", "infected", "with", "GFP", "-", "expressing", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "Infection", "of", "cells", "was", "monitored", "microscopically", "as", "green", "fluorescence", "through", "live", "-", "cell", "imaging", "at", "72", "hours", "post", "-", "infection", "(", "hpi", ")", "and", "is", "shown", "as", "the", "mean", "of", "the", "GFP", "-", "positive", "area", "relative", "to", "the", "whole", "area", "covered", "by", "cells", "in", "the", "same", "well", ".", "NHBE", "cells", "were", "were", "treated", "in", "(", "E", ")", "with", "the", "indicated", "drugs", "4", "hours", "after", "infection", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "DMSO", "control", "(", "N", "=", "5", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "five", "/", "ten", "biological", "replicates", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, RT-qPCR quantification of viral RNA (SARS-CoV-2 N gene relative to RPLP0) upon infection of A549-ACE2 cells with indicated SARS-CoV-2 strains at 24 hpi. Cells were pretreated with BB94 (10 µM) or DMSO for 6 h. Data are normalized to DMSO (N = 3-7). A two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three (A, biological replicates *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.B. RT-qPCR quantification of viral RNA (SARS-CoV-2 N gene relative to RPLP0) upon infection of A549-ACE2 cells with indicated SARS-CoV-2 strains at 24 hpi. Cells were pretreated with BB94 (10 µM), DPC-333 (10 µM) or DMSO for 6 h. Data are normalized to DMSO (N = 3-7). A two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three , B) biological replicates *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.C. Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) from ten donors were infected with SARS-CoV-2. NHBE cells were pre-treated with camostat mesylate (10µM), BB94 (1 µM or 10 µM) or DMSO for 6 hours. RNA was isolated at 24 hpi and levels of SARS-CoV-2 N relative to RPLP0 from total cellular RNA was measured by RT-qPCR. Data are normalized to the DMSO control (N = 5-10). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least five/ten biological replicates *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D, NHBE cells from five donors were infected with GFP-expressing SARS-CoV-2. Infection of cells was monitored microscopically as green fluorescence through live-cell imaging at 72 hours post-infection (hpi) and is shown as the mean of the GFP-positive area relative to the whole area covered by cells in the same well. In (D) NHBE cells were pre-treated with the indicated drugs for 6 hours before infection Data are normalized to the DMSO control (N = 5). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least five/ten biological replicates *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.E. NHBE cells from five donors were infected with GFP-expressing SARS-CoV-2. Infection of cells was monitored microscopically as green fluorescence through live-cell imaging at 72 hours post-infection (hpi) and is shown as the mean of the GFP-positive area relative to the whole area covered by cells in the same well. NHBE cells were were treated in (E) with the indicated drugs 4 hours after infection. Data are normalized to the DMSO control (N = 5). Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least five/ten biological replicates *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Western", "Blot", "(", "WB", ")", "analysis", "of", "A549", "-", "ACE2", "knock", "-", "out", "(", "KO", ")", "lines", ".", "Two", "different", "KO", "lines", "were", "generated", "using", "distinct", "CRISPR", "guide", "RNAs", "for", "both", "ADAM10", "and", "ADAM17", ".", "A", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NTC", ")", "guide", "RNA", "served", "as", "control", ".", "Shown", "are", "two", "replicates", "for", "each", "cell", "line", ".", "Mature", "(", "m", ")", "and", "immature", "(", "im", ")", "forms", "of", "ADAM10", "and", "ADAM17", "are", "indicated", ".", "ACE2", "levels", "remained", "unaffected", ".", "α", "-", "tubulin", "served", "as", "loading", "control", ".", "*", ":", "remaining", ",", "low", "amount", "of", "immature", "ADAM10", "and", "ADAM17", ".", "The", "double", "KO", "(", "dKO", ")", "was", "generated", "from", "guide", "1", "of", "each", "ADAM10", "and", "ADAM17", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "abundance", "of", "mature", "ADAM10", "and", "ADAM17", "protein", "forms", "from", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "loading", "control", "tubulin", "and", "to", "NTC", "(", "N", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "The", "band", "of", "mADAM17", "runs", "very", "close", "to", "three", "unspecific", "bands", "(", "marked", "with", "arrowheads", ")", "-", "one", "closely", "above", "and", "two", "closely", "below", "mADAM17", "(", "A", ")", ".", "Thus", ",", "quantification", "of", "remaining", "mADAM17", "in", "the", "ADAM10", "KO", "includes", "also", "these", "three", "unspecific", "bands", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ".", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "viral", "RNA", "(", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "N", "gene", "relative", "to", "RPLP0", ")", "upon", "infection", "of", "A549", "-", "ACE2", "NTC", "or", "KO", "cells", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "BB94", "(", "10", "µM", ")", "or", "DMSO", "for", "6", "h", "prior", "to", "infection", "and", "RNA", "was", "isolated", "at", "24", "hpi", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "NTC", "DMSO", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", "-", "G", ".", "UMAP", "of", "63", ",", "103", "cells", "from", "BAL", "fluid", "derived", "from", "infected", "individuals", "(", "D", ")", "Individual", "cell", "types", "are", "indicated", "in", "color", ".", "(", "E", ")", "Normalized", "counts", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "reads", ",", "ADAM10", ",", "ADAM17", ",", "and", "TMPRSS2", "gene", "expression", "levels", ".", "(", "F", ")", "Dot", "plot", "of", "ADAM10", ",", "ADAM17", ",", "and", "TMPRSS2", "expression", ",", "grouped", "by", "disease", "severity", ".", "Expression", "levels", "are", "color", "-", "coded", ",", "the", "percentage", "of", "cells", "expressing", "the", "aforementioned", "genes", "is", "size", "coded", ".", "(", "G", ")", "Cells", "that", "are", "infected", "and", "additionally", "express", "ADAM17", "(", "ADAM17", "+", ",", "red", ")", ",", "ADAM10", "(", "ADAM10", "+", ",", "blue", ")", ",", "both", "ADAMs", "(", "ADAM10", "+", "ADAM17", "+", ",", "purple", ")", ",", "or", "TMPRSS2", "(", "TMPRSS2", "+", ",", "orange", ")", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Western Blot (WB) analysis of A549-ACE2 knock-out (KO) lines. Two different KO lines were generated using distinct CRISPR guide RNAs for both ADAM10 and ADAM17. A non-targeting control (NTC) guide RNA served as control. Shown are two replicates for each cell line. Mature (m) and immature (im) forms of ADAM10 and ADAM17 are indicated. ACE2 levels remained unaffected. α-tubulin served as loading control. *: remaining, low amount of immature ADAM10 and ADAM17. The double KO (dKO) was generated from guide 1 of each ADAM10 and ADAM17. B. Quantification of the abundance of mature ADAM10 and ADAM17 protein forms from (A). Data are normalized to loading control tubulin and to NTC (N = 3-4). The band of mADAM17 runs very close to three unspecific bands (marked with arrowheads) - one closely above and two closely below mADAM17 (A). Thus, quantification of remaining mADAM17 in the ADAM10 KO includes also these three unspecific bands. Two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction. Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.C. RT-qPCR quantification of viral RNA (SARS-CoV-2 N gene relative to RPLP0) upon infection of A549-ACE2 NTC or KO cells with SARS-CoV-2. Cells were treated with BB94 (10 µM) or DMSO for 6 h prior to infection and RNA was isolated at 24 hpi. Two-way ANOVA with Tukey's post-hoc multiple comparison test. Data are normalized to NTC DMSO (N = 3). Data information: Data are represented as means ± 95% CI from at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D-G. UMAP of 63,103 cells from BAL fluid derived from infected individuals (D) Individual cell types are indicated in color. (E) Normalized counts of SARS-CoV-2 reads, ADAM10, ADAM17, and TMPRSS2 gene expression levels. (F) Dot plot of ADAM10, ADAM17, and TMPRSS2 expression, grouped by disease severity. Expression levels are color-coded, the percentage of cells expressing the aforementioned genes is size coded. (G) Cells that are infected and additionally express ADAM17 (ADAM17+, red), ADAM10 (ADAM10+, blue), both ADAMs (ADAM10+ ADAM17+, purple), or TMPRSS2 (TMPRSS2+, orange) are indicated."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Representative", "images", "of", "syncytia", "formation", "assay", ".", "Large", "syncytia", "were", "observed", "for", "NTC", "and", "ADAM17", "KO", "cells", ",", "but", "were", "strongly", "reduced", "when", "ADAM10", "was", "knocked", "-", "out", ",", "either", "alone", "or", "together", "with", "ADAM17", "or", "upon", "inhibition", "with", "BB94", "(", "10", "µM", ")", ".", "For", "both", "ADAMs", ",", "the", "cell", "lines", "obtained", "with", "gRNA", "sequence", "1", "were", "used", ".", "Images", "show", "GFP", "fluorescence", "and", "Hoechst", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "images", "from", "fluorescence", "microscopy", "(", "B", ")", ".", "Left", "plot", ":", "the", "area", "of", "the", "fused", "cells", "in", "green", "(", "GFP", ")", "was", "quantified", "and", "normalized", "to", "the", "Hoechst", "signal", "(", "blue", ")", "of", "the", "entire", "image", "to", "account", "for", "differences", "in", "cell", "density", ".", "Right", "plot", ":", "The", "nuclei", "within", "syncytia", "were", "determined", "by", "calculating", "the", "ratio", "between", "the", "Hoechst", "signal", "within", "syncytia", "and", "the", "total", "Hoechst", "signal", "in", "the", "entire", "image", ".", "The", "data", "are", "normalized", "to", "NTC", "DMSO", "(", "N", ">", "=", "8", ")", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "for", "multiple", "comparisons", ".", "All", "data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Representative images of syncytia formation assay. Large syncytia were observed for NTC and ADAM17 KO cells, but were strongly reduced when ADAM10 was knocked-out, either alone or together with ADAM17 or upon inhibition with BB94 (10 µM). For both ADAMs, the cell lines obtained with gRNA sequence 1 were used. Images show GFP fluorescence and Hoechst staining. Scale bars, 50 µm. C. Quantification of images from fluorescence microscopy (B). Left plot: the area of the fused cells in green (GFP) was quantified and normalized to the Hoechst signal (blue) of the entire image to account for differences in cell density. Right plot: The nuclei within syncytia were determined by calculating the ratio between the Hoechst signal within syncytia and the total Hoechst signal in the entire image. The data are normalized to NTC DMSO (N >= 8). Two-way ANOVA with Tukey's correction for multiple comparisons. All data are represented as means ± 95% CI of at least 3 independent experiments. **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5In", "vitro", "cleavage", "assay", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", ".", "Recombinant", "spike", "protein", "(", "1", "µg", ")", "was", "digested", "with", "ADAM10", ",", "TMPRSS2", "(", "A", ")", "for", "24", "hours", "at", "a", "1", ":", "1", "ratio", "and", "analyzed", "by", "Western", "Blot", ".", "Camostat", "mesylate", "or", "BB94", "(", "10", "µM", ")", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "TMPRSS2", "or", "ADAM", "proteases", ",", "respectively", ",", "for", "15", "min", "before", "addition", "of", "spike", "protein", ".", "The", "spike", "protein", "and", "fragments", "were", "detected", "using", "an", "antibody", "against", "its", "C", "-", "terminal", "6xHIS", "tag", ".", "B", ".", "In", "vitro", "cleavage", "assay", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", ".", "Recombinant", "spike", "protein", "(", "1", "µg", ")", "was", "digested", "with", "ADAM17", "(", "B", ")", "for", "24", "hours", "at", "a", "1", ":", "1", "ratio", "and", "analyzed", "by", "Western", "Blot", ".", "BB94", "(", "10", "µM", ")", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "ADAM", "proteases", ",", "respectively", ",", "for", "15", "min", "before", "addition", "of", "spike", "protein", ".", "The", "spike", "protein", "and", "fragments", "were", "detected", "using", "an", "antibody", "against", "its", "C", "-", "terminal", "6xHIS", "tag", ".", "C", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "a", "proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "between", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "Spike", "and", "ADAM17", "in", "A549", "-", "ACE2", "cells", ".", "Cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "and", "placed", "on", "ice", "(", "4", "°", "C", ")", ".", "After", "2", "h", ",", "cells", "were", "shifted", "to", "37", "°", "C", "for", "15", "min", "or", "left", "on", "ice", ".", "Images", "are", "presented", "as", "overlay", "between", "the", "Nuclei", "(", "Hoechst", ",", "blue", ")", "and", "the", "PLA", "(", "pseudo", "-", "color", ":", "red", ")", "channel", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "The", "number", "of", "PLA", "foci", "per", "cell", "was", "determined", "for", "the", "acquired", "images", "(", "N", "=", "28", "-", "30", ")", ".", "A", "two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ".", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "treated", "for", "48", "h", "with", "BB94", "(", "10", "µM", ")", ",", "DPC", "-", "333", "(", "5", "µM", ")", "or", "DMSO", ".", "PMA", "(", "25", "ng", "/", "ml", ")", "was", "added", "for", "3", "h", "before", "harvest", "to", "stimulate", "ACE2", "shedding", ".", "Concentration", "of", "the", "soluble", "ACE2", "fragment", "was", "determined", "in", "the", "conditioned", "medium", "by", "ELISA", "and", "is", "shown", "relative", "to", "the", "concentration", "in", "the", "DMSO", "control", "(", "N", "=", "6", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "multiple", "comparison", "test", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "GFP", "-", "encoding", "spike", "pseudoparticles", "(", "VSV", "pseudotyped", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", "(", "VSV", "-", "S", ")", "were", "incubated", "with", "indicated", "amounts", "of", "recombinant", ",", "soluble", "ACE2", "(", "sACE2", ")", "or", "bovine", "serum", "albumin", "(", "BSA", ")", "as", "a", "control", "prior", "to", "infection", "of", "A549", "-", "ACE2", "cells", ".", "At", "16", "hpi", ",", "infection", "was", "analyzed", "by", "counting", "GFP", "-", "positive", "cells", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "number", "of", "infected", "cells", "in", "virus", "-", "only", "control", "wells", "without", "sACE2", "or", "BSA", "(", "N", "=", "3", ")", ".", "Two", "-", "sided", "independent", "Student", "'", "s", "t", "test", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "FDR", "correction", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "95", "%", "CI", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In vitro cleavage assay of SARS-CoV-2 spike protein. Recombinant spike protein (1 µg) was digested with ADAM10, TMPRSS2 (A) for 24 hours at a 1:1 ratio and analyzed by Western Blot. Camostat mesylate or BB94 (10 µM) were pre-incubated with TMPRSS2 or ADAM proteases, respectively, for 15 min before addition of spike protein. The spike protein and fragments were detected using an antibody against its C-terminal 6xHIS tag.B. In vitro cleavage assay of SARS-CoV-2 spike protein. Recombinant spike protein (1 µg) was digested with ADAM17 (B) for 24 hours at a 1:1 ratio and analyzed by Western Blot. BB94 (10 µM) were pre-incubated with ADAM proteases, respectively, for 15 min before addition of spike protein. The spike protein and fragments were detected using an antibody against its C-terminal 6xHIS tag.C. Representative images and quantification of a proximity ligation assay (PLA) between the SARS-CoV-2 Spike and ADAM17 in A549-ACE2 cells. Cells were infected with SARS-CoV-2 and placed on ice (4°C). After 2 h, cells were shifted to 37°C for 15 min or left on ice. Images are presented as overlay between the Nuclei (Hoechst, blue) and the PLA (pseudo-color: red) channel. Scale bar, 20 µm. The number of PLA foci per cell was determined for the acquired images (N = 28-30). A two-sided independent Student's t-test with Benjamini-Hochberg FDR correction was performed. Data information: Data are represented as means ± 95% CI of at least 3 independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D. A549-ACE2 cells were treated for 48 h with BB94 (10 µM), DPC-333 (5 µM) or DMSO. PMA (25 ng/ml) was added for 3 h before harvest to stimulate ACE2 shedding. Concentration of the soluble ACE2 fragment was determined in the conditioned medium by ELISA and is shown relative to the concentration in the DMSO control (N = 6). One-way ANOVA with Tukey's post-hoc multiple comparison test. Data information: Data are represented as means ± 95% CI of at least 3 independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.E. GFP-encoding spike pseudoparticles (VSV pseudotyped with SARS-CoV-2 spike protein (VSV-S) were incubated with indicated amounts of recombinant, soluble ACE2 (sACE2) or bovine serum albumin (BSA) as a control prior to infection of A549-ACE2 cells. At 16 hpi, infection was analyzed by counting GFP-positive cells. Data are normalized to the number of infected cells in virus-only control wells without sACE2 or BSA (N = 3). Two-sided independent Student's t test with Benjamini-Hochberg FDR correction. Data information: Data are represented as means ± 95% CI of at least 3 independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "Expression", "of", "Ulk1", "and", "Atg5", "-", "12", "in", "the", "indicated", "erythroid", "cells", ".", "(", "b", "-", "e", ")", "Induction", "of", "conventional", "macroautophagy", "in", "WT", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", ",", "but", "not", "in", "Atg5", "−", "/", "−", ",", "embryonic", "erythroid", "cells", ".", "Ter119", "+", "erythroid", "cells", "from", "WT", ",", "Atg5", "−", "/", "−", ",", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", "embryonic", "mice", "(", "E18", ".", "5", ")", "were", "treated", "with", "1", "μM", "rapamycin", "(", "b", ",", "c", ")", "and", "1", "μM", "STS", "(", "d", ",", "e", ")", ",", "and", "then", "harvested", "at", "the", "indicated", "times", ".", "(", "b", ",", "d", ")", "Representative", "protein", "expression", "of", "LC3", "and", "p62", "measured", "by", "western", "blot", ".", "Actin", "was", "a", "loading", "control", ".", "Uncropped", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "10", ".", "(", "c", ",", "e", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "and", "p62", "protein", "expression", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P0", ".", "05", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ".", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "24", "h", "(", "ANOVA", ")", ".", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "b", "-", "e", ")", "Induction", "of", "conventional", "macroautophagy", "in", "WT", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", ",", "but", "not", "in", "Atg5", "−", "/", "−", ",", "embryonic", "erythroid", "cells", ".", "Ter119", "+", "erythroid", "cells", "from", "WT", ",", "Atg5", "−", "/", "−", ",", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", "embryonic", "mice", "(", "E18", ".", "5", ")", "were", "treated", "with", "1", " ", "μM", "rapamycin", "(", "b", ",", "c", ")", "and", "1", " ", "μM", "STS", "(", "d", ",", "e", ")", ",", "and", "then", "harvested", "at", "the", "indicated", "times", ".", "(", "b", ",", "d", ")", "Representative", "protein", "expression", "of", "LC3", "and", "p62", "measured", "by", "western", "blot", ".", "Actin", "was", "a", "loading", "control", ".", "Uncropped", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "10", ".", "(", "c", ",", "e", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "and", "p62", "protein", "expression", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "at", "P0", ".", "05", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ".", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "24", " ", "h", "(", "ANOVA", ")", ".", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) Expression of Ulk1 and Atg5-12 in the indicated erythroid cells.(b-e) Induction of conventional macroautophagy in WT and Ulk1gt/gt, but not in Atg5−/−, embryonic erythroid cells. Ter119+ erythroid cells from WT, Atg5−/−, and Ulk1gt/gt embryonic mice (E18.5) were treated with 1 μM rapamycin (b,c) and 1 μM STS (d,e), and then harvested at the indicated times. (b,d) Representative protein expression of LC3 and p62 measured by western blot. Actin was a loading control. Uncropped images are shown in Supplementary Fig. 10. (c,e) Semi-quantitative analysis of LC3-II/LC3-I and p62 protein expression (n=3, mean±s.d.). Asterisks indicate a significant difference at P0.05 (analysis of variance (ANOVA)). #P0.05 versus value of WT 24 h (ANOVA). 'NS' indicates not significant (ANOVA).(b-e) Induction of conventional macroautophagy in WT and Ulk1gt/gt, but not in Atg5−/−, embryonic erythroid cells. Ter119+ erythroid cells from WT, Atg5−/−, and Ulk1gt/gt embryonic mice (E18.5) were treated with 1 μM rapamycin (b,c) and 1 μM STS (d,e), and then harvested at the indicated times. (b,d) Representative protein expression of LC3 and p62 measured by western blot. Actin was a loading control. Uncropped images are shown in Supplementary Fig. 10. (c,e) Semi-quantitative analysis of LC3-II/LC3-I and p62 protein expression (n=3, mean±s.d.). Asterisks indicate a significant difference at P0.05 (analysis of variance (ANOVA)). #P0.05 versus value of WT 24 h (ANOVA). 'NS' indicates not significant (ANOVA)."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "Induction", "of", "alternative", "macroautophagy", "in", "WT", "and", "Atg5", "−", "/", "−", ",", "but", "not", "Ulk1gt", "/", "gt", "and", "DKO", ",", "erythroid", "cells", ".", "Erythroblasts", "and", "reticulocytes", "from", "the", "liver", "of", "embryonic", "mice", "(", "E18", ".", "5", ")", "were", "incubated", "with", "or", "without", "STS", "(", "1", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", ",", "followed", "by", "staining", "with", "anti", "-", "Lamp2", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "Ter119", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "DAPI", "-", "positive", "erythroblasts", "and", "DAPI", "-", "negative", "reticulocytes", "are", "shown", ".", "Lamp2", "image", "and", "merged", "image", "(", "DAPI", ",", "Ter119", "and", "Lamp2", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ".", "Large", "dots", "for", "Lamp2", "are", "observed", "in", "STS", "-", "treated", "WT", "and", "Atg5", "−", "/", "−", "cells", ",", "but", "not", "STS", "-", "treated", "Ulk1gt", "/", "gt", "or", "DKO", "cells", ".", "(", "b", ")", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "EC", "incubated", "with", "or", "without", "STS", ".", "Erythroid", "cells", "were", "harvested", "from", "the", "liver", "of", "embryonic", "mice", "(", "E18", ".", "5", ")", ",", "incubated", "with", "or", "without", "STS", "(", "1", "μM", ")", "for", "24", "h", ",", "and", "analysed", "by", "electron", "microscopy", "(", "EM", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "μm", ".", "Insets", "of", "WT", "and", "Atg5", "−", "/", "−", "cells", "show", "mitophagy", "(", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "μm", ")", ".", "Inset", "of", "a", "Ulk1gt", "/", "gt", "cell", "showing", "mitochondria", "that", "have", "not", "been", "engulfed", "(", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "μm", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "non", "-", "engulfed", "mitochondria", "and", "the", "arrowheads", "indicate", "engulfed", "mitochondria", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "mitophagy", "after", "STS", "treatment", ",", "calculated", "from", "EM", "photos", ".", "Population", "of", "reticulocytes", "with", "mitophagy", "(", "c", ")", ",", "number", "of", "mitochondria", "per", "reticulocytes", "(", "d", ")", "and", "population", "of", "reticulocytes", "showing", "macroautophagy", "(", "e", ")", "were", "calculated", "(", "n", ">", "35", "cells", "per", "mouse", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) Induction of alternative macroautophagy in WT and Atg5−/−, but not Ulk1gt/gt and DKO, erythroid cells. Erythroblasts and reticulocytes from the liver of embryonic mice (E18.5) were incubated with or without STS (1 μM) for 24 h, followed by staining with anti-Lamp2 (red), anti-Ter119 (green) and DAPI (blue). DAPI-positive erythroblasts and DAPI-negative reticulocytes are shown. Lamp2 image and merged image (DAPI, Ter119 and Lamp2) are shown. Scale bar, 1 μm. Large dots for Lamp2 are observed in STS-treated WT and Atg5−/− cells, but not STS-treated Ulk1gt/gt or DKO cells.(b) Representative electron micrographs of EC incubated with or without STS. Erythroid cells were harvested from the liver of embryonic mice (E18.5), incubated with or without STS (1 μM) for 24 h, and analysed by electron microscopy (EM). Scale bar, 1 μm. Insets of WT and Atg5−/− cells show mitophagy (Scale bar, 0.5 μm). Inset of a Ulk1gt/gt cell showing mitochondria that have not been engulfed (Scale bar, 0.5 μm). Arrows point to non-engulfed mitochondria and the arrowheads indicate engulfed mitochondria. (c-e) Quantitative analysis of mitophagy after STS treatment, calculated from EM photos. Population of reticulocytes with mitophagy (c), number of mitochondria per reticulocytes (d) and population of reticulocytes showing macroautophagy (e) were calculated (n>35 cells per mouse). The data are shown as mean±s.d. (n=3). *P0.05 versus value of WT (analysis of variance (ANOVA)); #P0.05 versus value of Atg5−/− (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT (ANOVA)."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Three", "-", "colour", "flow", "cytometry", "of", "erythroid", "cells", "from", "WT", "embryonic", "liver", "(", "E14", ".", "5", ")", "stained", "with", "anti", "-", "Ter119", ",", "anti", "-", "CD71", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "(", "Left", "upper", "panel", ")", "Ter119", "versus", "CD71", "fluorescence", ".", "(", "Other", "panels", ")", "FSC", "versus", "Mitotracker", "fluorescence", "of", "the", "R1", "(", "right", "upper", "panel", ")", ",", "R2", "(", "left", "lower", "panel", ")", "and", "R3", "(", "right", "lower", "panel", ")", "fractions", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Percentage", "of", "cells", "with", "a", "low", "number", "of", "mitochondria", "(", "mitochondrialow", "cells", ")", "among", "CD71", "−", "Ter119", "+", "EC", ".", "Erythroid", "cells", "from", "the", "liver", "(", "E14", ".", "5", "and", "E18", ".", "5", ")", "and", "peripheral", "blood", "(", "E18", ".", "5", ")", "of", "indicated", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Ter119", ",", "anti", "-", "CD71", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "(", "b", ")", "Representative", "histograms", "of", "mitochondrial", "content", "in", "CD71", "−", "Ter119", "+", "cells", ".", "Numbers", "indicate", "the", "population", "of", "mitochondrialow", "cells", ".", "(", "c", ")", "The", "percentage", "of", "CD71", "−", "Ter119", "+", "cells", "without", "mitochondria", "was", "determined", "by", "gating", "the", "mitochondrialow", "fraction", ",", "as", "shown", "in", "(", "b", ")", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "d", ")", "Percent", "mitochondrialow", "cells", "in", "the", "CD71", "−", "Ter119", "+", "EC", "of", "Atg7F", "/", "FCre", "embryo", ".", "Erythroid", "cells", "from", "the", "liver", "and", "peripheral", "blood", "of", "WT", "and", "Atg7F", "/", "FCre", "embryo", "(", "E18", ".", "5", ")", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Ter119", ",", "anti", "-", "CD71", ",", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "e", ")", "Percentage", "of", "mitochondrialow", "cells", "in", "Syto16low", "cells", ".", "Liver", "erythroid", "cells", "(", "E18", ".", "5", ")", "were", "stained", "with", "Syto16", "(", "DNA", ")", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "Representative", "dot", "plots", "of", "the", "mitochondrial", "content", "of", "Syto16low", "cells", "are", "demonstrated", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "5", ",", "the", "percentage", "of", "Syto16low", "cells", "without", "mitochondria", "was", "determined", "by", "gating", "the", "mitochondrialow", "fraction", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "f", ")", "Immunofluorescent", "analysis", "of", "mitochondrial", "and", "lysosomal", "proteins", ".", "Liver", "Ter119", "+", "cells", "(", "E18", ".", "5", ")", "of", "the", "indicated", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Tom20", "(", "mitochondrial", "marker", ")", "and", "anti", "-", "Lamp2", "(", "lysosomal", "marker", ")", "antibodies", ",", "and", "observed", "by", "fluorescent", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "2", " ", "μm", ".", "Green", ",", "red", ",", "white", ",", "and", "blue", "indicate", "Tom20", ",", "Lamp2", ",", "Ter119", "and", "DAPI", "(", "DNA", ")", ",", "respectively", ".", "Mitochondrial", "and", "lysosomal", "markers", "have", "separate", "distributions", "in", "Ulk1gt", "/", "gt", "cells", "and", "DKO", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Three-colour flow cytometry of erythroid cells from WT embryonic liver (E14.5) stained with anti-Ter119, anti-CD71 and Mitotracker Deep Red. (Left upper panel) Ter119 versus CD71 fluorescence. (Other panels) FSC versus Mitotracker fluorescence of the R1 (right upper panel), R2 (left lower panel) and R3 (right lower panel) fractions. (b,c) Percentage of cells with a low number of mitochondria (mitochondrialow cells) among CD71−Ter119+ EC. Erythroid cells from the liver (E14.5 and E18.5) and peripheral blood (E18.5) of indicated mice were stained with anti-Ter119, anti-CD71 and Mitotracker Deep Red.(b) Representative histograms of mitochondrial content in CD71−Ter119+ cells. Numbers indicate the population of mitochondrialow cells.(c) The percentage of CD71−Ter119+ cells without mitochondria was determined by gating the mitochondrialow fraction, as shown in (b) (mean±s.d., n=6). *P0.05 versus value of WT (analysis of variance (ANOVA)); #P0.05 versus value of Atg5−/− (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT (ANOVA).(d) Percent mitochondrialow cells in the CD71−Ter119+ EC of Atg7F/FCre embryo. Erythroid cells from the liver and peripheral blood of WT and Atg7F/FCre embryo (E18.5) were stained with anti-Ter119, anti-CD71, and Mitotracker Deep Red (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT (Student's t-test).(e) Percentage of mitochondrialow cells in Syto16low cells. Liver erythroid cells (E18.5) were stained with Syto16 (DNA) and Mitotracker Deep Red. Representative dot plots of the mitochondrial content of Syto16low cells are demonstrated in Supplementary Fig. 5, the percentage of Syto16low cells without mitochondria was determined by gating the mitochondrialow fraction (mean±s.d., n=6). *P0.05 versus value of WT (ANOVA); #P0.05 versus value of Atg5−/− (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT (ANOVA).(f) Immunofluorescent analysis of mitochondrial and lysosomal proteins. Liver Ter119+ cells (E18.5) of the indicated mice were stained with anti-Tom20 (mitochondrial marker) and anti-Lamp2 (lysosomal marker) antibodies, and observed by fluorescent microscopy. Scale bar, 2 μm. Green, red, white, and blue indicate Tom20, Lamp2, Ter119 and DAPI (DNA), respectively. Mitochondrial and lysosomal markers have separate distributions in Ulk1gt/gt cells and DKO cells."}
{"words": ["f4", "(", "a", "-", "f", ")", "Representative", "EM", "of", "WT", "(", "a", ")", ",", "ATG5", "−", "/", "−", "(", "b", ")", ",", "Ulk1gt", "/", "gt", "(", "c", ",", "d", ")", "and", "DKO", "(", "e", ",", "f", ")", "reticulocytes", "from", "embryonic", "liver", "(", "E14", ".", "5", ")", ".", "(", "a", ",", "b", ")", "Mitophagy", "was", "detected", "in", "WT", "and", "ATG5", "−", "/", "−", "cells", "(", "scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ")", ".", "Insets", "indicate", "mitophagy", "(", "scale", "bar", ",", "0", ".", "2", " ", "μm", ")", ".", "(", "c", ",", "e", ")", "In", "Ulk1gt", "/", "gt", "and", "DKO", "cells", ",", "numerous", "mitochondria", "were", "in", "contact", "with", "membrane", "structures", "(", "scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ")", ".", "Enlarged", "images", "are", "shown", "on", "the", "right", "side", "(", "scale", "bar", ",", "0", ".", "2", " ", "μm", ")", ".", "(", "d", ",", "f", ")", "Some", "Ulk1gt", "/", "gt", "and", "DKO", "cells", "showed", "plasma", "membrane", "blebs", "containing", "mitochondria", "(", "scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ")", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "mitophagy", "calculated", "from", "EM", "photos", "in", "the", "embryonic", "liver", "at", "E18", ".", "5", ".", "Population", "of", "reticulocytes", "with", "mitophagy", "(", "g", ")", ",", "and", "number", "of", "mitochondria", "per", "reticulocytes", "(", "h", ")", "were", "calculated", "(", "n", ">", "35", "cells", "per", "mouse", ")", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a-f) Representative EM of WT (a), ATG5−/− (b), Ulk1gt/gt (c,d) and DKO (e,f) reticulocytes from embryonic liver (E14.5). (a,b) Mitophagy was detected in WT and ATG5−/− cells (scale bar, 1 μm). Insets indicate mitophagy (scale bar, 0.2 μm). (c,e) In Ulk1gt/gt and DKO cells, numerous mitochondria were in contact with membrane structures (scale bar, 1 μm). Enlarged images are shown on the right side (scale bar, 0.2 μm). (d,f) Some Ulk1gt/gt and DKO cells showed plasma membrane blebs containing mitochondria (scale bar, 1 μm). (g,h) Quantitative analysis of mitophagy calculated from EM photos in the embryonic liver at E18.5. Population of reticulocytes with mitophagy (g), and number of mitochondria per reticulocytes (h) were calculated (n>35 cells per mouse). The data are shown as mean±s.d. (n=3). *P0.05 versus value of WT (analysis of variance (ANOVA)); #P0.05 versus value of Atg5−/− (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT (ANOVA)."}
{"words": ["f5", "(", "a", ")", "Erythroblasts", "(", "EB", ";", "mitochondriahigh", "Syto16high", ")", ",", "reticulocytes", "(", "RC", ";", "mitochondriahigh", "Syto16low", ")", "and", "EC", "(", "EC", ";", "Ter119", "+", "PBC", ")", "were", "collected", "from", "the", "indicated", "embryos", "(", "E18", ".", "5", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blot", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "Uncropped", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Figs", "11", "and", "12", ".", "(", "b", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "the", "expression", "level", "of", "each", "protein", "and", "the", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "EC", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "EC", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "EC", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "c", ")", "Modification", "of", "Ulk1", "and", "Atg13", "during", "erythrocyte", "maturation", ".", "Cell", "lysates", "were", "treated", "with", "λ", "-", "phosphatase", "(", "400", " ", "U", ")", "for", "45", " ", "min", "at", "30", " ", "°", "C", ",", "and", "band", "shift", "was", "examined", "by", "anti", "-", "Ulk1", "and", "anti", "-", "Atg13", "antibodies", ".", "Asterisk", "indicates", "non", "-", "specific", "band", ".", "Uncropped", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "12", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a) Erythroblasts (EB; mitochondriahigh Syto16high), reticulocytes (RC; mitochondriahigh Syto16low) and EC (EC; Ter119+ PBC) were collected from the indicated embryos (E18.5), and the expression of each protein was examined by western blot. The asterisk indicates a nonspecific band. Uncropped images are shown in Supplementary Figs 11 and 12.(b) Semi-quantitative analysis of the expression level of each protein and the LC3-II/LC3-I ratio (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT EC (analysis of variance (ANOVA)); #P0.05 versus value of Atg5−/− EC (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT EC (ANOVA).(c) Modification of Ulk1 and Atg13 during erythrocyte maturation. Cell lysates were treated with λ-phosphatase (400 U) for 45 min at 30 °C, and band shift was examined by anti-Ulk1 and anti-Atg13 antibodies. Asterisk indicates non-specific band. Uncropped images are shown in Supplementary Fig. 12."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Morphology", "of", "cultured", "erythroid", "cells", "on", "day", "0", ",", "1", "and", "3", "of", "differentiation", ".", "Erythroblasts", "were", "purified", "from", "embryonic", "liver", "(", "E14", ".", "5", ")", "and", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", "in", "erythrocyte", "differentiation", "medium", ".", "The", "cells", "were", "stained", "with", "a", "Diff", "-", "quick", "kit", ".", "(", "b", ")", "Percentage", "of", "cells", "without", "nuclei", "(", "Syto16low", "cells", ")", "on", "the", "indicated", "days", "of", "differentiation", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "Loss", "of", "nuclei", "occurred", "normally", "in", "all", "mice", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Percentage", "of", "Syto16low", "cells", "without", "mitochondria", ".", "Differentiated", "cells", "were", "stained", "with", "Syto16", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "Representative", "histograms", "of", "mitochondrial", "content", "in", "Syto16low", "cells", "on", "day", "6", "are", "shown", "in", "(", "c", ")", ".", "Numbers", "indicate", "the", "population", "of", "mitochondrialow", "cells", ".", "Representative", "dot", "plots", "are", "also", "available", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "13", ".", "(", "d", ")", "Percentage", "of", "Syto16low", "cells", "lacking", "mitochondria", "determined", "by", "gating", "the", "mitochondrialow", "fraction", "as", "shown", "in", "(", "c", ")", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ";", "#", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "ANOVA", ")", ";", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "e", "-", "h", ")", "Impact", "of", "various", "drugs", "on", "mitochondrial", "clearance", "during", "in", "vitro", "differentiation", ".", "Differentiated", "cells", "from", "WT", "embryos", "were", "incubated", "with", "or", "without", "wortmannin", "(", "e", ")", ",", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ")", "(", "f", ")", ",", "rapamycin", "(", "g", ")", "or", "compound", "C", "(", "h", ")", "at", "the", "indicated", "concentrations", "and", "time", "periods", ".", "Percentage", "of", "mitochondrialow", "cells", "/", "Syto16low", "cells", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "no", "drug", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "i", ")", "Impact", "of", "various", "drugs", "on", "mitochondrial", "clearance", "during", "in", "vitro", "differentiation", ".", "with", "cells", "from", "Atg5", "−", "/", "−", "embryos", "exposed", "to", "wortmannin", "or", "3", "-", "MA", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "no", "drug", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Morphology of cultured erythroid cells on day 0, 1 and 3 of differentiation. Erythroblasts were purified from embryonic liver (E14.5) and incubated for the indicated times in erythrocyte differentiation medium. The cells were stained with a Diff-quick kit. (b) Percentage of cells without nuclei (Syto16low cells) on the indicated days of differentiation (mean±s.d., n=6). Loss of nuclei occurred normally in all mice.(c,d) Percentage of Syto16low cells without mitochondria. Differentiated cells were stained with Syto16 and Mitotracker Deep Red. Representative histograms of mitochondrial content in Syto16low cells on day 6 are shown in (c). Numbers indicate the population of mitochondrialow cells. Representative dot plots are also available in Supplementary Fig. 13. (d) Percentage of Syto16low cells lacking mitochondria determined by gating the mitochondrialow fraction as shown in (c) (mean±s.d., n=6). *P0.05 versus value of WT (analysis of variance (ANOVA)); #P0.05 versus value of Atg5−/− (ANOVA); 'NS' indicates not significant versus value of WT (ANOVA).(e-h) Impact of various drugs on mitochondrial clearance during in vitro differentiation. Differentiated cells from WT embryos were incubated with or without wortmannin (e), 3-methyladenine (3-MA) (f), rapamycin (g) or compound C (h) at the indicated concentrations and time periods. Percentage of mitochondrialow cells/Syto16low cells was measured by flow cytometry (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of no drug (ANOVA).(i)Impact of various drugs on mitochondrial clearance during in vitro differentiation.with cells from Atg5−/− embryos exposed to wortmannin or 3-MA (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of no drug (ANOVA)."}
{"words": ["f7", "(", "a", ")", "Number", "of", "EC", "and", "haemoglobin", "content", "in", "the", "blood", "of", "the", "indicated", "mice", "(", "10", "-", "20", "weeks", "old", ";", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "b", ")", "Analysis", "of", "early", "erythrocyte", "development", ".", "Bone", "marrow", "cells", "were", "harvested", "from", "the", "indicated", "mice", "(", "10", "-", "20", "weeks", "old", ")", "and", "stained", "with", "anti", "-", "cKit", "and", "anti", "-", "Sca1", "antibodies", ".", "The", "population", "of", "each", "cell", "type", "was", "counted", "by", "FACS", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ")", ".", "(", "c", ")", "Percentage", "of", "mitochondria", "-", "containing", "Ter119", "+", "blood", "cells", ".", "Cells", "in", "peripheral", "blood", "from", "the", "indicated", "mice", "(", "10", "-", "20", "weeks", "old", ")", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Ter119", "antibody", "together", "with", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "The", "population", "of", "mitochondriahigh", "cells", "among", "Ter119", "-", "positive", "cells", "was", "counted", "by", "FACS", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "d", ")", "Percentage", "of", "mitochondria", "-", "containing", "Syto16low", "blood", "cells", ".", "Cells", "in", "peripheral", "blood", "from", "the", "indicated", "mice", "(", "10", "-", "20", "weeks", "old", ")", "were", "stained", "with", "Syto16", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", ".", "The", "population", "of", "mitochondriahigh", "cells", "among", "Syto16", "-", "negative", "cells", "was", "counted", "by", "FACS", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "e", ")", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "bone", "marrow", "reticulocytes", "in", "10", "week", "-", "old", "WT", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", "mice", "(", "scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ")", ".", "Insets", "indicate", "mitophagy", "(", "scale", "bar", ",", "0", ".", "2", " ", "μm", ")", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Erythroblasts", "(", "EB", ";", "mitochondriahigh", "Syto16high", ")", ",", "reticulocytes", "(", "RC", ";", "mitochondriahigh", "Syto16low", ")", "and", "EC", "(", "EC", ";", "Ter119", "+", "PBC", ")", "were", "collected", "from", "the", "indicated", "mice", "(", "10", "-", "20", "weeks", "old", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blot", ".", "Uncropped", "images", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "14", ".", "(", "g", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "the", "expression", "level", "of", "each", "protein", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "'", "NS", "'", "indicates", "not", "significant", "versus", "value", "of", "WT", "EC", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "The", "impact", "of", "Ulk1", "on", "mitochondrial", "clearance", "during", "stress", "erythropoiesis", ".", "(", "h", ")", "Representative", "images", "of", "erythrocyte", "in", "PHZ", "-", "treated", "WT", "and", "Ulk1gt", "/", "gt", "mice", "(", "14", "weeks", "old", ")", ".", "Blood", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Ter119", "(", "erythroid", "cell", "marker", ")", "and", "anti", "-", "Tom20", "(", "mitochondrial", "marker", ")", "antibodies", "and", "observed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Green", "and", "red", "indicate", "Ter119", "and", "Tom20", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "i", ")", "Percentage", "of", "mitochondrialow", "cells", "among", "Syto16low", "cells", ".", "Erythroid", "cells", "were", "stained", "with", "Syto16", "(", "DNA", ")", "and", "Mitotracker", "Deep", "Red", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P0", ".", "05", "versus", "value", "of", "WT", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Mitochondrial", "retention", "was", "observed", "in", "Ulk1gt", "/", "gt", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7(a) Number of EC and haemoglobin content in the blood of the indicated mice (10-20 weeks old; mean±s.d., n=6). *P0.05 versus value of WT (Student's t-test).(b) Analysis of early erythrocyte development. Bone marrow cells were harvested from the indicated mice (10-20 weeks old) and stained with anti-cKit and anti-Sca1 antibodies. The population of each cell type was counted by FACS (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT (analysis of variance (ANOVA)).(c) Percentage of mitochondria-containing Ter119+ blood cells. Cells in peripheral blood from the indicated mice (10-20 weeks old) were stained with anti-Ter119 antibody together with Mitotracker Deep Red. The population of mitochondriahigh cells among Ter119-positive cells was counted by FACS (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT (ANOVA).(d) Percentage of mitochondria-containing Syto16low blood cells. Cells in peripheral blood from the indicated mice (10-20 weeks old) were stained with Syto16 and Mitotracker Deep Red. The population of mitochondriahigh cells among Syto16-negative cells was counted by FACS (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT (ANOVA).(e) Representative electron micrographs of bone marrow reticulocytes in 10 week-old WT and Ulk1gt/gt mice (scale bar, 1 μm). Insets indicate mitophagy (scale bar, 0.2 μm).(f,g) Erythroblasts (EB; mitochondriahigh Syto16high), reticulocytes (RC; mitochondriahigh Syto16low) and EC (EC; Ter119+ PBC) were collected from the indicated mice (10-20 weeks old), and the expression of each protein was examined by western blot. Uncropped images are shown in Supplementary Fig. 14. (g) Semi-quantitative analysis of the expression level of each protein (mean±s.d., n=3). 'NS' indicates not significant versus value of WT EC (ANOVA).(h,i) The impact of Ulk1 on mitochondrial clearance during stress erythropoiesis. (h) Representative images of erythrocyte in PHZ-treated WT and Ulk1gt/gt mice (14 weeks old). Blood cells were stained with anti-Ter119 (erythroid cell marker) and anti-Tom20 (mitochondrial marker) antibodies and observed by fluorescence microscopy. Green and red indicate Ter119 and Tom20, respectively. Scale bar, 10 μm. (i) Percentage of mitochondrialow cells among Syto16low cells. Erythroid cells were stained with Syto16 (DNA) and Mitotracker Deep Red (mean±s.d., n=3). *P0.05 versus value of WT (Student's t-test). Mitochondrial retention was observed in Ulk1gt/gt mice."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "STAT3", "immunohistochemistry", "-", "staining", "of", "low", "STAT3", "and", "high", "STAT3", "PCa", "samples", ".", "Red", "arrows", "indicate", "transformed", "PCa", "glands", ",", "black", "arrows", "indicate", "pre", "-", "transformed", "normal", "prostate", "glands", ".", "Scale", "bar", "=", "100µm", ".", "#", "=", "sample", "-", "IDs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. STAT3 immunohistochemistry- staining of low STAT3 and high STAT3 PCa samples. Red arrows indicate transformed PCa glands, black arrows indicate pre-transformed normal prostate glands. Scale bar = 100µm. # = sample-IDs."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Differentially", "expressed", "proteins", "in", "PtenStat3pc", "-", "/", "-", "vs", ".", "Ptenpc", "-", "/", "-", "proteomic", "samples", ".", "Colors", "indicate", "adj", ".", "p", "-", "value", "and", "log2", "-", "FC", ".", "(", "Black", "=", "Log2", "-", "FC", "≤", "1", "&", "adj", ".", "p", "-", "value", "≥", "0", ".", "05", ",", "orange", "=", "Log2", "-", "FC", ">", "1", "&", "adj", ".", "p", "-", "value", "≥", "0", ".", "05", ",", "red", "=", "Log2", "-", "FC", ">", "1", "&", "adj", ".", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "FC", "=", "fold", "change", ".", "B", ".", "STAT3", "immunohistochemistry", "-", "staining", "of", "wild", "type", ",", "Ptenpc", "-", "/", "-", ",", "PtenStat3pc", "-", "/", "-", "mouse", "prostates", ".", "Scale", "bar", "=", "100µm", ".", "E", ".", "Metabolite", "concentrations", "in", "nmol", "/", "µg", "of", "5", "metabolites", "in", "WT", ",", "Ptenpc", "-", "/", "-", "and", "PtenStat3pc", "-", "/", "-", "prostates", ".", "Box", "-", "plot", "shows", "median", ",", "1st", "and", "3rd", "quartiles", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "±", "1", ".", "5", "interquartile", "range", ".", "Jitter", "represents", "biological", "replicates", ".", "ANOVA", "tests", "and", "Tukey", "multiple", "comparisons", "were", "applied", ".", "Red", "=", "PtenStat3pc", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "blue", "=", "Ptenpc", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "grey", "=", "wild", "type", "(", "WT", ",", "n", "=", "5", ")", ",", "q", "=", "adj", ".", "p", ".", "-", "value", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Differentially expressed proteins in PtenStat3pc-/- vs. Ptenpc-/- proteomic samples. Colors indicate adj.p-value and log2-FC. (Black = Log2-FC ≤ 1 & adj. p-value ≥ 0.05, orange = Log2-FC > 1 & adj. p-value ≥ 0.05, red = Log2-FC > 1 & adj. p-value < 0.05). FC = fold change.B. STAT3 immunohistochemistry- staining of wild type, Ptenpc-/-, PtenStat3pc-/- mouse prostates. Scale bar = 100µm.E. Metabolite concentrations in nmol/µg of 5 metabolites in WT, Ptenpc-/- and PtenStat3pc-/- prostates. Box-plot shows median, 1st and 3rd quartiles, and whiskers extend to ± 1.5 interquartile range. Jitter represents biological replicates. ANOVA tests and Tukey multiple comparisons were applied. Red = PtenStat3pc-/- (n = 3), blue = Ptenpc-/- (n = 5), grey = wild type (WT, n=5), q = adj. p.-value, n.s. = not significant."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "SDHB", "protein", "expression", "levels", "in", "a", "TMA", "(", "n", "=", "83", ")", "detected", "by", "immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", ".", "Box", "-", "plot", "shows", "median", ",", "1st", "and", "3rd", "quartiles", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "±", "1", ".", "5", "interquartile", "range", ".", "Jitter", "represents", "single", "values", "in", "groups", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunn", "'", "s", "all", "pairs", "test", "were", "applied", ".", "Q", "=", "adj", ".", "p", ".", "-", "value", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ".", "TMA", "=", "Tissue", "Micro", "Array", ".", "B", ".", "Representative", "IHC", "-", "staining", "of", "SDHB", "in", "normal", "prostate", "glands", "and", "Gleason", "grade", "(", "GL", ")", "3", "-", "5", "PCa", "glands", ".", "Scale", "bar", "=", "100µm", ".", "C", ".", "IDH2", "protein", "expression", "levels", "in", "a", "TMA", "(", "n", "=", "83", ")", "detected", "by", "IHC", ".", "Box", "-", "plot", "shows", "median", ",", "1st", "and", "3rd", "quartiles", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "±", "1", ".", "5", "interquartile", "range", ".", "Jitter", "represents", "single", "values", "in", "groups", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunn", "'", "s", "all", "pairs", "test", "were", "applied", ".", "Q", "=", "adj", ".", "p", ".", "-", "value", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ".", "D", ".", "Representative", "IHC", "staining", "of", "IDH2", "in", "normal", "prostate", "glands", "and", "GL", "3", "-", "5", "PCa", "glands", ".", "Scale", "bar", "=", "100µm", ".", "E", ".", "Nuclear", "(", "N", ")", "and", "cytoplasmatic", "(", "C", ")", "STAT3", "protein", "expression", "levels", "in", "a", "TMA", "(", "n", "=", "83", ")", "detected", "by", "IHC", ".", "Box", "-", "plot", "shows", "median", ",", "1st", "and", "3rd", "quartiles", ",", "and", "whiskers", "extend", "to", "±", "1", ".", "5", "interquartile", "range", ".", "Jitter", "represents", "single", "values", "in", "groups", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "and", "Dunn", "'", "s", "all", "pairs", "test", "were", "applied", ".", "Q", "=", "adj", ".", "p", ".", "-", "value", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. SDHB protein expression levels in a TMA (n = 83) detected by immunohistochemistry (IHC). Box-plot shows median, 1st and 3rd quartiles, and whiskers extend to ± 1.5 interquartile range. Jitter represents single values in groups. Kruskal-Wallis test and Dunn's all pairs test were applied. Q = adj. p.-value, n.s. = not significant. TMA = Tissue Micro Array.B. Representative IHC- staining of SDHB in normal prostate glands and Gleason grade (GL) 3 - 5 PCa glands. Scale bar = 100µm.C. IDH2 protein expression levels in a TMA (n = 83) detected by IHC. Box-plot shows median, 1st and 3rd quartiles, and whiskers extend to ± 1.5 interquartile range. Jitter represents single values in groups. Kruskal-Wallis test and Dunn's all pairs test were applied. Q = adj. p.-value, n.s. = not significant.D. Representative IHC staining of IDH2 in normal prostate glands and GL 3 - 5 PCa glands. Scale bar = 100µm.E. Nuclear (N) and cytoplasmatic (C) STAT3 protein expression levels in a TMA (n = 83) detected by IHC. Box-plot shows median, 1st and 3rd quartiles, and whiskers extend to ± 1.5 interquartile range. Jitter represents single values in groups. Kruskal-Wallis test and Dunn's all pairs test were applied. Q = adj. p.-value, n.s. = not significant."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Genes", "of", "the", "Hallmark", "gene", "set", "\"", "Oxidative", "phosphorylation", "\"", "that", "are", "differentially", "expressed", "in", "low", "STAT3", "vs", ".", "high", "STAT3", "tumors", ".", "Dotted", "lines", "show", "Log2", "-", "FC", "=", "±", "1", "(", "x", "-", "axis", ")", "and", "adj", ".", "p", "-", "value", "=", "-", "log10", "(", "0", ".", "05", ")", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "Orange", "=", "up", "-", "regulated", "genes", ",", "green", "=", "down", "-", "regulated", "genes", ".", "DE", "=", "differentially", "expressed", ".", "C", ".", "-", "D", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", "showing", "time", "to", "biochemical", "recurrence", "in", "months", "for", "PDK4", "in", "primary", "tumors", "(", "C", ")", "and", "in", "primary", "and", "metastatic", "tumors", "combined", "(", "D", ")", "in", "the", "MSKCC", "PCa", "GSE21032", "data", "set", ".", "Groups", "were", "generated", "by", "a", "median", "split", ".", "P", "-", "values", "were", "estimated", "by", "Log", "-", "rank", "test", "(", "C", "-", "D", ")", "and", "adjusted", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", "(", "D", ")", ".", "+", "=", "censored", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Genes of the Hallmark gene set \"Oxidative phosphorylation\" that are differentially expressed in low STAT3 vs. high STAT3 tumors. Dotted lines show Log2-FC = ±1 (x-axis) and adj. p-value = -log10(0.05) (y-axis). Orange = up-regulated genes, green = down-regulated genes. DE = differentially expressed.C.- D. Kaplan-Meier plots showing time to biochemical recurrence in months for PDK4 in primary tumors (C) and in primary and metastatic tumors combined (D) in the MSKCC PCa GSE21032 data set. Groups were generated by a median split. P-values were estimated by Log-rank test (C-D) and adjusted with Benjamini-Hochberg method (D). + = censored."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "STAT3", "and", "PDK4", "stratified", "subgroups", "were", "generated", "by", "median", "splits", "in", "MSKCC", "PCa", "GSE21032", "data", "set", ".", "Pearson", "correlation", "between", "STAT3", "and", "PDK4", "is", "shown", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "shows", "stratified", "subgroups", ".", "P", "-", "values", "were", "estimated", "by", "Log", "-", "rank", "test", "and", "adjusted", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", ".", "Hi", "=", "high", ",", "lo", "=", "low", ".", "B", ".", "Western", "blot", "of", "STAT3", ",", "PDK4", "and", "β", "-", "TUBULIN", "proteins", "in", "22Rv1", "cells", "with", "or", "without", "knockdown", "of", "STAT3", ".", "Ctrl", "=", "scrambled", "control", ",", "shSTAT3", "=", "short", "hairpin", "knockdown", "of", "STAT3", ".", "C", ".", "ChIP", "assay", "from", "IL", "-", "6", "stimulated", "or", "non", "-", "stimulated", "22Rv1", "cells", "with", "or", "without", "knockdown", "of", "STAT3", "was", "immunoprecipitated", "with", "a", "STAT3", "specific", "antibody", "(", "blue", "shades", ")", "and", "IgG", "antibody", "as", "negative", "control", "(", "orange", "shades", ")", "followed", "by", "qPCR", "with", "a", "promoter", "-", "specific", "primer", "pair", "for", "the", "PDK4", "gene", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SD", "from", "2", "technical", "replicates", ".", "Precipitated", "DNA", "is", "presented", "as", "%", "of", "input", ".", "One", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", "Result", "of", "qPCR", "using", "primer", "pair", "2", "is", "shown", ".", "Ctrl", "=", "scrambled", "control", ",", "shSTAT3", "=", "short", "hairpin", "knockdown", "of", "STAT3", ",", "+", "IL", "-", "6", "=", "IL", "-", "6", "stimulated", ".", "D", ".", "Correlation", "of", "STAT3", ",", "c", "-", "MYC", "and", "HIF", "-", "1α", "with", "PDK1", "-", "4", ",", "PDC", "-", "genes", "(", "PDHA1", ",", "PDHB", ",", "PDHX", ",", "DLAT", ",", "DLD", ")", "and", "TCA", "/", "OXPHOS", "genes", "(", "CS", ",", "IDH2", ",", "IDH3A", ",", "SDHB", ",", "SDHC", ",", "ATP5A1", ",", "NDUFS1", ")", "in", "MSKCC", "PCa", "(", "GSE21032", ")", ".", "Dot", "colors", "represent", "Pearson", "correlation", "(", "1", "=", "red", ",", "-", "1", "=", "blue", ")", ",", "dot", "sizes", "represent", "adj", ".", "p", "-", "values", "≤", "0", ".", "05", ".", "Only", "significant", "correlations", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. STAT3 and PDK4 stratified subgroups were generated by median splits in MSKCC PCa GSE21032 data set. Pearson correlation between STAT3 and PDK4 is shown. Kaplan-Meier plot shows stratified subgroups. P-values were estimated by Log-rank test and adjusted with Benjamini-Hochberg method. Hi = high, lo = low.B. Western blot of STAT3, PDK4 and β-TUBULIN proteins in 22Rv1 cells with or without knockdown of STAT3. Ctrl = scrambled control, shSTAT3 = short hairpin knockdown of STAT3.C. ChIP assay from IL-6 stimulated or non-stimulated 22Rv1 cells with or without knockdown of STAT3 was immunoprecipitated with a STAT3 specific antibody (blue shades) and IgG antibody as negative control (orange shades) followed by qPCR with a promoter- specific primer pair for the PDK4 gene. Bars represent mean ± SD from 2 technical replicates. Precipitated DNA is presented as % of input. One representative experiment is shown. Result of qPCR using primer pair 2 is shown. Ctrl = scrambled control, shSTAT3 = short hairpin knockdown of STAT3, +IL-6 = IL-6 stimulated.D. Correlation of STAT3, c-MYC and HIF-1α with PDK1-4, PDC- genes (PDHA1, PDHB, PDHX, DLAT, DLD) and TCA/OXPHOS genes (CS, IDH2, IDH3A, SDHB, SDHC, ATP5A1, NDUFS1) in MSKCC PCa (GSE21032). Dot colors represent Pearson correlation (1 = red, -1 = blue), dot sizes represent adj. p-values ≤ 0.05. Only significant correlations are shown. P-values were adjusted with Benjamini-Hochberg method."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "for", "30", "minutes", "and", "further", "cultured", "for", "various", "length", "of", "time", "as", "indicated", ".", "The", "dynamic", "of", "ENT3", "expression", "was", "determined", "by", "measuring", "Slc29a3", "transcripts", "via", "RT", "-", "qPCR", ".", "(", "B", ")", "Phagocytosis", "inhibitor", ",", "Cytochalasin", "D", "(", "CytoD", ")", ",", "pretreated", "BMDMs", "were", "incubated", "with", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "and", "subjected", "for", "Slc29a3", "expression", "analysis", "via", "RT", "-", "qPCR", "6", "hours", "post", "-", "infection", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ")", "Different", "bacterial", "components", "were", "applied", "as", "stimulants", "to", "BMDMs", ".", "Slc29a3", "expression", "was", "analyzed", "after", "30", "minutes", "of", "stimulation", "and", "a", "total", "of", "6", "hours", "incubation", ".", "(", "E", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "LPS", "for", "30", "minutes", ",", "harvested", "6", "hours", "post", "-", "stimulation", ",", "and", "subjected", "for", "RT", "-", "qPCR", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) BMDMs were treated with E. coli (MOI=100) for 30 minutes and further cultured for various length of time as indicated. The dynamic of ENT3 expression was determined by measuring Slc29a3 transcripts via RT-qPCR. (B) Phagocytosis inhibitor, Cytochalasin D (CytoD), pretreated BMDMs were incubated with E. coli (MOI=100) and subjected for Slc29a3 expression analysis via RT-qPCR 6 hours post-infection. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D) Different bacterial components were applied as stimulants to BMDMs. Slc29a3 expression was analyzed after 30 minutes of stimulation and a total of 6 hours incubation. (E) BMDMs were treated with different doses of LPS for 30 minutes, harvested 6 hours post-stimulation, and subjected for RT-qPCR analysis. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "WT", "or", "(", "D", ")", "MyD88", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "or", "live", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "TBK", "inhibitor", ",", "MRT", "67307", ",", "and", "analyzed", "for", "Slc29a3", "expression", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "The", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", "-", "treated", "BMDMs", "were", "examined", "for", "Ifnb1", "expression", "after", "30", "minutes", "of", "stimulation", "and", "a", "total", "of", "6", "hours", "incubation", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "100", "U", "/", "ml", "of", "IFN", "-", "β", "for", "various", "length", "of", "time", "and", "subjected", "for", "Slc29a3", "expression", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "shown", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) WT or (D) MyD88-/- BMDMs were stimulated with 10 ng/ml LPS or live E. coli (MOI=100) in the presence of 10 µM TBK inhibitor, MRT 67307, and analyzed for Slc29a3 expression. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(E) The 10 ng/ml LPS-treated BMDMs were examined for Ifnb1 expression after 30 minutes of stimulation and a total of 6 hours incubation. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F) BMDMs were treated with 100 U/ml of IFN-β for various length of time and subjected for Slc29a3 expression. Data information: The results shown are combined from three biological replicates (n=3), unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "-", "E", ")", "BMDMs", "from", "WT", ",", "IFNAR1", "-", "/", "-", "(", "B", ")", ",", "or", "STAT1", "-", "/", "-", "(", "C", ")", "mice", "were", "treated", "with", "10", "ng", "/", "ml", "LPS", ",", "live", "E", ".", "coli", "(", "MOI", "=", "100", ")", ",", "or", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", ",", "harvested", "and", "examined", "for", "Slc29a3", "induction", ".", "BMDMs", "from", "WT", ",", "IFNAR1", "-", "/", "-", "(", "D", ")", "or", "STAT1", "-", "/", "-", "(", "E", ")", "mice", "were", "treated", "with", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", ",", "50", "µg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ",", "or", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", ",", "harvested", "and", "examined", "for", "Slc29a3", "induction", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "in", "B", "to", "E", "are", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "The", "expression", "dynamic", "of", "Slc29a3", "was", "profiled", "in", "BMDMs", "treated", "with", "two", "different", "doses", "of", "IFN", "-", "α", "(", "F", ")", ",", "IFN", "-", "β", "(", "G", ")", ",", "IFN", "-", "γ", "(", "H", ")", "for", "various", "length", "of", "time", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "as", "1", ".", "The", "results", "shown", "in", "F", "to", "H", "from", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B-E) BMDMs from WT, IFNAR1-/- (B), or STAT1-/- (C) mice were treated with 10 ng/ml LPS, live E. coli (MOI=100), or 100 U/ml IFN-β, harvested and examined for Slc29a3 induction. BMDMs from WT, IFNAR1-/- (D) or STAT1-/- (E) mice were treated with 100 U/ml IFN-β, 50 µg/ml poly(I:C), or EMCV (MOI=10), harvested and examined for Slc29a3 induction. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown in B to E are from three biological replicates (n=3) Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F-H) The expression dynamic of Slc29a3 was profiled in BMDMs treated with two different doses of IFN-α (F), IFN-β (G), IFN-γ (H) for various length of time as indicated. Data information: The expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group as 1. The results shown in F to H from two biological replicates (n=2). Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "induction", "fold", "change", "(", "treated", "/", "untreated", ")", "of", "Slc29a3", "and", "selected", "ISG", "transcripts", "were", "curated", "from", "INTERFEROME", "database", ".", "Shown", "is", "data", "extracted", "from", "250", "IU", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "treated", "BMDMs", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Primers", "targeting", "3", "'", "flanking", "region", "2", "(", "D", ")", ",", "3", "'", "flanking", "region", "1", "(", "E", ")", ",", "and", "promoter", "region", "(", "F", ")", "were", "used", "to", "quantify", "the", "STAT1", "binding", "in", "BMDMs", "upon", "100", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "after", "4", "hour", "stimulation", "via", "qChIP", "assay", ".", "Data", "information", ":", "The", "results", "in", "D", "-", "F", "were", "generated", "from", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", "with", "four", "technical", "repeats", "each", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "One", "representative", "example", "is", "shown", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The induction fold change (treated/untreated) of Slc29a3 and selected ISG transcripts were curated from INTERFEROME database. Shown is data extracted from 250 IU/ml IFN-β treated BMDMs. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D-F) Primers targeting 3' flanking region 2 (D), 3' flanking region 1 (E), and promoter region (F) were used to quantify the STAT1 binding in BMDMs upon 100 U/ml IFN-β after 4 hour stimulation via qChIP assay. Data information: The results in D-F were generated from two biological replicates (n=2) with four technical repeats each (n=4). One representative example is shown. Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "(", "A", ")", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", "and", "harvested", "at", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "THP", "-", "1", "derived", "macrophages", "were", "challenged", "with", "EV71", "(", "MOI", "=", "5", ")", "and", "collected", "at", "different", "time", "points", ".", "(", "C", ")", "BMDMs", "were", "co", "-", "cultured", "with", "50", "µg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "with", "various", "length", "of", "time", "and", "harvested", ".", "The", "mRNA", "expression", "of", "Slc29a3", "or", "SLC29A3", "was", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "The", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "or", "RPLP0", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "at", "time", "0", "as", "1", ".", "Results", "are", "combined", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "ENT3fl", "/", "fl", "and", "Cx3cr1cre", "/", "+", "ENT3fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "12", ")", "were", "challenged", "with", "EMCV", "(", "104", "PFU", ",", "i", ".", "p", ".", ")", "and", "monitored", "for", "the", "survival", "(", "D", ")", "and", "disease", "severity", "(", "E", ")", "for", "two", "weeks", ".", "Survival", "results", "were", "analyzed", "by", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "ENT3fl", "/", "fl", "and", "Cx3cr1cre", "/", "+", "ENT3fl", "/", "fl", "mice", "were", "challenged", "with", "107", "PFU", "EMCV", "and", "measured", "the", "viral", "titer", "in", "the", "brain", "at", "post", "-", "infection", "day", "3", "by", "plaque", "assay", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Shown", "are", "representative", "plaque", "assay", "images", "(", "F", ")", "and", "the", "quantification", "(", "G", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) (A) BMDMs were infected with EMCV (MOI=10) and harvested at indicated time points. (B) THP-1 derived macrophages were challenged with EV71 (MOI=5) and collected at different time points. (C) BMDMs were co-cultured with 50 µg/ml poly (I:C) with various length of time and harvested. The mRNA expression of Slc29a3 or SLC29A3 was measured by RT-qPCR. The expression level was calculated relative to Rpl19 or RPLP0 and normalized to untreated group at time 0 as 1. Results are combined from three biological replicates (n=3) Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(D, E) ENT3fl/fl and Cx3cr1cre/+ENT3fl/fl mice (n=12) were challenged with EMCV (104 PFU, i.p.) and monitored for the survival (D) and disease severity (E) for two weeks. Survival results were analyzed by log-rank (Mantel-Cox) test, *p < 0.05. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(F, G) ENT3fl/fl and Cx3cr1cre/+ENT3fl/fl mice were challenged with 107 PFU EMCV and measured the viral titer in the brain at post-infection day 3 by plaque assay (n=6). Shown are representative plaque assay images (F) and the quantification (G). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", ",", "and", "the", "culture", "supernatants", "were", "harvested", "24", "hours", "post", "-", "infection", "to", "measure", "the", "production", "of", "IFN", "-", "α", ",", "IFN", "-", "β", ",", "and", "IFN", "-", "γ", "by", "ELISA", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "The", "mitochondrial", "respiratory", "capacity", "(", "D", ")", "and", "glycolysis", "capacity", "(", "E", ")", "of", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "treated", "with", "1000", "U", "/", "ml", "IFN", "-", "β", "for", "6", "hours", "were", "measured", "by", "extracellular", "flux", "analysis", ".", "Shown", "are", "the", "representative", "results", "of", "OCR", "and", "ECAR", "kinetics", "from", "six", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "The", "replication", "of", "EMCV", "in", "WT", "(", "G", ")", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "(", "H", ")", "were", "evaluated", "in", "the", "presence", "of", "exogenous", "1", "or", "10", "µM", "of", "ribonucleosides", "(", "A", ",", "U", ",", "C", ",", "G", ")", "9", "hours", "post", "-", "infection", "(", "MOI", "=", "10", ")", ".", "The", "expression", "of", "EMCV", "-", "2A2B", "was", "determined", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Shown", "are", "results", "from", "three", "to", "four", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "Data", "information", ":", "In", "G", ",", "H", ")", "the", "EMCV", "-", "2A2B", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "Rpl19", "and", "normalized", "to", "untreated", "group", "at", "time", "0", "as", "1", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "The", "combined", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with EMCV (MOI=10), and the culture supernatants were harvested 24 hours post-infection to measure the production of IFN-α, IFN-β, and IFN-γ by ELISA. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM.(D, E) The mitochondrial respiratory capacity (D) and glycolysis capacity (E) of WT and ENT3-/- BMDMs treated with 1000 U/ml IFN-β for 6 hours were measured by extracellular flux analysis. Shown are the representative results of OCR and ECAR kinetics from six biological replicates (n=6). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM.(G, H) The replication of EMCV in WT (G) and ENT3-/- BMDMs (H) were evaluated in the presence of exogenous 1 or 10 µM of ribonucleosides (A, U, C, G) 9 hours post-infection (MOI=10). The expression of EMCV-2A2B was determined by RT-qPCR. Shown are results from three to four biological replicates (n=3-4). Data information: In G, H) the EMCV-2A2B expression level was calculated relative to Rpl19 and normalized to untreated group at time 0 as 1. Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, ***p < 0.001. n.s. no significance. The combined data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Illustration", "of", "strategy", "to", "track", "the", "viral", "uncoating", "upon", "infection", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "(", "B", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Syto82", "-", "labeled", "EMCV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "and", "subjected", "to", "live", "imagining", "30", ",", "60", "and", "90", "minutes", "post", "-", "infection", ".", "The", "arrowheads", "indicated", "the", "Syto82", "+", "virus", "puncta", "in", "the", "cell", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "Syto82", "signal", "in", "BMDMs", "after", "60", "minutes", "was", "performed", "by", "enumerating", "Syto82", "+", "cells", "(", "%", ")", "and", "(", "D", ")", "the", "mean", "fluorescent", "intensity", "(", "MFI", ")", "per", "Syto82", "+", "cell", "(", "D", ")", ".", "Results", "were", "generated", "from", "images", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "each", "with", "4", "fields", "analyzed", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "Syto82", "-", "labeled", "EMCV", "(", "MOI", "=", "1", ")", "and", "co", "-", "stained", "with", "100", "nM", "Lysotracker", "Green", ",", "subjected", "to", "live", "imagining", "60", "minutes", "post", "-", "infection", ".", "Data", "were", "the", "representative", "images", "of", "two", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "WT", "and", "ENT3", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "infected", "with", "EMCV", "(", "MOI", "=", "10", ")", "for", "2", "hours", "and", "then", "enriched", "the", "endosomes", "and", "lysosomes", ".", "EMCV", "particles", "in", "endosome", "-", "or", "lysosome", "-", "enriched", "fractions", "were", "quantified", "by", "plaque", "assay", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "G", "-", "K", ")", "(", "G", ")", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "original", "strain", "or", "delta", "variant", "at", "MOI", "=", "0", ".", "1", "for", "48", "hours", ",", "harvested", ",", "and", "examined", "for", "SLC29A3", "induction", ".", "(", "H", ")", "ENT3", "knockdown", "in", "Calu", "-", "3", "cells", "was", "performed", "by", "lentiviral", "shRNA", "system", ".", "The", "knockdown", "efficiency", "was", "confirmed", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "ENT3", "knockdown", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "delta", "variant", "and", "subjected", "for", "the", "viral", "replication", "analysis", "24", "hours", "post", "-", "infection", ".", "The", "virus", "released", "out", "of", "cells", "was", "measured", "by", "plaque", "assay", "(", "I", ")", ",", "and", "the", "viral", "titer", "in", "the", "cells", "was", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "J", ")", ".", "(", "K", ")", "The", "replication", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "delta", "variant", "in", "scramble", "and", "ENT3", "knockdown", "Calu", "-", "3", "cells", "were", "evaluated", "in", "the", "presence", "of", "exogenous", "1", "or", "10", "µM", "of", "ribonucleosides", "(", "A", ",", "U", ",", "C", ",", "G", ")", "24", "hours", "post", "-", "infection", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", ".", "The", "SLC29A3", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "RPLP0", "and", "normalized", "to", "control", "as", "1", ".", "The", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "E", "gene", "expression", "level", "was", "calculated", "relative", "to", "RPLP0", "to", "normalize", "the", "cell", "number", ".", "Shown", "are", "combined", "results", "from", "three", "biological", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "no", "significance", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Illustration of strategy to track the viral uncoating upon infection. (B-D) (B) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with Syto82-labeled EMCV (MOI=1) and subjected to live imagining 30, 60 and 90 minutes post-infection. The arrowheads indicated the Syto82+ virus puncta in the cell. Scale bars represent 10 µm. (C) Quantification of Syto82 signal in BMDMs after 60 minutes was performed by enumerating Syto82+ cells (%) and (D) the mean fluorescent intensity (MFI) per Syto82+ cell (D). Results were generated from images of three biological replicates (n=3), each with 4 fields analyzed. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(E) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with Syto82-labeled EMCV (MOI=1) and co-stained with 100 nM Lysotracker Green, subjected to live imagining 60 minutes post-infection. Data were the representative images of two biological replicates (n=2). Scale bars represent 5 µm. (F) WT and ENT3-/- BMDMs were infected with EMCV (MOI=10) for 2 hours and then enriched the endosomes and lysosomes. EMCV particles in endosome- or lysosome-enriched fractions were quantified by plaque assay. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM.(G-K) (G) Calu-3 cells were infected with SARS-CoV-2 original strain or delta variant at MOI=0.1 for 48 hours, harvested, and examined for SLC29A3 induction. (H) ENT3 knockdown in Calu-3 cells was performed by lentiviral shRNA system. The knockdown efficiency was confirmed by RT-qPCR. ENT3 knockdown Calu-3 cells were infected with SARS-CoV-2 delta variant and subjected for the viral replication analysis 24 hours post-infection. The virus released out of cells was measured by plaque assay (I), and the viral titer in the cells was measured by RT-qPCR (J). (K) The replication of SARS-CoV-2 delta variant in scramble and ENT3 knockdown Calu-3 cells were evaluated in the presence of exogenous 1 or 10 µM of ribonucleosides (A, U, C, G) 24 hours post-infection (MOI=0.1). The SLC29A3 expression level was calculated relative to RPLP0 and normalized to control as 1. The SARS-CoV-2 E gene expression level was calculated relative to RPLP0 to normalize the cell number. Shown are combined results from three biological replicates (n=3). Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. no significance. Data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "1Western", "blotting", "showing", "the", "expression", "of", "RAP1", "and", "TRF2", "in", "MRC", "-", "5", "cells", "of", "different", "population", "doublings", "(", "PD", ")", ".", "Senescent", "cells", "(", "PD", "72", ")", "were", "left", "in", "culture", "for", "at", "least", "4", "weeks", "before", "harvesting", "for", "analysis", ".", "ChIP", "analysis", "of", "young", "(", "PD", "30", ")", "and", "senescent", "(", "PD", "72", ")", "MRC", "-", "5", "cells", "performed", "with", "either", "anti", "-", "RAP1", ",", "anti", "-", "TRF2", "or", "an", "IgG", "antibody", ".", "The", "immunoprecipitated", "and", "input", "products", "were", "loaded", "into", "a", "slot", "blot", "membrane", "and", "hybridized", "with", "a", "telomere", "probe", ",", "stripped", "and", "hybridized", "to", "an", "Alu", "probe", "in", "order", "to", "determine", "unspecific", "binding", ".", "Quantification", "was", "performed", "by", "normalizing", "the", "telomere", "signal", "of", "the", "immunoprecipitated", "to", "that", "of", "the", "input", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Immunofluorescence", "detection", "of", "53BP1", "(", "red", ")", "and", "a", "FISH", "probe", "staining", "telomeres", "(", "green", ")", "in", "young", "(", "PD", "26", ")", ",", "pre", "-", "senescent", "(", "PD", "66", ")", "and", "senescent", "(", "PD", "72", "+", "4", "weeks", ")", "MRC", "-", "5", "fibroblasts", ".", "The", "upper", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "telomere", "co", "-", "localizing", "with", "53BP1", "(", "TIFs", ")", ".", "Total", "DNA", "damage", "was", "measured", "by", "immunofluourescence", "detection", "of", "53BP1", ".", "The", "lower", "graph", "shows", "the", "total", "number", "of", "53BP1", "foci", "per", "nucleus", ".", "Approximately", "40", "-", "50", "cells", "were", "analyzed", "per", "replicate", "and", "per", "condition", ".", "Bars", "represent", "SEM", "of", "2", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Western blotting showing the expression of RAP1 and TRF2 in MRC-5 cells of different population doublings (PD). Senescent cells (PD 72) were left in culture for at least 4 weeks before harvesting for analysis.ChIP analysis of young (PD 30) and senescent (PD 72) MRC-5 cells performed with either anti-RAP1, anti-TRF2 or an IgG antibody. The immunoprecipitated and input products were loaded into a slot blot membrane and hybridized with a telomere probe, stripped and hybridized to an Alu probe in order to determine unspecific binding. Quantification was performed by normalizing the telomere signal of the immunoprecipitated to that of the input. Data represent mean +/- SD of three biological replicates.Immunofluorescence detection of 53BP1 (red) and a FISH probe staining telomeres (green) in young (PD 26), pre-senescent (PD 66) and senescent (PD 72 + 4 weeks) MRC-5 fibroblasts. The upper graph shows the percentage of telomere co-localizing with 53BP1 (TIFs). Total DNA damage was measured by immunofluourescence detection of 53BP1. The lower graph shows the total number of 53BP1 foci per nucleus. Approximately 40-50 cells were analyzed per replicate and per condition. Bars represent SEM of 2 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2Number", "of", "telomere", "fusions", "performed", "by", "PCR", "using", "3", "subtelomeric", "primers", "in", "the", "same", "reaction", "(", "16p1", ",", "21q1", "and", "XpYpM", ")", ".", "The", "primer", "16p1", "is", "able", "to", "bind", "the", "subtelomeric", "region", "of", "1p", "9q", ",", "12p", ",", "15q", ",", "16p", ",", "XqYq", "and", "the", "interstitial", "2q14", "region", ";", "the", "21q1", "primer", "binds", "the", "subtelomeric", "region", "of", "1q", ",", "2q", ",", "5q", ",", "6q", ",", "6p", ",", "8p", ",", "10q", ",", "13q", ",", "19p", ",", "19q", ",", "21q", ",", "22q", "and", "the", "interstitial", "2q13", "site", ".", "The", "PCR", "-", "fusion", "assay", "was", "performed", "in", "MRC", "-", "5", "primary", "fibroblasts", "of", "different", "population", "doublings", "(", "PD", ")", "with", "or", "without", "depletion", "of", "RAP1", "(", "shRAP1", "or", "shControl", "respectively", ")", ".", "Lentiviral", "infection", "was", "performed", "for", "10", "days", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Southern", "blotting", "showing", "the", "hybridization", "of", "the", "16p", "probe", "for", "the", "conditions", "described", "in", "A", ".", "Number", "of", "fusions", "per", "1", "µg", "of", "DNA", "is", "shown", "at", "the", "bottom", "of", "the", "gels", ".", "Number", "of", "fusions", "per", "1", "µg", "of", "DNA", "in", "MRC", "-", "5", "senescent", "cells", ".", "Lentiviral", "transfections", "with", "shRNAs", "were", "carried", "out", "for", "10", "days", "while", "transfections", "with", "siRNAs", "for", "6", "days", "(", "two", "subsequent", "transfections", "of", "3", "days", "each", ")", ".", "Representative", "southern", "blot", "membranes", "hybridized", "with", "the", "16p", "probe", "are", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Number of telomere fusions performed by PCR using 3 subtelomeric primers in the same reaction (16p1, 21q1 and XpYpM). The primer 16p1 is able to bind the subtelomeric region of 1p 9q, 12p, 15q, 16p, XqYq and the interstitial 2q14 region; the 21q1 primer binds the subtelomeric region of 1q, 2q, 5q, 6q, 6p, 8p, 10q, 13q, 19p, 19q, 21q, 22q and the interstitial 2q13 site. The PCR-fusion assay was performed in MRC-5 primary fibroblasts of different population doublings (PD) with or without depletion of RAP1 (shRAP1 or shControl respectively). Lentiviral infection was performed for 10 days. Data represent mean +/- SD of 3 biological replicates. Statistical analyses were performed using Mann-Whitney U test (**p < 0.001; ***p < 0.0001). Southern blotting showing the hybridization of the 16p probe for the conditions described in A. Number of fusions per 1 µg of DNA is shown at the bottom of the gels.Number of fusions per 1 µg of DNA in MRC-5 senescent cells. Lentiviral transfections with shRNAs were carried out for 10 days while transfections with siRNAs for 6 days (two subsequent transfections of 3 days each). Representative southern blot membranes hybridized with the 16p probe are shown. Data represent mean +/- SD of 3 biological replicates. Statistical analyses were performed using Mann-Whitney U test (*p < 0.05; **p < 0.001; ***p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "3Distribution", "of", "the", "telomere", "repeat", "array", "found", "at", "the", "junction", "between", "two", "fused", "chromosomes", "of", "senescent", "cells", "transduced", "with", "lentiviral", "vectors", "expressing", "either", "shControl", "or", "shRAP1", ".", "Variant", "telomere", "repeats", "were", "included", "in", "the", "estimation", "of", "the", "telomere", "array", "length", ".", "Data", "represent", "median", "+", "/", "-", "interquartile", "range", "(", "green", "lines", ")", "of", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Distribution of the telomere repeat array found at the junction between two fused chromosomes of senescent cells transduced with lentiviral vectors expressing either shControl or shRAP1. Variant telomere repeats were included in the estimation of the telomere array length. Data represent median +/- interquartile range (green lines) of 3 biological replicates. Statistical analysis was performed using Mann-Whitney U test ***p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "4RAP1", "expression", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "telomerase", "inhibitor", "BIBR1532", "for", "25", "days", "(", "20", "µM", "final", "concentration", ")", ".", "Fifteen", "days", "before", "cell", "harvesting", ",", "doxycycline", "(", "DOX", ";", "1", "µg", "/", "µl", "final", "concentration", ")", "was", "added", "to", "deplete", "the", "expression", "of", "RAP1", ".", "Telomere", "length", "analysis", "by", "southern", "blotting", "of", "the", "samples", "described", "in", "A", ".", "The", "size", "of", "the", "main", "intensity", "peak", "is", "indicated", "at", "the", "bottom", "of", "the", "gel", ".", "Number", "of", "fusions", "in", "HeLa", "cells", "after", "25", "days", "in", "culture", ".", "Cells", "were", "maintained", "with", "BIBR1532", "during", "the", "whole", "period", "of", "the", "experiment", ",", "while", "doxycycline", "(", "1", "µg", "/", "µl", "final", "concentration", ")", "and", "the", "infection", "with", "shControl", ",", "shLIG3", "or", "shLIG4", "was", "carried", "out", "for", "the", "last", "15", "days", "of", "the", "experiment", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "are", "shown", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Examples", "of", "metaphase", "spreads", "hybridized", "with", "a", "telomeric", "PNA", "probe", "(", "green", ")", "when", "RAP1", "was", "depleted", "(", "+", "DOX", ")", ".", "Telomerase", "was", "inhibited", "with", "BIBR1532", "for", "25", "days", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "chromosome", "aberrations", "observed", "in", "RAP1", "depleted", "cells", "(", "+", "DOX", ")", "or", "control", "(", "-", "DOX", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Approximately", "15", "metaphase", "spreads", "were", "analyzed", "per", "replicate", "with", "a", "total", "of", "2300", "chromosomes", "examined", "per", "condition", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4RAP1 expression in HeLa cells treated with the telomerase inhibitor BIBR1532 for 25 days (20 µM final concentration). Fifteen days before cell harvesting, doxycycline (DOX; 1 µg/µl final concentration) was added to deplete the expression of RAP1.Telomere length analysis by southern blotting of the samples described in A. The size of the main intensity peak is indicated at the bottom of the gel.Number of fusions in HeLa cells after 25 days in culture. Cells were maintained with BIBR1532 during the whole period of the experiment, while doxycycline (1 µg/µl final concentration) and the infection with shControl, shLIG3 or shLIG4 was carried out for the last 15 days of the experiment. Data represent mean +/- SD of three biological replicates are shown. Statistical analyses were performed using Mann-Whitney U test (*p < 0.05; **p < 0.001; ***p < 0.0001).Examples of metaphase spreads hybridized with a telomeric PNA probe (green) when RAP1 was depleted (+DOX). Telomerase was inhibited with BIBR1532 for 25 days. Scale bar = 10 µm. Quantification of chromosome aberrations observed in RAP1 depleted cells (+DOX) or control (-DOX). Data represent mean +/- SD of three biological replicates. Approximately 15 metaphase spreads were analyzed per replicate with a total of 2300 chromosomes examined per condition. *p < 0.05; two-tailed Student's t test."}
{"words": ["Figure", "5Growth", "curve", "of", "MRC", "-", "5", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "grown", "until", "senescence", "and", "after", "three", "weeks", "of", "no", "growth", "detection", ",", "lentiviral", "infections", "containing", "either", "shp21CIP1", "or", "shp21CIP1", "+", "shRAP1", "sequences", "were", "performed", ".", "Cells", "were", "harvested", "15", "days", "post", "infection", "(", "dpi", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "measured", "after", "8", "and", "15", "dpi", ".", "Expression", "of", "p21CIP1", "and", "RAP1", "after", "15", "dpi", "of", "cells", "transduced", "with", "shControl", ",", "shp21CIP1", "or", "shp21CIP1", "+", "shRAP1", ".", "Dividing", "cells", "(", "magenta", ")", "were", "identified", "by", "EdU", "staining", "(", "1", "µM", "EdU", "for", "24", "h", ")", ".", "The", "percentage", "of", "dividing", "cells", "after", "15", "dpi", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "Senescence", "-", "associated", "β", "-", "galactosidase", "(", "SA", "-", "β", "-", "gal", ")", "staining", "in", "senescent", "and", "post", "-", "senescent", "fibroblasts", "(", "1", "and", "15", "dpi", ")", "is", "shown", ".", "Percentage", "of", "SA", "-", "β", "-", "gal", "positive", "cells", "is", "indicated", "for", "each", "condition", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "performed", ",", "with", "approximately", "300", "cells", "analyzed", "per", "condition", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Senescent", "cells", ",", "transduced", "with", "shp21CIP1", "or", "shp21CIP1", "+", "shRAP1", "for", "15", "days", ",", "were", "stained", "with", "CytoCalcein", "violet", "(", "live", "cells", ")", ",", "Apopxin", "Green", "(", "apoptotic", "cells", ")", "and", "7", "-", "aminoactinomycin", "D", "(", "7", "-", "AAD", ")", "(", "late", "apoptostic", "/", "necrotic", "cells", ")", "and", "visualized", "by", "flow", "cytometry", ".", "Quantification", "of", "apoptotic", "cells", "from", "the", "conditions", "described", "in", "E", ".", "Data", "represent", "mean", "+", "/", "-", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Growth curve of MRC-5 fibroblasts. Cells were grown until senescence and after three weeks of no growth detection, lentiviral infections containing either shp21CIP1 or shp21CIP1 + shRAP1 sequences were performed. Cells were harvested 15 days post infection (dpi). Data represent mean +/- SD of three biological replicates measured after 8 and 15 dpi.Expression of p21CIP1 and RAP1 after 15 dpi of cells transduced with shControl, shp21CIP1 or shp21CIP1 + shRAP1.Dividing cells (magenta) were identified by EdU staining (1 µM EdU for 24 h). The percentage of dividing cells after 15 dpi is shown (n = 3). Scale bar = 10 µm.Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) staining in senescent and post-senescent fibroblasts (1 and 15 dpi) is shown. Percentage of SA-β-gal positive cells is indicated for each condition. Three biological replicates were performed, with approximately 300 cells analyzed per condition. Scale bar = 50 µm.Senescent cells, transduced with shp21CIP1 or shp21CIP1+shRAP1 for 15 days, were stained with CytoCalcein violet (live cells), Apopxin Green (apoptotic cells) and 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (late apoptostic/necrotic cells) and visualized by flow cytometry. Quantification of apoptotic cells from the conditions described in E. Data represent mean +/- SD of three biological replicates (**P < 0.001; two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "1ATAC", "-", "seq", "peaks", "more", "accessible", "in", "GPR56low", "(", "violet", ")", "or", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "against", "the", "background", "(", "grey", ")", "are", "enriched", "for", "enhancers", "associated", "with", "specific", "hematopoietic", "cell", "types", ".", "P", "-", "values", "and", "odds", "ratios", "are", "given", "for", "a", "pairwise", ",", "two", "-", "sided", "Fisher", "'", "s", "Exact", "test", "comparing", "each", "category", "(", "GPR56low", "/", "high", ")", "against", "the", "background", ".", "Enhancer", "annotations", "are", "taken", "from", "EnhancerAtlas", "2", ".", "0", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Knockdown", "efficiency", "of", "two", "shRNAs", "against", "GPR56", "(", "shGPR56weak", "and", "shGPR56strong", ")", "versus", "shLuc", "as", "negative", "control", "measured", "on", "protein", "level", "by", "flow", "cytometry", "in", "CD34", "+", "CB", "cells", ".", "Shown", "are", "representative", "FACS", "plots", "(", "left", ")", "and", "the", "percentage", "of", "GPR56", "+", "cells", "of", "transduced", "GFP", "+", "cells", "on", "day", "5", "(", "right", "panel", ")", ".", "Biological", "N", "=", "4", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Integrative", "Genome", "Viewer", "(", "IGV", ")", "snapshot", "showing", "ATAC", "-", "seq", "peaks", "along", "and", "upstream", "of", "the", "VWF", "gene", "in", "GPR56high", "vs", ".", "low", "samples", "(", "top", ",", "average", "peak", "size", "of", "10", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "and", "15", "GPR56low", "samples", "(", "violet", ")", ")", ",", "RNA", "-", "seq", "reads", "of", "the", "same", "location", "in", "AML", "samples", "with", "high", "(", "n", "=", "9", ")", "versus", "low", "(", "n", "=", "11", ")", "GPR56", "expression", "(", "two", "middle", "tracks", ")", ",", "and", "RNA", "-", "seq", "reads", "of", "shLuc", "versus", "GPR56", "knockdown", "CD34", "+", "cells", "(", "3", "bottom", "tracks", ",", "one", "of", "two", "replicates", "shown", "for", "each", "condition", ")", ".", "Track", "height", "was", "group", "-", "scaled", ".", "Dashed", "vertical", "lines", "indicate", "binding", "sites", "for", "the", "annotated", "TFs", ".", "TFBS", ":", "transcription", "factor", "binding", "site", "derived", "from", "the", "HOCOMOCO", "v10", "database", ";", "TSS", ":", "transcription", "start", "site", ".", "TFs", "in", "blue", "bind", "to", "differentially", "accessible", "chromatin", "regions", ".", "Volcano", "plot", "of", "differential", "transcription", "factor", "(", "TF", ")", "motif", "accessibility", "(", "activity", ")", "in", "GPR56high", "(", "turquoise", ")", "vs", "GPR56low", "(", "violet", ")", "samples", "and", "their", "corresponding", "adjusted", "p", "-", "values", "determined", "with", "diffTF", ".", "Highlighted", "are", "TFs", "whose", "RNA", "expression", "was", "also", "positively", "or", "negatively", "affected", "by", "GPR56", "KD", "in", "the", "RNA", "-", "seq", "dataset", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1ATAC-seq peaks more accessible in GPR56low (violet) or GPR56high (turquoise) against the background (grey) are enriched for enhancers associated with specific hematopoietic cell types. P-values and odds ratios are given for a pairwise, two-sided Fisher's Exact test comparing each category (GPR56low / high) against the background. Enhancer annotations are taken from EnhancerAtlas 2.0. *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05.Knockdown efficiency of two shRNAs against GPR56 (shGPR56weak and shGPR56strong) versus shLuc as negative control measured on protein level by flow cytometry in CD34+ CB cells. Shown are representative FACS plots (left) and the percentage of GPR56+ cells of transduced GFP+ cells on day 5 (right panel). Biological N=4, unpaired t-test, bars and error bars represent mean and standard deviation. *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05.Integrative Genome Viewer (IGV) snapshot showing ATAC-seq peaks along and upstream of the VWF gene in GPR56high vs. low samples (top, average peak size of 10 GPR56high (turquoise) and 15 GPR56low samples (violet)), RNA-seq reads of the same location in AML samples with high (n=9) versus low (n=11) GPR56 expression (two middle tracks), and RNA-seq reads of shLuc versus GPR56 knockdown CD34+ cells (3 bottom tracks, one of two replicates shown for each condition). Track height was group-scaled. Dashed vertical lines indicate binding sites for the annotated TFs. TFBS: transcription factor binding site derived from the HOCOMOCO v10 database; TSS: transcription start site. TFs in blue bind to differentially accessible chromatin regions.Volcano plot of differential transcription factor (TF) motif accessibility (activity) in GPR56high (turquoise) vs GPR56low (violet) samples and their corresponding adjusted p-values determined with diffTF. Highlighted are TFs whose RNA expression was also positively or negatively affected by GPR56 KD in the RNA-seq dataset."}
{"words": ["Figure", "2Violin", "plots", "showing", "geometric", "mean", "(", "horizontal", "line", ")", "and", "individual", "values", "(", "circles", ")", "of", "the", "engraftment", "levels", "of", "different", "hematopoietic", "cell", "types", "in", "the", "bone", "marrow", "of", "NSG", "mice", "20", "weeks", "after", "transplantation", "of", "CB", "CD34", "+", "cells", "following", "overnight", "-", "infection", "with", "shGPR56strong", "(", "turqouise", ")", "and", "shGPR56weak", "(", "gray", ")", "versus", "shLuc", "control", "(", "violet", ")", ".", "Shown", "are", "percentages", "of", "indicated", "populations", ",", "which", "are", "also", "co", "-", "positive", "for", "human", "CD45", "and", "GFP", ",", "relative", "to", "all", "harvested", "bone", "marrow", "cells", ".", "HSPC", ":", "CD34", "+", "SSClowCD33", "-", "CD19", "-", ",", "B", "precursor", ":", "CD34", "+", "CD19", "+", "CD33", "-", ",", "myeloid", "progenitor", "(", "myelo", ".", "prog", ".", ")", ":", "CD34", "+", "CD33", "+", "CD19", "-", ",", "mature", "B", "cells", ":", "CD19", "+", "CD34", "-", ",", "mature", "myeloid", "cells", ":", "CD33", "+", "CD19", "-", "CD34", "-", ".", "Multiple", "unpaired", "t", "-", "tests", "of", "log", "-", "transformed", "values", ",", "p", "-", "values", "were", "Benjamini", "and", "Hochberg", "corrected", "(", "padj", ")", ",", "*", "padj", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "padj", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "padj", "<", "0", ".", "0005", ".", "Adhesion", "of", "control", "and", "GPR56", "KD", "K562", "cells", "on", "fibronectin", "-", "functionalized", "substrates", ".", "Left", ":", "Overlay", "of", "phase", "contrast", "and", "microinterferometry", "images", "of", "control", "(", "above", ")", "and", "GPR56", "KD", "cells", "(", "below", ")", ".", "The", "area", "of", "tight", "adhesion", "extracted", "by", "microinterferometry", "is", "highlighted", "in", "turquoise", "and", "violet", ",", "respectively", ".", "Right", ":", "Comparison", "of", "adhesion", "areas", "extracted", "by", "microinterferometry", ",", "reduction", "of", "adhesion", "area", "by", "factor", "1", ".", "9", "in", "GPR56", "KD", "cells", "(", "p", "=", "1", ".", "0", "x", "10", "-", "10", ",", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "box", "plots", "showing", "medians", ",", "quartiles", ",", "and", "outliers", "according", "to", "the", "Tukey", "method", ")", ".", "Technical", "replicates", "Ncontrol", "=", "71", ",", "Technical", "replicates", "NKD", "=", "104", ",", "scale", "bar", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Violin plots showing geometric mean (horizontal line) and individual values (circles) of the engraftment levels of different hematopoietic cell types in the bone marrow of NSG mice 20 weeks after transplantation of CB CD34+ cells following overnight-infection with shGPR56strong (turqouise) and shGPR56weak (gray) versus shLuc control (violet). Shown are percentages of indicated populations, which are also co-positive for human CD45 and GFP, relative to all harvested bone marrow cells. HSPC: CD34+SSClowCD33-CD19-, B precursor: CD34+CD19+CD33-, myeloid progenitor (myelo. prog.): CD34+CD33+CD19-, mature B cells: CD19+CD34-, mature myeloid cells: CD33+CD19-CD34-. Multiple unpaired t-tests of log-transformed values, p-values were Benjamini and Hochberg corrected (padj), * padj<0.05, ** padj<0.005, *** padj<0.0005.Adhesion of control and GPR56 KD K562 cells on fibronectin-functionalized substrates. Left: Overlay of phase contrast and microinterferometry images of control (above) and GPR56 KD cells (below). The area of tight adhesion extracted by microinterferometry is highlighted in turquoise and violet, respectively. Right: Comparison of adhesion areas extracted by microinterferometry, reduction of adhesion area by factor 1.9 in GPR56 KD cells (p = 1.0 x 10-10, two-sided Mann-Whitney test, box plots showing medians, quartiles, and outliers according to the Tukey method). Technical replicates Ncontrol = 71, Technical replicates NKD = 104, scale bar 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "β", "-", "catenin", "protein", "expression", "in", "K562", "cells", "infected", "with", "shGPR56strong", "or", "shLuc", "negative", "control", "in", "presence", "and", "absence", "of", "Wnt3a", "(", "representative", "Western", "Blot", "(", "above", ")", "and", "quantification", "after", "normalization", "to", "GAPDH", "(", "below", ")", ".", "Shown", "is", "fold", "-", "change", "compared", "to", "shLuc", "in", "control", "media", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "standard", "deviation", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Left", ":", "Representative", "immunofluorescence", "(", "IF", ")", "images", "showing", "primary", "cilium", "formation", "in", "RPE", "cells", "upon", "starvation", "after", "infection", "with", "shLuc", "(", "above", ")", "or", "shGPR56strong", "(", "below", ")", ".", "The", "non", "-", "motile", "primary", "cilium", "is", "visualized", "using", "antibodies", "against", "γ", "-", "tubulin", ",", "which", "stains", "the", "basal", "body", ",", "and", "the", "ciliary", "membrane", "marker", "ARL13B", ".", "DAPI", "indicates", "the", "nucleus", ".", "Images", "on", "the", "right", "show", "selected", "cells", "at", "3", "x", "magnification", ".", "Brightness", "was", "increased", "in", "all", "images", "to", "enhance", "visibility", "of", "cilia", ".", "Right", ":", "Percentage", "of", "RPE", "-", "1", "cells", "with", "primary", "cilium", "in", "shLuc", "vs", ".", "shGPR56strong", "RPE", "-", "1", "cells", "at", "different", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "serum", "starvation", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", ",", "bars", "and", "error", "bars", "represent", "mean", "and", "stdev", "of", "three", "biological", "replicate", "wells", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3  β-catenin protein expression in K562 cells infected with shGPR56strong or shLuc negative control in presence and absence of Wnt3a (representative Western Blot (above) and quantification after normalization to GAPDH (below). Shown is fold-change compared to shLuc in control media, bars and error bars represent mean and standard deviation of three biological replicates, unpaired t-test).  Left: Representative immunofluorescence (IF) images showing primary cilium formation in RPE cells upon starvation after infection with shLuc (above) or shGPR56strong (below). The non-motile primary cilium is visualized using antibodies against γ-tubulin, which stains the basal body, and the ciliary membrane marker ARL13B. DAPI indicates the nucleus. Images on the right show selected cells at 3 x magnification. Brightness was increased in all images to enhance visibility of cilia. Right: Percentage of RPE-1 cells with primary cilium in shLuc vs. shGPR56strong RPE-1 cells at different time points after the start of serum starvation. Unpaired t-test, bars and error bars represent mean and stdev of three biological replicate wells. **** p<0.0001, *** p<0.0005, ** p<0.005, * p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "NimB1", ",", "NimB2", ",", "NimB3", ",", "NimB4", "and", "NimB5", "transcripts", ",", "normalized", "to", "RpL32", ",", "from", "carcass", ",", "macrophages", ",", "fat", "body", "and", "gut", "of", "wild", "type", "(", "w1118", ")", "L3", "wandering", "larvae", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "NimB4", "-", "sGFP", "macrophages", "of", "embryo", "at", "stage", "16", ";", "lateral", "(", "left", ")", "and", "ventral", "(", "right", ")", "views", ";", "Tissues", "were", "stained", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ",", "corresponding", "to", "NimB4", "-", "sGFP", ")", "and", "anti", "-", "SIMU", "antibodies", "(", "red", ",", "corresponding", "to", "macrophages", ")", ".", "The", "arrows", "show", "the", "presence", "of", "NimB4", "-", "sGFP", "inside", "the", "embryonic", "macrophages", ".", "Scale", "bars", "=", "20"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) RT-qPCR analysis of NimB1, NimB2, NimB3, NimB4 and NimB5 transcripts, normalized to RpL32, from carcass, macrophages, fat body and gut of wild type (w1118) L3 wandering larvae. Data are represented as mean ± SD from three independent experiments.(B) Representative confocal imaging of NimB4-sGFP macrophages of embryo at stage 16; lateral (left) and ventral (right) views; Tissues were stained with anti-GFP (green, corresponding to NimB4-sGFP) and anti-SIMU antibodies (red, corresponding to macrophages). The arrows show the presence of NimB4-sGFP inside the embryonic macrophages. Scale bars = 20 μm"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "CFSE", "-", "stained", "apoptotic", "bodies", "(", "green", ")", "incubated", "with", "secreted", "NimB4", "-", "RFP", "(", "B", ",", "C", ")", "or", "SPvkg", "-", "RFP", "(", "A", ")", ".", "Apoptotic", "bodies", "were", "pre", "-", "incubated", "in", "absence", "(", "A", ",", "B", ")", "or", "presence", "(", "C", ")", "of", "annexin", "V", "(", "25", "μg", "/", "mL", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "NimB4", "-", "RFP", "or", "SPvkg", "-", "RFP", "with", "the", "apoptotic", "bodies", "in", "presence", "or", "absence", "of", "Annexin", "V", ",", "as", "measured", "by", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", ".", "Values", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) Representative confocal imaging of CFSE-stained apoptotic bodies (green) incubated with secreted NimB4-RFP (B, C) or SPvkg-RFP (A). Apoptotic bodies were pre-incubated in absence (A, B) or presence (C) of annexin V (25 μg/mL). Scale bar = 10 μm. (D) Quantification of the colocalization of NimB4-RFP or SPvkg-RFP with the apoptotic bodies in presence or absence of Annexin V, as measured by Pearson's correlation coefficient. Values from at least four independent experiments are represented as mean ± SD (** P<0.01 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "wild", "type", "(", "w1118", ")", ",", "NimB4", "sk2", "and", "apoptosis", "-", "null", "NimB4", "sk2", ";", "Df", "(", "3L", ")", "H99", "embryonic", "macrophages", "at", "stage", "16", "of", "development", ";", "ventral", "and", "lateral", "view", ";", "Tissues", "were", "co", "-", "stained", "with", "Dcp", "-", "1", "(", "red", ",", "corresponding", "to", "apoptotic", "corpses", ")", "and", "anti", "-", "SIMU", "(", "green", ",", "corresponding", "to", "macrophages", ")", "antibodies", ".", "The", "arrows", "show", "the", "presence", "of", "apoptotic", "cells", "inside", "embryonic", "macrophages", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", "(", "C", ")", "Representative", "projections", "from", "confocal", "stacks", "of", "entire", "third", "instar", "wild", "type", "(", "w1118", ")", "and", "NimB4", "sk2", "larval", "brains", "stained", "with", "anti", "-", "Draper", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "Dcp1", "(", "red", ")", ".", "The", "arrows", "show", "the", "presence", "of", "apoptotic", "cells", "in", "the", "central", "area", "of", "NimB4", "sk2", "larval", "brain", ".", "Scale", "bars", "=", "100"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative confocal imaging of wild type (w1118), NimB4 sk2 and apoptosis-null NimB4 sk2; Df(3L) H99 embryonic macrophages at stage 16 of development; ventral and lateral view; Tissues were co-stained with Dcp-1 (red, corresponding to apoptotic corpses) and anti-SIMU (green, corresponding to macrophages) antibodies. The arrows show the presence of apoptotic cells inside embryonic macrophages. Scale bars = 20 μm(C) Representative projections from confocal stacks of entire third instar wild type (w1118) and NimB4 sk2 larval brains stained with anti-Draper (green) and anti-Dcp1 (red). The arrows show the presence of apoptotic cells in the central area of NimB4 sk2 larval brain. Scale bars = 100 μm"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "wild", "type", "(", "w1118", ")", ",", "NimB4", "sk2", "and", "draper", "macrophages", "incubated", "with", "fluorescently", "-", "labeled", "apoptotic", "cells", "(", "red", ",", "CellTraceTM", "Red", ")", "on", "ice", "for", "1h", "and", "stained", "with", "AlexaFluorTM", "488", "phalloidin", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "apoptotic", "cells", "(", "red", ")", "binding", "to", "the", "macrophages", "(", "green", ")", ".", "Values", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "(", "D", ")", "Ex", "vivo", "phagocytosis", "assay", "using", "Alexa555", "fluorescent", "apoptotic", "bodies", ".", "Wild", "type", ",", "NimB4sk2", ",", "NimB4", "genomic", "rescue", "(", "NimB4sk2", ",", "[", "NimB4", "]", ")", ",", "draper", "and", "NimC11", ",", "eater1", "macrophages", "from", "L3", "wandering", "were", "incubated", "with", "Alexa555", "fluorescent", "apoptotic", "bodies", "for", "30", ",", "60", "or", "120", "min", "at", "room", "temperature", ".", "Phagocytosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "(", "E", ")", "Ex", "vivo", "phagocytosis", "assay", "using", "AlexFluor488", "S", ".", "aureus", "Bioparticles", ".", "Wild", "type", ",", "NimB4sk2", "and", "NimC11", ",", "eater1", "macrophages", "from", "L3", "wandering", "were", "incubated", "with", "bioparticles", "for", "30", ",", "60", "or", "120", "min", "at", "room", "temperature", ".", "Phagocytosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative confocal imaging of wild type (w1118), NimB4 sk2 and draper macrophages incubated with fluorescently-labeled apoptotic cells (red, CellTraceTM Red) on ice for 1h and stained with AlexaFluorTM 488 phalloidin (green). Scale bar: 10 μm. (B) Quantification of the number of apoptotic cells (red) binding to the macrophages (green). Values from three independent experiments are represented as mean ± SD (*** P<0.001 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). (D) Ex vivo phagocytosis assay using Alexa555 fluorescent apoptotic bodies. Wild type, NimB4sk2, NimB4 genomic rescue (NimB4sk2, [NimB4]), draper and NimC11, eater1 macrophages from L3 wandering were incubated with Alexa555 fluorescent apoptotic bodies for 30, 60 or 120 min at room temperature. Phagocytosis was quantified by flow cytometry. Data are represented as mean ± SD from three independent experiments (* P<0.05,** P<0.01, **** P<0.0001 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests ns: not significant). (E) Ex vivo phagocytosis assay using AlexFluor488 S.aureus Bioparticles. Wild type, NimB4sk2 and NimC11, eater1 macrophages from L3 wandering were incubated with bioparticles for 30, 60 or 120 min at room temperature. Phagocytosis was quantified by flow cytometry. Data are represented as mean ± SD from three independent experiments (**** P<0.0001 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "wild", "type", "(", "w1118", ")", ",", "NimB4sk2", ",", "draper", ",", "eater1", "and", "croquemort", "△", "third", "instar", "larvae", "macrophages", "stained", "with", "LysoTracker", "Red", "(", "live", "imaging", ")", ".", "Overlay", "of", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", "(", "DIC", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Mean", "fluorescence", "intensity", "after", "staining", "with", "LysoTracker", "Red", "(", "live", "confocal", "imaging", ")", ".", "Values", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "transmission", "electron", "micrographs", "of", "macrophages", "from", "wild", "type", "(", "top", ",", "w1118", ")", "and", "NimB4sk2", "(", "bottom", ")", "L3", "wandering", "larvae", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "μm", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "vesicles", "per", "macrophages", "in", "the", "electron", "micrographs", ".", "Values", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "Rab7EYFP", "immunostaining", "in", "wild", "type", "(", "w1118", ")", "and", "NimB4", "sk2", "macrophages", ".", "Tissues", "were", "stained", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "red", ",", "Rab7", ")", ",", "counterstained", "with", "phalloidin", "(", "gray", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "enlarged", "vesicles", "are", "decorated", "with", "Rab7EYFP", "in", "the", "NimB4sk2", "macrophages", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative fluorescence microscopy images of wild type (w1118), NimB4sk2, draper, eater1 and croquemort△ third instar larvae macrophages stained with LysoTracker Red (live imaging). Overlay of fluorescence and differential interference contrast microscopy (DIC). Scale bar = 10 μm. (B) Mean fluorescence intensity after staining with LysoTracker Red (live confocal imaging). Values from at least three independent experiments are represented as mean ± SD ( ** P<0.01, **** P<0.0001 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests). (C) Representative transmission electron micrographs of macrophages from wild type (top, w1118) and NimB4sk2 (bottom) L3 wandering larvae. Scale bar: 2 μm (D) Quantification of the number of vesicles per macrophages in the electron micrographs. Values from at least three independent experiments are represented as mean ± SD (**** P<0.0001 by Mann-Whitney test). (E) Representative confocal imaging of Rab7EYFP immunostaining in wild type (w1118) and NimB4 sk2 macrophages. Tissues were stained with anti-GFP (red, Rab7), counterstained with phalloidin (gray) and DAPI (blue). The arrows indicate the enlarged vesicles are decorated with Rab7EYFP in the NimB4sk2 macrophages. Scale bar = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "imaging", "of", "localization", "of", "Lamp1", "-", "mcherry", "and", "LysoTracker", "Green", "in", "wild", "type", "(", "w1118", ")", ",", "NimB4", "sk2", "and", "draper", "△", "5", "macrophages", "(", "live", "imaging", ")", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "colocalization", "(", "w1118", ")", "or", "the", "clustering", "(", "NimB4sk2", "and", "draper", "△", "5", ")", "of", "Lamp1", "-", "mcherry", "and", "LysoTracker", "Green", "signals", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "Lamp1", "-", "mcherry", "with", "LysoTracker", "Green", ",", "as", "measured", "by", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "between", "the", "two", "signals", ".", "Values", "from", "at", "least", "five", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ")", ".", "(", "C", ")", "Ex", "vivo", "phagocytosis", "assay", "using", "apoptotic", "cells", "labelled", "with", "pHrodo", "™", "Red", ".", "Wild", "type", "(", "w1118", ")", ",", "NimB4sk2", "and", "draper", "△", "5", "macrophages", "from", "L3", "wandering", "larvae", "were", "incubated", "with", "pHrodo", "™", "Red", "apoptotic", "cells", "for", "60", "min", "at", "room", "temperature", ".", "Phagocytosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "(", "D", ")", "Ex", "vivo", "phagocytosis", "assay", "using", "pHrodoTM", "Red", "S", ".", "aureus", "BioparticlesTM", "conjugates", ".", "Wild", "type", ",", "NimB4sk2", "and", "NimC11", ",", "eater1", "Hml", "∆", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "GFP", "macrophages", "from", "L3", "wandering", "larvae", "were", "incubated", "with", "pHrodoTM", "Red", "S", ".", "aureus", "BioparticlesTM", "for", "30", ",", "60", "or", "120", "min", "at", "room", "temperature", ".", "Phagocytosis", "was", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative confocal imaging of localization of Lamp1-mcherry and LysoTracker Green in wild type (w1118), NimB4 sk2 and draper△5 macrophages (live imaging). The arrows indicate the colocalization (w1118) or the clustering (NimB4sk2 and draper△5) of Lamp1-mcherry and LysoTracker Green signals. Scale bar: 10 μm. (B) Quantification of the colocalization of Lamp1-mcherry with LysoTracker Green, as measured by Pearson's correlation coefficient between the two signals. Values from at least five independent experiments are represented as mean ± SD (* P<0.05 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests). (C) Ex vivo phagocytosis assay using apoptotic cells labelled with pHrodo™ Red. Wild type (w1118), NimB4sk2 and draper△5 macrophages from L3 wandering larvae were incubated with pHrodo™ Red apoptotic cells for 60 min at room temperature. Phagocytosis was quantified by flow cytometry. Data are represented as mean ± SD from three independent experiments (* P<0.05 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). (D) Ex vivo phagocytosis assay using pHrodoTM Red S.aureus BioparticlesTM conjugates. Wild type, NimB4sk2 and NimC11, eater1 Hml∆-Gal4>UAS-GFP macrophages from L3 wandering larvae were incubated with pHrodoTM Red S. aureus BioparticlesTM for 30, 60 or 120 min at room temperature. Phagocytosis was quantified by flow cytometry. Data are represented as mean ± SD from three independent experiments (* P<0.05by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "wild", "type", "(", "A", ")", "or", "NimB4sk2", "(", "B", ")", "macrophages", "expressing", "Rab5", "(", "middle", "panel", ")", "or", "Rab7", "(", "right", "panel", ")", "driven", "by", "Hml", "∆", "-", "Gal4", "and", "stained", "with", "the", "LysoTracker", "Red", "(", "live", "imaging", ")", ".", "Overlay", "of", "fluorescence", "and", "DIC", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "mean", "fluorescence", "intensity", "of", "LysoTracker", "in", "macrophages", "from", "larvae", "(", "confocal", "live", "imaging", ")", ".", "Values", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "tests", ".", "ns", ":", "not", "significant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Representative fluorescence microscopy images of wild type (A) or NimB4sk2 (B) macrophages expressing Rab5 (middle panel) or Rab7 (right panel) driven by Hml∆-Gal4 and stained with the LysoTracker Red (live imaging). Overlay of fluorescence and DIC. Scale bar = 10 μm. (C) Quantification of the mean fluorescence intensity of LysoTracker in macrophages from larvae (confocal live imaging). Values from at least three independent experiments are represented as mean ± SD (** P<0.01, **** P<0.0001 by ANOVA test followed by post hoc Dunnett's multiple comparison tests. ns: not significant). "}
{"words": ["Figure", "1Same", "as", "(", "E", ")", "with", "amiRhen1", "-", "14", "scions", "and", "non", "-", "transgenic", "WT", "or", "hen1", "-", "14", "rootstocks", ".", "Average", "relative", "U6", "-", "normalized", "band", "-", "intensity", "quantifications", "from", "two", "biological", "replicates", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Same as (E) with amiRhen1-14 scions and non-transgenic WT or hen1-14 rootstocks. Average relative U6-normalized band-intensity quantifications from two biological replicates are indicated."}
{"words": ["Figure", "2Phenotype", "of", "pSUC2", ":", ":", "amiRSUL", "plants", "in", "hst", "-", "1", "/", "-", "25", "/", "-", "26", "backgrounds", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "SUL", "mRNA", "levels", "in", "leaves", "with", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Error", "-", "bars", ":", "SD", ".", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "p", "-", "values", "are", "indicated", ".", "n", "=", "5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Phenotype of pSUC2::amiRSUL plants in hst-1/-25/-26 backgrounds.RT-qPCR analysis of SUL mRNA levels in leaves with the indicated genotypes. Error-bars: SD. Welch's t-test p-values are indicated. n=5."}
{"words": ["Figure", "3amiRSUL", "northern", "analysis", "in", "input", "and", "AGO1", "-", "immunoprecipitated", "(", "AGO1", "-", "IP", ")", "fractions", "isolated", "from", "leaves", "of", "pSUC2", ":", ":", "amiRSUL", "plants", "in", "the", "specified", "genotypes", ".", "No", "Ab", ":", "No", "antibody", "added", "to", "the", "HST", "input", "extract", "(", "IP", "negative", "control", ")", ".", "miR165", "/", "166", "and", "U6", "were", "probed", "as", "endogenous", "controls", ".", "AGO1", "western", "analysis", "and", "Coomassie", "blue", "(", "Coom", ".", ")", "staining", "of", "the", "western", "blot", "membrane", "are", "provided", "as", "controls", ".", "amiRSUL", "band", "-", "intensity", "quantifications", ",", "U6", "-", "normalized", "for", "input", "samples", ",", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3amiRSUL northern analysis in input and AGO1-immunoprecipitated (AGO1-IP) fractions isolated from leaves of pSUC2::amiRSUL plants in the specified genotypes. No Ab: No antibody added to the HST input extract (IP negative control). miR165/166 and U6 were probed as endogenous controls. AGO1 western analysis and Coomassie blue (Coom.) staining of the western blot membrane are provided as controls. amiRSUL band-intensity quantifications, U6-normalized for input samples, are indicated."}
{"words": ["Figure", "4amiRSUL", "northern", "analysis", ",", "in", "biological", "duplicates", ",", "in", "scions", "(", "S", ")", "and", "rootstocks", "(", "R", ")", "in", "the", "specified", "genotypes", "'", "grafting", "combinations", "(", "amiR", ":", "pSUC2", ":", ":", "amiRSUL", ")", "(", "see", "also", "Appendix", "Fig", ".", "S12B", ")", ".", "U6", ":", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Average", "relative", "U6", "-", "normalized", "band", "-", "intensity", "quantifications", "are", "indicated", "for", "each", "tissue", ".", "amiRSUL", "northern", "analysis", ",", "in", "biological", "duplicates", ",", "from", "total", "RNA", "extracted", "from", "aphids", "fed", "on", "WT", "or", "amiR", "plants", ",", "in", "the", "specified", "genetic", "backgrounds", ".", "U6", ":", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Average", "relative", "U6", "-", "normalized", "band", "-", "intensity", "quantifications", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4amiRSUL northern analysis, in biological duplicates, in scions (S) and rootstocks (R) in the specified genotypes' grafting combinations (amiR: pSUC2::amiRSUL) (see also Appendix Fig.S12B). U6: as in (A). Average relative U6-normalized band-intensity quantifications are indicated for each tissue.amiRSUL northern analysis, in biological duplicates, from total RNA extracted from aphids fed on WT or amiR plants, in the specified genetic backgrounds. U6: as in (A). Average relative U6-normalized band-intensity quantifications are indicated."}
{"words": ["Figure", "5Localization", "of", "HST", ":", "GFP", "and", ",", "as", "a", "reference", ",", "of", "tmGFP9", "expressed", "under", "the", "pSUC2", "promoter", "in", "Arabidopsis", "primary", "leaves", "(", "C", ")", "or", "roots", "(", "D", ")", ".", "CW", ":", "calcofluor", "white", "staining", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "µm", ".", "Confocal", "fluorescence", "images", "of", "the", "differentiation", "and", "division", "zones", "of", "Arabidopsis", "root", "tips", "expressing", "pSUC2", ":", ":", "HST", ":", "GFP", ",", "pSUC2", ":", ":", "GFP", "or", "pSUC2", ":", ":", "tmGFP9", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "Confocal", "fluorescence", "images", "of", "the", "differentiation", "and", "division", "zones", "of", "pSUC2", ":", ":", "GFPhst", "-", "1", "or", "pSUC2", ":", ":", "tmGFP9hst", "-", "1", "root", "tips", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Localization of HST:GFP and, as a reference, of tmGFP9 expressed under the pSUC2 promoter in Arabidopsis primary leaves (C) or roots (D). CW: calcofluor white staining. Scale bars: 20 µm.Confocal fluorescence images of the differentiation and division zones of Arabidopsis root tips expressing pSUC2::HST:GFP, pSUC2::GFP or pSUC2::tmGFP9. Scale bars: 100 µm. Confocal fluorescence images of the differentiation and division zones of pSUC2::GFPhst-1 or pSUC2::tmGFP9hst-1 root tips. Scale bars: 100 µm."}
{"words": ["Figure", "6Subcellular", "localizations", "of", "HST", ":", "GFP", "expressed", "from", "the", "UBQ10", "promoter", "(", "pUBQ", ")", "in", "Arabidopsis", "roots", "(", "i", ")", ".", "Distinct", "planes", "of", "the", "same", "root", "cells", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", "are", "shown", "(", "ii", "-", "iii", ")", ".", "PI", ":", "propidium", "iodide", "staining", ".", "Scale", "bars", ":", "50µm", "(", "i", ")", ";", "10µm", "(", "ii", "-", "iii", ")", ".", "Subcellular", "localizations", "of", "hst", "-", "3", ":", "GFP", "expressed", "from", "pUBQ", "in", "root", "cells", ".", "Distinct", "planes", "of", "the", "same", "root", "cells", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", "are", "shown", "(", "i", "-", "ii", ")", ".", "PI", ":", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Subcellular localizations of HST:GFP expressed from the UBQ10 promoter (pUBQ) in Arabidopsis roots (i). Distinct planes of the same root cells imaged by confocal microscopy are shown (ii-iii). PI: propidium iodide staining. Scale bars: 50µm (i); 10µm (ii-iii).Subcellular localizations of hst-3:GFP expressed from pUBQ in root cells. Distinct planes of the same root cells imaged by confocal microscopy are shown (i-ii). PI: as in (A). Scale bars: 10µm."}
{"words": ["Figure", "7miR395", "northern", "analysis", "in", "scions", "(", "S", ")", "and", "hyl1", "-", "2", "rootstocks", "(", "R", ")", ",", "in", "the", "indicated", "genotypes", "'", "combinations", ",", "under", "SO4", "-", "sufficient", "(", "+", "SO4", ")", "or", "SO4", "-", "starved", "(", "-", "SO4", ")", "conditions", ",", "in", "two", "biological", "replicates", "(", "rep", ".", ")", ".", "U6", "was", "probed", "as", "an", "endogenous", "control", ".", "Relative", "U6", "-", "normalized", "band", "-", "intensity", "quantifications", "are", "indicated", "for", "each", "tissue", "in", "-", "SO4", "conditions", ".", "miR160", "northern", "analysis", "in", "Meselect", "-", "separated", "leaf", "vasculature", "and", "epidermis", "in", "WT", "versus", "hst", "-", "1", "plants", ",", "in", "three", "biological", "replicates", "(", "rep", ".", ")", ".", "U6", ":", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Relative", "U6", "-", "normalized", "band", "-", "intensity", "quantifications", "are", "indicated", ".", "Basic", "fuchsin", "staining", "of", "protoxylem", "(", "unfilled", "arrowheads", ")", "and", "metaxylem", "(", "filled", "arrowheads", ")", "in", "WT", ",", "shr", "-", "2", "or", "hst", "-", "1", "roots", ".", "*", ":", "protoxylem", "gap", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7miR395 northern analysis in scions (S) and hyl1-2 rootstocks (R), in the indicated genotypes' combinations, under SO4-sufficient (+SO4) or SO4-starved (-SO4) conditions, in two biological replicates (rep.). U6 was probed as an endogenous control. Relative U6-normalized band-intensity quantifications are indicated for each tissue in -SO4 conditions.miR160 northern analysis in Meselect-separated leaf vasculature and epidermis in WT versus hst-1 plants, in three biological replicates (rep.). U6: as in (A). Relative U6-normalized band-intensity quantifications are indicated.Basic fuchsin staining of protoxylem (unfilled arrowheads) and metaxylem (filled arrowheads) in WT, shr-2 or hst-1 roots. *: protoxylem gap. Scale bars: 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Survival", "frequencies", "observed", "after", "DSB", "induction", "at", "TEL6R", "in", "WT", ",", "dnl4Δ", ",", "sir4Δ", "cells", ",", "expressing", "or", "not", "high", "levels", "of", "Sir3p", "(", "oeSir3", "and", "WT", "respectively", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Survival", "frequencies", "observed", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "Mre11", "-", "YFP", "foci", "in", "response", "to", "an", "I", "-", "SceI", "-", "induced", "DSB", "at", "LYS2", "in", "WT", "cells", ",", "expressing", "or", "not", "high", "levels", "of", "Sir3p", "(", "oeSir3", "and", "WT", "respectively", ")", ".", "Scale", "bars", "are", "2", "μm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "cells", "with", "DSB", "induced", "Mre11", "-", "YFP", "foci", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "I", "-", "SceI", "cleavage", "site", "in", "WT", ",", "sae2Δ", "and", "Sir3", "overexpressing", "(", "oeSir3", ")", "strains", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "H", ".", "Survival", "frequencies", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "locus", ",", "in", "strains", "where", "SIR3", "is", "expressed", "from", "its", "native", ",", "pADH1", "or", "pGPD", "promoters", "respectively", "and", "in", "which", "SAE2", "is", "expressed", "or", "not", "from", "a", "high", "copy", "number", "2µ", "plasmid", ".", "Fold", "increase", "in", "Sir3", "protein", "by", "pAHD1", "or", "pGPD", "is", "indicated", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Survival frequencies observed after DSB induction at TEL6R in WT, dnl4Δ, sir4Δ cells, expressing or not high levels of Sir3p (oeSir3 and WT respectively). Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. C. Survival frequencies observed after DSB induction at LYS2 in the indicated strains. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).F. Representative images of Mre11-YFP foci in response to an I-SceI-induced DSB at LYS2 in WT cells, expressing or not high levels of Sir3p (oeSir3 and WT respectively). Scale bars are 2 μm. G. Quantification of cells with DSB induced Mre11-YFP foci after DSB induction at LYS2 I-SceI cleavage site in WT, sae2Δ and Sir3 overexpressing (oeSir3) strains. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).H. Survival frequencies after DSB induction at LYS2 locus, in strains where SIR3 is expressed from its native, pADH1 or pGPD promoters respectively and in which SAE2 is expressed or not from a high copy number 2µ plasmid. Fold increase in Sir3 protein by pAHD1 or pGPD is indicated. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Representative", "images", "of", "Sir3", "-", "mCherry", "and", "Sae2", "-", "GFP", "signal", "in", "WT", "and", "SIR3", "overexpressing", "cells", ".", "Scale", "bars", "are", "2", "μm", ".", "B", ".", "Sir3", "-", "binding", "at", "TEL6R", "in", "untagged", ",", "WT", ",", "sir3Δ", "cells", "or", "in", "cells", "overexpressing", "Sir3", "(", "oeSir3", ")", ".", "Binding", "is", "probed", "by", "ChIP", "-", "qPCR", "0", ".", "2", "(", "red", "arrows", ")", "and", "1kb", "(", "blue", "arrows", ")", "from", "telomeres", "and", "at", "the", "OGG1", "control", "locus", "using", "antibodies", "against", "Sae2", "-", "GFP", ".", "The", "mean", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", "is", "shown", "and", "error", "bars", "correspond", "to", "the", "variation", "between", "replicates", "(", "SEM", ")", ".", "C", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "between", "Sir3", "and", "Sae2", "-", "GFP", "from", "cells", "overexpressing", "Sir3", ",", "analysed", "by", "Western", "blot", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Sir3", "antibodies", ".", "D", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "between", "Sir3", "and", "Sae2", "-", "GFP", "from", "WT", "cells", "using", "antibodies", "against", "Sae2", "-", "GFP", ",", "analysed", "by", "Western", "blot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Representative images of Sir3-mCherry and Sae2-GFP signal in WT and SIR3 overexpressing cells. Scale bars are 2 μm.B. Sir3-binding at TEL6R in untagged, WT, sir3Δ cells or in cells overexpressing Sir3 (oeSir3). Binding is probed by ChIP-qPCR 0.2 (red arrows) and 1kb (blue arrows) from telomeres and at the OGG1 control locus using antibodies against Sae2-GFP. The mean of three independent biological replicates is shown and error bars correspond to the variation between replicates (SEM).C. Co-immunoprecipitation between Sir3 and Sae2-GFP from cells overexpressing Sir3, analysed by Western blot with anti-GFP and anti-Sir3 antibodies. D. Co-immunoprecipitation between Sir3 and Sae2-GFP from WT cells using antibodies against Sae2-GFP, analysed by Western blot."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Yeast", "two", "-", "hybrid", "interaction", "analysis", "between", "Sae2C", "and", "Sir3SaID", "domains", "in", "WT", "or", "sir4Δ", "cells", ".", "Growth", "on", "-", "His", "+", "3AT", "and", "blue", "coloration", "on", "X", "-", "gal", "indicate", "an", "interaction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Yeast two-hybrid interaction analysis between Sae2C and Sir3SaID domains in WT or sir4Δ cells. Growth on -His + 3AT and blue coloration on X-gal indicate an interaction."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Representative", "images", "of", "two", "hybrid", "assays", "in", "the", "yKD1991", "strain", "testing", "the", "interaction", "of", "the", "WT", "or", "the", "mutant", "SIR3SaID", "fragment", "isolated", "from", "the", "screen", "with", "SAE2C", "or", "SIR4C", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "two", "hybrid", "assays", "testing", "the", "interaction", "of", "the", "WT", "or", "the", "mutant", "SIR3SaIDT557I", "fragment", "with", "SAE2C", "or", "SIR4C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Representative images of two hybrid assays in the yKD1991 strain testing the interaction of the WT or the mutant SIR3SaID fragment isolated from the screen with SAE2C or SIR4C. C. Representative images of two hybrid assays testing the interaction of the WT or the mutant SIR3SaIDT557I fragment with SAE2C or SIR4C."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Survival", "frequencies", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "locus", "in", "WT", "or", "sae2Δ", "strains", "where", "the", "Sir3SaID", "or", "Sir3SaIDT557I", "domains", "are", "overexpressed", "from", "a", "GPD", "promoter", "at", "the", "SIR3", "locus", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "Sae2", "-", "GFP", "in", "WT", "cells", "and", "in", "cells", "overexpressing", "either", "full", "-", "length", "Sir3", "or", "the", "sir3SaID", "domain", ".", "Scale", "bars", "are", "2", "μm", ".", "F", ".", "Representative", "silver", "-", "stained", "gels", "of", "in", "vitro", "GST", "-", "pulldown", "of", "GST", "or", "GST", "-", "Sir3SaID", ",", "GST", "-", "sir3", "-", "T557ISaID", "and", "Sae2C", "purified", "peptides", ".", "Control", ":", "Sae2C", "(", "300", "ng", ",", "lane", "6", ")", ".", "G", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "between", "Sae2", "-", "GFP", "and", "Sir3", "from", "untagged", ",", "Sae2", "-", "GFP", "WT", "cells", ",", "and", "Sae2", "-", "GFP", "cells", "overexpressing", "WT", "Sir3", "(", "oeSir3", ",", "WT", ")", ",", "Sae2", "-", "GFP", "sir3Δ", "or", "Sae2", "-", "GFP", "overexpressing", "the", "sir3", "-", "T557I", "mutant", "(", "oeSir3", ",", "T557I", ")", "using", "antibodies", "against", "Sae2", "-", "GFP", ",", "analysed", "by", "Western", "blot", "with", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "Sir3", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Survival frequencies after DSB induction at LYS2 locus in WT or sae2Δ strains where the Sir3SaID or Sir3SaIDT557I domains are overexpressed from a GPD promoter at the SIR3 locus. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).B. Representative images of Sae2-GFP in WT cells and in cells overexpressing either full-length Sir3 or the sir3SaID domain. Scale bars are 2 μm.F. Representative silver-stained gels of in vitro GST-pulldown of GST or GST-Sir3SaID, GST-sir3-T557ISaID and Sae2C purified peptides. Control: Sae2C (300 ng, lane 6).G. Co-immunoprecipitation between Sae2-GFP and Sir3 from untagged, Sae2-GFP WT cells, and Sae2-GFP cells overexpressing WT Sir3 (oeSir3, WT), Sae2-GFP sir3Δ or Sae2-GFP overexpressing the sir3-T557I mutant (oeSir3, T557I) using antibodies against Sae2-GFP, analysed by Western blot with anti-GFP and anti-Sir3 antibodies."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Survival", "frequencies", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "locus", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "C", ".", "Survival", "frequencies", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "locus", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Insertion", "of", "the", "strong", "TEF1p", "promoter", "upstream", "of", "the", "SIR4", "ORF", "leads", "to", "Sir4", "overexpression", ".", "Insertion", "of", "the", "ADH1p", "promoter", "upstream", "of", "SIR3", "leads", "to", "mild", "Sir3", "overexpression", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "E", ".", "Representative", "images", "of", "two", "hybrid", "assays", "testing", "the", "interaction", "between", "the", "full", "-", "length", "Sir3", "and", "full", "-", "length", "Sae2", "proteins", "in", "WT", "cells", "expressing", "or", "not", "high", "levels", "of", "Sir4", "(", "oeSir4", "and", "WT", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Survival frequencies after DSB induction at LYS2 locus in the indicated strains. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).C. Survival frequencies after DSB induction at LYS2 locus in the indicated strains. Insertion of the strong TEF1p promoter upstream of the SIR4 ORF leads to Sir4 overexpression. Insertion of the ADH1p promoter upstream of SIR3 leads to mild Sir3 overexpression. Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).E. Representative images of two hybrid assays testing the interaction between the full-length Sir3 and full-length Sae2 proteins in WT cells expressing or not high levels of Sir4 (oeSir4 and WT respectively)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Relative", "fold", "enrichment", "of", "Sae2", "at", "0", ".", "2", "kb", "from", "I", "-", "SceI", "site", "was", "evaluated", "by", "qPCR", "after", "ChIP", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "the", "variation", "between", "at", "least", "three", "biological", "replicas", "(", "SEM", ")", ".", "B", ".", "Relative", "fold", "enrichment", "of", "Sae2", "at", "0", ".", "2", "kb", "from", "TEL6R", "after", "DSB", "induction", "at", "the", "LYS2", "I", "-", "SceI", "site", "was", "evaluated", "by", "qPCR", "after", "ChIP", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "the", "variation", "between", "at", "least", "three", "biological", "replicas", "(", "SEM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "D", ".", "Survival", "frequencies", "after", "DSB", "induction", "at", "LYS2", "locus", "in", "sae2", "-", "E267E", "mutant", "cells", "overexpressing", "or", "not", "full", "-", "length", "Sir3", "(", "oeSir3", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "survival", "standard", "error", "(", "SEM", ")", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "Significance", "was", "determined", "using", "2", "-", "tailed", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "05", ",", "significant", ";", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "001", "to", "0", ".", "01", ",", "very", "significant", ";", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "0", ".", "0001", "to", "0", ".", "001", ",", "extremely", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "extremely", "significant", ";", "P", "≥", "0", ".", "05", ",", "not", "significant", "(", "ns", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Relative fold enrichment of Sae2 at 0.2 kb from I-SceI site was evaluated by qPCR after ChIP with anti-GFP antibodies. The error bars indicate the variation between at least three biological replicas (SEM). B. Relative fold enrichment of Sae2 at 0.2 kb from TEL6R after DSB induction at the LYS2 I-SceI site was evaluated by qPCR after ChIP with anti-GFP antibodies. The error bars indicate the variation between at least three biological replicas (SEM). Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns).D. Survival frequencies after DSB induction at LYS2 locus in sae2-E267E mutant cells overexpressing or not full-length Sir3 (oeSir3). Error bars indicate survival standard error (SEM) of at least three independent experiments. Data information: Significance was determined using 2-tailed, unpaired Student's t test. *P-value 0.01 to 0.05, significant; **P-value 0.001 to 0.01, very significant; ***P-value 0.0001 to 0.001, extremely significant; ****P < 0.0001, extremely significant; P ≥ 0.05, not significant (ns)."}
{"words": ["Figure", "1Schematic", ",", "western", "blot", ",", "and", "immunofluorescence", "analysis", "of", "the", "3", "×", "FLAG", "-", "UBXD8", "knockin", "U2OS", "cell", "line", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Data", "information", ":", "In", "C", ",", "mitochondria", "were", "visualized", "by", "anti", "-", "Tom20", "immunostaining", ";", "ER", "was", "labeled", "by", "anti", "-", "PDI", "immunostaining", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Schematic, western blot, and immunofluorescence analysis of the 3×FLAG-UBXD8 knockin U2OS cell line. Scale bar, 5 μm. Data information: In C, mitochondria were visualized by anti-Tom20 immunostaining; ER was labeled by anti-PDI immunostaining."}
{"words": ["Figure", "2Blue", "native", "gel", "analysis", "of", "UBXD8", "in", "mitochondrial", "fractions", "purified", "from", "WT", "and", "∆", "UBXD8", "HeLa", "cells", ".", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "UBXD8", "interaction", "with", "mitochondrial", "(", "MARCH5", "and", "MUL1", ")", "and", "ER", "(", "RNF185", ")", "ubiquitin", "E3", "ligases", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "lentivirus", "to", "stably", "express", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", "E3", "ligases", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "prepared", "for", "anti", "-", "HA", "immunoprecipitation", ".", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "UBXD8", "interaction", "with", "MARCH5", "and", "RNF185", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "3", "×", "FLAG", "-", "UBXD8", "knockin", "HEK293T", "cells", "were", "prepared", "for", "anti", "-", "FLAG", "immunoprecipitation", ".", "MARCH5", "and", "RNF185", ":", "short", "exposure", "for", "whole", "cell", "lysate", "blots", ",", "long", "exposure", "for", "FLAG", "-", "IP", "blots", ".", "Fractionation", "analysis", "of", "UBXD8", "'", "s", "effect", "on", "VCP", "recruitment", "to", "mitochondria", "and", "the", "ER", ".", "Whole", "cell", "lysate", ",", "mitochondria", ",", "and", "ER", "fractions", "were", "purified", "from", "WT", ",", "∆", "UBXD8", ",", "and", "∆", "UBXD8", "HeLa", "cells", "rescued", "with", "UBXD8", "or", "the", "UBX", "*", "mutant", ".", "UBX", "*", "-", "UBXD8", "carries", "four", "point", "mutations", "(", "K367A", ",", "F407A", ",", "P408G", ",", "R409A", ")", "in", "the", "UBX", "domain", "to", "disrupt", "the", "UBXD8", "-", "VCP", "interaction", ".", "For", "each", "sample", ",", "5", "μg", "proteins", "were", "loaded", "for", "western", "blot", "analysis", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "VCP", "levels", "in", "the", "mitochondria", "and", "ER", "fractions", "from", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", ".", "Statistics", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", ";", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Blue native gel analysis of UBXD8 in mitochondrial fractions purified from WT and ∆UBXD8 HeLa cells.Immunoprecipitation analysis of UBXD8 interaction with mitochondrial (MARCH5 and MUL1) and ER (RNF185) ubiquitin E3 ligases. HeLa cells were infected with lentivirus to stably express HA-tagged ubiquitin E3 ligases. Whole cell lysates were prepared for anti-HA immunoprecipitation.Immunoprecipitation analysis of UBXD8 interaction with MARCH5 and RNF185. Whole cell lysates from 3×FLAG-UBXD8 knockin HEK293T cells were prepared for anti-FLAG immunoprecipitation. MARCH5 and RNF185: short exposure for whole cell lysate blots, long exposure for FLAG-IP blots.Fractionation analysis of UBXD8's effect on VCP recruitment to mitochondria and the ER. Whole cell lysate, mitochondria, and ER fractions were purified from WT, ∆UBXD8, and ∆UBXD8 HeLa cells rescued with UBXD8 or the UBX* mutant. UBX*-UBXD8 carries four point mutations (K367A, F407A, P408G, R409A) in the UBX domain to disrupt the UBXD8-VCP interaction. For each sample, 5 μg proteins were loaded for western blot analysis.Quantitative analysis of VCP levels in the mitochondria and ER fractions from the indicated HeLa cells. Data are shown as mean ± SE from three biological repeats. Statistics: one-way ANOVA; **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "Western", "blot", "(", "A", ")", "and", "quantitative", "(", "B", ")", "analyses", "of", "MiD49", "and", "Mcl1", "degradation", "in", "WT", "and", "∆", "MARCH5", "HeLa", "cells", ".", "Cycloheximide", "(", "CHX", ":", "200", "μg", "/", "ml", ";", "protein", "synthesis", "inhibitor", ")", ";", "MG132", ":", "20", "μM", ",", "proteasome", "inhibitor", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "(", "B", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "B", ",", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "C", ",", "D", ".", "Western", "blot", "(", "C", ")", "and", "quantitative", "(", "D", ")", "analyses", "of", "Mcl1", "degradation", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "D", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "D", ",", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "E", ",", "F", ".", "Western", "blot", "(", "E", ")", "and", "quantitative", "(", "F", ")", "analyses", "of", "MiD49", "degradation", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "F", ")", ".", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "F", ")", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. Western blot (A) and quantitative (B) analyses of MiD49 and Mcl1 degradation in WT and ∆MARCH5 HeLa cells. Cycloheximide (CHX: 200 μg/ml; protein synthesis inhibitor); MG132: 20 μM, proteasome inhibitor. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats (B, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test (B, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s., not significant.C, D. Western blot (C) and quantitative (D) analyses of Mcl1 degradation in the indicated HeLa cells. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats D, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test D, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s., not significant.E, F. Western blot (E) and quantitative (F) analyses of MiD49 degradation in the indicated HeLa cells. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats F). Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test F); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "4Fractionation", "analysis", "of", "the", "subcellular", "localization", "of", "mito", "-", "UBXD8", "and", "ER", "-", "UBXD8", ".", "Whole", "cell", "lysate", ",", "mitochondria", ",", "and", "ER", "fractions", "were", "purified", "from", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Exogenously", "-", "expressed", "mito", "-", "UBXD8", "has", "similar", "expression", "level", "with", "endogenous", "UBXD8", "in", "WT", "cells", ";", "exogenously", "-", "expressed", "WT", "UBXD8", "and", "ER", "-", "UBXD8", "have", "similar", "expression", "levels", ".", "D", ",", "E", ".", "Western", "blot", "(", "D", ")", "and", "quantitative", "(", "E", ")", "analyses", "of", "Mcl1", "degradation", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "∆", "UBXD8", "HeLa", "cells", "were", "rescued", "with", "vector", ",", "WT", "-", ",", "mito", "-", ",", "and", "ER", "-", "UBXD8", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "(", "E", ")", ".", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "E", ")", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Fractionation analysis of the subcellular localization of mito-UBXD8 and ER-UBXD8. Whole cell lysate, mitochondria, and ER fractions were purified from the indicated HeLa cells. Exogenously-expressed mito-UBXD8 has similar expression level with endogenous UBXD8 in WT cells; exogenously-expressed WT UBXD8 and ER-UBXD8 have similar expression levels.D, E. Western blot (D) and quantitative (E) analyses of Mcl1 degradation in the indicated HeLa cells. ∆UBXD8 HeLa cells were rescued with vector, WT-, mito-, and ER-UBXD8. Data are shown as mean ± SE from three biological repeats (E). Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test (E); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5Cell", "survival", "analysis", "of", "the", "indicated", "HeLa", "cells", "treated", "with", "Actinomycin", "D", "(", "ActD", ",", "1", "μM", ")", "or", "Doxorubicin", "(", "Doxo", ",", "10", "μM", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "Cell", "Titer", "-", "Glo", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "D", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "D", ",", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "apoptosis", "activation", "(", "caspase", "cleavage", "and", "PARP", "cleavage", ")", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", "treated", "similarly", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Cell", "survival", "analysis", "of", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "7", "×", "105", "cells", "in", "one", "well", "of", "6", "-", "well", "plate", "were", "treated", "with", "ActD", "(", "200", "nM", ")", "for", "4", "hours", "or", "Doxo", "(", "50", "nM", ")", "for", "2", "hours", "and", "subsequently", "cultured", "in", "normal", "medium", "for", "21", "days", ".", "Surviving", "colonies", "were", "stained", "by", "0", ".", "1", "%", "(", "W", "/", "V", ")", "methylene", "blue", ".", "Representative", "images", "and", "quantifications", "of", "the", "surviving", "colony", "numbers", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "G", ")", ".", "Statistics", ":", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "G", ")", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cell survival analysis of the indicated HeLa cells treated with Actinomycin D (ActD, 1 μM) or Doxorubicin (Doxo, 10 μM). Representative images are shown. Cell viability was measured by Cell Titer-Glo. Scale bar, 50 μm. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats D, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test D, ; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.Western blot analysis of apoptosis activation (caspase cleavage and PARP cleavage) in the indicated HeLa cells treated similarly as in (D).Cell survival analysis of the indicated HeLa cells. 7 × 105 cells in one well of 6-well plate were treated with ActD (200 nM) for 4 hours or Doxo (50 nM) for 2 hours and subsequently cultured in normal medium for 21 days. Surviving colonies were stained by 0.1% (W/V) methylene blue. Representative images and quantifications of the surviving colony numbers are shown. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats G). Statistics: one-way ANOVA (G); *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6Western", "blot", "analysis", "of", "BH3", "-", "domain", "containing", "proteins", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", "treated", "with", "Doxo", "(", "10", "μM", ")", ".", "Three", "proteins", "with", "enhanced", "level", "in", "∆", "UBXD8", "cells", "(", "Noxa", ",", "Bik", ",", "and", "Bnip3", ")", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "Western", "blot", "and", "quantitative", "analysis", "of", "Noxa", "degradation", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "(", "B", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "B", ",", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "and", "quantitative", "analysis", "of", "Bik", "and", "Bnip3", "degradation", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "C", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "C", ",", ";", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "Western", "blot", "(", "D", ",", "analysis", "of", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Western", "blot", "F", ")", "analysis", "of", "the", "indicated", "HeLa", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Western blot analysis of BH3-domain containing proteins in the indicated HeLa cells treated with Doxo (10 μM). Three proteins with enhanced level in ∆UBXD8 cells (Noxa, Bik, and Bnip3) are highlighted in red.Western blot and quantitative analysis of Noxa degradation in the indicated HeLa cells. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats (B, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test (B, ; *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.001.Western blot and quantitative analysis of Bik and Bnip3 degradation in the indicated HeLa cells. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats C, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test C, ; *P < 0.05, **P < 0.001, ***P < 0.001.Western blot (D, analysis of the indicated HeLa cells.Western blot F) analysis of the indicated HeLa cells."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "images", "of", "the", "mitophagy", "events", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "mtKeima", "emission", "excited", "by", "405", "nm", "laser", "is", "shown", "as", "green", ";", "mtKeima", "emission", "excited", "by", "561", "nm", "laser", "is", "shown", "as", "red", ".", "Mitolysosomes", "are", "pointed", "by", "white", "arrows", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "C", "-", "F", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "mitophagy", "events", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "Only", "cells", "with", "mitophagy", "were", "selected", "to", "quantify", "mitolysosome", "numbers", "(", "D", ",", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "(", "C", "-", "F", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "C", "-", "F", ",", ";", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", ".", "I", "-", "K", ",", "Representative", "images", "(", "I", ")", "and", "quantitative", "analysis", "of", "mitophagy", "events", "(", "J", ",", "K", ")", "in", "the", "indicated", "HeLa", "cells", ".", "White", "arrows", "point", "to", "mitolysosomes", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", " ", "SE", "from", "three", "biological", "repeats", "J", ",", "K", ",", "Statistics", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "J", ",", "K", ")", ";", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative images of the mitophagy events in the indicated HeLa cells. mtKeima emission excited by 405 nm laser is shown as green; mtKeima emission excited by 561 nm laser is shown as red. Mitolysosomes are pointed by white arrows. Scale bar, 5 μm.C-F. Quantitative analysis of mitophagy events in the indicated HeLa cells. Only cells with mitophagy were selected to quantify mitolysosome numbers (D, F). Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats (C-F, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test (C-F, ; **P < 0.01, ***P < 0.001.I-K, Representative images (I) and quantitative analysis of mitophagy events (J, K) in the indicated HeLa cells. White arrows point to mitolysosomes. Scale bar, 5 μm. Data information: Data are shown as mean ± SE from three biological repeats J, K, Statistics: two-tailed unpaired Student's t-test J, K); **P < 0.01, ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Scatter", "plot", "of", "the", "relative", "timing", "of", "cell", "constriction", "versus", "the", "relative", "timing", "of", "nucleoid", "separation", ".", "The", "gray", "scale", "indicates", "the", "density", "of", "dots", "in", "a", "given", "area", "of", "the", "chart", ".", "The", "dotted", "contours", "represent", "the", "0", ".", "5", ",", "0", ".", "75", "and", "0", ".", "95", "probability", "contours", "of", "the", "240", "WT", "replicates", ".", "The", "Pearson", "correlation", "is", "ρ", "=", "0", ".", "65", ",", "with", "a", "95", "%", "CI", "=", "[", "0", ".", "63", ",", "0", ".", "66", "]", ".", "The", "black", "dotted", "diagonal", "represents", "the", "line", "where", "a", "strain", "should", "be", "if", "both", "nucleoid", "separation", "and", "cell", "constriction", "happens", "at", "the", "same", "time", ".", "Red", "dots", "highlight", "strainsC", ".", "Average", "dynamics", "of", "nucleoid", "separation", "and", "cell", "constriction", "for", "WT", "and", "the", "ΔmatP", "mutant", "strain", ".", "The", "cumulative", "distributions", "of", "the", "fraction", "of", "cells", "with", "two", "nucleoids", "(", "blue", ")", "and", "of", "the", "fraction", "of", "cells", "with", "a", "constriction", "degree", "above", "0", ".", "15", "(", "red", ")", "were", "plotted", "against", "cell", "age", ".", "Cell", "age", "was", "calculated", "according", "to", "the", "rank", "of", "each", "cell", "based", "on", "their", "cell", "length", "with", "the", "formula", "$", "\\", "text", "{", "age", "}", "_", "{", "i", "}", "\\", "left", "(", "F", "\\", "right", ")", "=", "\\", "-", "\\", "frac", "{", "ln", "(", "1", "-", "\\", "frac", "{", "F", "}", "{", "2", "}", ")", "}", "{", "ln", "(", "2", ")", "}", "$", ",", "where", "F", "represents", "the", "fraction", "of", "cells", "with", "a", "cell", "length", "equal", "or", "below", "the", "length", "of", "cell", "i", "(", "Wold", "et", "al", ",", "1994", ")", ".", "D", ".", "Same", "plots", "as", "in", "C", "for", "three", "strains", "clustering", "in", "island", "8", "with", "the", "ΔmatP", "strain", ".", "The", "WT", "curves", "shown", "in", "C", "were", "plotted", "in", "gray", "for", "comparison", ".", "E", ".", "Same", "plots", "as", "in", "C", "for", "two", "island", "-", "8", "strains", ",", "ΔycjV", "and", "ΔhslU", ",", "and", "the", "ΔhslV", "strain", ",", "which", "does", "not", "partition", "in", "island", "8", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Scatter plot of the relative timing of cell constriction versus the relative timing of nucleoid separation. The gray scale indicates the density of dots in a given area of the chart. The dotted contours represent the 0.5, 0.75 and 0.95 probability contours of the 240 WT replicates. The Pearson correlation is ρ = 0.65, with a 95% CI = [0.63, 0.66]. The black dotted diagonal represents the line where a strain should be if both nucleoid separation and cell constriction happens at the same time. Red dots highlight strainsC. Average dynamics of nucleoid separation and cell constriction for WT and the ΔmatP mutant strain. The cumulative distributions of the fraction of cells with two nucleoids (blue) and of the fraction of cells with a constriction degree above 0.15 (red) were plotted against cell age. Cell age was calculated according to the rank of each cell based on their cell length with the formula $\\text{age}_{i}\\left( F \\right) = \\ - \\frac{ln(1 - \\frac{F}{2})}{ln(2)}$, where F represents the fraction of cells with a cell length equal or below the length of cell i (Wold et al, 1994). D. Same plots as in C for three strains clustering in island 8 with the ΔmatP strain. The WT curves shown in C were plotted in gray for comparison. E. Same plots as in C for two island-8 strains, ΔycjV and ΔhslU, and the ΔhslV strain, which does not partition in island 8. "}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "The", "cumulative", "distribution", "of", "the", "proportion", "of", "constricting", "cells", "for", "the", "ftsA", "*", "mutant", "and", "its", "parent", "were", "plotted", "against", "cell", "age", ".", "We", "measured", "the", "degree", "of", "constriction", "of", "all", "cells", "using", "Oufti", ".", "For", "each", "strain", ",", "we", "had", "two", "independently", "acquired", "image", "sets", "(", "n", "=", "496", "and", "1", ",", "168", "cells", "for", "the", "WT", "replicates", "and", "n", "=", "692", "and", "1", ",", "506", "cells", "for", "the", "ftsA", "*", "replicates", ")", ".", "The", "distributions", "of", "the", "degree", "of", "constriction", "were", "not", "significantly", "different", "among", "the", "four", "datasets", "at", "a", "threshold", "p", "-", "value", "of", "0", ".", "01", "using", "a", "Kruskal", "-", "Wallis", "multi", "-", "comparison", "test", ".", "Moreover", ",", "Bonferroni", "-", "corrected", "post", "-", "hoc", "pairwise", "tests", "did", "not", "allow", "a", "distinction", "between", "WT", "and", "ftsA", "*", "samples", ".", "C", ".", "Scatter", "plot", "of", "the", "CV", "of", "the", "cell", "length", "for", "the", "whole", "population", "versus", "the", "CV", "of", "the", "cell", "length", "for", "constricting", "cells", "only", ".", "The", "contour", "lines", "represent", "the", "0", ".", "5", ",", "075", "and", "0", ".", "95", "probability", "envelopes", "of", "the", "240", "independent", "WT", "replicates", ".", "The", "gray", "color", "levels", "indicate", "the", "density", "of", "points", "in", "the", "vicinity", "of", "each", "strain", ".", "The", "∆", "mraZ", "strain", "discussed", "in", "the", "text", "is", "highlighted", "in", "red", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. The cumulative distribution of the proportion of constricting cells for the ftsA* mutant and its parent were plotted against cell age. We measured the degree of constriction of all cells using Oufti. For each strain, we had two independently acquired image sets (n = 496 and 1,168 cells for the WT replicates and n = 692 and 1,506 cells for the ftsA* replicates). The distributions of the degree of constriction were not significantly different among the four datasets at a threshold p-value of 0.01 using a Kruskal-Wallis multi-comparison test. Moreover, Bonferroni-corrected post-hoc pairwise tests did not allow a distinction between WT and ftsA* samples.C. Scatter plot of the CV of the cell length for the whole population versus the CV of the cell length for constricting cells only. The contour lines represent the 0.5, 075 and 0.95 probability envelopes of the 240 independent WT replicates. The gray color levels indicate the density of points in the vicinity of each strain. The ∆mraZ strain discussed in the text is highlighted in red."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "of", "AXL", "and", "OPCML", "protein", "levels", "in", "AXL", "-", "expressing", ",", "OPCML", "-", "null", "SKOV3", "and", "PEA1", "cell", "lines", "transduced", "with", "OPCML", "\"", "O", "\"", "or", "control", "Empty", "vector", "\"", "E", "\"", "(", "B", ")", "Mammalian", "2", "-", "Hybrid", "assay", "between", "OPCML", "and", "AXL", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "M", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SEM", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "C", ")", "Western", "blotting", "of", "the", "OPCML", "-", "GST", "pull", "down", ".", "Input", ":", "1", "/", "20", "of", "SKOV3", "-", "Empty", "whole", "cell", "lysate", "(", "D", ")", "Western", "blotting", "of", "the", "anti", "-", "AXL", "immunoprecipitation", ".", "Input", ":", "1", "/", "100", "of", "SKOV3", "-", "OPCML", "whole", "cell", "lysate", ".", "IP", ":", "Immunoprecipitated", "protein", ",", "IB", ":", "Immunoblotted", "protein", "(", "E", ")", "Immunostaining", "of", "OPCML", "(", "red", ")", "and", "AXL", "(", "green", ")", "in", "SKOV3", "-", "OPCML", "and", "PEA1", "-", "OPCML", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", "Data", "i", "M", ",", "(", "E", ")", "was", "performed", "once", "due", "to", "the", "limited", "numbers", "of", "primary", "cells", ";", "(", "G", ")", "FRET", "efficiency", "for", "AXL", "-", "OPCML", "interaction", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", ",", "using", "AXL", "-", "AXL", "FRET", "as", "a", "positive", "control", ".", "Cells", "were", "labeled", "with", "Anti", "-", "Axl", "rabbit", "(", "conjugated", "to", "donor", "probe", ")", "and", "Anti", "-", "OPCML", "mouse", "(", "conjugated", "to", "acceptor", "probe", ")", ",", "or", "Anti", "-", "Axl", "mouse", "(", "conjugated", "to", "acceptor", "probe", ")", "and", "Anti", "-", "Axl", "rabbit", "(", "conjugated", "to", "donor", "probe", ")", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "M", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SE", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "H", ")", "PLA", "of", "AXL", "-", "OPCML", "(", "red", ")", "in", "SKOV3", "and", "PEA1", "cells", "transduced", "with", "empty", "vector", "\"", "E", "\"", "or", "OPCML", "\"", "O", "\"", ".", "Scale", "bar", "=", "50μmPrimary", "ovarian", "tumour", "cells", "were", "characterised", "for", "AXL", "and", "OPCML", "levels", "by", "(", "I", ")", "Western", "blottin", "PAX8", "was", "used", "to", "identify", "ovarian", "cancer", "cellsPrimary", "ovarian", "tumour", "cells", "were", "characterised", "for", "AXL", "and", "OPCML", "levels", "b", "(", "J", ")", "Immunostaining", ".", "PAX8", "was", "used", "to", "identify", "ovarian", "cancer", "cells", "(", "K", ")", "Quantitation", "of", "AXL", "-", "OPCML", "PLA", "in", "primary", "cells", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "M", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SEM", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "L", ")", "Western", "blotting", "of", "membrane", "fractionation", "of", "SKOV3", "-", "Empty", "cells", ":", "total", "cell", "lysate", "\"", "T", "\"", ",", "liquid", "-", "disordered", "soluble", "fraction", "\"", "S", "\"", ",", "detergent", "resistant", "membrane", "fraction", "\"", "R", "\"", ".", "Caveolin", "-", "1", "is", "used", "as", "a", "marker", "of", "the", "R", "fraction", "and", "Calnexin", "is", "used", "as", "a", "marker", "for", "the", "S", "fraction", ",", "E", ":", "SKOV3", "-", "Empty", ",", "O", ":", "SKOV3", "-", "OPCML", "(", "M", ")", "Densitometry", "of", "AXL", "band", "intensities", "in", "(", "J", ")", "in", "S", "and", "R", ",", "normalized", "to", "AXL", "intensity", "in", "input", ".", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "M", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SE", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 (A) Western blotting of AXL and OPCML protein levels in AXL-expressing, OPCML-null SKOV3 and PEA1 cell lines transduced with OPCML \"O\" or control Empty vector \"E\" (B) Mammalian 2-Hybrid assay between OPCML and AXL Data in (A) to (M) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM s; *P < 0.05, ***P < 0.01, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(C) Western blotting of the OPCML-GST pull down. Input: 1/20 of SKOV3-Empty whole cell lysate(D) Western blotting of the anti-AXL immunoprecipitation. Input: 1/100 of SKOV3-OPCML whole cell lysate. IP: Immunoprecipitated protein, IB: Immunoblotted protein(E) Immunostaining of OPCML (red) and AXL (green) in SKOV3-OPCML and PEA1-OPCML cells. Scale bar = 10μm Data i M, (E) was performed once due to the limited numbers of primary cells;(G) FRET efficiency for AXL-OPCML interaction in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\", using AXL-AXL FRET as a positive control. Cells were labeled with Anti-Axl rabbit (conjugated to donor probe) and Anti-OPCML mouse (conjugated to acceptor probe), or Anti-Axl mouse (conjugated to acceptor probe) and Anti-Axl rabbit (conjugated to donor probe) Data in (A) to (M) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SE s; *P < 0.05, ***P < 0.01, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(H) PLA of AXL-OPCML (red) in SKOV3 and PEA1 cells transduced with empty vector \"E\" or OPCML \"O\". Scale bar = 50μmPrimary ovarian tumour cells were characterised for AXL and OPCML levels by (I) Western blottin PAX8 was used to identify ovarian cancer cellsPrimary ovarian tumour cells were characterised for AXL and OPCML levels b (J) Immunostaining. PAX8 was used to identify ovarian cancer cells(K) Quantitation of AXL-OPCML PLA in primary cells Data in (A) to (M) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM s; *P < 0.05, ***P < 0.01, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(L) Western blotting of membrane fractionation of SKOV3-Empty cells: total cell lysate \"T\", liquid-disordered soluble fraction \"S\", detergent resistant membrane fraction \"R\". Caveolin-1 is used as a marker of the R fraction and Calnexin is used as a marker for the S fraction, E: SKOV3-Empty, O: SKOV3-OPCML(M) Densitometry of AXL band intensities in (J) in S and R, normalized to AXL intensity in input. Data in (A) to (M) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SE s; *P < 0.05, ***P < 0.01, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests"}
{"words": ["Figure", "2", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", "over", "a", "12", "hour", "time", "course", "and", "(", "A", ")", "stained", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", ",", "Anti", "-", "OPCML", "(", "green", ")", "and", "Anti", "-", "AXL", "(", "red", ")", "antibodies", "(", "scale", "bar", "=", "10μm", ")", "(", "C", ",", "D", ")", "OPCML", "-", "AXL", "interaction", "(", "red", ")", "was", "visualised", "by", "PLA", "(", "scale", "bar", "=", "50μm", ")", "and", "quantified", ",", "n", "=", "3", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SE", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "testsd", ";", "(", "C", ",", "D", ")", "OPCML", "-", "AXL", "interaction", "(", "red", ")", "was", "visualised", "by", "PLA", "(", "scale", "bar", "=", "50μm", ")", "and", "quantified", ",", "n", "=", "3", "(", "E", ")", "Quantitation", "OPCML", "-", "AXL", "PLA", "interaction", "in", "primary", "ovarian", "tumour", "cells", ",", "n", "=", "1", "Data", "i", "M", ",", "(", "E", ")", "was", "performed", "once", "due", "to", "the", "limited", "numbers", "of", "primary", "cells", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "F", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "AXL", "antibody", "in", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", "as", "indicated", ".", "Input", ":", "1", "/", "50", "of", "whole", "cell", "lysate", "from", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", ".", "IP", ":", "Immunoprecipitated", "protein", ",", "IB", ":", "Immunoblotted", "protein", "(", "G", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "pAXL", "antibody", "in", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", "(", "H", ")", "OPCML", "-", "GST", "pull", "down", "assay", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", "(", "I", ")", "Membrane", "fractionation", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "into", "the", "detergent", "resistant", "\"", "R", "\"", "membrane", "fraction", "and", "the", "detergent", "soluble", "\"", "S", "\"", "fraction", "upon", "Gas6", "stimulation", "(", "K", ")", "FRAP", "recovery", "curves", "in", "insoluble", "lipid", "domain", "or", "soluble", "plasma", "membrane", "fraction", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "treated", "with", "Gas6", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SEM", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "L", ")", "Diffusion", "Co", "-", "efficient", "in", "insoluble", "lipid", "domain", "or", "soluble", "plasma", "membrane", "fraction", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "treated", "with", "Gas6", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SEM", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "M", ")", "percentage", "of", "AXL", "localised", "in", "insoluble", "lipid", "domain", "or", "soluble", "plasma", "membrane", "fraction", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "treated", "with", "Gas6", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SE", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "N", ")", "FRET", "Efficiency", "in", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", ",", "and", "labeled", "with", "Anti", "-", "Axl", "(", "donor", "probe", ")", "and", "Anti", "-", "OPCML", "(", "acceptor", "probe", ")", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±", "SEM", "s", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "\"", "s", "t", "tests", "(", "O", ")", "Western", "blotting", "of", "the", "\"", "S", "\"", "and", "\"", "R", "\"", "membrane", "fractions", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "OCPML", "\"", "O", "\"", "cells", "stimulated", "with", "Gas6", "for", "3", "hours", ",", "for", "Gas6", ",", "AXL", "and", "pAXL", ".", "Data", "in", "(", "A", ")", "to", "(", "O", ")", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "experiments", "with", "graphs", "depicting", "means", "±"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 SKOV3-OPCML cells stimulated with Gas6 over a 12 hour time course and (A) stained with DAPI (cyan), Anti-OPCML (green) and Anti-AXL (red) antibodies (scale bar = 10μm) (C,D) OPCML-AXL interaction (red) was visualised by PLA (scale bar = 50μm) and quantified, n = 3 Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SE s; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t testsd; (C,D) OPCML-AXL interaction (red) was visualised by PLA (scale bar = 50μm) and quantified, n = 3(E) Quantitation OPCML-AXL PLA interaction in primary ovarian tumour cells, n=1 Data i M, (E) was performed once due to the limited numbers of primary cells; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(F) Co-immunoprecipitation with anti-AXL antibody in cells stimulated with Gas6 as indicated. Input: 1/50 of whole cell lysate from SKOV3-OPCML cells. IP: Immunoprecipitated protein, IB: Immunoblotted protein(G) Co-immunoprecipitation with anti-pAXL antibody in SKOV3-OPCML cells stimulated with Gas6(H) OPCML-GST pull down assay in SKOV3-Empty cells stimulated with Gas6(I) Membrane fractionation in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells into the detergent resistant \"R\" membrane fraction and the detergent soluble \"S\" fraction upon Gas6 stimulation(K) FRAP recovery curves in insoluble lipid domain or soluble plasma membrane fraction in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells treated with Gas6 Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM s; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(L) Diffusion Co-efficient in insoluble lipid domain or soluble plasma membrane fraction in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells treated with Gas6 Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM s; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(M) percentage of AXL localised in insoluble lipid domain or soluble plasma membrane fraction in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells treated with Gas6 Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SE s; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(N) FRET Efficiency in SKOV3-OPCML \"O\" cells stimulated with Gas6, and labeled with Anti-Axl (donor probe) and Anti-OPCML (acceptor probe) Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM s; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001 by Student\"s t tests(O) Western blotting of the \"S\" and \"R\" membrane fractions in SKOV3-Empty \"E\" and OCPML \"O\" cells stimulated with Gas6 for 3 hours, for Gas6, AXL and pAXL. Data in (A) to (O) are representative of at least three experiments with graphs depicting means ± SEM"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Filipin", "staining", "of", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", "treated", "for", "30", "minutes", "with", "5mM", "MBCD", "and", "allowed", "to", "recover", "for", "0", ",", "30", "minutes", ",", "and", "12", "hours", "in", "serum", "free", "(", "SF", ")", "medium", "(", "B", ")", "Western", "blotting", "of", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", "treated", "with", "MBCD", "and", "separated", "into", "the", "detergent", "resistant", "\"", "R", "\"", "membrane", "fraction", "and", "the", "detergent", "soluble", "\"", "S", "\"", "fraction", "upon", "Gas6", "stimulation", "(", "C", ")", "Ratio", "of", "AXL", "band", "intensity", "in", "\"", "R", "\"", "or", "pAXL", "band", "intensity", "in", "\"", "S", "\"", "relative", "to", "total", "AXL", "\"", "T", "\"", "from", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "in", "(", "B", ")", "(", "D", ")", "MBCD", "treatment", "of", "SKOV3", "-", "EMPTY", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "cell", "lines", "was", "followed", "by", "the", "analysis", "of", "Gas6", "signalling", "kinetics", "by", "western", "blot", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "E", ",", "F", ")", "Signalling", "kinetics", "are", "presented", "for", "pAXL", "and", "pERK", "in", "SKOV3", "-", "EMPTY", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OCPML", "\"", "O", "\"", ",", "treated", "with", "MBCD", "and", "no", "treatment", "control", ",", "normalised", "to", "GAPDH", ",", "from", "(", "D", ")", "(", "G", ")", "PLA", "assay", "of", "AXL", "-", "OPCML", "interaction", "(", "red", ")", "upon", "Gas6", "stimulation", "in", "both", "MBCD", "treated", "and", "non", "-", "treated", "SKOV3", "-", "OPCML", "cells", ".", "Scale", "bar", "="], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) Filipin staining of SKOV3-OPCML cells treated for 30 minutes with 5mM MBCD and allowed to recover for 0, 30 minutes, and 12 hours in serum free (SF) medium(B) Western blotting of SKOV3-OPCML cells treated with MBCD and separated into the detergent resistant \"R\" membrane fraction and the detergent soluble \"S\" fraction upon Gas6 stimulation(C) Ratio of AXL band intensity in \"R\" or pAXL band intensity in \"S\" relative to total AXL \"T\" from SKOV3-OPCML \"O\" in (B)(D) MBCD treatment of SKOV3-EMPTY and SKOV3-OPCML cell lines was followed by the analysis of Gas6 signalling kinetics by western blot. GAPDH was used as loading control(E,F) Signalling kinetics are presented for pAXL and pERK in SKOV3-EMPTY \"E\" and SKOV3-OCPML \"O\", treated with MBCD and no treatment control, normalised to GAPDH, from (D)(G) PLA assay of AXL-OPCML interaction (red) upon Gas6 stimulation in both MBCD treated and non-treated SKOV3-OPCML cells. Scale bar = 50μm"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Western", "Blotting", "of", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "pre", "incubated", "with", "either", "no", "drug", "(", "DMSO", "only", "control", ")", ",", "1", ".", "09", "μM", "R428", ",", "or", "2", ".", "84", "μM", "R428", "for", "an", "hour", "and", "stimulated", "with", "Gas6", "for", "the", "indicated", "times", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", " ", "staining", "of", "pERK", "(", "red", ")", "and", "OPCML", "(", "magenta", ")", "in", "SKOV3", "-", "Empty", "\"", "E", "\"", "and", "SKOV3", "-", "OPCML", "\"", "O", "\"", "cells", "treated", "with", "R428", "and", "stimulated", "with", "Gas6", "for", "the", "indicted", "time", "points", ".", "Scale", "bars", "="], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Western Blotting of SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells pre incubated with either no drug (DMSO only control), 1.09 μM R428, or 2.84 μM R428 for an hour and stimulated with Gas6 for the indicated times. GAPDH was used as loading control(C) Immunofluorescence staining of pERK (red) and OPCML (magenta) in SKOV3-Empty \"E\" and SKOV3-OPCML \"O\" cells treated with R428 and stimulated with Gas6 for the indicted time points. Scale bars = 50μm"}
{"words": ["Figure", "1D", "Western", "blot", "of", "Sec63", ",", "mCherry", "and", "Pgk1", "from", "WT", "cells", "(", "SSY1404", ")", ",", "cells", "harboring", "the", "estradiol", "-", "inducible", "system", "(", "SSY1405", ")", "or", "∆", "opi1", "cells", "(", "SSY1607", ")", ",", "all", "of", "which", "expressed", "Sec63", "-", "mNeon", "and", "Rtn1", "-", "mCherry", ".", "Cells", "were", "untreated", "or", "treated", "with", "800", "nM", "estradiol", "for", "6", "h", ".", "Pgk1", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "E", "Quantification", "of", "ER", "size", "in", "estradiol", "-", "treated", "cells", "harboring", "the", "inducible", "system", "(", "SSY1405", ")", ",", "untreated", "∆", "opi1", "cells", "(", "SSY1607", ")", "and", "WT", "cells", "(", "SSY1404", ")", "treated", "with", "8", "mM", "DTT", "for", "1", "h", ".", "Bars", "represent", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "0", "nM", "estradiol", "or", "∆", "opi1", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D Western blot of Sec63, mCherry and Pgk1 from WT cells (SSY1404), cells harboring the estradiol-inducible system (SSY1405) or ∆opi1 cells (SSY1607), all of which expressed Sec63-mNeon and Rtn1-mCherry. Cells were untreated or treated with 800 nM estradiol for 6 h. Pgk1 served as a loading control.E Quantification of ER size in estradiol-treated cells harboring the inducible system (SSY1405), untreated ∆opi1 cells (SSY1607) and WT cells (SSY1404) treated with 8 mM DTT for 1 h. Bars represent mean + s.e.m., n = 3 biological replicates. Asterisks indicate statistical significance compared with 0 nM estradiol or ∆opi1 cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. *, P < 0.05; **, P < 0.01; n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "2A", "Sec63", "-", "mNeon", "images", "of", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "harboring", "the", "inducible", "system", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "800", "nM", "estradiol", "for", "6", "h", ".", "Two", "examples", "of", "each", "phenotypic", "class", "are", "shown", ".", "C", "Sec63", "-", "mNeon", "and", "Rtn1", "-", "mCherry", "images", "of", "∆", "lnp1", "and", "∆", "sey1", "cells", "harboring", "the", "inducible", "system", "and", "treated", "with", "800", "nM", "estradiol", "for", "6", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Sec63-mNeon images of cells of the indicated genotypes harboring the inducible system. Cells were treated with 800 nM estradiol for 6 h. Two examples of each phenotypic class are shown.C Sec63-mNeon and Rtn1-mCherry images of ∆lnp1 and ∆sey1 cells harboring the inducible system and treated with 800 nM estradiol for 6 h."}
{"words": ["Figure", "3C", "Quantification", "of", "peripheral", "ER", "structures", "in", "WT", "and", "∆", "ice2", "cells", "harboring", "the", "inducible", "system", "(", "SSY1405", ",", "1603", ")", "and", "treated", "with", "800", "nM", "estradiol", "for", "the", "times", "indicated", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "percentage", "of", "cell", "cortex", "covered", "by", "tubules", "(", "purple", ")", "or", "sheets", "(", "green", ")", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Upper", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "the", "sum", "of", "tubules", "and", "sheets", ",", "lower", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "sheets", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "the", "corresponding", "value", "in", "WT", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "E", "Quantification", "of", "peripheral", "ER", "structures", "in", "untreated", "WT", ",", "Δice2", ",", "Δopi1", "and", "Δice2", "Δopi1", "cells", "(", "SSY1404", ",", "2356", ",", "2595", ",", "2811", ")", ".", "Bars", "are", "the", "mean", "percentage", "of", "cell", "cortex", "covered", "by", "tubules", "(", "purple", ")", "or", "sheets", "(", "green", ")", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Upper", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "the", "sum", "of", "tubules", "and", "sheets", ",", "lower", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "for", "sheets", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "the", "corresponding", "value", "in", "WT", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C Quantification of peripheral ER structures in WT and ∆ice2 cells harboring the inducible system (SSY1405, 1603) and treated with 800 nM estradiol for the times indicated. Bars are the mean percentage of cell cortex covered by tubules (purple) or sheets (green), n = 3 biological replicates. Upper error bars are s.e.m. for the sum of tubules and sheets, lower error bars are s.e.m. for sheets. Asterisks indicate statistical significance compared with the corresponding value in WT cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. **, P < 0.01; n.s., not significant.E Quantification of peripheral ER structures in untreated WT, Δice2, Δopi1 and Δice2 Δopi1 cells (SSY1404, 2356, 2595, 2811). Bars are the mean percentage of cell cortex covered by tubules (purple) or sheets (green), n = 3 biological replicates. Upper error bars are s.e.m. for the sum of tubules and sheets, lower error bars are s.e.m. for sheets. Asterisks indicate statistical significance compared with the corresponding value in WT cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. **, P < 0.01; n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "4C", ",", "D", "Fluorescence", "images", "of", "cortical", "sections", "of", "WT", "and", "Δice2", "cells", "expressing", "Sec63", "-", "mNeon", "and", "Rtn1", "-", "mCherry", "(", "SSY1405", ",", "1603", ")", "that", "were", "untreated", "(", "C", ")", "or", "treated", "with", "8", "mM", "DTT", "for", "1", "h", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C, D Fluorescence images of cortical sections of WT and Δice2 cells expressing Sec63-mNeon and Rtn1-mCherry (SSY1405, 1603) that were untreated (C) or treated with 8 mM DTT for 1 h (D)."}
{"words": ["Figure", "5B", "Growth", "assays", "of", "untreated", "WT", ",", "Δice2", ",", "Δnem1", ",", "Δnem1", "Δice2", ",", "Δspo7", ",", "Δspo7", "Δice2", ",", "Δpah1", "and", "Δpah1", "Δice2", "cells", "(", "SSY1404", ",", "2356", ",", "2482", ",", "2484", ",", "2481", ",", "2483", ",", "2807", ",", "2808", ")", ".", "Numbers", "represent", "areas", "under", "the", "curves", "and", "serve", "as", "growth", "indices", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Data", "for", "WT", "and", "∆", "ice2", "cells", "are", "the", "same", "in", "the", "left", "and", "middle", "panels", ".", "C", ",", "D", "Lipidomic", "analysis", "of", "WT", ",", "Δice2", ",", "Δnem1", ",", "Δice2", "Δnem1", ",", "Δspo7", "and", "Δice2", "Δspo7", "cells", "(", "SSY1404", ",", "2356", ",", "2482", ",", "2484", ",", "2481", ",", "2483", ")", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "WT", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "for", "WT", "and", "Δice2", "cells", "are", "the", "same", "as", "in", "both", "panels", ".", "E", "Sec63", "-", "mNeon", "images", "of", "untreated", "WT", ",", "Δnem1", ",", "Δnem1Δice2", ",", "Δspo7", "and", "Δspo7", "Δice2", "cells", "(", "SSY1404", ",", "2482", ",", "2484", ",", "2481", ",", "2483", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Growth assays of untreated WT, Δice2, Δnem1, Δnem1 Δice2, Δspo7, Δspo7 Δice2, Δpah1 and Δpah1 Δice2 cells (SSY1404, 2356, 2482, 2484, 2481, 2483, 2807, 2808). Numbers represent areas under the curves and serve as growth indices. Mean + s.e.m., n = 3 biological replicates. Data for WT and ∆ice2 cells are the same in the left and middle panels.C, D Lipidomic analysis of WT, Δice2, Δnem1, Δice2 Δnem1, Δspo7 and Δice2 Δspo7 cells (SSY1404, 2356, 2482, 2484, 2481, 2483). Mean + s.e.m., n = 4 biological replicates. Asterisks indicate statistical significance compared with WT cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. *, P < 0.05; **, P < 0.01. Data for WT and Δice2 cells are the same as in both panels.E Sec63-mNeon images of untreated WT, Δnem1, Δnem1Δice2, Δspo7 and Δspo7 Δice2 cells (SSY1404, 2482, 2484, 2481, 2483)."}
{"words": ["Figure", "6D", "Western", "blot", "of", "HA", "from", "Pah1", "dephosphorylation", "reactions", "that", "contained", "phosphorylated", "Pah1", "-", "HA", "from", "∆", "nem1", "mutants", "(", "SSY3065", ")", "and", "microsomes", "from", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "SSY3053", ",", "3074", ",", "3075", ",", "3095", ")", ".", "Phosphorylated", "Pah1", "and", "dephosphorylated", "Pah1", "resulting", "from", "treatment", "with", "recombinant", "alkaline", "phosphatase", "(", "PPase", ")", "are", "shown", "for", "reference", ".", "E", "Western", "blot", "of", "HA", ",", "Sec61", "and", "Pgk1", "from", "cell", "lysates", "and", "microsomes", "prepared", "from", "WT", "and", "∆", "ice2", "cells", "expressing", "Nem1", "-", "HA", "(", "SSY3140", ",", "3141", ")", ".", "Nem1", "is", "undetectable", "in", "cell", "lysates", "due", "to", "its", "low", "abundance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D Western blot of HA from Pah1 dephosphorylation reactions that contained phosphorylated Pah1-HA from ∆nem1 mutants (SSY3065) and microsomes from cells of the indicated genotypes (SSY3053, 3074, 3075, 3095). Phosphorylated Pah1 and dephosphorylated Pah1 resulting from treatment with recombinant alkaline phosphatase (PPase) are shown for reference.E Western blot of HA, Sec61 and Pgk1 from cell lysates and microsomes prepared from WT and ∆ice2 cells expressing Nem1-HA (SSY3140, 3141). Nem1 is undetectable in cell lysates due to its low abundance."}
{"words": ["Figure", "7Western", "blots", "of", "FLAG", ",", "HA", "and", "Dpm1", "from", "cell", "lysates", "or", "anti", "-", "FLAG", "immunoprecipitates", "of", "WT", "or", "∆", "nem1", "cells", "containing", "Spo7", "-", "FLAG", ",", "Nem1", "-", "FLAG", "or", "Ice2", "-", "HA", "as", "indicated", "(", "SSY122", ",", "2421", ",", "3183", ",", "3184", ",", "3195", ",", "3196", ",", "3197", ")", ".", "The", "asterisk", "marks", "the", "position", "of", "the", "light", "chain", "from", "the", "antibody", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "The", "diamond", "marks", "a", "protein", "that", "is", "non", "-", "specifically", "precipitated", "by", "the", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "IP", ",", "immunoprecipitate", ".", "E", "Images", "of", "cells", "with", "endogenously", "tagged", "Ice2", "-", "mScarlet", "and", "Spo7", "-", "mNeon", "or", "Nem1", "-", "mNeon", "(", "SSY3244", ",", "3245", ")", ".", "Arrows", "indicate", "foci", "containg", "both", "Ice2", "and", "either", "Spo7", "or", "Nem1", ".", "F", "Quantification", "of", "Spo7", "and", "Nem1", "foci", "in", "WT", "and", "∆", "ice2", "cells", "(", "SSY2916", ",", "3238", ",", "2917", ",", "3239", ")", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "the", "respective", "WT", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Western blots of FLAG, HA and Dpm1 from cell lysates or anti-FLAG immunoprecipitates of WT or ∆nem1 cells containing Spo7-FLAG, Nem1-FLAG or Ice2-HA as indicated (SSY122, 2421, 3183, 3184, 3195, 3196, 3197). The asterisk marks the position of the light chain from the antibody used for immunoprecipitation. The diamond marks a protein that is non-specifically precipitated by the anti-FLAG antibody. IP, immunoprecipitate.E Images of cells with endogenously tagged Ice2-mScarlet and Spo7-mNeon or Nem1-mNeon (SSY3244, 3245). Arrows indicate foci containg both Ice2 and either Spo7 or Nem1. F Quantification of Spo7 and Nem1 foci in WT and ∆ice2 cells (SSY2916, 3238, 2917, 3239). Mean + s.e.m., n = 3 biological replicates. Asterisks indicate statistical significance compared with the respective WT cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. **, P < 0.01. "}
{"words": ["Figure", "8A", "Lipidomic", "analysis", "of", "WT", "and", "∆", "ice2", "cells", "in", "which", "PAH1", "was", "replaced", "with", "PAH1", "-", "HA", "or", "pah1", "(", "7A", ")", "-", "HA", "as", "indicated", "(", "SSY2841", ",", "SSY2842", ",", "SSY2970", ")", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "compared", "with", "WT", "cells", ",", "as", "judged", "by", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "assuming", "equal", "variance", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Lipidomic analysis of WT and ∆ice2 cells in which PAH1 was replaced with PAH1-HA or pah1(7A)-HA as indicated (SSY2841, SSY2842, SSY2970). Mean + s.e.m., n = 4 biological replicates. Asterisks indicate statistical significance compared with WT cells, as judged by a two-tailed Student's t-test assuming equal variance. **, P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "9A", "Sec63", "-", "mNeon", "images", "of", "mid", "and", "cortical", "sections", "of", "untreated", "WT", "and", "∆", "opi1", "cells", ",", "overexpressing", "ICE2", "where", "indicated", "(", "SSY1404", ",", "2588", ",", "2595", ",", "2596", ")", ".", "D", "Growth", "assays", "on", "solid", "media", "of", "WT", ",", "∆", "hac1", ",", "Δice2", ",", "and", "Δhac1", "Δice2", "cells", "(", "SSY1404", ",", "2356", ",", "2805", ",", "2806", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "0", ".", "2", "µg", "/", "ml", "tunicamycin", ".", "For", "each", "series", ",", "cells", "were", "diluted", "fivefold", "from", "one", "step", "to", "the", "next", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A Sec63-mNeon images of mid and cortical sections of untreated WT and ∆opi1 cells, overexpressing ICE2 where indicated (SSY1404, 2588, 2595, 2596).D Growth assays on solid media of WT, ∆hac1, Δice2, and Δhac1 Δice2 cells (SSY1404, 2356, 2805, 2806) in the absence or presence of 0.2 µg/ml tunicamycin. For each series, cells were diluted fivefold from one step to the next."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "F", ")", "Immunocytochemistry", "of", "DRG", "neurons", "and", "the", "corresponding", "quantifications", "of", "the", "indicated", "genotypes", "for", "surface", "TrkA", "(", "A", ")", ",", "surface", "TRPV1", "(", "B", ")", ",", "Rab3A", "(", "C", ")", ",", "synaptotagmin", "(", "D", ")", ",", "DENN", "/", "MADD", "(", "E", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "F", ")", ".", "TrkA", "and", "TRPV1", "were", "visualized", "without", "permeabilization", ".", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Welch", "'", "s", "t", "test", "from", "at", "least", "three", "independent", "cultures", ".", "Error", "bars", "show", "SEM", ".", "Scale", "bars", ",", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-F) Immunocytochemistry of DRG neurons and the corresponding quantifications of the indicated genotypes for surface TrkA (A), surface TRPV1 (B), Rab3A (C), synaptotagmin (D), DENN/MADD (E) and α-tubulin (F). TrkA and TRPV1 were visualized without permeabilization. ns, p > 0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; Welch's t test from at least three independent cultures. Error bars show SEM. Scale bars, 2 µm."}
{"words": ["Figure", "3Time", "-", "lapse", "fluorescence", "images", "of", "DRG", "neurons", "expressing", "KIF1A", "-", "EGFP", "and", "KIF1A", "(", "E239K", ")", "-", "EGFP", "(", "B", ")", "Arrowheads", "in", "(", "B", ")", "show", "the", "anterogradely", "moving", "particles", ".", "Scale", "bar", "in", "(", "B", ")", ",", "2", "μm", ".", "See", "Movies", "EV1", "and", "2", ".", "(", "F", ")", "Movements", "of", "KIF1A", "-", "EGFP", "and", "KIF1A", "(", "E239K", ")", "-", "EGFP", "expressed", "in", "KIF1A", "knockdown", "DRG", "and", "the", "scrambled", "control", ".", "White", "scale", "bar", ",", "1", "μm", ".", "(", "G", ")", "Anterograde", "velocities", "of", "the", "indicated", "genotypes", "calculated", "from", "the", "kymograph", "slopes", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "and", "SD", ".", "KD", "+", "KIF1A", "-", "EGFP", ",", "n", "=", "29", ";", "KD", "+", "KIF1A", "(", "E239K", ")", "-", "EGFP", ",", "n", "=", "32", ";", "scrambled", "+", "KIF1A", "-", "EGFP", ",", "n", "=", "44", ";", "scrambled", "+", "KIF1A", "(", "E239K", ")", "-", "EGFP", ",", "n", "=", "42", "from", "three", "independent", "cultures", ".", "ns", ",", "p", "=", "0", ".", "3329", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "Unpaired", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Time-lapse fluorescence images of DRG neurons expressing KIF1A-EGFP and KIF1A(E239K)-EGFP (B) Arrowheads in (B) show the anterogradely moving particles. Scale bar in (B), 2 μm. See Movies EV1 and 2.(F) Movements of KIF1A-EGFP and KIF1A(E239K)-EGFP expressed in KIF1A knockdown DRG and the scrambled control. White scale bar, 1 μm. (G) Anterograde velocities of the indicated genotypes calculated from the kymograph slopes. Data are shown as mean and SD. KD+KIF1A-EGFP, n = 29; KD+KIF1A(E239K)-EGFP, n = 32; scrambled+KIF1A-EGFP, n = 44; scrambled+KIF1A(E239K)-EGFP, n = 42 from three independent cultures. ns, p = 0.3329; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; Unpaired t test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "kymographs", "of", "tetramethylrhodamine", "-", "labelled", "microtubule", "movement", "driven", "by", "the", "WT", "and", "the", "E239K", "mutant", ".", "The", "arrowheads", "represent", "the", "end", "positions", "of", "the", "WT", "and", "E239K", ".", "(", "D", ")", "ATPase", "activity", "of", "WT", "(", "green", ")", "and", "E239K", "mutant", "(", "magenta", ")", "activated", "by", "microtubules", ".", "Data", "are", "represented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "The", "data", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "were", "analysed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "F", ")", "Rate", "constants", "(", "kobs", ")", "determined", "for", "the", "reaction", "of", "mant", "-", "ATP", "with", "nucleotide", "-", "free", "KIF1A", "(", "WT", ")", "and", "KIF1A", "(", "E239K", ")", "were", "plotted", "against", "concentration", "of", "mant", "-", "ATP", ".", "Data", "are", "represented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "The", "data", "from", "three", "independent", "measurements", "were", "analysed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative kymographs of tetramethylrhodamine-labelled microtubule movement driven by the WT and the E239K mutant. The arrowheads represent the end positions of the WT and E239K.(D) ATPase activity of WT (green) and E239K mutant (magenta) activated by microtubules. Data are represented as the mean ± SD. The data from at least three independent experiments were analysed. ****, p < 0.0001, two-way ANOVA.(F) Rate constants (kobs) determined for the reaction of mant-ATP with nucleotide-free KIF1A(WT) and KIF1A(E239K) were plotted against concentration of mant-ATP. Data are represented as the mean ± SD. The data from three independent measurements were analysed."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "positions", "of", "the", "β6", "-", "L10", "-", "β7", "and", "neck", "-", "coil", "peptides", "are", "shown", "in", "brown", "and", "green", ".", "The", "positions", "of", "the", "neck", "-", "linker", "peripheral", "peptides", "(", "α1", "-", "β3", "-", "P", "loop", ",", "α4", "-", "L12", "and", "L12", "-", "α5", ")", "are", "shown", "in", "light", "blue", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Quantitation", "of", "site", "-", "specific", "intramolecular", "interactions", ".", "Representative", "MS", "/", "MS", "spectra", "of", "the", "indicated", "peptides", ",", "including", "the", "mutated", "amino", "acid", "(", "β6", "-", "L10", "-", "β7", ")", "(", "B", "and", "C", ")", "and", "neck", "-", "coil", "(", "D", ")", ".", "In", "the", "inserted", "graphs", ",", "the", "intensities", "in", "the", "ADP", "-", "BeFx", "and", "ADP", "-", "AlFx", "states", "were", "measured", "with", "respect", "to", "the", "nucleotide", "-", "free", "state", "as", "1", ".", "0", ".", "Grey", "bar", "graphs", ",", "WT", ";", "black", "bar", "graphs", ",", "E239K", ";", "(", "-", ")", ",", "nucleotide", "-", "free", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The positions of the β6-L10-β7 and neck-coil peptides are shown in brown and green. The positions of the neck-linker peripheral peptides (α1-β3-P loop, α4-L12 and L12-α5) are shown in light blue. (B-D) Quantitation of site-specific intramolecular interactions. Representative MS/MS spectra of the indicated peptides, including the mutated amino acid (β6-L10-β7) (B and C) and neck-coil (D). In the inserted graphs, the intensities in the ADP-BeFx and ADP-AlFx states were measured with respect to the nucleotide-free state as 1.0. Grey bar graphs, WT; black bar graphs, E239K; (-), nucleotide-free."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "(", "e", ")", "Binding", "of", "monoclonal", "antibodies", "to", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "determined", "by", "ELISA", ".", "(", "f", ")", "Binding", "profiles", "of", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "to", "ACE2", "and", "antibodies", "(", "g", ")", "competition", "of", "CR3022", "and", "ACE2", "with", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "measured", "by", "BLI", "in", "OctetRED96", ".", "Binding", "kinetics", "was", "evaluated", "using", "a", "1", ":", "1", "Langmuir", "binding", "model", "by", "ForteBio", "Data", "Analysis", "7", ".", "0", "software", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.(e) Binding of monoclonal antibodies to 2019-nCoV RBD determined by ELISA.(f) Binding profiles of 2019-nCoV RBD to ACE2 and antibodies(g) competition of CR3022 and ACE2 with 2019-nCoV RBD measured by BLI in OctetRED96. Binding kinetics was evaluated using a 1:1 Langmuir binding model by ForteBio Data Analysis 7.0 software."}
{"words": ["Figure", "4C", "Comparison", "of", "meiotic", "chromosome", "segregation", "in", "cells", "lacking", "H3K9me3", "depending", "on", "Swi6", "'", "s", "affinity", "towards", "H3K9me2", ".", "Exemplary", "IF", "microscopy", "images", "of", "the", "indicated", "fission", "yeast", "strains", "are", "shown", ".", "Homothallic", "strains", "were", "incubated", "on", "SPAS", "plates", ".", "DNA", "and", "tubulin", "were", "stained", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "TAT", "-", "1", ",", "respectively", ".", "Missegregating", "chromosome", "is", "indicated", "with", "a", "yellow", "arrow", ";", "D", "Quantification", "of", "meiotic", "chromosome", "segregation", "phenotypes", ".", "The", "data", "for", "clr4", "+", "and", "clr4F449Y", "is", "the", "same", "as", "in", "Fig", "3B", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Number", "of", "total", "cells", "counted", "is", "indicated", "in", "each", "bar", ".", "E", "Comparison", "of", "co", "-", "segregation", "of", "centromere", "I", "(", "CenI", ")", "during", "MI", "in", "cells", "lacking", "H3K9me3", "depending", "on", "Swi6", "'", "s", "affinity", "towards", "H3K9me2", ".", "Exemplary", "live", "cell", "microscopy", "images", "of", "the", "indicated", "fission", "yeast", "strains", "during", "MI", "and", "MII", "are", "shown", ".", "Heterothallic", "strains", "were", "crossed", "and", "dyads", "as", "well", "as", "tetrads", "were", "subjected", "to", "the", "analysis", ".", "Heterozygous", "CenI", "-", "GFP", "was", "used", "to", "follow", "the", "segregation", "pattern", "during", "meiosis", ".", "The", "GFP", "-", "signal", "is", "additionally", "displayed", "in", "greyscale", "for", "better", "visibility", "F", "Quantification", "of", "CenI", "-", "GFP", "segregation", "during", "meiosis", ".", "The", "data", "for", "clr4", "+", "and", "clr4F449Y", "is", "the", "same", "as", "in", "Fig", "3D", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Number", "of", "total", "cells", "counted", "is", "indicated", "in", "each", "bar", ".", "G", "Tetrad", "dissection", "to", "asses", "spore", "viability", "in", "clr4F449Y", "swi6Chp1", "-", "like", "-", "CD", "cells", ".", "Exemplary", "image", "(", "left", ")", "and", "quantification", "of", "the", "spore", "viability", "(", "right", ")", "are", "shown", ".", "Meiosis", "was", "induced", "in", "homothallic", "cells", "and", "the", "resulting", "spores", "were", "dissected", ".", "The", "data", "for", "clr4", "+", "and", "clr4F449Y", "is", "the", "same", "as", "in", "Fig", "3F", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Number", "of", "dissected", "tetrads", "is", "indicated", "in", "each", "bar", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C Comparison of meiotic chromosome segregation in cells lacking H3K9me3 depending on Swi6's affinity towards H3K9me2. Exemplary IF microscopy images of the indicated fission yeast strains are shown. Homothallic strains were incubated on SPAS plates. DNA and tubulin were stained with DAPI and anti-TAT-1, respectively. Missegregating chromosome is indicated with a yellow arrow; D Quantification of meiotic chromosome segregation phenotypes. The data for clr4+ and clr4F449Y is the same as in Fig 3B. P values were calculated using Fisher's exact test. Number of total cells counted is indicated in each bar.E Comparison of co-segregation of centromere I (CenI) during MI in cells lacking H3K9me3 depending on Swi6's affinity towards H3K9me2. Exemplary live cell microscopy images of the indicated fission yeast strains during MI and MII are shown. Heterothallic strains were crossed and dyads as well as tetrads were subjected to the analysis. Heterozygous CenI-GFP was used to follow the segregation pattern during meiosis. The GFP-signal is additionally displayed in greyscale for better visibility F Quantification of CenI-GFP segregation during meiosis. The data for clr4+ and clr4F449Y is the same as in Fig 3D. P values were calculated using Fisher's exact test. Number of total cells counted is indicated in each bar.G Tetrad dissection to asses spore viability in clr4F449Y swi6Chp1-like-CD cells. Exemplary image (left) and quantification of the spore viability (right) are shown. Meiosis was induced in homothallic cells and the resulting spores were dissected. The data for clr4+ and clr4F449Y is the same as in Fig 3F. P values were calculated using Fisher's exact test. Number of dissected tetrads is indicated in each bar."}
{"words": ["Figure", "6A", "Western", "blot", "of", "whole", "-", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "using", "a", "PhosTag", "gel", "for", "anti", "-", "FLAG", "(", "top", ")", "and", "a", "Bis", "-", "Tris", "gel", "for", "anti", "-", "Act1", "detection", "(", "bottom", ")", ",", "respectively", ".", "WCL", "were", "prepared", "from", "mitotic", "and", "meiotic", "3xFLAG", "-", "clr4", "+", "/", "3xFLAG", "-", "clr4", "+", "cultures", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "C", "Western", "blot", "of", "FLAG", "IPs", "using", "a", "PhosTag", "gel", "to", "asses", "phosphorylation", "levels", "of", "Clr4", "in", "the", "indicated", "homothallic", "strains", ".", "D", "Western", "blot", "of", "FLAG", "IPs", "in", "3xFLAG", "-", "clr4", "+", "cdc2", "-", "as", "cells", ",", "treated", "with", "2", "µM", "1", "-", "NM", "-", "PP1", "for", "the", "indicated", "amount", "of", "time", ".", "The", "blot", "was", "first", "probed", "with", "the", "phospho", "-", "specific", "anti", "-", "pS458", "antibody", ",", "stripped", ",", "and", "reprobed", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Western blot of whole-cell lysates (WCL) using a PhosTag gel for anti-FLAG (top) and a Bis-Tris gel for anti-Act1 detection (bottom), respectively. WCL were prepared from mitotic and meiotic 3xFLAG-clr4+/3xFLAG-clr4+ cultures at the indicated time points.C Western blot of FLAG IPs using a PhosTag gel to asses phosphorylation levels of Clr4 in the indicated homothallic strains.D Western blot of FLAG IPs in 3xFLAG-clr4+ cdc2-as cells, treated with 2 µM 1-NM-PP1 for the indicated amount of time. The blot was first probed with the phospho-specific anti-pS458 antibody, stripped, and reprobed with an anti-FLAG antibody."}
{"words": ["Figure", "1Untreated", "or", "Ruxolitinib", "(", "10", "µM", ")", "-", "treated", "PBMCs", "from", "four", "individual", "donors", "were", "exposed", "to", "SARS", "-", "CoV", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "PBMCs", "inoculated", "with", "supernatant", "from", "Vero", "E6", "cell", "cultures", "mixed", "with", "PBS", "and", "OptiPro", "serum", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "0", ".", "5", "%", "gelatine", "were", "used", "as", "control", "condition", "(", "Mock", ")", ".", "Supernatants", "and", "individual", "cell", "fractions", "were", "collected", "at", "indicated", "time", "points", "post", "-", "inoculation", "and", "analyzed", "for", ":", "Infectivity", "in", "cell", "culture", "supernatants", "by", "plaque", "titration", "assay", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "cells", "from", "at", "least", "four", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "mock", "-", "and", "Ruxolitinib", "-", "treated", "samples", ".", "p", "-", "values", ">", "0", ".", "05", "were", "considered", "not", "significant", "and", "are", "not", "shown", "in", "the", "figure", ".", "n", ".", "d", ".", "=", "not", "detectable", ";", "h", ".", "p", ".", "e", ".", "=", "hours", "post", "-", "exposure", "Ruxo", ".", "=", "Ruxolitinib", ".", "PBMCs", "from", "four", "individual", "donors", "were", "exposed", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "PBMCs", "inoculated", "with", "supernatant", "from", "Vero", "E6", "cell", "cultures", "mixed", "with", "PBS", "and", "OptiPro", "serum", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "0", ".", "5", "%", "gelatine", "were", "used", "as", "control", "condition", "(", "Mock", ")", ".", "Supernatants", "and", "individual", "cell", "fractions", "were", "collected", "at", "indicated", "time", "points", "post", "-", "inoculation", "and", "analyzed", "for", ":", "Infectivity", "in", "cell", "culture", "supernatants", "by", "plaque", "titration", "assay", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "cells", "from", "at", "least", "four", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "p", "-", "values", ">", "0", ".", "05", "were", "considered", "not", "significant", "and", "are", "not", "shown", "in", "the", "figure", ".", "n", ".", "d", ".", "=", "not", "detectable", ";", "h", ".", "p", ".", "e", ".", "=", "hours", "post", "-", "exposure", ";", "RMV", "=", "RemdesivirUntreated", "or", "Ruxolitinib", "(", "10", "µM", ")", "-", "treated", "PBMCs", "from", "four", "individual", "donors", "were", "exposed", "to", "SARS", "-", "CoV", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "PBMCs", "inoculated", "with", "supernatant", "from", "Vero", "E6", "cell", "cultures", "mixed", "with", "PBS", "and", "OptiPro", "serum", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "0", ".", "5", "%", "gelatine", "were", "used", "as", "control", "condition", "(", "Mock", ")", ".", "Supernatants", "and", "individual", "cell", "fractions", "were", "collected", "at", "indicated", "time", "points", "post", "-", "inoculation", "and", "analyzed", "for", ":", "Viral", "RNA", "(", "genome", "equivalents", "/", "ml", ")", "concentrations", "in", "cell", "culture", "supernatants", "by", "Q", "-", "RT", "-", "PCR", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "cells", "from", "at", "least", "four", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "mock", "-", "and", "Ruxolitinib", "-", "treated", "samples", ".", "p", "-", "values", ">", "0", ".", "05", "were", "considered", "not", "significant", "and", "are", "not", "shown", "in", "the", "figure", ".", "n", ".", "d", ".", "=", "not", "detectable", ";", "h", ".", "p", ".", "e", ".", "=", "hours", "post", "-", "exposure", ";", "Ruxo", ".", "=", "Ruxolitinib", ".", "PBMCs", "from", "four", "individual", "donors", "were", "exposed", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "PBMCs", "inoculated", "with", "supernatant", "from", "Vero", "E6", "cell", "cultures", "mixed", "with", "PBS", "and", "OptiPro", "serum", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "0", ".", "5", "%", "gelatine", "were", "used", "as", "control", "condition", "(", "Mock", ")", ".", "Supernatants", "and", "individual", "cell", "fractions", "were", "collected", "at", "indicated", "time", "points", "post", "-", "inoculation", "and", "analyzed", "for", ":", "Viral", "RNA", "(", "genome", "equivalents", "/", "ml", ")", "concentrations", "in", "cell", "culture", "supernatants", "by", "Q", "-", "RT", "-", "PCR", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "cells", "from", "at", "least", "four", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "p", "-", "values", ">", "0", ".", "05", "were", "considered", "not", "significant", "and", "are", "not", "shown", "in", "the", "figure", ".", "n", ".", "d", ".", "=", "not", "detectable", ";", "h", ".", "p", ".", "e", ".", "=", "hours", "post", "-", "exposure", ";", "RMV", "=", "RemdesivirUntreated", "or", "Ruxolitinib", "(", "10", "µM", ")", "-", "treated", "PBMCs", "from", "four", "individual", "donors", "were", "exposed", "to", "SARS", "-", "CoV", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "PBMCs", "inoculated", "with", "supernatant", "from", "Vero", "E6", "cell", "cultures", "mixed", "with", "PBS", "and", "OptiPro", "serum", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "0", ".", "5", "%", "gelatine", "were", "used", "as", "control", "condition", "(", "Mock", ")", ".", "Supernatants", "and", "individual", "cell", "fractions", "were", "collected", "at", "indicated", "time", "points", "post", "-", "inoculation", "and", "analyzed", "for", ":", "(", "E", ")", "Relative", "changes", "of", "cell", "-", "associated", "viral", "genomic", "RNA", "quantities", "by", "Q", "-", "RT", "-", "PCR", "and", "normalized", "to", "RNASEP", "levels", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "cells", "from", "at", "least", "four", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "mock", "-", "and", "Ruxolitinib", "-", "treated", "samples", ".", "p", "-", "values", ">", "0", ".", "05", "were", "considered", "not", "significant", "and", "are", "not", "shown", "in", "the", "figure", ".", "h", ".", "p", ".", "e", ".", "=", "hours", "post", "-", "exposure", "Ruxo", ".", "=", "Ruxolitinib", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Untreated or Ruxolitinib (10 µM)-treated PBMCs from four individual donors were exposed to SARS-CoV or SARS-CoV-2 (MOI 0.5). PBMCs inoculated with supernatant from Vero E6 cell cultures mixed with PBS and OptiPro serum-free medium supplemented with 0.5% gelatine were used as control condition (Mock). Supernatants and individual cell fractions were collected at indicated time points post-inoculation and analyzed for: Infectivity in cell culture supernatants by plaque titration assay Data information: Data were generated in four individual experiments using cells from at least four individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M. Statistical significance was tested using paired Student's t-test comparing mock- and Ruxolitinib-treated samples. p-values > 0.05 were considered not significant and are not shown in the figure. n.d. = not detectable; h.p.e. = hours post-exposure Ruxo. = Ruxolitinib.PBMCs from four individual donors were exposed to SARS-CoV-2 (MOI 0.5). PBMCs inoculated with supernatant from Vero E6 cell cultures mixed with PBS and OptiPro serum-free medium supplemented with 0.5% gelatine were used as control condition (Mock). Supernatants and individual cell fractions were collected at indicated time points post-inoculation and analyzed for: Infectivity in cell culture supernatants by plaque titration assay Data information: Data were generated in four individual experiments using cells from at least four individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M. Statistical significance was tested using paired Student's t-test p-values > 0.05 were considered not significant and are not shown in the figure. n.d. = not detectable; h.p.e. = hours post-exposure; RMV = RemdesivirUntreated or Ruxolitinib (10 µM)-treated PBMCs from four individual donors were exposed to SARS-CoV or SARS-CoV-2 (MOI 0.5). PBMCs inoculated with supernatant from Vero E6 cell cultures mixed with PBS and OptiPro serum-free medium supplemented with 0.5% gelatine were used as control condition (Mock). Supernatants and individual cell fractions were collected at indicated time points post-inoculation and analyzed for: Viral RNA (genome equivalents/ml) concentrations in cell culture supernatants by Q-RT-PCR Data information: Data were generated in four individual experiments using cells from at least four individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M. Statistical significance was tested using paired Student's t-test comparing mock- and Ruxolitinib-treated samples. p-values > 0.05 were considered not significant and are not shown in the figure. n.d. = not detectable; h.p.e. = hours post-exposure; Ruxo. = Ruxolitinib.PBMCs from four individual donors were exposed to SARS-CoV-2 (MOI 0.5). PBMCs inoculated with supernatant from Vero E6 cell cultures mixed with PBS and OptiPro serum-free medium supplemented with 0.5% gelatine were used as control condition (Mock). Supernatants and individual cell fractions were collected at indicated time points post-inoculation and analyzed for: Viral RNA (genome equivalents/ml) concentrations in cell culture supernatants by Q-RT-PCR Data information: Data were generated in four individual experiments using cells from at least four individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M. Statistical significance was tested using paired Student's t-test p-values > 0.05 were considered not significant and are not shown in the figure. n.d. = not detectable; h.p.e. = hours post-exposure; RMV = RemdesivirUntreated or Ruxolitinib (10 µM)-treated PBMCs from four individual donors were exposed to SARS-CoV or SARS-CoV-2 (MOI 0.5). PBMCs inoculated with supernatant from Vero E6 cell cultures mixed with PBS and OptiPro serum-free medium supplemented with 0.5% gelatine were used as control condition (Mock). Supernatants and individual cell fractions were collected at indicated time points post-inoculation and analyzed for: (E) Relative changes of cell-associated viral genomic RNA quantities by Q-RT-PCR and normalized to RNASEP levels. Data information: Data were generated in four individual experiments using cells from at least four individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M. Statistical significance was tested using paired Student's t-test comparing mock- and Ruxolitinib-treated samples. p-values > 0.05 were considered not significant and are not shown in the figure. h.p.e. = hours post-exposure Ruxo. = Ruxolitinib."}
{"words": ["Figure", "2RNA", "extracted", "from", "Ruxolitinib", "-", "treated", "or", "mock", "-", "treated", ",", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "PBMCs", "was", "analyzed", "for", "(", "A", ")", "IFIT1", ",", "(", "B", ")", "IFNA1", "and", "IFNB1", "mRNA", "expression", "by", "Q", "-", "RT", "-", "PCR", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Suspension", "and", "adherent", "cell", "fractions", "were", "analyzed", "separately", ",", "except", "at", "the", "four", "hours", "time", "point", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "cellular", "RNASEP", "expression", "and", "are", "shown", "as", "fold", "change", "over", "mock", "-", "inoculated", "conditions", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "expression", "level", "of", "mock", "-", "inoculated", "cell", "cultures", "and", "is", "set", "to", "1", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "PBMCs", "from", "four", "or", "more", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", "(", "A", "-", "B", "Statistical", "significance", "between", "mock", "-", "and", "Ruxolitinib", "-", "treated", "samples", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "testing", "and", "comparing", "SARS", "-", "CoV", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "treated", "samples", "from", "the", "same", "donor", "and", "time", "points", ".", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "significant", "(", "*", ")", ",", "<", "0", ".", "01", "very", "significant", "(", "*", "*", ")", "or", "≥", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "not", "shown", ")", ".", "(", "C", ")", "Supernatants", "from", "Ruxolitinib", "-", "or", "mock", "-", "treated", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "or", "mock", "-", "inoculated", "PBMCs", "were", "collected", "48", "hours", "post", "exposure", "and", "cytokine", "expression", "of", "IFN", "-", "α2", ",", "IP", "-", "10", "/", "CXCL10", ",", "MCP", "-", "1", "/", "CCL2", "and", "MCP", "-", "3", "/", "CCL7", "were", "quantified", "using", "a", "Luminex", "-", "based", "immunoassay", ".", "PHA", "-", "or", "LPS", "-", "treated", "PBMCs", "were", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "Bars", "represent", "the", "results", "of", "a", "pool", "of", "four", "individual", "samples", "per", "condition", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "PBMCs", "from", "four", "or", "more", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "Statistical", "significance", "between", "mock", "-", "and", "Ruxolitinib", "-", "treated", "samples", "was", "tested", "using", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "testing", "and", "comparing", "SARS", "-", "CoV", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "treated", "samples", "from", "the", "same", "donor", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "significant", "(", "*", ")", ",", "<", "0", ".", "01", "very", "significant", "(", "*", "*", ")", "or", "≥", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "not", "shown", ")", ".", "n", ".", "d", ".", "=", "not", "detectable", ".", "(", "D", ")", "Supernatants", "collected", "from", "SARS", "-", "CoV", "-", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "or", "mock", "-", "exposed", "PBMCs", "at", "indicated", "time", "points", "were", "analyzed", "for", "the", "release", "of", "bioactive", "IFN", "using", "the", "HL116", "reporter", "cell", "assay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "generated", "in", "four", "individual", "experiments", "using", "PBMCs", "from", "four", "or", "more", "individual", "donors", "represented", "by", "different", "symbols", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "significant", "(", "*", ")", ",", "<", "0", ".", "01", "very", "significant", "(", "*", "*", ")", "or", "≥", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "not", "shown", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2RNA extracted from Ruxolitinib-treated or mock-treated, and SARS-CoV-, SARS-CoV-2- PBMCs was analyzed for (A) IFIT1, (B) IFNA1 and IFNB1 mRNA expression by Q-RT-PCR at indicated time points. Suspension and adherent cell fractions were analyzed separately, except at the four hours time point. Values were normalized to cellular RNASEP expression and are shown as fold change over mock-inoculated conditions. The dotted line indicates the expression level of mock-inoculated cell cultures and is set to 1. Data information: Data were generated in four individual experiments using PBMCs from four or more individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M (A-B Statistical significance between mock- and Ruxolitinib-treated samples was tested using paired Student's t-testing and comparing SARS-CoV to SARS-CoV-2-treated samples from the same donor and time points. P-values < 0.05 were considered significant (*), < 0.01 very significant (**) or ≥ 0.05 not significant (not shown).(C) Supernatants from Ruxolitinib- or mock-treated and SARS-CoV-, SARS-CoV-2 or mock-inoculated PBMCs were collected 48 hours post exposure and cytokine expression of IFN-α2, IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2 and MCP-3/CCL7 were quantified using a Luminex-based immunoassay. PHA- or LPS-treated PBMCs were used as a positive control. Bars represent the results of a pool of four individual samples per condition. Data information: Data were generated in four individual experiments using PBMCs from four or more individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, Statistical significance between mock- and Ruxolitinib-treated samples was tested using paired Student's t-testing and comparing SARS-CoV to SARS-CoV-2-treated samples from the same donor P-values < 0.05 were considered significant (*), < 0.01 very significant (**) or ≥ 0.05 not significant (not shown). n.d. = not detectable.(D) Supernatants collected from SARS-CoV-, SARS-CoV-2- or mock-exposed PBMCs at indicated time points were analyzed for the release of bioactive IFN using the HL116 reporter cell assay. Data information: Data were generated in four individual experiments using PBMCs from four or more individual donors represented by different symbols, bars represent the mean, error bars indicate the S.E.M P-values < 0.05 were considered significant (*), < 0.01 very significant (**) or ≥ 0.05 not significant (not shown)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Pseudotime", "cell", "trajectory", "analysis", "and", "GSEA", "analysis", "using", "genes", "differentially", "regulated", "between", "mock", "-", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "challenged", "conditions", "for", "indicated", "cell", "types", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "B", ")", "Representative", "UMAPs", "showing", "IFIT1", "and", "ISG15", "mRNA", "expression", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "C", ")", "Volcano", "plot", "of", "all", "DEGs", "in", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "exposed", "cells", "compared", "to", "mock", "-", "exposed", "cells", "in", "the", "indicated", "cell", "types", ".", "Known", "ISGs", "were", "colored", "in", "green", "based", "on", "their", "presence", "in", "the", "interferome", "database", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "D", ")", "Cell", "trajectory", "maps", "of", "indicated", "cell", "types", "with", "cells", "colored", "by", "expression", "of", "the", "genes", "in", "an", "IFN", "-", "module", "gene", "set", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "E", ")", "Dot", "plot", "depicting", "expression", "of", "selected", "ISGs", "and", "cytokines", ".", "Expression", "levels", "are", "color", "-", "coded", ",", "the", "percentage", "of", "cells", "expressing", "the", "respective", "gene", "is", "coded", "by", "symbol", "size", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Pseudotime cell trajectory analysis and GSEA analysis using genes differentially regulated between mock-, SARS-CoV- and SARS-CoV-2-challenged conditions for indicated cell types. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(B) Representative UMAPs showing IFIT1 and ISG15 mRNA expression in the indicated conditions. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(C) Volcano plot of all DEGs in SARS-CoV-2-exposed cells compared to mock-exposed cells in the indicated cell types. Known ISGs were colored in green based on their presence in the interferome database Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(D) Cell trajectory maps of indicated cell types with cells colored by expression of the genes in an IFN-module gene set. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(E) Dot plot depicting expression of selected ISGs and cytokines. Expression levels are color-coded, the percentage of cells expressing the respective gene is coded by symbol size. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "showing", "the", "absolute", "number", "(", "bars", ")", "and", "relative", "percentage", "of", "cells", "that", "were", "identified", "as", "virus", "RNA", "-", "Positive", "in", "SARS", "-", "CoV", "-", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "inoculated", "cultures", ",", "respectively", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "D", ")", "Plot", "of", "Log10", "average", "expression", "of", "genes", "showing", "a", "Log2", "(", "fold", "change", ")", ">", "0", ".", "2", "in", "viral", "RNA", "-", "Positive", "versus", "viral", "RNA", "-", "Negative", "monocytes", "from", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "(", "left", "panel", ")", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "(", "right", "panel", ")", "inoculated", "PBMCs", "with", "genes", "showing", "the", "highest", "expression", "fold", "change", "between", "both", "conditions", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", ".", "(", "E", ")", "IFN", "Module", "Score", "of", "viral", "-", "RNA", "-", "negative", "(", "grey", ";", "715", "and", "958", "cells", "in", "SARS", "-", "CoV", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "exposed", "cultures", ",", "respectively", ")", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "RNA", "-", "Positive", "(", "blue", ";", "56", "cells", ")", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "RNA", "-", "Positive", "(", "magenta", ";", "173", "cells", ")", "monocytes", ".", "Statistical", "significance", "was", "tested", "using", "a", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", "with", "continuity", "correction", ".", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "significant", "(", "*", ")", ",", "<", "0", ".", "01", "very", "significant", "(", "*", "*", ")", "or", "≥", "0", ".", "05", "not", "significant", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "in", "this", "figure", "are", "based", "on", "the", "analysis", "of", "two", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Bar graph showing the absolute number (bars) and relative percentage of cells that were identified as virus RNA-Positive in SARS-CoV- and SARS-CoV-2-inoculated cultures, respectively. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(D) Plot of Log10 average expression of genes showing a Log2(fold change) >0.2 in viral RNA-Positive versus viral RNA-Negative monocytes from the SARS-CoV- (left panel) and SARS-CoV-2- (right panel) inoculated PBMCs with genes showing the highest expression fold change between both conditions. Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors.(E) IFN Module Score of viral-RNA-negative (grey; 715 and 958 cells in SARS-CoV and SARS-CoV-2 exposed cultures, respectively), SARS-CoV-RNA-Positive (blue; 56 cells) and SARS-CoV-2-RNA-Positive (magenta; 173 cells) monocytes. Statistical significance was tested using a Wilcoxon rank sum test with continuity correction. P-values < 0.05 were considered significant (*), < 0.01 very significant (**) or ≥ 0.05 not significant Data information: Data shown in this figure are based on the analysis of two donors."}
{"words": ["Figure", "1Results", "of", "the", "ELISAs", "used", "to", "determine", "IFN", "-", "β", "(", "A", ")", "secretion", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", "-", "1", ",", "siRNF34", "-", "2", "or", "siRNF34", "-", "3", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "of", "the", "ELISAs", "used", "to", "determine", "IL6", "(", "B", ")", "secretion", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", "-", "1", ",", "siRNF34", "-", "2", "or", "siRNF34", "-", "3", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "(", "C", ")", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "E3", "ligase", "-", "dead", "mutant", "H342A", "followed", "by", "VSV", "infection", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ",", "and", "luciferase", "activity", "was", "reported", "as", "the", "fold", "induction", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "NF", "-", "κB", "(", "D", ")", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "E3", "ligase", "-", "dead", "mutant", "H342A", "followed", "by", "VSV", "infection", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ",", "and", "luciferase", "activity", "was", "reported", "as", "the", "fold", "induction", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Plaque", "assay", "of", "VSV", "loads", "in", "supernatants", "from", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", ",", "shRNF34", "-", "1", ",", "shRNF34", "-", "2", "or", "shRNF34", "-", "3", "and", "subsequently", "infected", "with", "VSV", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Microscopy", "images", "of", "shCtrl", "-", ",", "shRNF34", "-", "1", "-", ",", "shRNF34", "-", "2", "-", "or", "shRNF34", "-", "3", "cells", "infected", "with", "NDV", "-", "GFP", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Gray", "represents", "cells", ";", "green", "represents", "NDV", ".", "Scale", "bar", ",", "300", "μm", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "phosphorylated", "(", "p", ")", "and", "total", "IRF3", ",", "TBK1", ",", "and", "VSV", "-", "G", "proteins", "in", "PMA", "-", "differentiated", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "the", "IFN", "-", "β", "(", "H", ")", "mRNAs", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "results", "were", "normalized", "to", "the", "values", "obtained", "prior", "to", "VSV", "infection", ".", "(", "I", ")", "Results", "of", "the", "ELISA", "used", "to", "determine", "IFN", "-", "β", "secretion", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "ELISA", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "the", "IL8", ",", "ISG54", "and", "ISG56", "(", "J", ")", "mRNAs", "in", "PBMCs", "transfected", "with", "siCtrl", "or", "siRNF34", "-", "1", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "The", "results", "were", "normalized", "to", "the", "values", "obtained", "prior", "to", "VSV", "infection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Results of the ELISAs used to determine IFN-β (A) secretion in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34-1, siRNF34-2 or siRNF34-3 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Results of the ELISAs used to determine IL6 (B) secretion in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34-1, siRNF34-2 or siRNF34-3 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Luciferase activity driven by the IFN-β (C) promoter in HEK293T cells transfected with Flag-RNF34 or its E3 ligase-dead mutant H342A followed by VSV infection for the indicated times. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection, and luciferase activity was reported as the fold induction. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.Luciferase activity driven by the NF-κB (D) promoter in HEK293T cells transfected with Flag-RNF34 or its E3 ligase-dead mutant H342A followed by VSV infection for the indicated times. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection, and luciferase activity was reported as the fold induction. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(E) Plaque assay of VSV loads in supernatants from cells transfected with shCtrl, shRNF34-1, shRNF34-2 or shRNF34-3 and subsequently infected with VSV. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Microscopy images of shCtrl-, shRNF34-1-, shRNF34-2- or shRNF34-3 cells infected with NDV-GFP (MOI = 1.0) for the indicated times. Gray represents cells; green represents NDV. Scale bar, 300 μm.(G) Immunoblot showing the levels of the phosphorylated (p) and total IRF3, TBK1, and VSV-G proteins in PMA-differentiated THP-1 cells transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times.RT-PCR analysis of the expression of the IFN-β (H) mRNAs in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. The results were normalized to the values obtained prior to VSV infection.(I) Results of the ELISA used to determine IFN-β secretion in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. ELISA data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-test was used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.RT-PCR analysis of the expression of the IL8, ISG54 and ISG56 (J) mRNAs in PBMCs transfected with siCtrl or siRNF34-1 oligos and infected with VSV for the indicated times. The results were normalized to the values obtained prior to VSV infection."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "ISRE", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "V", ",", "Flag", "-", "N", "-", "RIG", "-", "I", ",", "Flag", "-", "MAVS", ",", "Flag", "-", "STING", "or", "Flag", "-", "TBK1", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Y2H", "analysis", "in", "the", "AH109", "yeast", "strain", "co", "-", "transformed", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "A", "positive", "RNF34", "-", "MAVS", "interaction", "resulted", "in", "colony", "formation", "on", "synthetic", "medium", "lacking", "tryptophan", ",", "leucine", ",", "adenine", ",", "and", "histidine", "containing", "X", "-", "gal", ".", "pGBKT7", "-", "TP53", "+", "pGADT7", "-", "T", "and", "pGBKT7", "-", "lam", "+", "pGADT7", "-", "T", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "AH109", "co", "-", "transfected", "with", "pGBKT7", "-", "RNF34", "+", "pACT", "-", "2", "was", "used", "to", "exclude", "the", "self", "-", "activation", "of", "RNF34", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "V", ".", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "agarose", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "D", ")", "GST", "-", "tagged", "RNF34", "was", "subjected", "to", "a", "pull", "-", "down", "assay", "with", "HEK293T", "cell", "lysates", ".", "Immunoblot", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "are", "shown", "in", "the", "top", "panel", ".", "Loading", "of", "the", "GST", "proteins", "assessed", "using", "Coomassie", "blue", "staining", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "GST", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "(", "E", ")", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "immunoprecipitates", "prepared", "from", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "vector", "-", "expressing", "plasmids", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "blotted", "onto", "a", "nitrocellulose", "membrane", ".", "The", "nitrocellulose", "membrane", "was", "incubated", "with", "soluble", "GST", "-", "RNF34", "(", "upper", "panel", ")", "or", "GST", "(", "middle", "panel", ")", "for", "2", "hrs", "and", "then", "analyzed", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "Flag", "-", "RNF34", "colocalization", "with", "endogenous", "MAVS", "in", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "12", "hrs", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "RNF34", "protein", "in", "THP", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "H", ")", "In", "situ", "PLA", "assay", "of", "the", "RNF34", "-", "MAVS", "complex", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", "using", "an", "anti", "-", "RNF34", "or", "anti", "-", "MAVS", "antibody", ".", "RNF34", "-", "MAVS", "complex", ",", "red", ";", "nuclei", ",", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "One", "hundred", "cells", "were", "counted", ",", "and", "the", "quantification", "of", "PLA", "signals", "per", "cell", "is", "shown", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "J", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "RNF34", "and", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "mMAVS", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Luciferase activity driven by the ISRE promoter in HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-V, Flag-N-RIG-I, Flag-MAVS, Flag-STING or Flag-TBK1. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(B) Y2H analysis in the AH109 yeast strain co-transformed with the indicated plasmids. A positive RNF34-MAVS interaction resulted in colony formation on synthetic medium lacking tryptophan, leucine, adenine, and histidine containing X-gal. pGBKT7-TP53+pGADT7-T and pGBKT7-lam+pGADT7-T were used as positive and negative controls, respectively. AH109 co-transfected with pGBKT7-RNF34+pACT-2 was used to exclude the self-activation of RNF34.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-MAVS or Flag-V. Anti-Flag or IgG agarose immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody.(D) GST-tagged RNF34 was subjected to a pull-down assay with HEK293T cell lysates. Immunoblot with an anti-MAVS antibody are shown in the top panel. Loading of the GST proteins assessed using Coomassie blue staining is shown in the bottom panel. GST was used as a negative control.(E) Anti-Flag or IgG immunoprecipitates prepared from cells transfected with Flag-MAVS or Flag-vector-expressing plasmids were subjected to SDS-PAGE and blotted onto a nitrocellulose membrane. The nitrocellulose membrane was incubated with soluble GST-RNF34 (upper panel) or GST (middle panel) for 2 hrs and then analyzed with anti-Flag antibody.(F) Representative confocal images of immunofluorescence staining for Flag-RNF34 colocalization with endogenous MAVS in THP-1 cells infected with VSV for 12 hrs. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) Immunoblot showing the levels of the RNF34 protein in THP-1 cells infected with VSV (MOI = 1.0) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control.(H) In situ PLA assay of the RNF34-MAVS complex in HEK293T cells infected with VSV (MOI =1.0) for the indicated times using an anti-RNF34 or anti-MAVS antibody. RNF34-MAVS complex, red; nuclei, blue. Scale bar, 5 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) One hundred cells were counted, and the quantification of PLA signals per cell is shown. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(J) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Myc-RNF34 and Flag-MAVS or Flag-mMAVS. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with anti-Myc or anti-Flag antibody."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "Myc", "-", "Ub", "together", "with", "HA", "-", "RNF34", "or", "HA", "-", "H342A", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "HA", "-", "RNF34", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "(", "K6", ",", "K11", ",", "K27", ",", "K29", ",", "K33", ",", "K48", ",", "or", "K63", "only", ")", "as", "indicated", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "and", "HA", "-", "RNF34", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "(", "wild", "-", "type", ",", "WT", ";", "Lys", "-", "to", "-", "Arg", "mutants", "of", "all", "Ub", "lysines", ",", "KO", ";", "K27", "/", "29R", ")", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "K27", "ubiquitination", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoprecipitation analysis in HEK293T cells expressing Flag-MAVS and Myc-Ub together with HA-RNF34 or HA-H342A. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. The levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS and HA-RNF34 together with Myc-Ub (K6, K11, K27, K29, K33, K48, or K63 only) as indicated. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS and HA-RNF34 together with Myc-Ub (wild-type, WT; Lys-to-Arg mutants of all Ub lysines, KO; K27/29R). Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Immunoprecipitation analysis of K27 ubiquitination of MAVS in HEK293T cells infected with VSV for the indicated times. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Immunoprecipitation analysis of siCtrl- or siRNF34-1-transfected cells infected with VSV for the indicated times. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti-Ub-K27 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "4Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Lys", "to", "Arg", "mutants", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "and", "HA", "-", "RNF34", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", ",", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "4KR", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "Ub", "and", "HA", "-", "RNF34", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "by", "performing", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "K311R", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "RNF34", "and", "/", "or", "Myc", "-", "TRIM31", "following", "a", "3MA", "(", "0", ".", "2", "mM", ")", "treatment", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Flag", ",", "anti", "-", "Ub", "-", "K63", "or", "anti", "-", "Ub", "-", "K27", "antibody", ".", "Levels", "of", "the", "transfected", "proteins", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "ell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "ubiquitination", "of", "endogenous", "MAVS", "in", "THP", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "siCtrl", ",", "siRNF34", ",", "or", "siTRIM31", "oligos", "and", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "endogenous", "interaction", "of", "MAVS", "-", "TRIM31", "and", "MAVS", "-", "RNF34", "in", "PBMCs", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or Lys to Arg mutants together with Myc-Ub and HA-RNF34. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA, anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or 4KR mutant together with Myc-Ub and HA-RNF34. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Ub-K27 antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed by performing immunoblotting with an anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells expressing Flag-MAVS or K311R mutant together with HA-RNF34 and/or Myc-TRIM31 following a 3MA (0.2 mM) treatment. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Flag, anti-Ub-K63 or anti-Ub-K27 antibody. Levels of the transfected proteins were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. ell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Co-immunoprecipitation analysis of the ubiquitination of endogenous MAVS in THP-1 cells transfected with siCtrl, siRNF34, or siTRIM31 oligos and infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Co-immunoprecipitation analysis of the endogenous interaction of MAVS-TRIM31 and MAVS-RNF34 in PBMCs infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "degradation", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "subjected", "to", "VSV", "infection", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "degradation", "of", "MAVS", "in", "HEK293T", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "for", "the", "indicated", "times", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NH4Cl", "(", "3", "mM", ")", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "mMAVS", "together", "with", "Myc", "-", "RNF34", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "increasing", "amounts", "of", "Myc", "-", "RNF34", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "with", "increasing", "amounts", "of", "HA", "-", "RNF34", "or", "its", "H342A", "mutant", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "together", "with", "WT", "Myc", "-", "RNF34", "or", "its", "ligase", "-", "dead", "mutant", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "MG132", "(", "10", "μM", ")", ",", "3", "-", "MA", "(", "1", "mM", ")", "or", "NH4Cl", "(", "3", "mM", ")", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "cells", "using", "an", "anti", "-", "MAVS", "antibody", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "-", "transfected", "PBMCs", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "THP", "-", "1", "cells", "expressing", "Flag", "-", "MAVS", "or", "the", "K311R", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "RNF34", "or", "Myc", "-", "TRIM31", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot showing the degradation of MAVS in HEK293T cells subjected to VSV infection (MOI = 1.0) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoblot showing the degradation of MAVS in HEK293T cells infected with VSV (MOI = 1.0) for the indicated times in the presence or absence of NH4Cl (3 mM). α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(C) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS or Flag-mMAVS together with Myc-RNF34. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS or its 4KR mutant together with increasing amounts of Myc-RNF34. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing Flag-MAVS with increasing amounts of HA-RNF34 or its H342A mutant. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in HEK293T cells expressing Flag-MAVS together with WT Myc-RNF34 or its ligase-dead mutant and cultured in the presence or absence of MG132 (10 μM), 3-MA (1 mM) or NH4Cl (3 mM). SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in siCtrl- or siRNF34-1-transfected cells using an anti-MAVS antibody. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(H) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siRNF34-1-transfected PBMCs. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in THP-1 cells expressing Flag-MAVS or the K311R mutant together with Myc-RNF34 or Myc-TRIM31. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", "or", "its", "I431A", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", ".", "Anti", "-", "Flag", "or", "IgG", "agarose", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", "or", "its", "I431A", "mutant", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "SQSTM1", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "D", ")", "Luciferase", "activity", "driven", "by", "the", "IFN", "-", "β", "promoter", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Flag", "-", "NDP52", "or", "its", "D439R", "/", "C443K", "mutant", ".", "Luciferase", "assays", "were", "performed", "24", "hrs", "after", "transfection", ".", "The", "luciferase", "reporter", "data", "are", "presented", "as", "means", "±", "SEM", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "statistical", "analyses", ":", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "and", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "MAVS", "or", "its", "4KR", "mutant", "together", "with", "Myc", "-", "NDP52", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "Myc", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "DNP52", "-", "RNF34", "interaction", "in", "cells", "infected", "with", "VSV", ".", "Anti", "-", "DNP52", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "DNP52", "or", "anti", "-", "RNF34", "antibody", ".", "The", "WCL", "was", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "RNF34", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "G", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "Flag", "-", "NDP52", "and", "HA", "-", "RNF34", "in", "WT", "or", "MAVS", "-", "/", "-", "cells", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "NDP52", "or", "its", "D439R", "/", "C443K", "mutant", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", "followed", "by", "VSV", "infection", ".", "Anti", "-", "Flag", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "I", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "expressing", "Flag", "-", "RNF34", "or", "Flag", "-", "V", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "J", ")", "Immunoblot", "showing", "the", "levels", "of", "the", "MAVS", "protein", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ",", "12", "hrs", ")", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "K", ")", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "MAVS", "-", "LC3", "interaction", "in", "siCtrl", "-", "or", "siNDP52", "-", "transfected", "cells", "infected", "with", "VSV", ".", "Anti", "-", "MAVS", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "using", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "MAVS", "or", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "NDP52", "levels", "were", "analyzed", "by", "performing", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "NDP52", "antibody", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-SQSTM1 or its I431A mutant together with HA-MAVS. Anti-Flag or IgG agarose immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Luciferase activity driven by the IFN-β promoter in HEK293T cells transfected with HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-SQSTM1 or its I431A mutant. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(C) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in HEK293T cells expressing HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-SQSTM1. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(D) Luciferase activity driven by the IFN-β promoter in HEK293T cells transfected with HA-MAVS or its 4KR mutant together with Flag-NDP52 or its D439R/C443K mutant. Luciferase assays were performed 24 hrs after transfection. The luciferase reporter data are presented as means ± SEM. Two-tailed Student's t-tests were used for statistical analyses: *, P < 0.05; **, P < 0.01; and ***, P < 0.001.(E) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-MAVS or its 4KR mutant together with Myc-NDP52. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-Myc or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Immunoprecipitation analysis of the DNP52-RNF34 interaction in cells infected with VSV. Anti-DNP52 immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-DNP52 or anti-RNF34 antibody. The WCL was immunoblotted with an anti-MAVS or anti- RNF34 antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(G) Immunoprecipitation analysis of the interaction between Flag-NDP52 and HA-RNF34 in WT or MAVS-/- cells. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(H) Immunoprecipitation analysis of HEK293T cells transfected with Flag-NDP52 or its D439R/C443K mutant together with HA-MAVS followed by VSV infection. Anti-Flag immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-HA or anti-Flag antibody. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(I) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siNDP52-transfected cells expressing Flag-RNF34 or Flag-V. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(J) Immunoblot showing the levels of the MAVS protein in siCtrl- or siNDP52-transfected cells infected with VSV (MOI = 1, 12 hrs). α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(K) Immunoprecipitation analysis of the MAVS-LC3 interaction in siCtrl- or siNDP52-transfected cells infected with VSV. Anti-MAVS immunoprecipitates were analyzed using immunoblotting with an anti-MAVS or anti-LC3 antibody. NDP52 levels were analyzed by performing immunoblotting with an anti-NDP52 antibody. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunoblot", "showing", "MAVS", ",", "IRF3", "-", "p", ",", "LC3", ",", "TOM20", "and", "HSP60", "levels", "in", "siCtrl", "-", "or", "siRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "Z", "-", "VAD", "(", "50", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "showing", "MAVS", ",", "LC3", ",", "TOM20", "and", "HSP60", "levels", "in", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "RNF34", "or", "its", "H342A", "mutant", "and", "subsequently", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "Representative", "confocal", "images", "(", "C", ")", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "NDP52", "colocalization", "with", "MAVS", "in", "shCtrl", "-", "or", "shRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Red", "represents", "MAVS", "and", "green", "represents", "NDP52", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "quantification", "(", "D", ")", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "NDP52", "colocalization", "with", "MAVS", "in", "shCtrl", "-", "or", "shRNF34", "-", "1", "cells", "infected", "with", "VSV", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "E", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "images", "of", "shCtrl", "-", "and", "shRNF34", "-", "1", "HEK293T", "cells", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "VSV", ".", "Arrows", "indicate", "mitochondria", "engulfed", "in", "autophagosomes", ".", "Double", "arrows", "indicate", "swollen", "mitochondria", "with", "disrupted", "cristae", ".", "M", ",", "mitochondria", "and", "N", ",", "nucleus", ".", "40000", "×", "magnification", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "the", "shift", "in", "the", "fluorescence", "emission", "of", "Keima", "from", "458", "nm", "to", "543", "nm", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Cell", "-", "based", "studies", "were", "performed", "independently", "at", "least", "three", "times", "with", "comparable", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunoblot showing MAVS, IRF3-p, LC3, TOM20 and HSP60 levels in siCtrl- or siRNF34-1 cells infected with VSV and cultured in the presence of Z-VAD (50 μM) for the indicated times. α-Tubulin was used as a loading control. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(B) Immunoblot showing MAVS, LC3, TOM20 and HSP60 levels in cells transfected with Flag-RNF34 or its H342A mutant and subsequently infected with VSV for the indicated times. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.Representative confocal images (C) of immunofluorescence staining for NDP52 colocalization with MAVS in shCtrl- or shRNF34-1 cells infected with VSV for the indicated times. Red represents MAVS and green represents NDP52. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.quantification (D) of immunofluorescence staining for NDP52 colocalization with MAVS in shCtrl- or shRNF34-1 cells infected with VSV for the indicated times. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(E) Transmission electron microscopy images of shCtrl- and shRNF34-1 HEK293T cells cultured in the presence or absence of VSV. Arrows indicate mitochondria engulfed in autophagosomes. Double arrows indicate swollen mitochondria with disrupted cristae. M, mitochondria and N, nucleus. 40000× magnification. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results.(F) Representative confocal images of the shift in the fluorescence emission of Keima from 458 nm to 543 nm. Scale bar, 10 μm. Cell-based studies were performed independently at least three times with comparable results."}
{"words": ["Figure", "1Colony", "formation", "assay", "of", "miRNA", "mimic", "transfected", "-", "Dgcr8", "-", "/", "-", "ESCs", ".", "There", "were", "17", "miRNAs", "that", "decreased", "the", "colony", "forming", "ability", ",", "15", "miRNAs", "that", "did", "not", "affect", "colony", "formation", "and", "8", "miRNAs", "enhanced", "colony", "formation", "of", "ESCs", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", ".", "Full", "data", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Colony formation assay of miRNA mimic transfected-Dgcr8-/- ESCs. There were 17 miRNAs that decreased the colony forming ability, 15 miRNAs that did not affect colony formation and 8 miRNAs enhanced colony formation of ESCs. Representative pictures are shown. Full data are shown in Supplementary Fig S1."}
{"words": ["Figure", "2Alkaline", "phosphatase", "staining", "of", "ESCs", "after", "miRNA", "mimic", "transfection", ".", "There", "were", "21", "miRNAs", "that", "decreased", "the", "AP", "activity", ",", "11", "miRNAs", "that", "mildly", "affected", "the", "AP", "activity", "and", "8", "miRNAs", "boosted", "the", "AP", "activity", "of", "ESCs", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", ".", "Full", "data", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S2", ".", "Cell", "cycle", "distribution", "in", "representative", "miRNAs", "evoking", "G1", "phase", "accumulation", "in", "miRNA", "mimic", "transfected", "Dgcr8", "-", "/", "-", "ESCs", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Full", "data", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S3A", ",", "B", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "Oct4", "in", "miRNA", "mimic", "transfected", "ESCs", ".", "20", "miRNAs", "decreased", "Oct4", "expression", "and", "produced", "small", "and", "grossly", "differentiated", "cell", "colonies", ",", "12", "miRNAs", "mildly", "affected", "Oct4", "expression", ",", "and", "8", "miRNAs", "improved", "Oct4", "expression", "and", "yielded", "compact", "and", "undifferentiated", "cell", "colonies", ".", "Representative", "pictures", "are", "shown", ".", "Full", "data", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S3C", ".", "AP", "staining", "of", "V6", ".", "5", "ESCs", "after", "mimic", "transfection", "(", "Full", "data", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S4B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Alkaline phosphatase staining of ESCs after miRNA mimic transfection. There were 21 miRNAs that decreased the AP activity, 11 miRNAs that mildly affected the AP activity and 8 miRNAs boosted the AP activity of ESCs. Representative pictures are shown. Full data are shown in Supplementary Fig S2.Cell cycle distribution in representative miRNAs evoking G1 phase accumulation in miRNA mimic transfected Dgcr8-/- ESCs. Error bars indicate s. d. (n=3). Full data are shown in Supplementary Fig S3A, B.Immunofluorescence staining of Oct4 in miRNA mimic transfected ESCs. 20 miRNAs decreased Oct4 expression and produced small and grossly differentiated cell colonies, 12 miRNAs mildly affected Oct4 expression, and 8 miRNAs improved Oct4 expression and yielded compact and undifferentiated cell colonies. Representative pictures are shown. Full data are shown in Supplementary Fig S3C.AP staining of V6.5 ESCs after mimic transfection (Full data are shown in Supplementary Fig S4B)."}
{"words": ["Figure", "3B", ",", "C", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "23a", ",", "miR", "-", "27a", "and", "miR", "-", "24", "during", "EB", "formation", "(", "B", ")", "and", "RA", "induced", "differentiation", "of", "V6", ".", "5", "ESCs", "(", "C", ")", ".", "The", "heatmap", "was", "representive", "of", "the", "results", "of", "quantitative", "analysis", ".", "D", ",", "E", ".", "The", "expression", "of", "primary", "miR", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", "transcript", "during", "EB", "formation", "(", "D", ")", "and", "RA", "induced", "differentiation", "(", "E", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "The", "expression", "of", "primary", "miR", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", "transcript", "during", "EB", "formation", "(", "D", ")", "and", "RA", "induced", "differentiation", "(", "E", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "F", ".", "Q", "-", "PCR", "analysis", "of", "miR", "-", "23a", ",", "miR", "-", "27a", "and", "miR", "-", "24", "expression", "in", "ESCs", "(", "JM8A3", ")", "and", "a", "variety", "of", "C57BL", "/", "6J", "adult", "tissues", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "Oct4", ",", "Sox2", "and", "Nanog", "in", "miRNA", "mimic", "transfected", "Dgcr8", "-", "/", "-", "ESCs", "and", "wild", "-", "type", "ESCs", ".", "H", ",", "I", ".", "Oct4", ",", "Nanog", ",", "Foxa2", ",", "Gata2", "and", "Nestin", "immunofluorescence", "staining", "of", "mimic", "transfected", "Dgcr8", "-", "/", "-", "(", "H", ")", "and", "wild", "-", "type", "ESCs", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B,C. Northern blot analysis of the expression of miR-23a, miR-27a and miR-24 during EB formation (B) and RA induced differentiation of V6.5 ESCs (C). The heatmap was representive of the results of quantitative analysis.D,E. The expression of primary miR-23a~27a~24-2 transcript during EB formation (D) and RA induced differentiation (E). Error bars indicate s.d. (n=3).D,E. The expression of primary miR-23a~27a~24-2 transcript during EB formation (D) and RA induced differentiation (E). Error bars indicate s.d. (n=3).F. Q-PCR analysis of miR-23a, miR-27a and miR-24 expression in ESCs (JM8A3) and a variety of C57BL/6J adult tissues. Data are shown as mean + s.d. (n=3).G. Relative protein levels of Oct4, Sox2 and Nanog in miRNA mimic transfected Dgcr8-/- ESCs and wild- type ESCs.H,I. Oct4, Nanog, Foxa2, Gata2 and Nestin immunofluorescence staining of mimic transfected Dgcr8-/- (H) and wild- type ESCs(I)."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "target", "genes", "in", "miR", "-", "27a", "or", "miR", "-", "24", "over", "-", "expressed", "V6", ".", "5", "ESCs", ".", "Candidate", "target", "genes", "whose", "expression", "was", "decreased", "were", "framed", ".", "The", "relative", "luciferase", "activity", "of", "the", "reporter", "constructs", "co", "-", "transfected", "with", "scramble", "or", "miR", "-", "27a", "and", "miR", "-", "24", "mimics", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "Candidate", "target", "genes", "whose", "luciferase", "activity", "was", "decreased", "were", "framed", ".", "PC", "group", "was", "positive", "reporter", "control", "which", "harbored", "reverse", "complementary", "sequence", "of", "miR", "-", "27a", "or", "miR", "-", "24", ".", "The", "relative", "luciferase", "activity", "of", "the", "wild", "-", "type", "3", "′", "UTR", "or", "mutated", "3", "′", "UTR", "reporter", "co", "-", "transfected", "with", "scramble", "or", "miR", "-", "27a", "and", "miR", "-", "24", "mimics", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ",", "G", "RT", "-", "PCR", "and", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "in", "vivo", "binding", "of", "the", "miRNAs", "with", "their", "targets", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "H", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "c", "-", "Myc", "expression", "in", "siRNA", "treated", "V6", ".", "5", "ESCs", ".", "I", ".", "Q", "-", "PCR", "analysis", "of", "primary", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", ",", "miR", "-", "23a", ",", "miR", "-", "27a", "and", "miR", "-", "24", "expression", "in", "c", "-", "Myc", "knocked", "down", "ESCs", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "K", ".", "ChIP", "-", "PCR", "and", "ChIP", "-", "q", "-", "PCR", "analysis", "of", "c", "-", "Myc", "binding", "to", "the", "putative", "sites", "in", "the", "promoter", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "L", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "of", "the", "wild", "-", "type", "and", "-", "15", "binding", "site", "mutated", "promoter", "in", "NIH3T3", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "c", "-", "Myc", "or", "the", "blank", "vector", "(", "NC", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ".", "M", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "of", "wild", "-", "type", "and", "-", "15", "binding", "site", "mutated", "promoter", "in", "V6", ".", "5", "ESCs", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis of the expression of target genes in miR-27a or miR-24 over-expressed V6.5 ESCs. Candidate target genes whose expression was decreased were framed.The relative luciferase activity of the reporter constructs co-transfected with scramble or miR-27a and miR-24 mimics. Error bars indicate s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05. Candidate target genes whose luciferase activity was decreased were framed. PC group was positive reporter control which harbored reverse complementary sequence of miR-27a or miR-24.The relative luciferase activity of the wild-type 3′ UTR or mutated 3′ UTR reporter co-transfected with scramble or miR-27a and miR-24 mimics. Data are shown as mean + s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05.F,G RT-PCR and qRT-PCR analysis of in vivo binding of the miRNAs with their targets. Error bars indicate s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05; ** indicates P-value < 0.01; *** indicates P-value < 0.001.H. Western blot analysis of c-Myc expression in siRNA treated V6.5 ESCs.I. Q-PCR analysis of primary-23a~27a~24-2, miR-23a, miR-27a and miR-24 expression in c-Myc knocked down ESCs. Error bars indicate s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05; ** indicates P-value < 0.01; *** indicates P-value < 0.001.K. ChIP-PCR and ChIP-q-PCR analysis of c-Myc binding to the putative sites in the promoter. Error bars indicate s.d. (n=3); *** indicates P-value < 0.001.L. Relative luciferase activity of the wild-type and -15 binding site mutated promoter in NIH3T3 cells co-transfected with c-Myc or the blank vector (NC). Error bars indicate s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05.M. Relative luciferase activity of wild-type and -15 binding site mutated promoter in V6.5 ESCs. Error bars indicate s.d. (n=3); * indicates P-value < 0.05."}
{"words": ["Figure", "5Validation", "of", "the", "effect", "of", "miRNA", "inhibition", "in", "MEFs", "by", "q", "-", "PCR", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "AP", "staining", "of", "the", "iPSC", "colonies", "in", "reprogramming", "with", "OSK", "combined", "with", "scramble", "control", ",", "inhibitors", "of", "miR", "-", "23a", ",", "miR", "-", "27a", ",", "miR", "-", "24", "and", "let", "-", "7c", "respectively", ".", "Fold", "increase", "in", "Oct4", "-", "GFP", "-", "positive", "cell", "colonies", "in", "the", "above", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "Morphology", "of", "typical", "Oct4", "-", "GFP", "-", "positive", "iPSC", "colonies", "that", "were", "reprogrammed", "by", "OSK", "combined", "with", "miRNA", "inhibitors", ".", "Detection", "of", "endogenous", "and", "exogenous", "Oct4", ",", "Sox2", ",", "Klf4", "and", "Nanog", "expression", "in", "iPSCs", ",", "ESCs", "and", "MEFs", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "Oct4", ",", "Nanog", "and", "SSEA1", "of", "the", "iPSC", "colonies", ".", "Q", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "self", "-", "renewal", "(", "Oct4", ",", "Sox2", ",", "Nanog", ")", "and", "differentiation", "(", "Cdx2", ",", "Foxa2", ",", "Brachyury", ",", "Hand1", ",", "Nestin", ",", "FGF5", ")", "relative", "markers", "in", "EBs", "derived", "from", "the", "iPSCs", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "teratoma", "derived", "from", "the", "iPSC", "colonies", ".", "Neuronal", "rosette", "(", "Ectoderm", ")", ",", "Cartilage", "(", "Mesoderm", ")", "and", "respiratory", "epithelium", "(", "Endoderm", ")", "are", "marked", "with", "black", "arrows", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Validation of the effect of miRNA inhibition in MEFs by q-PCR. Error bars indicate s.d. (n=3).AP staining of the iPSC colonies in reprogramming with OSK combined with scramble control, inhibitors of miR-23a, miR-27a, miR-24 and let-7c respectively.Fold increase in Oct4-GFP-positive cell colonies in the above cells. Data are shown as mean + s.d. (n=5); ** indicates P-value < 0.01; *** indicates P-value < 0.001.Morphology of typical Oct4-GFP-positive iPSC colonies that were reprogrammed by OSK combined with miRNA inhibitors.Detection of endogenous and exogenous Oct4, Sox2, Klf4 and Nanog expression in iPSCs, ESCs and MEFs by RT-PCR.Immunofluorescence staining of Oct4, Nanog and SSEA1 of the iPSC colonies.Q-PCR analysis of the expression of self-renewal (Oct4, Sox2, Nanog) and differentiation (Cdx2, Foxa2, Brachyury, Hand1, Nestin, FGF5) relative markers in EBs derived from the iPSCs. Error bars indicate s.d. (n=3).Hematoxylin and eosin staining of teratoma derived from the iPSC colonies. Neuronal rosette (Ectoderm), Cartilage (Mesoderm) and respiratory epithelium (Endoderm) are marked with black arrows."}
{"words": ["Figure", "6Genomic", "PCR", "of", "the", "specific", "fragments", "spanning", "miR", "-", "23", "~", "27", "~", "24", "clusters", ".", "WT", "indicate", "wild", "-", "type", "ESCs", ";", "DKO", "indicate", "miR", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", "-", "/", "-", ",", "miR", "-", "23b", "~", "27b", "~", "24", "-", "1", "-", "/", "-", "ESCs", ";", "KO", "indicate", "miR", "-", "23a", "~", "27a", "~", "24", "-", "2", "-", "/", "-", "ESCs", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "mature", "miR", "-", "23a", "/", "b", ",", "miR", "-", "27a", "/", "b", "and", "miR", "-", "24", "expression", "in", "wild", "-", "type", ",", "DKO", "and", "KO", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "AP", "staining", "of", "wild", "-", "type", "and", "miR", "-", "23", "~", "27", "~", "24", "cluster", "knockout", "ESCs", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Oct4", ",", "Sox2", "and", "Nanog", "expression", "in", "wild", "-", "type", "and", "miR", "-", "23", "~", "27", "~", "24", "cluster", "knockout", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Oct4", ",", "Sox2", "and", "Nanog", "immunofluorescence", "staining", "of", "wild", "-", "type", "and", "the", "knockout", "ESCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Genomic PCR of the specific fragments spanning miR-23~27~24 clusters. WT indicate wild-type ESCs; DKO indicate miR-23a~27a~24-2-/-, miR-23b~27b~24-1-/- ESCs; KO indicate miR-23a~27a~24-2-/- ESCs.Real-time PCR analysis of mature miR-23a/b, miR-27a/b and miR-24 expression in wild-type, DKO and KO ESCs. Data are shown as mean + s.d. (n=3).AP staining of wild-type and miR-23~27~24 cluster knockout ESCs.Real-time PCR analysis of Oct4, Sox2 and Nanog expression in wild-type and miR-23~27~24 cluster knockout ESCs. Data are shown as mean + s.d. (n=3).Oct4, Sox2 and Nanog immunofluorescence staining of wild-type and the knockout ESCs."}
{"words": ["Figure", "7Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "Oct4", "and", "several", "lineage", "differentiation", "markers", "expression", "during", "EB", "formation", "of", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Beating", "EB", "incidence", "during", "cardiac", "differentiation", "of", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "several", "cardiac", "markers", "expression", "during", "cardiac", "differentiation", "of", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Actinin", ",", "ANP", "and", "Troponin", "Iimmunofluorescence", "staining", "of", "differentiation", "cultures", "derived", "from", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Volumes", "of", "teratomas", "at", "different", "days", "after", "injection", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ".", "Weight", "of", "teratomas", "derived", "from", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "*", "indicates", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ".", "Oct4", "immunohistochemistry", "staining", "of", "teratomas", "derived", "from", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Representative", "Oct4", "positive", "regions", "are", "shown", ".", "Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "teratomas", "derived", "from", "wild", "-", "type", "and", "knockout", "ESCs", ".", "Ectoderm", ",", "Mesoderm", "and", "Endoderm", "are", "marked", "with", "different", "color", "arrows", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Real-time PCR analysis of Oct4 and several lineage differentiation markers expression during EB formation of wild-type and knockout ESCs. Data are shown as mean ± s.d. (n=3).Beating EB incidence during cardiac differentiation of wild-type and knockout ESCs. Data are shown as mean + s.d. (n=3). * indicates P-value < 0.05; ** indicates P-value < 0.01; *** indicates P-value < 0.001.Real-time PCR analysis of several cardiac markers expression during cardiac differentiation of wild-type and knockout ESCs. Data are shown as mean ± s.d. (n=3).Actinin, ANP and Troponin Iimmunofluorescence staining of differentiation cultures derived from wild-type and knockout ESCs.Volumes of teratomas at different days after injection. Data are shown as mean + s.d. (n=4). * indicates P-value < 0.05; ** indicates P-value < 0.01; *** indicates P-value < 0.001.Weight of teratomas derived from wild-type and knockout ESCs. Data are shown as mean ± s.d. ** indicates P-value < 0.01.Oct4 immunohistochemistry staining of teratomas derived from wild-type and knockout ESCs. Representative Oct4 positive regions are shown.Hematoxylin and eosin staining of teratomas derived from wild-type and knockout ESCs. Ectoderm, Mesoderm and Endoderm are marked with different color arrows."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "list", "of", "co", "-", "precipitated", "proteins", "as", "determined", "by", "immunoprecipitation", "followed", "by", "mass", "spectrometry", "(", "IP", "-", "MS", ")", ".", "The", "SWR1", "subunits", "not", "shared", "by", "the", "ISWI", "complexes", "are", "shown", "in", "blue", ";", "The", "DDT", "domain", "-", "containing", "ISWI", "specific", "subunits", "are", "shown", "in", "orange", ";", "CHR11", "and", "CHR17", "are", "shared", "subunits", "of", "the", "SWR1", "and", "ISWI", "complexes", "and", "are", "shown", "in", "green", ".", "(", "C", ")", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "MBD9", "with", "HTA9", ",", "HTA11", ",", "PIE1", ",", "CHR11", ",", "and", "CHR17", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The list of co-precipitated proteins as determined by immunoprecipitation followed by mass spectrometry (IP-MS). The SWR1 subunits not shared by the ISWI complexes are shown in blue; The DDT domain-containing ISWI specific subunits are shown in orange; CHR11 and CHR17 are shared subunits of the SWR1 and ISWI complexes and are shown in green. (C) Determination of the interaction of MBD9 with HTA9, HTA11, PIE1, CHR11, and CHR17 by co-immunoprecipitation. "}
{"words": ["Figure", "2", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "PIE1", "-", "Flag", ",", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "by", "in", "vitro", "pull", "down", "assays", ".", "PIE1", "-", "Flag", ",", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "were", "expressed", "from", "yeast", "and", "subjected", "to", "the", "pull", "down", "assays", ".", "Anti", "-", "Flag", "agaroses", "were", "independently", "used", "in", "the", "pull", "down", "assays", ".", "C", ")", "Determination", "of", "the", "interaction", "of", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "by", "in", "vitro", "pull", "down", "assays", ".", "MBD9", "-", "Myc", ",", "and", "CHR11", "-", "HA", "were", "expressed", "from", "yeast", "and", "subjected", "to", "the", "pull", "down", "assays", ".", "anti", "-", "HA", "(", "C", ")", "agaroses", "were", "independently", "used", "in", "the", "pull", "down", "assays", ".", "D", ")", "he", "effect", "of", "the", "pie1", "and", "mbd9", "-", "1", "mutations", "on", "the", "formation", "of", "the", "SWR1", "complex", "as", "determined", "by", "IP", "-", "MS", ".", "Transgenic", "plants", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "MBD9", ",", "PIE1", ",", "and", "CHR11", "in", "the", "WT", "and", "mutant", "backgrounds", "were", "subjected", "to", "the", "IP", "-", "MS", "experiment", "with", "anti", "-", "Flag", "agarose", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Determination of the interaction of PIE1-Flag, MBD9-Myc, and CHR11-HA by in vitro pull down assays. PIE1-Flag, MBD9-Myc, and CHR11-HA were expressed from yeast and subjected to the pull down assays. Anti-Flag agaroses were independently used in the pull down assays.  C) Determination of the interaction of MBD9-Myc, and CHR11-HA by in vitro pull down assays. MBD9-Myc, and CHR11-HA were expressed from yeast and subjected to the pull down assays. anti-HA (C) agaroses were independently used in the pull down assays.  D) he effect of the pie1 and mbd9-1 mutations on the formation of the SWR1 complex as determined by IP-MS. Transgenic plants expressing Flag-tagged MBD9, PIE1, and CHR11 in the WT and mutant backgrounds were subjected to the IP-MS experiment with anti-Flag agarose. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Morphological", "phenotypes", "of", "the", "WT", ",", "chr11", "/", "17", ",", "pie1", ",", "swc2", ",", "and", "rin2", "mutant", "plants", ".", "Shown", "are", "24", "-", "day", "-", "old", "plants", ".", "The", "top", "panel", "shows", "the", "phenotypes", "of", "plants", "in", "the", "soil", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "the", "phenotypes", "of", "plants", "on", "the", "black", "cloth", ".", "(", "B", ")", "Shown", "are", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", ",", "pie1", ",", "swc2", ",", "and", "rin2", "mutant", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "were", "cut", "from", "bolting", "plants", ".", "(", "C", ")", "The", "early", "-", "flowering", "phenotype", "of", "the", "mbd9", "-", "1", ",", "mbd9", "-", "3", ",", "mbd9", "-", "4", "and", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutants", "compared", "to", "the", "WT", ".", "24", "-", "day", "-", "old", "plants", "in", "soil", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Numbers", "of", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", "and", "mutant", "plants", "shortly", "after", "bolting", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "plants", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "E", ")", "Determination", "of", "the", "effect", "of", "the", "arp4", "-", "1", ",", "arp6", "and", "swc6", "-", "1", "mutations", "on", "flowering", "time", ".", "The", "top", "panel", "shows", "the", "number", "of", "rosette", "leaves", "in", "the", "WT", ",", "arp4", "-", "1", ",", "arp6", ",", "and", "swc6", "-", "1", "mutant", "plants", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "a", "photograph", "of", "the", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "plants", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "(", "F", ")", "Determination", "of", "the", "effect", "of", "the", "tra1a", "and", "tra1b", "mutations", "on", "flowering", "time", ".", "The", "top", "panel", "shows", "numbers", "of", "rosette", "leaves", "of", "the", "WT", ",", "tra1a", "-", "1", ",", "tra1a", "-", "2", ",", "and", "tra1b", "mutant", "plants", ";", "the", "bottom", "panel", "shows", "a", "photograph", "of", "the", "plants", ".", "Rosette", "leaves", "from", "at", "least", "20", "null", "were", "counted", "for", "each", "genotype", ".", "Values", "are", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "student", "'", "s", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) Morphological phenotypes of the WT, chr11/17, pie1, swc2, and rin2 mutant plants. Shown are 24-day-old plants. The top panel shows the phenotypes of plants in the soil; the bottom panel shows the phenotypes of plants on the black cloth.  (B) Shown are rosette leaves of the WT, pie1, swc2, and rin2 mutant plants. Rosette leaves were cut from bolting plants.  (C) The early-flowering phenotype of the mbd9-1, mbd9-3, mbd9-4 and hta9-1/11-1 mutants compared to the WT. 24-day-old plants in soil are shown.  (D) Numbers of rosette leaves of the WT and mutant plants shortly after bolting. Rosette leaves from at least 20 plants were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test.  (E) Determination of the effect of the arp4-1, arp6 and swc6-1 mutations on flowering time. The top panel shows the number of rosette leaves in the WT, arp4-1, arp6, and swc6-1 mutant plants; the bottom panel shows a photograph of the plants. Rosette leaves from at least 20 plants were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test.  (F) Determination of the effect of the tra1a and tra1b mutations on flowering time. The top panel shows numbers of rosette leaves of the WT, tra1a-1, tra1a-2, and tra1b mutant plants; the bottom panel shows a photograph of the plants. Rosette leaves from at least 20 null were counted for each genotype. Values are mean ± SD. ** P<0.01, student's t test. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Heat", "maps", "showing", "the", "effect", "of", "indicated", "mutations", "on", "the", "expression", "of", "differentially", "expressed", "genes", "identified", "in", "the", "mbd9", "-", "1", "mutant", ".", "The", "color", "bar", "shows", "log2", "(", "fold", "change", ")", ".", "Up", "-", "and", "down", "-", "regulation", "are", "shown", "by", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "Scatter", "plots", "showing", "that", "the", "expression", "pattern", "in", "the", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutant", "is", "correlated", "with", "that", "in", "the", "chr11", "/", "17", ",", "mbd9", "-", "1", ",", "and", "pie1", "mutants", ".", "The", "differentially", "expressed", "genes", "identified", "in", "the", "hta9", "-", "1", "/", "11", "-", "1", "mutant", "were", "subjected", "to", "the", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Heat maps showing the effect of indicated mutations on the expression of differentially expressed genes identified in the mbd9-1 mutant. The color bar shows log2(fold change). Up- and down-regulation are shown by red and blue, respectively. (C) Scatter plots showing that the expression pattern in the hta9-1/11-1 mutant is correlated with that in the chr11/17, mbd9-1, and pie1 mutants. The differentially expressed genes identified in the hta9-1/11-1 mutant were subjected to the analysis. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "The", "effect", "of", "indicated", "mutations", "on", "H2A", ".", "Z", "deposition", "as", "determined", "by", "immunoblotting", ".", "Chromatin", "-", "associated", "proteins", "were", "extracted", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "by", "the", "anti", "-", "H2A", ".", "Z", "antibody", ".", "The", "histone", "H4", "level", "was", "detected", "by", "the", "anti", "-", "H4", "antibody", "and", "indicated", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "Meta", "plots", "showing", "H2A", ".", "Z", "occupancy", "on", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "TSS", ",", "transcription", "start", "site", ";", "TTS", ",", "transcription", "termination", "site", ".", "RPKM", ",", "reads", "per", "kilobase", "per", "million", ".", "The", "H2A", ".", "Z", "ChIP", "-", "seq", "results", "were", "generated", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Heat", "maps", "showing", "H2A", ".", "Z", "enrichment", "in", "the", "WT", ",", "pie1", ",", "chr11", "/", "17", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", "over", "the", "PIE1", "(", "E", ")", "Shown", "are", "H2A", ".", "Z", "changes", "in", "the", "pie1", ",", "chr11", "/", "17", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", "relative", "to", "the", "WT", ".", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", "were", "subjected", "to", "the", "analysis", "and", "sorted", "by", "H2A", ".", "Z", "density", "in", "the", "WT", ".", "The", "color", "bar", "shows", "log2", "(", "fold", "change", ")", ".", "(", "F", ")", "Meta", "plots", "showing", "CHR11", "and", "PIE1", "occupancy", "on", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "TSS", ",", "transcription", "start", "site", ";", "TTS", ",", "transcription", "termination", "site", ".", "The", "CHR11", "-", "Flag", "and", "PIE1", "-", "Flag", "ChIP", "-", "seq", "data", "are", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Heat", "maps", "showing", "the", "enrichment", "of", "PIE1", "-", "Flag", "and", "CHR11", "-", "Flag", "over", "the", "PIE1", "-", "dependent", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "The", "peaks", "were", "sorted", "by", "H2A", ".", "Z", "density", "in", "the", "WT", ".", "(", "H", ")", "Box", "plot", "showing", "the", "enrichment", "of", "CHR11", "and", "PIE1", "over", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", "and", "non", "-", "H2A", ".", "Z", "target", "genes", ".", "The", "log2", "(", "fold", "change", ")", "values", "of", "RPKM", "between", "the", "CHR11", "-", "Flag", "or", "PIE1", "-", "Flag", "signals", "and", "the", "WT", "signals", "are", "shown", ".", "Center", "lines", "and", "box", "edges", "represent", "medians", "and", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "respectively", ".", "Whiskers", "extend", "to", "minimum", "and", "maximum", "values", "within", "1", ".", "5", "times", "of", "the", "IQR", ".", "The", "data", "shown", "are", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", ".", "The", "difference", "between", "the", "CHR11", "-", "Flag", "and", "PIE1", "-", "Flag", "ChIP", "-", "seq", "levels", "was", "determined", "by", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) The effect of indicated mutations on H2A.Z deposition as determined by immunoblotting. Chromatin-associated proteins were extracted and subjected to immunoblotting by the anti-H2A.Z antibody. The histone H4 level was detected by the anti-H4 antibody and indicated as a loading control.  (B) Meta plots showing H2A.Z occupancy on H2A.Z target genes. TSS, transcription start site; TTS, transcription termination site. RPKM, reads per kilobase per million. The H2A.Z ChIP-seq results were generated from two independent biological replicates.  (D) Heat maps showing H2A.Z enrichment in the WT, pie1, chr11/17, and mbd9-1 mutants over the PIE1  (E) Shown are H2A.Z changes in the pie1, chr11/17, and mbd9-1 mutants relative to the WT. PIE1-dependent H2A.Z target genes were subjected to the analysis and sorted by H2A.Z density in the WT. The color bar shows log2(fold change).  (F) Meta plots showing CHR11 and PIE1 occupancy on PIE1-dependent H2A.Z target genes. TSS, transcription start site; TTS, transcription termination site. The CHR11-Flag and PIE1-Flag ChIP-seq data are from two independent biological replicates. (G) Heat maps showing the enrichment of PIE1-Flag and CHR11-Flag over the PIE1-dependent H2A.Z target genes. The peaks were sorted by H2A.Z density in the WT. (H) Box plot showing the enrichment of CHR11 and PIE1 over H2A.Z target genes and non-H2A.Z target genes. The log2(fold change) values of RPKM between the CHR11-Flag or PIE1-Flag signals and the WT signals are shown. Center lines and box edges represent medians and the interquartile range (IQR), respectively. Whiskers extend to minimum and maximum values within 1.5 times of the IQR. The data shown are from two independent biological replicates. The difference between the CHR11-Flag and PIE1-Flag ChIP-seq levels was determined by student's t test. ** P<0.01. "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Increasing", "amounts", "of", "CHR11", "(", "left", "panel", ")", "or", "PIE1", "(", "right", "panel", ")", "were", "incubated", "with", "end", "-", "positioned", "(", "lane", "1", "-", "4", "and", "9", "-", "12", ")", "or", "center", "-", "positioned", "(", "lane", "5", "-", "8", "and", "13", "-", "16", ")", "mono", "-", "nucleosomes", "in", "the", "presence", "of", "ATP", ".", "The", "sliding", "results", "were", "then", "visualized", "on", "native", "PAGE", "gels", "by", "EB", "staining", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "nucleosomes", "over", "TSS", "of", "all", "protein", "-", "coding", "genes", "in", "the", "WT", ",", "chr11", "/", "17", ",", "pie1", ",", "and", "mbd9", "-", "1", "mutants", ".", "The", "MNase", "-", "seq", "results", "were", "generated", "from", "two", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Increasing amounts of CHR11 (left panel) or PIE1 (right panel) were incubated with end-positioned (lane 1-4 and 9-12) or center-positioned (lane 5-8 and 13-16) mono-nucleosomes in the presence of ATP. The sliding results were then visualized on native PAGE gels by EB staining.(B) Distribution of nucleosomes over TSS of all protein-coding genes in the WT, chr11/17, pie1, and mbd9-1 mutants. The MNase-seq results were generated from two independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", ")", "Representative", "immunoblot", "for", "key", "lipolytic", "enzymes", "HSL", "and", "ATGL", "protein", "expression", "and", "quantification", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "E", ",", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "autophagic", "flux", "in", "mWAT", "(", "upper", "panel", ")", "and", "gWAT", "(", "lower", "panel", ")", "adipose", "tissue", "stimulated", "ex", "vivo", "with", "lysosomal", "inhibitors", "100nM", "Bafilomycin", "A1", "and", "20mM", "NH4Cl", "for", "4", "hours", "or", "DMSO", "(", "Vehicle", ")", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "images", "from", "mesenteric", "adipose", "tissue", "7", "days", "post", "DSS", "-", "induced", "colitis", "induction", ".", "Lower", "panel", "is", "showing", "magnification", "of", "selected", "area", ".", "White", "arrows", "show", "autophagosomal", "structures", ".", "(", "J", ")", "Representative", "immunoblot", "for", "LC3", "-", "I", "/", "-", "II", "and", "ACTIN", "protein", "expression", "and", "quantification", "of", "autophagic", "flux", "in", "creeping", "fat", "tissues", "(", "CrF", ")", "and", "adjacent", "mesenteric", "adipose", "tissues", "(", "Ad", ".", "MAT", ")", "of", "Crohn", "'", "s", "disease", "patients", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Additionally", ",", "autophagic", "flux", "was", "determined", "in", "the", "mesenteric", "adipose", "tissue", "(", "MAT", ")", "of", "a", "colorectal", "cancer", "patient", "as", "control", "(", "dotted", "line", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "J", ")", "Paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E) Representative immunoblot for key lipolytic enzymes HSL and ATGL protein expression and quantification (n = 5-6/group). Data are represented as mean ± s.e.m. E, Unpaired Student's t-test.(F) Immunoblot analysis of autophagic flux in mWAT (upper panel) and gWAT (lower panel) adipose tissue stimulated ex vivo with lysosomal inhibitors 100nM Bafilomycin A1 and 20mM NH4Cl for 4 hours or DMSO (Vehicle) (n = 3-4/group). Data are represented as mean ± s.e.m. Unpaired Student's t-test.(G) Representative transmission electron microscopy images from mesenteric adipose tissue 7 days post DSS-induced colitis induction. Lower panel is showing magnification of selected area. White arrows show autophagosomal structures.(J) Representative immunoblot for LC3-I/-II and ACTIN protein expression and quantification of autophagic flux in creeping fat tissues (CrF) and adjacent mesenteric adipose tissues (Ad. MAT) of Crohn's disease patients (n = 3/group). Additionally, autophagic flux was determined in the mesenteric adipose tissue (MAT) of a colorectal cancer patient as control (dotted line). Data are represented as mean ± s.e.m. (J) Paired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Representative", "immunoblot", "for", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "protein", "expression", "and", "quantification", "of", "LC3", "conversion", "ratio", "(", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", ")", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "C", ",", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Colon", "length", "after", "two", "weeks", "post", "-", "deletion", "(", "steady", "state", ";", "n", "=", "14", "/", "group", ")", "and", "after", "DSS", "at", "day", "7", "(", "n", "=", "18", "-", "22", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "F", ",", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "images", "(", "10x", "magnification", ")", "of", "colon", "sections", "and", "quantification", "of", "histological", "score", "at", "steady", "state", "(", "n", "=", "9", "/", "group", ")", "and", "DSS", "colitis", "(", "n", "=", "18", "-", "22", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "G", ",", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "I", ")", "Absolute", "number", "CD45", "+", "immune", "cells", "from", "colons", "at", "steady", "state", "(", "n", "=", "13", "-", "14", "/", "group", ")", "or", "at", "7", "days", "post", "-", "DSS", "induction", "(", "n", "=", "18", "-", "22", "/", "group", ")", ".", "(", "J", ")", "Frequency", "of", "myeloid", "cell", "population", "in", "colon", "at", "day", "7", "post", "-", "DSS", "induction", "(", "n", "=", "18", "-", "25", "/", "group", ")", ".", "(", "K", ")", "Absolute", "number", "of", "Ly6C", "+", "monocytes", "discriminated", "by", "the", "absence", "or", "presence", "of", "MHCII", "for", "infiltrating", "and", "inflammatory", "monocytes", "respectively", "(", "n", "=", "18", "-", "25", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "I", ")", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "J", ",", "K", ")", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Representative immunoblot for LC3-I and LC3-II protein expression and quantification of LC3 conversion ratio (LC3-II/LC3-I) (n = 3/group). Data are represented as mean ± s.e.m. C, Unpaired Student's t-test.(F) Colon length after two weeks post-deletion (steady state; n = 14/group) and after DSS at day 7 (n = 18-22/group). Data are represented as mean ± s.e.m. , F, Unpaired Student's t-test.(G) Representative H&E staining images (10x magnification) of colon sections and quantification of histological score at steady state (n = 9/group) and DSS colitis (n = 18-22/group). Data are represented as mean ± s.e.m. G, Unpaired Student's t-test.(I) Absolute number CD45+ immune cells from colons at steady state (n = 13-14/group) or at 7 days post-DSS induction (n = 18-22/group). (J) Frequency of myeloid cell population in colon at day 7 post-DSS induction (n = 18-25/group). (K) Absolute number of Ly6C+ monocytes discriminated by the absence or presence of MHCII for infiltrating and inflammatory monocytes respectively (n = 18-25/group). Data are represented as mean ± s.e.m. I) Unpaired Student's t-test. (J, K) Two-Way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Ex", "vivo", "lipolysis", "measured", "by", "released", "free", "fatty", "acid", "(", "left", ",", "n", "=", "4", "-", "5", "/", "group", ")", "and", "glycerol", "(", "right", ",", "n", "=", "7", "-", "8", "/", "group", ")", "in", "culture", "supernatant", "of", "adipose", "tissue", "explants", "simulated", "with", "isoproterenol", "(", "10µM", ")", "for", "1", "-", "2h", ".", "(", "B", ")", "Ex", "vivo", "lipolysis", "measured", "by", "released", "free", "fatty", "acid", "(", "left", ",", "n", "=", "4", "/", "group", ")", "and", "glycerol", "(", "right", ",", "n", "=", "7", "/", "group", ")", "adipose", "tissue", "explants", "simulated", "with", "TNFα", "(", "100ng", "/", "mL", ")", "for", "24h", "before", "replacing", "with", "fresh", "medium", "in", "the", "absence", "of", "TNFα", "for", "3h", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ".", "(", "B", ",", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "Concentration", "of", "individual", "FFA", "species", "in", "serum", "in", "water", "-", "treated", "and", "DSS", "-", "treated", "mice", "as", "measured", "by", "FID", "-", "GC", "(", "n", "=", "12", "-", "14", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "E", ")", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Ex vivo lipolysis measured by released free fatty acid (left, n = 4-5/group) and glycerol (right, n = 7-8/group) in culture supernatant of adipose tissue explants simulated with isoproterenol (10µM) for 1-2h. (B) Ex vivo lipolysis measured by released free fatty acid (left, n = 4/group) and glycerol (right, n = 7/group) adipose tissue explants simulated with TNFα (100ng/mL) for 24h before replacing with fresh medium in the absence of TNFα for 3h. Data are represented as mean ± s.e.m. (A, B, Two-Way ANOVA. (B, Unpaired Student's t-test.(E) Concentration of individual FFA species in serum in water-treated and DSS-treated mice as measured by FID-GC (n = 12-14/group). Data are represented as mean ± s.e.m. E) Two-Way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Ex", "vivo", "lipolysis", "assays", "on", "Atg7", "-", "deficient", "adipose", "tissue", "explants", "simulated", "with", "isoproterenol", "(", "10µM", ")", "for", "1", "-", "2h", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "C", ",", "Two", "-", "Way", "ANOVA", ".", "(", "H", ")", "Expression", "of", "pro", "-", "inflammatory", "cytokines", "in", "colon", "tissues", "at", "7", "days", "post", "-", "DSS", "induction", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "Dotted", "line", "represents", "non", "-", "inflamed", "controls", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "K", ")", "Absolute", "number", "of", "Ly6C", "+", "monocytes", "discriminated", "by", "the", "absence", "or", "presence", "of", "MHCII", "for", "infiltrating", "and", "inflammatory", "monocytes", "respectively", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "K", ")", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Ex vivo lipolysis assays on Atg7-deficient adipose tissue explants simulated with isoproterenol (10µM) for 1-2h (n = 5-6/group). Data are represented as mean ± s.e.m. (C, Two-Way ANOVA.(H) Expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues at 7 days post-DSS induction (n = 8/group). Dotted line represents non-inflamed controls. Data are represented as mean ± s.e.m. Unpaired Student's t-test.(K) Absolute number of Ly6C+ monocytes discriminated by the absence or presence of MHCII for infiltrating and inflammatory monocytes respectively (n = 8/group). Data are represented as mean ± s.e.m. K) Unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "E", ")", "Fold", "change", "expression", "of", "NRF2", "-", "target", "genes", "in", "primary", "visceral", "adipocytes", "at", "day", "7", "after", "DSS", "induction", "from", "normalized", "counts", "of", "RNAseq", "dataset", "(", "n", "=", "6", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "H", ")", "Representative", "immunoblot", "of", "EPHX1", "and", "EPHX2", "in", "gonadal", "adipose", "tissues", "at", "day", "7", "after", "DSS", "induction", ".", "Asterix", "indicating", "non", "-", "specific", "band", "(", "n", "=", "14", "-", "18", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(E) Fold change expression of NRF2-target genes in primary visceral adipocytes at day 7 after DSS induction from normalized counts of RNAseq dataset (n = 6/group). Data are represented as mean ± s.e.m. Unpaired Student's t-test.(H) Representative immunoblot of EPHX1 and EPHX2 in gonadal adipose tissues at day 7 after DSS induction. Asterix indicating non-specific band (n = 14-18/group). Data are represented as mean ± s.e.m. Unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Colitis", "was", "induced", "in", "mice", "for", "7", "days", "and", "adipose", "tissues", "were", "extracted", "and", "cultured", "for", "6", "hours", "in", "serum", "-", "starved", "medium", ".", "Secretion", "of", "IL", "-", "10", "and", "from", "mesenteric", "(", "left", "panel", ")", "and", "gonadal", "adipose", "tissues", "(", "right", "panel", ")", "was", "measured", "by", "ELISA", ".", "Shapes", "identify", "individual", "experiments", "(", "n", "=", "5", "-", "15", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "B", ")", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "with", "regression", "for", "experiment", ".", "(", "F", ")", "Serum", "cytokines", "upon", "DSS", "-", "induced", "colitis", "at", "day", "7", "post", "-", "induction", "(", "n", "=", "17", "-", "23", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Two", "-", "Way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Colitis was induced in mice for 7 days and adipose tissues were extracted and cultured for 6 hours in serum-starved medium. Secretion of IL-10 and from mesenteric (left panel) and gonadal adipose tissues (right panel) was measured by ELISA. Shapes identify individual experiments (n = 5-15/group). Data are represented as mean ± s.e.m. (B) Two-Way ANOVA with regression for experiment.(F) Serum cytokines upon DSS-induced colitis at day 7 post-induction (n = 17-23/group). Data are represented as mean ± s.e.m. Two-Way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "Il10", "transcript", "levels", "in", "RAW264", ".", "7", "upon", "stimulation", "to", "epoxy", "fatty", "acids", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "IL", "-", "10", "protein", "levels", "in", "the", "supernatant", "of", "RAW264", ".", "7", "upon", "stimulation", "to", "epoxy", "fatty", "acids", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "One", "-", "Way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Quantification of Il10 transcript levels in RAW264.7 upon stimulation to epoxy fatty acids (n = 3/group). (B) Quantification of IL-10 protein levels in the supernatant of RAW264.7 upon stimulation to epoxy fatty acids (n = 3/group). Data are represented as mean ± s.e.m. (A,B) One-Way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", "-", "G", ")", "ssDNA", "repair", "efficiency", "of", "the", "indicated", "TS", "mutants", "as", "determined", "from", "the", "maximal", "and", "final", "percentages", "of", "cells", "with", "Rad52", "foci", "during", "the", "time", "course", "(", "right", "panels", ")", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "and", "released", "into", "S", "phase", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "033", "%", "MMS", "for", "1", "hour", "(", "60", "+", ")", ",", "treated", "with", "2", ".", "5", "%", "sodium", "thiosulfate", "to", "inactivate", "the", "MMS", ",", "washed", "and", "released", "into", "fresh", "medium", "for", "different", "times", ".", "They", "were", "also", "released", "into", "medium", "without", "MMS", "for", "1", "hour", "to", "control", "the", "formation", "of", "spontaneous", "Rad52", "-", "YFP", "foci", "(", "60", "-", ")", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "with", "foci", "at", "each", "point", "was", "normalized", "to", "the", "highest", "value", "of", "the", "wild", "type", ",", "taken", "as", "100", "(", "left", "panels", ")", ".", "Cell", "cycle", "progression", "was", "determined", "by", "cell", "sorting", ".", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "(", "wild", "type", ",", "rad18", "∆", ",", "mms2", "∆", ",", "rad51", "∆", ",", "rad57", "∆", ",", "rad54", "∆", ")", ",", "4", "(", "pol30", "-", "K164R", ")", "and", "5", "(", "rad5", "∆", ")", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "are", "shown", ",", "where", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C-G) ssDNA repair efficiency of the indicated TS mutants as determined from the maximal and final percentages of cells with Rad52 foci during the time course (right panels). Cells were synchronized in G1 and released into S phase in the presence of 0.033% MMS for 1 hour (60+), treated with 2.5% sodium thiosulfate to inactivate the MMS, washed and released into fresh medium for different times. They were also released into medium without MMS for 1 hour to control the formation of spontaneous Rad52-YFP foci (60-). The percentage of cells with foci at each point was normalized to the highest value of the wild type, taken as 100 (left panels). Cell cycle progression was determined by cell sorting. The mean and SEM of 3 (wild type, rad18∆, mms2∆, rad51∆, rad57∆, rad54∆), 4 (pol30-K164R) and 5 (rad5∆) independent experiments are shown. Statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test are shown, where three asterisks represent p-values <0.001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", "-", "E", ")", "ssDNA", "repair", "efficiency", "of", "the", "indicated", "TLS", "mutants", "as", "determined", "from", "the", "maximal", "and", "final", "percentages", "of", "cells", "with", "Rad52", "foci", "during", "the", "time", "course", "(", "D", "and", "E", ",", "right", "panel", ")", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "and", "released", "into", "S", "phase", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "033", "%", "MMS", "for", "1", "hour", ",", "treated", "with", "2", ".", "5", "%", "sodium", "thiosulfate", "to", "inactivate", "the", "MMS", ",", "washed", "and", "released", "into", "fresh", "medium", "for", "different", "times", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "with", "foci", "at", "each", "point", "was", "normalized", "to", "the", "highest", "value", "of", "the", "wild", "type", ",", "taken", "as", "100", "(", "C", "and", "E", ",", "left", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "and", "3", "-", "12", "12", "(", "wild", "type", ")", ",", "6", "(", "rev1", "∆", ",", "rev3", "∆", ",", "rad30", "∆", ",", "rev1", "∆", "rad30", "∆", ",", "rev3", "∆", "rad30", "∆", ")", ",", "and", "3", "(", "rev1", "∆", "rev3", "∆", "and", "rev1", "∆", "rev3", "∆", "rad30", "∆", ")", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "are", "shown", ",", "where", "one", ",", "two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C-E) ssDNA repair efficiency of the indicated TLS mutants as determined from the maximal and final percentages of cells with Rad52 foci during the time course (D and E, right panel). Cells were synchronized in G1 and released into S phase in the presence of 0.033% MMS for 1 hour, treated with 2.5% sodium thiosulfate to inactivate the MMS, washed and released into fresh medium for different times. The percentage of cells with foci at each point was normalized to the highest value of the wild type, taken as 100 (C and E, left panel). Data information: The mean and SEM of and 3-12 12 (wild type), 6 (rev1∆, rev3∆, rad30∆, rev1∆ rad30∆, rev3∆ rad30∆), and 3 (rev1∆ rev3∆ and rev1∆ rev3∆ rad30∆) independent experiments are shown. Statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test are shown, where one, two and three asterisks represent p-values <0.05, <0.01 and <0.001, respectively."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", "-", "D", ")", "ssDNA", "repair", "efficiency", "of", "the", "rad5", "∆", "and", "rev1", "∆", "mutants", "as", "determined", "from", "the", "maximal", "and", "final", "percentages", "of", "cells", "with", "Rad54", "foci", "during", "the", "time", "course", "(", "right", "panels", ")", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "and", "released", "into", "S", "phase", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "033", "%", "MMS", "for", "1", "hour", ",", "treated", "with", "2", ".", "5", "%", "sodium", "thiosulfate", "to", "inactivate", "the", "MMS", ",", "washed", "and", "released", "into", "fresh", "medium", "for", "different", "times", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "with", "foci", "at", "each", "point", "was", "normalized", "to", "the", "highest", "value", "of", "the", "wild", "type", ",", "taken", "as", "100", "(", "left", "panels", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "are", "shown", ",", "where", "one", ",", "two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C-D) ssDNA repair efficiency of the rad5∆ and rev1∆ mutants as determined from the maximal and final percentages of cells with Rad54 foci during the time course (right panels). Cells were synchronized in G1 and released into S phase in the presence of 0.033% MMS for 1 hour, treated with 2.5% sodium thiosulfate to inactivate the MMS, washed and released into fresh medium for different times. The percentage of cells with foci at each point was normalized to the highest value of the wild type, taken as 100 (left panels). Data information: The mean and SEM of independent experiments are shown. Statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test are shown, where one, two and three asterisks represent p-values <0.05, <0.01 and <0.001, respectively."}
{"words": ["Figure", "4fluorescence", "signal", "of", "RPA", "foci", "per", "cell", "(", "E", ")", "at", "times", "1", "or", "2", "(", "peak", ")", "and", "7", "hours", "from", "the", "time", "course", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Asterisks", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "One", ",", "two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ".", "(", "F", ")", "ssDNA", "repair", "efficiency", "of", "the", "indicated", "mutants", "as", "determined", "by", "ChIP", "against", "Rfa1", "-", "YFP", "at", "the", "ARS305", "replication", "origin", ".", "Cells", "were", "synchronized", "in", "G1", "and", "released", "into", "S", "phase", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "033", "%", "MMS", "for", "1", "hour", ",", "treated", "with", "2", ".", "5", "%", "sodium", "thiosulfate", "to", "inactivate", "the", "MMS", ",", "washed", "and", "released", "into", "fresh", "medium", ".", "The", "amount", "of", "Rfa1", "at", "ssDNA", "was", "determined", "at", "1", "and", "7", "hours", "after", "MMS", "release", ".", "RPA", "enrichment", "was", "calculated", "as", "the", "ratio", "between", "immunoprecipitate", "and", "input", "values", ".", "All", "values", "were", "normalized", "to", "the", "wild", "type", "at", "7", "hours", ",", "taken", "as", "1", ".", "Data", "information", ":", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Asterisks", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "One", ",", "two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ".", "In", "(", "F", ")", "all", "values", "were", "significant", "relative", "to", "the", "untagged", "controls", "(", "not", "shown", "for", "clarity", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4fluorescence signal of RPA foci per cell (E) at times 1 or 2 (peak) and 7 hours from the time course shown in (B). Data information: The mean and SEM of 3 independent experiments are shown. Asterisks indicate statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test. One, two and three asterisks represent p-values <0.05, <0.01 and <0.001, respectively.(F) ssDNA repair efficiency of the indicated mutants as determined by ChIP against Rfa1-YFP at the ARS305 replication origin. Cells were synchronized in G1 and released into S phase in the presence of 0.033% MMS for 1 hour, treated with 2.5% sodium thiosulfate to inactivate the MMS, washed and released into fresh medium. The amount of Rfa1 at ssDNA was determined at 1 and 7 hours after MMS release. RPA enrichment was calculated as the ratio between immunoprecipitate and input values. All values were normalized to the wild type at 7 hours, taken as 1. Data information: The mean and SEM of 3 independent experiments are shown. Asterisks indicate statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test. One, two and three asterisks represent p-values <0.05, <0.01 and <0.001, respectively. In (F) all values were significant relative to the untagged controls (not shown for clarity)."}
{"words": ["Figure", "5Effect", "of", "the", "lack", "of", "HR", "factors", "in", "spontaneous", "and", "MMS", "-", "induced", "mutagenesis", ".", "The", "frequency", "of", "spontaneous", "and", "MMS", "-", "induced", "forward", "mutagenesis", "at", "the", "CAN1", "locus", "was", "determined", "in", "mid", "-", "log", "phase", "cell", "cultures", "before", "(", "spontaneous", "mutagenesis", ")", "and", "after", "treatment", "with", "0", ".", "01", "%", "MMS", "for", "4", "hours", "(", "DNA", "damage", "-", "induced", ")", ".", "Thus", ",", "the", "frequency", "of", "DNA", "damage", "-", "induced", "mutagenesis", "includes", "the", "mutants", "that", "arose", "spontaneously", "before", "MMS", "addition", ".", "The", "frequency", "of", "mutagenesis", "was", "determined", "at", "0", ".", "01", "%", "MMS", "because", "at", "higher", "MMS", "concentrations", "the", "loss", "of", "viability", "of", "the", "rad", "mutants", "did", "not", "allow", "us", "to", "select", "for", "canavanine", "-", "resistant", "cells", ".", "Survival", "(", "%", ")", "after", "4", "hours", "in", "MMS", "relative", "to", "the", "wild", "type", "(", "taken", "as", "100", ")", "is", "shown", "below", "the", "genotypes", ".", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "6", "(", "wild", "type", ")", ",", "9", "(", "rad54", "∆", ")", "and", "3", "(", "rest", ")", "independent", "fluctuation", "tests", "are", "shown", ".", "Asterisks", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "one", ",", "two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ")", ".", "Only", "the", "statistical", "analysis", "of", "the", "effect", "of", "rad52", "∆", ",", "rad57", "∆", "and", "rad51", "∆", "on", "rad54", "∆", "-", "mediated", "mutagenesis", "is", "included", "for", "clarity", ".", "All", "mutants", "displayed", "statistically", "significant", "differences", "with", "the", "wild", "type", "and", "not", "with", "each", "other", "in", "the", "absence", "of", "MMS", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Effect of the lack of HR factors in spontaneous and MMS-induced mutagenesis. The frequency of spontaneous and MMS-induced forward mutagenesis at the CAN1 locus was determined in mid-log phase cell cultures before (spontaneous mutagenesis) and after treatment with 0.01% MMS for 4 hours (DNA damage-induced). Thus, the frequency of DNA damage-induced mutagenesis includes the mutants that arose spontaneously before MMS addition. The frequency of mutagenesis was determined at 0.01% MMS because at higher MMS concentrations the loss of viability of the rad mutants did not allow us to select for canavanine-resistant cells. Survival (%) after 4 hours in MMS relative to the wild type (taken as 100) is shown below the genotypes. The mean and SEM of 6 (wild type), 9 (rad54∆) and 3 (rest) independent fluctuation tests are shown. Asterisks indicate statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test (one, two and three asterisks represent p-values <0.05, <0.01 and <0.001, respectively). Only the statistical analysis of the effect of rad52∆, rad57∆ and rad51∆ on rad54∆-mediated mutagenesis is included for clarity. All mutants displayed statistically significant differences with the wild type and not with each other in the absence of MMS."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Effect", "of", "the", "rad54", "∆", "and", "rad52", "∆", "mutations", "in", "spontaneous", "and", "UV", "-", "induced", "uSCE", ".", "The", "frequency", "of", "spontaneous", "and", "UV", "-", "induced", "recombinants", "was", "determined", "by", "irradiating", "or", "not", "cells", "plated", "onto", "solid", "medium", "after", "the", "corresponding", "dilutions", "(", "SMM", "and", "SMM", "without", "histidine", "to", "calculate", "total", "and", "recombinant", "cells", ",", "respectively", ")", ".", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "-", "5", "independent", "fluctuation", "tests", "are", "shown", ".", "Asterisks", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "according", "to", "an", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Two", "and", "three", "asterisks", "represent", "p", "-", "values", "<", "0", ".", "01", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Effect of the rad54∆ and rad52∆ mutations in spontaneous and UV-induced uSCE. The frequency of spontaneous and UV-induced recombinants was determined by irradiating or not cells plated onto solid medium after the corresponding dilutions (SMM and SMM without histidine to calculate total and recombinant cells, respectively). The mean and SEM of 3-5 independent fluctuation tests are shown. Asterisks indicate statistically significant differences according to an unpaired two-tailed Student's t-test. Two and three asterisks represent p-values <0.01 and <0.001, respectively."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Rad6", "binds", "to", "DNA", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "MMS", ".", "ChEC", "analysis", "of", "G1", "-", "synchronyzed", "cells", "released", "in", "the", "absence", "or", "the", "presence", "of", "0", ".", "033", "%", "MMS", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "information", ":", "DNA", "gel", "electrophoresis", ",", "DNA", "content", "(", "cell", "sorting", ")", "and", "quantification", "of", "DNA", "digestion", "profiles", "are", "shown", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Rad6", "binding", "to", "DNA", "depends", "on", "Rad18", ",", "Rad52", "(", "C", ")", ",", "Rad51", "(", "D", ")", ",", "Rad57", "(", "E", ")", "but", "not", "Rad54", "(", "F", ")", "as", "determined", "by", "ChEC", "analyses", "of", "asynchronous", "cell", "cultures", "without", "or", "with", "0", ".", "05", "%", "MMS", "for", "2", "hours", ".", "Data", "information", ":", "DNA", "gel", "electrophoresis", ",", "DNA", "content", "(", "cell", "sorting", ")", "and", "quantification", "of", "DNA", "digestion", "profiles", "are", "shown", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "twice", "with", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Rad6 binds to DNA in the absence and presence of MMS. ChEC analysis of G1-synchronyzed cells released in the absence or the presence of 0.033% MMS for the indicated times. Data information: DNA gel electrophoresis, DNA content (cell sorting) and quantification of DNA digestion profiles are shown. The experiments were repeated twice with similar results.(C-F) Rad6 binding to DNA depends on Rad18, Rad52 (C), Rad51 (D), Rad57 (E) but not Rad54 (F) as determined by ChEC analyses of asynchronous cell cultures without or with 0.05% MMS for 2 hours. Data information: DNA gel electrophoresis, DNA content (cell sorting) and quantification of DNA digestion profiles are shown. The experiments were repeated twice with similar results."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", "-", "D", ")", "Effect", "of", "rad52", "∆", ",", "rad51", "∆", "(", "A", ")", ",", "rad57", "∆", "(", "B", ")", "and", "rad54", "∆", "(", "C", ")", "on", "PCNA", "ubiquitylation", "in", "cells", "synchronized", "in", "G1", "and", "released", "into", "fresh", "medium", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "025", "%", "MMS", ".", "Cell", "cycle", "progression", "was", "followed", "by", "cell", "sorting", "analysis", "and", "western", "blot", "against", "Clb2", ".", "Pgk1", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "The", "amounts", "of", "mono", "-", "and", "polyubiquitylated", "PCNA", "were", "normalized", "to", "the", "total", "amount", "of", "PCNA", ".", "For", "each", "time", "point", ",", "rad", "mutant", "values", "were", "relativized", "to", "those", "of", "the", "wild", "type", ",", "taken", "as", "1", ".", "The", "mean", "and", "SEM", "of", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "An", "asterisk", "indicates", "a", "mean", "significantly", "different", "than", "1", ",", "according", "to", "a", "One", "-", "sample", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A-D) Effect of rad52∆, rad51∆ (A), rad57∆ (B) and rad54∆ (C) on PCNA ubiquitylation in cells synchronized in G1 and released into fresh medium in the presence of 0.025% MMS. Cell cycle progression was followed by cell sorting analysis and western blot against Clb2. Pgk1 was used as loading control. The amounts of mono- and polyubiquitylated PCNA were normalized to the total amount of PCNA. For each time point, rad mutant values were relativized to those of the wild type, taken as 1. The mean and SEM of 3 independent experiments are shown (D). An asterisk indicates a mean significantly different than 1, according to a One-sample t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "in", "cortex", "(", "Cx", ")", ",", "hippocampus", "(", "Hip", ")", "and", "cerebellum", "(", "Cb", ")", "of", "NPA", "affected", "and", "control", "3", "year", "-", "old", "children", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "B", ")", "Magnified", "image", "showing", "ramified", "(", "left", ")", "versus", "amoeboid", "(", "right", ")", "morphology", "in", "control", "and", "NPA", "microglia", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Mean", "±", "SEM", "area", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "in", "different", "brain", "regions", "from", "a", "NPA", "affected", "and", "a", "control", "child", "(", "n", "=", "20", "cells", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "in", "Cx", ",", "Hip", "and", "Cb", "of", "3", "month", "-", "old", "ASMko", "and", "wt", "mice", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "in", "different", "brain", "regions", "from", "ASMko", "and", "wt", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "3D", "rendered", "images", "obtained", "with", "Imaris", "Surface", "software", "from", "high", "magnification", "images", "of", "immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "showing", "representative", "microglial", "morphology", "in", "Cx", ",", "Hip", "and", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Mean", "±", "SEM", "area", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "in", "the", "different", "brain", "regions", "from", "ASMko", "and", "wt", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", ">", "10", "cells", "per", "mouse", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "15", "μm", ".", "(", "H", ")", "Example", "of", "projection", "detection", "by", "the", "Filament", "Imaris", "software", ".", "(", "I", ")", "Mean", "±", "SEM", "branch", "point", "number", "per", "process", "and", "process", "length", "in", "iba1", "+", "cells", "obtained", "with", "the", "Imaris", "Filament", "software", "(", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Immunofluorescence staining against Iba-1 in cortex (Cx), hippocampus (Hip) and cerebellum (Cb) of NPA affected and control 3 year-old children. Scale bars, 50 μm. (B) Magnified image showing ramified (left) versus amoeboid (right) morphology in control and NPA microglia. Scale bars, 10 μm. (C) Mean ± SEM area of Iba-1 positive cells in different brain regions from a NPA affected and a control child (n = 20 cells, Student´s t-test). (D) Immunofluorescence staining against Iba-1 in Cx, Hip and Cb of 3 month-old ASMko and wt mice. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bars, 50 μm.(E) Mean ± SEM number of Iba-1 positive cells in different brain regions from ASMko and wt mice (n = 5 mice per group, Student´s t-test).(F) 3D rendered images obtained with Imaris Surface software from high magnification images of immunofluorescence staining against Iba-1 showing representative microglial morphology in Cx, Hip and Cb of ASMko and wt mice. Scale bars, 10 μm.(G) Mean ± SEM area of Iba-1 positive cells in the different brain regions from ASMko and wt mice (n = 5 mice per group, >10 cells per mouse, Student´s t-test). Scale bars, 15 μm.(H) Example of projection detection by the Filament Imaris software. (I) Mean ± SEM branch point number per process and process length in iba1+ cells obtained with the Imaris Filament software (Student´s t-test). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "for", "2", "months", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "B", ")", "Magnified", "images", "(", "from", "A", ")", "showing", "ramified", "(", "left", ")", "versus", "amoeboid", "(", "right", ")", "morphology", "in", "wt", "and", "ASMko", "microglia", "treated", "or", "not", "with", "PLX", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "μm", ".", "(", "C", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "in", "the", "Cb", "of", "the", "different", "mouse", "groups", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Performance", "in", "the", "Rotarod", "test", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "for", "2", "months", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "time", "spent", "in", "the", "rotating", "rod", "on", "each", "of", "four", "trials", "(", "D", ")", "or", "the", "mean", "±", "SEM", "time", "of", "the", "four", "trials", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Games", "-", "Howell", "(", "D", ")", "and", "Bonferroni", "(", "E", ")", "post", "hoc", ")", ".", "(", "F", ")", "Mean", "±", "SEM", "body", "weight", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "at", "the", "indicated", "time", "during", "long", "-", "term", "treatment", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", ".", "(", "G", ")", "Survival", "curve", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "with", "or", "without", "long", "-", "term", "PLX", "treatment", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "the", "PC", "marker", "Calbindin", "in", "mid", "and", "posterior", "lobules", "of", "Cb", "in", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "for", "2", "months", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "μm", ".", "(", "I", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Calbindin", "positive", "cells", "in", "the", "anterior", "(", "lobules", "I", "-", "V", ")", ",", "middle", "(", "lobules", "VI", "-", "VIII", ")", "and", "posterior", "zone", "(", "lobules", "IX", "-", "X", ")", "of", "the", "Cb", "from", "the", "different", "mouse", "groups", "(", "n", "=", "7", "mouse", "per", "group", ",", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Immunofluorescence staining against Iba-1 in Cb of ASMko and wt mice treated or not with PLX for 2 months. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bar, 100 μm. (B) Magnified images (from A) showing ramified (left) versus amoeboid (right) morphology in wt and ASMko microglia treated or not with PLX. Scale bars, 30 μm. (C) Mean ± SEM number of Iba-1 positive cells in the Cb of the different mouse groups (n = 7 mice per group, Two-way Anova, Bonferroni post hoc).(D, E) Performance in the Rotarod test of ASMko and wt mice treated or not with PLX for 2 months expressed as the mean ± SEM time spent in the rotating rod on each of four trials (D) or the mean ± SEM time of the four trials (E) (n = 7 mice per group, Two-way Anova, Games-Howell (D) and Bonferroni (E) post hoc).(F) Mean ± SEM body weight of ASMko and wt mice treated or not with PLX at the indicated time during long-term treatment (n= 7 mice per group, Two-way Anova, Bonferroni post hoc).(G) Survival curve of ASMko and wt mice with or without long-term PLX treatment (n = 7 mice per group).(H) Immunofluorescence staining against the PC marker Calbindin in mid and posterior lobules of Cb in ASMko and wt mice treated or not with PLX for 2 months. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bar, 500 μm. (I) Mean ± SEM number of Calbindin positive cells in the anterior (lobules I-V), middle (lobules VI-VIII) and posterior zone (lobules IX-X) of the Cb from the different mouse groups (n = 7 mouse per group, Two-way Anova, Bonferroni post hoc)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "CD16", "/", "CD32", "or", "Arg", "-", "1", "in", "Cb", "of", "ASMko", "mice", "(", "red", ")", ".", "Microglia", "were", "identified", "by", "F4", "/", "80", "or", "Iba", "-", "1", "staining", "(", "green", ")", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "B", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Arg", "-", "1", "and", "CD16", "/", "CD32", "positive", "microglia", "per", "area", "in", "Cb", "from", "ASMko", "and", "wt", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "C", ")", "Mean", "±", "SEM", "levels", "of", "TNFa", "protein", "in", "the", "Cb", "from", "ASMko", "and", "wt", "mice", "measured", "by", "ELISA", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Mean", "±", "SEM", "levels", "of", "TNFa", "mRNA", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Survival", "after", "LPS", "challenge", "in", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "dexamethasone", "(", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "F", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "MBP", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "for", "2", "months", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "G", ")", "Mean", "±", "SEM", "MBP", "intensity", "in", "the", "different", "mouse", "groups", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", ".", "(", "H", ")", "High", "magnification", "of", "immunofluorescence", "staining", "against", "MBP", "in", "ASMko", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "for", "2", "months", ".", "White", "arrows", "show", "MBP", "aggregates", "indicative", "of", "myelin", "debris", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "I", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "MBP", "aggregates", "per", "cell", "area", "in", "the", "different", "mouse", "groups", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "J", ")", "High", "magnification", "images", "and", "their", "3D", "rendered", "replicates", "from", "cerebellar", "wt", "and", "ASMko", "microglia", "identified", "by", "Iba", "-", "1", "and", "of", "the", "myelin", "marker", "MBP", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "K", ")", "Amplified", "image", "and", "its", "3D", "rendered", "replicate", "of", "amoeboid", "microglia", "containing", "myelin", "debris", "(", "arrowheads", ")", "in", "the", "ASMko", "cerebellum", ".", "The", "orthogonal", "projection", "of", "this", "cell", "in", "the", "lower", "panels", "confirms", "the", "presence", "of", "the", "myelin", "debris", "inside", "the", "cell", "and", "underneath", "the", "plasma", "membrane", "(", "arrowhead", ")", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "L", ")", "Mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "microglia", "showing", "internalised", "myelin", "debris", "in", "wt", "and", "ASMko", "mice", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunofluorescence staining against CD16/CD32 or Arg-1 in Cb of ASMko mice (red). Microglia were identified by F4/80 or Iba-1 staining (green). DAPI staining shows cell nuclei. Scale bar, 50 μm. (B) Mean ± SEM number of Arg-1 and CD16/CD32 positive microglia per area in Cb from ASMko and wt mice (n = 6 mice per group). (C) Mean ± SEM levels of TNFa protein in the Cb from ASMko and wt mice measured by ELISA (n = 7 mice per group, Student´s t-test).(D) Mean ± SEM levels of TNFa mRNA in Cb of ASMko and wt mice determined by qRT-PCR (n = 7 mice per group, Student´s t-test).(E) Survival after LPS challenge in ASMko and wt mice treated or not with dexamethasone (n = 8 mice per group).(F) Immunofluorescence staining against MBP in Cb of ASMko and wt mice treated or not with PLX for 2 months. Scale bar, 50 μm.(G) Mean ± SEM MBP intensity in the different mouse groups (n = 7 mice per group, Two-way Anova, Bonferroni post hoc).(H) High magnification of immunofluorescence staining against MBP in ASMko mice treated or not with PLX for 2 months. White arrows show MBP aggregates indicative of myelin debris. Scale bar, 50 μm. (I) Mean ± SEM number of MBP aggregates per cell area in the different mouse groups (n = 7 mice per group, Student´s t-test). (J) High magnification images and their 3D rendered replicates from cerebellar wt and ASMko microglia identified by Iba-1 and of the myelin marker MBP. Scale bars, 10 μm.(K) Amplified image and its 3D rendered replicate of amoeboid microglia containing myelin debris (arrowheads) in the ASMko cerebellum. The orthogonal projection of this cell in the lower panels confirms the presence of the myelin debris inside the cell and underneath the plasma membrane (arrowhead). DAPI staining shows cell nuclei. Scale bars, 10 μm. (L) Mean ± SEM percentage of microglia showing internalised myelin debris in wt and ASMko mice (n = 7 mice per group). "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "image", "of", "microglia", "in", "the", "Cb", "of", "ASMko", "mice", "showing", "accumulation", "of", "multillamelar", "vacuoles", "and", "other", "lysosome", "related", "vesicles", "filling", "the", "whole", "cytoplasm", "of", "these", "cells", ".", "Arrowhead", "identifies", "the", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "higher", "magnification", "showing", "a", "multillamelar", "body", "(", "arrowhead", ")", "with", "the", "characteristic", "concentric", "lamellar", "inclusions", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "μm", ".", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Galectin3", "-", "GFP", "in", "BV2", "microglial", "cells", "treated", "with", "or", "without", "SM", "(", "B", ")", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Galectin3", "-", "GFP", "in", "BV2", "microglial", "cells", "treated", "with", "or", "without", "Siramesine", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Galectin3", "-", "GFP", "positive", "vesicles", "in", "BV2", "microglial", "cells", "in", "the", "different", "conditions", "(", "n", "=", "4", "independent", "cultures", ",", ">", "50", "cells", "per", "culture", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Lysotracker", "-", "Red", "staining", "in", "BMDMs", "from", "wt", "and", "ASMko", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "of", "CathB", "levels", "and", "the", "cytosolic", "protein", "GAPDH", "in", "the", "cellular", "and", "cytosolic", "fractions", "of", "wt", "and", "ASMko", "BMDMs", "extracted", "with", "digitonin", "(", "left", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "pro", "-", "CathB", "and", "CathB", "levels", "in", "the", "cytosolic", "fractions", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "2", "cultures", "per", "genotype", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "(", "green", ")", "and", "CathB", "(", "red", ")", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", ".", "Arrowheads", "show", "double", "positive", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Below", ",", "magnified", "images", "of", "the", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "CathB", "(", "green", ")", ",", "Arg", "-", "1", "(", "red", ",", "anti", "-", "inflammatory", "microglia", ")", "and", "F4", "/", "80", "(", "yellow", ",", "all", "microglia", ")", "in", "Cb", "of", "ASMko", "mice", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Below", ",", "magnified", "images", "of", "the", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "I", ")", "Table", "showing", "mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "microglia", "presenting", "CathB", "staining", "(", "CathB", "+", "/", "Iba", "-", "1", "+", ")", ",", "and", "the", "number", "of", "CathB", "positive", "microglia", "co", "-", "expressing", "Arg", "-", "1", "(", "CathB", "+", "/", "Arg", "-", "1", "+", ")", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", ",", ">", "10", "cells", "per", "mouse", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Transmission electron microscopy image of microglia in the Cb of ASMko mice showing accumulation of multillamelar vacuoles and other lysosome related vesicles filling the whole cytoplasm of these cells. Arrowhead identifies the nuclei. Scale bar, 5 μm. On the right, higher magnification showing a multillamelar body (arrowhead) with the characteristic concentric lamellar inclusions. Scale bar, 0.5 μm.Immunofluorescence staining against Galectin3-GFP in BV2 microglial cells treated with or without SM (B) Scale bar, 10 μm.Immunofluorescence staining against Galectin3-GFP in BV2 microglial cells treated with or without Siramesine (C). Scale bar, 10 μm.(D) Mean ± SEM number of Galectin3-GFP positive vesicles in BV2 microglial cells in the different conditions (n = 4 independent cultures, >50 cells per culture, Student´s t-test).(E) Lysotracker-Red staining in BMDMs from wt and ASMko mice. Scale bar, 10 μm.(F) Western blot of CathB levels and the cytosolic protein GAPDH in the cellular and cytosolic fractions of wt and ASMko BMDMs extracted with digitonin (left). Mean ± SEM pro-CathB and CathB levels in the cytosolic fractions (right) (n=2 cultures per genotype, Student´s t-test).(G) Immunofluorescence staining against Iba-1 (green) and CathB (red) in Cb of ASMko and wt mice. Arrowheads show double positive cells. Scale bar, 50 μm. Below, magnified images of the selected areas. Scale bar, 20 μm. (H) Immunofluorescence staining against CathB (green), Arg-1 (red, anti-inflammatory microglia) and F4/80 (yellow, all microglia) in Cb of ASMko mice. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bar, 50 μm. Below, magnified images of the selected areas. Scale bar, 20 μm. (I) Table showing mean ± SEM percentage of microglia presenting CathB staining (CathB +/Iba-1+), and the number of CathB positive microglia co-expressing Arg-1 (CathB+/Arg-1+) in Cb of ASMko and wt mice (n = 5 mice, >10 cells per mouse). "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Western", "blot", "of", "CathB", "levels", "(", "for", "both", "the", "precursor", "(", "pro", "-", "CathB", ")", "and", "the", "cleaved", "-", "mature", "forms", ")", "in", "the", "culture", "media", "from", "ASMko", "and", "wt", "BMDMs", ".", "Staining", "of", "Ponceau", "-", "S", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "Mean", "±", "SEM", "fold", "increase", "in", "CathB", "levels", "in", "the", "culture", "media", "from", "wt", "and", "ASMko", "BMDMs", "(", "n", "=", "5", "independent", "cultures", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "LAMP", "-", "1", "(", "yellow", ")", "and", "Iba", "-", "1", "(", "red", ")", "in", "Cb", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ",", "zoomed", "images", "20", "μm", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "LAMP", "-", "1", "in", "non", "-", "permeabilised", "BMDMs", "from", "ASMko", "and", "wt", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Mean", "±", "SEM", "of", "LAMP", "-", "1", "levels", "on", "the", "surface", "of", "ASMko", "and", "wt", "BMDMs", "(", "n", "=", "4", "independent", "cultures", ",", ">", "40", "cells", "per", "culture", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Mean", "±", "SEM", "microvesicle", "and", "exosome", "numbers", "in", "the", "culture", "media", "from", "ASMko", "and", "wt", "BMDMs", "(", "n", "=", "6", "independent", "cultures", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "of", "CathB", "and", "Flotillin1", "levels", "in", "the", "secreted", "exosome", "fractions", "from", "ASMko", "and", "wt", "BMDMs", ".", "(", "H", ")", "Western", "blot", "of", "CathB", "levels", "in", "the", "exosome", "depleted", "culture", "media", "from", "wt", "and", "ASMko", "BMDMs", ".", "(", "I", ")", "Mean", "±", "SEM", "MTT", "absorbance", "reflecting", "cell", "viability", "in", "primary", "neurons", "from", "wt", "mice", "treated", "with", "conditioned", "media", "from", "ASMko", "and", "wt", "BMDMs", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "CathB", "inhibitor", "Ca074", "(", "n", "=", "4", "independent", "cultures", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", ".", "(", "J", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "(", "green", ")", "and", "CathB", "(", "red", ")", "in", "lobes", "of", "the", "Cb", "sensitive", "or", "resistant", "to", "Purkinje", "cell", "death", ".", "Asterisks", "indicate", "Purkinje", "cells", "in", "the", "resistant", "lobes", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "K", ")", "Mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "CathB", "positive", "microglia", "in", "resistant", "and", "sensitive", "Cb", "lobules", "of", "ASMko", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", ",", "χ2", "test", ")", ".", "(", "L", ")", "Western", "blot", "of", "Cath", "B", "and", "β", "-", "Actin", "levels", "in", "cerebellar", "extracts", "of", "wt", "and", "ASMko", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", ".", "(", "M", ")", "Mean", "±", "SEM", "of", "CathB", "levels", "normalized", "by", "β", "-", "Actin", "in", "cerebellar", "extracts", "of", "wt", "and", "ASMko", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "(", "n", "=", "6", "mice", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", ".", "(", "O", ")", "Western", "blot", "of", "CathB", "levels", "(", "for", "both", "the", "precursor", "(", "pro", "-", "CathB", ")", "and", "the", "cleaved", "-", "mature", "forms", ")", "in", "the", "culture", "media", "from", "ASMko", "and", "wt", "cerebellar", "organotypic", "cultures", "from", "mice", "fed", "with", "vehicle", "(", "veh", ")", "or", "PLX", "(", "PLX", ")", ".", "Below", ",", "Western", "blots", "of", "organotypic", "culture", "lysates", "against", "Iba", "-", "1", ",", "to", "confirm", "microglia", "depletion", ",", "and", "against", "GAPDH", "as", "loading", "control", ".", "(", "P", ")", "Mean", "±", "SEM", "increase", "in", "pro", "-", "CathB", "(", "left", ")", "and", "CathB", "(", "right", ")", "levels", "in", "the", "culture", "media", "from", "cerebellar", "organotypic", "cultures", "from", "wt", "and", "ASMko", "mice", "treated", "or", "not", "with", "PLX", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Western blot of CathB levels (for both the precursor (pro-CathB) and the cleaved-mature forms) in the culture media from ASMko and wt BMDMs. Staining of Ponceau-S is shown as loading control. (B) Mean ± SEM fold increase in CathB levels in the culture media from wt and ASMko BMDMs (n = 5 independent cultures, Student´s t-test). (C) Immunofluorescence staining against LAMP-1 (yellow) and Iba-1 (red) in Cb of ASMko and wt mice. Scale bar, 50 μm, zoomed images 20 μm.(D) Immunofluorescence staining against LAMP-1 in non-permeabilised BMDMs from ASMko and wt mice. Scale bar, 50 μm.(E) Mean ± SEM of LAMP-1 levels on the surface of ASMko and wt BMDMs (n = 4 independent cultures, >40 cells per culture, Student´s t-test).(F) Mean ± SEM microvesicle and exosome numbers in the culture media from ASMko and wt BMDMs (n = 6 independent cultures, Student´s t-test).(G) Western blot of CathB and Flotillin1 levels in the secreted exosome fractions from ASMko and wt BMDMs. (H) Western blot of CathB levels in the exosome depleted culture media from wt and ASMko BMDMs.(I) Mean ± SEM MTT absorbance reflecting cell viability in primary neurons from wt mice treated with conditioned media from ASMko and wt BMDMs in the presence or absence of the CathB inhibitor Ca074 (n = 4 independent cultures Two-way Anova, Bonferroni post hoc).(J) Immunofluorescence staining against Iba-1 (green) and CathB (red) in lobes of the Cb sensitive or resistant to Purkinje cell death. Asterisks indicate Purkinje cells in the resistant lobes. Scale bar, 50 μm.(K) Mean ± SEM percentage of CathB positive microglia in resistant and sensitive Cb lobules of ASMko mice (n = 5 mice, χ2 test).(L) Western blot of Cath B and β-Actin levels in cerebellar extracts of wt and ASMko mice treated or not with PLX. (M) Mean ± SEM of CathB levels normalized by β-Actin in cerebellar extracts of wt and ASMko mice treated or not with PLX (n= 6 mice Two-way Anova, Bonferroni post hoc). (O) Western blot of CathB levels (for both the precursor (pro-CathB) and the cleaved-mature forms) in the culture media from ASMko and wt cerebellar organotypic cultures from mice fed with vehicle (veh) or PLX (PLX). Below, Western blots of organotypic culture lysates against Iba-1, to confirm microglia depletion, and against GAPDH as loading control.(P) Mean ± SEM increase in pro-CathB (left) and CathB (right) levels in the culture media from cerebellar organotypic cultures from wt and ASMko mice treated or not with PLX (n = 3 mice per group Two-way Anova, Bonferroni post hoc)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Mean", "±", "SEM", "body", "weight", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "Ca074Me", "at", "the", "indicated", "time", "during", "treatment", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ")", ".", "Performance", "in", "the", "Rotarod", "test", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "Ca074Me", "for", "1", "month", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "time", "spent", "in", "the", "rotating", "rod", "on", "each", "of", "four", "trials", "(", "B", ")", "Performance", "in", "the", "Rotarod", "test", "of", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "Ca074Me", "for", "1", "month", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "time", "of", "the", "four", "trials", "(", "C", ")", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "the", "PC", "marker", "Calbindin", "in", "the", "posterior", "lobules", "of", "the", "Cb", "in", "ASMko", "and", "wt", "mice", "treated", "or", "not", "with", "Ca074Me", "for", "1", "month", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "(", "E", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "of", "Calbindin", "positive", "cells", "in", "the", "posterior", "zone", "(", "lobules", "IX", "-", "X", ")", "of", "the", "Cb", "from", "the", "different", "mouse", "groups", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", "Two", "-", "way", "Anova", ",", "Bonferroni", "post", "hoc", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Mean ± SEM body weight of ASMko and wt mice treated or not with Ca074Me at the indicated time during treatment (n = 7 mice per group).Performance in the Rotarod test of ASMko and wt mice treated or not with Ca074Me for 1 month expressed as mean ± SEM time spent in the rotating rod on each of four trials (B)Performance in the Rotarod test of ASMko and wt mice treated or not with Ca074Me for 1 month expressed as mean ± SEM time of the four trials (C)(D) Immunofluorescence staining against the PC marker Calbindin in the posterior lobules of the Cb in ASMko and wt mice treated or not with Ca074Me for 1 month. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bar, 200 μm.(E) Mean ± SEM number of Calbindin positive cells in the posterior zone (lobules IX-X) of the Cb from the different mouse groups (n= 7 mice per group Two-way Anova, Bonferroni post hoc)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "in", "Cx", ",", "Hip", "and", "Cb", "of", "2", "month", "-", "old", "Npc1nmf164", "and", "wt", "mice", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ",", "30", "μm", ".", "(", "B", ")", "3D", "rendered", "images", "obtained", "with", "Imaris", "Surface", "software", "from", "high", "magnification", "z", "-", "stack", "images", "of", "immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "showing", "representative", "microglial", "morphology", "in", "Cx", ",", "Hip", "and", "Cb", "of", "Npc1nmf164", "and", "wt", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "Mean", "±", "SEM", "number", "(", "upper", "panel", ")", "and", "area", "(", "lower", "panel", ")", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "in", "different", "brain", "regions", "from", "Npc1nmf164", "and", "wt", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", ">", "30", "cells", "per", "mouse", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "in", "the", "Cb", "of", "a", "NPC", "affected", "and", "a", "control", "child", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "Graph", "shows", "mean", "±", "SEM", "area", "of", "Iba", "-", "1", "positive", "cells", "(", "n", "=", "30", "cells", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "MBP", "in", "Cb", "of", "Npc1nmf164", "and", "wt", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Graph", "shows", "mean", "±", "SEM", "number", "of", "MBP", "aggregates", "per", "area", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "High", "magnification", "images", "and", "their", "3D", "rendered", "replicates", "from", "cerebellar", "Npc1nmf164", "microglia", "stained", "against", "Iba", "-", "1", "and", "MBP", "containing", "myelin", "debris", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "(", "up", ")", ",", "2", "μm", "(", "down", ")", ".", "The", "orthogonal", "projection", "of", "the", "cells", "in", "the", "right", "panels", "confirms", "the", "presence", "of", "myelin", "debris", "inside", "the", "cell", "and", "underneath", "the", "plasma", "membrane", ".", "DAPI", "staining", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "microglia", "showing", "internalised", "myelin", "debris", "in", "wt", "and", "Npc1nmf164", "mice", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "F4", "/", "80", "and", "CathB", "in", "Cb", "of", "Npc1nmf164", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", ".", "The", "table", "shows", "mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "microglia", "presenting", "CathB", "staining", "in", "Npc1nmf164", "and", "wt", "mice", ".", "Below", ",", "magnified", "images", "of", "the", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "I", ")", "Immunofluorescence", "staining", "against", "Iba", "-", "1", "and", "CathB", "in", "Cb", "of", "a", "NPC", "patient", ".", "DAPI", "shows", "cell", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "A", "merged", "magnified", "image", "of", "the", "selected", "area", "is", "shown", "in", "the", "right", "down", "panel", ",", "scale", "bar", "10", "μm", ".", "Table", "shows", "mean", "±", "SEM", "percentage", "of", "microglia", "presenting", "CathB", "staining", "in", "NPC", "and", "control", "children", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Immunofluorescence staining against Iba-1 in Cx, Hip and Cb of 2 month-old Npc1nmf164 and wt mice. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bars, 30 μm.(B) 3D rendered images obtained with Imaris Surface software from high magnification z-stack images of immunofluorescence staining against Iba-1 showing representative microglial morphology in Cx, Hip and Cb of Npc1nmf164 and wt mice. Scale bars, 10 μm.(C) Mean ± SEM number (upper panel) and area (lower panel) of Iba-1 positive cells in different brain regions from Npc1nmf164 and wt mice (n = 5 mice per group, >30 cells per mouse, Student´s t-test).(D) Immunofluorescence staining against Iba-1 in the Cb of a NPC affected and a control child. Scale bars, 50 μm. Graph shows mean ± SEM area of Iba-1 positive cells (n = 30 cells, Student´s t-test).(E) Immunofluorescence staining against MBP in Cb of Npc1nmf164 and wt mice. Scale bar, 50 μm. Graph shows mean ± SEM number of MBP aggregates per area (n = 5 mice per group, Student´s t-test).(F) High magnification images and their 3D rendered replicates from cerebellar Npc1nmf164 microglia stained against Iba-1 and MBP containing myelin debris (arrowheads). Scale bars, 10 μm (up), 2 μm (down). The orthogonal projection of the cells in the right panels confirms the presence of myelin debris inside the cell and underneath the plasma membrane. DAPI staining shows cell nuclei. Scale bars, 10 μm.(G) Mean ± SEM percentage of microglia showing internalised myelin debris in wt and Npc1nmf164 mice (n = 5 mice per group).(H) Immunofluorescence staining against F4/80 and CathB in Cb of Npc1nmf164 mice. Scale bar, 30 μm. The table shows mean ± SEM percentage of microglia presenting CathB staining in Npc1nmf164 and wt mice. Below, magnified images of the selected areas. Scale bar, 20 μm.(I) Immunofluorescence staining against Iba-1 and CathB in Cb of a NPC patient. DAPI shows cell nuclei. Scale bar, 50 μm. A merged magnified image of the selected area is shown in the right down panel, scale bar 10 μm. Table shows mean ± SEM percentage of microglia presenting CathB staining in NPC and control children."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "Western", "blot", "showing", "CARD14", "protein", "levels", "in", "skin", "and", "liver", "lysates", "of", "E18", ".", "5", "pups", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Representative", "images", "of", "K5creTg", "/", "+", "CARD14E138A", "+", "/", "+", "and", "K5creTg", "/", "+", "CARD14E138ATg", "/", "+", "pups", "at", "E18", ".", "5", ".", "Representative", "image", "of", "6", "month", "-", "old", "Malt1fl", "/", "fl", "K5cretg", "/", "+", "CARD14E138A", "+", "/", "+", "and", "Malt1fl", "/", "fl", "K5cretg", "/", "+", "CARD14E138Atg", "/", "+", "mice", ".", "Body", "weight", "and", "ear", "thickness", "of", "untreated", "WT", "and", "Malt1fl", "/", "fl", "K5creTg", "/", "+", "CARD14E138ATg", "/", "+", "male", "and", "female", "mice", "(", "between", "4", "and", "7", "months", "old", ")", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "mouse", ";", "the", "line", "represents", "the", "mean", "value", "(", "n", "≥", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "WT", "=", "Malt1fl", "/", "fl", "K5cre", "+", "/", "+", "CARD14E138A", "+", "/", "+", ",", "Malt1fl", "/", "fl", "K5cre", "+", "/", "+", "CARD14E138ATg", "/", "+", "and", "Malt1fl", "/", "fl", "K5creTg", "/", "+", "CARD14E138A", "+", "/", "+", "mice", ".", "Statistical", "difference", "between", "two", "groups", "was", "determined", "using", "a", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "ns", ":", "p", "-", "value", ">", "0", ".", "05", ")", "Representative", "H", "&", "E", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "ear", "and", "skin", "tissue", "of", "Malt1fl", "/", "fl", "K5cre", "+", "/", "+", "CARD14E138A", "+", "/", "+", "and", "Malt1fl", "/", "fl", "K5creTg", "/", "+", "CARD14E138ATg", "/", "+", "mice", "(", "scale", "bar", "represents", "100", "μm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative Western blot showing CARD14 protein levels in skin and liver lysates of E18.5 pups. Actin is shown as a loading control.Representative images of K5creTg/+ CARD14E138A+/+ and K5creTg/+ CARD14E138ATg/+ pups at E18.5.Representative image of 6 month-old Malt1fl/fl K5cretg/+ CARD14E138A+/+ and Malt1fl/fl K5cretg/+ CARD14E138Atg/+ mice.Body weight and ear thickness of untreated WT and Malt1fl/fl K5creTg/+ CARD14E138ATg/+ male and female mice (between 4 and 7 months old). Each symbol represents one mouse; the line represents the mean value (n≥4 mice per group). WT = Malt1fl/fl K5cre+/+ CARD14E138A+/+, Malt1fl/fl K5cre+/+ CARD14E138ATg/+ and Malt1fl/fl K5creTg/+ CARD14E138A+/+ mice. Statistical difference between two groups was determined using a Mann-Whitney U-test (ns: p-value>0.05)Representative H&E-stained histological sections of ear and skin tissue of Malt1fl/fl K5cre+/+ CARD14E138A+/+ and Malt1fl/fl K5creTg/+ CARD14E138ATg/+ mice (scale bar represents 100 μm)."}
{"words": ["Figure", "2Changes", "in", "relative", "body", "weight", "and", "ear", "thickness", "upon", "CARD14E138A", "induction", "with", "tamoxifen", ".", "Malt1EKO", "=", "Malt1fl", "/", "fl", ".", "The", "combined", "results", "of", "five", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "Malt1", "+", "/", "+", "WT", "n", "=", "17", ",", "Malt1fl", "/", "fl", "WT", "n", "=", "8", ",", "Malt1", "+", "/", "+", "ieCARD14E138A", "n", "=", "18", ",", "Malt1fl", "/", "fl", "ieCARD14E138A", "n", "=", "12", ")", ".", "Representative", "H", "&", "E", "-", "stained", "histological", "sections", "of", "ear", "tissue", "of", "tamoxifen", "-", "treated", "mice", "(", "Scale", "bar", "represents", "200", "μm", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "infiltrates", "of", "immune", "cells", ".", "Epidermal", "thickness", "measured", "on", "ear", "sections", ".", "Each", "symbol", "represents", "the", "mean", "of", "at", "least", "ten", "measurements", "for", "each", "ear", ";", "the", "line", "represents", "the", "mean", "value", ".", "The", "combined", "results", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Analysis", "of", "infiltrating", "immune", "cells", "in", "the", "ears", "of", "tamoxifen", "-", "treated", "mice", "using", "flow", "cytometry", ".", "Cell", "count", "of", "neutrophils", "(", "CD45", "+", "CD3", "/", "CD19", "-", "CD64", "-", "CD11b", "+", "Ly6G", "+", ")", ",", "eosinophils", "(", "CD45", "+", "CD3", "/", "CD19", "-", "CD64", "-", "Ly6G", "-", "SiglecF", "+", ")", ",", "T", "cells", "(", "CD45", "+", "CD3", "/", "CD19", "+", ",", "MHCII", "-", ")", ",", "DCs", "(", "CD45", "+", "CD3", "/", "CD19", "-", "CD64", "-", "MHCII", "+", "CD11c", "+", ")", "in", "single", "cell", "suspensions", "of", "the", "ear", "(", "n", "≥", "4", ")", ".", "mRNA", "expression", "levels", "of", "the", "indicated", "genes", "in", "ears", "relative", "to", "reference", "genes", "(", "Hprt1", ",", "Rpl13a", "and", "Tbp1", ")", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "mouse", ";", "the", "line", "represents", "the", "mean", "value", "(", "n", "≥", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Changes in relative body weight and ear thickness upon CARD14E138A induction with tamoxifen. Malt1EKO = Malt1fl/fl. The combined results of five independent experiments are shown (Malt1+/+ WT n=17, Malt1fl/fl WT n=8, Malt1+/+ ieCARD14E138A n=18, Malt1fl/fl ieCARD14E138A n=12).Representative H&E-stained histological sections of ear tissue of tamoxifen-treated mice (Scale bar represents 200 μm). Arrowheads indicate infiltrates of immune cells.Epidermal thickness measured on ear sections. Each symbol represents the mean of at least ten measurements for each ear; the line represents the mean value. The combined results of three independent experiments are shown.Analysis of infiltrating immune cells in the ears of tamoxifen-treated mice using flow cytometry. Cell count of neutrophils (CD45+ CD3/CD19- CD64- CD11b+ Ly6G+), eosinophils (CD45+ CD3/CD19- CD64- Ly6G- SiglecF+), T cells (CD45+ CD3/CD19+, MHCII-), DCs (CD45+ CD3/CD19- CD64- MHCII+CD11c+) in single cell suspensions of the ear (n≥4).mRNA expression levels of the indicated genes in ears relative to reference genes (Hprt1, Rpl13a and Tbp1). Each symbol represents one mouse; the line represents the mean value (n≥3)."}
{"words": ["Figure", "3Cleavage", "of", "MALT1", "substrates", "CYLD", "and", "BCL10", "as", "analyzed", "by", "western", "blotting", "of", "lysates", "of", "ear", "tissue", "of", "mice", "four", "days", "after", "treatment", "with", "tamoxifen", "and", "MALT1", "inhibitor", "or", "vehicle", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "Each", "lane", "represents", "one", "mouse", ".", "Changes", "in", "relative", "ear", "thickness", "and", "body", "weight", "in", "vehicle", "-", "and", "MALT1", "inhibitor", "-", "treated", "mice", "upon", "CARD14E138A", "induction", ".", "M1", "inh", "=", "MALT1", "inhibitor", ",", "WT", "=", "K14creERTg", "/", "+", "Rosa26", "+", "/", "+", ",", "ieCARD14E138A", "=", "K14creERTg", "/", "+", "Rosa26LSL", "-", "CARD14", "-", "E138A", "/", "+", ".", "Combined", "results", "of", "two", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "WT", "+", "vehicle", ":", "n", "=", "9", ",", "WT", "+", "M1", "inh", ":", "n", "=", "8", ",", "ieCARD14E138A", "+", "vehicle", ":", "n", "=", "9", ",", "ieCARD14E138A", "+", "M1", "inh", ":", "n", "=", "10", ")", ".", "Representative", "histological", "sections", "of", "ear", "tissue", "stained", "with", "hematoxylin", "and", "eosinmeasurements", "of", "epidermal", "thickness", "of", "tamoxifen", "-", "treated", "mice", ".", "Combined", "results", "of", "two", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Each", "symbol", "represents", "the", "mean", "of", "at", "least", "ten", "epidermal", "thickness", "measurements", "for", "each", "ear", ";", "the", "line", "represents", "the", "mean", "value", ".", "IL", "-", "6", "and", "IL", "-", "17a", "production", "by", "ear", "draining", "lymphocytes", "upon", "ex", "vivo", "restimulation", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "anti", "-", "CD28", "for", "3", "days", "(", "n", "≥", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Heatmap", "showing", "relative", "mRNA", "expression", "levels", "of", "the", "indicated", "genes", "in", "ear", "tissue", "normalized", "to", "reference", "genes", ".", "Values", "represent", "median", "of", "each", "group", "(", "n", "≥", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Cleavage of MALT1 substrates CYLD and BCL10 as analyzed by western blotting of lysates of ear tissue of mice four days after treatment with tamoxifen and MALT1 inhibitor or vehicle. Actin is shown as a loading control. Each lane represents one mouse.Changes in relative ear thickness and body weight in vehicle- and MALT1 inhibitor-treated mice upon CARD14E138A induction. M1 inh= MALT1 inhibitor, WT = K14creERTg/+ Rosa26+/+, ieCARD14E138A = K14creERTg/+ Rosa26LSL-CARD14-E138A/+. Combined results of two independent experiments are shown (WT + vehicle: n=9, WT + M1 inh: n=8, ieCARD14E138A + vehicle: n=9, ieCARD14E138A + M1 inh: n=10).Representative histological sections of ear tissue stained with hematoxylin and eosinmeasurements of epidermal thickness of tamoxifen-treated mice. Combined results of two independent experiments are shown. Each symbol represents the mean of at least ten epidermal thickness measurements for each ear; the line represents the mean value.IL-6 and IL-17a production by ear draining lymphocytes upon ex vivo restimulation with anti-CD3/anti-CD28 for 3 days (n≥3 biological replicates).Heatmap showing relative mRNA expression levels of the indicated genes in ear tissue normalized to reference genes. Values represent median of each group (n≥3)."}
{"words": ["Figure", "1Comparison", "of", "the", "phenotype", "of", "ENCCs", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", "at", "weeks", "2", ",", "4", "and", "6", "after", "BAC", "treatment", ".", "The", "intestinal", "extracts", "from", "the", "sham", "-", "treated", "guts", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "A", ")", "Morphology", "of", "the", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "on", "days", "2", "and", "4", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "The", "proliferation", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "is", "represented", "by", "neurosphere", "diameter", "(", "B", ")", "and", "change", "in", "diameter", "on", "day", "4", "compared", "with", "day", "2", "(", "C", ")", ".", "Comparison", "of", "the", "phenotype", "of", "ENCCs", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", "at", "weeks", "2", ",", "4", "and", "6", "after", "BAC", "treatment", ".", "The", "intestinal", "extracts", "from", "the", "sham", "-", "treated", "guts", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "D", ")", "ENCC", "viability", "assessed", "by", "CCK", "-", "8", "assay", ".", "Comparison", "of", "the", "phenotype", "of", "ENCCs", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", "at", "weeks", "2", ",", "4", "and", "6", "after", "BAC", "treatment", ".", "The", "intestinal", "extracts", "from", "the", "sham", "-", "treated", "guts", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "E", ")", "ENCCs", "number", "analyzed", "by", "nuclear", "staining", "with", "DAPI", ".", "Comparison", "of", "the", "phenotype", "of", "ENCCs", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", "at", "weeks", "2", ",", "4", "and", "6", "after", "BAC", "treatment", ".", "The", "intestinal", "extracts", "from", "the", "sham", "-", "treated", "guts", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "F", ")", "Migration", "of", "ENCCs", "evaluated", "by", "transwell", "plate", "assay", "and", "stain", "with", "crystal", "violet", ",", "Comparison", "of", "the", "phenotype", "of", "ENCCs", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", "at", "weeks", "2", ",", "4", "and", "6", "after", "BAC", "treatment", ".", "The", "intestinal", "extracts", "from", "the", "sham", "-", "treated", "guts", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "G", ")", "ENCC", "apoptosis", "determined", "by", "AnnexinV", "-", "FITC", "/", "PI", "stain", "and", "flow", "cytometry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Comparison of the phenotype of ENCCs treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats at weeks 2, 4 and 6 after BAC treatment. The intestinal extracts from the sham-treated guts were used as controls. (A) Morphology of the ENCC-derived neurospheres on days 2 and 4. (B-C) The proliferation of ENCC-derived neurospheres is represented by neurosphere diameter (B) and change in diameter on day 4 compared with day 2 (C).Comparison of the phenotype of ENCCs treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats at weeks 2, 4 and 6 after BAC treatment. The intestinal extracts from the sham-treated guts were used as controls. (D) ENCC viability assessed by CCK-8 assay.Comparison of the phenotype of ENCCs treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats at weeks 2, 4 and 6 after BAC treatment. The intestinal extracts from the sham-treated guts were used as controls. (E) ENCCs number analyzed by nuclear staining with DAPI.Comparison of the phenotype of ENCCs treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats at weeks 2, 4 and 6 after BAC treatment. The intestinal extracts from the sham-treated guts were used as controls. (F) Migration of ENCCs evaluated by transwell plate assay and stain with crystal violet,Comparison of the phenotype of ENCCs treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats at weeks 2, 4 and 6 after BAC treatment. The intestinal extracts from the sham-treated guts were used as controls. (G) ENCC apoptosis determined by AnnexinV-FITC/PI stain and flow cytometry."}
{"words": ["Figure", "2Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "(", "A", "-", "D", ")", "Cluster", "analysis", "at", "the", "(", "A", ")", "phylum", "and", "(", "C", ")", "genus", "levels", ".", "A", "column", "accumulation", "diagram", "of", "the", "top", "10", "most", "abundant", "(", "B", ")", "phyla", "and", "(", "D", ")", "genera", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "Inter", "-", "group", "diversity", "analysis", "to", "compare", "the", "differences", "in", "(", "H", ")", "intestinal", "microbiota", "The", "species", "indicated", "in", "red", "are", "linked", "to", "SCFAs", "production", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "metabolic", "mass", "spectrometry", "to", "compare", "the", "differences", "(", "I", ")", "SCFAs", "metabolites", "between", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "(", "J", ")", "Representative", "HE", "staining", "and", "quantification", "to", "assess", "the", "intestinal", "mucosal", "injury", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "(", "K", ")", "Representative", "IHC", "stain", "and", "quantification", "of", "CRP", "and", "TNF", "-", "α", "levels", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", "and", "inflammation", "in", "the", "hypoganglionosis", "and", "sham", "rats", ".", "For", "hypoganglionosis", ",", "fecal", "samples", "from", "the", "narrow", "segments", "(", "NS", ",", "BAC", "-", "treated", ",", "hypoganglionic", ")", "and", "expanded", "segments", "(", "ES", ",", "proximal", "to", "narrow", "segments", ",", "with", "abnormal", "ganglion", ")", "colon", "are", "analyzed", ",", "respectively", ".", "(", "L", ")", "Representative", "immunofluorescence", "stain", "and", "quantification", "of", "β", "-", "catenin", "levels", ".", "Nuclei", "were", "stained", "blue", "with", "DAPI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. (A-D) Cluster analysis at the (A) phylum and (C) genus levels. A column accumulation diagram of the top 10 most abundant (B) phyla and (D) genera.Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. Inter-group diversity analysis to compare the differences in (H) intestinal microbiota The species indicated in red are linked to SCFAs production.Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. metabolic mass spectrometry to compare the differences (I) SCFAs metabolites between the hypoganglionosis and sham rats.Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. (J) Representative HE staining and quantification to assess the intestinal mucosal injury.Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. (K) Representative IHC stain and quantification of CRP and TNF-α levels.Comparison of fecal microbial species and inflammation in the hypoganglionosis and sham rats. For hypoganglionosis, fecal samples from the narrow segments (NS, BAC-treated, hypoganglionic) and expanded segments (ES, proximal to narrow segments, with abnormal ganglion) colon are analyzed, respectively. (L) Representative immunofluorescence stain and quantification of β-catenin levels. Nuclei were stained blue with DAPI."}
{"words": ["Figure", "3Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "The", "diameter", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "on", "day", "2", "(", "A", ")", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "ENCC", "viability", "assessed", "by", "CCK", "-", "8", "assay", "(", "B", ")", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Migration", "of", "ENCCs", "using", "transwell", "plate", "assay", "and", "stain", "with", "crystal", "violet", "(", "C", ")", ",", "scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "C", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "ENCC", "apoptosis", "determined", "by", "AnnexinV", "-", "FITC", "/", "PI", "stain", "and", "flow", "cytometry", "(", "E", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "E", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "(", "G", ")", "Graphical", "protocol", "and", "weight", "change", "in", "the", "hypoganglionosis", ":", "untreated", "and", "treated", "with", "ENCCs", "only", ",", "or", "ENCCs", "+", "FMT", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "(", "H", ")", "Laparoscopic", "analysis", "indicating", "that", "the", "same", "segments", "were", "treated", "with", "BAC", "in", "all", "the", "groups", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "(", "I", ")", "Delay", "in", "distal", "colonic", "transit", "time", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "Comparison", "of", "neuronal", "markers", ".", "(", "J", ")", "Immunofluorescence", "stain", "and", "number", "of", "PGP9", ".", "5", "+", "cells", ".", "Nuclei", "were", "stained", "blue", "with", "DAPI", ";", "Triangles", "indicate", "the", "PGP9", ".", "5", "+", "cell", ".", "Comparison", "of", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "treated", "with", "the", "intestinal", "extract", "from", "hypoganglionosis", "rats", ",", "hypoganglionosis", "treated", "with", "Fecal", "microbiota", "transplantation", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "rat", ".", "Comparison", "of", "neuronal", "markers", ".", "(", "K", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "Tuj1", "and", "GFP", "localization", "at", "the", "injection", "and", "adjacent", "sides", ".", "Asterisks", "and", "triangles", "indicate", "the", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "+", "cells", "and", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "-", "cells", ",", "respectively", ".", "Nuclei", "were", "stained", "blue", "with", "DAPI", ".", "(", "L", "-", "M", ")", "Number", "of", "Tuj1", "+", ",", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "+", "cells", "(", "L", ")", "and", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "-", "cells", "(", "M", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. The diameter of ENCC-derived neurospheres on day 2 (A).Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. ENCC viability assessed by CCK-8 assay (B).Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. (C-D) Migration of ENCCs using transwell plate assay and stain with crystal violet (C), scale bar, 200 µm. (D) Quantification of C. (E-F) ENCC apoptosis determined by AnnexinV-FITC/PI stain and flow cytometry (E). (F) Quantification of E.Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. (G) Graphical protocol and weight change in the hypoganglionosis: untreated and treated with ENCCs only, or ENCCs+FMT.Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. (H) Laparoscopic analysis indicating that the same segments were treated with BAC in all the groups.Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. (I) Delay in distal colonic transit time.Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. Comparison of neuronal markers. (J) Immunofluorescence stain and number of PGP9.5+ cells. Nuclei were stained blue with DAPI; Triangles indicate the PGP9.5+ cell.Comparison of ENCC-derived neurospheres treated with the intestinal extract from hypoganglionosis rats, hypoganglionosis treated with Fecal microbiota transplantation (FMT) and sham rat. Comparison of neuronal markers. (K) Representative immunofluorescence images of Tuj1 and GFP localization at the injection and adjacent sides. Asterisks and triangles indicate the Tuj1+/GFP+ cells and Tuj1+/GFP- cells, respectively. Nuclei were stained blue with DAPI. (L-M) Number of Tuj1+, Tuj1+/GFP+ cells (L) and Tuj1+/GFP- cells(M)."}
{"words": ["Figure", "4Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", ",", "short", "-", "chain", "fatty", "acids", "and", "inflammation", "between", "hypoganglionosis", ":", "untreated", "(", "Hypoganglionosis", ")", "or", "treated", "with", "broad", "-", "range", "antibiotics", "(", ",", "Antibiotic", ")", ",", "broad", "-", "range", "antibiotics", "followed", "by", "FMT", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "groups", ".", "(", "A", "-", "D", ")", "Cluster", "analysis", "at", "the", "(", "A", ")", "phylum", "and", "(", "C", ")", "genus", ".", "Column", "accumulation", "diagrams", "of", "the", "top", "abundant", "microbiota", "at", "the", "(", "B", ")", "phylum", "and", "(", "D", ")", "genus", "levels", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", ",", "short", "-", "chain", "fatty", "acids", "and", "inflammation", "between", "hypoganglionosis", ":", "untreated", "(", "Hypoganglionosis", ")", "or", "treated", "with", "broad", "-", "range", "antibiotics", "(", ",", "Antibiotic", ")", ",", "broad", "-", "range", "antibiotics", "followed", "by", "FMT", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "groups", ".", "(", "G", ")", "SCFAs", "subsets", "in", "the", "feces", "and", "intestinal", "extracts", ",", "analyzed", "by", "targeted", "mass", "spectrometry", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", ",", "short", "-", "chain", "fatty", "acids", "and", "inflammation", "between", "hypoganglionosis", ":", "untreated", "(", "Hypoganglionosis", ")", "or", "treated", "with", "broad", "-", "range", "antibiotics", "(", ",", "Antibiotic", ")", ",", "broad", "-", "range", "antibiotics", "followed", "by", "FMT", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "groups", ".", "(", "H", ")", "IL", "-", "10", ",", "IL", "-", "17", ",", "and", "TNF", "-", "α", "levels", "in", "serum", "and", "intestinal", "extracts", ",", "assessed", "by", "ELISA", ".", "Comparison", "of", "fecal", "microbial", "species", ",", "short", "-", "chain", "fatty", "acids", "and", "inflammation", "between", "hypoganglionosis", ":", "untreated", "(", "Hypoganglionosis", ")", "or", "treated", "with", "broad", "-", "range", "antibiotics", "(", ",", "Antibiotic", ")", ",", "broad", "-", "range", "antibiotics", "followed", "by", "FMT", "(", "FMT", ")", "and", "sham", "groups", ".", "Correlation", "analysis", "of", "acetate", ",", "propionate", "or", "butyrate", "with", "IL", "-", "17", "in", "the", "intestinal", "extracts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Comparison of fecal microbial species, short-chain fatty acids and inflammation between hypoganglionosis: untreated (Hypoganglionosis) or treated with broad-range antibiotics (, Antibiotic), broad-range antibiotics followed by FMT (FMT) and sham groups. (A-D) Cluster analysis at the (A) phylum and (C) genus. Column accumulation diagrams of the top abundant microbiota at the (B) phylum and (D) genus levels.Comparison of fecal microbial species, short-chain fatty acids and inflammation between hypoganglionosis: untreated (Hypoganglionosis) or treated with broad-range antibiotics (, Antibiotic), broad-range antibiotics followed by FMT (FMT) and sham groups. (G) SCFAs subsets in the feces and intestinal extracts, analyzed by targeted mass spectrometry.Comparison of fecal microbial species, short-chain fatty acids and inflammation between hypoganglionosis: untreated (Hypoganglionosis) or treated with broad-range antibiotics (, Antibiotic), broad-range antibiotics followed by FMT (FMT) and sham groups. (H) IL-10, IL-17, and TNF-α levels in serum and intestinal extracts, assessed by ELISA.Comparison of fecal microbial species, short-chain fatty acids and inflammation between hypoganglionosis: untreated (Hypoganglionosis) or treated with broad-range antibiotics (, Antibiotic), broad-range antibiotics followed by FMT (FMT) and sham groups. Correlation analysis of acetate, propionate or butyrate with IL-17 in the intestinal extracts."}
{"words": ["Figure", "5Phenotype", "analysis", "of", "ENCCs", "treated", "with", "SCFAs", ".", "(", "A", ")", "ENCC", "viability", "assessed", "by", "CCK", "-", "8", "assay", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "NC", "group", ".", "Phenotype", "analysis", "of", "ENCCs", "treated", "with", "SCFAs", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Migration", "of", "ENCCs", "evaluated", "using", "transwell", "plate", "assay", "and", "stain", "with", "crystal", "violet", "(", "B", ")", ";", "Scale", "bars", "represent", "200", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "B", ".", "Phenotype", "analysis", "of", "ENCCs", "treated", "with", "SCFAs", ".", "Analysis", "of", "different", "IL", "-", "17", "concentrations", "on", "ENCC", "viability", "(", "D", ")", "Phenotype", "analysis", "of", "ENCCs", "treated", "with", "SCFAs", ".", "Analysis", "of", "different", "IL", "-", "17", "concentrations", "50", "ng", "/", "mL", "IL", "-", "17", "on", "ENCC", "migration", "(", "E", ",", "F", ")", "Phenotype", "analysis", "of", "ENCCs", "treated", "with", "SCFAs", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "ENCC", "apoptosis", "determined", "by", "AnnexinV", "-", "FITC", "/", "PI", "stain", "and", "flow", "cytometry", "(", "G", ")", ".", "(", "H", ")", ".", "Quantification", "of", "G", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Phenotype analysis of ENCCs treated with SCFAs. (A) ENCC viability assessed by CCK-8 assay. Data are normalized to the NC group.Phenotype analysis of ENCCs treated with SCFAs. (B-C) Migration of ENCCs evaluated using transwell plate assay and stain with crystal violet (B); Scale bars represent 200 µm. (C) Quantitative analysis of B.Phenotype analysis of ENCCs treated with SCFAs. Analysis of different IL-17 concentrations on ENCC viability (D)Phenotype analysis of ENCCs treated with SCFAs. Analysis of different IL-17 concentrations 50 ng/mL IL-17 on ENCC migration (E, F)Phenotype analysis of ENCCs treated with SCFAs. (G-H) ENCC apoptosis determined by AnnexinV-FITC/PI stain and flow cytometry (G). (H). Quantification of G."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Delay", "in", "distal", "colonic", "transit", "time", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Representative", "immunofluorescent", "images", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "number", "of", "PGP9", ".", "5", "+", "cells", ".", "Nuclei", "were", "stained", "blue", "with", "DAPI", ";", "Triangles", "indicate", "the", "PGP9", ".", "5", "+", "cell", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunofluorescent", "images", "of", "Tuj1", "and", "GFP", "localization", "at", "the", "injection", "and", "adjacent", "sides", ".", "Asterisks", "and", "triangles", "indicate", "the", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "+", "cells", "and", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "-", "cells", ",", "respectively", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "Number", "of", "Tuj1", "+", "and", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "+", "cells", "(", "F", ")", "and", "Tuj1", "+", "/", "GFP", "-", "cells", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Delay in distal colonic transit time.(C-D) Representative immunofluorescent images (C) and (D) number of PGP9.5+ cells. Nuclei were stained blue with DAPI; Triangles indicate the PGP9.5+ cell.(E) Representative immunofluorescent images of Tuj1 and GFP localization at the injection and adjacent sides. Asterisks and triangles indicate the Tuj1+/GFP+ cells and Tuj1+/GFP- cells, respectively.(F-G) Number of Tuj1+ and Tuj1+/GFP+ cells (F) and Tuj1+/GFP- cells(G)."}
{"words": ["Figure", "7Volcano", "diagram", "shows", "differentially", "expressed", "genes", "(", "DEGs", ")", "in", "ENCCs", "after", "SCFAs", "and", "IL", "-", "17A", "intervention", ",", "with", "up", "-", "regulated", "and", "down", "-", "regulated", "genes", "shown", "in", "yellow", "and", "blue", ",", "respectively", "(", "|", "log", "fold", "change", "|", "≥", "0", ".", "5", "and", "adjusted", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "E", ")", "ENCC", "viability", "assessed", "by", "CCK", "-", "8", "assay", "after", "intervention", "with", "MEK1", "/", "2", "inhibitor", "(", "U0126", ",", "50", "μM", ")", ",", "p38", "inhibitor", "(", "SB203580", ",", "1", "μM", ")", ",", "JNK", "inhibitor", "(", "SP600125", ",", "50", "μM", ")", "and", "MER5", "inhibitor", "(", "BIX", "02189", ",", "10", "μM", ")", ".", "Diameter", "analyses", "of", "the", "ENCC", "-", "derived", "neurospheres", "(", "F", ")", ",", "migration", "of", "ENCCs", "evaluated", "using", "transwell", "plate", "assay", "and", "stain", "with", "crystal", "violet", "on", "day", "2", "(", "G", ",", "H", ")", "show", "that", "MEK1", "/", "2", "inhibitor", "U0126", "suppressed", "SCFA", "-", "induced", "ENCC", "proliferation", "and", "migration", ".", "migration", "of", "ENCCs", "evaluated", "using", "transwell", "plate", "assay", "show", "that", "MEK1", "/", "2", "inhibitor", "U0126", "suppressed", "SCFA", "-", "induced", "ENCC", "proliferation", "and", "migration", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Volcano diagram shows differentially expressed genes (DEGs) in ENCCs after SCFAs and IL-17A intervention, with up-regulated and down-regulated genes shown in yellow and blue, respectively (|log fold change|≥0.5 and adjusted p<0.05).(E) ENCC viability assessed by CCK-8 assay after intervention with MEK1/2 inhibitor (U0126, 50 μM), p38 inhibitor (SB203580, 1 μM), JNK inhibitor (SP600125, 50 μM) and MER5 inhibitor (BIX 02189, 10 μM).Diameter analyses of the ENCC-derived neurospheres (F),migration of ENCCs evaluated using transwell plate assay and stain with crystal violet on day 2 (G, H) show that MEK1/2 inhibitor U0126 suppressed SCFA-induced ENCC proliferation and migration.migration of ENCCs evaluated using transwell plate assay show that MEK1/2 inhibitor U0126 suppressed SCFA-induced ENCC proliferation and migration."}
{"words": ["Figure", "1B", "Levels", "of", "INPP5Eprotein", "72", "h", "after", "transfection", "of", "N1E", "-", "115", "cells", "with", "control", "(", "siControl", ")", "or", "INPP5E", "-", "specific", "siRNAs", "(", "siINPP5E", "#", "1", "or", "#", "2", ")", ",", "as", "determined", "by", "immunoblot", ".", "C", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "for", "2", "h", "in", "growth", "medium", "with", "or", "without", "125", "nM", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ".", "A1", ")", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "anti", "-", "p62", ",", "anti", "-", "LC3", ",", "and", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "D", "Quantitation", "of", "protein", "signal", "intensities", "from", "immunoblots", "in", "C", "showing", "LC3", "-", "II", "(", "left", ")", "or", "p62", "(", "right", ")", "levels", ",", "following", "normalization", "to", "the", "control", "proteinGAPDH", ".", "Because", "Baf", ".", "A1", "inhibits", "autophagosome", "-", "lysosome", "fusion", "and", "degradation", "within", "lysosomes", "via", "inhibition", "of", "vacuolar", "-", "type", "H", "+", "-", "ATPase", ",", "it", "is", "possible", "to", "measure", "autophagic", "flux", ",", "i", ".", "e", ".", ",", "the", "degradation", "of", "autophagic", "substrates", "such", "as", "p62", "and", "LC3", "-", "II", ",", "by", "calculating", "the", "difference", "of", "the", "signal", "intensities", "of", "these", "proteins", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Baf", ".", "A1", ".", "Results", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "E", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "F", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "LC3puncta", "per", "cell", ",", "as", "described", "in", "E", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "G", "Electron", "micrographsin", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Arrowheads", "indicate", "autophagosomes", ".", "Bar", ",", "1", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Levels of INPP5Eprotein 72 h after transfection of N1E-115 cells with control (siControl) or INPP5E-specific siRNAs (siINPP5E #1 or #2), as determined by immunoblot.C N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured for 2 h in growth medium with or without 125 nM bafilomycin A1 (Baf.A1), and then analyzed by immunoblot using anti-p62, anti-LC3, and anti-GAPDH antibodies.D Quantitation of protein signal intensities from immunoblots in C showing LC3-II (left) or p62 (right) levels, following normalization to the control proteinGAPDH. Because Baf.A1 inhibits autophagosome-lysosome fusion and degradation within lysosomes via inhibition of vacuolar-type H+-ATPase, it is possible to measure autophagic flux, i.e., the degradation of autophagic substrates such as p62 and LC3-II, by calculating the difference of the signal intensities of these proteins in the presence and absence of Baf.A1. Results represent the mean ± s.d. of three independent experiments. **, P < 0.01.E N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-LC3 antibodies and analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Bar, 10 µm.F Quantitation of the number of LC3puncta per cell, as described in E (mean ± s.d.; n > 100 cells from three independent experiments). **, P < 0.01.G Electron micrographsin N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Arrowheads indicate autophagosomes. Bar, 1 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", ",", "siINPP5E", ",", "or", "siAtg2a", "/", "2b", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "The", "post", "-", "nuclear", "fraction", "(", "PNS", ")", "was", "separated", "into", "LSP", ",", "HSP", ",", "and", "HSS", "fractions", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblots", "using", "anti", "-", "p62", ",", "anti", "-", "LC3", ",", "and", "GAPDH", "antibodies", ".", "The", "subfractions", "were", "treated", "with", "proteinase", "K", "(", "Pro", ".", "K", ")", "with", "or", "without", "Triton", "X", "-", "100", ".", "Quantitation", "of", "protein", "signal", "intensities", "from", "immunoblots", "showing", "LC3", "-", "II", "(", "left", ")", "or", "p62", "(", "right", ")", "levels", ",", "following", "normalization", "to", "the", "control", "protein", "GAPDH", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "B", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "mCherry", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "for", "2", "h", "in", "growth", "medium", "containing", "200", "nM", "Torin1", "with", "protease", "inhibitors", "(", "10", "µg", "/", "ml", "Pepstatin", "A", "and", "10", "µg", "/", "ml", "E", "-", "64", "-", "d", ")", ".", "Because", "the", "treatment", "of", "protease", "inhibitors", "inhibits", "lysosomal", "degradation", ",", "LC3puncta", "persist", "even", "ifautophagosomes", "fuse", "with", "lysosomes", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Percentages", "of", "colocalization", "of", "LC3", "dots", "with", "LAMP1", "dots", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "20", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A N1E-115 cells treated with siControl, siINPP5E, or siAtg2a/2b were cultured in growth medium. The post-nuclear fraction (PNS) was separated into LSP, HSP, and HSS fractions, and then analyzed by immunoblots using anti-p62, anti-LC3, and GAPDH antibodies. The subfractions were treated with proteinase K (Pro. K) with or without Triton X-100. Quantitation of protein signal intensities from immunoblots showing LC3-II (left) or p62 (right) levels, following normalization to the control protein GAPDH. **, P < 0.01; *, P < 0.05.B NIE-115 cells stably expressing LAMP1-mCherry treated with siControl or siINPP5Es were cultured for 2 h in growth medium containing 200 nM Torin1 with protease inhibitors (10 µg/ml Pepstatin A and 10 µg/ml E-64-d). Because the treatment of protease inhibitors inhibits lysosomal degradation, LC3puncta persist even ifautophagosomes fuse with lysosomes. Cells were fixed and stained with anti-LC3 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm.C Percentages of colocalization of LC3 dots with LAMP1 dots (mean ± s.d.; n > 20 cells from three independent experiments). **, P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3B", "N1E", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "mSt", "-", "INPP5E", "(", "WT", ",", "D477N", ",", "∆", "CAAX", ",", "or", "295", "-", "644", ")", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5E", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", "with", "or", "without", "125", "nM", "Baf", ".", "A1", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "The", "mSt", "-", "INPP5Es", "used", "in", "this", "study", "were", "resistant", "to", "mouse", "siINPP5E", "because", "target", "sequence", "of", "the", "siRNA", "is", "different", "from", "the", "human", "correspondent", "sequence", ".", "C", "Quantitation", "of", "protein", "signal", "intensities", "from", "immunoblots", "in", "B", ",", "showing", "differences", "in", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Baf", ".", "A1", "following", "normalization", "to", "the", "control", "proteinGAPDH", ".", "Results", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "D", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "mSt", "-", "INPP5E", "(", "WT", ",", "D477N", ",", "or", "ΔCAAX", ")", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "The", "number", "showing", "to", "the", "right", "side", "indicates", "the", "colocalization", "rate", "of", "LAMP1", "with", "mSt", "-", "INPP5E", ".", "Bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B N1E-115 cells stably expressing mSt-INPP5E (WT, D477N, ∆CAAX, or 295-644) treated with siControl or siINPP5E were cultured in growth medium with or without 125 nM Baf.A1 for 2 h, and then analyzed by immunoblot using anti-LC3 and anti-GAPDH antibodies. The mSt-INPP5Es used in this study were resistant to mouse siINPP5E because target sequence of the siRNA is different from the human correspondent sequence.C Quantitation of protein signal intensities from immunoblots in B, showing differences in LC3-II levels in the presence and absence of Baf.A1 following normalization to the control proteinGAPDH. Results represent means ± s.d. of three independent experiments. **, P < 0.01; *, P < 0.05.D NIE-115 cells stably expressing mSt-INPP5E (WT, D477N, or ΔCAAX) were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. The number showing to the right side indicates the colocalization rate of LAMP1 with mSt-INPP5E. Bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "4A", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", "with", "20", "µg", "/", "ml", "DQ", "-", "BSA", "for", "12", "h", "and", "chased", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "B", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "in", "A", "showing", "colocalization", "of", "DQ", "-", "BSA", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "50", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Baf", ".", "A1", "was", "used", "as", "a", "control", "for", "inhibition", "of", "delivery", "and", "degradation", "of", "DQ", "-", "BSA", "via", "the", "endocytic", "pathway", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "non", "significant", ".", "C", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", ",", "siINPP5Es", ",", "or", "siCHMP5", "were", "stimulated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "EGF", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "anti", "-", "EGFR", "and", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "antibodies", ".", "Levels", "of", "CHMP5", "mRNA72", "h", "after", "transfection", "of", "N1E", "-", "115", "cells", "with", "siControl", "or", "siCHMP5", ",", "as", "analyzed", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "D", "Quantitation", "of", "EGFR", "degradation", "ratio", "in", "C", ".", "Results", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium with 20 µg/ml DQ-BSA for 12 h and chased for 2 h. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 antibodies and analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm.B Quantitation of signal intensities in A showing colocalization of DQ-BSA with LAMP1 (means ± s.d.; n > 50 cells from three independent experiments). Baf.A1 was used as a control for inhibition of delivery and degradation of DQ-BSA via the endocytic pathway. **, P < 0.01; n.s., non significant.C N1E-115 cells treated with siControl, siINPP5Es, or siCHMP5 were stimulated with 100 ng/ml EGF for the indicated time periods, and then analyzed by immunoblot using anti-EGFR and anti-α-tubulin antibodies. Levels of CHMP5 mRNA72 h after transfection of N1E-115 cells with siControl or siCHMP5, as analyzed by RT-PCR.D Quantitation of EGFR degradation ratio in C. Results represent means ± s.d. of three independent experiments. **, P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5A", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "mSt", "-", "2xML1N", "or", "-", "2xPLCδ1PH", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", "with", "or", "without", "200", "nM", "Torin1", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "or", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "B", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "mSt", "-", "2xML1N", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "C", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "in", "B", "showing", "mSt", "-", "2xML1N", "colocalizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "D", "N1E", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "2xML1N", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5E", "were", "transiently", "transfected", "with", "mSt", "-", "INPP5E", "(", "WT", ",", "D477N", ")", ".", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "showing", "GFP", "-", "2xML1N", "colocalizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "20", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "E", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "mCherry", "-", "2xFYVE", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "F", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "in", "E", "showing", "mCherry", "-", "2xFYVE", "colocalizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A NIE-115 cells stably expressing mSt-2xML1N or -2xPLCδ1PH were cultured in growth medium with or without 200 nM Torin1. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 or anti-LC3 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm.B NIE-115 cells stably expressing mSt-2xML1N treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm.C Quantitation of signal intensities in B showing mSt-2xML1N colocalizing with LAMP1 (means ± s.d.; n > 100 cells from three independent experiments). **, P < 0.01; *, P < 0.05.D N1E-115 cells stably expressing GFP-2xML1N treated with siControl or siINPP5E were transiently transfected with mSt-INPP5E (WT, D477N). Quantitation of signal intensities showing GFP-2xML1N colocalizing with LAMP1 (means ± s.d.; n > 20 cells from three independent experiments). **, P < 0.01; *, P < 0.05.E NIE-115 cells stably expressing mCherry-2xFYVE treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 antibodies, and then analyzed by immunofluorescence microscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm.F Quantitation of signal intensities in E showing mCherry-2xFYVE colocalizing with LAMP1 (means ± s.d.; n > 100 cells from three independent experiments). **, P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "6A", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", "and", "Phalloidin", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "showing", "Phalloidin", "colocalizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "40", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "B", "N1E", "-", "115", "cells", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5Es", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "phospho", "-", "Y421", "cortactin", "and", "anti", "-", "LAMP1", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantitation", "of", "signal", "intensities", "showing", "cortactin", "(", "pY421", ")", "colocalizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "40", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "C", "N1E", "-", "115", "cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "5", "µM", "Latrunculin", "A", "(", "Lat", "A", ")", "in", "growth", "medium", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "LC3puncta", "per", "cell", ".", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "100", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "D", "NIE", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "LAMP1", "-", "mCherry", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "0", ".", "5", "µM", "Lat", "A", "in", "growth", "medium", "for", "4", "h", ",", "subsequently", "cultured", "with", "200", "nM", "Torin1", "and", "protease", "inhibitors", "(", "10", "µg", "/", "ml", "Pepstatin", "A", "and", "10", "µg", "/", "ml", "E", "-", "64", "-", "d", ")", "for", "2", "h", "(", "Lat", "A", "treatment", "for", "total", "6h", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "immunofluorescencemicroscopy", ".", "Insets", "show", "the", "boxed", "areas", "at", "high", "magnification", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "Percentages", "of", "colocalization", "of", "LC3", "dots", "with", "LAMP1", "dots", "(", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ";", "n", ">", "20", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-LAMP1 antibodies and Phalloidin, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm. Quantitation of signal intensities showing Phalloidin colocalizing with LAMP1 (means ± s.d.; n > 40 cells from three independent experiments). **, P < 0.01.B N1E-115 cells treated with siControl or siINPP5Es were cultured in growth medium. Cells were fixed and stained with anti-phospho-Y421 cortactin and anti-LAMP1 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm. Quantitation of signal intensities showing cortactin (pY421) colocalizing with LAMP1 (means ± s.d.; n > 40 cells from three independent experiments). **, P < 0.01.C N1E-115 cells were treated with 0.5 µM Latrunculin A (Lat A) in growth medium for 6 h. Cells were fixed and stained with anti-LC3 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Bar, 10 µm. Quantitation of the number of LC3puncta per cell. (mean ± s.d.; n > 100 cells from three independent experiments). **, P < 0.01.D NIE-115 cells stably expressing LAMP1-mCherry were treated with DMSO or 0.5 µM Lat A in growth medium for 4 h, subsequently cultured with 200 nM Torin1 and protease inhibitors (10 µg/ml Pepstatin A and 10 µg/ml E-64-d) for 2 h (Lat A treatment for total 6h). Cells were fixed and stained with anti-LC3 antibodies, and then analyzed by immunofluorescencemicroscopy. Insets show the boxed areas at high magnification. Bar, 10 µm. Percentages of colocalization of LC3 dots with LAMP1 dots (mean ± s.d.; n > 20 cells from three independent experiments). **, P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "7B", "N1E", "-", "115", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "mutants", "treated", "with", "siControl", "or", "siINPP5E", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", "with", "or", "without", "125", "nM", "Baf", ".", "A1", "for", "2", "h", ",", "and", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "The", "mutants", "were", "resistant", "to", "mouse", "siINPP5E", "because", "target", "sequence", "of", "the", "siRNA", "is", "different", "from", "the", "human", "correspondent", "sequence", ".", "C", "Quantitation", "of", "protein", "signal", "intensities", "from", "immunoblots", "in", "B", "showing", "differences", "in", "LC3", "-", "II", "levels", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Baf", ".", "A1", "following", "normalization", "to", "the", "control", "proteinGAPDH", ".", "Results", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B N1E-115 cells stably expressing the indicated mutants treated with siControl or siINPP5E were cultured in growth medium with or without 125 nM Baf.A1 for 2 h, and analyzed by immunoblot using anti-LC3 and anti-GAPDH antibodies. The mutants were resistant to mouse siINPP5E because target sequence of the siRNA is different from the human correspondent sequence.C Quantitation of protein signal intensities from immunoblots in B showing differences in LC3-II levels in the presence and absence of Baf.A1 following normalization to the control proteinGAPDH. Results represent means ± s.d. of three independent experiments. **, P < 0.01; *, P < 0.05."}
{"words": ["figf1C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "plasmid", "in", "nutrient", "-", "rich", "or", "starvation", "medium", ".", "(", "a", ")", "Top", ":", "confocal", "microscopy", "of", "GFP", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Bottom", ":", "percentage", "of", "cells", "containing", "more", "than", "five", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "dots", "per", "cell", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "C38", "cells", ";", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", ".", "(", "b", ")", "Left", ":", "electron", "microscopy", "of", "starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "The", "right", "-", "hand", "images", "are", "higher", "magnifications", "showing", "areas", "enriched", "in", "autophagosomes", "in", "C38", "cells", "(", "arrows", ")", "and", "perinuclear", "mitochondria", "in", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "nm", ".", "Right", ":", "numbers", "of", "autophagosomes", "per", "cell", "counted", "in", "20", "cells", "per", "experiment", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "C38", "cells", ";", "ANOVA", ".", "(", "c", ")", "Fluorescence", "-", "activated", "cell", "sorting", "(", "FACS", ")", "analysis", "after", "staining", "with", "fluorescent", "dye", "DiOC6", "in", "starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Immunoblot", "of", "LC3", "in", "starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", "(", "d", ")", "and", "IB3", "-", "1", "cells", "(", "e", ")", "after", "incubation", "with", "E64d", "and", "pepstatin", "A", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Immunoblots", "(", "IB", ")", "of", "polyubiquitin", "(", "f", ")", "in", "starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Immunoblots", "(", "IB", ")", "of", "p62", "(", "g", ")", "in", "starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "h", ")", "Immunoblot", "of", "LC3", "and", "p62", "in", "control", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "CF", "(", "n", "=", "10", ")", "human", "nasal", "mucosa", ".", "(", "i", ")", "Number", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", "(", "per", "104", "mm", "−", "2", "of", "mucosa", ")", "in", "control", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "CF", "(", "n", "=", "10", ")", "human", "nasal", "mucosa", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", "versus", "controls", ";", "ANOVA", ".", "(", "j", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "p62", "in", "control", "and", "CF", "human", "nasal", "mucosa", ".", "Representative", "images", "from", "ten", "patients", "with", "CF", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ";", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "k", ")", "Number", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "lung", "tissues", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "CftrF508del", "mice", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "lung", "tissues", "from", "ten", "mice", "per", "group", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "WT", "mice", ";", "ANOVA", ".", "(", "l", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "p62", "in", "WT", "and", "CftrF508del", "homozygous", "mice", ".", "Representative", "staining", "from", "at", "least", "five", "airway", "epithelial", "areas", "per", "mouse", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "L", ",", "lumen", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1C38 and IB3-1 cells transfected with GFP-LC3 plasmid in nutrient-rich or starvation medium. (a) Top: confocal microscopy of GFP. N, nucleus. Scale bar, 10 μm. Bottom: percentage of cells containing more than five GFP-LC3 punctate dots per cell. Means ± s.d. (n = 5). Asterisk, P 0.001 versus C38 cells; analysis of variance (ANOVA).(b) Left: electron microscopy of starved C38 and IB3-1 cells. The right-hand images are higher magnifications showing areas enriched in autophagosomes in C38 cells (arrows) and perinuclear mitochondria in IB3-1 cells. N, nucleus. Scale bar, 250 nm. Right: numbers of autophagosomes per cell counted in 20 cells per experiment. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus C38 cells; ANOVA.(c) Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis after staining with fluorescent dye DiOC6 in starved C38 and IB3-1 cells.(d, e) Immunoblot of LC3 in starved C38 and IB3-1 cells (d) and IB3-1 cells (e) after incubation with E64d and pepstatin A.(f, g) Immunoblots (IB) of polyubiquitin (f) in starved C38 and IB3-1 cells. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(f, g) Immunoblots (IB) of p62 (g) in starved C38 and IB3-1 cells. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(h) Immunoblot of LC3 and p62 in control (n = 10) and CF (n = 10) human nasal mucosa. (i) Number of LC3-positive dots (per 104 mm−2 of mucosa) in control (n = 10) and CF (n = 10) human nasal mucosa. Means ± s.d. Asterisk, P 0.01 versus controls; ANOVA.(j) Confocal microscopy of p62 in control and CF human nasal mucosa. Representative images from ten patients with CF. Nuclei counterstained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue). Scale bar, 10 μm.(k) Number of LC3-positive dots in lung tissues from wild-type (WT) and CftrF508del mice. Means ± s.d. for lung tissues from ten mice per group. Asterisk, P 0.001 versus WT mice; ANOVA. (l) Confocal microscopy of p62 in WT and CftrF508del homozygous mice. Representative staining from at least five airway epithelial areas per mouse (n = 10 mice per group). L, lumen. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["figf2", "(", "a", "-", "d", ")", "Starved", "C38", "and", "IB3", "-", "1", "cells", ".", "(", "a", "-", "c", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "beclin", "1", "(", "green", ")", "and", "hVps34", "(", "red", ")", "(", "a", ")", ",", "calnexin", "(", "green", ")", "and", "hVps34", "(", "red", ")", "(", "b", ")", ",", "and", "beclin", "1", "(", "green", ")", "and", "HDAC6", "(", "red", ")", "(", "c", ",", "left", ")", "or", "hVps34", "(", "green", ")", "and", "HDAC6", "(", "red", ")", "(", "c", ",", "right", ")", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "of", "Ambra1", ",", "hVps15", ",", "hVps34", ",", "Atg14L", "and", "beclin", "1", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "e", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "HA", "(", "red", ")", "and", "calnexin", "(", "green", ")", "(", "top", ")", "or", "hVps34", "(", "red", ")", "and", "calnexin", "(", "green", ")", "(", "bottom", ")", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ")", "Left", ":", "confocal", "images", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Right", ":", "percentage", "of", "cells", "containing", "more", "than", "five", "LC3", "-", "positive", "dots", ".", "At", "least", "60", "cells", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "cells", "transfected", "with", "the", "empty", "vector", ";", "ANOVA", ".", "(", "g", ")", "Left", ":", "electron", "microscopy", "of", "HA", "-", "beclin", "1", "-", "transfected", "IB3", "-", "1", "cells", "shows", "areas", "enriched", "in", "autophagosomes", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "250", "nm", ".", "Right", ":", "number", "of", "autophagosomes", "per", "cell", ";", "20", "cells", "were", "counted", "in", "each", "experiment", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "cells", "transfected", "with", "the", "empty", "vector", ";", "ANOVA", ".", "(", "h", ")", "Immunoblot", "of", "HA", "and", "LC3", ".", "(", "i", ")", "Immunoblot", "of", "p62", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "j", ")", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", "in", "WT", "and", "CftrF508del", "mice", ".", "Representative", "of", "seven", "mice", "for", "each", "group", ".", "(", "k", ",", "l", ")", "CftrF508del", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "administered", "intranasally", "with", "a", "lentiviral", "vector", "encoding", "beclin", "1", "(", "LV", "-", "beclin", "1", ")", "or", "GFP", "(", "LV", "-", "GFP", ")", ".", "(", "k", ")", "LC3", "-", "positive", "dots", "per", "mm2", "of", "lung", "tissues", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "lung", "tissues", "from", "three", "mice", "per", "group", ".", "(", "l", ")", "Confocal", "microscopy", "micrographs", "of", "p62", ".", "L", ",", "lumen", ".", "Representative", "stainings", "from", "at", "least", "five", "airway", "epithelial", "areas", "per", "mouse", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a-d) Starved C38 and IB3-1 cells. (a-c) Confocal microscopy images of beclin 1 (green) and hVps34 (red) (a), calnexin (green) and hVps34 (red) (b), and beclin 1 (green) and HDAC6 (red) (c, left) or hVps34 (green) and HDAC6 (red) (c, right). N, nucleus. Scale bar, 10 μm. Yellow indicates co-localization.(d) Immunoblot of Ambra1, hVps15, hVps34, Atg14L and beclin 1. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(e) Confocal microscopy images of HA (red) and calnexin (green) (top) or hVps34 (red) and calnexin (green) (bottom). Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm.(f) Left: confocal images of LC3-positive dots. N, nucleus. Scale bar, 10 μm. Right: percentage of cells containing more than five LC3-positive dots. At least 60 cells were counted in each experiment. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus cells transfected with the empty vector; ANOVA.(g) Left: electron microscopy of HA-beclin 1-transfected IB3-1 cells shows areas enriched in autophagosomes (arrows). Scale bar, 250 nm. Right: number of autophagosomes per cell; 20 cells were counted in each experiment. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus cells transfected with the empty vector; ANOVA.(h) Immunoblot of HA and LC3. (i) Immunoblot of p62. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(j) Immunoblot of beclin 1 in WT and CftrF508del mice. Representative of seven mice for each group.(k, l) CftrF508del mice (n = 3 per group) were administered intranasally with a lentiviral vector encoding beclin 1 (LV-beclin 1) or GFP (LV-GFP). (k) LC3-positive dots per mm2 of lung tissues. Means ± s.d. for lung tissues from three mice per group. (l) Confocal microscopy micrographs of p62. L, lumen. Representative stainings from at least five airway epithelial areas per mouse. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "cultured", "with", "250", "μM", "cystamine", "or", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "human", "TG2", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "IB", ",", "immunoblot", ".", "(", "b", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "cultured", "with", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "(", "50", "μM", ")", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "human", "TG2", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "followed", "by", "incubation", "with", "MG132", ".", "(", "c", ")", "Cells", "immunostained", "with", "anti", "-", "beclin", "1", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "HDAC", "-", "6", "(", "red", ")", "antibodies", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "humanTG2", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "followed", "by", "incubation", "with", "MG132", ".", "(", "d", ")", "FRET", "analysis", "of", "beclin", "1", "-", "Alexa", "546", "(", "Al546", ")", "fluorescence", "after", "HDAC6", "-", "Cy5", "photobleaching", ".", "F", "/", "F0", "indicates", "the", "post", "-", "bleaching", "/", "pre", "-", "bleaching", "fluorescence", "ratio", "of", "Al546", "/", "Cy5", ".", "(", "e", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "human", "TG2", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "Immunoblot", "of", "TG2", ",", "Ambra", "-", "1", ",", "hVps15", ",", "hVps34", ",", "Atg14L", "and", "beclin", "1", "in", "IB3", "-", "1", "cells", "grown", "in", "starvation", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "f", ")", "IB3", "-", "1", "and", "C38", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "1", "μg", "of", "pLPCX", "-", "WT", "-", "TG", "or", "pLPCX", "-", "Cys277Ser", "-", "TG", "or", "the", "empty", "vector", ".", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "cystamine", "or", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "humanPIASy", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "(", "g", ")", "Percentage", "of", "cells", "containing", "more", "than", "five", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "dots", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "control", ";", "ANOVA", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "cystamine", "or", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "humanPIASy", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "(", "h", ")", "Left", ":", "electron", "micrographs", "of", "IB3", "-", "1", "cells", "showing", "areas", "enriched", "in", "autophagosomes", "(", "arrows", ")", "on", "PIASy", "gene", "silencing", ",", "EUK", "-", "134", "or", "cystamine", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "nm", ".", "Right", ":", "number", "of", "autophagosomes", "per", "cell", "counted", "in", "20", "cells", "per", "experiment", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "control", ";", "ANOVA", ".", "(", "i", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "treated", "with", "cystamine", ".", "Immunoblot", "of", "p62", ".", "(", "j", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "treated", "with", "cystamine", "or", "EUK", "-", "134", "or", "transfected", "with", "human", "PIASy", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", "(", "left", ")", "and", "PIASy", "(", "right", ")", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "The", "experiments", "were", "repeated", "three", "times", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", "for", "all", "blots", ".", "Densitometric", "analysis", "of", "blots", "and", "quantitative", "measurement", "of", "co", "-", "localizations", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) IB3-1 cells cultured with 250 μM cystamine or transfected with either 50 nM human TG2 siRNA or scrambled oligonucleotides. IP, immunoprecipitation; IB, immunoblot.(b) IB3-1 cells cultured with the proteasome inhibitor MG132 (50 μM).(c, d) IB3-1 cells transfected with either human TG2 siRNA or scrambled oligonucleotides followed by incubation with MG132. (c) Cells immunostained with anti-beclin 1 (green) and anti-HDAC-6 (red) antibodies. Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm.(c, d) IB3-1 cells transfected with either humanTG2 siRNA or scrambled oligonucleotides followed by incubation with MG132. (d) FRET analysis of beclin 1-Alexa 546 (Al546) fluorescence after HDAC6-Cy5 photobleaching. F/F0 indicates the post-bleaching/pre-bleaching fluorescence ratio of Al546/Cy5.(e) IB3-1 cells were transfected with either human TG2 siRNA or scrambled oligonucleotides. Immunoblot of TG2, Ambra-1, hVps15, hVps34, Atg14L and beclin 1 in IB3-1 cells grown in starvation. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(f) IB3-1 and C38 cells were transfected with either 1 μg of pLPCX-WT-TG or pLPCX-Cys277Ser-TG or the empty vector. Immunoblot of beclin 1. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(g, h) IB3-1 cells were treated with cystamine or 10 mM EUK-134 or transfected with either 50 nM humanPIASy siRNA or scrambled oligonucleotides. (g) Percentage of cells containing more than five GFP-LC3 punctate dots. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus control; ANOVA.(g, h) IB3-1 cells were treated with cystamine or 10 mM EUK-134 or transfected with either 50 nM humanPIASy siRNA or scrambled oligonucleotides. (h) Left: electron micrographs of IB3-1 cells showing areas enriched in autophagosomes (arrows) on PIASy gene silencing, EUK-134 or cystamine. Scale bar, 100 nm. Right: number of autophagosomes per cell counted in 20 cells per experiment. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus control; ANOVA.(i) IB3-1 cells treated with cystamine. Immunoblot of p62.(j) IB3-1 cells treated with cystamine or EUK-134 or transfected with human PIASy siRNA or scrambled oligonucleotides. Immunoblot of beclin 1 (left) and PIASy (right). Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10. The experiments were repeated three times. β-actin was used as loading control for all blots. Densitometric analysis of blots and quantitative measurement of co-localizations are shown in Supplementary Information, Fig. S9."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ",", "b", ")", "C38", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "human", "CFTR", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "(", "a", ",", "b", ")", "or", "cultured", "with", "CFTRinh", "-", "172", "(", "b", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cystamine", "(", "250", "μM", ")", "or", "EUK", "-", "134", "(", "10", "mM", ")", ".", "(", "a", ")", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", ",", "LC3", "and", "p62", "in", "C38", "cells", "on", "starvation", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "b", ")", "Percentage", "of", "cells", "containing", "more", "than", "five", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "dots", "per", "cell", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "scrambled", "oligonucleotides", ";", "circle", ",", "P", "0", ".", "01", "versus", "CFTR", "siRNA", "or", "CFTRinh", "-", "172", ";", "ANOVA", ".", "(", "c", "-", "g", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "-", "CFTRF508del", "or", "pGFP", "(", "empty", "vector", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "250", "μM", "cystamine", ".", "(", "c", ")", "Immunoblot", "of", "TG2", "and", "PIASy", ".", "(", "c", "-", "g", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "-", "CFTRF508del", "or", "pGFP", "(", "empty", "vector", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "250", "μM", "cystamine", ".", "(", "d", ")", "FRET", "analysis", "of", "TG2", "-", "Alexa", "546", "fluorescence", "after", "SUMO", "-", "1", "Cy5", "photobleaching", ".", "(", "c", "-", "g", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "-", "CFTRF508del", "or", "pGFP", "(", "empty", "vector", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "250", "μM", "cystamine", ".", "(", "e", ")", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", "and", "LC3", "in", "A549", "cells", "after", "starvation", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "c", "-", "g", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "-", "CFTRF508del", "or", "pGFP", "(", "empty", "vector", ")", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "mM", "EUK", "-", "134", "or", "250", "μM", "cystamine", ".", "(", "f", ")", "Percentage", "of", "cells", "containing", "more", "than", "five", "GFP", "-", "LC3", "punctate", "dots", "per", "cell", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", ";", "two", "asterisks", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ".", "(", "g", ")", "Immunostaining", "with", "anti", "-", "p62", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", "antibodies", "in", "starved", "A549", "cells", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Each", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a, b) C38 cells were transfected with either 50 nM human CFTR siRNA or scrambled oligonucleotides (a, b) or cultured with CFTRinh-172 (b) in the presence or absence of cystamine (250 μM) or EUK-134 (10 mM). (a) Immunoblot of beclin 1, LC3 and p62 in C38 cells on starvation. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10. (b) Percentage of cells containing more than five GFP-LC3 punctate dots per cell. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001 versus scrambled oligonucleotides; circle, P 0.01 versus CFTR siRNA or CFTRinh-172; ANOVA.(c-g) A549 cells were transfected with 1 μg of pGFP--CFTRF508del or pGFP (empty vector), in the presence or absence of 10 mM EUK-134 or 250 μM cystamine. (c) Immunoblot of TG2 and PIASy.(c-g) A549 cells were transfected with 1 μg of pGFP--CFTRF508del or pGFP (empty vector), in the presence or absence of 10 mM EUK-134 or 250 μM cystamine.(d) FRET analysis of TG2-Alexa 546 fluorescence after SUMO-1 Cy5 photobleaching.(c-g) A549 cells were transfected with 1 μg of pGFP--CFTRF508del or pGFP (empty vector), in the presence or absence of 10 mM EUK-134 or 250 μM cystamine.(e) Immunoblot of beclin 1 and LC3 in A549 cells after starvation. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(c-g) A549 cells were transfected with 1 μg of pGFP--CFTRF508del or pGFP (empty vector), in the presence or absence of 10 mM EUK-134 or 250 μM cystamine.(f) Percentage of cells containing more than five GFP-LC3 punctate dots per cell. Means ± s.d. for three independent experiments. Asterisk, P 0.001; two asterisks, P 0.01; ANOVA. (g) Immunostaining with anti-p62 (red) and anti-GFP (green) antibodies in starved A549 cells. Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm. Each experiment was repeated three times."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ",", "b", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "human", "beclin", "1", ",", "empty", "vector", ",", "p62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "followed", "by", "rosiglitazone", "(", "10", "μM", ")", ".", "(", "a", ")", "Cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "HDAC6", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "PPAR", "-", "γ", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "a", ",", "b", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "human", "beclin", "1", ",", "empty", "vector", ",", "p62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "followed", "by", "rosiglitazone", "(", "10", "μM", ")", ".", "(", "b", ")", "FRET", "analysis", "of", "increase", "in", "PPAR", "-", "γ", "-", "Alexa", "546", "fluorescence", "after", "N", "-", "CoR", "Cy5", "photobleaching", ".", "(", "c", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "human", "beclin", "1", "or", "the", "empty", "vector", "under", "nutrient", "starvation", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "LC", "-", "3", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "CFTR", "(", "green", ")", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "cultured", "under", "nutrient", "starvation", "with", "cystamine", "(", "250", "μM", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "PI", "(", "3", ")", "K", "inhibitor", "3", "-", "MA", ".", "Immunostaining", "was", "with", "anti", "-", "LAMP", "-", "1", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "CFTR", "(", "green", ")", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "e", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "human", "beclin", "1", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "250", "μM", "cystamine", "under", "nutrient", "starvation", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "p62", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "CFTR", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", ".", "N", ",", "cell", "nucleus", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "CFTRF508del", "or", "the", "empty", "vector", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "250", "μM", "cystamine", ".", "(", "f", ")", "Cells", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "GM", "-", "130", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Yellow", "indicates", "co", "-", "localization", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "g", ")", "FRET", "analysis", "of", "GFP", "fluorescence", "after", "HDAC6", "Cy3", "photobleaching", ".", "Each", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ".", "Quantitative", "measurement", "of", "co", "-", "localizations", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a, b) IB3-1 cells were transfected with either HA-tagged human beclin 1, empty vector, p62 siRNA or scrambled oligonucleotides followed by rosiglitazone (10 μM). (a) Cells were immunostained with anti-HDAC6 (red) and anti-PPAR-γ (green) antibodies. Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm.(a, b) IB3-1 cells were transfected with either HA-tagged human beclin 1, empty vector, p62 siRNA or scrambled oligonucleotides followed by rosiglitazone (10 μM).(b) FRET analysis of increase in PPAR-γ-Alexa 546 fluorescence after N-CoR Cy5 photobleaching.(c) IB3-1 cells were transfected with either HA-tagged human beclin 1 or the empty vector under nutrient starvation. Cells were immunostained with anti-LC-3 (red) and anti-CFTR (green). Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm.(d) IB3-1 cells were cultured under nutrient starvation with cystamine (250 μM) in the presence or absence of the PI(3)K inhibitor 3-MA. Immunostaining was with anti-LAMP-1 (red) and anti-CFTR (green). Yellow indicates co-localization. N, nucleus. Scale bar, 10 μm.(e) IB3-1 cells were transfected with either 50 nM human beclin 1 siRNA or scrambled oligonucleotides in the presence or absence of 250 μM cystamine under nutrient starvation. Cells were immunostained with anti-p62 (red) and anti-CFTR (green) antibodies. Yellow indicates co-localization. N, cell nucleus. Scale bar, 10 μm.(f, g) IB3-1 cells were transfected with 1 μg of pGFP-CFTRF508del or the empty vector, in the presence or absence of 250 μM cystamine. (f) Cells were immunostained with anti-GM-130 (red) and anti-GFP (green) antibodies. Yellow indicates co-localization (arrows). Scale bar, 10 μm. (g) FRET analysis of GFP fluorescence after HDAC6 Cy3 photobleaching. Each experiment was repeated three times. Quantitative measurement of co-localizations is shown in Supplementary Information, Fig. S9."}
{"words": ["figf6", "(", "a", "-", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "for", "24", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "CFTRF508del", "or", "empty", "vector", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "250", "μM", "cystamine", "or", "with", "either", "50", "nM", "human", "p62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "(", "a", ")", "Left", ":", "CFTR", "revealed", "with", "anti", "-", "GFP", "primary", "antibody", "in", "IB3", "-", "1", "cell", "lysate", ".", "Top", "arrow", ",", "complex", "-", "glycosylated", "form", "(", "apparent", "Mr", "of", "band", "C", "about", "170K", ",", "revealed", "as", "210K", "with", "GFP", "tag", ")", ";", "bottom", "arrow", ",", "core", "-", "glycosylated", "form", "(", "apparent", "Mr", "of", "band", "B", "about", "150K", ",", "revealed", "as", "190K", "with", "GFP", "tag", ")", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "Right", ":", "quantification", "of", "bands", "B", "(", "black", ")", "and", "C", "(", "white", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "levels", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "a", "-", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "for", "24", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "CFTRF508del", "or", "empty", "vector", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "250", "μM", "cystamine", "or", "with", "either", "50", "nM", "humanp62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "(", "b", ")", "Cells", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "under", "non", "-", "permeabilizing", "conditions", ".", "Serial", "confocal", "sections", "were", "collected", "from", "top", "to", "bottom", "of", "cell", ".", "(", "c", ")", "Side", "view", "(", "X", "-", "Z", ")", "of", "a", "z", "-", "stack", "of", "confocal", "images", "taken", "in", "b", ".", "(", "c", ")", "Side", "view", "(", "X", "-", "Z", ")", "of", "a", "z", "-", "stack", "of", "confocal", "images", "taken", "in", "b", ".", "(", "a", "-", "d", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "for", "24", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "1", "μg", "of", "pGFP", "-", "CFTRF508del", "or", "empty", "vector", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "250", "μM", "cystamine", "or", "with", "either", "50", "nM", "humanp62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "(", "d", ")", "Surface", "biotinylation", "assays", "was", "performed", "with", "membrane", "-", "impermeable", "sulpho", "-", "NHS", "-", "LC", "-", "biotin", ".", "The", "cells", "were", "fractioned", "to", "obtain", "the", "plasma", "membrane", "fraction", ",", "and", "biotinylated", "proteins", "were", "precipitated", "with", "streptavidin", "beads", ".", "Immunoblot", "of", "GFP", "to", "reveal", "the", "C", "form", ".", "E", "-", "cadherin", "and", "β", "-", "actin", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "(", "e", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "human", "beclin", "1", "or", "empty", "vector", ".", "Immunoblot", "of", "PIASy", ",", "TG2", ",", "phospho", "-", "p42", "/", "44", "and", "PPAR", "-", "γ", "proteins", ".", "(", "f", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "human", "p62", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", ".", "Immunoblot", "of", "p62", "and", "phospho", "-", "p42", "/", "44", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "g", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "human", "beclin", "1", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cystamine", ".", "Immunoblot", "of", "phospho", "-", "p42", "/", "44", ".", "(", "h", ")", "IB3", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "either", "50", "nM", "humanbeclin", "1", "siRNA", "or", "50", "nM", "humanATG5", "siRNA", "or", "scrambled", "oligonucleotides", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "cystamine", ".", "TNF", "-", "α", "secretion", ".", "Each", "bar", "represents", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a-d) IB3-1 cells transfected for 24 h at 37 °C with 1 μg of pGFP-CFTRF508del or empty vector in the presence or absence of 250 μM cystamine or with either 50 nM human p62 siRNA or scrambled oligonucleotides. (a) Left: CFTR revealed with anti-GFP primary antibody in IB3-1 cell lysate. Top arrow, complex-glycosylated form (apparent Mr of band C about 170K, revealed as 210K with GFP tag); bottom arrow, core-glycosylated form (apparent Mr of band B about 150K, revealed as 190K with GFP tag). Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10. Right: quantification of bands B (black) and C (white) normalized to β-actin levels. Values are means ± s.d. for three independent experiments.(a-d) IB3-1 cells transfected for 24 h at 37 °C with 1 μg of pGFP-CFTRF508del or empty vector in the presence or absence of 250 μM cystamine or with either 50 nM humanp62 siRNA or scrambled oligonucleotides.(b) Cells immunostained with an anti-GFP antibody under non-permeabilizing conditions. Serial confocal sections were collected from top to bottom of cell. (c) Side view (X-Z) of a z-stack of confocal images taken in b. (c) Side view (X-Z) of a z-stack of confocal images taken in b.(a-d) IB3-1 cells transfected for 24 h at 37 °C with 1 μg of pGFP-CFTRF508del or empty vector in the presence or absence of 250 μM cystamine or with either 50 nM humanp62 siRNA or scrambled oligonucleotides.(d) Surface biotinylation assays was performed with membrane-impermeable sulpho-NHS-LC-biotin. The cells were fractioned to obtain the plasma membrane fraction, and biotinylated proteins were precipitated with streptavidin beads. Immunoblot of GFP to reveal the C form. E-cadherin and β-actin were used as positive and negative controls, respectively.(e) IB3-1 cells transfected with either HA-tagged human beclin 1 or empty vector. Immunoblot of PIASy, TG2, phospho-p42/44 and PPAR-γ proteins.(f) IB3-1 cells transfected with either 50 nM human p62 siRNA or scrambled oligonucleotides. Immunoblot of p62 and phospho-p42/44. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(g) IB3-1 cells transfected with either 50 nM human beclin 1 siRNA or scrambled oligonucleotides in the presence or absence of cystamine. Immunoblot of phospho-p42/44.(h) IB3-1 cells transfected with either 50 nM humanbeclin 1 siRNA or 50 nM humanATG5 siRNA or scrambled oligonucleotides in the presence or absence of cystamine. TNF-α secretion. Each bar represents the mean ± s.d. for n = 3 experiments. Asterisk, P 0.01; ANOVA."}
{"words": ["figf7CF", "human", "nasal", "mucosae", "cultured", "with", "cystamine", "or", "NAC", "(", "patients", "4", "-", "10", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Table", "S1", ")", "(", "a", "-", "c", ")", "(", "a", ")", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", ".", "CF", "humannasal", "mucosae", "cultured", "with", "cystamine", "or", "NAC", "(", "patients", "4", "-", "10", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Table", "S1", ")", "(", "a", "-", "c", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "patients", "6", "-", "10", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Table", "S1", ")", "(", "b", ",", "c", ")", ".", "(", "b", ")", "Fluorescence", "microscopy", "quantification", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", ".", "Results", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", "between", "groups", "of", "treatment", ";", "ANOVA", ".", "CF", "humannasal", "mucosae", "cultured", "with", "cystamine", "or", "NAC", "(", "patients", "4", "-", "10", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Table", "S1", ")", "(", "a", "-", "c", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "patients", "6", "-", "10", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Table", "S1", ")", "(", "b", ",", "c", ")", ".", "(", "c", ")", "Confocal", "microscopy", "micrographs", "of", "p62", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "of", "five", "patients", "per", "group", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "of", "beclin", "1", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "LC3", "dots", "(", "per", "mm2", "of", "lung", "tissue", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "f", ")", "Immunoblot", "of", "TG2", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "g", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "SUMO", "-", "1", "in", "lung", "tissues", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "h", ")", "Number", "of", "CD68", "+", "macrophages", "counted", "in", "15", "-", "20", "different", "randomly", "taken", "sections", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "per", "mm2", "of", "lung", "tissue", "from", "seven", "mice", "in", "each", "group", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ".", "(", "d", "-", "i", ")", "CftrF508del", "mice", "treated", "with", "cystamine", "or", "PBS", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "-", "MA", "(", "e", "-", "i", ")", "(", "n", "=", "7", "per", "group", ")", ".", "(", "i", ")", "MPO", "activity", "in", "lung", "homogenates", "(", "expressed", "as", "10", "−", "3", "×", "optical", "density", "(", "OD", ")", "s", "−", "1", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "lung", "tissues", "from", "seven", "mice", "in", "each", "group", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", ";", "ANOVA", ".", "(", "j", "-", "m", ")", "CftrF508del", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "administered", "intranasally", "with", "a", "lentiviral", "vector", "encoding", "beclin", "1", "(", "LV", "-", "beclin", "1", ")", "or", "GFP", "(", "LV", "-", "GFP", ")", ".", "(", "j", ")", "TG2", "Immunoblot", "in", "lung", "tissues", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S10", ".", "(", "j", "-", "m", ")", "CftrF508del", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "administered", "intranasally", "with", "a", "lentiviral", "vector", "encoding", "beclin", "1", "(", "LV", "-", "beclin", "1", ")", "or", "GFP", "(", "LV", "-", "GFP", ")", ".", "(", "k", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "TG2", "activity", ".", "Representative", "stainings", "from", "at", "least", "five", "airway", "epithelial", "areas", "per", "mouse", "from", "three", "mice", "per", "group", ".", "L", ",", "lumen", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "j", "-", "m", ")", "CftrF508del", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "administered", "intranasally", "with", "a", "lentiviral", "vector", "encoding", "beclin", "1", "(", "LV", "-", "beclin", "1", ")", "or", "GFP", "(", "LV", "-", "GFP", ")", ".", "(", "l", ")", "Number", "of", "CD68", "+", "macrophages", "counted", "in", "15", "-", "20", "different", "randomly", "taken", "sections", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "per", "mm2", "of", "lung", "tissue", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ".", "(", "j", "-", "m", ")", "CftrF508del", "mice", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "administered", "intranasally", "with", "a", "lentiviral", "vector", "encoding", "beclin", "1", "(", "LV", "-", "beclin", "1", ")", "or", "GFP", "(", "LV", "-", "GFP", ")", ".", "(", "m", ")", "MPO", "activity", "in", "lung", "homogenates", "(", "expressed", "as", "10", "−", "3", "×", "OD", "s", "−", "1", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "lung", "tissues", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", ";", "ANOVA", ".", "Anti", "-", "β", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "loading", "control", "for", "immunoblot", "analysis", ".", "Densitometric", "analysis", "of", "blots", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7CF human nasal mucosae cultured with cystamine or NAC (patients 4-10 in Supplementary Information, Table S1) (a-c) (a) Immunoblot of beclin 1.CF humannasal mucosae cultured with cystamine or NAC (patients 4-10 in Supplementary Information, Table S1) (a-c) in the presence or absence of 3-MA (patients 6-10 in Supplementary Information, Table S1) (b, c). (b) Fluorescence microscopy quantification of LC3-positive dots. Results represent means ± s.d. Asterisk, P 0.05 between groups of treatment; ANOVA.CF humannasal mucosae cultured with cystamine or NAC (patients 4-10 in Supplementary Information, Table S1) (a-c) in the presence or absence of 3-MA (patients 6-10 in Supplementary Information, Table S1) (b, c). (c) Confocal microscopy micrographs of p62. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm. Representative of five patients per group.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (d) Immunoblot of beclin 1.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (e) Quantification of LC3 dots (per mm2 of lung tissue). Means ± s.d. Asterisk, P 0.01; ANOVA.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (f) Immunoblot of TG2. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (g) Confocal microscopy of SUMO-1 in lung tissues. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (h) Number of CD68+ macrophages counted in 15-20 different randomly taken sections. Means ± s.d. per mm2 of lung tissue from seven mice in each group. Asterisk, P 0.01; ANOVA.(d-i) CftrF508del mice treated with cystamine or PBS in the presence or absence of 3-MA (e-i) (n = 7 per group). (i) MPO activity in lung homogenates (expressed as 10−3 × optical density (OD) s−1). Means ± s.d. for lung tissues from seven mice in each group. Asterisk, P 0.05; ANOVA.(j-m) CftrF508del mice (n = 3 per group) administered intranasally with a lentiviral vector encoding beclin 1 (LV-beclin 1) or GFP (LV-GFP). (j) TG2 Immunoblot in lung tissues. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Information, Fig. S10.(j-m) CftrF508del mice (n = 3 per group) administered intranasally with a lentiviral vector encoding beclin 1 (LV-beclin 1) or GFP (LV-GFP). (k) Confocal microscopy of TG2 activity. Representative stainings from at least five airway epithelial areas per mouse from three mice per group. L, lumen. Scale bar, 10 μm.(j-m) CftrF508del mice (n = 3 per group) administered intranasally with a lentiviral vector encoding beclin 1 (LV-beclin 1) or GFP (LV-GFP). (l) Number of CD68+ macrophages counted in 15-20 different randomly taken sections. Means ± s.d. per mm2 of lung tissue. Asterisk, P 0.01; ANOVA.(j-m) CftrF508del mice (n = 3 per group) administered intranasally with a lentiviral vector encoding beclin 1 (LV-beclin 1) or GFP (LV-GFP). (m) MPO activity in lung homogenates (expressed as 10−3 × OD s−1). Means ± s.d. for lung tissues. Asterisk, P 0.05; ANOVA. Anti-β-Tubulin was used as loading control for immunoblot analysis. Densitometric analysis of blots is shown in Supplementary Information, Fig. S9."}
{"words": ["figf8CftrF508del", "mice", "(", "a", "-", "d", ")", "(", "a", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "LC3", "(", "top", ")", "and", "p62", "(", "bottom", ")", "in", "lung", "tissues", "from", "CftrF508del", "mice", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Representative", "images", "of", "ten", "PBS", "-", "treated", "and", "ten", "NAC", "-", "treated", "mice", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "LC3", "dots", "(", "per", "mm2", "of", "tissue", ")", "in", "lung", "tissues", "from", "CftrF508del", "mice", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "001", "versus", "PBS", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "CftrF508del", "mice", "(", "a", "-", "d", ")", "(", "c", ")", "Number", "of", "macrophages", "per", "mm2", "of", "lung", "tissue", "from", "CftrF508del", "mice", "(", "CD68", "-", "positive", "cells", "in", "15", "-", "20", "different", "randomly", "taken", "sections", "for", "each", "mouse", "lung", "for", "each", "condition", ")", ";", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "for", "three", "separate", "experiments", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", "versus", "PBS", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "CftrF508del", "mice", "(", "a", "-", "d", ")", "(", "d", ")", "MPO", "activity", "in", "lung", "homogenates", "from", "CftrF508del", "mice", "(", "expressed", "as", "10", "−", "3", "×", "OD", "s", "−", "1", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", "versus", "PBS", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "e", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "lung", "tissues", "from", "PBS", "-", "treated", "or", "NAC", "-", "treated", "mice", "-", "Tg", "LC3", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ")", "Number", "of", "LC3", "-", "positive", "dots", "in", "Scnn1b", "tissues", "from", "mice", "-", "Tg", "PBS", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "01", "versus", "mice", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "g", ")", "FRET", "analysis", "of", "TG2", "-", "Alexa", "546", "fluorescence", "after", "SUMO", "-", "1", "Cy5", "photobleaching", "in", "lung", "tissues", "from", "PBS", "-", "treated", "WT", "mice", "and", "PBS", "-", "treated", "or", "NAC", "-", "treated", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "h", ")", "Immunoblot", "of", "TG2", "and", "phospho", "-", "p42", "/", "44", "in", "lung", "tissues", "from", "PBS", "-", "treated", "WT", "mice", "and", "PBS", "-", "treated", "or", "NAC", "-", "treated", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", ".", "αβ", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "i", ")", "Lung", "histology", "of", "PBS", "-", "treated", "and", "NAC", "-", "treated", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", ".", "Haematoxylin", "staining", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "μm", ".", "Black", "arrows", "indicate", "decrease", "in", "lung", "infiltration", "in", "NAC", "-", "treated", "in", "comparison", "with", "PBS", "-", "treated", "mice", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "j", ")", "Left", ":", "confocal", "microscopy", "of", "COX", "-", "2", "staining", "(", "left", ")", "in", "PBS", "-", "treated", "and", "NAC", "-", "treated", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", ".", "Nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "μm", ".", "Right", ";", "number", "of", "COX", "-", "2", "-", "positive", "cells", "per", "mm2", "of", "lung", "tissue", "in", "NAC", "-", "treated", "and", "Scnn1b", "-", "treated", "mice", "-", "Tg", "PBS", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", "versus", "mice", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "1", "versus", "PBS", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "e", "-", "k", ")", "treated", "with", "NAC", "or", "PBS", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "(", "k", ")", "MPO", "activity", "in", "lung", "homogenates", "from", "PBS", "-", "treated", "and", "NAC", "-", "treated", "Scnn1b", "-", "Tg", "mice", "(", "expressed", "as", "10", "−", "3", "×", "OD", "s", "−", "1", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "d", ".", "Asterisk", ",", "P", "0", ".", "05", "versus", "PBS", "-", "treated", "mice", ";", "ANOVA", ".", "Densitometric", "analysis", "of", "the", "blot", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Information", ",", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8CftrF508del mice (a-d)(a) Confocal microscopy of LC3 (top) and p62 (bottom) in lung tissues from CftrF508del mice. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm. Representative images of ten PBS-treated and ten NAC-treated mice. (b) Quantification of LC3 dots (per mm2 of tissue) in lung tissues from CftrF508del mice. Means ± s.d. Asterisk, P 0.001 versus PBS-treated mice; ANOVA.CftrF508del mice (a-d)(c) Number of macrophages per mm2 of lung tissue from CftrF508del mice (CD68-positive cells in 15-20 different randomly taken sections for each mouse lung for each condition); means ± s.d. for three separate experiments. Asterisk, P 0.05 versus PBS-treated mice; ANOVA.CftrF508del mice (a-d)(d) MPO activity in lung homogenates from CftrF508del mice (expressed as 10−3 × OD s−1). Means ± s.d. Asterisk, P 0.05 versus PBS-treated mice; ANOVA.Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (e) Confocal microscopy of LC3-positive dots in lung tissues from PBS-treated or NAC-treated mice-Tg LC3. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 10 μm. (f) Number of LC3-positive dots in Scnn1b tissues from mice-Tg PBS. Means ± s.d. Asterisk, P 0.01 versus mice-treated mice; ANOVA.Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (g) FRET analysis of TG2-Alexa 546 fluorescence after SUMO-1 Cy5 photobleaching in lung tissues from PBS-treated WT mice and PBS-treated or NAC-treated Scnn1b-Tg mice.Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (h) Immunoblot of TG2 and phospho-p42/44 in lung tissues from PBS-treated WT mice and PBS-treated or NAC-treated Scnn1b-Tg mice. αβ-Tubulin was used as loading control.Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (i) Lung histology of PBS-treated and NAC-treated Scnn1b-Tg mice. Haematoxylin staining. Scale bar, 150 μm. Black arrows indicate decrease in lung infiltration in NAC-treated in comparison with PBS-treated mice (arrowheads).Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (j) Left: confocal microscopy of COX-2 staining (left) in PBS-treated and NAC-treated Scnn1b-Tg mice. Nuclei counterstained with DAPI (blue). Scale bar, 150 μm. Right; number of COX-2-positive cells per mm2 of lung tissue in NAC-treated and Scnn1b-treated mice-Tg PBS. Means ± s.d. Asterisk, P 0.05 versus mice-treated mice; ANOVA.1 versus PBS-treated mice; ANOVA.Scnn1b-Tg mice (e-k) treated with NAC or PBS (n = 10 per group). (k) MPO activity in lung homogenates from PBS-treated and NAC-treated Scnn1b-Tg mice (expressed as 10−3 × OD s−1). Means ± s.d. Asterisk, P 0.05 versus PBS-treated mice; ANOVA. Densitometric analysis of the blot is shown in Supplementary Information, Fig. S9."}
{"words": ["Figure", "1Figure", "1", ".", "Extensive", "identification", "of", "Mmi1", "RNA", "targets", "by", "combining", "RNA", "-", "IP", "sequencing", "and", "computational", "approaches", ".", "(", "A", ")", "Box", "-", "plot", "of", "the", "enrichment", "of", "the", "RNAs", "identified", "by", "Mmi1", "RNA", "-", "IPs", "coupled", "to", "high", "throughput", "sequencing", ".", "The", "log", "of", "the", "average", "enrichments", "obtained", "from", "two", "independent", "RNA", "-", "IPs", "is", "plotted", ".", "The", "enrichment", "is", "relative", "to", "the", "no", "antibody", "RNA", "-", "IPs", "conducted", "in", "parallel", "of", "Mmi1", "RNA", "-", "IPs", ".", "The", "mRNAs", "and", "lncRNAs", "enriched", "at", "least", "two", "folds", "in", "both", "Mmi1", "RNA", "-", "IPs", "are", "shown", "in", "blue", "and", "green", ",", "respectively", ".", "Crosses", "represent", "newly", "identified", "Mmi1", "targets", "and", "dots", "known", "targets", ".", "Figure", "1", ".", "Extensive", "identification", "of", "Mmi1", "RNA", "targets", "by", "combining", "RNA", "-", "IP", "sequencing", "and", "computational", "approaches", ".", "(", "D", ")", "RNA", "-", "IPs", "showing", "the", "impact", "of", "Mmi1", "YTH", "domain", "point", "mutations", "on", "Mmi1", "'", "s", "binding", "to", "ssm4", "mRNA", ".", "The", "lower", "part", "shows", "a", "Western", "blot", "monitoring", "the", "protein", "level", "of", "WT", "and", "mutant", "Mmi1", "proteins", "in", "the", "cells", "used", "for", "the", "RNA", "-", "IPs", ".", "Loading", "was", "monitored", "using", "an", "anti", "-", "Tub1", "(", "tubulin", ")", "antibody", ".", "Figure", "1", ".", "Extensive", "identification", "of", "Mmi1", "RNA", "targets", "by", "combining", "RNA", "-", "IP", "sequencing", "and", "computational", "approaches", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "RNA", "-", "IPs", "showing", "the", "YTH", "-", "dependent", "association", "of", "Mmi1", "to", "the", "lncRNAs", "identified", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "for", "three", "independent", "experiments", "for", "(", "D", ",", "E", "and", "F", ")", ".", "Figure", "1", ".", "Extensive", "identification", "of", "Mmi1", "RNA", "targets", "by", "combining", "RNA", "-", "IP", "sequencing", "and", "computational", "approaches", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "RNA", "-", "IPs", "showing", "the", "YTH", "-", "dependent", "association", "of", "Mmi1", "to", "the", "lncRNAs", "identified", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "for", "three", "independent", "experiments", "for", "(", "D", ",", "E", "and", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Figure 1. Extensive identification of Mmi1 RNA targets by combining RNA-IP sequencing and computational approaches. (A) Box-plot of the enrichment of the RNAs identified by Mmi1 RNA-IPs coupled to high throughput sequencing. The log of the average enrichments obtained from two independent RNA-IPs is plotted. The enrichment is relative to the no antibody RNA-IPs conducted in parallel of Mmi1 RNA-IPs. The mRNAs and lncRNAs enriched at least two folds in both Mmi1 RNA-IPs are shown in blue and green, respectively. Crosses represent newly identified Mmi1 targets and dots known targets.Figure 1. Extensive identification of Mmi1 RNA targets by combining RNA-IP sequencing and computational approaches. (D) RNA-IPs showing the impact of Mmi1 YTH domain point mutations on Mmi1's binding to ssm4 mRNA. The lower part shows a Western blot monitoring the protein level of WT and mutant Mmi1 proteins in the cells used for the RNA-IPs. Loading was monitored using an anti-Tub1 (tubulin) antibody.Figure 1. Extensive identification of Mmi1 RNA targets by combining RNA-IP sequencing and computational approaches. (E, F) RNA-IPs showing the YTH-dependent association of Mmi1 to the lncRNAs identified in (A) and (B). Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations for three independent experiments for (D, E and F).Figure 1. Extensive identification of Mmi1 RNA targets by combining RNA-IP sequencing and computational approaches. (E, F) RNA-IPs showing the YTH-dependent association of Mmi1 to the lncRNAs identified in (A) and (B). Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations for three independent experiments for (D, E and F)."}
{"words": ["Figure", "2Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "A", ")", "Upper", "part", ",", "scheme", "of", "S", ".", "pombe", "sexual", "differentiation", ".", "Lower", "part", ",", "microscopy", "images", "showing", "WT", "and", "mmi1", "∆", "cells", ",", "and", "mmi1", "∆", "cells", "expressing", "Mmi1", "-", "R351E", "or", "Mmi1", "-", "R381E", "mutant", "proteins", ".", "Images", "were", "taken", "after", "24", "hours", "of", "induction", "of", "sexual", "differentiation", "by", "growth", "on", "SPAS", "medium", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "that", "underwent", "differentiation", "and", "iodine", "vapor", "assays", ",", "conducted", "on", "the", "corresponding", "patches", ",", "are", "shown", "at", "the", "bottom", "of", "each", "image", ".", "Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "B", ")", "Mating", "assay", "showing", "the", "percentage", "of", "zygotes", "forming", "over", "time", "in", "the", "same", "cells", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "E", ")", "Mmi1", "RNA", "-", "IPs", "showing", "the", "specific", "loss", "of", "binding", "of", "Mmi1", "to", "nam1", "-", "1", "lncRNA", "but", "not", "to", "mei4", "mRNA", ",", "another", "target", "of", "Mmi1", ".", "Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "F", ")", "Mating", "assay", "showing", "the", "percentage", "of", "zygotes", "formed", "over", "time", "in", "WT", "and", "nam1", "-", "1", "cells", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "B", ",", "E", "and", "F", ")", ".", "Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "G", ")", "Western", "blots", "showing", "the", "level", "of", "Flag", "-", "Byr2", "protein", "over", "the", "first", "4", "hours", "of", "sexual", "differentiation", "in", "WT", "and", "nam1", "-", "1", "cells", ".", "Tubulin", "(", "Tub1", ")", "level", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Figure", "2", ".", "Mmi1", "binding", "to", "nam1", "lncRNA", "controls", "MAPK", "-", "mediated", "entry", "into", "sexual", "differentiation", ".", "(", "H", ")", "Microscopy", "images", "of", "WT", "(", "h90", ")", "cells", "transformed", "with", "an", "empty", "plasmid", "(", "Control", ")", "and", "nam1", "-", "1", "cells", "transformed", "with", "either", "an", "empty", "plasmid", "(", "Control", ")", "or", "a", "plasmid", "expressing", "Byr2", "protein", "(", "Byr2", ")", ",", "after", "24", "hours", "of", "induction", "of", "sexual", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (A) Upper part, scheme of S. pombe sexual differentiation. Lower part, microscopy images showing WT and mmi1∆ cells, and mmi1∆ cells expressing Mmi1-R351E or Mmi1-R381E mutant proteins. Images were taken after 24 hours of induction of sexual differentiation by growth on SPAS medium. The percentage of cells that underwent differentiation and iodine vapor assays, conducted on the corresponding patches, are shown at the bottom of each image.Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (B) Mating assay showing the percentage of zygotes forming over time in the same cells as in (A).Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (E) Mmi1 RNA-IPs showing the specific loss of binding of Mmi1 to nam1-1 lncRNA but not to mei4 mRNA, another target of Mmi1.Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (F) Mating assay showing the percentage of zygotes formed over time in WT and nam1-1 cells. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) (B, E and F).Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (G) Western blots showing the level of Flag-Byr2 protein over the first 4 hours of sexual differentiation in WT and nam1-1 cells. Tubulin (Tub1) level was used as a loading control.Figure 2. Mmi1 binding to nam1 lncRNA controls MAPK-mediated entry into sexual differentiation. (H) Microscopy images of WT (h90) cells transformed with an empty plasmid (Control) and nam1-1 cells transformed with either an empty plasmid (Control) or a plasmid expressing Byr2 protein (Byr2), after 24 hours of induction of sexual differentiation. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3Figure", "3", ".", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "A", ")", "Northern", "blots", "showing", "nam1", "and", "byr2", "RNA", "levels", "during", "the", "first", "4", "hours", "of", "sexual", "differentiation", ".", "Ribosomal", "RNAs", "(", "rRNAs", ")", "stained", "with", "ethidium", "bromide", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "Black", "lines", "indicate", "probes", "used", "to", "detect", "nam1", "and", "byr2", "RNAs", ".", "Figure", "3", ".", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "B", ")", "ChIPs", "showing", "the", "occupancy", "of", "the", "elongating", "RNAPII", "(", "RNAPII", "-", "S2P", ")", "over", "nam1", "-", "byr2", "locus", ",", "in", "WT", "and", "nam1", "-", "1", "cells", ".", "RNAPII", "-", "S2P", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "antibody", "recognizing", "the", "heptameric", "repeats", "(", "present", "in", "the", "C", "-", "terminal", "domain", "of", "the", "polymerase", ")", "when", "it", "is", "phosphorylated", "on", "its", "serine", "2", ".", "Black", "lines", ",", "genomic", "regions", "investigated", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "B", ",", "C", ",", "E", "and", "F", ")", ".", "Figure", "3", ".", " ", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "qPCRs", "showing", "the", "accumulation", "of", "nam1", "read", "-", "through", "transcripts", "(", "RT1", "-", "qPCR", ")", "and", "nam1", " ", "lncRNAs", "(", "RT2", "-", "qPCR", ")", "in", "cells", "with", "or", "without", "the", "transcription", "terminator", "Ttef", "inserted", "at", "the", "3", "'", "end", "of", "nam1", "(", "scheme", ")", ".", "Black", "arrow", ",", "primer", "used", "for", "the", "strand", "-", "specific", "reverse", "transcription", "(", "RT", ")", ";", "Black", "line", ",", "location", "of", "the", "region", "amplified", "by", "PCR", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "B", ",", "C", ",", "E", "and", "F", ")", ".", "Figure", "3", ".", " ", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "D", ")", "Microscopy", "images", "of", ",", "respectively", ",", "WT", "(", "h90", ")", ",", "nam1", "-", "1", "and", "nam1", "-", "1", "-", "Ttef", "cells", ",", "after", "induction", "of", "sexual", "differentiation", "for", "24", "hours", ".", "The", "percentage", "of", "sporulation", "and", "iodine", "vapor", "assays", "are", "shown", "at", "the", "bottom", "of", "the", "images", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Figure", "3", ".", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "qPCRs", "showing", "the", "accumulation", "of", "nam1", "read", "-", "through", "transcripts", "in", "mmi1", "∆", "and", "rrp6", "∆", "cells", ".", "Black", "arrow", "and", "line", "as", "in", "(", "C", ")", ".", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "B", ",", "C", ",", "E", "and", "F", ")", ".", "Figure", "3", ".", "Mmi1", "promotes", "transcription", "termination", "of", "nam1", "non", "-", "coding", "gene", "and", "prevents", "nam1", "read", "-", "through", "transcription", "from", "repressing", "the", "downstream", "MAPKKK", "gene", "byr2", ".", "(", "F", ")", "ChIPs", "monitoring", "the", "enrichment", "of", "H3K9me2", "over", "nam1", "-", "byr2", "locus", "and", "mei4", "gene", "in", "WT", "and", "rrp6", "∆", "cells", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "B", ",", "C", ",", "E", "and", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (A) Northern blots showing nam1 and byr2 RNA levels during the first 4 hours of sexual differentiation. Ribosomal RNAs (rRNAs) stained with ethidium bromide were used as loading controls. Black lines indicate probes used to detect nam1 and byr2 RNAs.Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (B) ChIPs showing the occupancy of the elongating RNAPII (RNAPII-S2P) over nam1-byr2 locus, in WT and nam1-1 cells. RNAPII-S2P was immunoprecipitated with an antibody recognizing the heptameric repeats (present in the C-terminal domain of the polymerase) when it is phosphorylated on its serine 2. Black lines, genomic regions investigated. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (B, C, E and F).Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (C) RT-qPCRs showing the accumulation of nam1 read-through transcripts (RT1-qPCR) and nam1 lncRNAs (RT2-qPCR) in cells with or without the transcription terminator Ttef inserted at the 3' end of nam1 (scheme). Black arrow, primer used for the strand-specific reverse transcription (RT); Black line, location of the region amplified by PCR. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (B, C, E and F).Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (D) Microscopy images of, respectively, WT (h90), nam1-1 and nam1-1-Ttef cells, after induction of sexual differentiation for 24 hours. The percentage of sporulation and iodine vapor assays are shown at the bottom of the images. Scale bar, 10 µm.Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (E) RT-qPCRs showing the accumulation of nam1 read-through transcripts in mmi1∆ and rrp6∆ cells. Black arrow and line as in (C). . Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (B, C, E and F).Figure 3. Mmi1 promotes transcription termination of nam1 non-coding gene and prevents nam1 read-through transcription from repressing the downstream MAPKKK gene byr2. (F) ChIPs monitoring the enrichment of H3K9me2 over nam1-byr2 locus and mei4 gene in WT and rrp6∆ cells. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (B, C, E and F)."}
{"words": ["Figure", "4Figure", "4", ".", "Mmi1", "drives", "Rrp6", "-", "dependent", "heterochromatin", "gene", "silencing", "at", "pericentromeric", "regions", ".", "(", "B", ")", "Northern", "blot", "showing", "the", "level", "of", "nam5", "/", "6", "/", "7", "lncRNA", "population", "in", "mmi1", "-", "ts3", ",", "dcr1", "∆", ",", "clr4", "∆", "single", "mutant", "cells", "and", "in", "mmi1", "-", "ts3", "dcr1", "∆", "and", "mmi1", "-", "ts3", "clr4", "∆", "double", "mutant", "cells", ",", "at", "the", "permissive", "(", "25ºC", ")", "and", "restrictive", "(", "36ºC", ")", "temperatures", ".", "Figure", "4", ".", "Mmi1", "drives", "Rrp6", "-", "dependent", "heterochromatin", "gene", "silencing", "at", "pericentromeric", "regions", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "PCRs", "monitoring", "the", "accumulation", "of", "nam7", "lncRNAs", "and", "nam7", "-", "L", "read", "-", "through", "transcripts", ",", "in", "the", "same", "cells", "and", "conditions", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Red", "arrow", "heads", "point", "to", "the", "expected", "PCR", "products", "while", "the", "other", "bands", "correspond", "to", "non", "-", "specific", "PCR", "products", ".", "From", "the", "scheme", "and", "the", "agarose", "gels", ":", "black", "arrows", ",", "primers", "used", "for", "the", "three", "different", "reverse", "transcriptions", ";", "black", "lines", "and", "red", "numbers", ",", "expected", "PCR", "products", "of", "the", "three", "different", "RT", "-", "PCRs", ";", "M", ",", "DNA", "ladder", "Markers", ";", "tub1", ",", "tubulin", "control", ".", "Figure", "4", ".", "Mmi1", "drives", "Rrp6", "-", "dependent", "heterochromatin", "gene", "silencing", "at", "pericentromeric", "regions", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCRs", "showing", "the", "levels", "of", "nam5", "/", "6", "/", "7", "lncRNA", "population", "in", "the", "double", "mutant", "rrp6", "∆", "dcr1", "∆", "cells", ",", "relative", "to", "the", "single", "mutant", "rrp6", "∆", "and", "dcr1", "∆", "cells", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "D", ",", "E", ")", ".", "P", "value", "was", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Figure", "4", ".", " ", "Mmi1", "drives", "Rrp6", "-", "dependent", "heterochromatin", "gene", "silencing", "at", "pericentromeric", "regions", ".", "(", "E", ")", "RNA", "-", "IPs", "showing", "that", "Rrp6", "-", "Myc13", "binds", "to", "nam5", "/", "6", "/", "7", " ", "lncRNAs", "in", "a", "Mmi1", "-", "dependent", "manner", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "D", ",", "E", ")", ".", "P", "value", "was", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Figure 4. Mmi1 drives Rrp6-dependent heterochromatin gene silencing at pericentromeric regions. (B) Northern blot showing the level of nam5/6/7 lncRNA population in mmi1-ts3, dcr1∆, clr4∆ single mutant cells and in mmi1-ts3 dcr1∆ and mmi1-ts3 clr4∆ double mutant cells, at the permissive (25ºC) and restrictive (36ºC) temperatures.Figure 4. Mmi1 drives Rrp6-dependent heterochromatin gene silencing at pericentromeric regions. (C) RT-PCRs monitoring the accumulation of nam7 lncRNAs and nam7-L read-through transcripts, in the same cells and conditions as in (B). Red arrow heads point to the expected PCR products while the other bands correspond to non-specific PCR products. From the scheme and the agarose gels: black arrows, primers used for the three different reverse transcriptions; black lines and red numbers, expected PCR products of the three different RT-PCRs; M, DNA ladder Markers; tub1, tubulin control.Figure 4. Mmi1 drives Rrp6-dependent heterochromatin gene silencing at pericentromeric regions. (D) RT-qPCRs showing the levels of nam5/6/7 lncRNA population in the double mutant rrp6∆ dcr1∆ cells, relative to the single mutant rrp6∆ and dcr1∆ cells. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (D, E). P value was calculated using a two-tailed Student's t-test.Figure 4. Mmi1 drives Rrp6-dependent heterochromatin gene silencing at pericentromeric regions. (E) RNA-IPs showing that Rrp6-Myc13 binds to nam5/6/7 lncRNAs in a Mmi1-dependent manner. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (D, E). P value was calculated using a two-tailed Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "5Figure", "5", ".", "Mmi1", "-", "and", "RNAi", "-", "mediated", "silencing", "of", "pericentromeric", "DNA", "transcription", "alternate", "during", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "(", "A", ")", "ChIPs", "assessing", "the", "localization", "of", "Mmi1", "to", "pericentromeric", "DNA", "in", "WT", "and", "clr4", "∆", "cells", ".", "Figure", "5", ".", "Mmi1", "-", "and", "RNAi", "-", "mediated", "silencing", "of", "pericentromeric", "DNA", "transcription", "alternate", "during", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "(", "B", ")", "ChIPs", "showing", "the", "localization", "of", "Mmi1", "(", "dashed", "line", ")", "and", "H3K9me2", "(", "black", "line", ")", "to", "the", "pericentromeric", "nam5", "/", "6", "/", "7", "DNA", "regions", "during", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "Cell", "synchronization", "was", "achieved", "by", "using", "cdc25", "-", "ts", "cells", "(", "see", "experimental", "procedures", "for", "more", "details", ")", ".", "Cell", "synchronization", "was", "monitored", "by", "measuring", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "a", "septum", "(", "right", "part", ")", ".", "Figure", "5", ".", " ", "Mmi1", "-", "and", "RNAi", "-", "mediated", "silencing", "of", "pericentromeric", "DNA", "transcription", "alternate", "during", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "qPCRs", "monitoring", "the", "levels", "of", "nam5", "/", "6", "/", "7", "(", "left", "part", ")", "and", "dg", "(", "middle", "part", ")", "lncRNA", "populations", "during", "the", "cell", "cycle", ".", "Average", "fold", "enrichment", "is", "shown", "with", "error", "bars", "that", "indicate", "mean", "average", "deviations", "(", "n", "=", "3", ")", "for", "(", "A", ",", "B", "and", "C", ")", ".", "Figure", "5", ".", "Mmi1", "-", "and", "RNAi", "-", "mediated", "silencing", "of", "pericentromeric", "DNA", "transcription", "alternate", "during", "the", "progression", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "PCRs", "monitoring", "the", "accumulation", "of", "nam7", "lncRNAs", "and", "nam7", "-", "L", "read", "-", "through", "transcripts", "in", "G2", "/", "M", "and", "G1", "/", "S", "phases", "from", "synchronized", "cells", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Red", "arrow", "heads", "point", "to", "the", "expected", "PCR", "products", ".", "The", "other", "bands", "are", "non", "-", "specific", "PCR", "products", ".", "From", "the", "scheme", ":", "black", "arrows", ",", "primers", "used", "for", "the", "reverse", "transcriptions", ";", "black", "lines", "and", "red", "numbers", ",", "regions", "amplified", "by", "PCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Figure 5. Mmi1- and RNAi-mediated silencing of pericentromeric DNA transcription alternate during the progression of the cell cycle. (A) ChIPs assessing the localization of Mmi1 to pericentromeric DNA in WT and clr4∆ cells.Figure 5. Mmi1- and RNAi-mediated silencing of pericentromeric DNA transcription alternate during the progression of the cell cycle. (B) ChIPs showing the localization of Mmi1 (dashed line) and H3K9me2 (black line) to the pericentromeric nam5/6/7 DNA regions during the progression of the cell cycle. Cell synchronization was achieved by using cdc25-ts cells (see experimental procedures for more details). Cell synchronization was monitored by measuring the percentage of cells with a septum (right part).Figure 5. Mmi1- and RNAi-mediated silencing of pericentromeric DNA transcription alternate during the progression of the cell cycle. (C) RT-qPCRs monitoring the levels of nam5/6/7 (left part) and dg (middle part) lncRNA populations during the cell cycle. Average fold enrichment is shown with error bars that indicate mean average deviations (n=3) for (A, B and C).Figure 5. Mmi1- and RNAi-mediated silencing of pericentromeric DNA transcription alternate during the progression of the cell cycle. (D) RT-PCRs monitoring the accumulation of nam7 lncRNAs and nam7-L read-through transcripts in G2/M and G1/S phases from synchronized cells as in (B). Red arrow heads point to the expected PCR products. The other bands are non-specific PCR products. From the scheme: black arrows, primers used for the reverse transcriptions; black lines and red numbers, regions amplified by PCR."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "E", "Scatter", "plots", "showing", "the", "association", "of", "each", "of", "the", "p", "-", "tau", "biomarkers", "with", "age", "in", "the", "Aβ", "-", "negative", "(", "A", "-", ";", "blue", ";", "n", "=", "250", ")", "and", "the", "Aβ", "-", "positive", "(", "A", "+", ";", "red", ";", "n", "=", "131", ")", "groups", ".", "The", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "and", "the", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "each", "of", "the", "groups", ".", "For", "each", "group", ",", "the", "standardized", "regression", "coefficients", "(", "β", ")", "and", "the", "P", "-", "values", "were", "computed", "using", "a", "linear", "model", "adjusting", "for", "sex", ".", "Additionally", ",", "we", "computed", "the", "'", "Age", "x", "Aβ", "status", "'", "interaction", "term", ".", "Abbreviations", ":", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "Mid", ",", "mid", "-", "region", ";", "N", ",", "N", "-", "terminal", ";", "p", "-", "tau", ",", "phosphorylated", "tau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-E Scatter plots showing the association of each of the p-tau biomarkers with age in the Aβ-negative (A-; blue; n = 250) and the Aβ-positive (A+; red; n = 131) groups. The solid lines indicate the regression line and the 95% confidence intervals for each of the groups. For each group, the standardized regression coefficients (β) and the P-values were computed using a linear model adjusting for sex. Additionally, we computed the 'Age x Aβ status' interaction term. Abbreviations: CSF, cerebrospinal fluid; Mid, mid-region; N, N-terminal; p-tau, phosphorylated tau."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", ",", "E", ")", "Dot", "and", "box", "-", "plot", "comparing", "each", "of", "the", "p", "-", "tau", "biomarker", "between", "the", "Aβ", "-", "negative", "(", "A", "-", ";", "blue", ";", "n", "=", "250", ")", "and", "the", "Aβ", "-", "positive", "(", "A", "+", ";", "red", ";", "n", "=", "131", ")", "groups", ".", "Aβ", "positivity", "was", "defined", "as", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "<", "0", ".", "071", ".", "(", "F", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "J", ")", "Scatter", "plots", "depicting", "the", "changes", "between", "each", "p", "-", "tau", "biomarker", "as", "a", "function", "of", "CSF", "Aβ42", "/", "40", ".", "The", "horizontal", "-", "axes", "directions", "were", "inverted", ";", "lower", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "reflects", "higher", "Aβ", "pathology", ".", "For", "each", "Aβ", "status", "group", ",", "we", "computed", "the", "standardized", "regression", "coefficients", "(", "β", ")", "and", "the", "P", "-", "values", ",", "adjusted", "for", "age", "and", "sex", ".", "The", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "and", "the", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "each", "of", "the", "Aβ", "status", "groups", ".", "The", "dashed", "green", "lines", "indicate", "the", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "cutoff", ".", "Participants", "were", "also", "colour", "-", "coded", "based", "on", "the", "Aβ", "PET", "CL", "scale", "(", "≤", "12CL", ",", "black", ";", ">", "12CL", ",", "turquoise", ";", "Aβ", "PET", "non", "-", "available", ",", "grey", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B, C, D, E) Dot and box-plot comparing each of the p-tau biomarker between the Aβ-negative (A-; blue; n = 250) and the Aβ-positive (A+; red; n =131) groups. Aβ positivity was defined as CSF Aβ42/40 ratio < 0.071.(F, G, H, I, J) Scatter plots depicting the changes between each p-tau biomarker as a function of CSF Aβ42/40. The horizontal-axes directions were inverted; lower CSF Aβ42/40 ratio reflects higher Aβ pathology. For each Aβ status group, we computed the standardized regression coefficients (β) and the P-values, adjusted for age and sex. The solid lines indicate the regression line and the 95% confidence intervals for each of the Aβ status groups. The dashed green lines indicate the CSF Aβ42/40 cutoff. Participants were also colour-coded based on the Aβ PET CL scale (≤12CL, black; >12CL, turquoise; Aβ PET non-available, grey)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", ",", "E", ")", "Dot", "and", "box", "-", "plot", "comparing", "each", "of", "the", "p", "-", "tau", "biomarker", "between", "the", "Aβ", "negative", "(", "A", "-", ";", "blue", ";", "n", "=", "287", ")", "and", "the", "Aβ", "positive", "(", "A", "+", ";", "red", ";", "n", "=", "42", ")", "groups", ".", "Aβ", "positivity", "was", "defined", "with", "Aβ", "PET", "visual", "read", ".", "(", "F", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "J", ")", "Scatter", "plots", "depicting", "the", "changes", "between", "each", "p", "-", "tau", "biomarker", "as", "a", "function", "of", "Aβ", "PET", "Centiloids", "(", "CL", ")", ".", "The", "standardized", "regression", "coefficients", "(", "β", ")", "and", "the", "P", "-", "values", "were", "computed", "using", "a", "linear", "model", "adjusting", "for", "age", "and", "sex", ".", "The", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "and", "the", "95", "%", "confidence", "intervals", ".", "The", "dashed", "green", "lines", "indicate", "the", "CL12", "and", "CL30", "cutoffs", ".", "Participants", "were", "also", "colour", "-", "coded", "based", "on", "the", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "(", "A", "-", ",", "black", ";", "A", "+", ",", "turquoise", ")", ".", "(", "K", ",", "L", ",", "M", ",", "N", ",", "O", ")", "Dot", "and", "box", "-", "plots", "depicting", "comparison", "between", "each", "of", "the", "p", "-", "tau", "biomarker", "between", "Centiloid", "scale", "groups", ":", "(", "i", ")", "≤", "12CL", "(", "blue", ";", "n", "=", "278", ")", ",", "(", "ii", ")", "12", "-", "30CL", "(", "subthreshold", "Aβ", "pathology", "group", ";", "grey", ";", "n", "=", "28", ")", ",", "(", "iii", ")", ">", "30CL", "(", "red", ";", "n", "=", "25", ")", ".", "The", "box", "-", "plots", "depict", "the", "median", "(", "horizontal", "bar", ")", ",", "interquartile", "range", "(", "IQR", ",", "hinges", ")", "and", "1", ".", "5", "x", "IQR", "(", "whiskers", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B, C, D, E) Dot and box-plot comparing each of the p-tau biomarker between the Aβ negative (A-; blue; n = 287) and the Aβ positive (A+; red; n = 42) groups. Aβ positivity was defined with Aβ PET visual read.(F, G, H, I, J) Scatter plots depicting the changes between each p-tau biomarker as a function of Aβ PET Centiloids (CL). The standardized regression coefficients (β) and the P-values were computed using a linear model adjusting for age and sex. The solid lines indicate the regression line and the 95% confidence intervals. The dashed green lines indicate the CL12 and CL30 cutoffs. Participants were also colour-coded based on the CSF Aβ42/40 ratio (A-, black; A+, turquoise).(K, L, M, N, O) Dot and box-plots depicting comparison between each of the p-tau biomarker between Centiloid scale groups: (i) ≤12CL (blue; n = 278), (ii) 12 - 30CL (subthreshold Aβ pathology group; grey; n = 28), (iii) >30CL (red; n = 25). The box-plots depict the median (horizontal bar), interquartile range (IQR, hinges) and 1.5 x IQR (whiskers)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "ROC", "analysis", "was", "performed", "to", "test", "the", "accuracy", "to", "discriminate", "between", "Aβ", "-", "positive", "(", "A", "+", ")", "from", "Aβ", "-", "negative", "(", "A", "-", ")", "individuals", ".", "Aβ", "positivity", "was", "defined", "as", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "<", "0", ".", "071", "(", "A", ")", ",", "Aβ", "PET", "positive", "visual", "read", "(", "B", ")", "or", "Aβ", "PET", "Centiloid", "(", "CL", ")", ">", "12", "(", "C", ")", ".", "Abbreviations", ":", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "Mid", ",", "mid", "-", "region", ";", "NfL", ",", "neurofilament", "light", ";", "N", ",", "N", "-", "terminal", ";", "p", "-", "tau", ",", "phosphorylated", "tau", ";", "t", "-", "tau", ",", "total", "tau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C ROC analysis was performed to test the accuracy to discriminate between Aβ-positive (A+) from Aβ-negative (A-) individuals. Aβ positivity was defined as CSF Aβ42/40 < 0.071 (A), Aβ PET positive visual read (B) or Aβ PET Centiloid (CL) > 12 (C). Abbreviations: CSF, cerebrospinal fluid; Mid, mid-region; NfL, neurofilament light; N, N-terminal; p-tau, phosphorylated tau; t-tau, total tau."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "Dot", "and", "box", "-", "plot", "showing", "the", "levels", "of", "each", "p", "-", "tau", "biomarker", "in", "each", "of", "the", "AT", "groups", ".", "Aβ", "-", "positive", "(", "A", "+", ")", "was", "defined", "by", "a", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "<", "0", ".", "071", "and", "Tau", "-", "positive", "(", "T", "+", ")", "by", "an", "Elecsys", "CSF", "Mid", "-", "p", "-", "tau181", ">", "24", "pg", "/", "ml", ".", "The", "box", "-", "plots", "depict", "the", "median", "(", "horizontal", "bar", ")", ",", "interquartile", "range", "(", "IQR", ",", "hinges", ")", "and", "1", ".", "5", "x", "IQR", "(", "whiskers", ")", ".", "The", "horizontal", "dashed", "line", "indicates", "the", "median", "of", "the", "p", "-", "tau", "biomarker", "in", "the", "A", "-", "T", "-", "group", ".", "Abbreviations", ":", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "Mid", ",", "mid", "-", "region", ";", "N", ",", "N", "-", "terminal", ";", "p", "-", "tau", ",", "phosphorylated", "tau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D Dot and box-plot showing the levels of each p-tau biomarker in each of the AT groups. Aβ-positive (A+) was defined by a CSF Aβ42/40 < 0.071 and Tau-positive (T+) by an Elecsys CSF Mid-p-tau181 > 24 pg/ml. The box-plots depict the median (horizontal bar), interquartile range (IQR, hinges) and 1.5 x IQR (whiskers). The horizontal dashed line indicates the median of the p-tau biomarker in the A-T- group. Abbreviations: CSF, cerebrospinal fluid; Mid, mid-region; N, N-terminal; p-tau, phosphorylated tau."}
{"words": ["Figure", "6The", "graphs", "represent", "the", "z", "-", "scores", "changes", "of", "each", "CSF", "biomarker", "as", "a", "function", "of", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "ratio", "(", "as", "proxy", "of", "disease", "progression", ")", "using", "a", "robust", "local", "weighted", "regression", "method", ".", "The", "z", "-", "scores", "were", "calculated", "using", "the", "mean", "and", "the", "SD", "of", "each", "CSF", "biomarker", "in", "the", "A", "-", "T", "-", "group", "as", "a", "reference", ".", "The", "solid", "lines", "depict", "the", "trajectory", "of", "each", "CSF", "biomarker", ".", "The", "dashed", "lines", "depict", "the", "trajectories", "of", "the", "plasma", "biomarkers", ".", "The", "vertical", "black", "dashed", "line", "indicates", "the", "CSF", "Aβ42", "/", "40", "cutoff", "for", "A", "+", ".", "Note", "that", "the", "CSF", "p", "-", "tau", "biomarkers", "reach", "the", "2", "z", "-", "scores", "(", "depicted", "with", "an", "horizontal", "dashed", "line", ")", "with", "the", "following", "sequence", ":", "Mid", "-", "p", "-", "tau231", ",", "N", "-", "p", "-", "tau181", ",", "N", "-", "p", "-", "tau217", ",", "Mid", "-", "p", "-", "tau181", "and", "t", "-", "tau", ".", "Abbreviations", ":", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "Mid", ",", "mid", "-", "region", ";", "NfL", ",", "Neurofilament", "light", ";", "N", ",", "N", "-", "terminal", ";", "p", "-", "tau", ",", "phosphorylated", "tau", ";", "t", "-", "tau", ",", "total", "tau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6The graphs represent the z-scores changes of each CSF biomarker as a function of CSF Aβ42/40 ratio (as proxy of disease progression) using a robust local weighted regression method. The z-scores were calculated using the mean and the SD of each CSF biomarker in the A-T- group as a reference. The solid lines depict the trajectory of each CSF biomarker. The dashed lines depict the trajectories of the plasma biomarkers. The vertical black dashed line indicates the CSF Aβ42/40 cutoff for A+. Note that the CSF p-tau biomarkers reach the 2 z-scores (depicted with an horizontal dashed line) with the following sequence: Mid-p-tau231, N-p-tau181, N-p-tau217, Mid-p-tau181 and t-tau. Abbreviations: CSF, cerebrospinal fluid; Mid, mid-region; NfL, Neurofilament light; N, N-terminal; p-tau, phosphorylated tau; t-tau, total tau."}
{"words": ["Figure", "1A", "Representative", "clinical", "picture", "of", "two", "patients", "with", "CAOP", "syndrome", "(", "14", "-", "year", "-", "old", "patient", "1", "and", "5", "-", "year", "-", "old", "patient", "2", ")", ".", "B", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "of", "skin", "biopsies", "from", "patient", "1", "and", "healthy", "controls", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Representative clinical picture of two patients with CAOP syndrome (14-year-old patient 1 and 5-year-old patient 2).B Haematoxylin and eosin (H&E) staining of skin biopsies from patient 1 and healthy controls. Scale bars: 200 µm."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "images", "showing", "keratinocyte", "mitochondria", "(", "red", "arrow", ")", "in", "patient", "1", "(", "A", ")", "and", "in", "the", "Mbtps1", "-", "conditional", "knockout", "(", "cKO", ")", "mouse", "model", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", ".", "C", ",", "D", "Quantification", "of", "the", "mitochondrial", "number", "and", "morphology", "in", "patient", "1", "(", "C", ")", "and", "the", "Mbtps1", "-", "cKO", "mouse", "model", "(", "D", ")", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ":", "n", "=", "13", "biological", "replicates", "of", "normal", "individuals", ",", "n", "=", "10", "biological", "replicates", "of", "patient", "1", ".", "Middle", "and", "right", "panel", ":", "n", "=", "121", "biological", "samples", "of", "normal", "individuals", "and", "patient", "1", ".", "(", "D", ")", "Left", "panel", ":", "n", "=", "23", "biological", "replicates", "of", "Mbtps1", "-", "loxP", "mice", ";", "n", "=", "15", "biological", "replicates", "of", "Mbtps1", "-", "cKO", "mice", ".", "Middle", "panel", "and", "right", "panel", ":", "n", "=", "113", "biological", "replicates", "of", "Mbtps1", "-", "loxP", "mice", "and", "Mbtps1", "-", "cKO", ".", "E", "Immunofluorescence", "experiments", "showed", "that", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", "was", "diffusely", "localized", "in", "the", "cytosol", "and", "showed", "lower", "mitochondrial", "localization", "compared", "with", "wild", "-", "type", "S1P", ",", "which", "suggested", "that", "these", "variants", "disrupt", "its", "mitochondrial", "import", ".", "The", "white", "arrowheads", "indicate", "the", "colocation", "(", "yellow", ")", "of", "S1P", "(", "green", ")", "and", "the", "mitochondrial", "tracer", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", "(", "panels", "1", "-", "4", ")", ";", "scale", "bars", ":", "2", "μm", "(", "panel", "5", ")", ".", "F", "Cellular", "component", "separation", "assay", "showing", "that", "S1P", "was", "enriched", "in", "mitochondria", ".", "Biochemical", "fractionation", "of", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", ",", "cytosol", "(", "Cyto", ",", "tubulin", ")", ",", "mitochondria", "(", "Mito", ",", "COX", "IV", ")", ",", "lysosomes", "(", "Lyso", ",", "LAMP1", ")", ",", "Golgi", "apparatus", "(", "Golgi", ",", "GM130", ")", ",", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ",", "ERp72", ")", ",", "and", "nucleus", "(", "Nue", ",", "Lamin", "B", ")", "from", "HaCaT", "cells", ".", "G", "A", "component", "separation", "assay", "revealed", "a", "lower", "expression", "of", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", "than", "wild", "-", "type", "S1P", "in", "mitochondria", ".", "H", "The", "impaired", "binding", "of", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", "to", "translocase", "of", "the", "outer", "membrane", "(", "TOM", ")", "70", "and", "translocase", "of", "the", "inner", "membrane", "(", "TIM", ")", "23", "was", "detected", "by", "a", "coimmunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B Representative transmission electron microscopy (TEM) images showing keratinocyte mitochondria (red arrow) in patient 1 (A) and in the Mbtps1-conditional knockout (cKO) mouse model (B). Scale bars: 2 µm.C, D Quantification of the mitochondrial number and morphology in patient 1 (C) and the Mbtps1-cKO mouse model (D). (C) Left panel: n = 13 biological replicates of normal individuals, n = 10 biological replicates of patient 1. Middle and right panel: n = 121 biological samples of normal individuals and patient 1. (D) Left panel: n = 23 biological replicates of Mbtps1-loxP mice; n = 15 biological replicates of Mbtps1-cKO mice. Middle panel and right panel: n =113 biological replicates of Mbtps1-loxP mice and Mbtps1-cKO.E Immunofluorescence experiments showed that mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg) was diffusely localized in the cytosol and showed lower mitochondrial localization compared with wild-type S1P, which suggested that these variants disrupt its mitochondrial import. The white arrowheads indicate the colocation (yellow) of S1P (green) and the mitochondrial tracer (red). Scale bars: 20 μm (panels 1-4); scale bars: 2 μm (panel 5).F Cellular component separation assay showing that S1P was enriched in mitochondria. Biochemical fractionation of the whole cell lysate (WCL), cytosol (Cyto, tubulin), mitochondria (Mito, COX IV), lysosomes (Lyso, LAMP1), Golgi apparatus (Golgi, GM130), endoplasmic reticulum (ER, ERp72), and nucleus (Nue, Lamin B) from HaCaT cells.G A component separation assay revealed a lower expression of mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg) than wild-type S1P in mitochondria.H The impaired binding of mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg) to translocase of the outer membrane (TOM) 70 and translocase of the inner membrane (TIM) 23 was detected by a coimmunoprecipitation (Co-IP) assay."}
{"words": ["Figure", "3A", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "of", "S1P", "-", "binding", "proteins", ".", "Total", "protein", "lysate", "was", "subjected", "to", "coimmunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "with", "normal", "IgG", "or", "S1P", "antibody", ".", "The", "purified", "protein", "complex", "was", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "then", "subjected", "to", "silver", "staining", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "bands", "containing", "S1P", ",", "ETFA", "and", "ETFB", ".", "The", "differential", "bands", "were", "then", "analysed", "by", "liquid", "chromatography", "-", "tandem", "mass", "spectrometry", "(", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ")", ".", "C", "S1P", "interacts", "with", "endogenous", "ETFA", "and", "ETFB", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Total", "protein", "lysate", "was", "subjected", "to", "Co", "-", "IP", "with", "normal", "IgG", ",", "ETFA", "(", "left", "panel", ")", "or", "ETFB", "(", "right", "panel", ")", "antibody", ".", "The", "interaction", "between", "S1P", "and", "ETFA", "/", "ETFB", "was", "then", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "D", "The", "direct", "interaction", "between", "S1P", "and", "ETFA", "-", "ETFB", "was", "validated", "by", "a", "GST", "pull", "-", "down", "assay", ".", "Left", "panel", ":", "in", "vitro", "-", "translated", "S1P", "was", "pulled", "down", "by", "purified", "GST", "-", "ETFA", "fusion", "protein", ".", "Right", "panel", ":", "in", "vitro", "-", "translated", "S1P", "was", "pulled", "down", "by", "purified", "GST", "-", "ETFB", "fusion", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A LC-MS/MS analysis of S1P-binding proteins. Total protein lysate was subjected to coimmunoprecipitation (Co-IP) with normal IgG or S1P antibody. The purified protein complex was separated by SDS-PAGE and then subjected to silver staining. The arrows indicate the bands containing S1P, ETFA and ETFB. The differential bands were then analysed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).C S1P interacts with endogenous ETFA and ETFB in HaCaT cells. Total protein lysate was subjected to Co-IP with normal IgG, ETFA (left panel) or ETFB (right panel) antibody. The interaction between S1P and ETFA/ETFB was then detected by immunoblotting.D The direct interaction between S1P and ETFA-ETFB was validated by a GST pull-down assay. Left panel: in vitro-translated S1P was pulled down by purified GST-ETFA fusion protein. Right panel: in vitro-translated S1P was pulled down by purified GST-ETFB fusion protein."}
{"words": ["Figure", "4A", "Representative", "immunohistochemical", "images", "of", "S1P", ",", "ETFA", "and", "ETFB", "in", "normal", "controls", "and", "patient", "1", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "B", "Unchanged", "mRNA", "levels", "and", "decreased", "protein", "levels", "of", "ETFA", "and", "ETFB", "were", "observed", "in", "the", "skin", "biopsy", "of", "patient", "1", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "(", "upper", "panel", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", "of", "normal", "controls", ";", "n", "=", "6", "technical", "replicates", "of", "patient", "1", ")", "and", "immunohistochemistry", "(", "lower", "panel", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "of", "the", "S1P", ",", "ETFA", "and", "ETFB", "levels", ".", "C", "Representative", "immunohistochemistry", "images", "of", "S1P", ",", "ETFA", "and", "ETFB", "in", "both", "Mbtps1", "-", "conditional", "knockout", "(", "cKO", ")", "and", "Mbtps1", "-", "loxP", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "D", "MBTPS1", "gene", "knockout", "led", "to", "decreases", "in", "the", "ETFA", "and", "ETFB", "protein", "levels", "in", "vivo", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "(", "upper", "panel", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "and", "immunohistochemistry", "(", "lower", "panel", ",", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "of", "the", "S1P", ",", "ETFA", "and", "ETFB", "levels", "in", "Mbtps1", "-", "cKO", "mice", "and", "Mbtps1", "-", "loxP", "mice", ".", "E", "Cycloheximide", "(", "CHX", ")", "chase", "analysis", "showed", "that", "MBTPS1", "knockout", "induced", "rapid", "degradation", "of", "ETFA", "and", "ETFB", "proteins", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Left", "panel", ":", "Representative", "western", "blotting", "images", "of", "the", "ETFA", "and", "ETFB", "protein", "levels", "during", "CHX", "chase", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "immunoblotting", "results", "corresponding", "to", "the", "left", "panel", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "F", "Mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", "only", "weakly", "interacted", "with", "ETFA", "and", "ETFB", ".", "We", "constructed", "Flag", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "S1P", "HaCaT", "cell", "lines", "and", "then", "performed", "a", "Co", "-", "IP", "assay", "with", "Flag", "antibody", ",", "and", "the", "interaction", "between", "S1P", "and", "ETFA", "/", "ETFB", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "G", "Wild", "-", "type", "S1P", ",", "but", "not", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", ",", "decreased", "the", "association", "between", "ETFA", "and", "ETFB", ".", "We", "performed", "a", "Co", "-", "IP", "assay", "with", "an", "ETFA", "antibody", ",", "and", "the", "interaction", "between", "ETFA", "and", "ETFB", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "H", "Wild", "-", "type", "S1P", ",", "but", "not", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", ",", "enhanced", "the", "incorporation", "of", "FAD", "into", "the", "ETF", "complex", ".", "The", "visible", "spectra", "of", "flavin", "show", "two", "shoulder", "peaks", "at", "420", "nm", "and", "460", "nm", ",", "indicating", "the", "incorporation", "of", "FAD", "in", "the", "ETF", "complex", ".", "In", "the", "presence", "of", "the", "wild", "-", "type", "S1P", "protein", ",", "the", "two", "peaks", "were", "shifted", "by", "0", ".", "02", "OD", "units", ",", "whereas", "the", "additional", "mutant", "S1P", "(", "p", ".", "Val355Gly", "and", "p", ".", "Ter1053Arg", ")", "weakly", "shifted", "the", "two", "peaks", "by", "0", ".", "005", "-", "0", ".", "01", "OD", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Representative immunohistochemical images of S1P, ETFA and ETFB in normal controls and patient 1. Scale bars: 100 μm.B Unchanged mRNA levels and decreased protein levels of ETFA and ETFB were observed in the skin biopsy of patient 1. Quantitative RT-PCR analysis (upper panel, n = 6 biological replicates of normal controls; n = 6 technical replicates of patient 1) and immunohistochemistry (lower panel, n = 6 biological replicates; n = 3 technical replicates) of the S1P, ETFA and ETFB levels.C Representative immunohistochemistry images of S1P, ETFA and ETFB in both Mbtps1-conditional knockout (cKO) and Mbtps1-loxP mice. Scale bars: 100 μm.D MBTPS1 gene knockout led to decreases in the ETFA and ETFB protein levels in vivo. Quantitative RT-PCR analysis (upper panel, n = 6 biological replicates) and immunohistochemistry (lower panel, n = 6 biological replicates) of the S1P, ETFA and ETFB levels in Mbtps1-cKO mice and Mbtps1-loxP mice.E Cycloheximide (CHX) chase analysis showed that MBTPS1 knockout induced rapid degradation of ETFA and ETFB proteins in HaCaT cells. Left panel: Representative western blotting images of the ETFA and ETFB protein levels during CHX chase. Right panel: Quantification of the immunoblotting results corresponding to the left panel (n = 3 biological replicates).F Mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg) only weakly interacted with ETFA and ETFB. We constructed Flag-tagged wild-type and mutant S1P HaCaT cell lines and then performed a Co-IP assay with Flag antibody, and the interaction between S1P and ETFA/ETFB was detected by immunoblotting.G Wild-type S1P, but not mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg), decreased the association between ETFA and ETFB. We performed a Co-IP assay with an ETFA antibody, and the interaction between ETFA and ETFB was detected by immunoblotting.H Wild-type S1P, but not mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg), enhanced the incorporation of FAD into the ETF complex. The visible spectra of flavin show two shoulder peaks at 420 nm and 460 nm, indicating the incorporation of FAD in the ETF complex. In the presence of the wild-type S1P protein, the two peaks were shifted by 0.02 OD units, whereas the additional mutant S1P (p.Val355Gly and p.Ter1053Arg) weakly shifted the two peaks by 0.005-0.01 OD units."}
{"words": ["Figure", "5Mitochondrial", "respiration", "(", "OCR", ")", "in", "control", "(", "Ctrl", ")", "and", "MBTPS1", "-", "knockout", "(", "KO", ")", "HaCaT", "cells", "was", "quantified", "in", "real", "time", "using", "a", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analyser", ".", "Right", "subpanels", ":", "Quantification", "of", "basal", "respiration", ",", "maximal", "respiration", ",", "and", "OCR", "-", "coupled", "ATP", "production", "in", "mitochondrial", "respiration", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "B", "Quantification", "of", "relevant", "metabolites", "in", "mitochondrial", "oxidative", "phosphorylation", "(", "OXPHOS", ")", "and", "glycolysis", "in", "Ctrl", "and", "MBTPS1", "-", "KO", "HaCaT", "cells", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "C", "Nonmitochondrial", "respiration", "(", "ECAR", ")", "was", "quantified", "in", "real", "time", "using", "a", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analyser", ".", "Quantification", "of", "non", "-", "glycolytic", "acidification", ",", "glycolysis", ",", "glycolytic", "capacity", ",", "and", "glycolytic", "reserve", "in", "Ctrl", "and", "MBTPS1", "-", "KO", "HaCaT", "cells", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "D", "MBTPS1", "knockout", "led", "to", "a", "decrease", "in", "global", "ATP", "production", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Control", "and", "MBTPS1", "-", "KO", "HaCaT", "cells", "were", "cultured", "in", "6", "-", "well", "dishes", ".", "A", "standard", "curve", "was", "generated", "to", "calculate", "the", "sample", "ATP", "concentrations", "using", "an", "ATP", "Lite", "Luminescence", "Assay", "Kit", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "E", "MBTPS1", "knockout", "significantly", "increased", "the", "generation", "of", "mitochondrial", "reactive", "oxygen", "species", "(", "Mito", "SOX", ")", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Left", "panel", ":", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "Mito", "SOX", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "Right", "panel", ":", "The", "immunofluorescence", "intensity", "was", "quantified", "to", "calculate", "the", "relative", "Mito", "ROS", "level", "in", "HaCaT", "cells", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mitochondrial respiration (OCR) in control (Ctrl) and MBTPS1-knockout (KO) HaCaT cells was quantified in real time using a Seahorse extracellular flux analyser. Right subpanels: Quantification of basal respiration, maximal respiration, and OCR-coupled ATP production in mitochondrial respiration (n = 5 biological replicates).B Quantification of relevant metabolites in mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and glycolysis in Ctrl and MBTPS1-KO HaCaT cells (n = 4 biological replicates).C Nonmitochondrial respiration (ECAR) was quantified in real time using a Seahorse extracellular flux analyser. Quantification of non-glycolytic acidification, glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve in Ctrl and MBTPS1-KO HaCaT cells (n = 4 biological replicates).D MBTPS1 knockout led to a decrease in global ATP production in HaCaT cells. Control and MBTPS1-KO HaCaT cells were cultured in 6-well dishes. A standard curve was generated to calculate the sample ATP concentrations using an ATP Lite Luminescence Assay Kit (n = 4 biological replicates).E MBTPS1 knockout significantly increased the generation of mitochondrial reactive oxygen species (Mito SOX) in HaCaT cells. Left panel: Representative immunofluorescence images of Mito SOX in HaCaT cells. Scale bars: 100 µm. Right panel: The immunofluorescence intensity was quantified to calculate the relative Mito ROS level in HaCaT cells (n = 4 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "6A", "The", "S1P", "deficiency", "-", "induced", "decrease", "in", "ETFA", "and", "ETFB", "was", "significantly", "reversed", "by", "riboflavin", "(", "Rib", ")", "in", "a", "concentration", "-", "dependent", "manner", "in", "MBTPS1", "-", "KO", "HaCaT", "cells", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "MBTPS1", "-", "KO", "cells", "were", "initially", "cultured", "in", "DMEM", "for", "24", "h", "and", "supplemented", "with", "0", ",", "2", ".", "5", ",", "5", ",", "or", "10", "µM", "riboflavin", "for", "3", "days", ".", "The", "expression", "of", "ETFA", "and", "ETFB", "was", "then", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "B", "The", "S1P", "deficiency", "-", "induced", "abnormalities", "in", "mitochondrial", "respiration", "can", "be", "significantly", "reversed", "by", "riboflavin", "supplementation", "and", "ETFA", "/", "B", "overexpression", "in", "HaCaT", "cells", ".", "Left", "panel", ":", "Mitochondrial", "respiration", "(", "OCR", ")", "was", "quantified", "in", "real", "time", "using", "a", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analyser", ".", "C", "The", "decreased", "global", "ATP", "production", "caused", "by", "S1P", "deficiency", "could", "be", "significantly", "reversed", "by", "riboflavin", "supplementation", "and", "ETFA", "/", "B", "overexpression", "in", "HaCaT", "cells", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "D", "Inflammatory", "lesions", "in", "CAOP", "syndrome", "were", "significantly", "improved", "by", "riboflavin", "supplementation", ".", "The", "representative", "head", "image", "of", "patient", "1", "before", "therapy", "is", "shown", "in", "Figure", "1A", "(", "panel", "1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A The S1P deficiency-induced decrease in ETFA and ETFB was significantly reversed by riboflavin (Rib) in a concentration-dependent manner in MBTPS1-KO HaCaT cells. GAPDH was used as a loading control. MBTPS1-KO cells were initially cultured in DMEM for 24 h and supplemented with 0, 2.5, 5, or 10 µM riboflavin for 3 days. The expression of ETFA and ETFB was then detected by immunoblotting.B The S1P deficiency-induced abnormalities in mitochondrial respiration can be significantly reversed by riboflavin supplementation and ETFA/B overexpression in HaCaT cells. Left panel: Mitochondrial respiration (OCR) was quantified in real time using a Seahorse extracellular flux analyser.C The decreased global ATP production caused by S1P deficiency could be significantly reversed by riboflavin supplementation and ETFA/B overexpression in HaCaT cells (n = 4 biological replicates).D Inflammatory lesions in CAOP syndrome were significantly improved by riboflavin supplementation. The representative head image of patient 1 before therapy is shown in Figure 1A (panel 1)."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "which", "expresses", "β", "-", "galactosidase", "as", "an", "indicator", "of", "T", "cell", "activation", ")", "by", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "horizontal", "axis", ")", "with", "HSV", "-", "1", ",", "then", "incubated", "for", "12", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "the", "hybridoma", ".", "A595", ",", "absorbance", "at", "595", "nm", ".", "b", ")", "Activation", "of", "the", "hybridoma", "as", "described", "in", "a", ",", "with", "the", "addition", "of", "dimethyl", "sulfoxide", "(", "DMSO", ";", "negative", "control", ")", ",", "bafilomycin", "A", "(", "Baf", ")", ",", "brefeldin", "A", "(", "BFA", ")", "or", "MG", "-", "132", "at", "2", "h", "after", "macrophage", "infection", ".", "(", "c", ")", "Activation", "of", "the", "hybridoma", "as", "described", "in", "a", ",", "with", "the", "addition", "of", "bafilomycin", "A", "at", "2", "h", "after", "macrophage", "infection", ".", "(", "d", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "gB", "(", "blue", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "(", "red", ")", "in", "HSV", "-", "1", "-", "infected", "macrophages", ";", "pink", "indicates", "colocalization", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "40", ".", "(", "e", ")", "CD8", "+", "T", "cell", "-", "stimulatory", "capacity", "(", "as", "described", "in", "a", ")", "of", "uninfected", "macrophages", "(", "Mock", ")", ",", "of", "BMA", "(", "BMA", "-", "HSV", ")", "or", "J774", "(", "J774", "-", "HSV", ")", "macrophages", "infected", "for", "8", "h", "with", "HSV", "-", "1", ",", "and", "of", "cocultures", "of", "J774", "macrophages", "(", "H", "-", "2d", ")", "infected", "for", "1", "h", "with", "HSV", "-", "1", ",", "then", "mixed", "with", "uninfected", "BMA", "(", "H", "-", "2b", ")", "macrophages", "at", "a", "ratio", "of", "1", ":", "1", "and", "cultured", "together", "for", "8", "h", "(", "J774", "-", "HSV", "+", "BMA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (which expresses β-galactosidase as an indicator of T cell activation) by macrophages infected for various times (horizontal axis) with HSV-1, then incubated for 12 h at 37 °C with the hybridoma. A595, absorbance at 595 nm.b) Activation of the hybridoma as described in a, with the addition of dimethyl sulfoxide (DMSO; negative control), bafilomycin A (Baf), brefeldin A (BFA) or MG-132 at 2 h after macrophage infection.(c) Activation of the hybridoma as described in a, with the addition of bafilomycin A at 2 h after macrophage infection.(d) Immunofluorescence microscopy of gB (blue) and LAMP-1 (red) in HSV-1-infected macrophages; pink indicates colocalization. Original magnification, × 40.(e) CD8+ T cell-stimulatory capacity (as described in a) of uninfected macrophages (Mock), of BMA (BMA-HSV) or J774 (J774-HSV) macrophages infected for 8 h with HSV-1, and of cocultures of J774 macrophages (H-2d) infected for 1 h with HSV-1, then mixed with uninfected BMA (H-2b) macrophages at a ratio of 1:1 and cultured together for 8 h (J774-HSV + BMA)."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "LC3", "expression", "in", "macrophages", "infected", "for", "2", "-", "8", "h", "(", "left", "margin", ")", "with", "HSV", "-", "1", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "20", ".", "(", "b", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "described", "in", "Fig", ".", "1a", ")", "by", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "horizontal", "axis", ")", "with", "HSV", "-", "1", ",", "with", "(", "DMEM", "+", "3", "-", "MA", ")", "or", "without", "(", "DMEM", ")", "the", "addition", "of", "3", "-", "methyladenine", "2", "h", "after", "infection", ",", "then", "incubated", "for", "12", "h", "at", "37", "°", "C", "with", "the", "hybridoma", ".", "(", "c", ")", "Activation", "of", "the", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "b", ")", "by", "macrophages", "transfected", "for", "60", "h", "with", "control", "(", "Ctrl", ")", "siRNA", "or", "Atg5", "-", "specific", "siRNA", ",", "then", "infected", "for", "8", "h", "or", "12", "h", "with", "HSV", "-", "1", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "Atg", "-", "5", "in", "siRNA", "-", "treated", "macrophages", ".", "(", "e", ")", "Activation", "of", "the", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "b", ")", "by", "macrophages", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "and", "incubated", "at", "37", "°", "C", "(", "Basal", ")", ",", "incubated", "for", "12", "h", "at", "39", "°", "C", "before", "being", "infected", "with", "HSV", "-", "1", "(", "heat", "shock", "(", "HS", ")", ")", ",", "or", "treated", "with", "rapamycin", "during", "HSV", "-", "1", "infection", "(", "Rapa", ")", ",", "with", "(", "+", "Baf", ")", "or", "without", "the", "addition", "of", "bafilmycin", "A", "at", "2", "h", "after", "infection", ".", "(", "f", ")", "Activation", "of", "the", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "b", ")", "by", "macrophages", "transfected", "for", "60", "h", "with", "control", "siRNA", "or", "Atg5", "-", "specific", "siRNA", ",", "then", "infected", "for", "8", "h", "with", "HSV", "-", "1", ",", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "−", ")", "the", "addition", "of", "rapamycin", "at", "2", "h", "after", "infection", ".", "Results", "in", "b", ",", "c", ",", "e", ",", "f", "are", "normalized", "to", "results", "obtained", "for", "CD8", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "macrophages", "infected", "for", "8", "h", "at", "37", "°", "C", "without", "further", "treatment", "(", "b", ",", "e", ")", "or", "infected", "macrophages", "treated", "with", "control", "siRNA", "(", "c", ",", "f", ")", "and", "are", "presented", "in", "arbitrary", "units", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "a", ",", "d", ")", "or", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ";", "b", ",", "c", ",", "e", ",", "f", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Immunofluorescence microscopy of LC3 expression in macrophages infected for 2-8 h (left margin) with HSV-1. Original magnification, × 20.(b) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (described in Fig. 1a) by macrophages infected for various times (horizontal axis) with HSV-1, with (DMEM + 3-MA) or without (DMEM) the addition of 3-methyladenine 2 h after infection, then incubated for 12 h at 37 °C with the hybridoma.(c) Activation of the hybridoma (as described in b) by macrophages transfected for 60 h with control (Ctrl) siRNA or Atg5-specific siRNA, then infected for 8 h or 12 h with HSV-1.(d) Immunoblot analysis of Atg-5 in siRNA-treated macrophages. (e) Activation of the hybridoma (as described in b) by macrophages infected with HSV-1 and incubated at 37 °C (Basal), incubated for 12 h at 39 °C before being infected with HSV-1 (heat shock (HS)), or treated with rapamycin during HSV-1 infection (Rapa), with (+ Baf) or without the addition of bafilmycin A at 2 h after infection.  (f) Activation of the hybridoma (as described in b) by macrophages transfected for 60 h with control siRNA or Atg5-specific siRNA, then infected for 8 h with HSV-1, with (+) or without (−) the addition of rapamycin at 2 h after infection. Results in b,c,e,f are normalized to results obtained for CD8+ T cells stimulated with macrophages infected for 8 h at 37 °C without further treatment (b,e) or infected macrophages treated with control siRNA (c,f) and are presented in arbitrary units. Data are representative of three independent experiments (a,d) or are from three independent experiments (mean and s.e.m. of triplicate samples; b,c,e,f). "}
{"words": ["figf3", "(", "a", "-", "c", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "uninfected", "macrophages", "incubated", "at", "37", "°", "C", "(", "control", ";", "a", ")", ",", "subjected", "to", "mild", "heat", "shock", "(", "b", ")", "or", "treated", "with", "rapamycin", "(", "c", ")", ",", "then", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", ".", "d", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "the", "expression", "of", "LC3", ",", "gB", "and", "GFP", "(", "VP26", ")", "by", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "left", "margin", ")", "with", "HSV", "-", "1", ".", "White", "indicates", "colocalization", ".", "(", "e", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "macrophages", "infected", "for", "6", "h", "or", "8", "h", "(", "left", "margin", ")", "with", "wild", "-", "type", "HSV", "-", "1", "(", "WT", ")", "or", "HSV", "-", "1", "lacking", "ICP34", ".", "5", "(", "Δ34", ".", "5", ")", ".", "Blue", ",", "staining", "of", "nuclei", "with", "DAPI", "(", "4", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ")", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "100", "(", "a", "-", "c", ")", "or", "×", "63", "(", "d", ",", "e", ")", ".", "Results", "in", "a", "-", "e", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "f", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1a", ")", "by", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "horizontal", "axis", ")", "with", "wild", "-", "type", "HSV", "-", "1", "strain", "17", "+", "(", "WT", "17", "+", ")", "or", "Δ34", ".", "5", "HSV", "-", "1", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ")", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Immunoblot", "analysis", "(", "IB", ";", "g", ")", "and", "flow", "cytometry", "(", "h", ")", "of", "the", "expression", "of", "HSV", "-", "1", "proteins", "(", "g", ")", "and", "gB", "(", "h", ")", "in", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "above", "lanes", "(", "g", ")", "or", "plots", "(", "h", ")", ")", "with", "wild", "-", "type", "or", "Δ34", ".", "5", "HSV", "-", "1", ".", "Ctrl", ",", "control", "(", "uninfected", "BMA", "macrophages", ";", "h", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "(", "g", ")", "or", "three", "(", "h", ")", "independent", "experiments", ".", "(", "i", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1a", ")", "by", "macrophages", "infected", "for", "various", "times", "(", "below", "graph", ")", "with", "wild", "-", "type", "or", "Δ34", ".", "5", "HSV", "-", "1", ",", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "the", "addition", "of", "bafilomycin", "A", "at", "2", "h", "after", "infection", ".", "Results", "in", "f", ",", "i", "are", "normalized", "to", "results", "obtained", "for", "CD8", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "macrophages", "infected", "for", "6", "h", "with", "wild", "-", "type", "virus", "(", "f", ")", "or", "with", "infected", "macrophages", "incubated", "without", "bafilomycin", "(", "i", ")", "and", "are", "presented", "in", "arbitrary", "units", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3 (a-c) Immunofluorescence microscopy of uninfected macrophages incubated at 37 °C (control; a), subjected to mild heat shock (b) or treated with rapamycin (c), then stained with anti-LC3. d) Immunofluorescence microscopy of the expression of LC3, gB and GFP (VP26) by macrophages infected for various times (left margin) with HSV-1. White indicates colocalization. (e) Immunofluorescence microscopy of macrophages infected for 6 h or 8 h (left margin) with wild-type HSV-1 (WT) or HSV-1 lacking ICP34.5 (Δ34.5). Blue, staining of nuclei with DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Original magnification, × 100 (a-c) or × 63 (d,e). Results in a-e are representative of three independent experiments. (f) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (as described in Fig. 1a) by macrophages infected for various times (horizontal axis) with wild-type HSV-1 strain 17+ (WT 17+) or Δ34.5 HSV-1. Data are from three independent experiments (mean and s.e.m. of triplicate samples). (g,h) Immunoblot analysis (IB; g) and flow cytometry (h) of the expression of HSV-1 proteins (g) and gB (h) in macrophages infected for various times (above lanes (g) or plots (h)) with wild-type or Δ34.5 HSV-1. Ctrl, control (uninfected BMA macrophages; h). Data are representative of two (g) or three (h) independent experiments.  (i) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (as described in Fig. 1a) by macrophages infected for various times (below graph) with wild-type or Δ34.5 HSV-1, with (+) or without (-) the addition of bafilomycin A at 2 h after infection. Results in f,i are normalized to results obtained for CD8+ T cells stimulated with macrophages infected for 6 h with wild-type virus (f) or with infected macrophages incubated without bafilomycin (i) and are presented in arbitrary units. Data are from three independent experiments (mean and s.e.m. of triplicate samples). "}
{"words": ["figf4", "Electron", "microscopy", "of", "macrophages", "10", "h", "after", "infection", "with", "HSV", "-", "1", ".", "(", "a", ")", "Arrows", "indicate", "membrane", "-", "coiled", "structures", "emerging", "from", "the", "nucleus", "of", "an", "infected", "cell", ".", "(", "b", "-", "d", ")", "Four", "-", "layered", "membrane", "structures", "formed", "by", "coiling", "of", "the", "nuclear", "membrane", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Glucose", "-", "6", "-", "phosphatase", "(", "black", "deposits", ")", "on", "autophagosome", "-", "like", "structures", "emerging", "from", "the", "nuclear", "envelope", "or", "free", "in", "the", "cytoplasm", ",", "and", "viral", "capsids", "in", "the", "cytoplasm", "engulfed", "in", "the", "lumen", "of", "an", "autophagosome", "-", "like", "compartment", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "VP", ",", "viral", "particles", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "μm", "(", "a", ")", ",", "0", ".", "25", "μm", "(", "b", "-", "d", ",", "f", ")", "or", "0", ".", "4", "μm", "(", "e", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cell", "profiles", "in", "each", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4 Electron microscopy of macrophages 10 h after infection with HSV-1. (a) Arrows indicate membrane-coiled structures emerging from the nucleus of an infected cell. (b-d) Four-layered membrane structures formed by coiling of the nuclear membrane. (e,f) Glucose-6-phosphatase (black deposits) on autophagosome-like structures emerging from the nuclear envelope or free in the cytoplasm, and viral capsids in the cytoplasm engulfed in the lumen of an autophagosome-like compartment. N, nucleus; VP, viral particles. Scale bars, 1 μm (a), 0.25 μm (b-d,f) or 0.4 μm (e). Images are representative of three independent experiments with at least 100 cell profiles in each. "}
{"words": ["figf5", "Immunoelectron", "microscopy", "of", "macrophages", "10", "h", "after", "infection", "with", "HSV", "-", "1", ".", "(", "a", "-", "c", ")", "Accumulation", "of", "LC3", "(", "a", ",", "b", ")", "and", "gB", "(", "c", ")", ".", "(", "d", ")", "Fusion", "of", "four", "-", "layered", "membrane", "structures", "and", "lysosomes", "preloaded", "with", "bovine", "serum", "albumin", "-", "gold", "(", "BSA", "-", "gold", ";", "black", "dots", ")", ".", "Original", "magnification", ",", "×", "54", ",", "800", "(", "a", ",", "b", ")", ",", "×", "69", ",", "000", "(", "c", ")", "or", "×", "38", ",", "000", "(", "d", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "(", "a", "-", "c", ")", "or", "two", "(", "d", ")", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5 Immunoelectron microscopy of macrophages 10 h after infection with HSV-1. (a-c) Accumulation of LC3 (a,b) and gB (c). (d) Fusion of four-layered membrane structures and lysosomes preloaded with bovine serum albumin-gold (BSA-gold; black dots). Original magnification, × 54,800 (a,b), × 69,000 (c) or × 38,000 (d). Images are representative of three (a-c) or two (d) independent experiments. "}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1a", ")", "by", "macrophages", "exposed", "to", "DMSO", "(", "negative", "control", ")", ",", "mild", "heat", "shock", ",", "IL", "-", "1β", "or", "IFN", "-", "γ", ".", "(", "b", ")", "Dansylcadaverin", "staining", "of", "untreated", "macrophages", "(", "Basal", ")", "or", "macrophages", "exposed", "to", "mild", "heat", "shock", ",", "IFN", "-", "γ", "or", "IL", "-", "1β", "and", "infected", "for", "8", "h", "with", "wild", "-", "type", "HSV", "-", "1", ",", "normalized", "to", "the", "signal", "obtained", "in", "basal", "conditions", "and", "presented", "in", "arbitrary", "units", ".", "(", "c", "-", "f", ")", "Activation", "of", "the", "gB", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "hybridoma", "(", "as", "described", "in", "Fig", ".", "1a", ")", "by", "macrophages", "incubated", "at", "37", "°", "C", "(", "c", ")", "or", "exposed", "to", "mild", "heat", "shock", "(", "d", ")", ",", "IL", "-", "1β", "(", "e", ")", "or", "IFN", "-", "γ", "(", "f", ")", "and", "infected", "for", "8", "h", "with", "wild", "-", "type", "HSV", "-", "1", "with", "the", "addition", "of", "DMSO", "(", "negative", "control", ")", ",", "3", "-", "methyladenine", ",", "bafilomycin", ",", "brefeldin", "A", "or", "MG", "-", "132", "at", "2", "h", "after", "infection", ".", "Results", "in", "a", ",", "c", "-", "f", "are", "normalized", "to", "results", "obtained", "for", "CD8", "+", "T", "cells", "stimulated", "with", "macrophages", "incubated", "with", "DMSO", "in", "each", "condition", "and", "are", "presented", "in", "arbitrary", "units", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "mean", "and", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "triplicate", "samples", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6 (a) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (as described in Fig. 1a) by macrophages exposed to DMSO (negative control), mild heat shock, IL-1β or IFN-γ.  (b) Dansylcadaverin staining of untreated macrophages (Basal) or macrophages exposed to mild heat shock, IFN-γ or IL-1β and infected for 8 h with wild-type HSV-1, normalized to the signal obtained in basal conditions and presented in arbitrary units.  (c-f) Activation of the gB-specific CD8+ T cell hybridoma (as described in Fig. 1a) by macrophages incubated at 37 °C (c) or exposed to mild heat shock (d), IL-1β (e) or IFN-γ (f) and infected for 8 h with wild-type HSV-1 with the addition of DMSO (negative control), 3-methyladenine, bafilomycin, brefeldin A or MG-132 at 2 h after infection. Results in a,c-f are normalized to results obtained for CD8+ T cells stimulated with macrophages incubated with DMSO in each condition and are presented in arbitrary units. Data are from three independent experiments (mean and s.e.m. of triplicate samples). "}
{"words": ["Figure", "1Confirmation", "of", "peptide", "entry", "into", "neurons", ".", "Cultures", "were", "incubated", "with", "Bio", "-", "TMyc", "(", "25", "µM", ",", "1", "h", ")", "(", "panel", "b", ")", "or", "left", "untreated", "(", "panel", "a", ")", ".", "Arrowheads", "highlight", "peptide", "permeability", ",", "detected", "by", "fluorescein", "Avidin", "D", "(", "green", ")", ",", "into", "neurons", "labeled", "with", "neuronal", "-", "specific", "antibody", "NeuN", "(", "red", ")", ".", "Peptide", "is", "not", "detected", "in", "some", "neurons", "(", "arrow", ")", "and", "non", "-", "neuronal", "cells", "(", "asterisk", ")", ".", "Confocal", "microscopy", "images", "correspond", "to", "single", "sections", "and", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Effect", "of", "TMyc", "on", "neuronal", "survival", ".", "Primary", "cultures", "were", "incubated", "with", "TMyc", "(", "5", ",", "15", "or", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "and", "subjected", "to", "treatment", "with", "NMDA", "(", "100", "µM", ")", "and", "glycine", "(", "10", "µM", ")", "for", "4", "h", ".", "Specific", "neuronal", "viability", "was", "established", "and", "expressed", "relative", "to", "values", "in", "cultures", "with", "no", "treatment", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "represented", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Tukey", "HSD", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Confirmation of peptide entry into neurons. Cultures were incubated with Bio-TMyc (25 µM, 1 h) (panel b) or left untreated (panel a). Arrowheads highlight peptide permeability, detected by fluorescein Avidin D (green), into neurons labeled with neuronal-specific antibody NeuN (red). Peptide is not detected in some neurons (arrow) and non-neuronal cells (asterisk). Confocal microscopy images correspond to single sections and are representative of five independent experiments. Scale bar, 10 μm.Effect of TMyc on neuronal survival. Primary cultures were incubated with TMyc (5, 15 or 25 μM, 30 min) and subjected to treatment with NMDA (100 µM) and glycine (10 µM) for 4 h. Specific neuronal viability was established and expressed relative to values in cultures with no treatment. Means ± SEM are represented (n = 8) and statistical analysis was performed by ANOVA test followed by post-hoc Tukey HSD test."}
{"words": ["Figure", "2Effect", "of", "TFL457", ",", "TFL482", "and", "TFL541", "on", "TrkB", "-", "FL", "levels", ".", "Cultures", "preincubated", "with", "TrkB", "-", "FL", "peptides", "or", "TMyc", "(", "25", "µM", ",", "30", "min", ")", ",", "followed", "by", "chronic", "NMDA", "treatment", "(", "2", "h", ")", ",", "were", "compared", "to", "cells", "without", "peptide", ".", "Levels", "of", "full", "-", "length", "(", "FL", ")", "TrkB", "were", "established", "with", "panTrkB", ",", "an", "antibody", "for", "the", "extracellular", "domain", "that", "also", "detects", "the", "truncated", "forms", "(", "tTrkB", ")", ".", "Quantitation", "of", "peptide", "interference", "of", "TrkB", "-", "FL", "downregulation", ".", "Receptor", "levels", "were", "normalized", "to", "NSE", "and", "expressed", "relative", "to", "values", "obtained", "in", "cultures", "without", "peptide", "or", "NMDA", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "represented", "and", "analysis", "was", "performed", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Tukey", "HSD", "test", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "02", ";", "n", "=", "4", ")", ".", "Effect", "of", "TFL457", ",", "TFL482", "and", "TFL541", "on", "neuronal", "viability", "after", "chronic", "excitotoxicity", ".", "Cultures", "were", "preincubated", "with", "peptides", "and", "treated", "with", "NMDA", "for", "0", "-", "6", "h", "as", "before", ".", "Values", "for", "each", "time", "point", "were", "represented", "relative", "to", "those", "of", "neurons", "incubated", "with", "the", "same", "peptide", "but", "no", "NMDA", ".", "Mean", "±", "SEM", "of", "eleven", "(", "TFL457", ")", ",", "three", "(", "TFL482", ")", "and", "seven", "(", "TFL541", ")", "independent", "experiments", "is", "given", ".", "Effect", "of", "TFL518", "on", "TrkB", "-", "FL", "levels", ".", "Cultures", "incubated", "with", "TFL518", "as", "before", "were", "compared", "to", "those", "treated", "with", "TMyc", "or", "TFL457", ".", "TFL518", "effect", "on", "neuronal", "viability", ".", "Cultures", "were", "treated", "and", "analyzed", "as", "above", ".", "No", "significant", "differences", "were", "found", "for", "TFL518", "while", "neuroprotection", "by", "TFL457", "was", "confirmedEffect", "of", "TFL457", "on", "neuronal", "viability", "after", "acute", "excitotoxicity", ".", "Cells", "were", "induced", "with", "NMDA", "(", "50", "μM", ")", "and", "glycine", "(", "10", "μM", ")", "for", "1", "h", "and", ",", "after", "agonists", "removal", ",", "culture", "proceeded", "for", "20", "h", "with", "DL", "-", "AP5", "(", "200", "μM", ")", "and", "TMyc", "or", "TFL457", "(", "15", "μM", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "relative", "to", "cultures", "incubated", "with", "TMyc", "but", "no", "NMDA", "is", "represented", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Effect of TFL457, TFL482 and TFL541 on TrkB-FL levels. Cultures preincubated with TrkB-FL peptides or TMyc (25 µM, 30 min), followed by chronic NMDA treatment (2 h), were compared to cells without peptide. Levels of full-length (FL) TrkB were established with panTrkB, an antibody for the extracellular domain that also detects the truncated forms (tTrkB). Quantitation of peptide interference of TrkB-FL downregulation. Receptor levels were normalized to NSE and expressed relative to values obtained in cultures without peptide or NMDA. Means ± SEM are represented and analysis was performed by ANOVA test followed by post-hoc Tukey HSD test (*p = 0.02; n = 4).Effect of TFL457, TFL482 and TFL541 on neuronal viability after chronic excitotoxicity. Cultures were preincubated with peptides and treated with NMDA for 0-6 h as before. Values for each time point were represented relative to those of neurons incubated with the same peptide but no NMDA. Mean ± SEM of eleven (TFL457), three (TFL482) and seven (TFL541) independent experiments is given.Effect of TFL518 on TrkB-FL levels. Cultures incubated with TFL518 as before were compared to those treated with TMyc or TFL457.TFL518 effect on neuronal viability. Cultures were treated and analyzed as above. No significant differences were found for TFL518 while neuroprotection by TFL457 was confirmedEffect of TFL457 on neuronal viability after acute excitotoxicity. Cells were induced with NMDA (50 μM) and glycine (10 μM) for 1 h and, after agonists removal, culture proceeded for 20 h with DL-AP5 (200 μM) and TMyc or TFL457 (15 μM). Mean ± SEM relative to cultures incubated with TMyc but no NMDA is represented."}
{"words": ["Figure", "3Effect", "of", "TFL457", "on", "Y515", "and", "Y816", "phosphorylation", ".", "Cultures", "preincubated", "with", "TMyc", "or", "TFL457", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "were", "treated", "with", "NMDA", "(", "0", "-", "6", "h", ")", "and", "analyzed", "with", "panTrkB", "or", "phosphospecific", "antibodies", ".", "Quantitation", "of", "pY515", "and", "pY816", ".", "Mean", "±", "SEM", "of", "normalized", "pY515", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "pY816", "(", "n", "=", "4", ")", "levels", "obtained", "after", "NMDA", "-", "treatment", "(", "2", "h", ")", "are", "represented", "relative", "to", "those", "found", "in", "cells", "with", "the", "same", "peptide", "but", "no", "NMDA", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "unpaired", "Student", "t", "test", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "046", ";", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significant", ")", ".", "Analysis", "by", "immunoprecipitation", "of", "TFL457", "effect", "on", "pY816", "levels", ".", "Cultures", "preincubated", "and", "treated", "as", "before", "with", "NMDA", "(", "2", "h", ")", ",", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "specific", "for", "phosphorylated", "tyrosine", "(", "pY", ")", ".", "pY816", "was", "analyzed", "by", "WB", "in", "immunoprecipates", ".", "TFL457", "effects", "on", "neuronal", "viability", "after", "inhibition", "of", "TrkB", "-", "FL", "signaling", ".", "Cultures", "were", "preincubated", "(", "30", "min", ")", "with", "inhibitors", "specific", "for", "PI3K", "(", "Wortmannin", ",", "100", "nM", ")", ",", "MAPK", "/", "ERK", "(", "UO126", ",", "300", "nM", ")", "or", "PLCγ", "(", "U", "-", "73122", ",", "5", "μM", ")", "before", "incubation", "with", "TMyc", "or", "TFL457", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", ".", "Viability", "was", "established", "4", "h", "after", "NMDA", "treatment", ".", "Means", "±", "SEM", "relative", "to", "untreated", "cultures", "are", "represented", "and", "data", "were", "analyzed", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Tukey", "HSD", "test", "(", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "009", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "02", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significant", ",", "respectively", "for", "TMyc", "vs", "TFL457", "in", "untreated", "or", "Wortmannin", ",", "UO126", "or", "U", "-", "73122", "-", "treated", "cells", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "008", "for", "untreated", "vs", "U", "-", "73122", "-", "treated", "cells", "preincubated", "with", "TFL457", ";", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Effect of TFL457 on Y515 and Y816 phosphorylation. Cultures preincubated with TMyc or TFL457 (25 μM, 30 min) were treated with NMDA (0-6 h) and analyzed with panTrkB or phosphospecific antibodies. Quantitation of pY515 and pY816. Mean ± SEM of normalized pY515 (n = 7) or pY816 (n = 4) levels obtained after NMDA-treatment (2 h) are represented relative to those found in cells with the same peptide but no NMDA. Statistical analysis was performed by unpaired Student t test (*p = 0.046; n.s. = non-significant).Analysis by immunoprecipitation of TFL457 effect on pY816 levels. Cultures preincubated and treated as before with NMDA (2 h), were immunoprecipitated with antibodies specific for phosphorylated tyrosine (pY). pY816 was analyzed by WB in immunoprecipates.TFL457 effects on neuronal viability after inhibition of TrkB-FL signaling. Cultures were preincubated (30 min) with inhibitors specific for PI3K (Wortmannin, 100 nM), MAPK/ERK (UO126, 300 nM) or PLCγ (U-73122, 5 μM) before incubation with TMyc or TFL457 (25 μM, 30 min). Viability was established 4 h after NMDA treatment. Means ± SEM relative to untreated cultures are represented and data were analyzed by ANOVA test followed by post-hoc Tukey HSD test (***p = 0.0001, **p = 0.009, *p = 0.02, n.s. = non-significant, respectively for TMyc vs TFL457 in untreated or Wortmannin, UO126 or U-73122-treated cells; **p = 0.008 for untreated vs U-73122-treated cells preincubated with TFL457; n = 5)."}
{"words": ["Figure", "4Dose", "-", "dependent", "TFL457", "effects", ".", "Cultures", "incubated", "with", "TMyc", "o", "TFL457", "(", "5", ",", "15", "o", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "were", "treated", "with", "NMDA", "(", "2", "h", ")", "and", "compared", "to", "cells", "without", "peptide", "or", "NMDA", ".", "Time", "-", "course", "TFL457", "effects", ".", "Cells", "preincubated", "with", "peptides", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "were", "treated", "with", "NMDA", "(", "0", "-", "6", "h", ")", ".", "Quantitation", "of", "peptide", "effects", ".", "Normalized", "protein", "levels", "are", "presented", "relative", "to", "values", "obtained", "in", "cells", "incubated", "with", "the", "same", "peptide", "but", "no", "NMDA", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "given", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Bonferroni", "test", ",", "comparing", "TMyc", "or", "TFL457", "-", "treated", "cells", "for", "each", "time", "-", "point", "(", "TrkB", "-", "FL", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0009", "and", "*", "p", "=", "0", ".", "02", ";", "CREB", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0149", "and", "*", "p", "=", "0", ".", "0148", ";", "pCREB", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0012", ";", "MEF2D", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0023", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0047", ".", "All", "values", "are", "respectively", "for", "2", "or", "4", "h", ";", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Dose-dependent TFL457 effects. Cultures incubated with TMyc o TFL457 (5, 15 o 25 μM, 30 min) were treated with NMDA (2 h) and compared to cells without peptide or NMDA.Time-course TFL457 effects. Cells preincubated with peptides (25 μM, 30 min) were treated with NMDA (0-6 h).Quantitation of peptide effects. Normalized protein levels are presented relative to values obtained in cells incubated with the same peptide but no NMDA. Means ± SEM are given. Results were analyzed by a two-way ANOVA test followed by post-hoc Bonferroni test, comparing TMyc or TFL457-treated cells for each time-point (TrkB-FL, ***p = 0.0009 and *p = 0.02; CREB, *p = 0.0149 and *p = 0.0148; pCREB, ***p = 0.0007 and **p = 0.0012; MEF2D, **p = 0.0023 and **p = 0.0047. All values are respectively for 2 or 4 h; n = 6)."}
{"words": ["Figure", "5Effect", "of", "TFL457", "on", "MEF2", "-", "promoter", "activity", ".", "Cultures", "transfected", "with", "pMEF2", "(", "two", "minimal", "wild", "type", "MEF2", "elements", ")", "or", "pMEF2mut", "(", "mutant", ")", "were", "preincubated", "with", "CPPs", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "and", "treated", "with", "NMDA", "(", "100", "µM", ",", "2", "h", ")", ".", "Means", "±", "SEM", "of", "luciferase", "activities", "obtained", "in", "excitotoxicity", ",", "relative", "to", "values", "found", "in", "cells", "treated", "with", "same", "peptide", "and", "no", "NMDA", ",", "are", "presented", ".", "Effect", "on", "CRE", "-", "promoter", "activity", ".", "pCRE", "contains", "two", "minimal", "CREs", ".", "Peptide", "preincubation", "was", "as", "above", "with", "or", "without", "KG", "-", "501", "(", "10", "µM", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "luciferase", "activities", "are", "given", "relative", "to", "values", "in", "cells", "treated", "with", "the", "same", "peptide", "but", "no", "NMDA", "or", "KG", "-", "501", ".", "Effect", "on", "NMDAR", "-", "subunit", "promoters", ".", "Cells", "transfected", "with", "pGluN1", "or", "pGluN2A", "were", "treated", "and", "analyzed", "as", "in", "panel", "A", "(", "pGluN1", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "016", ";", "pGluN2A", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "029", ";", "n", "=", "14", ")", ".", "Effects", "on", "BDNF", "promoter", "III", "or", "TrkB", "promoter", ".", "Cells", "transfected", "with", "pIIIBDNF", "(", "n", "=", "9", ")", ",", "pTrkB", "(", "n", "=", "7", ")", "or", "pCRE", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "as", "a", "control", ",", "were", "processed", "as", "above", "but", "using", "20", "µM", "NMDA", "for", "4", "h", ".", "Data", "are", "presented", "and", "analyzed", "as", "in", "panel", "A", "(", "pCRE", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0098", ";", "pIIIBDNF", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "029", ";", "pTrkB", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "033", ")", ".", "Effects", "of", "TFL457", "on", "mRNA", "levels", "of", "CREB", "/", "MEF2", "-", "regulated", "genes", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", "from", "cultures", "preincubated", "with", "CPPs", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "and", "treated", "or", "not", "with", "NMDA", "(", "100", "µM", ",", "4", "h", ")", ".", "Levels", "of", "mRNA", "were", "normalized", "to", "NSE", "(", "genes", "expressed", "in", "neurons", ",", "left", "panel", ")", "or", "GAPDH", "(", "neuronal", "and", "glial", "expression", ",", "right", "panel", ")", ".", "Means", "±", "SEM", "of", "levels", "obtained", "in", "excitotoxicity", "relative", "to", "values", "found", "in", "cells", "treated", "with", "same", "peptide", "and", "no", "NMDA", "are", "presented", ".", "Differences", "found", "in", "excitotoxicity", "were", "analyzed", "by", "ANOVA", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "Tukey", "HSD", "test", "(", "GluN1", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "00096", ";", "GluN2A", ",", "p", "=", "0", ".", "98", ";", "TrkB", "-", "FL", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "00037", ";", "BDNF", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "045", ";", "n", "=", "8", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Effect of TFL457 on MEF2-promoter activity. Cultures transfected with pMEF2 (two minimal wild type MEF2 elements) or pMEF2mut (mutant) were preincubated with CPPs (25 μM, 30 min) and treated with NMDA (100 µM, 2 h). Means ± SEM of luciferase activities obtained in excitotoxicity, relative to values found in cells treated with same peptide and no NMDA, are presented.Effect on CRE-promoter activity. pCRE contains two minimal CREs. Peptide preincubation was as above with or without KG-501 (10 µM). Mean ± SEM luciferase activities are given relative to values in cells treated with the same peptide but no NMDA or KG-501.Effect on NMDAR-subunit promoters. Cells transfected with pGluN1 or pGluN2A were treated and analyzed as in panel A (pGluN1, *p = 0.016; pGluN2A, *p = 0.029; n = 14).Effects on BDNF promoter III or TrkB promoter. Cells transfected with pIIIBDNF (n = 9), pTrkB (n = 7) or pCRE (n = 5), as a control, were processed as above but using 20 µM NMDA for 4 h. Data are presented and analyzed as in panel A (pCRE, **p = 0.0098; pIIIBDNF, *p = 0.029; pTrkB, *p = 0.033).Effects of TFL457 on mRNA levels of CREB/MEF2-regulated genes. Total RNA was extracted from cultures preincubated with CPPs (25 μM, 30 min) and treated or not with NMDA (100 µM, 4 h). Levels of mRNA were normalized to NSE (genes expressed in neurons, left panel) or GAPDH (neuronal and glial expression, right panel). Means ± SEM of levels obtained in excitotoxicity relative to values found in cells treated with same peptide and no NMDA are presented. Differences found in excitotoxicity were analyzed by ANOVA test followed by post-hoc Tukey HSD test (GluN1, ***p = 0.00096; GluN2A, p = 0.98; TrkB-FL, ***p = 0.00037; BDNF, *p = 0.045; n = 8)."}
{"words": ["Figure", "6TFL457", "interference", "of", "RIP", "and", "calpain", "-", "processing", "in", "excitotoxicity", ".", "Cultures", "were", "preincubated", "with", "peptides", "(", "25", "µM", ",", "30", "min", ")", "or", "left", "untreated", "before", "NMDA", "addition", "(", "2", "h", ")", ".", "Different", "exposures", "are", "shown", "to", "facilitate", "visualization", "of", "FL", ",", "f42", "/", "39", "or", "f32", ".", "Quantitation", "of", "normalized", "f32", "and", "f42", "/", "39", "levels", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "shown", "relative", "to", "cultures", "treated", "with", "NMDA", "and", "no", "peptide", ".", "Effect", "of", "TFL457", "on", "neuronal", "viability", "after", "calpain", "inhibition", ".", "After", "30", "min", "preincubation", "with", "calpeptin", "(", "Calp", ",", "10", "µM", ")", "and", "calpain", "inhibitor", "III", "(", "CiIII", ",", "10", "µM", ")", ",", "cultures", "were", "treated", "with", "CPPs", "and", "NMDA", "(", "4", "h", ")", "as", "before", ".", "Means", "±", "SEM", "relative", "to", "those", "obtained", "in", "untreated", "cultures", "are", "given", ".", "Effect", "of", "TFL457", "on", "neuronal", "viability", "after", "metalloproteinase", "inhibition", ".", "Cultures", "preincubated", "with", "GM6001", "(", "10", "µM", ",", "30", "min", ")", "were", "treated", "with", "CPPs", "and", "NMDA", "as", "before", ".", "Analysis", "was", "performed", "as", "above", "(", "without", "GM6001", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", ";", "with", "GM6001", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0006", ";", "n", "=", "4", ")", ".", "Effect", "of", "NMDA", "on", "total", "and", "cell", "-", "surface", "TrkB", "-", "FL", "levels", ".", "Cultures", "were", "incubated", "with", "NMDA", "(", "100", "µM", ")", "or", "BDNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "1", "h", ".", "Membrane", "proteins", "were", "labeled", "and", "purified", "and", "compared", "to", "corresponding", "total", "lysates", ".", "TrkB", "-", "FL", "levels", "are", "expressed", "relative", "to", "untreated", "cells", ".", "Effect", "of", "TFL457", "on", "the", "decrease", "of", "TrkB", "-", "FL", "surface", "levels", "induced", "by", "NMDA", ".", "Analysis", "was", "performed", "as", "before", "in", "cells", "incubated", "with", "CPPs", "(", "25", "μM", ",", "30", "min", ")", "and", "NMDA", "-", "treated", "(", "1", "h", ")", ".", "Results", "obtained", "in", "excitotoxic", "cultures", "are", "expressed", "relative", "to", "cells", "treated", "with", "the", "same", "peptide", "but", "no", "NMDA", ".", "Effect", "of", "endocytosis", "inhibition", "on", "TrkB", "-", "FL", "downregulation", ".", "The", "infarcted", "area", "of", "the", "ipsilateral", "hemisphere", "(", "I", ")", "was", "compared", "to", "the", "corresponding", "region", "of", "the", "contralateral", "area", "(", "C", ")", ".", "Results", "from", "representative", "mice", "injected", "with", "dynasore", "or", "vehicle", "are", "shown", ".", "Different", "exposures", "are", "presented", "to", "facilitate", "visualization", "of", "dynasore", "effects", "on", "TrkB", "-", "FL", "and", "f32", ".", "Quantitation", "of", "TrkB", "-", "FL", "and", "TrkB", "-", "T1", "in", "the", "infarcted", "area", ".", "Normalized", "protein", "levels", "are", "expressed", "relative", "to", "those", "of", "the", "corresponding", "contralateral", "region", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6TFL457 interference of RIP and calpain-processing in excitotoxicity. Cultures were preincubated with peptides (25 µM, 30 min) or left untreated before NMDA addition (2 h). Different exposures are shown to facilitate visualization of FL, f42/39 or f32. Quantitation of normalized f32 and f42/39 levels. Means ± SEM are shown relative to cultures treated with NMDA and no peptide.Effect of TFL457 on neuronal viability after calpain inhibition. After 30 min preincubation with calpeptin (Calp, 10 µM) and calpain inhibitor III (CiIII, 10 µM), cultures were treated with CPPs and NMDA (4 h) as before. Means ± SEM relative to those obtained in untreated cultures are given.Effect of TFL457 on neuronal viability after metalloproteinase inhibition. Cultures preincubated with GM6001 (10 µM, 30 min) were treated with CPPs and NMDA as before. Analysis was performed as above (without GM6001, ***p = 0.0007; with GM6001, ***p = 0.0006; n = 4).Effect of NMDA on total and cell-surface TrkB-FL levels. Cultures were incubated with NMDA (100 µM) or BDNF (100 ng/ml) for 1 h. Membrane proteins were labeled and purified and compared to corresponding total lysates. TrkB-FL levels are expressed relative to untreated cells.Effect of TFL457 on the decrease of TrkB-FL surface levels induced by NMDA. Analysis was performed as before in cells incubated with CPPs (25 μM, 30 min) and NMDA-treated (1 h). Results obtained in excitotoxic cultures are expressed relative to cells treated with the same peptide but no NMDA.Effect of endocytosis inhibition on TrkB-FL downregulation. The infarcted area of the ipsilateral hemisphere (I) was compared to the corresponding region of the contralateral area (C). Results from representative mice injected with dynasore or vehicle are shown. Different exposures are presented to facilitate visualization of dynasore effects on TrkB-FL and f32. Quantitation of TrkB-FL and TrkB-T1 in the infarcted area. Normalized protein levels are expressed relative to those of the corresponding contralateral region."}
{"words": ["Figure", "7Confirmation", "of", "Bio", "-", "TFL457", "delivery", "to", "mice", "cortex", ".", "Biotinylated", "TFL457", "(", "Bio", "-", "TFL457", ",", "4", "nMole", "/", "g", ",", "retro", "-", "orbitally", "injected", ")", "was", "detected", "in", "coronal", "sections", "stained", "with", "NeuN", "and", "DAPI", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "of", "cortical", "areas", "correspond", "to", "single", "sections", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Representative", "analysis", "of", "TrkB", "-", "FL", "at", "3", "h", "of", "damage", ".", "Comparison", "of", "the", "infarcted", "area", "(", "I", ")", "and", "the", "corresponding", "contralateral", "region", "(", "C", ")", "is", "shown", ".", "Quantitation", "of", "TrkB", "-", "FL", "levels", ".", "Means", "±", "SEM", "of", "normalized", "TrkB", "-", "FL", "levels", "in", "the", "infarcted", "area", "relative", "to", "the", "corresponding", "contralateral", "regionRepresentative", "1", "mm", "brain", "coronal", "slices", "stained", "with", "TTC", "after", "24", "h", "of", "insult", "corresponding", "to", "animals", "injected", "with", "MTMyc", "or", "MTFL457", ".", "Infarct", "volume", "of", "animals", "injected", "with", "MTMyc", "or", "MTFL457", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "hemisphere", "volume", ".", "Means", "±", "SEM", "are", "given", ".", "Differences", "were", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "00008", ";", "n", "=", "14", ")", ".", "Results", "for", "MTFL457", "are", "also", "expressed", "as", "percentage", "of", "the", "infarct", "volume", "in", "animals", "injected", "with", "MTMyc", ".", "Evaluation", "of", "balance", "and", "motor", "coordination", ".", "Number", "of", "contralateral", "hind", "paw", "slips", "were", "measured", "after", "24", "h", "of", "damage", ".", "Data", "spread", "is", "presented", "by", "box", "and", "whisker", "plots", "showing", "interquartile", "range", ",", "median", ",", "minimum", "and", "maximum", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Confirmation of Bio-TFL457 delivery to mice cortex. Biotinylated TFL457 (Bio- TFL457, 4 nMole/g, retro-orbitally injected) was detected in coronal sections stained with NeuN and DAPI. Representative confocal microscopy images of cortical areas correspond to single sections. Scale bar, 10 µm.Representative analysis of TrkB-FL at 3 h of damage. Comparison of the infarcted area (I) and the corresponding contralateral region (C) is shown. Quantitation of TrkB-FL levels. Means ± SEM of normalized TrkB-FL levels in the infarcted area relative to the corresponding contralateral regionRepresentative 1 mm brain coronal slices stained with TTC after 24 h of insult corresponding to animals injected with MTMyc or MTFL457.Infarct volume of animals injected with MTMyc or MTFL457 expressed as a percentage of the hemisphere volume. Means ± SEM are given. Differences were analyzed by Student's t-test (***p = 0.00008; n = 14). Results for MTFL457 are also expressed as percentage of the infarct volume in animals injected with MTMyc.Evaluation of balance and motor coordination. Number of contralateral hind paw slips were measured after 24 h of damage. Data spread is presented by box and whisker plots showing interquartile range, median, minimum and maximum values."}
{"words": ["Figure", "1IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "A", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "B", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "C", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "D", ")", "in", "Myc", "empty", "vector", "(", "200", "ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "H1299", "cells", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "E", ")", "in", "the", "indicated", "siRNA", "-", "transfected", "H1299", "cells", "(", "si", "-", "NC", ",", "si", "-", "SIRT5", "#", "1", "and", "si", "-", "SIRT5", "#", "2", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "NC", ",", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "F", ")", "in", "the", "indicated", "siRNA", "-", "transfected", "H1299", "cells", "(", "si", "-", "NC", ",", "si", "-", "SIRT5", "#", "1", "and", "si", "-", "SIRT5", "#", "2", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "NC", ",", "negative", "control", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "G", ")", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "or", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "H", ")", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "or", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "with", "or", "without", "SeV", "infection", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "I", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "transfection", "for", "18", "~", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "J", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "RIG", "-", "I", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200ng", ")", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "K", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "MDA5", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "L", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "MAVS", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "M", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "Myc", "-", "TBK1", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "N", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "IRF3", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "0", ",", "100", "ng", "or", "200", "ng", ")", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "O", "ISRE", "reporter", "activity", "in", "co", "-", "transfection", "of", "HA", "-", "MAVS", "(", "200", "ng", ")", "together", "with", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "200ng", ")", "or", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", "(", "200ng", ")", "respectively", "in", "HEK293T", "cells", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "luciferase", "activity", "in", "the", "control", "cells", ".", "UI", ",", "uninfected", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IFN-β promoter activity (A) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected HEK293T cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (B) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected HEK293T cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (C) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected H1299 cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (D) in Myc empty vector (200 ng) or Myc-SIRT5 (200 ng)-transfected H1299 cells with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (E) in the indicated siRNA-transfected H1299 cells (si-NC, si-SIRT5#1 and si-SIRT5#2) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. NC, negative control. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (F) in the indicated siRNA-transfected H1299 cells (si-NC, si-SIRT5#1 and si-SIRT5#2) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. NC, negative control. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).IFN-β promoter activity (G) in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) or the wildtype (WT) H1299 cells (SIRT5 +/+) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).ISRE reporter activity (H) in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) or the wildtype (WT) H1299 cells (SIRT5 +/+) with or without SeV infection (SeV or UI) for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).I ISRE reporter activity in Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng)-transfected HEK293T cells with or without poly(I:C) transfection for 18~24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).J ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-RIG-I (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200ng)-transfected HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).K ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-MDA5 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).L ISRE reporter activity in co-transfection of HA-MAVS (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).M ISRE reporter activity in co-transfection of Myc-TBK1 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).N ISRE reporter activity in co-transfection of HA-IRF3 (200 ng) together with Myc-SIRT5 (0, 100 ng or 200 ng) in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).O ISRE reporter activity in co-transfection of HA-MAVS (200 ng) together with Myc-SIRT5 (200ng) or Myc-SIRT5-H158Y(200ng) respectively in HEK293T cells for 24 h. Data information: Graphs represent fold-induction relative to the luciferase activity in the control cells. UI, uninfected. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Confocal", "microscopy", "image", "of", "endogenous", "SIRT5", "co", "-", "localized", "with", "endogenous", "MAVS", "in", "H1299", "cells", "detected", "by", "immunofluorescence", "staining", "using", "anti", "-", "SIRT5", "and", "anti", "-", "MAVS", "antibodies", ".", "Mito", ",", "Mitotracker", ";", "Scale", "bar", "=", "8", "µm", ".", "B", "-", "C", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "Myc", "-", "SIRT5", "with", "HA", "-", "MAVS", "and", "vice", "versa", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", "for", "24", "h", ".", "Anti", "-", "Myc", "(", "B", ")", "or", "anti", "-", "HA", "antibody", "conjugated", "agarose", "beads", "(", "C", ")", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "and", "the", "interaction", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "D", "Endogenous", "interaction", "between", "MAVS", "and", "SIRT5", ".", "Anti", "-", "MAVS", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "normal", "mouse", "IgG", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "E", "Endogenous", "interaction", "between", "MAVS", "and", "SIRT5", "in", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "(", "MAVS", "+", "/", "+", ")", "or", "SIRT5", "-", "deficient", "(", "MAVS", "-", "/", "-", ")", "H1299", "cells", ".", "Anti", "-", "MAVS", "antibody", "was", "used", "for", "immunoprecipitation", ",", "and", "the", "interaction", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SIRT5", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "F", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "for", "GST", "-", "tagged", "MAVS", "and", "His", "-", "tagged", "SIRT5", ".", "GST", "-", "tagged", "MAVS", "and", "His", "-", "tagged", "SIRT5", "were", "expressed", "in", "Escherichia", "coli", "(", "BL21", ")", ",", "respectively", ".", "The", "association", "of", "GST", "-", "MAVS", "with", "His", "-", "SIRT5", "was", "detected", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SIRT5", "antibody", ".", "GST", "and", "GST", "-", "MAVS", "proteins", "were", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "H", "-", "I", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "HA", "-", "SIRT5", "with", "Flag", "-", "MAVS", "-", "truncated", "mutants", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Anti", "-", "Flag", "antibody", "conjugated", "agarose", "beads", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "and", "the", "interaction", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Flag", "-", "MAVS", "fragments", "(", "WT", ":", "full", "length", ";", "ΔC1", ",", "1", "-", "173", "aa", ";", "ΔC2", ",", "1", "-", "513", "aa", ";", "ΔN1", ",", "91", "-", "540", "aa", ";", "ΔN2", ",", "173", "-", "540", "aa", ";", "ΔCARD", ",", "Δ10", "-", "77", "aa", ";", "ΔPR", ",", "Δ103", "-", "173", "aa", ";", "ΔTM", ",", "Δ514", "-", "535", "aa", ")", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Confocal microscopy image of endogenous SIRT5 co-localized with endogenous MAVS in H1299 cells detected by immunofluorescence staining using anti-SIRT5 and anti-MAVS antibodies. Mito, Mitotracker; Scale bar = 8 µm.B-C Co-immunoprecipitation of Myc-SIRT5 with HA-MAVS and vice versa. HEK293T cells were co-transfected with indicated plasmids for 24 h. Anti-Myc (B) or anti-HA antibody conjugated agarose beads (C) were used for immunoprecipitation and the interaction was detected by immunoblotting with the indicated antibodies. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.D Endogenous interaction between MAVS and SIRT5. Anti-MAVS antibody was used for immunoprecipitation, and normal mouse IgG was used as a control. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.E Endogenous interaction between MAVS and SIRT5 in the wildtype (WT) (MAVS +/+) or SIRT5-deficient (MAVS -/-) H1299 cells. Anti-MAVS antibody was used for immunoprecipitation, and the interaction was detected by immunoblotting with anti-SIRT5 antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.F GST pull-down assay for GST-tagged MAVS and His-tagged SIRT5. GST-tagged MAVS and His-tagged SIRT5 were expressed in Escherichia coli (BL21), respectively. The association of GST-MAVS with His-SIRT5 was detected by immunoblotting with anti-SIRT5 antibody. GST and GST-MAVS proteins were stained with Coomassie blue.H-I Co-immunoprecipitation analysis of HA-SIRT5 with Flag-MAVS-truncated mutants. HEK293T cells were co-transfected with the indicated plasmids. Anti-Flag antibody conjugated agarose beads were used for immunoprecipitation and the interaction was analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. Flag-MAVS fragments (WT: full length; ΔC1, 1-173 aa; ΔC2, 1-513 aa; ΔN1, 91-540 aa; ΔN2, 173-540 aa; ΔCARD, Δ10-77 aa; ΔPR, Δ103-173 aa; ΔTM, Δ514-535 aa). Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", "MAVS", "could", "be", "succinylated", "in", "vitro", ".", "GST", "-", "MAVS", "(", "A", ")", "extracted", "from", "E", ".", "coli", "or", "Flag", "-", "tagged", "MAVS", "(", "B", ")", "protein", "purified", "from", "HEK293T", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "Protein", "succinylation", "was", "detected", "with", "anti", "-", "pan", "-", "succinyl", "-", "lysine", "antibody", ";", "GST", "-", "MAVS", "or", "Flag", "-", "MAVS", "was", "stained", "by", "Coomassie", "blue", ".", "C", "The", "succinylated", "residue", "in", "MAVS", "was", "identified", "by", "mass", "spectrometry", "analysis", ".", "E", "Dot", "-", "blot", "assay", "for", "the", "specificity", "of", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Equal", "amounts", "of", "succinyl", "-", "peptides", "or", "the", "control", "peptides", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "dilutions", "of", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "GST", "-", "MAVS", "(", "F", ")", "extracted", "from", "E", ".", "coli", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "The", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "lysine", "7", "was", "detected", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Flag", "-", "MAVS", "(", "G", ")", "purified", "from", "HEK293T", "cells", "was", "incubated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "succinyl", "-", "CoA", ".", "The", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "lysine", "7", "was", "detected", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "H", "Disruption", "of", "SIRT5", "in", "H1299", "cells", "enhanced", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "compared", "to", "that", "in", "the", "SIRT5", "-", "intact", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "(", "3", ".", "2", "vs", ".", "1", ".", "0", ")", ".", "The", "cell", "lysates", "from", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "or", "the", "SIRT5", "-", "intact", "H1299", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "or", "mouse", "IgG", "control", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "I", "Reconstitution", "of", "WT", "SIRT5", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "caused", "a", "significant", "reduction", "in", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "(", "1", ".", "0", "vs", ".", "0", ".", "2", ")", ";", "but", "overexpression", "of", "SIRT5", "-", "H158Y", "in", "SIRT5", "-", "/", "-", "H1299", "cells", "has", "no", "effect", "on", "the", "reduction", "in", "succinylation", "of", "MAVS", "at", "Lys", "7", "(", "1", ".", "0", "vs", ".", "1", ".", "2", ")", ".", "The", "SIRT5", "-", "/", "-", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "SIRT5", "or", "Flag", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ",", "followed", "by", "immunoprecipitating", "with", "anti", "-", "MAVS", "antibody", "or", "mouse", "IgG", "control", ",", "and", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "TCL", ",", "total", "cell", "lysates", ".", "J", "-", "K", "Knockout", "of", "Sirt5", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "J", ")", "and", "lungs", "(", "K", ")", ".", "Proteins", "extracted", "from", "livers", "(", "J", ")", "and", "lungs", "(", "K", ")", "of", "Sirt5", "KO", "and", "the", "wildtype", "littermates", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "detected", "by", "the", "indicated", "antibodies", ".", "MAVS", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ",", "and", "anti", "-", "pan", "-", "succinyl", "-", "lysine", "antibody", "was", "used", "as", "positive", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B MAVS could be succinylated in vitro. GST-MAVS (A) extracted from E.coli or Flag-tagged MAVS (B) protein purified from HEK293T cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. Protein succinylation was detected with anti-pan-succinyl-lysine antibody; GST-MAVS or Flag-MAVS was stained by Coomassie blue.C The succinylated residue in MAVS was identified by mass spectrometry analysis.E Dot-blot assay for the specificity of anti-succ-K7-MAVS antibody. Equal amounts of succinyl-peptides or the control peptides were immunoblotted with the indicated dilutions of anti-succ-K7-MAVS antibody.GST-MAVS (F) extracted from E.coli cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. The succinylation of MAVS at lysine 7 was detected by anti-succ-K7-MAVS antibody.Flag-MAVS (G) purified from HEK293T cells was incubated with the indicated concentrations of succinyl-CoA. The succinylation of MAVS at lysine 7 was detected by anti-succ-K7-MAVS antibody.H Disruption of SIRT5 in H1299 cells enhanced succinylation of MAVS at Lys 7 compared to that in the SIRT5-intact H1299 cells (SIRT5 +/+) (3.2 vs. 1.0). The cell lysates from SIRT5-deficient H1299 cells or the SIRT5-intact H1299 cells were immunoprecipitated with anti-MAVS antibody or mouse IgG control, followed by immunoblotting with anti-succ-K7-MAVS antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.I Reconstitution of WT SIRT5 in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5 -/-) caused a significant reduction in succinylation of MAVS at Lys 7 (1.0 vs. 0.2); but overexpression of SIRT5-H158Y in SIRT5 -/- H1299 cells has no effect on the reduction in succinylation of MAVS at Lys 7 (1.0 vs. 1.2). The SIRT5 -/- H1299 cells were transfected with Flag-SIRT5 or Flag-SIRT5-H158Y, followed by immunoprecipitating with anti-MAVS antibody or mouse IgG control, and immunoblotting with anti-succ-K7-MAVS antibody. Data information: IP, immunoprecipitation; TCL, total cell lysates.J-K Knockout of Sirt5 increased Mavs succinylation in mouse livers (J) and lungs (K). Proteins extracted from livers (J) and lungs (K) of Sirt5 KO and the wildtype littermates (n = 3 per group) were detected by the indicated antibodies. MAVS succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody, and anti-pan-succinyl-lysine antibody was used as positive controls."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "analysis", "(", "qPCR", ")", "of", "IFNβ", "(", "A", ")", ",", "CXCL10", "(", "B", ")", "and", "IFIT1", "(", "C", ")", "mRNA", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "D", "-", "F", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "(", "D", ")", ",", "CXCL10", "(", "E", ")", ",", "and", "IFIT1", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "G", "-", "I", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "(", "G", ")", ",", "CXCL10", "(", "H", ")", "and", "IFIT1", "(", "I", ")", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "J", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "mRNA", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", ",", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", ",", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "H158Y", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "stimulation", "with", "or", "without", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "K", "qPCR", "analysis", "of", "IFNβ", "mRNA", "in", "SIRT5", "-", "deficient", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", ")", "transfected", "with", "the", "control", "plasmid", "(", "Myc", "empty", ")", "or", "the", "plasmid", "expressing", "Myc", "-", "SIRT5", "(", "Myc", "-", "SIRT5", ")", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "H158Y", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "infection", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "SeV", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "L", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "MAVS", "aggregates", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "HA", "-", "MAVS", "together", "with", "WT", "Myc", "-", "SIRT5", "or", "its", "enzyme", "-", "deficient", "mutant", "(", "Myc", "-", "SIRT5", "-", "H158Y", ")", "after", "infected", "with", "SeV", "for", "12h", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "M", "-", "N", "IFN", "-", "β", "promoter", "activity", "(", "M", ")", "and", "ISRE", "reporter", "activity", "(", "N", ")", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "Myc", "-", "SIRT5", "together", "with", "HA", "-", "MAVS", "or", "HA", "-", "MAVS", "-", "K7R", ".", "Data", "information", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "O", ")", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", "and", "viral", "infectivity", "western", "blot", "analysis", "(", "P", ")", "Data", "information", ":", "ll", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "SIRT5", "-", "deficient", "or", "WT", "H1299", "cells", "(", "SIRT5", "-", "/", "-", "or", "SIRT5", "+", "/", "+", ")", "were", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "(", "MOI", "=", "0", ".", "1", ")", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "Q", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C Quantitative real time PCR analysis (qPCR) of IFNβ (A), CXCL10 (B) and IFIT1 (C) mRNA in HEK293T cells transfected with the control plasmid (Myc empty) or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5) for 24 h, followed by infection with or without SeV (SeV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).D-F qPCR analysis of IFNβ (D), CXCL10 (E), and IFIT1 (F) mRNA in SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) infected with or without SeV (SeV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).G-I qPCR analysis of IFNβ (G), CXCL10 (H) and IFIT1 (I) mRNA in SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) infected with or without VSV (VSV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).J qPCR analysis of IFNβ mRNA in HEK293T cells transfected with the control plasmid (Myc empty), or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5), or its enzyme-deficient mutant H158Y (Myc-SIRT5-H158Y) for 24 h, followed by stimulation with or without poly(I:C) for 8 h. Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).K qPCR analysis of IFNβ mRNA in SIRT5-deficient H1299 cells (SIRT5-/-) transfected with the control plasmid (Myc empty) or the plasmid expressing Myc-SIRT5 (Myc-SIRT5) or its enzyme-deficient mutant H158Y (Myc-SIRT5-H158Y) for 24 h, followed by infection with (+) or without (-) SeV for 8 h. Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).L SDD-AGE analysis of MAVS aggregates in HEK293T cells transfected HA-MAVS together with WT Myc-SIRT5 or its enzyme-deficient mutant (Myc-SIRT5-H158Y) after infected with SeV for 12h. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control.M-N IFN-β promoter activity (M) and ISRE reporter activity (N) in HEK293T cells co-transfected Myc-SIRT5 together with HA-MAVS or HA-MAVS-K7R. Data information All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h, and viral infectivity was detected by fluorescence microscopy (O)SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h and viral infectivity western blot analysis (P) Data information: ll data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).SIRT5-deficient or WT H1299 cells (SIRT5 -/- or SIRT5 +/+) were infected with VSV-GFP viruses (MOI = 0.1) for 12 h, and viral infectivity was detected by flow cytometry analysis (n = 3) (Q)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "F", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "A", ")", ",", "Ifnα1", "(", "B", ")", ",", "Ifnα4", "(", "C", ")", ",", "Ifit1", "(", "D", ")", ",", "Cxcl10", "(", "E", ")", ",", "and", "Cxcl11", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "SeV", "or", "UI", ")", "for", "8h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "G", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "the", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "for", "monomeric", "(", "Monomer", ")", "and", "dimeric", "(", "Dimer", ")", "Irf3", "(", "top", ";", "native", "-", "PAGE", ")", ",", "phosphorylated", "Irf3", "(", "p", "-", "Irf3", ")", ",", "total", "Irf3", ",", "Sirt5", ",", "and", "GAPDH", "(", "bottom", ")", ".", "H", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "for", "8", "h", ",", "the", "interaction", "between", "endogenous", "Mavs", "and", "Rig", "-", "I", "was", "revealed", "by", "immunoprecipitation", "using", "anti", "-", "Mavs", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "Rig", "-", "I", "antibody", ".", "I", "SDD", "-", "AGE", "analysis", "of", "Mavs", "aggregates", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "SeV", "for", "12", "h", ".", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "J", "-", "O", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "J", ")", ",", "Ifnα1", "(", "K", ")", ",", "Ifnα4", "(", "L", ")", ",", "Ifit1", "(", "M", ")", ",", "Cxcl10", "(", "N", ")", ",", "and", "Cxcl11", "(", "O", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "P", ")", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "Q", ")", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "MEF", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "were", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", ",", "and", "viral", "infectivity", "was", "detected", "by", "flow", "cytometry", "analysis", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "R", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-F qPCR analysis of Ifnβ (A), Ifnα1 (B), Ifnα4 (C), Ifit1 (D), Cxcl10 (E), and Cxcl11 (F) mRNA in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (SeV or UI) for 8h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).G WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without SeV for the indicated times, and the cell lysates were analyzed by immunoblotting for monomeric (Monomer) and dimeric (Dimer) Irf3 (top; native-PAGE), phosphorylated Irf3 (p-Irf3), total Irf3, Sirt5, and GAPDH (bottom).H WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without SeV for 8 h, the interaction between endogenous Mavs and Rig-I was revealed by immunoprecipitation using anti-Mavs antibody, followed by immunoblotting with anti-Rig-I antibody.I SDD-AGE analysis of Mavs aggregates in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with SeV for 12 h. SDS-PAGE immunoblotting was used as a loading control.J-O qPCR analysis of Ifnβ (J), Ifnα1 (K), Ifnα4 (L), Ifit1 (M), Cxcl10 (N), and Cxcl11 (O) mRNA in WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by fluorescence microscopy (P)WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by western blot analysis (Q)WT or Sirt5-deficient MEF cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) were infected with or without VSV-GFP viruses for 12 h, and viral infectivity was detected by flow cytometry analysis (n = 3) (R). Data information: All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "6qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "A", ")", ",", "Ifnα1", "(", "B", ")", ",", "Ifnα4", "(", "C", ")", ",", "Ifit1", "(", "D", ")", ",", "Rig", "-", "I", "(", "E", ")", ",", "Cxcl10", "(", "F", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "Sev", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Cxcl11", "(", "G", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "SeV", "(", "Sev", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "H", ")", ",", "Ifnα1", "(", "I", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnα4", "(", "J", ")", ",", "Ifit1", "(", "K", ")", ",", "Rig", "-", "I", "(", "L", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Cxcl10", "(", "M", ")", "and", "Cxcl11", "(", "N", ")", "mRNA", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "infected", "with", "or", "without", "VSV", "viruses", "(", "VSV", "or", "UI", ")", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "UI", ",", "un", "-", "infected", ".", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "cells", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "O", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "image", "of", "replication", "in", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "BMDC", "cells", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "after", "infected", "with", "VSV", "-", "GFP", "viruses", "for", "12", "h", "(", "MOI", "=", "1", ")", "(", "fluorescence", ",", "upper", ";", "bright", "-", "field", ",", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "75", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6qPCR analysis of Ifnβ (A), Ifnα1 (B), Ifnα4 (C), Ifit1 (D), Rig-I (E), Cxcl10 (F) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (Sev or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Cxcl11 (G) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without SeV (Sev or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Ifnβ (H), Ifnα1 (I) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Ifnα4 (J), Ifit1 (K), Rig-I (L) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).qPCR analysis of Cxcl10 (M) and Cxcl11 (N) mRNA in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) infected with or without VSV viruses (VSV or UI) for 8 h. Data information: UI, un-infected. The graphs represent fold-induction relative to the untreated cells. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test).O Confocal fluorescence microscopy image of replication in WT or Sirt5-deficient BMDC cells (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) after infected with VSV-GFP viruses for 12 h (MOI = 1) (fluorescence, upper; bright-field, bottom). Scale bar = 75 µm."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "B", "VSV", "infection", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "A", ")", "and", "lungs", "(", "B", ")", ".", "Proteins", "in", "the", "livers", "(", "A", ")", "and", "lungs", "(", "B", ")", "of", "WT", "littermates", "injected", "intraperitoneally", "with", "(", "+", ")", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "(", "-", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "were", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Mavs", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Relative", "succinylation", "level", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "C", "-", "D", "Knockout", "of", "Sirt5", "increased", "Mavs", "succinylation", "in", "mouse", "livers", "(", "C", ")", "and", "lungs", "(", "D", ")", "upon", "VSV", "infection", ".", "Proteins", "in", "the", "livers", "(", "C", ")", "and", "lungs", "(", "D", ")", "of", "Sirt5", "-", "deficient", "or", "WT", "littermates", "(", "Sirt5", "-", "/", "-", "or", "Sirt5", "+", "/", "+", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", ")", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", "for", "24", "h", "were", "detected", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Mavs", "succinylation", "was", "determined", "by", "anti", "-", "succ", "-", "K7", "-", "MAVS", "antibody", ".", "Relative", "succinylation", "level", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "E", "Survival", "(", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", ")", "of", "WT", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "a", "high", "dose", "of", "VSV", "(", "5", "×", "107", "PFU", "per", "mouse", ")", "and", "monitored", "for", "10", "d", ".", "F", "ELISA", "assay", "of", "Ifnβ", "in", "serum", "from", "the", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "G", "Hematoxylin", "-", "and", "-", "eosin", "-", "stained", "images", "of", "lung", "sections", "from", "mice", "in", "F", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Ifnβ", "(", "H", ")", ",", "Ifnα1", "(", "I", ")", ",", "Ifit1", "(", "J", ")", ",", "Isg15", "(", "K", ")", ",", "Cxcl10", "(", "L", ")", ",", "Cxcl11", "(", "M", ")", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Rig", "-", "I", "(", "N", ")", ",", "and", "Irf7", "(", "O", ")", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", ".", "P", "qPCR", "analysis", "of", "VSV", "mRNA", "in", "the", "lungs", "of", "WT", "or", "Sirt5", "-", "deficient", "mice", "(", "Sirt5", "+", "/", "+", "or", "Sirt5", "-", "/", "-", ")", "injected", "intraperitoneally", "with", "VSV", "(", "1", "×", "107", "plaque", "-", "forming", "units", "(", "PFU", ")", "per", "mouse", ")", "or", "PBS", "control", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "The", "graphs", "represent", "fold", "-", "induction", "relative", "to", "the", "untreated", "WT", "mice", ".", "PBS", ",", "phosphate", "buffer", "saline", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "values", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "indicate", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "or", "two", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-B VSV infection increased Mavs succinylation in mouse livers (A) and lungs (B). Proteins in the livers (A) and lungs (B) of WT littermates injected intraperitoneally with (+) VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control (-) (n = 3 per group) were detected with the indicated antibodies. Mavs succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody. Relative succinylation level was quantified (right panel).C-D Knockout of Sirt5 increased Mavs succinylation in mouse livers (C) and lungs (D) upon VSV infection. Proteins in the livers (C) and lungs (D) of Sirt5-deficient or WT littermates (Sirt5 -/- or Sirt5 +/+) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse)) (n = 3 per group) for 24 h were detected with the indicated antibodies. Mavs succinylation was determined by anti-succ-K7-MAVS antibody. Relative succinylation level was quantified (right panel).E Survival (Kaplan-Meier curve) of WT mice (n = 7) and Sirt5-deficient mice (n = 7) injected intraperitoneally with a high dose of VSV (5 × 107 PFU per mouse) and monitored for 10 d.F ELISA assay of Ifnβ in serum from the WT mice (n = 4) and Sirt5-deficient mice (n = 4) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse)) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).G Hematoxylin-and-eosin-stained images of lung sections from mice in F. Scale bar = 50 µm.qPCR analysis of Ifnβ (H), Ifnα1 (I), Ifit1 (J), Isg15 (K), Cxcl10 (L), Cxcl11 (M) mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).qPCR analysis of Rig-I (N), and Irf7 (O) mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis).P qPCR analysis of VSV mRNA in the lungs of WT or Sirt5-deficient mice (Sirt5 +/+ or Sirt5 -/-) injected intraperitoneally with VSV (1 × 107 plaque-forming units (PFU) per mouse) or PBS control for 24 h. Data information: The graphs represent fold-induction relative to the untreated WT mice. PBS, phosphate buffer saline. All data are presented as the mean values based on three independent experiments, and error bars indicate S.E.M. (unpaired two-tailed Student's t test or two-way ANOVA analysis)."}
{"words": ["Figure", "1Human", "placental", "syncytiotrophoblast", "cells", "express", "markers", "of", "cellular", "senescence", ",", "p16", "Sections", "of", "normal", "human", "post", "-", "partum", ",", "third", "trimester", ",", "placenta", "were", "evaluated", "by", "immunofluorescence", "co", "-", "staining", "for", "senescence", "regulators", "(", "A", ")", "p16", "Green", "label", ":", "the", "syncytiotrophoblast", "marker", "βHCG", ",", "red", "label", ":", "p16", "Blue", "label", ":", "DAPI", "nuclear", "stain", ".", "Arrowheads", "indicate", "positively", "stained", "syncytiotrophoblast", "cells", "βHCG", "+", "/", "p16", "+", "(", "A", ")", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Human", "placental", "syncytiotrophoblast", "cells", "express", "markers", "of", "cellular", "senescence", ",", "p21", ".", "Sections", "of", "normal", "human", "post", "-", "partum", ",", "third", "trimester", ",", "placenta", "were", "evaluated", "by", "immunofluorescence", "co", "-", "staining", "for", "senescence", "regulators", "(", "B", ")", "p21", ".", "Green", "label", ":", "the", "syncytiotrophoblast", "marker", "βHCG", ",", "red", "label", ":", "p21", ".", "Blue", "label", ":", "DAPI", "nuclear", "stain", ".", "Arrowheads", "indicate", "positively", "stained", "syncytiotrophoblast", "cells", ",", "βHCG", "+", "/", "p21", "+", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Sections", "of", "human", "normal", "third", "-", "trimester", "placentas", "post", "-", "partum", "(", "n", "=", "4", "normal", "placentas", ")", "and", "IUGR", "-", "complicated", "placentas", "of", "the", "same", "gestational", "age", "(", "n", "=", "4", "IUGR", "placentas", ")", "were", "stained", "for", "senescence", "-", "related", "markers", "of", "p15", "(", "C", ")", ",", "p16", "(", "D", ")", ",", "p21", "(", "E", ")", ",", "and", "p53", "(", "F", ")", "in", "the", "syncytiotrophoblast", "(", "n", "=", "3", "sections", ",", "derived", "from", "each", "normal", "and", "IUGR", "placenta", ")", ".", "Percentages", "of", "positively", "stained", "syncytia", "were", "quantified", "(", "n", "=", "at", "least", "12", "fields", "of", "view", "from", "all", "sections", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "Arrowheads", "indicate", "syncytiotrophoblast", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "protein", "content", "of", "p16", ",", "p21", ",", "p53", "and", "DCR", "in", "normal", "(", "n", "=", "4", "placentas", ")", "and", "in", "IUGR", "-", "complicated", "placentas", "(", "n", "=", "4", "placentas", ")", ".", "Each", "lane", "represents", "one", "independent", "placenta", ".", "(", "H", ")", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "p16", ",", "p21", "and", "DCR2", "expression", "in", "IUGR", "-", "complicated", "and", "in", "normal", "placentas", ".", "Results", "were", "obtained", "from", "four", "human", "normal", "and", "four", "IUGR", "placentas", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Human placental syncytiotrophoblast cells express markers of cellular senescence, p16 Sections of normal human post-partum, third trimester, placenta were evaluated by immunofluorescence co-staining for senescence regulators (A) p16 Green label: the syncytiotrophoblast marker βHCG, red label: p16 Blue label: DAPI nuclear stain. Arrowheads indicate positively stained syncytiotrophoblast cells βHCG+/p16+ (A) Scale bar, 50 µm.Human placental syncytiotrophoblast cells express markers of cellular senescence, p21. Sections of normal human post-partum, third trimester, placenta were evaluated by immunofluorescence co-staining for senescence regulators (B) p21. Green label: the syncytiotrophoblast marker βHCG, red label: p21. Blue label: DAPI nuclear stain. Arrowheads indicate positively stained syncytiotrophoblast cells , βHCG+/p21+ (B). Scale bar, 50 µm.(C-F) Sections of human normal third-trimester placentas post-partum (n=4 normal placentas) and IUGR-complicated placentas of the same gestational age (n=4 IUGR placentas) were stained for senescence-related markers of p15 (C), p16 (D), p21 (E), and p53 (F) in the syncytiotrophoblast (n=3 sections, derived from each normal and IUGR placenta). Percentages of positively stained syncytia were quantified (n= at least 12 fields of view from all sections). Scale bar, 100 µm. Arrowheads indicate syncytiotrophoblast cells. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) p < 0.001.(G) Immunoblot analysis of the protein content of p16, p21, p53 and DCR in normal (n=4 placentas) and in IUGR-complicated placentas (n=4 placentas). Each lane represents one independent placenta.(H) Quantitative RT-PCR analysis of p16, p21 and DCR2 expression in IUGR-complicated and in normal placentas. Results were obtained from four human normal and four IUGR placentas. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2DCE", "-", "MRI", "was", "performed", "on", "pregnant", "mice", "of", "WT", ",", "Cdkn1a", ",", "p53", ",", "Cdkn2a", "and", "Cdkn2a", ";", "p53", "genotypes", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "Mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "an", "albumin", "-", "labeled", "contrast", "agent", "(", "biotin", "-", "BSA", "-", "GdDTPA", ";", "10", "mg", "/", "mouse", ")", "and", "placental", "enhancement", "was", "monitored", "at", "9", ".", "4T", "MRI", "for", "60", "min", ".", "(", "A", ")", "Representative", "T1", "-", "weighted", "image", "of", "a", "pregnant", "WT", "mouse", "and", "a", "selection", "of", "four", "different", "placentas", "(", "outlined", "by", "colored", "lines", ")", ".", "DCE", "-", "MRI", "was", "performed", "on", "pregnant", "mice", "of", "WT", ",", "Cdkn1a", ",", "p53", ",", "Cdkn2a", "and", "Cdkn2a", ";", "p53", "genotypes", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "Mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "an", "albumin", "-", "labeled", "contrast", "agent", "(", "biotin", "-", "BSA", "-", "GdDTPA", ";", "10", "mg", "/", "mouse", ")", "and", "placental", "enhancement", "was", "monitored", "at", "9", ".", "4T", "MRI", "for", "60", "min", ".", "(", "B", ")", "Representative", "SI", "dynamics", "of", "a", "single", "WT", "placenta", "(", "marked", "in", "A", ")", ",", "following", "biotin", "-", "BSA", "-", "GdDTPA", "administered", "for", "60", "min", ".", "SI", "parameters", "of", "Initial", "Enhancement", "and", "Recovery", "are", "illustrated", ".", "DCE", "-", "MRI", "was", "performed", "on", "pregnant", "mice", "of", "WT", ",", "Cdkn1a", ",", "p53", ",", "Cdkn2a", "and", "Cdkn2a", ";", "p53", "genotypes", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "Mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "an", "albumin", "-", "labeled", "contrast", "agent", "(", "biotin", "-", "BSA", "-", "GdDTPA", ";", "10", "mg", "/", "mouse", ")", "and", "placental", "enhancement", "was", "monitored", "at", "9", ".", "4T", "MRI", "for", "60", "min", ".", "(", "C", ")", "Representative", "SI", "dynamics", "of", "a", "single", "WT", "placenta", "(", "marked", "in", "A", ")", "over", "time", ".", "Scale", "bar", ",", "2", ".", "5", "mm", ".", "DCE", "-", "MRI", "was", "performed", "on", "pregnant", "mice", "of", "WT", ",", "Cdkn1a", ",", "p53", ",", "Cdkn2a", "and", "Cdkn2a", ";", "p53", "genotypes", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "Mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "an", "albumin", "-", "labeled", "contrast", "agent", "(", "biotin", "-", "BSA", "-", "GdDTPA", ";", "10", "mg", "/", "mouse", ")", "and", "placental", "enhancement", "was", "monitored", "at", "9", ".", "4T", "MRI", "for", "60", "min", ".", "(", "D", "−", "G", ")", "Representative", "SI", "plots", "of", "Cdkn1a", "-", "/", "-", "(", "D", ")", ",", "p53", "-", "/", "-", "(", "E", ")", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "(", "F", ")", ",", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "(", "G", ")", "placentas", ",", "compared", "to", "their", "WT", "or", "HET", "littermates", ".", "(", "H", "−", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "SI", "Initial", "Enhancement", "(", "H", ")", "and", "SI", "Recovery", "(", "I", ")", "in", "WT", ",", "Cdkn1a", "-", "/", "-", ",", "p53", "-", "/", "-", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ",", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", ".", "MRI", "experiments", "were", "repeated", "at", "least", "three", "times", "for", "each", "murine", "genotype", "(", "n", ">", "=", "3", "placental", "SI", "measurements", "from", "each", "genotype", ")", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", ";", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2DCE-MRI was performed on pregnant mice of WT, Cdkn1a, p53, Cdkn2a and Cdkn2a;p53 genotypes on day E14.5. Mice were injected i.v. with an albumin-labeled contrast agent (biotin-BSA-GdDTPA; 10 mg/mouse) and placental enhancement was monitored at 9.4T MRI for 60 min. (A) Representative T1-weighted image of a pregnant WT mouse and a selection of four different placentas (outlined by colored lines). DCE-MRI was performed on pregnant mice of WT, Cdkn1a, p53, Cdkn2a and Cdkn2a;p53 genotypes on day E14.5. Mice were injected i.v. with an albumin-labeled contrast agent (biotin-BSA-GdDTPA; 10 mg/mouse) and placental enhancement was monitored at 9.4T MRI for 60 min. (B) Representative SI dynamics of a single WT placenta (marked in A), following biotin-BSA-GdDTPA administered for 60 min. SI parameters of Initial Enhancement and Recovery are illustrated.DCE-MRI was performed on pregnant mice of WT, Cdkn1a, p53, Cdkn2a and Cdkn2a;p53 genotypes on day E14.5. Mice were injected i.v. with an albumin-labeled contrast agent (biotin-BSA-GdDTPA; 10 mg/mouse) and placental enhancement was monitored at 9.4T MRI for 60 min. (C) Representative SI dynamics of a single WT placenta (marked in A) over time. Scale bar, 2.5 mm.DCE-MRI was performed on pregnant mice of WT, Cdkn1a, p53, Cdkn2a and Cdkn2a;p53 genotypes on day E14.5. Mice were injected i.v. with an albumin-labeled contrast agent (biotin-BSA-GdDTPA; 10 mg/mouse) and placental enhancement was monitored at 9.4T MRI for 60 min. (D−G) Representative SI plots of Cdkn1a-/- (D), p53-/- (E), Cdkn2a-/- (F), and Cdkn2a-/-;p53-/- (G) placentas, compared to their WT or HET littermates. (H−I) Quantification of the SI Initial Enhancement (H) and SI Recovery (I) in WT, Cdkn1a-/-, p53-/-, Cdkn2a-/-, and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas. MRI experiments were repeated at least three times for each murine genotype (n>=3 placental SI measurements from each genotype). Values are means +SEM; Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3Histological", "evaluation", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "sections", "in", "the", "labyrinth", "zone", "of", "murine", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", "placentas", ")", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "p53", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "and", "Cdkn1a", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", ",", "compared", "to", "WT", "placentas", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "A", "−", "E", ")", "The", "labyrinth", "zone", "of", "the", "WT", "(", "A", ")", "differs", "from", "those", "of", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "(", "B", ")", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "(", "C", ")", "placentas", ".", "Black", "arrows", "indicate", "regular", "-", "sized", "nuclei", "in", "the", "WT", "placenta", "and", "polyploidy", "in", "the", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", ".", "Blue", "arrows", "indicate", "normal", "vasculature", "in", "the", "WT", "placenta", "and", "collapsed", "vasculature", "in", "the", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", ".", "Labyrinths", "of", "p53", "-", "/", "-", "(", "D", ")", "and", "Cdkn1a", "-", "/", "-", "(", "E", ")", "placentas", "did", "not", "differ", "from", "that", "of", "the", "WT", "placenta", ".", "L", ",", "labyrinth", ".", "Staining", "for", "each", "placenta", "was", "performed", "in", "triplicates", ".", "Histological", "evaluation", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "sections", "in", "the", "labyrinth", "zone", "of", "murine", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", "placentas", ")", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "p53", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "and", "Cdkn1a", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", ",", "compared", "to", "WT", "placentas", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "F", "−", "G", ")", "Ki67", "immunostaining", "in", "the", "labyrinth", "zones", "of", "murine", "WT", ",", "p53", "-", "/", "-", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ",", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", ",", "on", "day", "E14", ".", "5", "(", "n", "=", "3", "placentas", "from", "each", "genotype", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "Ki67", "staining", "in", "the", "labyrinth", "zone", "are", "shown", ".", "Positive", "Ki67", "trophoblast", "cells", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "L", ",", "labyrinth", ".", "(", "G", ")", "Proliferation", "scores", "(", "n", "=", "3", "scores", ",", "derived", "from", "three", "placentas", "of", "each", "genotype", ")", "based", "on", "Ki67", "staining", "show", "enhanced", "Ki67", "expression", "in", "the", "placental", "labyrinths", "of", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", "relative", "to", "WT", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "three", "scores", "for", "each", "genotype", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "a", "one", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", ".", "Histological", "evaluation", "of", "H", "&", "E", "-", "stained", "sections", "in", "the", "labyrinth", "zone", "of", "murine", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", "placentas", ")", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", ",", "compared", "to", "WT", "placentas", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "SA", "-", "β", "-", "gal", "staining", "in", "the", "labyrinth", "zones", "of", "WT", ",", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ",", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "(", "I", ")", "SA", "-", "β", "-", "gal", "activity", ",", "quantified", "by", "ImageJ", "sofware", "in", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "labyrinths", ",", "is", "significantly", "reduced", "relative", "to", "those", "in", "WT", "labyrinth", "(", "n", ">", "=", "7", "fields", "of", "view", "from", "each", "genotype", ")", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", ".", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "a", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Histological evaluation of H&E-stained sections in the labyrinth zone of murine Cdkn2a-/- (n=5 placentas), Cdkn2a-/-;p53-/- (n=5), p53-/- (n=4), and Cdkn1a-/- (n=3) placentas on day E14.5, compared to WT placentas (n=6). (A−E) The labyrinth zone of the WT (A) differs from those of Cdkn2a-/- (B) and Cdkn2a-/-;p53-/- (C) placentas. Black arrows indicate regular-sized nuclei in the WT placenta and polyploidy in the Cdkn2a-/- and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas. Blue arrows indicate normal vasculature in the WT placenta and collapsed vasculature in the Cdkn2a-/- and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas. Labyrinths of p53-/- (D) and Cdkn1a-/- (E) placentas did not differ from that of the WT placenta. L, labyrinth. Staining for each placenta was performed in triplicates. Histological evaluation of H&E-stained sections in the labyrinth zone of murine Cdkn2a-/- (n=5 placentas), Cdkn2a-/-;p53-/- (n=5), p53-/- (n=4), and Cdkn1a-/- (n=3) placentas on day E14.5, compared to WT placentas (n=6). (F−G) Ki67 immunostaining in the labyrinth zones of murine WT , p53-/- ,Cdkn2a-/-, and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas, on day E14.5 (n=3 placentas from each genotype). (F) Representative images of Ki67 staining in the labyrinth zone are shown. Positive Ki67 trophoblast cells are indicated with arrows. L, labyrinth. (G) Proliferation scores (n=3 scores, derived from three placentas of each genotype) based on Ki67 staining show enhanced Ki67 expression in the placental labyrinths of Cdkn2a-/- and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas relative to WT. Values are means +SEM of three scores for each genotype. *P < 0.05 by a one-tailed unpaired Student's t-test. Data information: Scale bars, 50 µm.Histological evaluation of H&E-stained sections in the labyrinth zone of murine Cdkn2a-/- (n=5 placentas), Cdkn2a-/-;p53-/- (n=5) placentas on day E14.5, compared to WT placentas (n=6). (H) Representative images of SA-β-gal staining in the labyrinth zones of WT, Cdkn2a-/-, and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas on day E14.5. (I) SA-β-gal activity, quantified by ImageJ sofware in Cdkn2a-/- and Cdkn2a-/-;p53-/- labyrinths, is significantly reduced relative to those in WT labyrinth (n>=7 fields of view from each genotype). Values are means + SEM. (***) p < 0.001 by a two-tailed unpaired Student's t-test. Data information: Scale bars, 50 µm. "}
{"words": ["Figure", "4Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "On", "days", "1", "and", "5", "after", "seeding", ",", "cell", "fusion", "was", "monitored", "by", "staining", "for", "phalloidin", "(", "F", "-", "actin", ")", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "(", "B", ")", "Trophoblast", "cell", "fusion", "was", "quantified", "on", "days", "1", ",", "3", ",", "and", "5", "post", "-", "seeding", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", ",", "derived", "independently", "from", "human", "placentas", "of", "three", "pregnancies", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "human", "βhCG", "hormone", ",", "normally", "secreted", "by", "functional", "syncytiotrophoblast", "cells", ",", "in", "the", "medium", "of", "a", "representative", "trophoblast", "culture", "on", "post", "-", "delivery", "days", "2", ",", "3", "and", "5", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "(", "D", ")", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "of", "published", "datasets", "from", "human", "primary", "trophoblast", "cultures", "on", "days", "5", "and", "2", "(", "n", "=", "4", "trophoblast", "culture", "of", "day", "5", "and", "day", "2", ")", ".", "Gene", "sets", "related", "to", "pregnancy", ",", "aging", ",", "immune", "response", ",", "cytokine", "activity", ",", "MAPK", ",", "JAK", "-", "STAT", ",", "NF", "-", "κB", "and", "metalloproteinase", "activity", "were", "found", "to", "be", "enriched", "in", "day", "5", "cultures", ",", "whereas", "on", "the", "same", "day", "gene", "sets", "related", "to", "cell", "cycle", ",", "E2F", "targets", ",", "mitosis", "and", "DNA", "replication", "were", "downregulated", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "permutation", "testing", "with", "normalized", "enrichment", "score", "(", "NES", ")", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "the", "cell", "cycle", "-", "related", "genes", "p16", ",", "p21", "and", "CCNE1", "Data", "information", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "values", "are", "expressed", "as", "means", "+", "SEM", ".", "Results", "were", "obtained", "from", "trophoblast", "cultures", "derived", "from", "human", "placentas", "of", "four", "independent", "pregnancies", ".", "All", "RT", "-", "PCR", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "the", "syncytiotrophoblast", "markers", "GCM1", ",", "CGA", "and", "CGB", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "values", "are", "expressed", "as", "means", "+", "SEM", ".", "Results", "were", "obtained", "from", "trophoblast", "cultures", "derived", "from", "human", "placentas", "of", "four", "independent", "pregnancies", ".", "All", "RT", "-", "PCR", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "(", "G", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "human", "trophoblast", "cells", ",", "derived", "independently", "from", "two", "placentas", ",", "on", "days", "2", "and", "5", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "the", "SASP", "components", "CCL2", ",", "CCL5", ",", "CCL8", ",", "IL6", ",", "IL1β", ",", "TGF", "-", "β", "and", "PDG", "-", "FC", "(", "H", ")", "in", "human", "primary", "trophoblast", "cultures", "on", "days", "5", "and", "2", ".", "Data", "information", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "values", "are", "expressed", "as", "means", "+", "SEM", ".", "Results", "were", "obtained", "from", "trophoblast", "cultures", "derived", "from", "human", "placentas", "of", "four", "independent", "pregnancies", ".", "All", "RT", "-", "PCR", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Human", "term", "placentas", "were", "dissected", "and", "cytotrophoblast", "cells", "were", "extracted", "and", "seeded", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "the", "metalloproteases", "MMP2", ",", "MMP3", "and", "MMP9", "(", "I", ")", ",", "in", "human", "primary", "trophoblast", "cultures", "on", "days", "5", "and", "2", ".", "Data", "information", ":", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "values", "are", "expressed", "as", "means", "+", "SEM", ".", "Results", "were", "obtained", "from", "trophoblast", "cultures", "derived", "from", "human", "placentas", "of", "four", "independent", "pregnancies", ".", "All", "RT", "-", "PCR", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "repeated", "at", "least", "three", "times", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. On days 1 and 5 after seeding, cell fusion was monitored by staining for phalloidin (F-actin) (green) and DAPI (blue). Scale bar, 50 μm.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. (B) Trophoblast cell fusion was quantified on days 1, 3, and 5 post-seeding. Values are means + SEM, derived independently from human placentas of three pregnancies.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. (C) Quantification of the human βhCG hormone, normally secreted by functional syncytiotrophoblast cells, in the medium of a representative trophoblast culture on post-delivery days 2, 3 and 5.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. (D) Gene set enrichment analysis (GSEA) of published datasets from human primary trophoblast cultures on days 5 and 2 (n=4 trophoblast culture of day 5 and day 2). Gene sets related to pregnancy, aging, immune response, cytokine activity, MAPK, JAK-STAT, NF-κB and metalloproteinase activity were found to be enriched in day 5 cultures, whereas on the same day gene sets related to cell cycle, E2F targets, mitosis and DNA replication were downregulated. Statistical significance was determined by permutation testing with normalized enrichment score (NES)Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. Quantitative RT-PCR analysis of expression of the cell cycle-related genes p16, p21 and CCNE1 Data information: Quantitative RT-PCR values are expressed as means +SEM. Results were obtained from trophoblast cultures derived from human placentas of four independent pregnancies. All RT-PCR experiments were performed in triplicates and repeated at least three times. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. Quantitative RT-PCR analysis of expression of the syncytiotrophoblast markers GCM1, CGA and CGB (F). Data information: Quantitative RT-PCR values are expressed as means +SEM. Results were obtained from trophoblast cultures derived from human placentas of four independent pregnancies. All RT-PCR experiments were performed in triplicates and repeated at least three times. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. (G) Immunoblot analysis of the indicated proteins in human trophoblast cells, derived independently from two placentas, on days 2 and 5.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. Quantitative RT-PCR analysis of expression of the SASP components CCL2, CCL5, CCL8, IL6, IL1β, TGF-β and PDG-FC (H) in human primary trophoblast cultures on days 5 and 2. Data information: Quantitative RT-PCR values are expressed as means +SEM. Results were obtained from trophoblast cultures derived from human placentas of four independent pregnancies. All RT-PCR experiments were performed in triplicates and repeated at least three times. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01.Human term placentas were dissected and cytotrophoblast cells were extracted and seeded. Quantitative RT-PCR analysis of expression of the metalloproteases MMP2, MMP3 and MMP9 (I), in human primary trophoblast cultures on days 5 and 2. Data information: Quantitative RT-PCR values are expressed as means +SEM. Results were obtained from trophoblast cultures derived from human placentas of four independent pregnancies. All RT-PCR experiments were performed in triplicates and repeated at least three times. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "WT", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", ",", "on", "day", "E14", ".", "5", "(", "two", "independent", "placentas", "out", "of", "four", "from", "each", "genotype", "are", "shown", ")", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "Mmp2", "in", "murine", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "and", "in", "WT", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", "(", "n", ">", "=", "4", "fields", "of", "view", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "Mmp9", "in", "murine", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "and", "in", "WT", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", "(", "n", ">", "=", "4", "fields", "of", "view", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Representative", "images", "(", "D", ")", "and", "quantification", "(", "E", ")", "of", "in", "-", "situ", "gelatin", "zymography", "of", "the", "labyrinth", "zone", "of", "murine", "WT", "and", "Cdkn2a", "-", "/", "-", ";", "p53", "-", "/", "-", "placentas", "on", "day", "E14", ".", "5", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Representative", "images", "(", "F", ")", "and", "quantification", "(", "G", ")", "of", "in", "-", "situ", "zymography", "of", "human", "normal", "third", "trimester", "post", "-", "partum", "placentas", "and", "placentas", "from", "IUGR", "-", "complicated", "pregnancies", "of", "the", "same", "gestational", "age", "(", "n", ">", "=", "9", "fields", "of", "view", "of", "normal", "and", "IUGR", "placentas", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "H", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "protein", "content", "of", "p", "-", "p65", ",", "p65", ",", "p", "-", "STAT3", "and", "STAT3", "in", "normal", "placentas", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "placentas", "from", "IUGR", "-", "complicated", "pregnancies", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Each", "lane", "represents", "one", "independent", "placenta", ".", "(", "I", ")", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "expression", "of", "MMP2", ",", "MMP9", ",", "IL6", ",", "and", "the", "JAK", "-", "STAT", "targets", "IFNAR1", "and", "IFNAR2", ",", "in", "normal", "placentas", "and", "placentas", "from", "IUGR", "-", "complicated", "pregnancies", ".", "Results", "are", "from", "four", "human", "normal", "placentas", "and", "four", "placentas", "from", "IUGR", "-", "complicated", "pregnancies", ".", "Data", "information", ":", "Values", "are", "means", "+", "SEM", "of", "at", "least", "three", "experimental", "repeats", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblot analysis of the indicated proteins in WT and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas, on day E14.5 (two independent placentas out of four from each genotype are shown).RT-PCR analysis of expression of Mmp2 in murine Cdkn2a-/-;p53-/- and in WT placentas on day E14.5 (n>=4 fields of view for each genotype). Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) P<0.001.RT-PCR analysis of expression of Mmp9 in murine Cdkn2a-/-;p53-/- and in WT placentas on day E14.5 (n>=4 fields of view for each genotype). Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) P<0.001.(D, E) Representative images (D) and quantification (E) of in-situ gelatin zymography of the labyrinth zone of murine WT and Cdkn2a-/-;p53-/- placentas on day E14.5. Scale bar, 50 μm. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) P<0.001.(F, G) Representative images (F) and quantification (G) of in-situ zymography of human normal third trimester post-partum placentas and placentas from IUGR-complicated pregnancies of the same gestational age (n>=9 fields of view of normal and IUGR placentas). Scale bar, 100 µm. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) P<0.001.(H) Immunoblot analysis of the protein content of p-p65, p65, p-STAT3 and STAT3 in normal placentas (n=4) and placentas from IUGR-complicated pregnancies (n=4). Each lane represents one independent placenta.(I) Quantitative RT-PCR analysis of expression of MMP2, MMP9, IL6, and the JAK-STAT targets IFNAR1 and IFNAR2, in normal placentas and placentas from IUGR-complicated pregnancies. Results are from four human normal placentas and four placentas from IUGR-complicated pregnancies. Data information: Values are means + SEM of at least three experimental repeats. Statistical significance was determined by unpaired two-tailed Student's t-test (*) p < 0.05; (**) p < 0.01; (***) P<0.001."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Bar", "graph", "summarizing", "the", "efficiency", "of", "single", "RNAi", "knockdowns", "for", "28", "out", "of", "the", "30", "TRs", ",", "and", "their", "effects", "in", "the", "reprogramming", "efficiency", "in", "comparison", "to", "control", "cells", "expressing", "scramble", "shRNA", ".", "The", "efficiency", "of", "each", "TR", "'", "s", "knockdown", "(", "KD", ")", "does", "not", "correlate", "with", "its", "effect", "in", "reprogramming", "efficiency", ".", "The", "knockdown", "of", "9", "(", "Class", "III", ")", "out", "of", "the", "28", "TRs", "decreased", "the", "efficiency", "of", "the", "reprogramming", "in", "a", "statistically", "significant", "manner", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Class", "I", "corresponds", "to", "one", "TR", "inhibiting", "reprogramming", ",", "whereas", "Class", "II", "corresponds", "to", "18", "TRs", "having", "a", "weak", "or", "no", "effect", "in", "repogramming", ".", "Shown", "are", "the", "effects", "of", "28", "out", "of", "30", "TRs", ",", "because", "we", "did", "not", "succeed", "in", "knocking", "down", "Cphx", "and", "Phox2a", ".", "(", "C", ")", "Left", ":", "Shown", "is", "a", "line", "graph", "depicting", "normalized", "mRNA", "expression", "levels", "of", "the", "9", "TRs", "at", "the", "indicated", "time", "points", "during", "the", "reprogramming", "of", "MEFs", ".", "The", "data", "were", "plotted", "after", "normalization", "with", "the", "endogenous", "Gapdh", "using", "the", "\"", "ΔCt", "method", "\"", ".", "The", "grey", "vertical", "dashed", "line", "depicts", "day", "6", "in", "which", "the", "expression", "levels", "of", "nearly", "all", "TRs", "peaks", ".", "Notice", "that", "the", "y", "-", "axis", "is", "broken", "to", "accommodate", "the", "large", "spread", "of", "expression", "levels", ".", "Right", ":", "Shown", "are", "western", "blots", "using", "antibodies", "specific", "for", "Irf6", ",", "Tead4", ",", "Taf1c", ",", "Rcan1", "and", "Tfap4", ".", "Whole", "cell", "extracts", "were", "prepared", "from", "MEFs", "at", "day", "6", "of", "reprogramming", "and", "run", "side", "-", "by", "-", "side", "with", "extracts", "from", "control", "samples", "(", "day", "0", ")", ".", "Gapdh", ",", "mTOR", "and", "b", "-", "Tubulin", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "(", "D", ")", "Same", "as", "in", "(", "B", ")", "except", "MEFs", "were", "co", "-", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "all", "possible", "pairwise", "combinations", "of", "shRNAs", "for", "the", "nine", "TRs", ".", "Left", ":", "Heat", "map", "depicting", "the", "effects", "of", "paired", "KD", "combinations", "in", "the", "Reprogramming", "Efficiency", "(", "RE", "%", ")", ".", "Shown", "are", "the", "average", "REs", "values", "from", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "REs", "of", "the", "double", "KDs", "were", "evaluated", "against", "the", "RE", "of", "the", "corresponding", "single", "KDs", ".", "Right", ":", "Alkaline", "Phosphatase", "(", "AP", ")", "stained", "cultures", "of", "terminal", "reprogrammed", "MEFs", "upon", "representative", "single", "and", "double", "KDs", "of", "our", "shRNA", "-", "based", "screens", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Bar graph summarizing the efficiency of single RNAi knockdowns for 28 out of the 30 TRs, and their effects in the reprogramming efficiency in comparison to control cells expressing scramble shRNA. The efficiency of each TR's knockdown (KD) does not correlate with its effect in reprogramming efficiency. The knockdown of 9 (Class III) out of the 28 TRs decreased the efficiency of the reprogramming in a statistically significant manner (unpaired two-tailed Student's t-test, p-value <0.05). Data are shown as mean ± SEM of at least two independent experiments. Class I corresponds to one TR inhibiting reprogramming, whereas Class II corresponds to 18 TRs having a weak or no effect in repogramming. Shown are the effects of 28 out of 30 TRs, because we did not succeed in knocking down Cphx and Phox2a.(C) Left: Shown is a line graph depicting normalized mRNA expression levels of the 9 TRs at the indicated time points during the reprogramming of MEFs. The data were plotted after normalization with the endogenous Gapdh using the \"ΔCt method\". The grey vertical dashed line depicts day 6 in which the expression levels of nearly all TRs peaks. Notice that the y-axis is broken to accommodate the large spread of expression levels. Right: Shown are western blots using antibodies specific for Irf6, Tead4, Taf1c, Rcan1 and Tfap4. Whole cell extracts were prepared from MEFs at day 6 of reprogramming and run side-by-side with extracts from control samples (day 0). Gapdh, mTOR and b-Tubulin were used as loading controls.(D) Same as in (B) except MEFs were co-transduced with lentiviruses expressing all possible pairwise combinations of shRNAs for the nine TRs. Left: Heat map depicting the effects of paired KD combinations in the Reprogramming Efficiency (RE%). Shown are the average REs values from at least two independent experiments. The REs of the double KDs were evaluated against the RE of the corresponding single KDs. Right: Alkaline Phosphatase (AP) stained cultures of terminal reprogrammed MEFs upon representative single and double KDs of our shRNA-based screens."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "RNA", "in", "situ", "hybridization", "depicting", "the", "expression", "patterns", "of", "the", "nine", "TRs", "in", "days", "3", "and", "6", "of", "MEFs", "reprogramming", ".", "The", "boundaries", "of", "the", "early", "-", "iPSCs", "formations", "are", "indicated", "by", "a", "blue", "dashed", "line", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "showing", "the", "percentage", "of", "cells", "isolated", "from", "early", "-", "iPSCs", "colonies", "or", "outside", "of", "the", "colonies", "(", "rest", "of", "population", ")", "expressing", "each", "of", "the", "9", "TRs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "0", ".", "05", "<", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "1", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "when", "appropriate", ".", "(", "D", ")", "Scatter", "plot", "depicting", "a", "visual", "unbiased", "representation", "of", "the", "percentile", "of", "cells", "expressing", "each", "of", "the", "nine", "TRs", ".", "Each", "dot", "depicts", "the", "percentage", "of", "cells", "expressing", "the", "indicated", "TRs", "in", "individual", "experiments", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Anova", "test", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "E", ")", "Schematic", "representation", "of", "the", "statistical", "analysis", "estimating", "the", "probability", "of", "co", "-", "expression", "of", "the", "nine", "TRs", "per", "cell", "within", "the", "early", "-", "iPSCs", "colonies", ".", "Each", "row", "consists", "of", "9", "tiles", "representing", "a", "single", "cell", "and", "each", "column", "shows", "the", "expression", "status", "of", "each", "of", "the", "nine", "TRs", "(", "shown", "with", "different", "color", ")", "in", "282", "cells", "(", "right", "side", "legend", ")", ".", "The", "co", "-", "expression", "of", "gradually", "increasing", "numbers", "of", "TRs", "is", "grouped", "from", "the", "bottom", "to", "the", "top", "of", "the", "figure", ".", "The", "left", "part", "has", "been", "generated", "by", "estimating", "the", "percentages", "of", "expression", "of", "any", "single", "TR", "per", "cell", "as", "derived", "from", "single", "gene", "expression", "in", "single", "cells", ",", "while", "the", "right", "part", "depicts", "the", "co", "-", "expression", "of", "combinations", "of", "the", "nine", "TRs", "based", "on", "double", "and", "triple", "single", "-", "cell", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) RNA in situ hybridization depicting the expression patterns of the nine TRs in days 3 and 6 of MEFs reprogramming. The boundaries of the early-iPSCs formations are indicated by a blue dashed line. Scale bars: 100 μm.(C) Bar graph showing the percentage of cells isolated from early-iPSCs colonies or outside of the colonies (rest of population) expressing each of the 9 TRs. Data are shown as mean ± SEM of at least two independent experiments. 0.05 < (*)p < 0.1, *p < 0.05, **p < 0.01 by unpaired Student's t-test or Welch's t-test, when appropriate.(D) Scatter plot depicting a visual unbiased representation of the percentile of cells expressing each of the nine TRs. Each dot depicts the percentage of cells expressing the indicated TRs in individual experiments. Data are shown as mean ± SEM of at least two independent experiments. Anova test p<0.0001.(E) Schematic representation of the statistical analysis estimating the probability of co-expression of the nine TRs per cell within the early-iPSCs colonies. Each row consists of 9 tiles representing a single cell and each column shows the expression status of each of the nine TRs (shown with different color) in 282 cells (right side legend). The co-expression of gradually increasing numbers of TRs is grouped from the bottom to the top of the figure. The left part has been generated by estimating the percentages of expression of any single TR per cell as derived from single gene expression in single cells, while the right part depicts the co-expression of combinations of the nine TRs based on double and triple single-cell experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "I", ")", "Shown", "are", "ChIP", "-", "seq", "big", "wig", "files", "in", "the", "IGV", "browser", "depicting", "the", "binding", "of", "Oct4", "(", "Red", ")", ",", "Sox2", "(", "Blue", ")", ",", "Klf4", "(", "Green", ")", "and", "c", "-", "Myc", "(", "Black", ")", "to", "putative", "regulatory", "regions", "in", "the", "nine", "TRs", "genes", "in", "MEFs", "undergoing", "reprogramming", "(", "18", "hrs", ",", "D3", "and", "D5", ")", "and", "in", "control", "MEFs", ",", "mESCs", "and", "miPSCs", ".", "All", "peaks", "have", "been", "normalized", "against", "input", "DNA", ".", "The", "relative", "sizes", "of", "the", "represented", "genomic", "loci", "and", "the", "corresponding", "TSSs", "are", "also", "indicated", ".", "The", "side", "color", "bar", "depicts", "the", "expression", "levels", "of", "each", "TR", "at", "the", "indicated", "time", "points", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-I) Shown are ChIP-seq big wig files in the IGV browser depicting the binding of Oct4 (Red), Sox2 (Blue), Klf4 (Green) and c-Myc (Black) to putative regulatory regions in the nine TRs genes in MEFs undergoing reprogramming (18 hrs, D3 and D5) and in control MEFs, mESCs and miPSCs. All peaks have been normalized against input DNA. The relative sizes of the represented genomic loci and the corresponding TSSs are also indicated. The side color bar depicts the expression levels of each TR at the indicated time points."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Heatmap", "summarizing", "the", "effects", "of", "each", "of", "the", "nine", "TRs", "single", "knockdowns", "on", "the", "expression", "of", "the", "other", "TRs", "on", "day", "6", ";", "The", "white", "color", "denotes", "no", "change", "in", "expression", "levels", ".", "(", "D", ")", "Scatter", "plots", "depicting", "the", "extent", "of", "co", "-", "expression", "of", "either", "the", "broadly", "-", "or", "early", "-", "iPSCs", "-", "specifically", "expressed", "TRs", "in", "individual", "cells", "obtained", "from", "the", "early", "-", "iPSCs", "colonies", "or", "from", "the", "rest", "of", "the", "population", "(", "left", "and", "right", "panel", "respectively", ")", ".", "Each", "dot", "depicts", "the", "percentage", "of", "cells", "co", "-", "expressing", "a", "unique", "combination", "of", "two", "or", "three", "TRs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Heatmap", "summarizing", "the", "most", "striking", "effects", "of", "double", "nine", "TRs", "KDs", "on", "the", "expression", "of", "the", "other", "TRs", "and", "on", "the", "expression", "of", "the", "Epcam", "and", "Lin28a", "pluripotency", "markers", ";", "the", "white", "color", "indicates", "no", "change", "in", "expression", "levels", ".", "The", "genes", "examined", "have", "been", "ranked", "in", "the", "heatmap", "according", "to", "their", "order", "of", "upregulation", "during", "reprogramming", ";", "Lin28a", "is", "the", "latest", "upregulated", "gene", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Heatmap summarizing the effects of each of the nine TRs single knockdowns on the expression of the other TRs on day 6; The white color denotes no change in expression levels.(D) Scatter plots depicting the extent of co-expression of either the broadly- or early-iPSCs-specifically expressed TRs in individual cells obtained from the early-iPSCs colonies or from the rest of the population (left and right panel respectively). Each dot depicts the percentage of cells co-expressing a unique combination of two or three TRs. Data are shown as mean ± SEM of at least two independent experiments.(E) Heatmap summarizing the most striking effects of double nine TRs KDs on the expression of the other TRs and on the expression of the Epcam and Lin28a pluripotency markers; the white color indicates no change in expression levels. The genes examined have been ranked in the heatmap according to their order of upregulation during reprogramming; Lin28a is the latest upregulated gene."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Shown", "is", "a", "bar", "graph", "depicting", "the", "effect", "of", "overexpression", "of", "the", "indicated", "TRs", "in", "reprogramming", "efficiency", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "y", "axis", "labeled", "as", "%", "reprogramming", "efficiency", "refers", "to", "the", "AP", "+", "colonies", "scored", "as", "iPSCs", ".", "(", "C", ")", "Shown", "is", "a", "bar", "graph", "depicting", "the", "effects", "of", "rescue", "experiments", "in", "reprogramming", "efficiency", ".", "MEFs", "undergoing", "reprogramming", "were", "knocked", "down", "using", "shRNAs", "for", "the", "endogenous", "Nanog", "or", "Irf6", "expression", "and", "were", "co", "-", "infected", "with", "a", "vector", "expressing", "an", "shRNA", "-", "resistant", "human", "homologue", "of", "Nanog", "or", "Irf6", "(", "hNanog", "OE", ",", "hIrf6", "OE", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Shown is a bar graph depicting the effect of overexpression of the indicated TRs in reprogramming efficiency. Data are shown as mean ± SEM of at least two independent experiments. The y axis labeled as % reprogramming efficiency refers to the AP+ colonies scored as iPSCs.(C) Shown is a bar graph depicting the effects of rescue experiments in reprogramming efficiency. MEFs undergoing reprogramming were knocked down using shRNAs for the endogenous Nanog or Irf6 expression and were co-infected with a vector expressing an shRNA-resistant human homologue of Nanog or Irf6 (hNanog OE, hIrf6 OE). Data are shown as mean ± SEM of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Immunolocalization", "of", "TSN2", "-", "TAPa", "and", "GFP", "-", "TAPa", "fusion", "proteins", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "seedlings", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "no", "stress", "(", "NS", ")", "conditions", "(", "23ºC", ")", "or", "incubated", "for", "40", "min", "at", "39ºC", "(", "HS", ")", "and", "then", "immunostained", "with", "α", "-", "Myc", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Immunolocalization of TSN2-TAPa and GFP-TAPa fusion proteins in root cells of 5-d-old seedlings. The seedlings were grown under no stress (NS) conditions (23ºC) or incubated for 40 min at 39ºC (HS) and then immunostained with α-Myc. Scale bars = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3B", ",", "Co", "-", "localization", "of", "RFP", "-", "TSN2", "(", "red", ")", "with", "GFP", "-", "ADH2", "(", "negative", "control", ")", "and", "GFP", "-", "UBP1", "(", "positive", "control", ")", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "incubated", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "at", "39ºC", "for", "40", "min", "(", "HS", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ".", "C", ",", "Pearson", "and", "Spearman", "coefficients", "(", "rp", "and", "rs", ",", "respectively", ")", "of", "co", "-", "localization", "(", "PSC", ")", "of", "RFP", "-", "TSN2", "with", "individual", "GFP", "-", "tagged", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "listed", "in", "A", "and", "with", "both", "negative", "and", "positive", "control", "proteins", "(", "denoted", "by", "red", "arrowheads", ")", "under", "HS", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "at", "least", "5", "replicate", "measurements", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ",", "BiFC", "between", "cYFP", "-", "TSN2", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaf", "cells", "or", "protoplasts", "after", "HS", "(", "39ºC", "for", "40", "min", ")", ".", "BiFC", "analysis", "of", "cYFP", "-", "TSN2", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "(", "TIPs", ")", "with", "empty", "vectors", "(", "EV", ")", "encoding", "nYFP", "and", "cYFP", ",", "respectively", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Only", "one", "representative", "example", "of", "BiFC", "between", "cYFP", "and", "nYFP", "-", "TIP", "is", "shown", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B, Co-localization of RFP-TSN2 (red) with GFP-ADH2 (negative control) and GFP-UBP1 (positive control) in N. benthamiana protoplasts incubated under 23°C (NS) or at 39ºC for 40 min (HS). Scale bars = 5 μm.C, Pearson and Spearman coefficients (rp and rs, respectively) of co-localization (PSC) of RFP-TSN2 with individual GFP-tagged TSN-interacting proteins listed in A and with both negative and positive control proteins (denoted by red arrowheads) under HS. Data represent means ± SD of at least 5 replicate measurements from three independent experiments.D, BiFC between cYFP-TSN2 and nYFP-TSN-interacting proteins in N. benthamiana leaf cells or protoplasts after HS (39ºC for 40 min). BiFC analysis of cYFP-TSN2 and nYFP-TSN-interacting proteins (TIPs) with empty vectors (EV) encoding nYFP and cYFP, respectively was used as a negative control. Only one representative example of BiFC between cYFP and nYFP-TIP is shown. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "4D", ",", "BiFC", "between", "cYFP", "-", "TSN2", "(", "full", "-", "length", ")", ",", "cYFP", "-", "SN", "or", "cYFP", "-", "Tudor", "and", "nYFP", "-", "TSN", "-", "interacting", "proteins", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "after", "HS", "(", "39ºC", "for", "40", "min", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "Boxplots", "show", "quantification", "of", "the", "reconstituted", "YFP", "signal", ".", "AU", ",", "arbitrary", "units", ".", "Upper", "and", "lower", "box", "boundaries", "represent", "the", "first", "and", "third", "quantiles", ",", "respectively", ",", "horizontal", "lines", "mark", "the", "median", ",", "and", "whiskers", "mark", "the", "highest", "and", "lowest", "values", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "each", "containing", "seven", "individual", "measurements", ",", "were", "performed", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tudor", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D, BiFC between cYFP-TSN2 (full-length), cYFP-SN or cYFP-Tudor and nYFP-TSN-interacting proteins in N. benthamiana protoplasts after HS (39ºC for 40 min). Scale bars = 10 μm. Boxplots show quantification of the reconstituted YFP signal. AU, arbitrary units. Upper and lower box boundaries represent the first and third quantiles, respectively, horizontal lines mark the median, and whiskers mark the highest and lowest values. Three independent experiments, each containing seven individual measurements, were performed. ***P < 0.001 vs Tudor (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "5B", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "of", "the", "two", "TSN", "isoforms", "and", "RH12", "in", "protein", "extracts", "prepared", "from", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "agro", "-", "infiltrated", "with", "GFP", "-", "TSN1", "or", "GFP", "-", "TSN2", "and", "Myc", "-", "RH12", ".", "Free", "GFP", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Input", "and", "Co", "-", "Ip", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "α", "-", "Myc", "and", "α", "-", "GFP", ".", "C", ",", "Localization", "of", "RH12", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "GFP", "-", "RH12", "under", "control", "of", "the", "native", "promoter", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B, Co-immunoprecipitation (Co-Ip) of the two TSN isoforms and RH12 in protein extracts prepared from N. benthamiana leaves agro-infiltrated with GFP-TSN1 or GFP-TSN2 and Myc-RH12. Free GFP was used as a negative control. Input and Co-Ip fractions were analyzed by immunoblotting using α-Myc and α-GFP.C, Localization of RH12 in root cells of 5-d-old Arabidopsis seedlings expressing GFP-RH12 under control of the native promoter. The seedlings were grown under 23°C (NS) or incubated at 39°C for 60 min (HS). Scale bars = 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "of", "TSN", "and", "RBP47", "in", "protein", "extracts", "prepared", "from", "10", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "RBP47", "and", "grown", "under", "no", "stress", "(", "NS", ")", ",", "HS", "(", "39ºC", "for", "60", "min", ")", "or", "salt", "(", "NaCl", ")", "stress", "(", "150", "mM", "NaCl", "for", "60", "min", ")", "conditions", ".", "The", "GFP", "-", "expressing", "line", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Endogenous", "TSN", "(", "107", "kD", ")", "was", "detected", "in", "total", "fractions", "(", "Input", ")", "and", "fractions", "co", "-", "immunoprecipitated", "(", "Co", "-", "Ip", ")", "with", "RBP47", "but", "not", "with", "free", "GFP", "in", "all", "three", "conditions", ".", "Input", "and", "Co", "-", "Ip", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "α", "-", "TSN", "and", "α", "-", "GFP", ".", "C", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "tagged", "proteins", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "RBP47", ",", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "UBP1", ",", "Pro35S", ":", "GFP", "-", "TCTP", "and", "ProUBQ", ":", "GFP", "-", "SnRK1α2", ".", "The", "seedlings", "were", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", ",", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", "or", "treated", "with", "200", "mM", "NaCl", "at", "23", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "NaCl", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, Co-immunoprecipitation (Co-Ip) of TSN and RBP47 in protein extracts prepared from 10-d-old Arabidopsis seedlings expressing Pro35S:GFP-RBP47 and grown under no stress (NS), HS (39ºC for 60 min) or salt (NaCl) stress (150 mM NaCl for 60 min) conditions. The GFP-expressing line was used as a negative control. Endogenous TSN (107 kD) was detected in total fractions (Input) and fractions co-immunoprecipitated (Co-Ip) with RBP47 but not with free GFP in all three conditions. Input and Co-Ip fractions were analyzed by immunoblotting using α-TSN and α-GFP.C, Localization of GFP-tagged proteins in root cells of 5-d-old Arabidopsis seedlings expressing Pro35S:GFP-RBP47, Pro35S:GFP-UBP1, Pro35S:GFP-TCTP and ProUBQ:GFP-SnRK1α2. The seedlings were grown under 23°C (NS), incubated at 39°C for 60 min (HS) or treated with 200 mM NaCl at 23°C for 60 min (NaCl). Scale bars = 10 μm"}
{"words": ["Figure", "7D", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "WT", "and", "tsn1", "tsn2", "seedlings", "grown", "under", "23", "°", "C", "(", "NS", ")", "or", "incubated", "at", "39", "°", "C", "for", "60", "min", "(", "HS", ")", ".", "Insets", "show", "enlarged", "areas", "inside", "dashed", "rectangles", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "J", ",", "Colocalization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", ",", "GFP", "-", "SnRK1α1CD", ",", "or", "GFP", "-", "SnRK1α1RD", "with", "RFP", "-", "RBP47", "in", "N", ".", "benthamiana", "protoplasts", "subjected", "to", "HS", "(", "40", "min", "at", "39", "°", "C", ")", ".", "For", "colocalization", "analysis", "under", "NS", "conditions", "see", "Fig", ".", "EV5B", ".", "For", "CHX", "treatment", ",", "protoplasts", "were", "incubated", "with", "200", "ng", "μL", "-", "1", "CHX", "for", "30", "min", "at", "23ºC", "before", "HS", ".", "GFP", "and", "RFP", "fusion", "proteins", "were", "expressed", "under", "the", "control", "of", "the", "UBQ", "and", "35S", "promoter", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D, Localization of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 in root cells of 5-d-old Arabidopsis WT and tsn1 tsn2 seedlings grown under 23°C (NS) or incubated at 39°C for 60 min (HS). Insets show enlarged areas inside dashed rectangles. Scale bars = 10 μm.J, Colocalization of GFP-SnRK1α1, GFP-SnRK1α1CD, or GFP-SnRK1α1RD with RFP-RBP47 in N. benthamiana protoplasts subjected to HS (40 min at 39°C). For colocalization analysis under NS conditions see Fig. EV5B. For CHX treatment, protoplasts were incubated with 200 ng μL-1 CHX for 30 min at 23ºC before HS. GFP and RFP fusion proteins were expressed under the control of the UBQ and 35S promoter, respectively. Scale bars = 5 μm."}
{"words": ["Figure", "8C", ",", "Localization", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "in", "root", "cells", "of", "5", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "WT", "seedlings", "incubated", "at", "39", "°", "C", "and", "imaged", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "GFP", "-", "SnRK1α1", "and", "GFP", "-", "SnRK1α2", "foci", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "C", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "at", "least", "16", "replicate", "measurements", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ",", "F", ",", "Immunoblot", "analysis", "with", "indicated", "antibodies", "of", "protein", "extracts", "prepared", "from", "root", "tips", "of", "10", "-", "d", "-", "old", "Arabidopsis", "tsn1", "tsn2", "(", "E", ")", "or", "tsn1", "tsn2", "expressing", "ProTSN2", ":", "GFP", "-", "TSN2", "(", "F", ")", "heat", "-", "stressed", "seedlings", "(", "39ºC", ")", "0", ",", "20", ",", "40", "and", "60", "min", "after", "the", "onset", "of", "HS", ".", "The", "charts", "show", "SnRK1", "activity", ",", "expressed", "as", "the", "ratio", "of", "phosphorylated", "to", "total", "SnRK1", "protein", ".", "The", "data", "represent", "mean", "ratios", "of", "integrated", "band", "intensities", "(", "for", "both", "isoforms", ")", "normalized", "to", "0", "min", "±", "SD", "from", "at", "least", "four", "different", "experiments", ".", "P", "values", "denote", "statistically", "significant", "differences", "for", "comparisons", "to", "0", "min", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ",", "Expression", "levels", "of", "DIN2", "and", "DIN6", "in", "Arabidopsis", "WT", ",", "tsn1", "tsn2", ",", "tsn1", "tsn2", ";", "TSN2", "and", "snrk1α1", "-", "/", "-", "snrk1α2", "-", "/", "+", "10", "-", "d", "-", "old", "heat", "-", "stressed", "seedlings", "relative", "to", "unstressed", "controls", ".", "For", "CHX", "treatment", ",", "the", "WT", "seedlings", "were", "pre", "-", "treated", "with", "200", "ng", "μL", "-", "1", "CHX", "for", "30", "min", "before", "HS", ".", "Upper", "and", "lower", "box", "boundaries", "represent", "the", "first", "and", "third", "quantiles", ",", "respectively", ".", "Horizontal", "lines", "mark", "the", "median", "of", "five", "replicate", "measurements", ",", "and", "whiskers", "mark", "the", "highest", "and", "lowest", "values", ".", "Means", "with", "different", "letters", "are", "significantly", "different", "at", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8C, Localization of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 in root cells of 5-d-old Arabidopsis WT seedlings incubated at 39°C and imaged at the indicated time points. Scale bars = 10 μm. D, Quantification of GFP-SnRK1α1 and GFP-SnRK1α2 foci in the experiment shown in C. Data represent means ± SD of at least 16 replicate measurements. The experiment was repeated three times with similar results. ***P < 0.05 (two-tailed t-test). E, F, Immunoblot analysis with indicated antibodies of protein extracts prepared from root tips of 10-d-old Arabidopsis tsn1 tsn2 (E) or tsn1 tsn2 expressing ProTSN2:GFP-TSN2 (F) heat-stressed seedlings (39ºC) 0, 20, 40 and 60 min after the onset of HS. The charts show SnRK1 activity, expressed as the ratio of phosphorylated to total SnRK1 protein. The data represent mean ratios of integrated band intensities (for both isoforms) normalized to 0 min ± SD from at least four different experiments. P values denote statistically significant differences for comparisons to 0 min (two-tailed t-test).G, Expression levels of DIN2 and DIN6 in Arabidopsis WT, tsn1 tsn2, tsn1 tsn2;TSN2 and snrk1α1-/- snrk1α2-/+ 10-d-old heat-stressed seedlings relative to unstressed controls. For CHX treatment, the WT seedlings were pre-treated with 200 ng μL-1 CHX for 30 min before HS. Upper and lower box boundaries represent the first and third quantiles, respectively. Horizontal lines mark the median of five replicate measurements, and whiskers mark the highest and lowest values. Means with different letters are significantly different at P < 0.05 (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "10", "nM", "control", "(", "n", "=", "84", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "171", ")", ",", "20", "nM", "control", "(", "n", "=", "101", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "157", ")", "and", "40", "nM", "control", "(", "n", "=", "86", ")", "or", "Nup50", "siRNA", "(", "n", "=", "204", ")", ".", "72", "h", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "fixed", "with", "4", "%", "PFA", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "Nup50", "and", "mAB414", ",", "chromatin", "was", "labeled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "Quantitation", "of", "the", "mAB414", "rim", "intensity", "at", "three", "different", "Nup50", "RNAi", "and", "control", "oligo", "concentrations", ".", "The", "means", "are", "indicated", "as", "diamonds", ",", "error", "bars", "show", "the", "standard", "deviations", ".", "P", "-", "values", "have", "been", "calculated", "from", "a", "student", "t", "-", "test", "comparing", "the", "mean", "between", "the", "experimental", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) HeLa cells were transfected with 10 nM control (n=84) or Nup50 siRNA (n=171), 20 nM control (n=101) or Nup50 siRNA (n=157) and 40 nM control (n=86) or Nup50 siRNA (n=204). 72 h post transfection, cells were fixed with 4% PFA and stained with antibodies against Nup50 and mAB414, chromatin was labeled with DAPI. Scale bars: 50 µm. Quantitation of the mAB414 rim intensity at three different Nup50 RNAi and control oligo concentrations. The means are indicated as diamonds, error bars show the standard deviations. P-values have been calculated from a student t-test comparing the mean between the experimental conditions."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Mouse", "3T3", "-", "NIH", "cells", "were", "transfected", "with", "20", "nM", "control", ",", "Nup50A", ",", "Nup50B", "or", "a", "combination", "of", "Nup50A", "and", "Nup50B", "siRNA", ".", "After", "72h", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "mAB414", "(", "green", ")", "and", "antibodies", "against", "mouse", "Nup50", "(", "red", ")", ".", "Chromatin", "is", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "The", "merge", "of", "the", "three", "channels", "is", "shown", "on", "the", "left", "column", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "An", "insert", "shows", "a", "zoom", "on", "a", "representative", "nucleus", "for", "each", "picture", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "the", "mAB414", "rim", "intensity", "from", "n", "=", "4", "independent", "experiments", "done", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "each", "represented", "by", "a", "different", "color", ".", "The", "mean", "of", "each", "individual", "experiment", "and", "condition", "is", "represented", "by", "a", "diamond", ",", "the", "mean", "of", "all", "four", "experiments", "by", "a", "horizontal", "black", "line", ".", "P", "-", "values", "have", "been", "calculated", "from", "a", "paired", "ratio", "t", "-", "test", "comparing", "the", "mean", "between", "the", "experimental", "conditions", ".", "Error", "bars", "show", "the", "standard", "deviations", "of", "the", "means", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Mouse 3T3-NIH cells were transfected with 20 nM control, Nup50A, Nup50B or a combination of Nup50A and Nup50B siRNA. After 72h cells were fixed and stained with mAB414 (green) and antibodies against mouse Nup50 (red). Chromatin is stained with DAPI (blue). The merge of the three channels is shown on the left column. Scale bar: 50 µm. An insert shows a zoom on a representative nucleus for each picture. Scale bar: 10 µm.(B) Quantitation of the mAB414 rim intensity from n=4 independent experiments done as in (A), each represented by a different color. The mean of each individual experiment and condition is represented by a diamond, the mean of all four experiments by a horizontal black line. P-values have been calculated from a paired ratio t-test comparing the mean between the experimental conditions. Error bars show the standard deviations of the means."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Demembranated", "sperm", "chromatin", "was", "preincubated", "in", "Xenopus", "egg", "extract", ",", "depleted", "for", "MEL28", "/", "ELYS", "or", "Nup50", "(", "B", ")", "or", "control", "treated", "(", "Mock", ",", "A", ")", ".", "After", "10", "min", ",", "membranes", "were", "added", "to", "the", "reaction", ".", "Reactions", "were", "stopped", "at", "the", "indicated", "time", "points", "by", "fixation", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", "after", "immunostaining", "with", "α", "-", "MEL28", "/", "ELYS", "(", "A", ")", ",", "α", "-", "Nup50", "(", "B", ")", ",", "and", "mAb414", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "Chromatin", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", "in", "the", "overlay", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) Demembranated sperm chromatin was preincubated in Xenopus egg extract, depleted for MEL28/ELYS or Nup50 (B) or control treated (Mock, A). After 10 min, membranes were added to the reaction. Reactions were stopped at the indicated time points by fixation and analyzed by confocal microscopy after immunostaining with α-MEL28/ELYS (A), α-Nup50 (B), and mAb414 (A, B). Chromatin was stained with DAPI (blue in the overlay). Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "43", "µM", "recombinant", "EGFP", ",", "EGFP", "-", "tagged", "MEL28", "/", "ELYS", "(", "aa", "2290", "-", "2408", ")", "or", "EGFP", "-", "tagged", "Nup50", "were", "incubated", "with", "empty", "or", "DNA", "-", "coated", "magnetic", "beads", ",", "which", "were", "chromatinized", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", "(", "right", "panel", ")", "or", "unchromatinized", "DNA", "-", "beads", "(", "left", "panel", ")", ".", "After", "3h", "the", "beads", "were", "re", "-", "isolated", ",", "washed", ",", "co", "-", "stained", "with", "DAPI", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 43 µM recombinant EGFP, EGFP-tagged MEL28/ELYS (aa 2290-2408) or EGFP-tagged Nup50 were incubated with empty or DNA-coated magnetic beads, which were chromatinized with Xenopus egg extracts (right panel) or unchromatinized DNA-beads (left panel). After 3h the beads were re-isolated, washed, co-stained with DAPI and analyzed by confocal microscopy. Scale bar: 10 µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "Nup50", "comprising", "different", "point", "mutations", "in", "the", "minimal", "NPC", "binding", "region", "and", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "Bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "GST", "-", "fusion", "constructs", "of", "the", "Xenopus", "Nup50", "minimal", "NPC", "binding", "fragment", "(", "aa", "144", "-", "189", ")", "comprising", "no", "or", "single", "point", "mutations", "were", "incubated", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", ".", "Starting", "material", "as", "well", "as", "bound", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", ".", "The", "quantitation", "shows", "the", "average", "MEL28", "/", "ELYS", "and", "Nup153", "bead", "bound", "signal", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "normalized", "to", "the", "signal", "of", "their", "respective", "wild", "-", "type", "GST", "fusion", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) HeLa cells were transfected with EGFP-Nup50 comprising different point mutations in the minimal NPC binding region and analyzed as in (A). Scale Bar: 10 µm.(D) GST-fusion constructs of the Xenopus Nup50 minimal NPC binding fragment (aa 144-189) comprising no or single point mutations were incubated with Xenopus egg extracts. Starting material as well as bound proteins were analyzed by Western blotting with indicated antibodies. The quantitation shows the average MEL28/ELYS and Nup153 bead bound signal from three independent experiments, normalized to the signal of their respective wild-type GST fusion Data points from individual experiments are indicated."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "wild", "-", "type", "Nup50", "or", "different", "mutants", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "points", "from", "the", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "with", "N", "-", "terminal", "Nup50", "truncations", "and", "an", "minimal", "N", "-", "terminal", "fragment", ".", "Samples", "were", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "Average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "points", "from", "the", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with recombinant wild-type Nup50 or different mutants. Nuclei were fixed in 4% PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. (B) Average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of at least three independent experiments shown in (A). Data points from the individual experiments are indicated. (C) Confocal microscopy images of nuclei assembled with N-terminal Nup50 truncations and an minimal N-terminal fragment. Samples were analyzed as in (A). (D) Average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of at least three independent experiments shown in (C). Data points from the individual experiments are indicated. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "fixed", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", "(", "mock", ")", "and", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "mouse", "Nup50", "orthologues", ".", "Nuclei", "were", "stained", "for", "Nup50", "(", "Nup50", "antibody", "for", "Xenopus", "protein", ",", "His6", "for", "mouse", "protein", ")", "and", "NPCs", "(", "mAB414", ",", "red", ")", "on", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "The", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "performed", "as", "in", "B", ")", "is", "shown", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "E", ")", "GST", "-", "fusion", "constructs", "of", "the", "Xenopus", "Nup53", "RRM", "domain", "(", "aa", "162", "-", "267", ",", "control", ")", "full", "-", "length", "Xenopus", "Nup50", "and", "the", "two", "mouse", "Nup50", "orthologues", "were", "incubated", "with", "Xenopus", "egg", "extracts", ".", "Starting", "material", "as", "well", "as", "bound", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "indicated", "antibodies", "The", "right", "panel", "shows", "the", "average", "MEL28", "/", "ELYS", ",", "Nup153", ",", "importin", "β", "and", "ran", "bead", "bound", "signal", "from", "two", "independent", "experiments", "normalized", "to", "their", "respective", "Xenopus", "signal", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Confocal microscopy images of fixed nuclei assembled for 120 min in mock depleted (mock) and Nup50 depleted (∆Nup50) Xenopus egg extracts supplemented with recombinant mouse Nup50 orthologues. Nuclei were stained for Nup50 (Nup50 antibody for Xenopus protein, His6 for mouse protein) and NPCs (mAB414, red) on the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. (C) The average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments (performed as in B) is shown. Data points from individual experiments are indicated. (E) GST-fusion constructs of the Xenopus Nup53 RRM domain (aa 162-267, control) full-length Xenopus Nup50 and the two mouse Nup50 orthologues were incubated with Xenopus egg extracts. Starting material as well as bound proteins were analyzed by Western blotting with indicated antibodies The right panel shows the average MEL28/ELYS, Nup153, importin β and ran bead bound signal from two independent experiments normalized to their respective Xenopus signal. Data points from individual experiments are indicated."}
{"words": ["Figure", "8HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "FLAG", "-", "tag", "vector", "as", "a", "control", "or", "FLAG", "-", "Nup50", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "aa", "1", "-", "120", "of", "the", "human", "sequence", ")", ".", "24", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "lysed", ",", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "immuno", "-", "isolated", "and", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", "with", "the", "Volcano", "blot", "showing", "the", "identified", "interactors", "of", "Nup50", "(", "yellow", ",", "data", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "KPNA2", "is", "the", "gene", "name", "of", "importin", "α", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "FLAG", "-", "tag", "vector", "as", "a", "control", "or", "FLAG", "-", "Nup50", "N", "-", "terminal", "fragment", "(", "aa", "1", "-", "120", "of", "the", "human", "sequence", ")", ".", "24", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "lysed", ",", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "immuno", "-", "isolated", "and", "analyzed", "by", "western", "blotting", "(", "B", ")", ",", "with", "10", "%", "of", "the", "inputs", "loaded", ".", "The", "quantification", "of", "the", "western", "blot", "(", "B", ",", "lower", "panel", ")", "shows", "the", "mean", "signal", "intensity", "normalized", "on", "the", "input", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "Data", "points", "from", "individual", "experiments", "are", "indicated", ".", "(", "E", ")", "2", "µM", "recombinant", "Ran", ",", "loaded", "with", "MANT", "-", "GDP", "was", "incubated", "with", "2", "mM", "GppNHp", "in", "buffer", "control", ",", "supplemented", "with", "2", "nM", "recombinant", "RCC1", ",", "20", "nM", "recombinant", "Xenopus", "Nup50", "proteins", ",", "or", "RCC1", "and", "Nup50", "together", ".", "GDP", "to", "GppNHp", "exchanged", "was", "monitored", "by", "the", "decrease", "in", "MANT", "fluorescence", "of", "the", "liberated", "GDP", "-", "MANT", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "rate", "constant", "of", "each", "experimental", "condition", "with", "n", "=", "4", "independent", "experiment", "per", "condition", ",", "bars", "represent", "the", "mean", ",", "individual", "data", "points", "are", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "recombinant", "Xenopus", "wild", "-", "type", "Nup50", "or", "RCC1", "binding", "mutants", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantitation", "shows", "the", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Individual", "data", "points", "are", "indicated", "(", "H", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "nuclei", "assembled", "for", "120", "min", "in", "mock", "depleted", ",", "Nup50", "depleted", "(", "∆", "Nup50", ")", ",", "and", "Nup50", "depleted", "Xenopus", "egg", "extracts", "supplemented", "with", "RCC1", "excess", "as", "indicated", ".", "Nuclei", "were", "fixed", "in", "4", "%", "PFA", "and", "0", ".", "5", "%", "glutaraldehyde", ",", "stained", "for", "NPCs", "(", "mAB414", ")", "and", "the", "chromatin", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantitation", "shows", "the", "average", "percentage", "of", "mAB414", "positive", "nuclei", "for", "100", "randomly", "chosen", "chromatin", "substrates", "in", "each", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Individual", "data", "points", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HEK293T cells were transfected with empty FLAG-tag vector as a control or FLAG-Nup50 N-terminal fragment (aa 1-120 of the human sequence). 24 h post transfection cells were lysed, FLAG-tagged proteins immuno-isolated and analyzed by mass spectrometry with the Volcano blot showing the identified interactors of Nup50 (yellow, data from three independent experiments) Data points from individual experiments are indicated. KPNA2 is the gene name of importin α.HEK293T cells were transfected with empty FLAG-tag vector as a control or FLAG-Nup50 N-terminal fragment (aa 1-120 of the human sequence). 24 h post transfection cells were lysed, FLAG-tagged proteins immuno-isolated and analyzed by western blotting (B), with 10% of the inputs loaded. The quantification of the western blot (B, lower panel) shows the mean signal intensity normalized on the input of at least two independent experiments. Data points from individual experiments are indicated.(E) 2 µM recombinant Ran, loaded with MANT-GDP was incubated with 2 mM GppNHp in buffer control, supplemented with 2 nM recombinant RCC1, 20 nM recombinant Xenopus Nup50 proteins, or RCC1 and Nup50 together. GDP to GppNHp exchanged was monitored by the decrease in MANT fluorescence of the liberated GDP-MANT. The lower panel shows the rate constant of each experimental condition with n=4 independent experiment per condition, bars represent the mean, individual data points are indicated.(G) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with recombinant Xenopus wild-type Nup50 or RCC1 binding mutants. Nuclei were fixed in 4 % PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. Quantitation shows the average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments. Individual data points are indicated (H) Confocal microscopy images of nuclei assembled for 120 min in mock depleted, Nup50 depleted (∆Nup50), and Nup50 depleted Xenopus egg extracts supplemented with RCC1 excess as indicated. Nuclei were fixed in 4 % PFA and 0.5 % glutaraldehyde, stained for NPCs (mAB414) and the chromatin (DAPI). Scale bar: 10 µm. Quantitation shows the average percentage of mAB414 positive nuclei for 100 randomly chosen chromatin substrates in each of three independent experiments. Individual data points are indicated. "}
{"words": ["Figure", "1Comparison", "of", "structural", "preservation", "in", "cryosections", "picked", "up", "with", "sucrose", "(", "a", ")", "and", "MU", "(", "b", ")", ".", "In", "isolated", "hepatocytes", ",", "autophagy", "was", "induced", "for", "30", "min", "in", "suspension", "buffer", "before", "fixation", ".", "(", "a", ")", "Cryosection", "picked", "up", "with", "2", ".", "3", "M", "sucrose", "and", "labeled", "for", "SOD", ".", "Note", "the", "presence", "of", "large", ",", "\"", "empty", "\"", "gaps", "between", "sequestered", "contents", "of", "the", "AV", "and", "the", "surrounding", "cytoplasm", ".", "(", "b", ")", "A", "similar", "section", "as", "a", ",", "but", "picked", "up", "with", "an", "MU", "mixture", ".", "The", "AV", "are", "no", "longer", "distorted", "and", "the", "overall", "membranous", "structures", "are", "sharply", "delineated", ".", "The", "SOD", "-", "labeling", "density", "of", "AVi", "is", "as", "that", "of", "the", "cytosol", ",", "whereas", "AVd", "show", "much", "more", "intense", "labeling", ".", "(", "Inset", ")", "An", "AVi", "/", "d", "that", "is", "distinct", "from", "AVi", "by", "its", "single", "limiting", "membrane", ".", "The", "highly", "pleiomorphic", "AVd", "are", "also", "bound", "by", "a", "distinctive", "single", "membrane", ",", "but", "in", "contrast", "to", "AVi", "/", "d", ",", "their", "contents", "are", "characterized", "by", "debris", "of", "digested", "material", ".", "Bars", ",", "250", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Comparison of structural preservation in cryosections picked up with sucrose (a) and MU (b). In isolated hepatocytes, autophagy was induced for 30 min in suspension buffer before fixation. (a) Cryosection picked up with 2.3 M sucrose and labeled for SOD. Note the presence of large, \"empty\" gaps between sequestered contents of the AV and the surrounding cytoplasm. (b) A similar section as a, but picked up with an MU mixture. The AV are no longer distorted and the overall membranous structures are sharply delineated. The SOD-labeling density of AVi is as that of the cytosol, whereas AVd show much more intense labeling. (Inset) An AVi/d that is distinct from AVi by its single limiting membrane. The highly pleiomorphic AVd are also bound by a distinctive single membrane, but in contrast to AVi/d, their contents are characterized by debris of digested material. Bars, 250 nm."}
{"words": ["Figure", "2Labeling", "patterns", "of", "cathepsin", "D", "and", "CAIII", "in", "MU", "picked", "-", "up", "cryosections", ".", "(", "a", ")", "Cells", "treated", "as", "in", "Fig", ".", "1", "b", ",", "but", "the", "section", "was", "immunolabeled", "for", "cathepsin", "D", ",", "which", "is", "not", "detectable", "in", "the", "AVi", ",", "moderately", "present", "in", "the", "AVi", "/", "d", ",", "and", "abundant", "in", "AVd", ".", "Cells", "in", "b", "and", "c", "had", "endocytosed", "5", "-", "nm", "gold", "tracer", "for", "20", "and", "40", "min", ",", "respectively", ",", "before", "fixation", "and", "CAIII", "labeling", ".", "(", "b", ")", "Complex", "fusion", "profile", "of", "a", "CAIII", "-", "positive", "AVi", ",", "an", "AVd", "which", "is", "without", "CAIII", "labeling", ",", "and", "a", "VE", "that", "contains", "an", "endocytosed", "gold", "probe", "(", "arrow", ")", ".", "Close", "to", "the", "AVd", "is", "another", "tracer", "-", "bearing", "VE", ".", "(", "c", ")", "Fusion", "profile", "of", "a", "tracer", "-", "bearing", "MVE", "and", "an", "AVi", "/", "d", "that", "exhibits", "a", "single", "limiting", "membrane", "and", "a", "CAIII", "-", "labeling", "concentration", "similar", "to", "that", "of", "the", "cytoplasm", ".", "Bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Labeling patterns of cathepsin D and CAIII in MU picked-up cryosections. (a) Cells treated as in Fig. 1 b, but the section was immunolabeled for cathepsin D, which is not detectable in the AVi, moderately present in the AVi/d, and abundant in AVd. Cells in b and c had endocytosed 5-nm gold tracer for 20 and 40 min, respectively, before fixation and CAIII labeling. (b) Complex fusion profile of a CAIII-positive AVi, an AVd which is without CAIII labeling, and a VE that contains an endocytosed gold probe (arrow). Close to the AVd is another tracer-bearing VE. (c) Fusion profile of a tracer-bearing MVE and an AVi/d that exhibits a single limiting membrane and a CAIII-labeling concentration similar to that of the cytoplasm. Bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "3Appearance", "of", "tracer", "in", "AV", ".", "Cells", "were", "allowed", "to", "endocytose", "tracer", "particles", "continuously", "for", "the", "designated", "periods", "of", "time", ".", "At", "each", "time", ",", "random", "sections", "were", "searched", "for", "AV", "+", ",", "and", "AV", "+", "/", "500", "cell", "profiles", "were", "plotted", ".", "The", "number", "of", "cell", "profiles", "examined", "(", "denominator", ")", "and", "the", "respective", "number", "of", "AV", "+", "scored", "(", "numerator", ")", "are", "listed", "above", "the", "graph", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Appearance of tracer in AV. Cells were allowed to endocytose tracer particles continuously for the designated periods of time. At each time, random sections were searched for AV+, and AV+/500 cell profiles were plotted. The number of cell profiles examined (denominator) and the respective number of AV+ scored (numerator) are listed above the graph."}
{"words": ["Figure", "4Tracer", "distribution", "in", "AV", "+", "types", ".", "Cells", "were", "allowed", "to", "endocytose", "tracer", "particles", "continuously", "for", "the", "designated", "periods", "of", "time", ".", "At", "each", "time", ",", "random", "sections", "were", "searched", "for", "AV", "+", ".", "The", "results", "are", "categorized", "according", "to", "AV", "types", "and", "plotted", "for", "the", "relative", "distribution", "of", "tracers", ".", "The", "total", "tracer", "counts", "are", "given", "on", "top", "of", "each", "bar", ".", "The", "number", "in", "each", "block", "represents", "the", "actual", "number", "of", "AV", "profiles", ",", "from", "which", "tracer", "counts", "are", "scored", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Tracer distribution in AV+ types. Cells were allowed to endocytose tracer particles continuously for the designated periods of time. At each time, random sections were searched for AV+. The results are categorized according to AV types and plotted for the relative distribution of tracers. The total tracer counts are given on top of each bar. The number in each block represents the actual number of AV profiles, from which tracer counts are scored."}
{"words": ["Figure", "5Fusion", "profiles", ".", "Cells", "exposed", "to", "5", "-", "nm", "gold", "tracers", "for", "20", "(", "a", "and", "c", ")", "and", "25", "min", "(", "b", ")", "before", "fixation", ".", "Sections", "were", "picked", "up", "by", "MU", "and", "air", "-", "dried", "(", "c", ")", "or", "underwent", "immunolabeling", "with", "anti", "-", "SOD", "antibodies", "(", "a", "and", "b", ")", ".", "(", "a", ")", "Fusion", "between", "a", "small", "VE", "(", "arrow", ")", "and", "an", "AVi", ".", "A", "cluster", "of", "two", "gold", "particles", "(", "arrowhead", ")", "is", "also", "seen", "at", "another", "location", ".", "(", "b", ")", "Fusion", "between", "an", "electron", "lucent", "MVE", "(", "arrow", ")", "and", "an", "AVd", ".", "(", "c", ")", "Fusion", "between", "an", "MVE", "(", "arrow", ")", "and", "an", "AVd", ".", "Bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Fusion profiles. Cells exposed to 5-nm gold tracers for 20 (a and c) and 25 min (b) before fixation. Sections were picked up by MU and air-dried (c) or underwent immunolabeling with anti-SOD antibodies (a and b). (a) Fusion between a small VE (arrow) and an AVi. A cluster of two gold particles (arrowhead) is also seen at another location. (b) Fusion between an electron lucent MVE (arrow) and an AVd. (c) Fusion between an MVE (arrow) and an AVd. Bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "6Endosome", "types", "involved", "in", "FP", "+", ".", "The", "FP", "+", "were", "classified", "according", "to", "MVE", "and", "VE", "involved", ".", "The", "actual", "numbers", "of", "FP", "+", "analyzed", "are", "given", "above", "the", "bars", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Endosome types involved in FP+. The FP+ were classified according to MVE and VE involved. The actual numbers of FP+ analyzed are given above the bars."}
{"words": ["Figure", "7ASGP", "-", "R", "labeling", "in", "FP", "+", "and", "endosomes", ".", "Cells", "exposed", "for", "40", "min", "to", "5", "-", "nm", "gold", "tracer", ".", "Section", "immunolabeled", "for", "ASGP", "-", "R", "with", "10", "-", "nm", "gold", ".", "(", "a", ")", "Low", "ASGP", "-", "R", "labeling", "in", "tracer", "-", "carrying", "endocytic", "vesicles", "(", "arrowheads", ")", ",", "adjacent", "to", "(", "top", ")", "or", "fusing", "with", "(", "bottom", ")", "an", "AVi", "/", "d", ".", "(", "b", ")", "ASGP", "-", "R", "labeling", "at", "the", "plasma", "membrane", "and", "in", "endosomal", "elements", "near", "the", "cell", "surface", "(", "ex", ",", "extra", "cellular", "space", ")", ".", "Vesicles", "of", "the", "MVE", "(", "asterisk", ")", "and", "VE", "(", "arrowhead", ")", "type", ",", "containing", "endocytosed", "gold", ",", "are", "present", "in", "the", "same", "area", ".", "(", "c", ")", "As", "b", ".", "A", "VE", "-", "like", "vesicle", "with", "endocytosed", "gold", "and", "low", "ASGP", "-", "R", "labeling", "(", "arrowhead", ")", "is", "shown", "connected", "to", "an", "ASGP", "-", "R", "rich", "element", "(", "arrow", ")", ",", "possibly", "a", "recycling", "endosome", ".", "Bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7ASGP-R labeling in FP+ and endosomes. Cells exposed for 40 min to 5-nm gold tracer. Section immunolabeled for ASGP-R with 10-nm gold. (a) Low ASGP-R labeling in tracer-carrying endocytic vesicles (arrowheads), adjacent to (top) or fusing with (bottom) an AVi/d. (b) ASGP-R labeling at the plasma membrane and in endosomal elements near the cell surface (ex, extra cellular space). Vesicles of the MVE (asterisk) and VE (arrowhead) type, containing endocytosed gold, are present in the same area. (c) As b. A VE-like vesicle with endocytosed gold and low ASGP-R labeling (arrowhead) is shown connected to an ASGP-R rich element (arrow), possibly a recycling endosome. Bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "8AV", "types", "involved", "in", "FP", "+", ".", "The", "same", "FP", "+", "data", "as", "used", "in", "Fig", ".", "6", "were", "classified", "according", "to", "the", "AV", "types", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8AV types involved in FP+. The same FP+ data as used in Fig. 6 were classified according to the AV types."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "exposed", "to", "5", "Gy", "ionizing", "radiation", "(", "γIR", ")", ",", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "and", "γH2AX", ".", "Images", "for", "representative", "intra", "-", "nuclear", "RASSF1A", "foci", "distribution", "are", "shown", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "RASSF1A", "foci", "at", "the", "time", "points", "presented", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "5", "Gy", "γIR", "and", "2", "h", "post", "treatment", "fixed", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "irradiated", "with", "5", "Gy", "and", "2", "h", "post", "treatment", "stained", "for", "RASSF1A", "(", "R1A", ")", "and", "NUCLEOLIN", "(", "NCL", ")", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "50", "ng", "/", "ml", "NCS", "for", "30", "min", ",", "washed", "and", "2", "h", "later", "fixed", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "distance", "of", "RASSF1A", "+", "/", "γH2AX", "+", "foci", "or", "RASSF1A", "-", "/", "γH2AX", "+", "foci", "to", "the", "closest", "nucleolus", "(", "based", "on", "Fibrillarin", "(", "Fb", ")", "staining", ")", "was", "measured", ".", "Middle", "line", "represents", "the", "median", "and", "the", "boxes", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "The", "whiskers", "mark", "the", "smallest", "and", "largest", "values", ".", "(", "F", ")", "AsiSI", "expression", "in", "U2OS", "cells", "was", "induced", "by", "OHT", "and", "cells", "were", "stained", "for", "RASSF1A", "and", "γH2AX", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "in", "higher", "magnification", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "RASSF1A", "foci", "in", "(", "F", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "U2OS", "cells", "with", "stable", "integration", "of", "a", "Lac", "operator", "(", "LacO", ")", "sequence", "adjacent", "to", "an", "I", "-", "SceI", "endonuclease", "site", "were", "transfected", "with", "Lac", "Repressor", "(", "LacR", ")", "-", "mCherry", "and", "GFP", "or", "GFP", "-", "NLS", "-", "HA", "-", "I", "-", "SceI", ".", "24", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "53BP1", "or", "RASSF1A", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "LacO", "arrays", "enriched", "for", "53BP1", "or", "RASSF1A", "in", "(", "H", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "J", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "endonuclease", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "and", "γH2AX", ".", "Fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "RASSF1A", "(", "green", ")", "and", "γH2AX", "(", "red", ")", "signals", "across", "the", "HeLa", "nuclei", "are", "shown", ".", "Position", "of", "line", "scan", "indicated", "by", "the", "yellow", "line", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) HeLa cells were exposed to 5 Gy ionizing radiation (γIR), collected at the indicated time points and stained for RASSF1A and γH2AX. Images for representative intra-nuclear RASSF1A foci distribution are shown. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines.(B) Quantification of the number of cells with RASSF1A foci at the time points presented in (A). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(C) HeLa cells were treated with 5 Gy γIR and 2 h post treatment fixed and stained with the indicated antibodies. (D) HeLa cells were irradiated with 5 Gy and 2 h post treatment stained for RASSF1A (R1A) and NUCLEOLIN (NCL). (E) HeLa cells were treated with 50 ng/ml NCS for 30 min, washed and 2 h later fixed and stained with the indicated antibodies. The distance of RASSF1A+/γH2AX+ foci or RASSF1A-/γH2AX+ foci to the closest nucleolus (based on Fibrillarin (Fb) staining) was measured. Middle line represents the median and the boxes 25th and 75th percentiles. The whiskers mark the smallest and largest values.(F) AsiSI expression in U2OS cells was induced by OHT and cells were stained for RASSF1A and γH2AX. Boxed areas are shown in higher magnification. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines. (G) Quantification of the number of cells with RASSF1A foci in (F). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(H) U2OS cells with stable integration of a Lac operator (LacO) sequence adjacent to an I-SceI endonuclease site were transfected with Lac Repressor (LacR)-mCherry and GFP or GFP-NLS-HA-I-SceI. 24 h post transfection cells were fixed and stained for 53BP1 or RASSF1A. (I) Quantification of the LacO arrays enriched for 53BP1 or RASSF1A in (H). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(J) HeLa cells were transfected with I-PpoI endonuclease and stained for RASSF1A and γH2AX. Fluorescence intensity profiles of RASSF1A (green) and γH2AX (red) signals across the HeLa nuclei are shown. Position of line scan indicated by the yellow line."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Cells", "were", "co", "-", "stained", "for", "RASSF1A", "(", "R1A", ")", "and", "NBS1", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "in", "higher", "magnification", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Assessment", "of", "RASSF1A", "localisation", "after", "induction", "of", "rDNA", "DSBs", "using", "the", "I", "-", "PpoI", "endonuclease", "in", "methanol", "fixed", "HeLa", "cells", ".", "Fluorescence", "intensity", "profile", "of", "RASSF1A", "(", "green", ")", "and", "LAMIN", "A", "/", "C", "(", "red", ")", "signals", "across", "the", "HeLa", "nuclei", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "rDNA", "DSBs", "in", "control", "and", "I", "-", "PpoI", "treated", "cells", ".", "Position", "of", "line", "scan", "indicated", "by", "the", "yellow", "line", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "6", "h", "later", "stained", "for", "RASSF1A", "-", "pS131", "(", "R1A", "-", "pS131", ")", "and", "γH2AX", ".", "Fluorescence", "intensity", "profile", "of", "RASSF1A", "-", "pS131", "(", "green", ")", "and", "γH2AX", "(", "red", ")", "signals", "across", "the", "HeLa", "nuclei", "are", "shown", ".", "Position", "of", "line", "scan", "indicated", "by", "the", "yellow", "line", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "cells", "with", "RASSF1A", "-", "pS131", "positive", "nucleolar", "caps", "6", "h", "post", "I", "-", "PpoI", "transfection", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "Fig", "EV3A", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "the", "ATMi", "or", "ATRi", "prior", "to", "transfection", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "6", "h", "post", "mRNA", "transfection", "cells", "were", "stained", "for", "RASSF1A", "-", "pS131", "(", "R1A", "-", "pS131", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "(", "F", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "ATM", "inhibitor", "(", "ATMi", ")", "followed", "by", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "transfection", "and", "6", "h", "later", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "for", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "I", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "ATMi", "followed", "by", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "transfection", "and", "6", "h", "later", "cells", "were", "fixed", "and", "RASSF1A", "recruitment", "at", "rDNA", "DSBs", "was", "assessed", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "(", "I", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) HeLa cells were transfected with I-PpoI mRNA and collected at the indicated time points. Cells were co-stained for RASSF1A (R1A) and NBS1. Boxed areas are shown in higher magnification. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines. (B) Quantification of (A). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(C) Assessment of RASSF1A localisation after induction of rDNA DSBs using the I-PpoI endonuclease in methanol fixed HeLa cells. Fluorescence intensity profile of RASSF1A (green) and LAMIN A/C (red) signals across the HeLa nuclei in the presence and absence of rDNA DSBs in control and I-PpoI treated cells. Position of line scan indicated by the yellow line.(D) HeLa cells were transfected with the I-PpoI mRNA and 6 h later stained for RASSF1A-pS131 (R1A-pS131) and γH2AX. Fluorescence intensity profile of RASSF1A-pS131 (green) and γH2AX (red) signals across the HeLa nuclei are shown. Position of line scan indicated by the yellow line.(E) Quantification of cells with RASSF1A-pS131 positive nucleolar caps 6 h post I-PpoI transfection. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments. Representative images are shown in Fig EV3A.(F) HeLa cells were treated with the ATMi or ATRi prior to transfection with I-PpoI mRNA. 6 h post mRNA transfection cells were stained for RASSF1A-pS131 (R1A-pS131). (G) Quantification of (F). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(H) HeLa cells were treated or not with ATM inhibitor (ATMi) followed by I-PpoI mRNA transfection and 6 h later cell lysates were analyzed by western blot for the indicated antibodies.(I) HeLa cells were treated or not with ATMi followed by I-PpoI mRNA transfection and 6 h later cells were fixed and RASSF1A recruitment at rDNA DSBs was assessed. (J) Quantification of (I). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "with", "I", "-", "PpoI", "induced", "rDNA", "breaks", "were", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Intra", "-", "nucleolar", "cap", "localization", "for", "RASSF1A", "and", "53BP1", "in", "correlation", "with", "other", "proteins", "was", "accessed", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "in", "higher", "magnification", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "and", "53BP1", ".", "Fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "RASSF1A", "(", "green", ")", "and", "53BP1", "(", "red", ")", "signals", "across", "the", "HeLa", "nuclei", "are", "shown", ".", "Position", "of", "line", "scan", "indicated", "by", "the", "yellow", "line", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siRNAs", "against", "LUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "53BP1", "(", "si53BP1", ")", ",", "48", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "(", "R1A", ")", "and", "γH2AX", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "(", "C", ")", "and", "western", "blot", "analysis", "from", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "si53BP1", "treated", "cells", "for", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siRNAs", "against", "LUSIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "RNF8", "(", "siRNF8", ")", ",", "48", "h", "later", "transfected", "for", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "and", "γH2AX", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "(", "E", ")", "and", "western", "blot", "analysis", "from", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siRNF8", "treated", "cells", "for", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siRNA", "against", "53BP1", ",", "or", "an", "ATM", "inhibitor", "(", "ATMi", ")", "followed", "by", "5", "Gy", "of", "ionizing", "radiation", "(", "γIR", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", "2", "h", "post", "treatment", "and", "stained", "for", "RASSF1A", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "cells", "with", "RASSF1A", "foci", "in", "(", "G", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "Western", "blot", "analysis", "from", "total", "cell", "extracts", "with", "the", "indicated", "treatments", "and", "RASSF1A", "immuneprecipitates", "(", "IPs", ")", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", "immunoprecipitation", "served", "as", "a", "control", ".", "(", "J", ")", "Western", "blot", "analysis", "from", "total", "cell", "extracts", "and", "RASSF1A", "immunoprecipitates", "with", "the", "indicated", "treatments", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", "immunoprecipitation", "served", "as", "a", "control", ".", "(", "K", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "RASSF1A", "(", "FLAG", "-", "R1A", ")", ",", "FLAG", "-", "RASSF1A131A", "(", "FLAG", "-", "R1A131A", ")", "or", "pcDNA3", "and", "24", "h", "later", "transfected", "with", "the", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "against", "FLAG", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "total", "cell", "extracts", "and", "the", "IPs", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) HeLa cells with I-PpoI induced rDNA breaks were stained with the indicated antibodies. Intra-nucleolar cap localization for RASSF1A and 53BP1 in correlation with other proteins was accessed. Boxed areas are shown in higher magnification.(B) HeLa cells were transfected with I-PpoI mRNA and stained for RASSF1A and 53BP1. Fluorescence intensity profiles of RASSF1A (green) and 53BP1 (red) signals across the HeLa nuclei are shown. Position of line scan indicated by the yellow line.(C) HeLa cells were treated with siRNAs against LUCIFERASE (siLUC) or 53BP1 (si53BP1), 48 h later transfected with I-PpoI mRNA, fixed and stained for RASSF1A (R1A) and γH2AX. (D) Quantification of (C) and western blot analysis from siLUCIFERASE (siLUC) or si53BP1 treated cells for the indicated antibodies. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(E) HeLa cells were treated with siRNAs against LUSIFERASE (siLUC) or RNF8 (siRNF8), 48 h later transfected for I-PpoI mRNA, fixed and stained for RASSF1A and γH2AX. (F) Quantification of (E) and western blot analysis from siLUCIFERASE (siLUC) or siRNF8 treated cells for the indicated antibodies. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(G) HeLa cells were treated with siRNA against 53BP1, or an ATM inhibitor (ATMi) followed by 5 Gy of ionizing radiation (γIR). Cells were fixed 2 h post treatment and stained for RASSF1A. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines. (H) Quantification of cells with RASSF1A foci in (G). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(I) Western blot analysis from total cell extracts with the indicated treatments and RASSF1A immuneprecipitates (IPs) with the indicated antibodies. IgG immunoprecipitation served as a control.(J) Western blot analysis from total cell extracts and RASSF1A immunoprecipitates with the indicated treatments with the indicated antibodies. IgG immunoprecipitation served as a control.(K) U2OS cells were transfected with FLAG-RASSF1A (FLAG-R1A), FLAG-RASSF1A131A (FLAG-R1A131A) or pcDNA3 and 24 h later transfected with the I-PpoI mRNA. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation against FLAG. Western blot analysis of total cell extracts and the IPs is shown."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "53BP1WT", "(", "aa1", "-", "1972", ")", ",", "HA", "-", "53BP1ΔBRCT", "(", "aa", "1", "-", "1709", ")", ",", "HA", "-", "53BP1ΔΝterminus", "(", "aa", "921", "-", "1972", ")", "or", "empty", "pcDNA3", "vector", "and", "24", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "HA", "tag", "antibody", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "total", "cell", "extracts", "and", "the", "IPs", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "full", "length", "MYC", "-", "RASSF1A", "or", "with", "the", "indicated", "RASSF1A", "deletion", "mutants", "and", "24", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "a", "MYC", "-", "tag", "antibody", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "total", "cell", "extracts", "and", "the", "IPs", "is", "shown", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "si53BP1", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "stained", "for", "ATM", "-", "pS1981", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "(", "C", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "E", "-", "H", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "two", "different", "siRNAs", "against", "RASSF1A", "(", "siR1A", "_", "1", "and", "siR1A", "_", "2", ")", "and", "48", "h", "later", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "to", "induce", "rDNA", "DSBs", ".", "6", "h", "post", "mRNA", "transfection", ",", "cells", "were", "stained", "for", "V5", "to", "identify", "I", "-", "PpoI", "transfected", "cells", "and", "the", "other", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "images", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "quantification", "of", "staining", "(", "G", ",", "H", ")", "for", "the", "indicated", "antibodies", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", ",", "siRASSF1A", "or", "si53BP1", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "the", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "underwent", "ImmunoFISH", "against", "UBF", "and", "an", "rDNA", "probe", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "in", "higher", "magnification", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "J", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", ",", "siRASSF1A", "or", "si53BP1", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "the", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "underwent", "ImmunoFISH", "against", "ATM", "-", "pS1981", "and", "an", "rDNA", "probe", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "in", "higher", "magnification", ".", "Nucleolar", "boundaries", "are", "marked", "with", "dashed", "lines", ".", "(", "K", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siRASSF1A", "followed", "by", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "transfection", ".", "6", "h", "later", "cells", "were", "stained", "for", "53BP1", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "(", "K", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "M", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "340", ")", "or", "a", "RASSF1A", "mutant", "that", "lacks", "the", "SARAH", "domain", ",", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "288", ")", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "N", ")", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "340", ")", "or", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "288", ")", ".", "24", "h", "later", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "harvested", "after", "6", "h", ".", "Cell", "lysates", "underwent", "cell", "fractionation", "and", "the", "chromatin", "bound", "fraction", "was", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "(", "O", ")", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "siRNA", "against", "RASSF1A", "followed", "by", "transfection", "with", "MYC", "-", "tag", ",", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "340", ")", "or", "MYC", "-", "RASSF1A", "(", "1", "-", "288", ")", ".", "24", "h", "later", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "stained", "for", "MYC", "expression", "and", "ATM", "-", "pS1981", ".", "(", "P", ")", "Quantification", "of", "cells", "with", "ATM", "-", "pS1981", "positive", "nucleolar", "caps", "in", "(", "O", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) U2OS cells were transfected with either HA-53BP1WT (aa1-1972), HA-53BP1ΔBRCT (aa 1-1709), HA-53BP1ΔΝterminus (aa 921-1972) or empty pcDNA3 vector and 24 h later transfected with I-PpoI mRNA. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with an HA tag antibody. Western blot analysis of total cell extracts and the IPs is shown.(B) U2OS cells were transfected with either full length MYC-RASSF1A or with the indicated RASSF1A deletion mutants and 24 h later transfected with I-PpoI mRNA. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with a MYC-tag antibody. Western blot analysis of the total cell extracts and the IPs is shown.(C) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or si53BP1 and 48 h later transfected with I-PpoI mRNA and stained for ATM-pS1981. (D) Quantification of (C). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(E-H) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or two different siRNAs against RASSF1A (siR1A_1 and siR1A_2) and 48 h later cells were transfected with I-PpoI mRNA to induce rDNA DSBs. 6 h post mRNA transfection, cells were stained for V5 to identify I-PpoI transfected cells and the other indicated antibodies. Representative images (E, F) and quantification of staining (G, H) for the indicated antibodies are shown. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(I) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC), siRASSF1A or si53BP1 and 48 h later transfected with the I-PpoI mRNA. Cells were fixed and underwent ImmunoFISH against UBF and an rDNA probe. Boxed areas are shown in higher magnification. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines. (J) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC), siRASSF1A or si53BP1 and 48 h later transfected with the I-PpoI mRNA. Cells were fixed and underwent ImmunoFISH against ATM-pS1981 and an rDNA probe. Boxed areas are shown in higher magnification. Nucleolar boundaries are marked with dashed lines.(K) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or siRASSF1A followed by I-PpoI mRNA transfection. 6 h later cells were stained for 53BP1. (L) Quantification of (K). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(M) U2OS cells were transfected with MYC-RASSF1A (1-340) or a RASSF1A mutant that lacks the SARAH domain, MYC-RASSF1A (1-288). Cells were transfected with I-PpoI mRNA and stained with the indicated antibodies.(N) U2OS cells were transfected with MYC-RASSF1A (1-340) or MYC-RASSF1A (1-288). 24 h later cells were transfected with I-PpoI mRNA and harvested after 6 h. Cell lysates underwent cell fractionation and the chromatin bound fraction was analyzed by western blot.(O) U2OS cells were treated with siRNA against RASSF1A followed by transfection with MYC-tag, MYC-RASSF1A (1-340) or MYC-RASSF1A (1-288). 24 h later cells were transfected with I-PpoI mRNA and stained for MYC expression and ATM-pS1981.(P) Quantification of cells with ATM-pS1981 positive nucleolar caps in (O). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "ATMi", "or", "ATRi", "prior", "to", "transfection", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "RPA", "and", "quantified", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "ATMi", "or", "ATRi", "prior", "to", "transfection", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "RAD51", "and", "quantified", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "two", "different", "siRNAs", "against", "RASSF1A", "(", "siR1A", "_", "1", "and", "siR1A", "_", "2", ")", "and", "48", "h", "later", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "to", "induce", "rDNA", "DSBs", ".", "6", "h", "post", "mRNA", "transfection", ",", "cells", "were", "stained", "for", "V5", "to", "identify", "I", "-", "PpoI", "transfected", "cells", "and", "the", "other", "indicated", "antibodies", ".", "Representative", "images", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "quantification", "of", "staining", "(", "D", ",", "F", ")", "for", "the", "indicated", "antibodies", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "analysis", "from", "HeLa", "cell", "extracts", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "H", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "si53BP1", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "and", "stained", "for", "RPA", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "(", "H", ")", ".", "107", "values", "were", "analysed", "in", "siLUC", "and", "90", "values", "were", "analysed", "in", "si53BP1", ".", "(", "J", ")", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", ",", "siRASSF1A", "(", "siR1A", ")", "or", "si53BP1", ",", "treated", "with", "10", "μM", "BrdU", "for", "24", "h", "prior", "to", "I", "-", "PpoI", "mRNA", "transfection", ".", "6", "h", "post", "I", "-", "PpoI", "treated", "cells", "were", "pre", "-", "extracted", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "BrdU", "under", "non", "denaturing", "conditions", "to", "visualize", "ssDNA", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "(", "J", ")", ".", "Fold", "change", "of", "nuclear", "BrdU", "signal", "relative", "to", "siLUC", "is", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "L", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "endonuclease", "and", "stained", "for", "MST2", "and", "γH2AX", ".", "Fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "MST2", "(", "green", ")", "and", "γH2AX", "(", "red", ")", "signals", "across", "the", "HeLa", "nuclei", "are", "shown", ".", "Position", "of", "line", "scan", "indicated", "by", "the", "yellow", "line", ".", "(", "M", ")", "Validation", "of", "the", "MST2", "siRNA", "with", "western", "blot", ".", "(", "N", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siMST2", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "5", "-", "EU", "for", "30", "min", "prior", "to", "fixation", "and", "assessed", "for", "incorporation", ".", "(", "O", ")", "Quantification", "of", "5", "-", "EU", "intensity", "in", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siMST2", "treated", "cells", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Middle", "line", "represents", "the", "median", "and", "the", "boxes", "25th", "and", "75th", "percentiles", ".", "The", "whiskers", "mark", "the", "smallest", "and", "largest", "values", ".", "100", "values", "were", "analyzed", "in", "each", "condition", ".", "(", "P", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siMST2", "and", "48", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "6", "h", "post", "transfection", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "RASSF1A", "(", "R1A", ")", "and", "γH2AX", ".", "(", "Q", ")", "Quantification", "of", "(", "P", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "R", "-", "W", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "siLUCIFERASE", "(", "siLUC", ")", "or", "siMST2", "and", "48", "h", "later", "transfected", "with", "I", "-", "PpoI", "mRNA", ".", "Cells", "were", "stained", "for", "ATM", "-", "pS1981", "(", "R", ")", ",", "KAP1", "-", "pS824", "(", "T", ")", "and", "RPA", "(", "V", ")", "and", "quantified", "(", "S", ",", "U", ",", "W", ")", ".", "108", "values", "in", "(", "S", ")", ",", "95", "values", "in", "(", "U", ")", "and", "100", "values", "in", "(", "W", ")", "were", "analysed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HeLa cells were pre-treated with the ATMi or ATRi prior to transfection with I-PpoI mRNA. Cells were stained for RPA and quantified. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments. (B) HeLa cells were pre-treated with the ATMi or ATRi prior to transfection with I-PpoI mRNA. Cells were stained for RAD51 and quantified. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(C-F) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or two different siRNAs against RASSF1A (siR1A_1 and siR1A_2) and 48 h later cells were transfected with I-PpoI mRNA to induce rDNA DSBs. 6 h post mRNA transfection, cells were stained for V5 to identify I-PpoI transfected cells and the other indicated antibodies. Representative images (C, E) and quantification of staining (D, F) for the indicated antibodies are shown. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(G) Western blot analysis from HeLa cell extracts treated with the indicated siRNAs for the indicated antibodies.(H) Cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or si53BP1 and 48 h later transfected with I-PpoI mRNA and stained for RPA. (I) Quantification of (H). 107 values were analysed in siLUC and 90 values were analysed in si53BP1.(J) U2OS cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC), siRASSF1A (siR1A) or si53BP1, treated with 10 μM BrdU for 24 h prior to I-PpoI mRNA transfection. 6 h post I-PpoI treated cells were pre-extracted, fixed and stained for BrdU under non denaturing conditions to visualize ssDNA. (K) Quantification of (J). Fold change of nuclear BrdU signal relative to siLUC is shown. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(L) HeLa cells were transfected with I-PpoI endonuclease and stained for MST2 and γH2AX. Fluorescence intensity profiles of MST2 (green) and γH2AX (red) signals across the HeLa nuclei are shown. Position of line scan indicated by the yellow line.(M) Validation of the MST2 siRNA with western blot.(N) HeLa cells treated with siLUCIFERASE (siLUC) or siMST2 and 48 h later transfected with I-PpoI mRNA. Cells were treated with 5-EU for 30 min prior to fixation and assessed for incorporation. (O) Quantification of 5-EU intensity in siLUCIFERASE (siLUC) or siMST2 treated cells transfected with I-PpoI mRNA. Middle line represents the median and the boxes 25th and 75th percentiles. The whiskers mark the smallest and largest values. 100 values were analyzed in each condition.(P) HeLa cells were treated with siLUCIFERASE (siLUC) or siMST2 and 48 h post transfection cells were transfected with I-PpoI mRNA. 6 h post transfection cells were fixed and stained for RASSF1A (R1A) and γH2AX. (Q) Quantification of (P). Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(R-W) HeLa cells treated with siLUCIFERASE (siLUC) or siMST2 and 48 h later transfected with I-PpoI mRNA. Cells were stained for ATM-pS1981 (R), KAP1-pS824 (T) and RPA (V) and quantified (S, U, W). 108 values in (S), 95 values in (U) and 100 values in (W) were analysed."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "Β", ")", "Clonogenic", "survival", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "the", "indicated", "doses", "of", "Ionizing", "radiation", "(", "γIR", ")", ".", "Survival", "fraction", "was", "calculated", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Clonogenic", "survival", "analysis", "and", "representative", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "followed", "by", "I", "‐", "PpoI", "WT", "or", "I", "-", "PpoI", "H98A", "mRNA", "transfections", ".", "Survival", "ratio", "I", "-", "PpoI", "WT", "/", "I", "-", "PpoI", "H98A", "in", "each", "siRNA", "condition", "is", "presented", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "and", "derive", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "45S", "rDNA", "copy", "number", "analysis", "in", "patients", "'", "tumors", "compared", "to", "adjacent", "controls", "in", "the", "LUAD", "cohort", ".", "67", "tumor", "samples", "and", "43", "samples", "from", "adjacent", "tissue", "were", "analyzed", ".", "(", "F", ")", "45S", "rDNA", "copy", "number", "analysis", "in", "the", "LUAD", "patient", "samples", "based", "on", "RASSF1A", "CpG", "promoter", "methylation", ".", "67", "samples", "were", "analysed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(Β) Clonogenic survival analysis of HeLa cells treated with the indicated siRNAs and the indicated doses of Ionizing radiation (γIR). Survival fraction was calculated. Error bars represent SEM and derive from 3 independent experiments.(C) Clonogenic survival analysis and representative images of HeLa cells treated with the indicated siRNAs followed by I‐PpoI WT or I-PpoI H98A mRNA transfections. Survival ratio I-PpoI WT/I-PpoI H98A in each siRNA condition is presented. Error bars represent standard deviation and derive from 3 independent experiments.(E) 45S rDNA copy number analysis in patients' tumors compared to adjacent controls in the LUAD cohort. 67 tumor samples and 43 samples from adjacent tissue were analyzed. (F) 45S rDNA copy number analysis in the LUAD patient samples based on RASSF1A CpG promoter methylation. 67 samples were analysed."}
{"words": ["Figure", "2IE", "were", "isolated", "and", "binding", "to", "HBMEC", "and", "HDMEC", "was", "determined", "under", "flow", "conditions", ".", "Number", "of", "IE", "bound", "per", "mm2", "EC", "surface", "was", "calculated", "and", "shown", "is", "the", "mean", "±", "95", "%", "CI", "for", "26", "CM", "and", "33", "UM", "cases", "on", "HBMEC", "and", "21", "CM", "and", "35", "UM", "cases", "on", "HDMEC", "on", "a", "log", "scale", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "by", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "dotted", "line", "is", "20", "IE", "/", "mm2", ",", "the", "cut", "-", "off", "value", "for", "inclusion", "of", "the", "inhibition", "data", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2IE were isolated and binding to HBMEC and HDMEC was determined under flow conditions. Number of IE bound per mm2 EC surface was calculated and shown is the mean ± 95% CI for 26 CM and 33 UM cases on HBMEC and 21 CM and 35 UM cases on HDMEC on a log scale. P-value was calculated by two-tailed unpaired t-test. The dotted line is 20 IE/mm2, the cut-off value for inclusion of the inhibition data."}
{"words": ["Figure", "3IE", "were", "isolated", "and", "binding", "to", "HBMEC", "and", "HDMEC", "was", "determined", "under", "flow", "conditions", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "5", "µg", "/", "ml", "αICAM", "-", "1", "or", "αCD36", "antibody", "or", "50", "µg", "/", "ml", "rEPCR", ".", "Number", "of", "IE", "bound", "per", "mm2", "EC", "surface", "was", "determined", ".", "IE", "were", "isolated", "and", "binding", "to", "HBMEC", "and", "HDMEC", "was", "determined", "under", "flow", "conditions", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "5", "µg", "/", "ml", "αICAM", "-", "1", "or", "αCD36", "antibody", "or", "50", "µg", "/", "ml", "rEPCR", ".", "Number", "of", "IE", "bound", "per", "mm2", "EC", "surface", "was", "determined", ".", "Using", "the", "same", "data", ",", "percentage", "inhibition", "by", "αICAM", "-", "1", "antibody", "was", "calculated", "relatively", "to", "binding", "in", "the", "absence", "of", "antibody", ".", "Using", "the", "same", "data", ",", "percentage", "inhibition", "by", "rEPCR", "was", "calculated", "relatively", "to", "binding", "in", "the", "absence", "of", "inhibitor", ".", "Using", "the", "same", "data", ",", "percentage", "inhibition", "by", "αCD36", "antibody", "was", "calculated", "relatively", "to", "binding", "in", "the", "absence", "of", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3IE were isolated and binding to HBMEC and HDMEC was determined under flow conditions in the absence and presence of 5 µg/ml αICAM-1 or αCD36 antibody or 50 µg/ml rEPCR. Number of IE bound per mm2 EC surface was determined.IE were isolated and binding to HBMEC and HDMEC was determined under flow conditions in the absence and presence of 5 µg/ml αICAM-1 or αCD36 antibody or 50 µg/ml rEPCR. Number of IE bound per mm2 EC surface was determined. Using the same data, percentage inhibition by αICAM-1 antibody was calculated relatively to binding in the absence of antibody. Using the same data, percentage inhibition by rEPCR was calculated relatively to binding in the absence of inhibitor. Using the same data, percentage inhibition by αCD36 antibody was calculated relatively to binding in the absence of antibody."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Ventricular", "weight", "to", "tibia", "length", "ratio", "(", "VW", "/", "TL", ")", "of", "littermate", "control", "(", "LC", ")", "or", "cardiomyocyte", "-", "specific", "NCoR1", "knockout", "(", "CMNKO", ")", "mice", ".", "n", "=", "10", ":", "9", ":", "12", ":", "7", ".", "(", "B", ")", "Ventricular", "weight", "to", "body", "weight", "ratio", "(", "VW", "/", "BW", ")", "of", "LC", "or", "CMNKO", "mice", ".", "n", "=", "10", ":", "8", ":", "12", ":", "7", ".", "(", "C", ")", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "of", "cross", "sections", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "wheat", "germ", "agglutinin", "(", "WGA", ")", "staining", "of", "cross", "section", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "cardiomyocyte", "size", ".", "n", "=", "11", ":", "10", ":", "8", ":", "8", ".", "(", "F", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "hypertrophy", "-", "related", "genes", "in", "left", "ventricles", ".", "n", "=", "9", ":", "9", ":", "11", ":", "8", ".", "(", "G", ")", "Ejection", "fraction", "measured", "by", "echocardiography", ".", "n", "=", "9", ":", "7", ":", "14", ":", "10", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "H", ")", "Fractional", "shortening", "measured", "by", "echocardiography", ".", "n", "=", "9", ":", "7", ":", "14", ":", "10", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Ventricular weight to tibia length ratio (VW/TL) of littermate control (LC) or cardiomyocyte-specific NCoR1 knockout (CMNKO) mice. n=10:9:12:7.(B) Ventricular weight to body weight ratio (VW/BW) of LC or CMNKO mice. n=10:8:12:7.(C) Representative H&E staining of cross sections of left ventricles. Scale bar: 50μm.(D) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of cross section of left ventricles. Scale bar: 10μm.(E) Quantification of cardiomyocyte size. n=11:10:8:8.(F) qRT-PCR analysis of hypertrophy-related genes in left ventricles. n=9:9:11:8.(G) Ejection fraction measured by echocardiography. n=9:7:14:10. Student's t test was used for statistical analysis.(H) Fractional shortening measured by echocardiography. n=9:7:14:10. Student's t test was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "hearts", "from", "LC", "or", "CMNKO", "mice", "subjected", "to", "sham", "operation", "or", "AAC", "for", "2", "weeks", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5cm", ".", "(", "B", ")", "VW", "/", "BW", "of", "LC", "or", "CMNKO", "mice", "2", "weeks", "after", "sham", "operation", "or", "AAC", ".", "n", "=", "9", ":", "9", ":", "16", ":", "15", ".", "(", "C", ")", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "of", "cross", "sections", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "25μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "WGA", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "cardiomyocyte", "size", ".", "n", "=", "10", ":", "10", ":", "8", ":", "9", ".", "(", "F", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "hypertrophy", "-", "related", "genes", "in", "left", "ventricles", ".", "n", "=", "8", ":", "7", ":", "15", ":", "15", ".", "(", "G", ")", "Representative", "picrosirius", "red", "staining", "of", "cross", "sections", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "fibrotic", "areas", ".", "n", "=", "11", ":", "10", ":", "10", ":", "9", ".", "(", "I", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "fibrosis", "-", "related", "genes", "in", "left", "ventricles", ".", "n", "=", "8", ":", "7", ":", "15", ":", "15", ".", "(", "J", ")", "Ejection", "fraction", "measured", "by", "echocardiography", ".", "n", "=", "9", ":", "7", ":", "14", ":", "12", ".", "(", "K", ")", "Fractional", "shortening", "measured", "by", "echocardiography", ".", "n", "=", "9", ":", "7", ":", "14", ":", "12", ".", "(", "L", ")", "Lung", "weight", "to", "body", "weight", "ratio", "(", "LW", "/", "BW", ")", "of", "LC", "or", "CMNKO", "mice", "2", "weeks", "after", "sham", "operation", "or", "AAC", ".", "n", "=", "8", ":", "7", ":", "16", ":", "15", ".", "(", "M", ")", "Cumulative", "survival", "rate", "of", "LC", "or", "CMNKO", "mice", "subjected", "to", "AAC", ".", "n", "=", "12", ":", "10", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of hearts from LC or CMNKO mice subjected to sham operation or AAC for 2 weeks. Scale bar: 0.5cm.(B) VW/BW of LC or CMNKO mice 2 weeks after sham operation or AAC. n=9:9:16:15.(C) Representative H&E staining of cross sections of left ventricles. Scale bar: 25μm.(D) Representative WGA staining. Scale bar: 10μm.(E) Quantification of cardiomyocyte size. n=10:10:8:9.(F) qRT-PCR analysis of hypertrophy-related genes in left ventricles. n=8:7:15:15.(G) Representative picrosirius red staining of cross sections of left ventricles. Scale bar: 50μm.(H) Quantification of fibrotic areas. n=11:10:10:9.(I) qRT-PCR analysis of fibrosis-related genes in left ventricles. n=8:7:15:15.(J) Ejection fraction measured by echocardiography. n=9:7:14:12.(K) Fractional shortening measured by echocardiography. n=9:7:14:12.(L) Lung weight to body weight ratio (LW/BW) of LC or CMNKO mice 2 weeks after sham operation or AAC. n=8:7:16:15.(M) Cumulative survival rate of LC or CMNKO mice subjected to AAC. n=12:10. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "NCoR1", "in", "neonatal", "rat", "ventricular", "myocytes", "(", "NRVMs", ")", "transfected", "with", "siControl", "or", "siNCoR1", "for", "3", "days", ".", "siControl", "indicates", "control", "siRNA", ";", "siNCoR1", ",", "NCoR1", "siRNA", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "Actinin", "in", "NRVMs", "transfected", "with", "siRNA", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "(", "H2O", ")", "or", "phenylephrine", "(", "PE", ")", "for", "another", "48h", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "area", "of", "α", "-", "Actinin", "-", "positive", "NRVMs", "with", "or", "without", "NCoR1", "knockdown", ".", "A", "total", "of", "40", "NRVMs", "was", "randomly", "chosen", "from", "4", "replicate", "coverslips", "for", "each", "group", "and", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "NRVMs", "with", "or", "without", "NCoR1", "knockdown", ".", "n", "=", "4", ":", "4", ".", "(", "E", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "NCoR1", "-", "flag", "in", "NRVMs", "infected", "by", "control", "lentivirus", "(", "Control", ")", "or", "NCoR1", "-", "flag", "lentivirus", "(", "NCoR1", "-", "OV", ")", "for", "4", "days", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "Actinin", "in", "NRVMs", "infected", "with", "lentivirus", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "or", "PE", "for", "another", "48h", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "area", "of", "α", "-", "Actinin", "-", "positive", "NRVMs", "with", "or", "without", "NCoR1", "overexpression", ".", "A", "total", "of", "30", "NRVMs", "was", "randomly", "chosen", "from", "3", "replicate", "coverslips", "for", "each", "group", "and", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "NRVMs", "with", "or", "without", "NCoR1", "overexpression", ".", "n", "=", "4", ":", "3", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Western blotting analysis of NCoR1 in neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) transfected with siControl or siNCoR1 for 3 days. siControl indicates control siRNA; siNCoR1, NCoR1 siRNA.(B) Representative immunofluorescence staining of α-Actinin in NRVMs transfected with siRNA for 48h and then treated with vehicle (H2O) or phenylephrine (PE) for another 48h. Scale bar: 50μm.(C) Quantification of the surface area of α-Actinin-positive NRVMs with or without NCoR1 knockdown. A total of 40 NRVMs was randomly chosen from 4 replicate coverslips for each group and used for statistical analysis.(D) qRT-PCR analysis of Acta1 and Nppa in NRVMs with or without NCoR1 knockdown. n=4:4.(E) Western blotting analysis of NCoR1-flag in NRVMs infected by control lentivirus (Control) or NCoR1-flag lentivirus (NCoR1-OV) for 4 days.(F) Representative immunofluorescence staining of α-Actinin in NRVMs infected with lentivirus for 48h and then treated with vehicle or PE for another 48h. Scale bar: 50μm.(G) Quantification of the surface area of α-Actinin-positive NRVMs with or without NCoR1 overexpression. A total of 30 NRVMs was randomly chosen from 3 replicate coverslips for each group and used for statistical analysis.(H) qRT-PCR analysis of Acta1 and Nppa in NRVMs with or without NCoR1 overexpression. n=4:3. Data represent three independent experiments. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "Actinin", "in", "NRVMs", "transfected", "with", "siRNA", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "(", "H2O", ")", "or", "PE", "for", "another", "48h", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "siMEF2a", "indicates", "MEF2a", "siRNA", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "area", "of", "α", "-", "Actinin", "-", "positive", "NRVMs", "with", "or", "without", "knockdown", "of", "NCoR1", "and", "/", "or", "MEF2a", ".", "A", "total", "of", "15", "-", "20", "NRVMs", "was", "randomly", "chosen", "from", "3", "replicate", "coverslips", "for", "each", "group", "and", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "Actinin", "in", "NRVMs", "transfected", "with", "siRNA", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "or", "PE", "for", "another", "48h", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "siMEF2d", "indicates", "MEF2d", "siRNA", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "area", "of", "α", "-", "Actinin", "-", "positive", "NRVMs", "with", "or", "without", "knockdown", "of", "NCoR1", "and", "/", "or", "MEF2d", ".", "A", "total", "of", "15", "-", "19", "NRVMs", "was", "randomly", "chosen", "from", "3", "replicate", "coverslips", "for", "each", "group", "and", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "E", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "NRVMs", ".", "n", "=", "4", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative immunofluorescence staining of α-Actinin in NRVMs transfected with siRNA for 48h and then treated with vehicle (H2O) or PE for another 48h. Scale bar: 50μm. siMEF2a indicates MEF2a siRNA.(B) Quantification of the surface area of α-Actinin-positive NRVMs with or without knockdown of NCoR1 and/or MEF2a. A total of 15-20 NRVMs was randomly chosen from 3 replicate coverslips for each group and used for statistical analysis.(C) Representative immunofluorescence staining of α-Actinin in NRVMs transfected with siRNA for 48h and then treated with vehicle or PE for another 48h. Scale bar: 50μm. siMEF2d indicates MEF2d siRNA.(D) Quantification of the surface area of α-Actinin-positive NRVMs with or without knockdown of NCoR1 and/or MEF2d. A total of 15-19 NRVMs was randomly chosen from 3 replicate coverslips for each group and used for statistical analysis.(E) qRT-PCR analysis of Acta1 and Nppa in NRVMs. n=4. Data represent three independent experiments. Student's t test was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Luciferase", "assays", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "promoters", "in", "HEK293FT", "cells", "transfected", "with", "NCoR1", "-", "Flag", "and", "/", "or", "MEF2a", "-", "HA", "or", "with", "empty", "plasmids", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "B", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "analysis", "of", "NCoR1", "and", "MEF2a", "in", "HEK293FT", "cells", "transfected", "with", "full", "-", "length", "NCoR1", "-", "Flag", "and", "MEF2a", "-", "HA", ".", "(", "C", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "NCoR1", "and", "truncated", "MEF2a", "in", "HEK293FT", "cells", ".", "Schematic", "illustration", "of", "MEF2a", "-", "HA", "construct", "is", "shown", "above", "the", "Co", "-", "IP", "results", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "MEF2a", "and", "truncated", "NCoR1", "in", "HEK293FT", "cells", ".", "Schematic", "illustration", "of", "NCoR1", "-", "Flag", "construct", "is", "shown", "above", "the", "Co", "-", "IP", "results", ".", "(", "E", ")", "Luciferase", "assays", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "promoters", "in", "HEK293FT", "cells", "transfected", "with", "full", "-", "length", "MEF2a", "and", "domain", "-", "specific", "NCoR1", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "F", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "NCoR1", "-", "flag", "in", "NRVMs", "infected", "by", "control", "lentivirus", "(", "Control", ")", "or", "NCoR1", "(", "1939", "-", "2453", ")", "-", "flag", "lentivirus", "[", "NCoR1", "(", "1939", "-", "2453", ")", "-", "OV", "]", "for", "4", "days", ".", "(", "G", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "α", "-", "Actinin", "in", "NRVMs", "infected", "with", "lentivirus", "for", "48h", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "PE", "for", "another", "48h", ".", "Scale", "bar", ":", "50μm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "area", "of", "α", "-", "Actinin", "-", "positive", "NRVMs", ".", "A", "total", "of", "30", "NRVMs", "was", "randomly", "chosen", "from", "3", "replicate", "coverslips", "for", "each", "group", "and", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "I", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "NRVMs", ".", "n", "=", "4", ":", "4", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Luciferase assays of Acta1 and Nppa promoters in HEK293FT cells transfected with NCoR1-Flag and/or MEF2a-HA or with empty plasmids. Student's t test was used for statistical analysis(B) Co-immunoprecipitation (Co-IP) analysis of NCoR1 and MEF2a in HEK293FT cells transfected with full-length NCoR1-Flag and MEF2a-HA.(C) Co-IP analysis of NCoR1 and truncated MEF2a in HEK293FT cells. Schematic illustration of MEF2a-HA construct is shown above the Co-IP results.(D) Co-IP analysis of MEF2a and truncated NCoR1 in HEK293FT cells. Schematic illustration of NCoR1-Flag construct is shown above the Co-IP results.(E) Luciferase assays of Acta1 and Nppa promoters in HEK293FT cells transfected with full-length MEF2a and domain-specific NCoR1. Student's t test was used for statistical analysis(F) Western blotting analysis of NCoR1-flag in NRVMs infected by control lentivirus (Control) or NCoR1 (1939-2453)-flag lentivirus [NCoR1(1939-2453)-OV] for 4 days.(G) Representative immunofluorescence staining of α-Actinin in NRVMs infected with lentivirus for 48h and then treated with vehicle (DMSO) or PE for another 48h. Scale bar: 50μm.(H) Quantification of the surface area of α-Actinin-positive NRVMs. A total of 30 NRVMs was randomly chosen from 3 replicate coverslips for each group and used for statistical analysis. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis(I) qRT-PCR analysis of Acta1 and Nppa in NRVMs. n=4:4. Data represent three independent experiments. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "ChIP", "analysis", "showing", "enrichment", "of", "NCoR1", "in", "MEF2", "binding", "regions", "on", "the", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "(", "B", ")", "ChIP", "analysis", "of", "enrichment", "of", "MEF2a", "on", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "n", "=", "3", ":", "3", ".", "ChIP", "analysis", "of", "enrichment", "of", "HDAC4", "(", "C", ")", "on", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "n", "=", "4", ":", "4", "for", "(", "C", ")", "ChIP", "analysis", "of", "enrichment", "of", "HDAC5", "(", "D", ")", "on", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "n", "=", "3", ":", "3", "for", "(", "DChIP", "analysis", "of", "enrichment", "of", ",", "acetylated", "-", "Histone", "4", "(", "ac", "-", "H4", ")", "(", "E", ")", "on", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", ",", "n", "=", "3", ":", "3ChIP", "analysis", "of", "enrichment", "of", "ac", "-", "H3", "(", "F", ")", "on", "promoters", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "n", "=", "3", ":", "3", "(", "G", ")", "ChIP", "analysis", "of", "RNA", "Polymerase", "II", "enrichment", "on", "the", "transcriptional", "regions", "of", "Acta1", "and", "Nppa", "in", "ventricular", "samples", ".", "n", "=", "3", ":", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) ChIP analysis showing enrichment of NCoR1 in MEF2 binding regions on the promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples.(B) ChIP analysis of enrichment of MEF2a on promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples. n=3:3.ChIP analysis of enrichment of HDAC4 (C) on promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples. n=4:4 for (C)ChIP analysis of enrichment of HDAC5 (D) on promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples. n=3:3 for (DChIP analysis of enrichment of , acetylated-Histone 4 (ac-H4) (E) on promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples. , n=3:3ChIP analysis of enrichment of ac-H3 (F) on promoters of Acta1 and Nppa in ventricular samples. n=3:3(G) ChIP analysis of RNA Polymerase II enrichment on the transcriptional regions of Acta1 and Nppa in ventricular samples. n=3:3."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "RIDs", "of", "NCoR1", "in", "left", "ventricular", "samples", "from", "mice", "infected", "with", "AAV9", "GFP", "or", "AAV9", "NCoR1", "-", "RIDs", "(", "1939", "-", "2453", ")", "-", "Flag", ".", "(", "B", ")", "VW", "/", "BW", "of", "mice", "2", "weeks", "after", "sham", "operation", "or", "AAC", ".", "n", "=", "7", ":", "7", ":", "12", ":", "12", ".", "(", "C", ")", "Representative", "H", "&", "E", "staining", "of", "cross", "sections", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "WGA", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "cardiomyocyte", "size", ".", "n", "=", "6", ":", "6", ":", "7", ":", "8", ".", "(", "F", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "hypertrophy", "-", "related", "genes", "in", "left", "ventricles", ".", "n", "=", "8", ":", "8", ":", "11", ":", "11", ".", "(", "G", ")", "Representative", "picrosirius", "red", "staining", "of", "cross", "sections", "of", "left", "ventricles", ".", "Scale", "bar", ":", "20μm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "fibrotic", "areas", ".", "n", "=", "5", ":", "5", ":", "7", ":", "7", ".", "(", "I", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "fibrosis", "-", "related", "genes", "in", "left", "ventricles", ".", "n", "=", "8", ":", "8", ":", "11", ":", "11", ".", "(", "J", ")", "Ejection", "fraction", "measured", "before", ",", "2", "weeks", "and", "4", "weeks", "after", "AAC", ".", "n", "=", "6", ":", "6", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "(", "K", ")", "Fractional", "shortening", "measured", "before", ",", "2", "weeks", "and", "4", "weeks", "after", "AAC", ".", "n", "=", "6", ":", "6", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferoni", "post", "-", "tests", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blotting analysis of RIDs of NCoR1 in left ventricular samples from mice infected with AAV9 GFP or AAV9 NCoR1-RIDs (1939-2453)-Flag.(B) VW/BW of mice 2 weeks after sham operation or AAC. n=7:7:12:12.(C) Representative H&E staining of cross sections of left ventricles. Scale bar: 10μm.(D) Representative WGA staining. Scale bar: 10μm.(E) Quantification of cardiomyocyte size. n=6:6:7:8.(F) qRT-PCR analysis of hypertrophy-related genes in left ventricles. n=8:8:11:11.(G) Representative picrosirius red staining of cross sections of left ventricles. Scale bar: 20μm.(H) Quantification of fibrotic areas. n=5:5:7:7.(I) qRT-PCR analysis of fibrosis-related genes in left ventricles. n=8:8:11:11.(J) Ejection fraction measured before, 2 weeks and 4 weeks after AAC. n=6:6. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis.(K) Fractional shortening measured before, 2 weeks and 4 weeks after AAC. n=6:6. Two-way ANOVA followed by Bonferoni post-tests was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "1", "A", "TUNEL", "assay", "comparing", "apoptotic", "cells", "in", "Miwi", "+", "/", "-", "and", "Miwi", "-", "/", "-", "testis", "during", "diakinesis", ".", "Blue", ",", "DAPI", ";", "Green", ",", "TUNEL", "labeling", ".", "Asterisk", "indicates", "TUNEL", "-", "positive", "stained", "cells", "in", "the", "meiotic", "metaphase", "stage", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "B", ",", "C", "Meiotic", "metaphase", "I", "plate", "in", "FACS", "-", "sorted", "Miwi", "heterozygous", "(", "B", ")", "and", "knockout", "(", "C", ")", "spermatocytes", ".", "Green", ":", "phospho", "-", "histone", "H3", ";", "red", ":", "α", "/", "β", "-", "tubulin", ".", "Asterisk", "indicates", "misaligned", "chromosome", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "D", "Frequency", "of", "abnormal", "arrangement", "in", "the", "meiotic", "metaphase", "I", "plate", ".", "White", ",", "Miwi", "heterozygous", ";", "Light", "gray", ",", "Miwi", "knockout", ".", "Three", "mice", "were", "used", "for", "each", "genotype", ",", "total", "numbers", "of", "counted", "metaphase", "I", "plate", "in", "Miwi", "heterozygous", "and", "knockout", "are", "113", "and", "181", ",", "respectively", ".", "E", ",", "F", "Meiotic", "metaphase", "II", "spread", "preparations", "of", "Miwi", "heterozygous", "(", "E", ")", "and", "knockout", "(", "F", ")", "spermatocytes", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "G", "Frequency", "of", "meiotic", "metaphase", "II", "(", "MII", ")", "cells", "with", "chromosomal", "abnormalities", ".", "Chromosome", "counts", "were", "defined", "as", "the", "number", "of", "paired", "sister", "chromatids", "per", "MII", "metaphase", "cell", ".", "The", "frequency", "was", "calculated", "as", "the", "number", "of", "cells", "with", "given", "pairs", "of", "sister", "chromatids", "(", "20", ",", "<", "20", ",", "or", ">", "20", ")", "divided", "by", "the", "total", "number", "of", "cells", ".", "Three", "mice", "were", "used", "for", "each", "genotype", ",", "total", "numbers", "of", "counted", "MII", "cells", "in", "Miwi", "heterozygous", "and", "knockout", "are", "204", "and", "302", ",", "respectively", ".", "H", ",", "I", "Meiotic", "metaphase", "I", "spread", "preparations", "of", "Miwi", "heterozygous", "(", "H", ")", "and", "knockout", "(", "I", ")", "spermatocytes", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "J", "Frequency", "of", "meiotic", "metaphase", "I", "(", "MI", ")", "cells", "with", "chromosomal", "abnormalities", ".", "Chromosome", "counts", "were", "defined", "as", "the", "number", "of", "paired", "homologous", "chromosomes", "per", "MI", "metaphase", "cells", ".", "The", "frequency", "was", "calculated", "in", "the", "same", "way", "as", "in", "(", "G", ")", ",", "except", "for", "that", "the", "number", "of", "paired", "chromosomes", "was", "counted", "instead", ".", "Three", "mice", "were", "used", "for", "each", "genotype", ",", "total", "numbers", "of", "counted", "MI", "cells", "in", "Miwi", "heterozygous", "and", "knockout", "are", "265", "and", "358", ",", "respectively", ".", "K", ",", "L", "Mitotic", "metaphase", "spread", "preparations", "of", "Miwi", "heterozygous", "(", "K", ")", "and", "knockout", "(", "L", ")", "testes", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "M", "Frequency", "of", "mitotic", "metaphase", "cells", "with", "chromosomal", "abnormalities", ".", "Chromosome", "counts", "were", "defined", "as", "the", "number", "of", "chromosomes", "per", "mitotic", "metaphase", "cell", ".", "Three", "mice", "were", "used", "for", "each", "genotype", ",", "total", "numbers", "of", "counted", "mitotic", "metaphase", "cells", "in", "Miwi", "heterozygous", "and", "knockout", "are", "52", "and", "71", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 A TUNEL assay comparing apoptotic cells in Miwi+/- and Miwi-/- testis during diakinesis. Blue, DAPI; Green, TUNEL labeling. Asterisk indicates TUNEL-positive stained cells in the meiotic metaphase stage. Scale bars, 10 μm.  B, C Meiotic metaphase I plate in FACS-sorted Miwi heterozygous (B) and knockout (C) spermatocytes. Green: phospho-histone H3; red: α/β-tubulin. Asterisk indicates misaligned chromosome. Scale bars, 10 μm. D Frequency of abnormal arrangement in the meiotic metaphase I plate. White, Miwi heterozygous; Light gray, Miwi knockout. Three mice were used for each genotype, total numbers of counted metaphase I plate in Miwi heterozygous and knockout are 113 and 181, respectively.  E, F Meiotic metaphase II spread preparations of Miwi heterozygous (E) and knockout (F) spermatocytes. Scale bars, 5 μm. G Frequency of meiotic metaphase II (MII) cells with chromosomal abnormalities. Chromosome counts were defined as the number of paired sister chromatids per MII metaphase cell. The frequency was calculated as the number of cells with given pairs of sister chromatids (20, <20, or >20) divided by the total number of cells. Three mice were used for each genotype, total numbers of counted MII cells in Miwi heterozygous and knockout are 204 and 302, respectively.  H, I Meiotic metaphase I spread preparations of Miwi heterozygous (H) and knockout (I) spermatocytes. Scale bars, 5 μm. J Frequency of meiotic metaphase I (MI) cells with chromosomal abnormalities. Chromosome counts were defined as the number of paired homologous chromosomes per MI metaphase cells. The frequency was calculated in the same way as in (G), except for that the number of paired chromosomes was counted instead. Three mice were used for each genotype, total numbers of counted MI cells in Miwi heterozygous and knockout are 265 and 358, respectively. K, L Mitotic metaphase spread preparations of Miwi heterozygous (K) and knockout (L) testes. Scale bars, 5 μm. M Frequency of mitotic metaphase cells with chromosomal abnormalities. Chromosome counts were defined as the number of chromosomes per mitotic metaphase cell. Three mice were used for each genotype, total numbers of counted mitotic metaphase cells in Miwi heterozygous and knockout are 52 and 71, respectively. "}
{"words": ["Figure", "2", "A", "Equal", "amounts", "of", "total", "RNA", "isolated", "from", "Miwi", "knockout", "(", "-", "/", "-", ")", ",", "heterozygote", "(", "+", "/", "-", ")", "and", "slicer", "activity", "-", "deficient", "mutant", "(", "-", "/", "ADH", ")", "spermatocytes", ",", "were", "resolved", "on", "a", "1", "%", "agarose", "gel", ".", "The", "gel", "was", "subjected", "to", "northern", "blot", "analysis", "using", "probes", "specific", "for", "the", "sense", "(", "S", ")", "and", "antisense", "(", "As", ")", "strands", "of", "major", "(", "Maj", ")", "and", "minor", "(", "Min", ")", "satellite", "RNA", "transcripts", ".", "The", "blot", "was", "re", "-", "hybridized", "with", "a", "28S", "-", "complementary", "probe", "to", "demonstrate", "equal", "loading", "(", "bottom", "on", "the", "left", ")", ".", "The", "relative", "abundance", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ",", "normalized", "to", "the", "28S", "signal", "from", "the", "blot", ".", "B", "100ng", "of", "total", "RNA", "was", "isolated", "from", "Miwi", "heterozygous", "(", "+", "/", "-", ")", ",", "knockout", "(", "-", "/", "-", ")", "and", "slicer", "activity", "-", "deficient", "mutant", "(", "-", "/", "ADH", ")", "spermatocytes", "and", "was", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "with", "primers", "specific", "to", "major", "satellite", "RNA", ",", "minor", "satellite", "RNA", ",", "5S", ",", "5", ".", "8S", "and", "Gapdh", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "5S", "rRNA", ".", "5", ".", "8S", "rRNA", "and", "Gapdh", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "Sertoli", "-", "spermatogenic", "cell", "co", "-", "cultures", "were", "transfected", "with", "vectors", "ectopically", "expressing", "both", "strands", "of", "major", "satellite", "RNA", "(", "Maj", ",", "dark", "gray", "bar", ")", ",", "both", "strands", "of", "minor", "satellite", "RNA", "(", "Min", ",", "black", "bar", ")", ",", "full", "-", "length", "18S", "(", "18S", ",", "light", "gray", "bar", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ",", "white", "bar", ")", ".", "Total", "RNA", "isolated", "from", "equal", "numbers", "of", "FACS", "-", "sorted", "MIWI", "-", "expressing", "spermatocytes", "were", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "with", "primers", "specific", "to", "major", "satellite", "RNA", "(", "C", ")", ",", "minor", "satellite", "RNA", "(", "D", ")", ",", "18S", "(", "E", ")", "Sertoli", "-", "spermatogenic", "cell", "co", "-", "cultures", "were", "transfected", "with", "vectors", "ectopically", "expressing", "both", "strands", "of", "major", "satellite", "RNA", "(", "Maj", ",", "dark", "gray", "bar", ")", ",", "both", "strands", "of", "minor", "satellite", "RNA", "(", "Min", ",", "black", "bar", ")", ",", "full", "-", "length", "18S", "(", "18S", ",", "light", "gray", "bar", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ",", "white", "bar", ")", ".", "Total", "RNA", "isolated", "from", "equal", "numbers", "of", "FACS", "-", "sorted", "MIWI", "-", "expressing", "spermatocytes", "were", "subjected", "to", "qRT", "-", "PCR", "with", "primers", "specific", "to", "5", ".", "8S", "(", "F", ")", "and", "Gapdh", "(", "G", ")", ".", "Data", "presented", "were", "normalized", "to", "5S", "rRNA", ".", "5", ".", "8S", "rRNA", "(", "F", ")", "and", "Gapdh", "(", "G", ")", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "H", "Immunofluorescence", "images", "of", "Meiotic", "metaphase", "I", "plate", "in", "Sertoli", "-", "spermatogenic", "cell", "co", "-", "cultures", ".", "Shown", "were", "spermatocytes", "over", "-", "expressing", "both", "strands", "of", "major", "satellite", "RNA", "(", "Maj", ")", ",", "both", "strands", "of", "minor", "satellite", "RNA", "(", "Min", ")", ",", "full", "-", "length", "18S", "(", "18S", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", ".", "Green", ":", "phospho", "-", "histone", "H3", ";", "red", ":", "α", "/", "β", "-", "tubulin", ".", "Asterisk", "indicates", "misaligned", "chromosome", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "I", "Frequency", "of", "mis", "-", "arrangement", "of", "the", "meiotic", "metaphase", "I", "plate", "in", "Sertoli", "-", "spermatogenic", "cell", "cocultures", "using", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "testes", ".", "Spermatocytes", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "both", "strands", "of", "major", "satellite", "RNA", "(", "Maj", ",", "dark", "gray", ")", ",", "both", "strands", "of", "minor", "satellite", "RNA", "(", "Min", ",", "black", ")", ",", "full", "-", "length", "18S", "(", "18S", ",", "light", "gray", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ",", "white", ")", ".", "n", "=", "3", "cultures", "for", "each", "group", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "meiotic", "metaphase", "plate", "in", "Ctrl", ",", "18S", ",", "Maj", "and", "Min", "were", "153", ",", "144", ",", "130", "and", "141", ",", "respectively", ".", "J", "Combined", "RNA", "-", "DNA", "FISH", "analysis", "of", "major", "satellite", "transcripts", "and", "DNA", "regions", "in", "Miwi", "heterozygote", "(", "Miwi", "+", "/", "-", ")", "and", "knockout", "(", "Miwi", "-", "/", "-", ")", "diakinesis", "spermatocytes", ".", "Sense", "major", "satellite", "RNA", "transcripts", "were", "first", "detected", "using", "an", "antisense", "probe", "(", "red", "signal", ")", ",", "and", "then", "the", "major", "satellite", "DNA", "region", "was", "further", "detected", "using", "a", "sense", "probe", "(", "green", "signal", ")", ".", "For", "RNase", "A", "treatment", ",", "the", "slides", "were", "incubated", "with", "(", "+", "RNase", "A", ")", "or", "without", "(", "-", "RNase", "A", ")", "100", "μg", "/", "ml", "RNase", "A", "for", "1", "hour", "before", "adding", "antisense", "probe", ".", "Nuclear", "DNA", "was", "stained", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "same", "pericentric", "heterochromatin", "in", "each", "channel", "per", "cell", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A Equal amounts of total RNA isolated from Miwi knockout (-/-), heterozygote (+/-) and slicer activity-deficient mutant (-/ADH) spermatocytes, were resolved on a 1% agarose gel. The gel was subjected to northern blot analysis using probes specific for the sense (S) and antisense (As) strands of major (Maj) and minor (Min) satellite RNA transcripts. The blot was re-hybridized with a 28S-complementary probe to demonstrate equal loading (bottom on the left). The relative abundance was quantified using ImageJ software, normalized to the 28S signal from the blot.  B 100ng of total RNA was isolated from Miwi heterozygous (+/-), knockout (-/-) and slicer activity-deficient mutant (-/ADH) spermatocytes and was subjected to qRT-PCR with primers specific to major satellite RNA, minor satellite RNA, 5S, 5.8S and Gapdh. Data were normalized to 5S rRNA. 5.8S rRNA and Gapdh were used as negative controls.Sertoli-spermatogenic cell co-cultures were transfected with vectors ectopically expressing both strands of major satellite RNA (Maj, dark gray bar), both strands of minor satellite RNA (Min, black bar), full-length 18S (18S, light gray bar) or empty vector (Ctrl, white bar). Total RNA isolated from equal numbers of FACS-sorted MIWI-expressing spermatocytes were subjected to qRT-PCR with primers specific to major satellite RNA (C), minor satellite RNA (D), 18S (E) Sertoli-spermatogenic cell co-cultures were transfected with vectors ectopically expressing both strands of major satellite RNA (Maj, dark gray bar), both strands of minor satellite RNA (Min, black bar), full-length 18S (18S, light gray bar) or empty vector (Ctrl, white bar). Total RNA isolated from equal numbers of FACS-sorted MIWI-expressing spermatocytes were subjected to qRT-PCR with primers specific to 5.8S (F) and Gapdh (G). Data presented were normalized to 5S rRNA. 5.8S rRNA (F) and Gapdh (G) were used as negative controls.  H Immunofluorescence images of Meiotic metaphase I plate in Sertoli-spermatogenic cell co-cultures. Shown were spermatocytes over-expressing both strands of major satellite RNA (Maj), both strands of minor satellite RNA (Min), full-length 18S (18S) or empty vector (Ctrl). Green: phospho-histone H3; red: α/β-tubulin. Asterisk indicates misaligned chromosome. Scale bar, 5 μm.  I Frequency of mis-arrangement of the meiotic metaphase I plate in Sertoli-spermatogenic cell cocultures using Miwi+/-;Stra8-Cre testes. Spermatocytes transfected with vectors expressing both strands of major satellite RNA (Maj, dark gray), both strands of minor satellite RNA (Min, black), full-length 18S (18S, light gray) or empty vector (Ctrl, white). n=3 cultures for each group. The total numbers of counted meiotic metaphase plate in Ctrl, 18S, Maj and Min were 153, 144, 130 and 141, respectively.  J Combined RNA-DNA FISH analysis of major satellite transcripts and DNA regions in Miwi heterozygote (Miwi+/-) and knockout (Miwi-/-) diakinesis spermatocytes. Sense major satellite RNA transcripts were first detected using an antisense probe (red signal), and then the major satellite DNA region was further detected using a sense probe (green signal). For RNase A treatment, the slides were incubated with (+RNase A) or without (-RNase A) 100 μg/ml RNase A for 1 hour before adding antisense probe. Nuclear DNA was stained by DAPI (blue). Arrows indicate the same pericentric heterochromatin in each channel per cell. Scale bars represent 2 µm. "}
{"words": ["Figure", "3", "A", "Combined", "immunofluorescence", "and", "DNA", "FISH", "analysis", "of", "the", "kinetochore", "inner", "plate", "/", "centromere", "formation", "in", "Miwi", "heterozygous", "(", "Miwi", "+", "/", "-", ")", "and", "knockout", "(", "Miwi", "-", "/", "-", ")", "spermatocytes", "at", "diakinesis", "/", "metaphase", "I", ".", "For", "slicer", "activity", "-", "deficient", "mutant", "spermatocytes", "(", "Miwi", "-", "/", "ADH", ")", ",", "the", "images", "are", "presented", "in", "Fig", "EV1A", ".", "Chromosomes", "were", "stained", "with", "anti", "-", "centromere", "protein", "antibody", "(", "CREST", ",", "purple", "signal", ")", ",", "indicating", "the", "kinetochore", "inner", "plate", "/", "centromere", ".", "Major", "satellite", "DNA", "regions", "were", "detected", "using", "an", "antisense", "probe", "(", "red", "signal", ")", "which", "revealed", "the", "specific", "localization", "of", "pericentromeres", "in", "chromosomes", ".", "Nuclear", "DNA", "was", "stained", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "µm", ".", "B", "Left", "panel", ":", "illustration", "of", "kinetochore", "configurations", "in", "meiotic", "metaphase", "I", ".", "The", "kinetochores", "of", "sister", "chromatids", "cohere", "to", "form", "a", "single", "microtubule", "-", "binding", "interface", ".", "The", "inner", "-", "outer", "kinetochore", "axis", "connects", "the", "pericentric", "chromatin", "to", "the", "spindle", "microtubule", ".", "CREST", "(", "centromere", "protein", ")", "and", "BUBR1", "(", "budding", "uninhibited", "by", "benzimidazole", "-", "related", "1", ")", "served", "as", "markers", "for", "the", "inner", "and", "outer", "regions", "of", "the", "kinetochore", ",", "respectively", ".", "A", "major", "satellite", "DNA", "(", "Maj", "sat", "DNA", ")", "probe", "was", "used", "to", "detect", "the", "pericentric", "chromatin", ".", "Right", "panel", ":", "categories", "of", "inner", "kinetochore", "configurations", "from", "A", ".", "Right", "panels", ":", "Inner", "kinetochore", "configurations", "in", "MI", "were", "classified", "as", "overlapping", "(", "two", "sister", "kinetochores", "which", "overlap", "by", "more", "than", "their", "individual", "radii", ",", "also", "see", "yellow", "arrow", "in", "A", ")", ",", "adjacent", "(", "two", "sister", "kinetochores", "which", "overlap", "by", "less", "than", "100", "%", "of", "their", "individual", "radii", ",", "also", "see", "magenta", "arrow", "in", "A", ")", "or", "separated", "(", "two", "sister", "kinetochores", "without", "overlapping", ",", "also", "see", "light", "blue", "arrow", "in", "A", ")", "kinetochores", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "C", "Population", "of", "overlapping", ",", "adjacent", ",", "and", "separated", "inner", "kinetochores", "shown", "in", "B", ".", "The", "results", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "cells", "in", "Miwi", "+", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "-", "and", "Miwi", "-", "/", "ADH", "spermatocytes", "were", "88", ",", "118", "and", "125", ",", "respectively", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "sister", "kinetochore", "pairs", "in", "Miwi", "+", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "-", "and", "Miwi", "-", "/", "ADH", "spermatocytes", "were", "3", ",", "520", ",", "4", ",", "720", "and", "5", ",", "000", ",", "respectively", ".", "D", "Combined", "immunofluorescence", "and", "DNA", "FISH", "analysis", "of", "kinetochore", "inner", "and", "outer", "plate", "formation", "in", "Miwi", "heterozygous", "(", "Miwi", "+", "/", "-", ")", "and", "knockout", "(", "Miwi", "-", "/", "-", ")", "at", "diakinesis", "/", "metaphase", "I", ".", "For", "slicer", "activity", "-", "deficient", "mutant", "spermatocytes", "(", "Miwi", "-", "/", "ADH", ")", ",", "the", "images", "are", "presented", "in", "Fig", "EV1B", ".", "Chromosomes", "were", "stained", "with", "anti", "-", "BUBR1", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "centromere", "-", "protein", "(", "CREST", ",", "purple", ")", "antibodies", "to", "mark", "the", "kinetochore", "outer", "and", "inner", "plate", ",", "respectively", ".", "In", "addition", ",", "major", "satellite", "DNA", "regions", "were", "further", "detected", "using", "an", "antisense", "probe", "(", "red", "signal", ")", ".", "Nuclear", "DNA", "was", "stained", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "O", "-", "O", "kinetochore", "pairs", ":", "yellow", "arrow", ";", "S", "-", "S", ",", "magenta", "arrow", ";", "O", "-", "S", ",", "light", "blue", "arrow", ";", "and", "S", "-", "O", ",", "light", "green", "arrow", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "µm", ".", "E", "Magnified", "images", "of", "categories", "of", "sister", "kinetochore", "configurations", "from", "D", ".", "One", "arrow", "indicates", "overlapping", "pair", ".", "Double", "arrows", "indicate", "split", "pair", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "F", "Population", "of", "the", "sister", "kinetochores", "shown", "in", "E", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "cells", "in", "Miwi", "+", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "-", "and", "Miwi", "-", "/", "ADH", "spermatocytes", "were", "93", ",", "89", "and", "81", ",", "respectively", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "sister", "kinetochore", "pairs", "in", "Miwi", "+", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "-", "and", "Miwi", "-", "/", "ADH", "spermatocytes", "were", "3", ",", "720", ",", "3", ",", "560", "and", "3", ",", "240", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A Combined immunofluorescence and DNA FISH analysis of the kinetochore inner plate/centromere formation in Miwi heterozygous (Miwi+/-) and knockout (Miwi-/-) spermatocytes at diakinesis/metaphase I. For slicer activity-deficient mutant spermatocytes (Miwi-/ADH), the images are presented in Fig EV1A. Chromosomes were stained with anti-centromere protein antibody (CREST, purple signal), indicating the kinetochore inner plate/centromere. Major satellite DNA regions were detected using an antisense probe (red signal) which revealed the specific localization of pericentromeres in chromosomes. Nuclear DNA was stained by DAPI (blue). Scale bars represent 2 µm.  B Left panel: illustration of kinetochore configurations in meiotic metaphase I. The kinetochores of sister chromatids cohere to form a single microtubule-binding interface. The inner-outer kinetochore axis connects the pericentric chromatin to the spindle microtubule. CREST (centromere protein) and BUBR1 (budding uninhibited by benzimidazole-related 1) served as markers for the inner and outer regions of the kinetochore, respectively. A major satellite DNA (Maj sat DNA) probe was used to detect the pericentric chromatin. Right panel: categories of inner kinetochore configurations from A. Right panels: Inner kinetochore configurations in MI were classified as overlapping (two sister kinetochores which overlap by more than their individual radii, also see yellow arrow in A), adjacent (two sister kinetochores which overlap by less than 100% of their individual radii, also see magenta arrow in A) or separated (two sister kinetochores without overlapping, also see light blue arrow in A) kinetochores. The scale bar represents 1 µm. C Population of overlapping, adjacent, and separated inner kinetochores shown in B. The results represent the mean ± SD of three independent experiments. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted cells in Miwi+/-, Miwi-/- and Miwi-/ADH spermatocytes were 88, 118 and 125, respectively. The total numbers of counted sister kinetochore pairs in Miwi+/-, Miwi-/- and Miwi-/ADH spermatocytes were 3,520, 4,720 and 5,000, respectively.  D Combined immunofluorescence and DNA FISH analysis of kinetochore inner and outer plate formation in Miwi heterozygous (Miwi+/-) and knockout (Miwi-/-) at diakinesis/metaphase I. For slicer activity-deficient mutant spermatocytes (Miwi-/ADH), the images are presented in Fig EV1B. Chromosomes were stained with anti-BUBR1 (green) and anti-centromere-protein (CREST, purple) antibodies to mark the kinetochore outer and inner plate, respectively. In addition, major satellite DNA regions were further detected using an antisense probe (red signal). Nuclear DNA was stained by DAPI (blue). O-O kinetochore pairs: yellow arrow; S-S, magenta arrow; O-S, light blue arrow; and S-O, light green arrow. Scale bars represent 2 µm. E Magnified images of categories of sister kinetochore configurations from D. One arrow indicates overlapping pair. Double arrows indicate split pair. The scale bar represents 1 µm. F Population of the sister kinetochores shown in E. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted cells in Miwi+/-, Miwi-/- and Miwi-/ADH spermatocytes were 93, 89 and 81, respectively. The total numbers of counted sister kinetochore pairs in Miwi+/-, Miwi-/- and Miwi-/ADH spermatocytes were 3,720, 3,560 and 3,240, respectively. "}
{"words": ["Figure", "4B", "RNA", "pull", "-", "down", "assay", "using", "biotinylated", "major", "and", "minor", "satellite", "RNA", "transcripts", "and", "whole", "cell", "extracts", "from", "Miwi", "heterozygoous", "(", "Miwi", "+", "/", "-", ")", ",", "knockout", "(", "Miwi", "-", "/", "-", ")", ",", "slicer", "activity", "-", "deficient", "mutant", "(", "Miwi", "-", "/", "ADH", ")", ",", "and", "Mov10l1", "germline", "knockout", "(", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", ")", "testes", ".", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", "represent", "a", "pachytene", "piRNA", "-", "deficient", "condition", ".", "Approximately", "one", "repeat", "of", "In", "vitro", "transcribed", "major", "and", "minor", "satellite", "RNAs", "corresponding", "to", "the", "sequences", "in", "A", "were", "used", "as", "baits", ".", "Precipitated", "proteins", "were", "visualized", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "the", "indicated", "proteins", "(", "MIWI", "and", "MILI", ")", ".", "The", "input", "equals", "1", "/", "10", "to", "1", "/", "80", "of", "the", "protein", "lysate", "used", "in", "the", "pull", "-", "down", ".", "Transcripts", "corresponding", "to", "300", " ", "nt", "and", "162", " ", "nt", "of", "the", "18S", "rRNA", "sequence", "served", "as", "controls", "for", "the", "antisense", "(", "As", ")", "and", "sense", "(", "S", ")", "sequence", "of", "major", "and", "minor", "satellite", "transcripts", ",", "respectively", ".", "The", "blot", "was", "re", "-", "probed", "with", "anti", "-", "GAPDH", "antibody", "serving", "as", "a", "negative", "control", ".", "C", "In", "vitro", "RNA", "processing", "assay", "with", "nuage", "-", "nuclear", "fraction", "from", "testicular", "lysates", "of", "Miwi", "knockout", "(", "-", "/", "-", ")", ",", "heterozygous", "(", "+", "/", "-", ")", ",", "and", "slicer", "activity", "-", "deficient", "(", "-", "/", "ADH", ")", "mutants", ",", "and", "5", "'", "-", "end", "radioactively", "labelled", "RNA", "targets", "corresponding", "to", "approximately", "one", "and", "two", "repeats", "of", "major", "and", "minor", "satellite", "sequences", "(", "see", "panel", "A", "for", "details", ")", ".", "Transcripts", "corresponding", "to", "162", ",", "300", ",", "and", "542", "nt", "of", "the", "18S", "rRNA", "sequence", "served", "as", "controls", ".", "Arrow", "indicates", "the", "cleavage", "products", "of", "In", "vitro", "transcribed", "sense", "major", "satellite", "RNAs", "after", "reactions", ".", "D", "In", "vitro", "RNA", "processing", "assay", "with", "nuage", "-", "nuclear", "fraction", "from", "Mov10l1", "heterozygous", "(", "Mov10l1f", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ")", "and", "Mov10l1", "germline", "knockout", "(", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", ")", "testis", "lysates", ",", "and", "5", "'", "-", "end", "radioactively", "labelled", "RNA", "targets", "corresponding", "to", "approximately", "one", "and", "two", "repeats", "of", "sense", "and", "antisense", "major", "satellite", "sequences", ".", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", "represent", "a", "pachytene", "piRNA", "-", "deficient", "condition", ".", "The", "arrow", "indicates", "the", "cleavage", "product", "of", "the", "in", "vitro", "transcribed", "sense", "major", "satellite", "RNA", ".", "RNA", "-", "immunoprecipitation", "was", "performed", "using", "anti", "-", "MIWI", "antibody", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "anti", "-", "MIWI", "immunoprecipitates", "and", "subjected", "to", "Northern", "blot", "analysis", "using", "probes", "specific", "for", "potential", "piRNAs", "(", "piR", "major", "-", "a", "and", "b", ")", ",", "as", "indicated", "in", "panel", "20", "%", "of", "input", "RNA", "from", "each", "group", "was", "used", "as", "the", "control", ".", "The", "blot", "was", "re", "-", "hybridized", "with", "piR", "-", "A", "and", "piR", "-", "E", "complementary", "probes", "to", "demonstrate", "the", "efficiency", "of", "the", "RNA", "-", "IP", ".", "A", "miR", "-", "16", "complementary", "probe", "served", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B RNA pull-down assay using biotinylated major and minor satellite RNA transcripts and whole cell extracts from Miwi heterozygoous (Miwi+/-), knockout (Miwi-/-), slicer activity-deficient mutant (Miwi-/ADH), and Mov10l1 germline knockout (Mov10l1f/-;Stra8-Cre) testes. Mov10l1f/-;Stra8-Cre mice represent a pachytene piRNA-deficient condition. Approximately one repeat of In vitro transcribed major and minor satellite RNAs corresponding to the sequences in A were used as baits. Precipitated proteins were visualized by Western blotting using antibodies against the indicated proteins (MIWI and MILI). The input equals 1/10 to 1/80 of the protein lysate used in the pull-down. Transcripts corresponding to 300 nt and 162 nt of the 18S rRNA sequence served as controls for the antisense (As) and sense (S) sequence of major and minor satellite transcripts, respectively. The blot was re-probed with anti-GAPDH antibody serving as a negative control.C In vitro RNA processing assay with nuage-nuclear fraction from testicular lysates of Miwi knockout (-/-), heterozygous (+/-), and slicer activity-deficient (-/ADH) mutants, and 5'-end radioactively labelled RNA targets corresponding to approximately one and two repeats of major and minor satellite sequences (see panel A for details). Transcripts corresponding to 162, 300, and 542 nt of the 18S rRNA sequence served as controls. Arrow indicates the cleavage products of In vitro transcribed sense major satellite RNAs after reactions.D In vitro RNA processing assay with nuage-nuclear fraction from Mov10l1 heterozygous (Mov10l1f/+;Stra8-Cre) and Mov10l1 germline knockout (Mov10l1f/-;Stra8-Cre) testis lysates, and 5'-end radioactively labelled RNA targets corresponding to approximately one and two repeats of sense and antisense major satellite sequences. Mov10l1f/-;Stra8-Cre mice represent a pachytene piRNA-deficient condition. The arrow indicates the cleavage product of the in vitro transcribed sense major satellite RNA.RNA-immunoprecipitation was performed using anti-MIWI antibody. RNA was extracted from anti-MIWI immunoprecipitates and subjected to Northern blot analysis using probes specific for potential piRNAs (piR major-a and b), as indicated in panel 20% of input RNA from each group was used as the control. The blot was re-hybridized with piR-A and piR-E complementary probes to demonstrate the efficiency of the RNA-IP. A miR-16 complementary probe served as a negative control."}
{"words": ["Figure", "5", "A", "RNA", "pull", "-", "down", "was", "performed", "using", "in", "vitro", "transcribed", "biotinylated", "transcripts", "and", "whole", "cell", "extracts", "from", "Miwi", "+", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "-", ",", "Miwi", "-", "/", "ADH", ",", "and", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "testes", ".", "Mov10l1f", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", "represent", "a", "pachytene", "piRNA", "-", "deficient", "condition", ".", "In", "vitro", "transcribed", "RNAs", "corresponding", "to", "approximately", "one", "repeat", "of", "major", "and", "minor", "satellite", "sequences", "were", "used", "as", "baits", ".", "Precipitated", "protein", "was", "visualized", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Dicer", "antibody", ".", "B", "Equal", "amounts", "of", "total", "RNA", "isolated", "from", "spermatocytes", "of", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "and", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", ",", "were", "resolved", "on", "a", "1", "%", "agarose", "gel", ".", "The", "gel", "was", "subjected", "to", "Northern", "blot", "analysis", "using", "probes", "specific", "for", "the", "sense", "and", "antisense", "sequences", "of", "major", "and", "minor", "satellites", ".", "The", "blot", "was", "re", "-", "hybridized", "with", "a", "28S", "rRNA", "-", "complementary", "probe", "to", "demonstrate", "equal", "loading", "(", "bottom", "on", "the", "left", ")", ".", "C", "in", "vitro", "RNA", "processing", "assay", "with", "nuage", "-", "enriched", "nuclear", "fraction", "from", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "and", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", ",", "and", "5", "'", "-", "end", "radioactively", "labelled", "RNA", "targets", "corresponding", "to", "approximately", "one", "and", "two", "repeats", "of", "sense", "and", "antisense", "major", "satellite", "sequences", ".", "Arrow", "indicates", "the", "cleavage", "products", "of", "In", "vitro", "transcribed", "sense", "major", "satellite", "RNAs", "by", "MIWI", "-", "piRNA", "complex", ".", "D", "Equal", "amounts", "of", "total", "RNA", "isolated", "from", "spermatocytes", "of", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "and", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", ",", "were", "digested", "with", "RNase", "III", "(", "RNase", "III", ")", "or", "nuclease", "S1", "(", "S1", ")", ",", "and", "further", "resolved", "on", "a", "1", "%", "agarose", "gel", ".", "The", "gel", "was", "subjected", "to", "northern", "blot", "analysis", "using", "probes", "specific", "for", "the", "sense", "(", "S", ")", "and", "antisense", "(", "As", ")", "strands", "of", "major", "(", "Maj", ")", "and", "minor", "(", "Min", ")", "satellite", "transcripts", ".", "The", "blot", "was", "re", "-", "hybridized", "with", "18S", "and", "28S", "-", "complementary", "probes", "to", "demonstrate", "equal", "loading", "and", "the", "same", "efficiency", "of", "RNase", "III", "or", "nuclease", "S1", "digestion", ".", "E", "Sequential", "in", "vitro", "RNA", "processing", "assay", "using", "5", "'", "-", "end", "radioactively", "labelled", "RNA", "targets", "corresponding", "to", "approximately", "one", "repeat", "of", "sense", "and", "antisense", "major", "satellite", "sequences", ".", "The", "nuage", "-", "nuclear", "fraction", "from", "Miwi", "+", "/", "-", "testes", "is", "indicated", "as", "N", ".", "Total", "cellular", "extracts", "(", "T", ")", "from", "Miwi", "+", "/", "-", "testes", "were", "subjected", "to", "immunodepletion", "using", "anti", "-", "Dicer", "antibodies", "(", "α", "-", "Dicer", ")", ",", "with", "IgG", "(", "IgG", ")", "as", "a", "negative", "control", ".", "The", "incubation", "time", "(", "Incub", ".", "t", ")", "was", "0", ".", "5", "and", "1", "hour", ".", "The", "arrow", "indicates", "the", "product", "of", "MIWI", "-", "mediated", "cleavage", "of", "the", "in", "vitro", "transcribed", "sense", "major", "satellite", "RNA", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A RNA pull-down was performed using in vitro transcribed biotinylated transcripts and whole cell extracts from Miwi+/-, Miwi-/-, Miwi-/ADH, and Mov10l1f/-;Stra8-Cre testes. Mov10l1f/-;Stra8-Cre mice represent a pachytene piRNA-deficient condition. In vitro transcribed RNAs corresponding to approximately one repeat of major and minor satellite sequences were used as baits. Precipitated protein was visualized by Western blotting using anti-Dicer antibody.  B Equal amounts of total RNA isolated from spermatocytes of Miwi+/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi-/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi+/-;Dicerf/-;Stra8-Cre and Miwi-/-;Dicerf/-;Stra8-Cre mice, were resolved on a 1% agarose gel. The gel was subjected to Northern blot analysis using probes specific for the sense and antisense sequences of major and minor satellites. The blot was re-hybridized with a 28S rRNA-complementary probe to demonstrate equal loading (bottom on the left).  C in vitro RNA processing assay with nuage-enriched nuclear fraction from Miwi+/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi-/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, and Miwi+/-;Dicerf/-;Stra8-Cre mice, and 5'-end radioactively labelled RNA targets corresponding to approximately one and two repeats of sense and antisense major satellite sequences. Arrow indicates the cleavage products of In vitro transcribed sense major satellite RNAs by MIWI-piRNA complex.  D Equal amounts of total RNA isolated from spermatocytes of Miwi+/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi-/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi+/-;Dicerf/-;Stra8-Cre and Miwi-/-;Dicerf/-;Stra8-Cre mice, were digested with RNase III (RNase III) or nuclease S1 (S1), and further resolved on a 1% agarose gel. The gel was subjected to northern blot analysis using probes specific for the sense (S) and antisense (As) strands of major (Maj) and minor (Min) satellite transcripts. The blot was re-hybridized with 18S and 28S-complementary probes to demonstrate equal loading and the same efficiency of RNase III or nuclease S1 digestion.  E Sequential in vitro RNA processing assay using 5'-end radioactively labelled RNA targets corresponding to approximately one repeat of sense and antisense major satellite sequences. The nuage-nuclear fraction from Miwi+/- testes is indicated as N. Total cellular extracts (T) from Miwi+/- testes were subjected to immunodepletion using anti-Dicer antibodies (α-Dicer), with IgG (IgG ) as a negative control. The incubation time (Incub. t) was 0.5 and 1 hour. The arrow indicates the product of MIWI-mediated cleavage of the in vitro transcribed sense major satellite RNA."}
{"words": ["Figure", "6", "A", "Frequency", "of", "overlapping", ",", "adjacent", ",", "and", "separated", "inner", "kinetochores", ".", "Spermatocytes", "from", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "+", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "Miwi", "+", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", ",", "and", "Miwi", "-", "/", "-", ";", "Dicerf", "/", "-", ";", "Stra8", "-", "Cre", "mice", "were", "used", "to", "examine", "sister", "kinetochore", "configuration", "at", "meiosis", "I", "as", "shown", "in", "Fig", "3A", "and", "3B", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "cells", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "101", ",", "117", ",", "129", "and", "115", ",", "respectively", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "sister", "kinetochore", "pairs", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "4", ",", "040", ",", "4", ",", "680", ",", "5", ",", "160", "and", "4", ",", "600", ",", "respectively", ".", "B", "Frequency", "of", "the", "different", "sister", "kinetochore", "configurations", ".", "The", "four", "types", "of", "spermatocytes", "in", "A", "were", "used", "to", "examine", "sister", "kinetochore", "configurations", "in", "meiosis", "I", "metaphase", "with", "O", "-", "O", ",", "S", "-", "S", ",", "O", "-", "S", ",", "or", "S", "-", "O", "as", "defined", "in", "the", "text", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "cells", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "134", ",", "140", ",", "140", "and", "130", ",", "respectively", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "sister", "kinetochore", "pairs", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "5", ",", "360", ",", "5", ",", "600", ",", "5", ",", "600", "and", "5", ",", "200", ",", "respectively", ".", "C", "Frequency", "of", "abnormal", "arrangement", "in", "the", "meiotic", "metaphase", "I", "plate", ".", "The", "four", "types", "of", "spermatocytes", "in", "A", "and", "B", "were", "used", "to", "perform", "immunofluorescence", "as", "shown", "in", "Fig", "1B", "and", "C", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "metaphase", "I", "plates", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "221", ",", "181", ",", "421", "and", "240", ",", "respectively", ".", "D", "Frequency", "of", "meiosis", "I", "metaphase", "cells", "with", "chromosomal", "abnormalities", ".", "The", "four", "types", "of", "spermatocytes", "in", "A", "-", "C", "were", "used", "to", "perform", "a", "metaphase", "spread", "as", "shown", "in", "Fig", "1H", "and", "1I", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "MI", "cells", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "89", ",", "73", ",", "132", "and", "104", ",", "respectively", ".", "E", "Frequency", "of", "meiosis", "II", "metaphase", "cells", "with", "chromosomal", "abnormalities", ".", "The", "four", "types", "of", "spermatocytes", "in", "A", "-", "D", "were", "used", "to", "perform", "a", "metaphase", "spread", "as", "shown", "in", "Fig", "1K", "and", "L", ".", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "genotype", ".", "The", "total", "numbers", "of", "counted", "MII", "cells", "in", "the", "four", "types", "of", "spermatocytes", "were", "74", ",", "87", ",", "85", "and", "94", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A Frequency of overlapping, adjacent, and separated inner kinetochores. Spermatocytes from Miwi+/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi-/-;Dicerf/+;Stra8-Cre, Miwi+/-;Dicerf/-;Stra8-Cre, and Miwi-/-;Dicerf/-;Stra8-Cre mice were used to examine sister kinetochore configuration at meiosis I as shown in Fig 3A and 3B. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted cells in the four types of spermatocytes were 101, 117, 129 and 115, respectively. The total numbers of counted sister kinetochore pairs in the four types of spermatocytes were 4,040, 4,680, 5,160 and 4,600, respectively. B Frequency of the different sister kinetochore configurations. The four types of spermatocytes in A were used to examine sister kinetochore configurations in meiosis I metaphase with O-O, S-S, O-S, or S-O as defined in the text. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted cells in the four types of spermatocytes were 134, 140, 140 and 130, respectively. The total numbers of counted sister kinetochore pairs in the four types of spermatocytes were 5,360, 5,600, 5,600 and 5,200, respectively.  C Frequency of abnormal arrangement in the meiotic metaphase I plate. The four types of spermatocytes in A and B were used to perform immunofluorescence as shown in Fig 1B and C. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted metaphase I plates in the four types of spermatocytes were 221, 181, 421 and 240, respectively. D Frequency of meiosis I metaphase cells with chromosomal abnormalities. The four types of spermatocytes in A-C were used to perform a metaphase spread as shown in Fig 1H and 1I. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted MI cells in the four types of spermatocytes were 89, 73, 132 and 104, respectively. E Frequency of meiosis II metaphase cells with chromosomal abnormalities. The four types of spermatocytes in A-D were used to perform a metaphase spread as shown in Fig 1K and L. n=3 mice for each genotype. The total numbers of counted MII cells in the four types of spermatocytes were 74, 87, 85 and 94, respectively. "}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "F", "'", "Upper", "panels", "(", "A", "-", "F", ")", "show", "morphology", "of", "c4da", "neurons", "of", "the", "indicated", "genotypes", "at", "the", "third", "instar", "larval", "stage", ",", "lower", "panels", "(", "A", "'", "-", "F", "'", ")", "show", "c4da", "neuron", "morphology", "at", "18", "h", "after", "puparium", "formation", "(", "APF", ")", ".", "Neurons", "were", "labeled", "by", "CD8", ":", ":", "GFP", "expression", "under", "ppk", "-", "GAL4", "or", "by", "tdtomato", "expression", "in", "MARCM", "clones", ".", "(", "A", ",", "A", "'", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "control", "Orco", "dsRNA", ".", "Scale", "bars", "are", "100", "μm", "in", "A", "(", "for", "larval", "images", ")", "and", "50", "μm", "in", "A", "'", "(", "for", "pupal", "images", ")", ".", "(", "B", ",", "B", "'", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", ".", "(", "C", ",", "C", "'", ")", "Homozygous", "PP2A", "-", "29BGE16781", "mutant", "c4da", "neuron", "MARCM", "clones", ".", "(", "D", ",", "D", "'", ")", "Homozygous", "PP2A", "-", "29BGE16781", "mutant", "c4da", "neuron", "MARCM", "clones", "expressing", "UAS", "-", "HAPP2A", "-", "29B", ".", "(", "E", ",", "E", "'", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "dominant", "-", "negative", "Mts", ".", "(", "F", ",", "F", "'", ")", "Homozygous", "mtss5286", "mutant", "c4da", "neuron", "MARCM", "clones", ".", "G", "Penetrance", "of", "pruning", "defects", "at", "18", "h", "APF", "in", "A", "'", "-", "E", "'", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Number", "of", "neurons", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", ",", "the", "number", "of", "animals", "is", "given", "below", "in", "parentheses", ".", "H", "Severity", "of", "pruning", "defects", "at", "18", "h", "APF", "in", "A", "'", "-", "E", "'", "as", "assessed", "by", "number", "of", "primary", "and", "secondary", "dendrites", "attached", "to", "soma", "at", "18", "h", "APF", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A - F' Upper panels (A - F) show morphology of c4da neurons of the indicated genotypes at the third instar larval stage, lower panels (A' - F') show c4da neuron morphology at 18 h after puparium formation (APF). Neurons were labeled by CD8::GFP expression under ppk-GAL4 or by tdtomato expression in MARCM clones. (A, A') C4da neurons expressing control Orco dsRNA. Scale bars are 100 μm in A (for larval images) and 50 μm in A' (for pupal images). (B, B') C4da neurons expressing PP2A-29B dsRNA. (C, C') Homozygous PP2A-29BGE16781 mutant c4da neuron MARCM clones. (D, D') Homozygous PP2A-29BGE16781 mutant c4da neuron MARCM clones expressing UAS-HAPP2A-29B. (E, E') C4da neurons expressing dominant-negative Mts. (F, F') Homozygous mtss5286 mutant c4da neuron MARCM clones. G Penetrance of pruning defects at 18 h APF in A' - E'. ** P<0.005, *** P<0.0005, Fisher's exact test. Number of neurons for each genotype are given in the figure, the number of animals is given below in parentheses. H Severity of pruning defects at 18 h APF in A' - E' as assessed by number of primary and secondary dendrites attached to soma at 18 h APF. Data are mean +/- s. d., ** P<0.005, *** P<0.0005, Wilcoxon's test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. "}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "J", "The", "indicated", "Sox14", "or", "Mical", "constructs", "were", "tested", "for", "their", "ability", "to", "suppress", "pruning", "defects", "induced", "by", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "expression", ".", "C4da", "neurons", "were", "labeled", "by", "CD8", ":", ":", "GFP", "expression", "under", "ppk", "-", "GAL4", ",", "and", "dendrite", "pruning", "defects", "were", "assessed", "at", "18", "h", "APF", ".", "Panels", "A", "-", "E", "show", "effects", "of", "Sox14", "/", "Mical", "pathway", "manipulations", "alone", ",", "panels", "F", "-", "J", "show", "neurons", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", ".", "The", "scale", "bar", "in", "A", "is", "50", "μm", ".", "(", "A", ",", "F", ")", "C4da", "neurons", "(", "co", "-", ")", "expressing", "lacZ", ".", "(", "B", ",", "G", ")", "C4da", "neurons", "(", "co", "-", ")", "overexpressing", "Sox14", ".", "(", "C", ",", "H", ")", "C4da", "neurons", "(", "co", "-", ")", "overexpressing", "Mical", ".", "(", "D", ",", "I", ")", "C4da", "neurons", "(", "co", "-", ")", "expressing", "Mical", "∆", "redox", ".", "(", "E", ",", "J", ")", "C4da", "neurons", "(", "co", "-", ")", "expressing", "Mical", "∆", "CH", ".", "K", "Penetrance", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "A", "-", "J", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", "the", "numbers", "of", "animals", "are", "given", "below", "in", "parentheses", ".", "L", "Severity", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "A", "-", "J", "as", "assessed", "by", "number", "of", "primary", "and", "secondary", "dendrites", "attached", "to", "soma", "at", "18", "h", "APF", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-J The indicated Sox14 or Mical constructs were tested for their ability to suppress pruning defects induced by PP2A-29B dsRNA expression. C4da neurons were labeled by CD8::GFP expression under ppk-GAL4, and dendrite pruning defects were assessed at 18 h APF. Panels A - E show effects of Sox14/Mical pathway manipulations alone, panels F - J show neurons coexpressing PP2A-29B dsRNA. The scale bar in A is 50 μm. (A, F) C4da neurons (co-)expressing lacZ. (B, G) C4da neurons (co-)overexpressing Sox14. (C, H) C4da neurons (co-)overexpressing Mical. (D, I) C4da neurons (co-)expressing Mical∆redox. (E, J) C4da neurons (co-)expressing Mical∆CH. K Penetrance of pruning defects in panels A - J. * P<0.05, *** P<0.0005, Fisher's exact test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure the numbers of animals are given below in parentheses. L Severity of pruning defects in panels A - J as assessed by number of primary and secondary dendrites attached to soma at 18 h APF. Data are mean +/- s. d., * P<0.05, *** P<0.0005, Wilcoxon's test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. "}
{"words": ["Figure", "3C4da", "neurons", "were", "labeled", "by", "CD8", ":", ":", "GFP", "expression", "under", "ppk", "-", "GAL4", ",", "and", "expression", "of", "Sox14", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", ".", "A", "-", "C", "Sox14", "stainings", "at", "2", "h", "APF", ".", "(", "A", ")", "Control", "c4da", "neurons", ".", "(", "B", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", ".", "(", "C", ")", "C4da", "neuron", "expressing", "dominant", "-", "negative", "Mts", ".", "D", "Quantification", "of", "Sox14", "expression", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "C4da", "neuron", "Sox14", "expression", "was", "normalized", "to", "Sox14", "expression", "in", "neighboring", "ddaE", "c1da", "neurons", "(", "identified", "by", "characteristic", "cell", "body", "shape", ")", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ".", "The", "numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "each", "graph", "(", "data", "were", "not", "derived", "from", "independent", "experiments", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "C4da", "neurons", "were", "labeled", "by", "CD8", ":", ":", "GFP", "expression", "under", "ppk", "-", "GAL4", ",", "and", "expression", "of", "Mical", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", ".", "E", "-", "H", "Mical", "stainings", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "(", "E", ")", "Mical", "expression", "in", "control", "c4da", "neurons", "at", "2", "h", "APF", ".", "(", "F", ")", "Mical", "expression", "in", "c4da", "neurons", "expressing", "dominant", "-", "negative", "Mts", "at", "2", "h", "APF", ".", "(", "G", ")", "Mical", "expression", "in", "c4da", "neurons", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "at", "2", "h", "APF", ".", "(", "H", ")", "Mical", "expression", "in", "c4da", "neurons", "expressing", "Orco", "dsRNA", "at", "0", "h", "APF", ".", "(", "I", ")", "Mical", "expression", "in", "c4da", "neurons", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "at", "0", "h", "APF", ".", "J", "Quantification", "of", "Mical", "expression", "in", "(", "E", "-", "I", ")", ".", "C4da", "neuron", "Mical", "expression", "was", "normalized", "to", "Mical", "expression", "in", "neighboring", "ddaE", "c1da", "neurons", "(", "marked", "by", "asterisks", ")", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ".", "The", "numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "each", "graph", "(", "data", "were", "not", "derived", "from", "independent", "experiments", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", "in", "A", "and", "E", "are", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C4da neurons were labeled by CD8::GFP expression under ppk-GAL4, and expression of Sox14 was assessed by immunofluorescence. A - C Sox14 stainings at 2 h APF. (A) Control c4da neurons. (B) C4da neurons expressing PP2A-29B dsRNA. (C) C4da neuron expressing dominant-negative Mts. D Quantification of Sox14 expression in (A - C). C4da neuron Sox14 expression was normalized to Sox14 expression in neighboring ddaE c1da neurons (identified by characteristic cell body shape). Data are mean +/- s. d.. The numbers of neurons (animals) for each genotype are given in each graph (data were not derived from independent experiments). n. s., not significant, *** P<0.0005, Wilcoxon's test. C4da neurons were labeled by CD8::GFP expression under ppk-GAL4, and expression of Mical was assessed by immunofluorescence. E - H Mical stainings at the indicated time points. (E) Mical expression in control c4da neurons at 2 h APF. (F) Mical expression in c4da neurons expressing dominant-negative Mts at 2 h APF. (G) Mical expression in c4da neurons expressing PP2A-29B dsRNA at 2 h APF. (H) Mical expression in c4da neurons expressing Orco dsRNA at 0 h APF. (I) Mical expression in c4da neurons expressing PP2A-29B dsRNA at 0 h APF. J Quantification of Mical expression in (E - I). C4da neuron Mical expression was normalized to Mical expression in neighboring ddaE c1da neurons (marked by asterisks). Data are mean +/- s. d.. The numbers of neurons (animals) for each genotype are given in each graph (data were not derived from independent experiments). n. s., not significant, ** P<0.005, *** P<0.0005, Wilcoxon's test. Data information: Scale bars in A and E are 10 μm. "}
{"words": ["Figure", "4", "A", "-", "G", "The", "indicated", "UAS", "-", "tsr", "constructs", "were", "tested", "for", "their", "ability", "to", "suppress", "pruning", "defects", "induced", "by", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "expression", ".", "Suppression", "tests", "were", "performed", "as", "in", "Figure", "2", ".", "Panels", "A", "-", "C", "show", "effects", "of", "the", "expression", "of", "wild", "type", "or", "phosphomutant", "tsr", "variants", "on", "dendrite", "pruning", ",", "panels", "D", "-", "G", "show", "neurons", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", ".", "(", "A", ",", "E", ")", "C4da", "neuron", "(", "co", "-", ")", "overexpressing", "wild", "type", "tsr", ".", "(", "B", ",", "F", ")", "C4da", "neuron", "(", "co", "-", ")", "overexpressing", "tsr", "S3A", ".", "(", "C", ",", "G", ")", "C4da", "neuron", "(", "co", "-", ")", "overexpressing", "tsr", "S3E", ".", "The", "arrow", "in", "panel", "G", "denotes", "a", "characteristic", "varicosity", "at", "the", "tip", "of", "an", "unpruned", "dendrite", ".", "(", "D", ")", "C4da", "neuron", "co", "-", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "lacZ", "as", "a", "UAS", "titration", "control", ".", "H", "Penetrance", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "A", "-", "G", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", ".", "I", "Severity", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "A", "-", "G", "as", "assessed", "by", "number", "of", "primary", "and", "secondary", "dendrites", "attached", "to", "soma", "at", "18", "h", "APF", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", ".", "J", "-", "L", "GFP", "-", "tagged", "Drosophila", "cofilin", "(", "GFP", ":", ":", "tsr", ")", "was", "expressed", "in", "c4da", "neurons", "under", "ppk", "-", "GAL4", ",", "and", "its", "localization", "was", "assessed", "at", "the", "indicated", "developmental", "stages", "by", "live", "imaging", ".", "Panels", "J", "-", "L", "show", "GFP", ":", ":", "tsr", "localization", "in", "c4da", "neurons", "at", "the", "third", "instar", "stage", ",", "panels", "J", "'", "-", "L", "'", "show", "GFP", ":", ":", "tsr", "localization", "in", "c4da", "neurons", "at", "6", "h", "APF", ".", "(", "J", ",", "J", "'", ")", "Control", "c4da", "neurons", "expressing", "Orco", "dsRNA", ".", "(", "K", ",", "K", "'", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "Mical", "dsRNA", ".", "(", "L", ",", "L", "'", ")", "C4da", "neurons", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", ".", "M", "Quantification", "of", "GFP", ":", ":", "tsr", "punctae", "in", "samples", "J", "-", "L", "'", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ",", "the", "numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "analyzed", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", "(", "data", "were", "not", "derived", "from", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A - G The indicated UAS-tsr constructs were tested for their ability to suppress pruning defects induced by PP2A-29B dsRNA expression. Suppression tests were performed as in Figure 2. Panels A - C show effects of the expression of wild type or phosphomutant tsr variants on dendrite pruning, panels D - G show neurons coexpressing PP2A-29B dsRNA. (A, E) C4da neuron (co-)overexpressing wild type tsr. (B, F) C4da neuron (co-)overexpressing tsr S3A. (C, G) C4da neuron (co-)overexpressing tsr S3E. The arrow in panel G denotes a characteristic varicosity at the tip of an unpruned dendrite. (D) C4da neuron co-expressing PP2A-29B dsRNA and lacZ as a UAS titration control. H Penetrance of pruning defects in panels A - G. * P<0.05, Fisher's exact test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. I Severity of pruning defects in panels A - G as assessed by number of primary and secondary dendrites attached to soma at 18 h APF. Data are mean +/- s. d., * P<0.05, Wilcoxon's test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. J - L GFP-tagged Drosophila cofilin (GFP::tsr) was expressed in c4da neurons under ppk-GAL4, and its localization was assessed at the indicated developmental stages by live imaging. Panels J - L show GFP::tsr localization in c4da neurons at the third instar stage, panels J' - L' show GFP::tsr localization in c4da neurons at 6 h APF. (J, J') Control c4da neurons expressing Orco dsRNA. (K, K') C4da neurons expressing Mical dsRNA. (L, L') C4da neurons expressing PP2A-29B dsRNA. M Quantification of GFP::tsr punctae in samples J - L'. Data are mean +/- s. d., the numbers of neurons (animals) analyzed for each genotype are given in the figure (data were not derived from independent experiments). ** P<0.005, *** P<0.0005, n. s., not significant, Wilcoxon's test. "}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "H", "Genetic", "interactions", "between", "PP2A", "-", "29B", "and", "actin", "regulators", "during", "dendrite", "pruning", ".", "The", "indicated", "manipulations", "of", "actin", "regulators", "were", "tested", "for", "their", "ability", "to", "suppress", "pruning", "defects", "induced", "by", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "expression", ".", "Suppression", "tests", "were", "performed", "as", "in", "Figure", "2", ".", "(", "A", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "tdtomato", "as", "suppression", "control", ".", "(", "B", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "GFP", ":", ":", "tsr", ".", "(", "C", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "RacN17", ".", "(", "D", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "RhoN19", ".", "(", "E", ")", "C4da", "neuron", "expressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "in", "ena210", "/", "+", "background", ".", "(", "F", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "Orco", "dsRNA", "as", "suppression", "control", ".", "(", "G", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "Chicadee", "dsRNA", ".", "(", "H", ")", "C4da", "neuron", "coexpressing", "PP2A", "-", "29B", "dsRNA", "and", "moesin", "dsRNA", ".", "I", "Penetrance", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "E", "-", "L", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", ".", "J", "Severity", "of", "pruning", "defects", "in", "panels", "E", "-", "L", "as", "assessed", "by", "number", "of", "primary", "and", "secondary", "dendrites", "attached", "to", "soma", "at", "18", "h", "APF", ".", "Data", "are", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "d", ".", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0005", ",", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ".", "Numbers", "of", "neurons", "(", "animals", ")", "for", "each", "genotype", "are", "given", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A - H Genetic interactions between PP2A-29B and actin regulators during dendrite pruning. The indicated manipulations of actin regulators were tested for their ability to suppress pruning defects induced by PP2A-29B dsRNA expression. Suppression tests were performed as in Figure 2. (A) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and tdtomato as suppression control. (B) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and GFP::tsr. (C) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and RacN17. (D) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and RhoN19. (E) C4da neuron expressing PP2A-29B dsRNA in ena210/+ background. (F) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and Orco dsRNA as suppression control. (G) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and Chicadee dsRNA. (H) C4da neuron coexpressing PP2A-29B dsRNA and moesin dsRNA. I Penetrance of pruning defects in panels E - L. n. s., not significant, Fisher's exact test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. J Severity of pruning defects in panels E - L as assessed by number of primary and secondary dendrites attached to soma at 18 h APF. Data are mean +/- s. d., * P<0.05, ** P<0.005, *** P<0.0005, Wilcoxon's test. Numbers of neurons (animals) for each genotype are given in the figure. "}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "SHARPIN", "expression", "in", "the", "human", "mammary", "gland", ".", "Cross", "-", "section", "of", "a", "mammary", "duct", "(", "upper", "panel", ")", "and", "magnification", "of", "the", "marked", "area", "(", "lower", "panel", ")", ".", "SHARPIN", "-", "positive", "luminal", "(", "grey", "arrow", ")", "and", "stromal", "cells", "(", "red", "arrow", ")", ",", "and", "the", "approximate", "position", "of", "the", "basal", "lamina", "(", "dashed", "red", "line", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "SHARPIN", "protein", "expression", "in", "isolated", "primary", "mammary", "epithelial", "cells", "(", "MECs", ")", "and", "mammary", "stromal", "fibroblasts", "(", "MSFs", ")", ".", "CDH1", "and", "vimentin", "were", "used", "as", "markers", "of", "epithelial", "and", "stromal", "cell", "lineages", ",", "respectively", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "control", "for", "protein", "loading", ".", "C", ".", "FACS", "-", "based", "isolation", "of", "mouse", "mammary", "gland", "basal", "epithelial", "cells", "(", "LinnegCD24intICAM", "-", "1hi", ")", ",", "mature", "luminal", "epithelial", "cells", "(", "LinnegCD24hiICAM", "-", "1neg", ")", ",", "luminal", "progenitor", "cells", "(", "LinnegCD24hiICAM", "-", "1int", ")", ",", "and", "stromal", "cells", "(", "LinnegCD24neg", ")", ".", "D", ".", "Quantitative", "PCR", "analysis", "of", "SHARPIN", "mRNA", "expression", "in", "cell", "populations", "isolated", "in", "(", "C", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", "-", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunohistochemical analysis of SHARPIN expression in the human mammary gland. Cross-section of a mammary duct (upper panel) and magnification of the marked area (lower panel). SHARPIN-positive luminal (grey arrow) and stromal cells (red arrow), and the approximate position of the basal lamina (dashed red line) are indicated. Scale bar represents 50 μm.B. Western blot analysis of SHARPIN protein expression in isolated primary mammary epithelial cells (MECs) and mammary stromal fibroblasts (MSFs). CDH1 and vimentin were used as markers of epithelial and stromal cell lineages, respectively. GAPDH served as a control for protein loading.C. FACS-based isolation of mouse mammary gland basal epithelial cells (LinnegCD24intICAM-1hi), mature luminal epithelial cells (LinnegCD24hiICAM-1neg), luminal progenitor cells (LinnegCD24hiICAM-1int), and stromal cells (LinnegCD24neg).D. Quantitative PCR analysis of SHARPIN mRNA expression in cell populations isolated in (C) (mean ± SEM, n = 3 - 5)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "G", ".", "Mammary", "ductal", "outgrowth", "in", "3", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "or", "Sharpincpdm", "female", "mice", ".", "A", ".", "Representative", "carmine", "-", "alum", "stained", "mammary", "gland", "whole", "mounts", ".", "Arrow", "indicates", "the", "inguinal", "lymph", "node", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "mm", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "mammary", "ductal", "outgrowth", "area", "(", "n", "=", "4", "-", "15", "glands", ")", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "ductal", "branch", "points", "per", "mammary", "gland", "(", "n", "=", "7", "-", "9", "glands", ",", "7", "weeks", "old", "mice", ")", ".", "A", "-", "G", ".", "Mammary", "ductal", "outgrowth", "in", "3", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "or", "Sharpincpdm", "female", "mice", ".", "D", ".", "Cryosections", "from", "7", "weeks", "old", "wt", "or", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "glands", "stained", "with", "HE", "(", "upper", "panel", ")", "or", "immunolabelled", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Scale", "bars", "represent", "20", "μmA", "-", "G", ".", "Mammary", "ductal", "outgrowth", "in", "3", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "or", "Sharpincpdm", "female", "mice", ".", "E", ".", "Representative", "carmine", "-", "alum", "stained", "images", "highlighting", "terminal", "end", "buds", "(", "TEBs", ")", "in", "7", "weeks", "old", "wt", "and", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "glands", "and", "F", ".", "quantification", "of", "the", "number", "of", "TEBs", "per", "gland", "(", "n", "=", "9", "-", "10", "glands", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "500", "μm", ".", "A", "-", "G", ".", "Mammary", "ductal", "outgrowth", "in", "3", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "or", "Sharpincpdm", "female", "mice", ".", "G", ".", "TEBs", "in", "paraffin", "sections", "from", "wt", "or", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "glands", "stained", "with", "HE", "(", "upper", "panel", ")", "or", "immunolabelled", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "µm", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-G. Mammary ductal outgrowth in 3-7 weeks old wt or Sharpincpdm female mice. A. Representative carmine-alum stained mammary gland whole mounts. Arrow indicates the inguinal lymph node. Scale bars represent 2 mm. B. Quantification of mammary ductal outgrowth area (n = 4 - 15 glands). C. Quantification of the number of ductal branch points per mammary gland (n = 7 - 9 glands, 7 weeks old mice).A-G. Mammary ductal outgrowth in 3-7 weeks old wt or Sharpincpdm female mice. D. Cryosections from 7 weeks old wt or Sharpincpdm mouse mammary glands stained with HE (upper panel) or immunolabelled with the indicated antibodies. Scale bars represent 20 μmA-G. Mammary ductal outgrowth in 3-7 weeks old wt or Sharpincpdm female mice. E. Representative carmine-alum stained images highlighting terminal end buds (TEBs) in 7 weeks old wt and Sharpincpdm mouse mammary glands and F. quantification of the number of TEBs per gland (n = 9 - 10 glands). Scale bar represents 500 μm.A-G. Mammary ductal outgrowth in 3-7 weeks old wt or Sharpincpdm female mice. G. TEBs in paraffin sections from wt or Sharpincpdm mouse mammary glands stained with HE (upper panel) or immunolabelled with the indicated antibodies (lower panel). Scale bars represent 50 µm. Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", ".", "Monitoring", "of", "mammary", "gland", "development", "following", "transplantation", "of", "wt", "or", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "epithelium", "in", "the", "mammary", "fat", "pads", "(", "epithelium", "-", "free", ")", "of", "virgin", "wt", "mice", ".", "A", ".", "Representative", "carmine", "-", "alum", "stained", "images", "of", "mouse", "mammary", "glands", "generated", "from", "wt", "or", "Sharpincpdm", "epithelial", "tissue", "transplants", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "transplant", "growth", "take", "-", "on", "-", "rate", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "fat", "pad", "filling", "rate", "of", "grown", "transplants", "(", "n", "=", "7", "-", "10", ")", "in", "wt", "hosts", ".", "D", ".", "Monitoring", "of", "mammary", "gland", "differentiation", "during", "pregnancy", "following", "transplantation", "of", "wt", "or", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "epithelium", "into", "wt", "hosts", ".", "Host", "animals", "were", "subsequently", "mated", "and", "mammary", "glands", "isolated", "at", "P15", ".", "Representative", "Carmine", "-", "alum", "stained", "mammary", "gland", "whole", "mounts", "generated", "from", "wt", "and", "cdpm", "mammary", "epithelial", "transplants", "(", "upper", "panel", ")", ",", "and", "magnifications", "of", "the", "branched", "ductal", "epithelium", "(", "lower", "panel", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "1", "mm", ".", "E", ".", "Representative", "images", "of", "carmine", "-", "alum", "stained", "mouse", "mammary", "gland", "whole", "mounts", "generated", "from", "7", "weeks", "old", "S100a4", "-", "Cre", ";", "Sharpinfl", "/", "fl", "conditional", "knockout", "mice", "and", "their", "littermate", "controls", "(", "S100a4", "-", "Cre", ";", "Sharpin", "fl", "/", "+", ")", "F", ".", "Quantification", "of", "the", "normalized", "Sharpincpdm", "and", "S100a4", "-", "Cre", ";", "Sharpinfl", "/", "fl", "mammary", "ductal", "outgrowth", "area", "relative", "to", "littermate", "control", "mice", "(", "wt", "and", "Sharpincpdm", "n", "=", "10", "glands", ";", "S100a4", "-", "Cre", ";", "Sharpin", "fl", "/", "+", "and", "S100a4", "-", "Cre", ";", "Sharpinfl", "/", "fl", "n", "=", "8", "glands", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TEBs", "per", "gland", "(", "n", "=", "8", "-", "9", "glands", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C. Monitoring of mammary gland development following transplantation of wt or Sharpincpdm mouse mammary epithelium in the mammary fat pads (epithelium-free) of virgin wt mice. A. Representative carmine-alum stained images of mouse mammary glands generated from wt or Sharpincpdm epithelial tissue transplants. B. Quantification of transplant growth take-on-rate (n = 17). C. Quantification of fat pad filling rate of grown transplants (n = 7 - 10) in wt hosts.D. Monitoring of mammary gland differentiation during pregnancy following transplantation of wt or Sharpincpdm mouse mammary epithelium into wt hosts. Host animals were subsequently mated and mammary glands isolated at P15. Representative Carmine-alum stained mammary gland whole mounts generated from wt and cdpm mammary epithelial transplants (upper panel), and magnifications of the branched ductal epithelium (lower panel) are shown (n = 5 mice). Scale bars represent 1 mm.E. Representative images of carmine-alum stained mouse mammary gland whole mounts generated from 7 weeks old S100a4-Cre; Sharpinfl/fl conditional knockout mice and their littermate controls (S100a4-Cre; Sharpin fl/+) F. Quantification of the normalized Sharpincpdm and S100a4-Cre; Sharpinfl/fl mammary ductal outgrowth area relative to littermate control mice (wt and Sharpincpdm n = 10 glands; S100a4-Cre; Sharpin fl/+ and S100a4-Cre; Sharpinfl/fl n = 8 glands). G. Quantification of the number of TEBs per gland (n = 8 - 9 glands). Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Second", "harmonic", "generation", "(", "SHG", ")", "and", "unfiltered", "multiphoton", "(", "MP", ")", "imaging", "of", "collagen", "fibres", "surrounding", "TEBs", "(", "dashed", "line", ")", "in", "6", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "and", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "glands", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "mice", ",", "5", "-", "13", "TEBs", "analysed", "per", "mouse", ";", "scale", "bars", "represent", "100", "µm", ")", ".", "Magnified", "images", "of", "collagen", "fibres", "are", "also", "shown", "(", "scale", "bars", "represent", "50", "µm", ")", ".", "B", ".", "Frequency", "of", "clear", "collagen", "bundles", "around", "TEBs", "per", "mouse", "(", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "6", "-", "9", "mice", ")", ".", "C", ".", "AFM", "indentation", "analysis", "of", "stromal", "stiffness", "in", "6", "-", "7", "weeks", "old", "wt", "and", "Sharpincpdm", "mouse", "mammary", "gland", "tissue", "sections", "(", "n", "=", "3", "mice", ";", "3", "-", "6", "sample", "sections", "per", "mouse", "and", "192", "indentation", "curves", "per", "sample", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Second harmonic generation (SHG) and unfiltered multiphoton (MP) imaging of collagen fibres surrounding TEBs (dashed line) in 6-7 weeks old wt and Sharpincpdm mouse mammary glands (n = 6 - 9 mice, 5 - 13 TEBs analysed per mouse; scale bars represent 100 µm). Magnified images of collagen fibres are also shown (scale bars represent 50 µm). B. Frequency of clear collagen bundles around TEBs per mouse (Mean ± SEM, n = 6 - 9 mice).C. AFM indentation analysis of stromal stiffness in 6-7 weeks old wt and Sharpincpdm mouse mammary gland tissue sections (n = 3 mice; 3 - 6 sample sections per mouse and 192 indentation curves per sample)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Ingenuity", "Pathway", "Analysis", "of", "differential", "gene", "expression", "(", "fold", "-", "change", "(", "FC", ")", ">", "1", ".", "5", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSFs", "(", "passage", "0", ")", ".", "The", "differentially", "expressed", "genes", "implicated", "in", "the", "most", "significantly", "altered", "canonical", "pathways", "(", "leukocyte", "adhesion", "and", "transmigration", ",", "and", "tissue", "fibrosis", ")", "are", "shown", ".", "Three", "independent", "cell", "isolation", "replicates", "were", "compared", "pairwise", ".", "FC", "colour", "scale", "represents", "a", "range", "from", "0", "−", "4", ".", "B", ".", "Analysis", "of", "collagen", "degradation", "on", "cross", "-", "bow", "-", "shaped", "micropatterns", "coated", "with", "the", "DQ", "collagen", "substrate", ".", "Mean", "intensity", "projection", "images", "of", "the", "DQ", "collagen", "fluorescence", "(", "top", "panel", ";", "cell", "area", "is", "outlined", "by", "dashed", "line", ";", "original", "integer", "range", "0", "−", "255", ")", "and", "single", "confocal", "images", "of", "the", "fibrinogen", "-", "Alexa647", "-", "marked", "micropatterns", "(", "bottom", "panel", ")", "are", "shown", "(", "n", "≥", "53", "from", "four", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "C", "-", "D", ".", "Collagen", "plug", "contraction", "assay", "using", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSFs", "or", "wt", "MSFs", "with", "SHARPIN", "siRNA", "silencing", "C", ".", "Representative", "light", "microscopy", "images", "of", "the", "collagen", "plugs", "three", "days", "post", "cell", "culture", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "the", "average", "collagen", "plug", "area", "1", "−", "3", "days", "after", "seeding", "(", "n", "=", "3", "-", "6", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "2", "mm", ".", "E", ".", "SHARPIN", "protein", "level", "after", "silencing", "with", "negative", "control", "siRNA", "or", "SHARPIN", "siRNA", "in", "wt", "MSFs", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "F", "-", "I", ".", "Traction", "force", "microscopy", "analysis", "of", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSFs", "on", "collagen", "-", "coated", "matrices", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "traction", "forces", "observed", "in", "wt", "and", "Sharpincpdm", "cells", "(", "colour", "scale", "units", ":", "Pa", ";", "cell", "boundaries", "are", "indicated", "by", "dashed", "lines", ")", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "strain", "energy", "per", "cell", "(", "n", "=", "8", "−", "11", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "F", "-", "I", ".", "Traction", "force", "microscopy", "analysis", "of", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSFs", "on", "collagen", "-", "coated", "matrices", ".", "H", ".", "Representative", "images", "of", "the", "traction", "forces", "and", "mCherry", "fluorescence", "of", "mCherry", "-", "Ctrl", "transfected", "wt", "cells", "and", "mCherry", "-", "Ctrl", "or", "mCherry", "-", "SHARPIN", "transfected", "Sharpincpdm", "cells", ".", "Scale", "bars", "represent", "20", "µm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "strain", "energy", "per", "cell", "(", "wt", "mCherry", "control", "n", "=", "26", ";", "Sharpincpdm", "mCherry", "-", "Ctrl", "n", "=", "21", ";", "Sharpincpdm", "mCherry", "-", "SHARPIN", "n", "=", "24", "cells", "from", "five", "independent", "experiments", ")", ".", "J", "-", "K", ".", "Focal", "adhesion", "dynamics", ".", "J", ".", "Visualization", "of", "GFP", "-", "Paxillin", "dynamics", "in", "a", "wt", "and", "a", "Sharpincpdm", "cell", "over", "time", ".", "Colour", "scale", "represents", "a", "range", "from", "early", "to", "late", "occurring", "focal", "adhesions", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "focal", "adhesion", "average", "size", ",", "assembly", "rate", "and", "disassembly", "rate", "(", "wt", "n", "=", "17527", ",", "5250", ",", "5311", "FAs", ";", "and", "Sharpincpdm", "n", "=", "9052", ",", "2790", ",", "3264", "FAs", ",", "respectively", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Ingenuity Pathway Analysis of differential gene expression (fold-change (FC) > 1.5, p < 0.05) in wt and Sharpincpdm MSFs (passage 0). The differentially expressed genes implicated in the most significantly altered canonical pathways (leukocyte adhesion and transmigration, and tissue fibrosis) are shown. Three independent cell isolation replicates were compared pairwise. FC colour scale represents a range from 0−4.B. Analysis of collagen degradation on cross-bow-shaped micropatterns coated with the DQ collagen substrate. Mean intensity projection images of the DQ collagen fluorescence (top panel; cell area is outlined by dashed line; original integer range 0 − 255) and single confocal images of the fibrinogen-Alexa647-marked micropatterns (bottom panel) are shown (n ≥ 53 from four independent experiments). Scale bars represent 10 μm.C-D. Collagen plug contraction assay using wt and Sharpincpdm MSFs or wt MSFs with SHARPIN siRNA silencing C. Representative light microscopy images of the collagen plugs three days post cell culture. D. Quantification of the average collagen plug area 1−3 days after seeding (n = 3-6). Scale bars represent 2 mm.E. SHARPIN protein level after silencing with negative control siRNA or SHARPIN siRNA in wt MSFs. Tubulin was used as loading control.F-I. Traction force microscopy analysis of wt and Sharpincpdm MSFs on collagen-coated matrices. F. Representative images of traction forces observed in wt and Sharpincpdm cells (colour scale units: Pa; cell boundaries are indicated by dashed lines). G. Quantification of strain energy per cell (n = 8 − 11 cells from two independent experiments).F-I. Traction force microscopy analysis of wt and Sharpincpdm MSFs on collagen-coated matrices. H. Representative images of the traction forces and mCherry fluorescence of mCherry-Ctrl transfected wt cells and mCherry-Ctrl or mCherry-SHARPIN transfected Sharpincpdm cells. Scale bars represent 20 µm. I. Quantification of strain energy per cell (wt mCherry control n = 26; Sharpincpdm mCherry-Ctrl n = 21; Sharpincpdm mCherry-SHARPIN n = 24 cells from five independent experiments).J-K. Focal adhesion dynamics. J. Visualization of GFP-Paxillin dynamics in a wt and a Sharpincpdm cell over time. Colour scale represents a range from early to late occurring focal adhesions. K. Quantification of focal adhesion average size, assembly rate and disassembly rate (wt n =17527, 5250, 5311 FAs; and Sharpincpdm n= 9052, 2790, 3264 FAs, respectively from two independent experiments). Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Quantification", "of", "soluble", "collagen", "levels", "in", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSF", "cultures", "on", "days", "2", ",", "5", "and", "7", "post", "serum", "removal", "(", "n", "=", "6", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "B", "-", "C", ".", "Analysis", "of", "the", "collagen", "network", "in", "cell", "-", "derived", "matrices", "(", "CDMs", ")", "produced", "by", "wt", "and", "Sharpincpdm", "MSFs", "using", "COL1A1", "immunolabelling", ".", "B", ".", "Maximum", "intensity", "projections", "of", "confocal", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "μm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "distinct", "collagen", "fibre", "bundles", "in", "wt", "and", "Sharpincpdm", "CDM", "samples", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Quantification of soluble collagen levels in wt and Sharpincpdm MSF cultures on days 2, 5 and 7 post serum removal (n = 6 from two independent experiments).B-C. Analysis of the collagen network in cell-derived matrices (CDMs) produced by wt and Sharpincpdm MSFs using COL1A1 immunolabelling. B. Maximum intensity projections of confocal images are shown. Scale bars represent 50 μm. C. Quantification of distinct collagen fibre bundles in wt and Sharpincpdm CDM samples (n = 5). Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2Cells", "were", "fixed", "and", "the", "viral", "bait", "fused", "with", "the", "V5", "-", "tag", "was", "visualized", "by", "immunofluorescence", "staining", "using", "Alexa", "Fluor", "-", "488", "labeled", "anti", "-", "V5", "immunostaining", "(", "yellow", ")", ",", "actin", "with", "Alexa", "Fluor594", "-", "labeled", "phalloidin", "(", "magenta", ")", ",", "and", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", "(", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cells were fixed and the viral bait fused with the V5-tag was visualized by immunofluorescence staining using Alexa Fluor-488 labeled anti-V5 immunostaining (yellow), actin with Alexa Fluor594-labeled phalloidin (magenta), and nuclei were stained with DAPI (cyan) (Scale bar: 10 μm)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Viral", "bait", "-", "bait", "correlation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Viral bait-bait correlation."}
{"words": ["Figure", "6A", "For", "the", "image", "-", "based", "drug", "screening", ",", "Calu", "-", "1", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "in", "the", "presence", "of", "drugs", "with", "indicated", "doses", "for", "48", " ", "h", ",", "immunostained", ",", "imaged", "and", "analyzed", ".", "The", "example", "images", "of", "mock", "-", "infected", "cells", "and", "virus", "-", "infected", "control", "cells", "(", "no", "drugs", ")", ".", "The", "viral", "yield", "in", "cells", "was", "detected", "with", "an", "antibody", "for", "the", "viral", "N", "protein", "(", "virus", "-", "infected", "cells", ";", "upper", "image", ")", ",", "and", "nuclear", "staining", "(", "mock", "-", "infected", "cells", ";", "lower", "image", ")", "(", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ")", ".", "B", "The", "dose", "-", "response", "curves", "for", "six", "drugs", "with", "potential", "antiviral", "effects", ".", "The", "drug", "-", "induced", "inhibition", "of", "virus", "infection", "(", "count", "of", "N", "protein", "positive", "cells", ")", "was", "quantified", "using", "the", "area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ")", "values", ".", "C", "The", "effect", "of", "drugs", "on", "cell", "viability", "in", "the", "presence", "of", "the", "virus", ",", "e", ".", "g", ".", ",", "cytotoxicity", "was", "evaluated", "by", "the", "count", "of", "nuclei", ".", "D", "Inhibition", "of", "interactions", "formed", "with", "DDX39B", "in", "the", "presence", "of", "MTX", "using", "co", "-", "IP", "assay", ".", "DDX39B", "is", "fused", "to", "the", "C", "terminus", "of", "a", "V5", "tag", ",", "and", "the", "interaction", "partner", "is", "fused", "with", "a", "Strep", "-", "HA", "tag", ".", "The", "diagram", "(", "upper", ")", "shows", "the", "interaction", "pairs", "formed", "with", "DDX39B", "used", "for", "co", "-", "IP", "assay", ".", "Dot", "-", "blot", "results", "(", "lower", ")", "show", "the", "interaction", "pairs", "(", "arrangement", "as", "upper", "panel", ")", "in", "presence", "of", "different", "concentration", "of", "MTX", "as", "indicated", "on", "the", "top", "of", "the", "image", ".", "The", "image", "displayed", "is", "representative", "of", "3", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "DDX39B", "binding", "to", "different", "interaction", "partners", ".", "Quantification", "of", "V5", "-", "tagged", "DDX39B", "protein", "amount", "was", "normalized", "over", "HA", "-", "tagged", "interaction", "partner", "intensity", "and", "displayed", "as", "a", "fold", "change", "over", "the", "ratio", "of", "untreated", "cells", ".", "Data", "that", "represent", "the", "mean", "of", "3", "replicates", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "A", "fold", "change", ">", "0", ".", "5", "is", "considered", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A For the image-based drug screening, Calu-1 cells were infected with SARS-CoV-2 in the presence of drugs with indicated doses for 48 h, immunostained, imaged and analyzed. The example images of mock-infected cells and virus-infected control cells (no drugs). The viral yield in cells was detected with an antibody for the viral N protein (virus-infected cells; upper image), and nuclear staining (mock-infected cells; lower image) (Scale bar: 200 μm).B The dose-response curves for six drugs with potential antiviral effects. The drug-induced inhibition of virus infection (count of N protein positive cells) was quantified using the area under the curve (AUC) values.C The effect of drugs on cell viability in the presence of the virus, e.g., cytotoxicity was evaluated by the count of nuclei.D Inhibition of interactions formed with DDX39B in the presence of MTX using co-IP assay. DDX39B is fused to the C terminus of a V5 tag, and the interaction partner is fused with a Strep-HA tag. The diagram (upper) shows the interaction pairs formed with DDX39B used for co-IP assay. Dot-blot results (lower) show the interaction pairs (arrangement as upper panel) in presence of different concentration of MTX as indicated on the top of the image. The image displayed is representative of 3 replicates (n = 3).E Quantification of DDX39B binding to different interaction partners. Quantification of V5-tagged DDX39B protein amount was normalized over HA-tagged interaction partner intensity and displayed as a fold change over the ratio of untreated cells. Data that represent the mean of 3 replicates are highlighted in red. A fold change > 0.5 is considered significant."}
{"words": ["Figure", "1A", "αSMA", "mRNA", "levels", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "and", "the", "effect", "of", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "001", ".", "B", "Collagen1α2", "mRNA", "levels", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "±", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "01", ".", "C", "mRNA", "levels", "of", "ER", "-", "stress", "related", "genes", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", ".", "*", "P", "CHOP", "=", "0", ",", "045", ",", "*", "P", "Bip", "=", "0", ",", "023", ",", "*", "P", "spliced", "XBP", "-", "1", "P", "=", "0", ",", "001", ",", "compared", "to", "corresponding", "control", ".", "D", "Western", "blot", "of", "CHOP", "protein", "levels", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "cells", "±", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "E", "Agarose", "gel", "showing", "the", "presence", "of", "spliced", "and", "unspliced", "XBP", "-", "1", "mRNA", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "±", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "F", "Immunohistochemistry", "staining", "of", "αSMA", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1fibroblasts", "±", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "Scale", "bars", "=", "20μm", ".", "G", "Quantification", "of", "secreted", "soluble", "collagen", "proteins", "produced", "by", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "cells", "±", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "049", ".", "H", "αSMA", "mRNA", "expression", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "cells", "overexpressing", "two", "RNase", "dead", "mutants", "(", "K599A", "and", "K907A", ")", "of", "IRE1α", ".", "*", "P", "K599A", "=", "0", ".", "013", ",", "*", "P", "K907A", "=", "0", ".", "0008", "compared", "to", "WT", ".", "I", "αSMA", "mRNA", "expression", "in", "TGFβ", "-", "treated", "IRE1α", "-", "/", "-", "or", "WT", "MEF", "cells", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "025", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A αSMA mRNA levels in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts and the effect of the IRE1α inhibitor 4μ8C. *P = 0,001.B Collagen1α2 mRNA levels in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts ± the IRE1α inhibitor 4μ8C. *P = 0,01.C mRNA levels of ER-stress related genes in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts. *P CHOP = 0,045, *P Bip = 0,023, *P spliced XBP-1 P = 0,001, compared to corresponding control.D Western blot of CHOP protein levels in TGFβ-treated HFL1 cells ± the IRE1α inhibitor 4μ8C.E Agarose gel showing the presence of spliced and unspliced XBP-1 mRNA in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts ± the IRE1α inhibitor 4μ8C.F Immunohistochemistry staining of αSMA in TGFβ-treated HFL1fibroblasts ± the IRE1α inhibitor 4μ8C. Scale bars = 20μm.G Quantification of secreted soluble collagen proteins produced by TGFβ-treated HFL1 cells ± the IRE1α inhibitor 4μ8C. *P = 0,049.H αSMA mRNA expression in TGFβ-treated HFL1 cells overexpressing two RNase dead mutants (K599A and K907A) of IRE1α. *P K599A = 0.013, *P K907A = 0.0008 compared to WT.I αSMA mRNA expression in TGFβ-treated IRE1α -/- or WT MEF cells. *P = 0.025."}
{"words": ["Figure", "2A", "miR", "-", "150", "levels", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "and", "the", "effect", "of", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "046", "compared", "to", "control", ".", "B", "miR", "-", "150", "levels", "in", "HFL1", "fibroblasts", "overexpressing", "two", "RNase", "dead", "mutants", "(", "K599A", "and", "K907A", ")", "of", "IRE1α", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0043", "(", "K599A", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "043", "(", "K907A", ")", ",", "compared", "to", "control", ".", "C", "miR", "-", "150", "levels", "in", "TGFβ", "-", "treated", "WT", "(", "IRE1α", "+", "/", "+", ")", "and", "IRE1α", "-", "/", "-", "MEF", "cells", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "018", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "compared", "to", "the", "Ctrl", ".", "D", "miR", "-", "150", "levels", "in", "IRE1α", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "that", "were", "either", "untransfected", "(", "UT", ")", "or", "transfected", "with", "miRNA", "inhibitor", "control", "(", "siCtrl", ")", "or", "with", "a", "miR", "-", "150", "-", "5p", "miRNA", "inhibitor", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "034", "compared", "to", "UT", ".", "E", "αSMA", "mRNA", "expression", "in", "TGFβ", "-", "treated", "IRE1α", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "that", "were", "either", "untransfected", "(", "UT", ")", "or", "transfected", "with", "miRNA", "inhibitor", "control", "(", "siCtrl", ")", "or", "with", "a", "miR150", "-", "5p", "miRNA", "inhibitor", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "043", "compared", "to", "UT", ".", "F", "miR", "-", "150", "levels", "in", "HFL1", "fibroblasts", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", "(", "Ctrl", ")", "or", "a", "miR", "-", "150", "expression", "plasmid", "(", "miR150", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "038", ".", "G", "Western", "blot", "of", "c", "-", "Myb", "in", "TGFβ", "-", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "that", "were", "either", "untransfected", "(", "UT", ")", ",", "transfected", "with", "a", "control", "plasmid", "(", "pCtrl", ")", "or", "a", "miR150", "expression", "plasmid", "(", "miR150", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0206", "in", "UT", "Ctrl", "vs", ".", "UT", "TGFβ", "and", "P", "=", "0", ".", "0126", "in", "pCtrl", "Ctrl", "vs", ".", "pCtrl", "TGFβ", ".", "H", "Western", "blot", "of", "αSMA", "in", "the", "same", "experimental", "setup", "as", "in", "G", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0405", "in", "UT", "Ctrl", "vs", ".", "UT", "TGFβ", ",", "and", "P", "=", "0", ".", "0284", "in", "pCtrl", "Ctrl", "vs", ".", "pCtrl", "TGFβ", ".", "I", "c", "-", "Myb", "mRNA", "levels", "in", "untransfected", "HFL1", "cells", "(", "UT", ")", "and", "in", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "an", "siRNA", "targeting", "c", "-", "Myb", "(", "sicMyb", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "00001", "compared", "to", "UT", ".", "J", "αSMA", "mRNA", "expression", "in", "untransfected", "HFL1", "cells", "(", "UT", ")", "and", "in", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "with", "a", "siRNA", "targeting", "c", "-", "Myb", "(", "sicMyb", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0042", "in", "UT", "Ctrl", "vs", ".", "UT", "TGFβ", ".", "L", "In", "vitro", "cleavage", "assay", "with", "recombinant", "IRE1α", "and", "miR", "-", "150", "(", "left", ")", "or", "XBP", "-", "1", "(", "right", ")", ".", "M", "miR", "-", "150", "expression", "in", "HFL", "-", "1", "cells", "that", "were", "pre", "-", "treated", "with", "TGFβ", "in", "the", "absence", "of", "presence", "of", "4μ8C", "and", "then", "treated", "with", "Actinomycin", "D", "(", "ActD", ")", "for", "4", "and", "24", "hours", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "027", "compared", "to", "TGFβ", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A miR-150 levels in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts and the effect of the IRE1α inhibitor 4μ8C. * P = 0.046 compared to control.B miR-150 levels in HFL1 fibroblasts overexpressing two RNase dead mutants (K599A and K907A) of IRE1α. * P = 0.0043 (K599A), P = 0.043 (K907A), compared to control.C miR-150 levels in TGFβ-treated WT (IRE1α +/+) and IRE1α -/- MEF cells. *P = 0.018. Results are expressed as fold change compared to the Ctrl.D miR-150 levels in IRE1α -/- MEF cells that were either untransfected (UT) or transfected with miRNA inhibitor control (siCtrl) or with a miR-150-5p miRNA inhibitor. * P = 0.034 compared to UT.E αSMA mRNA expression in TGFβ-treated IRE1α -/- MEF cells that were either untransfected (UT) or transfected with miRNA inhibitor control (siCtrl) or with a miR150-5p miRNA inhibitor. *P = 0.043 compared to UT.F miR-150 levels in HFL1 fibroblasts transfected with a control plasmid (Ctrl) or a miR-150 expression plasmid (miR150). * P = 0.038.G Western blot of c-Myb in TGFβ-treated HFL1 fibroblasts that were either untransfected (UT), transfected with a control plasmid (pCtrl) or a miR150 expression plasmid (miR150). *P = 0.0206 in UT Ctrl vs. UT TGFβ and P = 0.0126 in pCtrl Ctrl vs. pCtrl TGFβ .H Western blot of αSMA in the same experimental setup as in G. * P = 0.0405 in UT Ctrl vs. UT TGFβ, and P = 0.0284 in pCtrl Ctrl vs. pCtrl TGFβ.I c-Myb mRNA levels in untransfected HFL1 cells (UT) and in cells transfected with a control siRNA (siCtrl) or an siRNA targeting c-Myb (sicMyb). * P = 0.00001 compared to UT.J αSMA mRNA expression in untransfected HFL1 cells (UT) and in cells transfected with a control siRNA (siCtrl) or with a siRNA targeting c-Myb (sicMyb). * P = 0.0042 in UT Ctrl vs. UT TGFβ.L In vitro cleavage assay with recombinant IRE1α and miR-150 (left) or XBP-1 (right).M miR-150 expression in HFL-1 cells that were pre-treated with TGFβ in the absence of presence of 4μ8C and then treated with Actinomycin D (ActD) for 4 and 24 hours. * P = 0.027 compared to TGFβ."}
{"words": ["Figure", "3A", "Analysis", "of", "ER", "size", "in", "HFL1", "fibroblasts", "treated", "with", "TGFβ", "in", "the", "absence", "(", "Ctrl", ")", "or", "presence", "of", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ",", "or", "in", "HFL1", "cells", "transfected", "with", "a", "siRNA", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "with", "siRNA", "targeting", "XBP", "-", "1", "(", "siXBP", "-", "1", ")", ".", "The", "ER", "was", "visualized", "with", "ER", "tracker", "Red", "and", "nuclei", "stained", "with", "Hoechst", "(", "left", ",", "scale", "bars", "=", "20", "μm", ")", "or", "by", "electron", "microscopy", "(", "right", ",", "scale", "bars", "=", "200", "nm", ")", "where", "red", "lines", "mark", "the", "ER", ".", "B", "Quantification", "of", "ER", "size", "relative", "to", "the", "nucleus", "from", "the", "experimental", "setup", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", "in", "Ctrl", ",", "and", "*", "P", "=", "0", ".", "0223", "in", "siCtrl", ".", "C", "XBP", "-", "1", "mRNA", "expression", "in", "untransfected", "HFL1", "cells", "(", "UT", ")", "and", "in", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "siRNA", "targeting", "XBP", "-", "1", "(", "siXBP", "-", "1", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "0001", ".", "D", "Collagen", "protein", "levels", "in", "TGFβ", "treated", "HFL1", "fibroblasts", "transfected", "as", "described", "in", "C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Analysis of ER size in HFL1 fibroblasts treated with TGFβ in the absence (Ctrl) or presence of the IRE1α inhibitor 4μ8C, or in HFL1 cells transfected with a siRNA control siRNA (siCtrl) or with siRNA targeting XBP-1 (siXBP-1). The ER was visualized with ER tracker Red and nuclei stained with Hoechst (left, scale bars = 20 μm) or by electron microscopy (right, scale bars = 200 nm) where red lines mark the ER.B Quantification of ER size relative to the nucleus from the experimental setup in A. * P = 0.0001 in Ctrl, and * P = 0.0223 in siCtrl.C XBP-1 mRNA expression in untransfected HFL1 cells (UT) and in cells transfected with control siRNA (siCtrl) or siRNA targeting XBP-1 (siXBP-1). * P = 0,0001.D Collagen protein levels in TGFβ treated HFL1 fibroblasts transfected as described in C. * P = 0,005."}
{"words": ["Figure", "4A", "The", "effect", "of", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", "on", "CCl4", "induced", "liver", "fibrosis", "in", "C57BL", "/", "6mice", "as", "measured", "by", "the", "histological", "metavir", "score", ".", "Ctrl", "(", "n", "=", "8", ")", ";", "Ctrl", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "6", ")", ";", "CCl4", "(", "n", "=", "6", ")", ";", "CCl4", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "0077", ".", "B", "Representative", "liver", "tissue", "sections", "stained", "with", "sirius", "red", "for", "collagen", "(", "top", ")", "and", "αSMA", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "C", "Percentage", "of", "αSMA", "positive", "cells", "in", "pericentral", "areas", "in", "livers", "from", "mice", "in", "the", "experimental", "setup", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "036", ".", "D", "Liver", "to", "body", "weight", "ratio", "from", "the", "experimental", "setup", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "0031", ".", "E", "BiP", "mRNA", "expression", "in", "liver", "tissue", "from", "mice", "presented", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "020", ".", "F", "Representative", "gel", "showing", "levels", "of", "spliced", "and", "unspliced", "XBP", "-", "1", "in", "liver", "tissue", "from", "control", "and", "CCl4", "-", "induced", "cirrhotic", "mice", "and", "the", "effect", "of", "4μ8C", "treatment", ".", "G", "miR150", "expression", "in", "liver", "tissue", "from", "mice", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "032", "compared", "to", "untreated", "controls", ".", "H", "αSMA", "mRNA", "levels", "in", "primary", "stellate", "cells", "isolated", "from", "mouse", "liver", "and", "then", "treated", "or", "not", "with", "TGFβ", "±", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "031", ",", "n", "=", "3", ".", "I", "BiP", "mRNA", "levels", "in", "primary", "stellate", "cells", "isolated", "from", "mouse", "liver", "and", "then", "treated", "with", "or", "without", "TGFβ", "±", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "008", ",", "n", "=", "3", ".", "J", "Microscopic", "images", "of", "primary", "mouse", "hepatic", "stellate", "cells", "stained", "for", "BiP", "(", "top", ")", "or", "αSMA", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "K", "Western", "blot", "showing", "BiP", "protein", "expression", "in", "primary", "mouse", "hepatic", "stellate", "cells", ".", "L", "Quantification", "of", "mRNA", "expression", "levels", "of", "CTGF", "and", "collagen", "in", "primary", "human", "hepatic", "stellate", "cells", "stimulated", "with", "TGFβ", "±", "4μ8C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A The effect of the IRE1α inhibitor 4μ8C on CCl4 induced liver fibrosis in C57BL/6mice as measured by the histological metavir score. Ctrl (n = 8) ; Ctrl + 4μ8C (n = 6) ; CCl4 (n = 6); CCl4 + 4μ8C (n = 8). * P = 0,0077.B Representative liver tissue sections stained with sirius red for collagen (top) and αSMA (bottom). Scale bars= 50 μm.C Percentage of αSMA positive cells in pericentral areas in livers from mice in the experimental setup in A. * P = 0,036.D Liver to body weight ratio from the experimental setup in A. * P = 0,0031.E BiP mRNA expression in liver tissue from mice presented in A. * P = 0,020.F Representative gel showing levels of spliced and unspliced XBP-1 in liver tissue from control and CCl4-induced cirrhotic mice and the effect of 4μ8C treatment.G miR150 expression in liver tissue from mice in A. * P = 0,032 compared to untreated controls.H αSMA mRNA levels in primary stellate cells isolated from mouse liver and then treated or not with TGFβ ± 4μ8C. * P = 0,031, n = 3.I BiP mRNA levels in primary stellate cells isolated from mouse liver and then treated with or without TGFβ ± 4μ8C. * P = 0,008, n = 3.J Microscopic images of primary mouse hepatic stellate cells stained for BiP (top) or αSMA (bottom). Scale bars = 20 μm.K Western blot showing BiP protein expression in primary mouse hepatic stellate cells.L Quantification of mRNA expression levels of CTGF and collagen in primary human hepatic stellate cells stimulated with TGFβ ±4μ8C."}
{"words": ["Figure", "5A", "The", "effect", "of", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", "on", "TGFβ", "-", "induced", "skin", "fibrosis", "in", "C57BL", "/", "6", "mice", "as", "measured", "by", "the", "percentage", "of", "sirius", "red", "areas", "in", "the", "hypodermis", ".", "Ctrl", "(", "n", "=", "6", ")", ";", "Ctrl", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "5", ")", ";", "TGFβ", "(", "n", "=", "8", ")", ";", "TGFβ", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "046", ".", "B", "Representative", "skin", "tissue", "sections", "stained", "with", "sirius", "red", "for", "collagen", "(", "top", ")", "and", "αSMA", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "C", "Percentage", "αSMA", "-", "positive", "cells", "in", "the", "hypodermis", "of", "mice", "from", "the", "experimental", "setup", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "024", ".", "D", "Representative", "image", "of", "the", "area", "selected", "for", "laser", "capture", "microdissection", "(", "scale", "bars", "=", "100", "μm", ")", ".", "E", "Expression", "levels", "of", "αSMA", "mRNA", "in", "samples", "of", "hypodermis", "obtained", "by", "laser", "capture", "microdissection", ".", "Ctrl", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Ctrl", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "TGFβ", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "TGFβ", "+", "4μ8C", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "044", ".", "F", "miR", "-", "150", "expression", "levels", "in", "the", "same", "samples", "as", "shown", "in", "E", ".", "G", "Immunohistochemistry", "staining", "of", "αSMA", "in", "primary", "skinfibroblasts", "isolated", "from", "healthy", "mice", "after", "treatment", "with", "TGFβ", "±", "4μ8C", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "μm", ".", "H", "αSMA", "mRNA", "expression", "in", "primary", "mouse", "skin", "fibroblasts", "after", "treatment", "with", "TGFβ", "±", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "049", ",", "n", "=", "4", ".", "I", "Agarose", "gel", "showing", "levels", "of", "spliced", "and", "unspliced", "XBP", "-", "1", "in", "primary", "mouse", "skin", "fibroblasts", "treated", "as", "indicated", "with", "TGFβ", "and", "4μ8C", ".", "J", "BiP", "mRNA", "expression", "in", "primary", "mouse", "skin", "fibroblasts", "after", "treatment", "with", "TGFβ", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "00007", "for", "TGFβ", "vs", ".", "Ctrl", "and", "P", "=", "0", ",", "00002", "for", "TGFβ", "vs", ".", "TGFβ", "+", "4μ8C", ".", "n", "=", "4", ".", "K", "Western", "blot", "showing", "CHOP", "protein", "expression", "in", "primary", "mouse", "skin", "fibroblasts", "treated", "as", "indicated", "with", "TGFβ", "and", "4μ8C", ".", "L", "miR", "-", "150", "mRNA", "levels", "in", "primary", "mouse", "skin", "fibroblasts", "treated", "as", "indicated", "with", "TGFβ", "and", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "00031", "compared", "to", "untreated", "control", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A The effect of the IRE1α inhibitor 4μ8C on TGFβ-induced skin fibrosis in C57BL/6 mice as measured by the percentage of sirius red areas in the hypodermis. Ctrl (n = 6); Ctrl + 4μ8C (n = 5); TGFβ (n = 8); TGFβ + 4μ8C (n = 8). * P = 0,046.B Representative skin tissue sections stained with sirius red for collagen (top) and αSMA (bottom). Scale bars = 50 μm.C Percentage αSMA-positive cells in the hypodermis of mice from the experimental setup in A. * P = 0,024.D Representative image of the area selected for laser capture microdissection (scale bars = 100 μm).E Expression levels of αSMA mRNA in samples of hypodermis obtained by laser capture microdissection. Ctrl (n = 5), Ctrl + 4μ8C (n = 5), TGFβ (n = 5), TGFβ + 4μ8C (n = 5). * P = 0,044.F miR-150 expression levels in the same samples as shown in E.G Immunohistochemistry staining of αSMA in primary skinfibroblasts isolated from healthy mice after treatment with TGFβ ± 4μ8C. Scale bars = 20 μm.H αSMA mRNA expression in primary mouse skin fibroblasts after treatment with TGFβ ± 4μ8C. * P = 0,049, n = 4.I Agarose gel showing levels of spliced and unspliced XBP-1 in primary mouse skin fibroblasts treated as indicated with TGFβ and 4μ8C.J BiP mRNA expression in primary mouse skin fibroblasts after treatment with TGFβ in the absence and presence of 4μ8C. * P = 0,00007 for TGFβ vs. Ctrl and P = 0,00002 for TGFβ vs. TGFβ + 4μ8C. n=4.K Western blot showing CHOP protein expression in primary mouse skin fibroblasts treated as indicated with TGFβ and 4μ8C.L miR-150 mRNA levels in primary mouse skin fibroblasts treated as indicated with TGFβ and 4μ8C. * P = 0,00031 compared to untreated control, n = 3."}
{"words": ["Figure", "6A", "CTGF", "mRNA", "expression", "levels", "in", "skin", "(", "dSSc", ")", "and", "lung", "(", "LSSc", ")", "fibroblasts", "isolated", "from", "scleroderma", "patients", "and", "treated", "with", "the", "IRE1α", "inhibitor", "4μ8C", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "018", "for", "dSSc", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "P", "=", "0", ",", "003", "for", "LSSc", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "B", "Collagen1α2", "mRNA", "expression", "levels", "in", "the", "same", "samples", "as", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "0030", "for", "dSSC", "and", "P", "=", "0", ",", "0036", "for", "LSSc", ".", "C", "Quantification", "of", "collagen", "protein", "levels", "in", "the", "same", "samples", "as", "in", "A", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "010", ".", "D", "Immunohistochemistry", "staining", "to", "detect", "BiP", "protein", "in", "fibroblasts", "isolated", "from", "scleroderma", "patients", "treated", "or", "not", "with", "4μ8C", ".", "E", "mRNA", "levels", "of", "αSMA", "in", "primary", "lung", "fibroblasts", "isolated", "from", "patients", "with", "either", "cystic", "fibrosis", "(", "CF", ")", ",", "chronic", "obstructive", "pulmonary", "disease", "(", "COPD", ")", "or", "asthma", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "00001", "for", "asthma", "vs", ".", "healthy", "controls", ",", "and", "P", "=", "0", ",", "00003", "for", "ctrl", "vs", ".", "4μ8C", "in", "asthma", "patients", ".", "F", "Quantification", "of", "mRNA", "levels", "for", "BiP", "in", "same", "samples", "as", "in", "E", ".", "*", "P", "=", "0", ",", "0023", "between", "asthma", "and", "healthy", "controls", "and", "P", "=", "0", ",", "0031", "between", "4μ8C", "-", "treated", "and", "control", "treatment", "in", "fibroblasts", "from", "asthma", "patients", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A CTGF mRNA expression levels in skin (dSSc) and lung (LSSc) fibroblasts isolated from scleroderma patients and treated with the IRE1α inhibitor 4μ8C. * P = 0,018 for dSSc (n = 6) and P = 0,003 for LSSc (n = 3).B Collagen1α2 mRNA expression levels in the same samples as in A. * P = 0,0030 for dSSC and P = 0,0036 for LSSc.C Quantification of collagen protein levels in the same samples as in A. * P = 0,010.D Immunohistochemistry staining to detect BiP protein in fibroblasts isolated from scleroderma patients treated or not with 4μ8C.E mRNA levels of αSMA in primary lung fibroblasts isolated from patients with either cystic fibrosis (CF), chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or asthma. * P = 0,00001 for asthma vs. healthy controls, and P = 0,00003 for ctrl vs. 4μ8C in asthma patients.F Quantification of mRNA levels for BiP in same samples as in E. * P = 0,0023 between asthma and healthy controls and P = 0,0031 between 4μ8C-treated and control treatment in fibroblasts from asthma patients."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "Virus", "titers", "in", "the", "blood", "from", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "fed", "an", "NSD", "(", "0", ".", "45", "%", "NaCl", ")", "or", "HSD", "(", "4", "%", "NaCl", ")", "for", "30", "days", "(", "A", ")", "or", "7", "days", "(", "B", ")", "and", "then", "intraperitoneally", "infected", "with", "VSV", "(", "1x108", "PFU", "per", "gram", "body", ",", "48", "hrs", ")", "were", "analyzed", "by", "the", "TCID50", "assay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "and", "SEM", "of", "five", "biological", "replicates", "For", "all", "statistical", "testing", ",", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "H", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "viral", "RNA", "levels", "in", "U937", ",", "THP1", ",", "HT1080", ",", "2fTGH", "and", "A549", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "I", "RAW264", ".", "7", "cells", "were", "infected", "with", "VSV", "/", "H1N1", "/", "SeV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ",", "or", "were", "transfected", "with", "HBV", "-", "replicon", "or", "HCV", "-", "replicon", "and", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Viral", "RNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "Data", "show", "the", "mean", " ", "and", "SD", "of", "four", "or", "three", "biological", "replicates", ".", "For", "all", "statistical", "testing", ",", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B Virus titers in the blood from mice (n=5) fed an NSD (0.45% NaCl) or HSD (4% NaCl) for 30 days (A) or 7 days (B) and then intraperitoneally infected with VSV (1x108 PFU per gram body, 48 hrs) were analyzed by the TCID50 assay. Data information: Data represent mean and SEM of five biological replicates For all statistical testing, p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test. NS, not significant (p > 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001.H RT-qPCR analysis of viral RNA levels in U937, THP1, HT1080, 2fTGH and A549 cells infected with VSV (MOI=1.0, 24 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). I RAW264.7 cells were infected with VSV/H1N1/SeV (MOI=1.0, 24 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM), or were transfected with HBV-replicon or HCV-replicon and then treated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Viral RNA levels were analyzed by RT-qPCR. Data information: Data show the mean and SD of four or three biological replicates. For all statistical testing, p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test. NS, not significant (p > 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2A", "Western", "blot", "analysis", "of", "VSV", "-", "G", "protein", "levels", "in", "Ifnar1", "+", "/", "+", "or", "Ifnar1", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicatesC", "RAW264", ".", "7", "cells", "were", "treated", "with", "mIFNβ", "(", "50", "IU", "/", "ml", ",", "20", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "17", ",", "34", "and", "51", "mM", ")", ".", "After", "washing", ",", "cells", "were", "infected", "with", "H1N1", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "and", "viral", "RNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "and", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "and", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "F", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Ifit1", ",", "Isg54", "and", "Isg15", "mRNA", "levels", "in", "HEK293T", "pretreated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", "and", "then", "treated", "with", "IFNα", "(", "1", ",", "000", "IU", "/", "ml", ")", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "and", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "and", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "G", "RAW264", ".", "7", "cells", "were", "treated", "with", "mIFNβ", "(", "500", "IU", "/", "ml", ")", "for", "12", "hrs", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "or", "control", "ddH2O", "(", "Ctrl", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "a", "quantitative", "proteomic", "analysis", "with", "a", "TMT2", "-", "plex", "method", "to", "identify", "the", "differentially", "expressed", "proteins", ".", "The", "upregulated", "and", "downregulated", "proteins", "were", "analyzed", "in", "the", "volcano", "plot", ".", "The", "most", "dramatically", "downregulated", "ISG", "protein", ",", "Viperin", "(", "Rsad2", ")", ",", "was", "marked", "in", "the", "dotted", "frame", ".", "H", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "protein", "in", "RAW264", ".", "7", "treated", "with", "mIFNβ", "(", "100", "and", "500", "IU", "/", "ml", ",", "12", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "I", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "protein", "in", "HT1080", "treated", "with", "IFNα", "(", "1", ",", "000", "IU", "/", "ml", ")", "and", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "as", "(", "H", ")", ".", "J", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "protein", "in", "MEF", "cells", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "0", ".", "5", "and", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "K", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "protein", "in", "THP1", "infected", "with", "H1N1", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicatesN", "Survival", "curves", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "Rsad2", "+", "/", "+", "or", "Rsad2", "-", "/", "-", "mice", "administrated", "with", "an", "NSD", "or", "HSD", "for", "7", "days", "and", "then", "intraperitoneally", "infected", "with", "VSV", "(", "1", "×", "108", "PFU", "per", "gram", "body", "mouse", ",", "n", "=", "10", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "(", "N", ")", "show", "the", "mean", " ", "and", "SEM", "of", "ten", "biological", "replicates", ",", "and", "p", "value", "was", "calculated", "using", "logrank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "tests", ".", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Western blot analysis of VSV-G protein levels in Ifnar1+/+ or Ifnar1-/- MEF cells infected with VSV (MOI=1.0, 24 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). Data information: are representative of at least two biological replicatesC RAW264.7 cells were treated with mIFNβ (50 IU/ml, 20 hrs) immediately after addition of NaCl (+17, 34 and 51 mM). After washing, cells were infected with H1N1 (MOI=1.0, 24 hrs) and viral RNA levels were analyzed by RT-qPCR. Data information: Data represent mean and SD of three biological replicates, and p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test For all statistical testing: NS, not significant (p > 0.05), **p < 0.01 and ***p < 0.001.F RT-qPCR analysis of Ifit1, Isg54 and Isg15 mRNA levels in HEK293T pretreated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs and then treated with IFNα (1,000 IU/ml) as indicated. Data information: Data represent mean and SD of three biological replicates, and p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test For all statistical testing: NS, not significant (p > 0.05), **p < 0.01 and ***p < 0.001.G RAW264.7 cells were treated with mIFNβ (500 IU/ml) for 12 hrs immediately after addition of NaCl (+34 mM) or control ddH2O (Ctrl). Whole cell lysates were subjected to a quantitative proteomic analysis with a TMT2-plex method to identify the differentially expressed proteins. The upregulated and downregulated proteins were analyzed in the volcano plot. The most dramatically downregulated ISG protein, Viperin (Rsad2), was marked in the dotted frame.H Western blot analysis of Viperin protein in RAW264.7 treated with mIFNβ (100 and 500 IU/ml, 12 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). I Western blot analysis of Viperin protein in HT1080 treated with IFNα (1,000 IU/ml) and NaCl (+34 mM) as (H). J Western blot analysis of Viperin protein in MEF cells infected with VSV (MOI=0.5 and 1.0, 24 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). K Western blot analysis of Viperin protein in THP1 infected with H1N1 (MOI= 1.0) immediately after addition of NaCl (+34 mM). Data information: Data are representative of at least two biological replicatesN Survival curves of 8-week-old Rsad2+/+ or Rsad2-/- mice administrated with an NSD or HSD for 7 days and then intraperitoneally infected with VSV (1×108 PFU per gram body mouse, n=10). Data information: Data (N) show the mean and SEM of ten biological replicates, and p value was calculated using logrank (Mantel-Cox) tests. For all statistical testing: NS, not significant (p > 0.05), **p < 0.01 and ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3B", "Western", "blot", "analysis", "of", "FH", "-", "Viperin", "protein", "in", "stable", "FH", "-", "Viperin", "-", "expressing", "HeLa", "cells", "pretreated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "and", "then", "treated", "with", "CHX", "(", "50", "μM", ")", "for", "6", "and", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "C", "RAW264", ".", "7", "were", "treated", "with", "MG132", "(", "10", "μM", ")", "and", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ",", "followed", "by", "mIFNβ", "(", "300", "IU", "/", "ml", ")", "treatment", "for", "12", "hrs", ".", "Viperin", "protein", "levels", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "J", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "in", "2fTGH", "cells", "transfected", "with", "control", "shRNAs", "(", "shCtrl", ")", "or", "shRNAs", "against", "USP33", "(", "shUSP33", ")", "and", "then", "treated", "with", "IFNα", "(", "1", ",", "000", "IU", "/", "ml", ")", "for", "different", "times", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "M", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "protein", "in", "Usp33", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "transfected", "with", "FH", "-", "USP33", "(", "wild", "type", ",", "WT", ";", "C194S", "and", "H673Q", ",", "DM", ")", "and", "then", "stimulated", "with", "mIFNβ", "(", "500", " ", "IU", "/", "ml", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "O", "Western", "blot", "analysis", "of", "Flag", "-", "Viperin", "in", "stable", "Flag", "-", "Viperin", "-", "expressing", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", "or", "shUSP33", "and", "then", "treated", "with", "CHX", "(", "50", "μM", ")", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Western blot analysis of FH-Viperin protein in stable FH-Viperin-expressing HeLa cells pretreated with additional NaCl (+34 mM) and then treated with CHX (50 μM) for 6 and 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.C RAW264.7 were treated with MG132 (10 μM) and additional NaCl (+34 mM), followed by mIFNβ (300 IU/ml) treatment for 12 hrs. Viperin protein levels were analyzed by immunoblotting. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.J Western blot analysis of Viperin in 2fTGH cells transfected with control shRNAs (shCtrl) or shRNAs against USP33 (shUSP33) and then treated with IFNα (1,000 IU/ml) for different times. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.M Western blot analysis of Viperin protein in Usp33-/- MEF cells transfected with FH-USP33 (wild type, WT; C194S and H673Q, DM) and then stimulated with mIFNβ (500 IU/ml) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.O Western blot analysis of Flag-Viperin in stable Flag-Viperin-expressing HEK293T cells transfected with shCtrl or shUSP33 and then treated with CHX (50 μM) as indicated. Data information: Data are representative of at least two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4D", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "Viperin", "ubiquitination", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "Viperin", ",", "HA", "-", "Ub", "and", "shUSP33", ",", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicatesE", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "levels", "in", "2fTGH", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", "or", "shUSP33", "and", "then", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "12", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicatesG", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "VSV", "RNA", "levels", "in", "2fTGH", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", "or", "shUSP33", "and", "then", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "24", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "(", "G", ")", "represent", "mean", "and", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "and", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "I", "Survival", "curves", "of", "8", "-", "week", "-", "old", "Usp33", "-", "/", "-", "mice", "fed", "an", "NSD", "(", "0", ".", "5", "%", "NaCl", ")", "or", "HSD", "(", "4", "%", "NaCl", ")", "for", "7", "days", "and", "then", "infected", "with", "VSV", "(", "1x108", "PFU", "per", "gram", "body", "mouse", ",", "n", "=", "10", ")", ".", "Data", "information", ":", ";", "Data", "(", "I", ")", "show", "mean", " ", "and", "SEM", "of", "ten", "biological", "replicates", ",", "and", "p", "value", "was", "calculated", "using", "logrank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "tests", ".", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "NS", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D Immunoprecipitation analysis of Viperin ubiquitination in HEK293T cells co-transfected with Flag-Viperin, HA-Ub and shUSP33, then treated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicatesE Western blot analysis of Viperin levels in 2fTGH cells transfected with shCtrl or shUSP33 and then infected with VSV (MOI=1.0, 12 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). Data information: Data are representative of at least two biological replicatesG RT-qPCR analysis of VSV RNA levels in 2fTGH cells transfected with shCtrl or shUSP33 and then infected with VSV (MOI=1.0, 24 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). Data information: Data (G) represent mean and SD of three biological replicates, and p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test For all statistical testing: NS, not significant (p > 0.05). ***p < 0.001.I Survival curves of 8-week-old Usp33-/- mice fed an NSD (0.5% NaCl) or HSD (4% NaCl) for 7 days and then infected with VSV (1x108 PFU per gram body mouse, n=10). Data information: ; Data (I) show mean and SEM of ten biological replicates, and p value was calculated using logrank (Mantel-Cox) tests. For all statistical testing: NS, not significant (p > 0.05). ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5G", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "ubiquitination", "of", "Flag", "-", "USP33", "in", "p97", "-", "WT", "or", "p97", "-", "KO", "2fTGH", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "USP33", "and", "HA", "-", "Ub", "and", "then", "treated", "with", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "L", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "Viperin", "ubiquitination", "in", "HT1080", "cells", "transfected", "with", "shCtrl", "or", "shp97", "(", "1", "#", "or", "2", "#", ")", "and", "then", "treated", "with", "IFNα", "(", "1", ",", "000", "IU", "/", "ml", ",", "12", "hrs", ")", "immediately", "after", "addition", "of", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "N", "Western", "blot", "analysis", "of", "Myc", "-", "Viperin", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "Viperin", "and", "shCtrl", "or", "shp97", ",", "and", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5G Immunoprecipitation analysis of ubiquitination of Flag-USP33 in p97-WT or p97-KO 2fTGH cells co-transfected with Flag-USP33 and HA-Ub and then treated with NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.L Immunoprecipitation analysis of Viperin ubiquitination in HT1080 cells transfected with shCtrl or shp97 (1# or 2#) and then treated with IFNα (1,000 IU/ml, 12 hrs) immediately after addition of NaCl (+34 mM). Data information: Data are representative of at least two biological replicates.N Western blot analysis of Myc-Viperin in HEK293T cells co-transfected with Myc-Viperin and shCtrl or shp97, and then treated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6E", ",", "F", "Mass", "spectrometry", "analysis", "of", "acetylation", "of", "Flag", "-", "p97", "(", "E", ")", "in", "RAW264", ".", "7", "transfected", "with", "Flag", "-", "p97", "and", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "or", "control", "ddH2O", "(", "Ctrl", ")", "for", "12", "hrs", ".", "The", "intensity", "of", "p97", "-", "K663", "site", "was", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "H", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "USP33", "and", "Myc", "-", "p97", "in", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "p97", "(", "WT", "or", "K663R", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "L", "Western", "blot", "analysis", "of", "FH", "-", "USP33", "levels", "in", "p97", "-", "KO", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "p97", "(", "WT", "or", "K663R", ")", "and", "Flag", "-", "USP33", ",", "and", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "M", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "Viperin", "ubiquitination", "in", "p97", "-", "KO", "2fTGH", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "p97", "(", "WT", "or", "K663R", ")", ",", "Flag", "-", "Viperin", "and", "HA", "-", "Ub", "as", "indicated", ",", "and", "then", "treated", "with", "additional", "NaCl", "(", "+", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E, F Mass spectrometry analysis of acetylation of Flag-p97 (E) in RAW264.7 transfected with Flag-p97 and then treated with additional NaCl (+34 mM) or control ddH2O (Ctrl) for 12 hrs. The intensity of p97-K663 site was shown in (F).H Immunoprecipitation analysis of the interaction between USP33 and Myc-p97 in HEK293T cells transfected with Myc-p97 (WT or K663R). Data information: Data are representative of at least two biological replicates.L Western blot analysis of FH-USP33 levels in p97-KO HEK293T cells co-transfected with Myc-p97 (WT or K663R) and Flag-USP33, and then treated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates.M Immunoprecipitation analysis of Viperin ubiquitination in p97-KO 2fTGH cells co-transfected with Myc-p97 (WT or K663R), Flag-Viperin and HA-Ub as indicated, and then treated with additional NaCl (+34 mM) for 12 hrs. Data information: Data are representative of at least two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "7B", "Western", "blot", "analysis", "of", "USP33", "in", "RAW264", ".", "7", "cells", "cultured", "in", "media", "containing", "reduced", "concentration", "of", "NaCl", "(", "-", "17", "and", "-", "34", "mM", ")", "for", "12", "hrs", ".", "C", "Western", "blot", "analysis", "of", "Viperin", "in", "HT1080", "cells", "treated", "with", "IFNα", "(", "1", ",", "000", "IU", "/", "ml", ",", "12", "hrs", ")", "in", "media", "containing", "reduced", "concentration", "of", "NaCl", "(", "-", "17", ",", "-", "34", "and", "-", "51", "mM", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicatesD", "RAW264", ".", "7", "cells", "were", "infected", "with", "VSV", "(", "MOI", "=", "1", ".", "0", ",", "12", "hrs", ")", "in", "media", "containing", "reduced", "concentration", "of", "NaCl", "(", "-", "17", "and", "-", "34", "mM", ")", ".", "Viral", "RNA", "levels", "were", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "information", ":", "Data", "(", "D", ")", "represent", "mean", "and", "SD", "of", "four", "biological", "replicates", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", "Mice", "(", "n", "=", "5", ")", "were", "intraperitoneally", "infected", "with", "VSV", "(", "1x108", "PFU", "per", "gram", "body", ")", ".", "12", "hrs", "post", "infection", ",", "mice", "were", "fed", "an", "NSD", "(", "0", ".", "45", "%", "NaCl", ")", "or", "LSD", "(", "0", ".", "15", "%", "NaCl", ")", "for", "3", "days", ".", "Then", "VSV", "RNA", "levels", "in", "mouse", "spleen", "tissues", "were", "detected", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "I", "Virus", "titers", "in", "the", "mouse", "blood", "(", "n", "=", "5", ")", "from", "(", "H", ")", "were", "analyzed", "by", "the", "TCID50", "assay", ".", "Data", "information", ":", "Data", "show", "mean", " ", "and", "SEM", "of", "five", "biological", "replicates", ".", "For", "all", "statistical", "testing", ":", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "N", ".", "S", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "and", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B Western blot analysis of USP33 in RAW264.7 cells cultured in media containing reduced concentration of NaCl (-17 and -34 mM) for 12 hrs. C Western blot analysis of Viperin in HT1080 cells treated with IFNα (1,000 IU/ml, 12 hrs) in media containing reduced concentration of NaCl (-17, -34 and -51 mM). Data information: Data are representative of at least two biological replicatesD RAW264.7 cells were infected with VSV (MOI=1.0, 12 hrs) in media containing reduced concentration of NaCl (-17 and -34 mM). Viral RNA levels were analyzed by RT-qPCR. Data information: Data (D) represent mean and SD of four biological replicates For all statistical testing: p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test. N.S, not significant (p > 0.05) and **p < 0.01, ***p < 0.001 (two-tailed unpaired Student's t-test).H Mice (n=5) were intraperitoneally infected with VSV (1x108 PFU per gram body). 12 hrs post infection, mice were fed an NSD (0.45% NaCl) or LSD (0.15% NaCl) for 3 days. Then VSV RNA levels in mouse spleen tissues were detected by RT-qPCR. I Virus titers in the mouse blood (n=5) from (H) were analyzed by the TCID50 assay. Data information: Data show mean and SEM of five biological replicates. For all statistical testing: p values were calculated using two-tailed unpaired Student's t-test. N.S, not significant (p > 0.05) and **p < 0.01, ***p < 0.001 (two-tailed unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Immunoblot", "of", "PPAR", "-", "α", "and", "Tubulin", "(", "control", ")", "(", "top", ")", "in", "WAT", "from", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "with", "relative", "quantification", "(", "bottom", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0035", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Immunostaining", "of", "PPAR", "-", "α", "expression", "in", "WAT", "from", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ")", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", ".", "C", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "PPAR", "-", "α", "and", "PPAR", "-", "α", "target", "genes", ",", "using", "RNA", "from", "epididymalfat", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0022", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0083", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0107", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0011", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0037", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "ChIP", "assay", "of", "CPT1b", "promoter", "in", "adipocytes", "isolated", "from", "WT", ",", "FADD", "-", "D", "and", "ad", "-", "FADDmice", ".", "Soluble", "chromatin", "from", "adipocytes", "was", "immunoprecipitated", "with", "control", "mouse", "IgG", "or", "antibodies", "against", "PPAR", "-", "α", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "E", "ChIP", "assay", "of", "CPT1b", "promoter", "in", "adipocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", ".", "Soluble", "chromatin", "from", "adipocytes", "was", "immunoprecipitated", "with", "control", "mouse", "IgG", "or", "antibodies", "against", "FADD", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "F", "PPAR", "-", "α", "and", "RIP140coimmunoprecipitate", "in", "WT", "but", "not", "FADD", "knockout", "or", "FADD", "-", "D", "MEFs", ".", "PPAR", "-", "α", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "the", "cell", "lysates", "of", "WT", "or", "FADD", "knockout", "MEFs", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "having", "similar", "results", ".", "G", "PPAR", "-", "α", "and", "RIP140coimmunoprecipitate", "in", "WT", "but", "not", "FADD", "knockout", "MEFs", "upon", "WY", "-", "14", ",", "643", "stimulation", ".", "Ligand", "-", "dependent", "interactions", "were", "examined", "in", "the", "presence", "of", "100", "μM", "WY", "-", "14", ",", "643", "where", "indicated", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "having", "similar", "results", ".", "H", "Coimmunoprecipitation", "analysis", "of", "FADD", "and", "RIP140", "in", "293T", "cells", ".", "As", "indicated", ",", "lysates", "from", "the", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "RIP140", ",", "HA", "-", "FADD", "-", "A", "or", "HA", "-", "FADD", "-", "D", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "FADD", "-", "A", "and", "FADD", "-", "D", "were", "detected", "using", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "having", "similar", "results", ".", "I", "Coimmunoprecipitation", "analysis", "of", "FADD", "and", "PPAR", "-", "α", "in", "293T", "cells", ".", "As", "indicated", ",", "lysates", "from", "the", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "Flag", "-", "FADD", "-", "A", ",", "Flag", "-", "FADD", "-", "D", "or", "HA", "-", "PPAR", "-", "α", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "PPAR", "-", "α", "was", "visualized", "by", "anti", "-", "HA", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "having", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Immunoblot of PPAR-α and Tubulin (control) (top) in WAT from WT and FADD-D mice with relative quantification (bottom). Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0035 (Student's t-test).B Immunostaining of PPAR-α expression in WAT from WT and FADD-D mice (Scale bars = 50 μm). Shown are typical results from four different fields and three different experiments.C Quantitative real time PCR for PPAR-α and PPAR-α target genes, using RNA from epididymalfat from 10-week-old male WT and FADD-D mice fed a SD. Data are expressed as mean ± SEM from two independent experiments (n = 6 total for each genotype). *P = 0.0022, **P = 0.0083, ***P = 0.0107, #P = 0.0011, ##P = 0.0037 (Student's t-test).D ChIP assay of CPT1b promoter in adipocytes isolated from WT, FADD-D and ad-FADDmice. Soluble chromatin from adipocytes was immunoprecipitated with control mouse IgG or antibodies against PPAR-α. The experiments were performed in triplicate.E ChIP assay of CPT1b promoter in adipocytes isolated from WT and FADD-D mice. Soluble chromatin from adipocytes was immunoprecipitated with control mouse IgG or antibodies against FADD. The experiments were performed in triplicate.F PPAR-α and RIP140coimmunoprecipitate in WT but not FADD knockout or FADD-D MEFs. PPAR-α was immunoprecipitated (IP) from the cell lysates of WT or FADD knockout MEFs. Data shown are representative of three independent experiments having similar results.G PPAR-α and RIP140coimmunoprecipitate in WT but not FADD knockout MEFs upon WY-14,643 stimulation. Ligand-dependent interactions were examined in the presence of 100 μM WY-14,643 where indicated. Data shown are representative of three independent experiments having similar results.H Coimmunoprecipitation analysis of FADD and RIP140 in 293T cells. As indicated, lysates from the cells transfected with plasmids encoding Flag-RIP140, HA-FADD-A or HA-FADD-D were subjected to immunoprecipitation with an anti-Flag antibody. FADD-A and FADD-D were detected using an anti-HA antibody. Data shown are representative of three independent experiments having similar results.I Coimmunoprecipitation analysis of FADD and PPAR-α in 293T cells. As indicated, lysates from the cells transfected with plasmids encoding Flag-FADD-A, Flag-FADD-D or HA-PPAR-α were subjected to immunoprecipitation with an anti-Flag antibody. PPAR-α was visualized by anti-HA. Data shown are representative of three independent experiments having similar results."}
{"words": ["Figure", "2A", "Left", ",", "Body", "weights", "of", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "either", "a", "SD", "(", "n", "=", "8", "for", "each", "genotype", ")", "or", "a", "HFD", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Right", ",", "Food", "intake", "per", "mouse", "fed", "a", "HFD", "measured", "over", "20", "days", "normalized", "by", "body", "weight", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Representative", "photographs", "of", "fat", "pads", "and", "organs", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "mice", ".", "C", "Left", ",", "fat", "pad", "weights", "as", "a", "percentage", "of", "body", "weight", "(", "BW", ")", "and", "in", "absolute", "amounts", "(", "inset", ")", "from", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "mice", ".", "Mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", "until", "15", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0014", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0038", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0045", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "*", "^", "P", "=", "0", ".", "0252", ",", "*", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0082", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0275", ",", "#", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0071", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "Middle", ",", "fat", "pad", "weights", "of", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "mice", "on", "a", "HFD", "at", "30", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Inset", ",", "triacylglycerol", "(", "TAG", ")", "content", "in", "epididymal", "WAT", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Right", ",", "weight", "of", "liver", "normalized", "by", "body", "weight", "for", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "littermates", "at", "the", "age", "of", "15", "weeks", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Epi", ",", "epididymal", "fat", ";", "Ren", ",", "renal", "fat", ";", "Ing", ",", "inguinal", "fat", ".", "C", "Left", ",", "fat", "pad", "weights", "as", "a", "percentage", "of", "body", "weight", "(", "BW", ")", "and", "in", "absolute", "amounts", "(", "inset", ")", "from", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "mice", ".", "Mice", "were", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", "until", "15", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0014", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0038", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0045", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "*", "^", "P", "=", "0", ".", "0252", ",", "*", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0082", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0275", ",", "#", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0071", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "Middle", ",", "fat", "pad", "weights", "of", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "mice", "on", "a", "HFD", "at", "30", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Inset", ",", "triacylglycerol", "(", "TAG", ")", "content", "in", "epididymal", "WAT", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Right", ",", "weight", "of", "liver", "normalized", "by", "body", "weight", "for", "male", "FADD", "-", "D", "and", "WT", "littermates", "at", "the", "age", "of", "15", "weeks", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Epi", ",", "epididymal", "fat", ";", "Ren", ",", "renal", "fat", ";", "Ing", ",", "inguinal", "fat", ".", "D", "Weight", "of", "brown", "adipose", "tissue", "normalized", "by", "body", "weight", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0008", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "MRI", "of", "body", "fat", "content", ":", "standard", "non", "-", "fat", "-", "suppressed", "(", "left", ")", ",", "fat", "-", "suppressed", "(", "middle", ")", "and", "fat", "-", "only", "(", "right", ")", ".", "Representative", "images", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", "showing", "similar", "results", "are", "shown", ".", "F", "Paraffin", "-", "embedded", "sections", "of", "WAT", "and", "BAT", "from", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "were", "stained", "with", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", ".", "G", "Left", ",", "relative", "amounts", "of", "liver", "and", "muscle", "triacylglycerol", "contents", "in", "10", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Right", ",", "relative", "amounts", "of", "cholesterol", "in", "the", "liver", "and", "muscle", "of", "the", "same", "group", "of", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0015", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0318", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "H", "Left", ",", "plasma", "triacylglycerol", "levels", "in", "10", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "following", "fasting", "for", "20", "h", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Right", ",", "plasma", "cholesterol", "levels", "in", "the", "same", "group", "of", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0124", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Left, Body weights of male WT and FADD-D mice on either a SD (n = 8 for each genotype) or a HFD (n = 6 for each genotype). Right, Food intake per mouse fed a HFD measured over 20 days normalized by body weight (n = 10 for each genotype). Results are means ± SEM. *P = 0.0007 (Student's t-test).B Representative photographs of fat pads and organs of 10-week-old male FADD-D and WT mice.C Left, fat pad weights as a percentage of body weight (BW) and in absolute amounts (inset) from male FADD-D and WT mice. Mice were fed a SD or a HFD until 15 weeks of age (n = 6 for each genotype). Results are means ± SEM. *P = 0.0012, **P = 0.0002, ***P = 0.0027, ****P = 0.0014, ^P = 0.0038, ^^P = 0.0019, #P = 0.0045, ##P = 0.0007, *^P = 0.0252, *^^P = 0.0082, ###P = 0.0275, ####P = 0.0071 (one-way ANOVA). Middle, fat pad weights of male FADD-D and WT mice on a HFD at 30 weeks of age (n = 6 for each genotype). Inset, triacylglycerol (TAG) content in epididymal WAT. Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0003, **P = 0.0005, ***P = 0.0019, ****P = 0.0011 (Student's t-test). Right, weight of liver normalized by body weight for male FADD-D and WT littermates at the age of 15 weeks (n = 6 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. NS, not statistically significant (Student's t-test). Epi, epididymal fat; Ren, renal fat; Ing, inguinal fat.C Left, fat pad weights as a percentage of body weight (BW) and in absolute amounts (inset) from male FADD-D and WT mice. Mice were fed a SD or a HFD until 15 weeks of age (n = 6 for each genotype). Results are means ± SEM. *P = 0.0012, **P = 0.0002, ***P = 0.0027, ****P = 0.0014, ^P = 0.0038, ^^P = 0.0019, #P = 0.0045, ##P = 0.0007, *^P = 0.0252, *^^P = 0.0082, ###P = 0.0275, ####P = 0.0071 (one-way ANOVA). Middle, fat pad weights of male FADD-D and WT mice on a HFD at 30 weeks of age (n = 6 for each genotype). Inset, triacylglycerol (TAG) content in epididymal WAT. Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0003, **P = 0.0005, ***P = 0.0019, ****P = 0.0011 (Student's t-test). Right, weight of liver normalized by body weight for male FADD-D and WT littermates at the age of 15 weeks (n = 6 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. NS, not statistically significant (Student's t-test). Epi, epididymal fat; Ren, renal fat; Ing, inguinal fat.D Weight of brown adipose tissue normalized by body weight (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0008 (Student's t-test).E MRI of body fat content: standard non-fat-suppressed (left), fat-suppressed (middle) and fat-only (right). Representative images of three independent experiments (n = 6 total for each genotype) showing similar results are shown.F Paraffin-embedded sections of WAT and BAT from WT and FADD-D mice were stained with H&amp;amp;E. Scale bar = 50 μm. Shown are typical results from four different fields and three different experiments.G Left, relative amounts of liver and muscle triacylglycerol contents in 10-month-old WT and FADD-D mice (n = 6 for each genotype). Right, relative amounts of cholesterol in the liver and muscle of the same group of WT and FADD-D mice (n = 6 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0015, **P = 0.0027, ***P = 0.0318 (Student's t-test). NS, not statistically significant.H Left, plasma triacylglycerol levels in 10-month-old WT and FADD-D mice following fasting for 20 h (n = 5 for each genotype). Right, plasma cholesterol levels in the same group of WT and FADD-D mice (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0124 (Student's t-test). NS, not statistically significant."}
{"words": ["Figure", "3A", "Serum", "free", "fatty", "acid", "(", "FFA", ")", "levels", "and", "triacylglycerol", "levels", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "fed", "a", "HFD", "for", "20", "days", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0059", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Serum", "levels", "of", "leptin", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", "fed", "a", "SD", "or", "a", "HFD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0032", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0038", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "C", "Morphology", "of", "inguinal", "WAT", ",", "BAT", ",", "and", "liver", "from", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "fed", "a", "HFD", "for", "20", "days", ".", "WAT", "and", "BAT", "were", "stained", "with", "hematoxylin", "and", "eosin", ".", "Liver", "tissues", "were", "stained", "with", "Oil", "red", "O", "to", "demonstrate", "lipid", "accumulation", "and", "counterstained", "with", "hematoxylin", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", ".", "D", "Comparison", "of", "cell", "size", "in", "WAT", "of", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "maintained", "on", "SD", "and", "HFD", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "E", "FADD", "-", "D", "mice", "lost", "more", "weight", "as", "compared", "with", "WT", "on", "20", "-", "h", "fasting", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0085", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Whole", "-", "body", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "VO2", ")", "during", "24", "hr", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "fed", "a", "SD", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0055", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0081", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "Average", "respiratory", "exchange", "ratio", "(", "VCO2", "/", "VO2", ")", "(", "RER", ")", "for", "the", "dark", "and", "light", "period", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0042", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0079", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", "Rectal", "temperature", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0217", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "I", "Average", "values", "of", "energy", "expenditure", "(", "EE", ")", "for", "the", "24", "hr", "period", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0054", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "J", "Physical", "activity", "for", "the", "dark", "and", "light", "period", "in", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "means", "±", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Serum free fatty acid (FFA) levels and triacylglycerol levels in WT and FADD-D mice fed a HFD for 20 days (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0059, **P = 0.0012 (Student's t-test).B Serum levels of leptin in WT and FADD-D mice (n = 4 for each genotype) fed a SD or a HFD. Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0032, **P = 0.0003, ***P = 0.0038 (one-way ANOVA).C Morphology of inguinal WAT, BAT, and liver from WT and FADD-D mice fed a HFD for 20 days. WAT and BAT were stained with hematoxylin and eosin. Liver tissues were stained with Oil red O to demonstrate lipid accumulation and counterstained with hematoxylin. Scale bars = 50 μm. Shown are typical results from four different fields and three different experiments.D Comparison of cell size in WAT of WT and FADD-D mice maintained on SD and HFD (n = 5 for each genotype).E FADD-D mice lost more weight as compared with WT on 20-h fasting (n = 4 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0085 (Student's t-test).F Whole-body oxygen consumption rate (VO2) during 24 hr in WT and FADD-D mice fed a SD (n = 4 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0055, **P = 0.0081 (Student's t-test).G Average respiratory exchange ratio (VCO2/VO2) (RER) for the dark and light period in WT and FADD-D mice (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0042, **P = 0.0079 (Student's t-test).H Rectal temperature (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0217 (Student's t-test).I Average values of energy expenditure (EE) for the 24 hr period in WT and FADD-D mice (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. *P = 0.0054 (Student's t-test).J Physical activity for the dark and light period in WT and FADD-D mice (n = 5 for each genotype). Data are expressed as means ± SEM. NS, not statistically significant (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "4A", "Left", ",", "transmission", "electron", "microscopy", "analysis", "of", "adipocytes", "from", "WAT", "and", "BAT", "of", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", ".", "Arrowheads", "indicate", "mitochondria", "and", "lipid", "droplets", "(", "L", ")", "(", "×", "5", ",", "000", "magnification", ")", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "mitochondria", "in", "WAT", "and", "BAT", "of", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0083", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "UCP1", ",", "Dio2", ",", "PPARd", ",", "UCP3", ",", "CPT1", "and", "PGC1", "-", "α", ",", "using", "RNA", "from", "epididymalfat", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0014", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0025", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0008", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "UCP3", ",", "CPT1", ",", "PPARd", "and", "PGC1", "-", "α", ",", "using", "RNA", "from", "skeletal", "muscle", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0329", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0092", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0085", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "UCP1", ",", "using", "RNA", "from", "BAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0018", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "Immunoblotting", "of", "UCP1", "and", "Tubulin", "(", "control", ")", "(", "top", ")", "with", "relative", "quantification", "(", "bottom", ")", ",", "using", "total", "cell", "lysates", "of", "BAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0217", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Oxygen", "consumption", "in", "isolated", "BAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0025", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0006", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "PGC1α", ",", "C", "/", "EBPα", "and", "PPARγ", ",", "using", "RNA", "from", "BAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0113", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "H", "β", "-", "oxidation", "analysis", "of", "white", "adipocytes", "isolated", "from", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "1", "-", "14C", "labeled", "oleic", "acid", "was", "added", "to", "the", "medium", "containing", "isolated", "adipocytes", "(", "5", "×", "105", ")", ",", "and", "14CO2", "trapped", "by", "the", "filter", "paper", "soaked", "with", "hyamine", "hydroxide", "was", "measured", "after", "a", "3", "h", "-", "incubation", "by", "a", "scintillation", "counter", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0022", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "I", "Basal", "and", "stimulated", "(", "+", "100", "nM", "isoproterenol", ")", "lipolysis", ",", "as", "measured", "by", "glycerol", "(", "left", ")", "and", "fatty", "acids", "(", "right", ")", "released", "from", "explants", "of", "epididymal", "WAT", "from", "overnight", "fasted", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "fed", "a", "HFD", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0078", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0065", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0008", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0133", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0053", ",", "^", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0006", ",", "^", "^", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0001", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0082", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0051", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0009", ",", "*", "^", "P", "=", "0", ".", "0151", ",", "*", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "*", "*", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "*", "^", "P", "=", "0", ".", "0002", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "J", "Molar", "ratio", "of", "FFA", "to", "glycerol", "release", "from", "WAT", "explants", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0412", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0033", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Left, transmission electron microscopy analysis of adipocytes from WAT and BAT of WT and FADD-D mice. Arrowheads indicate mitochondria and lipid droplets (L) (× 5,000 magnification). Right, quantification of mitochondria in WAT and BAT of WT and FADD-D mice, respectively. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments (n = 6 total for each genotype). *P = 0.0007, **P = 0.0083 (Student's t-test).B Quantitative real time PCR for UCP1, Dio2, PPARd, UCP3, CPT1 and PGC1-α, using RNA from epididymalfat from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments (n = 6 total for each genotype). *P = 0.0014, **P = 0.0025, ***P = 0.0006, ****P = 0.0007, #P = 0.0003, ##P = 0.0008 (Student's t-test).C Quantitative real time PCR for UCP3, CPT1, PPARd and PGC1-α, using RNA from skeletal muscle from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments (n = 6 total for each genotype). *P = 0.0027, **P = 0.0329, ***P = 0.0092, ****P = 0.0085 (Student's t-test).D Quantitative real time PCR for UCP1, using RNA from BAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments (n = 6 total for each genotype). *P = 0.0018 (Student's t-test).E Immunoblotting of UCP1 and Tubulin (control) (top) with relative quantification (bottom), using total cell lysates of BAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0217 (Student's t-test).F Oxygen consumption in isolated BAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD (n = 4 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0025, **P = 0.0006 (Student's t-test).G Quantitative real time PCR for PGC1α, C/EBPα and PPARγ, using RNA from BAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from two independent experiments (n = 4 total for each genotype). *P = 0.0113 (Student's t-test). NS, not statistically significant.H β-oxidation analysis of white adipocytes isolated from WT (n = 5) and FADD-D mice (n = 4). 1-14C labeled oleic acid was added to the medium containing isolated adipocytes (5×105), and 14CO2 trapped by the filter paper soaked with hyamine hydroxide was measured after a 3 h-incubation by a scintillation counter. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0022 (Student's t-test).I Basal and stimulated (+ 100 nM isoproterenol) lipolysis, as measured by glycerol (left) and fatty acids (right) released from explants of epididymal WAT from overnight fasted 10-week-old male WT and FADD-D mice fed a HFD (n = 4 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0078, **P = 0.0065, ***P = 0.0008, ^P = 0.0133, ^^P = 0.0053, ^^^P = 0.0006, ^^^^P = 0.0001, #P = 0.0082, ##P = 0.0051, ###P = 0.0009, *^P = 0.0151, *^^P = 0.0019, **^^P = 0.0005, ***^P = 0.0002 (Student's t-test).J Molar ratio of FFA to glycerol release from WAT explants (n = 4 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0412, **P = 0.0033 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "5A", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "enzymes", "related", "to", "lipid", "metabolism", ",", "using", "RNA", "from", "epididymalfat", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0162", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0105", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0063", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "B", "cAMP", "abundance", "in", "epididymalWAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "HFD", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0033", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Basal", "and", "forskolin", "-", "stimulated", "adenylyl", "cyclase", "activity", "in", "epididymalWAT", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "on", "a", "HFD", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0177", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0091", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Immunoblotting", "of", "phosphorylated", "HSL", "(", "p", "-", "HSL", ")", ",", "HSL", ",", "p", "-", "PKA", "substrate", ",", "desnutrin", "and", "Tubulin", "(", "control", ")", "(", "left", ")", "with", "relative", "quantification", "(", "right", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0032", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "E", "Basal", "and", "stimulated", "(", "+", "200", "nM", "isoproterenol", ")", "lipolysis", "in", "epididymalWAT", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "BAY", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0019", ",", "*", "*", "P", "=", "00038", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0035", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0053", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "F", "Basal", "and", "stimulated", "(", "+", "200", "nM", "isoproterenol", ")", "lipolysis", "in", "isolated", "adipocytes", "from", "10", "-", "week", "-", "old", "WT", "and", "FADD", "-", "D", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "BAY", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0033", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0051", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "004", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0057", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "G", "Immunoblotting", "of", "phosphorylated", "PKC", "(", "p", "-", "PKC", ")", ",", "ERK", ",", "phosphorylated", "ERK", "(", "p", "-", "ERK", ")", "and", "β", "-", "actin", "(", "control", ")", "(", "left", ")", "with", "relative", "quantification", "(", "right", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0119", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0034", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Quantitative real time PCR for enzymes related to lipid metabolism, using RNA from epididymalfat from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a SD. Data are expressed as mean ± SEM from two independent experiments (n = 5 total for each genotype). *P = 0.0162, **P = 0.0105, ***P = 0.0063 (Student's t-test). NS, not statistically significant.B cAMP abundance in epididymalWAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a HFD (n = 4 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0033 (Student's t-test).C Basal and forskolin-stimulated adenylyl cyclase activity in epididymalWAT from 10-week-old male WT and FADD-D mice on a HFD (n = 4 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0177, *P = 0.0091 (Student's t-test).D Immunoblotting of phosphorylated HSL (p-HSL), HSL, p-PKA substrate, desnutrin and Tubulin (control) (left) with relative quantification (right). Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0032, **P = 0.0011 (Student's t-test). NS, not statistically significant.E Basal and stimulated (+200 nM isoproterenol) lipolysis in epididymalWAT of 10-week-old male WT and FADD-D mice (n = 4 for each genotype) treated with or without 10 μM BAY. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0019, **P = 00038, ^P = 0.0035, ^^P = 0.0053 (one-way ANOVA). NS, not statistically significant.F Basal and stimulated (+200 nM isoproterenol) lipolysis in isolated adipocytes from 10-week-old WT and FADD-D mice (n = 4 for each genotype) treated with or without 10 μM BAY. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0033, **P = 0.0051, ^P = 0.004, ^^P = 0.0057 (one-way ANOVA). NS, not statistically significant.G Immunoblotting of phosphorylated PKC (p-PKC), ERK, phosphorylated ERK (p-ERK) and β-actin (control) (left) with relative quantification (right). Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0119, **P = 0.0034 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Typical", "growth", "curves", "of", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "maintained", "on", "a", "SD", "(", "left", "panel", ")", "or", "a", "HFD", "(", "right", "panel", ")", "(", "n", "=", "8", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0435", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0371", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0217", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0236", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0158", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0113", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "Body", "composition", "by", "NMR", "to", "show", "the", "fat", "mass", "and", "fat", "mass", "ratio", "in", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "after", "10", "weeks", "of", "HFD", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0027", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Food", "intake", "in", "15", "-", "week", "-", "old", "male", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "fed", "a", "HFD", "(", "n", "=", "8", "for", "each", "genotype", ")", ".", "D", "and", "E", "Representative", "pictures", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "-", "stained", "sections", "of", "epididymalWAT", "from", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "at", "10", "weeks", "(", "D", ")", "and", "after", "10", "weeks", "of", "an", "HFD", "(", "E", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", ".", "F", "The", "average", "cross", "-", "sectional", "area", "of", "adipocytes", "in", "epididymalWAT", "is", "shown", "in", "the", "bar", "graph", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "002", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "G", "The", "distribution", "of", "adipocyte", "cross", "-", "sectional", "area", "in", "epididymalWAT", "of", "HFD", "-", "fed", "control", "or", "ad", "-", "FADDmice", "is", "shown", "in", "the", "bar", "graph", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "H", "Representative", "pictures", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "-", "stained", "sections", "of", "brown", "adipose", "tissue", "from", "HFD", "-", "fed", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Typical growth curves of control and ad-FADDmice maintained on a SD (left panel) or a HFD (right panel) (n = 8 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0435, **P =0.0371, ^P = 0.0217, #P = 0.0236, ##P = 0.0158, ###P = 0.0113 (Student's t-test).B Body composition by NMR to show the fat mass and fat mass ratio in control and ad-FADDmice after 10 weeks of HFD (n = 6 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0027, **P = 0.0012 (Student's t-test).C Food intake in 15-week-old male control and ad-FADDmice fed a HFD (n = 8 for each genotype).D and E Representative pictures of hematoxylin and eosin-stained sections of epididymalWAT from control and ad-FADDmice at 10 weeks (D) and after 10 weeks of an HFD (E) are shown. Scale bar = 50 μm. Shown are typical results from four different fields and three different experiments.F The average cross-sectional area of adipocytes in epididymalWAT is shown in the bar graph (n = 6 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.002 (Student's t-test). NS, not statistically significant.G The distribution of adipocyte cross-sectional area in epididymalWAT of HFD-fed control or ad-FADDmice is shown in the bar graph (n = 6 for each genotype).H Representative pictures of hematoxylin and eosin-stained sections of brown adipose tissue from HFD-fed control and ad-FADDmice are shown. Scale bar = 50 μm. Shown are typical results from four different fields and three different experiments."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", "HFD", "-", "fed", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "were", "housed", "in", "a", "computer", "-", "controlled", "open", "-", "circuit", "indirect", "calorimeter", "to", "determine", "(", "A", ")", "oxygen", "consumption", ",", "(", "B", ")", "carbon", "dioxide", "production", ",", "and", "(", "C", ")", "respiratory", "exchange", "ratio", "(", "RER", ")", "during", "the", "light", "(", "8", "am", "-", "8", "pm", ")", "and", "dark", "(", "8", "pm", "-", "8", "am", ")", "periods", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0379", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0453", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0445", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "D", "The", "result", "of", "real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "analysis", "for", "UCP1", "in", "brown", "adipose", "tissue", "from", "HFD", "-", "fed", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "is", "shown", "in", "the", "bar", "graph", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", "total", "for", "each", "genotype", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0172", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "Immunoblot", "of", "UCP1", "and", "Tubulin", "(", "control", ")", "(", "top", ")", "in", "BAT", "from", "control", "and", "ad", "-", "FADDmice", "with", "relative", "quantification", "(", "bottom", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0053", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Mice", "were", "initially", "maintained", "at", "room", "temperature", "and", "then", "transferred", "to", "cold", "incubator", "(", "5", "°", "C", ")", ".", "Rectal", "body", "temperature", "was", "recorded", "at", "the", "indicated", "time", "points", "using", "thermoprobe", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0466", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0357", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0229", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0138", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0206", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C HFD-fed control and ad-FADDmice were housed in a computer-controlled open-circuit indirect calorimeter to determine (A) oxygen consumption, (B) carbon dioxide production, and (C) respiratory exchange ratio (RER) during the light (8 am - 8 pm) and dark (8 pm - 8 am) periods (n = 5 for each genotype). Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0379, **P = 0.0453, ***P = 0.0445 (Student's t-test). NS, not statistically significant.D The result of real-time quantitative PCR analysis for UCP1 in brown adipose tissue from HFD-fed control and ad-FADDmice is shown in the bar graph. Data are expressed as mean ± SEM from two independent experiments (n = 4 total for each genotype). *P = 0.0172 (Student's t-test).E Immunoblot of UCP1 and Tubulin (control) (top) in BAT from control and ad-FADDmice with relative quantification (bottom). Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0053 (Student's t-test).F Mice were initially maintained at room temperature and then transferred to cold incubator (5°C). Rectal body temperature was recorded at the indicated time points using thermoprobe (n = 6 for each genotype). Results are means ± SEM. *P = 0.0466, **P = 0.0357, #P = 0.0229, ##P = 0.0138, ###P = 0.0206 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "8A", "and", "B", "Blood", "glucose", "levels", "and", "serum", "insulin", "levels", "in", "2", "-", "h", "GTT", "12", "weeks", "after", "HFD", ".", "Inset", "graphs", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", "depict", "the", "respective", "analysis", "of", "the", "area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ")", ".", "Data", "shown", "are", "from", "one", "experiment", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ",", "representative", "of", "a", "total", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0287", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0173", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0332", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0453", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0077", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0344", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0412", ",", "#", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0495", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0435", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0304", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "ITT", "12", "weeks", "after", "HFD", ".", "Data", "shown", "are", "from", "one", "experiment", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "genotype", ")", ",", "representative", "of", "a", "total", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0127", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0232", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0373", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0385", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Insulin", "-", "stimulated", "Akt", "phosphorylation", "(", "Ser473", ")", "in", "WAT", ",", "liver", ",", "and", "skeletal", "muscle", "of", "control", "and", "ad", "-", "FADD", "mice", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "E", "Adiponectin", "mRNA", "was", "measured", "in", "isolated", "epididymal", "adipocytes", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0044", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "-", "H", "Total", "adiponectin", "levels", "(", "F", ")", ",", "HMW", "adiponectin", "(", "G", ")", ",", "and", "the", "ratio", "of", "HMW", "to", "total", "adiponectin", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0217", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0116", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0175", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "-", "H", "Total", "adiponectin", "levels", "(", "F", ")", ",", "HMW", "adiponectin", "(", "G", ")", ",", "and", "the", "ratio", "of", "HMW", "to", "total", "adiponectin", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0217", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0116", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0175", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "I", "Basal", "and", "insulin", "-", "stimulated", "glucose", "uptake", "in", "control", "and", "FADD", "deficient", "primary", "isolated", "adipocytes", ".", "Data", "shown", "are", "from", "one", "experiment", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ")", ",", "representative", "of", "a", "total", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0073", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "J", "Basal", "and", "insulin", "-", "stimulated", "glucose", "uptake", "in", "3T3L1", "cells", "differentiated", "to", "adipocytes", "and", "infected", "with", "lentivirus", "containing", "FADD", "shRNA", "or", "scrambled", "shRNA", "control", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0092", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "K", "Basal", "and", "insulin", "-", "stimulated", "glucose", "uptake", "in", "control", "and", "FADD", "deficient", "primary", "isolated", "adipocytes", "treated", "with", "DMSO", "or", "5", "μM", "MK886", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0135", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A and B Blood glucose levels and serum insulin levels in 2-h GTT 12 weeks after HFD. Inset graphs in (A) and (B) depict the respective analysis of the area under the curve (AUC). Data shown are from one experiment (n = 6 for each genotype), representative of a total of two independent experiments. Results are means ± SEM. *P = 0.0287, **P = 0.0173, ***P = 0.0332, ****P = 0.0453, #P = 0.0077, ##P = 0.0344, ###P = 0.0412, ####P = 0.0495, ^P = 0.0435, ^^P = 0.0304 (Student's t-test).C ITT 12 weeks after HFD. Data shown are from one experiment (n = 6 for each genotype), representative of a total of two independent experiments. Results are means ± SEM. *P = 0.0127, **P = 0.0232, ***P = 0.0373, ****P = 0.0385 (Student's t-test).D Insulin-stimulated Akt phosphorylation (Ser473) in WAT, liver, and skeletal muscle of control and ad-FADD mice. The experiments were performed in triplicate.E Adiponectin mRNA was measured in isolated epididymal adipocytes by RT-PCR. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0044 (Student's t-test).F-H Total adiponectin levels (F), HMW adiponectin (G), and the ratio of HMW to total adiponectin (H). n = 5 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0217, **P = 0.0116, ***P = 0.0175 (Student's t-test).F-H Total adiponectin levels (F), HMW adiponectin (G), and the ratio of HMW to total adiponectin (H). n = 5 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0217, **P = 0.0116, ***P = 0.0175 (Student's t-test).I Basal and insulin-stimulated glucose uptake in control and FADD deficient primary isolated adipocytes. Data shown are from one experiment (n = 4 for each genotype), representative of a total of two independent experiments. Results are means ± SEM. *P = 0.0073 (Student's t-test).J Basal and insulin-stimulated glucose uptake in 3T3L1 cells differentiated to adipocytes and infected with lentivirus containing FADD shRNA or scrambled shRNA control. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments. *P = 0.0092 (Student's t-test).K Basal and insulin-stimulated glucose uptake in control and FADD deficient primary isolated adipocytes treated with DMSO or 5 μM MK886. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0135 (one-way ANOVA). NS, not statistically significant."}
{"words": ["Figure", "9A", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "the", "macrophage", "marker", "F4", "/", "80", "in", "SVCs", "isolated", "from", "epididymal", "adipose", "tissue", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0279", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", "F4", "/", "80", "immunostaining", "in", "epi", "-", "WAT", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "Shown", "are", "typical", "results", "from", "four", "different", "fields", "and", "three", "different", "experiments", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "the", "proinflammatory", "M1", "-", "like", "macrophage", "marker", "CD11c", "in", "SVCs", "isolated", "from", "epididymal", "adipose", "tissue", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "five", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0221", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "inflammatory", "and", "anti", "-", "inflammatory", "cytokines", "in", "Epi", "-", "WAT", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0201", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0159", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0263", ",", "^", "P", "=", "0", ".", "0227", ",", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0215", ",", "^", "^", "^", "P", "=", "0", ".", "0312", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0231", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0255", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0094", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "E", "-", "H", "Serum", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "(", "E", ")", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0077", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0052", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0114", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0127", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", "-", "H", "Serum", "levels", "of", "IL", "-", "6", "(", "F", ")", ",", "IL", "-", "12p40", "(", "G", ")", ",", "and", "IL", "-", "10", "(", "H", ")", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0077", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0052", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0114", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0127", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A Relative mRNA levels of the macrophage marker F4/80 in SVCs isolated from epididymal adipose tissue. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0279 (Student's t-test).B F4/80 immunostaining in epi-WAT. Scale bars = 50 μm. Shown are typical results from four different fields and three different experiments. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0003 (Student's t-test).C Relative mRNA levels of the proinflammatory M1-like macrophage marker CD11c in SVCs isolated from epididymal adipose tissue. Data are expressed as mean ± SEM from five independent experiments. *P = 0.0221 (Student's t-test).D Relative mRNA levels of inflammatory and anti-inflammatory cytokines in Epi-WAT. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0201, **P = 0.0159, ***P = 0.0263, ^P = 0.0227, ^^P = 0.0215, ^^^P = 0.0312, #P = 0.0231, ##P = 0.0255, ###P = 0.0094 (Student's t-test). NS, not statistically significant.E-H Serum levels of TNF-α (E). n = 5 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0077, **P = 0.0052, ***P = 0.0114, ****P = 0.0127 (Student's t-test).E-H Serum levels of IL-6 (F), IL-12p40 (G), and IL-10 (H). n = 5 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0077, **P = 0.0052, ***P = 0.0114, ****P = 0.0127 (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "10A", "Top", ",", "representative", "photographs", "of", "20", "-", "week", "-", "old", "male", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Bottom", ",", "representative", "photographs", "of", "their", "livers", "and", "epididymalWAT", ".", "B", "Comparison", "of", "weights", "of", "WAT", "depots", "from", "WT", ",", "FADD", "-", "D", ",", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0022", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", ",", "#", "P", "=", "0", ".", "0009", ",", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "#", "#", "#", "P", "=", "0", ".", "0027", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "C", "Basal", "and", "stimulated", "lipolysis", "measured", "by", "fatty", "acid", "release", "from", "explants", "of", "epididymalWAT", "in", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "HFD", ".", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "D", "cAMP", "level", "in", "WAT", "of", "10", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", ",", "FADD", "-", "D", ",", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "HFD", ".", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0017", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "E", "Whole", "-", "body", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "VO2", ")", "during", "24", "hr", "in", "WT", ",", "FADD", "-", "D", ",", "ob", "/", "ob", ",", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "n", "=", "4", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0053", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0025", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0062", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0011", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "F", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "Dio2", ",", "PPARd", "and", "UCP1", ",", "using", "RNA", "from", "epididymal", "fat", "from", "20", "-", "week", "-", "old", "male", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0009", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0015", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0003", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "UCP3", ",", "PGC", "-", "1α", ",", "PPARd", "and", "CPT1", ",", "using", "RNA", "from", "skeletal", "muscle", "from", "20", "-", "week", "-", "old", "male", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0105", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0033", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0058", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "H", "Quantitative", "real", "time", "PCR", "for", "UCP1", ",", "PPARa", ",", "CPT1", "and", "PGC", "-", "1α", ",", "using", "RNA", "from", "brown", "adipose", "fat", "from", "20", "-", "week", "-", "old", "male", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0012", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0129", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0103", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0207", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "I", "Oxidation", "of", "[", "1", "-", "14C", "]", "oleic", "acid", "to", "14CO2by", "adipocytes", "isolated", "from", "WT", ",", "FADD", "-", "D", ",", "ob", "/", "ob", ",", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", ".", "Data", "shown", "are", "from", "one", "experiment", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "genotype", ")", ",", "representative", "of", "a", "total", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Results", "are", "means", "±", "SEM", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0031", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0075", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "NS", ",", "not", "statistically", "significant", ".", "J", "Immunoblot", "of", "VLCAD", ",", "LCAD", ",", "MCAD", ",", "PTL", "and", "Tubulin", "(", "control", ")", ",", "using", "protein", "extracts", "from", "epididymal", "fat", "from", "15", "-", "week", "-", "old", "male", "WT", ",", "FADD", "-", "D", ",", "ob", "/", "ob", "and", "FADD", "-", "D", "/", "ob", "/", "ob", "mice", "fed", "a", "SD", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "having", "similar", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10A Top, representative photographs of 20-week-old male ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. Bottom, representative photographs of their livers and epididymalWAT.B Comparison of weights of WAT depots from WT, FADD-D, ob/ob and FADD-D/ob/ob mice. n = 5 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0007, **P = 0.0022, ***P = 0.0011, #P = 0.0009, ##P = 0.0003, ###P = 0.0027 (one-way ANOVA).C Basal and stimulated lipolysis measured by fatty acid release from explants of epididymalWAT in 10-week-old male ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a HFD. n = 4 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0003, **P = 0.001 (one-way ANOVA).D cAMP level in WAT of 10-week-old male WT, FADD-D, ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a HFD. n = 4 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0017, **P = 0.001 (one-way ANOVA).E Whole-body oxygen consumption rate (VO2) during 24 hr in WT, FADD-D, ob/ob, and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. n = 4 for each genotype. Data are expressed as mean ± SEM. *P = 0.0053, **P = 0.0025, ***P = 0.0062, ****P = 0.0011 (one-way ANOVA).F Quantitative real time PCR for Dio2, PPARd and UCP1, using RNA from epididymal fat from 20-week-old male ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0009, **P = 0.0015, ***P = 0.0003 (Student's t-test).G Quantitative real time PCR for UCP3, PGC-1α, PPARd and CPT1, using RNA from skeletal muscle from 20-week-old male ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0105, **P = 0.0033, ***P = 0.0058 (Student's t-test). NS, not statistically significant.H Quantitative real time PCR for UCP1, PPARa, CPT1 and PGC-1α, using RNA from brown adipose fat from 20-week-old male ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. Data are expressed as mean ± SEM from four independent experiments. *P = 0.0012 **P = 0.0129, ***P = 0.0103, ****P = 0.0207 (Student's t-test).I Oxidation of [1-14C] oleic acid to 14CO2by adipocytes isolated from WT, FADD-D, ob/ob, and FADD-D/ob/ob mice. Data shown are from one experiment (n = 3 for each genotype), representative of a total of two independent experiments. Results are means ± SEM. *P = 0.0031, **P = 0.0075 (one-way ANOVA). NS, not statistically significant.J Immunoblot of VLCAD, LCAD, MCAD, PTL and Tubulin (control), using protein extracts from epididymal fat from 15-week-old male WT, FADD-D, ob/ob and FADD-D/ob/ob mice fed a SD. Data shown are representative of three independent experiments having similar results."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Figures", "show", "the", "presence", "of", "differentially", "expressed", "genes", "within", "the", "analyzed", "single", "cells", ".", "Black", "color", "indicates", "cells", "with", "RPKM", "values", "above", "40", "for", "Pax3", ",", "300", "for", "Stmn2", ",", "200", "for", "Slc1a3", "and", "100", "for"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Figures show the presence of differentially expressed genes within the analyzed single cells. Black color indicates cells with RPKM values above 40 for Pax3, 300 for Stmn2, 200 for Slc1a3 and 100 for Mbp"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Expression", "(", "RPKM", ")", "of", "Sox3", "and", "Sox9", "in", "NPC", "and", "GPC", "cultures", "from", "RNA", "-", "seq", "experiments", ".", "Results", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "-", "4", "experiments", "(", "n", "=", "3", "for", "NPC", "and", "n", "=", "4", "for", "GPC", ",", "*", "*", "*", "equals", "p", "=", "4x10", "-", "5", ",", "t", ".", "test", ")", "(", "C", ")", "Immunohistochemical", "analysis", "of", "SOX3", "and", "SOX9", "expression", "in", "ESC", "derived", "NPC", "and", "GPC", "cultures", ".", "Analysis", "of", "TUJ1", ",", "GFAP", "and", "SOX10", "protein", "expression", "in", "differentiated", "cultures", "revealed", "that", "NPC", "give", "rise", "to", "neurons", "and", "GPCs", "to", "astrocytes", "and", "oligodendrocytes", ".", "Scale", "bar", "represents", "40µm1", "]", ".", "(", "F", ")", "H3K27Ac", "read", "density", "in", "NPCs", "or", "GPCs", "around", "DNA", "-", "regions", "bound", "by", "SOX3", "in", "NPCs", ".", "SOX3", "DNA", "-", "regions", "with", "different", "H3K27Ac", "read", "density", "patterns", "in", "NPCs", "and", "GPCs", "were", "categorized", "as", "group", "I", "and", "II", "loci", ".", "Graphs", "show", "the", "mean", "read", "density", "of", "H3K27Ac", "in", "NPCs", "and", "GPCs", "at", "group", "I", "and", "II", "loci", "(", "G", ")", "Expression", "pattern", "of", "genes", "associated", "with", "group", "I", "and", "II", "loci", "(", "from", "Fig", ".", "2E", ")", "within", "differentially", "expressed", "gene", "sets", ".", "Significance", "calculated", "by", "prop", ".", "test", "R", ",", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "H", ")", "Venn", "diagram", "shows", "overlap", "between", "SOX3", "binding", "in", "NPCs", "and", "GPCs", ".", "Bar", "graph", "shows", "expression", "pattern", "of", "genes", "continuously", "bound", "by", "SOX3", " ", "NPCs", "and", "GPCs", ".", "(", "I", ")", "Venn", "diagram", "shows", "overlap", "between", "SOX3", "and", "SOX9", "binding", "in", "GPCs", ".", "Bar", "graph", "shows", "expression", "pattern", "of", "genes", "co", "-", "bound", "by", "SOX3", "and", "SOX9", "in", "GPCs", ".", "(", "J", ")", "ChIP", "-", "seq", "peak", "graphics", "around", "the", "astrocyte", "gene", "Fgfbp3", ".", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "are", "derived", "from", "three", "different", "experiments", ";", "SOX3", " ", "ChIPs", "in", "NPCs", ",", "SOX3", " ", "ChIPs", "in", "GPCs", ",", "SOX9", " ", "ChIPs", "in", "GPCs", ".", "Both", "ChIP", "-", "seq", "reads", "and", "called", "peak", "regions", "(", "underlying", "black", "lines", ")", "are", "shown", "for", "all", "data", "sets", ".", "Bar", "graphs", "shows", "the", "distribution", "of", "differentially", "expressed", "genes", "that", "are", "bound", "by", "all", "three", "factors", ".", "P", "-", "values", "(", "phyper", ",", "R", ")", "were", "calculated", "from", "the", "total", "number", "of", "protein", "coding", "genes", "in", "mm10", "assembly", "(", "23", "´", "389", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Expression (RPKM) of Sox3 and Sox9 in NPC and GPC cultures from RNA-seq experiments. Results are represented as mean ± SEM from 3-4 experiments (n=3 for NPC and n=4 for GPC, *** equals p=4x10-5, t.test)(C) Immunohistochemical analysis of SOX3 and SOX9 expression in ESC derived NPC and GPC cultures. Analysis of TUJ1, GFAP and SOX10 protein expression in differentiated cultures revealed that NPC give rise to neurons and GPCs to astrocytes and oligodendrocytes. Scale bar represents 40µm1]. (F) H3K27Ac read density in NPCs or GPCs around DNA-regions bound by SOX3 in NPCs. SOX3 DNA-regions with different H3K27Ac read density patterns in NPCs and GPCs were categorized as group I and II loci. Graphs show the mean read density of H3K27Ac in NPCs and GPCs at group I and II loci(G) Expression pattern of genes associated with group I and II loci (from Fig. 2E) within differentially expressed gene sets. Significance calculated by prop.test R, (***) P<0.001. (H) Venn diagram shows overlap between SOX3 binding in NPCs and GPCs. Bar graph shows expression pattern of genes continuously bound by SOX3 NPCs and GPCs. (I) Venn diagram shows overlap between SOX3 and SOX9 binding in GPCs. Bar graph shows expression pattern of genes co-bound by SOX3 and SOX9 in GPCs. (J) ChIP-seq peak graphics around the astrocyte gene Fgfbp3. ChIP-seq peaks are derived from three different experiments; SOX3 ChIPs in NPCs, SOX3 ChIPs in GPCs, SOX9 ChIPs in GPCs. Both ChIP-seq reads and called peak regions (underlying black lines) are shown for all data sets. Bar graphs shows the distribution of differentially expressed genes that are bound by all three factors. P-values (phyper, R) were calculated from the total number of protein coding genes in mm10 assembly (23´389)"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Graphical", "view", "showing", "SOX9", "and", "SOX10", "expression", "among", "spinal", "cord", "cells", "analyzed", "with", "scRNA", "-", "seq", "(", "B", ")", "Bar", "graph", "shows", "enrichment", "of", "genes", "bound", "by", "SOX10", "in", "rat", " ", "oligodendrocytes", "within", "the", "differentially", "expressed", "gene", "sets", ".", "Yellow", "bar", "represents", "enrichment", "within", "NPC", "/", "GPC", "genes", ",", "green", "bar", "within", "neuronal", "genes", ",", "blue", "bar", "within", "astrocytic", "genes", "and", "red", "bar", "within", "oligodendrocytic", "genes", ".", "SOX10", " ", "ChIP", "-", "seq", "data", "from", "[", "37", "(", "F", ")", "Expression", "of", "Nfia", ",", "Ehf", "and", "Zbtb3", "among", "spinal", "cord", "cells", "analyzed", "with", "scRNA", "-", "seq", ".", "Red", "color", "indicates", "cells", "with", "RPKM", "values", "above", "55", "for", "Nfia", ",", "5", "for", "Zbtb3", "and", "5", "for", "Ehf", ".", "n", "=", "3", "for", "SOX9", "and", "2", "for", "SOX3", ".", "P", "-", "values", "(", "phyper", ",", "R", ")", "were", "calculated", "from", "the", "total", "number", "of", "genes", "for", "mm10", "(", "23", "´", "389", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Graphical view showing SOX9 and SOX10 expression among spinal cord cells analyzed with scRNA-seq(B) Bar graph shows enrichment of genes bound by SOX10 in rat oligodendrocytes within the differentially expressed gene sets. Yellow bar represents enrichment within NPC/GPC genes, green bar within neuronal genes, blue bar within astrocytic genes and red bar within oligodendrocytic genes. SOX10 ChIP-seq data from [37(F) Expression of Nfia, Ehf and Zbtb3 among spinal cord cells analyzed with scRNA-seq. Red color indicates cells with RPKM values above 55 for Nfia, 5 for Zbtb3 and 5 for Ehf. n=3 for SOX9 and 2 for SOX3. P-values (phyper, R) were calculated from the total number of genes for mm10 (23´389)"}
{"words": ["Figure", "5", " ", "(", "A", ")", "Luc", "-", "reporter", "assays", "in", "P19", "cells", ".", "Luc", "-", "reporters", "containing", "SOX3", "and", "SOX9", "bound", "CRMs", "around", "the", "astrocyte", "specific", "genes", "Fgfbp3", "and", "Ttyh1", "were", "strongly", "activated", "by", "SOX9", "in", "synergy", "with", "NFIA", ";", "an", "activation", "that", "could", "be", "efficiently", "blocked", "by", "SOX3", ".", "No", "activation", "of", "these", "reporters", "could", "be", "detected", "with", "SOX10", "or", "SOX11", ".", "(", "B", ")", "Luc", "-", "reporters", "containing", "SOX9", "and", "SOX10", "bound", "DNA", "-", "regions", "around", "the", "astrocyte", "genes", "Aldh1l1", "and", "Atp1a2", ",", "which", "are", "not", "expressed", "in", "SOX10", "+", " ", "oligodendrocytes", ",", "could", "not", "be", "activated", "by", "SOX9", "or", "SOX10", " ", "(", "C", ")", "Luc", "-", "reporters", "containing", "SOX9", "and", "SOX10", "bound", "CRMs", "around", "the", "oligodendrocyte", "specific", "genes", "Plekhb1", "and", "Mid2", "were", "activated", "in", "an", "additive", "manner", "by", "SOX9", "and", "SOX10", ".", "No", "activation", "could", "be", "detected", "with", "SOX11", ".", "(", "D", ")", "Luc", "-", "reporters", "containing", "SOX3", "and", "SOX11", "bound", "CRMs", "of", "the", "neuronal", "genes", "Tubb3", "and", "Lhx2", ",", "which", "are", "sequentially", "bound", "by", "SOX3", "and", "SOX11", ",", "could", "be", "activated", "by", "SOX11", "and", "efficiently", "repressed", "by", "SOX3", ".", "No", "activation", "could", "be", "detected", "with", "SOX10", "(", "E", ")", "Forced", "expression", "of", "SOX3", "for", "96", "hrs", "in", "differentiating", "GPCs", "blocked", "the", "formation", "of", "astrocytes", "but", "not", "oligodendrocytes", ".", "Scale", "bar", ",", "25µm", ".", "(", "F", ")", "Statistical", "view", "of", "Fig", ".", "5E", ".", "Bars", "represents", "mean", "values", "(", "of", "3", "experiments", ")", "of", "cells", "expressing", "GFAP", "or", "SOX10", "in", "GFP", "or", "Sox3", "-", "transduced", "cells", ".", "Error", "bars", "in", "figure", "5", "indicate", "standard", "deviation", "of", "3", "-", "7", "individual", "samples", "and", "three", "-", "star", "significance", ">", "0", ".", "001", "(", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "*", ")", "0", ",", "05", "<", "P", "<", "0", ",", "01", ";", "(", "*", "*", ")", "0", ",", "01", "<", "P", "<", "0", ",", "001", ";", "(", "*", "*", "*", ")", "P", "<", "0", ","], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 (A) Luc-reporter assays in P19 cells. Luc-reporters containing SOX3 and SOX9 bound CRMs around the astrocyte specific genes Fgfbp3 and Ttyh1 were strongly activated by SOX9 in synergy with NFIA; an activation that could be efficiently blocked by SOX3. No activation of these reporters could be detected with SOX10 or SOX11. (B) Luc-reporters containing SOX9 and SOX10 bound DNA-regions around the astrocyte genes Aldh1l1 and Atp1a2, which are not expressed in SOX10+ oligodendrocytes, could not be activated by SOX9 or SOX10 (C) Luc-reporters containing SOX9 and SOX10 bound CRMs around the oligodendrocyte specific genes Plekhb1 and Mid2 were activated in an additive manner by SOX9 and SOX10. No activation could be detected with SOX11. (D) Luc-reporters containing SOX3 and SOX11 bound CRMs of the neuronal genes Tubb3 and Lhx2, which are sequentially bound by SOX3 and SOX11, could be activated by SOX11 and efficiently repressed by SOX3. No activation could be detected with SOX10(E) Forced expression of SOX3 for 96 hrs in differentiating GPCs blocked the formation of astrocytes but not oligodendrocytes. Scale bar, 25µm. (F) Statistical view of Fig. 5E. Bars represents mean values (of 3 experiments) of cells expressing GFAP or SOX10 in GFP or Sox3-transduced cells. Error bars in figure 5 indicate standard deviation of 3-7 individual samples and three-star significance > 0.001 (t-test). (*) 0,05<P<0,01; (**) 0,01<P<0,001; (***) P<0,001"}
{"words": ["Figure", "6", " ", "(", "A", ")", "SOX3", "over", "-", "expression", "experiments", "in", "chicken", " ", "spinal", "cord", "at", "E4", ".", "48", "hrs", "post", "electroporation", ",", "transfected", "side", "showed", "decreased", "expression", "of", "FGFR2", ",", "NFIA", "and", "Fgfr3", ".", "Bar", ":", "50µm", ".", "(", "B", ")", "24", "hrs", "after", "miss", "-", "expression", "of", "a", "dominant", "negative", "version", "of", "SOXB1", "(", "dnSOXB1", ")", ",", "premature", "expression", "of", "FGFR2", ",", "NFIA", "and", "Fgfr3", "were", "found", "in", "the", "transfected", "side", ".", "Bar", ":", "40µm", ".", "(", "C", ")", "24", "hrs", "after", "SOX9", "over", "-", "expression", "in", "chicken", " ", "spinal", "cord", "(", "at", "E4", ")", ",", "increased", "expression", "of", "FGFR2", ",", "NFIA", "and", "Fgfr3", "was", "shown", "compared", "to", "the", "un", "-", "transfected", "control", "side", ".", "Bar", ":", "40µm", ".", "(", "D", ")", "Sox3", "and", "Sox9", "co", "-", "electroporation", "in", "chicken", " ", "spinal", "cord", "at", "E4", "could", "rescue", "the", "effect", "of", "SOX9", "overexpression", "and", "FGFR2", ",", "NFIA", "and", "Fgfr3", "levels", "were", "comparable", "to", "the", "un", "-", "transfected", "control", "side", ".", "Embryos", "were", "analyzed", "24", "hrs", "post", "electroporation", ".", "Bar", ":", "40µm", ".", "(", "E", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 (A) SOX3 over-expression experiments in chicken spinal cord at E4. 48 hrs post electroporation, transfected side showed decreased expression of FGFR2, NFIA and Fgfr3. Bar: 50µm. (B) 24 hrs after miss-expression of a dominant negative version of SOXB1 (dnSOXB1), premature expression of FGFR2, NFIA and Fgfr3 were found in the transfected side. Bar: 40µm. (C) 24 hrs after SOX9 over-expression in chicken spinal cord (at E4), increased expression of FGFR2, NFIA and Fgfr3 was shown compared to the un-transfected control side. Bar: 40µm. (D) Sox3 and Sox9 co-electroporation in chicken spinal cord at E4 could rescue the effect of SOX9 overexpression and FGFR2, NFIA and Fgfr3 levels were comparable to the un-transfected control side. Embryos were analyzed 24 hrs post electroporation. Bar: 40µm. (E "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "cells", "released", "from", "mitosis", "for", "1", ",", "2", "or", "3h", "in", "EdU", "-", "containing", "medium", ".", "Top", ",", "DNA", "staining", "with", "DAPI", ";", "Bottom", ",", "EdU", "immunofluorescence", ".", "L", ",", "M", "and", "H", "indicate", "cells", "with", "low", ",", "medium", "or", "high", "levels", "of", "EdU", "incorporation", ".", "The", "barplot", "shows", "the", "quantification", "of", "the", "proportion", "of", "replicating", "cells", "at", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative images of cells released from mitosis for 1, 2 or 3h in EdU-containing medium. Top, DNA staining with DAPI; Bottom, EdU immunofluorescence. L, M and H indicate cells with low, medium or high levels of EdU incorporation. The barplot shows the quantification of the proportion of replicating cells at each time point."}
{"words": ["Figure", "2Y", "-", "axis", ",", "z", "-", "score", ";", "X", "-", "axis", ",", "timepoints", ".", "A", "indicates", "asynchronous", "cells", ",", "M", "mitotic", "cells", "and", "the", "numbers", "represent", "the", "minutes", "after", "release", "from", "the", "mitotic", "block", ")", ".", "Dots", "show", "individual", "replicates", "and", "lines", "averages", "(", "n", "=", "3", "for", "A", "and", "M", ";", "n", "=", "2", "for", "each", "post", "-", "mitotic", "sample", ")", ".", "Pre", "-", "mRNA", "levels", "are", "shown", "for", "pluripotency", "genes", "(", "Oct4", ",", "Klf4", ",", "Esrrb", ")", "and", "cell", "cycle", "regulators", "(", "E2f1", ",", "Cdk2", ",", "Rb", ")", ";", "mRNA", "levels", "for", "individual", "histone", "genes", "(", "only", "averages", "are", "shown", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Y-axis, z-score; X-axis, timepoints. A indicates asynchronous cells, M mitotic cells and the numbers represent the minutes after release from the mitotic block). Dots show individual replicates and lines averages (n=3 for A and M; n=2 for each post-mitotic sample). Pre-mRNA levels are shown for pluripotency genes (Oct4, Klf4, Esrrb) and cell cycle regulators (E2f1, Cdk2, Rb); mRNA levels for individual histone genes (only averages are shown)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "genes", "presenting", "at", "least", "1", "TF", "binding", "site", "as", "detected", "by", "ChIP", "-", "seq", "within", "25kb", "centred", "on", "the", "TSS", ",", "calculated", "for", "each", "gene", "category", "shown", "in", "(", "A", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Percentage of genes presenting at least 1 TF binding site as detected by ChIP-seq within 25kb centred on the TSS, calculated for each gene category shown in (A)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Heatmaps", "presented", "for", "untreated", "(", "-", "IAA", ";", "left", ")", "or", "CTCF", "-", "depleted", "(", "+", "IAA", ";", "right", ")", "CTCF", "-", "AID", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Heatmaps presented for untreated (-IAA; left) or CTCF-depleted (+IAA; right) CTCF-AID cells."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Gene", "expression", "changes", "(", "z", "-", "score", ")", "in", "asynchronous", "cells", "and", "during", "post", "-", "mitotic", "release", "of", "CTCF", "-", "AID", "cells", "treated", "or", "not", "with", "IAA", "to", "deplete", "CTCF", "(", "blue", ",", "presence", "of", "CTCF", ";", "red", ",", "absence", ")", ".", "Samples", "are", "indicated", "on", "the", "X", "-", "axis", "(", "A", ":", "asynchronous", "cells", ";", "M", ":", "mitotic", "cells", ";", "numbers", ":", "minutes", "since", "release", "from", "mitotic", "block", ")", ".", "Six", "gene", "groups", "are", "shown", ",", "based", "on", "the", "time", "of", "their", "response", "to", "CTCF", "depletion", "(", "asy", ",", "late", ",", "early", ")", "and", "the", "direction", "of", "the", "transcriptional", "change", "(", "up", ",", "down", ")", ".", "The", "number", "of", "genes", "of", "each", "group", "is", "indicated", ".", "The", "yellow", "shadow", "areas", "indicate", "times", "showing", "expression", "changes", ".", "The", "boxplots", "show", "the", "median", "(", "bar", ")", ",", "25", "-", "75", "%", "percentiles", "(", "box", ")", "and", "1", ".", "5", "-", "fold", "inter", "-", "quartile", "range", "(", "whiskers", ")", ".", "(", "C", ")", "Average", "binding", "profile", "(", "X", "-", "axis", ",", "reads", "per", "million", ")", "of", "CTCF", "(", "top", ")", "and", "the", "Cohesin", "subunit", "SMC1", "(", "bottom", ")", ",", "across", "8kb", "centred", "on", "the", "TSS", "of", "genes", "responding", "to", "CTCF", "depletion", "exclusively", "in", "asynchronous", "cells", "(", "left", ")", "or", "either", "late", "or", "early", "upon", "mitotic", "release", "(", "middle", "and", "right", ",", "respectively", ")", ".", "Interphase", "is", "shown", "in", "blue", "and", "mitosis", "in", "red", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Gene expression changes (z-score) in asynchronous cells and during post-mitotic release of CTCF-AID cells treated or not with IAA to deplete CTCF (blue, presence of CTCF; red, absence). Samples are indicated on the X-axis (A: asynchronous cells; M: mitotic cells; numbers: minutes since release from mitotic block). Six gene groups are shown, based on the time of their response to CTCF depletion (asy, late, early) and the direction of the transcriptional change (up, down). The number of genes of each group is indicated. The yellow shadow areas indicate times showing expression changes. The boxplots show the median (bar), 25-75% percentiles (box) and 1.5-fold inter-quartile range (whiskers).(C) Average binding profile (X-axis, reads per million) of CTCF (top) and the Cohesin subunit SMC1 (bottom), across 8kb centred on the TSS of genes responding to CTCF depletion exclusively in asynchronous cells (left) or either late or early upon mitotic release (middle and right, respectively). Interphase is shown in blue and mitosis in red."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Western", "blot", "of", "PTEN", "variants", "in", "a", "panel", "of", "human", "cancer", "cell", "lines", "using", "a", "rabbit", "monoclonal", "antibody", "against", "the", "C", "-", "terminal", "region", "of", "PTEN", "The", "PTEN", "null", "prostate", "cancer", "cell", "line", "PC3", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Western blot of PTEN variants in a panel of human cancer cell lines using a rabbit monoclonal antibody against the C-terminal region of PTEN The PTEN null prostate cancer cell line PC3 was used as a negative control."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Verification", "of", "expression", "of", "FLAG", "-", "tagged", "PTENα", ",", "PTENβ", ",", "and", "PTENε", "in", "PtenFLAG", "knock", "-", "in", "mice", ".", "Various", "tissues", "from", "PtenFLAG", "knock", "-", "in", "mice", "or", "control", "wild", "-", "type", "mice", "were", "lysed", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "FLAG", "M2", "magnetic", "beads", "before", "being", "immunoblotted", "with", "the", "anti", "-", "PTENα"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Verification of expression of FLAG-tagged PTENα, PTENβ, and PTENε in PtenFLAG knock-in mice. Various tissues from PtenFLAG knock-in mice or control wild-type mice were lysed for immunoprecipitation with anti-FLAG M2 magnetic beads before being immunoblotted with the anti-PTENα antibody"}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Reduction", "of", "PTENε", "in", "response", "to", "eIF2A", "knockdown", ".", "Hela", "cells", "were", "infected", "with", "lentivirus", "expressing", "eIF2A", "shRNA", ",", "eIF5", "shRNA", ",", "or", "scramble", "shRNA", "separately", ".", "The", "knockdown", "of", "eIF2A", "or", "eIF5", "was", "validated", "by", "western", "blot", "(", "left", "panel", ")", ".", "Lysates", "of", "Hela", "cells", "were", "collected", "and", "subjected", "to", "western", "blot", "analysis", "with", "antibodies", "against", "PTEN", ",", "and", "GAPDH", "(", "right", "panel", ")", ".", "C", ".", "Overexpression", "of", "eIF2A", "induces", "the", "relative", "expression", "of", "PTENε", ".", "FLAG", "-", "tagged", "eIF2A", "or", "eIF5", "were", "overexpressed", "in", "DU145", "cells", "before", "western", "blot", "analysis", "of", "PTENε", "expression", "with", "an", "antibody", "against", "PTEN", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Reduction of PTENε in response to eIF2A knockdown. Hela cells were infected with lentivirus expressing eIF2A shRNA, eIF5 shRNA, or scramble shRNA separately. The knockdown of eIF2A or eIF5 was validated by western blot (left panel). Lysates of Hela cells were collected and subjected to western blot analysis with antibodies against PTEN, and GAPDH (right panel).C. Overexpression of eIF2A induces the relative expression of PTENε. FLAG-tagged eIF2A or eIF5 were overexpressed in DU145 cells before western blot analysis of PTENε expression with an antibody against PTEN. GAPDH was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "5C", ".", "The", "transfected", "Hela", "PTEN", "-", "/", "-", "cells", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "β", "-", "catenin", "antibody", "and", "DAPI", "before", "being", "imaged", "with", "confocal", "microscopy", ".", "To", "determine", "the", "sequences", "that", "are", "critical", "for", "the", "membrane", "localization", "of", "PTENε", ".", "Hela", "were", "transfected", "with", "constructs", "Thirty", "-", "six", "hours", "after", "transfection", ",", "transfected", "Hela", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "β", "-", "catenin", "antibody", "and", "DAPI", ",", "followed", "by", "imaging", "with", "confocal", "microscopy", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "5", "μm", "(", "F", ")", ".", "The", "transfected", "HEK293", "cells", "were", "conducted", "with", "cell", "fractionation", "before", "western", "blotting", "with", "GFP", ",", "E", "-", "cadherin", ",", "and", "β", "-", "tubulin", "antibodies", "(", "G", ")", ".", "C", ":", "cytoplasm", ".", "M", ":", "cell", "plasma", "membrane", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C. The transfected Hela PTEN-/- cells were stained with an anti-β-catenin antibody and DAPI before being imaged with confocal microscopy.To determine the sequences that are critical for the membrane localization of PTENε. Hela were transfected with constructs Thirty-six hours after transfection, transfected Hela cells were stained with anti-β-catenin antibody and DAPI, followed by imaging with confocal microscopy. The scale bars represent 5 μm (F).The transfected HEK293 cells were conducted with cell fractionation before western blotting with GFP, E-cadherin, and β-tubulin antibodies (G). C: cytoplasm. M: cell plasma membrane."}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "Images", "of", "immunofluorescence", "staining", "for", "PTENε", "and", "its", "interacting", "proteins", "(", "VASP", "and", "FSCN1", ")", ".", "Hela", "PTEN", "-", "/", "-", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "by", "a", "plasmid", "expressing", "C", "-", "terminal", "GFP", "-", "tagged", "PTENε", "with", "FLAG", "-", "tagged", "targets", "(", "FSCN1", ",", "VASP", ")", "separately", ",", "followed", "by", "staining", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "DAPI", ",", "and", "were", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "E", ".", "The", "cell", "plasma", "membrane", "localization", "of", "PTENε", "is", "required", "for", "its", "interaction", "with", "downstream", "targets", ".", "FLAG", "-", "tagged", "CDC42", ",", "VASP", ",", "ACTR2", ",", "or", "FSCN1", "plasmid", "was", "co", "-", "transfected", "with", "a", "plasmid", "expressing", "PTENε", "with", "or", "without", "69", "-", "81aa", "deletion", "carrying", "C", "-", "terminal", "S", "-", "tag", "and", "HA", "tag", "in", "HEK293", "cells", ".", "Cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "S", "protein", "agarose", "before", "western", "blotting", "with", "antibodies", "against", "the", "FLAG", "tag", "and", "HA", "tag", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Purified", "ACTR2", "or", "VASP", "was", "phosphorylated", "in", "vitro", "by", "NIK", "or", "PKA", "and", "subsequently", "used", "in", "a", "phosphatase", "assay", "with", "His", "-", "PTENε", "or", "without", "purified", "PTENε", "protein", "as", "a", "control", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "p", "-", "ACTR2", "(", "Thr237", "and", "Thr238", ")", "and", "p", "-", "VASP", "(", "Ser157", ")", ".", "Purified", "proteins", "(", "PTENε", ",", "PKA", ",", "NIK", ",", "ACTR", ",", "and", "VASP", ")", "were", "detected", "by", "anti", "-", "His", "antibody", "(", "ZSGB", "-", "BIO", ",", "TA", "-", "02", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. Images of immunofluorescence staining for PTENε and its interacting proteins (VASP and FSCN1). Hela PTEN-/- cells were co-transfected by a plasmid expressing C-terminal GFP-tagged PTENε with FLAG-tagged targets (FSCN1, VASP) separately, followed by staining with an anti-FLAG antibody and DAPI, and were imaged by confocal microscopy.E. The cell plasma membrane localization of PTENε is required for its interaction with downstream targets. FLAG-tagged CDC42, VASP, ACTR2, or FSCN1 plasmid was co-transfected with a plasmid expressing PTENε with or without 69-81aa deletion carrying C-terminal S-tag and HA tag in HEK293 cells. Cell lysates were incubated with S protein agarose before western blotting with antibodies against the FLAG tag and HA tag.(H, I) Purified ACTR2 or VASP was phosphorylated in vitro by NIK or PKA and subsequently used in a phosphatase assay with His-PTENε or without purified PTENε protein as a control, followed by immunoblotting with antibodies against p-ACTR2 (Thr237 and Thr238) and p-VASP (Ser157). Purified proteins (PTENε, PKA, NIK, ACTR, and VASP) were detected by anti-His antibody (ZSGB-BIO, TA-02)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "F", "-", "actin", "in", "PTENε", "or", "PTENε", "Y210L", "overexpressed", "Hela", "PTEN", "-", "/", "-", "cells", "and", "control", "cells", ".", "PTENε", "-", "GFP", ",", "PTENε", "Y210L", "-", "GFP", ",", "or", "mock", "construct", "was", "introduced", "into", "HeLa", "PTEN", "-", "/", "-", "cells", "respectively", ".", "The", "transfected", "cells", "were", "stained", "with", "Phalloidin", "and", "DAPI", "before", "being", "imaged", "with", "confocal", "microscopy", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "5", "μm", "(", "left", "panel", ")", ".", "White", "arrows", "shown", "in", "the", "magnified", "immunofluorescence", "images", "indicate", "the", "filopodia", "in", "the", "cell", "membrane", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "filopodia", "per", "cell", "by", "FiloQuant", "software", "and", "the", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "were", "analyzed", "with", "the", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "G", ".", "Left", "panel", ":", "immunoblotting", "analyses", "were", "used", "to", "verify", "the", "level", "of", "overexpressed", "PTENε", "or", "PTENε", "Y210L", "in", "B16", "cells", ".", "Middle", "panel", ":", "representative", "images", "showing", "the", "lung", "metastasis", "of", "PTENε", "or", "PTENε", "Y210L", "overexpressed", "B16", "cells", "or", "control", "cells", "in", "the", "mouse", "pulmonary", "metastasis", "model", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "H", "&", "E", ",", "hematoxylin", "-", "eosin", "staining", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "600", "mm", "(", "upper", "panel", ")", "and", "500μm", "(", "lower", "panel", ")", "separately", ".", "Right", "panel", ":", "the", "representative", "bar", "graphs", "showing", "the", "quantification", "of", "tumor", "metastatic", "ability", "was", "displayed", "by", "measuring", "the", "number", "of", "tumor", "nodules", "(", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "based", "on", "three", "independent", "replicates", ")", ".", "The", "overexpression", "of", "PTENε", "attenuated", "tumor", "metastatic", "ability", "compared", "with", "the", "vector", "control", "group", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "the", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Immunofluorescence staining of F-actin in PTENε or PTENε Y210L overexpressed Hela PTEN-/- cells and control cells. PTENε-GFP, PTENε Y210L-GFP, or mock construct was introduced into HeLa PTEN-/- cells respectively. The transfected cells were stained with Phalloidin and DAPI before being imaged with confocal microscopy. The scale bars represent 5 μm (left panel). White arrows shown in the magnified immunofluorescence images indicate the filopodia in the cell membrane. B. Quantification of the number of filopodia per cell by FiloQuant software and the data are presented as mean ± SD of three independent experiments and were analyzed with the unpaired t-test. ****, p<0.001.G. Left panel: immunoblotting analyses were used to verify the level of overexpressed PTENε or PTENε Y210L in B16 cells. Middle panel: representative images showing the lung metastasis of PTENε or PTENε Y210L overexpressed B16 cells or control cells in the mouse pulmonary metastasis model (n=4). H & E, hematoxylin-eosin staining. The scale bars represent 600 mm (upper panel) and 500μm (lower panel) separately. Right panel: the representative bar graphs showing the quantification of tumor metastatic ability was displayed by measuring the number of tumor nodules (data are presented as mean ± SD based on three independent replicates). The overexpression of PTENε attenuated tumor metastatic ability compared with the vector control group. ****, p<0.0001 in the unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "and", "B", ")", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "were", "treated", "with", "the", "TLR", "ligands", "Pam3", ",", "lipopolysaccharide", "(", "LPS", ")", ",", "or", "FSL", "-", "1", "and", "analyzed", "by", "RNA", "-", "seq", "8", "h", "later", ".", "Circos", "plots", "show", "genome", "-", "wide", "differential", "expression", "of", "protein", "-", "coding", "genes", "(", "A", ")", "and", "non", "-", "protein", "-", "coding", "genes", "(", "B", ")", "between", "untreated", "and", "treated", "macrophages", ".", "The", "outermost", "to", "innermost", "circles", "show", "downregulated", "(", "blue", ")", "or", "upregulated", "(", "red", ")", "genes", "in", "cells", "stimulated", "with", "FSL", "-", "1", ",", "LPS", ",", "and", "Pam3", ",", "respectively", ".", "Chromosomes", "are", "indicated", "by", "the", "numbers", "1", "-", "22", "and", "X", "and", "Y", ".", "(", "F", ")", "RT", "-", "qPCR", "validation", "of", "differentially", "expressed", "lncRNAs", "and", "mRNAs", "in", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "stimulated", "for", "8", "h", "with", "flagellin", "(", "FLA", ")", ",", "FSL", "-", "1", ",", "imiquimod", ",", "LPS", ",", "Pam3", ",", "or", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ".", "Heat", "map", "shows", "the", "fold", "change", "in", "expression", "of", "13", "mRNAs", "(", "left", ")", "and", "lncRNAs", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A and B) THP1-derived macrophages were treated with the TLR ligands Pam3, lipopolysaccharide (LPS), or FSL-1 and analyzed by RNA-seq 8 h later. Circos plots show genome-wide differential expression of protein-coding genes (A) and non-protein-coding genes (B) between untreated and treated macrophages. The outermost to innermost circles show downregulated (blue) or upregulated (red) genes in cells stimulated with FSL-1, LPS, and Pam3, respectively. Chromosomes are indicated by the numbers 1-22 and X and Y.(F) RT-qPCR validation of differentially expressed lncRNAs and mRNAs in THP1-derived macrophages stimulated for 8 h with flagellin (FLA), FSL-1, imiquimod, LPS, Pam3, or poly(I:C). Heat map shows the fold change in expression of 13 mRNAs (left) and lncRNAs (right)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Activation", "and", "suppression", "of", "nearby", "genes", "by", "eight", "cis", "-", "acting", "lncRNAs", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "non", "-", "targeting", "control", "(", "NC", ")", "shRNA", "or", "shRNAs", "targeted", "to", "the", "indicated", "lncRNAs", "and", "protein", "-", "coding", "genes", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "Silencing", "of", "cis", "-", "regulated", "gene", "pairs", "affects", "GBS", "-", "induced", "expression", "of", "IL", "-", "6", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "transduced", "with", "the", "indicated", "NC", "or", "targeting", "shRNAs", "for", "72", "h", ",", "infected", "with", "GBS", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "gentamicin", "for", "30", "min", "to", "terminate", "infection", ".", "RT", "-", "qPCR", "were", "performed", "at", "10", "h", "post", "-", "infection", ".", "Silencing", "of", "cis", "-", "regulated", "gene", "pairs", "affects", "GBS", "-", "induced", "expression", "of", "IL", "-", "6", "IL", "-", "6", "ELISA", "quantification", "(", "C", ")", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "transduced", "with", "the", "indicated", "NC", "or", "targeting", "shRNAs", "for", "72", "h", ",", "infected", "with", "GBS", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "gentamicin", "for", "30", "min", "to", "terminate", "infection", ".", "ELISA", "were", "performed", "at", "10", "h", "post", "-", "infection", ".", "Silencing", "of", "cis", "-", "regulated", "gene", "pairs", "affects", "GBS", "-", "induced", "expression", "of", "IL", "-", "1α", "(", "D", ")", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "transduced", "with", "the", "indicated", "NC", "or", "targeting", "shRNAs", "for", "72", "h", ",", "infected", "with", "GBS", "for", "1", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "gentamicin", "for", "30", "min", "to", "terminate", "infection", ".", "RT", "-", "qPCR", "were", "performed", "at", "10", "h", "post", "-", "infection", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Activation and suppression of nearby genes by eight cis-acting lncRNAs. RT-qPCR analysis of THP1-derived macrophages transduced with lentiviruses expressing non-targeting control (NC) shRNA or shRNAs targeted to the indicated lncRNAs and protein-coding genes. Mean ± SD of n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, ****p < 0.0001 by Student's t test.Silencing of cis-regulated gene pairs affects GBS-induced expression of IL-6 RT-qPCR analysis of THP1-derived macrophages transduced with the indicated NC or targeting shRNAs for 72 h, infected with GBS for 1 h, and then treated with gentamicin for 30 min to terminate infection. RT-qPCR were performed at 10 h post-infection.Silencing of cis-regulated gene pairs affects GBS-induced expression of IL-6 IL-6 ELISA quantification (C) of THP1-derived macrophages transduced with the indicated NC or targeting shRNAs for 72 h, infected with GBS for 1 h, and then treated with gentamicin for 30 min to terminate infection. ELISA were performed at 10 h post-infection.Silencing of cis-regulated gene pairs affects GBS-induced expression of IL-1α (D). RT-qPCR analysis of THP1-derived macrophages transduced with the indicated NC or targeting shRNAs for 72 h, infected with GBS for 1 h, and then treated with gentamicin for 30 min to terminate infection. RT-qPCR were performed at 10 h post-infection."}
{"words": ["Figure", "3lnc", "-", "MARCKS", "(", "B", ")", "expressions", "were", "quantified", "in", "cells", "stably", "expressing", "dCas9", "/", "KRAB", "/", "BFP", "and", "the", "NC", "or", "sgRNAs", ".", ",", "MARCKS", "(", "C", ")", "expressions", "were", "quantified", "in", "cells", "stably", "expressing", "dCas9", "/", "KRAB", "/", "BFP", "and", "the", "NC", "or", "sgRNAs", ".", "IL", "-", "6", "(", "D", ")", "expressions", "were", "quantified", "in", "cells", "stably", "expressing", "dCas9", "/", "KRAB", "/", "BFP", "and", "the", "NC", "or", "sgRNAs", ".", "Overexpression", "of", "lnc", "-", "MARCKS", "decreases", "MARCKS", "expression", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "THP1", "cells", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "empty", "vector", "(", "E", ".", "V", ".", ")", "or", "lnc", "-", "MARCKS", ",", "treated", "with", "PMA", "overnight", ",", "and", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", ".", "Lnc", "-", "MARCKS", "and", "MARCKS", "expression", "(", "F", ")", "Overexpression", "of", "lnc", "-", "MARCKS", "enhances", "IL", "-", "6", "expression", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "THP1", "cells", "transduced", "with", "lentiviruses", "expressing", "empty", "vector", "(", "E", ".", "V", ".", ")", "or", "lnc", "-", "MARCKS", ",", "treated", "with", "PMA", "overnight", ",", "and", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", ".", "IL", "-", "6", "expression", "(", "G", ")", ".", "lnc", "-", "MARCKS", "regulates", "MARCKS", "in", "primary", "macrophages", ".", "Primary", "macrophages", "were", "transfected", "with", "NC", "or", "lnc", "-", "MARCKS", "antisense", "oligo", "to", "knock", "down", "lnc", "-", "MARCKS", "expression", ".", "48", "h", "later", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", "and", "harvested", "to", "detect", "lnc", "-", "MARCKS", "(", "H", ")", "lnc", "-", "MARCKS", "regulates", "MARCKS", "in", "primary", "macrophages", ".", "Primary", "macrophages", "were", "transfected", "with", "NC", "or", "lnc", "-", "MARCKS", "antisense", "oligo", "to", "knock", "down", "lnc", "-", "MARCKS", "expression", ".", "48", "h", "later", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", "and", "harvested", "to", "detect", "MARCKS", "(", "I", ")", ",", "lnc", "-", "MARCKS", "regulates", "IL", "-", "6", "in", "primary", "macrophages", ".", "Primary", "macrophages", "were", "transfected", "with", "NC", "or", "lnc", "-", "MARCKS", "antisense", "oligo", "to", "knock", "down", "lnc", "-", "MARCKS", "expression", ".", "48", "h", "later", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", "and", "harvested", "to", "detect", "IL", "-", "6", "expressions", "(", "J", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3lnc-MARCKS (B) expressions were quantified in cells stably expressing dCas9/KRAB/BFP and the NC or sgRNAs., MARCKS (C) expressions were quantified in cells stably expressing dCas9/KRAB/BFP and the NC or sgRNAs.IL-6 (D) expressions were quantified in cells stably expressing dCas9/KRAB/BFP and the NC or sgRNAs.Overexpression of lnc-MARCKS decreases MARCKS expression RT-qPCR analysis of THP1 cells transduced with lentiviruses expressing empty vector (E.V.) or lnc-MARCKS, treated with PMA overnight, and left unstimulated or stimulated with Pam3 for 8 h. Lnc-MARCKS and MARCKS expression (F)Overexpression of lnc-MARCKS enhances IL-6 expression. RT-qPCR analysis of THP1 cells transduced with lentiviruses expressing empty vector (E.V.) or lnc-MARCKS, treated with PMA overnight, and left unstimulated or stimulated with Pam3 for 8 h. IL-6 expression (G).lnc-MARCKS regulates MARCKS in primary macrophages. Primary macrophages were transfected with NC or lnc-MARCKS antisense oligo to knock down lnc-MARCKS expression. 48 h later, cells were stimulated with Pam3 for 8 h and harvested to detect lnc-MARCKS (H)lnc-MARCKS regulates MARCKS in primary macrophages. Primary macrophages were transfected with NC or lnc-MARCKS antisense oligo to knock down lnc-MARCKS expression. 48 h later, cells were stimulated with Pam3 for 8 h and harvested to detect MARCKS (I),lnc-MARCKS regulates IL-6 in primary macrophages. Primary macrophages were transfected with NC or lnc-MARCKS antisense oligo to knock down lnc-MARCKS expression. 48 h later, cells were stimulated with Pam3 for 8 h and harvested to detect IL-6 expressions (J)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "ROCKI", "is", "recruited", "to", "the", "MARCKS", "promoter", "in", "Pam3", "-", "stimulated", "THP1", "-", "derived", "macrophages", ".", "ChIRP", "analysis", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "treated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", ".", "ChIRP", "assays", "were", "performed", "using", "a", "non", "-", "specific", "lacZ", "probe", "or", "probes", "specific", "for", "lnc", "-", "MARCKS", ".", "Specificity", "of", "ROCKI", "probes", "(", "left", ")", ",", "and", "enrichment", "at", "the", "MARCKS", "promoter", "(", "right", ")", ".", "(", "B", ")", "Mass", "spectrometry", "identifies", "APEX1", "as", "a", "candidate", "ROCKI", "-", "binding", "protein", "in", "THP1", "-", "derived", "macrophages", ".", "APEX1", "MS", "/", "MS", "count", "represents", "the", "ratio", "between", "the", "number", "of", "APEX1", "peptides", "and", "all", "peptides", "detected", ".", "Mean", "of", "n", "=", "2", "samples", ".", "ROCKI", "and", "ROCKI", "-", "AS", "represent", "ROCKI", "and", "antisense", "strand", "of", "ROCKI", "transcripts", ",", "respectively", ".", "(", "C", ")", "ROCKI", "inhibition", "of", "MARCKS", "expression", "is", "dependent", "on", "APEX1", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "MARCKS", ",", "ROCKI", ",", "and", "APEX1", "expression", "in", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "overexpressing", "ROCKI", "and", "/", "or", "depleted", "of", "APEX1", ".", "(", "D", ")", "APEX1", "specially", "binds", "to", "ROCKI", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "APEX1", "in", "lacZ", ",", "or", "ROCKI", "pull", "-", "down", "fractions", ".", "Vimentin", ",", "which", "non", "-", "specifically", "binds", "to", "all", "RNA", "probes", ",", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "ROCKI", "associates", "with", "APEX1", ".", "Left", ":", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "ROCKI", "present", "in", "anti", "-", "APEX1", "antibody", "or", "control", "IgG", "immunoprecipitates", "from", "nuclear", "lysates", "of", "Pam3", "-", "treated", "THP1", "-", "derived", "macrophages", ".", "Right", ":", "APEX1", "western", "blot", "of", "the", "same", "immunoprecipitates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) ROCKI is recruited to the MARCKS promoter in Pam3-stimulated THP1-derived macrophages. ChIRP analysis of THP1-derived macrophages treated with Pam3 for 8 h. ChIRP assays were performed using a non-specific lacZ probe or probes specific for lnc-MARCKS. Specificity of ROCKI probes (left), and enrichment at the MARCKS promoter (right).(B) Mass spectrometry identifies APEX1 as a candidate ROCKI-binding protein in THP1-derived macrophages. APEX1 MS/MS count represents the ratio between the number of APEX1 peptides and all peptides detected. Mean of n = 2 samples. ROCKI and ROCKI-AS represent ROCKI and antisense strand of ROCKI transcripts, respectively.(C) ROCKI inhibition of MARCKS expression is dependent on APEX1. RT-qPCR analysis of MARCKS, ROCKI, and APEX1 expression in THP1-derived macrophages overexpressing ROCKI and/or depleted of APEX1.(D) APEX1 specially binds to ROCKI. Western blot analysis of APEX1 in lacZ, or ROCKI pull-down fractions. Vimentin, which non-specifically binds to all RNA probes, is shown as a loading control.(E) ROCKI associates with APEX1. Left: RT-qPCR analysis of ROCKI present in anti-APEX1 antibody or control IgG immunoprecipitates from nuclear lysates of Pam3-treated THP1-derived macrophages. Right: APEX1 western blot of the same immunoprecipitates."}
{"words": ["Figure", "5ChIP", "analysis", "of", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "demonstrates", "APEX1", "recruitment", "to", "the", "MARCKS", "promoter", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "fragments", "of", "the", "MARCKS", "promoter", "region", "(", "a", "and", "b", ")", "or", "a", "non", "-", "specific", "region", "(", "nc", ")", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "APEX1", "antibody", ".", "ChIP", "analysis", "of", "APEX1", "recruitment", "to", "the", "MARCKS", "promoter", "was", "performed", "except", "the", "cells", "expressed", "control", "shRNA", "(", "NC", ")", "or", "ROCKI", "shRNA", "and", "treated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "the", "percentage", "of", "enrichment", "in", "normalized", "to", "input", ".", "An", "unrelated", "region", "of", "the", "ACTB2", "promoter", "was", "amplified", "as", "a", "control", ".", "Left", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "APEX1", "and", "HDAC1", "in", "control", "rabbit", "IgG", "or", "anti", "-", "APEX1", "antibody", "immunoprecipitates", "from", "NC", "(", "control", ")", "or", "ROCKI", "knockdown", "THP1", "-", "derived", "macrophages", ".", "Right", ":", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "ROCKI", "in", "the", "same", "immunoprecipitates", ".", "Knockdown", "of", "ROCKI", "decreased", "HDAC1", "enrichment", "on", "the", "MARCKS", "promoter", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "HDAC1", "was", "performed", "using", "an", "anti", "-", "HDAC1", "antibody", ".", "Knockdown", "of", "ROCKI", "enhances", "H3K27ac", "deposition", "on", "the", "MARCKS", "promoter", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "H3K27ac", "was", "performed", "using", "an", "anti", "-", "H3K27ac", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5ChIP analysis of THP1-derived macrophages demonstrates APEX1 recruitment to the MARCKS promoter. RT-qPCR analysis of fragments of the MARCKS promoter region (a and b) or a non-specific region (nc) co-immunoprecipitated with anti-APEX1 antibody.ChIP analysis of APEX1 recruitment to the MARCKS promoter was performed except the cells expressed control shRNA (NC) or ROCKI shRNA and treated with Pam3 for 8 h. The y-axis shows the percentage of enrichment in normalized to input. An unrelated region of the ACTB2 promoter was amplified as a control.Left: Western blot analysis of APEX1 and HDAC1 in control rabbit IgG or anti-APEX1 antibody immunoprecipitates from NC (control) or ROCKI knockdown THP1-derived macrophages. Right: RT-qPCR analysis of ROCKI in the same immunoprecipitates.Knockdown of ROCKI decreased HDAC1 enrichment on the MARCKS promoter. ChIP-qPCR analysis of HDAC1 was performed using an anti- HDAC1 antibody.Knockdown of ROCKI enhances H3K27ac deposition on the MARCKS promoter. ChIP-qPCR analysis of H3K27ac was performed using an anti-H3K27ac antibody."}
{"words": ["Figure", "6Heatmap", "of", "representative", "genes", "commonly", "upregulated", "in", "ROCKI", "-", "overexpressing", "and", "MARCKS", "-", "knockdown", "THP1", "-", "derived", "macrophages", ".", "RT", "-", "qPCR", "validation", "of", "inflammatory", "gene", "expression", "in", "ROCKI", "-", "overexpressing", "and", "MARCKS", "-", "knockdown", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "stimulated", "with", "Pam3", "for", "8", "h", ".", "E", ".", "V", ".", ",", "empty", "vector", ";", "NC", ",", "control", "shRNA", ".", "MARCKS", "is", "a", "negative", "regulator", "of", "Ca2", "+", "signaling", ".", "Fluo", "-", "4", "fluorescence", "of", "MARCKS", ",", "ROCKI", ",", "or", "NC", "(", "control", ")", "shRNA", "-", "expressing", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "before", "and", "after", "treatment", "with", "PMA", "and", "Pam3", ".", "Triton", "X", "-", "100", "was", "added", "to", "obtain", "the", "maximal", "[", "Ca2", "+", "]", "signal", ".", "Fluorescence", "levels", "are", "expressed", "as", "the", "change", "in", "signal", "normalized", "to", "the", "maximal", "fluorescence", "(", "ΔF", "/", "Fmax", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Heatmap of representative genes commonly upregulated in ROCKI-overexpressing and MARCKS-knockdown THP1-derived macrophages.RT-qPCR validation of inflammatory gene expression in ROCKI-overexpressing and MARCKS-knockdown THP1-derived macrophages stimulated with Pam3 for 8 h. E.V., empty vector; NC, control shRNA.MARCKS is a negative regulator of Ca2+ signaling. Fluo-4 fluorescence of MARCKS, ROCKI, or NC (control) shRNA-expressing THP1-derived macrophages before and after treatment with PMA and Pam3. Triton X-100 was added to obtain the maximal [Ca2+] signal. Fluorescence levels are expressed as the change in signal normalized to the maximal fluorescence (ΔF/Fmax)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "QTL", "signals", "for", "ROCKI", "(", "LINC01268", ")", "gene", "expression", "in", "whole", "blood", "(", "top", ",", "black", ")", ",", "H3K27ac", "promoter", "signal", "in", "monocytes", "(", "middle", ",", "green", ")", ",", "and", "H3K4me1", "signal", "in", "monocytes", "(", "bottom", ",", "orange", ")", "in", "a", "400", "kb", "window", "around", "the", "MARCKS", "/", "ROCKI", "locus", ".", "The", "signals", "were", "strongly", "co", "-", "localized", "(", "Pshared", "=", ".", "97", ",", "Pshared", "=", ".", "98", ")", "suggesting", "they", "represent", "the", "same", "signal", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "ROCKI", "expression", "in", "dendritic", "cell", "samples", "from", "uninfected", "and", "M", ".", "tuberculosis", "-", "infected", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) QTL signals for ROCKI (LINC01268) gene expression in whole blood (top, black), H3K27ac promoter signal in monocytes (middle, green), and H3K4me1 signal in monocytes (bottom, orange) in a 400 kb window around the MARCKS/ROCKI locus. The signals were strongly co-localized (Pshared=.97, Pshared=.98) suggesting they represent the same signal.(C) RT-qPCR analysis of ROCKI expression in dendritic cell samples from uninfected and M. tuberculosis-infected donors."}
{"words": ["Figure", "7D", ",", "Affinity", "capture", "of", "proteins", "by", "OC43p", "and", "OC43", "-", "SCR", "bound", "magnetic", "beads", ".", "Specific", "reactivity", "to", "Atp1a1", "and", "Atp1a2", "was", "detected", "by", "protein", "immunoblotting", "using", "specific", "primary", "antibodies", ".", "OC43p", "-", "SCR", "-", "coated", "and", "uncoated", "beads", "(", "Beads", ")", "were", "used", "to", "control", "non", "-", "specific", "binding", ".", "Spinal", "cords", "were", "isolated", "from", "male", "(", "M", ")", "and", "female", "(", "F", ")", "rats", "(", "n", "=", "2", "/", "group", ")", ".", "Input", "protein", "lysates", "(", "right", "side", ",", "in", "duplicates", ")", "served", "as", "loading", "controls", ".", "Approximate", "molecular", "weights", "(", "in", "kDa", ")", "are", "indicated", "by", "arrows", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D, Affinity capture of proteins by OC43p and OC43-SCR bound magnetic beads. Specific reactivity to Atp1a1 and Atp1a2 was detected by protein immunoblotting using specific primary antibodies. OC43p-SCR-coated and uncoated beads (Beads) were used to control non-specific binding. Spinal cords were isolated from male (M) and female (F) rats (n=2/group). Input protein lysates (right side, in duplicates) served as loading controls. Approximate molecular weights (in kDa) are indicated by arrows."}
{"words": ["Figure", "2Determination", "of", "TAPBPL", "protein", "expression", "in", "normal", "and", "tumor", "human", "tissues", "by", "immunohistochemistry", "using", "anti", "-", "TAPBPL", "or", "isotype", "Ab", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Determination of TAPBPL protein expression in normal and tumor human tissues by immunohistochemistry using anti-TAPBPL or isotype Ab."}
{"words": ["Figure", "3Splenocytes", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "freshly", "harvested", ".", "Resting", "and", "activated", "T", "cells", ",", "monocytes", ",", "macrophages", ",", "DCs", "and", "B", "cells", "were", "obtained", "as", "in", "Figure", "2", ".", "The", "resting", "and", "activated", "immune", "cells", "were", "stained", "with", "biotinylated", "TAPBPL", "-", "Ig", "or", "control", "Ig", "，", "followed", "by", "streptavidin", "PE", ",", "as", "well", "as", "anti", "-", "CD4", ",", "CD8", ",", "CD11b", ",", "F4", "/", "80", ",", "CD11c", ",", "B220", "or", "CD19", "antibody", "to", "identify", "immune", "cells", ".", "statistical", "analysis", "showing", "the", "binding", "TAPBPL", "-", "Ig", "or", "control", "Ig", "to", "freshly", "harvest", "and", "activated", "immune", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "calculated", "by", "two", "‐", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "with", "control", "Ig", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "with", "resting", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Splenocytes from C57BL/6 mice were freshly harvested. Resting and activated T cells, monocytes, macrophages, DCs and B cells were obtained as in Figure 2. The resting and activated immune cells were stained with biotinylated TAPBPL-Ig or control Ig，followed by streptavidin PE, as well as anti-CD4, CD8, CD11b, F4/80, CD11c, B220 or CD19 antibody to identify immune cells. statistical analysis showing the binding TAPBPL-Ig or control Ig to freshly harvest and activated immune cells (n=3). Significance was calculated by two‐way ANOVA with Tukey test. * P<0.05 compared with control Ig. ** P<0.05 compared with resting cells."}
{"words": ["Figure", "4Splenic", "cells", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "cultured", "with", "anti", "-", "CD3", "antibody", "and", "anti", "-", "CD28", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "antibodies", "in", "the", "presence", "of", "graded", "doses", "of", "hTAPBPL", "-", "Ig", "or", "equimolar", "amounts", "of", "control", "Ig", "(", "3", ".", "75", "and", "5", ".", "63", "µg", "/", "ml", ")", "for", "1", "day", "The", "cells", "were", "analyzed", "for", "CD69", "+", ",", "cells", "in", "CD4", "and", "CD8", "T", "cells", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "and", "statistical", "analyses", "of", "the", "percentages", "of", "CD69", "+", ",", "and", "CD44loCD62Lhi", "Naïve", "T", "cells", "in", "CD4", "and", "CD8", "T", "cells", ".", "The", "data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "calculated", "by", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "with", "control", "Ig", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Splenic cells from C57BL/6 mice were cultured with anti-CD3 antibody and anti-CD28 (0.5 µg/ml) antibodies in the presence of graded doses of hTAPBPL-Ig or equimolar amounts of control Ig (3.75 and 5.63 µg/ml) for 1 day The cells were analyzed for CD69+, cells in CD4 and CD8 T cells. Representative flow cytometric and statistical analyses of the percentages of CD69+, and CD44loCD62Lhi Naïve T cells in CD4 and CD8 T cells. The data are expressed as mean + SD (n=3). Significance was calculated by two‐tailed Student's t‐test. * P<0.05 compared with control Ig."}
{"words": ["Figure", "5Splenic", "cells", "were", "labelled", "with", "CFSE", "and", "cultured", "in", "96", "-", "well", "plates", "that", "were", "precoated", "with", "anti", "-", "CD3", "antibody", "and", "hTAPBPL", "-", "Ig", "or", "control", "Ig", "for", "3", "days", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "cells", "were", "analyzed", "for", "CFSE", "levels", "by", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", ".", "statistical", "analysis", "of", "(", "D", ")", "CD4", "and", "(", "E", ")", "CD8", "T", "cell", "proliferation", ".", "Purified", "human", "T", "cells", "were", "cultured", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "human", "CD3", "antibody", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "of", "graded", "doses", "of", "hTAPBPL", "-", "Ig", "(", "1", ".", "5", "and", "3", "µg", "/", "ml", ")", "or", "control", "Ig", "protein", "(", "1", ".", "5", "and", "3", "µg", "/", "ml", ")", "for", "3", "days", ".", "Cell", "proliferation", "was", "measured", "by", "[", "3H", "]", "thymidine", "incorporation", ".", "The", "data", "are", "expressed", "as", "mean", "+", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "was", "calculated", "by", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "compared", "with", "control", "Ig", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Splenic cells were labelled with CFSE and cultured in 96-well plates that were precoated with anti-CD3 antibody and hTAPBPL-Ig or control Ig for 3 days as in (A). The cells were analyzed for CFSE levels by CD4+ and CD8+ T cells. statistical analysis of (D) CD4 and (E) CD8 T cell proliferation.Purified human T cells were cultured with plate-bound anti-human CD3 antibody (1 µg/ml) in the presence of graded doses of hTAPBPL-Ig (1.5 and 3 µg/ml) or control Ig protein (1.5 and 3 µg/ml) for 3 days. Cell proliferation was measured by [3H] thymidine incorporation. The data are expressed as mean + SD (n=3). Significance was calculated by two‐tailed Student's t‐test. * P<0.05 compared with control Ig."}
{"words": ["Figure", "7Anti", "-", "hTAPBPL", "mAb", "(", "clone", "54", ")", "neutralized", "the", "inhibitory", "activity", "of", "hTAPBPL", "-", "Ig", "on", "T", "cell", "proliferation", "Significance", "in", "was", "calculated", "by", "one", "‐", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "test", "and", "others", "by", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "anti", "-", "hTAPBPL", "Ab", "group", "was", "compared", "with", "isotype", "Ab", "group", ".", "DBA", "/", "2J", "mice", "were", "injected", "s", ".", "c", ".", "with", "1", "×", "105", "P388", "murine", "leukemia", "cells", ",", "followed", "by", "injection", "of", "the", "anti", "-", "hTAPBPL", "mAb", "(", "25", ",", "50", ",", "or", "100µg", ")", "or", "isotype", "Ab", "(", "25", ",", "50", ",", "or", "100", "µg", ")", "3", "times", "per", "week", ".", "Tumors", "size", "was", "measured", "over", "time", ".", "The", "mean", "tumor", "diameter", "(", "mm3", ")", "+", "S", ".", "D", ".", "at", "the", "indicated", "time", "points", "are", "shown", ".", "Tumor", "infiltrating", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "examined", "by", "immunofluorescence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Anti-hTAPBPL mAb (clone 54) neutralized the inhibitory activity of hTAPBPL-Ig on T cell proliferation Significance in was calculated by one‐way ANOVA with Dunnett test and others by two‐tailed Student's t‐test. * P<0.05, anti-hTAPBPL Ab group was compared with isotype Ab group.DBA/2J mice were injected s.c. with 1× 105 P388 murine leukemia cells, followed by injection of the anti-hTAPBPL mAb (25, 50, or 100µg) or isotype Ab (25, 50, or 100 µg) 3 times per week. Tumors size was measured over time. The mean tumor diameter (mm3) + S.D. at the indicated time points are shown.Tumor infiltrating CD4+ and CD8+ T cells were examined by immunofluorescence."}
{"words": ["Figure", "1LDH", "assay", "was", "performed", "after", "24", "h", "of", "cold", "stress", "on", "ice", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1LDH assay was performed after 24 h of cold stress on ice. Data are presented as mean ± SEM; n = 3, biological replicates. ****p < 0.0001, ***p < 0.001 by one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparison test."}
{"words": ["Figure", "2Immunoblots", "of", "MICU1", "and", "its", "mutants", "rescued", "by", "the", "lentivirus", ".", "Arrows", "indicate", "MICU1", "or", "the", "dimer", ".", "*", "indicates", "the", "potential", "DTT", "-", "resistant", "dimer", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunoblots of MICU1 and its mutants rescued by the lentivirus. Arrows indicate MICU1 or the dimer. * indicates the potential DTT-resistant dimer."}
{"words": ["Figure", "3MMP", "was", "monitored", "by", "TMRE", "fluorescence", "at", "every", "1", "h", ".", "FCCP", "(", "200", "µM", ")", "and", "antimycin", "A", "(", "50", "µM", ")", "were", "used", "as", "pretreatments", "for", "30", "min", ".", "Data", "were", "normalized", "by", "basal", "state", "of", "WT", "A549", "cells", "(", "B", "-", "D", ")", "Data", "at", "1", "h", "(", "C", ")", ",", "5", "h", "(", "D", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "(", "B", "-", "D", ")", "biological", "replicates", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "paired", "T", "-", "test", "(", "C", ")", ",", "or", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "DLDH", "release", "was", "measured", "after", "cold", "stress", "for", "24", "h", ".", "FCCP", "(", "200", "µM", ")", ",", "antimycin", "A", "(", "50", "µM", ")", ",", "mitoQ", "and", "decylQ", "(", "500", "nM", ")", "were", "used", "as", "pretreatments", "for", "30", "min", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "(", "G", ")", ",", "biological", "replicates", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "or", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "whose", "raw", "value", "were", "normalized", "by", "the", "C11", "-", "BODIPY", "581", "/", "591", "without", "cold", "stress", "of", "non", "-", "treatment", ",", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ",", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3MMP was monitored by TMRE fluorescence at every 1 h. FCCP (200 µM) and antimycin A (50 µM) were used as pretreatments for 30 min. Data were normalized by basal state of WT A549 cells (B-D) Data at 1 h (C), 5 h (D are presented as mean ± SEM; n = 4 (B-D) biological replicates, ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05 by paired T-test (C), or one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparison test (DLDH release was measured after cold stress for 24 h. FCCP (200 µM), antimycin A (50 µM), mitoQ and decylQ (500 nM) were used as pretreatments for 30 min. Data are presented as mean ± SEM; n = 4 (G) , biological replicates, ****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, by one-way ANOVA followed by Dunnett's or Bonferroni's multiple comparison test. whose raw value were normalized by the C11-BODIPY 581/591 without cold stress of non-treatment, are presented as mean ± SEM; n = 5, biological replicates. **p < 0.01, *p < 0.05, by one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparison test."}
{"words": ["Figure", "4LDH", "release", "was", "measured", "after", "cold", "stress", "for", "24", "h", ".", "BAPTA", "-", "AM", "(", "10", "µM", ")", "was", "used", "as", "pretreatments", "for", "30", "min", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "by", "unpaired", "T", "-", "test", ".", "LDH", "release", "was", "measured", "after", "cold", "stress", "for", "16", "h", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ",", "biological", "replicates", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "unpaired", "T", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4LDH release was measured after cold stress for 24 h. BAPTA-AM (10 µM) was used as pretreatments for 30 min. Data are presented as mean ± SEM; n = 3, biological replicates, ****p < 0.0001, by unpaired T-test.LDH release was measured after cold stress for 16 h. Data are presented as mean ± SEM; n = 5, biological replicates, *p < 0.05, by unpaired T-test."}
{"words": ["Figure", "1", "B", ":", "Silver", "nitrate", "staining", "of", "proteins", "pulled", "-", "down", "using", "the", "control", "peptide", "(", "left", ")", "or", "the", "FFAT", "peptide", "(", "right", ")", ",", "after", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "two", "major", "differential", "bands", "are", "highlighted", "by", "arrows", "C", ":", "Tandem", "mass", "spectrometry", "result", "table", "showing", "the", "three", "top", "scored", "proteins", "identified", "in", "the", "FFAT", "peptide", "bound", "fraction", ".", "Score", ":", "protein", "score", "based", "on", "the", "sum", "of", "the", "ion", "scores", "of", "all", "peptides", "identified", ";", "Cov", ".", ";", "percentage", "of", "the", "protein", "sequence", "covered", "by", "identified", "peptides", ";", "Pep", ".", ":", "number", "of", "unique", "peptide", "sequences", "identified", "E", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "proteins", "pulled", "-", "down", "using", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", "peptide", "(", "left", ")", "or", "the", "FFAT", "(", "FFAT", ")", "peptide", "(", "right", ")", ".", "The", "Input", ",", "FT", "(", "flow", "-", "through", ")", ",", "and", "Elution", "fractions", "correspond", "to", "HeLa", "cell", "total", "protein", "extract", ",", "unbound", "proteins", "and", "bound", "proteins", ",", "respectively", ".", "Representative", "illustration", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 B: Silver nitrate staining of proteins pulled-down using the control peptide (left) or the FFAT peptide (right), after SDS-PAGE. The two major differential bands are highlighted by arrows C: Tandem mass spectrometry result table showing the three top scored proteins identified in the FFAT peptide bound fraction. Score: protein score based on the sum of the ion scores of all peptides identified; Cov.; percentage of the protein sequence covered by identified peptides; Pep.: number of unique peptide sequences identified  E: Western blot analysis of proteins pulled-down using the control (Ctrl) peptide (left) or the FFAT (FFAT) peptide (right). The Input, FT (flow-through), and Elution fractions correspond to HeLa cell total protein extract, unbound proteins and bound proteins, respectively. Representative illustration of at least two independent experiments "}
{"words": ["Figure", "5", "A", ":", "List", "of", "the", "5", "top", "scored", "proteins", "interacting", "with", "MOSPD2", "and", "known", "to", "contain", "a", "FFAT", "motif", "(", "see", "Appendix", "Table", "S1", "for", "the", "full", "list", ")", ".", "Proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "GFP", "-", "MOSPD2", "and", "GFP", "-", "MOSPD2", "RD", "/", "LD", "proteins", "were", "identified", "by", "mass", "spectrometry", ";", "proteins", "were", "filtered", "for", "their", "ability", "to", "bind", "MOSPD2", "and", "not", "the", "RD", "/", "LD", "mutant", ".", "The", "sub", "-", "cellular", "localization", "of", "the", "proteins", "is", "indicated", "[", "53", ",", "65", "-", "69", "]", "B", "-", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "MOSPD2", "(", "WT", "and", "RD", "/", "LD", "mutant", ")", "and", "Flag", "-", "tagged", "STARD3", "(", "B", ")", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "C", "-", "E", ")", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "actin", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "D", "-", "F", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "B", "-", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "MOSPD2", "(", "WT", "and", "RD", "/", "LD", "mutant", ")", "and", "Flag", "-", "tagge", "STARD3NL", "(", "C", ")", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "C", "-", "E", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "actin", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "usin", "anti", "-", "ORP1", "(", "C", ")", ",", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "B", "-", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "MOSPD2", "(", "WT", "and", "RD", "/", "LD", "mutant", ")", "and", "Flag", "-", "tagge", "ORP1L", "(", "D", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "C", "-", "E", ")", ",", "anti", "-", "ORP1", "(", "D", ")", ")", ",", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "actin", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "D", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "B", "-", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "MOSPD2", "(", "WT", "and", "RD", "/", "LD", "mutant", ")", "and", "Flag", "-", "tagge", "STARD11", "(", "E", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "C", "-", "E", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "actin", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "D", "-", "F", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "B", "-", "F", ":", "Immunoprecipitation", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "experiments", "between", "GFP", "-", "MOSPD2", "(", "WT", "and", "RD", "/", "LD", "mutant", ")", "an", "HA", "-", "tagged", "PTPIP51", "(", "F", ")", "(", "WT", "and", "FFAT", "-", "deficient", ")", ".", "Approximatively", "5", "µg", "of", "total", "protein", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "usin", "anti", "-", "HA", "(", "F", ")", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "actin", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", ".", "Immunoprecipitated", "material", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "Flag", "(", "B", ",", "D", "-", "F", ")", ",", "and", "anti", "-", "GFP", "(", "B", "-", "F", ")", "antibodies", "G", ":", "Immunoprecipitation", "(", "anti", "-", "Flag", ")", "experiment", "between", "Flag", "-", "tagged", "STARD3NL", "(", "WT", "and", "FFAT", "-", "deficient", ")", "and", "endogenous", "MOSPD2", ".", "Proteins", "extracts", "and", "immunoprecipitated", "material", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "MOSPD2", ",", "anti", "-", "STARD3NL", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A: List of the 5 top scored proteins interacting with MOSPD2 and known to contain a FFAT motif (see Appendix Table S1 for the full list). Proteins co-precipitated with GFP-MOSPD2 and GFP-MOSPD2 RD/LD proteins were identified by mass spectrometry; proteins were filtered for their ability to bind MOSPD2 and not the RD/LD mutant. The sub-cellular localization of the proteins is indicated [53,65-69]  B-F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-MOSPD2 (WT and RD/LD mutant) and Flag-tagged STARD3 (B) Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag (B, C-E) anti-GFP (B-F), and anti-actin (B-F) antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag (B, D-F and anti-GFP (B-F) antibodies B-F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-MOSPD2 (WT and RD/LD mutant) and Flag-tagge STARD3NL (C) Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag (B, C-E anti-GFP (B-F), and anti-actin (B-F) antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed usin anti-ORP1 (C), and anti-GFP (B-F) antibodies B-F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-MOSPD2 (WT and RD/LD mutant) and Flag-tagge ORP1L (D Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag (B, C-E), anti-ORP1 (D) ), anti-GFP (B-F), and anti-actin (B-F) antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag (B, D-F ), and anti-GFP (B-F) antibodies B-F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-MOSPD2 (WT and RD/LD mutant) and Flag-tagge STARD11 (E Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot using anti-Flag (B, C-E anti-GFP (B-F), and anti-actin (B-F) antibodies Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag (B, D-F and anti-GFP (B-F) antibodies B-F: Immunoprecipitation (GFP-Trap) experiments between GFP-MOSPD2 (WT and RD/LD mutant) an HA-tagged PTPIP51 (F) (WT and FFAT-deficient). Approximatively 5 µg of total protein extracts were analyzed by Western blot usin anti-HA (F) anti-GFP (B-F), and anti-actin (B-F) antibodies. Immunoprecipitated material was analyzed using anti-Flag (B, D-F ), and anti-GFP (B-F) antibodies G: Immunoprecipitation (anti-Flag) experiment between Flag-tagged STARD3NL (WT and FFAT-deficient) and endogenous MOSPD2. Proteins extracts and immunoprecipitated material were analyzed by Western blot using anti-MOSPD2, anti-STARD3NL and anti-actin antibodies "}
{"words": ["Figure", "8", "A", ":", "GFP", "-", "tagged", "MOSPD2", "(", "green", ")", "expressing", "cells", "were", "labelled", "with", "an", "anti", "-", "MOSPD2", "antibody", "(", "magenta", ")", ".", "The", "superposition", "of", "the", "green", "and", "magenta", "signals", "indicates", "that", "the", "anti", "-", "MOSPD2", "antibody", "recognized", "efficiently", "MOSPD2", "by", "immunofluorescence", "Data", "information", ":", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", ":", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5x", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Right", ":", "Linescan", "analyses", "with", "fluorescence", "intensities", "of", "the", "green", "and", "magenta", "channels", "along", "the", "white", "arrow", "shown", "on", "the", "subpanel", "Overlay", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", " ", "B", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "MOSPD2", "and", "VAP", "proteins", "in", "control", "HeLa", "cells", "(", "WT", ")", "and", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "a", "control", "shRNA", "(", "shCtrl", ")", "and", "two", "individual", "shRNAs", "targeting", "MOSPD2", "(", "shMOSPD2", "-", "α", "or", "shMOSPD2", "-", "β", ")", ".", "Quantification", "of", "MOSPD2", " ", "protein", "level", "is", "shown", "below", ".", "Means", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", ".", "n", ":", "three", "independent", "experiments", " ", "C", ":", "Endogenous", "MOSPD2", "(", "green", ")", "was", "labelled", "in", "control", "HeLa", "cells", "(", "WT", ")", ",", "in", "cells", "expressing", "a", "control", "shRNA", "(", "shCtrl", ")", ",", "and", "in", "cells", "expressing", "two", "individual", "shRNAs", "targeting", "MOSPD2", "(", "shMOSPD2", "-", "α", "or", "shMOSPD2", "-", "β", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", "D", ":", "Endogenous", "MOSPD2", "(", "green", ")", "staining", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "ER", "marker", "GFP", "-", "ER", "(", "magenta", ")", "Data", "information", ":", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", ":", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5x", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Right", ":", "Linescan", "analyses", "with", "fluorescence", "intensities", "of", "the", "green", "and", "magenta", "channels", "along", "the", "white", "arrow", "shown", "on", "the", "subpanel", "Overlay", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "E", "-", "F", ":", "Endogenous", "MOSPD2", "(", "green", ")", "staining", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "STARD3NL", "(", "E", "(", "anti", "-", "Flag", ";", "magenta", ")", "Data", "information", ":", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", ":", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5x", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Right", ":", "Linescan", "analyses", "with", "fluorescence", "intensities", "of", "the", "green", "and", "magenta", "channels", "along", "the", "white", "arrow", "shown", "on", "the", "subpanel", "Overlay", ".", "Black", "rectangles", "indicate", "the", "positions", "of", "late", "endosomes", "(", "E", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "E", "-", "F", ":", "Endogenous", "MOSPD2", "(", "green", ")", "staining", "in", "HeLa", "cells", "expressin", "Flag", "-", "STARD3NL", "∆", "FFAT", "(", "F", ")", "(", "anti", "-", "Flag", ";", "magenta", ")", "Data", "information", ":", "(", "A", ",", "D", "-", "F", ")", ":", "The", "subpanels", "on", "the", "right", "are", "higher", "magnification", "(", "3", ".", "5x", ")", "images", "of", "the", "area", "outlined", "in", "white", ".", "The", "Overlay", "panel", "shows", "merged", "green", "and", "magenta", "images", ".", "The", "Coloc", "panel", "displays", "a", "colocalization", "mask", "on", "which", "pixels", "where", "the", "green", "and", "the", "magenta", "channels", "co", "-", "localize", "are", "shown", "in", "white", ".", "Right", ":", "Linescan", "analyses", "with", "fluorescence", "intensities", "of", "the", "green", "and", "magenta", "channels", "along", "the", "white", "arrow", "shown", "on", "the", "subpanel", "Overlay", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "G", ":", "Pearson", "correlation", "coefficients", "between", "endogenous", "MOSPD2", "and", "Flag", "-", "STARD3NL", "(", "WT", "or", "ΔFFAT", ")", "staining", "are", "shown", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "(", "number", "of", "cells", ":", "MOSPD2", "-", "Flag", "-", "STARD3NL", ":", "27", ";", "MOSPD2", "-", "Flag", "-", "STARD3NL", "ΔFFAT", ":", "26", ";", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Means", "and", "error", "bars", "(", "SD", ")", "are", "shown", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "two", "-", "tailed", "P", "value", ";", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ",", "0001", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 A: GFP-tagged MOSPD2 (green) expressing cells were labelled with an anti-MOSPD2 antibody (magenta). The superposition of the green and magenta signals indicates that the anti-MOSPD2 antibody recognized efficiently MOSPD2 by immunofluorescence Data information: (A, D-F): The subpanels on the right are higher magnification (3.5x) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Right: Linescan analyses with fluorescence intensities of the green and magenta channels along the white arrow shown on the subpanel Overlay Scale bars: 10 µm B: Western blot analysis of MOSPD2 and VAP proteins in control HeLa cells (WT) and in HeLa cells expressing a control shRNA (shCtrl) and two individual shRNAs targeting MOSPD2 (shMOSPD2-α or shMOSPD2-β). Quantification of MOSPD2 protein level is shown below. Means and error bars (SD) are shown. n: three independent experiments  C: Endogenous MOSPD2 (green) was labelled in control HeLa cells (WT), in cells expressing a control shRNA (shCtrl), and in cells expressing two individual shRNAs targeting MOSPD2 (shMOSPD2-α or shMOSPD2-β). Scale bar: 10 µm  D: Endogenous MOSPD2 (green) staining in HeLa cells expressing the ER marker GFP-ER (magenta) Data information: (A, D-F): The subpanels on the right are higher magnification (3.5x) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Right: Linescan analyses with fluorescence intensities of the green and magenta channels along the white arrow shown on the subpanel Overlay Scale bars: 10 µm E-F: Endogenous MOSPD2 (green) staining in HeLa cells expressing Flag-STARD3NL (E (anti-Flag; magenta) Data information: (A, D-F): The subpanels on the right are higher magnification (3.5x) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Right: Linescan analyses with fluorescence intensities of the green and magenta channels along the white arrow shown on the subpanel Overlay. Black rectangles indicate the positions of late endosomes (E). Scale bars: 10 µm  E-F: Endogenous MOSPD2 (green) staining in HeLa cells expressin Flag-STARD3NL ∆FFAT (F) (anti-Flag; magenta) Data information: (A, D-F): The subpanels on the right are higher magnification (3.5x) images of the area outlined in white. The Overlay panel shows merged green and magenta images. The Coloc panel displays a colocalization mask on which pixels where the green and the magenta channels co-localize are shown in white. Right: Linescan analyses with fluorescence intensities of the green and magenta channels along the white arrow shown on the subpanel Overlay Scale bars: 10 µm G: Pearson correlation coefficients between endogenous MOSPD2 and Flag-STARD3NL (WT or ΔFFAT) staining are shown. Each dot represents a single cell (number of cells: MOSPD2-Flag-STARD3NL: 27; MOSPD2-Flag-STARD3NL ΔFFAT: 26; from three independent experiments). Means and error bars (SD) are shown. Mann-Whitney test (two-tailed P value; ****: P< 0,0001) "}
{"words": ["Figure", "9", "A", ":", "Western", "blot", "analysis", "of", "MOSPD2", ",", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", "proteins", "in", "control", "HeLa", "cells", "(", "WT", ")", "and", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", ",", "and", "with", "siRNA", "targeting", "MOSPD2", "(", "siMOSPD2", ")", ",", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", "(", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", ",", "and", "MOSPD2", ",", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", "(", "siMOSPD2", "/", "VAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", "B", "-", "F", ":", "TEM", "images", "of", "control", "HeLa", "cell", "(", "B", ":", "HeLa", "-", "silenced", "HeLa", "cells", ".", "An", "interpretation", "scheme", "representing", "contacts", "between", "organelles", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "the", "ER", ",", "endosomes", "and", "ILV", "are", "in", "dark", ",", "light", "and", "medium", "gray", ",", "respectively", ".", "Mitochondria", "and", "Golgi", "are", "in", "pink", "and", "light", "green", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "B", "-", "F", ":", "TEM", "images", "of", "control", "HeLa", "cell", "C", ":", "HeLa", "/", "siCtrl", "-", "silenced", "HeLa", "cells", ".", "An", "interpretation", "scheme", "representing", "contacts", "between", "organelles", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "the", "ER", ",", "endosomes", "and", "ILV", "are", "in", "dark", ",", "light", "and", "medium", "gray", ",", "respectively", ".", "Mitochondria", "and", "Golgi", "are", "in", "pink", "and", "light", "green", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "B", "-", "F", ":", "TEM", "images", "o", "MOSPD2", "(", "D", ":", "siMOSPD2", "-", "silenced", "HeLa", "cells", ".", "An", "interpretation", "scheme", "representing", "contacts", "between", "organelles", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "the", "ER", ",", "endosomes", "and", "ILV", "are", "in", "dark", ",", "light", "and", "medium", "gray", ",", "respectively", ".", "Mitochondria", "and", "Golgi", "are", "in", "pink", "and", "light", "green", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "B", "-", "F", ":", "TEM", "images", "o", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", "(", "E", ":", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", "-", "silenced", "HeLa", "cells", ".", "An", "interpretation", "scheme", "representing", "contacts", "between", "organelles", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "the", "ER", ",", "endosomes", "and", "ILV", "are", "in", "dark", ",", "light", "and", "medium", "gray", ",", "respectively", ".", "Mitochondria", "and", "Golgi", "are", "in", "pink", "and", "light", "green", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "B", "-", "F", ":", "TEM", "images", "o", "MOSPD2", ",", "VAP", "-", "A", "and", "VAP", "-", "B", "(", "F", ":", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", "/", "MOSPD2", ")", "-", "silenced", "HeLa", "cells", ".", "An", "interpretation", "scheme", "representing", "contacts", "between", "organelles", "is", "shown", "on", "the", "right", ";", "the", "ER", ",", "endosomes", "and", "ILV", "are", "in", "dark", ",", "light", "and", "medium", "gray", ",", "respectively", ".", "Mitochondria", "and", "Golgi", "are", "in", "pink", "and", "light", "green", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", " ", "G", "-", "I", ":", "Quantification", "by", "stereology", "of", "ER", "-", "mitochondria", "(", "G", "contacts", ".", "The", "percentages", "of", "mitochondria", "perimeter", "in", "contact", "with", "the", "ER", "(", "G", "are", "shown", "as", "means", "and", "error", "bars", "(", "SEM", ")", ".", "(", "G", ")", "200", "(", "HeLa", ")", ",", "208", "(", "siCtrl", ")", ",", "199", "(", "siMOSPD2", ")", ",", "202", "(", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", ",", "199", "(", "siMOSPD2", "/", "VAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", "mitochondria", "from", "8", ",", "10", ",", "8", ",", "12", "and", "12", "cells", ",", "respectively", ",", "were", "analyzed", " ", "G", "-", "I", ":", "Quantification", "by", "stereology", "o", " ", "ER", "-", "endosome", "(", "H", "contacts", "The", "percentages", "o", ")", ",", "endosome", "perimeter", "in", "contact", "with", "the", "ER", "(", "H", "are", "shown", "as", "means", "and", "error", "bars", "(", "SEM", ")", "(", "H", ",", "I", ")", "202", "(", "HeLa", ")", ",", "189", "(", "siCtrl", ")", ",", "148", "(", "siMOSPD2", ")", ",", "141", "(", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", ",", "221", "(", "siMOSPD2", "/", "VAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", "endosomes", "from", "9", ",", "19", ",", "10", ",", "14", "and", "12", "cells", ",", "respectively", ",", "were", "analyzed", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "*", ":", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ",", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", " ", "G", "-", "I", ":", "Quantification", "by", "stereology", "o", " ", "endosome", "-", "endosome", "(", "I", ")", "contacts", ".", "The", "percentages", "o", "endosome", "perimeter", "in", "contact", "with", "an", "endosome", "(", "I", ")", "are", "shown", "as", "means", "and", "error", "bars", "(", "SEM", ")", "(", "H", ",", "I", ")", "202", "(", "HeLa", ")", ",", "189", "(", "siCtrl", ")", ",", "148", "(", "siMOSPD2", ")", ",", "141", "(", "siVAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", ",", "221", "(", "siMOSPD2", "/", "VAP", "-", "A", "/", "VAP", "-", "B", ")", "endosomes", "from", "9", ",", "19", ",", "10", ",", "14", "and", "12", "cells", ",", "respectively", ",", "were", "analyzed", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "\"", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "*", ":", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ",", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9 A: Western blot analysis of MOSPD2, VAP-A and VAP-B proteins in control HeLa cells (WT) and in HeLa cells transfected with a control siRNA (siCtrl), and with siRNA targeting MOSPD2 (siMOSPD2), VAP-A and VAP-B (siVAP-A/VAP-B), and MOSPD2, VAP-A and VAP-B (siMOSPD2/VAP-A/VAP-B)  B-F: TEM images of control HeLa cell (B: HeLa -silenced HeLa cells. An interpretation scheme representing contacts between organelles is shown on the right; the ER, endosomes and ILV are in dark, light and medium gray, respectively. Mitochondria and Golgi are in pink and light green, respectively. Scale bars: 500 µm  B-F: TEM images of control HeLa cell C: HeLa/siCtrl -silenced HeLa cells. An interpretation scheme representing contacts between organelles is shown on the right; the ER, endosomes and ILV are in dark, light and medium gray, respectively. Mitochondria and Golgi are in pink and light green, respectively. Scale bars: 500 µm  B-F: TEM images o MOSPD2 (D: siMOSPD2 -silenced HeLa cells. An interpretation scheme representing contacts between organelles is shown on the right; the ER, endosomes and ILV are in dark, light and medium gray, respectively. Mitochondria and Golgi are in pink and light green, respectively. Scale bars: 500 µm  B-F: TEM images o VAP-A and VAP-B (E: siVAP-A/VAP-B -silenced HeLa cells. An interpretation scheme representing contacts between organelles is shown on the right; the ER, endosomes and ILV are in dark, light and medium gray, respectively. Mitochondria and Golgi are in pink and light green, respectively. Scale bars: 500 µm  B-F: TEM images o MOSPD2, VAP-A and VAP-B (F: siVAP-A/VAP-B/MOSPD2) -silenced HeLa cells. An interpretation scheme representing contacts between organelles is shown on the right; the ER, endosomes and ILV are in dark, light and medium gray, respectively. Mitochondria and Golgi are in pink and light green, respectively. Scale bars: 500 µm  G-I: Quantification by stereology of ER-mitochondria (G contacts. The percentages of mitochondria perimeter in contact with the ER (G are shown as means and error bars (SEM). (G) 200 (HeLa), 208 (siCtrl), 199 (siMOSPD2), 202 (siVAP-A/VAP-B), 199 (siMOSPD2/VAP-A/VAP-B) mitochondria from 8, 10, 8, 12 and 12 cells, respectively, were analyzed G-I: Quantification by stereology o ER-endosome (H contacts The percentages o ), endosome perimeter in contact with the ER (H are shown as means and error bars (SEM) (H, I) 202 (HeLa), 189 (siCtrl), 148 (siMOSPD2), 141 (siVAP-A/VAP-B), 221 (siMOSPD2/VAP-A/VAP-B) endosomes from 9, 19, 10, 14 and 12 cells, respectively, were analyzed. Kruskal-Wallis with Dunn\"s multiple comparison test (*: P-values <0.05; ***: P< 0,001; ****: P <0.0001) G-I: Quantification by stereology o endosome-endosome (I) contacts. The percentages o endosome perimeter in contact with an endosome (I) are shown as means and error bars (SEM) (H, I) 202 (HeLa), 189 (siCtrl), 148 (siMOSPD2), 141 (siVAP-A/VAP-B), 221 (siMOSPD2/VAP-A/VAP-B) endosomes from 9, 19, 10, 14 and 12 cells, respectively, were analyzed. Kruskal-Wallis with Dunn\"s multiple comparison test (*: P-values <0.05; ***: P< 0,001; ****: P <0.0001)"}
{"words": ["Figure", "1All", "analyses", "were", "performed", "using", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "A", ")", "Immunohistochemistry", "analysis", "of", "small", "intestinal", "sections", ",", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "All", "analyses", "were", "performed", "using", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "B", ")", "Western", "blot", "analysis", "with", "protein", "extracts", "obtained", "from", "ex", "vivo", "-", "purified", "intestinal", "crypts", "and", "probed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "All", "analyses", "were", "performed", "using", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "C", ")", "Haematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "sections", "prepared", "from", "different", "intestinal", "tracts", ".", "All", "analyses", "were", "performed", "using", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "D", ")", "Immunohistochemistry", "analysis", "of", "small", "intestinal", "sections", ",", "using", "specific", "antibodies", "for", "the", "proliferation", "marker", "KI67", ".", "All", "analyses", "were", "performed", "using", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "E", ")", "Expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "the", "proliferation", "related", "markers", "indicated", "in", "the", "figure", "using", "RNA", "extracted", "from", "intestinal", "crypts", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "for", "three", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1All analyses were performed using AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.A) Immunohistochemistry analysis of small intestinal sections, using the indicated antibodies.All analyses were performed using AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.B) Western blot analysis with protein extracts obtained from ex vivo-purified intestinal crypts and probed with the indicated antibodies.All analyses were performed using AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.C) Haematoxylin and eosin staining of sections prepared from different intestinal tracts.All analyses were performed using AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.D) Immunohistochemistry analysis of small intestinal sections, using specific antibodies for the proliferation marker KI67.All analyses were performed using AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.E) Expression analysis by qRT-PCR of the proliferation related markers indicated in the figure using RNA extracted from intestinal crypts. Graphs show mean ± SD for three replicates."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "PAS", "and", "(", "B", ")", "Alcian", "blue", "staining", "of", "sections", "prepared", "from", "the", "different", "intestinal", "tracts", "isolated", "from", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", ".", "C", ")", "Quantification", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "Goblet", "cells", "in", "crypts", "and", "villi", "from", "the", "same", "mice", "sown", "in", "A", "and", "B", ".", "More", "than", "100", "crypts", "and", "villi", "were", "scored", "for", "each", "condition", "after", "15", "days", "from", "the", "first", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "D", ")", "Immunohistochemistry", "analyses", "in", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", "and", "sacrificed", "after", "15", "days", "using", "a", "lysozyme", "-", "specific", "antibody", "(", "upper", "panels", ":", "LYZ", ",", "a", "Paneth", "cell", "-", "specific", "marker", ")", ".", "Histochemical", "assay", "probing", "for", "alkaline", "phosphatase", "activity", "is", "presented", "in", "the", "middle", "panels", "(", "ALPI", ",", "an", "enterocyte", "-", "specific", "marker", ")", ".", "Combined", "Ki67", "immunohistochemistry", "and", "histochemical", "Alcian", "blue", "staining", "is", "presented", "in", "the", "lower", "panels", "(", "Alcian", "/", "KI67", ")", ".", "E", ")", "GFP", "expression", "from", "an", "Lgr5", "-", "eGFPtransgene", "identifying", "LGR5", "+", "ISCs", "in", "near", "-", "native", "agarose", "-", "embedded", "sections", "from", "Eed", "+", "/", "+", "and", "Eed", "-", "/", "-", "mice", "at", "30", "days", "from", "the", "first", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "Cell", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) PAS and (B) Alcian blue staining of sections prepared from the different intestinal tracts isolated from AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice (n=5) injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days.C) Quantification (mean ± SD) of Goblet cells in crypts and villi from the same mice sown in A and B. More than 100 crypts and villi were scored for each condition after 15 days from the first β-naphthoflavone administration.D) Immunohistochemistry analyses in AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice injected with β-naphthoflavone and sacrificed after 15 days using a lysozyme-specific antibody (upper panels: LYZ, a Paneth cell-specific marker). Histochemical assay probing for alkaline phosphatase activity is presented in the middle panels (ALPI, an enterocyte-specific marker). Combined Ki67 immunohistochemistry and histochemical Alcian blue staining is presented in the lower panels (Alcian/KI67).E) GFP expression from an Lgr5-eGFPtransgene identifying LGR5+ ISCs in near-native agarose-embedded sections from Eed+/+ and Eed-/- mice at 30 days from the first β-naphthoflavone administration. Cell nuclei were counterstained with DAPI."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Radiation", "-", "induced", "intestinal", "regeneration", ":", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "were", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", ",", "irradiated", "with", "10", "Gy", "15", "days", "later", ",", "and", "sacrificed", "4", "and", "8", "days", "after", "irradiation", ".", "Sections", "prepared", "from", "the", "different", "intestinal", "tracts", "were", "stained", "with", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "B", ")", "Immunohistochemistry", "analyses", "in", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "treated", "as", "in", "A", "using", "H3K27me3", "and", "KI67", "specific", "antibodies", "at", "8", "days", "post", "-", "irradiation", ".", "C", ")", "Quantification", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "KI67", "positive", "cells", "per", "crypt", "(", "B", ")", ".", "More", "than", "100", "crypts", "were", "scored", "for", "each", "condition", ".", "D", ")", "In", "vitro", "organoids", "formation", "using", "crypts", "isolated", "from", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eed", "-", "/", "-", "mice", "15", "days", "after", "the", "first", "β", "-", "naphthoflavone", "injection", ".", "Organoids", "pictures", "were", "taken", "5", "days", "later", "at", "low", "and", "higher", "magnification", "(", "insets", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Radiation-induced intestinal regeneration: AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice were injected with β-naphthoflavone, irradiated with 10 Gy 15 days later, and sacrificed 4 and 8 days after irradiation. Sections prepared from the different intestinal tracts were stained with haematoxylin and eosin (n=6).B) Immunohistochemistry analyses in AhCre Eed+/+ and AhCre Eedfl/fl mice treated as in A using H3K27me3 and KI67 specific antibodies at 8 days post-irradiation.C) Quantification (mean ± SD) of KI67 positive cells per crypt (B). More than 100 crypts were scored for each condition.D) In vitro organoids formation using crypts isolated from AhCre Eed+/+ and AhCre Eed-/- mice 15 days after the first β-naphthoflavone injection. Organoids pictures were taken 5 days later at low and higher magnification (insets)."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Volcano", "plot", "showing", "the", "expression", "changes", "with", "a", "minimal", "fold", "change", "of", "3", "(", "FC", "=", "3", ")", "at", "genome", "-", "wide", "levels", "in", "AhCre", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", "relative", "to", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "crypts", "15", "days", "after", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "B", ")", "Bar", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "H3K27me3", "-", "positive", "promoters", "among", "the", "differentially", "regulated", "genes", "in", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", ".", "All", "gene", "promoters", "and", "5", "independent", "random", "sampling", "of", "167", "gene", "promoters", "extracted", "the", "mouse", "genome", "are", "presented", "as", "specificity", "controls", ".", "C", ")", "Intensity", "profiles", "for", "H3K27me3", "and", "SUZ12", "occupancy", "at", "the", "promoters", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "with", "respect", "to", "down", "-", "regulated", "genes", "in", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", ".", "D", ")", "Genomic", "snapshots", "of", "the", "Cdkn2a", "locus", "showing", "SUZ12", "occupancy", "and", "H3K27me3", "deposition", "at", "the", "promoter", "regions", "of", "both", "the", "p16", "and", "the", "ARF", "isoforms", ".", "E", ")", "Genomic", "snapshots", "of", "the", "RNAseq", "profile", "of", "the", "Cdkn2a", "locus", "in", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", "15", "days", "after", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "F", ")", "Expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "both", "Cdkn2a", "isoforms", "(", "p16Ink4A", "and", "p19Arf", ")", "in", "AhCre", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", "15", "days", "after", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "G", ")", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "using", "specific", "secretory", "and", "enterocytic", "transcriptional", "signatures", "with", "respect", "to", "the", "list", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "Eed", "-", "/", "-", "crypts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Volcano plot showing the expression changes with a minimal fold change of 3 (FC=3) at genome-wide levels in AhCre Eed-/- crypts relative to AhCre Eed+/+ crypts 15 days after β-naphthoflavone administration.B) Bar plot showing the percentage of H3K27me3-positive promoters among the differentially regulated genes in Eed-/- crypts. All gene promoters and 5 independent random sampling of 167 gene promoters extracted the mouse genome are presented as specificity controls.C) Intensity profiles for H3K27me3 and SUZ12 occupancy at the promoters of up-regulated genes with respect to down-regulated genes in Eed-/- crypts.D) Genomic snapshots of the Cdkn2a locus showing SUZ12 occupancy and H3K27me3 deposition at the promoter regions of both the p16 and the ARF isoforms.E) Genomic snapshots of the RNAseq profile of the Cdkn2a locus in AhCre Eed+/+ and AhCre Eed-/- crypts 15 days after β-naphthoflavone administration.F) Expression analysis by qRT-PCR (mean ± SD) of both Cdkn2a isoforms (p16Ink4A and p19Arf) in AhCre Eed+/+ and AhCre Eed-/- crypts 15 days after β-naphthoflavone administration.G) Gene set enrichment analysis (GSEA) using specific secretory and enterocytic transcriptional signatures with respect to the list of up-regulated genes in Eed-/- crypts."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "top", "panels", ")", "and", "PAS", "staining", "(", "bottom", "panels", ")", "of", "sections", "prepared", "from", "different", "intestinal", "tracts", "in", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "15", "days", "after", "the", "first", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "B", ")", "Quantification", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "Goblet", "cells", "along", "the", "crypt", "-", "to", "-", "villus", "axis", "from", "the", "staining", "shown", "in", "A", ".", "More", "than", "100", "crypts", "and", "villi", "were", "scored", "for", "each", "condition", ".", "C", ")", "Immunhistochemistry", "analysis", "using", "anti", "-", "KI67", "antibody", "of", "intestinal", "sections", "prepared", "from", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "15", "days", "after", "the", "first", "β", "-", "naphthoflavone", "administration", ".", "D", ")", "Radiation", "-", "induced", "intestinal", "regeneration", ":", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eed", "+", "/", "+", "and", "AhCre", "Cdkn2a", "-", "/", "-", "Eedfl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "injected", "with", "β", "-", "naphthoflavone", ",", "irradiated", "with", "10", "Gy", "15", "days", "later", ",", "and", "sacrificed", "8", "days", "after", "irradiation", ".", "Sections", "prepared", "from", "the", "different", "intestinal", "tracts", "were", "stained", "with", "haematoxylin", "and", "eosin", "(", "first", "panels", ")", "and", "Alcian", "Blue", "(", "last", "panels", ")", ".", "Sections", "were", "also", "stained", "for", "immunohistochemistry", "analysis", "(", "second", "and", "third", "panels", ")", "using", "H3K27me3", "and", "Ki67", "-", "specific", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Haematoxylin and eosin (top panels) and PAS staining (bottom panels) of sections prepared from different intestinal tracts in AhCre Cdkn2a-/- Eed+/+ and AhCre Cdkn2a-/- Eedfl/fl mice 15 days after the first β-naphthoflavone administration (n=5).B) Quantification (mean ± SD) of Goblet cells along the crypt-to-villus axis from the staining shown in A. More than 100 crypts and villi were scored for each condition.C) Immunhistochemistry analysis using anti-KI67 antibody of intestinal sections prepared from AhCre Cdkn2a-/- Eed+/+ and AhCre Cdkn2a-/- Eedfl/fl mice 15 days after the first β-naphthoflavone administration.D) Radiation-induced intestinal regeneration: AhCre Cdkn2a-/- Eed+/+ and AhCre Cdkn2a-/- Eedfl/fl mice (n=6) were injected with β-naphthoflavone, irradiated with 10 Gy 15 days later, and sacrificed 8 days after irradiation. Sections prepared from the different intestinal tracts were stained with haematoxylin and eosin (first panels) and Alcian Blue (last panels). Sections were also stained for immunohistochemistry analysis (second and third panels) using H3K27me3 and Ki67-specific antibodies."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "the", "indicated", "intestinal", "epithelial", "cell", "markers", "regulated", "by", "the", "Wnt", "and", "Notch", "signaling", "pathways", "that", "are", "involved", "in", "stem", "cell", "homeostasis", ",", "regionalization", ",", "and", "Goblet", "cell", "differentiation", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "B", ")", "Genomic", "snapshots", "of", "the", "indicated", "genomic", "loci", "for", "SUZ12", "occupancy", "and", "H3K27me3", "deposition", "in", "intestinal", "crypts", "of", "wild", "type", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", ")", "Expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "±", "SD", ")", "of", "the", "Goblet", "cell", "markers", "(", "Atoh1", ",", "Gfi1", ",", "Spdef", ")", ",", "early", "secretory", "precursor", "cells", "(", "Dll1", ")", ",", "NOTCH", "targets", "(", "Hes1", ",", "Olfm4", ")", "and", "intestinal", "stem", "cells", "(", "Lgr5", ",", "Rnf43", ")", "in", "wild", "type", "intestinal", "crypts", "purified", "38hrs", "after", "treatment", "with", "the", "NOTCH", "inhibitor", "DBZ", ".", "DMSO", "served", "as", "vehicle", "negative", "control", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "D", ")", "ChIP", "analysis", "of", "Atoh1", "and", "Gfi1", "loci", "using", "H3K27me3", "specific", "antibody", ".", "The", "same", "crypts", "described", "in", "C", "were", "used", ".", "H3K27me3", "levels", "were", "normalized", "on", "Histone", "H3", "density", "(", "percentage", "of", "H3", "signal", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Expression analysis by qRT-PCR (mean ± SD) of the indicated intestinal epithelial cell markers regulated by the Wnt and Notch signaling pathways that are involved in stem cell homeostasis, regionalization, and Goblet cell differentiation (n=3).B) Genomic snapshots of the indicated genomic loci for SUZ12 occupancy and H3K27me3 deposition in intestinal crypts of wild type mice (n=3).C) Expression analysis by qRT-PCR (mean ± SD) of the Goblet cell markers (Atoh1, Gfi1, Spdef), early secretory precursor cells (Dll1), NOTCH targets (Hes1, Olfm4) and intestinal stem cells (Lgr5, Rnf43) in wild type intestinal crypts purified 38hrs after treatment with the NOTCH inhibitor DBZ. DMSO served as vehicle negative control (n=4).D) ChIP analysis of Atoh1 and Gfi1 loci using H3K27me3 specific antibody. The same crypts described in C were used. H3K27me3 levels were normalized on Histone H3 density (percentage of H3 signal). Graphs show mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "PPARγ", "mRNA", "expression", "in", "sperm", "from", "control", "and", "MSUS", "mice", ".", "Control", "n", "=", "15", ",", "MSUS", "n", "=", "13", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "029", ",", "t", "=", "2", ".", "30", ",", "df", "=", "26", ".", "(", "c", ")", "Relative", "luciferase", "luminescence", "in", "transfected", "GC", "-", "1", "cells", "exposed", "to", "serum", "from", "control", "or", "MSUS", "mice", ".", "Numbers", "correspond", "to", "serum", "from", "individual", "animals", "applied", "to", "different", "cell", "culture", "wells", ".", "Control", "n", "=", "17", ",", "MSUS", "n", "=", "22", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "042", ",", "t", "=", "2", ".", "1", ",", "df", "=", "37", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) PPARγ mRNA expression in sperm from control and MSUS mice. Control n = 15, MSUS n = 13, two-tailed Student's t-test, P = 0.029, t = 2.30, df = 26.(c) Relative luciferase luminescence in transfected GC-1 cells exposed to serum from control or MSUS mice. Numbers correspond to serum from individual animals applied to different cell culture wells. Control n = 17, MSUS n = 22, two-tailed Student's t-test, P = 0.042, t = 2.1, df = 37."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "b", ")", "Adult", "weight", "in", "the", "offspring", "of", "tesaglitazar", "-", "injected", "males", "(", "Tesa", "-", "inj", ",", "n", "=", "16", ")", "compared", "to", "the", "offspring", "of", "vehicle", "-", "injected", "males", "(", "Vehicle", "-", "inj", ",", "n", "=", "23", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "019", ",", "t", "=", "2", ".", "44", ",", "df", "=", "37", ".", "(", "c", ")", "Glucose", "level", "in", "the", "offspring", "of", "Tesa", "-", "inj", "(", "n", "=", "14", ")", "and", "Vehicle", "-", "inj", "(", "n", "=", "21", ")", "males", "during", "a", "glucose", "tolerance", "test", ".", "Repeated", "measures", "ANOVA", ",", "treatment", "effect", "P", "=", "0", ".", "0083", ",", "F", "(", "1", ",", "33", ")", "=", "7", ".", "877", ",", "time", "effect", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "F", "(", "4", ",", "132", ")", "=", "347", ".", "7", ",", "interaction", "P", "=", "0", ".", "0776", ",", "F", "(", "4", ",", "132", ")", "=", "2", ".", "155", "Conc", ".", ";", "concentration", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(b) Adult weight in the offspring of tesaglitazar-injected males (Tesa-inj, n = 16) compared to the offspring of vehicle-injected males (Vehicle-inj, n = 23). Two-tailed Student's t-test, P = 0.019, t = 2.44, df = 37.(c) Glucose level in the offspring of Tesa-inj (n = 14) and Vehicle-inj (n = 21) males during a glucose tolerance test. Repeated measures ANOVA, treatment effect P = 0.0083, F (1, 33) = 7.877, time effect P < 0.0001, F (4, 132) = 347.7, interaction P = 0.0776, F (4, 132) = 2.155 Conc.; concentration."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", "Differentially", "expressed", "transposable", "elements", "in", "sperm", "from", "Tesa", "-", "inj", "and", "MSUS", "males", ".", "Data", "represent", "genes", "with", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "similar", "fold", "change", ".", "Fold", "change", "in", "heat", "map", "represents", "log2", "(", "fold", "change", ")", "respective", "to", "the", "corresponding", "control", "group", ".", "Total", "overlap", "is", "presented", "in", "Extended", "Data", "Fig", ".", "11", ".", "b", ")", "mRNAs", "/", "lincRNAs", "in", "sperm", "from", "Tesa", "-", "inj", "and", "MSUS", "males", ".", "Data", "represent", "genes", "with", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "similar", "fold", "change", ".", "Fold", "change", "in", "heat", "map", "represents", "log2", "(", "fold", "change", ")", "respective", "to", "the", "corresponding", "control", "group", ".", "Total", "overlap", "is", "presented", "in", "Extended", "Data", "Fig", ".", "11", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "(", "c", ")", "Volcano", "plot", "and", "(", "d", ")", "heat", "map", "of", "differentially", "expressed", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ")", "mRNA", "/", "lincRNA", "in", "sperm", "from", "Tesa", "-", "inj", "males", ".", "Dashed", "black", "lines", "in", "(", "c", ")", "represent", "y", "=", "1", ".", "3", ",", "equivalent", "to", "FDR", "=", "0", ".", "05", ",", "and", "x", "=", "±", "0", ".", "03", ",", "equivalent", "to", "FC", "=", "1", ".", "23", "and", "0", ".", "81", ".", "Black", "dots", "represent", "top", "candidates", ",", "which", "all", "have", "FC", ">", "2", "or", "FC", "<", "0", ".", "5", ",", "and", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "Teal", "dots", "represent", "non", "-", "significant", "genes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a Differentially expressed transposable elements in sperm from Tesa-inj and MSUS males. Data represent genes with P < 0.05 and similar fold change. Fold change in heat map represents log2(fold change) respective to the corresponding control group. Total overlap is presented in Extended Data Fig. 11.b) mRNAs/lincRNAs in sperm from Tesa-inj and MSUS males. Data represent genes with P < 0.05 and similar fold change. Fold change in heat map represents log2(fold change) respective to the corresponding control group. Total overlap is presented in Extended Data Fig. 11.(c,d) (c) Volcano plot and (d) heat map of differentially expressed (FDR < 0.05) mRNA/lincRNA in sperm from Tesa-inj males. Dashed black lines in (c) represent y = 1.3, equivalent to FDR = 0.05, and x = ±0.03, equivalent to FC = 1.23 and 0.81. Black dots represent top candidates, which all have FC > 2 or FC < 0.5, and FDR < 0.05. Teal dots represent non-significant genes."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "b", ")", "Weight", "in", "adult", "male", "MSUS", "offspring", "and", "the", "offspring", "of", "males", "injected", "with", "MSUS", "serum", "compared", "to", "respective", "control", "groups", ".", "MSUS", "offspring", "n", "=", "22", ",", "Control", "offspring", "n", "=", "24", ",", "one", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "data", "reproduced", ")", "P", "=", "0", ".", "045", ",", "t", "=", "1", ".", "734", ",", "df", "=", "44", ".", "MSUS", "serum", "-", "injected", "offspring", "n", "=", "30", ",", "Control", "serum", "-", "injected", "offspring", "n", "=", "31", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "U", "=", "334", ".", "5", ",", "P", "=", "0", ".", "059", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Blood", "glucose", "levels", "in", "MSUS", "offspring", "and", "the", "offspring", "of", "MSUS", "serum", "-", "injected", "males", "following", "a", "30", "-", "min", "restraint", "challenge", ".", "MSUS", "offspring", "n", "=", "13", ",", "Control", "offspring", "n", "=", "12", ",", "repeat", "measures", "ANOVA", ",", "treatment", "effect", "P", "=", "0", ".", "016", ",", "F", "(", "1", ",", "23", ")", "=", "6", ".", "704", ",", "time", "effect", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "F", "(", "3", ",", "69", ")", "=", "53", ".", "13", ",", "interaction", "P", "=", "0", ".", "027", ",", "F", "(", "3", ",", "69", ")", "=", "3", ".", "25", ",", "at", "15", "-", "min", "adjusted", "P", "=", "0", ".", "0015", ",", "t", "=", "3", ".", "693", ",", "df", "=", "92", ".", "MSUS", "serum", "-", "injected", "offspring", "n", "=", "17", ",", "and", "Control", "serum", "-", "injected", "offspring", "n", "=", "14", ",", "repeat", "measures", "ANOVA", ",", "treatment", "effect", "P", "=", "0", ".", "023", ",", "F", "(", "1", ",", "14", ")", "=", "6", ".", "493", ",", "time", "effect", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "F", "(", "3", ",", "42", ")", "=", "48", ".", "4", ",", "interaction", "P", "=", "0", ".", "29", ",", "F", "(", "3", ",", "42", ")", "=", "1", ".", "29", ".", "Conc", ".", ",", "concentration", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(b) Weight in adult male MSUS offspring and the offspring of males injected with MSUS serum compared to respective control groups. MSUS offspring n = 22, Control offspring n = 24, one-tailed Student's t-test (data reproduced) P = 0.045, t = 1.734, df = 44. MSUS serum-injected offspring n = 30, Control serum-injected offspring n = 31, two-tailed Mann-Whitney U = 334.5, P = 0.059.(c,d) Blood glucose levels in MSUS offspring and the offspring of MSUS serum-injected males following a 30-min restraint challenge. MSUS offspring n = 13, Control offspring n = 12, repeat measures ANOVA, treatment effect P = 0.016, F (1, 23) = 6.704, time effect P < 0.0001, F (3, 69) = 53.13, interaction P = 0.027, F (3, 69) = 3.25, at 15-min adjusted P = 0.0015, t = 3.693, df = 92. MSUS serum-injected offspring n = 17, and Control serum-injected offspring n = 14, repeat measures ANOVA, treatment effect P = 0.023, F (1,14) = 6.493, time effect P < 0.0001, F (3, 42) = 48.4, interaction P = 0.29, F (3, 42) = 1.29. Conc., concentration."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "C", ",", "D", ".", "WT", ",", "∆", "cpt1", "∆", "ept1", "(", "B", ")", ",", "Δcho2", "(", "C", ")", "or", "Δopi3", "(", "D", ")", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "to", "logarithmic", "phase", "in", "SD", "-", "URA", ",", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "4", "h", "of", "starvation", ".", "Cells", "were", "harvested", "at", "indicated", "time", "points", "and", "subjected", "to", "western", "blotting", "(", "left", "panel", ")", ".", "Pgk1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Middle", "panel", "-", "Autophagic", "activity", "during", "starvation", "was", "quantified", "by", "calculating", "the", "ratio", "of", "free", "GFP", "to", "total", "GFP", "(", "GFP", "-", "Atg8", "+", "free", "GFP", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "paired", ",", "two", "tailed", ")", "(", "ns", "-", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Right", "panel", "-", "Ape1", "maturation", "was", "quantified", "by", "measuring", "the", "mApe1", "level", "out", "of", "the", "total", "Ape1", "amount", ",", "during", "SD", "and", "SD", "-", "N", ".", "E", ".", "WT", ",", "Δopi3", ",", "and", "Δcho2", "as", "well", "as", "Δatg1", "(", "negative", "autophagy", "control", ")", "cells", "expressing", "chromosomally", "-", "tagged", "Fba1", "-", "GFP", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", ",", "and", "starved", "in", "SD", "-", "N", "for", "4", "hours", ".", "Cells", "were", "harvested", "at", "indicated", "starvation", "time", "points", "and", "subjected", "to", "western", "blotting", "(", "left", "panel", ")", ".", "Pgk1", "was", "monitored", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", "panel", "-", "Autophagic", "activity", "during", "starvation", "was", "quantified", ",", "by", "calculating", "the", "ratio", "of", "free", "GFP", "to", "total", "GFP", "(", "Fba1", "-", "GFP", "+", "free", "GFP", ")", ".", "F", ".", "WT", ",", "Δopi3", ",", "Δcho2", "and", "Δatg1", "cells", "on", "the", "background", "of", "pho8Δ60", "pho13Δ", "strain", ",", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", ",", "and", "starved", "in", "SD", "-", "N", "for", "4", "hours", ".", "Pho8", "activity", "was", "measured", "by", "the", "alkaline", "phosphatase", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, C, D. WT, ∆cpt1∆ept1 (B), Δcho2 (C) or Δopi3 (D) cells expressing GFP-Atg8 were grown to logarithmic phase in SD-URA, and shifted to SD-N for 4 h of starvation. Cells were harvested at indicated time points and subjected to western blotting (left panel). Pgk1 was used as a loading control. Middle panel- Autophagic activity during starvation was quantified by calculating the ratio of free GFP to total GFP (GFP-Atg8 + free GFP). Statistical analysis was done by student's t-test (paired, two tailed) (ns- not significant, ****, p≤0.0001), error bars represent SEM of at least 3 independent experiments. Right panel- Ape1 maturation was quantified by measuring the mApe1 level out of the total Ape1 amount, during SD and SD-N.E. WT, Δopi3, and Δcho2 as well as Δatg1 (negative autophagy control) cells expressing chromosomally-tagged Fba1-GFP were grown to log phase in SD, and starved in SD-N for 4 hours. Cells were harvested at indicated starvation time points and subjected to western blotting (left panel). Pgk1 was monitored as a loading control. Right panel- Autophagic activity during starvation was quantified, by calculating the ratio of free GFP to total GFP (Fba1-GFP + free GFP).F. WT, Δopi3, Δcho2 and Δatg1 cells on the background of pho8Δ60 pho13Δ strain, were grown to log phase in SD, and starved in SD-N for 4 hours. Pho8 activity was measured by the alkaline phosphatase assay."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "Atg8", "(", "green", ")", "and", "vacuole", "(", "red", ",", "stained", "with", "FM4", "-", "64", ")", ".", "WT", ",", "Δopi3", "and", "Δcho2", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", "medium", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "3", "h", ".", "Cells", "were", "observed", "by", "confocal", "microscopy", "before", "(", "SD", ")", "and", "during", "nitrogen", "starvation", "(", "SD", "-", "N", ")", "(", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "Quantification", "of", "of", "cells", "with", "or", "without", "GFP", "inside", "vacuoles", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", ",", "compared", "to", "WT", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", "(", "ns", "-", "not", "significant", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", "and", "condition", ":", "SD", "(", "WT", "(", "n", "=", "446", ")", ",", "Δcho2", "(", "n", "=", "272", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "272", ")", ")", ",", "SD", "-", "N", "(", "WT", "(", "n", "=", "398", ")", ",", "Δcho2", "(", "n", "=", "224", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "213", ")", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Representative images of GFP-Atg8 (green) and vacuole (red, stained with FM4-64). WT, Δopi3 and Δcho2 cells expressing GFP-Atg8 were grown to log phase in SD-URA medium and shifted to SD-N for 3 h. Cells were observed by confocal microscopy before (SD) and during nitrogen starvation (SD-N) (left panel). Scale bar 1 µm. Right panel- Quantification of of cells with or without GFP inside vacuoles. Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's, compared to WT (****, p≤0.0001) (ns- not significant), error bars represent SEM of at least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain and condition: SD (WT (n=446), Δcho2 (n=272), Δopi3 (n=272)), SD-N (WT (n=398), Δcho2 (n=224), Δopi3 (n=213))."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", ",", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "4", "h", ",", "choline", "(", "1", "mM", ")", "was", "not", "supplemented", "(", "-", "choline", ")", "or", "supplemented", "to", "SD", "and", "SD", "-", "N", "(", "+", "choline", "SD", ",", "SD", "-", "N", ")", "or", "only", "to", "SD", "-", "N", "(", "+", "choline", ",", "SD", "-", "N", ")", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "harvested", "at", "indicated", "time", "points", "and", "subjected", "to", "western", "blotting", "(", "left", "panel", ")", ".", "Pgk1", "was", "monitored", "as", "a", "loading", "control", ".", "Middle", "panel", "-", "Autophagic", "activity", "was", "quantified", "during", "starvation", "by", "calculating", "the", "ratio", "of", "free", "GFP", "to", "total", "GFP", "(", "GFP", "-", "Atg8", "+", "free", "GFP", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", ",", "compared", "to", "WT", "(", "ns", "-", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Right", "panel", "-", "Ape1", "maturation", "was", "quantified", "by", "measuring", "the", "mApe1", "level", "out", "of", "the", "total", "Ape1", "amount", "in", "Δopi3", "cells", "at", "growth", "(", "SD", ")", "or", "during", "starvation", "(", "SD", "-", "N", ")", ",", "with", "choline", "supplemented", "as", "indicated", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "compared", "to", "WT", "(", "ns", "-", "not", "significant", ",", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "Atg8", "(", "green", ")", "and", "vacuole", "(", "red", ",", "stained", "with", "FM4", "-", "64", ")", ".", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "were", "grown", "in", "SD", "-", "URA", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", ".", "Choline", "(", "1mM", ")", "was", "either", "excluded", "(", "-", "choline", ")", ",", "added", "to", "growth", "and", "starvation", "medium", "(", "+", "choline", "SD", ",", "SD", "-", "N", ")", "or", "added", "only", "to", "starvation", "medium", "(", "+", "choline", ",", "SD", "-", "N", ")", ".", "Cells", "were", "observed", "using", "confocal", "microscopy", "during", "starvation", "(", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "Quantification", "of", "cells", "with", "GFP", "inside", "vacuoles", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", ",", "compared", "to", "WT", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "ns", "-", "not", "significant", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", "condition", ";", "-", "Choline", ":", "WT", "(", "n", "=", "487", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "316", ")", ",", "Choline", "SD", ",", "SD", "-", "N", ":", "WT", "(", "n", "=", "251", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "361", ")", ",", "Choline", "SD", "-", "N", ":", "WT", "(", "n", "=", "320", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "267", ")", ".", "D", ".", "PC", "levels", "determined", "by", "shotgun", "lipidomics", "for", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", ",", "with", "or", "without", "choline", "(", "1", "mM", ")", "supplementation", "to", "SD", "-", "N", ".", "Samples", "were", "taken", "after", "4", "h", "in", "SD", "-", "N", "medium", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. WT and Δopi3 cells expressing GFP-Atg8 were grown to log phase in SD-URA, and shifted to SD-N for 4 h, choline (1 mM) was not supplemented (-choline) or supplemented to SD and SD-N (+choline SD, SD-N) or only to SD-N (+choline, SD-N) as indicated. Cells were harvested at indicated time points and subjected to western blotting (left panel). Pgk1 was monitored as a loading control. Middle panel- Autophagic activity was quantified during starvation by calculating the ratio of free GFP to total GFP (GFP-Atg8 + free GFP). Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's, compared to WT (ns-not significant, ****, p≤0.0001), error bars represent SEM of at least 3 independent experiments. Right panel- Ape1 maturation was quantified by measuring the mApe1 level out of the total Ape1 amount in Δopi3 cells at growth (SD) or during starvation (SD-N), with choline supplemented as indicated. Statistical analysis was done by Sidak's multiple comparisons test compared to WT (ns-not significant, *, p≤0.05, **, p≤0.005, ****, p≤0.0001), error bars represent SEM of at least 3 independent experiments.C. Representative images of GFP-Atg8 (green) and vacuole (red, stained with FM4-64). WT and Δopi3 cells expressing GFP-Atg8 were grown in SD-URA and shifted to SD-N. Choline (1mM) was either excluded (-choline), added to growth and starvation medium (+choline SD, SD-N) or added only to starvation medium (+choline, SD-N). Cells were observed using confocal microscopy during starvation (left panel). Scale bar 1 µm. Right panel- Quantification of cells with GFP inside vacuoles. Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's, compared to WT (****, p≤0.0001, ns- not significant), error bars represent SEM of 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain condition; -Choline: WT (n=487), Δopi3 (n=316), Choline SD, SD-N: WT (n=251), Δopi3 (n=361), Choline SD-N: WT (n=320), Δopi3 (n=267). D. PC levels determined by shotgun lipidomics for WT and Δopi3 cells expressing GFP-Atg8, with or without choline (1 mM) supplementation to SD-N. Samples were taken after 4 h in SD-N medium."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Representative", "Images", "of", "Atg5", "-", "mNG", "with", "sfTq2", "-", "Atg8", "during", "SD", "-", "N", ".", "Δatg3", "and", "Δatg3Δopi3", "cells", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "medium", ",", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "4", "h", ",", "and", "observed", "by", "Widefield", "microscopy", "(", "left", "panel", ")", ",", "scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "quantification", "of", "percentage", "of", "cells", "with", "Atg5", "puncta", "during", "different", "time", "points", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", "ns", "-", "not", "significant", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", "and", "time", "point", "(", "0", "hour", ":", "Δatg3", "(", "n", "=", "296", ")", ",", "Δatg3Δopi3", "(", "n", "=", "111", ")", ",", "1", "hour", ":", "Δatg3", "(", "n", "=", "325", ")", ",", "Δatg3Δopi3", "(", "n", "=", "110", ")", ",", "2", "hours", ":", "Δatg3", "(", "n", "=", "338", ")", ",", "Δatg3Δopi3", "(", "n", "=", "135", ")", ",", "4", "hours", ":", "Δatg3", "(", "n", "=", "309", ")", ",", "Δatg3Δopi3", "(", "n", "=", "167", ")", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", ".", "Cells", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", "medium", ",", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "3", "h", "and", "observed", "by", "Airyscan", "microscopy", "(", "left", "panel", ")", ".", "White", "dashes", "indicate", "cell", "boundaries", ",", "yellow", "dashes", "indicate", "phagophores", ".", "For", "each", "cell", "-", "Magnification", "of", "yellow", "dashed", "area", "(", "top", "right", ")", ",", "schematic", "representation", "(", "bottom", "right", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "cup", "shaped", "GFP", "-", "Atg8", "structures", "imaged", "by", "Airyscan", "microscopy", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ")", "(", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", ",", "WT", "(", "n", "=", "45", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "110", ")", ".", "D", ".", "Representative", "CLEM", "images", "of", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", ",", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", "medium", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "for", "3h", ".", "Cells", "were", "harvested", ",", "deep", "frozen", "and", "processed", "for", "CLEM", "(", "left", "panel", ")", ",", "V", "-", "vacuole", ".", "For", "Δopi3", "cell", "-", "Magnification", "of", "yellow", "dashed", "area", "of", "GFP", "-", "Atg8", "positive", "phagophore", "(", "top", "right", ")", ",", "TEM", "image", "only", "(", "middle", "right", ")", ",", "schematic", "representation", "of", "a", "phagophore", "(", "bottom", "right", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "cup", "shaped", "GFP", "-", "Atg8", "positive", "cup", "shaped", "membrane", "structures", "imaged", "by", "CLEM", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "unpaired", ")", "(", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", ",", "WT", "(", "n", "=", "20", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "21", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Representative Images of Atg5-mNG with sfTq2-Atg8 during SD-N. Δatg3 and Δatg3Δopi3 cells were grown to log phase in SD medium, shifted to SD-N for 4 h, and observed by Widefield microscopy (left panel), scale bar 1 µm. Right panel- quantification of percentage of cells with Atg5 puncta during different time points. Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's ns- not significant), error bars represent SEM of 2 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain and time point (0 hour: Δatg3 (n=296), Δatg3Δopi3 (n=111), 1 hour: Δatg3 (n=325), Δatg3Δopi3 (n=110), 2 hours: Δatg3 (n=338), Δatg3Δopi3 (n=135), 4 hours: Δatg3 (n=309), Δatg3Δopi3 (n=167).C. Representative images of WT and Δopi3 cells expressing GFP-Atg8. Cells were grown to log phase in SD-URA medium, shifted to SD-N for 3 h and observed by Airyscan microscopy (left panel). White dashes indicate cell boundaries, yellow dashes indicate phagophores. For each cell - Magnification of yellow dashed area (top right), schematic representation (bottom right). Scale bar 1 µm. Right panel- quantification of the percentage of cells with cup shaped GFP-Atg8 structures imaged by Airyscan microscopy. Statistical analysis was done by student's t-test (unpaired) (** p≤0.05), error bars represent SEM of least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain, WT (n=45), Δopi3 (n=110).D. Representative CLEM images of WT and Δopi3 cells expressing GFP-Atg8, grown to log phase in SD-URA medium and shifted to SD-N for 3h. Cells were harvested, deep frozen and processed for CLEM (left panel), V-vacuole. For Δopi3 cell - Magnification of yellow dashed area of GFP-Atg8 positive phagophore (top right), TEM image only (middle right), schematic representation of a phagophore (bottom right). Scale bar 1 µm. Right panel- quantification of the percentage of cells with cup shaped GFP-Atg8 positive cup shaped membrane structures imaged by CLEM. Statistical analysis was done by student's t-test (unpaired) (*** p≤0.005), error bars represent SEM of least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain, WT (n=20), Δopi3 (n=21)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Representative", "images", "of", "Δypt7", ",", "Δopi3Δypt7", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "(", "z", "-", "stack", "projection", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", "medium", "and", "starved", "in", "SD", "-", "N", ",", "images", "were", "taken", "during", "starvation", "in", "indicated", "time", "points", "by", "widefield", "microscopy", "(", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "quantification", "of", "GFP", "-", "Atg8", "puncta", "per", "cell", "in", "Δypt7", ",", "Δopi3Δypt7", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "0001", ",", "ns", "-", "not", "significant", ")", ",", "compared", "to", "WT", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "of", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", "and", "time", "point", ",", "0", "hours", ":", "Δypt7", "(", "n", "=", "322", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "194", ")", ",", "1", ".", "5", "hours", ":", "Δypt7", "(", "n", "=", "220", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "155", ")", ",", "3", ".", "5", "hours", "Δypt7", "(", "n", "=", "216", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "307", ")", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "cup", "-", "shaped", "phagophores", "in", "Δypt7", "and", "Δopi3Δypt7", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "during", "starvation", "(", "1", "-", "3h", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "students", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", ",", "Δypt7", "(", "n", "=", "347", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "474", ")", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "mNG", "-", "tagged", "Atg8", "colocalized", "with", "mScarletI", "-", "PXVam7", ".", "WT", ",", "Δopi3", ",", "Δatg1", "and", "Δopi3Δatg1", "cells", "on", "the", "background", "of", "Δymr1", ",", "expressing", "mScarletI", "-", "PXVam7", "under", "the", "CUP1", "promoter", "from", "the", "knocked", "-", "out", "VPS38", "locus", ",", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "medium", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "copper", "sulfate", ",", "and", "shifted", "to", "SD", "-", "N", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "copper", "sulfate", ".", "Images", "were", "taken", "during", "SD", "-", "N", "(", "1", "-", "3", "h", ")", "by", "widefield", "microscopy", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "autophagic", "structure", "diameters", "in", "WT", "and", "Δopi3", "cells", "on", "the", "background", "of", "Δymr1Δvps38", "(", "C", ")", "by", "ImageJ", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "unpaired", ",", "two", "sided", "(", "ns", "-", "not", "significant", ")", ",", "error", "bars", "represent", "SEM", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", ",", "WT", "(", "n", "=", "51", ")", ",", "Δopi3", "(", "n", "=", "28", ")", ".", "E", ".", "Representative", "images", "of", "Δypt7", ",", "Δopi3Δypt7", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Atg8", "(", "projection", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SD", "-", "URA", "medium", "and", "starved", "in", "SD", "-", "N", ",", "with", "supplementation", "of", "choline", "(", "1", "mM", ")", "to", "SD", "and", "SD", "-", "N", "as", "indicated", ".", "Images", "were", "taken", "during", "growth", "and", "starvation", "by", "confocal", "microscopy", "(", "left", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", "1", "µm", ".", "Right", "panel", "-", "quantification", "of", "cell", "with", "more", "than", "two", "GFP", "-", "Atg8", "puncta", ",", "in", "Δypt7", "and", "Δopi3Δypt7", "at", "growth", "(", "SD", ")", "or", "starvation", "(", "SD", "-", "N", ")", "in", "the", "presence", "(", "+", "choline", ":", "SD", ",", "SD", "-", "N", ")", "or", "absence", "(", "-", "choline", ")", "of", "choline", "(", "1", "mM", ")", ".", "Incidence", "were", "normalized", "to", "Δypt7", "(", "SD", "-", "N", ")", "control", ".", "Statistical", "analysis", "was", "done", "by", "Anova", "multiple", "comparisons", "test", "-", "Sidak", "'", "s", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "of", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Number", "of", "cells", "analyzed", "for", "each", "strain", "and", "condition", ",", "SD", ":", "Δypt7", "(", "n", "=", "209", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "111", ")", ",", "SD", "-", "N", ":", "Δypt7", "(", "n", "=", "118", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "103", ")", ",", "SD", "+", "Choline", ":", "Δypt7", "(", "n", "=", "107", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "120", ")", ",", "Δypt7", "(", "n", "=", "84", ")", ",", "Δopi3Δypt7", "(", "n", "=", "74", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Representative images of Δypt7, Δopi3Δypt7 expressing GFP-Atg8 (z-stack projection). Cells were grown to log phase in SD-URA medium and starved in SD-N, images were taken during starvation in indicated time points by widefield microscopy (left panel). Scale bar 1 µm. Right panel- quantification of GFP-Atg8 puncta per cell in Δypt7, Δopi3Δypt7 at indicated time points. Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's (****, p≤0.0001, ns- not significant), compared to WT. Error bars represent SEM of least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain and time point, 0 hours: Δypt7 (n=322), Δopi3Δypt7 (n=194), 1.5 hours: Δypt7 (n=220), Δopi3Δypt7 (n=155), 3.5 hours Δypt7 (n=216), Δopi3Δypt7 (n=307). B. Quantification of cup-shaped phagophores in Δypt7 and Δopi3Δypt7 cells expressing GFP-Atg8 during starvation (1-3h). Statistical analysis was done by students t-test (***, p≤0.001), error bars represent SEM from at least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain, Δypt7 (n= 347), Δopi3Δypt7 (n= 474).C. Representative images of mNG-tagged Atg8 colocalized with mScarletI-PXVam7. WT, Δopi3, Δatg1 and Δopi3Δatg1 cells on the background of Δymr1, expressing mScarletI-PXVam7 under the CUP1 promoter from the knocked-out VPS38 locus, were grown to log phase in SD medium in the presence of 10 µM copper sulfate, and shifted to SD-N in the presence of 10 µM copper sulfate. Images were taken during SD-N (1-3 h) by widefield microscopy. D. Quantification of autophagic structure diameters in WT and Δopi3 cells on the background of Δymr1Δvps38 (C) by ImageJ. Statistical analysis was done by student's t-test, unpaired, two sided (ns- not significant), error bars represent SEM of at least three independent experiments. Number of cells analyzed for each strain, WT (n=51), Δopi3 (n=28).E. Representative images of Δypt7, Δopi3Δypt7 cells expressing GFP-Atg8 (projection). Cells were grown to log phase in SD-URA medium and starved in SD-N, with supplementation of choline (1 mM) to SD and SD-N as indicated. Images were taken during growth and starvation by confocal microscopy (left panel). Scale bar 1 µm. Right panel- quantification of cell with more than two GFP-Atg8 puncta, in Δypt7 and Δopi3Δypt7 at growth (SD) or starvation (SD-N) in the presence (+choline: SD, SD-N) or absence (-choline) of choline (1 mM). Incidence were normalized to Δypt7 (SD-N) control. Statistical analysis was done by Anova multiple comparisons test- Sidak's (***, p≤0.001). Error bars represent SEM of least 3 independent experiments. Number of cells analyzed for each strain and condition, SD: Δypt7 (n=209), Δopi3Δypt7 (n=111), SD-N: Δypt7 (n=118), Δopi3Δypt7 (n=103), SD+Choline: Δypt7 (n=107), Δopi3Δypt7 (n=120), Δypt7 (n=84), Δopi3Δypt7 (n=74)."}
{"words": ["Figure", "1Overexpression", "of", "USP36", "promotes", "SUMOylation", "in", "cells", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "from", "H1299", "(", "A", ")", ",", "U2OS", "and", "HeLa", "(", "B", ")", "cells", "transfected", "with", "control", "empty", "vector", "or", "Flag", "-", "USP36", "were", "assayed", "by", "IB", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Overexpression of USP36 promotes SUMOylation in cells. Whole cell lysates (WCL) from H1299 (A), U2OS and HeLa (B) cells transfected with control empty vector or Flag-USP36 were assayed by IB."}
{"words": ["Figure", "2H1299", "cells", "transfected", "with", "WT", "USP36", "or", "the", "indicated", "mutants", "and", "His", "-", "SUMO2", "were", "subjected", "to", "Ni2", "+", "-", "NTA", "agarose", "beads", "pull", "down", "(", "PD", ")", "followed", "by", "IB", "using", "anti", "-", "SUMO2", "/", "3", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2H1299 cells transfected with WT USP36 or the indicated mutants and His-SUMO2 were subjected to Ni2+-NTA agarose beads pull down (PD) followed by IB using anti-SUMO2/3 antibody."}
{"words": ["Figure", "3USP36", "interacts", "with", "Ubc9", "in", "cells", ".", "H1299", "cell", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "were", "subjected", "to", "co", "-", "IP", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", "followed", "by", "IB", ".", "USP36", "SUMOylates", "PARP1", "in", "vitro", ".", "Recombinant", "T7", "-", "PARP1", "protein", "(", "0", ".", "1", "μM", ")", "was", "incubated", "with", "SUMO", "E1", "(", "30", "nM", ")", ",", "Ubc9", "(", "50", "nM", ")", ",", "SUMO2", "(", "4", "μM", ")", "in", "the", "presence", "of", "USP361", "-", "800", "(", "50", "nM", ")", "and", "/", "or", "ATP", "(", "2", ".", "5", "mM", ")", "at", "30ºC", "for", "5", "hours", "and", "then", "assayed", "by", "IB", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3USP36 interacts with Ubc9 in cells. H1299 cell transfected with the indicated plasmids were subjected to co-IP with anti-Flag antibody followed by IB.USP36 SUMOylates PARP1 in vitro. Recombinant T7-PARP1 protein (0.1 μM) was incubated with SUMO E1 (30 nM), Ubc9 (50 nM), SUMO2 (4 μM) in the presence of USP361-800 (50 nM) and/or ATP (2.5 mM) at 30ºC for 5 hours and then assayed by IB."}
{"words": ["Figure", "4USP36", "SUMOylates", "Nhp2", "and", "Nop58", "in", "vitro", ".", "In", "vitro", "SUMOylation", "assays", "were", "performed", "by", "incubating", "recombinant", "Nhp2", "(", "F", ",", "G", ")", "or", "Nop58", "(", "H", ")", "(", "0", ".", "1", "μM", ")", "with", "SUMO", "E1", "(", "30", "nM", ")", ",", "Ubc9", "(", "50", "nM", ")", ",", "SUMO2", "(", "4", "μM", ")", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "USP361", "-", "800", "(", "50", "nM", ",", "1x", ";", "100", "nM", ",", "2x", ")", "and", "/", "or", "ATP", "(", "2", ".", "5", "mM", ")", "at", "37ºC", "for", "two", "hours", "or", "the", "indicated", "times", ".", "The", "reactions", "were", "assayed", "by", "IB", "using", "anti", "-", "Nhp2", "and", "anti", "-", "Nop58", "antibodies", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4USP36 SUMOylates Nhp2 and Nop58 in vitro. In vitro SUMOylation assays were performed by incubating recombinant Nhp2 (F, G) or Nop58 (H) (0.1 μM) with SUMO E1 (30 nM), Ubc9 (50 nM), SUMO2 (4 μM) in the absence or presence of USP361-800 (50 nM, 1x; 100 nM, 2x) and/or ATP (2.5 mM) at 37ºC for two hours or the indicated times. The reactions were assayed by IB using anti-Nhp2 and anti-Nop58 antibodies, respectively."}
{"words": ["Figure", "5USP36", "does", "not", "change", "the", "levels", "of", "endogenous", "snoRNP", "proteins", ".", "HeLa", "cells", "infected", "with", "scrambled", "or", "the", "indicated", "USP36", "shRNA", "lentiviruses", "were", "assayed", "by", "IB", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5USP36 does not change the levels of endogenous snoRNP proteins. HeLa cells infected with scrambled or the indicated USP36 shRNA lentiviruses were assayed by IB."}
{"words": ["Figure", "6USP36", "promotes", "the", "binding", "of", "Nhp2", "to", "snoRNAs", ".", "H1299", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "Nhp2", "and", "V5", "-", "USP36", "individually", "or", "together", "were", "assayed", "by", "RNA", "-", "IP", "with", "anti", "-", "Flag", "or", "control", "mouse", "IgG", ",", "followed", "by", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "the", "indicated", "box", "H", "/", "ACA", "snoRNAs", "(", "C", ")", ".", "Shown", "is", "one", "representative", "experiment", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "compared", "to", "Nhp2", "alone", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6USP36 promotes the binding of Nhp2 to snoRNAs. H1299 cells transfected with Flag-Nhp2 and V5-USP36 individually or together were assayed by RNA-IP with anti-Flag or control mouse IgG, followed by RT-qPCR detection of the indicated box H/ACA snoRNAs (C). Shown is one representative experiment of three independent experiments. Data were presented as mean ± SD, n=3 technical replicates. *P<0.05; **P<0.01, compared to Nhp2 alone (Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", ".", "USP36", "is", "required", "for", "rRNA", "processing", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "scr", "or", "USP36", "siRNA", "(", "left", "panels", ")", "or", "infected", "with", "scr", "or", "USP36", "shRNA", "lentiviruses", "(", "right", "panels", ")", "were", "assayed", "for", "rRNA", "processing", "by", "Northern", "blot", "using", "5", "'", "-", "ETS", ",", "ITS1", "and", "ITS2", "probes", "as", "indicated", ".", "Knockdown", "of", "USP36", "inhibits", "translation", ".", "HeLa", "cells", "infected", "with", "scr", "or", "USP36", "shRNA", "lentiviruses", "were", "incubated", "with", "O", "-", "propargyl", "-", "puromycin", "(", "OPP", ")", "followed", "by", "Click", "-", "iT", "OPP", "protein", "synthesis", "assays", ".", "Representative", "images", "(", "C", ")", "and", "quantification", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "D", ")", ".", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "compared", "to", "scr", "control", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B). USP36 is required for rRNA processing. HeLa cells transfected with scr or USP36 siRNA (left panels) or infected with scr or USP36 shRNA lentiviruses (right panels) were assayed for rRNA processing by Northern blot using 5'- ETS, ITS1 and ITS2 probes as indicated.Knockdown of USP36 inhibits translation. HeLa cells infected with scr or USP36 shRNA lentiviruses were incubated with O-propargyl-puromycin (OPP) followed by Click-iT OPP protein synthesis assays. Representative images (C) and quantification from three independent experiments (D). Data were presented as mean ± SD, n=3 biological replicates. ***P<0.001, compared to scr control (Student's t-test). Scale bar = 50 μM."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Cell", "proliferation", "for", "PC3", "cells", "transfected", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "monitored", "in", "real", "time", "for", "60h", "with", "SP", "Dynamic", "Xcelligence", "system", "(", "Voltage", "2", ".", "5", "K", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", ".", "Slopes", "compared", "by", "ANCOVA", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", ")", "Left", "panel", ":", "Cell", "cycle", "profile", "of", "PC3", "cells", "transfected", "with", "siSCR", "or", "siCLU", ".", "Right", "panel", ":", "Percentage", "quantification", "of", "variation", "in", "G1", ",", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "G2", "/", "M", "population", "p", "=", "0", ".", "0058", ";", "G1", "p", "=", "0", ".", "008", ".", ")", ".", "Inset", ":", "Western", "blot", "with", "CLU", "antibody", "in", "PC3", "cells", "after", "CLU", "silencing", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ":", "RNA", "-", "Microarray", "analysis", "comparing", "PC3", "cells", "transfected", "with", "siCLU", "versus", "siSCR", "and", "Kinexus", "phosphokinome", "microarray", "analysis", "comparing", "LNCaP", "-", "transfected", "with", "siCLU", "versus", "siSCR", ".", "Target", "genes", "expression", "is", "shown", "as", "fold", "change", "relative", "to", "siSCR", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", "by", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "for", "all", "the", "genes", "listed", ".", "Central", "panel", ":", "Venn", "diagram", "to", "graphically", "illustrate", "the", "overlap", "of", "mRNA", "and", "proteins", "involved", "in", "the", "regulation", "of", "mitosis", "in", "both", "transcriptome", "and", "phosphokinome", "analysis", ".", "The", "comparison", "of", "these", "2", "experiments", "shows", "modification", "of", "4", "mitosis", "regulators", ".", "Right", "panel", ":", "Western", "blot", "validating", "the", "expression", "levels", "of", "target", "proteins", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Cell proliferation for PC3 cells transfected with siSCR or siCLU monitored in real time for 60h with SP Dynamic Xcelligence system (Voltage 2.5 K). Error bars represent mean ± SEM, n=4. Slopes compared by ANCOVA test, p<0.0001.(B) Left panel: Cell cycle profile of PC3 cells transfected with siSCR or siCLU. Right panel: Percentage quantification of variation in G1, S and G2/M phases. Error bars represent mean ± SEM, n=3, **p<0.01 by paired Student's t-test. (G2/M population p= 0.0058; G1 p=0.008.). Inset: Western blot with CLU antibody in PC3 cells after CLU silencing. Vinculin was used as loading control.(C) Left panel: RNA-Microarray analysis comparing PC3 cells transfected with siCLU versus siSCR and Kinexus phosphokinome microarray analysis comparing LNCaP-transfected with siCLU versus siSCR. Target genes expression is shown as fold change relative to siSCR, p ≤0.05 by an unpaired t-test for all the genes listed. Central panel: Venn diagram to graphically illustrate the overlap of mRNA and proteins involved in the regulation of mitosis in both transcriptome and phosphokinome analysis. The comparison of these 2 experiments shows modification of 4 mitosis regulators. Right panel: Western blot validating the expression levels of target proteins."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Real", "-", "time", "PCR", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "in", "three", "different", "prostate", "cancer", "cell", "lines", ".", "Target", "genes", "expression", "was", "calculated", "relative", "to", "GAPDH", "and", "normalized", "to", "siSCR", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "after", "siSCR", "or", "si", "CLU", "transfection", "in", "the", "same", "prostate", "cancer", "cell", "lines", "as", "in", "A", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "in", "PC3", "cells", "after", "transfection", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "followed", "by", "transfection", "with", "CLU", "or", "empty", "expression", "plasmid", "for", "additional", "48h", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Real-time PCR for CLU and Cdc25C in three different prostate cancer cell lines. Target genes expression was calculated relative to GAPDH and normalized to siSCR. Error bars represent mean ± SD, n=3.(B) Western blot for CLU and Cdc25C after siSCR or si CLU transfection in the same prostate cancer cell lines as in A. Vinculin was used as loading control.(C) Western blot for CLU and Cdc25C in PC3 cells after transfection with siSCR or siCLU followed by transfection with CLU or empty expression plasmid for additional 48h. Vinculin was used as loading control"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Upper", "panel", ":", "Western", "blot", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "from", "LNCaP", "xenografts", "harvested", "from", "mice", "treated", "with", "OGX", "-", "011", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "SCR", "ASO", "control", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Lower", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "protein", "levels", ",", "relative", "to", "the", "loading", "control", ",", "reported", "as", "dot", "plots", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "t", "-", "test", "followed", "by", "Welch", "'", "s", "correction", "(", "CLU", "p", "=", "0", ".", "049", ",", "Cdc25C", "p", "=", "0", ".", "024", ")", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "with", "the", "correspondent", "quantification", "of", "protein", "levels", "(", "left", ")", "and", "real", "time", "PCR", "(", "right", ")", "from", "untreated", "LNCaP", "xenografts", "harvested", "at", "endpoint", ".", "The", "negative", "correlation", "between", "CLU", "-", "RNA", "and", "Cdc25C", "-", "RNA", "ΔΔCT", "values", "was", "calculated", "using", "a", "spearman", "test", "(", "rho", "=", "-", "0", ".", "86", ";", "p", "=", "0", ".", "0107", ")", ".", "(", "C", ")", "Immunoistochemistry", "staining", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "of", "radical", "prostatectomy", "samples", "from", "historical", "control", "specimens", "with", "no", "neoadjuvant", "therapy", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "neoadjuvant", "hormone", "therapy", ",", "(", "NHT", ")", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "the", "combination", "of", "NHT", "and", "OGX", "-", "011", "(", "n", "=", "9", ")", "for", "3", "months", "prior", "surgery", ".", "Average", "score", "staining", "from", "the", "3", "groups", "(", "left", ")", "and", "representative", "sections", "for", "CLU", "and", "Cdc25C", "(", "right", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "CLU", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "untreated", "versus", "3mNHT", "(", "p", "=", "0", ".", "0213", ")", ";", "3mNHT", "versus", "3mNHT", "+", "OGX", "-", "011", "(", "p", "=", "0", ".", "012", ")", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "All", "cases", "were", "normalized", "by", "clinical", "stage", ",", "Gleason", "score", "and", "serum", "PSA", ".", "For", "each", "patient", ",", "the", "pathologist", "selected", "the", "area", "with", "the", "highest", "Gleason", "score", ".", "Scale", "bar", "represents", "100"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Upper panel: Western blot for CLU and Cdc25C from LNCaP xenografts harvested from mice treated with OGX-011 (n=8) or SCR ASO control (n=6). Vinculin was used as loading control. Lower panel: Quantification of the protein levels, relative to the loading control, reported as dot plots. *p<0.05 by t-test followed by Welch's correction (CLU p= 0.049, Cdc25C p= 0.024).(B) Western blot with the correspondent quantification of protein levels (left) and real time PCR (right) from untreated LNCaP xenografts harvested at endpoint. The negative correlation between CLU-RNA and Cdc25C-RNA ΔΔCT values was calculated using a spearman test (rho=-0.86; p=0.0107).(C) Immunoistochemistry staining for CLU and Cdc25C of radical prostatectomy samples from historical control specimens with no neoadjuvant therapy (n=5) or neoadjuvant hormone therapy, (NHT) (n=5) or the combination of NHT and OGX-011 (n=9) for 3 months prior surgery. Average score staining from the 3 groups (left) and representative sections for CLU and Cdc25C (right). Error bars represent mean ± SEM. CLU: *p<0.05; untreated versus 3mNHT (p=0.0213); 3mNHT versus 3mNHT +OGX-011 (p=0.012) by ANOVA followed by Bonferroni post hoc analysis. All cases were normalized by clinical stage, Gleason score and serum PSA. For each patient, the pathologist selected the area with the highest Gleason score. Scale bar represents 100 µm"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "from", "parental", "PC3", "cells", "transfected", "with", "CLU", "and", "Cdc25C", "plasmid", "expression", "vectors", ".", "Proteins", "were", "immunoprecipitated", "with", "specific", "anti", "-", "Cdc25C", "(", "left", ")", "and", "CLU", "(", "right", ")", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "Dual", "immunofluorescence", "staining", "with", "Cdc25C", "(", "green", ")", "and", "CLU", "(", "red", ")", "antibodies", "in", "PC3", "cells", ".", "Confocal", "microscopy", "was", "used", "to", "identify", "the", "interaction", "(", "white", "arrows", ")", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "(", "DAPI", ")", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "represent", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Duolink", "proximity", "ligation", "assay", "between", "Cdc25C", "and", "CLU", "in", "PC3", "cells", ".", "Confocal", "microscopy", "was", "used", "to", "detect", "the", "interaction", "(", "red", "dots", ")", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "PC3", "cells", "transfected", "with", "siCLU", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Scale", "bar", "represent", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Co-immunoprecipitation from parental PC3 cells transfected with CLU and Cdc25C plasmid expression vectors. Proteins were immunoprecipitated with specific anti-Cdc25C (left) and CLU (right) antibodies and analyzed by immunoblotting.(B) Dual immunofluorescence staining with Cdc25C (green) and CLU (red) antibodies in PC3 cells. Confocal microscopy was used to identify the interaction (white arrows). DNA was counterstained with (DAPI) (blue). Scale bar represent 10 µm.(C) Duolink proximity ligation assay between Cdc25C and CLU in PC3 cells. Confocal microscopy was used to detect the interaction (red dots). DNA was counterstained with DAPI (blue). PC3 cells transfected with siCLU were used as a negative control. Scale bar represent 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Left", "panel", ":", "Western", "blot", "for", "CLU", ",", "Cdc25C", ",", "Cdc25C", "-", "T48", ",", "Cdc25C", "S216", "and", "Cdc25C", "S198", "in", "PC", "-", "3", "cells", "after", "siSCR", "or", "siCLU", "transfection", ",", "synchronization", "and", "nocodazole", "release", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Right", "panel", ":", "Immunofluorescence", "microscopy", "for", "Cdc25C", "-", "T48", "in", "PC3", "cells", "after", "siSCR", "or", "siCLU", "transfection", ".", "DNA", "was", "counterstained", "with", "(", "DAPI", ")", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", ",", "Cdc25C", "-", "T48", ",", "Cdk1", "and", "PP2A", "in", "PC3", "cells", "after", "siSCR", "or", "siCLU", "transfection", "and", "after", "synchronization", "followed", "by", "treatment", "with", "or", "without", "okadaic", "acid", "(", "OA", ")", "(", "100", "nM", ")", "for", "12", "hours", ".", "Proteins", "were", "extracted", "15", "min", "after", "nocodazole", "release", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "for", "PP2A", ",", "CLU", ",", "Cdc25C", "-", "T48", ",", "Cdc25C", ",", "Wee1", "and", "Cdk1", "in", "PC3", "cells", "transfected", "with", "siSCR", "or", "siPP2A", "synchronized", "and", "nocodazole", "released", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "D", ")", "PP2A", "phosphatase", "activity", "measurement", "in", "PC3", "cells", "after", "siSCR", "or", "siCLU", "transfection", ",", "synchronization", "and", "nocodazole", "release", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "p", "=", "0", ".", "0025", ")", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "comparisons", ".", "Cells", "treated", "with", "no", "peptide", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Left panel: Western blot for CLU, Cdc25C, Cdc25C-T48, Cdc25C S216 and Cdc25C S198 in PC-3 cells after siSCR or siCLU transfection, synchronization and nocodazole release at indicated time points. Vinculin was used as loading control. Right panel: Immunofluorescence microscopy for Cdc25C-T48 in PC3 cells after siSCR or siCLU transfection. DNA was counterstained with (DAPI) (blue). Scale bar represents 10 µm.(B) Western blot for CLU, Cdc25C-T48, Cdk1 and PP2A in PC3 cells after siSCR or siCLU transfection and after synchronization followed by treatment with or without okadaic acid (OA) (100 nM) for 12 hours. Proteins were extracted 15 min after nocodazole release. Vinculin was used as loading control.(C) Western blot for PP2A, CLU, Cdc25C-T48, Cdc25C, Wee1 and Cdk1 in PC3 cells transfected with siSCR or siPP2A synchronized and nocodazole released at indicated time points. Vinculin was used as loading control.(D) PP2A phosphatase activity measurement in PC3 cells after siSCR or siCLU transfection, synchronization and nocodazole release at indicated time points. Error bar represent mean ± SEM, n=3, ** p<0.01 (p=0.0025) by ANOVA followed by Bonferroni's post hoc comparisons. Cells treated with no peptide were used as a negative control."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", ",", "Cdk1", "Y15", ",", "Cdk1", "and", "Wee1", "in", "PC", "-", "3", "cells", "after", "siSCR", "or", "siCLU", "transfection", "followed", "by", "synchronization", "and", "nocodazole", "release", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "B", ")", "Wee1", "expression", "level", "was", "evaluated", "in", "PC3", "cells", "after", "CLU", "silencing", "by", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "followed", "by", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "(", "C", ")", "FACS", "analysis", "showing", "percentage", "of", "the", "PC3", "cells", "positive", "for", "phosphohistone", "H3", "after", "transfection", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "in", "presence", "and", "absence", "of", "Wee1", "inhibitor", ",", "MK", "-", "1775", ".", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Mann", "-", "Whitney", "(", "D", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", ",", "Wee1", ",", "Cdk1", "Y15", ",", "Cdk1", "and", "Cyclin", "B1", "in", "PC3", "cells", "after", "transfection", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "followed", "by", "synchronization", "and", "treatment", "with", "or", "without", "MK", "-", "1775", ",", "a", "specific", "Wee1", "inhibitor", ",", "for", "12", "hours", ".", "Cells", "were", "harvested", "at", "different", "time", "points", "after", "nocodazole", "release", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blot for CLU, Cdk1 Y15, Cdk1 and Wee1 in PC-3 cells after siSCR or siCLU transfection followed by synchronization and nocodazole release at indicated time points. Vinculin was used as loading control(B) Wee1 expression level was evaluated in PC3 cells after CLU silencing by real-time PCR. Error bar represent mean ± SEM, n=3, *** p<0.001 (p=0.0001) by unpaired t-test followed by Welch's correction.(C) FACS analysis showing percentage of the PC3 cells positive for phosphohistone H3 after transfection with siSCR or siCLU in presence and absence of Wee1 inhibitor, MK-1775. Error bar represent mean ± SEM, n=3, ****p<0.0001 by Mann-Whitney(D) Western blot for CLU, Wee1, Cdk1 Y15, Cdk1 and Cyclin B1 in PC3 cells after transfection with siSCR or siCLU followed by synchronization and treatment with or without MK-1775, a specific Wee1 inhibitor, for 12 hours. Cells were harvested at different time points after nocodazole release. Vinculin was used as loading control."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Cabazitaxel", "IC50", "calculation", "using", "WST1", "assay", "in", "PC3", "cells", "after", "transfection", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "(", "left", ")", ",", "and", "SCR", "or", "OGX", "-", "011", "(", "right", ")", "followed", "by", "72h", "of", "cabazitaxel", "treatment", ".", "Percentage", "of", "surviving", "cells", "was", "calculated", "relative", "to", "control", ".", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ".", "Inset", ":", "Western", "blot", "was", "performed", "to", "verify", "CLU", "knockdown", "in", "cells", ".", "(", "B", ")", "Mitotic", "cells", "and", "cells", "in", "mitotic", "catastrophe", "were", "counted", "using", "DAPI", "in", "PC", "-", "3", "cells", "after", "SCR", "or", "OGX", "-", "011", "transfection", "followed", "by", "different", "concentration", "of", "cabazitaxel", "as", "indicated", "(", ">", "1000", "counts", ")", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "caba", "1", ".", "5", "nM", "p", "=", "0", ".", "00115", ";", "3", "nM", "p", "=", "0", ".", "0105", ";", "4", ".", "5", "nM", "p", "=", "1", ".", "93x10", "-", "7", ",", ";", "6", ".", "25", "nM", "p", "=", "8", ".", "9x10", "-", "9", ";", "12", ".", "5", "nM", "p", "=", "6", ".", "8x10", "-", "9", ";", "25", "nM", "p", "=", "1", ".", "2x10", "-", "9", ")", ".", "(", "C", ")", "Clonogenic", "assay", "in", "PC", "-", "3", "cells", "after", "SCR", "or", "OGX", "-", "011", "transfection", "followed", "by", "treatment", "with", "different", "concentrations", "of", "cabazitaxel", "as", "indicated", ".", "The", "number", "of", "survival", "clones", "was", "assessed", "after", "15", "days", "using", "crystal", "violet", "assay", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "n", "=", "3", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "Mann", "-", "Whitney", "(", "0", "nM", "caba", "p", "=", "0", ".", "039", ";", "0", ".", "5", "nM", "p", "=", "0", ".", "0079", ";", "2", "nM", "p", "=", "0", ".", "0079", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Cabazitaxel IC50 calculation using WST1 assay in PC3 cells after transfection with siSCR or siCLU (left), and SCR or OGX-011 (right) followed by 72h of cabazitaxel treatment. Percentage of surviving cells was calculated relative to control. Error bar represent mean ± SEM, n=3. Inset: Western blot was performed to verify CLU knockdown in cells.(B) Mitotic cells and cells in mitotic catastrophe were counted using DAPI in PC-3 cells after SCR or OGX-011 transfection followed by different concentration of cabazitaxel as indicated (>1000 counts) Error bar represent mean ± SEM.,*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001 by Student's t-test.( caba 1.5 nM p=0.00115 ; 3 nM p=0.0105 ; 4.5 nM p=1.93x10-7, ; 6.25 nM p=8.9x10-9; 12.5 nM p=6.8x10-9; 25 nM p=1.2x10-9).(C) Clonogenic assay in PC-3 cells after SCR or OGX-011 transfection followed by treatment with different concentrations of cabazitaxel as indicated. The number of survival clones was assessed after 15 days using crystal violet assay. Error bars represent mean ± SEM n=3,*p<0.05, **p<0.01 by Mann-Whitney (0 nM caba p=0.039; 0.5 nM p=0.0079; 2 nM p=0.0079)"}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "Cell", "cycle", "distribution", "of", "syncronized", "PC3", "and", "PC3", "-", "R", "-", "caba", "cells", "60", "min", "after", "nocodazole", "release", "at", "indicated", "time", "points", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "for", "CLU", ",", "Cdc25C", ",", "Cdc25C", "-", "T48", ",", "Cdk1", ",", "Cdk1", "-", "Y15", "and", "Wee1", "in", "IGRCaP", "-", "1", "and", "PC3", "parental", "(", "WT", ")", "or", "cabazitaxel", "-", "resistant", "(", "R", "-", "caba", ")", "cells", "as", "well", "as", "for", "PC3", "-", "R", "-", "caba", "cells", "transfected", "with", "siSCR", "or", "siCLU", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Cell", "survival", "measured", "using", "WST1", "in", "PC3", "-", "R", "-", "caba", "cells", "after", "SCR", "or", "OGX", "-", "011", "transfection", "and", "treatment", "with", "10", "nM", "cabazitaxel", "for", "48h", ".", "Error", "bar", "represent", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "correction", ".", "(", "D", ")", "Cell", "survival", "measured", "using", "WST1", "in", "PC3", "resistant", "cells", "after", "transfection", "with", "siSCR", "or", "siCLU", "followed", "by", "treatment", "with", "cabazitaxel", "(", "10", "nM", ";", "C10", ")", ",", "MK", "-", "1775", "(", "10", "nM", ";", "MK10", ")", "or", "both", "for", "72", "hours", ".", ".", "Error", "bar", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "3", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "correction", ".", "(", "E", ")", "PARP", "cleavage", "was", "assessed", "by", "western", "blot", "in", "cells", "treated", "as", "in", "D", "and", "its", "relative", "expression", "was", "quantified", "by", "densitometry", "using", "ImageJ", ".", "Vinculin", "was", "used", "as", "loading", "control", "(", "F", ")", "Left", "panel", ":", "Quantification", "of", "tumour", "volume", "over", "52", "days", "in", "nude", "male", "mice", "xenotransplanted", "with", "PC3", "-", "docetaxel", "resistant", "cells", "and", "treated", "with", "either", "MK", "-", "1775", "(", "M", ",", "black", "line", ")", ",", "MK", "-", "1775", "and", "micellar", "taxane", "(", "MT", ",", "blue", "line", ")", ",", "micellar", "taxane", "and", "OGX", "-", "011", "(", "TO", ",", "red", "line", ")", "or", "MK", "-", "1775", ",", "micellar", "taxane", "and", "OGX", "-", "011", "(", "MTO", ",", "green", "line", ")", ".", "The", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", ".", "Right", "panel", ":", "Slopes", "of", "tumor", "growth", "between", "groups", ",", "were", "compared", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "analysis", ".", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "p", "=", "0", ".", "0488", "(", "M", "to", "TO", ")", ";", "p", "=", "0", ".", "0007", "(", "M", "to", "MTO", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) Cell cycle distribution of syncronized PC3 and PC3-R-caba cells 60 min after nocodazole release at indicated time points.(B) Western blot for CLU, Cdc25C, Cdc25C-T48, Cdk1, Cdk1-Y15 and Wee1 in IGRCaP-1 and PC3 parental (WT) or cabazitaxel-resistant (R-caba) cells as well as for PC3-R-caba cells transfected with siSCR or siCLU. Vinculin was used as loading control.(C) Cell survival measured using WST1 in PC3-R-caba cells after SCR or OGX-011 transfection and treatment with 10 nM cabazitaxel for 48h. Error bar represent mean ± SEM, n=3, *** p<0.001 by one way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc correction.(D) Cell survival measured using WST1 in PC3 resistant cells after transfection with siSCR or siCLU followed by treatment with cabazitaxel (10 nM; C10), MK-1775 (10 nM; MK10) or both for 72 hours. .Error bar represent the mean ± SEM, n=3, *** p<0.001 by one way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc correction.(E) PARP cleavage was assessed by western blot in cells treated as in D and its relative expression was quantified by densitometry using ImageJ. Vinculin was used as loading control(F) Left panel: Quantification of tumour volume over 52 days in nude male mice xenotransplanted with PC3-docetaxel resistant cells and treated with either MK-1775 (M, black line), MK-1775 and micellar taxane (MT, blue line), micellar taxane and OGX-011 (TO, red line) or MK-1775, micellar taxane and OGX-011 (MTO, green line). The error bars indicate mean ± SEM, n=8. Right panel: Slopes of tumor growth between groups, were compared by ANOVA followed by Dunnett's post hoc analysis..*p<0.05, ***p<0.001 .p=0.0488 (M to TO); p=0.0007 (M to MTO)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Identification", "of", "FASTKD2", "interacting", "proteins", "by", "AP", "-", "MS", "and", "BioID", ".", "26", "high", "confidence", "interactors", "detected", "by", "both", "techniques", "are", "listed", "on", "the", "right", ".", "B", ".", "Prey", "specificity", "graph", "for", "BioID", "interactome", "of", "TRUB2", "protein", ".", "Prey", "specificity", "was", "calculated", "as", "the", "relative", "enrichment", "of", "interaction", "of", "individual", "preys", "and", "TRUB2", ",", "compared", "to", "their", "interaction", "with", "138", "other", "baits", "(", "42", "mitochondrial", "baits", ",", "96", "baits", "from", "other", "cellular", "compartments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Identification of FASTKD2 interacting proteins by AP-MS and BioID. 26 high confidence interactors detected by both techniques are listed on the right.B. Prey specificity graph for BioID interactome of TRUB2 protein. Prey specificity was calculated as the relative enrichment of interaction of individual preys and TRUB2, compared to their interaction with 138 other baits (42 mitochondrial baits, 96 baits from other cellular compartments)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "indicated", "proteins", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "B", ".", "BN", "-", "PAGE", "analysis", "of", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "shows", "an", "OXPHOS", "defect", "as", "revealed", "by", "subunit", "-", "specific", "antibodies", "against", "individual", "OXPHOS", "complexes", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "individual", "OXPHOS", "complexes", "normalized", "to", "Complex", "II", "levels", ".", "The", "graph", "represents", "the", "relative", "abundance", "of", "individual", "complexes", "in", "cells", "treated", "with", "the", "specified", "siRNA", "versus", "controls", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "3", "-", "7", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "paired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Pulse", "-", "labeling", "mitochondrial", "translation", "experiment", "of", "the", "13", "mitochondria", "-", "encoded", "polypeptides", "(", "seven", "subunits", "of", "complex", "I", "[", "ND", "]", ",", "three", "subunits", "of", "complex", "IV", "[", "COX", "]", ",", "two", "subunits", "of", "complex", "V", "[", "ATP", "]", "and", "one", "subunit", "of", "complex", "III", "[", "cyt", "b", "]", ")", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "(", "E", ")", "Detail", "of", "a", "mitochondrial", "pulse", "-", "labeling", "experiment", "showing", "a", "severe", "decrease", "in", "the", "translation", "of", "ATP6", "and", "ATP8", "in", "TRUB2", "depleted", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of indicated proteins in control and siRNA treated cells.B. BN-PAGE analysis of siRNA-mediated depletion shows an OXPHOS defect as revealed by subunit-specific antibodies against individual OXPHOS complexes.C. Quantification of the levels of individual OXPHOS complexes normalized to Complex II levels. The graph represents the relative abundance of individual complexes in cells treated with the specified siRNA versus controls. The bars represent the mean ± SEM of 3-7 independent experiments. P-values were calculated using paired two-tailed t-test (* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001).D, E. Pulse-labeling mitochondrial translation experiment of the 13 mitochondria-encoded polypeptides (seven subunits of complex I [ND], three subunits of complex IV [COX], two subunits of complex V [ATP] and one subunit of complex III [cyt b]) in control and siRNA treated cells. (E) Detail of a mitochondrial pulse-labeling experiment showing a severe decrease in the translation of ATP6 and ATP8 in TRUB2 depleted cells."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ".", "Identification", "of", "mitochondrial", "ribosomal", "proteins", "and", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", "by", "sucrose", "gradient", "centrifugation", "in", "control", "cells", "(", "A", ")", "Individual", "fractions", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "migration", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "are", "shown", ".", "A", ",", "B", ".", "Identification", "of", "mitochondrial", "ribosomal", "proteins", "and", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", "by", "sucrose", "gradient", "centrifugation", "in", "cells", "treated", "with", "siRNA", "(", "B", ")", ".", "Individual", "fractions", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "migration", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "are", "shown", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "the", "levels", "of", "the", "mt", "-", "SSU", "(", "28S", ")", ",", "the", "mt", "-", "LSU", "(", "39S", ")", "and", "the", "mitochondrial", "monosome", "(", "55S", ")", "normalized", "to", "the", "SDHA", "levels", ".", "The", "graph", "represents", "the", "relative", "abundance", "of", "individual", "subunits", "in", "cells", "treated", "with", "specified", "siRNA", "versus", "controls", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "D", ".", "2D", "-", "immunoblot", "analysis", "(", "BN", "-", "PAGE", "/", "SDS", "-", "PAGE", ")", "of", "pseudouridine", "synthase", "interacting", "proteins", ".", "The", "migration", "(", "sizes", "in", "kDa", ")", "of", "known", "protein", "complexes", "in", "the", "first", "dimension", "is", "indicated", "on", "the", "top", "of", "the", "blot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B. Identification of mitochondrial ribosomal proteins and pseudouridine synthase interacting proteins by sucrose gradient centrifugation in control cells (A) Individual fractions were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. The migration of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) are shown.A, B. Identification of mitochondrial ribosomal proteins and pseudouridine synthase interacting proteins by sucrose gradient centrifugation in cells treated with siRNA (B). Individual fractions were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. The migration of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) are shown.C. Quantification of the levels of the mt-SSU (28S), the mt-LSU (39S) and the mitochondrial monosome (55S) normalized to the SDHA levels. The graph represents the relative abundance of individual subunits in cells treated with specified siRNA versus controls. The bars represent the mean ± SEM.D. 2D-immunoblot analysis (BN-PAGE/SDS-PAGE) of pseudouridine synthase interacting proteins. The migration (sizes in kDa) of known protein complexes in the first dimension is indicated on the top of the blot."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Quantification", "of", "Δ", "(", "the", "difference", "between", "the", "rate", "of", "deletions", "in", "CMC", "treated", "vs", "un", "-", "treated", "cells", ")", "for", "individual", "ψ", "sites", "in", "control", "and", "siRNA", "treated", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "one", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Quantification of Δ (the difference between the rate of deletions in CMC treated vs un-treated cells) for individual ψ sites in control and siRNA treated cells. The bars represent the mean ± SEM of two independent experiments. P-values were calculated using a one-tailed t-test (* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001)."}
{"words": ["Figure", "1SILAC", "-", "based", "proteomics", "data", "identify", "known", "(", "red", ")", "&", "novel", "(", "green", ")", "hypoxia", "-", "induced", "proteins", "in", "SW620", "cells", ".", "One", "sample", "T", "-", "test", "was", "performed", ".", "Western", "blotting", "confirmed", "GPRC5A", "as", "a", "hypoxia", "-", "induced", "protein", "in", "SILAC", "lysates", ".", "Validation", "of", "GPRC5A", "western", "blot", "data", "using", "siRNA", ".", "*", "Non", "-", "specific", "band", "of", "~", "60kDa", "not", "depleted", "by", "GPRC5A", "siRNA", ".", "Confocal", "microscopy", "showing", "plasma", "membrane", "GPRC5A", "expression", "in", "hypoxic", "SW620", "cells", "(", "scale", "bars", ":", "75um", ")", ".", "Western", "blotting", "showing", "GPRC5A", "upregulation", "by", "hypoxia", "in", "a", "panel", "of", "colorectal", "tumour", "cell", "lines", ".", "Basal", "&", "hypoxia", "-", "induced", "GPRC5A", "protein", "expression", "was", "decreased", "by", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", ".", "Depletion", "of", "HIF", "-", "1β", "decreased", "GPRC5A", "protein", "upregulation", "in", "hypoxia", ".", "Hypoxia", "mimetic", "DMOG", "induced", "HIF", "-", "1", "/", "2α", ",", "CA9", "&", "GPRC5A", "protein", "expression", ".", "Dual", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", "reduced", "GPRC5A", "induction", "by", "DMOG", ".", "qRT", "-", "PCR", "demonstrating", "that", "GPRC5A", "mRNA", "was", "upregulated", "by", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "was", "normalised", "to", "HPRT", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "demonstrating", "that", "HIF", "-", "1", "/", "2α", "depletion", "decreased", "GPRC5A", "induction", "during", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "was", "normalised", "to", "HPRT", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", ".", "ChIP", "/", "PCR", "analyses", "identify", "HIF", "-", "1α", "a", "binding", "to", "the", "GPRC5A", "promoter", "region", "containing", "a", "putative", "optimal", "HRE", "(", "error", "bars", "±", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1SILAC-based proteomics data identify known (red) & novel (green) hypoxia-induced proteins in SW620 cells. One sample T-test was performed.Western blotting confirmed GPRC5A as a hypoxia-induced protein in SILAC lysates.Validation of GPRC5A western blot data using siRNA. *Non-specific band of ~60kDa not depleted by GPRC5A siRNA.Confocal microscopy showing plasma membrane GPRC5A expression in hypoxic SW620 cells (scale bars: 75um).Western blotting showing GPRC5A upregulation by hypoxia in a panel of colorectal tumour cell lines.Basal & hypoxia-induced GPRC5A protein expression was decreased by HIF-1/2α depletion.Depletion of HIF-1β decreased GPRC5A protein upregulation in hypoxia.Hypoxia mimetic DMOG induced HIF-1/2α, CA9 & GPRC5A protein expression. Dual HIF-1/2α depletion reduced GPRC5A induction by DMOG.qRT-PCR demonstrating that GPRC5A mRNA was upregulated by hypoxia. GPRC5A was normalised to HPRT (error bars ± SD).qRT-PCR demonstrating that HIF-1/2α depletion decreased GPRC5A induction during hypoxia. GPRC5A was normalised to HPRT (error bars ± SD).ChIP/PCR analyses identify HIF-1α a binding to the GPRC5A promoter region containing a putative optimal HRE (error bars ± SD)."}
{"words": ["Figure", "2Expression", "of", "CA9", "in", "formalin", "fixed", "paraffin", "embedded", "hypoxic", "SW620", "cells", "by", "IHC", ".", "Reduced", "CA9", "expression", "with", "siRNA", "confirms", "antibody", "specificity", "(", "scale", "bars", ":", "200um", ")", ".", "Expression", "of", ";", "GPRC5A", "in", "formalin", "fixed", "paraffin", "embedded", "hypoxic", "SW620", "cells", "by", "IHC", ".", "Reduced", ";", "GPRC5A", "expression", "with", "siRNA", "confirms", "antibody", "specificity", "(", "scale", "bars", ":", "200um", ")", ".", "IHC", "analysis", "of", "serial", "sections", "from", "human", "colorectal", "tissue", "from", "patients", "with", "mesenteric", "ischaemia", "(", "strangulated", "colon", ")", ".", "GPRC5A", "is", "co", "-", "expressed", "with", "CA9", "in", "the", "colonic", "epithelial", "cells", "(", "scale", "bars", ":", "50um", ")", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "mouse", "intestinal", "tissue", ".", "Gene", "expression", "was", "normalised", "to", "housekeeping", "gene", "Tbp", ".", "Raw", "data", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "are", "shown", "(", "error", "bars", "±", "SEM", ")", ".", "Tg", "[", "fli1", ":", "eGFP", ";", "vhl", "-", "/", "-", "]", "&", "Tg", "[", "fli1", ":", "eGFP", "]", "zebrafish", "embryos", "(", "5", "days", "post", "-", "fertilisation", ")", "demonstrate", "excessive", "angiogenesis", "&", "increased", "expression", "of", "HIF", "target", "genes", "(", "scale", "bars", ":", "100um", ")", ".", "gprc5ba", "was", "induced", "in", "vhl", "mutant", "zebrafish", "embryos", "&", "fli1", ":", "eGFP", "zebrafish", "embryos", "exposed", "to", "5", "%", "O2", "(", "vs", "normoxia", ")", "for", "24", "hours", "(", "RT", "-", "PCR", ")", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", "following", "analysis", "of", "transcriptomics", "dataset", "GSE24551", ".", "Event", "-", "free", "survival", "is", "significantly", "reduced", "in", "patients", "with", "tumours", "expressing", "high", "levels", "of", "GPRC5A", "mRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Expression of CA9 in formalin fixed paraffin embedded hypoxic SW620 cells by IHC. Reduced CA9 expression with siRNA confirms antibody specificity (scale bars: 200um).Expression of ; GPRC5A in formalin fixed paraffin embedded hypoxic SW620 cells by IHC. Reduced ; GPRC5A expression with siRNA confirms antibody specificity (scale bars: 200um).IHC analysis of serial sections from human colorectal tissue from patients with mesenteric ischaemia (strangulated colon). GPRC5A is co-expressed with CA9 in the colonic epithelial cells (scale bars: 50um).Quantitative RT-PCR analysis of mouse intestinal tissue. Gene expression was normalised to housekeeping gene Tbp. Raw data from three independent experiments (n=3 mice) are shown (error bars ± SEM).Tg[fli1:eGFP; vhl-/-] & Tg[fli1:eGFP] zebrafish embryos (5 days post-fertilisation) demonstrate excessive angiogenesis & increased expression of HIF target genes (scale bars: 100um).gprc5ba was induced in vhl mutant zebrafish embryos & fli1:eGFP zebrafish embryos exposed to 5% O2 (vs normoxia) for 24 hours (RT-PCR).Kaplan-Meier curve following analysis of transcriptomics dataset GSE24551. Event-free survival is significantly reduced in patients with tumours expressing high levels of GPRC5A mRNA."}
{"words": ["Figure", "3GPRC5A", "depletion", "markedly", "increases", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "during", "hypoxia", ".", "Three", "independent", "siRNA", "sequences", "targeting", "GPRC5A", "induce", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "during", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "depletion", "reduces", "hypoxic", "cell", "growth", "/", "survival", ".", "Crystal", "violet", "cell", "assays", "show", "reduced", "cell", "growth", "/", "survival", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", "during", "hypoxia", "[", "n", "=", "3", "]", ".", "Expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "rescues", "hypoxic", "GPRC5A", "-", "depleted", "cells", "from", "apoptosis", ".", "Upper", ":", "doxycycline", "-", "induced", "expression", "GPRC5Asi1R", "rescues", "increases", "caspase", "-", "3", "/", "PARP", "cleavage", "induced", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "Lower", ":", "generation", "of", "an", "siRNA1", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "by", "synonymous", "mutations", ".", "Caspase", "inhibitor", "QVD", "prevents", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", "induces", "apoptosis", "as", "determined", "by", "the", "violet", "ratiometric", "membrane", "asymmetry", "probe", "/", "dead", "cell", "apoptosis", "assay", "and", "flow"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3GPRC5A depletion markedly increases caspase-3 activation/PARP cleavage during hypoxia.Three independent siRNA sequences targeting GPRC5A induce caspase-3 activation/PARP cleavage during hypoxia.GPRC5A depletion reduces hypoxic cell growth/survival. Crystal violet cell assays show reduced cell growth/survival in GPRC5A depleted cells during hypoxia [n=3].Expression of an siRNA-resistant GPRC5A cDNA rescues hypoxic GPRC5A-depleted cells from apoptosis. Upper: doxycycline-induced expression GPRC5Asi1R rescues increases caspase-3/PARP cleavage induced by GPRC5A depletion in hypoxia. Lower: generation of an siRNA1 resistant GPRC5A cDNA by synonymous mutations.Caspase inhibitor QVD prevents caspase-3 activation/PARP cleavage by GPRC5A depletion in hypoxia.GPRC5A depletion in hypoxia induces apoptosis as determined by the violet ratiometric membrane asymmetry probe/dead cell apoptosis assay and flow cytometry"}
{"words": ["Figure", "4Hypoxia", "induced", "YAP", "stabilisation", "via", "Ser397", "dephosphorylated", "was", "abrogated", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "Hypoxia", "-", "induced", "nuclear", "localisation", "of", "YAP", "was", "attenuated", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "Hypoxia", "activated", "TEAD", "activity", "(", "8x", "GTIIC", "-", "luc", "reporter", ")", "but", "this", "was", "reduced", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "A", "representative", "triplicate", "experiment", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Hypoxia", "reduced", "LATS", "activity", "and", "expression", "but", "this", "was", "prevented", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "Constitutively", "active", "RhoA", "(", "G14V", ")", "expression", "restored", "YAP", "stabilisation", "(", "Ser397", "dephosphorylation", ")", "by", "hypoxia", "in", "GPRC5A", "depleted", "cells", ".", "The", "YAP", "/", "TEAD", "inhibitor", "verteporfin", "selectively", "inhibited", "cancer", "cell", "survival", "in", "hypoxia", "by", "crystal", "violet", "assay", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "YAP", "knockdown", "was", "sufficient", "to", "induce", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "in", "hypoxia", "and", "was", "not", "further", "enhanced", "by", "GPRC5A", "depletion", ".", "Crystal", "violet", "assays", "show", "that", "YAP", "was", "required", "downstream", "of", "GPRC5A", "to", "promote", "cell", "survival", ".", "GPRC5A", "depleted", "cells", "were", "rescued", "by", "expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "cDNA", "(", "GPRC5Asi1R", ")", "but", "this", "was", "prevented", "by", "co", "-", "depletion", "of", "YAP", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Expression", "of", "an", "siRNA", "-", "resistant", "GPRC5A", "rescued", "the", "critical", "phenotypes", "of", "GPRC5A", "depletion", ".", "GPRC5Asi1R", "expression", "prevented", "PARP", "cleavage", "in", "hypoxia", "as", "well", "as", "restoring", "hypoxia", "-", "induced", "YAP", "stabilisation", "(", "Ser397", "dephosphorylation", ")", ";", "these", "phenotypes", "were", "reversed", "by", "YAP", "depletion", ".", "GPRC5A", "depletion", "attenuated", "hypoxia", "-", "induced", "BCL", "-", "XL", "expression", ".", "Constitutively", "active", "YAP", "(", "S127A", ")", "expression", "induced", "BCL", "-", "XL", "expression", "and", "prevents", "caspase", "-", "3", "activation", "/", "PARP", "cleavage", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", ".", "GPRC5Asi1R", "expression", "restored", "BCL", "-", "XL", "expression", "and", "prevents", "the", "appearance", "of", "cleaved", "caspase", "-", "3", "induced", "by", "GPRC5A", "depletion", "in", "hypoxia", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Hypoxia induced YAP stabilisation via Ser397 dephosphorylated was abrogated in GPRC5A depleted cells.Hypoxia-induced nuclear localisation of YAP was attenuated in GPRC5A depleted cells.Hypoxia activated TEAD activity (8x GTIIC-luc reporter) but this was reduced by GPRC5A depletion. A representative triplicate experiment is shown (n=3).Hypoxia reduced LATS activity and expression but this was prevented by GPRC5A depletion.Constitutively active RhoA (G14V) expression restored YAP stabilisation (Ser397 dephosphorylation) by hypoxia in GPRC5A depleted cells.The YAP/TEAD inhibitor verteporfin selectively inhibited cancer cell survival in hypoxia by crystal violet assay (n=3 independent experiments).YAP knockdown was sufficient to induce caspase-3 activation/PARP cleavage in hypoxia and was not further enhanced by GPRC5A depletion.Crystal violet assays show that YAP was required downstream of GPRC5A to promote cell survival. GPRC5A depleted cells were rescued by expression of an siRNA-resistant GPRC5A cDNA (GPRC5Asi1R) but this was prevented by co-depletion of YAP (n=3 independent experiments).Expression of an siRNA-resistant GPRC5A rescued the critical phenotypes of GPRC5A depletion. GPRC5Asi1R expression prevented PARP cleavage in hypoxia as well as restoring hypoxia-induced YAP stabilisation (Ser397 dephosphorylation); these phenotypes were reversed by YAP depletion.GPRC5A depletion attenuated hypoxia-induced BCL-XL expression.Constitutively active YAP (S127A) expression induced BCL-XL expression and prevents caspase-3 activation/PARP cleavage by GPRC5A depletion in hypoxia.GPRC5Asi1R expression restored BCL-XL expression and prevents the appearance of cleaved caspase-3 induced by GPRC5A depletion in hypoxia."}
{"words": ["Figure", "1A", "CUEDC2protein", "levels", "in", "mouse", "tissues", ".", "Adult", "(", "12", "-", "week", "-", "old", ")", "mouse", "was", "sacrifices", "and", "total", "protein", "was", "extracted", "from", "the", "liver", ",", "kidney", ",", "lung", ",", "spleen", ",", "heart", ",", "stomach", ",", "intestine", ",", "prostate", ",", "testis", ",", "brain", ",", "and", "thymus", ".", "B", "(", "top", ")", "In", "vivo", "cardiac", "ischemia", "-", "reperfusion", "model", "protocol", "(", "30", "-", "minute", "ischemia", "followed", "by", "indicated", "times", "of", "reperfusion", ")", ".", "(", "bottom", ")", "Mice", "were", "subjected", "to", "reversible", "ischemia", "in", "vivo", "for", "30", "minutes", "and", "reperfused", "for", "different", "time", "period", ".", "Protein", "was", "extracted", "from", "the", "area", "at", "risk", "of", "heart", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "of", "CUEDC2", "and", "CUEDC1", ".", "Representative", "results", "were", "shown", "from", "2", "mice", "at", "each", "time", "point", ",", "and", "experiments", "were", "repeated", "for", "three", "times", ".", "C", "Isolated", "primary", "ratneonatal", "cardiomyocytes", "were", "treated", "to", "hypoxia", "with", "serum", "free", "-", "medium", "for", "6h", "and", "reoxygenated", "accompanying", "adding", "serum", "back", "for", "different", "time", "period", "in", "vitro", "and", "the", "protein", "level", "of", "CUEDC2", "was", "tested", "at", "different", "time", "points", "during", "reoxygenation", ".", "Each", "experiment", "was", "repeated", "for", "three", "times", ".", "D", "CUEDC2", "protein", "level", "was", "plotted", "using", "the", "immunohistochemical", "scores", "as", "described", "in", "methods", ".", "(", "left", ")", "Plot", "of", "CUEDC2", "scores", "in", "each", "BZ", "and", "DZ", "(", "n", "=", "9", "patients", ")", ".", "(", "right", ")", "Representative", "images", "from", "immunohistochemistry", "staining", "for", "CUEDC2", "in", "tissues", "from", "patients", "who", "suffered", "acute", "myocardial", "infarctions", ".", "The", "boxed", "areas", "in", "the", "left", "images", "are", "magnified", "in", "the", "middle", "and", "right", "images", ".", "DZ", ",", "distant", "zone", ";", "BZ", ",", "border", "zone", ".", "Scale", "bars", ",", "250", "μm", "(", "left", ")", ",", "50", "μm", "(", "middle", "and", "right", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A CUEDC2protein levels in mouse tissues. Adult (12-week-old) mouse was sacrifices and total protein was extracted from the liver, kidney, lung, spleen, heart, stomach, intestine, prostate, testis, brain, and thymus.B (top) In vivo cardiac ischemia-reperfusion model protocol (30-minute ischemia followed by indicated times of reperfusion). (bottom) Mice were subjected to reversible ischemia in vivo for 30 minutes and reperfused for different time period. Protein was extracted from the area at risk of heart at the indicated time points and subjected to immunoblot analysis of CUEDC2 and CUEDC1. Representative results were shown from 2 mice at each time point, and experiments were repeated for three times.C Isolated primary ratneonatal cardiomyocytes were treated to hypoxia with serum free-medium for 6h and reoxygenated accompanying adding serum back for different time period in vitro and the protein level of CUEDC2 was tested at different time points during reoxygenation. Each experiment was repeated for three times.D CUEDC2 protein level was plotted using the immunohistochemical scores as described in methods. (left) Plot of CUEDC2 scores in each BZ and DZ (n = 9 patients). (right) Representative images from immunohistochemistry staining for CUEDC2 in tissues from patients who suffered acute myocardial infarctions. The boxed areas in the left images are magnified in the middle and right images. DZ, distant zone; BZ, border zone. Scale bars, 250 μm (left), 50 μm (middle and right). * p = 0.001."}
{"words": ["Figure", "2A", "Primary", "mousecardiomyocytes", "were", "treated", "with", "H2O2", "(", "1", "mM", ")", "for", "3", "hours", "and", "cardiomyocyteviability", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "results", "of", "flow", "cytometry", "analysis", ".", "B", "Quantitative", "analysis", "of", "PI", "-", "positive", "cells", "treated", "with", "H2O2", "was", "shown", "(", "42", ".", "9", "±", "3", ".", "1", "%", "in", "wild", "-", "type", "group", "vs", ".", "10", ".", "1", "±", "4", ".", "4", "%", "in", "Cuedc2", "-", "/", "-", "group", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0004", ",", "n", "=", "5", "wells", "per", "group", "and", "repeated", "for", "three", "times", ")", ".", "C", "Mouse", "neonatal", "cardiomyocytes", "were", "subjected", "to", "hypoxia", "for", "6", "hours", "and", "then", "reoxygenation", "for", "30", "minutes", ".", "Cardiomyocytes", "were", "then", "stained", "with", "5", "μM", "CellROX", "®", "Deep", "Red", "Reagent", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "results", "of", "flow", "cytometry", "analysis", "are", "shown", ",", "and", "all", "experiments", "were", "repeated", "for", "three", "times", ".", "D", "ROS", "levels", "were", "quantitated", "and", "summarized", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0108", ",", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", "and", "repeated", "for", "three", "times", ".", "E", "HPLC", "detection", "of", "a", "superoxide", "probe", "oxidized", "dihydroethidium", "(", "DHE", ")", "product", "in", "sham", "and", "I", "/", "R", "injury", "heart", "tissue", "(", "30", "-", "min", "ischemia", "followed", "by", "30", "-", "min", "reperfusion", ")", ",", "2", "-", "hydroxyethidium", "(", "EOH", ")", ",", "a", "specific", "product", "for", "superoxide", "anion", "radical", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", ".", "F", "In", "the", "same", "samples", "of", "(", "E", ")", ",", "HPLC", "detection", "of", "ethidium", "(", "E", ")", ",", "oxidized", "by", "other", "reactive", "oxygen", "species", "such", "as", "H2O2", "(", "mainly", ")", "and", "ONOO", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Primary mousecardiomyocytes were treated with H2O2 (1 mM) for 3 hours and cardiomyocyteviability was determined by flow cytometry. Representative results of flow cytometry analysis.B Quantitative analysis of PI-positive cells treated with H2O2 was shown (42.9 ± 3.1% in wild-type group vs. 10.1 ± 4.4% in Cuedc2-/- group, * p = 0.0004, n = 5 wells per group and repeated for three times).C Mouse neonatal cardiomyocytes were subjected to hypoxia for 6 hours and then reoxygenation for 30 minutes. Cardiomyocytes were then stained with 5 μM CellROX® Deep Red Reagent and analyzed by flow cytometry. Representative results of flow cytometry analysis are shown, and all experiments were repeated for three times.D ROS levels were quantitated and summarized. * p = 0.0108, n = 3 wells per group and repeated for three times.E HPLC detection of a superoxide probe oxidized dihydroethidium (DHE) product in sham and I/R injury heart tissue (30-min ischemia followed by 30-min reperfusion), 2-hydroxyethidium (EOH), a specific product for superoxide anion radical. *p < 0.0001, n = 5 in each group.F In the same samples of (E), HPLC detection of ethidium (E), oxidized by other reactive oxygen species such as H2O2 (mainly) and ONOO. *p = 0.0001, n = 5 in each group."}
{"words": ["Figure", "3A", "Protein", "was", "extracted", "from", "the", "area", "at", "risk", "of", "left", "ventricle", "from", "wild", "-", "type", "or", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "with", "30", "-", "minute", "ischemia", "followed", "by", "30", "-", "minute", "reperfusion", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "Representative", "results", "from", "2", "mice", "are", "shown", ",", "and", "each", "experiment", "was", "repeated", "for", "three", "times", ".", "B", "Neonatal", "mousecardiomyocytes", "were", "subjected", "to", "hypoxia", "for", "6", "hours", ",", "followed", "by", "the", "indicated", "times", "of", "reoxygenation", ",", "before", "protein", "was", "extracted", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "C", "Luciferase", "assay", "of", "WT", "or", "Cuedc2", "-", "/", "-", "MEFs", "transiently", "transfected", "with", "an", "NF", "-", "κB", "-", "responsive", "luciferase", "reporter", "and", "then", ",", "1", "d", "later", ",", "treated", "for", "6", "h", "with", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ";", "TNF", ")", "or", "for", "H", "/", "R", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0032", ",", "n", "=", "3", "per", "group", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "013", ",", "n", "=", "3", "per", "group", ".", "D", "Wild", "-", "type", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "were", "treated", "with", "a", "sham", "or", "I", "/", "R", "operation", "in", "vivo", ".", "Three", "hours", "after", "the", "onset", "of", "reperfusion", ",", "the", "mRNA", "levels", "of", "tumor", "necrosis", "factor", "α", "(", "TNFα", ")", ",", "interleukin", "6", "(", "IL", "-", "6", ")", "and", "interleukin", "23", "(", "IL", "-", "23", ")", "were", "tested", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "3", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Protein was extracted from the area at risk of left ventricle from wild-type or Cuedc2-/- mice with 30-minute ischemia followed by 30-minute reperfusion and subjected to immunoblot analysis. Representative results from 2 mice are shown, and each experiment was repeated for three times.B Neonatal mousecardiomyocytes were subjected to hypoxia for 6 hours, followed by the indicated times of reoxygenation, before protein was extracted and subjected to immunoblot analysis.C Luciferase assay of WT or Cuedc2-/- MEFs transiently transfected with an NF-κB-responsive luciferase reporter and then, 1 d later, treated for 6 h with TNF (10 ng/ml; TNF) or for H/R. * p = 0.0032, n = 3 per group, ** p = 0.013, n = 3 per group.D Wild-type and Cuedc2-/- mice were treated with a sham or I/R operation in vivo. Three hours after the onset of reperfusion, the mRNA levels of tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin 6 (IL-6) and interleukin 23 (IL-23) were tested. * p = 0.0005, ** p = 0.0001, n = 3 per group."}
{"words": ["Figure", "4A", "Protein", "was", "extracted", "from", "the", "left", "ventricle", "of", "wild", "-", "type", "or", "Cuedc2", "-", "/", "-", "adult", "mice", "(", "12", "week", "-", "old", ")", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "(", "3", "mice", "per", "group", ")", ".", "B", "Wild", "-", "type", "or", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "were", "subjected", "to", "a", "heart", "ischemia", "for", "30", "-", "minute", "in", "vivo", ",", "followed", "by", "reperfusion", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Protein", "was", "extracted", "from", "the", "area", "at", "risk", "of", "left", "ventricle", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "C", "GPX1", "protein", "level", "was", "plotted", "using", "the", "immunohistochemical", "scores", "as", "described", "in", "methods", ".", "(", "left", ")", "representative", "images", "from", "immunohistochemistry", "staining", "for", "GPX1", "in", "tissues", "from", "patients", "who", "suffered", "acute", "myocardial", "infarctions", ".", "(", "right", ")", "plot", "of", "GPX1", "scores", "in", "each", "BZ", "and", "DZ", "(", "n", "=", "9", "patients", ")", ".", "DZ", ",", "distant", "area", ";", "BZ", ",", "border", "zone", ".", "Scale", "bars", ",", "250", "μm", "(", "left", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0039", ".", "D", "Primary", "neonatal", "mousecardiomyocytes", "stably", "expressing", "control", "or", "GPX1", "shRNA", "by", "lentivirus", "infection", "were", "treated", "with", "H2O2", "(", "1", "mM", ")", "for", "3", "hours", ".", "Cell", "viability", "was", "detected", "by", "FACS", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0275", ",", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "E", "Primary", "neonatal", "mousecardiomyocytes", "were", "transfected", "with", "lentivirus", "carrying", "control", "or", "GPX1", "shRNA", ",", "and", "the", "efficiency", "of", "GPX1", "knockdown", "was", "tested", "by", "immunoblotting", ".", "F", "Primary", "neonatal", "mousecardiomyocytes", "stably", "expressing", "control", "or", "GPX1", "shRNA", "by", "lentivirus", "infection", "were", "subjected", "to", "H2O2", "(", "1", "mM", ")", "for", "30", "minutes", "and", "then", "stained", "with", "5", "μM", "CellROX", "®", "Deep", "Red", "Reagent", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0056", ";", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0218", ",", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ",", "n", "=", "3", "wells", "per", "group", ".", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Protein was extracted from the left ventricle of wild-type or Cuedc2-/- adult mice (12 week-old) and subjected to immunoblot analysis (3 mice per group).B Wild-type or Cuedc2-/- mice were subjected to a heart ischemia for 30-minute in vivo, followed by reperfusion for the indicated times. Protein was extracted from the area at risk of left ventricle and subjected to immunoblot analysis.C GPX1 protein level was plotted using the immunohistochemical scores as described in methods. (left) representative images from immunohistochemistry staining for GPX1 in tissues from patients who suffered acute myocardial infarctions. (right) plot of GPX1 scores in each BZ and DZ (n = 9 patients). DZ, distant area; BZ, border zone. Scale bars, 250 μm (left). * p = 0.0039.D Primary neonatal mousecardiomyocytes stably expressing control or GPX1 shRNA by lentivirus infection were treated with H2O2 (1 mM) for 3 hours. Cell viability was detected by FACS. * p = 0.0001; ** p = 0.0275, n = 3 wells per group. NS, not significant.E Primary neonatal mousecardiomyocytes were transfected with lentivirus carrying control or GPX1 shRNA, and the efficiency of GPX1 knockdown was tested by immunoblotting.F Primary neonatal mousecardiomyocytes stably expressing control or GPX1 shRNA by lentivirus infection were subjected to H2O2 (1 mM) for 30 minutes and then stained with 5 μM CellROX® Deep Red Reagent and analyzed by flow cytometry. * p = 0.0056; ** p = 0.0218, n = 3 wells per group, n = 3 wells per group. NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "5A", "Lysates", "from", "MEF", "-", "WT", "or", "MEF", "-", "Cuedc2", "-", "/", "-", "cells", "treated", "with", "20μM", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "the", "indicated", "times", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "left", ")", ".", "Relative", "GPX1", "levels", "were", "quantified", "by", "densitometry", "(", "right", ")", ".", "B", "MEF", "-", "Cuedc2", "-", "/", "-", "cells", "were", "transfected", "with", "increasing", "amounts", "of", "FLAG", "-", "CUEDC2", "(", "mouse", ")", "plasmids", "(", "1", "μg", "and", "2", "μg", ")", ".", "At", "24", "hours", "after", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG", "-", "132", "(", "10", "μM", ")", ".", "Cells", "were", "cultured", "for", "additional", "6", "hours", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "C", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "FLAG", "-", "GPX1", ",", "HA", "-", "CUEDC2", ",", "and", "Myc", "-", "ubiquitin", "plasmids", "as", "indicated", "and", "treated", "with", "MG", "-", "132", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hours", "before", "harvest", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "FLAG", "(", "M2", ")", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "an", "anti", "-", "GPX1", "antibody", ".", "Whole", "-", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "analyzed", "by", "Western", "blots", "with", "anti", "-", "FLAG", "or", "anti", "-", "HA", "antibody", "to", "determine", "the", "protein", "of", "Flag", "-", "GPX1", "and", "HA", "-", "CUEDC2", ".", "D", "The", "heart", "tissue", "lysates", "from", "wide", "-", "type", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "were", "incubated", "with", "IgG", "or", "anti", "-", "GPX1", "antibody", ",", "and", "then", "captured", "on", "protein", "G", "-", "Sepharose", "beads", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "an", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", ".", "E", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "Flag", "-", "CUEDC2", "or", "Flag", "-", "CUEDC2", "△", "CUE", "(", "deletion", "of", "the", "CUE", "domain", "of", "CUEDC2", ")", ",", "and", "treated", "with", "MG", "-", "132", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hours", "before", "harvest", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Flag", "(", "M2", ")", ".", "The", "immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "using", "an", "anti", "-", "GPX1", "antibody", ".", "Whole", "-", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "analyzed", "by", "Western", "blots", "with", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "GPX1", "antibody", "to", "determine", "the", "protein", "of", "Flag", "-", "CUEDC2", "and", "GPX1", ".", "v", ":", "vector", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Lysates from MEF-WT or MEF-Cuedc2-/- cells treated with 20μM cycloheximide (CHX) for the indicated times were subjected to immunoblotting (left). Relative GPX1 levels were quantified by densitometry (right).B MEF-Cuedc2-/- cells were transfected with increasing amounts of FLAG-CUEDC2 (mouse) plasmids (1 μg and 2 μg). At 24 hours after transfection, the cells were treated with the proteasome inhibitor MG-132 (10 μM). Cells were cultured for additional 6 hours and subjected to immunoblotting.C HEK293T cells were transfected with the FLAG-GPX1, HA-CUEDC2, and Myc-ubiquitin plasmids as indicated and treated with MG-132 (10 µM) for 6 hours before harvest. Cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-FLAG (M2). The immunoprecipitates were analyzed by western blot using an anti-GPX1 antibody. Whole-cell lysates (WCL) were analyzed by Western blots with anti-FLAG or anti-HA antibody to determine the protein of Flag-GPX1 and HA-CUEDC2.D The heart tissue lysates from wide-type and Cuedc2-/- mice were incubated with IgG or anti-GPX1 antibody, and then captured on protein G-Sepharose beads. The immunoprecipitates were analyzed by immunoblotting with an anti-ubiquitin antibody.E HEK293T cells were transfected with the Flag-CUEDC2 or Flag-CUEDC2△CUE (deletion of the CUE domain of CUEDC2), and treated with MG-132 (10 µM) for 6 hours before harvest. Cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Flag (M2). The immunoprecipitates were analyzed by western blot using an anti-GPX1 antibody. Whole-cell lysates (WCL) were analyzed by Western blots with anti-Flag or anti-GPX1 antibody to determine the protein of Flag-CUEDC2 and GPX1. v: vector."}
{"words": ["Figure", "6A", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "increasing", "amounts", "of", "Flag", "-", "TRIM33", "expression", "vectors", "and", "48", "hours", "after", "transfection", ",", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "using", "antibodies", "as", "indicated", ".", "B", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "increasing", "amounts", "of", "Flag", "-", "FBXW7", "expression", "vectors", "and", "48", "hours", "after", "transfection", ",", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "IB", ")", ".", "C", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "as", "indicated", ",", "at", "18", "h", "after", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "(", "20μM", ")", "for", "6", "hours", "and", "then", "harvested", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "by", "Flag", "-", "antibody", "(", "M2", "beads", ")", "and", "Ubiquitin", "-", "conjugated", "GPX1", "was", "detected", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "Myc", "antibody", ".", "D", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "control", "or", "CUEDC2", "siRNA", "and", "increasing", "amounts", "of", "Flag", "-", "TRIM33", "expression", "vectors", ",", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "using", "antibodies", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A HEK293 cells were transfected with increasing amounts of Flag-TRIM33 expression vectors and 48 hours after transfection, cell lysates were subjected to immunoblotting (IB) using antibodies as indicated.B HEK293 cells were transfected with increasing amounts of Flag-FBXW7 expression vectors and 48 hours after transfection, cell lysates were subjected to immunoblotting (IB).C HEK293T cells were transfected as indicated, at 18 h after transfection, the cells were treated with the proteasome inhibitor MG132 (20μM) for 6 hours and then harvested. Cell lysates were immunoprecipitated by Flag-antibody (M2 beads) and Ubiquitin-conjugated GPX1 was detected by Western blotting with anti-Myc antibody.D HEK293 cells were transfected with either control or CUEDC2 siRNA and increasing amounts of Flag-TRIM33 expression vectors, cell lysates were subjected to immunoblotting (IB) using antibodies as indicated."}
{"words": ["Figure", "7A", "CUEDC2", "ablation", "reduced", "I", "/", "R", "injury", ",", "which", "was", "induced", "by", "30", "minutes", "of", "ischemia", "followed", "by", "24", "hours", "reperfusion", ".", "AAR", ",", "area", "at", "risk", ";", "LV", ",", "left", "ventricular", "area", ",", "IRI", ",", "area", "of", "I", "/", "R", "injury", ".", "The", "ratios", "of", "AAR", "to", "LV", ",", "IRI", "to", "AAR", "and", "IRI", "to", "LV", "are", "shown", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "compared", "with", "WT", ",", "n", "=", "15", "mice", "per", "group", ".", "(", "top", "panel", ")", "Representative", "cross", "-", "sectional", "slices", "derived", "from", "the", "hearts", "stained", "by", "TTC", ".", "Area", "of", "I", "/", "R", "injury", "is", "indicated", "in", "light", "pink", ".", "B", "Representative", "images", "of", "ventricular", "myocardium", "sections", "from", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "exposed", "to", "sham", "operation", "or", "I", "/", "R", "injury", "(", "2", "hours", "after", "the", "onset", "of", "reperfusion", "following", "30", "-", "min", "ischemia", ")", ".", "Green", ",", "TUNEL", "-", "positive", "myocytenuclei", ";", "red", ",", "Troponin", "I", "-", "stained", "cardiomyocytes", ";", "blue", ",", "DAPI", "-", "stained", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "C", "Quantitative", "analysis", "of", "apoptosis", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ".", "D", "SerumLDH", "levels", "in", "sham", "-", "operated", "mice", "or", "those", "subjected", "to", "ischemia", "and", "a", "4", "-", "hour", "reperfusion", ".", "Data", "from", "3", "separate", "experiments", "was", "analyzed", "by", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "13", "mice", "per", "group", ".", "E", "Echocardiography", "analysis", "of", "left", "ventricular", "dimensions", "and", "cardiac", "function", "at", "1", "week", "post", "-", "I", "/", "R", "in", "mice", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "15", "mice", "in", "the", "sham", "-", "operated", "group", "and", "n", "=", "10", "mice", "in", "the", "I", "/", "R", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A CUEDC2 ablation reduced I/R injury, which was induced by 30 minutes of ischemia followed by 24 hours reperfusion. AAR, area at risk; LV, left ventricular area, IRI, area of I/R injury. The ratios of AAR to LV, IRI to AAR and IRI to LV are shown. * p < 0.0001 compared with WT, n = 15 mice per group. (top panel) Representative cross-sectional slices derived from the hearts stained by TTC. Area of I/R injury is indicated in light pink.B Representative images of ventricular myocardium sections from WT and Cuedc2-/- mice exposed to sham operation or I/R injury (2 hours after the onset of reperfusion following 30-min ischemia). Green, TUNEL-positive myocytenuclei; red, Troponin I-stained cardiomyocytes; blue, DAPI-stained nuclei. Scale bar, 50 μm.C Quantitative analysis of apoptosis. * p < 0.0001, n = 8 mice per group.D SerumLDH levels in sham-operated mice or those subjected to ischemia and a 4-hour reperfusion. Data from 3 separate experiments was analyzed by one-way analysis of variance. * p < 0.0001, n = 13 mice per group.E Echocardiography analysis of left ventricular dimensions and cardiac function at 1 week post-I/R in mice. ** p < 0.0001, n = 15 mice in the sham-operated group and n = 10 mice in the I/R group."}
{"words": ["Figure", "8A", "Immunoblotting", "for", "CUEDC2", "protein", "level", ".", "4", "weeks", "after", "tail", "-", "vein", "injection", "of", "rAAV9", "-", "CUEDC2", ",", "indicated", "mice", "tissues", "were", "harvested", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "to", "detect", "CUEDC2", "protein", "level", ".", "Ctl", ":", "heart", "of", "rAAV9", "-", "GFP", "injected", "mice", ".", "B", "Animals", "were", "injected", "by", "rAAV9", "-", "CUEDC2", "in", "a", "different", "amount", "of", "viral", "genomes", "(", "VG", ")", ".", "Heart", "tissues", "were", "then", "analyzed", "by", "immunoblotting", "to", "detect", "CUEDC2", "transduction", ".", "Tubulin", "protein", "level", "was", "examined", "for", "normalization", "purposes", ".", "C", "The", "ratios", "of", "AAR", "to", "LV", ",", "IRI", "to", "AAR", "and", "IRI", "to", "LV", "are", "shown", ".", "n", "=", "10", "mice", "in", "WT", "+", "rAAV", "-", "GFP", "group", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "GFP", "group", ";", "n", "=", "12", "mice", "in", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "CUEDC2", "(", "1", "×", "1010", "VG", ")", "group", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "CUEDC2", "(", "1", "×", "1011", "VG", ")", "group", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0055", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0146", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0200", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0377", ".", "D", "Effect", "of", "rAAV9", "-", "CUEDC2", "treatment", "on", "echocardiography", "indices", "of", "left", "ventricle", "function", "recovery", "post", "-", "I", "/", "R", "measured", "by", "fractional", "shortening", "(", "FS", ")", "and", "ejection", "fraction", "(", "EF", ")", ".", "WT", "+", "rAAV", "-", "GFP", "(", "n", "=", "10", ")", ";", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "GFP", "(", "n", "=", "10", ")", ";", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "CUEDC2", "(", "Low", "dose", ")", "(", "n", "=", "12", ")", ";", "Cuedc2", "-", "/", "-", "+", "rAAV", "-", "CUEDC2", "(", "High", "dose", ")", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Immunoblotting for CUEDC2 protein level. 4 weeks after tail-vein injection of rAAV9-CUEDC2, indicated mice tissues were harvested and subjected to immunoblotting to detect CUEDC2 protein level. Ctl: heart of rAAV9-GFP injected mice.B Animals were injected by rAAV9-CUEDC2 in a different amount of viral genomes (VG). Heart tissues were then analyzed by immunoblotting to detect CUEDC2 transduction. Tubulin protein level was examined for normalization purposes.C The ratios of AAR to LV, IRI to AAR and IRI to LV are shown. n = 10 mice in WT + rAAV-GFP group and Cuedc2-/- + rAAV-GFP group; n = 12 mice in Cuedc2-/- + rAAV-CUEDC2 (1×1010 VG) group and Cuedc2-/- + rAAV-CUEDC2 (1×1011 VG) group. * p = 0.0055, ** p = 0.0146, *** p = 0.0200, **** p = 0.0377.D Effect of rAAV9-CUEDC2 treatment on echocardiography indices of left ventricle function recovery post-I/R measured by fractional shortening (FS) and ejection fraction (EF). WT+ rAAV-GFP (n = 10); Cuedc2-/- + rAAV-GFP (n = 10); Cuedc2-/- + rAAV-CUEDC2 (Low dose) (n = 12); Cuedc2-/- + rAAV-CUEDC2 (High dose) (n = 12). ** p < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "9A", "HPLC", "detection", "of", "a", "superoxide", "probe", "oxidized", "dihydroethidium", "(", "DHE", ")", "product", "in", "young", "(", "8", "-", "week", "-", "old", ")", "and", "old", "mouse", "(", "20", "-", "month", "-", "old", ")", "heart", "tissue", ",", "2", "-", "hydroxyethidium", "(", "EOH", ")", ",", "a", "specific", "product", "for", "superoxide", "anion", "radical", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0087", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", ".", "B", "HPLC", "detection", "of", "ethidium", "(", "E", ")", ",", "oxidized", "by", "other", "reactive", "oxygen", "species", "such", "as", "H2O2", "(", "mainly", ")", "and", "ONOO", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0021", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", ".", "C", "Comparison", "of", "8", "-", "hydroxy", "-", "2", "'", "-", "deoxyguanosine", "(", "8", "-", "OHdG", ")", "in", "young", "and", "old", "mice", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0164", ",", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "D", "Comparison", "of", "heart", "weight", "/", "body", "weight", "(", "HW", "/", "BW", ")", "in", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "036", ",", "n", "=", "15", "in", "young", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ",", "n", "=", "10", "in", "old", "WT", "mice", "and", "n", "=", "12", "in", "old", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ".", "E", "Comparison", "of", "the", "left", "ventricle", "function", "in", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", "by", "transthoracic", "echocardiography", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0384", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0389", ".", "n", "=", "15", "in", "young", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ",", "n", "=", "10", "in", "old", "WT", "mice", "and", "n", "=", "12", "in", "old", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ".", "F", "Left", "ventriclecardiomyocytes", "apoptosis", "was", "tested", "by", "TUNEL", "staining", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0017", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", ".", "G", "Left", "ventricle", "myocardial", "fibrosis", "was", "tested", "by", "Masson", "staining", "in", "WT", "and", "Cuedc2", "-", "/", "-", "mice", ".", "The", "represent", "results", "were", "shown", "in", "(", "G", ")", "and", "the", "quantitative", "analysis", "of", "myocardial", "fibrosis", "was", "shown", "in", "(", "H", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0177", ",", "n", "=", "5", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A HPLC detection of a superoxide probe oxidized dihydroethidium (DHE) product in young (8-week-old) and old mouse (20-month-old) heart tissue, 2-hydroxyethidium (EOH), a specific product for superoxide anion radical. * p = 0.0087, n = 5 in each group.B HPLC detection of ethidium (E), oxidized by other reactive oxygen species such as H2O2 (mainly) and ONOO. * p = 0.0021, n = 5 in each group.C Comparison of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) in young and old mice. * p = 0.0164, n = 6 mice per group.D Comparison of heart weight / body weight (HW/BW) in WT and Cuedc2-/- mice. ** p = 0.036, n = 15 in young WT and Cuedc2-/- mice, n = 10 in old WT mice and n = 12 in old Cuedc2-/- mice.E Comparison of the left ventricle function in WT and Cuedc2-/- mice by transthoracic echocardiography. *p = 0.0384, **p = 0.0389. n = 15 in young WT and Cuedc2-/- mice, n = 10 in old WT mice and n = 12 in old Cuedc2-/- mice.F Left ventriclecardiomyocytes apoptosis was tested by TUNEL staining. *p = 0.0017, n = 5 in each group.G Left ventricle myocardial fibrosis was tested by Masson staining in WT and Cuedc2-/- mice. The represent results were shown in (G) and the quantitative analysis of myocardial fibrosis was shown in (H). *p = 0.0177, n = 5 in each group."}
{"words": ["Figure", "1Volcano", "plot", "representation", "of", "AFG3L2E408Q", "-", "FLAG", "interaction", "partners", ".", "Mitochondria", "isolated", "from", "Flp", "-", "In", "HEK293T", "-", "REx", "cells", "expressing", "AFG3L2E408Q", "-", "FLAG", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", ".", "Co", "-", "purifying", "proteins", "were", "identified", "by", "quantitative", "mass", "spectrometry", "(", "MS", ")", "(", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ")", "followed", "by", "an", "unpaired", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "and", "permutation", "-", "based", "FDR", "estimation", "to", "correct", "for", "multiple", "testing", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ".", "Significantly", "enriched", "MitoCarta", "3", ".", "0", "proteins", "are", "colored", "in", "red", ",", "gene", "names", "indicate", "previously", "verified", "AFG3L2", "interactors", "and", "TMBIM5", "(", "GHITM", ",", "MICS1", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "HeLa", "wildtype", "(", "WT", ")", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TMBIM5", "and", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "16", "h", ".", "Control", "(", "0", ".", "1", "%", "DMSO", ")", ",", "actinomycin", "D", "(", "1", "µM", ")", ",", "venetoclax", "(", "1", "µM", ")", ",", "A", "-", "1155463", "(", "1", "µM", ")", ",", "staurosporine", "(", "1", "µM", ")", ",", "thapsigargin", "(", "2", "µM", ")", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "HeLa", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "or", "siRNA", "targeting", "MCU", "for", "72", "h", ".", "Where", "indicated", "samples", "were", "treated", "with", "staurosporine", "(", "STS", ";", "1", "µM", ")", "for", "16", "h", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Viability", "of", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "cells", "(", "depleted", "of", "MCU", "when", "indicated", ")", "after", "incubation", "with", "staurosporine", "(", "STS", ";", "0", ".", "1", "µM", ")", "for", "16", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "assessed", "cytofluorimetrically", "monitoring", "NucView488", "and", "RedDot2", "staining", "and", "expressed", "as", "percentage", "of", "all", "cells", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ";", "mean", "±", "SD", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", ".", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "and", "siRNA", "targeting", "MCU", "for", "48", "h", "and", "incubated", "with", "staurosporine", "(", "0", ".", "1", "µM", ")", "for", "16", "h", "in", "the", "presence", "of", "Z", "-", "VAD", "-", "FMK", "(", "50", "µM", ")", "and", "epoxomicin", "(", "1", "µM", ")", "to", "prevent", "apoptosis", ".", "Cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "directed", "against", "cytochrome", "c", "(", "green", ")", "and", "TOMM20", "(", "magenta", ")", ".", "*", "Cells", "with", "cytosolic", "cytochrome", "c", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "number", "of", "cells", ">", "150", "each", "experiment", ")", ".", "Calcium", "retention", "capacity", "(", "CRC", ")", "was", "assessed", "in", "isolated", "mitochondria", "of", "HEK293T", "WT", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "in", "sucrose", "-", "based", "medium", "containing", "respiratory", "substrates", "and", "the", "membrane", "-", "impermeable", "Ca2", "+", "sensor", "Ca2", "+", "Green", "-", "5N", ".", "Ca2", "+", "Green", "-", "5N", "fluorescence", "was", "monitored", "following", "repeated", "addition", "of", "Ca2", "+", "pulses", "(", "10", "µM", ")", ".", "Data", "show", "representative", "traces", "(", "2", "independent", "experiments", "run", "in", "triplicate", "each", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Volcano plot representation of AFG3L2E408Q-FLAG interaction partners. Mitochondria isolated from Flp-In HEK293T-REx cells expressing AFG3L2E408Q-FLAG were subjected to immunoprecipitation. Co-purifying proteins were identified by quantitative mass spectrometry (MS) (n=5 independent experiments) followed by an unpaired two-sided t-test and permutation-based FDR estimation to correct for multiple testing (FDR<0.05. Significantly enriched MitoCarta 3.0 proteins are colored in red, gene names indicate previously verified AFG3L2 interactors and TMBIM5 (GHITM, MICS1).Representative immunoblot of HeLa wildtype (WT) cells transfected with scrambled siRNA (control) or siRNA targeting TMBIM5 and treated with the indicated drugs for 16 h. Control (0.1% DMSO), actinomycin D (1 µM), venetoclax (1 µM), A-1155463 (1 µM), staurosporine (1 µM), thapsigargin (2 µM). n=3 independent experiments.Representative immunoblot of HeLa WT and TMBIM5-/- cells transfected with scrambled siRNA (control) or siRNA targeting MCU for 72 h. Where indicated samples were treated with staurosporine (STS; 1 µM) for 16 h. (n=3 independent experiments).Viability of WT and TMBIM5-/- cells (depleted of MCU when indicated) after incubation with staurosporine (STS; 0.1 µM) for 16 h. Cell viability was assessed cytofluorimetrically monitoring NucView488 and RedDot2 staining and expressed as percentage of all cells. n=3 independent experiments; two-tailed t-test; mean ±SD. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.WT and TMBIM5-/- HeLa cells were transfected with the indicated scrambled siRNA (control) and siRNA targeting MCU for 48 h and incubated with staurosporine (0.1 µM) for 16 h in the presence of Z-VAD-FMK (50 µM) and epoxomicin (1 µM) to prevent apoptosis. Cells were subjected to immunofluorescence analysis with antibodies directed against cytochrome c (green) and TOMM20 (magenta). *Cells with cytosolic cytochrome c. (n=3 independent experiments; number of cells > 150 each experiment).Calcium retention capacity (CRC) was assessed in isolated mitochondria of HEK293T WT cells transfected with the indicated siRNA. The experiment was performed in sucrose-based medium containing respiratory substrates and the membrane-impermeable Ca2+ sensor Ca2+ Green-5N. Ca2+ Green-5N fluorescence was monitored following repeated addition of Ca2+ pulses (10 µM). Data show representative traces (2 independent experiments run in triplicate each condition)."}
{"words": ["Figure", "2Fluorescence", "(", "F", ")", "F", "/", "F0", "ratio", "quantifications", ",", "where", "F0", "is", "the", "average", "of", "the", "first", "ten", "seconds", "and", "F", "is", "the", "fluorescence", "peak", "measured", "after", "thapsigargin", "(", "2", "µM", ")", "administration", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "right", "shows", "mtRED", "-", "GECO", "ratio", "traces", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "and", "siRNA", "targeting", "TMBIM5", ".", "Each", "measurement", "was", "performed", "in", "at", "least", "10", "cells", "from", "6", "different", "preparations", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", ".", "Matrix", "pH", "was", "measured", "with", "Sypher3smito", "in", "wildtye", "(", "WT", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "or", "siRNA", "targeting", "TMBIM5", "for", "72", "h", ".", "The", "probe", "was", "calibrated", "in", "KRB", "buffer", "by", "the", "stepwise", "addition", "/", "removal", "of", "permeant", "weak", "acid", ".", "Each", "measurement", "was", "performed", "in", "at", "least", "80", "cells", "from", "7", "different", "preparations", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", ".", "Mitochondrial", "membrane", "potential", "was", "monitored", "with", "TMRM", "in", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", ".", "Fluorescent", "intensity", "was", "calculated", "as", "ratio", "to", "the", "value", "upon", "CCCP", "addition", "(", "15", "µM", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "relative", "to", "control", ".", "Each", "measurement", "was", "performed", "in", "triplicate", "from", "4", "different", "preparations", ".", "Matrix", "pH", "was", "measured", "with", "Sypher3smito", "in", "WT", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "TMBIM5", "or", "TMBIM5D294K", "D325K", "for", "24", "h", ".", "The", "ratio", "of", "absorbance", "at", "488", "nm", "and", "405", "nm", "is", "shown", "in", "arbitrary", "units", "(", "a", ".", "u", ".", ")", ".", "Each", "measurement", "was", "performed", "in", "at", "least", "20", "cells", "from", "3", "different", "preparations", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "WT", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "TMBIM5", "or", "TMBIM5D294K", "D325K", "for", "24", "h", "(", "right", "panel", ")", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", ".", "Liposome", "assay", ".", "Recombinant", "TMBIM5", "was", "reconstituted", "in", "liposomes", "containing", "100", "µM", "Fura", "-", "2", ".", "CaCl2", "was", "added", "later", "at", "the", "concentration", "of", "100", "µM", ".", "Rmax", "was", "obtained", "at", "the", "end", "of", "the", "experiment", "after", "the", "addition", "of", "ionomycin", "(", "10", "µM", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "of", "R", "/", "Rmax", ",", "where", "R", "is", "the", "peak", "after", "CaCl2", "addition", ".", "Where", "indicated", "GdCl3", "(", "100", "µM", ")", "was", "added", "10", "min", "before", "the", "experiment", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "shown", "as", "black", ",", "white", "and", "grey", "dots", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", ".", "Liposome", "assay", "(", "as", "in", "E", ")", ".", "Slope", "was", "calculated", "in", "the", "100", "s", "after", "100", "µM", "CaCl2", "addition", "as", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "shown", "as", "black", ",", "white", "and", "grey", "dots", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "A", "p", "-", "value", "of", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "statistically", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Fluorescence (F) F/F0 ratio quantifications, where F0 is the average of the first ten seconds and F is the fluorescence peak measured after thapsigargin (2 µM) administration (left panel). The right shows mtRED-GECO ratio traces of HeLa cells transfected with scrambled siRNA (control) and siRNA targeting TMBIM5. Each measurement was performed in at least 10 cells from 6 different preparations. Mean ±SD; two-tailed t-test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.Matrix pH was measured with Sypher3smito in wildtye (WT) HeLa cells transfected with scrambled siRNA (control) or siRNA targeting TMBIM5 for 72 h. The probe was calibrated in KRB buffer by the stepwise addition/removal of permeant weak acid. Each measurement was performed in at least 80 cells from 7 different preparations. Mean ±SD; two-tailed t-test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.Mitochondrial membrane potential was monitored with TMRM in WT and TMBIM5-/- HeLa cells. Fluorescent intensity was calculated as ratio to the value upon CCCP addition (15 µM). Values are expressed as mean ±SD relative to control. Each measurement was performed in triplicate from 4 different preparations.Matrix pH was measured with Sypher3smito in WT HeLa cells transiently expressing TMBIM5 or TMBIM5D294K D325K for 24 h. The ratio of absorbance at 488 nm and 405 nm is shown in arbitrary units (a.u.). Each measurement was performed in at least 20 cells from 3 different preparations. Representative immunoblot of WT HeLa cells transfected with TMBIM5 or TMBIM5D294K D325K for 24 h (right panel). Mean ±SD; two-tailed t-test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.Liposome assay. Recombinant TMBIM5 was reconstituted in liposomes containing 100 µM Fura-2. CaCl2 was added later at the concentration of 100 µM. Rmax was obtained at the end of the experiment after the addition of ionomycin (10 µM). Data are expressed as mean of R/Rmax, where R is the peak after CaCl2 addition. Where indicated GdCl3 (100 µM) was added 10 min before the experiment. n=3 independent experiments, shown as black, white and grey dots. Mean ±SD; two-tailed t-test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant. Liposome assay (as in E). Slope was calculated in the 100 s after 100 µM CaCl2 addition as expressed as mean ±SD. n=3 independent experiments, shown as black, white and grey dots. Two-tailed t-test. A p-value of <0.05 was considered statistically significant."}
{"words": ["Figure", "5Alterations", "in", "mitochondrial", "proteome", "in", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", "upon", "depletion", "of", "AFG3L2", ".", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "or", "siRNA", "targeting", "AFG3L2", "for", "48", "h", ".", "Proteins", ",", "which", "were", "downregulated", "in", "the", "absence", "of", "TMBIM5", "and", "whose", "steady", "state", "levels", "was", "altered", "upon", "depletion", "of", "AFG3L2", ",", "were", "identified", "using", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "An", "interaction", "p", "-", "value", "of", "0", ".", "01", "was", "used", "as", "a", "cutoff", ".", "Log2", "-", "transformed", "LFQ", "intensities", "of", "MitoCarta", "3", ".", "0", "proteins", "were", "Z", "-", "Score", "normalized", "and", "visualized", "in", "a", "hierarchical", "cluster", "analysis", "(", "Euclidean", "distance", ",", "complete", "method", ")", ".", "The", "dendrogram", "is", "omitted", ".", "Proteins", "accumulating", "upon", "depletion", "of", "AFG3L2", "(", "cluster", "1", ",", "C1", ")", "and", "proteins", "whose", "steady", "state", "levels", "are", "decreased", "upon", "depletion", "of", "AFG3L2", "(", "cluster", "2", ",", "C2", ")", "are", "shown", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "TMBIM5", "-", "/", "-", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "or", "siRNA", "targeting", "AFG3L2", "for", "48", "h", ".", "Samples", "were", "treated", "with", "the", "protein", "synthesis", "inhibitor", "cycloheximide", "(", "CHX", ";", "10", "μg", "/", "ml", ")", "and", "collected", "at", "the", "indicated", "time", "points", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Alterations in mitochondrial proteome in WT and TMBIM5-/- HeLa cells upon depletion of AFG3L2. WT and TMBIM5-/- HeLa cells were transfected with scrambled siRNA (control) or siRNA targeting AFG3L2 for 48 h. Proteins, which were downregulated in the absence of TMBIM5 and whose steady state levels was altered upon depletion of AFG3L2, were identified using a two-way ANOVA. An interaction p-value of 0.01 was used as a cutoff. Log2-transformed LFQ intensities of MitoCarta 3.0 proteins were Z-Score normalized and visualized in a hierarchical cluster analysis (Euclidean distance, complete method). The dendrogram is omitted. Proteins accumulating upon depletion of AFG3L2 (cluster 1, C1) and proteins whose steady state levels are decreased upon depletion of AFG3L2 (cluster 2, C2) are shown.Representative immunoblot of TMBIM5-/- HeLa cells transfected with scrambled siRNA (control) or siRNA targeting AFG3L2 for 48 h. Samples were treated with the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX; 10 μg/ml) and collected at the indicated time points (n=3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "6Volcano", "plot", "of", "mitochondrial", "protein", "(", "MitoCarta", "3", ".", "0", ")", "changes", "in", "WT", "HeLa", "cells", "treated", "with", "oligomycin", "(", "10", "μM", "for", "16", "h", ")", "when", "compared", "to", "untreated", "cells", ".", "Before", "MitoCarta", "3", ".", "0", "-", "filtering", ",", "significantly", "altered", "proteins", "were", "identified", "using", "a", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "followed", "by", "permutation", "-", "based", "FDR", "estimation", "to", "0", ".", "05", "and", "are", "colored", "in", "blue", "(", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "WT", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "16", "h", ".", "Antimycin", "A", "(", "AA", ";", "10", "μM", ")", ",", "piericidin", "A", "(", "10", "μM", ")", "and", "oligomycin", "(", "10", "μM", ")", ".", "Representative", "immunoblot", "of", "WT", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "(", "control", ")", "and", "siRNA", "targeting", "AFG3L2", "for", "48", "h", ",", "treated", "when", "indicated", "with", "oligomycin", "(", "10", "μM", ")", "for", "16", "h", ".", "Quantification", "of", "TMBIM5", "levels", "is", "shown", "on", "the", "right", "panel", ".", "TMBIM5", "levels", "in", "untreated", "WT", "cells", "was", "set", "to", "1", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "mean", "±", "SD", ")", ".", "TMBIM5", "abundance", "determined", "by", "mass", "spectrometry", "in", "WT", "HeLa", "cells", "treated", "with", "oligomycin", "(", "10", "µM", ";", "16", "h", ")", "and", "depleted", "of", "AFG3L2", "when", "indicated", ".", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "using", "a", "two", "-", "sided", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "The", "central", "band", "of", "each", "box", "is", "the", "median", "value", ",", "and", "the", "box", "defines", "the", "25th", "(", "lower", ")", "and", "75th", "(", "higher", ")", "quantile", ".", "The", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", "in", "the", "data", "excluding", "outliers", "(", "greater", "than", "1", ".", "5", "*", "inter", "quantile", "range", "distance", "to", "median", "-", "no", "outliers", "found", "here", ")", ".", "Zoom", "in", "to", "selected", "clusters", "of", "hierarchical", "clustering", "of", "Z", "-", "Score", "normalized", "log2", "LFQ", "intensities", ".", "Proteins", "that", "were", "significantly", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ")", "accumulated", "between", "HeLa", "WT", "and", "TMBIM5", "-", "/", "-", "cells", "after", "oligomycin", "treatment", "(", "10", "µM", ")", "for", "16", "h", "were", "clustered", "using", "Euclidean", "distance", "and", "the", "complete", "method", "on", "protein", "features", ".", "The", "figure", "shows", "identified", "cluster", "C4", "and", "C5", "with", "gene", "names", "and", "MitoCarta", "3", ".", "0", "localization", "annotations", ".", "The", "row", "dendrogram", "is", "omitted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Volcano plot of mitochondrial protein (MitoCarta 3.0) changes in WT HeLa cells treated with oligomycin (10 μM for 16 h) when compared to untreated cells. Before MitoCarta 3.0-filtering, significantly altered proteins were identified using a two-sided t-test followed by permutation-based FDR estimation to 0.05 and are colored in blue (n=5 independent experiments).Representative immunoblot of WT HeLa cells treated with the indicated drugs for 16 h. Antimycin A (AA; 10 μM), piericidin A (10 μM) and oligomycin (10 μM).Representative immunoblot of WT HeLa cells transfected with scrambled siRNA (control) and siRNA targeting AFG3L2 for 48 h, treated when indicated with oligomycin (10 μM) for 16 h. Quantification of TMBIM5 levels is shown on the right panel. TMBIM5 levels in untreated WT cells was set to 1 (n=3 independent experiments; mean ±SD).TMBIM5 abundance determined by mass spectrometry in WT HeLa cells treated with oligomycin (10 µM; 16 h) and depleted of AFG3L2 when indicated. n=5 independent experiments. P-value was calculated using a two-sided unpaired t-test. The central band of each box is the median value, and the box defines the 25th (lower) and 75th (higher) quantile. The whiskers represent the minimum and maximum value in the data excluding outliers (greater than 1.5 * inter quantile range distance to median - no outliers found here).Zoom in to selected clusters of hierarchical clustering of Z-Score normalized log2 LFQ intensities. Proteins that were significantly (FDR<0.05) accumulated between HeLa WT and TMBIM5-/- cells after oligomycin treatment (10 µM) for 16 h were clustered using Euclidean distance and the complete method on protein features. The figure shows identified cluster C4 and C5 with gene names and MitoCarta 3.0 localization annotations. The row dendrogram is omitted."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "AICD", "was", "induced", "in", "hPBT", "cells", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "Apoptotic", "cells", "were", "detected", "at", "indicated", "times", "after", "AICD", "induction", "by", "flow", "cytometry", "as", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "positive", "cells", "and", "the", "ratio", "between", "AICD", "and", "Ctrl", "values", "obtained", "are", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "B", ".", "AICD", "was", "induced", "in", "Jurkat", "cells", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "Apoptotic", "cells", "were", "detected", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "hPBT", "cells", "were", "transfected", "with", "mtYFP", "and", "after", "24h", "AICD", "was", "induced", ".", "Representative", "reconstructions", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "the", "mtYFP", "fluorescence", "30", "'", "after", "AICD", "induction", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "D", ".", "Morphometric", "analysis", "of", "mitochondrial", "shape", "of", "cells", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "E", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "mtYFP", ",", "24h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", ".", "Representative", "reconstructions", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "the", "mtYFP", "fluorescence", "24h", "after", "AICD", "induction", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "F", ".", "Morphometric", "analysis", "of", "mitochondrial", "shape", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "E", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "G", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "hPBT", "cells", "treated", "as", "indicated", ".", "30min", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "2μm", ".", "H", ".", "24h", "after", "AICD", "induction", "Jurkat", "cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "cells", "treated", "as", "indicated", "are", "shown", ".", "In", "EM", "images", "white", "arrowheads", "point", "to", "autophagic", "vesicles", "(", "late", "autophagosomes", "or", "most", "likely", "autophagolysosomes", ",", "Aφ", ")", ";", "black", "arrows", "point", "to", "mitochondria", "(", "mito", ")", "with", "remodelled", "cristae", ",", "specifically", "touching", "a", "representative", "disorganized", "crista", ".", "Scale", "bar", ",", "2μm", ".", "I", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "of", "hPBT", "cells", "transfected", "with", "mtYFP", ",", "fixed", "30", "'", "after", "AICD", "induction", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "cytochrome", "c", "antibody", "(", "red", ")", ".", "J", ".", "Cytochrome", "c", "localization", "index", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "cells", "treated", "as", "in", "(", "I", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "K", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "Jurkat", "cells", "transfected", "with", "mtYFP", ",", "fixed", "at", "32h", "after", "AICD", "induction", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "cytochrome", "c", "antibody", ".", "L", ".", "Cytochrome", "c", "localization", "index", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "images", "per", "condition", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. AICD was induced in hPBT cells as described in Materials and methods. Apoptotic cells were detected at indicated times after AICD induction by flow cytometry as AnnexinV/PI double positive cells and the ratio between AICD and Ctrl values obtained are shown. Data represent mean ± SE of six independent experiments.B. AICD was induced in Jurkat cells as described in Materials and methods. Apoptotic cells were detected as in (A). Data represent mean ± SE of five independent experiments.C. hPBT cells were transfected with mtYFP and after 24h AICD was induced. Representative reconstructions of confocal z-stacks of the mtYFP fluorescence 30' after AICD induction is shown. Scale bar, 5μm.D. Morphometric analysis of mitochondrial shape of cells treated as in (B). Data represent mean ± SE of five independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).E. Jurkat cells were transfected with mtYFP, 24h after AICD induction cells were fixed. Representative reconstructions of confocal z-stacks of the mtYFP fluorescence 24h after AICD induction are shown. Scale bar, 5μm.F. Morphometric analysis of mitochondrial shape in cells treated as in (E) is shown. Data represent mean ± SE of five independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).G. Representative electron micrographs of hPBT cells treated as indicated. 30min after AICD induction cells were fixed and processed for electron microscopy. Scale bar, 2μm.H. 24h after AICD induction Jurkat cells were fixed and processed for electron microscopy. Representative electron micrographs of cells treated as indicated are shown. In EM images white arrowheads point to autophagic vesicles (late autophagosomes or most likely autophagolysosomes, Aφ); black arrows point to mitochondria (mito) with remodelled cristae, specifically touching a representative disorganized crista. Scale bar, 2μm.I. Representative confocal microscopy images of hPBT cells transfected with mtYFP, fixed 30' after AICD induction and immunostained with an anti-cytochrome c antibody (red).J. Cytochrome c localization index was calculated from 30 randomly selected cells treated as in (I). Data represent mean ± SE of three independent experiments.K. Representative confocal images of Jurkat cells transfected with mtYFP, fixed at 32h after AICD induction and immunostained with an anti-cytochrome c antibody.L. Cytochrome c localization index was calculated from 30 randomly selected images per condition. Data represent mean ± SE of five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Protein", "samples", "(", "20", "μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGEand", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "WB", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "B", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "pE", "-", "GFP", "and", "the", "indicated", "plasmids", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", ",", "viability", "was", "determined", "cytofluorimetrically", "as", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", ",", "annexin", "-", "V", "-", "PE", "-", "negative", "cells", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "as", "indicated", ".", "Representative", "reconstructions", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "the", "mtYFP", "fluorescence", "24h", "after", "AICD", "induction", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "D", ".", "Morphometric", "analysis", "of", "mitochondrial", "shape", "of", "cells", "transfected", "as", "in", "(", "C", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "E", ".", "AICD", "was", "induced", "in", "Jurkat", "cells", "over", "expressing", "pE", "-", "GFP", "and", "the", "indicated", "plasmids", "and", "sorted", "for", "GFP", "positive", "fluorescence", ".", "24h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "randomly", "selected", "mitochondria", "from", "cells", "treated", "as", "indicated", "are", "shown", ".", "White", "arrow", "points", "to", "tight", "cristae", "structure", ",", "black", "arrow", "points", "to", "remodelled", "cristae", "and", "to", "a", "swollen", "cristae", "junction", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "2μm", ".", "F", ".", "Morphometric", "analysis", "of", "cristae", "width", "in", "cells", "transfected", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "G", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "of", "cells", "transfected", "as", "indicated", ",", "fixed", "32h", "after", "AICD", "induction", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "cytochrome", "c", "antibody", "(", "red", ")", ".", "H", ".", "Cytochrome", "c", "localization", "index", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "cells", "(", "per", "condition", ")", "transfected", "as", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Protein samples (20 μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGEand immunoblotted with the indicated antibodies. WB are representative of at least three independent experiments.B. Jurkat cells were transfected with pE-GFP and the indicated plasmids. 32h after AICD induction, viability was determined cytofluorimetrically as the percentage of GFP-positive, annexin-V-PE-negative cells. Data represent mean ± SE of five independent experiments.C. Jurkat cells were transfected as indicated. Representative reconstructions of confocal z-stacks of the mtYFP fluorescence 24h after AICD induction are shown. Scale bar, 5μm.D. Morphometric analysis of mitochondrial shape of cells transfected as in (C) is shown. Data represent mean ± SE of five independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).E. AICD was induced in Jurkat cells over expressing pE-GFP and the indicated plasmids and sorted for GFP positive fluorescence. 24h after AICD induction cells were fixed and processed for electron microscopy. Representative electron micrographs of randomly selected mitochondria from cells treated as indicated are shown. White arrow points to tight cristae structure, black arrow points to remodelled cristae and to a swollen cristae junction. Scale bar, 0.2μm.F. Morphometric analysis of cristae width in cells transfected as in (E).G. Representative confocal microscopy images of cells transfected as indicated, fixed 32h after AICD induction and immunostained with an anti-cytochrome c antibody (red).H. Cytochrome c localization index was calculated from 30 randomly selected cells (per condition) transfected as in (G). Data represent mean ± SE of five independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "of", "cells", "transfected", "GFP", "-", "LC3", "and", "Parkin", "-", "Cherry", ",", "treated", "as", "indicated", ",", "fixed", "24h", "after", "AICD", "induction", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "TOM20", "antibody", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "B", ".", "Statistical", "analysis", "of", "Parkin", "localization", "in", "cells", "subjected", "to", "AICD", "or", "to", "10μM", "CCCP", "for", "the", "indicated", "times", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "C", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Where", "indicated", ",", "lysosomal", "proteases", "inhibitors", "E64D", "and", "PepA", "were", "added", ".", "LC3", "-", "Parkin", "-", "mitochondria", "co", "-", "localization", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "cells", "per", "condition", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "5μmD", ".", "hPBT", "cells", "were", "transfected", "with", "LC3", "-", "cherry", "and", "treated", "as", "indicated", ".", "30min", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "TUNEL", "and", "DAPI", ".", "Representative", "reconstructions", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "the", "LC3", "-", "Cherry", "fluorescence", "and", "single", "stacks", "for", "DAPI", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "E", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "autophagy", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "20", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "F", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "treated", "as", "indicated", ".", "Representative", "reconstructions", "of", "confocal", "z", "-", "stacks", "of", "the", "GFP", "-", "LC3", "fluorescence", "16h", "after", "AICD", "induction", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "G", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "autophagic", "flux", "in", "cells", "treated", "as", "in", "(", "F", ")", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "H", ".", "Protein", "samples", "(", "20", "μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Where", "indicated", ",", "lysosomal", "proteases", "inhibitors", "E64D", "and", "PepA", "were", "added", ".", "WB", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Representative confocal microscopy images of cells transfected GFP-LC3 and Parkin-Cherry, treated as indicated, fixed 24h after AICD induction and immunostained with anti-TOM20 antibody are shown. Scale bar, 5μm.B. Statistical analysis of Parkin localization in cells subjected to AICD or to 10μM CCCP for the indicated times is shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).C. Cells were treated as in (A). Where indicated, lysosomal proteases inhibitors E64D and PepA were added. LC3-Parkin-mitochondria co-localization was calculated from 30 randomly selected cells per condition. Data represent mean ± SE of three independent experiments. Scale bar, 5μmD. hPBT cells were transfected with LC3-cherry and treated as indicated. 30min after AICD induction cells were fixed and stained with TUNEL and DAPI. Representative reconstructions of confocal z-stacks of the LC3-Cherry fluorescence and single stacks for DAPI are shown. Scale bar, 5μm.E. Statistical analysis of the autophagy in cells treated as in (D) is shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments (n = 20 cells per condition in each experiment).F. Jurkat cells were transfected with GFP-LC3 and treated as indicated. Representative reconstructions of confocal z-stacks of the GFP-LC3 fluorescence 16h after AICD induction are shown. Scale bar, 5μm.G. Statistical analysis of the autophagic flux in cells treated as in (F) is shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).H. Protein samples (20 μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. Where indicated, lysosomal proteases inhibitors E64D and PepA were added. WB are representative of at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "B", ".", "Protein", "samples", "(", "20", "μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Wb", "are", "representative", "of", "at", "least", "four", "independent", "experiments", ".", "Levels", "of", "proteins", "and", "phosphorylation", "status", "of", "AMPK", "were", "quantified", "and", "analyzed", "as", "shown", ".", "In", "these", "panels", ",", "Time", "states", "for", "\"", "time", ",", "hours", ",", "after", "AICD", "treatment", "\"", "and", "indicates", "at", "which", "time", "upon", "AICD", "induction", "samples", "have", "been", "collected", ".", "C", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", ",", "viability", "was", "determined", "cytofluorimetrically", "as", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", ",", "annexin", "-", "V", "-", "PE", "-", "negative", "cells", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Protein", "samples", "from", "Jurkat", "cells", "over", "expressing", "empty", "vector", "or", "AMPKS173A", "-", "S485A", "were", "immunoblotted", "for", "LC3", "and", "LC3", "-", "II", "/", "Actin", "ratio", "was", "quantified", "and", "analyzed", "as", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", "-", "F", ".", "Protein", "samples", "(", "20", "μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "WB", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Levels", "of", "proteins", "and", "phosphorylation", "status", "of", "LC3", "were", "quantified", "and", "analyzed", "as", "shown", ".", "G", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", ",", "viability", "was", "determined", "cytofluorimetrically", "as", "described", "above", ".", "H", "-", "I", ".", "Cells", "where", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "and", "where", "indicated", "10μM", "H89", "was", "added", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "P", "-", "AMPK", "Ser485", "-", "491", "phosphorylation", "(", "H", ")", "and", "of", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", "ratio", "(", "I", ")", "during", "AICD", "are", "shown", ".", "J", "-", "K", ".", "AICD", "was", "induced", "in", "Jurkat", "cells", "(", "J", ")", "and", "in", "hPBT", "cells", "(", "K", ")", "in", "presence", "of", "10μM", "H89", ".", "At", "indicated", "time", "points", "(", "hours", ")", "after", "AICD", "induction", ",", "apoptotic", "cells", "were", "detected", "by", "flow", "cytometry", "as", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "positive", "cells", "and", "the", "ratio", "between", "AICD", "and", "Ctrl", "values", "obtained", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-B. Protein samples (20 μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. Wb are representative of at least four independent experiments. Levels of proteins and phosphorylation status of AMPK were quantified and analyzed as shown. In these panels, Time states for \"time, hours, after AICD treatment\" and indicates at which time upon AICD induction samples have been collected.C. Jurkat cells were transfected with the indicated plasmids. 32h after AICD induction, viability was determined cytofluorimetrically as the percentage of GFP-positive, annexin-V-PE-negative cells. Data represent mean ± SE of three independent experiments.D. Protein samples from Jurkat cells over expressing empty vector or AMPKS173A-S485A were immunoblotted for LC3 and LC3-II/Actin ratio was quantified and analyzed as shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments.E-F. Protein samples (20 μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. WB are representative of at least three independent experiments. Levels of proteins and phosphorylation status of LC3 were quantified and analyzed as shown.G. Jurkat cells were transfected with the indicated plasmids. 32h after AICD induction, viability was determined cytofluorimetrically as described above.H-I. Cells where treated as in (A) and where indicated 10μM H89 was added. Quantitative analysis of P-AMPK Ser485-491 phosphorylation (H) and of LC3-II/LC3-I ratio (I) during AICD are shown.J-K. AICD was induced in Jurkat cells (J) and in hPBT cells (K) in presence of 10μM H89. At indicated time points (hours) after AICD induction, apoptotic cells were detected by flow cytometry as AnnexinV/PI double positive cells and the ratio between AICD and Ctrl values obtained are shown."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Apoptotic", "cells", "were", "detected", "at", "indicated", "time", "points", "after", "AICD", "induction", "in", "hPBT", "cells", "by", "flow", "cytometry", "as", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "positive", "cells", ".", "Where", "indicated", "hPBT", "cells", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "100nM", "rapamycin", "for", "24h", "before", "AICD", "induction", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "B", ".", "AICD", "was", "induced", "in", "Jurkat", "cells", "and", "where", "indicated", "100nM", "rapamycin", "was", "added", "at", "time", "0h", "of", "AICD", "induction", ".", "Apoptotic", "cell", "death", "analysis", "was", "carried", "out", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "except", "that", "cells", "were", "analysed", "32h", "after", "AICD", "induction", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "six", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Morphometric", "analysis", "of", "mitochondrial", "shape", "24h", "after", "AICD", "induction", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "mtYFP", "24h", "before", "AICD", "induction", "and", ",", "where", "indicated", ",", "100nM", "rapamycin", "was", "added", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "four", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "30", "cells", "per", "condition", "in", "each", "experiment", ")", ".", "D", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "cells", "subjected", "to", "AICD", "untreated", "(", "upper", "panel", ")", "or", "treated", "with", "100nM", "rapamycin", "(", "lower", "panel", ")", ".", "24h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "electron", "microscopy", ",", "Scale", "bar", ",", "2μm", ".", "E", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "mtYFP", "and", "treated", "as", "indicated", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "cytochrome", "c", "antibody", ".", "Cytochrome", "c", "localization", "index", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "images", "per", "condition", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "DRP1S637A", "-", "GFP", ",", "24h", "after", "transfection", "AICD", "was", "induced", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", "viability", "was", "determined", "cytofluorimetrically", "as", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", ",", "annexin", "-", "V", "-", "PE", "-", "negative", "cells", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "G", "-", "H", ".", "Jurkat", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "mt", "-", "RFP", "and", "the", "indicated", "plasmids", ",", "32h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "cytochrome", "c", "antibody", ".", "Cytochrome", "c", "localization", "index", "(", "G", ")", "and", "mitochondrial", "morphology", "(", "H", ")", "were", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "images", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "I", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "DRP1K38A", ",", "24h", "after", "transfection", "AICD", "was", "induced", ".", "32h", "after", "AICD", "induction", "viability", "was", "determined", "cytofluorimetrically", "as", "the", "percentage", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "negative", "cells", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Apoptotic cells were detected at indicated time points after AICD induction in hPBT cells by flow cytometry as AnnexinV/PI double positive cells. Where indicated hPBT cells were pre-incubated with 100nM rapamycin for 24h before AICD induction. Data represent mean ± SE of six independent experiments.B. AICD was induced in Jurkat cells and where indicated 100nM rapamycin was added at time 0h of AICD induction. Apoptotic cell death analysis was carried out as in (A), except that cells were analysed 32h after AICD induction. Data represent mean ± SE of six independent experiments.C. Morphometric analysis of mitochondrial shape 24h after AICD induction. Jurkat cells were transfected with mtYFP 24h before AICD induction and, where indicated, 100nM rapamycin was added. Data represent mean ± SE of four independent experiments (n = 30 cells per condition in each experiment).D. Representative electron micrographs of cells subjected to AICD untreated (upper panel) or treated with 100nM rapamycin (lower panel). 24h after AICD induction cells were fixed and processed for electron microscopy, Scale bar, 2μm.E. Jurkat cells were transfected with mtYFP and treated as indicated. 32h after AICD induction cells were fixed and immunostained with an anti-cytochrome c antibody. Cytochrome c localization index was calculated from 30 randomly selected images per condition. Data represent mean ± SE of four independent experiments.F. Jurkat cells were transfected with DRP1S637A-GFP, 24h after transfection AICD was induced. 32h after AICD induction viability was determined cytofluorimetrically as the percentage of GFP-positive, annexin-V-PE-negative cells. Data represent mean ± SE of three independent experiments.G-H. Jurkat cells were co-transfected with mt-RFP and the indicated plasmids, 32h after AICD induction cells were fixed and immunostained with an anti-cytochrome c antibody. Cytochrome c localization index (G) and mitochondrial morphology (H) were calculated from 30 randomly selected images. Data represent mean ± SE of three independent experiments.I. Jurkat cells were transfected with DRP1K38A, 24h after transfection AICD was induced. 32h after AICD induction viability was determined cytofluorimetrically as the percentage AnnexinV/PI double negative cells. Data represent mean ± SE of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Protein", "samples", "(", "20", "μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "WB", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "B", "-", "C", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "ratio", "between", "the", "protein", "levels", "of", "mitochondrial", "markers", "and", "Actin", "during", "AICD", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Jurkat", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "LC3", "and", "Parkin", "-", "Cherry", ",", "32h", "after", "AICD", "induction", "cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "TOM20", "antibody", ".", "Representative", "images", "for", "each", "condition", "are", "presented", ".", "Scale", "bar", ",", "5μm", ".", "E", ".", "LC3", "-", "Parkin", "-", "mitochondria", "co", "-", "localization", "was", "calculated", "from", "30", "randomly", "selected", "images", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "referring", "to", "Ctrl", "and", "AICD", "-", "stimulated", "cells", "without", "rapamycin", "correspond", "to", "the", "ones", "presented", "in", "Fig", ".", "3C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Protein samples (20 μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. WB are representative of at least three independent experiments.B-C. Quantitative analysis of the ratio between the protein levels of mitochondrial markers and Actin during AICD is shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments.D. Jurkat cells were co-transfected with GFP-LC3 and Parkin-Cherry, 32h after AICD induction cells were fixed and immunostained with an anti-TOM20 antibody. Representative images for each condition are presented. Scale bar, 5μm.E. LC3-Parkin-mitochondria co-localization was calculated from 30 randomly selected images. Data represent mean ± SE of three independent experiments. Data referring to Ctrl and AICD-stimulated cells without rapamycin correspond to the ones presented in Fig.3C."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Splenocytes", "were", "isolated", "from", "Ambragt", "/", "+", "and", "wt", "C57", "/", "BL6mice", "and", "activated", "as", "indicated", "in", "materials", "and", "methods", ".", "At", "day", "7", "after", "activation", ",", "AICD", "was", "induced", "with", "0", ".", "1μg", "/", "ml", "of", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "mCD3", "(", "Clone", "17A2", ")", ".", "Apoptotic", "cells", "were", "detected", "12h", "after", "AICD", "induction", "by", "flow", "cytometry", "as", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "positive", "cells", ".", "B", ".", "Splenocytes", "were", "isolated", "from", "ATG7", "fl", "/", "fl", "and", "wt", "C57", "/", "BL6mice", ".", "Activation", "of", "splenocytes", "and", "AICD", "were", "performed", "as", "previously", "described", ".", "At", "day", "5", "after", "activation", ",", "cells", "were", "infected", "with", "retroviral", "constructs", "expressing", "CRE", "recombinase", ".", "Where", "indicated", ",", "cells", "were", "pre", "-", "incubated", "with", "100nM", "rapamycin", "for", "24h", "before", "AICD", "induction", ".", "Apoptotic", "cells", "were", "detected", "2h", "after", "AICD", "induction", "by", "flow", "cytometry", "as", "AnnexinV", "/", "PI", "double", "positive", "cells", ".", "C", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "scramble", "or", "ATG7", "siRNA", "24h", "before", "AICD", "induction", ".", "AICD", "was", "induced", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", ".", "Where", "indicated", "100nM", "rapamycin", "was", "added", "at", "time", "0h", "of", "AICD", "induction", ".", "Apoptotic", "cell", "death", "analysis", "was", "carried", "out", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "except", "that", "cells", "were", "analysed", "32h", "after", "AICD", "induction", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Mitochondrial", "depolarization", "upon", "AICD", "induction", "was", "analysed", "in", "cells", "treated", "as", "indicated", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "E", ".", "Protein", "samples", "(", "20μg", ")", "from", "Jurkat", "cells", "treated", "as", "indicated", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "WB", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "ratio", "between", "the", "protein", "levels", "of", "mitochondrial", "markers", "and", "GRP75", "during", "AICD", "is", "shown", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SE", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Splenocytes were isolated from Ambragt/+ and wt C57/BL6mice and activated as indicated in materials and methods. At day 7 after activation, AICD was induced with 0.1μg/ml of plate-bound anti-mCD3 (Clone 17A2). Apoptotic cells were detected 12h after AICD induction by flow cytometry as AnnexinV/PI double positive cells.B. Splenocytes were isolated from ATG7 fl/fl and wt C57/BL6mice. Activation of splenocytes and AICD were performed as previously described. At day 5 after activation, cells were infected with retroviral constructs expressing CRE recombinase. Where indicated, cells were pre-incubated with 100nM rapamycin for 24h before AICD induction. Apoptotic cells were detected 2h after AICD induction by flow cytometry as AnnexinV/PI double positive cells.C. Jurkat cells were transfected with scramble or ATG7 siRNA 24h before AICD induction. AICD was induced as described in materials and methods. Where indicated 100nM rapamycin was added at time 0h of AICD induction. Apoptotic cell death analysis was carried out as in (A), except that cells were analysed 32h after AICD induction. Data represent mean ± SE of five independent experiments.D. Mitochondrial depolarization upon AICD induction was analysed in cells treated as indicated. Data represent mean ± SE of five independent experiments.E. Protein samples (20μg) from Jurkat cells treated as indicated were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. WB are representative of three independent experiments.F. Quantitative analysis of the ratio between the protein levels of mitochondrial markers and GRP75 during AICD is shown. Data represent mean ± SE of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", "Concentrations", "of", "amylase", ",", "lipase", ",", "CRP", ",", "and", "ANGPTL4", "in", "the", "sera", "of", "patients", "(", "n", "=", "90", ")", "diagnosed", "with", "pancreatitis", ".", "The", "box", "plots", "show", "a", "typical", "display", "consisting", "of", "a", "median", "value", "depicted", "by", "the", "line", "in", "the", "center", "of", "the", "box", ";", "an", "interquartile", "range", "(", "IQR", ";", "25th", "to", "the", "75th", "percentile", ")", "depicted", "by", "the", "box", ";", "and", "the", "maximum", "(", "Q3", "+", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "and", "minimum", "(", "Q1", "-", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "values", "depicted", "by", "the", "whisker", ".", "Statistical", "significance", "of", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "tests", "is", "indicated", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S2", ".", "ANGPTL4", "and", "CRP", "concentration", "from", "pancreatitis", "patients", "were", "determined", "by", "sandwich", "ELISA", ".", "The", "correlation", "between", "ANGPTL4", "and", "CRP", "is", "depicted", "with", "Pearson", "correlation", "coefficient", "(", "R", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "levels", "of", "ANGPTL4", "and", "CRP", "from", "an", "individual", "patient", "(", "n", "=", "90", ")", ".", "B", "Pancreatitis", "and", "adjacent", "normal", "regions", "(", "n", "=", "6", ")", "were", "stained", "by", "immunofluorescence", "for", "amylase", "and", "ANGPTL4", ".", "Scale", "bar", "represents", "30", "µmC", "H", "&", "E", "staining", ",", "ANGPTL4", "and", "amylase", "expression", "by", "immunofluorescence", "analysis", "after", "the", "induction", "of", "mild", "(", "AP", ")", "and", "severe", "acute", "pancreatitis", "(", "SAP", ")", "for", "2", "h", "(", "n", "=", "15", ",", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "µm", ".", "D", "Amylase", ",", "lipase", ",", "and", "ANGPTL4", "were", "assessed", "in", "the", "serum", "from", "AP", "and", "SAP", "animal", "models", "and", "ANGPTL4", "protein", "expression", "were", "determined", "in", "the", "blood", "and", "pancreas", "(", "n", "=", "15", ",", "each", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Concentrations of amylase, lipase, CRP, and ANGPTL4 in the sera of patients (n = 90) diagnosed with pancreatitis. The box plots show a typical display consisting of a median value depicted by the line in the center of the box; an interquartile range (IQR; 25th to the 75th percentile) depicted by the box; and the maximum (Q3+1.5*IQR) and minimum (Q1-1.5*IQR) values depicted by the whisker. Statistical significance of Mann-Whitney U-tests is indicated (** P < 0.01 and *** P < 0.001). Exact P values are shown in Appendix Table S2. ANGPTL4 and CRP concentration from pancreatitis patients were determined by sandwich ELISA. The correlation between ANGPTL4 and CRP is depicted with Pearson correlation coefficient (R). Each dot represents the levels of ANGPTL4 and CRP from an individual patient (n = 90).B Pancreatitis and adjacent normal regions (n = 6) were stained by immunofluorescence for amylase and ANGPTL4. Scale bar represents 30 µmC H&E staining, ANGPTL4 and amylase expression by immunofluorescence analysis after the induction of mild (AP) and severe acute pancreatitis (SAP) for 2 h (n = 15, each group). Scale bar represents 50 µm.D Amylase, lipase, and ANGPTL4 were assessed in the serum from AP and SAP animal models and ANGPTL4 protein expression were determined in the blood and pancreas (n = 15, each group)."}
{"words": ["Figure", "2A", "AP", "was", "induced", "by", "5", "injections", "(", "IP", ")", "of", "cerulein", "at", "a", "dosage", "of", "50", "μg", "/", "kg", ".", "SAP", "was", "induced", "by", "AP", "and", "one", "injection", "of", "lipopolysaccharide", "(", "LPS", ",", "IP", ")", "at", "a", "dosage", "of", "20", "mg", "/", "kg", ".", "AP", "+", "ANGPTL4", "(", "2", "mg", "/", "kg", ")", "was", "induced", "by", "AP", "and", "one", "injection", "of", "ANGPTL4", "(", "IP", ")", "at", "a", "dosage", "of", "2", "mg", "/", "kg", ".", "ANGPTL4", "(", "4", "mg", "/", "kg", ")", "was", "induced", "by", "two", "injections", "of", "ANGPTL4", "(", "IP", ")", "at", "a", "dosage", "of", "2", "mg", "/", "kg", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "6", "h", "after", "pancreatitis", "induction", ".", "(", "H", "&", "E", "and", "immunofluorescent", "staining", "for", "IL", "-", "1β", "(", "red", ")", "and", "amylase", "(", "green", ")", "was", "performed", "along", "with", "immunohistochemistry", "for", "ANGPTL4", "in", "pancreas", "tissues", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "µmB", "Concentrations", "of", "the", "inflammatory", "cytokines", "TGF", "-", "β", ",", "IL", "-", "1β", ",", "and", "IFN", "-", "γ", "as", "well", "as", "ANGPTL4", "in", "the", "sera", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "C", "TUNEL", "staining", "for", "apoptosis", "and", "vacuoles", "formation", "(", "TEM", ")", ".", "Red", "arrow", ",", "apoptotic", "cells", ";", "white", "dotted", "line", ",", "vacuoles", "region", ".", "D", "T", ".", "E", ".", "M", ".", "ANGPTL4", "immunogold", "labelling", "were", "performed", "in", "pancreas", "tissues", "from", "the", "AP", ",", "SAP", "and", "ANGPTL4", "-", "treated", "models", "(", "n", "=", "5", ",", "each", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A AP was induced by 5 injections (IP) of cerulein at a dosage of 50 μg/kg. SAP was induced by AP and one injection of lipopolysaccharide (LPS, IP) at a dosage of 20 mg/kg. AP+ANGPTL4 (2 mg/kg) was induced by AP and one injection of ANGPTL4 (IP) at a dosage of 2 mg/kg. ANGPTL4 (4 mg/kg) was induced by two injections of ANGPTL4 (IP) at a dosage of 2 mg/kg. Mice were sacrificed 6 h after pancreatitis induction. (H&E and immunofluorescent staining for IL-1β (red) and amylase (green) was performed along with immunohistochemistry for ANGPTL4 in pancreas tissues (n = 10, each group). Scale bar represents 50 µmB Concentrations of the inflammatory cytokines TGF-β, IL-1β, and IFN-γ as well as ANGPTL4 in the sera (n = 10, each group).C TUNEL staining for apoptosis and vacuoles formation (TEM). Red arrow, apoptotic cells; white dotted line, vacuoles region.D T.E.M. ANGPTL4 immunogold labelling were performed in pancreas tissues from the AP, SAP and ANGPTL4-treated models (n = 5, each group)."}
{"words": ["Figure", "3A", "AP", "and", "SAP", "were", "induced", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "ANGPTL4", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "15", ",", "each", "group", ")", ",", "as", "described", "in", "the", "material", "and", "methods", ".", "H", "&", "E", "staining", ",", "TUNEL", "staining", "for", "apoptosis", ",", "and", "immunofluorescence", "staining", "for", "ANGPTL4", "(", "red", ")", "and", "amylase", "(", "green", ")", "were", "performed", "in", "the", "pancreatic", "tissues", ".", "ANGPTL4", "and", "IL", "-", "6", "protein", "expressions", "were", "also", "determined", "in", "pancreatic", "tissues", "from", "ANGPTL4", "WT", "and", "-", "/", "-", "mice", "by", "Western", "blotting", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "µm", ".", "B", "Levels", "of", "ANGPTL4", ",", "amylase", ",", "lipase", ",", "and", "MPO", "in", "serum", "(", "n", "=", "15", ",", "each", "group", ")", ".", "C", "Immunofluorescence", "staining", "of", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "6", ",", "and", "the", "levels", "of", "the", "inflammatory", "cytokines", "TGF", "-", "β", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "and", "IL", "-", "1β", "in", "the", "sera", "from", "ANGPTL4", "WT", "and", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "150"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A AP and SAP were induced in wild type (WT) and ANGPTL4 -/- mice (n = 15, each group), as described in the material and methods. H&E staining, TUNEL staining for apoptosis, and immunofluorescence staining for ANGPTL4 (red) and amylase (green) were performed in the pancreatic tissues. ANGPTL4 and IL-6 protein expressions were also determined in pancreatic tissues from ANGPTL4 WT and -/- mice by Western blotting. Scale bar represents 100 µm.B Levels of ANGPTL4, amylase, lipase, and MPO in serum (n = 15, each group).C Immunofluorescence staining of TNF-α and IL-6, and the levels of the inflammatory cytokines TGF-β, IFN-γ, and IL-1β in the sera from ANGPTL4 WT and -/- mice (n = 10, each group). Scale bar represents 150 µm"}
{"words": ["Figure", "4A", "For", "macrophage", "depletion", "models", ",", "mice", "(", "six", "weeks", ")", "were", "injected", "with", "GdCl3", "(", "15", "mg", "/", "kg", ")", ".", "After", "the", "induction", "of", "macrophage", "depletion", "in", "the", "mice", ",", "pancreatitis", "was", "induced", "by", "cerulein", ",", "LPS", ",", "and", "ANGPTL4", "for", "24", "h", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "H", "&", "E", "staining", "of", "pancreatic", "tissue", ",", "and", "levels", "of", "amylase", "and", "lipase", "in", "the", "serum", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "µmB", "Immunohistochemistry", "for", "the", "macrophage", "marker", "CD11b", "and", "ANGPTL4", "in", "pancreas", "tissues", ".", "Levels", "of", "ANGPTL4", "in", "the", "serum", "were", "measured", "in", "the", "AP", ",", "SAP", ",", "and", "ANGPTL4", "(", "4", "mg", "/", "kg", ")", "groups", "of", "macrophage", "WT", "or", "depletion", "mice", "h", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "µmC", "Immunofluorescent", "staining", "of", "the", "F4", "/", "80", "macrophage", "marker", "and", "quantification", "of", "macrophage", "-", "positive", "cells", "in", "the", "AP", "and", "SAP", "groups", "from", "the", "ANGPTL4", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "150"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A For macrophage depletion models, mice (six weeks) were injected with GdCl3 (15 mg/kg). After the induction of macrophage depletion in the mice, pancreatitis was induced by cerulein, LPS, and ANGPTL4 for 24 h (n = 10, each group). H&E staining of pancreatic tissue, and levels of amylase and lipase in the serum. Scale bar represents 100 µmB Immunohistochemistry for the macrophage marker CD11b and ANGPTL4 in pancreas tissues. Levels of ANGPTL4 in the serum were measured in the AP, SAP, and ANGPTL4 (4 mg/kg) groups of macrophage WT or depletion mice h (n = 10, each group). Scale bar represents 100 µmC Immunofluorescent staining of the F4/80 macrophage marker and quantification of macrophage-positive cells in the AP and SAP groups from the ANGPTL4 -/-and WT mice (n = 10). Scale bar represents 150 µm"}
{"words": ["Figure", "5A", "Cell", "morphology", "and", "the", "mRNA", "levels", "of", "inflammatory", "cytokines", ",", "including", "and", "TNF", "-", "α", ",", "IL", "-", "6", ",", "and", "IL", "-", "1β", "in", "mouse", "primary", "macrophages", "treated", "with", "LPS", "and", "ANGPTL4", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "using", "qPCR", "and", "RT", "-", "PCR", ",", "and", "levels", "of", "TGF", "-", "β", "and", "NO", "in", "the", "LPS", "-", "and", "ANGPTL4", "-", "treated", "primary", "macrophages", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "µmB", "Migration", "assays", "were", "performed", "with", "mouse", "primary", "acinar", "cells", "and", "macrophages", "using", "IBIDI", "removable", "2", "-", "well", "silicone", "culture", "inserts", "that", "were", "placed", "in", "a", "cell", "culture", "μ", "-", "Dish", "and", "transwell", "at", "24", "h", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "µmC", "Mouse", "primary", "acinar", "cells", "and", "macrophages", "were", "labelled", "with", "fluorescence", "dyes", "(", "macrophages", ",", "red", "and", "acinar", "cells", ",", "green", ")", ".", "Co", "-", "cultured", "cells", "treated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "of", "ANGPTL4", "or", "LPS", "were", "analyzed", "by", "microscopy", "at", "12", "and", "48", "h", ".", "Scale", "bars", "represent", "80", "µm", "(", "red", ")", "and", "40", "µm", "(", "white", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Cell morphology and the mRNA levels of inflammatory cytokines, including and TNF-α, IL-6, and IL-1β in mouse primary macrophages treated with LPS and ANGPTL4 (100 ng/ml) using qPCR and RT-PCR, and levels of TGF-β and NO in the LPS- and ANGPTL4-treated primary macrophages (n = 5). Scale bar represents 100 µmB Migration assays were performed with mouse primary acinar cells and macrophages using IBIDI removable 2-well silicone culture inserts that were placed in a cell culture μ-Dish and transwell at 24 h (n = 5). Scale bar represents 50 µmC Mouse primary acinar cells and macrophages were labelled with fluorescence dyes (macrophages, red and acinar cells, green). Co-cultured cells treated with 100 ng/ml of ANGPTL4 or LPS were analyzed by microscopy at 12 and 48 h. Scale bars represent 80 µm (red) and 40 µm (white)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Macrophage", "cells", "were", "treated", "with", "ANGPTL4", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "24", "h", "and", "then", "cytokine", "levels", "were", "analyzed", "by", "a", "mouse", "cytokine", "profiler", "assay", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Mean", "pixel", "density", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", "analysis", ".", "B", "ANGPTL4", "and", "C5a", "expression", "levels", "were", "measured", "in", "bone", "marrow", "-", "derived", "macrophages", "from", "pancreatitis", "-", "induced", "ANGPTL4", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", ".", "C", "Phospho", "-", "kinase", "array", "was", "performed", "to", "find", "the", "mechanism", "by", "which", "ANGPTL4", "increased", "C5a", "in", "human", "THP1", "-", "derived", "macrophage", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "ANGPTL4", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "6", "h", ".", "After", "phospho", "-", "kinase", "array", "analysis", ",", "the", "expression", "of", "AMPKα", ",", "JNK", ",", "AKT", ",", "P70S6K", ",", "and", "EGFR", "was", "confirmed", "by", "western", "blotting", ".", "D", "To", "explore", "whether", "ANGPTL4", "affects", "JNK", ",", "AMPK", ",", "and", "PI3K", "/", "AKT", "signaling", ",", "each", "inhibitor", "(", "SP600125", ",", "compound", "C", ",", "and", "HS", "-", "173", ",", "1", "µM", ")", "was", "treated", "to", "in", "THP1", "-", "derived", "macrophages", "for", "2", "h", "after", "ANGPTL4", "treatment", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "for", "6", "h", ".", "E", "C5a", ",", "C5aR", ",", "TNF", "-", "α", ",", "IL", "-", "6", ",", "and", "IL", "-", "1β", "mRNA", "levels", "were", "identified", "by", "qPCR", "in", "mouse", "macrophages", "or", "primary", "acinar", "cells", "after", "treatment", "with", "ANGPTL4", "and", "LPS", "(", "100", " ", "ng", "/", "ml", ")", ".", "In", "the", "transwell", "experiment", ",", "mouse", "primary", "acinar", "cells", "were", "cultured", "in", "the", "lower", "well", "and", "macrophages", "were", "incubated", "in", "the", "upper", "transwell", "bucket", "treated", "with", "ANGPTL4", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Expression", "of", "ANGPTL4", ",", "C5aR", ",", "and", "C5a", "was", "determined", "in", "siANGPTL4", "-", "treated", "THP1", "-", "derived", "macrophage", "after", "LPS", "activation", ".", "F", "In", "the", "transwell", "experiment", ",", "TUNEL", "positive", "cells", "and", "C5aR", "expression", "were", "identified", "in", "primary", "acinar", "cells", "after", "C5aR", "antagonist", "(", "W", "-", "54011", ",", "10", "nM", ")", "pretreatment", "for", "12", "h", "prior", "to", "treatment", "with", "ANGPTL4", ",", "LPS", ",", "and", "C5a", "(", "100", " ", "ng", "/", "ml", ")", "for", "24", "h", "to", "macrophage", "in", "transwell", ".", "Scale", "bar", "represents", "20"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Macrophage cells were treated with ANGPTL4 (100 ng/ml) for 24 h and then cytokine levels were analyzed by a mouse cytokine profiler assay (n=3). Mean pixel density was quantified using ImageJ software analysis.B ANGPTL4 and C5a expression levels were measured in bone marrow-derived macrophages from pancreatitis-induced ANGPTL4-/- and WT mice.C Phospho-kinase array was performed to find the mechanism by which ANGPTL4 increased C5a in human THP1-derived macrophage cells (n=3). Cells were treated with ANGPTL4 (100 ng/ml) for 6 h. After phospho-kinase array analysis, the expression of AMPKα, JNK, AKT, P70S6K, and EGFR was confirmed by western blotting.D To explore whether ANGPTL4 affects JNK, AMPK, and PI3K/AKT signaling, each inhibitor (SP600125, compound C, and HS-173, 1 µM) was treated to in THP1-derived macrophages for 2 h after ANGPTL4 treatment (100 ng/ml) for 6 h.E C5a, C5aR, TNF-α, IL-6, and IL-1β mRNA levels were identified by qPCR in mouse macrophages or primary acinar cells after treatment with ANGPTL4 and LPS (100 ng/ml). In the transwell experiment, mouse primary acinar cells were cultured in the lower well and macrophages were incubated in the upper transwell bucket treated with ANGPTL4 (100 ng/ml). Expression of ANGPTL4, C5aR, and C5a was determined in siANGPTL4-treated THP1-derived macrophage after LPS activation.F In the transwell experiment, TUNEL positive cells and C5aR expression were identified in primary acinar cells after C5aR antagonist (W-54011, 10 nM) pretreatment for 12 h prior to treatment with ANGPTL4, LPS, and C5a (100 ng/ml) for 24 h to macrophage in transwell. Scale bar represents 20 µm"}
{"words": ["Figure", "7A", "Concentrations", "of", "C5a", "in", "the", "sera", "from", "pancreatitis", "patients", ",", "and", "correlation", "between", "ANGPTL4", "and", "C5a", "in", "the", "sera", "from", "pancreatitis", "patients", "(", "n", "=", "90", ")", ".", "The", "box", "plots", "show", "a", "typical", "display", "consisting", "of", "a", "median", "value", "depicted", "by", "the", "line", "in", "the", "center", "of", "the", "box", ";", "an", "interquartile", "range", "(", "IQR", ";", "25th", "to", "the", "75th", "percentile", ")", "depicted", "by", "the", "box", ";", "and", "the", "maximum", "(", "Q3", "+", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "and", "minimum", "(", "Q1", "-", "1", ".", "5", "*", "IQR", ")", "values", "depicted", "by", "the", "whisker", ".", "Statistical", "significance", "of", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "tests", "is", "indicated", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Exact", "P", "values", "are", "shown", "in", "Appendix", "Table", "S2", ".", "The", "correlation", "between", "C5a", "and", "ANGPTL4", "is", "depicted", "with", "Pearson", "correlation", "coefficient", "(", "R", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "levels", "of", "C5a", "and", "ANGPTL4", "from", "an", "individual", "patient", "(", "n", "=", "90", ")", ".", "The", "immunofluorescent", "expression", "of", "C5a", "and", "amylase", "was", "observed", "in", "pancreatitis", "and", "adjacent", "normal", "regions", "in", "patient", "tissues", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "µmB", "Immunofluorescence", "staining", "of", "C5a", "in", "pancreas", "tissues", "from", "ANGPTL4", "-", "/", "-", "and", "WT", "animals", "and", "macrophage", "depletion", "/", "WT", "models", "with", "pancreatitis", ".", "Scale", "bar", "represents", "150", "µm", ".", "Levels", "of", "C5a", "were", "measured", "in", "serum", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "C", "After", "macrophages", "were", "activated", "with", "LPS", "(", "100", " ", "ng", "/", "ml", ")", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "either", "neutralizing", "ANGPTL4", "or", "C5a", "antibody", "(", "100", " ", "ng", "/", "ml", ")", "or", "an", "isotype", "control", "(", "IgG", ")", ".", "ANGPTL4", ",", "C5a", ",", "TNF", "-", "α", ",", "and", "IL", "-", "6", "levels", "were", "measured", "in", "culture", "media", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "D", "The", "neutralizing", "ANGPTL4", "antibody", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "was", "injected", "twice", "(", "IP", ")", "into", "the", "AP", "and", "SAP", "models", ".", "H", "&", "E", "staining", "of", "pancreatic", "tissues", "and", "the", "concentrations", "of", "ANGPTL4", ",", "C5a", ",", "TNF", "-", "α", ",", "and", "amylase", "in", "the", "serum", "(", "n", "=", "10", ",", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "50"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Concentrations of C5a in the sera from pancreatitis patients, and correlation between ANGPTL4 and C5a in the sera from pancreatitis patients (n = 90). The box plots show a typical display consisting of a median value depicted by the line in the center of the box; an interquartile range (IQR; 25th to the 75th percentile) depicted by the box; and the maximum (Q3+1.5*IQR) and minimum (Q1-1.5*IQR) values depicted by the whisker. Statistical significance of Mann-Whitney U-tests is indicated (*** P < 0.001). Exact P values are shown in Appendix Table S2. The correlation between C5a and ANGPTL4 is depicted with Pearson correlation coefficient (R). Each dot represents the levels of C5a and ANGPTL4 from an individual patient (n = 90). The immunofluorescent expression of C5a and amylase was observed in pancreatitis and adjacent normal regions in patient tissues. Scale bar represents 50 µmB Immunofluorescence staining of C5a in pancreas tissues from ANGPTL4 -/- and WT animals and macrophage depletion/WT models with pancreatitis. Scale bar represents 150 µm. Levels of C5a were measured in serum (n = 7).C After macrophages were activated with LPS (100 ng/ml), the cells were treated with either neutralizing ANGPTL4 or C5a antibody (100 ng/ml) or an isotype control (IgG). ANGPTL4, C5a, TNF-α, and IL-6 levels were measured in culture media (n = 5).D The neutralizing ANGPTL4 antibody (10 mg/kg) was injected twice (IP) into the AP and SAP models. H&E staining of pancreatic tissues and the concentrations of ANGPTL4, C5a, TNF-α, and amylase in the serum (n = 10, each group). Scale bar represents 50 µm"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", ".", "Human", "neutrophils", "stained", "for", "CD66b", "after", "incubation", "with", "RBCs", "infected", "with", "GFP", "+", "P", ".", "falciparum", "parasites", "(", "white", "arrows", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "neutrophils", "were", "stained", "with", "CD66b", "(", "red", ")", ",", "GFP", "expressing", "parasites", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "upper", "and", "lower", "panel", "show", "two", "different", "cells", ".", "(", "B", ")", ".", "Giemsa", "staining", "of", "freshly", "isolated", "human", "neutrophils", "from", "a", "healthy", "donor", "incubated", "with", "iRBCs", "harboring", "late", "stages", "P", ".", "falciparum", "parasites", "(", "black", "arrows", ")", ".", "(", "C", ")", ".", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "human", "neutrophils", "incubated", "with", "opsonized", "or", "non", "-", "opsonized", "GFP", "+", "-", "late", "-", "stage", "iRBCs", ".", "Free", "neutrophils", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "GFP", "+", "iRBCs", "phagocytosed", "by", "neutrophils", ".", "The", "phagocytosis", "was", "analysed", "by", "flow", "cytometry", "(", "FACS", ")", ".", "Data", "information", ":"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A). Human neutrophils stained for CD66b after incubation with RBCs infected with GFP+ P. falciparum parasites (white arrows). Nuclei were stained with DAPI (blue), neutrophils were stained with CD66b (red), GFP expressing parasites (green). Scale bar, 5 µm. The upper and lower panel show two different cells.(B). Giemsa staining of freshly isolated human neutrophils from a healthy donor incubated with iRBCs harboring late stages P. falciparum parasites (black arrows).(C). Flow cytometry analysis of human neutrophils incubated with opsonized or non-opsonized GFP+-late-stage iRBCs. Free neutrophils were used as control.(D). Quantification of GFP+ iRBCs phagocytosed by neutrophils. The phagocytosis was analysed by flow cytometry (FACS). Data information:"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", ".", "Interaction", "between", "neutrophils", "and", "opsonized", "(", "red", ")", "or", "non", "-", "opsonized", "(", "blue", ")", "GFP", "+", "iRBCs", "by", "time", "in", "a", "\"", "pulse", "-", "chase", "\"", "experiment", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "+", "-", "neutrophils", "following", "5", "min", "of", "co", "-", "culture", "was", "set", "as", "100", "%", ".", "(", "C", ")", ".", "Parasitemia", "(", "percentage", "%", ")", "of", "NF54", "iRBCs", "cultures", "with", "or", "without", "daily", "addition", "of", "freshly", "isolated", "neutrophils", ".", "(", "D", ")", ".", "Parasitemia", "(", "percentage", "%", ")", "of", "cultures", "of", "RBC", "infected", "by", "different", "P", ".", "falciparum", "lines", "(", "NF54", ",", "Dd2", ",", "SL", ",", "PfEMP1", "-", "KO", ")", ".", "The", "parasites", "were", "kept", "in", "culture", "for", "six", "days", "in", "the", "presence", "(", "Neut", ".", ")", "or", "absence", "(", "Cont", ".", ")", "of", "neutrophils", ".", "(", "E", ")", ".", "Percentage", "change", "in", "parasitemia", "following", "neutrophil", "challenge", "of", "RBCs", "infected", "by", "different", "parasite", "lines", "(", "NF54", ",", "Dd2", ",", "SL", ",", "PfEMP1", "-", "KO", ")", ".", "(", "F", ")", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "the", "effect", "of", "neutrophil", "challenge", "on", "parasite", "cell", "cycle", "progression", ".", "Neutrophils", "were", "stained", "with", "an", "anti", "-", "CD11b", "antibody", ",", "while", "iRBCs", "were", "labeled", "with", "SYBR", "green", ".", "Gating", "for", "iRBCs", "were", "performed", "by", "gating", "for", "the", "SYBR", "green", "and", "CD11b", "negative", "population", ",", "excluding", "the", "neutrophils", "that", "were", "SYBR", "green", "negative", ",", "but", "CD11b", "positive", ".", "(", "G", ")", ".", "Short", "term", "neutrophil", "killing", "of", "late", "-", "stage", "NF54", "-", "luciferase", "positive", "RBCs", "in", "the", "presence", "(", "red", ")", "or", "absence", "(", "blue", ")", "of", "catalase", ".", "(", "H", ")", ".", "Parasitemia", "of", "cultures", "of", "iRBCs", "challenged", "with", "neutrophils", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "catalase", ".", "(", "I", ")", ".", "Short", "-", "term", "luciferase", "-", "based", "killing", "assay", "using", "neutrophils", "from", "three", "different", "donors", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "5", "uM", "cytochalasin", "D", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A). Interaction between neutrophils and opsonized (red) or non-opsonized (blue) GFP+ iRBCs by time in a \"pulse-chase\" experiment. The percentage of GFP+-neutrophils following 5 min of co-culture was set as 100%.(C). Parasitemia (percentage %) of NF54 iRBCs cultures with or without daily addition of freshly isolated neutrophils.(D). Parasitemia (percentage %) of cultures of RBC infected by different P. falciparum lines (NF54, Dd2, SL, PfEMP1-KO). The parasites were kept in culture for six days in the presence (Neut.) or absence (Cont.) of neutrophils.(E). Percentage change in parasitemia following neutrophil challenge of RBCs infected by different parasite lines (NF54, Dd2, SL, PfEMP1-KO).(F). Flow cytometric analysis of the effect of neutrophil challenge on parasite cell cycle progression. Neutrophils were stained with an anti-CD11b antibody, while iRBCs were labeled with SYBR green. Gating for iRBCs were performed by gating for the SYBR green and CD11b negative population, excluding the neutrophils that were SYBR green negative, but CD11b positive.(G). Short term neutrophil killing of late-stage NF54-luciferase positive RBCs in the presence (red) or absence (blue) of catalase.(H). Parasitemia of cultures of iRBCs challenged with neutrophils in the presence or absence of catalase.(I). Short-term luciferase-based killing assay using neutrophils from three different donors in the presence or absence of 5 uM cytochalasin D."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "human", "neutrophils", "cultured", "alone", "(", "Control", ")", ",", "incubated", "with", "late", "-", "stage", "NF54", "parasites", "(", "wild", "type", ")", "or", "PfEMP1", "Knock", "out", "(", "PfEMP1", "KO", ")", "GFP", "+", "iRBC", ".", "(", "B", ")", ".", "Flow", "cytometric", "quantification", "of", "the", "effect", "of", "trypsin", "treatment", "on", "neutrophil", "interaction", "with", "wild", "type", "and", "PfEMP1", "KO", "GFP", "+", "iRBC", ".", "(", "C", ")", ".", "Luciferase", "-", "based", "killing", "assay", "and", "neutrophil", "elimination", "of", "late", "-", "stage", "wild", "type", "(", "wt", ")", "and", "PfEMP1ko", "iRBC", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A). Representative flow cytometric analysis of human neutrophils cultured alone (Control), incubated with late-stage NF54 parasites (wild type) or PfEMP1 Knock out (PfEMP1 KO) GFP+ iRBC.(B). Flow cytometric quantification of the effect of trypsin treatment on neutrophil interaction with wild type and PfEMP1 KO GFP+ iRBC.(C). Luciferase-based killing assay and neutrophil elimination of late-stage wild type (wt) and PfEMP1ko iRBC."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", ".", "Short", "-", "term", "(", "6h", ")", "neutrophil", "killing", "of", "unselected", "NF54", "and", "antibody", "-", "selected", "PFD1235w", "expressing", "parasite", "lines", ".", "(", "C", ")", ".", "Flow", "cytometric", "quantification", "of", "neutrophil", "interaction", "with", "MitoTracker", "(", "APC", "+", ")", "stained", "NF54", "iRBCs", "and", "antibody", "-", "selected", "PFD1235w", "expressing", "iRBC", ".", "(", "D", ")", ".", "Percent", "reduction", "in", "parasitemia", "of", "NF54", "and", "antibody", "-", "selected", "PFD1235w", "expressing", "parasites", "after", "5", "days", "of", "co", "-", "culture", "with", "neutrophils", ",", "compared", "to", "unchallenged", "parasites", "(", "E", ")", ".", "var", "gene", "transcription", "profiles", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "antibody", "-", "selected", "PFD1235w", "expressing", "parasite", "line", "cultured", "in", "the", "absence", "(", "upper", "panel", ")", "or", "presence", "(", "lower", "panel", ")", "of", "neutrophils", ".", "Steady", "state", "mRNA", "levels", "of", "each", "individual", "var", "gene", "was", "calculated", "as", "in", "A", ".", "I", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B). Short-term (6h) neutrophil killing of unselected NF54 and antibody-selected PFD1235w expressing parasite lines.(C). Flow cytometric quantification of neutrophil interaction with MitoTracker (APC+) stained NF54 iRBCs and antibody-selected PFD1235w expressing iRBC.(D). Percent reduction in parasitemia of NF54 and antibody-selected PFD1235w expressing parasites after 5 days of co-culture with neutrophils, compared to unchallenged parasites(E). var gene transcription profiles measured by qRT-PCR of antibody-selected PFD1235w expressing parasite line cultured in the absence (upper panel) or presence (lower panel) of neutrophils. Steady state mRNA levels of each individual var gene was calculated as in A. I."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "QRT", "-", "PCR", "assay", "of", "PAX6", ",", "SOX1", ",", "NKX2", "-", "1", ",", "NKX2", "-", "2", ",", "TBR1", "and", "TBR2", "during", "dorsal", "(", "up", ")", "and", "ventral", "(", "down", ")", "neural", "differentiation", ".", "(", "B", ")", "QRT", "-", "PCR", "assay", "of", "SOX1", "-", "OT", "V1", "during", "dorsal", "(", "up", ")", "and", "ventral", "(", "down", ")", "neural", "differentiation", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "PAX6", "(", "green", ")", "and", "SOX1", "(", "red", ")", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "F", ")", ",", "and", "quantification", "of", "SOX1", "+", "cells", "(", "G", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "H", ")", ",", "and", "quantification", "of", "MAP2", "+", "cells", "(", "I", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "PAX6", "(", "green", ")", "and", "SOX1", "(", "red", ")", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "J", ")", ",", "and", "quantification", "of", "SOX1", "+", "cells", "(", "K", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0003", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "L", "and", "M", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "L", ")", ",", "and", "quantification", "of", "GABA", "+", "cells", "(", "M", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) QRT-PCR assay of PAX6, SOX1, NKX2-1, NKX2-2, TBR1 and TBR2 during dorsal (up) and ventral (down) neural differentiation. (B) QRT-PCR assay of SOX1-OT V1 during dorsal (up) and ventral (down) neural differentiation Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).(F and G) Immunostaining assay of PAX6 (green) and SOX1 (red) in control and V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation (F), and quantification of SOX1+ cells (G), p=0.0001. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).(H and I) Immunostaining assay of MAP2 (green) in control and V1-PAKI cells on day 35 of dorsal neural differentiation (H), and quantification of MAP2+ cells (I), p=0.0001. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).(J and K) Immunostaining assay of PAX6 (green) and SOX1 (red) in control and V1-PAKI cells on day 16 of ventral neural differentiation (J), and quantification of SOX1+ cells (K), p=0.0003. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).(L and M) Immunostaining assay of GABA (green) in control and V1-PAKI cells on day 35 of ventral neural differentiation (L), and quantification of GABA+ cells (M), p=0.0001. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", "and", "D", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "35", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "C", ")", ",", "and", "quantification", "of", "MAP2", "+", "cells", "(", "D", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "in", "control", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "35", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "F", ")", ",", "and", "quantification", "of", "GABA", "+", "cells", "(", "G", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "H", ")", ",", "and", "quantification", "of", "MAP2", "+", "cells", "(", "I", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", "+", "ptSOX1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "-", "dox", "group", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "J", ")", ",", "and", "quantification", "of", "GABA", "+", "cells", "(", "K", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "V1", "-", "PAKI", "+", "ptSOX1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "-", "dox", "group", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C and D) Immunostaining assay of MAP2 (green) in control and SOX1KO cells on day 35 of dorsal neural differentiation (C), and quantification of MAP2+ cells (D), p=0.0001. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). ***p<0.001 versus Ctrl group (unpaired two-tailed Student's t-test).(F and G) Immunostaining assay of GABA (green) in control and SOX1KO cells on day 35 of ventral neural differentiation (F), and quantification of GABA+ cells (G), p=0.0001. Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). ***p<0.001 versus Ctrl group (unpaired two-tailed Student's t-test).(H and I) Immunostaining assay of MAP2 (green) after SOX1 overexpression in V1-PAKI cells on day 35 of dorsal neural differentiation (H), and quantification of MAP2+ cells (I), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (V1-PAKI+ptSOX1+dox). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). ***p<0.001 versus Ctrl group ; ###p<0.001 versus -dox group (one-way ANOVA).(J and K) Immunostaining assay of GABA (green) after SOX1 overexpression in V1-PAKI cells on day 35 of ventral neural differentiation (J), and quantification of GABA+ cells (K), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0002 (V1-PAKI+ptSOX1+dox). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). ***p<0.001 versus Ctrl group ; ###p<0.001 versus -dox group (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Enrichment", "of", "H3K14Ac", "(", "left", ")", "and", "H3K27Ac", "(", "right", ")", "on", "SOX1", "promoter", "region", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "A", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0046", "(", "H3K14Ac", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0223", "(", "H3K27Ac", ")", "and", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "B", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0499", "(", "H3K14Ac", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0022", "(", "H3K27Ac", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "versus", "Ctrl", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "after", "4", "HDAC", "inhibitors", "(", "4i", ")", ",", "including", "RG2833", "(", "2833", ",", "2μM", ")", ",", "CAY10683", "(", "CAY", ",", "2μM", ")", ",", "PCI", "-", "34051", "(", "34051", ",", "5μM", ")", "and", "Bufexamac", "(", "Buf", ",", "12", ".", "5μM", ")", ",", "treatment", "or", "remove", "one", "inhibitor", "from", "these", "4", "HDAC", "inhibitors", "(", "4i", ")", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "after", "Bufexamac", "treatment", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "G", ")", ",", "and", "quantification", "of", "SOX1", "+", "cells", "(", "H", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "+", "Buf", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "V1", "-", "PAKI", "group", ";", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "after", "Bufexamac", "treatment", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "J", ")", ",", "and", "quantification", "of", "MAP2", "+", "cells", "(", "K", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "+", "Buf", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "V1", "-", "PAKI", "group", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "L", ")", "Enrichment", "of", "RNA", "polymerase", "Ⅱ", "on", "SOX1", "promoter", "region", "after", "Bufexamac", "treatment", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "(", "left", ",", "p", "=", "0", ".", "0007", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "+", "Buf", ")", ")", "and", "ventral", "(", "right", ",", "p", "=", "0", ".", "0083", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0276", "(", "+", "Buf", ")", ")", "neural", "differentiation", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "V1", "-", "PAKI", "group", ";", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Enrichment of H3K14Ac (left) and H3K27Ac (right) on SOX1 promoter region in control and V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation (A), p=0.0046 (H3K14Ac), p=0.0223 (H3K27Ac) and ventral neural differentiation (B), p=0.0499 (H3K14Ac), p=0.0022 (H3K27Ac). Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01 versus Ctrl group (unpaired two-tailed Student's t-test).(C Immunostaining assay of SOX1 (red) after 4 HDAC inhibitors (4i), including RG2833 (2833, 2μM), CAY10683 (CAY, 2μM), PCI-34051 (34051, 5μM) and Bufexamac (Buf, 12.5μM), treatment or remove one inhibitor from these 4 HDAC inhibitors (4i) in V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation Scale bar, 100 μm.(G and H) Immunostaining assay of SOX1 (red) after Bufexamac treatment in V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation (G), and quantification of SOX1+ cells (H), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (+Buf). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus Ctrl group ; #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 versus V1-PAKI group ; (one-way ANOVA).(J and K) Immunostaining assay of MAP2 (green) after Bufexamac treatment in V1-PAKI cells on day 35 of dorsal neural differentiation (J), and quantification of MAP2+ cells (K), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (+Buf). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus Ctrl group ; #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 versus V1-PAKI group (one-way ANOVA).(L) Enrichment of RNA polymerase Ⅱ on SOX1 promoter region after Bufexamac treatment in V1-PAKI cells on day 16 of dorsal (left, p=0.0007 (V1-PAKI), p=0.0002 (+Buf)) and ventral (right, p=0.0083 (V1-PAKI), p=0.0276 (+Buf)) neural differentiation. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus Ctrl group ; #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 versus V1-PAKI group ; (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "and", "C", ")", "RIP", "analysis", "for", "endogenous", "interaction", "between", "HDAC10", "and", "SOX1", "-", "OT", "V1", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "B", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0085", "and", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "C", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0152", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "IgG", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Enrichment", "of", "HDAC10", "on", "SOX1", "promoter", "region", "in", "control", "and", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "D", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0052", "and", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "E", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "after", "SOX1", "-", "OT", "V1", ",", "SOX1", "-", "OT", "V1", "-", "5P", "or", "SOX1", "-", "OT", "V1", "-", "3P", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "G", ")", ",", "and", "quantification", "of", "SOX1", "+", "cells", "(", "H", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptV1", "+", "dox", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "pt5P", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "after", "SOX1", "-", "OT", "V1", ",", "SOX1", "-", "OT", "V1", "-", "5P", "or", "SOX1", "-", "OT", "V1", "-", "3P", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "16", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "I", ")", ",", "and", "quantification", "of", "SOX1", "+", "cells", "(", "J", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptV1", "+", "dox", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "pt5P", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "-", "dox", "group", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B and C) RIP analysis for endogenous interaction between HDAC10 and SOX1-OT V1 on day 16 of dorsal neural differentiation (B), p=0.0085 and ventral neural differentiation (C), p=0.0152. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus IgG group (unpaired two-tailed Student's t-test).(D and E) Enrichment of HDAC10 on SOX1 promoter region in control and V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation (D), p=0.0052 and ventral neural differentiation (E), p=0.0001. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 versus Ctrl group (unpaired two-tailed Student's t-test).(G and H) Immunostaining assay of SOX1 (red) after SOX1-OT V1, SOX1-OT V1-5P or SOX1-OT V1-3P overexpression in V1-PAKI cells on day 16 of dorsal neural differentiation (G), and quantification of SOX1+ cells (H), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptV1+dox), p=0.0001 (pt5P+dox). Scale bar, 100 μm. (I and J) Immunostaining assay of SOX1 (red) after SOX1-OT V1, SOX1-OT V1-5P or SOX1-OT V1-3P overexpression in V1-PAKI cells on day 16 of ventral neural differentiation (I), and quantification of SOX1+ cells (J), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptV1+dox), p=0.0001 (pt5P+dox). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). *p<0.05, ***p<0.001 versus Ctrl group ; #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 versus -dox group (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "and", "B", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "ASCL1", "(", "green", ")", "in", "control", ",", "V1", "-", "PAKI", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "25", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "A", ")", ",", "and", "quantification", "of", "ASCL1", "+", "cells", "(", "B", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0021", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0024", "(", "SOX1KO", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "ASCL1", "(", "green", ")", "in", "control", ",", "V1", "-", "PAKI", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "25", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "C", ")", ",", "and", "quantification", "of", "ASCL1", "+", "cells", "(", "D", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0003", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0004", "(", "SOX1KO", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "ASCL1", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "25", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "E", ")", ",", "and", "quantification", "of", "ASCL1", "+", "cells", "(", "F", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptSOX1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "G", "and", "H", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "ASCL1", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "25", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "G", ")", ",", "and", "quantification", "of", "ASCL1", "+", "cells", "(", "H", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptSOX1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "I", "and", "J", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "after", "ASCL1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "dorsal", "neural", "differentiation", "(", "I", ")", ",", "and", "quantification", "of", "MAP2", "+", "cells", "(", "J", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptASCL1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "K", "and", "L", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "after", "ASCL1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "35", "of", "ventral", "neural", "differentiation", "(", "K", ")", ",", "and", "quantification", "of", "GABA", "+", "cells", "(", "L", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "V1", "-", "PAKI", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "ptASCL1", "+", "dox", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "Ctrl", "group", ";", "#", "#", "#", "p", "<", "0", ".", "001", "versus", "-", "dox", "group", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A and B) Immunostaining assay of ASCL1 (green) in control, V1-PAKI and SOX1KO cells on day 25 of dorsal neural differentiation (A), and quantification of ASCL1+ cells (B), p=0.0021 (V1-PAKI), p=0.0024 (SOX1KO). Scale bar, 100 μm. (C and D) Immunostaining assay of ASCL1 (green) in control, V1-PAKI and SOX1KO cells on day 25 of ventral neural differentiation (C), and quantification of ASCL1+ cells (D), p=0.0003 (V1-PAKI), p=0.0004 (SOX1KO). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). **p<0.01, ***p<0.001 versus Ctrl group (unpaired two-tailed Student's t-test).(E and F) Immunostaining assay of ASCL1 (green) after SOX1 overexpression in V1-PAKI cells on day 25 of dorsal neural differentiation (E), and quantification of ASCL1+ cells (F), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptSOX1+dox). Scale bar, 100 μm. (G and H) Immunostaining assay of ASCL1 (green) after SOX1 overexpression in V1-PAKI cells on day 25 of ventral neural differentiation (G), and quantification of ASCL1+ cells (H), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptSOX1+dox). Scale bar, 100 μm. (I and J) Immunostaining assay of MAP2 (green) after ASCL1 overexpression in V1-PAKI cells on day 35 of dorsal neural differentiation (I), and quantification of MAP2+ cells (J), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptASCL1+dox). Scale bar, 100 μm. (K and L) Immunostaining assay of GABA (green) after ASCL1 overexpression in V1-PAKI cells on day 35 of ventral neural differentiation (K), and quantification of GABA+ cells (L), p=0.0001 (V1-PAKI), p=0.0001 (ptASCL1+dox). Scale bar, 100 μm. Data information: Data are presented as mean ±SEM from three independent experiments (n=3). ***p<0.001 versus Ctrl group ; ###p<0.001 versus -dox group (one-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "and", "B", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "in", "control", ",", "V1", "-", "PAKI", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "40", "of", "dorsal", "(", "A", ")", "and", "ventral", "(", "B", ")", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "C", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "in", "control", ",", "V1", "-", "PAKI", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "40", "of", "dorsal", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "in", "control", ",", "V1", "-", "PAKI", "and", "SOX1KO", "cells", "on", "day", "40", "of", "ventral", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "SOX1", "(", "red", ")", "after", "SOX1", "-", "OT", "V1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "40", "of", "dorsal", "(", "E", ")", "and", "ventral", "(", "F", ")", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "G", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "MAP2", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "-", "OT", "V1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "40", "of", "dorsal", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "H", ")", "Immunostaining", "assay", "of", "GABA", "(", "green", ")", "after", "SOX1", "-", "OT", "V1", "overexpression", "in", "V1", "-", "PAKI", "cells", "on", "day", "40", "of", "ventral", "organoids", "differentiation", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A and B) Immunostaining assay of SOX1 (red) in control, V1-PAKI and SOX1KO cells on day 40 of dorsal (A) and ventral (B) organoids differentiation. Scale bar, 100 μm. (C) Immunostaining assay of MAP2 (green) in control, V1-PAKI and SOX1KO cells on day 40 of dorsal organoids differentiation. Scale bar, 100 μm. (D) Immunostaining assay of GABA (green) in control, V1-PAKI and SOX1KO cells on day 40 of ventral organoids differentiation. Scale bar, 100 μm.(E and F) Immunostaining assay of SOX1 (red) after SOX1-OT V1 overexpression in V1-PAKI cells on day 40 of dorsal (E) and ventral (F) organoids differentiation. Scale bar, 100 μm. (G) Immunostaining assay of MAP2 (green) after SOX1-OT V1 overexpression in V1-PAKI cells on day 40 of dorsal organoids differentiation. Scale bar, 100 μm. (H) Immunostaining assay of GABA (green) after SOX1-OT V1 overexpression in V1-PAKI cells on day 40 of ventral organoids differentiation. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Total", "T", "cells", "were", "enriched", "from", "spleens", "of", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", ",", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", ",", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "mice", ".", "Expression", "of", "Ptpn6", "and", "Ptpn11", "was", "tested", "by", "immunoblot", "in", "cell", "lysates", ",", "Gapdh", "used", "as", "loading", "control", ".", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "and", "control", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Tumour", "growth", "in", "individual", "mice", "is", "shown", "for", "the", "indicated", "genotypes", "and", "treatments", ";", "number", "of", "mice", "eradicating", "the", "tumour", "is", "shown", "within", "the", "graphs", "(", "C", ")", ".", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "and", "control", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Survival", "curves", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "Tumour", "growth", "in", "individual", "mice", "challenged", "with", "MC38", "and", "subsequently", "treated", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", "is", "shown", "for", "each", "indicated", "genotype", ";", "number", "of", "mice", "eradicating", "the", "tumour", "is", "shown", "within", "the", "graphs", "(", "G", ")", ".", "individual", "mice", "challenged", "with", "MC38", "and", "subsequently", "treated", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", "is", "shown", "for", "each", "indicated", "genotype", "Survival", "curves", "of", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", "and", "control", "mice", "is", "shown", "(", "H", ")", ".", "I", ",", "J", ")", "10", "-", "12", "days", "following", "MC38", "tumour", "inoculation", "and", "treatment", "with", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "isotype", "control", ",", "CD4cre", "Ptpn6", "/", "11wt", "/", "wt", "and", "CD4cre", "Ptpn6fl", "/", "fl", "/", "Ptpn11fl", "/", "flWbm", "mice", "were", "sacrificed", ",", "and", "TILs", "analysed", ".", "Graphs", "depict", "frequencies", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "gated", "as", "CD45", "+", "TCRβ", "+", "CD8", "+", ")", "expressing", "IFN", "-", "γ", "and", "TNFα", "upon", "re", "-", "stimulation", "(", "G", ")", "and", "percentages", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Total T cells were enriched from spleens of Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm, CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm, CD4cre Ptpn6fl/fl mice. Expression of Ptpn6 and Ptpn11 was tested by immunoblot in cell lysates, Gapdh used as loading control.CD4cre Ptpn6fl/fl and control mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Tumour growth in individual mice is shown for the indicated genotypes and treatments; number of mice eradicating the tumour is shown within the graphs (C).CD4cre Ptpn6fl/fl and control mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Survival curves are shown (D).Tumour growth in individual mice challenged with MC38 and subsequently treated with anti-PD-1 antibody or isotype control is shown for each indicated genotype; number of mice eradicating the tumour is shown within the graphs (G).individual mice challenged with MC38 and subsequently treated with anti-PD-1 antibody or isotype control is shown for each indicated genotype Survival curves of CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm and control mice is shown (H).I, J) 10-12 days following MC38 tumour inoculation and treatment with anti-PD-1 antibody or isotype control, CD4cre Ptpn6/11wt/wt and CD4cre Ptpn6fl/fl/Ptpn11fl/flWbm mice were sacrificed, and TILs analysed. Graphs depict frequencies of CD8+ T cells (gated as CD45+ TCRβ+ CD8+) expressing IFN-γ and TNFα upon re-stimulation (G) and percentages of CD8+ T cells (H)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Ptpn6", "and", "Ptpn11", "copy", "number", ",", "as", "estimated", "through", "high", "resolution", "mass", "spectrometry", "in", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "CTLs", ".", "C", "and", "D", ")", "GzmBcre", "R26R", "-", "YFP", "reporter", "mice", "were", "injected", "subcutaneously", "with", "MC38", "cells", "and", "analysed", "after", "11", "days", ".", "Graphs", "show", "the", "percentage", "of", "YFP", "+", "cells", "among", "CD45", "+", "CD8", "+", "TILs", "(", "C", ")", "and", "the", "percentage", "of", "PD", "-", "1", "+", "cells", "among", "CD45", "+", "CD8", "+", "YFP", "+", "TILs", "(", "D", ")", ".", "Results", "depict", "n", "=", "4", "mice", "(", "C", "and", "D", ")", ".", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "mice", "were", "subcutaneously", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "Survival", "curves", "and", "statistical", "comparisons", "between", "different", "groups", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "The", "tumour", "start", "depicts", "the", "time", "(", "days", ")", "following", "tumour", "engraftment", "after", "which", "the", "tumour", "is", "palpable", ",", "while", "tumour", "endpoint", "depicts", "the", "time", "(", "days", ")", "from", "tumour", "start", "until", "the", "reaching", "the", "maximal", "allowed", "tumour", "size", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Ptpn6 and Ptpn11 copy number, as estimated through high resolution mass spectrometry in GzmBcre Ptpn6/11fl/fl and control CTLs.C and D) GzmBcre R26R-YFP reporter mice were injected subcutaneously with MC38 cells and analysed after 11 days. Graphs show the percentage of YFP+ cells among CD45+ CD8+ TILs (C) and the percentage of PD-1+ cells among CD45+ CD8+ YFP+ TILs (D). Results depict n = 4 mice (C and D).GzmBcre Ptpn6/11fl/fl and control Ptpn6/11fl/fl mice were subcutaneously injected with MC38 cells. Survival curves and statistical comparisons between different groups are shown (E).The tumour start depicts the time (days) following tumour engraftment after which the tumour is palpable, while tumour endpoint depicts the time (days) from tumour start until the reaching the maximal allowed tumour size (F)."}
{"words": ["Figure", "3C", ")", "Numbers", "of", "CTLs", "(", "gated", "on", "CD8", "+", "T", "cells", ")", "from", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "or", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "mice", "were", "counted", "daily", "by", "flow", "cytometry", "with", "the", "addition", "of", "DAPI", "to", "monitor", "dead", "cells", ".", "D", ")", "Quantitative", "high", "-", "resolution", "mass", "spectrometry", "was", "used", "to", "resolve", "the", "proteome", "of", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "CTLs", "(", "day", "7", ")", ".", "The", "plot", "depicts", "protein", "copy", "number", "in", "control", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "cells", ".", "Significantly", "altered", "proteins", "are", "indicated", "in", "red", ";", "selected", "examples", "are", "annotated", ".", "Results", "are", "based", "on", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "and", "two", "-", "tailed", ",", "unequal", "-", "variance", "t", "-", "test", "on", "log10", "transformed", "copy", "number", "per", "cell", "values", "was", "used", "to", "compare", "differences", "between", "experimental", "groups", ".", "G", ")", "Graph", "illustrates", "the", "percentage", "of", "DAPI", "+", "dead", "cells", "of", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "GzmBcre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "CTLs", "(", "gated", "on", "CD8", "+", "T", "cells", ")", "at", "the", "indicated", "days", "as", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "H", ")", "Protein", "copy", "number", "of", "Tnfrsf1b", "and", "Mcl", "-", "1", "in", "GzmB", "cre", "Ptpn6", "/", "11fl", "/", "fl", "and", "control", "CTLs", ",", "as", "estimated", "through", "high", "resolution", "mass", "spectrometry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C) Numbers of CTLs (gated on CD8+ T cells) from Ptpn6/11fl/fl or GzmBcre Ptpn6/11fl/fl mice were counted daily by flow cytometry with the addition of DAPI to monitor dead cells.D) Quantitative high-resolution mass spectrometry was used to resolve the proteome of Ptpn6/11fl/fl and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl CTLs (day 7). The plot depicts protein copy number in control and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl cells. Significantly altered proteins are indicated in red; selected examples are annotated. Results are based on n = 3 biological replicates and two-tailed, unequal-variance t-test on log10 transformed copy number per cell values was used to compare differences between experimental groups.G) Graph illustrates the percentage of DAPI+ dead cells of Ptpn6/11fl/fl and GzmBcre Ptpn6/11fl/fl CTLs (gated on CD8+ T cells) at the indicated days as measured by flow cytometry.H) Protein copy number of Tnfrsf1b and Mcl-1 in GzmB cre Ptpn6/11fl/fl and control CTLs, as estimated through high resolution mass spectrometry."}